CN106995822A - 定制供人类使用的抗体、可变结构域和链 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及提供专门定制供人类使用的抗体治疗剂和预防剂。本发明提供了文库、脊椎动物和细胞，例如转基因小鼠或大鼠或者转基因小鼠或大鼠细胞。此外，本发明涉及使用脊椎动物分离抗体或编码抗体的核苷酸序列的方法。本发明还提供了抗体、重链、多肽、核苷酸序列、药物组合物和用途。

Description

定制供人类使用的抗体、可变结构域和链
本申请是2012年9月18日提交的题为“定制供人类使用的抗体、可变结构域和链”的中国专利申请201280056727.0的分案申请。
技术领域
本发明涉及提供专门定制供人类使用的抗体治疗剂和预防剂。
本发明提供了文库、脊椎动物和细胞，例如转基因小鼠或大鼠或者转基因小鼠或大鼠细胞。此外，本发明涉及使用脊椎动物分离抗体或编码抗体的核苷酸序列的方法。本发明还提供了抗体、重链、多肽、核苷酸序列、药物组合物和用途。
背景技术
本领域技术水平提供包含转基因免疫球蛋白基因座的非人脊椎动物(例如小鼠和大鼠)和细胞，此类基因座包含人可变(V)、多样性(D)和/或连接(J)区段，和任选存在的人恒定区。可替代地，在转基因基因座中提供宿主脊椎动物的内源恒定区(例如小鼠或大鼠恒定区)。构建此类转基因脊椎动物的方法及其在抗原免疫后生成抗体及其核酸的用途为本领域所知，例如参见US7501552(Medarex)、US5939598(Abgenix)、US6130364(Abgenix)、W002/066630(Regeneron)、W02011004192(Genome Research Limited)、W02009076464、W02009143472和W02010039900(Ablexis)，所述专利的公开内容明确引入本文。本领域的此类转基因基因座包括不同量的人V(D)J库集(repertoire)。现有转基因免疫球蛋白基因座基于单个人DNA来源。在具有此类转基因基因座的非人脊椎动物中人抗体可变区的潜在多样性因此受限。
本发明人考虑将希望定制这些转基因非人脊椎动物的基因组(以及因此这些的抗体和抗体链产物)以解决人的天然抗体基因使用中的可变性和共同性。本发明人希望实现这点，以便更好地解决基于抗体的治疗和预防药物的人类使用。
还将希望在转基因免疫球蛋白基因座和容纳这些的非人脊椎动物中以及在此类动物的免疫后产生的抗体中提供人可变区的新型和潜在扩展的库集和多样性。
发明内容
本发明已由跨越众多不同人类群体和跨越来自人类个体的超过两千份样品的天然抗体基因区段分布的广泛生物信息学分析开发。本发明人已承担这一艰巨任务，以更彻底了解且设计非人脊椎动物系统和所得的抗体，以更好地解决就整体而言的人类医学治疗剂，以及使得能够合理设计以针对特定种族的人类群体。使用此类合理设计，本发明人已以这样的方式构建了转基因非人脊椎动物以及分离的抗体、抗体链和表达这些的细胞，所述方式获得利用基因区段的产物，所述基因区段已在人生物信息学分析的基础上有意包括。例子举例说明其中本发明人为此分离许多细胞和抗体的工作实验。
本发明还涉及合成扩展和人种多样的超人(superhuman)免疫球蛋白基因库集。本发明因此提供了新型和潜在扩展的合成免疫球蛋白多样性，因此提供可以从其中选择人抗体治疗剂前导物的多样性库。当寻求发现具有希望特征的抗体时，该扩展库是有用的，所述希望特征例如针对靶抗原的相对高亲和力，而无需进一步的亲和力成熟(例如使用费力的体外技术例如噬菌体或核糖体展示)，或改善的生物物理学特征，或针对先前难以用抗体针对的由现有抗体结合位点未达到的靶和新表位。
本发明还提供了潜在偏向特定人类群体的成员共同的可变基因使用的多样性，其可用于生成抗体用于治疗和/或预防此类群体内的疾病或状况。这个使抗体库集偏向的能力允许定制抗体治疗剂，目的在于更有效治疗和/或预防特定人类群体中的疾病或医学状况。
本发明人认识到在转基因基因座中提供来自不同来源的免疫球蛋白基因区段的可能性，以便提供由其可以生成抗体治疗剂(和抗体工具试剂)的新型和潜在扩展的抗体多样性。这开放了转基因人-小鼠/大鼠技术询问与迄今为止能够的不同和可能更大的抗体序列空间的可能性的潜力。
在合理设计转基因抗体基因座以及抗体和抗体链中，本发明人还认识到相对长的HCDR3长度(至少20个氨基酸)通常是针对表位所希望的。例如，已从由感染性疾病病原体感染的人中分离天然存在的抗体，此类抗体具有长HCDR3长度。在这方面已发现中和抗体。长HCDR3长度将希望针对其他抗原(例如受体裂缝或酶活性位点)，而不仅仅限于感染性疾病病原体，并且因此本发明人认识到工程化转基因基因座以能够产生长HCDR3抗体和重链的可能性的一般需要性。通过经由1000Genomes计划对超过2000份人DNA样品费力执行生物信息学连同合理序列选择，本发明人鉴定特定人基因区段变体JH6*02的包括对于产生长HCDR3抗体和链是希望的。
另外的合理设计和生物信息学已导致本发明人认识到特定人恒定区变体跨越许多不同人类群体是保守的。本发明人认识到这开放通过在产物中使用此类特定恒定区，而不是任意选择人恒定区(或合成形式的人恒定区)，对人抗体、链和可变结构域作出选择的可能性。本发明的这个方面还使得能够对特定人类种族群体定制基于抗体的药物，从而比迄今为止已进行的更紧密地匹配药物与患者(和因此的疾病设置)。用人恒定区(推测衍生自一个(通常未知的)种族群体或非天然存在的)的任意选择人源化的抗体无法同样在不同人类种族群体的患者中起作用，这在本领域技术水平中可以是问题。这是重要的，因为恒定区具有提供抗体效应子功能的主要作用，例如用于抗体再循环、细胞和补体召募以及用于细胞杀死。
为此，在本发明的第一种配置中，提供了
第一配置
非人脊椎动物或脊椎动物细胞(任选ES细胞或抗体生产细胞)，其包含具有超人免疫球蛋白重链人VH和/或D和/或J基因库集的基因组。
非人脊椎动物或脊椎动物细胞(任选ES细胞或抗体生产细胞)，其包含具有超人免疫球蛋白轻链人VL基因库集的基因组；任选地其中脊椎动物或细胞根据第一配置。
非人脊椎动物或脊椎动物细胞(任选ES细胞或抗体生产细胞)，其基因组包含转基因免疫球蛋白基因座(例如重链基因座或轻链基因座)，所述基因座包含如下所述可操作地连接免疫球蛋白恒定区的上游，根据第一和第二人免疫球蛋白基因区段(任选V区段)的免疫球蛋白基因区段；任选地其中基因组对于所述转基因免疫球蛋白基因座是纯合的；
任选地其中免疫球蛋白基因座所包含的超过功能性V基因区段的天然人互补体；和/或
任选地其中免疫球蛋白基因座所包含的超过功能性D基因区段的天然人互补体；和/或
任选地其中免疫球蛋白基因座所包含的超过功能性J基因区段的天然人互补体。
转基因非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)或脊椎动物细胞(任选ES细胞或抗体生产细胞)，其基因组包含转基因免疫球蛋白基因座，所述基因座包含可操作地连接非人脊椎动物恒定区的上游的多个人免疫球蛋白基因区段，用于产生具有非人脊椎动物恒定区和人可变区的嵌合抗体、或嵌合轻或重链的库集；其中转基因基因座包含一个或多个人免疫球蛋白V基因区段、一个或多个人J基因区段和任选存在的一个或多个人D基因区段，所述基因区段中的第一个(任选V区段)和所述基因区段中的第二个(任选V区段)是不同的，并且分别衍生自第一和第二人类个体的基因组，其中所述个体是不同的；和任选是无关的；
任选地其中免疫球蛋白基因座所包含的超过功能性V基因区段的天然人互补体；和/或
任选地其中免疫球蛋白基因座所包含的超过功能性D基因区段的天然人互补体；和/或
任选地其中免疫球蛋白基因座所包含的超过功能性J基因区段的天然人互补体。
转基因非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)或脊椎动物细胞(任选ES细胞或抗体生产细胞)，其基因组包含第一和第二转基因免疫球蛋白基因座，每个基因座包含可操作地连接非人脊椎动物恒定区的上游的多个人免疫球蛋白基因区段，用于产生具有非人脊椎动物恒定区和人可变区的嵌合抗体、或嵌合轻或重链的库集；
其中(i)第一转基因基因座包含一个或多个人免疫球蛋白V基因区段、一个或多个人J基因区段和任选存在的一个或多个人D基因区段，(ii)第二转基因基因座包含一个或多个人免疫球蛋白V基因区段、一个或多个人J基因区段和任选存在的一个或多个人D基因区段；和(iii)其中所述第一基因座的第一(任选V)基因区段和所述第二基因座的第二(任选V)基因区段是不同的，并且分别衍生自第一和第二人类个体的基因组，其中所述个体是不同的；和任选是无关的；
任选地其中所述第一和第二基因座在所述基因组中的不同染色体上(任选地具有相同染色体编号的染色体)；
任选地其中每个免疫球蛋白基因座所包含的超过功能性V基因区段的天然人互补体；和/或
任选地其中每个免疫球蛋白基因座所包含的超过功能性D基因区段的天然人互补体；和/或
任选地其中每个免疫球蛋白基因座所包含的超过功能性J基因区段的天然人互补体。
构建根据本发明的细胞(例如ES细胞)的方法，所述方法包括：
(a)鉴定(或所述)第一人类个体的基因组序列的功能性V和J(和任选D)基因区段；
(b)鉴定(或所述)第二人类个体的基因组序列的一个或多个功能性V和/或D和/或J基因区段；其中这些另外的基因区段未在第一个体的基因组序列中发现；
(c)和在细胞中构建转基因免疫球蛋白基因座，其中(a)和(b)的基因区段在可操作地连接恒定区上游的基因座中提供。
在一个实施方案中，步骤(b)中的一个或多个基因区段由选自1000Genomes、Ensembl、Genbank和IMGT数据库的免疫球蛋白基因数据库鉴定。
本文中，Genbank是Genbank发行版本号185.0或191.0的提及；1000Genomes数据库是2012年3月16日的第1期，发行版本v3；Ensembl数据库是汇编GRCh37.p8(10/04/2012)；IMGT数据库在www.imgt.org处可获得。
在一个实施方案中，第一和第二人类个体分别是第一和第二种族群体的成员，其中所述群体是不同的，任选地其中衍生自第二个体的基因组序列的人免疫球蛋白基因区段在第二种族群体中是低频率的(任选罕见的)。
本发明的这一配置还提供制备转基因非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)的方法，所述方法包括：
(a)通过执行上述方法构建ES细胞(例如小鼠C57BL/6N、C57BL/6J、129S5或129Sv品系ES细胞)；
(b)将ES细胞注入供体非人脊椎动物胚泡(例如小鼠C57BL/6N、C57BL/6J、129S5或129Sv品系胚泡)内；
(c)将胚泡植入非人脊椎动物代孕母体(例如C57BL/6N、C57BL/6J、129S5或129Sv品系小鼠)内；和
(d)从所述母体获得幼崽，其中所述幼崽的基因组包含转基因免疫球蛋白基因座。
在一个实施方案中，本发明提供了分离结合预定抗原(例如细菌或病毒病原体抗原)的抗体的方法，所述方法包括免疫本发明的非人脊椎动物。
第二配置
抗体产生转基因细胞的文库，所述细胞的基因组共同编码抗体库集，其中
(a)第一转基因细胞表达具有由第一免疫球蛋白基因编码的链的第一抗体，该基因包含在第一人未重排免疫球蛋白基因区段重组后产生的第一可变结构域核苷酸序列；
(b)第二转基因细胞表达具有由第二免疫球蛋白基因编码的链的第二抗体，该第二基因包含在第二人未重排免疫球蛋白基因区段重组后产生的第二可变结构域核苷酸序列，该第一和第二抗体是不相同的；
(c)第一和第二基因区段是不同的且分别衍生自第一和第二人类个体的基因组序列，其中所述个体是不同的；和任选是无关的；
(d)其中所述细胞是非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)细胞。
在一个实施方案中，第一和第二人类个体分别是第一和第二种族群体的成员，其中所述群体是不同的；任选地其中所述种族群体选自1000Genomes数据库中鉴定的那些。
在另一个实施方案中，第二人免疫球蛋白基因区段是第一人免疫球蛋白基因区段的多态性变体；任选地其中第二基因区段选自下表1–7和9–14(例如选自表13或表14)中任一个中的基因区段，例如第二基因区段是VH1-69的多态性变体。
第三配置
分离的抗体，其具有
(a)由核苷酸序列编码的重链，所述核苷酸序列通过在转基因非人脊椎动物动物中未重排的人免疫球蛋白V基因区段与人D和人J区段重组后产生，任选伴随在所述细胞中的亲和力成熟，其中所述基因区段之一衍生自来自第一人类种族群体的个体的基因组，并且其他两个基因区段衍生自来自第二不同人类种族群体的个体的基因组，并且其中抗体包含所述非人脊椎动物的重链恒定区(例如啮齿类动物、小鼠或大鼠重链恒定区)；和/或
(b)由核苷酸序列编码的轻链，所述核苷酸序列通过在转基因非人脊椎动物动物中未重排的人免疫球蛋白V基因区段与人J区段重组后产生，任选伴随在所述细胞中的亲和力成熟，其中所述基因区段之一衍生自来自第一人类种族群体(任选与(a)中的第一群体相同)的个体的基因组，并且其他基因区段衍生自来自第二不同人类种族群体(任选与(a)中的第二群体相同)的个体的基因组，并且其中抗体包含所述非人脊椎动物的轻链恒定区(例如啮齿类动物、小鼠或大鼠轻链恒定区)；
(c)任选地，其中抗体的每个可变结构域是人可变结构域。
(d)任选地，其中重链恒定区是γ型恒定区。
本发明还提供了编码抗体的分离的核苷酸序列，任选地其中序列在抗体表达载体中、任选在宿主细胞中提供。
本发明还提供了产生人抗体的方法，所述方法包括用人抗体恒定区置换第三配置的抗体的非人脊椎动物恒定区。
本发明还提供了药物组合物，其包含根据第三配置的抗体、或根据上述方法产生的抗体和稀释剂、赋形剂或载体；任选地，其中组合物在与IV针或注射器连接的容器或者IV袋中提供。
本发明还提供了抗体生产细胞，其表达在任意配置中所述的第二抗体。
在可替代配置中，本发明考虑第一和第二免疫球蛋白基因区段(例如特定人类种系VH或VL基因区段的两种或更多种多态性变体)的核苷酸序列的组合，以提供合成基因区段。在一个实施方案中，此类合成基因区段用于构建转基因免疫球蛋白基因座，其中合成基因区段与可操作地连接恒定区上游的一个或多个人可变和J区(和任选存在的一个或多个人D区)组合提供。当在非人脊椎动物或细胞(例如小鼠或大鼠细胞，例如ES细胞)的基因组中提供时，本发明提供了超人基因区段多样性。待组合的序列可以选自这样的基因区段，其已观察到在针对特定抗原(例如流感抗原，例如血凝素)产生的人抗体中是常用的。通过组合所述序列，合成基因区段可以在体内重组，以产生非常适合于治疗和/或预防由所述抗原介导的疾病或状况(例如流感)的抗体。
第四配置
非人脊椎动物(任选小鼠或大鼠)或脊椎动物细胞，其基因组包含位于恒定区上游的免疫球蛋白重链基因座，其包含人基因区段JH6*02、一个或多个VH基因区段和一个或多个D基因区段；其中重链基因座中的基因区段可操作地连接其恒定区，从而使得小鼠能够产生由人JH6*02与D区段和VH区段重组产生的抗体重链。
非人脊椎动物细胞(任选小鼠细胞或大鼠细胞)，其基因组包含免疫球蛋白重链基因座，其包含位于恒定区上游的人基因区段JH6*02、一个或多个VH基因区段和一个或多个D基因区段；其中重链基因座中的基因区段可操作地连接其恒定区，用于产生(例如在后续后代细胞中)由人JH6*02与D区段和VH区段重组产生的抗体重链。
从本发明的脊椎动物中分离的重链(例如由抗体包含的)，其中所述重链包含具有至少20个氨基酸的HCDR3。
用于产生对靶抗原特异性的重链、VH结构域或抗体的方法，所述方法包括用抗原免疫本发明的非人脊椎动物，且分离对靶抗原特异性的重链、VH结构域或抗体或者产生所述重链、VH结构域或抗体的细胞，其中所述重链、VH结构域或抗体包含衍生自人JH6*02与VH基因区段和D基因区段重组的HCDR3。
由该方法产生的重链、VH结构域或抗体。
表达重链VH结构域的B细胞或杂交瘤，所述重链VH结构域与重链的VH结构域相同。
核酸，其编码权利要求22、23或28的重链的VH结构域或编码所述重链。
载体(例如CHO细胞或HEK293细胞载体)，其包含所述核酸；任选地其中所述载体在宿主细胞(例如CHO细胞或HEK293细胞)中。
药物组合物，其包含所述抗体、重链或VH结构域(例如由抗体包含的)，连同药学可接受的赋形剂、稀释剂或药物(例如进一步的抗原特异性可变结构域、重链或抗体)。
上文抗体、重链或VH结构域(例如由抗体包含的)用于医学。
上文抗体、重链或VH结构域(例如由抗体包含的)在制造用于治疗和/或预防人中医学状况的药物中的用途。
第五配置
产生抗体重链的方法，所述方法包括：
(a)提供抗原特异性重链可变结构域；和
(b)组合所述可变结构域与人重链恒定区以产生包含(在N至C末端方向)可变结构域和恒定区的抗体重链；
其中
人重链恒定区是IGHG1ref、IGHG2ref、IGHG2a、IGHG3ref、IGHG3a、IGHG3b、IGHG4ref或IGHG4a恒定区。
包含人重链的抗体，该重链包含对于抗原特异性的可变结构域和恒定区，所述恒定区是IGHG1ref、IGHG2ref、IGHG2a、IGHG3ref、IGHG3a、IGHG3b、IGHG4ref或IGHG4a恒定区。任选地，所述可变结构域包含小鼠AID模式体细胞突变。
多肽，其包含(在N至C末端方向)前导序列、对于抗原特异性的人可变结构域和人恒定区，所述人恒定区为IGHG1ref、IGHG2ref、IGHG2a、IGHG3ref、IGHG3a、IGHG3b、IGHG4ref或IGHG4a恒定区，其中(i)所述前导序列不是天然人可变结构域前导序列；和/或(ii)所述可变结构域包含小鼠AID模式体细胞突变和/或小鼠末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)模式连接突变。
核苷酸序列，其编码(在5'到3'方向)前导序列和人抗体重链，该重链包含对于抗原特异性的可变结构域和恒定区，所述恒定区是IGHG1ref、IGHG2ref、IGHG2a、IGHG3ref、IGHG3a、IGHG3b、IGHG4ref或IGHG4a恒定区；并且所述前导序列对于所述重链表达是可操作的，并且其中所述前导序列不是天然人可变结构域前导序列。
核苷酸序列，其编码(在5'到3'方向)启动子和人抗体重链，该重链包含对于抗原特异性的可变结构域和恒定区，所述恒定区是IGHG1ref、IGHG2ref、IGHG2a、IGHG3ref、IGHG3a、IGHG3b、IGHG4ref或IGHG4a恒定区；并且启动子对于所述重链表达是可操作的，并且其中所述启动子不是天然人启动子。
载体(例如CHO细胞或HEK293细胞载体)，其包含IGHG1ref、IGHG2ref、IGHG2a、IGHG3ref、IGHG3a、IGHG3b、IGHG4ref或IGHG4a恒定区核苷酸序列，其为用于插入人抗体重链可变结构域核苷酸序列的克隆位点的3'，从而使得在此类可变结构域序列插入后，所述载体包含(在5'到3'方向)启动子、前导序列、可变结构域序列和恒定区序列，从而使得当存在于宿主细胞中时，所述载体能够表达人抗体重链。
第六配置
具有基因组的非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)或非人脊椎动物细胞(例如ES细胞或B细胞)，所述基因组包含相同类型的至少3个人可变区基因区段(例如至少3个人VH6-1基因区段、至少3个人JH6基因区段、至少3个人Vκ1-39基因区段、至少3个人D2-2基因区段或至少3个人Jκ1基因区段)，其中所述人基因区段中的至少两个是彼此不相同的变体。
具有基因组的非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)或非人脊椎动物细胞(例如ES细胞或B细胞)，所述基因组包含在相同Ig基因座处顺式的相同类型的至少2个不同的非内源可变区基因区段(例如至少2个人VH6-1基因区段、至少3个人JH6基因区段、至少2个人Vκ1-39基因区段、至少2个人D2-2基因区段或至少2个人Jκ1基因区段)。
具有基因组的非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)或非人脊椎动物细胞(例如ES细胞或B细胞)，所述基因组包含在相同Ig基因座处反式的相同类型的至少2个不同的人可变区基因区段(例如至少2个人VH6-1基因区段、至少2个人JH6基因区段、至少2个人Vκ1-39基因区段、至少2个人D2-2基因区段或至少2个人Jκ1基因区段)；和任选存在的相同类型的第三人基因区段，其中所述第三基因区段与所述2个不同基因区段之一是顺式的。
包含人可变区基因区段的库集的非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)群体，其中所述多个包含相同类型的至少2个人可变区基因区段(例如至少2个人VH6-1基因区段、至少2个人JH6基因区段、至少2个人Vκ1-39基因区段、至少2个人D2-2基因区段或至少2个人Jκ1基因区段)，所述不同基因区段中的第一个在群体的第一脊椎动物的基因组中提供，并且所述不同基因区段中的第二个在群体的第二脊椎动物的基因组中提供，其中所述第一脊椎动物的基因组不包含所述第二基因区段。
具有基因组的非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)或非人脊椎动物细胞(例如ES细胞或B细胞)，所述基因组包含相同类型的至少2个不同的非内源可变区基因区段(例如至少2个人VH6-1基因区段、至少2个人JH6基因区段、至少2个人Vκ1-39基因区段、至少2个人D2-2基因区段或至少2个人Jκ1基因区段)，其中所述基因区段衍生自不同人类个体的基因组序列，所述人类个体在至少3代以上是遗传学不相关的。
增强非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)的人免疫球蛋白基因多样性的方法，所述方法包括给脊椎动物提供基因组，所述基因组包含相同类型的至少3个人可变区基因区段(例如至少3个人VH6-1基因区段、至少3个人JH6基因区段、至少3个人Vκ1-39基因区段、至少3个人D2-2基因区段或至少3个人Jκ1基因区段)，其中所述人基因区段中的至少两个是彼此不相同的变体。
增强非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)的免疫球蛋白基因多样性的方法，所述方法包括给脊椎动物提供基因组，所述基因组包含在相同Ig基因座处顺式的相同类型的至少2个不同的非内源可变区基因区段(例如至少2个人VH6-1基因区段、至少2个人JH6基因区段、至少2个人Vκ1-39基因区段、至少2个人D2-2基因区段或至少2个人Jκ1基因区段)。
增强非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)的免疫球蛋白基因多样性的方法，所述方法包括给脊椎动物提供基因组，所述基因组包含在相同Ig基因座处反式的相同类型的至少2个不同的人可变区基因区段(例如至少2个人VH6-1基因区段、至少2个人JH6基因区段、至少2个人Vκ1-39基因区段、至少2个人D2-2基因区段或至少2个人Jκ1基因区段)；和任选存在的相同类型的第三人基因区段，其中所述第三基因区段与所述2个不同基因区段之一是顺式的。
提供增强的人免疫球蛋白可变区基因区段库集的方法，所述方法包括提供包含人可变区基因区段的库集的非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)群体，其中所述方法包括提供相同类型的至少2个不同的人可变区基因区段(例如至少2个人VH6-1基因区段、至少2个人JH6基因区段、至少2个人Vκ1-39基因区段、至少2个人D2-2基因区段或至少2个人Jκ1基因区段)，其中所述不同基因区段中的第一个在群体的第一脊椎动物的基因组中提供，并且所述不同基因区段中的第二个在群体的第二脊椎动物的基因组中提供，其中所述第一脊椎动物的基因组不包含所述第二基因区段。
增强非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)的人免疫球蛋白基因多样性的方法，所述方法包括给脊椎动物提供基因组，所述基因组包含相同类型的至少2个不同的非内源可变区基因区段(例如至少2个人VH6-1基因区段、至少2个人JH6基因区段、至少2个人Vκ1-39基因区段、至少2个人D2-2基因区段或至少2个人Jκ1基因区段)，其中所述基因区段衍生自不同人类个体的基因组序列，所述人类个体在至少3代以上是遗传学不相关的。
增强非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)的人免疫球蛋白基因多样性的方法，所述方法包括给脊椎动物提供基因组，所述基因组包含相同类型的至少2个人可变区基因区段(例如至少2个人VH6-1基因区段、至少2个人JH6基因区段、至少2个人Vκ1-39基因区段、至少2个人D2-2基因区段或至少2个人Jκ1基因区段)，其中所述基因区段衍生自不同人类个体的基因组序列，所述人类个体在至少3代以上是遗传学不相关的；任选地其中所述不同基因区段中的至少2或3个在所述基因组中的相同Ig基因座处提供。
具有基因组的非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)或非人脊椎动物细胞(例如ES细胞或B细胞)，所述基因组包含相同类型的第一和第二人Ig基因座基因区段(例如第一和第二人JH6基因区段；或第一和第二人IgG2基因区段；或第一和第二人Jλ7基因区段)，其中所述第一基因区段是选自表1和9–14(例如选自表13或表14)中任何一个的基因区段(例如IGHJ6-a)，并且所述第二基因区段是相应参考序列。
非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)群体，其包含相同类型的第一和第二人Ig基因座基因区段(例如第一和第二人JH6基因区段；或第一和第二人IgG2基因区段；或第一和第二人Jλ7基因区段)，其中所述第一基因区段是选自表1和9–14(例如选自表13或表14)中任何一个的基因区段(例如IGHJ6-a)，并且所述第二基因区段是相应参考序列，其中所述第一基因区段在群体的第一脊椎动物的基因组中提供，并且所述第二基因区段在群体的第二脊椎动物的基因组中提供。
增强非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)的人免疫球蛋白基因多样性的方法，所述方法包括给脊椎动物提供基因组，所述基因组包含相同类型的第一和第二人Ig基因座基因区段(例如第一和第二人JH6基因区段；或第一和第二IgG2基因区段；或第一和第二人Jλ7基因区段)，其中所述第一基因区段是选自表1和9–14(例如选自表13或表14)中任何一个的基因区段(例如IGHJ6-a)，并且所述第二基因区段是相应参考序列。
在这一配置的一个方面，本发明涉及如下文进一步描述的人D基因区段变体。
在这一配置的一个方面，本发明涉及如下文进一步描述的人V基因区段变体。
在这一配置的一个方面，本发明涉及如下文进一步描述的人J基因区段变体。
附图说明
图1–3：示意性举例说明用于产生重组工程(recombineered)BAC载体的方案，以将V基因区段加入小鼠基因组内；
图4：示意性举例说明使用顺序重组酶介导的盒式交换(sRMCE)用于将V基因区段加入小鼠基因组内的方案；和
图5(以4个部分)：仅显示可变(V)编码区的13种IGHV1-69变体的比对。不同于VH1-69变体*01的核苷酸在适当位置处指出，而相同核苷酸用破折号标记。当核苷酸变化导致氨基酸差异时，编码的氨基酸显示在相应三联体上方。如指出的，加框区域对应于CDR1、CDR2和CDR3。
图6示意性举例说明基因区段多样性和根据本发明顺式包括变体的作用：
(a)在正常个人中的情况：在相同染色体上的重组限制变体的组合，例如抗体基因V4-4可以仅在变体1内重组以形成例如V4-4-D-J6或V4-4-D-J2A。类似地，变体V4-4A不能与来自变体1的J6或J2A重组并且仅能够与来自变体2的J基因连接以形成V4-4A-D-J6A和V4-4A-D-J2。V4-4-J2/J6复杂性＝4。
(b)在转基因小鼠中的情况：仅提供一种变体，因此基因组是有限的。V4-4-J6/J2复杂性＝2。
(c)本发明的超级小鼠：变体顺式加入并且因此可以以每一个组合重组，扩展库集。例如，V4-4可以与J6A、J6、J2A或J2重组并且类似地，V4-4A可以与这些相同J基因重组。V4-4-J6/J2复杂性＝8，其在这一简单例子中是个人复杂性的两倍，并且是具有单个变体的小鼠复杂性的4X。
图7：人JH6*02变体的比对。不同于JH6*01的核苷酸在适当位置处指出，而相同氨基酸用破折号标记。当核苷酸变化导致氨基酸差异时，编码的氨基酸显示在上方。登记号(例如J00256)显示于IMGT变体名称左侧。
图8：来自多个物种的JH序列的比对。
图9：密码子表
图10：BAC数据库提取物
附表说明
表1:人IgH V多态性变体
表2:人IgH D多态性变体
表3:人IgH J多态性变体
表4:人Ig Vk多态性变体
表5:人Ig Vλ多态性变体
表6:人IgH Jk多态性变体
表7:人IgH Jλ多态性变体
表8:1000基因组计划人类群体
表9:在针对感染性疾病病原体的人抗体应答中的免疫球蛋白基因使用
表10A:人IgH JH5变体出现
表10B:非同义人IgH JH5变体
表11A:人IgH JH6变体出现
表11B:非同义人IgH JH6变体
表12A:人IgH JH2变体出现
表12B:非同义人IgH JH2变体
表13:变体频率分析和人类群体分布
表14:频繁的人变体分布
表15:人基因区段使用：来自首次用于实验的非人脊椎动物的重链库集
表16:人基因区段使用：来自免疫的非人脊椎动物的重链库集
表17:人基因区段使用：来自抗原特异性杂交瘤的重链库集
表18:序列关联表
表19:与人γ恒定区亚型关联的功能概括
表20:在少数人类群体中流行的基因区段
表21:基因组和序列信息
具体实施方式
用于本发明的JH6*02及其他人DNA序列的合适来源对于技术人员将是显而易见的。例如，能够从同意的人供体(例如按照本文实施例的颊拭子样品)中收集DNA样品，由其可以获得合适的DNA序列用于构建本发明的基因座。如技术人员已知的，人DNA的其他来源是商购可得的。可替代地，技术人员能够通过参考本文公开的人Ig基因区段序列的一个或多个数据库来构建基因区段序列。
关于根据本发明的人V、D和J基因区段的示例来源是得自Roswell Park CancerInstitute(RPCI)/Invitrogen的细菌人工染色体(RPCI-11BAC)。参见http:// bacpac.chori.org/hmale11.htm，其如下描述了BAC：
"RPCI-11人男性BAC文库
RPCI-11人男性BAC文库(Osoegawa等人，2001)使用由Kazutoyo Osoegawa开发的改善的克隆技术(Osoegawa等人，1998)进行构建。该文库由Kazutoyo Osoegawa生成。构建通过来自National Human Genome Research Institute(NHGRI，NIH)(#1R01RG01165-03)的基金资助。该文库根据新的NHGRI/DOE"Guidance on Human Subjects in Large-ScaleDNA Sequencing...来生成
“男性血液经由双盲法选择方案来获得。男性血液DNA从一个随机选择的供体(在10个男性供体中)中分离”。
·Osoegawa K，Mammoser AG，Wu C，Frengen E，Zeng C，Catanese JJ，de JongPJ；Genome Res.2001Mar；11(3):483-96；"A bacterial artificial chromosome libraryfor sequencing the complete human genome"；
·Osoegawa，K.，Woon，P.Y.，Zhao，B.，Frengen，E.，Tateno，M.，Catanese，J.J和deJong，P.J.(1998)；"An Improved Approach for Construction of BacterialArtificial Chromosome Libraries"；Genomics 52，1-8.
