JP2018508224A - 抗原を結合する軽鎖可変領域を選択する非ヒト動物 - Google Patents
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Abstract
再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座と、単一の再配列されたヒト軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座とを含む、非ヒト動物及び細胞が提供され、更に、それらを作るための方法及び組成物、それらを使うための方法及び組成物が提供される。再配列されていないヒト軽鎖遺伝子セグメントは、重鎖定常領域ヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、軽鎖定常領域ヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。また、免疫グロブリン軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を得るための方法も提供され、そのドメインは、同種の可変ドメインの不在下で、抗原を結合することが可能であり、そのような核酸配列を、例えば宿主細胞内に発現し、多重特異性抗原結合タンパク質を生成することが可能である。
Description
(関連出願の相互参照)
本出願は、2015年3月19日に出願された、米国仮特許出願第62/135,419号の関連出願であり、米国特許法第119条(e)の下でこの仮出願に基づく優先権を主張し、この出願は、参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、2015年3月19日に出願された、米国仮特許出願第62/135,419号の関連出願であり、米国特許法第119条(e)の下でこの仮出願に基づく優先権を主張し、この出願は、参照により本明細書に組み込まれる。
(配列表)
本明細書と同時に、配列表の公式な複製が、2016年3月18日作成の、2016−03−18−1150WO01−SEQ−LIST_ST25.txtというファイル名、約8.62キロバイトのサイズのASCII形式の配列表として、EFSウェブを介して電子的に提出される。このASCII形式の文書に含まれる配列表は、本明細書の一部であり、かつ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書と同時に、配列表の公式な複製が、2016年3月18日作成の、2016−03−18−1150WO01−SEQ−LIST_ST25.txtというファイル名、約8.62キロバイトのサイズのASCII形式の配列表として、EFSウェブを介して電子的に提出される。このASCII形式の文書に含まれる配列表は、本明細書の一部であり、かつ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
(発明の分野)
本明細書で提供されるのは、ユニバーサル軽鎖に属する免疫グロブリンハイブリッド鎖由来で、かつユニバーサル軽鎖の同種の可変ドメインとは独立に(例えば、それなしで)抗原を結合し得る、免疫グロブリン軽鎖可変(VL/CHxULC)ドメインであり、また、VL/CHxULCドメインを発現する遺伝子改変非ヒト動物及び細胞であり、VL/CHxULCドメインをコードする核酸であり、1つ以上のVL/CHxULCドメインを含む抗原結合タンパク質(例えば、多重特異性抗原結合タンパク質)であり、更にはin vitroで、1つ以上のVL/CHxULCドメインを含む抗原結合タンパク質(例えば、多重特異性抗原結合タンパク質)を生成する方法である。
本明細書で提供されるのは、ユニバーサル軽鎖に属する免疫グロブリンハイブリッド鎖由来で、かつユニバーサル軽鎖の同種の可変ドメインとは独立に(例えば、それなしで)抗原を結合し得る、免疫グロブリン軽鎖可変(VL/CHxULC)ドメインであり、また、VL/CHxULCドメインを発現する遺伝子改変非ヒト動物及び細胞であり、VL/CHxULCドメインをコードする核酸であり、1つ以上のVL/CHxULCドメインを含む抗原結合タンパク質(例えば、多重特異性抗原結合タンパク質)であり、更にはin vitroで、1つ以上のVL/CHxULCドメインを含む抗原結合タンパク質(例えば、多重特異性抗原結合タンパク質)を生成する方法である。
生物製剤は、一般に、従来型の抗体フォーマットに基づくいくつかの有望な新しい診断法及び治療法となっている。しかしながら従来の抗体ベースの設計には、抗原結合が典型的には、4つのポリペプチド(2つの同一な免疫グロブリン重鎖及び2つの同一な免疫グロブリン軽鎖)を含む抗体分子を要するがゆえの制約があり得る。本発明は、免疫グロブリンベースの治療デザインの改善及び多様化に対する必要性が未だ存在するという認識を含むものである。
本発明は、免疫グロブリンフォーマットに基づく抗原結合タンパク質の開発、製造、及び/又は使用のためのテクノロジーの改良を提供するものである。本発明は、そのようなテクノロジーに対して、従来の抗体ベースのフォーマットはある制約を課すという認識を含むものである。例えば本発明は、抗原結合部位が重鎖及び軽鎖可変ドメインからなるように要求することは、一部の抗原決定基に関して実現できる、利用可能な親和性及び/又は特異性を制約し得るということを認識するものである。
本発明は、これらの問題を解決するテクノロジーを提供するものである。とりわけ本発明は、「ユニバーサル」又は「コモン」免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを発現し、かつ、例えば、新たな抗原結合タンパク質フォーマットの開発及び/又は製造に有用な、遺伝子操作された非ヒト動物を提供する。しかも本発明は驚くべきことに、ユニバーサル免疫グロブリン軽鎖を発現している動物を用いることにより、パートナー(又は同種の)免疫グロブリン鎖の可変ドメインが軽鎖可変ドメインである場合にも、抗原結合部位内でその可変ドメイン結合特性が支配的となり得るパートナー免疫グロブリン鎖を選択するように向けることが可能であるということを示すものである。したがって、当該技術分野で予想されるのとは反対に、本発明は、例えば、ユニバーサル軽鎖可変ドメインと関連付けられた場合、及び/又は同種のユニバーサル軽鎖可変ドメインなしで、即ち、それとは独立に抗原を結合し、免疫グロブリン軽鎖可変領域が参加する抗原結合部位の、特異性及び/又は親和性を決定する又は制御する免疫グロブリン軽鎖可変領域を開発することが可能であるということを示すものである。