超人免疫球蛋白基因库集
本发明涉及合成扩展和种族多样的超人免疫球蛋白基因库集。人免疫球蛋白库集超出在自然界中发现的那些(即“超人的”)，例如，它们比天然人库集更多样或它们包含以并非自然的方式来自不同来源的人免疫球蛋白基因区段的组合。因此，本发明的库集是“超人”免疫球蛋白库集，并且本发明涉及这些在转基因细胞和非人脊椎动物中的应用，用于产生嵌合抗体(具有使用重组DNA技术将这些转换成全人分离抗体的可能性)。本发明因此提供了新型和潜在扩展的合成免疫球蛋白多样性，其提供可以从其中选择人抗体治疗剂前导物(抗体治疗剂和抗体工具试剂)的多样性库。这开放了转基因人-小鼠/大鼠技术询问与迄今为止能够的不同和可能更大的抗体序列空间的可能性的潜力。为此，在一个实施方案中，本发明提供了SUPERHUMAN MOUSETM(也称为SUPRA-MOUSETM)和SUPERHUMAN RATTM(也称为SUPRA-RATTM)。
在开发这一想法中，本发明人已认识到由于诸如HapMap Project、1000GenomesProject和各种各样其他免疫球蛋白基因数据库(关于更多细节参见下文)的努力，采掘技术人员现在可获得的巨大遗传资源的可能性。因此，在一些实施方案中，本发明人认识到这些基因组测序发展在本发明中的应用，以生成合成产生和种族多样的人工免疫球蛋白基因库集。在一个方面，本发明人认识到此类库集可用于产生具有改善的亲和力和/或生物物理学特征的抗体，和/或其中借助于此类库集产生的表位特异性范围是新型的，提供了针对迄今为止由现有转基因免疫球蛋白基因座难解决或难以针对的表位的抗体。
本发明提供了文库、脊椎动物和细胞，例如转基因小鼠或大鼠或者转基因小鼠或大鼠细胞。此外，本发明涉及使用脊椎动物分离抗体或编码抗体的核苷酸序列的方法。本发明还提供了抗体、核苷酸序列、药物组合物和用途。
变异分析
本发明人已认识到利用遗传变异分析的能力的方法和抗体基因座设计。参考人基因组提供了用于人样品的实验工作和遗传分析的基础。参考人是来自少数个体的基因组的汇集，并且对于基因组的任何一个区段，关于两个染色体之一的高质量单个参考基因组是可获得的。因为参考基因组由一系列非常大型的插入克隆装配，所以这些克隆的身份是已知的。相应地，使用人基因组DNA的实验工作通常对参考序列由其衍生的克隆进行。
个别人在其序列中不同，并且近期几个个体已测序其基因组，例如James Watson和Craig Venter。这些个体的基因组序列的比较已揭示在基因组的编码和非编码部分中其序列和参考基因组之间的差异，大约1000个碱基中的1个是不同的。一些变体将是有意义的并且促成个体间差异。在极端情况下，这些将导致遗传疾病。变异可以牵涉对施用于人类患者的药物的不同应答，例如获得针对治疗的患者应答的不希望有的降低。
1000-Genomes Project具有鉴定人基因组中最频繁变异的目的。这一公共领域计划涉及测序来自不同种族群的超过1000个个体的基因组，比较这些序列与参考，并且装配变体目录。这已使编码区中的变体注释成为可能，但因为该序列未衍生自DNA的大克隆，所以来自二倍体个体的序列分析不能区分母系和父系遗传的染色体之间的变异分布。当在蛋白质编码基因中鉴定超过一种变体时，不能阐明蛋白质的每种形式中的变体分布模式。例如，如果在个体中的相同蛋白质的不同位置中检测到两种变体，则这可以导致具有两种变体的一个拷贝和另一个中无变体，或每个拷贝可以仅具有一种变体。为了阐明真实蛋白质的序列，1000-Genome Project已测序母代-父代体-子代三体组。这允许使序列变体“分阶段”，换言之鉴定由一个或另一个亲本遗传的序列块且使变体解卷积。
为了进一步理解在1000-基因组集合内的变异，已开发了工具，其可以鉴定来自1000基因组数据集中的分阶段数据的DNA区域的显著变体(定义为非同义氨基酸变化)。该工具已可在线获得http://www.1000genomes.org/variation-pattern-finder。该工具允许研究者下载在特定坐标之间分隔的非同义变异。下载文件配置为个体基因型，但数据是分阶段的，因此可以提取不同群体中的单倍型信息和特定单倍型的频率。
本发明人的1000-基因组数据关于来自重和轻链的C、V D和J基因的个别人编码区段分析揭示在这些区段中存在显著变异。个体通常具有两个不同的重链等位基因，以及在κ和λ基因座处的不同轻链等位基因。可以由每个等位基因生成的抗体库集将是不同的。该变异将促成对某些抗原更好或不同的免疫应答。
迄今为止已用免疫球蛋白重和轻链基因座生成的人源化小鼠含有仅一个类型的免疫球蛋白基因座。即使这些小鼠含有全人重链基因座，变异也将小于通常人中含有的，因为仅可获得一组C、V、D和J基因，而通常人将含有两组。
本发明人已设计改善当构建转基因非人脊椎动物和细胞用于体内人抗体和可变区生产时的这种局限性的方法。
可以生成具有两个不同基因座的小鼠，每个基因座工程化为具有V、D和J区段的不同库集。这可以在单个小鼠或者两个或更多个分开小鼠品系中，并且将类似于或超出在正常人中发现的库集。此类小鼠的工程化将超越在迄今为止的仅具有一组等位基因的人源化小鼠中所述的库集。
然而，本发明人也认识到这也具有局限性，因为不同基因座通常将不相互作用以改组基因座之间的V、D和J变体。该相同局限性在人中也是固有的，因此该系统不利用所有组合的重组变体的优点。
为了超越人中的正常库集并且利用C、V、D和J变体的组合的优点，在一个实施方案中，本发明人决定提供以顺式在相同染色体上的这些变体。参见图6。这些基因座特征在于具有超过正常数目的J、D或V基因。例如，对于J基因，n＝6，但包括一个J6变体和一个J2变体将使这增加至n＝8。例如，这可以与关于D和V基因的另外变体组合。通过1000-Genomes数据库的详细分析，本发明人已设计候选多态人变体基因区段例如JH基因区段(例如参见实施例)的集合，其可以构建到小鼠中的转基因重和轻链基因座的设计内，用于表达越来越多样和新的合成人可变区库集。此外，通过利用天然存在的人变体基因区段，按照本发明的实施方案，这解决与人类患者的相容性，因为本发明人的分析已抽出这样的候选变体，其是天然保守的并且有时在人类种族群体中是非常流行的。另外，这使得能够定制本发明的配置以提供更好地针对特定人类种族群体的基于抗体的药物。
在根据本发明的任何配置的例子中，提供了基因座(以及包含这些的细胞和脊椎动物)，在其中使用来自不同人类群体的基因区段。这是增加抗体基因多样性所希望的，以更好地针对更多样的人类患者。在一个例子中，所述基因区段分别来自第一和第二不同人类群体，并且因此第二基因区段在第二人类群体中发现，但在第一人类群体中则没有(或罕见)。罕见意指例如基因区段在1000Genomes数据库中的第一群体中的5、4、3、2或1或零个个体中发现。例如，所述第一基因区段可以通过参考本文的表13或14显示为存在于第一群体中，第二基因区段可以通过参考表13显示为存在于第二群体中而不存在于第一群体中。任选地，所述第一基因区段还可以通过参考表13或14显示为存在于第二群体中。
在本发明的任何配置或方面，当使用V基因区段时，这可以任选与天然前导序列一起使用。例如，基因组DNA(例如来自如实施例中的BAC)的使用将意指天然前导区将用于掺入本发明的基因座和基因组内的每个V基因区段。在替代方案中，技术人员将希望插入非天然前导序列连同V基因区段中的一个或多个。类似地，在本发明的任何配置或方面，当使用V基因区段时，这可以任选与天然5'UTR序列一起使用。例如，基因组DNA(例如来自如实施例中的BAC)的使用将意指天然5'UTR序列将用于掺入本发明的基因座和基因组内的每个V基因区段。在替代方案中，技术人员可能希望排除天然5'UTR序列。
在第一配置中，本发明提供了
(a)超人重链基因库集
非人脊椎动物或脊椎动物细胞(任选ES细胞或抗体生产细胞)，其包含具有超人免疫球蛋白重链人VH和/或D和/或J基因库集的基因组。
在一个方面，本发明的细胞是胚胎干细胞。例如，ES细胞衍生自小鼠C57BL/6N、C57BL/6J、129S5或129Sv品系。在一个方面，非人脊椎动物是啮齿类动物，适当地小鼠，并且本发明的细胞是啮齿类动物细胞或ES细胞，适当地小鼠ES细胞。本发明的ES细胞可以使用本领域众所周知的技术用于生成动物，所述技术包括将ES细胞注射到胚泡内，随后将嵌合胚泡植入雌性内以产生后代，所述后代可以进行育种且选择具有所需插入的纯合重组体。在一个方面，本发明涉及包含ES细胞衍生的组织和宿主胚胎衍生的组织的转基因动物。在一个方面，本发明涉及遗传改变的后代动物，其包括对于VDJ和/或VJ区具有纯合重组体的动物。
天然人免疫球蛋白基因区段库集由下述组成(参见例如www.imgt.org)：
VH：总共125；有功能的41
DH：总共27；有功能的23
JH：总共8；有功能的6
Vk：总共77；有功能的38
Jk：总共5；有功能的5
Vλ：总共75；有功能的31
Jλ：总共7；有功能的5
在一个实施方案中，脊椎动物或细胞基因组包含转基因免疫球蛋白重链基因座，其包含多个人免疫球蛋白VH基因区段、一个或多个人D基因区段和一个或多个人J基因区段，其中所述多个VH基因区段的组成超过功能性VH基因区段的天然人库集；任选地其中所述基因组对于所述转基因重链基因座是纯合的。
在脊椎动物或细胞的一个实施方案中，VH基因库集由下述组成：衍生自第一人类个体的基因组序列的多个VH基因区段，补充有衍生自第二不同人类个体的基因组序列的一个或多个不同VH基因区段。任选地，D和J区段衍生自第一人类个体的基因组序列。任选地，来自第二个体的基因组序列的VH基因区段选自在表1、13或14中列出的VH基因区段。以这种方式，基因座提供D基因区段的超人库集。
任选地，个体是无关的。例如，如果个体之一不在相同代或者回溯一、二、三或四代的其他个体的家谱中出现，则个体在本发明的任何配置或方面的上下文中是“无关的”。可替代地，例如，如果它们在目前这一代或者回溯一、二、三或四代中不共享共同祖先，则它们是无关的。
在脊椎动物或细胞的一个实施方案中，转基因基因座包含超过41个功能性人VH基因区段种类，并且因此包含超过天然的人功能库集。任选地，所述基因座包含至少42、43、44、45、46、47、48、49或50个功能性人VH基因区段种类(例如，其中所述基因座包含所述第一个体的全部功能性VH库集，补充有衍生自第二人类个体的基因组序列的一个或多个VH基因区段且任选补充有衍生自第三人类个体的基因组序列的一个或多个VH基因区段)。以这种方式，所述基因座提供VH基因区段的超人库集，其可用于生成新型基因和抗体多样性用于治疗和工具抗体选择。
在脊椎动物或细胞的一个实施方案中，所述转基因基因座包含衍生自第一个体的基因组序列的第一VH基因区段和衍生自第二个体的基因组序列的第二VH基因区段，其中所述第二VH基因区段是第一VH基因区段的多态性变体。例如，VH基因区段是如下文实施例中举例说明的VH1-69的多态性变体。任选地，所述基因座包含第一VH基因区段的进一步多态性变体(例如衍生自第三人类个体的基因组序列的变体)。以这种方式，所述基因座提供VH基因区段的超人库集。
在脊椎动物或细胞的一个实施方案中，基因组(对于超人VH多样性可替代或另外地)包含转基因免疫球蛋白重链基因座，其包含多个人免疫球蛋白VH基因区段、多个人D基因区段和一个或多个人J基因区段，其中所述多个D基因区段的组成超过功能性D基因区段的天然人库集。任选地，所述基因组对于所述转基因重链基因座是纯合的。
在脊椎动物或细胞的一个实施方案中，D基因库集由下述组成：衍生自(或所述)第一人类个体的基因组序列的多个D基因区段，补充有衍生自(或所述)第二不同人类个体的基因组序列的一个或多个不同D基因区段。任选地，所述个体是无关的。任选地，J区段衍生自第一人类个体的基因组序列。任选地，来自第二个体的基因组序列的D基因区段选自在表2、13或14中列出的D基因区段。以这种方式，所述基因座提供D基因区段的超人库集。
在脊椎动物或细胞的一个实施方案中，转基因基因座包含超过23个功能性人D基因区段种类；任选地，其中所述基因座包含至少24、25、26、27、28、29、30或31个功能性人D基因区段种类(例如，其中所述基因座包含所述第一个体的全部功能性D库集，补充有衍生自第二人类个体的基因组序列的一个或多个D基因区段且任选补充有衍生自第三人类个体的基因组序列的一个或多个D基因区段)。以这种方式，所述基因座提供D基因区段的超人库集。
在脊椎动物或细胞的一个实施方案中，转基因基因座包含衍生自第一个体的基因组序列的第一D基因区段和衍生自第二个体的基因组序列的第二D基因区段，其中所述第二D基因区段是第一D基因区段的多态性变体。任选地，所述基因座包含第一D基因区段的进一步多态性变体(例如衍生自第三人类个体的基因组序列的变体)。以这种方式，所述基因座提供D基因区段的超人库集。
在脊椎动物或细胞(对于超人VH和/或JH多样性可替代或另外地)的一个实施方案中，基因组包含(或所述)转基因免疫球蛋白重链基因座，其包含多个人免疫球蛋白VH基因区段、一个或多个人D基因区段和多个人JH基因区段，其中所述多个J基因区段的组成超过功能性J基因区段的天然人库集；任选地，其中所述基因组对于所述转基因重链基因座是纯合的。
在脊椎动物或细胞的一个实施方案中，JH基因库集由下述组成：衍生自(或所述)第一人类个体的基因组序列的多个J基因区段，补充有衍生自(或所述)第二不同人类个体的基因组序列的一个或多个不同J基因区段。任选地，所述个体是无关的。任选地，D区段衍生自第一人类个体的基因组序列。任选地，来自第二个体的基因组序列的J基因区段选自在表3、13或14中列出的J基因区段。以这种方式，所述基因座提供JH基因区段的超人库集。
在脊椎动物或细胞的一个实施方案中，转基因基因座包含超过6个功能性人JH基因区段。任选地，所述基因座包含至少7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个功能性人JH基因区段(例如，其中所述基因座包含所述第一个体的全部功能性JH库集，补充有衍生自第二人类个体的基因组序列的一个或多个JH基因区段且任选补充有衍生自第三人类个体的基因组序列的一个或多个JH基因区段)。以这种方式，所述基因座提供JH基因区段的超人库集。
在脊椎动物或细胞的一个实施方案中，转基因基因座包含衍生自第一个体的基因组序列的第一JH基因区段和衍生自第二个体的基因组序列的第二JH基因区段，其中所述第二JH基因区段是第一JH基因区段的多态性变体。任选地，所述基因座包含第一JH基因区段的进一步多态性变体(例如衍生自第三人类个体的基因组序列的变体)。以这种方式，所述基因座提供JH基因区段的超人库集。
(b)超人轻链基因库集
本发明的第一配置还提供了：
非人脊椎动物或脊椎动物细胞(任选ES细胞或抗体生产细胞)，其包含具有超人免疫球蛋白轻链人VL基因库集的基因组。任选地，该脊椎动物或细胞包含根据第一配置的方面(a)的重链转基因。因此，超人多样性在细胞和脊椎动物中的重和轻链免疫球蛋白基因区段两者中提供。例如，细胞或脊椎动物的基因组对于重和轻链转基因是纯合的并且内源抗体表达失活。此类脊椎动物可用于用预定抗原免疫以产生一种或多种所选抗体，其结合所述抗原且具有得自超人基因区段库集内的重组的人可变区。这潜在提供了从其中选择治疗、预防和工具抗体的新型抗体和基因序列空间。
在第一配置的方面(b)的一个实施方案中，脊椎动物或细胞基因组包含
(i)转基因免疫球蛋白κ轻链基因座，其包含多个人免疫球蛋白Vκ基因区段和一个或多个人J基因区段，其中所述多个Vκ基因区段的组成超过功能性Vκ基因区段的天然人库集；任选地，其中所述基因组对于所述转基因κ轻链基因座是纯合的；和/或
(ii)转基因免疫球蛋白λ轻链基因座，其包含多个人免疫球蛋白Vλ基因区段和一个或多个人J基因区段，其中所述多个Vλ基因区段的组成超过功能性Vλ基因区段的天然人库集；任选地，其中所述基因组对于所述转基因λ轻链基因座是纯合的。
以这种方式，所述基因座提供VL基因区段的超人库集。
在脊椎动物或细胞的一个实施方案中，
(i)Vκ基因库集由下述组成：衍生自第一人类个体的基因组序列的多个Vκ基因区段，补充有衍生自第二不同人类个体的基因组序列的一个或多个Vκ基因区段；任选地，其中所述个体是无关的；任选地，其中J区段衍生自第一人类个体的基因组序列；和任选地，其中来自第二个体的基因组序列的Vκ基因区段选自在表4、13或14中列出的Vκ基因区段；和
(i)Vλ基因库集由下述组成：衍生自第一人类个体的基因组序列的多个Vλ基因区段，补充有衍生自第二不同人类个体的基因组序列的一个或多个Vλ基因区段；任选地，其中所述个体是无关的；任选地，其中J区段衍生自第一人类个体的基因组序列；和任选地，其中来自第二个体的基因组序列的Vλ基因区段选自在表5、13或14中列出的Vλ基因区段。
以这种方式，所述基因座提供VL基因区段的超人库集。
在脊椎动物或细胞的一个实施方案中，
-κ轻链转基因基因座包含超过38个功能性人Vκ基因区段种类；任选地，其中所述基因座包含至少39、40、41、42、43、44、45、46、47或48个功能性人Vκ基因区段种类(例如，其中所述基因座包含所述第一个体的全部功能性Vκ库集，补充有衍生自第二人类个体的基因组序列的一个或多个Vκ基因区段且任选补充有衍生自第三人类个体的基因组序列的一个或多个Vκ基因区段)；和
-λ轻链转基因基因座包含超过31个功能性人Vλ基因区段种类；任选地，其中所述基因座包含至少32、33、34、35、36、37、38、39、40或41个功能性人Vλ基因区段种类(例如，其中所述基因座包含所述第一个体的全部功能性Vλ库集，补充有衍生自第二人类个体的基因组序列的一个或多个Vλ基因区段且任选补充有衍生自第三人类个体的基因组序列的一个或多个Vλ基因区段)。
以这种方式，所述基因座提供VL基因区段的超人库集。
在脊椎动物或细胞的一个实施方案中，
-κ轻链转基因基因座包含衍生自第一个体的基因组序列的第一Vκ基因区段和衍生自第二个体的基因组序列的第二Vκ基因区段，其中所述第二Vκ基因区段是第一Vκ基因区段的多态性变体；任选地，其中所述基因座包含第一Vκ基因区段的进一步多态性变体(例如衍生自第三人类个体的基因组序列的变体)；和
-λ轻链转基因基因座包含衍生自第一个体的基因组序列的第一Vλ基因区段和衍生自第二个体的基因组序列的第二Vλ基因区段，其中所述第二Vλ基因区段是第一Vλ基因区段的多态性变体；任选地，其中所述基因座包含第一Vλ基因区段的进一步多态性变体(例如衍生自第三人类个体的基因组序列的变体)。
以这种方式，所述基因座提供VL基因区段的超人库集。
在脊椎动物或细胞的一个实施方案中，基因组包含(或所述)转基因免疫球蛋白轻链基因座，其包含多个人免疫球蛋白VL基因区段和多个人JL基因区段，其中所述多个J基因区段的组成超过功能性J基因区段的天然人库集；任选地，其中所述基因组对于所述转基因重链基因座是纯合的。
在脊椎动物或细胞的一个实施方案中，
(i)Jκ基因库集由下述组成：衍生自(或所述)第一人类个体的基因组序列的多个Jκ基因区段，补充有衍生自(或所述)第二不同人类个体的基因组序列的一个或多个Jκ基因区段；任选地，其中所述个体是无关的；任选地，其中Vκ区段衍生自第一人类个体的基因组序列；任选地，其中来自第二个体的基因组序列的Jκ基因区段选自在表6、13或14中列出的Jκ基因区段；和
(ii)Jκ基因库集由下述组成：衍生自(或所述)第一人类个体的基因组序列的多个Jλ基因区段，补充有衍生自(或所述)第二不同人类个体的基因组序列的一个或多个Jλ基因区段；任选地，其中所述个体是无关的；任选地，其中Vλ区段衍生自第一人类个体的基因组序列；任选地，其中来自第二个体的基因组序列的Jλ基因区段选自在表7、13或14中列出的Jλ基因区段。
以这种方式，所述基因座提供JL基因区段的超人库集。
在脊椎动物或细胞的一个实施方案中，
(i)转基因轻链基因座包含超过5个功能性人Jκ基因区段种类；任选地，其中所述基因座包含至少6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个功能性人Jκ基因区段种类(例如，其中所述基因座包含所述第一个体的全部功能性Jκ库集，补充有衍生自第二人类个体的基因组序列的一个或多个Jκ基因区段且任选补充有衍生自第三人类个体的基因组序列的一个或多个Jκ基因区段)；和/或
(i)转基因轻链基因座包含超过5个功能性人Jλ基因区段种类；任选地，其中所述基因座包含至少6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个功能性人Jλ基因区段种类(例如，其中所述基因座包含所述第一个体的全部功能性Jλ库集，补充有衍生自第二人类个体的基因组序列的一个或多个Jλ基因区段且任选补充有衍生自第三人类个体的基因组序列的一个或多个Jλ基因区段)。
以这种方式，所述基因座提供JL基因区段的超人库集。
在脊椎动物或细胞的一个实施方案中，
(i)κ轻链转基因基因座包含衍生自第一个体的基因组序列的第一Jκ基因区段和衍生自第二个体的基因组序列的第二Jκ基因区段，其中所述第二Jκ基因区段是第一Jκ基因区段的多态性变体；任选地，其中所述基因座包含第一Jκ基因区段的进一步多态性变体(例如衍生自第三人类个体的基因组序列的变体)；和
(ii)λ轻链转基因基因座包含衍生自第一个体的基因组序列的第一Jλ基因区段和衍生自第二个体的基因组序列的第二Jλ基因区段，其中所述第二Jκ基因区段是第一Jλ基因区段的多态性变体；任选地，其中所述基因座包含第一Jλ基因区段的进一步多态性变体(例如衍生自第三人类个体的基因组序列的变体)。
以这种方式，所述基因座提供JL基因区段的超人库集。
第一配置的进一步方面在下文描述。
在第二配置中，本发明提供了
其基因组共同编码抗体库集的抗体产生转基因细胞的文库，其中
(a)第一转基因细胞表达具有由第一免疫球蛋白基因编码的链(例如重链)的第一抗体，该基因包含在第一人未重排免疫球蛋白基因区段(例如VH)重组后产生的第一可变结构域核苷酸序列中；
(b)第二转基因细胞表达具有由第二免疫球蛋白基因编码的链(例如重链)的第二抗体，该第二基因包含在第二人未重排免疫球蛋白基因区段(例如VH)重组后产生的第二可变结构域核苷酸序列中，该第一和第二抗体是不相同的；
(c)第一和第二基因区段是不同的且分别衍生自第一和第二人类个体的基因组序列，其中所述个体是不同的；和任选是无关的；
(d)其中所述细胞是非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)细胞(例如B细胞或杂交瘤)。
在一个实施方案中，文库在体外提供。在另一个实施方案中，文库通过一种或多种转基因非人脊椎动物在体内提供。例如，该脊椎动物或每个脊椎动物根据本发明的第一配置的任何方面。
在一个实施方案中，文库编码具有10-109种抗体的抗体库集，例如10、20、30、40、50、100或1000-108；或10、20、30、40、50、100或1000-107；或10、20、30、40、50、100或1000-106；或10、20、30、40、50、100或1000-105；或10、20、30、40、50、100或1000-104种抗体。在一个例子中，文库编码具有至少103、104、105、106、107、108、109或1010种抗体的抗体库集。
第一可变结构域核苷酸序列在第一人未重排免疫球蛋白基因区段与一个或多个其他免疫球蛋白基因区段(例如人免疫球蛋白基因区段)重组后产生。例如，当第一基因区段是VH时，第一可变结构域核苷酸序列(VH结构域)在VH与人D和JH区段在第一转基因细胞或其祖先中体内重组后产生，任选伴随体细胞超变。例如，当第一基因区段是VL时，第一可变结构域核苷酸序列(VL结构域)在VL与人JL区段在第一转基因细胞或其祖先中体内重组后产生，任选伴随体细胞超变。
第二可变结构域核苷酸序列在第二人未重排免疫球蛋白基因区段与一个或多个其他免疫球蛋白基因区段(例如人免疫球蛋白基因区段)重组后产生。例如，当第二基因区段是VH时，第二可变结构域核苷酸序列(VH结构域)在VH与人D和JH区段在第二转基因细胞或其祖先中体内重组后产生，任选伴随体细胞超变。例如，当第二基因区段是VL时，第二可变结构域核苷酸序列(VL结构域)在VL与人JL区段在第二转基因细胞或其祖先中体内重组后产生，任选伴随体细胞超变。
所述第一和第二基因区段分别衍生自第一和第二人类个体的基因组序列。在一个例子中，此类基因区段从样品细胞中分离或克隆，所述样品细胞使用如技术人员已知的标准分子生物学技术取自所述个体。基因区段的序列可以在本发明中使用前进行突变(例如通过引入高达5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸变化)。在另一个例子中，基因区段通过在数据库中鉴定候选人免疫球蛋白基因区段而衍生(参见下文指导)并且编码用于本发明的基因区段的核苷酸序列通过参考(例如与参考序列相同或具有高达5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸变化的突变体)数据库序列进行制备。技术人员将知道通过参考数据库或通过得自细胞样品来获得核苷酸序列的方法。
在本发明的任何配置的脊椎动物、细胞或文库的一个实施方案中，所述第一和第二人类个体分别是第一和第二种族群体的成员，其中所述群体是不同的。因此，这提供了在按照本发明的转基因基因座、细胞和脊椎动物中的超人基因多样性。
人类群体
任选地，种族群体选自1000Genomes Project数据库中鉴定的那些。在这方面，参见表8，其提供1000Genomes基因组数据库基于其的种族群体的细节。
N A Rosenberg等人(Science 20December 2002：第298卷no.5602 2342-2343)研究不同地理祖先的人类群体的遗传结构。总之，取样52个群体，这些是具有下述的群体：
非洲祖先
(姆巴提俾格米人、Biaka俾格米人、和说尼日尔-科尔多凡语言的人(班图人、约鲁巴人或Mandenka群体)，
欧亚祖先
(欧洲祖先(奥克尼人、阿地盖人、巴斯克人、法国人、俄罗斯人、意大利人、撒丁岛人、托斯卡尼人)、中东祖先(莫札比特人、贝多因人、德鲁兹人、巴勒斯坦人)，
中/南亚祖先(俾路支人、Brahul、莫克兰人、信德人、帕坦人、布鲁肖人、哈扎拉人、维吾尔人、卡拉什人))，
东亚祖先
(汉人、傣人(Dal)、达斡尔人、赫哲人、拉祜人、苗人、鄂伦春人、畲人、土家人、土人、锡伯人、彝人、蒙古人、纳西人、柬埔寨人、日本人、雅库特人)、大洋洲祖先(美拉尼西亚人、巴布亚人)；或
美洲祖先
(卡利吉亚纳人、苏瑞人、哥伦比亚人、玛雅人、比马人)。
International HapMap Project，Nature，2003 Dec 18；426(6968):789-96公开了HapMap Project的目标：通过测定来自具有来自非洲、亚洲和欧洲部分的祖先的群体的DNA样品中的一百万或更多种序列变体的基因型、其频率和它们之间的相关程度来测定人基因组中的DNA序列变异的常见模式。不同地理祖先的有关人类群体包括约鲁巴人、日本人、中国人、北欧和西欧群体。更具体而言：
具有北欧或西欧祖先的犹他州群体(样品在1980年由Centre d'Etude duPolymorphisme Humain(CEPH)收集)；
具有来自尼日利亚伊巴丹的约鲁巴人祖先的群体；
具有日本人祖先的群体；和
具有来自中国的中国汉人祖先的群体。
该作者引用较早出版物提出祖先地理是用于取样人类群体的合理基础。
从中选择在本发明中使用的群体的人类群体的合适样品如下：
(a)欧洲祖先
(b)北欧祖先；西欧祖先；托斯卡尼祖先；英国人祖先、芬兰祖先或伊比利亚祖先。
(c)更具体而言，具有北欧和/或西欧祖先的犹他州居民群体；意大利的托斯卡尼群体；英格兰和/或苏格兰的英国人群体；芬兰的芬兰群体；或西班牙的伊比利亚群体。
(a)东亚祖先
(b)日本人祖先；中国人祖先或越南人祖先。
(c)更具体而言，日本东京的日本人群体；中国北京的中国汉人群体；西双版纳的中国傣人群体；越南胡志明市的京人群体；或美国科罗拉多州丹佛市的中国人群体。
(a)西非祖先
(b)约鲁巴人祖先；卢西亚人祖先；冈比亚人祖先；或马拉维人祖先。
(c)更具体而言，尼日利亚伊巴丹的约鲁巴人群体；肯尼亚Webuye的卢西亚人群体；冈比亚西区分区的冈比亚人群体；或马拉维布兰太尔的马拉维人群体。
(a)美洲群体
(b)美洲原住民祖先；加勒比黑人祖先；墨西哥人祖先；波多黎各祖先；哥伦比亚祖先；或秘鲁祖先。
(c)更具体而言，美国西南部的非洲祖先群体；密西西比州杰克逊的非裔美国人群体；巴巴多斯的非洲加勒比人群体；加利福尼亚州洛杉矶的墨西哥人祖先群体；波多黎各的波多黎各人群体；哥伦比亚麦德林的哥伦比亚人群体；或秘鲁利马的秘鲁人群体。
(a)南亚祖先
(b)阿洪姆人祖先；卡亚斯塔人(Kayadtha)祖先；Reddy祖先；马拉地人；或旁遮普人祖先。
(c)更具体而言，印度阿萨姆邦的阿洪姆人群体；印度加尔各答的卡亚斯塔人群体；印度海德拉巴的Reddy群体；印度孟买的马拉地人群体；或巴基斯坦拉合尔的旁遮普人群体。
在本发明的任何配置中，在一个实施方案中，每个人类群体选自上文标记“(a)”的群体。
在本发明的任何配置中，在另一个实施方案中，每个人类群体选自上文标记“(b)”的群体。
在本发明的任何配置中，在另一个实施方案中，每个人类群体选自上文标记“(c)”的群体。
在本发明的脊椎动物文库、细胞或文库的一个实施方案中，所述第一和第二种族群体选自具有欧洲祖先的种族群体、具有东亚祖先的种族群体、具有西非祖先的种族群体、具有美洲祖先的种族群体和具有南亚祖先的种族群体。
在本发明的脊椎动物文库、细胞或文库的一个实施方案中，所述第一和第二种族群体选自具有北欧祖先的种族群体；或具有西欧祖先的种族群体；或具有托斯卡尼祖先的种族群体；或具有英国人祖先的种族群体；或具有冰岛祖先的种族群体；或具有芬兰祖先的种族群体；或具有伊比利亚祖先的种族群体；或具有日本人祖先的种族群体；或具有中国人祖先的种族群体；或越南人祖先的种族群体；或具有约鲁巴人祖先的种族群体；或具有卢西亚人祖先的种族群体；或具有冈比亚人祖先的种族群体；或具有马拉维人祖先的种族群体；或具有美洲原住民祖先的种族群体；或具有加勒比黑人祖先的种族群体；或具有墨西哥人祖先的种族群体；或具有波多黎各人祖先的种族群体；或具有哥伦比亚人祖先的种族群体；或具有秘鲁人祖先的种族群体；或具有阿洪姆人祖先的种族群体；或具有卡亚斯塔人祖先的种族群体；或具有Reddy祖先的种族群体；或具有马拉地人的种族群体；或具有旁遮普人祖先的种族群体。
在本发明的脊椎动物、细胞或文库的任何配置的一个实施方案中，衍生自第二个体的基因组序列的人免疫球蛋白基因区段在第二种族群体中是低频率的(任选罕见的)。任选地，人免疫球蛋白基因区段在第二人类群体中，例如如在1000Genomes数据库中，具有0.5％-5％、任选小于0.5％的次要等位基因频率(Minor Allele Frequency，MAF)(累积频率)。
在本发明的脊椎动物、细胞或文库的任何配置的一个实施方案中，第一可变区核苷酸序列通过第一人免疫球蛋白基因区段与第一J基因区段和任选存在的第一D基因区段的重组产生，其中所述第一人免疫球蛋白基因区段是V基因区段并且V、D和J区段衍生自第一人类群体，任选来自第一人类群体的一个个体的基因组。
在本发明的脊椎动物文库、细胞或文库的一个实施方案中，第二可变区核苷酸序列通过第二人免疫球蛋白基因区段与第二J基因区段和任选存在的第二D基因区段的重组产生，其中第二人免疫球蛋白基因区段是衍生自第二群体的V基因区段并且D和/或J区段衍生自第一人类群体，任选地D和J基因区段来自第一人类群体的一个个体的基因组。
在本发明的脊椎动物文库、细胞或文库的一个实施方案中，已与所述第一和第二V基因区段重组的所有D和J区段均为衍生自第一人类群体的D和J区段，任选地D和J基因区段来自第一人类群体的一个个体的基因组。
在文库的一个实施方案中，所述第二人免疫球蛋白基因区段是第一人免疫球蛋白基因区段的多态性变体；任选地，其中所述第二基因区段选自表1–7和9–14(例如选自表13或表14)中任一个中的基因区段。
在文库的一个实施方案中，所述第一和第二人免疫球蛋白基因区段是两个(i)VH基因区段；(ii)D区段；(iii)J区段(任选地两个JH区段、两个Jκ区段或两个Jλ区段)；(iv)恒定区(任选两个γ恒定区，任选两个Cγ-1恒定区)；(v)CH1区；(vi)CH2区；或(vii)CH3区。
所述文库是例如首次用于实验的并且任选具有10或102-109种细胞的文库大小。例如，10、20、30、40、50、100或1000-108；或10、20、30、40、50、100或1000-107；或10、20、30、40、50、100或1000-106；或10、20、30、40、50、100或1000-105；或10、20、30、40、50、100或1000-104种细胞。
所述文库例如已针对预定抗原进行选择并且任选具有10或102-109种细胞的文库大小。例如，10、20、30、40、50、100或1000-108；或10、20、30、40、50、100或1000-107；或10、20、30、40、50、100或1000-106；或10、20、30、40、50、100或1000-105；或10、20、30、40、50、100或1000-104种细胞。
在本发明的文库的一个实施方案中，所述第一和第二细胞分别是第一和第二祖先非人脊椎动物细胞的后代，其中所述第一祖先细胞包括包含所述第一人免疫球蛋白基因区段的基因组；并且所述第二祖先细胞包括包含所述第二人免疫球蛋白基因区段的基因组。
本发明进一步提供了抗体产生转基因细胞的文库，其基因组共同编码抗体库集，其中所述文库包含上文描述的第一和第二祖先细胞。
本发明进一步提供了杂交瘤细胞文库，其通过本发明的文库(例如B细胞文库)与融合配偶体细胞融合产生并且任选具有10或102-109种细胞的文库大小。例如，10、20、30、40、50、100或1000-108；或10、20、30、40、50、100或1000-107；或10、20、30、40、50、100或1000-106；或10、20、30、40、50、100或1000-105；或10、20、30、40、50、100或1000-104种细胞。杂交瘤的产生是技术人员众所周知的。融合配偶体的例子是SP2/0-g14(得自ECACC)、P3XS3-Ag8.S53(得自LGC Standards；CRL-1580)、NS1和NS0细胞。如常规的，可以执行PEG融合或电融合。
在第三配置中，本发明提供了：
分离的抗体，其具有
(a)由核苷酸序列编码的重链，所述核苷酸序列在转基因非人脊椎动物动物中未重排的人免疫球蛋白V基因区段与人D和人J区段重组后产生，任选伴随所述细胞中的亲和力成熟，其中所述基因区段之一(例如VH)衍生自来自第一人类种族群体的个体的基因组，并且其他两个基因区段(例如D和JH)衍生自来自第二(例如分别为第二和第三)不同人类种族群体的个体的基因组，并且其中所述抗体包含所述非人脊椎动物的重链恒定区(例如啮齿类动物、小鼠或大鼠重链恒定区)(例如Cγ)；和/或
(b)由核苷酸序列编码的轻链，所述核苷酸序列在转基因非人脊椎动物动物中未重排的人免疫球蛋白V基因区段与人J区段重组后产生，任选伴随所述细胞中的亲和力成熟，其中所述基因区段之一(例如VL)衍生自来自第一人类种族群体(任选与(a)中的第一群体相同)的个体的基因组，并且其他基因区段(例如JL)衍生自来自第二不同人类种族群体(任选与(a)中的第二群体相同)的个体的基因组，并且其中所述抗体包含所述非人脊椎动物的轻链恒定区(例如啮齿类动物、小鼠或大鼠重链恒定区)；
(c)任选地，其中抗体的每个可变结构域是人可变结构域。
(d)任选地，其中所述重链恒定区是μ或γ型恒定区。
本发明还提供了编码第三配置的抗体的分离的核苷酸序列，任选地其中所述序列在抗体表达载体中、任选在宿主细胞中提供。合适的载体是哺乳动物表达载体(例如CHO细胞载体或HEK293细胞载体)、酵母载体(例如用于在巴斯德毕赤酵母(Picchia pastoris)中表达的载体，或细菌表达载体，例如用于大肠杆菌(E.coli)表达的载体。
本发明还提供了产生人抗体的方法，所述方法包括用人抗体恒定区(例如公开于表13或18中的C变体)置换第三配置的抗体的非人脊椎动物恒定区。技术人员将知道实现这点的标准分子生物学技术。例如，关于标准免疫，参见Harlow，E.&Lane，D.1998，第5版，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Lab.Press，Plainview，NY；以及Pasqualini和Arap，Proceedings of the National Academy of Sciences(2004)101:257-259。抗体的可变区与人恒定区的连接可以通过本领域容易获得的技术实现，例如使用对于技术人员显而易见的常规重组DNA和RNA技术。参见例如Sambrook，J和Russell，D.(2001，第3版)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold Spring HarborLab.Press，Plainview，NY)。
在一个实施方案中，该方法包括进一步制备所述抗体的突变体或衍生物。
本发明还提供了药物组合物，其包含根据第三配置的抗体、或本发明的人抗体和稀释剂、赋形剂或载体；任选地，其中所述组合物在与IV针或注射器连接的容器或者IV袋中提供。
本发明还提供了抗体生产细胞(例如哺乳动物细胞，例如CHO或HEK293；酵母细胞例如巴斯德毕赤酵母；细菌细胞例如大肠杆菌；B细胞或杂交瘤)，其表达第三配置的第二抗体或本发明的分离的抗体。
本发明的第一配置还提供了：
非人脊椎动物或脊椎动物细胞(任选ES细胞或抗体生产细胞)，其基因组包含转基因免疫球蛋白基因座(例如重链基因座或轻链基因座)，所述基因座包含上文与第三配置结合描述的根据第一和第二人免疫球蛋白基因区段(任选V区段)的免疫球蛋白基因区段。所述基因区段可操作地连接免疫球蛋白恒定区的上游；任选地，其中基因组对于所述转基因免疫球蛋白基因座是纯合的。
任选地，所述免疫球蛋白基因座所包含的超过功能性V基因区段的天然人互补体；和/或
任选地，其中所述免疫球蛋白基因座所包含的超过功能性D基因区段的天然人互补体；和/或
任选地，其中所述免疫球蛋白基因座所包含的超过功能性J基因区段的天然人互补体。
以这种方式，在根据本发明的转基因非人脊椎动物或脊椎动物细胞中提供超人免疫球蛋白基因库集。
第一配置还提供了：
转基因非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)或脊椎动物细胞(任选ES细胞或抗体生产细胞)，其基因组包含转基因免疫球蛋白基因座，所述基因座包含可操作地连接非人脊椎动物恒定区的上游的多个免疫球蛋白基因区段，用于产生具有非人脊椎动物恒定区和人可变区的嵌合抗体、或嵌合轻或重链的库集；其中所述转基因基因座包含一个或多个人免疫球蛋白V基因区段、一个或多个人J基因区段和任选存在的一个或多个人D基因区段，所述基因区段中的第一个(任选V区段)和所述基因区段中的第二个(任选V区段)是不同的并且分别衍生自第一和第二人类个体的基因组，其中所述个体是不同的；和任选是无关的；
任选地，其中所述免疫球蛋白基因座所包含的超过功能性V基因区段的天然人互补体；和/或
任选地，其中所述免疫球蛋白基因座所包含的超过功能性D基因区段的天然人互补体；和/或
任选地，其中所述免疫球蛋白基因座所包含的超过功能性J基因区段的天然人互补体。
以这种方式，在根据本发明的转基因非人脊椎动物或脊椎动物细胞中提供超人免疫球蛋白基因库集。
第一配置还提供了：
转基因非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)或脊椎动物细胞(任选ES细胞或抗体生产细胞)，其基因组包含第一和第二转基因免疫球蛋白基因座，每个基因座包含可操作地连接非人脊椎动物恒定区的上游的多个人免疫球蛋白基因区段，用于产生具有非人脊椎动物恒定区和人可变区的嵌合抗体、或嵌合轻或重链的库集；
其中(i)所述第一转基因基因座包含一个或多个人免疫球蛋白V基因区段、一个或多个人J基因区段和任选存在的一个或多个人D基因区段，(ii)所述第二转基因基因座包含一个或多个人免疫球蛋白V基因区段、一个或多个人J基因区段和任选存在的一个或多个人D基因区段；和(iii)其中所述第一基因座的第一(任选V)基因区段和所述第二基因座的第二(任选V)基因区段是不同的并且分别衍生自第一和第二人类个体的基因组，其中所述个体是不同的；和任选是无关的；
任选地，其中所述第一和第二基因座在所述基因组中的不同染色体上(任选地具有相同染色体编号的染色体)；
任选地，其中每个免疫球蛋白基因座所包含的超过功能性V基因区段的天然人互补体；和/或
任选地，其中每个免疫球蛋白基因座所包含的超过功能性D基因区段的天然人互补体；和/或
任选地，其中每个免疫球蛋白基因座所包含的超过功能性J基因区段的天然人互补体。
以这种方式，在根据本发明的转基因非人脊椎动物或脊椎动物细胞中提供超人免疫球蛋白基因库集。
在第一配置的这些实施方案中，所述免疫球蛋白基因区段任选如对于第三配置描述的。
在第一配置的这些实施方案中，基因组任选包含第三免疫球蛋白基因区段(任选V区段)，所述第三基因区段衍生自人类个体，所述人类个体不同于第一(以及任选第二)基因区段衍生自其的个体；任选其中所述第一、第二和第三基因区段是人免疫球蛋白基因区段的多态性变体(例如VH1-69–关于进一步描述参见实施例)。
在第一配置的这些实施方案中，脊椎动物或细胞的基因组任选对于第一、第二和任选的第三基因区段是纯合的，其中所述第一、第二和任选的第三基因区段的拷贝在可操作地连接共同非人脊椎动物恒定区上游的相同染色体上一起提供。
例如，每个第一、第二和任选的第三基因区段是V基因区段。
在一个例子中，本发明的文库通过非人脊椎动物的集合(任选啮齿类动物、小鼠或大鼠的集合)提供；任选地，其中所述集合的第一成员产生所述第一抗体而不是所述第二抗体，并且集合的第二成员产生所述第二抗体(但任选不是所述第一抗体)。因此考虑制备非人脊椎动物，其中不同人基因组已用作在脊椎动物中构建转基因基因座的来源。例如，第一脊椎动物包含转基因重链基因座，其具有仅来自第一(和任选第二)人类群体或个体的基因区段；第二脊椎动物包含转基因重链基因座，其具有仅来自第三(和任选第四)人类群体或个体的基因区段；并且任选地，基于独特或重叠的人类群体基因组，可以类似地构建第三和更多脊椎动物。然而，当作为转基因脊椎动物的混合群体提供时，混合群体提供大于在天然人库集中发现的人免疫球蛋白基因的集合库。这可用于扩展抗体和基因序列空间超出用具有人免疫球蛋白基因座的现有转基因小鼠和大鼠能够的那些。如上文解释的，这些已基于单个人基因组。
在一个实施方案中，非人脊椎动物的集合具有局限于人类群体的人免疫球蛋白基因，所述人类群体在上文提及的相同群体属类“(a)”下集合在一起。这提供了偏向产生在群体属类(a)中流行的人抗体可变区的基因库集并且因此可用于生成关于所述群体成员的抗体治疗剂/预防剂。可替代地，当来自不同人类群体的基因区段在根据本发明的单个转基因中(不一定在脊椎动物的集合中)提供时，不同人类群体例如在上文提及的相同群体属类“(a)”下集合在一起。
本发明还提供了由根据本发明的细胞文库表达的抗体库集。
在本发明的任何配置的非人脊椎动物或细胞中，在一个例子中，转基因基因座的恒定区是所述脊椎动物的内源恒定区(例如内源小鼠或大鼠恒定区，例如来自与非人脊椎动物自身相同的小鼠或大鼠品系)。
本发明还提供了构建根据本发明的细胞(例如ES细胞)的方法，所述方法包括：
(a)鉴定(或所述)第一人类个体的基因组序列的功能性V和J(和任选存在的D)基因区段；
(b)鉴定(或所述)第二人类个体的基因组序列的一个或多个功能性V和/或D和/或J基因区段；其中这些另外的基因区段未在第一个体的基因组序列中发现；
(c)和在细胞中构建转基因免疫球蛋白基因座，其中(a)和(b)的基因区段在可操作地连接恒定区上游的基因座中提供。
任选地，细胞包含根据步骤(a)至(c)构建的重链基因座和/或根据步骤(a)至(c)构建的轻链基因座(κ和/或λ基因座)。
任选地，细胞对于该转基因基因座或每个转基因基因座是纯合的；任选地，其中来自对于所述细胞内源的基因座的抗体表达已失活。这可用于使功能性抗体基因库集和因此的抗体生产局限于具有人可变区的抗体。
任选地，步骤(b)中的一个或多个基因区段从选自1000Genomes、Ensembl、Genbank和IMGT数据库的免疫球蛋白基因数据库鉴定。
任选地，所述第一和第二人类个体分别是第一和第二种族群体的成员，其中所述群体是不同的，任选其中衍生自第二个体的基因组序列的人免疫球蛋白基因区段在第二种族群体中是低频率的(任选罕见的)。
本发明还提供制备转基因非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)的方法，所述方法包括：
(a)通过执行上述方法构建ES细胞(例如小鼠C57BL/6N、C57BL/6J、129S5或129Sv品系ES细胞)；
(b)将ES细胞注入供体非人脊椎动物胚泡(例如小鼠C57BL/6N、C57BL/6J、129S5或129Sv品系胚泡)内；
(c)将胚泡植入非人脊椎动物代孕母体(例如C57BL/6N、C57BL/6J、129S5或129Sv品系小鼠)内；和
(d)从所述母体获得幼崽，其中所述幼崽的基因组包含转基因免疫球蛋白基因座。
本发明提供了由该方法制备的转基因非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)或其后代。本发明还提供了此类非人脊椎动物的群体。
ES细胞显微注射到胚泡内和其后生成转基因小鼠是本领域中的常规实践，并且技术人员知道可用于实现这点的技术。C57BL/6N、C57BL/6J、129S5或129Sv小鼠品系和ES细胞是可容易公开获得的。
本发明还提供了分离结合预定抗原(例如细菌或病毒病原体抗原)的抗体的方法，所述方法包括：
(a)提供根据本发明的脊椎动物(任选小鼠或大鼠)；
(b)用所述抗原(任选其中抗原是感染性疾病病原体的抗原)免疫(例如使用标准初免-加强法)所述脊椎动物；
(c)从脊椎动物中取出B淋巴细胞且选择表达结合所述抗原的抗体的一或多个B淋巴细胞；
(d)任选使所述选择的B淋巴细胞或其后代永生化，任选通过由其产生杂交瘤进行；和
(e)分离由所述B淋巴细胞表达的抗体(例如，以及IgG型抗体)；和
(f)任选产生所述抗体的衍生物或变体。
该方法任选在步骤(e)后进一步包括下述步骤：从所述B淋巴细胞中分离编码结合所述抗原的所述抗体的核酸；任选用编码人或人源化重链恒定区的核苷酸序列交换所述抗体的重链恒定区核苷酸序列且任选亲和力成熟所述抗体的可变区；和任选将所述核酸插入表达载体和任选宿主内。
免疫球蛋白基因区段的生物信息学和选择
还参见关于上文变异分析的讨论。
技术人员将了解人抗体基因序列的来源，例如IMGT(www.imgt.org)、GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)。用于数据库操作的生物信息学工具也是技术人员可容易获得和已知的，例如如由1000Genomes Project/EBI(www.1000genomes.org)可公开获得的。
作为抗体基因区段序列的来源，技术人员还将知道下述可用数据库和资源(包括其更新)：
1.1.Kabat Database(G.Johnson和T.T.Wu，2002；http:// www.kabatdatabase.com)。由E.A.Kabat和T.T.Wu于1966年创建，Kabat数据库公开抗体、T细胞受体、主要组织相容性复合物(MHC)I和II类分子及其他免疫学感兴趣蛋白质的比对序列。可搜索界面由SeqhuntII工具提供，并且一系列效用可用于序列比对、序列亚组分类和变异性作图的生成。还参见Kabat，E.A.,Wu，T.T.，Perry，H.，Gottesman，K.和Foeller，C.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，NIH公开号91-3242,Bethesda，MD，其引入本文作为参考，特别是关于在本发明中使用的人基因区段。
1.2.KabatMan(A.C.R.Martin，2002；http://www.bioinf.org.uk/abs/ simkab.html)。这是对Kabat序列数据库作出简单查询的网页界面。
1.3.IMGT，International ImMunoGeneTics InformationM.-P.Lefranc，2002；http://imgt.cines.fr)。IMGT是整合的信息系统，其专注于所有脊椎动物物种的抗体、T细胞受体和MHC分子。它提供标准化数据的共同门户，所述标准化数据包括核苷酸和蛋白质序列、寡核苷酸引物、基因图、遗传多态性、特异性以及二维(2D)和三维(3D)结构。IMGT包括三个序列数据库(IMGT/LIGM-DB、IMGT/MHC-DB、IMGT/PRIMERDB)、一个基因组数据库(IMGT/GENE-DB)、一个3D结构数据库(IMGT/3Dstructure-DB)和一系列网络资源("IMGT Marie-Paule page")和互动工具。
1.4.V-BASE(I.M.Tomlinson，2002；http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase)。V-BASE是由超过一千种公开序列汇集的所有人抗体种系可变区序列的综合目录。它包括比对软件DNAPLOT(由Hans-Helmar Althaus和Werner Muller开发)的版本，其允许重排的抗体V基因与其最紧密种系基因区段的比对。
1.5.Antibodies—Structure and Sequence(A.C.R.Martin，2002；http:// www.bioinf.org.uk/abs)。该页面概括关于抗体结构和序列的有用信息。它提供了对于Kabat抗体序列数据的查询界面、关于抗体的一般信息、晶体结构和与其他抗体相关信息的链接。它还分配保藏于蛋白质数据库(PDB)中的所有抗体结构的自动化概括。特别有利的是关于抗体可变区的多种编号方案的充分描述和比较。
1.6.AAAAA—AHo's Amazing Atlas of Antibody Anatomy(A.Honegger，2001；http://www.unizh.ch/～antibody)。该资源包括用于结构分析、建模和工程化的工具。它采用用于抗体和T细胞受体序列的综合结构比对的统一方案，并且包括用于抗体分析的Excel宏和图解表示法。
1.7.WAM—Web Antibody Modeling(N.Whitelegg和A.R.Rees，2001；http:// antibody.bath.ac.uk)。由在英国的University of Bath的Centre for ProteinAnalysis and Design托管。使用建立的理论方法的组合，基于AbM包(以前由OxfordMolecular销售)构建抗体Fv序列的3D模型，该网站还包括最新的抗体结构信息。
1.8.Mike's Immunoglobulin Structure/Function Page(M.R.Clark，2001；http://www.path.cam.ac.uk/～mrc7/mikeimages.html)。这些页面提供关于免疫球蛋白结构和功能的教育材料，并且由许多彩色图像、模型和动画举例说明。另外的信息在抗体人源化和Mike Clark's Therapeutic Antibody Human Homology Project上可获得，其旨在使临床功效和抗免疫球蛋白应答与治疗抗体的可变区序列关联。
1.9.The Antibody Resource Page(The Antibody Resource Page，2000；http://www.antibodyresource.com)。该网站将自身描述为“抗体研究和供应商的完整指南”。提供了与氨基酸测序工具、核苷酸抗体测序工具和杂交瘤/细胞培养数据库的链接。
1.9.Humanization bYDesign(J.Saldanha，2000；http:// people.cryst.bbk.ac.uk/～ubcg07s)。该资源提供了关于抗体人源化技术的概述。最有用的特点是超过40种公开的人源化抗体的可搜索数据库(通过序列和文本)，包括关于设计问题、构架选择、构架回复突变和人源化构建体的结合亲和力的信息。
还参见Antibody Engineering Methods and Protocols，Ed.Benny K CLo，Methods in Molecular BiologyTM，Human Press。另外，在http://www.blogsua.com/pdf/ antibody-engineering-methods-and-protocolsantibody-engineering-methods-and- protocols.pdf处。
作为基因组序列变异数据的来源，技术人员还将知道下述可用数据库和资源(包括其更新)：
1.HapMap(The International HapMap Consortium.2003；http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/index.html.en)。HapMap Project是国际计划，其旨在比较不同个体的遗传序列以鉴定含有共享的遗传变体的染色体区域。HapMap www网站提供了鉴定染色体区域和其中的变体的工具，其选项深入到群体水平频率数据。
2.1000Genomes(The 1000Genomes Project Consortium 2010；http://www.1000genomes.org/)。该资源提供关于来自25个不同群体组之一的2500个未鉴定个体的完全基因组序列，目的在于鉴定>1％的基因组变体。网站提供利用在线工具(例如'Variation Pattern Finder')查询数据且下载关于个别群体组的变体数据的能力。
3.Japanese SNP Database(H.Haga等人2002；http://snp.ims.u-tokyo.ac.jp/ index.html)。基于鉴定190,562种人遗传变体的研究，该网站为具有有用特点的基因组变体编目录，用于搜索和概括数据。
能够鉴定在免疫球蛋白基因中分类为低频率的变体或与特定人类种族群体分离的罕见变体。为了该分析的目的，低频率免疫球蛋白基因区段分类为在特定人类群体中具有0.5％-5％的‘次要等位基因频率’(MAF)(累积频率)的基因区段，罕见变体是分类为在特定人类群体中具有小于0.5％的MAF的基因区段。
设想下述生物信息学方案以鉴定用于本发明的人免疫球蛋白基因区段：
(a)鉴定含有目的基因区段的一个或多个基因组区域(‘靶基因组区域’)并且使用匹配由1000Genomes计划或International HapMap计划(或另一种选择的所选人基因数据库)使用的序列装配构建的坐标，计算基因组坐标。
(b)鉴定对先前在(a)中鉴定的基因组区域作图的基因组变体。在每个超级群体和优选亚群中检索关于变体的变体频率，在所述群体中此类数据是可获得的。在HapMap WWW网站上可容易获得的工具和用于1000Genomes Project的VWC工具可用于这个步骤。
(c)过滤来自靶基因组区域的基因组变体的列表，以仅含有分类为‘非同义’单核苷酸多态性(SNP)或基因组‘插入或缺失’(插入缺失)的变体。进一步过滤以包括仅存在于外显子序列中的那些。
(d)关联每个超级群体(例如'欧洲祖先'、'东亚祖先、'西非祖先'、'美洲'和'南亚祖先')中每个鉴定变体的群体频率数据以鉴定与少于两个超级群体分离的那些变体。使所有鉴定的变体与每个亚群(例如'欧洲祖先'超级群体可以细分为群如‘'CEU–具有北欧或西欧祖先的犹他州居民’，‘意大利的TSI托斯卡尼’和‘来自英格兰和苏格兰的英国人’)进一步关联并产生关于超级群体内的变体罕见性的第二评分。
(e)收集显示与特定亚群的分离的一个或多个基因区段用于构建根据本发明的合成基因座。
在本文的一个实施方案中，“种系”指规范种系基因区段序列。
通过1000Genomes数据库的详细分析，本发明人已设计候选多态抗体基因区段变体例如人变体JH基因区段(例如参见实施例4)的集合，其可以构建到小鼠中的转基因重链基因座的设计内用于表达越来越多样和新的合成人可变区库集。为此，本发明提供了下述实施方案。
在第四配置中，本发明提供了
人JH6*02变体的选择
基于人JH6*02的转基因IgH基因座、非人脊椎动物、细胞和抗体
如上文解释的，在设计转基因Ig重链基因座中，本发明人已考虑可得自1000Genomes计划(参见www.1000genomes.org)的巨大的数据量，其分析在许多人类群体中的基因分布，且特别是关于Ig基因区段的数据。本发明人还知道公开于IMGT数据库(参见www.imgt.org)和Ensembl(参见www.ensembl.org)中的人基因区段。本发明人需要作出关于下述的选择：哪些人基因区段包括在这些数据库和本领域已知的人Ig基因区段信息的其他来源包括本文公开的这些其他数据库中存在的大量人基因区段中。当选择人JH基因区段时，本发明人知道人JH6编码相对长的氨基酸序列，并且因此本发明人认为希望包括这用于增加产生具有相对长的HCDR3区的IgH链的机会。具有长HCDR3(根据IMGT命名法至少20个氨基酸)的抗体已显示有效中和多种病原体，包括HIV、流感病毒、疟疾和非洲锥虫。还参考天然存在的骆驼科动物(例如美洲驼或骆驼)的仅重链抗体，其具有长HCDR3用于到达相对无法接近的表位(参见例如EP0937140)。长HCDR3可以形成具有扩展环结构的独特稳定亚结构域，其高出抗体表面以赋予精细特异性。在一些情况下，长HCDR3自身对于表位结合和中和是足够的(Liu，L等人；Journal of Virology.2011.85：8467-8476，引入本文作为参考)。长HCDR3的独特结构允许它与病原体表面上的无法接近结构或广泛糖基化内的关联(cognate)表位结合。在人外周血中，存在含有具有超过24个氨基酸长度的HCDR3的约3.5％天然B抗体或1.9％记忆B IgG抗体(PLoS One.2012；7(5):e36750.Epub 2012May 9；"Humanperipheral blood antibodies with long HCDR3s are established primarily atoriginal recombination using a limited subset of germline genes"；Briney BS等人，引入本文作为参考)(图1)。使用分析指出这些抗体优先使用具有人D2-2、D3-3或D2-15的人JH6(Brinley，BS等人，图2-5)。还参见PLoS One.2011Mar 30；6(3):e16857；Comparison of antibody repertoires produced by HIV-1infection，other chronicand acute infections，and systemic autoimmune disease"；Breden F等人，引入本文作为参考。抗体的所有HCDR3的约20％使用JH6。然而，在这些具有超过24个氨基酸的HCDR3的抗体中，70％使用JH6(Brinley，BS等人，图2)。
本领域存在关于下述的需要：可以制备具有长人HCDR3的抗体和重链的遗传修饰的非人脊椎动物和细胞以及可以选自此类脊椎动物和细胞的抗体、链和VH结构域，其中这些可以针对由长HCDR3更好接近的靶表位。
因此，本发明人在本发明的这一配置中选择包括人JH6基因区段作为其IgH基因座设计中的强制性人基因区段。几种不同的天然存在的人JH6变体是已知的(例如JH6*01至*04以及其他；IMGT命名法)。在决定哪种人JH6变体应包括在转基因IgH基因座设计中时，本发明人考虑这点。一些人JH6变体的比对示于图7中(来自www.imgt.org；破折号指出相同核苷酸；相对于*01变体的核苷酸变化由加下划线的核苷酸显示，并且相应氨基酸变化由加下划线的氨基酸显示；Genbank登记号(发行版本185.0)由前缀J、X、M或A显示)。本发明人使用人基因组DNA样品的测序，公共IgH DNA数据库的检查以及基于变体序列的知情选择作为得出使用哪种JH6变体的合理选择的手段。
1000Genomes数据库使用人JH6*03作为参考序列，其将是技术人员希望构建转基因IgH基因座的可能选择。本发明人注意到(例如本文图7)在JH6*03中的第6位是由TAC密码子编码的酪氨酸(Y)，而一些其他天然存在的人变体具有由GGT密码子编码的甘氨酸(G)(甘氨酸作为YYG基序存在，形成更大的YYGXDX基序的部分)。为了理解这点的潜在意义，本发明人执行来自其他脊椎动物物种的JH序列的分析。本发明人惊讶地注意到YYG和YYGXDX基序跨越许多脊椎动物物种是保守的(参见图7和8)。因此，这提示本发明人该基序的保存可能是希望的，其可以指导用于本发明的JH6变体的选择。
当本发明人考虑分别编码Y或G的TAC密码子相对于GGT密码子时，出现另一个指标。本发明人考虑这些核苷酸序列对活化诱导的胞苷脱氨酶(AID)的作用的影响。本发明人了解活化诱导的胞苷脱氨酶(AID)被认为起始在多步机制中的Ig体细胞超变(SHM)，并且当合理设计基因座时，它们针对该活性。AID催化DNA中C至U的脱氨基，生成在C碱基处的突变。位于热点基序内的胞苷优先脱氨基。某些基序是关于AID活性的热点(DGYW、WRC、WRCY、WRCH、RGYW、AGY、TAC、WGCW，其中W＝A或T，Y＝C或T，D＝A，G或T，H＝A或C或T，和R＝A或G)。在JH6*03中第6位处编码Y的TAC密码子的存在产生AID突变热点(胞苷是AID的底物)，这些热点是先前句子中加下划线的基序。本发明人考虑这点的影响，并且在实现这点时，他们考虑在胞苷处由AID活性产生的可能突变体。参考图9。本发明人注意到在TAC密码子的第三个碱基处的突变将获得3种可能结果：Y、终止或终止。因此，在遗传密码中可能的三个终止密码子中(其他由TGA编码–参见图9)，其中两个将由编码JH6*03中第6位的TAC密码子中的胞苷突变提供。因此，本发明人考虑这可能增加在基于JH6*03的转基因基因座中的非生产性IgH可变区生产的机会。此外，本发明人注意到相反GGT密码子的提供(按照其他人JH6变体)似乎优选，因为第三个碱基的突变从不产生终止密码子(参见图9)，并且此外，将保留在第6位处的甘氨酸编码和因此保留保守性，本发明人还注意到这在跨越物种保守的YYG和YYGXDX基序中。
已决定不使用JH6*03，本发明人需要作出来自其他可能人变体的选择。MDV基序在基于人JH6的HCDR3的C末端，邻近构架4(FW4)以WGQ基序开始(参考由JH6*01编码的所示序列；图7)。在作出其关于基因座设计的选择中，本发明人希望使在产物IgH链和包括这些的抗体中该HCDR3/FW4连接的保守达到最大。本发明人认为这是重链可变结构域功能性和构象希望的。本发明人认为这在一些情况下可能是使免疫原性降到最低(适合于人药学用途)希望的。与这些考虑一致，本发明人希望作出由于体内SHM，使在HCDR3/FW4连接周围的突变降到最低的选择，以保存连接配置。参见Rogozin&Diaz；"Cutting Edge：DGYW/WRCH Is aBetter Predictor of Mutability at G:C Bases in Ig Hypermutation Than theWidely Accepted RGYW/WRCY Motif and Probably Reflects a Two-Step Activation-Induced Cytidine Deaminase-Triggered Process"；Journal of Immunology；2004年3月15日，第172卷no.6 3382-3384。DGYW基序的例子是GGCA。当分析变体序列时，本发明人已记住这点。
记住这些考虑，本发明人特别决定使用人JH6*02作为用于其IgH基因座设计的强制性人JH6。JH6*01拒绝作为强制性JH6基因区段，因为核苷酸序列GGG CAA(编码G和Q)含有GGCA基序，其为AID识别热点。本发明人认识到由于编码G和K(分别为第11和12位)的序列GGC AAA的存在，JH6*04也含有此类基序。本发明人还认识到*02变体具有C代替*01变体中的G，C希望是同义变化(即，不改变在CDR3/FW4连接周围的编码的氨基酸序列)，并且另外，这不提供GGCA AID热点基序。因此，本发明人决定强制性JH6应具有该C碱基，并且这也将其指向使用人JH6*02变体。
在本文本发明的任何配置的一个例子中，包括在基因座或基因组中的唯一JH6种类是人JH6*02。
本发明人从9个同意的人类成人的颊拭子获得9份匿名DNA样品。对IgH基因组DNA进行测序以证实天然JH6变体使用。发现所有9个人的基因组均含有JH6*02变体基因区段。在9个人中的7个中，基因组对于JH6*02是纯合的(即，每个染色体14具有JH6*02作为其在IgH基因座中的JH6基因区段)。本发明人还检查来自众所周知的科学家Craig Venter和JimWatson的基因组的可公开获得的序列信息。这两个基因组也均含有JH6*02。这提示本发明人该变体在人中是共同的。
因此，本发明人基于下述作出人JH6*02的选择
(i)含有跨越几个脊椎动物物种是保守的YYG和YYGXDX基序；
(ii)少一个TAC密码子(危害终止密码子的AID热点)的提供和代替保存YYG和YYGXDX基序的密码子的选择；
(iii)在HCDR3/FW4连接的区域中的GGCA AID热点的避免；和
(iv)在JH6*02变体的人中的共同出现(和因此保守和可接受性)。
这一原理通过本发明人在实验室例子中进行测试，以便查看人JH6*02是否能够希望地参与外源(非人脊椎动物)设置中的抗体基因区段重组和重链生产，并且此外，评价基于人JH6*02的长HCDR3是否能够在此类非人系统中在体内(在首次用于实验和免疫的设置中)产生。在一些非人设置例如小鼠中注意到，YYG和YYGXDX基序不是保守的，并且因此本发明人决定必须测试JH6*02(具有YYG和YYGXDX基序)是否能够在此类外源设置中适当起作用以参与VDJ重组和针对抗原的选择。
因此，如实施例中进一步解释的，本发明人构建了在ES细胞中含有转基因JH6*02的IgH基因座，由ES细胞生成转基因非人脊椎动物(首次用于实验的和用一系列不同靶抗原类型免疫的)，分离基于JH6*02的抗体和重链序列以及表达这些的B细胞，并且制备表达基于所选JH6*02变体的抗原特异性抗体的杂交瘤。本发明人发现JH6*02变体是广泛使用的并且可以促成在许多不同重链(包括抗原特异性重链)中具有至少20个氨基酸的HCDR3的产生。所选变体在所有设置(首次用于实验的、免疫的和抗原特异性的)中优选超过其他JH基因区段使用以生产具有至少20个氨基酸的HCDR3。
因此，本发明提供了包括人JH6*02(IMGT命名法)作为强制性JH基因区段的IgH基因座。在一个实施方案中，所述基因座包含人JH6*02下游(即3')的非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)恒定区基因区段；以及人JH6*02上游(即5')的一个或多个VH基因区段(例如多个人VH基因区段)和一个或多个D基因区段(例如多个人D基因区段)。例如，所述基因座由载体(例如DNA载体，例如酵母人工染色体(YAC)、BAC或PAC)包含。此类载体(例如YAC)可以使用标准技术(例如原核注射)引入非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)细胞内，从而使得基因座整合到细胞基因组内用于表达包含至少一条链的IgH链，所述链的可变结构域是人JH6*02与VH和D基因区段重组的产物。
在另一个例子中，所述基因座(例如具有全人、大鼠或小鼠恒定区、或人/小鼠嵌合恒定区)可以在非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)细胞的基因组中提供。例如。细胞是ES细胞或抗体生产细胞(例如分离的B细胞、iPS细胞或杂交瘤)。
在另一个例子中，本发明提供了包含本发明的IgH基因座的非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)，所述IgH基因座包含人JH6*02基因区段，其中所述基因座可以表达IgH链，其可变结构域是人JH6*02与VH和D基因区段重组的产物。如例子中所示，本发明人已成功产生此类小鼠，其产生此类具有基于人JH6*02的VH结构域的IgH链。在暴露于一系列靶抗原之前(首次用于实验的)和之后(免疫的)，本发明人分离且测序来自小鼠的IgH链，并且通过与IMGT IgH基因区段序列比较证实分离的链(和含有这些的抗体)基于JH6*02产生。此类链在首次用于实验的小鼠以及来自免疫的小鼠的抗原特异性抗体中发现。B细胞从免疫的小鼠中分离，其中B细胞表达基于JH6*02的抗体，并且由B细胞生成杂交瘤，该杂交瘤表达基于JH6*02的抗原特异性抗体。因此，本发明提供了基于人JH6*02使用的本发明的基因座、脊椎动物、细胞和杂交瘤，并且显示可以在脊椎动物免疫后成功产生且分离基于JH6*02的抗体和表达这些的B细胞，相应的杂交瘤是其VH结构域基于JH6*02的抗体的良好来源，例如用于施用于患者，例如用于人类医学。此外，发现能够产生且分离抗原特异性抗体，其VH结构域基于JH6*02并且其具有相对长的HCDR3(例如20个氨基酸)。
因此，本发明提供了如下述条款中的实施方案：
1.非人脊椎动物(任选小鼠或大鼠)或脊椎动物细胞，其基因组包含免疫球蛋白重链基因座，其包含位于恒定区上游的人基因区段JH6*02、一个或多个VH基因区段和一个或多个D基因区段；其中重链基因座中的基因区段可操作地连接其恒定区，从而使得小鼠能够产生由人JH6*02与D区段和VH区段重组产生的抗体重链。
在另一个例子中，本发明提供了
非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)或脊椎动物细胞，其基因组包含免疫球蛋白重链基因座，其包含选自下述的人IGHV基因区段中的一个、多个或全部：V3-21、V3-13、V3-7、V6-1、V1-8、V1-2、V7-4-1、V1-3、V1-18、V4-4、V3-9、V3-23、V3-11和V3-20(例如V3-21*03、V3-13*01、V3-7*01、V6-1*01、V1-8*01、V1-2*02、V7-4-1*01、V1-3*01、V1-18*01、V4-4*01、V3-9*01和V3-23*04中的一个、多个或全部)。这些区段在首次用于实验的库集中发现是生产性的，以产生长度至少20个氨基酸的HCDR3。在一个实施方案中，所述基因座包含人JH6，例如JH6*02。
本发明还提供了具有至少20个氨基酸的HCDR3大小的HCDR3、VH结构域、抗体重链或抗体。任选地，HCDR3或VH结构域(或者重链或抗体的VH结构域)包含小鼠AID模式体细胞超变和/或小鼠dTd模式突变。例如，当VH结构域在包含小鼠AID和/或小鼠TdT(例如内源AID或TdT)的小鼠中产生时，可以提供这点。还参见Annu.Rev.Biochem.2007.76:1-22；JavierM.Di Noia和Michael S.Neuberger，"Molecular Mechanisms of Antibody SomaticHypermutation"(特别是图1和关于小鼠中AID热点的相关讨论)；和Curr OpinImmunol.1995 Apr；7(2):248-54，"Somatic hypermutation"，Neuberger MS和Milstein C(特别是关于小鼠中热点的讨论)，所述参考文献的内容引入本文作为参考。
这些区段在首次用于实验的库集中发现与人JH6*02组合是生产性的，以产生长度至少20个氨基酸的HCDR3。
在一个例子中，脊椎动物是首次用于实验的。在另一个实施方案中，脊椎动物相反用靶抗原进行免疫。
在一个例子中，下文提及的脊椎动物或细胞在用靶抗原免疫后能够如此产生抗体重链。在一个例子中，脊椎动物是免疫的脊椎动物，其产生对于靶抗原特异性的抗体重链并且其中重链的可变结构域是VH、D和JH6*02之间重组的产物。例如，D选自人D3-3、D2-15、D3-9；D4-17；D3-10；D2-2；D5-24；D6-19；D3-22；D6-13；D5-12；D1-26；D1-20；D5-18；D3-16；D2-21；D1-14；D7-27；D1-1；D6-25；D2-14和D4-23(例如选自D3-9*01；D4-17*01；D3-10*01；D2-2*02；D5-24*01；D6-19*01；D3-22*01；D6-13*01；D5-12*01；D1-26*01；D1-20*01；D5-18*01；D3-16*02；D2-21*02；D1-14*01；D7-27*02；D1-1*01；D6-25*01；D2-15*01；和D4-23*01)。例如，D是人D3-9或D3-10。在一个例子中，HCDR3长度是至少20个氨基酸(例如20、21、23或24)。
在脊椎动物或细胞的一个例子中，基因组包含另外的人JH基因区段(例如JH2、3、4和5基因区段)。
在脊椎动物或细胞的一个例子中，基因组包含免疫球蛋白轻链基因座，其包含恒定区(例如人或小鼠λ或κ恒定区)上游的一个或多个人V基因区段和一个或多个人J基因区段。
如技术人员已知的，对于重链的重排和表达，基因座包含控制元件，例如一个或多个J基因区段和恒定区之间的Eμ和Sμ。在一个例子中，小鼠Eμ和Sμ包括在JH6*02和恒定区之间的重链基因座中(即，按5'至3'次序，基因座包含JH6*02、Eμ和Sμ以及恒定区)。在一个例子中，Eμ和Sμ是小鼠129衍生的基因组(例如129Sv衍生的基因组，例如129Sv/EV(例如129S7Sv/Ev(例如来自可得自Baylor College of Medicine，Texas，USA的AB2.1或AB2.2细胞)或129S6Sv/Ev))))的Eμ和Sμ；在另一个例子中，Eμ和Sμ是小鼠C57BL/6衍生的基因组的Eμ和Sμ。在这方面，基因座可以在选自AB2.1、AB2.2、VGF1、CJ7和FH14的细胞的基因组的IgH基因座中构建。在引入本文作为参考的Auerbach W，Dunmore JH，Fairchild-Huntress V等人；Establishment and chimera analysis of 129/SvEv-and C57BL/6-derived mouseembryonic stem cell lines.Biotechniques 2000；29:1024-8，30，32中构建且描述了VGF1细胞。
另外或可替代地，恒定区(或至少Cμ；或Cμ及其γ恒定区)是紧接的上文段落中所述的基因组的恒定区(或Cμ；或Cμ及其γ恒定区)。
JH6*02及其他人DNA序列的合适来源对于技术人员将是显而易见的。例如，能够从同意的人供体(例如按照本文实施例的颊拭子样品)中收集DNA样品，由其可以获得合适的DNA序列用于构建本发明的基因座。如技术人员已知的，人DNA的其他来源是商购可得的。可替代地，技术人员能够通过参考本文公开的人Ig基因区段序列的一个或多个数据库来构建基因区段序列。
2.条款1的脊椎动物，其中所述脊椎动物已用靶抗原免疫并且其中所述重链的可变结构域是VH、D和JH6*02之间重组的产物并且其中所述HCDR3长度是至少20个氨基酸(例如20、21、23或24)。
任选地，免疫的脊椎动物产生对于靶抗原特异性的抗体重链并且其中重链的可变结构域是VH、D和JH6*02之间重组的产物并且其中HCDR3长度是至少20个氨基酸(例如20、21、23或24)。