即ち、一部の実施形態では、本発明は、ユニバーサル軽鎖可変ドメインに関連付けられた場合に、かつ/又は、同種のユニバーサル軽鎖可変ドメインとは独立に抗原を結合し、1つ以上の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む多重特異性抗原結合タンパク質を含む、抗原結合タンパク質を提供する。また、例えば、抗原特異性及び親和性が、免疫グロブリン軽鎖可変ドメインの多様性のみに又は主としてその多様性に由来し、かつ/又は、免疫グロブリン軽鎖可変ドメインの多様性のみに又はその多様性に主として存在する、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン配列の、開発、製造、及び/又は使用のためのテクノロジー、例えばそのような非ヒト動物及びin vitroの組み換え方法も提供される。
本明細書に記載の様々な態様及び実施形態は、再配列された軽鎖可変遺伝子配列(例えば、再配列された軽鎖VLJL配列)によってコードされている重鎖定常領域及び免疫グロブリン軽鎖可変ドメインに、作動可能に連結された免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む結合タンパク質を発現する、遺伝子改変非ヒト動物が、本明細書において認識された様々な問題を解決し、かつ/又は驚くべき結果を提供し得る、という驚くべき発見に部分的に基づくものである。非ヒト動物のゲノムが、(i)例えば、内因性の重鎖遺伝子座で重鎖定常領域配列に作動可能に連結された、再配列されていないヒト軽鎖遺伝子セグメント(例えば、VL及びJL遺伝子セグメント)を含む、ハイブリッドの免疫グロブリン鎖の遺伝子座と、(ii)軽鎖定常遺伝子に作動可能に連結された、再配列された免疫グロブリン軽鎖可変配列(例えばユニバーサル軽鎖可変領域配列のような、単一の再配列された免疫グロブリン軽鎖可変領域配列がその例である)を含む、免疫グロブリン軽鎖の遺伝子座と、を含む場合に、その非ヒト動物は、重鎖定常領域に作動可能に連結された、再配列されていない(即ち、多様化可能な)免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子セグメント上での抗体の多様化のメカニズムに焦点を当てることが可能である。再配列されていないヒト軽鎖遺伝子セグメントを再配列すると、そのセグメントは、重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された軽鎖可変領域遺伝子配列を形成し、免疫グロブリンハイブリッド鎖をコードする、即ち、重鎖定常領域と融合する軽鎖可変ドメインを含む免疫グロブリンポリペプチドをコードする配列を形成する。本明細書に記載のゲノムを有する非ヒト動物は、それぞれが、典型的な四量体型抗体フォーマットで同種のユニバーサル軽鎖に関連付けられる、二量体型免疫グロブリンハイブリッド鎖を含む抗原結合タンパク質を生成することが可能であり、その場合に、免疫グロブリンハイブリッド鎖は、ユニバーサル軽鎖の軽鎖可変ドメイン、例えば、VL/CHxULC可変ドメインと同種の軽鎖可変ドメインを含む。
本明細書において示されるように、免疫グロブリンハイブリッド鎖(例えば、免疫グロブリンハイブリッド鎖可変ドメインをコードするVL/JL遺伝子配列によってコードされている)に由来する軽鎖可変VL/CHxULCドメインであって、ユニバーサル軽鎖可変ドメインと同種である軽鎖可変VL/CHxULCドメインは、同種のユニバーサル軽鎖可変ドメインの存在下又は不在下で、目的の抗原を結合することができる。VL/CHxULCドメインが免疫グロブリンハイブリッド鎖に由来する場合、そのハイブリッド鎖は、好ましくは体細胞超変異されるが、単一ドメイン抗体ではなく、例えば、好ましくは、IgD、IgG、IgE、及びIgAからなる群から選択されるアイソタイプを有し、かつ機能的CH1ドメインを含む、重鎖定常領域を有する。また、このような可変VL/CHxULCドメインが、異なるエピトープに対して特異的な非同種の別の可変ドメインと関連付けられた場合、可変VL/CHxULCドメインが重鎖定常領域又は軽鎖定常領域に操作可能に融合されているかどうかに関わらず、その可変VL/CHxULCドメインは、抗原を結合することが可能である。
したがって、本明細書において提供されるのは、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン、例えば軽鎖可変VL/CHxULCドメインを含む、少なくとも第1の結合成分を含む抗原結合タンパク質であって、VL/CHxULCドメインは、(1)例えば、Igμ、Igδ、Igγ、Igα及び/又はIgεのような1つ以上の重鎖定常領域遺伝子で、それぞれが機能的CH1ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む、重鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結された軽鎖配列によってコードされている、免疫グロブリンハイブリッド鎖に由来し、(2)軽鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結された、再配列された軽鎖配列によってコードされているユニバーサル軽鎖に対して同種のものである。
一部の実施形態では、軽鎖可変VL/CHxULCドメインは、VκOHxULCドメインであり、例えば、κ軽鎖可変領域ヌクレオチド配列に由来し、かつ/又はそれによりコードされており、そのヌクレオチド配列は、例えば、ヒトκ軽鎖可変領域ヌクレオチド配列であってよく、具体的には例えば、Vκ1−5、Vκ1−6、Vκ1−8、Vκ1−9、Vκ1−12、Vκ1−13、Vκ1−16、Vκ1−17、Vκ1−22、Vκ1−27、Vκ1−32、Vκ1−33、Vκ1−35、Vκ1−37、Vκ1−39、Vκ1D−8、Vκ1D−12、Vκ1D−13、Vκ1D−16、Vκ1D−17、Vκ1D−22、Vκ1D−27、Vκ1D−32、Vκ1D−33、Vκ1D−35、Vκ1D−37、Vκ1D−39、Vκ1D−42、Vκ1D−43、Vκ1−NL1、Vκ2−4、Vκ2−10、Vκ2−14、Vκ2−18、Vκ2−19、Vκ2−23、Vκ2−24、Vκ2−26、Vκ2−28、Vκ2−29、Vκ2−30、Vκ2−36、Vκ2−38、Vκ2−40、Vκ2D−10、Vκ2D−14、Vκ2D−18、Vκ2D−19、Vκ2D−23、Vκ2D−24、Vκ2D−26、Vκ2D−28、Vκ2D−29、Vκ2D−30、Vκ2D−36、Vκ2D−38、Vκ2D−40、Vκ3−7、Vκ3−11、Vκ3−15、Vκ3−20、Vκ3−25、Vκ3−31、Vκ3−34、Vκ3D−7、Vκ3D−7、Vκ3D−11、Vκ3D−15、Vκ3D−15、Vκ3D−20、Vκ3D−25、Vκ3D−31、Vκ3D−34、Vκ3−NL1、Vκ3−NL2、Vκ3−NL3、Vκ3−NL4、Vκ3−NL5、Vκ4−1、Vκ5−2、Vκ6−21、Vκ6D−21、Vκ6D−41、又はVκ7−3遺伝子セグメント配列であってよく、これらは、(ヒト)Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4、又はJκ5遺伝子セグメント、又は、それらの体細胞超変異された変異体で再配列されていてもよい。一部の実施形態では、軽鎖可変VL/CHxULCドメインは、VλOHxULCドメインであり、例えば、λ軽鎖可変領域ヌクレオチド配列に由来し、かつ/又はそれによってコードされ、そのヌクレオチド配列は、例えば、ヒトλ軽鎖可変領域ヌクレオチド配列であってよく、具体的には例えば、Vλ3−1、Vλ4−3、Vλ2−8、Vλ3−9、Vλ3−10、Vλ2−11、Vλ3−12、Vλ2−14、Vλ3−16、Vλ2−18、Vλ3−19、Vλ3−21、Vλ3−22、Vλ2−23、Vλ3−25、Vλ3−27、Vλ1−36、Vλ5−37、Vλ5−39、Vλ1−40、Vλ7−43、Vλ1−44、Vλ5−45、Vλ7−46、Vλ1−47、Vλ9−49、Vλ1−51、Vλ5−52、Vλ6−57、Vλ4−60、Vλ8−61、又はVλ4−69遺伝子セグメント配列であってよく、これらは、(ヒト)Jλ1、Jλ2、Jλ3、又はJλ7遺伝子セグメント配列、又は、それらの体細胞超変異された変異体で再配列されていてもよい。