3.非人脊椎动物细胞(例如小鼠细胞或大鼠细胞)，其基因组包含免疫球蛋白重链基因座，其包含恒定区上游的人基因区段JH6*02、一个或多个VH基因区段和一个或多个D基因区段；其中所述重链基因座中的基因区段可操作地连接其恒定区，用于产生(例如在后续后代细胞中)由人JH6*02与D区段和VH区段重组产生的抗体重链。
4.条款3的细胞，其为能够分化成表达所述重链的后代抗体生产细胞的ES细胞。
5.任何前述条款的脊椎动物或细胞，其中所述重链基因座包含与JH6*02基因区段5'可操作地连接的人JH6*02重组信号序列(RSS)。
例如，天然RSS-JH6*02序列可以用于有利地维持RSS及其JH基因区段之间的天然配对。在这方面，使用下述序列：
ggtttttgtggggtgaggatggacattctgccattgtgattactactactactacggtatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccg tctcctcag(SEQ ID NO：238)
RSS具有共同体系结构：9聚体(例如上文加下划线的第一序列)，随后为22bp间隔物，和随后的7聚体(例如上文加下划线的第二序列)。间隔物通常为23bp+/-1，而9和7聚体是更保守的。
6.条款5的脊椎动物或细胞，其中所述RSS为SEQ ID NO：238或与SEQ ID NO：238的22聚体序列至少70％相同且侧翼具有相同的9聚体和7聚体序列的序列。
7.条款6的脊椎动物或细胞，其中所述RSS和JH6*02作为SEQ ID NO：237提供。
8.任何前述条款的脊椎动物或细胞，其中所述JH6*02是基因组中的唯一JH6型基因区段。
9.任何前述条款的脊椎动物或细胞，其中所述JH6*02是基因座中与恒定区最紧密的JH基因区段。
10.任何前述条款的脊椎动物或细胞，其中所述基因座包含下述人D基因区段中的一个、多个或全部：D3-9；D4-17；D3-10；D2-2；D5-24；D6-19；D3-22；D6-13；D5-12；D1-26；D1-20；D5-18；D3-16；D2-21；D1-14；D7-27；D1-1；D6-25；D2-14；和D4-23。
例如，基因座包含下述人D基因区段中的一个、多个或全部：D3-9*01；D4-17*01；D3-10*01；D2-2*02；D5-24*01；D6-19*01；D3-22*01；D6-13*01；D5-12*01；D1-26*01；D1-20*01；D5-18*01；D3-16*02；D2-21*02；D1-14*01；D7-27*02；D1-1*01；D6-25*01；D2-15*01；和D4-23*01。
11.条款10的脊椎动物或细胞，其中所述基因座包含下述人D基因区段中的一个、多个或全部：D3-9、D3-10、D6-19、D4-17、D6-13、D3-22、D2-2、D2-25和D3-3。
这些D基因区段发现与人JH6*02组合是生产性的，以产生长度至少20个氨基酸的HCDR3。
在一个例子中，基因座包含下述人D基因区段中的一个、多个或全部：D3-9、D3-10、D6-19、D4-17、D6-13和D3-22(例如D3-9*01、D3-10*01、D6-19*01、D4-17*01、D6-13*01和D3-22*01中的一个、多个或全部)。这些D区段在首次用于实验的库集中发现与人JH6*02组合是生产性的，以产生长度至少20个氨基酸的HCDR3。
在一个例子中，基因座包含下述人D基因区段中的一个、多个或全部：D3-10、D6-19和D1-26(例如D3-10*01、D6-19*01和D1-26*01中的一个、多个或全部)。这些D区段在免疫的库集中发现与人JH6*02组合是生产性的，以产生长度至少20个氨基酸的HCDR3。
在一个例子中，基因座包含下述人D基因区段中的一个、多个或全部：D3-9和D3-10(例如D3-9*01和D3-10*01中的一个、多个或全部)。这些D区段在抗原特异性库集中发现与人JH6*02组合是生产性的，以产生长度至少20个氨基酸的HCDR3。
12.任何前述条款的脊椎动物或细胞，其中所述基因座包含多个人D基因区段，并且所述JH6*02处于关于最3'的人D基因区段(或由基因座包含的人D区段的全部)的人类种系配置中。
在一个例子中，最3'的D基因区段是D7-27。在一个例子中，基因座包含来自如种系人IgH基因座中存在的D1-1至D7-27的人D基因区段的全部(例如，如IMGT基因库中所示)。
可替代或另外地，JH6*02处于关于Eμ、Sμ和恒定区(例如Cμ)中的一个、多个或全部的人类种系配置中。
13.任何前述条款的脊椎动物或细胞，其中所述基因座包含选自下述人IGHV基因区段中的一个、多个或全部：V3-21、V3-13、V3-7、V6-1、V1-8、V1-2、V7-4-1、V1-3、V1-18、V4-4、V3-9、V3-23、V3-11和V3-20。
在一个例子中，基因座包含选自下述人IGHV基因区段中的一个、多个或全部：V3-21、V3-13、V3-7、V6-1、V1-8、V1-2、V7-4-1、V1-3、V1-18、V4-4、V3-9、V3-23(例如V3-21*03、V3-13*01、V3-7*01、V6-1*01、V1-8*01、V1-2*02、V7-4-1*01、V1-3*01、V1-18*01、V4-4*01、V3-9*01和V3-23*04中的一个、多个或全部)。这些区段在首次用于实验的库集中发现与人JH6*02组合是生产性的，以产生长度至少20个氨基酸的HCDR3。
在一个例子中，基因座包含选自下述人IGHV基因区段中的一个、多个或全部：V3-7、V3-11和V4-4(例如V3-7*01、V3-11*01和V4-4*02中的一个、多个或全部)。这些区段在免疫的库集中发现与人JH6*02组合是生产性的，以产生长度至少20个氨基酸的HCDR3。
在一个例子中，基因座包含选自下述人IGHV基因区段中的一个、多个或全部：V4-4、V1-8、V3-9、V3-11和V3-20(例如V4-4*02、V1-8*01、V3-9*01、V3-11*01和V3-20中的一个、多个或全部(例如*d01)。这些区段在抗原特异性库集中发现与人JH6*02组合是生产性的，以产生长度至少20个氨基酸的HCDR3。
14.任何前述条款的脊椎动物或细胞，其中所述基因座包含人D3-9*01、D3-10*01、D6-19*01、D6-13*01、D1-26*01、IGHV1-8*01、IGHV4-61*01、IGHV6-1*01、IGHV4-4*02、IGHV1-3*01、IGHV3-66*03、IGHV3-7*01和IGHV3-9*01中的一个、多个或全部。
这些是与JH6*02非常频繁地组合以产生生产性重链和抗体的基因区段。
例如，基因座包含人IGHV1-8*01、D3-9*01和D3-10*01中的一个、多个或全部。这些基因区段与JH6*02一起是生产性的，以在超过10种抗体中产生具有至少20个氨基酸的HCDR3。
15.抗体生产细胞(例如B细胞)，其为条款3–14中任一项的细胞的后代，其中所述抗体生产细胞包含重链基因座，其包含由人JH6*02与D区段和VH区段(例如JH6*02与人VH3-11(例如VH3-11*01)和D3-9；VH3-20(例如VH3-20*01)和D3-10；VH4-4(例如VH4-4*02)和D3-10；VH3-9(例如VH3-9*01)和D3-10；或VH1-8(例如VH1-8*01)和D310)重组产生的重排可变区。
此类可变区将是在本发明的非人脊椎动物或细胞中的体内体细胞超变的产物。
16.条款15的细胞，其为表达包含重链的靶抗原特异性抗体的B细胞或杂交瘤，所述重链包含由人JH6*02与D区段和VH区段(例如JH6*02与人VH3-11(例如VH3-11*01)和D3-9；VH3-20(例如VH3-20*01)和D3-10；VH4-4(例如VH4-4*02)和D3-10；VH3-9(例如VH3-9*01)和D3-10；或VH1-8(例如VH1-8*01)和D310)重组产生的重排可变区。
此类可变区将是在本发明的非人脊椎动物或细胞中的体内体细胞超变的产物。
17.任何前述条款的脊椎动物或细胞，其中所述抗体重链特异性结合靶抗原。
18.任何前述条款的脊椎动物或细胞，其中所述抗体重链具有至少20个氨基酸的HCDR3长度。
任选地，HCDR3长度为至少21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸。另外，在一个例子中，长度不超过35、34、33、32或31个氨基酸。例如，HCDR3长度为20、21、22、23或24个氨基酸。
19.任何前述条款的脊椎动物或细胞，其中所述抗体重链是JH6*02与条款13或14中所述的人VH基因区段和/或条款10、11或14中所述的D基因区段重组的产物。
20.任何前述条款的脊椎动物或细胞，其中所有内源非人脊椎动物重链可变区基因区段已在基因组中失活(例如通过基因区段缺失或倒位)。
21.任何前述条款的脊椎动物或细胞，其中所述基因组对于所述重链基因座是纯合的。
22.从条款1、2、5-14和17-21中任一项的脊椎动物中分离的重链(例如由抗体包含)，其中所述重链包含具有至少20个氨基酸的HCDR3。
23.条款22的重链，其中所述HCDR3是人JH6*02与条款13或14中所述的人VH基因区段和/或条款10、11或14中所述的D基因区段重组的产物。
在一个例子中，重链是嵌合的，其中C区是非人的。在一个例子中，重链是人的，其中C区是人的。
24.重链(例如由抗体包含)，其VH可变结构域与条款22或23的重链的VH可变结构域相同，并且包含人恒定区或人-小鼠嵌合恒定区(例如CH1是人的，其他恒定结构域是小鼠的)。
25.条款22、23或24的重链，其VH可变结构域对于靶抗原是特异性的。
26.用于产生对靶抗原特异性的重链、VH结构域或抗体的方法，所述方法包括用抗原免疫根据条款1、2、5-14和17–21中任一项的非人脊椎动物，且分离对靶抗原特异性的重链、VH结构域或抗体，或者产生所述重链、VH结构域或抗体的细胞，其中所述重链、VH结构域或抗体包含衍生自人JH6*02与VH基因区段和D基因区段重组的HCDR3。
27.用于产生人重链或抗体的方法，其包括执行条款26的方法，其中所述基因座的恒定区是非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)恒定区，并且随后用人抗体恒定区置换所述分离的重链或抗体的非人恒定区(例如通过工程化编码所述抗体的核酸)。
28.重链、VH结构域或抗体，其由条款26或27的方法产生。
任选地，HCDR3长度如本文描述的为至少20个氨基酸。
29.表达重链VH结构域的B细胞或杂交瘤，所述重链VH结构域与条款22、23或28的重链的VH结构域相同。
30.核酸，其编码条款22、23或28的重链的VH结构域，或编码条款22、23、24、25或28的重链。
31.载体(例如CHO细胞或HEK293细胞载体)，其包含条款30的核酸；任选其中所述载体在宿主细胞(例如CHO细胞或HEK293细胞)中。
32.药物组合物，其包含条款22-25和28中任一项的抗体、重链或VH结构域(例如由抗体包含的)，连同药学可接受的赋形剂、稀释剂或药物(例如进一步的抗原特异性可变结构域、重链或抗体)。
33.用于医学(例如人类医学)的条款22-25和28中任一项的抗体、重链或VH结构域(例如由抗体包含的)。
例如，基因座包含下述人VH基因区段
IGHV6-1
IGHV3-7
IGHV1-8
IGHV3-9
IGHV3-11
IGHV3-13
IGHV1-18
IGHV3-30
IGHV4-31
IGHV4-39
IGHV4-59
以及任选存在的(i)和/或(ii)
(i)
IGHV1-2
IGHV2-5和
IGHV3-21
(ii)
IGHV1-2
IGHV2-5
IGHV3-21
IGHV1-24
例如，基因座包含下述人VH基因区段变体
IGHV6-1*01
IGHV3-7*01
IGHV1-8*01
IGHV3-9*01
IGHV3-11*01
IGHV3-13*01
IGHV1-18*01
IGHV3-30*18
IGHV4-31*03
IGHV4-39*01和
IGHV4-59*01；
以及任选存在的(iii)或(iv)
(ii)
IGHV1-2*04
IGHV2-5*10和
IGHV3-21*03
(iv)
IGHV1-2*02
IGHV2-5*01
IGHV3-21*01和
IGHV1-24*01
例如，基因座包含下述人JH基因区段变体
IGHJ2*01
IGHJ3*02
IGHJ4*02
IGHJ5*02和
IGHJ6*02
例如，基因座包含下述人D基因区段
IGHD1-1
IGHD2-2
IGHD3-9
IGHD3-10
IGHD5-12
IGHD6-13
IGHD1-14
IGHD2-15
IGHD3-16
IGHD4-17
IGHD6-19
IGHD2-21
IGHD5-24
IGHD1-26和
IGHD7-27
和以及任选存在的(v)或(vi)
(v)
IGHD3-3
(vi)
IGHD3-3
IGHD4-4
IGHD5-5
IGHD6-6
IGHD1-7
IGHD2-8和
IGHD2-8
在第五配置中，本发明提供了
对人类使用和抗体人源化定制的恒定区
另外的合理设计和生物信息学已导致本发明人认识到特定人恒定区变体跨越许多不同人类群体是保守的。本发明人认识到这开放通过在产物中使用此类特定恒定区，而不是任意选择人恒定区(或合成形式的人恒定区)，对人抗体、链和可变结构域作出选择的可能性。本发明的这个方面还使得能够对特定人类种族群体定制基于抗体的药物，从而比迄今为止已进行的更紧密地匹配药物与患者(和因此的疾病设置)。用人恒定区(推测衍生自一个(通常未知的)种族群体或非天然存在的)的任意选择人源化的抗体无法同样在不同人类种族群体的患者中起作用，这在本领域技术水平中可以是问题。这是重要的，因为恒定区具有提供抗体效应子功能的主要作用，例如用于抗体再循环、细胞和补体召募以及用于细胞杀死。
如WO2011066501中进一步讨论的，人IgG亚型IgG1、IgG2、gG3和IgG4显示出召募免疫功能的不同能力，所述免疫功能例如抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC，例如IgG1和IgG3)、抗体依赖性细胞的吞噬作用(ADCP，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)和补体依赖性细胞毒性(CDC，例如IgG1、IgG3)。此类免疫功能的亚型特异性衔接基于Fc受体对不同免疫细胞的选择性和结合C1q且活化膜攻击复合物(MAC)装配的能力。在多个类型中，关于FcY受体(例如FcYRI、FcYRIIa/b/c、FcYRIIIa/b)的相对亲和力对于IgG1和IgG3很高，然而，存在对于IgG2的最低限度亲和力(限制于FcYRIIa 131H多态性)，并且IgG4仅对于FcYRI具有可测量的亲和力。使用比较序列分析和共晶体结构，关于受体结合的关键接触残基已对跨越下铰链和CH2区的氨基酸残基作图。使用标准蛋白质工程技术，已在增强或减少抗体制剂对于Fc受体和补体的C1q组分的亲和力中获得一些成功。
在同种型中，IgG2最不能结合Fc受体的家族。使用IgG2作为起点，已作出发现突变体的努力，所述突变体具有减少的效应子功能，但保留FcRn结合、延长的稳定性和低免疫原性。具有这种性质的改善突变体可以提供具有保留安全性的改善的抗体治疗剂。与细胞表面靶结合的人IgG1治疗抗体能够衔接效应细胞，其可以通过抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)介导靶细胞的细胞裂解。这些机制通过抗体Fc结构域的CH2区与免疫效应细胞上的FcyR受体或C1q(补体级联的第一种组分)的相互作用而发生。表19显示不同人γ亚型的活性。取决于目的人类中的疾病设置，技术人员可以相应地选择促进或抑制活性。例如，当希望分离在人类患者中通过经典途径和FcYR1识别具有相对高的补体活化活性的全人重链和抗体时，人γ-1恒定区的使用是希望的。还参见MolImmunol.2003Dec；40(9):585-93；"Differential binding to human Fcgamma RIIa andFcgamma RIIb receptors by human IgG wild type and mutant antibodies"；ArmourKL等人，其引入本文作为参考。
IgG2恒定区非常适合于产生根据本发明的抗体和重链，用于与人中的细胞因子或可溶靶结合，因为IgG2基本上是FcYRI,III-沉默、FcYRIIa-活性的并且几乎没有补体活性。
IgG1恒定区具有用于人治疗剂的广泛效用，因为IgG1抗体和重链是FcYRI,II,III-活性的并且具有补体活性。这可以通过使用已如本领域已知的通过工程化活化的人γ-1恒定区得到增强。
本发明人的工作因此已鉴定不同同种型的人恒定区集合，当人源化嵌合抗体链(或使V结构域例如dAb或骆驼科动物VHH与恒定区缀合)时，可以从其中作出知情选择。集合基于1000Genomes数据库的生物信息学分析进行鉴定，本发明人选择跨越几个人类种族群体频繁出现的恒定区变体，以及在个别群体内以相对高的频率出现的那些(如由其基因组包含变体的个体数目评价)。通过在这个基础上经由众多可能序列分选，本发明人已提供了人恒定区变体的集合，所述人恒定区变体是天然存在的并且在合适设计抗体、重链及其他基于抗体的形式(其具有人恒定区)时可以使用。特别地，当人源化嵌合重链以产生其中可变和恒定区两者均为人的全人链时，这是有用的。这对与接受基于抗体的药物的人类患者的相容性是有用的。
为此，本发明提供了下述方面：
1.产生抗体重链的方法，所述方法包括：
(a)提供抗原特异性重链可变结构域(例如VH(例如人VH或dAb)或VHH或人源化重链可变结构域)；和
(b)组合可变结构域与人重链恒定区以产生包含(在N至C末端方向)可变结构域和恒定区的抗体重链；
其中
人重链恒定区是IGHAref、IGHA1a、IGHA2a、IGHA2b、IGHG1ref、IGHG2ref、IGHG2a、IGHG3ref、IGHG3a、IGHG3b、IGHG4ref、IGHG4a、IGHDref、IGHEref、IGHMref、IGHMa或IGHMb恒定区。
步骤(b)可以例如使用重组DNA技术使用相应核苷酸序列执行。
对于根据这一配置的任何方面的恒定区，基因组DNA或等价物(即，具有内含子和外显子以及任选存在的5'UTR序列，例如具有天然或非天然前导序列)可以用于恒定区。例如，此处开始作为SEQ ID NO：365公开的"GENOMIC"序列中的任一。可替代地，可以使用无内含子序列，例如此处开始作为SEQ ID NO：365公开的"CDS"序列中的任一(例如具有天然或非天然前导序列)。
任选对于本发明的这一配置的任何方面，人重链恒定区是IGHAref恒定区。
任选对于本发明的这一配置的任何方面，人重链恒定区是IGHA1a恒定区。
任选对于本发明的这一配置的任何方面，人重链恒定区是IGHA2a恒定区。
任选对于本发明的这一配置的任何方面，人重链恒定区是IGHA2b恒定区。
任选对于本发明的这一配置的任何方面，人重链恒定区是IGHG1ref恒定区。
任选对于本发明的这一配置的任何方面，人重链恒定区是IGHG2ref恒定区。
任选对于本发明的这一配置的任何方面，人重链恒定区是IGHG2a恒定区。
任选对于本发明的这一配置的任何方面，人重链恒定区是IGHG3ref恒定区。
任选对于本发明的这一配置的任何方面，人重链恒定区是IGHG3a恒定区。
任选对于本发明的这一配置的任何方面，人重链恒定区是IGHG3b恒定区。
任选对于本发明的这一配置的任何方面，人重链恒定区是IGHG4ref恒定区。
任选对于本发明的这一配置的任何方面，人重链恒定区是IGHG4a恒定区。
任选对于本发明的这一配置的任何方面，人重链恒定区是IGHDref恒定区。
任选对于本发明的这一配置的任何方面，人重链恒定区是IGHEref恒定区。
任选对于本发明的这一配置的任何方面，人重链恒定区是IGHMref恒定区。
任选对于本发明的这一配置的任何方面，人重链恒定区是IGHMa恒定区。
任选对于本发明的这一配置的任何方面，人重链恒定区是IGHMb恒定区。
任选地，产生重链或包含所述重链的抗体的衍生物(例如突变体或缀合物)。例如，可以缀合毒性有效负荷(例如用于肿瘤学应用)。例如，如本领域已知的，可以引入一种或多种突变以失活或增强Fc效应子功能。
2.方面1的方法，其中所述可变结构域是人可变结构域。
人可变结构域是例如在转基因非人脊椎动物中的人VH、D和JH基因区段重组的产物。可替代地，可变结构域使用体外展示技术从人VH文库中鉴定，例如使用如本领域已知的噬菌体展示、核糖体展示或酵母展示。
在另一个实施方案中，可变结构域是人源化可变结构域，例如包含具有非人(例如小鼠或大鼠)CDR)的人构架。人源化技术是本领域常规的，并且将是技术人员容易知道的。
3.任何前述方面的方法，其中所述可变结构域先前已选自用抗原免疫的非人脊椎动物。
例如，脊椎动物(例如小鼠或大鼠)基因组包含嵌合重链基因座，其包含可操作地连接非人脊椎动物恒定区上游的人可变区(人V、D和JH基因区段)，从而使得基因座能够重排用于表达包含人可变结构域和非人脊椎动物恒定区的重链。
在可替代实施方案中，使用体外技术例如噬菌体展示、核糖体展示或酵母展示选择可变结构域。在这种情况下，可变结构域可以连同或不连同恒定区一起展示，条件是按照本发明它以后与人恒定区组合。
4.任何前述方面的方法，其包括提供包含编码恒定区的核苷酸序列的表达载体(例如哺乳动物表达载体，例如CHO或HEK293载体)；将编码可变结构域的核苷酸序列插入载体恒定区序列的5'；将载体插入宿主细胞内且由宿主细胞表达重链；所述方法进一步包括分离包含可变结构域和人恒定区的重链(例如作为抗体的部分)。
当载体由宿主细胞例如CHO或HEK293细胞容纳时，载体包含足以实现重链表达的调节元件。
5.任何前述方面的方法，其进一步包括获得编码重链的核苷酸序列。
6.包含人重链的抗体，该重链包含对于抗原特异性的可变结构域和恒定区，所述恒定区是IGHAref、IGHA1a、IGHA2a、IGHA2b、IGHG1ref、IGHG2ref、IGHG2a、IGHG3ref、IGHG3a、IGHG3b、IGHG4ref、IGHG4a、IGHDref、IGHEref、IGHMref、IGHMa或IGHMb恒定区。
7.多肽，其包含(在N至C末端方向)前导序列、对于抗原特异性的人可变结构域和人恒定区，所述人恒定区为IGHAref、IGHA1a、IGHA2a、IGHA2b、IGHG1ref、IGHG2ref、IGHG2a、IGHG3ref、IGHG3a、IGHG3b、IGHG4ref、IGHG4a、IGHDref、IGHEref、IGHMref、IGHMa或IGHMb恒定区，其中(i)前导序列不是天然人可变结构域前导序列(例如前导序列是另一种人前导序列或非人前导序列)；和/或(ii)可变结构域包含小鼠AID模式体细胞突变或小鼠末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)模式连接突变。
8.核苷酸序列，其编码(在5'到3'方向)前导序列和人抗体重链，该重链包含对于抗原特异性的可变结构域和恒定区，所述恒定区是IGHAref、IGHA1a、IGHA2a、IGHA2b、IGHG1ref、IGHG2ref、IGHG2a、IGHG3ref、IGHG3a、IGHG3b、IGHG4ref、IGHG4a、IGHDref、IGHEref、IGHMref、IGHMa或IGHMb恒定区；并且前导序列对于重链表达是可操作的(例如在哺乳动物CHO或HEK293细胞中)并且其中前导序列不是天然人可变结构域前导序列(例如前导序列是另一种人前导序列或非人前导序列)。
在一个例子中，前导序列是
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGC
其翻译为
MGWSCIILFLVATATGVHS
9.核苷酸序列，其编码(在5'到3'方向)启动子和人抗体重链，该重链包含对于抗原特异性的可变结构域和恒定区，所述恒定区是IGHAref、IGHA1a、IGHA2a、IGHA2b、IGHG1ref、IGHG2ref、IGHG2a、IGHG3ref、IGHG3a、IGHG3b、IGHG4ref、IGHG4a、IGHDref、IGHEref、IGHMref、IGHMa或IGHMb恒定区；并且启动子对于重链表达是可操作的(例如在哺乳动物CHO或HEK293细胞中)并且其中启动子不是天然人启动子。
在一个实施方案中，启动子序列是人IGK 3-15启动子。
10.方面6–9中任一项的抗体、多肽或核苷酸序列，其中所述可变结构域包含小鼠AID模式体细胞突变和/或小鼠末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)模式连接突变。
例如，在本发明的这一配置的任何方面，为了提供小鼠AID模式体细胞突变和/或小鼠末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)模式连接突变，一种方法是从非人脊椎动物或细胞中选择可变结构域。例如，如本文公开的脊椎动物或细胞。
11.载体(例如CHO细胞或HEK293细胞载体)，其包含方面8、9或10的核酸；任选其中所述载体在宿主细胞(例如CHO细胞或HEK293细胞)中。
12.药物组合物，其包含方面6、7和10中任一项的抗体或多肽，连同药学可接受的赋形剂、稀释剂或药物(例如进一步的抗原特异性可变结构域、抗体链或抗体)。
13.方面6、7和10中任一项的抗体或多肽，其用于治疗和/或预防人类患者中的医学状况。
14.方面6、7和10中任一项的抗体或多肽制造用于治疗和/或预防人类患者中的医学状况的药物的用途。
15.方面13或14的抗体、多肽或用途，其中所述人类是选自群体编号1-14的人类群体的成员，其中所述群体如下编号(群体标记根据1000Genomes Project命名法)
1＝ASW；
2＝CEU；
3＝CHB；
4＝CHS；
5＝CLM；
6＝FIN；
7＝GBR；
8＝IBS；
9＝JPT；
10＝LWK；
11＝MXL；
12＝PUR；
13＝TSI；
14＝YRI。
16.方面15的抗体、多肽或用途，其中所述恒定区是
(i)IGHA1a恒定区，并且所述人类群体选自任何群体编号1-14；
(ii)IGHA2a恒定区，并且所述人类群体选自任何群体编号1-14；
(iii)IGHA2b恒定区，并且所述人类群体选自任何群体编号1-14；
(iv)IGHG2a恒定区，并且所述人类群体选自任何群体编号1-9和11-13；
(v)IGHG3a恒定区，并且所述人类群体选自任何群体编号1-14；
(vi)IGHG3b恒定区，并且所述人类群体选自任何群体编号1-8和11-13；
(vii)IGHG4a恒定区，并且所述人类群体选自任何群体编号1-9和11-13；
(viii)IGHMa恒定区，并且所述人类群体选自任何群体编号1-14；或
(ix)IGHMb恒定区，并且所述人类群体选自任何群体编号1-14；
其中所述群体如下编号(群体标记根据1000Genomes Project命名法)
1＝ASW；
2＝CEU；
3＝CHB；
4＝CHS；
5＝CLM；
6＝FIN；
7＝GBR；
8＝IBS；
9＝JPT；
10＝LWK；
11＝MXL；
12＝PUR；
13＝TSI；
14＝YRI。
17.载体(例如CHO细胞或HEK293细胞载体)，其包含IGHG1ref、IGHG2ref、IGHG2a、IGHG3ref、IGHG3a、IGHG3b、IGHG4ref或IGHG4a恒定区核苷酸序列，其为用于插入人抗体重链可变结构域核苷酸序列的克隆位点的3'，从而使得在此类可变结构域序列插入后，载体包含(在5'到3'方向)启动子、前导序列、可变结构域序列和恒定区序列，从而使得当存在于宿主细胞中时，载体能够表达人抗体重链。
在第六配置中，本发明提供了
在相同基因组中顺式或反式的多重变体
本发明人的分析已揭示如表13和表14中阐述的天然存在的人抗体基因区段变体的分组。这揭示在非人脊椎动物和细胞中产生转基因基因组的可能性，其中基因组所含有的超过特定人基因区段的天然人互补体。在一个例子中，这可以通过在各自Ig基因座中的一个或两个上(例如在小鼠基因组或小鼠细胞基因组中容纳IgH的一条或两条染色体上)提供特定基因区段类型的超过天然人互补体来实现。
为此，本发明的这一配置提供了下述(如编号段落中阐述的)：
1.具有基因组的非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)或非人脊椎动物细胞(例如ES细胞或B细胞)，所述基因组包含相同类型的至少3个人可变区基因区段(例如至少3个人VH6-1基因区段、至少3个人JH6基因区段、至少3个人Vκ1-39基因区段、至少3个人D2-2基因区段或至少3个人Jκ1基因区段)，其中所述人基因区段中的至少两个是彼此不相同的变体。
例如，基因组包含可变区，其包含恒定区上游的V、D和J基因区段(用于重链基因座的可变区)或V和J基因区段(用于轻链基因座的可变区)，分别用于表达重或轻链。
在替代方案中，通过提供人基因区段的一个变体类型的几个拷贝，技术人员可以选择提供特定基因区段类型的超过野生型人互补体。因此，提供了
具有基因组的非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)或非人脊椎动物细胞(例如ES细胞或B细胞)，所述基因组包含相同类型的至少3个人可变区基因区段(例如至少3个人VH6-1基因区段、至少3个人JH6基因区段、至少3个人Vκ1-39基因区段、至少3个人D2-2基因区段或至少3个人Jκ1基因区段)，其中人基因区段是相同变体。
例如，基因组包含可变区，其包含恒定区上游的V、D和J基因区段(用于重链基因座的可变区)或V和J基因区段(用于轻链基因座的可变区)，分别用于表达重或轻链。
2.具有基因组的非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)或非人脊椎动物细胞(例如ES细胞或B细胞)，所述基因组包含在相同Ig基因座处顺式的相同类型的至少2个不同的非内源可变区基因区段(例如至少2个人VH6-1基因区段、至少3个人JH6基因区段、至少2个人Vκ1-39基因区段、至少2个人D2-2基因区段或至少2个人Jκ1基因区段)。
在替代方案中，通过提供人基因区段的一个变体类型的几个拷贝，技术人员可以选择提供特定基因区段类型的超过野生型人互补体。因此，提供了
具有基因组的非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)或非人脊椎动物细胞(例如ES细胞或B细胞)，所述基因组包含在相同Ig基因座处顺式的相同变体类型的至少2个非内源可变区基因区段(例如至少2个人JH6*02基因区段)。
3.具有基因组的非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)或非人脊椎动物细胞(例如ES细胞或B细胞)，所述基因组包含在相同Ig基因座处反式的相同类型的至少2个不同的人可变区基因区段(例如至少2个人VH6-1基因区段、至少2个人JH6基因区段、至少2个人Vκ1-39基因区段、至少2个人D2-2基因区段或至少2个人Jκ1基因区段)；和任选存在的相同类型的第三人基因区段，其中所述第三基因区段与所述2个不同基因区段之一是顺式的。
在替代方案中，通过提供人基因区段的一个变体类型的几个拷贝，技术人员可以选择提供特定基因区段类型的超过野生型人互补体。因此，提供了
具有基因组的非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)或非人脊椎动物细胞(例如ES细胞或B细胞)，所述基因组包含在相同Ig基因座处反式的相同变体类型的至少2个不同的人可变区基因区段(例如至少2个人JH6*02基因区段)；和任选存在的相同变体类型的第三人基因区段，其中所述第三基因区段与所述2个不同基因区段之一是顺式的。
4.包含人可变区基因区段的库集的非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)群体，其中所述多个包含相同类型的至少2个人可变区基因区段(例如至少2个人VH6-1基因区段、至少2个人JH6基因区段、至少2个人Vκ1-39基因区段、至少2个人D2-2基因区段或至少2个人Jκ1基因区段)，所述不同基因区段中的第一个在群体的第一脊椎动物的基因组中提供，并且所述不同基因区段中的第二个在群体的第二脊椎动物的基因组中提供，其中所述第一脊椎动物的基因组不包含所述第二基因区段。
5.具有基因组的非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)或非人脊椎动物细胞(例如ES细胞或B细胞)，所述基因组包含相同类型的至少2个不同的非内源可变区基因区段(例如至少2个人VH6-1基因区段、至少2个人JH6基因区段、至少2个人Vκ1-39基因区段、至少2个人D2-2基因区段或至少2个人Jκ1基因区段)，其中所述基因区段衍生自不同人类个体的基因组序列，所述人类个体在至少3代以上是遗传学不相关的。
6.增强非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)的人免疫球蛋白基因多样性的方法，所述方法包括给脊椎动物提供基因组，所述基因组包含相同类型的至少3个人可变区基因区段(例如至少3个人VH6-1基因区段、至少3个人JH6基因区段、至少3个人Vκ1-39基因区段、至少3个人D2-2基因区段或至少3个人Jκ1基因区段)，其中所述人基因区段中的至少两个是彼此不相同的变体。
7.增强非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)的免疫球蛋白基因多样性的方法，所述方法包括给脊椎动物提供基因组，所述基因组包含在相同Ig基因座处顺式的相同类型的至少2个不同的非内源可变区基因区段(例如至少2个人VH6-1基因区段、至少2个人JH6基因区段、至少2个人Vκ1-39基因区段、至少2个人D2-2基因区段或至少2个人Jκ1基因区段)。
8.增强非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)的免疫球蛋白基因多样性的方法，所述方法包括给脊椎动物提供基因组，所述基因组包含在相同Ig基因座处反式的相同类型的至少2个不同的人可变区基因区段(例如至少2个人VH6-1基因区段、至少2个人JH6基因区段、至少2个人Vκ1-39基因区段、至少2个人D2-2基因区段或至少2个人Jκ1基因区段)；和任选存在的相同类型的第三人基因区段，其中所述第三基因区段与所述2个不同基因区段之一是顺式的。
9.提供增强的人免疫球蛋白可变区基因区段库集的方法，所述方法包括提供包含人可变区基因区段的库集的非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)群体，其中所述方法包括提供相同类型的至少2个不同的人可变区基因区段(例如至少2个人VH6-1基因区段、至少2个人JH6基因区段、至少2个人Vκ1-39基因区段、至少2个人D2-2基因区段或至少2个人Jκ1基因区段)，其中所述不同基因区段中的第一个在群体的第一脊椎动物的基因组中提供，并且所述不同基因区段中的第二个在群体的第二脊椎动物的基因组中提供，其中所述第一脊椎动物的基因组不包含所述第二基因区段。
10.增强非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)的人免疫球蛋白基因多样性的方法，所述方法包括给脊椎动物提供基因组，所述基因组包含相同类型的至少2个不同的非内源可变区基因区段(例如至少2个人VH6-1基因区段、至少2个人JH6基因区段、至少2个人Vκ1-39基因区段、至少2个人D2-2基因区段或至少2个人Jκ1基因区段)，其中所述基因区段衍生自不同人类个体的基因组序列，所述人类个体在至少3代以上是遗传学不相关的。
11.任何前述段落的脊椎动物、细胞或方法，其中所述不同基因区段中的至少2或3个在所述基因组中的相同Ig基因座处以顺式提供。
12.任何前述段落的脊椎动物、细胞或方法，其中所述基因区段衍生自不同人类个体的基因组序列，所述人类个体在至少3代以上是遗传学不相关的。
13.任何前述段落的脊椎动物、细胞或方法，其中所述基因区段衍生自两个或更多个不同人类个体的基因组序列；任选其中所述不同人类个体来自不同人类群体。
14.段落13的脊椎动物、细胞或方法，其中所述个体是遗传学不相关的。
15.增强非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)的人免疫球蛋白基因多样性的方法，所述方法包括给脊椎动物提供基因组，所述基因组包含相同类型的至少2个人可变区基因区段(例如至少2个人VH6-1基因区段、至少2个人JH6基因区段、至少2个人Vκ1-39基因区段、至少2个人D2-2基因区段或至少2个人Jκ1基因区段)，其中所述基因区段衍生自不同人类个体的基因组序列，所述人类个体在至少3代以上是遗传学不相关的；任选其中所述不同基因区段中的至少2或3个在所述基因组中的相同Ig基因座处提供。
16.段落15的方法，其中所述不同人类个体来自不同人类群体。
17.段落15的方法，其中所述个体是遗传学不相关的。
18.前述段落的脊椎动物、细胞或方法，其中所述不同区段的至少一个是人类种系基因区段的合成突变体。
19.任何前述段落的脊椎动物、细胞或方法，其中每个所述基因区段在10个或更多个不同人类群体中出现。