特に、再配列されていない免疫グロブリンVLとJL遺伝子セグメントのとのハイブリッドの免疫グロブリンの遺伝子座における再配列は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、又はそれより多くのN領域の付加を含む遺伝子配列をコードする、再配列された免疫グロブリン軽鎖可変VL/CHxULCドメインを結果としてもたらし得る。1つの実施形態では、VL/CHxULCドメインをコードする再配列された免疫グロブリン軽鎖遺伝子において観察される、N領域の付加及び/又は体細胞突然変異は、内因性の軽鎖遺伝子座で再配列されている、再配列された軽鎖可変配列(ただし、同じVL遺伝子セグメントと同じJL遺伝子セグメントとに由来するもの)において観察される、N領域の付加及び/又は体細胞突然変異の数よりも、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、又は少なくとも5倍多い。遺伝子配列をコードするVL/CHxULCにおける、N領域の付加数が増加すると、内因性の軽鎖遺伝子座で組み替えられたVL/JL遺伝子配列によってコードされている軽鎖可変VLドメインと比較して、CDR3により多くのアミノ酸を有する軽鎖可変VL/CHxULCドメインがコード可能になる。したがって、一部の実施形態では、本明細書において提供される抗原結合タンパク質は、その可変VL/CHxULCドメインが、9、10、11、12個、又はそれより多くのアミノ酸長を有するCDR3を含む、免疫グロブリン軽鎖可変VL/CHxULCドメインを含む。一部の実施形態では、VL/CHxULCドメインは、9個のアミノ酸長であるCDR3を含む。一部の実施形態では、VL/CHxULCドメインは、10個のアミノ酸長であるCDR3を含む。一部の実施形態では、VL/CHxULCドメインは、11個のアミノ酸長であるCDR3を含む。一部の実施形態では、VL/CHxULCドメインは、12個のアミノ酸長であるCDR3を含む。
好ましい実施形態では、本明細書に記載の抗原結合タンパク質は、単一ドメイン結合タンパク質ではなく、例えば、重鎖のみ結合タンパク質ではない。したがって、一部の実施形態では、説明される第1の結合成分は、例えば、少なくとも機能性CH1ドメイン又は軽鎖定常ドメインを含む重鎖定常領域のような定常領域に融合された軽鎖可変VL/CHxULCドメインを含み、その可変VL/CHxULCドメインが、(1)機能性CH1ドメインを含み、かつ(2)ユニバーサル軽鎖と同種のものである免疫グロブリンハイブリッド鎖に由来するものであり、例えば、免疫グロブリン軽鎖可変VL/CHxULCドメインは、少なくとも機能性CH1ドメインをコードする、重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されるか又はされていたものであり、かつそれゆえに、9、10、11、12個、又はそれより多くのアミノ酸長であるCDR3を含み得る、VκOHxULC又はVλOHxULCドメイン(それぞれ、再配列された(ヒト)Vκ/Jκ又はVλ/Jλ配列によってコードされているものである)である。
したがって、一部の実施形態では、本明細書に記載の抗原結合タンパク質は、少なくとも機能性CH1ドメインを含み、かつ任意選択で、ヒンジ領域、CH2ドメイン、CH3ドメイン、CH4ドメイン、又はそれらの組合せを更に含む、重鎖定常領域に融合された免疫グロブリン軽鎖可変VL/CHxULCドメインを含む(例えば、免疫グロブリン軽鎖VL/CHxULCドメインが、軽鎖定常領域とジスルフィド結合を形成可能なCH1ドメインに融合されている)少なくとも第1の結合成分を含む。一部の実施形態では、重鎖定常領域は、少なくとも機能性CH1ドメインを含む、非ヒト重鎖定常領域である。一部の実施形態では、非ヒト重鎖定常領域は、少なくとも機能性CH1ドメインを含む、齧歯類(例えば、ラット又はマウス)又はニワトリの重鎖定常領域である。一部の実施形態では、重鎖定常領域は、少なくとも機能性CH1ドメインを含む、ヒト重鎖定常領域である。一部の実施形態では、重鎖定常領域(又はCH1ドメイン)は、IgM、IgD、IgG、IgE、及びIgAからなる群から選択されるアイソタイプを有する。一部の実施形態では、可変VL/CHxULCドメインは、IgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4からなる群から選択される下位クラスを有するIgG重鎖定常領域(又はCH1ドメイン)に融合される。一部の実施形態では、可変VL/CHxULCドメインは、CH3ドメインを含む、ヒトの、かつ突然変異したIgG1、IgG2、又はIgG4重鎖定常領域(又はCH1ドメイン)に融合され、その突然変異は、IgG1、IgG2、又はIgG4重鎖定常領域のCH3ドメインで起こり、かつCH3ドメインのAタンパク質との結合を減少又は消滅させるものであり、例えば、その突然変異は、IMGT番号付けシステムにおける、(a)95R、並びに(b)95R及び96F、又はEU番号付けシステムにおける、(a’)435R、並びに(b’)435R及び436Fからなる群から選択されるものである。一部の実施形態では、ヒトの、かつ突然変異した重鎖定常領域は、ヒトの、かつ突然変異したIgG1定常領域であり、かつ、(a)95R又は(b)95R及び96F(IMGT番号付けシステムで)の突然変異に加えて、IMGTエキソン番号付けシステムにおける、16E、18M、44S、52N、57M、及び82I、又はEU番号付けシステムにおける、356E、358M、384S、392N、397M、及び422Iからなる群から選択される、1〜5つの一時変異を更に含む。一部の実施形態では、ヒト重鎖定常領域は、ヒトIgG2定常領域であり、かつ(a)95R又は(b)95R及び96F(IMGT番号付けシステムで)の突然変異に加えて、IMGTエキソン番号付けシステムにおける、44S、52N、82I、又は、EU番号付けシステムにおける、348S、392N、及び422Iからなる群から選択される、1〜2つの一時変異を更に含む。他の実施形態では、ヒト重鎖定常領域は、ヒトIgG4定常領域であり、かつ(a)95R又は(b)95R及び96F(IMGT番号付けシステムで)の突然変異に加えて、IMGTエキソン番号付けシステムにおける、15R、44S、52N、57M、69K、79Q、及び82I、又はEU番号付けシステムにおける、355R、384S、392N、397M、409K、419Q、及び422Iからなる群から選択される、1〜7つの一時変異、及び/又は、IMGTエキソン番号付けシステムにおける105P、又はEU番号付けシステムにおける445Pの一時変異を更に含む。