20.前述段落的脊椎动物、细胞或方法，其中每个所述基因区段具有5％或更大(例如10、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95％或更大)的人频率。
在这方面，技术人员可以由表14中提供的信息指导。
频率可以例如是在1000Genomes数据库中的累积频率。
21.段落20的脊椎动物、细胞或方法，其中每个所述基因区段在10个或更多个不同人类群体中出现。
22.任何前述段落的脊椎动物、细胞或方法，其中每个所述基因区段在1000Genomes数据库中的超过50个个体中出现。
23.前述段落的脊椎动物、细胞或方法，其中每个所述基因区段(i)具有5％或更大(例如10、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95％或更大)的人频率；和(ii)在10个或更多个不同人类群体中出现。
在这方面，技术人员可以由表14中提供的信息指导。
频率可以例如是在1000Genomes数据库中的累积频率。
24.具有基因组的非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)或非人脊椎动物细胞(例如ES细胞或B细胞)，所述基因组包含相同类型的第一和第二人Ig基因座基因区段(例如第一和第二人JH6基因区段；或第一和第二IgG2基因区段；或第一和第二人Jλ7基因区段)，其中所述第一基因区段是选自表14的基因区段(例如IGHJ6-a)并且所述第二基因区段是相应参考序列(例如IGHJ6ref；SEQ ID NO：244)。
表14列出通常出现的天然人变体。可见这些跨越许多人类群体出现，并且因此有用地具有用于基于抗体的人类药物的广泛适用性。
例如，基因区段作为插入内源非人脊椎动物Ig基因座内的靶向插入片段提供。可替代地，可以进行如本领域已知的随机整合(例如使用YAC)。
例如，基因组包含可变区，其包含恒定区上游的V、D和J基因区段(用于重链基因座的可变区)或V和J基因区段(用于轻链基因座的可变区)，分别用于表达重或轻链。
在另一个实施方案中，本发明使技术人员能够选择两个或更多个不同的天然存在的人基因区段变体，用于组合到非人脊椎动物或细胞的基因组内。无需包括参考序列。可能希望使用一个或多个罕见基因区段以增加库集的多样性。另外或可替代地，可能希望包括相同类型的频繁和罕见变体的混合物以提供库集多样性。变体可以另外或可替代地选择以定制对一个或多个特定人类群体的基因区段包括，如由表13或表14中提供的信息指出的。
因此，本发明提供了
具有基因组的非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)或非人脊椎动物细胞(例如ES细胞或B细胞)，所述基因组包含相同类型的第一和第二人Ig基因座基因区段(例如第一和第二人JH6基因区段；或第一和第二IgG2基因区段；或第一和第二人Jλ7基因区段)，其中所述基因区段是选自表13或表14的基因区段；和任选其中所述基因区段中的一个或多个在表14中出现(例如IGHJ6-a)或是参考序列(例如IGHJ6ref；SEQ ID NO：244)。
25.段落24的脊椎动物或细胞，其中所述基因组包含所述类型的第三人基因区段，所述第三基因区段不同于所述第一和第二基因区段。
26.段落24或25的脊椎动物或细胞，其中所述第一和第二基因区段在相同染色体上是顺式的；和任选所述第三基因区段在所述染色体上也是顺式的。
27.段落26的脊椎动物或细胞，其中所述基因区段是插入内源非人Ig基因座内的靶向插入片段。
例如，基因区段是重链基因区段并且非人基因座是IgH基因座。例如，基因区段是轻链(κ或λ)基因区段并且非人基因座是IgL基因座。
28.段落24或25的脊椎动物或细胞，其中所述第一和第二基因区段在不同染色体上是反式的。
因此，染色体是相同类型(例如两个小鼠染色体6或大鼠染色体4)。
29.段落24–28中任一项的脊椎动物或细胞，其中所述第一基因区段是选自表1-7和9–14(例如选自表13或表14)中任何一个的基因区段并且所述第二基因区段是相应参考序列。
30.非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)群体，其包含相同类型的第一和第二人Ig基因座基因区段(例如第一和第二人JH6基因区段；或第一和第二IgG2基因区段；或第一和第二人Jλ7基因区段)，其中所述第一基因区段是选自表1-7和9–14(例如表13或表14)中任何一个的基因区段(例如IGHJ6-a)并且所述第二基因区段是相应参考序列(例如SEQ ID NO：7)，其中所述第一基因区段在群体的第一脊椎动物的基因组中提供，并且所述第二基因区段在群体的第二脊椎动物的基因组中提供。
31.段落30的群体，其中所述第一脊椎动物的基因组不包含所述第二基因区段。
32.段落30或31的群体，其中所述群体包含所述类型的第三人基因区段，所述第三基因区段不同于所述第一和第二基因区段，并且任选其中所述第一和第三基因区段存在于第一脊椎动物的基因组中。
33.段落30、31或32的群体，其中所述基因区段是插入各自基因组中的内源非人Ig基因座内的靶向插入片段。
例如，基因区段是重链基因区段并且非人基因座是IgH基因座。例如，基因区段是轻链(κ或λ)基因区段并且非人基因座是IgL基因座。
34.段落30–33中任一项的段落，其中所述第一基因区段是选自表1-7和9–14(例如表13或表14)中任何一个的基因区段并且所述第二基因区段是相应参考序列。
35.增强非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)的人免疫球蛋白基因多样性的方法，所述方法包括给脊椎动物提供基因组，所述基因组包含相同类型的第一和第二人Ig基因座基因区段(例如第一和第二人JH6基因区段；或第一和第二IgG2基因区段；或第一和第二人Jλ7基因区段)，其中所述第一基因区段是选自表1-7和9–14(例如表13或表14)中任何一个的基因区段(例如IGHJ6-a)并且所述第二基因区段是相应参考序列(例如SEQ ID NO：7)。
36.提供增强的人免疫球蛋白基因区段库集的方法，所述方法包括根据段落30–33中任一项的群体。
少数群体中流行的变体
在另一个方面，值得注意的是某些人基因区段变体可以在群体的一个或少数中相对频繁地出现，但跨越许多不同人类群体未流行地发现。存在这样的想法：由于反复暴露于群体通常暴露于其的抗原(例如疾病病原体抗原)，特定种系基因区段库集已在个别人类种族群体中进化。反复暴露和突变可能已导致可以在群体中提供针对所述抗原(病原体)的有效应答的基因区段变体进化，并且这可以解释这些群体中的基因区段的保守(与可能未频繁遇到该抗原的其他人类种族群体相反)。考虑到这点，本发明人从其分析中鉴定这样的基因区段变体，其在少数人类群体中相对流行，但跨越许多群体则不是。本发明人认识到在本发明的配置中包括此类基因区段中的一个或多个(例如在转基因Ig基因座、脊椎动物和细胞中)将可用于产生抗体、Ig链和可变结构域，其可以针对少数人类群体可能变得暴露于其的抗原(例如引起疾病的抗原或病原体)。此类产物将可用于治疗和/或预防此类群体成员中的疾病或医学状况。这个方面还可以用于解决感染性疾病病原体，其可能在少数群体中是常见的，但在未来或在进化中相对近期已变成在其他人类群体中更流行的引起疾病的病原体(即针对所讨论的一种或多种基因区段变体在表13中未列出的那些)。为此，从1000Genomes数据库中，本发明人已鉴定表20中列出的基因区段变体。
因此，根据本文描述的任何配置或方面，在本发明中使用的基因区段中的一个、多个或全部可以是表20A、20B、20C或20D中列出的基因区段。
多重JH基因区段变体
这一配置的具体应用是如下的多重人JH基因区段的提供。
具有基因组的非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)或非人脊椎动物细胞(例如ES细胞或B细胞)，所述基因组包含相同类型的至少3个人JH基因区段(JH1、JH2、JH3、JH4、JH5或JH6)，其中所述人JH基因区段中的至少两个是彼此不相同的变体。
在一个例子中，本发明的任何细胞均为分离的细胞。“分离的”细胞是已由其生产环境(例如天然或重组)的组分鉴定、分离和/或回收的细胞。优选地，分离的细胞不与来自其生产环境的所有其他组分结合，例如从而使得细胞可以产生关于FDA可批准或批准标准的抗体。它的生产环境的污染物组分例如得自重组转染的细胞的那种，是通常干扰所得抗体的研究、诊断或治疗用途的材料，并且可以包括酶、激素及其他蛋白质或非蛋白质溶质。在优选实施方案中，多肽将纯化：(1)至如通过例如Lowry法测定的，按抗体的重量计大于95％，并且在一些实施方案中，至按重量计大于99％；(2)至足以通过使用转杯式序列分析仪获得N末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)至使用考马斯蓝或优选的银染色，通过SDS-PAGE在非还原或还原条件下的同质性。然而，通常分离的细胞将通过至少一个纯化步骤进行制备。
具有基因组的非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)或非人脊椎动物细胞(例如ES细胞或B细胞)，所述基因组包含在相同Ig(例如IgH，例如内源IgH，例如小鼠或大鼠IgH)基因座处顺式的相同类型(JH1、JH2、JH3、JH4、JH5或JH6)的至少2个不同的非内源JH基因区段(例如人基因区段)。在一个例子中，该基因组包括包含所述不同JH基因区段的人VH、D和JH库集。任选地，非内源JH基因区段是非小鼠或非大鼠的，例如人JH基因区段。在一个例子中，非内源基因区段中的一个或多个或全部是合成的。
具有基因组的非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)或非人脊椎动物细胞(例如ES细胞或B细胞)，所述基因组包含在相同Ig(例如IgH，例如内源IgH，例如小鼠或大鼠IgH)基因座处反式的相同类型(JH1、JH2、JH3、JH4、JH5或JH6)的至少2个不同的人JH基因区段；和任选存在的相同类型的第三人JH基因区段，其中所述第三JH与所述2个不同的人JH基因区段之一是顺式的。
包含人JH基因区段的库集的非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)群体，其中所述多个包含相同类型(JH1、JH2、JH3、JH4、JH5或JH6)的至少2个不同的人JH基因区段，所述不同的JH基因区段中的第一个在群体的第一脊椎动物的基因组中提供，并且所述不同的JH基因区段中的第二个在群体的第二脊椎动物的基因组中提供，其中所述第一脊椎动物的基因组不包含所述第二JH基因区段。
具有基因组的非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)或非人脊椎动物细胞(例如ES细胞或B细胞)，所述基因组包含相同类型(JH1、JH2、JH3、JH4、JH5或JH6)的至少2个不同的非内源(例如人)JH基因区段，其中所述JH基因区段衍生自不同人类个体的基因组序列，所述人类个体在至少3代(例如3、4、5或6代)以上是遗传学不相关的。任选地，非内源JH基因区段是人JH基因区段。在一个例子中，非内源基因区段中的一个或多个或全部是合成的。
增强非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)的人免疫球蛋白基因多样性的方法，所述方法包括给脊椎动物提供基因组，所述基因组包含相同类型(JH1、JH2、JH3、JH4、JH5或JH6)的至少3个人JH基因区段，其中所述人JH基因区段中的至少两个是彼此不相同的变体。
增强非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)的免疫球蛋白基因多样性的方法，所述方法包括给脊椎动物提供基因组，所述基因组包含在相同Ig(例如IgH，例如内源IgH，例如小鼠或大鼠IgH)基因座)处顺式的相同类型(JH1、JH2、JH3、JH4、JH5或JH6)的至少2个不同的非内源(例如人)JH基因区段。任选地，非内源JH基因区段是非小鼠或非大鼠的，例如人JH基因区段。在一个例子中，非内源基因区段中的一个或多个或全部是合成的。
增强非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)的免疫球蛋白基因多样性的方法，所述方法包括给脊椎动物提供基因组，所述基因组包含在相同Ig(例如IgH，例如内源IgH，例如小鼠或大鼠IgH)基因座处反式的相同类型(JH1、JH2、JH3、JH4、JH5或JH6)的至少2个不同的人JH基因区段；和任选存在的相同类型的第三人JH基因区段，其中所述第三JH与所述2个不同JH基因区段之一是顺式的。
提供增强的人免疫球蛋白JH基因区段库集的方法，所述方法包括提供包含人JH基因区段的库集的非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)群体，其中所述方法包括提供相同类型(JH1、JH2、JH3、JH4、JH5或JH6)的至少2个不同的人JH基因区段，其中所述不同的JH基因区段中的第一个在群体的第一脊椎动物的基因组中提供，并且所述不同的JH基因区段中的第二个在群体的第二脊椎动物的基因组中提供，其中所述第一脊椎动物的基因组不包含所述第二JH基因区段。
增强非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)的人免疫球蛋白基因多样性的方法，所述方法包括给脊椎动物提供基因组，所述基因组包含相同类型(JH1、JH2、JH3、JH4、JH5或JH6)的至少2个不同的非内源(例如人)JH基因区段，其中所述JH基因区段衍生自不同人类个体的基因组序列，所述人类个体在至少3代(例如3、4、5或6代)以上是遗传学不相关的。任选地，非内源JH基因区段是人JH基因区段。在一个例子中，非内源基因区段中的一个或多个或全部是合成的。
在本发明的脊椎动物或细胞或方法的一个例子中，所述不同基因区段中的至少2或3个在所述基因组中的相同Ig基因座处以顺式提供。
在本发明的脊椎动物或细胞或方法的一个例子中，JH基因区段衍生自不同人类个体的基因组序列，所述人类个体在至少3代(例如3、4、5或6代)以上是遗传学不相关的。
在本发明的脊椎动物或细胞或方法的一个例子中，JH基因区段衍生自两个或更多个不同人类个体的基因组序列；任选其中所述不同人类个体来自不同人类群体。
在本发明的脊椎动物或细胞或方法的一个例子中，所述个体是遗传学不相关的(例如回溯3、4、5或6代)。
在本发明的脊椎动物或细胞或方法的一个例子中，不同JH基因区段中的至少一个是人类种系JH基因区段的合成突变体。
本发明还提供了增强非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)的人免疫球蛋白基因多样性的方法，所述方法包括给脊椎动物提供基因组，所述基因组包含相同类型(JH1、JH2、JH3、JH4、JH5或JH6)的至少2个人JH基因区段，其中所述JH基因区段衍生自不同人类个体的基因组序列，所述人类个体在至少3代(例如3、4、5或6代)以上是遗传学不相关的；任选其中所述不同基因区段中的至少2或3个在所述基因组中的相同IgH基因座处提供。
在本发明的这一实施方案的脊椎动物或细胞或方法的一个例子中，基因组包含补充有一个、两个或更多个人JH基因区段的人JH基因区段类型的基本上全部功能性库集，其中所述基本上全部功能性库集和补充性JH基因区段在人类个体的种系基因组中未发现在一起。
在本发明的群体的一个例子中，该群体包含补充有一个、两个或更多个人JH基因区段的人JH基因区段类型的基本上全部功能性库集，其中所述基本上全部功能性库集和补充性JH基因区段在人类个体的种系基因组中未发现在一起。
具有基因组的非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)或非人脊椎动物细胞(例如ES细胞或B细胞)，所述基因组包含补充有一个、两个或更多个人JH基因区段的人JH基因区段类型的基本上全部功能性库集，其中所述基本上全部功能性库集和补充性JH基因区段在人类个体的种系基因组中未发现在一起。
非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)群体，其包含补充有一个、两个或更多个人JH基因区段的人JH基因区段类型的基本上全部功能性库集，其中所述基本上全部功能性库集和补充性JH基因区段在人类个体的种系基因组中未发现在一起。
在脊椎动物或群体的一个例子中，所述JH基因区段中的至少一个是SEQ ID NO：1、2、3或4。例如，所述JH基因区段中的至少一个是SEQ ID NO：1，并且所述补充性JH基因区段中的至少一个、两个或更多个是根据上文任何例子的变体。例如，所述JH基因区段中的至少一个是SEQ ID NO：2，并且所述补充性JH基因区段中的至少一个、两个或更多个是根据上文例子中任何一个的变体。例如，所述JH基因区段中的至少一个是SEQ ID NO：2，并且所述补充性JH基因区段中的至少一个、两个或更多个是根据上文例子中任何一个的变体。
在一个实施方案中，本发明的非人脊椎动物或脊椎动物细胞包含基因组，其包括包含人基因区段的VH、D和JH基因库集，所述JH基因库集(例如人JH基因区段库集)包含：
在所述基因组中的相同Ig基因座处顺式的由至少2个不同的JH1基因区段提供的多个JH1基因区段；
在所述基因组中的相同Ig基因座处顺式的由至少2个不同的JH2基因区段提供的多个JH2基因区段；
在所述基因组中的相同Ig基因座处顺式的由至少2个不同的JH3基因区段提供的多个JH3基因区段；
在所述基因组中的相同Ig基因座处顺式的由至少2个不同的JH4基因区段提供的多个JH4基因区段；
在所述基因组中的相同Ig基因座处顺式的由至少2个不同的JH5基因区段提供的多个JH5基因区段；和/或
在所述基因组中的相同Ig基因座处顺式的由至少2个不同的JH6基因区段提供的多个JH6基因区段；
任选其中所述JH基因区段衍生自两个或更多个不同人类个体的基因组序列。
任选所述至少2个不同的JH基因区段是人基因区段或衍生自人基因区段的合成基因区段。
任选地，Ig基因座是IgH基因座，例如内源基因座，例如小鼠或大鼠IgH基因座。
在一个实施方案中，本发明的非人脊椎动物或脊椎动物细胞包含基因组，其包括包含人基因区段的VH、D和JH基因库集，所述JH基因库集(例如人JH基因区段库集)包含：
由至少3个不同的JH1基因区段提供的多个JH1基因区段；
由至少3个不同的JH2基因区段提供的多个JH2基因区段；
由至少3个不同的JH3基因区段提供的多个JH3基因区段；
由至少3个不同的JH4基因区段提供的多个JH4基因区段；
由至少3个不同的JH5基因区段提供的多个JH5基因区段；和/或
由至少3个不同的JH6基因区段提供的多个JH6基因区段；
任选其中所述JH基因区段衍生自两个或三个不同人类个体的基因组序列；
任选其中所述不同基因区段中的至少2或3个在所述基因组中的相同Ig基因座处以顺式提供。
任选所述至少3个不同的JH基因区段是人基因区段或衍生自人基因区段的合成基因区段。
任选地，Ig基因座是IgH基因座，例如内源基因座，例如小鼠或大鼠IgH基因座。
任选地，在脊椎动物或细胞中，不同人类个体来自不同人类群体。
任选地，在脊椎动物或细胞中，所述个体是遗传学不相关的(例如回溯3、4、5或6代)。
任选地，在脊椎动物或细胞中，不同JH基因区段中的至少一个是人类种系JH基因区段的合成突变体。
在根据本发明的非人脊椎动物或脊椎动物细胞(任选ES细胞或B细胞)的一个实施方案中，该脊椎动物或细胞基因组包含人VH、D和JH基因库集，所述JH基因库集(例如人JH基因库集)包含：
由至少2个不同的人JH1基因区段提供的多个JH1基因区段，任选在所述基因组中的相同Ig基因座处以顺式提供；
由至少2个不同的人JH2基因区段提供的多个JH2基因区段，任选在所述基因组中的相同Ig基因座处以顺式提供；
由至少2个不同的人JH3基因区段提供的多个JH3基因区段，任选在所述基因组中的相同Ig基因座处以顺式提供；
由至少2个不同的人JH4基因区段提供的多个JH4基因区段，任选在所述基因组中的相同Ig基因座处以顺式提供；
由至少2个不同的人JH5基因区段提供的多个JH5基因区段，任选在所述基因组中的相同Ig基因座处以顺式提供；和/或
由至少2个不同的人JH6基因区段提供的多个JH6基因区段，任选在所述基因组中的相同Ig基因座处以顺式提供；
其中所述JH基因区段衍生自不同人类个体的基因组序列，所述人类个体在至少3代(例如3、4、5或6代)以上是遗传学不相关的。
任选所述至少2个不同的JH基因区段是人基因区段或衍生自人基因区段的合成基因区段。
任选地，Ig基因座是IgH基因座，例如内源基因座，例如小鼠或大鼠IgH基因座。
任选地，在脊椎动物或细胞中，所述人类个体来自不同人类群体。
JH5
一个实施方案提供了本发明的脊椎动物、细胞或群体，其基因组包含多个JH5基因区段，其中所述多个包含SEQ ID NO：1的人JH5基因变体，其中所述变体包含在对应于人染色体14上的下述位置的一个或多个位置处的核苷酸突变：
106,330,024
106,330,027
106,330,032
106,330,041
106.330.44
106.330.45
106.330.62
106.330.63
106.330.65
106.330.66
106.330.67
106.330.68和
106,330,071。
在脊椎动物、细胞或群体中，任选地，所述多个包含SEQ ID NO：1的人JH5基因变体，其中所述变体在对应于人染色体14上第106,330,067位的位置处包含鸟嘌呤；且任选与SEQ ID NO：1序列相比不含进一步突变。
任选地，该变体另外包含在对应于下述的位置处的突变：(i)在人染色体14上的第106,330,071位(任选另外突变是鸟嘌呤)；(ii)在人染色体14上的第106,330,066位(任选的另外突变是鸟嘌呤)；和/或(iii)在人染色体14上的第106,330,068位(任选另外突变是胸腺嘧啶)。
任选地，所述多个包含SEQ ID NO：1的人JH5基因变体，其中所述变体在对应于人染色体14上第106,330,071位的位置处包含鸟嘌呤；且任选与SEQ ID NO：1序列相比不含进一步突变。
任选地，该变体另外包含在对应于下述的位置处的突变：(i)在人染色体14上的第106,330,063位(任选另外突变是腺嘌呤)；和/或(ii)在人染色体14上的第106,330,067位(任选另外突变是鸟嘌呤)。
任选地，所述多个包含SEQ ID NO：1的人JH5基因变体，其中所述变体在对应于人染色体14上第106,330,045位的位置处包含胞嘧啶；且任选与SEQ ID NO：1序列相比不含进一步突变。
任选地，所述多个包含SEQ ID NO：1的人JH5基因变体，其中所述变体在对应于人染色体14上第106,330,044位的位置处包含腺嘌呤；且任选与SEQ ID NO：1序列相比不含进一步突变。
任选地，该变体另外包含在对应于下述的位置处的突变：(i)在人染色体14上的第106,330,66位(任选另外突变是鸟嘌呤)；和/或(ii)在人染色体14上的第106,330,068位(任选另外突变是胸腺嘧啶)。
任选地，所述多个包含SEQ ID NO：1的人JH5基因变体，其中所述变体在对应于人染色体14上第106,330,066位的位置处包含鸟嘌呤；且任选与SEQ ID NO：1序列相比不含进一步突变。
任选地，该变体另外包含在对应于下述的位置处的突变：(i)在人染色体14上的第106,330,67位(任选另外突变是鸟嘌呤)；和/或(ii)在人染色体14上的第106,330,068位(任选另外突变是胸腺嘧啶)。
任选地，所述多个包含SEQ ID NO：1的人JH5基因变体，其中所述变体在对应于人染色体14上第106,330,068位的位置处包含胸腺嘧啶；且任选与SEQ ID NO：1序列相比不含进一步突变。
任选地，该变体另外包含在对应于下述的位置处的突变：(i)在人染色体14上的第106,330,067位(任选另外突变是鸟嘌呤)；和/或(ii)在人染色体14上的第106,330,066位(任选另外突变是鸟嘌呤)。
任选地，所述多个包含SEQ ID NO：1的人JH5基因变体，其中所述变体在对应于人染色体14上第106,330,027位的位置处包含胞嘧啶；且任选与SEQ ID NO：1序列相比不含进一步突变。
任选地，所述多个包含SEQ ID NO：1的人JH5基因变体，其中所述变体在对应于人染色体14上第106,330,024位的位置处包含腺嘌呤；且任选与SEQ ID NO：1序列相比不含进一步突变。
任选地，所述多个包含SEQ ID NO：1的人JH5基因变体，其中所述变体在对应于人染色体14上第106,330,032位的位置处包含胸腺嘧啶；且任选与SEQ ID NO：1序列相比不含进一步突变。
任选地，所述多个包含SEQ ID NO：1的人JH5基因变体，其中所述变体在对应于人染色体14上第106,330,041位的位置处包含胸腺嘧啶；且任选与SEQ ID NO：1序列相比不含进一步突变。
任选地，所述多个包含SEQ ID NO：1的人JH5基因变体，其中所述变体在对应于人染色体14上第106,330,063位的位置处包含腺嘌呤或胸腺嘧啶；且任选与SEQ ID NO：1序列相比不含进一步突变。
任选地，该变体另外包含在对应于人染色体14上第106,330,071位的位置处的突变(任选另外突变是鸟嘌呤)。
任选地，所述多个包含SEQ ID NO：1的人JH5基因变体，其中所述变体在对应于人染色体14上第106,330,062位的位置处包含胞嘧啶；且任选与SEQ ID NO：1序列相比不含进一步突变。
任选地，基因组包含SEQ ID NO:1；任选与变体中的一个、两个或更多个在相同Ig基因座处为顺式。
JH6
一个实施方案提供了本发明的脊椎动物、细胞或群体，其基因组包含多个JH6基因区段，其中所述多个包含SEQ ID NO：2的人JH6基因变体，其中所述变体包含在对应于人染色体14上的下述位置的一个或多个位置处的核苷酸突变：
106,329,411
106.329.413
106.329.414
106,329,417
106,329,419
106,329,426
106,329,434
106,329,435和
106,329,468。
任选地，脊椎动物、细胞或群体的基因组包含多个JH6基因区段，其中所述多个包含SEQ ID NO：2的人JH6基因变体，其中所述变体在对应于人染色体14上第106,329,435位的位置处包含鸟嘌呤；且任选与SEQ ID NO：2序列相比不含进一步突变。
任选地，该变体另外包含在对应于下述的位置处的突变：(i)在人染色体14上的第106,329,468位(任选另外突变是鸟嘌呤)；(ii)在人染色体14上的第106,329,419位(任选另外突变是腺嘌呤)；(iii)在人染色体14上的第106,329,434位(任选另外突变是胞嘧啶)，和/或在人染色体14上的第106,329,414位(任选另外突变是鸟嘌呤)；(iv)在人染色体14上的第106,329,426位(任选另外突变是腺嘌呤)；(v)在人染色体14上的第106,329,413位(任选另外突变是腺嘌呤)；(vi)在人染色体14上的第106,329,417位(任选另外突变是胸腺嘧啶)；(vii)在人染色体14上的第106,329,411位(任选另外突变是胸腺嘧啶)；(viii)在人染色体14上的第106,329,451位(任选另外突变是腺嘌呤)；(ix)在人染色体14上的第106,329,452位(任选另外突变是胞嘧啶)；和/或(x)在人染色体14上的第106,329,453位(任选另外突变是胞嘧啶)。
任选地，该变体另外包含在对应于下述的位置处的突变：在人染色体14上的第106,329,451位，该另外突变是腺嘌呤；在人染色体14上的第106,329,452位，该另外突变是胞嘧啶；和在人染色体14上的第106,329,453位，该另外突变是胞嘧啶。
脊椎动物、细胞或群体任选包含多个JH6基因区段，其中所述多个包含SEQ ID NO：2的人JH6基因变体，其中所述变体在对应于人染色体14上第106,329,468位的位置处包含鸟嘌呤；且任选与SEQ ID NO：2序列相比不含进一步突变。
任选地，该变体另外包含在对应于人染色体14上第106,329,435位的位置处的突变(任选另外突变是鸟嘌呤)。
任选地，脊椎动物、细胞或群体包含多个JH6基因区段，其中所述多个包含SEQ IDNO：2的人JH6基因变体，其中所述变体在对应于人染色体14上第106,329,417位的位置处包含胸腺嘧啶；且任选与SEQ ID NO：2序列相比不含进一步突变。
任选地，该变体另外包含在对应于人染色体14上第106,329,435位的位置处的突变(任选另外突变是鸟嘌呤)。
任选地，脊椎动物、细胞或群体包含多个JH6基因区段，其中所述多个包含SEQ IDNO：2的人JH6基因变体，其中所述变体在对应于人染色体14上第106,329,434位的位置处包含胞嘧啶；且任选与SEQ ID NO：2序列相比不含进一步突变。
任选地，该变体另外包含在对应于下述的位置处的突变：(i)在人染色体14上的第106,329,414位(任选另外突变是鸟嘌呤)；和/或(ii)在人染色体14上的第106,329,435位(任选另外突变是鸟嘌呤)。
任选地，脊椎动物、细胞或群体包含多个JH6基因区段，其中所述多个包含SEQ IDNO：2的人JH6基因变体，其中所述变体在对应于人染色体14上第106,329,411位的位置处包含胸腺嘧啶；且任选与SEQ ID NO：2序列相比不含进一步突变。
任选地，该变体另外包含在对应于人染色体14上第106,329,435位的位置处的突变(任选另外突变是鸟嘌呤)。
任选地，脊椎动物、细胞或群体包含多个JH6基因区段，其中所述多个包含其为上述变体的反义序列的人JH6基因变体。
任选地，基因组包含SEQ ID NO:2；任选与JH6变体中的一个、两个或更多个在相同Ig基因座处为顺式。
JH2
一个实施方案提供了本发明的脊椎动物、细胞或群体，其基因组包含多个JH2基因区段，其中所述多个包含SEQ ID NO：3的人JH2基因变体，其中所述变体包含在对应于人染色体14上的下述位置的一个或多个位置处的核苷酸突变：
106,331,455
106,331,453和
106,331,409。
任选地，脊椎动物、细胞或群体包含所述多个JH2基因区段，其中所述多个包含SEQID NO：3的人JH2基因变体，其中所述变体在对应于人染色体14上第106,331,455位的位置处包含鸟嘌呤；且任选与SEQ ID NO：3序列相比不含进一步突变。
任选地，该变体另外包含在对应于下述的位置处的突变：(i)在人染色体14上的第106,331,453位(任选另外突变是腺嘌呤)；和/或(ii)在人染色体14上的第106,331,409位(任选另外突变是腺嘌呤)；(iii)在人染色体14上的第106,329,434位(任选另外突变是腺嘌呤)。
任选地，脊椎动物、细胞或群体包含多个JH2基因区段，其中所述多个包含SEQ IDNO：3的人JH2基因变体，其中所述变体在对应于人染色体14上第106,331,453位的位置处包含腺嘌呤；且任选与SEQ ID NO：3序列相比不含进一步突变。
任选地，该变体另外包含在对应于人染色体14上第106,331,409位的位置处的突变(任选另外突变是腺嘌呤)。
任选地，脊椎动物、细胞或群体包含多个JH2基因区段，其中所述多个包含SEQ IDNO：3的人JH2基因变体，其中所述变体在对应于人染色体14上第106,331,409位的位置处包含腺嘌呤；且任选与SEQ ID NO：3序列相比不含进一步突变。
任选地，脊椎动物、细胞或群体包含多个JH2基因区段，其中所述多个包含其为上述变体的反义序列的人JH2基因变体。
任选地，基因组包含SEQ ID NO:3；任选与JH2变体中的一个、两个或更多个在相同Ig基因座处为顺式。
任选地，脊椎动物、细胞或群体基因组包含选自SEQ ID NO：1–3的两个或更多个不同的JH基因区段和上述变体；任选地其中所述JH基因区段在相同免疫球蛋白Ig基因座处是顺式的。
多重人D基因区段变体
这一配置的具体应用是提供如下的多重人D基因区段(如以条款编号154开始的编号条款中阐述的)。
154.具有基因组的非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)或非人脊椎动物细胞(例如ES细胞或B细胞)，所述基因组包含相同类型的至少3个人D基因区段(例如D2-2基因区段)，其中所述人D基因区段中的至少两个是彼此不相同的变体(例如D2-2ref和D2-2a)。
在本发明的第六配置的任何方面的一个例子中(V、D、J或C)，变体中的一个或多个或全部是天然存在的人基因区段。
在本发明的第六配置的任何方面的一个例子中(V、D、J或C)，变体中的一个或多个可以是人基因区段的合成变体。
155.具有基因组的非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)或非人脊椎动物细胞(例如ES细胞或B细胞)，所述基因组包含在相同Ig基因座处顺式的相同类型的至少2个不同的非内源D基因区段(例如D2-2ref和D2-2a)。
156.具有基因组的非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)或非人脊椎动物细胞(例如ES细胞或B细胞)，所述基因组包含在相同Ig基因座处反式的相同类型的至少2个不同的人D基因区段(例如D2-2ref和D2-2a)；和任选存在的相同类型的第三人D基因区段(例如(例如D2-2ref、D2-2a或D2-2b)，其中所述第三D与所述2个不同的D基因区段之一是顺式的。
157.包含人D基因区段的库集的非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)群体，其中所述多个包含相同类型的至少2个不同的人D基因区段(例如D2-2基因区段)，所述不同的D基因区段中的第一个(例如D2-2ref)在群体的第一脊椎动物的基因组中提供，并且所述不同的D基因区段中的第二个(例如D2-2a)在群体的第二脊椎动物的基因组中提供，其中所述第一脊椎动物的基因组不包含所述第二D基因区段。
158.具有基因组的非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)或非人脊椎动物细胞(例如ES细胞或B细胞)，所述基因组包含相同类型的至少2个不同的非内源D基因区段(例如人D2-2基因区段)，其中所述D基因区段衍生自不同人类个体的基因组序列，所述人类个体在至少3代以上是遗传学不相关的。
159.增强非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)的人免疫球蛋白基因多样性的方法，所述方法包括给脊椎动物提供基因组，所述基因组包含相同类型的至少3个人D基因区段(例如D2-2基因区段)，其中所述人D基因区段中的至少两个是彼此不相同的变体(例如D2-2ref和D2-2a)。
160.增强非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)的免疫球蛋白基因多样性的方法，所述方法包括给脊椎动物提供基因组，所述基因组包含在相同Ig基因座处顺式的相同类型的至少2个不同的非内源D基因区段(例如人D2-2基因区段)。
161.增强非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)的免疫球蛋白基因多样性的方法，所述方法包括给脊椎动物提供基因组，所述基因组包含在相同Ig基因座处反式的相同类型的至少2个不同的人D基因区段(例如D2-2ref和D2-2a)；和任选存在的相同类型的第三人D基因区段(例如D2-2ref、D2-2a或D2-2b)，其中所述第三D与所述2个不同的D基因区段之一是顺式的。
162.提供增强的人免疫球蛋白D基因区段库集的方法，所述方法包括提供包含人D基因区段的库集的非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)群体，其中所述方法包括提供相同类型的至少2个不同的人D基因区段(例如D2-2ref和D2-2a)，其中所述不同的D基因区段中的第一个在群体的第一脊椎动物的基因组中提供，并且所述不同的D基因区段中的第二个在群体的第二脊椎动物的基因组中提供，其中所述第一脊椎动物的基因组不包含所述第二D基因区段。
163.增强非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)的人免疫球蛋白基因多样性的方法，所述方法包括给脊椎动物提供基因组，所述基因组包含相同类型的至少2个不同的非内源D基因区段(例如D2-2ref和D2-2a)，其中所述D基因区段衍生自不同人类个体的基因组序列，所述人类个体在至少3代以上是遗传学不相关的。
164.条款154、156或158的脊椎动物或细胞，或条款159、161或163的方法，其中所述不同基因区段中的至少2或3个在所述基因组中的相同Ig基因座处以顺式提供。
165.条款154、155或156的脊椎动物或细胞，或条款159–162和164中任一项的方法，其中所述D基因区段衍生自不同人类个体的基因组序列，所述人类个体在至少3代以上是遗传学不相关的。
166.条款154–157中任一项的脊椎动物或细胞，或条款159–162和165中任一项的方法，其中所述D基因区段衍生自两个或更多个不同人类个体的基因组序列；任选其中所述不同人类个体来自不同人类群体。
167.条款165的脊椎动物、细胞或方法，其中所述个体是遗传学不相关的。
168.条款154–167中任一项的脊椎动物、细胞或方法，其中所述不同D区段的至少一个是人类种系D基因区段的合成突变体。
169.增强非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)的人免疫球蛋白基因多样性的方法，所述方法包括给脊椎动物提供基因组，所述基因组包含相同类型的至少2个人D基因区段(例如D2-2ref和D2-2a)，其中所述D基因区段衍生自不同人类个体的基因组序列，所述人类个体在至少3代以上是遗传学不相关的；任选其中所述不同基因区段中的至少2或3个在所述基因组中的相同IgH基因座处提供。
170.条款154–158和164-168中任一项的脊椎动物或细胞，其中所述基因组包含补充有一个、两个或更多个变体人D基因区段的人D基因区段类型的基本上全部功能性库集，其中所述基本上全部功能性库集和补充性D基因区段在人类个体的种系基因组中未发现在一起。
171.条款157的群体，其中所述群体包含补充有一个、两个或更多个变体人D基因区段的人D基因区段类型的基本上全部功能性库集，其中所述基本上全部功能性库集和补充性D基因区段在人类个体的种系基因组中未发现在一起。
172.具有基因组的非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)或非人脊椎动物细胞(例如ES细胞或B细胞)，所述基因组包含补充有一个、两个或更多个变体人D基因区段的人D基因区段类型的基本上全部功能性库集，其中所述基本上全部功能性库集和补充性D基因区段在人类个体的种系基因组中未发现在一起。
173.非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)群体，其包含补充有一个、两个或更多个变体人D基因区段的人JH基因区段类型的基本上全部功能性库集，其中所述基本上全部功能性库集和补充性D基因区段在人类个体的种系基因组中未发现在一起。
174.条款172的脊椎动物或细胞或者条款173的群体，其包含选自下述的第一和第二D基因区段：
D2-2ref和D2-2a；或
D2-21ref和D2-21a；或
D3-10ref和D3-10a；或
D3-16ref和D3-16a；或
D2-8ref和D2-8a；或
D3-3ref和D3-3a；或
D4-23ref和D4-23a；或
D6-13ref和D6-13a；或
D3-9ref和D3-9a；或
D4-4ref和D4-4a；或
D7-27ref和D7-27a；
任选其中所述第一和/或第二D基因区段以两个或更多个拷贝存在。
例如，提供了第一基因区段的两个或三个拷贝，任选连同第二基因区段的一个、两个或三个拷贝。拷贝可以以顺式或反式排列。
175.条款174的脊椎动物、细胞或群体，其包含人基因区段D2-2ref和D2-2a；以及D3-3ref和D3-3a；以及任选存在的D2-15。
在一个例子中，脊椎动物、细胞或群体包含选自下述的一个或多个D区段：人D3-3、D2-15、D3-9；D4-17；D3-10；D2-2；D5-24；D6-19；D3-22；D6-13；D5-12；D1-26；D1-20；D5-18；D3-16；D2-21；D1-14；D7-27；D1-1；D6-25；D2-14和D4-23(例如选自D3-9*01；D4-17*01；D3-10*01；D2-2*02；D5-24*01；D6-19*01；D3-22*01；D6-13*01；D5-12*01；D1-26*01；D1-20*01；D5-18*01；D3-16*02；D2-21*02；D1-14*01；D7-27*02；D1-1*01；D6-25*01；D2-15*01；和D4-23*01)，连同所述一个或多个所选区段的一种或多种参考序列。这些在具有至少20个氨基酸的HCDR3长度的可变结构域中发现(参见本文实施例)。
176.根据条款155的非人脊椎动物或脊椎动物细胞，其包含基因组，所述基因组包括包含人基因区段的VH、D和JH基因库集，所述D基因库集包含下述中的一种或多种：
在所述基因组中的相同Ig基因座处顺式的由至少2个不同的D2-2基因区段提供的多个D2-2基因区段；
在所述基因组中的相同Ig基因座处顺式的由至少2个不同的D2-21基因区段提供的多个D2-21基因区段；
在所述基因组中的相同Ig基因座处顺式的由至少2个不同的D3-10基因区段提供的多个D3-10基因区段；
在所述基因组中的相同Ig基因座处顺式的由至少2个不同的D3-16基因区段提供的多个D3-16基因区段；
在所述基因组中的相同Ig基因座处顺式的由至少2个不同的D2-8基因区段提供的多个D2-8基因区段；
在所述基因组中的相同Ig基因座处顺式的由至少2个不同的D3-3基因区段提供的多个D3-3基因区段；
在所述基因组中的相同Ig基因座处顺式的由至少2个不同的D4-23基因区段提供的多个D4-23基因区段；
在所述基因组中的相同Ig基因座处顺式的由至少2个不同的D6-13基因区段提供的多个D6-13基因区段；
在所述基因组中的相同Ig基因座处顺式的由至少2个不同的D3-9基因区段提供的多个D3-9基因区段；
在所述基因组中的相同Ig基因座处顺式的由至少2个不同的D4-4基因区段提供的多个D4-4基因区段；和
在所述基因组中的相同Ig基因座处顺式的由至少2个不同的D7-27基因区段提供的多个D7-27基因区段；
任选其中所述D基因区段衍生自两个或更多个不同人类个体的基因组序列。
177.根据条款155的非人脊椎动物或脊椎动物细胞，其包含基因组，所述基因组包括包含人基因区段的VH、D和JH基因库集，所述D基因库集包含下述中的一种或多种：
在所述基因组中反式的由至少2个不同的D2-2基因区段提供的多个D2-2基因区段；
在所述基因组中反式的由至少2个不同的D2-21基因区段提供的多个D2-21基因区段；
在所述基因组中反式的由至少2个不同的D3-10基因区段提供的多个D3-10基因区段；
在所述基因组中反式的由至少2个不同的D3-16基因区段提供的多个D3-16基因区段；
在所述基因组中反式的由至少2个不同的D2-8基因区段提供的多个D2-8基因区段；
在所述基因组中反式的由至少2个不同的D3-3基因区段提供的多个D3-3基因区段；
在所述基因组中反式的由至少2个不同的D4-23基因区段提供的多个D4-23基因区段；
在所述基因组中反式的由至少2个不同的D6-13基因区段提供的多个D6-13基因区段；
在所述基因组中反式的由至少2个不同的D3-9基因区段提供的多个D3-9基因区段；
在所述基因组中反式的由至少2个不同的D4-4基因区段提供的多个D4-4基因区段；和
在所述基因组中反式的由至少2个不同的D7-27基因区段提供的多个D7-27基因区段；
任选其中所述D基因区段衍生自两个或更多个不同人类个体的基因组序列。
178.根据条款154的非人脊椎动物或脊椎动物细胞(任选ES细胞或B细胞)，其包含基因组，所述基因组包括包含人基因区段的VH、D和JH基因库集，所述D基因库集包含下述中的一种或多种：
由至少3个不同的D2-2基因区段提供的多个D2-2基因区段；
由至少3个不同的D2-21基因区段提供的多个D2-21基因区段；
由至少3个不同的D3-10基因区段提供的多个D3-10基因区段；
由至少3个不同的D3-16基因区段提供的多个D3-16基因区段；
由至少3个不同的D2-8基因区段提供的多个D2-8基因区段；
由至少3个不同的D3-3基因区段提供的多个D3-3基因区段；
由至少3个不同的D4-23基因区段提供的多个D4-23基因区段；
由至少3个不同的D6-13基因区段提供的多个D6-13基因区段；
由至少3个不同的D3-9基因区段提供的多个D3-9基因区段；
由至少3个不同的D4-4基因区段提供的多个D4-4基因区段；和
由至少3个不同的D7-27基因区段提供的多个D7-27基因区段；
任选其中所述D基因区段衍生自两个或三个不同人类个体的基因组序列。
任选其中所述不同基因区段中的至少2或3个在所述基因组中的相同Ig基因座处以顺式提供。
179.条款176、177或178的脊椎动物或细胞，其中所述不同人类个体来自不同人类群体。
180.条款176–179中任一项的脊椎动物或细胞，其中所述个体是遗传学不相关的。
181.条款176–180中任一项的脊椎动物或细胞，其中所述不同D基因区段中的至少一个是人类种系D基因区段的合成突变体。
182.根据条款158的非人脊椎动物或脊椎动物细胞(任选ES细胞或B细胞)，其包括包含人VH、D和JH基因库集的基因组，所述D基因库集包含下述中的一种或多种：
由至少2种不同的D2-2基因提供的多个D2-2基因区段；任选在所述基因组中以顺式提供；
由至少2种不同的D2-21基因提供的多个D2-21基因区段；任选在所述基因组中以顺式提供；
由至少2种不同的D3-10基因提供的多个D3-10基因区段；任选在所述基因组中以顺式提供；
由至少2种不同的D3-16基因提供的多个D3-16基因区段；任选在所述基因组中以顺式提供；
由至少2种不同的D2-8基因提供的多个D2-8基因区段；任选在所述基因组中以顺式提供；
由至少2种不同的D3-3基因提供的多个D3-3基因区段；任选在所述基因组中以顺式提供；
由至少2种不同的D4-23基因提供的多个D4-23基因区段；任选在所述基因组中以顺式提供；
由至少2种不同的D6-13基因提供的多个D6-13基因区段；任选在所述基因组中以顺式提供；
由至少2种不同的D3-9基因提供的多个D3-9基因区段；任选在所述基因组中以顺式提供；
由至少2种不同的D4-4基因提供的多个D4-4基因区段；任选在所述基因组中以顺式提供；和
由至少2种不同的D7-27基因提供的多个D7-27基因区段；任选在所述基因组中以顺式提供；
其中所述D基因区段衍生自不同人类个体的基因组序列，所述人类个体在至少3代以上是遗传学不相关的。
183.条款182的脊椎动物或细胞，其中所述人类个体来自不同人类群体。
184.条款154–183中任一项的脊椎动物、细胞或群体，其中所述D基因区段中的一个或多个是人类种系D基因区段的变体，其中所述变体基因区段编码这样的氨基酸序列，其与由人类种系D基因区段编码的相应氨基酸序列有1、2或3个氨基酸不同，条件是当所述相应氨基酸序列不包括终止密码子时，由所述变体编码的所述氨基酸序列不包括终止密码子。
任选地，该变体和种系D基因区段编码在读码框2(IMGT编号)中的各自氨基酸序列。参见Briney等人2012。
185.条款184的脊椎动物、细胞或群体，其中由人类种系D基因区段编码的所述相应氨基酸序列是亲水或疏水序列(根据J Mol Biol.1997Jul 25；270(4):587-97；CorbettSJ等人；表2)。
186.条款184或185的脊椎动物、细胞或群体，其包含所述变体和所述种系人D基因区段；任选其中所述变体和种系人D基因区段在相同染色体上是顺式的。
187.条款184–186中任一项的脊椎动物、细胞或群体，其中种系人D基因区段是D2、D3、D5或D6家族基因区段；任选D2-2、D2-15、D3-3、D3-9、D3-10、D3-22、D5-5、D5-18、D6-6、D6-13、D6-19基因区段。
这些D区段在所有三个读码框中均为可用的。
任选地，使用这些人类种系D基因区段中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或全部的变体。
188.条款154–187中任一项的脊椎动物、细胞或群体，其包含多个D2-2基因区段，其中所述多个包含在对应于人染色体14上的下述位置的一个或多个核苷酸位置处彼此不同的D2-2基因区段：
106,382,687和
106,382,711。
189.条款188的脊椎动物、细胞或群体，其中所述多个包含人D2-2基因区段((任选两个拷贝和/或处于纯合状态)，其在对应于人染色体14上第106,382,687位的位置处包含胸腺嘧啶；且任选与D2-2ref序列相比不含进一步突变。
190.条款188或189的脊椎动物、细胞或群体，其中所述多个包含人D2-2基因区段，其在对应于人染色体14上第106,382,687位的位置处包含胞嘧啶；且任选与D2-2a序列相比不含进一步突变。
191.条款188–190中任一项的脊椎动物、细胞或群体，其中所述多个包含人D2-2基因区段，其在对应于人染色体14上第106,382,711位的位置处包含腺嘌呤；且任选与D2-2b序列相比不含进一步突变。
192.条款188–191中任一项的脊椎动物、细胞或群体，其中所述多个包含人D2-2基因区段，其在对应于人染色体14上第106,382,711位的位置处包含胸腺嘧啶；且任选与D2-2ref序列相比不含进一步突变。
193.条款154–192中任一项的脊椎动物、细胞或群体，其包含多个D7-27基因区段，其中所述多个包含在对应于人染色体14上第106,331,767位的核苷酸位置处彼此不同的D7-27基因区段。
194.条款193的脊椎动物、细胞或群体，其中所述多个包含人D7-27基因区段(任选两个拷贝和/或处于纯合状态)，其在对应于人染色体14上第106,331,767位的位置处包含胞嘧啶；且任选与D7-27ref序列相比不含进一步突变。
195.条款193或194的脊椎动物、细胞或群体，其中所述多个包含人D7-27基因区段，其在对应于人染色体14上第106,331,767位的位置处包含鸟嘌呤；且任选与D7-27a序列相比不含进一步突变。
196.条款154–195中任一项的脊椎动物、细胞或群体，其包含多个D4-23基因区段，其中所述多个包含在对应于人染色体14上第106,350,740位的核苷酸位置处彼此不同的D4-23基因区段。
197.条款196的脊椎动物、细胞或群体，其中所述多个包含人D4-23基因区段(任选两个拷贝和/或处于纯合状态)，其在对应于人染色体14上第106,350,740位的位置处包含腺嘌呤；且任选与D4-23ref序列相比不含进一步突变。
198.条款196或197的脊椎动物、细胞或群体，其中所述多个包含人D4-23基因区段(任选两个拷贝和/或处于纯合状态)，其在对应于人染色体14上第106,350,740位的位置处包含鸟嘌呤；且任选与D4-23a序列相比不含进一步突变。
199.条款154–197中任一项的脊椎动物、细胞或群体，其包含多个D2-21基因区段，其中所述多个包含在对应于人染色体14上第106,354,418位的核苷酸位置处彼此不同的D2-21基因区段。
200.条款199的脊椎动物、细胞或群体，其中所述多个包含人D2-21基因区段(任选两个拷贝和/或处于纯合状态)，其在对应于人染色体14上第106,354,418位的位置处包含腺嘌呤；且任选与D2-21ref序列相比不含进一步突变。
201.条款199或200的脊椎动物、细胞或群体，其中所述多个包含人D2-21基因区段(任选两个拷贝和/或处于纯合状态)，其在对应于人染色体14上第106,354,418位的位置处包含鸟嘌呤；且任选与D2-21a序列相比不含进一步突变。
202.条款154–201中任一项的脊椎动物、细胞或群体，其包含多个D3-16基因区段，其中所述多个包含在对应于人染色体14上第106,354,418位的核苷酸位置处彼此不同的D3-16基因区段。
203.条款202的脊椎动物、细胞或群体，其中所述多个包含人D3-16基因区段(任选两个拷贝和/或处于纯合状态)，其在对应于人染色体14上第106,361,515位的位置处包含胸腺嘧啶；且任选与D3-16ref序列相比不含进一步突变。
204.条款202或203的脊椎动物、细胞或群体，其中所述多个包含人D3-16基因区段(任选两个拷贝和/或处于纯合状态)，其在对应于人染色体14上第106,361,515位的位置处包含胞嘧啶；且任选与D3-16a序列相比不含进一步突变。
205.条款154–204中任一项的脊椎动物、细胞或群体，其包含多个D6-13基因区段，其中所述多个包含在对应于人染色体14上第106,367,013位的核苷酸位置处彼此不同的D6-13基因区段。
206.条款205的脊椎动物、细胞或群体，其中所述多个包含人D6-13基因区段(任选两个拷贝和/或处于纯合状态)，其在对应于人染色体14上第106,367,013位的位置处包含胸腺嘧啶；且任选与D6-13ref序列相比不含进一步突变。
207.条款205或206的脊椎动物、细胞或群体，其中所述多个包含人D6-13基因区段(任选两个拷贝和/或处于纯合状态)，其在对应于人染色体14上第106,367,013位的位置处包含胞嘧啶；且任选与D6-13a序列相比不含进一步突变。
208.条款154–207中任一项的脊椎动物、细胞或群体，其包含多个D3-10基因区段，其中所述多个包含在对应于人染色体14上的下述位置的一个或多个核苷酸位置处彼此不同的D3-10基因区段：
106,370,370和
106,370,371。
209.条款208的脊椎动物、细胞或群体，其中所述多个包含人D3-10基因区段(任选两个拷贝和/或处于纯合状态)，其在对应于人染色体14上第106,370,370位的位置处包含胸腺嘧啶；且任选与D3-10ref序列相比不含进一步突变。
210.条款208或209的脊椎动物、细胞或群体，其中所述多个包含人D3-10基因区段(任选两个拷贝和/或处于纯合状态)，其在对应于人染色体14上第106,370,370位的位置处包含胞嘧啶；且任选与D3-10a序列相比不含进一步突变。
211.条款208、209或210的脊椎动物、细胞或群体，其中所述多个包含人D3-10基因区段(任选两个拷贝和/或处于纯合状态)，其在对应于人染色体14上第106,370,371位的位置处包含腺嘌呤；且任选与D3-10ref序列相比不含进一步突变。
212.条款208–211中任一项的脊椎动物、细胞或群体，其中所述多个包含人D3-10基因区段(任选两个拷贝和/或处于纯合状态)，其在对应于人染色体14上第106,370,371位的位置处包含鸟嘌呤；且任选与D3-10b序列相比不含进一步突变。
213.条款154–212中任一项的脊椎动物、细胞或群体，其包含多个D3-9基因区段，其中所述多个包含在对应于人染色体14上第106,370,567位的核苷酸位置处彼此不同的D3-9基因区段。
214.条款213的脊椎动物、细胞或群体，其中所述多个包含人D3-9基因区段(任选两个拷贝和/或处于纯合状态)，其在对应于人染色体14上第106,370,567位的位置处包含腺嘌呤；且任选与D3-9ref序列相比不含进一步突变。
215.条款213或214的脊椎动物、细胞或群体，其中所述多个包含人D3-9基因区段(任选两个拷贝和/或处于纯合状态)，其在对应于人染色体14上第106,370,567位的位置处包含胸腺嘧啶；且任选与D3-9a序列相比不含进一步突变。
216.条款154–215中任一项的脊椎动物、细胞或群体，其包含多个D2-8基因区段，其中所述多个包含在对应于人染色体14上的下述位置的一个或多个核苷酸位置处彼此不同的D2-8基因区段：
106,373,085；
106,373,086和
106,373,089。
217.条款216的脊椎动物、细胞或群体，其中所述多个包含人D2-8基因区段(任选两个拷贝和/或处于纯合状态)，其在对应于人染色体14上第106,373,085位的位置处包含胞嘧啶。
218.条款216或217的脊椎动物、细胞或群体，其中所述多个包含人D2-8基因区段(任选两个拷贝和/或处于纯合状态)，其在对应于人染色体14上第106,373,085位的位置处包含胸腺嘧啶；且任选与D2-8b序列相比不含进一步突变。
219.条款216、217或218的脊椎动物、细胞或群体，其中所述多个包含人D2-8基因区段(任选两个拷贝和/或处于纯合状态)，其在对应于人染色体14上第106,373,086位的位置处包含胞嘧啶；且任选与D2-8ref序列相比不含进一步突变。
220.条款216–219中任一项的脊椎动物、细胞或群体，其中所述多个包含人D2-8基因区段，其在对应于人染色体14上第106,373,086位的位置处包含胸腺嘧啶；且任选与D2-8ref序列相比不含进一步突变。
221.条款154–220中任一项的脊椎动物、细胞或群体，其包含多个D4-4基因区段，其中所述多个包含在对应于人染色体14上的下述位置的一个或多个核苷酸位置处彼此不同的D4-4基因区段：
106,379,086；和
106,379,089。
222.条款221的脊椎动物、细胞或群体，其中所述多个包含D4-4基因区段(任选两个拷贝和/或处于纯合状态)，其在对应于人染色体14上第106,379,086位的位置处包含胞嘧啶；且任选与D4-4ref序列相比不含进一步突变。
223.条款221或222的脊椎动物、细胞或群体，其中所述多个包含人D4-4基因区段(任选两个拷贝和/或处于纯合状态)，其在对应于人染色体14上第106,379,086位的位置处包含胸腺嘧啶；且任选与D4-4a序列相比不含进一步突变。
224.条款221、222或223的脊椎动物、细胞或群体，其中所述多个包含人D4-4基因区段(任选两个拷贝和/或处于纯合状态)，其在对应于人染色体14上第106,379,089位的位置处包含胞嘧啶；且任选与D4-4ref序列相比不含进一步突变或在对应于人染色体14上第106,379,086位的位置处不含胞嘧啶。
225.条款221–224中任一项的脊椎动物、细胞或群体，其中所述多个包含人D4-4基因区段(任选两个拷贝和/或处于纯合状态)，其在对应于人染色体14上第106,373,089位的位置处包含胸腺嘧啶；且任选与D4-4a序列相比不含进一步突变。
226.条款154–225中任一项的脊椎动物、细胞或群体，其包含多个D3-3基因区段，其中所述多个包含在对应于人染色体14上的下述位置的一个或多个核苷酸位置处彼此不同的D3-3基因区段：
106,380,241；和
106,380,246。
227.条款226的脊椎动物、细胞或群体，其中所述多个包含D3-3基因区段(任选两个拷贝和/或处于纯合状态)，其在对应于人染色体14上第106,380,241位的位置处包含胸腺嘧啶；且任选与D3-3ref序列相比不含进一步突变。
228.条款226或227的脊椎动物、细胞或群体，其中所述多个包含人D3-3基因区段(任选两个拷贝和/或处于纯合状态)，其在对应于人染色体14上第106,380,241位的位置处包含胞嘧啶；且任选与D3-3a序列相比不含进一步突变。
229.条款226、227或228的脊椎动物、细胞或群体，其中所述多个包含人D3-3基因区段(任选两个拷贝和/或处于纯合状态)，其在对应于人染色体14上第106,380,246位的位置处包含腺嘌呤；且任选与D3-3ref序列相比不含进一步突变。
230.条款226–229中任一项的脊椎动物、细胞或群体，其中所述多个包含人D3-3基因区段(任选两个拷贝和/或处于纯合状态)，其在对应于人染色体14上第106,380,246位的位置处包含胸腺嘧啶；且任选与D3-3a序列相比不含进一步突变。
多重人JL基因区段变体
这一配置的具体应用是提供如下的多重人JL基因区段(Jκ和/或Jλ)(如以段落编号80开始的编号段落中阐述的)。
80.具有基因组的非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)或非人脊椎动物细胞(例如ES细胞或B细胞)，所述基因组包含相同类型的至少3个人JL基因区段(例如Jκ1)，其中所述人JL基因区段中的至少两个是彼此不相同的变体。
81.具有基因组的非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)或非人脊椎动物细胞(例如ES细胞或B细胞)，所述基因组包含在相同Ig基因座处顺式的相同类型的至少2个不同的非内源JL基因区段(例如Jκ1)。
82.具有基因组的非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)或非人脊椎动物细胞(例如ES细胞或B细胞)，所述基因组包含在相同Ig基因座处反式的相同类型的至少2个不同的人JL基因区段(例如Jκ1)；和任选存在的相同类型的第三人JL基因区段，其中所述第三JL与所述2个不同的JL基因区段之一是顺式的。
83.包含人JL基因区段的库集的非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)群体，其中所述多个包含相同类型的至少2个不同的人JL基因区段(例如Jκ1)，所述不同的JL基因区段中的第一个在群体的第一脊椎动物的基因组中提供，并且所述不同的JL基因区段中的第二个在群体的第二脊椎动物的基因组中提供，其中所述第一脊椎动物的基因组不包含所述第二JL基因区段。
84.具有基因组的非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)或非人脊椎动物细胞(例如ES细胞或B细胞)，所述基因组包含相同类型的至少2个不同的非内源JL基因区段(例如Jκ1)，其中所述JL基因区段衍生自不同人类个体的基因组序列，所述人类个体在至少3代以上是遗传学不相关的。
85.增强非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)的人免疫球蛋白基因多样性的方法，所述方法包括给脊椎动物提供基因组，所述基因组包含相同类型的至少3个人JL基因区段(例如Jκ1)，其中所述人JL基因区段中的至少两个是彼此不相同的变体。
86.增强非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)的免疫球蛋白基因多样性的方法，所述方法包括给脊椎动物提供基因组，所述基因组包含在相同Ig基因座处顺式的相同类型的至少2个不同的非内源JL基因区段(例如Jκ1)。
87.增强非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)的免疫球蛋白基因多样性的方法，所述方法包括给脊椎动物提供基因组，所述基因组包含在相同Ig基因座处反式的相同类型的至少2个不同的人JL基因区段(例如Jκ1)；和任选存在的相同类型的第三人JL基因区段，其中所述第三JL与所述2个不同的JL基因区段之一是顺式的。
88.提供增强的人免疫球蛋白JL基因区段库集的方法，所述方法包括提供包含人JL基因区段的库集的非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)群体，其中所述方法包括提供相同类型的至少2个不同的人JL基因区段(例如Jκ1)，其中所述不同的JL基因区段中的第一个在群体的第一脊椎动物的基因组中提供，并且所述不同的JL基因区段中的第二个在群体的第二脊椎动物的基因组中提供，其中所述第一脊椎动物的基因组不包含所述第二JL基因区段。
89.增强非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)的人免疫球蛋白基因多样性的方法，所述方法包括提供具有基因组的脊椎动物，所述基因组包含相同类型的至少2个不同的非内源JL基因区段(例如Jκ1)，其中所述JL基因区段衍生自不同人类个体的基因组序列，所述人类个体在至少3代以上是遗传学不相关的。
90.段落80、82或84的脊椎动物或细胞，或段落85、82或89的方法，其中所述不同基因区段中的至少2或3个在所述基因组中的相同Ig基因座处以顺式提供。
91.段落80、81或82的脊椎动物或细胞，或段落85、86或87的方法，其中所述JL基因区段衍生自不同人类个体的基因组序列，所述人类个体在至少3代以上是遗传学不相关的。
92.段落80、81或82的脊椎动物或细胞，或段落85、86或87的方法，其中所述JL基因区段衍生自两个或更多个不同人类个体的基因组序列；任选其中所述不同人类个体来自不同人类群体。
93.段落92的脊椎动物、细胞或方法，其中所述个体是遗传学不相关的。
94.段落80–93中任一项的脊椎动物、细胞或方法，其中所述不同JL区段的至少一个是人类种系JL基因区段的合成突变体。
95.增强非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)的人免疫球蛋白基因多样性的方法，所述方法包括给脊椎动物提供基因组，所述基因组包含相同类型的至少2个人JL基因区段(例如Jκ1)，其中所述JL基因区段衍生自不同人类个体的基因组序列，所述人类个体在至少3代以上是遗传学不相关的；任选其中所述不同基因区段中的至少2或3个在所述基因组中的相同IgL基因座处提供。
96.段落80-82和84中任一项的脊椎动物或细胞，其中所述基因组包含分别补充有一个、两个或更多个人Jκ和/或Jλ基因区段的人Jκ和/或Jλ基因区段类型的基本上全部功能性库集，其中所述基本上全部功能性库集和补充性基因区段在人类个体的种系基因组中未发现在一起。
97.段落83的群体，其中所述群体包含分别补充有一个、两个或更多个人Jκ和/或Jλ基因区段的人JL基因区段类型的基本上全部功能性库集，其中所述基本上全部功能性库集和补充性基因区段在人类个体的种系基因组中未发现在一起。
98.具有基因组的非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)或非人脊椎动物细胞(例如ES细胞或B细胞)，所述基因组包含分别补充有一个、两个或更多个人Jκ和/或Jλ基因区段的人Jκ和/或Jλ基因区段类型的基本上全部功能性库集，其中所述基本上全部功能性库集和补充性基因区段在人类个体的种系基因组中未发现在一起。
99.非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)群体，其包含分别补充有一个、两个或更多个人Jκ和/或Jλ基因区段的人Jκ和/或Jλ基因区段类型的基本上全部功能性库集，其中所述基本上全部功能性库集和补充性基因区段在人类个体的种系基因组中未发现在一起。
100.根据段落81的非人脊椎动物或脊椎动物细胞，其包含基因组，所述基因组包括包含人基因区段的VL和JL基因库集，所述JL基因库集包含：
在所述基因组中的相同Ig基因座处以顺式的由至少2个不同的人Jκ1基因区段提供的多个人Jκ1基因区段；
在所述基因组中的相同Ig基因座处以顺式的由至少2个不同的人Jκ1基因区段提供的多个人Jκ2基因区段；
在所述基因组中的相同Ig基因座处以顺式的由至少2个不同的人Jκ1基因区段提供的多个人Jκ3基因区段；
在所述基因组中的相同Ig基因座处以顺式的由至少2个不同的人Jκ1基因区段提供的多个人Jκ4基因区段；
在所述基因组中的相同Ig基因座处以顺式的由至少2个不同的人Jκ1基因区段提供的多个人Jκ5基因区段；
在所述基因组中的相同Ig基因座处以顺式的由至少2个不同的人Jλ1基因区段提供的多个人Jλ1基因区段；
在所述基因组中的相同Ig基因座处以顺式的由至少2个不同的人Jλ2基因区段提供的多个人Jλ2基因区段；
在所述基因组中的相同Ig基因座处以顺式的由至少2个不同的人Jλ3基因区段提供的多个人Jλ3基因区段；
在所述基因组中的相同Ig基因座处以顺式的由至少2个不同的人Jλ4基因区段提供的多个人Jλ4基因区段；
在所述基因组中的相同Ig基因座处以顺式的由至少2个不同的人Jλ5基因区段提供的多个人Jλ5基因区段；
在所述基因组中的相同Ig基因座处以顺式的由至少2个不同的人Jλ6基因区段提供的多个人Jλ6基因区段；或
在所述基因组中的相同Ig基因座处以顺式的由至少2个不同的人Jλ7基因区段提供的多个人Jλ7基因区段；
任选其中所述JL基因区段衍生自两个或更多个不同人类个体的基因组序列。
101.根据段落80的非人脊椎动物或脊椎动物细胞(任选ES细胞或B细胞)，其包含基因组，所述基因组包括包含人基因区段的VL和JL基因库集，所述JL基因库集包含：
由至少3(例如3、4、5、6或7)个不同的人Jκ1基因区段提供的多个人Jκ1基因区段；
由至少3(例如3、4、5、6或7)个不同的人Jκ1基因区段提供的多个人Jκ2基因区段；
由至少3(例如3、4、5、6或7)个不同的人Jκ1基因区段提供的多个人Jκ3基因区段；
由至少3(例如3、4、5、6或7)个不同的人Jκ1基因区段提供的多个人Jκ4基因区段；
由至少3(例如3、4、5、6或7)个不同的人Jκ1基因区段提供的多个人Jκ5基因区段；
由至少3(例如3、4、5、6或7)个不同的人Jλ1基因区段提供的多个人Jλ1基因区段；
由至少3(例如3、4、5、6或7)个不同的人Jλ2基因区段提供的多个人Jλ2基因区段；
由至少3(例如3、4、5、6或7)个不同的人Jλ3基因区段提供的多个人Jλ3基因区段；
由至少3(例如3、4、5、6或7)个不同的人Jλ4基因区段提供的多个人Jλ4基因区段；
由至少3(例如3、4、5、6或7)个不同的人Jλ5基因区段提供的多个人Jλ5基因区段；
由至少3(例如3、4、5、6或7)个不同的人Jλ6基因区段提供的多个人Jλ6基因区段；或
由至少3(例如3、4、5、6或7)个不同的人Jλ7基因区段提供的多个人Jλ7基因区段；
任选其中所述JL基因区段衍生自两个或三个不同人类个体的基因组序列。
任选其中所述不同基因区段中的至少2或3个在所述基因组中的相同Ig基因座处以顺式提供。
102.段落104或105的脊椎动物或细胞，其中所述不同人类个体来自不同人类群体。
103.段落104-106中任一项的脊椎动物或细胞，其中所述个体是遗传学不相关的。
104.段落104-107中任一项的脊椎动物或细胞，其中所述不同JL基因区段中的至少一个是人类种系JL基因区段的合成突变体。
105.根据段落84的非人脊椎动物或脊椎动物细胞(任选ES细胞或B细胞)，其包括包含人VL和JL基因库集的基因组，所述JL基因库集包含：
由至少2个不同的人Jκ1基因区段提供的多个人Jκ1基因区段，任选在所述基因组中的相同Ig基因座处以顺式提供；
由至少2个不同的人Jκ1基因区段提供的多个人Jκ2基因区段，任选在所述基因组中的相同Ig基因座处以顺式提供；
由至少2个不同的人Jκ1基因区段提供的多个人Jκ3基因区段，任选在所述基因组中的相同Ig基因座处以顺式提供；
由至少2个不同的人Jκ1基因区段提供的多个人Jκ4基因区段，任选在所述基因组中的相同Ig基因座处以顺式提供；
由至少2个不同的人Jκ1基因区段提供的多个人Jκ5基因区段，任选在所述基因组中的相同Ig基因座处以顺式提供；
由至少2个不同的人Jλ1基因区段提供的多个人Jλ1基因区段，任选在所述基因组中的相同Ig基因座处以顺式提供；
由至少2个不同的人Jλ2基因区段提供的多个人Jλ2基因区段，任选在所述基因组中的相同Ig基因座处以顺式提供；
由至少2个不同的人Jλ3基因区段提供的多个人Jλ3基因区段，任选在所述基因组中的相同Ig基因座处以顺式提供；
由至少2个不同的人Jλ4基因区段提供的多个人Jλ4基因区段，任选在所述基因组中的相同Ig基因座处以顺式提供；
由至少2个不同的人Jλ5基因区段提供的多个人Jλ5基因区段，任选在所述基因组中的相同Ig基因座处以顺式提供；
由至少2个不同的人Jλ6基因区段提供的多个人Jλ6基因区段，任选在所述基因组中的相同Ig基因座处以顺式提供；或
由至少2个不同的人Jλ7基因区段提供的多个人Jλ7基因区段，任选在所述基因组中的相同Ig基因座处以顺式提供；
其中所述JL基因区段衍生自不同人类个体的基因组序列，所述人类个体在至少3代以上是遗传学不相关的。
106.段落109的脊椎动物或细胞，其中所述人类个体来自不同人类群体。
技术人员将认识到标准分子生物学技术可以用于提供用于本发明的包含免疫球蛋白基因区段(例如V、D和/或J)的合成组合的载体，从而使得该载体可以用于构建转基因免疫球蛋白基因座(例如使用如本领域已知的同源重组和/或重组酶介导的盒式交换，例如参见US7501552(Medarex)、US5939598(Abgenix)、US6130364(Abgenix)、W002/066630(Regeneron)、W02011004192(Genome Research Limited)、W02009076464、W02009143472和W02010039900(Ablexis)，所述专利的公开内容明确引入本文。例如，基因区段的此类合成组合可以使用标准重组工程技术在大肠杆菌中进行，以在使用同源重组或RMCE(例如使用cre/lox位点特异性重组)插入胚胎干细胞中之前构建容纳所述合成组合的BAC载体。重组工程的细节可以在www.genebridges.com处以及EP1034260和EP1204740中发现，所述专利的公开内容明确引入本文。
在一个实施方案中，使脊椎动物的免疫应答(和因此所得的前导抗体)偏向预定基因区段是有用的，所述基因区段例如已知在针对抗原例如感染性疾病病原体的抗原的天然人免疫应答中常用的基因区段。例如，VH1-69通常用于在人中产生针对流感病毒的抗体；因此，能够在本发明的基因座中包括VH区段VH1-69的两或更多个多态DNA形式。下文例子举例说明可以如何构建此类转基因基因座，其中多样性通过扩展基于天然存在的VH1-69多态性变体的VH1-69基因区段库集得到扩展。
在本发明的任何配置中的一个实施方案中，基因组已进行修饰以防止或减少完全内源抗体的表达。用于实现这点的合适技术的例子可以在PCT/GB2010/051122、US7501552、US6673986、US6130364、W02009/076464、EP1399559和US6586251中找到，所述专利的公开内容引入本文作为参考。在一个实施方案中，内源重链免疫球蛋白基因座的非人脊椎动物VDJ区、和任选存在的内源轻链免疫球蛋白基因座(λ和/或κ基因座)的VJ区已被失活。例如，非人脊椎动物VDJ区的全部或部分通过哺乳动物的内源重链免疫球蛋白基因座中的倒位被失活，任选伴随倒位区域在内源Ig基因座的上游或下游移动(参见例如W02011004192，所述专利的公开内容引入本文作为参考)。例如，非人脊椎动物VJ区的全部或部分通过哺乳动物的内源κ链免疫球蛋白基因座中的倒位被失活，任选伴随倒位区域在内源Ig基因座的上游或下游移动。例如，非人脊椎动物VJ区的全部或部分通过哺乳动物的内源λ链免疫球蛋白基因座中的倒位被失活，任选伴随倒位区域在内源Ig基因座的上游或下游移动。在一个实施方案中，内源重链基因座以这种方法被失活，如内源κ和λ基因座中的一个或二者一样。