加えて、一部の実施形態では、本明細書に記載の抗原結合タンパク質は、軽鎖定常ドメインに融合された免疫グロブリン軽鎖可変VL/CHxULCドメインを含む、少なくとも第1の結合成分を含む。一部の実施形態では、軽鎖定常ドメインは、非ヒト軽鎖定常ドメインである。一部の実施形態では、非ヒト軽鎖定常ドメインは、齧歯類(例えば、ラット又はマウス)、又はニワトリの軽鎖定常ドメインである。一部の実施形態では、軽鎖定常ドメインは、ヒト軽鎖定常ドメインである。一部の実施形態では、軽鎖定常ドメインは、軽鎖κ定常ドメインである。一部の実施形態では、軽鎖定常ドメインは、軽鎖λ定常ドメインである。
一部の実施形態では、本明細書に記載の免疫グロブリン軽鎖可変VL/CHxULC(例えば、VκOHxULC又はVλOHxULC)ドメインは、同種のユニバーサル軽鎖の不在下で、目的の抗原を結合する。したがって、本明細書に記載の第1の結合成分は、免疫グロブリン軽鎖可変VL/CHxULCドメイン、又は定常領域、例えば、少なくとも機能性CH1ドメインを含む重鎖定常領域、又は軽鎖定常領域に融合された免疫グロブリン軽鎖可変VL/CHxULCドメインから本質的になるか、又は、それからなり、その可変VL/CHxULCドメインは、ユニバーサル軽鎖と同種の免疫グロブリンハイブリッド鎖に由来し、例えば、免疫グロブリン軽鎖可変VL/CHxULCドメインは、重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されているか又はされていたものであり、かつそれゆえに、9、10、11、12個、又はそれより多くのアミノ酸長であるCDR3を含み得る、再配列された(ヒト)Vκ/Jκ又はVλ/Jλ配列によってコードされている。
他の実施形態では、第1の結合成分は、免疫グロブリン軽鎖VL/CHxULC可変ドメインに関連付けられた、同種のユニバーサル軽鎖可変ドメインを更に含み、可変VL/CHxULCドメインは、免疫グロブリンハイブリッド鎖に由来し(例えば、免疫グロブリン軽鎖可変VL/CHxULCドメインは、重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されているか又はされていたものであり、かつそれゆえに、9、10、11、12個、又はそれより多くのアミノ酸長であるCDR3を含み得る、再配列された(ヒト)Vκ/Jκ又はVλ/Jλ配列によってコードされている)、かつ免疫グロブリンハイブリッド鎖は、再配列されたVL/JL遺伝子配列によってコードされている、ユニバーサル軽鎖と同種のものであり、かつユニバーサル軽鎖可変ドメインは、再配列されたVL/JL遺伝子配列、又はその体細胞超変異された変異体によってコードされている。
一部の実施形態では、ユニバーサル軽鎖可変ドメインは、κ配列、例えば、ヒトκ配列によってコードされているか、又はそれに由来し、例えば、その配列は具体的には、Vκ1−5、Vκ1−6、Vκ1−8、Vκ1−9、Vκ1−12、Vκ1−13、Vκ1−16、Vκ1−17、Vκ1−22、Vκ1−27、Vκ1−32、Vκ1−33、Vκ1−35、Vκ1−37、Vκ1−39、Vκ1D−8、Vκ1D−12、Vκ1D−13、Vκ1D−16、Vκ1D−17、Vκ1D−22、Vκ1D−27、Vκ1D−32、Vκ1D−33、Vκ1D−35、Vκ1D−37、Vκ1D−39、Vκ1D−42、Vκ1D−43、Vκ1−NL1、Vκ2−4、Vκ2−10、Vκ2−14、Vκ2−18、Vκ2−19、Vκ2−23、Vκ2−24、Vκ2−26、Vκ2−28、Vκ2−29、Vκ2−30、Vκ2−36、Vκ2−38、Vκ2−40、Vκ2D−10、Vκ2D−14、Vκ2D−18、Vκ2D−19、Vκ2D−23、Vκ2D−24、Vκ2D−26、Vκ2D−28、Vκ2D−29、Vκ2D−30、Vκ2D−36、Vκ2D−38、Vκ2D−40、Vκ3−7、Vκ3−11、Vκ3−15、Vκ3−20、Vκ3−25、Vκ3−31、Vκ3−34、Vκ3D−7、Vκ3D−7、Vκ3D−11、Vκ3D−15、Vκ3D−15、Vκ3D−20、Vκ3D−25、Vκ3D−31、Vκ3D−34、Vκ3−NL1、Vκ3−NL2、Vκ3−NL3、Vκ3−NL4、Vκ3−NL5、Vκ4−1、Vκ5−2、Vκ6−21、Vκ6D−21、Vκ6D−41、又はVκ7−3遺伝子セグメント配列であってよく、これらは、(ヒト)Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4、又はJκ5遺伝子セグメント配列、又はそれらの体細胞超変異された変異体で再配列されていてよい。一部の実施形態では、ユニバーサル軽鎖可変ドメインは、ヒトJκ5遺伝子セグメント配列によって再配列されたヒトVκ1−39遺伝子セグメント配列、又は、それらの体細胞超変異された変異体を含むヌクレオチド配列によってコードされているか、又はそれに由来する。一部の実施形態では、ユニバーサル軽鎖可変ドメインは、ヒトJκ1遺伝子セグメント配列によって再配列されたヒトVκ3−20遺伝子セグメント配列、又は、それらの体細胞超変異された変異体を含むヌクレオチド配列によってコードされているか、又はそれに由来する。一部の実施形態では、ユニバーサル軽鎖可変ドメインは、λ配列によってコードされるか、又はそれに由来し、その配列は、例えば、ヒトVλ3−1、Vλ4−3、Vλ2−8、Vλ3−9、Vλ3−10、Vλ2−11、Vλ3−12、Vλ2−14、Vλ3−16、Vλ2−18、Vλ3−19、Vλ3−21、Vλ3−22、Vλ2−23、Vλ3−25、Vλ3−27、Vλ1−36、Vλ5−37、Vλ5−39、Vλ1−40、Vλ7−43、Vλ1−44、Vλ5−45、Vλ7−46、Vλ1−47、Vλ9−49、Vλ1−51、Vλ5−52、Vλ6−57、Vλ4−60、Vλ8−61、又はVλ4−69遺伝子セグメント配列であり、それらは、(ヒト)Jλ1、Jλ2、Jλ3、若しくはJλ7遺伝子セグメント配列、又はそれらの体細胞超変異された変異体で再配列されている。一部の実施形態では、ユニバーサル軽鎖可変ドメインは、Jλ3遺伝子セグメント配列、又はその体細胞超変異された変異体で再配列されたVλ2〜14の遺伝子セグメント配列を含む、ヌクレオチド配列によってコードされているか、又はそれに由来する。一部の実施形態では、ユニバーサル軽鎖可変ドメインは、Jλ7遺伝子セグメント配列、又はその体細胞超変異された変異体で再配列されたVλ2〜14の遺伝子セグメント配列を含む、ヌクレオチド配列によってコードされているか、又はそれに由来する。