另外或可替代地，脊椎动物已在遗传背景中生成，所述遗传背景防止成熟宿主B和T淋巴细胞的产生，任选RAG-1缺陷和/或RAG-2缺陷背景。关于生成RAG-1缺陷动物的技术参见US5859301。
因此，在本发明的任何配置或方面的一个实施方案中，内源重和轻链表达已被失活。
在一个实施方案中，每个所述基因座恒定区是重链内源非人脊椎动物(任选宿主小鼠或大鼠)恒定区。
在一个实施方案中，每个所述基因座恒定区是轻链内源非人脊椎动物(任选宿主小鼠或大鼠)恒定区。
本发明提供了通过根据本发明免疫至少一种脊椎动物(例如小鼠或大鼠)制备的单克隆或多克隆抗体组合物，任选其中所述抗原是感染性疾病病原体的抗原(例如细菌或病毒病原体抗原)，任选其中相同抗原用于免疫所有脊椎动物；任选其中一种或多种抗体是IgG型(例如IgG1)。
本发明还提供了由本发明的方法产生的单克隆或多克隆抗体混合物或其衍生抗体或混合物，例如其中一个或多个恒定区已被改变(例如置换为不同的恒定区例如人恒定区；或者突变以增强或消除Fc效应子功能)。在本发明的一个方面，提供了单克隆或多克隆抗体混合物用于治疗和/或预防人中的疾病或状况，例如用于治疗和/或预防感染性疾病，其中任选其中每种抗体结合感染性疾病病原体的抗原，优选相同抗原。
在本发明的一个方面，提供了根据本发明的分离的单克隆或多克隆抗体、或其突变型或衍生抗体在制造用于治疗和/或预防人中的疾病或状况例如感染性疾病的药物中的用途，任选其中所述感染性疾病是由细菌或病毒病原体引起的疾病。
突变型抗体的例子是相对于通过本发明的方法可获得或获得的分离的抗体(例如IgG型，例如IgG1型抗体)，在其可变区中具有直至15或10个氨基酸突变的抗体。衍生物的例子是这样的，其已进行修饰以用不同恒定区例如人恒定区置换恒定区，或者突变以增强或消除Fc效应子功能。
感染性疾病的例子是由细菌或病毒病原体引起或介导的疾病。例如，感染性疾病选自由选自下述的病原体引起的疾病：流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)、大肠杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)、疱疹病毒科病毒、巨细胞病毒(CMV)、HIV和流感病毒。
定制V(D)J掺入免疫球蛋白基因座用于生成针对感染性疾病的抗体
本发明人认识到将希望基于针对抗原例如感染性疾病病原体的抗原的天然人免疫应答，提供脊椎动物、细胞、方法等用于生产治疗和/或预防抗体。在这方面，文献观察到频繁使用的免疫球蛋白基因区段，以在人中产生抗感染应答(表9)。
在上文的多个配置、方面、实施方案和例子中，本发明为技术人员提供了选择免疫球蛋白基因区段的可能性，其方式使库集定制或偏向用于生成抗体以治疗和/或预防感染性疾病。本发明人已根据所得的抗体的所需应用分类下述基因区段组用于本发明。
列表A：
用于结合由病原体表达的抗原的抗体的免疫球蛋白基因区段
(a)选自下述的VL基因区段：VλII基因家族成员、VλVII 4A、VλII 2.1、VλVII 4A、Vλ1基因家族成员、Vλ3基因家族成员、IGLV1S2、Vλ3-cML70、Ialh2、lalvl、Ia3h3、Kv325、VκI基因家族成员、κI-15A(KL012)、VκII家族成员、VκIII家族成员、VκI基因家族成员、κI-15A(KL012)、VκII A2(任选A2a变体)、VκA27(Humkv325)和与其至少80％相同的基因区段。
(b)选自下述的Vλ基因区段：VλII基因家族成员、VλVII 4A、VλII 2.1、VλVII 4A、Vλ1基因家族成员、Vλ3基因家族成员、IGLV1S2、Vλ3-cML70、Ialh2、lalvl、Ia3h3和与其至少80％相同的基因区段。
(c)选自下述的Vκ基因区段：Kv325、VκI基因家族成员、κI-15A(KL012)、VκII家族成员、VκIII家族成员、VκI基因家族成员、κI-15A(KL012)、VκII A2(任选A2a变体)、VκA27(Humkv325)和与其至少80％相同的基因区段。
(d)VH基因区段：VHIII基因家族成员(任选VHIIIa或VHIIIb家族成员)、VHIV基因家族成员、VHIII 9.1(VH3-15)、VHIII VH26(VH3-23)、VH3-21、LSG6.1、LSG12.1、DP77(V3-21)、VH H11、VH1GRR、ha3h2、VHI-ha1c1、VHIII-VH2-1、VH4.18、ha4h3、Hv1051、71-2、Hv1f10、VH4.11、71-4、VH251、VH1-69和与其至少80％相同的基因区段。
(e)选自下述的Jλ基因区段：Jλ2、Jλ3和与其至少80％相同的基因区段。
(f)选自下述的D基因区段：Dk1、Dxp'1、Dn4r、D2r和与其至少80％相同的基因区段。
列表A1：
用于结合由细菌病原体表达的抗原的抗体的免疫球蛋白基因区段
(a)选自下述的Vλ基因区段：VλII基因家族成员、VλVII 4A、VλII 2.1、VλVII 4A和与其至少80％相同的基因区段。
(b)选自下述的Vκ基因区段：VκI基因家族成员、κI-15A(KL012)、VκII家族成员、VκIII家族成员、VκI基因家族成员、κI-15A(KL012)、VκII A2(任选A2a变体)、VκA27(Humkv325)和与其至少80％相同的基因区段。
(c)VH基因区段：VH3基因家族成员(任选VHIIIa或VHIIIb家族成员)、VHIII 9.1(VH3-15)、VHIII VH26(VH3-23)、VH3-21、LSG6.1、LSG12.1、DP77(V3-21)、VH H11和与其至少80％相同的基因区段。
(d)选自下述的Jλ基因区段：Jλ2、Jλ3和与其至少80％相同的基因区段。
(e)选自下述的JH基因区段：JH2、JH3、JH4和与其至少80％相同的基因区段。
列表A1.1：
用于结合由流感嗜血杆菌表达的抗原的抗体的免疫球蛋白基因区段
(a)选自下述的Vλ基因区段：VλII基因家族成员、VλVII 4A、VλII 2.1、VλVII 4A和与其至少80％相同的基因区段。
(b)选自下述的Vκ基因区段：VκII家族成员、VκIII家族成员、VκI基因家族成员、κI-15A(KL012)、VκII A2(任选A2a变体)、VκA27(Humkv325)和与其至少80％相同的基因区段。
(c)VH基因区段：VH3基因家族成员(任选VHIIIb家族成员)、VHIII 9.1(VH3-15)、VHIII VH26(VH3-23)、VH3-21、LSG6.1、LSG12.1、DP77(V3-21)和与其至少80％相同的基因区段。
(d)选自下述的Jλ基因区段：Jλ2、Jλ3和与其至少80％相同的基因区段。
列表A1.2：
用于结合由大肠杆菌或脑膜炎奈瑟氏菌表达的抗原的抗体的免疫球蛋白基因区 段
(a)VH基因区段：VH3基因家族成员(任选VHIIIa或VHIIIb家族成员)、VHIII 9.1(VH3-15)、VH H11、VHIII VH26(VH3-23)、与其至少80％相同的基因区段，例如VHIII 9.1+JH3；或VH H11+JH4；或VHIII VH26+JH2。
(b)选自下述的Vκ基因区段：VκI基因家族成员、κI-15A(KL012)和与其至少80％相同的基因区段。
(c)选自下述的Vλ基因区段：VλII基因家族成员、VλII 2.1和与其至少80％相同的基因区段。
(d)选自下述的JH基因区段：JH2、JH3、JH4和与其至少80％相同的基因区段。
A2：
用于结合由病毒病原体表达的抗原的抗体的免疫球蛋白基因区段
(a)选自下述的VH基因区段：VHIII基因家族成员、VHIV基因家族成员、VHIII-VH26(VH3-23)、VH1GRR、ha3h2、VHI-ha1c1、VHIII-VH2-1、VH4.18、ha4h3、Hv1051、71-2、Hv1f10、VH4.11、71-4、VH251、VH1-69和与其至少80％相同的基因区段。
(b)选自下述的Vλ基因区段：Vλ1基因家族成员、Vλ3基因家族成员、IGLV1S2、Vλ3-cML70、Ialh2、lalvl、Ia3h3和与其至少80％相同的基因区段。
(c)选自下述的Vk基因区段：Kv325和与其至少80％相同的基因区段。
(d)选自下述的JH基因区段：JH3、JH5、JH6和与其至少80％相同的基因区段。
(e)选自下述的D基因区段：Dk1、Dxp'1、Dn4r、D2r和与其至少80％相同的基因区段。
(f)选自下述的Jλ基因区段：Jλ2、Jλ3和与其至少80％相同的基因区段。
A2.1：
用于结合由疱疹病毒科(例如VZV或HSV)表达的抗原的抗体的免疫球蛋白基因区 段
(a)选自下述的VH基因区段：VHIII基因家族成员、VHIV基因家族成员、VHIII-VH26(VH3-23)、VH1GRR、ha3h2、VHI-ha1c1、VHIII-VH2-1、VH4.18、ha4h3和与其至少80％相同的基因区段。
(b)选自下述的Vλ基因区段：Vλ1基因家族成员、Vλ3基因家族成员、IGLV1S2、Vλ3-cML70、Ialh2、lalvl、Ia3h3和与其至少80％相同的基因区段。
(c)选自下述的JH基因区段：JH3、JH5、JH6和与其至少80％相同的基因区段。
(d)选自下述的D基因区段：Dk1、Dxp'1、Dn4r、D2r和与其至少80％相同的基因区段。
(e)选自下述的Jλ基因区段：Jλ2、Jλ3和与其至少80％相同的基因区段。
A2.2：
用于结合由CMV表达的抗原的抗体的免疫球蛋白基因区段
(a)选自下述的VH基因区段：Hv1051和与其至少80％相同的基因区段。
(b)选自下述的Vk基因区段：Kv325和与其至少80％相同的基因区段。
A2.3：
用于结合由HIV表达的抗原的抗体的免疫球蛋白基因区段
(a)选自下述的VH基因区段：71-2、Hv1f10、VH4.11、71-4、VH251、VH1-69和与其至少80％相同的基因区段。
A2.4：
用于结合由流感病毒表达的抗原的抗体的免疫球蛋白基因区段
(a)选自下述的VH基因区段：VH1-69和与其至少80％相同的基因区段。
因此，
当希望生成抗体或抗体混合物以治疗和/或预防感染性疾病时，在本发明的任何配置、方面、方法、例子或实施方案中使用的一个或多个V、D和/或全部J基因区段可以选自列表A1。因此，例如，在本发明的第一配置的(a)中，所述重链V基因区段选自列表A中的VH基因区段，任选伴随该列表中的D。
当希望生成抗体或抗体混合物以治疗和/或预防由细菌病原体引起或介导的感染性疾病时，在本发明的任何配置、方面、方法、例子或实施方案中使用的一个或多个或全部V、D和/或J基因区段可以选自列表A1。
当希望生成抗体或抗体混合物以治疗和/或预防由病毒病原体引起或介导的感染性疾病时，在本发明的任何配置、方面、方法、例子或实施方案中使用的一个或多个或全部V、D和/或J基因区段可以选自列表A2。
当希望生成抗体或抗体混合物以治疗和/或预防由流感嗜血杆菌引起或介导的感染性疾病时，在本发明的任何配置、方面、方法、例子或实施方案中使用的一个或多个或全部V、D和/或J基因区段可以选自列表A1.1。
当希望生成抗体或抗体混合物以治疗和/或预防由大肠杆菌或脑膜炎奈瑟氏菌引起或介导的感染性疾病时，在本发明的任何配置、方面、方法、例子或实施方案中使用的一个或多个或全部V、D和/或J基因区段可以选自列表A1.2。
当希望生成抗体或抗体混合物以治疗和/或预防由疱疹病毒科(例如VZV或HSV)引起或介导的感染性疾病时，在本发明的任何配置、方面、方法、例子或实施方案中使用的一个或多个或全部V、D和/或J基因区段可以选自列表A2.1。
当希望生成抗体或抗体混合物以治疗和/或预防由CMV引起或介导的感染性疾病时，在本发明的任何配置、方面、方法、例子或实施方案中使用的一个或多个或全部V、D和/或J基因区段可以选自列表A2.2。
当希望生成抗体或抗体混合物以治疗和/或预防由HIV引起或介导的感染性疾病时，在本发明的任何配置、方面、方法、例子或实施方案中使用的一个或多个或全部V、D和/或J基因区段可以选自列表A2.3。
当希望生成抗体或抗体混合物以治疗和/或预防由流感病毒引起或介导的感染性疾病时，在本发明的任何配置、方面、方法、例子或实施方案中使用的一个或多个或全部V、D和/或J基因区段可以选自列表A2.4。
任选地，本发明的基因座中的每个VH区段选自列表A1、A2、A1.1、A1.2、A2.1、A2.2、A2.3或A2.4。
任选地，本发明的基因座中的每个VL区段选自列表A1、A2、A1.1、A1.2、A2.1、A2.2、A2.3或A2.4。
任选地，本发明的基因座中的每个D区段选自列表A1、A2、A1.1、A1.2、A2.1、A2.2、A2.3或A2.4。
任选地，本发明的基因座中的每个JL区段选自列表A1、A2、A1.1、A1.2、A2.1、A2.2、A2.3或A2.4。
用于治疗和预防具有特定祖先的患者的抗体
已采取本文描述的广泛生物信息学分析练习，本发明人认识到该分析的输出已使得能够鉴定可用于产生基于抗体和VH结构域的药物的特定基因区段，所述基于抗体和VH结构域的药物对于患者的祖先(即基因型)专门定制。即，抗体可以在下述基础上进行选择：它们在转基因非人脊椎动物(例如具有转基因IgH基因座的小鼠或大鼠)中在体内制备并且特别衍生自在患者群体的成员中相对流行的基因区段，即衍生自相同人类祖先的个体。因为变体分布跨越不同群体而不同(参见表13)，所以这推测反映在这些群体中的有用变体基因类型的进化、适应和保守的作用。因此，通过根据本发明定制基于抗体的药物，能够匹配药物与群体基因偏向，因此目的在于制备用于该特定人类群体的更佳药物。更佳可以例如意指更有效、更好中和、更高靶抗原亲和力、更少免疫原性、更少的对药物的患者反应等。如药物研究与开发过程中标准的，这可以凭经验测定。
因此，本发明提供了下述实施方案(从条款345开始编号)：
345.用于施用于中国人患者的分离的抗体，所述抗体包含人重链，所述重链包含对于抗原特异性的可变结构域和恒定区，其中所述恒定区是这样的人恒定区，其选自在中国人群体中发现的表13中的恒定区(例如IGHG恒定区)并具有至少1或5％的累积频率；并且其中
(i)所述可变结构域衍生自所述人基因区段在非人脊椎动物中(例如小鼠或大鼠中)的重组；和/或(ii)所述可变结构域包含非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)AID模式突变和非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)模式突变。
在另一个实施方案中，本发明提供了
用于施用于中国人患者的分离的抗体，所述抗体包含人重链，所述重链包含对于抗原特异性的可变结构域和恒定区，其中所述恒定区是这样的人恒定区，其选自在中国人群体中存在的恒定区(例如IGHG恒定区)，具有至少5％的累积频率；并且其中
(i)所述可变结构域衍生自所述人基因区段在非人脊椎动物中(例如小鼠或大鼠中)的重组；和/或(ii)所述可变结构域包含非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)AID模式突变和非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)模式突变。
在一个例子中，恒定区在1000Genomes数据库中发现。在一个例子中，恒定区在表13中发现。
346.条款345的抗体，其中所述恒定区是IGHG1a、IGHG2a、IGHG3a、IGHG3b或IGHG4a恒定区。
347.条款345或346的抗体，其中所述可变结构域衍生自人VH基因区段与人D基因区段和人JH基因区段的重组，所述VH基因区段选自在中国人群体中发现的表13中的VH并具有至少5％的累积频率。
在另一个实施方案中，本发明提供了
条款345或346的抗体，其中所述可变结构域衍生自人VH基因区段与人D基因区段和人JH基因区段的重组，所述VH基因区段选自在中国人群体中存在的VH，具有至少5％的累积频率。
在一个例子中，基因区段在1000Genomes数据库中发现。在一个例子中，基因区段在表13中发现。
348.条款345、346或347的抗体，其中所述可变结构域衍生自人VH基因区段与人D基因区段和人JH基因区段的重组，所述D基因区段选自在中国人群体中发现的表13中的D并具有至少5％的累积频率。
在另一个实施方案中，本发明提供了
条款345、346或347的抗体，其中所述可变结构域衍生自人VH基因区段与人D基因区段和人JH基因区段的重组，所述D基因区段选自在中国人群体中存在的D，具有至少5％的累积频率。
在一个例子中，基因区段在1000Genomes数据库中发现。在一个例子中，基因区段在表13中发现。
349.条款345、346、347或348的抗体，其中所述可变结构域衍生自人VH基因区段与人D基因区段和人JH基因区段的重组，所述JH基因区段选自在中国人群体中发现的表13中的JH并具有至少5％的累积频率。
在另一个实施方案中，本发明提供了
条款345、346、347或348的抗体，其中所述可变结构域衍生自人VH基因区段与人D基因区段和人JH基因区段的重组，所述JH基因区段选自在中国人群体中存在的JH，具有至少5％的累积频率。
在一个例子中，基因区段在1000Genomes数据库中发现。在一个例子中，基因区段在表13中发现。
350.分离的VH结构域，其与条款347-349中任一项中所述的可变结构域相同，任选在其C末端与多肽(例如抗体Fc)融合。
在一个实施方案中，提供了与条款347-349中任一项中所述的可变结构域相同的分离的VH结构域，其为缀合物的部分，与标记(例如用于在患者中成像)或毒素(例如放射性毒性有效负荷，例如用于患者中的癌症治疗)或半衰期延长部分(例如人血清白蛋白的PEG)缀合。
351.药物组合物，其包含条款345-350中任一项的抗体或可变结构域连同药学可接受的赋形剂、稀释剂或药物(例如进一步的抗原特异性可变结构域、抗体链或抗体)。
352.用于施用于中国人患者的分离的抗体，所述抗体包含人重链，所述重链包含对于抗原特异性的可变结构域和恒定区，其中所述可变结构域衍生自人VH基因区段与人D基因区段和人JH基因区段的重组，所述VH基因区段选自在中国人群体中发现的表13中的VH并具有至少5％的累积频率；并且其中
(i)所述可变结构域衍生自所述人基因区段在非人脊椎动物中(例如小鼠或大鼠中)的重组；和/或(ii)所述可变结构域包含非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)AID模式突变和非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)模式突变。
在另一个实施方案中，本发明提供了
用于施用于中国人患者的分离的抗体，所述抗体包含人重链，所述重链包含对于抗原特异性的可变结构域和恒定区，其中所述可变结构域衍生自人VH基因区段与人D基因区段和人JH基因区段的重组，所述VH基因区段选自在中国人群体中存在的VH，具有至少5％的累积频率；并且其中
(i)所述可变结构域衍生自所述人基因区段在非人脊椎动物中(例如小鼠或大鼠中)的重组；和/或(ii)所述可变结构域包含非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)AID模式突变和非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)模式突变。
353.条款352的抗体，其中所述可变结构域衍生自人VH基因区段与人D基因区段和人JH基因区段的重组，所述D基因区段选自在中国人群体中发现的表13中的D并具有至少5％的累积频率。
在另一个实施方案中，本发明提供了
条款352的抗体，其中所述可变结构域衍生自人VH基因区段与人D基因区段和人JH基因区段的重组，所述D基因区段选自在中国人群体中存在的D，具有至少5％的累积频率。
在一个例子中，基因区段在1000Genomes数据库中发现。在一个例子中，基因区段在表13中发现。
354.条款352或353的抗体，其中所述可变结构域衍生自人VH基因区段与人D基因区段和人JH基因区段的重组，所述JH基因区段选自在中国人群体中发现的表13中的JH并具有至少5％的累积频率。
在另一个实施方案中，本发明提供了
条款352或353的抗体，其中所述可变结构域衍生自人VH基因区段与人D基因区段和人JH基因区段的重组，所述JH基因区段选自在中国人群体中存在的JH，具有至少5％的累积频率。
在一个例子中，基因区段在1000Genomes数据库中发现。在一个例子中，基因区段在表13中发现。
355.分离的VH结构域，其与条款352-354中任一项中所述的可变结构域相同，任选在其C末端与多肽(例如抗体Fc)融合。
在一个实施方案中，提供了与条款352-354中任一项中所述的可变结构域相同的VH结构域，其为缀合物的一部分，与标记(例如用于在患者中成像)或毒素(例如放射性毒性有效负荷，例如用于患者中的癌症治疗)或半衰期延长部分(例如人血清白蛋白的PEG)缀合。
356.药物组合物，其包含条款352-355中任一项的抗体或可变结构域连同药学可接受的赋形剂、稀释剂或药物(例如进一步的抗原特异性可变结构域、抗体链或抗体)。
357.用于治疗和/或预防中国人患者中的疾病或医学状况的抗体重链或VH结构域(例如作为抗体的部分提供)，其中所述重链是通过下述步骤产生的重链(或是此类重链的拷贝)：
(a)从非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)中选择抗原特异性抗体重链或VH结构域，其中所述重链或VH结构域衍生自人VH基因区段与人D基因区段和人JH基因区段的重组，所述VH基因区段选自在中国人群体中发现的表13中的VH并具有至少5％的累积频率；
(b)通过组合所述重链的可变结构域与人恒定区的任选重链人源化；或通过与人恒定区组合任选人源化所选VH结构域。
在另一个实施方案中，本发明提供了
用于治疗和/或预防中国人患者中的疾病或医学状况的抗体重链或VH结构域(例如作为抗体的部分提供)，其中所述重链是通过下述步骤产生的重链(或是此类重链的拷贝)：
(a)从非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)中选择抗原特异性抗体重链或VH结构域，其中所述重链或VH结构域衍生自人VH基因区段与人D基因区段和人JH基因区段的重组，所述VH基因区段选自在中国人群体中存在的VH，具有至少5％的累积频率；
(b)通过组合所述重链的可变结构域与人恒定区的任选重链人源化；或通过与人恒定区组合任选人源化所选VH结构域。
在一个例子中，VH基因区段在1000Genomes数据库中发现。在一个例子中，基因区段在表13中发现。
358.条款357的抗体重链或VH结构域，其中所述人恒定区如条款345或346中所述。
359.如条款357或358中所述的抗体重链或VH结构域，其用于治疗和/或预防中国人患者中的疾病或医学状况的药物中。
360.治疗和/或预防中国人患者中的疾病或医学状况的方法，所述方法包括给所述患者施用治疗或预防有效量的如条款357或358中所述的抗体重链或VH结构域。
361.用于施用于具有欧洲、东亚、西非、南亚或美洲祖先的患者的分离的抗体，所述抗体包含人重链，所述重链包含对于抗原特异性的可变结构域和恒定区，其中所述恒定区是这样的人恒定区，其选自分别在具有欧洲、东亚、西非、南亚或美洲祖先的群体中发现的表13中的恒定区(例如IGHG恒定区)并具有至少1或5％的累积频率；并且其中
(i)所述可变结构域衍生自所述人基因区段在非人脊椎动物中(例如小鼠或大鼠中)的重组；或(ii)所述可变结构域包含非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)AID模式突变和非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)模式突变。
在另一个实施方案中，本发明提供了
用于施用于具有欧洲、东亚、西非、南亚或美洲祖先的患者的分离的抗体，所述抗体包含人重链，所述重链包含对于抗原特异性的可变结构域和恒定区，其中所述恒定区是这样的人恒定区，其选自分别在具有欧洲、东亚、西非、南亚或美洲祖先的群体中存在的恒定区(例如IGHG恒定区)，具有至少1或5％的累积频率；并且其中
(i)所述可变结构域衍生自所述人基因区段在非人脊椎动物中(例如小鼠或大鼠中)的重组；或(ii)所述可变结构域包含非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)AID模式突变和非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)模式突变。
在一个例子中，恒定区在1000Genomes数据库中发现。在一个例子中，恒定区在表13中发现。
362.条款361的抗体，其中所述恒定区是IGHG1a、IGHG2a、IGHG3a、IGHG3b或IGHG4a恒定区并且所述患者具有欧洲祖先。
363.条款361或362的抗体，其中所述可变结构域衍生自人VH基因区段与人D基因区段和人JH基因区段的重组，所述VH基因区段选自在所述群体中发现的表13中的VH并具有至少1或5％的累积频率。
在另一个实施方案中，本发明提供了
条款361或362的抗体，其中所述可变结构域衍生自人VH基因区段与人D基因区段和人JH基因区段的重组，所述VH基因区段选自在中国人群体中存在的VH，具有至少5％的累积频率。
在一个例子中，基因区段在1000Genomes数据库中发现。在一个例子中，基因区段在表13中发现。
364.条款361、362或363的抗体，其中所述可变结构域衍生自人VH基因区段与人D基因区段和人JH基因区段的重组，所述D基因区段选自在所述群体中发现的表13中的D并具有至少1或5％的累积频率。
在另一个实施方案中，本发明提供了
条款361、362或363的抗体，其中所述可变结构域衍生自人VH基因区段与人D基因区段和人JH基因区段的重组，所述D基因区段选自在中国人群体中存在的D，具有至少5％的累积频率。
在一个例子中，基因区段在1000Genomes数据库中发现。在一个例子中，基因区段在表13中发现。
365.条款361、362、363或364的抗体，其中所述可变结构域衍生自人VH基因区段与人D基因区段和人JH基因区段的重组，所述JH基因区段选自在所述群体中发现的表13中的JH并具有至少1或5％的累积频率。
在另一个实施方案中，本发明提供了
条款361、362、363或364的抗体，其中所述可变结构域衍生自人VH基因区段与人D基因区段和人JH基因区段的重组，所述JH基因区段选自在中国人群体中存在的JH，具有至少5％的累积频率。
在一个例子中，基因区段在1000Genomes数据库中发现。在一个例子中，基因区段在表13中发现。
366.分离的VH结构域，其与条款363-365中任一项中所述的可变结构域相同，任选在其C末端与多肽(例如抗体Fc)融合。
367.药物组合物，其包含条款361-366中任一项的抗体或可变结构域连同药学可接受的赋形剂、稀释剂或药物(例如进一步的抗原特异性可变结构域、抗体链或抗体)。
368.用于施用于具有欧洲、东亚、西非或美洲祖先的患者的分离的抗体，所述抗体包含人重链，所述重链包含对于抗原特异性的可变结构域和恒定区，其中所述可变结构域衍生自人VH基因区段与人D基因区段和人JH基因区段的重组，所述VH基因区段选自分别在具有欧洲、东亚、西非、南亚或美洲祖先的群体中发现的表13中的VH并具有至少1或5％的累积频率；并且其中
(i)所述可变结构域衍生自所述人基因区段在非人脊椎动物中(例如小鼠或大鼠中)的重组；或(ii)所述可变结构域包含非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)AID模式突变和非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)模式突变。
在另一个实施方案中，本发明提供了
用于施用于具有欧洲、东亚、西非或美洲祖先的患者的分离的抗体，所述抗体包含人重链，所述重链包含对于抗原特异性的可变结构域和恒定区，其中所述可变结构域衍生自人VH基因区段与人D基因区段和人JH基因区段的重组，所述VH基因区段选自分别在具有欧洲、东亚、西非、南亚或美洲祖先的群体中存在的VH并具有至少1或5％的累积频率；并且其中
(i)所述可变结构域衍生自所述人基因区段在非人脊椎动物中(例如小鼠或大鼠中)的重组；或(ii)所述可变结构域包含非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)AID模式突变和非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)模式突变。
在一个例子中，VH基因区段在1000Genomes数据库中发现。在一个例子中，基因区段在表13中发现。
369.条款368的抗体，其中所述可变结构域衍生自人VH基因区段与人D基因区段和人JH基因区段的重组，所述D基因区段选自在所述群体中发现的表13中的D并具有至少1或5％的累积频率。
在另一个例子中，本发明提供了
条款368的抗体，其中所述可变结构域衍生自人VH基因区段与人D基因区段和人JH基因区段的重组，所述D基因区段选自在所述群体中存在的D，具有至少1或5％的累积频率。
在一个例子中，D基因区段在1000Genomes数据库中发现。在一个例子中，基因区段在表13中发现。
370.条款368或369的抗体，其中所述可变结构域衍生自人VH基因区段与人D基因区段和人JH基因区段的重组，所述JH基因区段选自在所述群体中发现的表13中的JH并具有至少1或5％的累积频率。
在另一个例子中，本发明提供了
条款368或369的抗体，其中所述可变结构域衍生自人VH基因区段与人D基因区段和人JH基因区段的重组，所述JH基因区段选自在所述群体中存在的JH并具有至少1或5％的累积频率。
在一个例子中，JH基因区段在1000Genomes数据库中发现。在一个例子中，基因区段在表13中发现。
371.分离的VH结构域，其与条款368-370中任一项中所述的可变结构域相同，任选在其C末端与多肽(例如抗体Fc)融合。
372.药物组合物，其包含条款368-371中任一项的抗体或可变结构域连同药学可接受的赋形剂、稀释剂或药物(例如进一步的抗原特异性可变结构域、抗体链或抗体)。
373.用于治疗和/或预防具有欧洲、东亚、西非、南亚或美洲祖先的患者中的疾病或医学状况的抗体重链或VH结构域(例如作为抗体的部分提供)，其中所述重链是通过下述步骤产生的重链(或是此类重链的拷贝)：
(a)从非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)中选择抗原特异性抗体重链或VH结构域，其中所述重链或VH结构域衍生自人VH基因区段与人D基因区段和人JH基因区段的重组，所述VH基因区段选自在所述群体中发现的表13中的VH并具有至少1或5％的累积频率；
(b)通过组合所述重链的可变结构域与人恒定区任选人源化所述重链；或通过与人恒定区组合任选人源化所选VH结构域。
在另一个实施方案中，本发明提供了
用于治疗和/或预防具有欧洲、东亚、西非、南亚或美洲祖先的患者中的疾病或医学状况的抗体重链或VH结构域(例如作为抗体的部分提供)，其中所述重链是通过下述步骤产生的重链(或是此类重链的拷贝)：
(a)从非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)中选择抗原特异性抗体重链或VH结构域，其中所述重链或VH结构域衍生自人VH基因区段与人D基因区段和人JH基因区段的重组，所述VH基因区段选自在所述群体中存在的VH，具有至少1或5％的累积频率；
(b)通过组合所述重链的可变结构域与人恒定区任选人源化所述重链；或通过与人恒定区组合任选人源化所选VH结构域。
在一个例子中，VH基因区段在1000Genomes数据库中发现。在一个例子中，基因区段在表13中发现。
374.条款373的抗体重链或VH结构域，其中所述人恒定区如条款361或362中所述。
375.如条款373或374中所述的抗体重链或VH结构域，其用于治疗和/或预防具有所述祖先的患者中的疾病或医学状况的药物中。
376.治疗和/或预防具有欧洲、东亚、西非、南亚或美洲祖先的患者中的疾病或医学状况的方法，所述方法包括给所述患者施用治疗或预防有效量的如条款373或374中所述的抗体重链或VH结构域。
在本文实施方案中，中国人患者可以是中国汉人患者。
在本文实施方案中，具有欧洲祖先的患者可以是具有北欧或西欧祖先、意大利祖先、英国或苏格兰祖先、芬兰祖先或伊比利亚祖先的患者。
在本文实施方案中，具有东亚祖先的患者可以是具有中国汉人祖先、日本人祖先、中国人傣人祖先、越南人祖先或京人祖先的患者。
在本文实施方案中，具有西非祖先的患者可以是具有约鲁巴人祖先、卢西亚人祖先、冈比亚人祖先或马拉维人祖先的患者。
在本文实施方案中，具有美洲祖先的患者可以是具有非裔美国人祖先、非洲加勒比人祖先、墨西哥人祖先、波多黎各人祖先、哥伦比亚人祖先或秘鲁人祖先的患者。
在本文实施方案中，具有南亚祖先的患者可以是具有阿洪姆人祖先、卡亚斯塔人祖先、Reddy祖先、马拉地人祖先或旁遮普人祖先的患者。
在任何方面的例子中，所述累积频率为至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95％。
应当理解本文描述的特定实施方案显示作为举例说明而不是限制本发明。本发明的主要特征在不偏离本发明的范围的情况下可以用于多个实施方案中。本领域技术人员将认识到，或能够使用不超过常规研究确定本文描述的特定程序的众多等价物。此类等价物视为在本发明的范围内且由权利要求涵盖。说明书中提及的所有出版物和专利申请指示本发明所属领域技术人员的技能水平。所有出版物和专利申请均引入本文作为参考，其程度与每个个别出版物或专利申请特别且个别指出引入本文作为参考相同。当在权利要求和/或说明书中与术语“包含”结合使用时，单词“一个”或“一种”的使用可以意指“一个/一种”，但它还可以与“一个或多个/一种或多种”、“至少一个/种”和“一个或超过一个/一种或超过一种”的含义一致。在权利要求中术语“或”的使用用于意指“和/或”，除非明确指出仅指替代方案或替代方案是相互排斥的，尽管公开内容支持仅指替代方案和“和/或”的定义。本申请自始至终，术语“约”用于指示值包括装置的固有误差变化，该方法用于测定值，或在研究对象中存在的变化。
如本说明书和一个或多个权利要求中使用的，单词“包含”(和任何形式的包含)、具有(和任何形式的具有)、包括(和任何形式的包括)、或含有(和任何形式的含有)是包括在内的或开放式的并且不排除另外未叙述的元件或方法步骤。
如本文使用的术语“或其组合”指在该术语前所列出的项目的所有排列和组合。例如，“A、B、C或其组合意欲包括下述中的至少一个：A、B、C、AB、AC、BC或ABC，并且如果次序在特定背景下是重要的，还包括BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。继续这一例子，明确包括的是含有一个或多个项目或术语的重复，例如BB、AAA、MB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等等。技术人员将理解通常不存在关于以任何组合的项目或术语数目的限制，除非上下文明显并非如此。
本公开内容的任何部分可以与公开内容的任何其他部分组合阅读，除非上下文明显并非如此。
本文公开和请求保护的组合物和/或方法的全部可以按照本公开内容进行制备且执行，无需过度实验。虽然本发明的组合物和方法已就优选实施方案而言进行描述，但对于本领域技术人员显而易见的是：可以对组合物和/或方法和在本文描述的方法的步骤和步骤顺序中施加变化，而不偏离本发明的概念、精神和范围。对本领域技术人员显而易见的所有此类相似替代和修饰视为在如由所附权利要求定义的本发明的精神、范围和概念内。
本发明在下述非限制性假想实施例中更详细地描述。
实施例
实施例1
“将多态V区加入小鼠基因组的重组工程BAC载体”
图1到3描述可以用于将多态V基因区引入基因组DNA内的重组工程方法(参见上文参考文献)。在一个实施方案中，通过标准技术将来自人重链区的基因组片段插入细菌人工染色体(BAC)载体。优选地，可以通过标准技术包括商购可得文库的序列搜索或通过与含有BAC的细菌菌落杂交以鉴定具有目的BAC的那些，从BAC文库中分离大小范围可为20-kb至200-kb或更多的此类BAC。
选择具有几个VH基因区段的BAC；在图1中，这些一般鉴定为例如VH[a]到VH[z]。本领域技术人员将容易鉴定适当的基因组片段，例如来自人VH5-78到VH1-68的大约120-kb片段，其包括5个内源活性VH基因区段和7个VH假基因。使用重组工程技术，内源VH基因区段可以置换为多态VH或VL基因区段。在这一例子中，需要两个步骤。第一个步骤将内源VH基因区段的V区编码外显子置换为正-负选择操纵子，在这一例子中，是编码氨苄青霉素抗性基因(Amp)和链霉素致敏核糖体蛋白(rpsL)的操纵子。某些细菌菌株可以通过对链霉素的抗性就rpsL基因的不存在进行选择。与在内源VH基因外显子侧翼的序列同源的短DNA段放置在rpsL-Amp操纵子的5'和3'。在适当的重组因子/标准重组工程技术(参见上文参考文献)的存在下，在操纵子片段和BAC之间的重组将导致内源VH基因外显子置换为操纵子(图1a)，其通过对氨苄青霉素的抗性加以选择。第二步骤使用相同同源序列以便将插入的操纵子置换为所需多态VH基因区段。在这一例子中，插入人VH1-69基因(图1b和1c)。特别地，使用VH1-69的*02变体[ref IMGT和图5]。由于操纵子特别是rpsL部分的丧失，在变得对链霉素抗性的细菌中选择多态VH基因区段的成功整合。
在这一例子中，可以对于每个内源VH基因区段或对于与希望置换为多态V基因区段一样多的内源基因区段重复所述两步过程(图1d)。
显而易见，任何多态V基因区段可以以这种方式插入并且任何内源V基因区段包括假基因均可以充当靶。重链和两个轻链基因座的每个中的V基因区段可以使用这种技术置换为可用作BAC插入物的适当基因组片段。
图2描述了用于产生编码多态V基因区段的基因组片段的另一种方法。在这一例子中，将多态V基因区段插入缺乏其他基因、控制元件或其他功能的基因组DNA区域内。此类‘沙漠(desert)’区可以基于序列分析和克隆到BAC内或在现有BAC文库中鉴定的相应的DNA片段加以选择。以此类基因组片段开始，重组工程技术可以用于以例如10-kb的间隔插入多态V基因区段。在这一例子中，150-kb基因组片段可以容纳高达15个多态V基因区段的插入。区段的插入是两步过程。第一重组工程步骤在特定位点处插入rpsL-Amp操纵子。与特定位点同源的序列用于置于操纵子侧翼。这些通过重组工程系统使用以将元件特异性插入BAC基因组片段内并且通过对氨苄青霉素的抗性选择阳性事件(图2a)。第二步骤通过相似的重组工程步骤，使用相同序列同源性，将基因组片段中的操纵子置换为多态V基因区段(图2b)。在这一例子中，插入多态VH基因区段的外显子和启动子元件两者，导致rpsL-Amp操纵子的置换和因此对链霉素的抗性(图2c)。
用于将多态V基因区段插入基因组片段上的特定位点的两步技术可以重复多次，产生具有几个多态基因区段包括其启动子元件的BAC基因组片段。显而易见的是可以组合图1和2中所示的例子，其中用于插入的技术可以用于将额外多态V基因区段加入BAC基因组片段，如图1中所示。可能选择将这些额外区段加入IG基因组片段，因为一旦插入非人哺乳动物的基因组内，此类片段就将更顺应适当的IG基因表达。已知基因组片段可以具有元件如增强子或促成某些染色质构象的元件，两者在野生型基因表达中都是重要的。
图3描述了产生具有多态V基因区段的基因组片段的另外方法。该方法依赖使用重组工程短(约50-150个碱基，优选100个碱基)单链DNA片段与同源序列重组的效率(Nat RevGenet.2001 Oct；2(10):769-79；Recombineering：a powerful new tool for mousefunctional genomics；Copeland NG，Jenkins NA，Court DL)。在重组工程中使用的重组酶优先结合且使用此类短单链DNA片段作为用于起始同源重组的底物。效率可以高达10-2，即阳性事件可以在得自重组工程的大约100个随机挑选(未选择)的克隆中发现。在这一例子中，当一种或多种单核苷酸变化引入单链片段内时发生的阳性事件转移至含有V基因区段和周围基因组DNA的BAC插入物，所述一种或多种核苷酸变化在BAC上的同源序列处发生。
例如，多态V基因区段可以与内源V基因区段相差仅1或2，或高达10或15个核苷酸变化。此类核苷酸多态性的例子在图5中描述。包含多态核苷酸变化的短单链区可以使用标准技术化学合成。将所得到的单链DNA片段引入细菌内并且经由重组工程技术，大约100个BAC片段中的1个将已经通过所述单链片段的同源掺入而掺入多态核苷酸(图3a)。具有所需核苷酸变化的BAC可以通过经由聚合酶链反应(PCR)扩增和测序(两者均通过标准技术)来筛选例如几百个个别克隆进行鉴定。在例子中，两个核苷酸变化将VH1-69*01基因区段转换成VH1-69*02基因区段(图3b)。
明确的是可以对于在单个BAC基因组片段上含有的多个内源V基因区段重复该过程。另外，图2中所述的技术可以通过插入现有V基因区段之间的区域内用于加入另外的多态V基因区段。如对于本领域技术人员显而易见的，这些技术的组合可以用于产生多态和内源人V基因区段的众多变化。另外显而易见的是可以组合具有工程化的多态V基因区段和内源人V基因区段的几个不同的基因组片段以产生甚至更多变化。
实施例2
“使用经修饰的BAC的SRMCE将多态V区加入基因组”
使用实施例1中所述的方法产生的具有多态V基因区段的经修饰的BAC可以用于改变非人哺乳动物的基因组。这些改变可以导致完整的IG基因座，其中正常免疫球蛋白区域重组导致包括人V基因区段的VDJ或VJ组合。此类动物可以如何制备的例子是使用图4中概述的策略通过改变例如小鼠胚胎干(ES)细胞的基因组。
将具有多态V基因区段的经修饰的BAC整合到基因组内的一种技术是顺序重组酶介导的盒交换(SRMCE)。该技术在WO2011004192(Genome Research Limited)中描述，其整体引入本文作为参考。
SRMCE提供了用在特定位置处插入的‘着陆垫(landing pad)’修饰的基因座。该插入可以经由同源重组从新形成或是由于先前BAC插入的结果。在这一例子中，着陆垫插入小鼠IGH基因座中最3'的J基因区段和Cμ基因区段之间，并且经由SRMCE技术的先前BAC插入已导致5个人V基因区段和2个V区假基因的加入。着陆垫具有如图4中所示的元件，其允许选择第二靶向BAC片段的正确插入。该插入的特异性由允许的lox位点之间cre重组酶介导的交换提供。lox位点仅允许与相容lox位点的重组。在这一例子中，loxP位点将仅与loxP重组，并且lox2272将仅与lox2272重组。这提供如图4b和4c中所述的BAC片段插入的方向性。
具有正确插入的ES细胞克隆通过对嘌呤霉素的抗性选自不含插入或具有非生产性插入的克隆库。对嘌呤霉素的抗性起因于活性启动子元件PGK与puroTK编码区的并列。正确插入通过标准技术包括连接处的PCR、内部元件的PCR、Southern印迹、比较基因组杂交(CGH)、测序等加以验证。在例子中，正确的lox2272-lox2272和loxP-loxP重组还导致在插入前不存在的完整两组piggyBac元件。完整的piggyBac元件包含一组反向重复，其在图中由"PB5'"和"PB3'"描述。适当定向的piggyBac元件组是piggyBac转座酶的底物，其可以催化元件之间的重组，导致间插序列以及两个元件的缺失。在piggyBac转座后剩余的DNA保持完整并且缺乏piggyBac元件的任何残留部分。在例子中，具有成功piggyBac转座的ES细胞克隆通过活性puroTK元件的丧失选择，所述活性puroTK元件致使细胞对药物FIAU具有抗性(图4c和4d)。
这一例子中的SRMCE法的最终产物是在5'侧上的小鼠基因组的序列和在3'侧上的小鼠IGH恒定区基因区段之间，具有连同一组内源未修饰VH基因区段一起插入的几个多态V基因区段的IGH基因座。多态V基因区段这样定位，从而使得它们可以参与和B细胞成熟相关的重组事件，获得VDJ基因区段。这些基因区段随后可以转录且剪接至小鼠恒定区。这些转录物的翻译将导致由多态V基因区段编码的抗体重链、人DH基因区段、人JH基因区段和小鼠恒定重链基因区段的产生。
如技术人员众所周知的，经由所述细胞注射入小鼠胚泡胚胎内，将注射的胚胎转移到合适的接受者并且培养产生的嵌合后代，ES细胞克隆可以用于产生遗传修饰的小鼠系。经修饰的基因座可以通过育种扩散，并且取决于遗传杂交制备为杂合或纯合的。
由这一例子中提供的IGH基因座的结构和涉及B细胞受体(BCR)的机制和抗体基因重排的知识显而易见的是，将产生多态V基因区段与多种DH和JH基因区段的大量不同组合，并且这些可以促成在遗传修饰动物中的B细胞群体中的功能性抗体基因的大的库集。在这一例子中，掺入几种不同的人VH1-69多态性以提供超人VH多样性。这个特定VH基因区段已知在抗体中流行，其结合感染性疾病病原体(例如流感病毒)和因此具有该例子的遗传修饰的小鼠的抗体库集将预期产生这样的抗体，其具有有利于结合感染性疾病病原体的那些的偏向。换言之，所述库集将具有更大的抗体子集，对于病原体抗原具有优良亲和力。此类病原体的例子包括流感病毒、丙型肝炎病毒(HCV)和人免疫缺陷病毒-1(HIV-1)(还参见上表)。
实施例3
"13个VH1-69等位基因的比对"
通过掺入另外的V基因区段多态性构建更多样的抗体库集需要V基因区段的多态性变体的可用性。此类变体的一个资源包括序列数据库。在这一例子中，提供了VH1-69基因区段的13种不同变体。
这些变体序列和比较由"IMmunoGeneTics"IMGT Information System(www.imgt.com)数据库抽提。图5是变体*02到*13与*01变体的比对简图。VH1-69*01核苷酸和氨基酸序列在图的上部提供。当剩余变体与*01变体序列相同时，在序列下插入破折号。核苷酸差异沿适当变体注明，并且如果序列变化导致蛋白质编码变化，则氨基酸变化在三联体上指出。
图5描述与*01变体相比较，关于每种变体的1–4个氨基酸变化。所有氨基酸变化均在编码互补决定区(CDR)的重链蛋白质的部分中发生。这些区域负责抗原特异性和抗体对于抗原的亲和力。显而易见的是在抗体库集中提供另外的多态CDR将增加存在对于多种抗原具有优良结合特征的可能性。在几个报告中，已观察到VH1-69编码的重链可变区通常在结合流感病毒、HCV和HIV-1抗原的抗体中发现(参见上表)。因此，使用实施例1和2的方法将这一实施例的多态V基因区段掺入转基因动物模型内将可能导致具有更多抗体的所述转基因动物中的抗体库集，所述抗体结合与这些及其他病原体相关的抗原。另外如本领域已知的，更大的库集增加使用例如杂交瘤技术发现单克隆抗体的概率，所述单克隆抗体以高亲和力和特异性与所需抗原结合。
本公开内容因此在这些实施例中描述了转基因小鼠模型，其可以用病原体或其他抗原免疫。来自此类免疫的小鼠的血浆B细胞可以用于制备杂交瘤文库，其可以筛选结合病原体抗原的抗体产生。考虑到多态VH1-69基因区段加入所述转基因小鼠中的IGH基因座，该文库将优于来自用于发现此类抗体的常规转基因小鼠的文库。
这些实施例并不限于可以选择的人多态V基因区段或用于将其引入动物模型内的方法。该方法可以用于构建具有免疫球蛋白D和/或J区段的转基因基因座。V、D、J区段可以来自多个人来源(任选超过一个人类种族群体)。
实施例4
选自1000Genomes数据库的人IgH JH基因变体
呈现关于人JH2、5和6变体的数据。在表10A、11A和12A中，列出了来自多个群体的人类的样品，其中本发明人的序列分析已揭示在一个或两个IgH JH等位基因中多态性的存在。群体代码在上表8中说明。多态性是来自JH2、5和6参考序列(分别为SEQ ID NO：1、2和3；参见下文)的核苷酸变体。所有参考文献是得自Ensembl数据库(www.ensembl.org)的序列。JH5参考是公开于该数据库中的人IgH J5-001。JH6参考是公开于该数据库中的人IgH J6-001。JH2参考是公开于该数据库中的人IgH J2-001。
参考核苷酸和编码的氨基酸序列在下一页上显示。还提供了与编码氨基酸序列的比对，包括在人染色体14上的相应位置编号。
变体频率显示于表10A、11A和12A并且这些与1000Genomes数据库(于2011年10月的目前发行版本)中的变体频率相关。
表10B、11B和12B显示在人JH变体中的非同义核苷酸多态性，如通过本发明人从1000Genomes数据库分选的。对于变体位置显示对应于人染色体14上的核苷酸位置的位置编号(染色体14是人中具有IgH基因座的染色体)。因此，例如，表11B中的第一个条目是"14:106330027:A/C"，其指变体JH5序列中的位置，其中该位置对应于人染色体14上第106,330,027位，此类位置是参考序列中的A(腺嘌呤)。“C”指出本发明人观察到在1000Genomes数据库中发现的变体中该位置处至胞嘧啶的突变。该变化导致在编码序列的氨基酸水平上的变化(即“非同义”变化)，在这种情况下，在变体中从丝氨酸(在参考中发现)到丙氨酸的变化。
实施例5：
人抗体基因区段变体鉴定和群体分析
使用来自GRCh.p8Human Genome汇编(www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/ assembly/grc)的坐标从Ensembl WWW网站(www.ensembl.org)鉴定用于变体分析的关于每种靶基因的基因组编码区坐标。使用收集的基因位置坐标，使用Perl'Variant PatternFinder'(VPF-www.1000genomes.org/variation-pattern-finder-api-documentation)从1000 Genomes Project的公开ftp网站处提取变体数据。
由VPF提取的数据使用软件进行后加工以提取具有其相关基因型调用的所有非同义(NSS)变体。汇集基因型调用以形成独特单元型，代表与1000Genome群体组相关的NSS变体组和在这些群体内的出现频率。
分析结果的输出导致表例如表13。该表的主体描述每种单元型，依次给出关于该基因的独特ID(在范围a-z,aa-zz中)，个体和独特群体组中的群体频率和出现；一个或多个后续列描述在每个位置处的DNA碱基调用，其形成给出来自参考序列的碱基或变体碱基调用的单元型。
表13以这种方式构建。表可以如下阅读：
前四列(左至右)由下述组成：(1)单元型ID字母('ref'指出参考–在来自GRCh37Human Reference Assembly的每个基因组位置处的DNA碱基调用)，(2)在不同群体中观察到的单元型累积频率，(3)在其中观察到特异性单元型的个体数，(4)鉴定的个体属于的独特群体组编号(实际群体组标识符展示为关于每个单元型的最右侧列中的ID串。例如，单元型'a'具有'3,4,9,13'的群体ID串)。
群体如下编号(群体标记根据1000Genomes Project命名法)
1＝ASW；
2＝CEU；
3＝CHB；
4＝CHS；
5＝CLM；
6＝FIN；
7＝GBR；
8＝IBS；
9＝JPT；
10＝LWK；
11＝MXL；
12＝PUR；
13＝TSI；
14＝YRI。
后续列详述单个点变体且具有下述格式(上到下)：(1)变体的人基因组位置(格式[染色体编号]:[位置]例如'14:106204113')；(2)如DbSNP(www.ncbi.nlm.nih.gov/ projects/SNP/)中定义的关于点变体的标识符；(3)一行或另外行显示由于特定转录物的变体导致的氨基酸变化(对于每行在最右侧列中的Ensembl转录物ID指示)，格式是参考序列中的氨基酸，随后为'->'，和在参考序列中由变体取代引起的氨基酸(例如'Gly->Arg'意指翻译的参考序列将导致在该位置处的甘氨酸，而鉴定变体的取代将导致含有精氨酸的翻译蛋白质)，使用IUPAC三字母氨基酸代码(http://pac.iupac.org/publications/pac/ pdf/1972/pdf/3104x0639.pdf)。后续行(一个/单元型)显示在每个位置处的DNA碱基，匹配参考序列的碱基以白色背景上的黑色显示，与参考不同的碱基显示为在黑色背景上的白色文字。
最右侧的列含有关于每个基因转录物的Ensembl转录物ID(例如'ENST00000390542')，并且涉及对这列左侧的氨基酸变化。因为转录物是不同长度，每个变体位置可以具有或不具有在该位置处的相关氨基酸变化。
实施例6：
基于人JH6*02的转基因小鼠、B细胞、杂交瘤、抗体和重链
功能性人基因区段库集(从VH2-26到JH6，关于人IgH基因座的结构参见IMGT数据库；http://www.imgt.org/IMGTrepertoire/index.php？section＝LocusGenes& repertoire＝locus&species＝h uman&group＝IGK)由本发明人分区(sectored)以产生两种不同的转基因重链等位基因(指示S2F和S3F)和相应小鼠。转基因等位基因在小鼠中表达并且在RNA转录物水平上评价重链库集。使用生物信息学方法执行深入序列分析以评价V、D和JH基因使用，在可变结构域序列中包括具有至少20个氨基酸的HCDR3长度。通过倒位失活内源小鼠可变区基因区段(按照WO2011004192中所述的方法，本公开内容引入本文作为参考)。
人供体DNA样品的测序：保守JH6*02变体的鉴定
通过获得颊拭子获得来自9个匿名知情人供体的DNA样品。
将样品加工并且根据QIAamp DNA Mini Kit(目录号51304，Qiagen)的方案提取DNA样品。
设置PCR反应以扩增JH6区，并且测序PCR产物(PCR寡核苷酸序列：正向5'-AGGCCAGCAGAGGGTTCCATG-3'(SEQ ID NO：444)，反向5'-GGCTCCCAGATCCTCAAGGCAC-3'(SEQID NO：445))。
通过与来自IMGT注释数据库(http://www.imgt.org/)的JH6参考序列比较执行序列分析，并且这鉴定所有9个供体基因组均含有人JH6*02变体，其中该变体在9个供体中的7个中处于纯合状态。本发明人还咨询在Ensembl人基因组数据库[http://www.ensembl.org/]处对于Jim Watson和Craig Venter可公开获得的基因组序列。这些也含有人JH6*02变体。本发明人证实人JH6*02是人中的共同的保守变体，并且因此是按照本发明用于构建转基因IgH基因座的良好候选物。
合适的人DNA序列BAC的鉴定
基于基因名称(IGH)或位置(染色体14：106026574-107346185)从Ensemble(http://www.ensembl.org/index.html)或UCSC(http://genome.ucsc.edu/)人数据库搜索鉴定一系列人细菌人工染色体(BAC)克隆。选择七个人RP11 BAC克隆(参见图10中的UCSC数据库的提取，鉴定的BAC是环状的)，RP11-1065N8 BAC携带人JH6*02。总之，下述BAC鉴定为人IgH基因座DNA的来源：RP11-1065N8、RP11-659B19、RP11-141I7、RP-112H5、RP11-101G24、RP11-12F16和RP11-47P23。
使用相似方法，可以选择不同BAC克隆(例如不同RP11克隆ID或来自RP11的不同来源)或遗传工程化的BAC用于插入小鼠IgH基因座内以提供转基因小鼠中的人库集的不同组。
转基因IgH基因座的构建
来自第1IGH BAC(RP11-1065N8)的人重基因区段插入小鼠AB2.1 ES细胞(BaylorCollege of Medicine)的IGH基因座内以产生示为S1等位基因的重链等位基因。插入的人序列对应于人染色体14从第106494908位到第106328951位的序列并且包含功能性重链基因区段VH2-5、VH7-4-1、VH4-4、VH1-3、VH1-2、VH6-1、D1-1、D2-2、D3-9、D3-10、D4-11、D5-12、D6-13、D1-14、D2-15、D3-16、D4-17、D5-18、D6-19、D1-20、D2-21、D3-22、D4-23、D5-24、D6-25、D1-26、D7-27、JH1、JH2、JH3、JH4、JH5和JH6(按5'至3'次序)，其中JH6选择为人JH6*02变体。插入在小鼠染色体12上第114666435和114666436位之间，其为小鼠Cμ区的上游。小鼠VH、D和JH基因区段保留在基因座中，插入的人重链DNA的紧邻上游(5')。
构建第二等位基因S2，其中通过来自第二BAC(BAC2)的人DNA的顺序插入，更多的人功能性VH基因区段插入S1等位基因中插入的最5'VH的上游(5')。来自BAC2的插入的人序列对应于人染色体14从第106601551位到第106494909位的序列并且包含功能性重链基因区段VH3-13、VH3-11、VH3-9、VH1-8、VH3-7。小鼠VH、D和JH基因区段保留在基因座中，插入的人重链DNA的紧邻上游(5')。在后续步骤中，将这些倒位以使其失活，从而产生其中仅人重链可变区基因区段是活性的S2F小鼠。
构建第三等位基因S3，其中通过来自第三BAC(BAC3)的人DNA的顺序插入，更多的人功能性VH基因区段插入S2等位基因中插入的最5'VH的上游(5')。插入的序列对应于人染色体14从第106759988位到第106609301位的序列并且包含功能性重链基因区段VH2-26、VH1-24、VH3-23、VH3-21、VH3-20、VH1-18和VH3-15。小鼠VH、D和JH基因区段保留在基因座中，插入的人重链DNA的紧邻上游(5')。在后续步骤中，将这些倒位以使其失活，从而产生其中仅人重链可变区基因区段是活性的S3F小鼠。
使用标准程序由ES细胞生成具有插入内源重链基因座的S2F或S3F的小鼠。在小鼠内通过包含neoR的失活序列插入小鼠JH-Cμ内含子(以产生"HA"等位基因)内失活其他内源重链基因座。
免疫程序
S2F或S3F基因型的转基因小鼠用商业获得或内部产生的20-40ug重组蛋白质初免，经由ip途径使用在完全弗氏佐剂(Sigma F 5881)和10ug/动物CpG(CpG寡核苷酸；Invivogen，San Diego，California，USA)中的抗原1(OVλ(Sigma A7641)；抗原2(人感染性疾病病原体抗原)和抗原3(人抗原)并且随后用在不完全弗氏佐剂(Sigma F 5506)和10ug/动物的CpG中的约一半抗原量以约两周间隔加强两次。末次加强在两周后无需任何佐剂iv施用，并且含有在PBS中的5-10ug蛋白质。
杂交瘤融合程序
在末次加强后3天获得脾，用CpG(25μm终浓度)处理脾细胞且静置直至第二天。使用BTX ECM2001电融合仪器，随后使细胞与SP0/2Ag14骨髓瘤细胞(HPA Cultures目录号85072401)融合。使融合细胞静置以恢复20分钟，随后种植在T75烧瓶中直至第二天早晨。随后将细胞离心且通过稀释系列在96孔培养板上铺平板并且在筛选前静置约10天。培养基在该时期中改变1-3次。
筛选
使用均相时间分辨荧光测定法(htrf)使用铕穴状化合物(Europium cryptate)标记的抗小鼠IgG(Cisbio抗小鼠Ig铕穴状化合物)和生物素标签的靶抗原与商购可得的链霉抗生物素蛋白缀合的供体(Cisbio；链霉抗生物素蛋白缀合的D2)或通过IgG特异性384孔ELISA筛选上文杂交瘤孔的培养上清液。通过htrf鉴定的阳性孔放大到24孔板或立即使用IgG特异性检测ELISA法反筛选(counterscreened)。通过初级ELISA筛选鉴定的阳性立即扩大至24孔板。一旦培养物扩大至24孔阶段且达到汇合，就使用htrf或IgG特异性ELISA再测试上清液以证实与靶抗原的结合。随后还通过表面等离子体共振使用BioRad ProteOnXPR36仪器分析此类证实的培养物的上清液。对于这点，在杂交瘤培养物中表达的抗体捕获在具有抗小鼠IgG(GE Healthcare BR-1008-38))共价偶联的生物传感器芯片表面的生物传感器GLM芯片(BioRad 176-512)上。抗原随后用作分析物且经过捕获的杂交瘤抗体表面。对于抗原2和抗原3，通常使用256nM、64nM、16nM、4nM和1nM的浓度，对于抗原1，通常使用1028nM、256nM、64nM、16nM和4nM的浓度，使用0nM注射(即单独的缓冲液)双重参考结合曲线。使用BioRad ProteOn XPR36分析软件固有的1:1模型测定动力学和总体亲和力。
具有证实的结合活性的任何克隆用于制备总RNA并且随后通过PCR以回收重链可变区序列。执行标准5'-RACE以分析来自S2F和S3F小鼠中的转基因重链基因座的RNA转录物。另外，执行由小鼠产生的大约2000种序列的深入序列分析。
生物信息学分析
用于分析的序列得自两种不同方法：
·第一种来自由脾提取的RNA：使用基于小鼠IgH基因座的Cμ区的寡核苷酸作为PCR模板合成第一条cDNA链。使用该寡核苷酸与寡核苷酸dT-锚定引物进行PCR。随后将PCR产物克隆到pDrive载体(Qiagen)并且随后测序。
·第二种来自通过电融合生成的杂交瘤：使用标准Trizol方法从目的杂交瘤系提取总RNA并且在-80℃下冷冻用于长期贮存。使用标准Superscript III逆转录酶以及与用于重链的所有小鼠IgG同种型结合的基因特异性反向引物和用于轻链扩增的小鼠κ恒定区引物，由100ng总RNA生成cDNA。2-3ul cDNA随后用作PCR反应中的模板，使用Pfu DNA聚合酶和一组对人免疫球蛋白可变结构域的前导序列退火的简并正向引物以及一种小鼠泛IgG反向引物。PCR产物在1％琼脂糖凝胶上运行并且提取纯化大约350-450碱基对的条带。随后测序DNA。
来自第一种方法的序列可以来自首次用于实验的小鼠的IgM或来自免疫小鼠的IgG。来自第二种方法的样品均来自免疫小鼠的IgG，并且对免疫抗原特异性。分析大约2000种序列。
序列作为一对正向和反向读数获得。首先将这些修剪以去除来自读数末端的低质量碱基调用(从两个末端修剪直至19核苷酸窗具有25或更多的平均质量评分)。通过获得反向读数的反向互补体，并且使其针对正向读数比对，将读数组合在一起。比对评分对于匹配为5，对于错配为-4，缺口开放罚分10和间隙延伸罚分1。通过步进经过比对且比较碱基产生共有序列。当存在不一致时，使用来自测序的具有最高质量值的碱基。
BLAST+(Basic Local Alignment Search Tool)(Camacho C.，Coulouris G.，Avagyan V.，Ma N.，Papadopoulos J.，Bealer K.，&Madden T.L.(2008)"BLAST+：architecture and applications."BMC Bioinformatics 10:421http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20003500)程序'blastn'随后用于发现在每种序列中使用的种系J和V区段。字长30用于V匹配，15用于J匹配。针对搜索的数据库由BAC的NGS测序构建，其用于生成Kymouse。
如果序列匹配V和J区段，则两者之间的序列随后与小鼠中的种系D区段的数据库比较，使用'blastn'与字长4以及选项'blastn-short'和'ungapped'。如果可能，这用于分配D区段。通过在V区段中搜索保守的"TATTACTGT"序列和在J区段中的"CTGGGG"鉴定CDR3。如果未发现这些基序，则随后允许高达4个错配。使用IMGT的CDR3定义，因此CDR3长度从V中的"TGT"后到J中的"TGG"前计算。排除具有异读框连接(不具有可除以3的CDR3核苷酸长度的那些)或含有终止密码子("TAA"、"TAG"或"TGA")的序列。
匹配V、J和D区段的鉴定以及来自该分配的CDR长度随后保存作为用于下游分析的表。使用的IGHJ6*02比例从首次用于实验到免疫小鼠增加，以及富含具有长HCDR3(定义为由20个或更多个氨基酸组成)的序列亚群：
这显示通过免疫选择JH6*02基因区段，因为JH6*02使用的比例在免疫后增加。JH6*02也用于具有长HCDR3长度的大多数抗体中，所述长HCDR3长度对于由长HCDR3长度抗体特异性结合的靶是希望的。
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***

Claims (21)

1.一种用于产生对靶抗原具有特异性的重链、VH结构域或抗体的方法，其中所述重链、VH结构域或抗体包含长度至少20个氨基酸的HCDR3，所述方法包括
提供非人脊椎动物，任选小鼠或大鼠，其具有包含免疫球蛋白重链基因座的基因组，所述重链基因座包含位于恒定区上游的未重排的人基因区段JH6*02、一个或多个VH基因区段和一个或多个D基因区段；其中所述重链基因座中的基因区段可操作地连接其恒定区，从而所述脊椎动物能够产生由人JH6*02与人D区段和人VH区段重组产生的抗体重链，
其中所述JH6*02基因区段包含如下核苷酸序列：ATTACTA CTACTACTAC GGTATGGACGTCTGGGGCCA AGGGACCACG GTCACCGTCT CCTCAG；以及
其中所述脊椎动物经靶抗原免疫并产生对所述靶抗原具有特异性的抗体重链，其中所述重链的可变结构域是人VH、D和JH6*02之间重组的产物，并且其中HCDR3长度是至少20个氨基酸；以及
从所述非人脊椎动物分离对靶抗原具有特异性的重链、VH结构域或抗体或者产生所述重链、VH结构域或抗体的细胞，其中所述重链、VH结构域或抗体包含衍生自人JH6*02与人VH基因区段和人D基因区段重组的HCDR3；
任选其中所述基因座的恒定区是非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)恒定区，并且用人恒定区置换分离的重链或抗体的非人恒定区。
2.权利要求1的方法，包含从所述脊椎动物中取出B淋巴细胞且选择表达与所述抗原结合的抗体的一或多个B淋巴细胞，任选使所述选择的B淋巴细胞或其后代永生化，任选通过由其产生杂交瘤进行，和分离由所述B淋巴细胞表达的抗体。
3.权利要求2的方法，其还包含从所述B淋巴细胞分离编码所述抗体的核酸。
4.前述权利要求任一项的方法，其中所述基因座的恒定区是非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)恒定区，并且所述方法还包含用人恒定区置换分离的重链或抗体的非人恒定区。
5.权利要求3的方法，其还包含用编码人或人源化重链恒定区的核苷酸序列交换所述抗体的重链恒定区核苷酸序列，且任选亲和力成熟所述抗体的可变区。
6.权利要求3或5的方法，其还包含将所述核酸插入表达载体以及任选地插入宿主细胞。
7.权利要求6的方法，其包含表达来自宿主细胞的重链、VH结构域或抗体并提供分离的重链、VH结构域或抗体。
8.一种具有基因组的非人脊椎动物细胞，所述基因组包含：
相同类型的至少3个人可变区基因区段，其中所述人基因区段中的至少两个是彼此不相同的变体；
在相同Ig基因座处顺式的相同类型的至少2个不同的人可变区基因区段；
在相同Ig基因座处反式的相同类型的至少2个不同的人可变区基因区段；或者
相同类型的第一和第二人Ig基因座基因区段，其中所述第一基因区段是选自表1–7和9–14中任一个的基因区段并且所述第二基因区段是相应参考序列。
9.一种增强非人脊椎动物的人免疫球蛋白基因多样性的方法，所述方法包括给脊椎动物提供权利要求8中限定的基因组。
10.一种提供增强的人免疫球蛋白可变区基因区段库集的方法，所述方法包括：
提供包含人可变区基因区段的库集的非人脊椎动物群体；
提供相同类型的至少2个不同的人可变区基因区段，其中所述不同的基因区段中的第一个在群体的第一脊椎动物的基因组中提供，并且所述不同的基因区段中的第二个在群体的第二脊椎动物的基因组中提供，其中所述第一脊椎动物的基因组不包含所述第二基因区段。
11.一种其基因组共同编码抗体库集的抗体生产转基因细胞的文库，其中
(a)第一转基因细胞表达具有由第一免疫球蛋白基因编码的链的第一抗体，该基因包含在第一人未重排免疫球蛋白基因区段重组后产生的第一可变结构域核苷酸序列；
(b)第二转基因细胞表达具有由第二免疫球蛋白基因编码的链的第二抗体，该第二基因包含在第二人未重排免疫球蛋白基因区段重组后产生的第二可变结构域核苷酸序列，该第一和第二抗体是不相同的；
(c)第一和第二基因区段是不同的且分别衍生自第一和第二人类个体的基因组序列，其中所述个体是不同的；其中所述第二人免疫球蛋白基因区段是第一人免疫球蛋白基因区段的多态性变体并且其中第二基因区段选自表1–7和9–14中任一个中的基因区段；并且其中
(d)所述细胞是非人脊椎动物细胞。
12.一种分离的抗体，其具有
(a)由核苷酸序列编码的重链，所述核苷酸序列在转基因非人脊椎动物细胞中未重排的人免疫球蛋白V基因区段与人D和人J区段重组后产生，任选伴随所述细胞中的亲和力成熟，其中所述基因区段之一衍生自来自第一人类种族群体的个体的基因组，并且其他两个基因区段衍生自来自第二不同人类种族群体的个体的基因组，并且其中所述抗体包含所述非人脊椎动物的重链恒定区；和/或
(b)由核苷酸序列编码的轻链，所述核苷酸序列在转基因非人脊椎动物细胞中未重排的人免疫球蛋白V基因区段与人J区段重组后产生，任选伴随所述细胞中的亲和力成熟，其中所述基因区段之一衍生自来自第一人类种族群体的个体的基因组，并且其他基因区段衍生自来自第二不同人类种族群体的个体的基因组，并且其中所述抗体包含所述非人脊椎动物的轻链恒定区。
13.一种转基因非人脊椎动物细胞，其基因组包含转基因免疫球蛋白基因座，所述基因座包含可操作地连接非人脊椎动物恒定区的上游的多个人免疫球蛋白基因区段，用于产生具有非人脊椎动物恒定区和人可变区的嵌合抗体、或嵌合轻或重链的库集；其中所述转基因基因座包含一个或多个人免疫球蛋白V基因区段、一个或多个人J基因区段和任选存在的一个或多个人D基因区段；所述基因区段中的第一(任选V区段)和所述基因区段中的第二(任选V区段)是不同的并且分别衍生自第一和第二人类个体的基因组，其中所述个体是不同的；
任选其中所述免疫球蛋白基因座包含超过功能性V基因区段的天然人互补体；和/或
任选其中所述免疫球蛋白基因座包含超过功能性D基因区段的天然人互补体；和/或
任选其中所述免疫球蛋白基因座包含超过功能性J基因区段的天然人互补体。
14.一种转基因非人脊椎动物细胞，其基因组包含第一和第二转基因免疫球蛋白基因座，每个基因座包含可操作地连接非人脊椎动物恒定区的上游的多个人免疫球蛋白基因区段，用于产生具有非人脊椎动物恒定区和人可变区的嵌合抗体、或嵌合轻或重链的库集；其中
(i)所述第一转基因基因座包含一个或多个人免疫球蛋白V基因区段、一个或多个人J基因区段和任选存在的一个或多个人D基因区段，
(ii)所述第二转基因基因座包含一个或多个人免疫球蛋白V基因区段、一个或多个人J基因区段和任选存在的一个或多个人D基因区段；和
(iii)其中所述第一基因座的第一(任选V)基因区段和所述第二基因座的第二(任选V)基因区段是不同的并且分别衍生自第一和第二人类个体的基因组，其中所述个体是不同的；
任选其中所述第一和第二基因座在所述基因组中的不同染色体上(任选具有相同染色体编号的染色体)；
任选其中每个免疫球蛋白基因座包含超过功能性V基因区段的天然人互补体；和/或
任选其中每个免疫球蛋白基因座包含超过功能性D基因区段的天然人互补体；和/或
任选其中每个免疫球蛋白基因座包含超过功能性J基因区段的天然人互补体。
15.一种非人脊椎动物细胞，其包含基因组，所述基因组包含：
(i)转基因重链免疫球蛋白基因座，其中所述基因座包含衍生自相同人类个体的基因组序列的功能性VH、D和JH区段的完全人库集，补充有在所述人类个体的基因组序列中未发现的一个或多个另外的功能性人VH、D和/或JH基因区段；
(ii)转基因κ轻链免疫球蛋白基因座，其中所述基因座包含衍生自相同人类个体的基因组序列的功能性Vκ和Jκ区段的完全人库集，补充有在所述人类个体的基因组序列中未发现的一个或多个另外的功能性人Vκ和/或Jκ基因区段；或
(iii)转基因λ轻链免疫球蛋白基因座，其中所述基因座包含衍生自相同人类个体的基因组序列的功能性Vλ和Jλ区段的完全人库集，补充有在所述人类个体的基因组序列中未发现的一个或多个另外的功能性人Vλ和/或Jλ基因区段。
16.一种包含合成免疫球蛋白基因单元型的转基因免疫球蛋白基因座，所述单元型包含第一和第二人基因区段(每个均为V、D或J)、转换区和恒定区，其中
a)所述第二基因区段是所述第一基因区段的多态性变体；或
b)所述第一和第二基因区段分别衍生自来自根据1000Genomes数据库的不同的第一和第二种族群体的个体的基因组序列并且所述第二基因区段在根据1000Genomes数据库的第一群体中未发现；和
其中所述恒定区和任选转换区是非人脊椎动物恒定和转换区。
17.一种产生抗体重链的方法，所述方法包括：
提供抗原特异性重链可变结构域；和
组合所述可变结构域与人重链恒定区以产生包含(在N至C末端方向)所述可变结构域和恒定区的抗体重链；
其中所述人重链恒定区是IGHAref、IGHA1a、IGHA2a、IGHA2b、IGHG1ref、IGHG2ref、IGHG2a、IGHG3ref、IGHG3a、IGHG3b、IGHG4ref、IGHG4a、IGHDref、IGHEref、IGHMref、IGHMa或IGHMb恒定区。
18.一种非人细胞(例如小鼠细胞或大鼠细胞)，其包含基因组，所述基因组包含转基因重链免疫球蛋白基因座，其中所述基因座包含可操作地连接于非人脊椎动物恒定区(例如小鼠恒定区，例如Cμ和/或Cγ)的上游的至少42个(任选至少43、44、45、46、47、48、49、50个)功能性人VH基因区段、一个或多个功能性人D基因区段、一个或多个功能性人JH基因区段。
19.一种非人细胞(例如小鼠细胞或大鼠细胞)，其包含基因组，所述基因组包含转基因κ轻链免疫球蛋白基因座，其中所述基因座包含可操作地连接于非人脊椎动物恒定区(例如小鼠恒定区)的上游的至少39个功能性人Vκ基因区段和一个或多个功能性人Jκ基因区段。
20.一种非人细胞(例如小鼠细胞或大鼠细胞)，其包含基因组，所述基因组包含转基因λ轻链免疫球蛋白基因座，其中所述基因座包含可操作地连接于非人脊椎动物恒定区(例如小鼠恒定区)的上游的至少32个功能性人Vλ基因区段和一个或多个功能性人Jλ基因区段。
21.一种用于施用于中国人患者的分离的抗体，所述抗体包含人重链，所述重链包含对抗原具有特异性的可变结构域和恒定区，其中所述恒定区是这样的人恒定区，其选自在中国人群体中发现的表13中的恒定区(例如IGHG恒定区)并具有至少5％的累积频率；并且其中
(i)所述可变结构域衍生自所述人基因区段在非人脊椎动物中(例如小鼠或大鼠中)的重组；或
(ii)所述可变结构域包含非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)AID模式突变和非人脊椎动物(例如小鼠或大鼠)末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)模式突变。
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