本明細書に記載の第1の結合成分は、免疫グロブリン軽鎖可変VL/CHxULC(例えば、VκOHxULC又はVλOHxULC)ドメインと、ジスルフィド結合又はペプチドリンカーによって関連付け、例えばリンクされる、同種のユニバーサル軽鎖可変ドメインとを含み得る。一部の実施形態では、本明細書に記載の第1の結合成分は、同種のユニバーサル軽鎖可変ドメインに、例えば、scFV型フォーマットで、ペプチドリンカーを介してリンクされる、VL/CHxULC可変ドメインを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の第1の結合成分は、(i)少なくとも機能性CH1ドメイン、例えば、機能性CH1ドメインに融合された免疫グロブリン軽鎖可変VL/CHxULC(例えば、VκOHxULC又はVλOHxULC)ドメイン、を含む、重鎖定常領域に融合された免疫グロブリン軽鎖可変VL/CHxULC(例えば、VκOHxULC又はVλOHxULC)ドメインと、(ii)軽鎖定常ドメインに融合されたユニバーサル軽鎖可変ドメインとを含み、CH1ドメインが、ジスルフィド結合又はペプチドリンカーによって、軽鎖定常ドメインにリンクされる。1つの実施形態では、VL/CHxULC−可変ドメインは、少なくとも機能性CH1ドメインを含む(かつ任意選択で、ヒンジ領域、CH2ドメイン、CH3ドメイン、CH4ドメイン、又はそれらの組合せを更に含む)重鎖定常領域に融合され、ユニバーサル軽鎖可変ドメインは、軽鎖定常ドメインに融合され、機能性CH1ドメインは、ジスルフィド結合により、軽鎖定常ドメインにリンクされる。別の1つの実施形態では、第1の結合成分は、scFabフォーマットであり、例えば、VL/CHxULC可変ドメインは、少なくとも機能性CH1ドメインを含む重鎖定常領域に融合され、ユニバーサル軽鎖可変ドメインは、軽鎖定常ドメインに融合され、かつ機能性CH1ドメインは、ペプチドリンカーによって、軽鎖定常ドメインにリンクされている。
一部の実施形態では、第1の結合成分は、任意選択でCH1ドメインを含むヒト重鎖又はヒト軽鎖定常ドメインと融合されている、ヒトVL/CHxULC(例えば、ヒトVκOHxULC、又はヒトVλOHxULC)ドメインを含む。1つの実施形態では、本明細書において提供される抗原結合タンパク質は、本明細書に記載の第1の結合成分のみから本質的になるか、又はそれからなっており、その第1の結合成分が目的の抗原と結合している。
また、本明細書に記載のVL/CHxULC(例えば、VκOHxULC又はVλOHxULC)可変ドメインを含む第1の結合成分を含むことに加えて、重鎖又はハイブリッド鎖に由来する第2の免疫グロブリン可変ドメインを含む第2の結合成分を更に含む抗原結合タンパク質も提供されるが、第1の成分のVL/CHxULC可変ドメインと第2の結合成分の第2の可変ドメインとの両方が、同一な再配列された軽鎖可変領域遺伝子配列に由来する、例えば、それによってコードされている、ユニバーサル軽鎖可変ドメインと同種のものであり得るが、好ましくは同種のものである。したがって、VL/CHxULC及び第2の可変ドメインがそれぞれ同種のユニバーサル軽鎖可変ドメインにおけるいかなる差異も、体細胞超変異の結果であり、例えば、体細胞超変異又は親和性成熟のプロセスから生じたものと判定され得る。
本明細書において提供される抗原結合タンパク質は、本明細書に記載の第1及び第2の結合成分を含み得るが、第1及び第2の結合成分は、同一のVL/CHxULC可変ドメインを含み、かつ抗原結合タンパク質は単一特異性のものであり、例えば、目的の単一のエピトープに特異的に結合し得る。
一部の実施形態では、第1及び第2の結合成分は同一ではなく、例えば、同じ抗原に存在し得る、又は異なる抗原に存在し得る異なるエピトープを結合する。したがって、本明細書に記載の抗原結合タンパク質は、多重特異性抗原結合タンパク質であり得、かつ、(i)第1のエピトープに対して特異的な第1の可変ドメイン、例えば、VL/CHxULCドメイン(例えば、VκOHxULC又はVλOHxULC)を含む第1の結合成分と、(ii)第2のエピトープに対して特異的な第2の可変ドメインを含む第2の結合成分とを含み得るが、その第2の可変ドメインは、第2のVL/CHxULCドメイン又はVHxULCドメイン(重鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結されたVHDJH遺伝子配列によってコードされている重鎖に由来する重鎖可変ドメインで、その重鎖可変ドメインは、ユニバーサル軽鎖可変ドメインと同種のものである)のいずれか一方であり、第1及び第2のエピトープは同一ではなく、かつ第1及び第2の可変ドメインはそれぞれ、同じ単一の、再配列された軽鎖可変領域遺伝子配列に由来し、それゆえに、同一であるか、又は体細胞超変異された変異体(例えば、体細胞超変異を通じてのみアミノ酸配列が異なる)である、ユニバーサル軽鎖可変ドメインと同種のものである。一部の実施形態では、第1及び第2の可変VL/CHxULCドメインは、同じ単一の、再配列された軽鎖可変領域遺伝子配列に由来し、それゆえに、同一であるか、又は体細胞超変異された変異体である、ユニバーサル軽鎖可変ドメインと同種のものであるが、第2の可変ドメインは、第1のエピトープとは異なる第2のエピトープを結合する第2のVL/CHxULC(例えば、VκOHxULC又はVλOHxULC)ドメインである。一部の実施形態では、第2の可変ドメインは、第1のエピトープとは異なる第2のエピトープを結合する、免疫グロブリン重鎖可変(VHxULC)ドメインであるが、第1の結合成分のVL/CHxULC可変ドメイン及び、第2の結合成分のVHxULC可変ドメインは、同じ単一の、再配列された軽鎖可変領域遺伝子配列に由来し、それゆえに、同一であるか、又は体細胞超変異された変異体である、ユニバーサル軽鎖可変ドメインと同種のものである。本明細書において提供される、同一ではない第1及び第2の結合成分を含む多重特異性抗原結合タンパク質は、目的の2つ以上のエピトープと特異的に結合し得る。
第2の結合成分が、VHxULCドメインである第2の可変ドメインを含む一部の実施形態では、VHドメインは、重鎖可変領域ヌクレオチド配列、例えば、ヒト重鎖可変領域ヌクレオチド配列、例えば、ヒトのレパートリー、例えば、IMGTデータベース(www.imgt.org)に記載の、任意のヒト重鎖可変遺伝子セグメント又はその体細胞超変異された変異体内に存在する、任意のヒトVH、D、及びJH遺伝子セグメント配列によってコードされている。
加えて、第1の結合成分及び第2の結合成分は、1つ以上のペプチドリンカー、1つ以上のジスルフィド結合、及び/又は1つ以上のロイシンジッパーにより、本明細書において提供される多重特異性抗原結合タンパク質が、同種のユニバーサル軽鎖を含む典型的な抗体に類似の、Fab様構造、scFab様構造、二重特異性抗体様構造、scFv様構造、scFv−Fc様構造、scFv−ジッパー様構造、又は四量体型構造からなる群から選択される形態であるように関連付けられ得る。したがって、一部の実施形態では、VL/CHxULC(例えば、VκOHxULC又はVλOHxULC)及び第2の可変ドメインのいずれか一方又は両方が、定常領域(例えば、機能性CH1ドメインを含む重鎖定常領域、又は軽鎖定常ドメイン)に融合されていても、あるいはされていなくてもよく、かつ/又は同種のユニバーサル軽鎖可変ドメインに関連付けられていても、あるいはされていなくてもよい。
一部の実施形態では、第1の成分の可変VL/CHxULC(例えば、VκOHxULC又はVλOHxULC)ドメインが、第2の結合成分の第2の可変(VL/CHxULC又はVHxULC)ドメインに、抗原結合タンパク質が二重特異性抗体様構造、scFv様構造、scFv−Fc様構造、又はscFv−ジッパー様構造を有し得るように、ペプチドリンカーによりリンクされる。一部の実施形態では、(1)(a)第1の成分のVL/CHxULC可変ドメイン、又は(b)第2の結合成分の第2の可変ドメインのうちの少なくとも一方が、少なくとも機能性CH1ドメインを含む(かつ任意選択で、ヒンジ領域、CH2ドメイン、CH3ドメイン、CH4ドメイン、又はそれらの組合せを更に含む)(非ヒト又はヒト)重鎖定常領域に融合され、かつ(2)(a)第1の成分のVL/CHxULC可変ドメイン、又は(b)第2の結合成分の第2の可変ドメインのうちの他方が、(非ヒト又はヒト)軽鎖定常(CL)ドメインに融合され、CH1ドメインが、CLドメインに、抗原結合タンパク質がFab様構造を有するように、ジスルフィド結合によってリンクされるか、又はCH1ドメインが、CLドメインに、抗原結合タンパク質がscFab様構造を有し得るように、ペプチドリンカーによってリンクされる。
一部の実施形態では、第1のVL/CHxULC(VκOHxULC又はVλOHxULC)と第2の(VL/CHxULC又はVHxULC)可変ドメインとの両方が、それぞれ対応する第1及び第2の重鎖定常領域に融合し、第1及び第2の重鎖定常領域のそれぞれは、それぞれ対応する第1の機能性CH1ドメイン及び第2の機能性CH1ドメイン(各重鎖定常領域は、任意選択で、ヒンジ領域、CH2ドメイン、CH3ドメイン、CH4ドメイン、又はそれらの組合せを更に含む)を含み、かつ第1及び第2の重鎖定常領域は、例えば、ジスルフィド結合又はペプチドリンカーによりリンクされる。一部の実施形態では、重鎖定常領域のうちの少なくとも一方(又は両方)が、非ヒト重鎖定常領域、例えば、齧歯類(例えば、ラット又はマウス)、又はニワトリ重鎖定常領域である。一部の実施形態では、重鎖定常領域のうちの少なくとも一方(又は両方)が、ヒト重鎖定常領域である。一部の実施形態では、重鎖定常領域のうちの少なくとも一方(又は両方)が、IgM、IgD、IgG、IgE、及びIgAからなる群から選択されるアイソタイプを有する。一部の実施形態では、第1の可変VL/CHxULC及び第2の可変ドメインのうちの少なくとも一方(又は両方)が、IgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4からなる群から選択される下位クラスを有するIgG重鎖定常領域に融合される。一部の実施形態では、第1の可変VL/CHxULC及び第2の可変ドメインが、同一のアイソタイプ及び/又は下位クラスを有する重鎖定常領域に融合されるが、任意選択で、重鎖定常領域は、Aタンパク質に対する親和性が異なっている。第1の可変VL/CHxULCと第2の可変ドメインとの両方が、ヒトIgG1、IgG2、又はIgG4重鎖定常領域に融合されている一部の実施形態では、第1の可変VL/CHxULC及び第2の可変ドメインのうちの一方のみが、CH3ドメインのAタンパク質への結合を減少又は消滅させる、CH3ドメインに突然変異、例えば、IMGT番号付けシステムにおける、(a)95R、並びに(b)95R及び96F、又はEU番号付けシステムにおける、(a’)435R、並びに(b’)435R及び436Fからなる群から選択される突然変異を含む、ヒトIgG1、IgG2、又はIgG4重鎖定常領域に融合される。一部の実施形態では、ヒト重鎖定常領域は、ヒトIgG1定常領域であり、かつIMGTエキソン番号付けシステムにおける、16E、18M、44S、52N、57M、及び82I、又はEU番号付けシステムにおける、356E、358M、384S、392N、397M、及び422Iからなる群から選択される、1〜5つの一時変異を更に含む。一部の実施形態では、ヒト重鎖定常領域は、ヒトIgG2定常領域であり、かつIMGTエキソン番号付けシステムにおける、44S、52N、及び82I、又はEU番号付けシステムにおける、348S、392N、及び422Iからなる群から選択される、1つ又は2つの一時変異を更に含む。他の実施形態では、ヒト重鎖定常領域は、ヒトIgG4定常領域であり、かつ、IMGTエキソン番号付けシステムにおける、15R、44S、52N、57M、69K、79Q、及び82I、又は、EU番号付けシステムにおける、355R、384S、392N、397M、409K、419Q、422Iからなる群から選択される1〜7つの一時変異、及び/又は、IMGTエキソン番号付けシステムにおける一時変異105P若しくはEU番号付けシステムにおける445Pを更に含む。
一部の実施形態では、第1及び第2の結合成分は、それぞれに、それぞれ対応する第1及び第2の軽鎖定常(CL)ドメインに融合されている、それぞれ対応する第1及び第2のユニバーサル軽鎖可変ドメインを更に含み、第1及び第2のCLドメインは、例えばジスルフィド結合によって、それぞれ対応する第1及び第2の重鎖定常領域の第1及び第2のCH1ドメインにリンクされ、第1及び第2のユニバーサル軽鎖可変ドメインは、同じ単一の再配列された軽鎖可変領域遺伝子配列に由来し、かつそれゆえに、同一のものであるか、又は体細胞超変異された変異体である。
一部の実施形態では、本明細書に記載の抗原結合タンパク質は、任意選択で、少なくともCH1ドメインを含むヒト重鎖又はヒト軽鎖定常ドメインに融合されている、ヒトVL/CHxULC(VκOHxULC又はVλOHxULC)ドメインを含む第1の結合成分と、任意選択で、CH1ドメインを含むヒト重鎖又はヒト軽鎖定常ドメインに融合されている、第2のヒトVL/CHxULC又はヒトVHxULCドメインを含む、第2の結合成分と、任意選択で、ヒト軽鎖定常ドメインに融合されているヒトユニバーサル軽鎖可変ドメインを含むヒトユニバーサル軽鎖と、を含む。
非ヒト動物には、例えば、哺乳類が挙げられ、かつ特定の実施形態では、齧歯類(例えば、マウス、ラット、又はハムスター)が挙げられる。一部の実施形態では、非ヒト動物には、鳥類、例えば、ニワトリが挙げられる。本発明は、(例えば、それらの生殖系のゲノム及び/又はそれらのB細胞のゲノムに)本明細書に記載の核酸配列を含有し、かつ/又は本明細書に記載の抗原結合タンパク質(例えば、免疫グロブリン鎖及び/又は抗体)を発現するように遺伝子操作された非ヒト動物を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、非ヒト動物を遺伝子操作して、抗原特異性及び親和性が、免疫グロブリン軽鎖可変ドメインの多様性によって支配される(例えば、結果それのみから若しくはそれから主として生じる、及び/又は、それにのみ若しくはそれに主として存在する)、免疫グロブリン軽鎖ドメインの生成のための改善されたin vivo系を提供することは望ましいという認識を、特に含むものである。一部の実施形態では、本発明は、非ヒト動物を遺伝子操作して、免疫グロブリン重鎖可変ドメインから独立して抗原を結合する免疫グロブリン軽鎖可変ドメインに対する、改善されたin vivo親和性成熟及び/又は選択を可能にすることは望ましいという認識を含むものである。一部の実施形態では、本発明は、例えば、前述の特性の一部又は全部を有する免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン(VκOHxULC又はVλOHxULC)の選択に用いるため、そのゲノムが、重鎖定常領域に作動可能に連結された再配列されていないヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメントと、再配列されたヒト軽鎖可変領域核酸配列とを含む非ヒト動物は望ましいという認識を含むものである。
一部の実施形態では、本発明は、VL/CHxULC可変ドメインを生成可能な非ヒト動物を提供し、その非ヒト動物は、その生殖系のゲノムに、(a)例えば、内因性の非ヒト重鎖遺伝子座に、それぞれが機能性CH1ドメインをコードする配列、例えば、インタクトなIgμ遺伝子と、インタクトなIgδ遺伝子、インタクトなIgγ遺伝子、インタクトなIgε遺伝子、及びインタクトなIgα遺伝子のうちの少なくとも1つと、を含む1つ以上の重鎖定常領域遺伝子を含む、免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された、再配列された(ヒト)VL/JL遺伝子配列を形成するように再配列することが可能な、再配列されていない(ヒト)免疫グロブリン軽鎖(VL及びJL)遺伝子セグメントを含む、第1のハイブリッドの免疫グロブリン遺伝子座であって、免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された、再配列されたヒトVL/JL遺伝子配列が、ハイブリッドの免疫グロブリン鎖をコードする第1のハイブリッドの免疫グロブリン遺伝子座と、(b)例えば、内因性の非ヒト軽鎖遺伝子座に、免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む第2の軽鎖免疫グロブリン遺伝子座であって、免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ユニバーサル軽鎖をコードし、かつ非ヒト動物は、免疫グロブリンハイブリッド鎖及びユニバーサル軽鎖を含む抗原結合タンパク質を発現する細胞、例えば、リンパ球、例えば、B細胞を生成可能であるか又は実際に生成し、かつ免疫グロブリンハイブリッド鎖の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインが、VL/CHxULCドメインである第2の軽鎖免疫グロブリン遺伝子座と、を含む。一部の実施形態では、非ヒト動物は哺乳類又は鳥類である。一部のある実施形態では、鳥類はニワトリである。一部のある実施形態では、哺乳類は、齧歯類である。一部の実施形態では、齧歯類は、マウス、ラット、及びハムスターからなる群から選択される。
一部の実施形態では、本発明の非ヒト動物は、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列についてホモ接合型である。一部の実施形態では、本発明の非ヒト動物は、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列についてヘテロ接合型である。一部の実施形態では、本発明の非ヒト動物は、ハイブリッドの免疫グロブリン遺伝子座についてホモ接合型である。一部の実施形態では、本発明の非ヒト動物は、ハイブリッドの免疫グロブリン遺伝子座についてヘテロ接合型である。一部の実施形態では、再配列されていない(ヒト)免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子セグメントは、それぞれが、機能性CH1ドメイン、例えば、インタクトなIgμ遺伝子と、インタクトなIgδ遺伝子、インタクトなIgγ遺伝子、インタクトなIgε遺伝子、及びインタクトなIgα遺伝子のうちの少なくとも1つとをコードする配列を含む、1つ以上の重鎖定常領域遺伝子を含む、非ヒト重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、非ヒト重鎖定常領域核酸配列は、それぞれが、機能性CH1ドメイン、例えば、インタクトなIgμ遺伝子と、インタクトなIgδ遺伝子、インタクトなIgγ遺伝子、インタクトなIgε遺伝子、及びインタクトなIgα遺伝子のうちの少なくとも1つとをコードする配列を含む、1つ以上の重鎖定常領域遺伝子を含む、マウス、ラット、又はニワトリの重鎖定常領域核酸配列である。一部の実施形態では、非ヒト動物は齧歯類であり、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子セグメントは、それぞれが、機能性CH1ドメイン、例えば、インタクトなIgμ遺伝子と、インタクトなIgδ遺伝子、インタクトなIgγ遺伝子、インタクトなIgε遺伝子、及びインタクトなIgα遺伝子のうちの少なくとも1つとをコードする配列を含む、1つ以上の重鎖定常領域遺伝子を含む、ヒト重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている。
一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、非ヒト軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている。一部のある実施形態では、非ヒト軽鎖定常領域核酸配列は、マウス又はラットの軽鎖定常領域核酸配列である。一部の実施形態では、非ヒト動物は齧歯類であり、かつ再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒト軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている。
一部のある実施形態では、軽鎖定常領域核酸配列は、κ配列である。一部のある実施形態では、軽鎖定常領域核酸配列は、λ配列である。
一部の実施形態では、第2の免疫グロブリン遺伝子座は、軽鎖κ遺伝子座である。一部の実施形態では、第2の免疫グロブリン遺伝子座は、軽鎖λ遺伝子座である。
一部の実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリンVL及びJL遺伝子セグメントは、Vκ及びJκ遺伝子セグメントである。一部の実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリンVL及びJL遺伝子セグメントは、Vλ及びJλ遺伝子セグメントである。
一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒトκ軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒトλ軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、第1の遺伝子座は、Vκ1−5、Vκ1−6、Vκ1−8、Vκ1−9、Vκ1−12、Vκ1−13、Vκ1−16、Vκ1−17、Vκ1−22、Vκ1−27、Vκ1−32、Vκ1−33、Vκ1−35、Vκ1−37、Vκ1−39、Vκ1D−8、Vκ1D−12、Vκ1D−13、Vκ1D−16、Vκ1D−17、Vκ1D−22、Vκ1D−27、Vκ1D−32、Vκ1D−33、Vκ1D−35、Vκ1D−37、Vκ1D−39、Vκ1D−42、Vκ1D−43、Vκ1−NL1、Vκ2−4、Vκ2−10、Vκ2−14、Vκ2−18、Vκ2−19、Vκ2−23、Vκ2−24、Vκ2−26、Vκ2−28、Vκ2−29、Vκ2−30、Vκ2−36、Vκ2−38、Vκ2−40、Vκ2D−10、Vκ2D−14、Vκ2D−18、Vκ2D−19、Vκ2D−23、Vκ2D−24、Vκ2D−26、Vκ2D−28、Vκ2D−29、Vκ2D−30、Vκ2D−36、Vκ2D−38、Vκ2D−40、Vκ3−7、Vκ3−11、Vκ3−15、Vκ3−20、Vκ3−25、Vκ3−31、Vκ3−34、Vκ3D−7、Vκ3D−7、Vκ3D−11、Vκ3D−15、Vκ3D−15、Vκ3D−20、Vκ3D−25、Vκ3D−31、Vκ3D−34、Vκ3−NL1、Vκ3−NL2、Vκ3−NL3、Vκ3−NL4、Vκ3−NL5、Vκ4−1、Vκ5−2、Vκ6−21、Vκ6D−21、Vκ6D−41、及びVκ7−3からなる群から選択される、1つ以上の再配列されていないヒト免疫グロブリンVL遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、第1の遺伝子座は、Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4、及びJκ5を含む、再配列されていないヒト免疫グロブリンJL遺伝子セグメントを含む。
一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列中のVκ遺伝子セグメントは、Vκ1−5、Vκ1−6、Vκ1−8、Vκ1−9、Vκ1−12、Vκ1−13、Vκ1−16、Vκ1−17、Vκ1−22、Vκ1−27、Vκ1−32、Vκ1−33、Vκ1−35、Vκ1−37、Vκ1−39、Vκ1D−8、Vκ1D−12、Vκ1D−13、Vκ1D−16、Vκ1D−17、Vκ1D−22、Vκ1D−27、Vκ1D−32、Vκ1D−33、Vκ1D−35、Vκ1D−37、Vκ1D−39、Vκ1D−42、Vκ1D−43、Vκ1−NL1、Vκ2−4、Vκ2−10、Vκ2−14、Vκ2−18、Vκ2−19、Vκ2−23、Vκ2−24、Vκ2−26、Vκ2−28、Vκ2−29、Vκ2−30、Vκ2−36、Vκ2−38、Vκ2−40、Vκ2D−10、Vκ2D−14、Vκ2D−18、Vκ2D−19、Vκ2D−23、Vκ2D−24、Vκ2D−26、Vκ2D−28、Vκ2D−29、Vκ2D−30、Vκ2D−36、Vκ2D−38、Vκ2D−40、Vκ3−7、Vκ3−11、Vκ3−15、Vκ3−20、Vκ3−25、Vκ3−31、Vκ3−34、Vκ3D−7、Vκ3D−7、Vκ3D−11、Vκ3D−15、Vκ3D−15、Vκ3D−20、Vκ3D−25、Vκ3D−31、Vκ3D−34、Vκ3−NL1、Vκ3−NL2、Vκ3−NL3、Vκ3−NL4、Vκ3−NL5、Vκ4−1、Vκ5−2、Vκ6−21、Vκ6D−21、Vκ6D−41、及びVκ7−3からなる群から選択される(ヒト生殖系)Vκ遺伝子セグメントである。一部のある実施形態では、VL遺伝子セグメントは、Vκ1−39及びVκ3−20からなる群から選択される。一部の実施形態では、Vκ遺伝子セグメントは、ヒト生殖系Vκ1−39遺伝子セグメント及びヒト生殖系Vκ3−20遺伝子セグメントからなる群から選択される。
一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列中のJL遺伝子セグメントは、Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4、及びJκ5、例えば、ヒト生殖系Jκ1遺伝子セグメント、ヒト生殖系Jκ2遺伝子セグメント、ヒト生殖系Jκ3遺伝子セグメント、ヒト生殖系Jκ4遺伝子セグメント、及びヒト生殖系Jκ5遺伝子セグメントからなる群から選択される。
一部のある実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、Vκ1−39及びJκ5を含む。一部のある実施形態では、Vκ1−39は、Jκ5によって再配列されている。一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、配列番号1と記載される。一部のある実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、Vκ3−20及びJκ1を含む。一部のある実施形態では、Vκ3−20は、Jκ1によって再配列されている。一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、配列番号2と記載される。
一部の実施形態では、非ヒト動物は齧歯類であり、軽鎖定常領域核酸配列は、ラット又はマウスのCκ定常領域核酸配列である。
一部の実施形態では、非ヒト動物は齧歯類であり、重鎖定常領域核酸配列は、それぞれが、機能性CH1ドメインをコードする、Igμ、Igδ、Igγ、Igε、Igαからなる群から選択される、ラット又はマウスの定常領域配列である。
一部の実施形態では、第1の遺伝子座は、Vλ3−1、Vλ4−3、Vλ2−8、Vλ3−9、Vλ3−10、Vλ2−11、Vλ3−12、Vλ2−14、Vλ3−16、Vλ2−18、Vλ3−19、Vλ3−21、Vλ3−22、Vλ2−23、Vλ3−25、Vλ3−27、Vλ1−36、Vλ5−37、Vλ5−39、Vλ1−40、Vλ7−43、Vλ1−44、Vλ5−45、Vλ7−46、Vλ1−47、Vλ9−49、Vλ1−51、Vλ5−52、Vλ6−57、Vλ4−60、Vλ8−61、及びVλ4−69からなる群から選択される1つ以上の再配列されていないヒト免疫グロブリンVL遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、第1の遺伝子座は、Jλ1、Jλ2、Jλ3、及びJλ7を含む、再配列されていないヒト免疫グロブリンJL遺伝子セグメントを含む。
一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列中のVL遺伝子セグメントは、Vλ3−1、Vλ4−3、Vλ2−8、Vλ3−9、Vλ3−10、Vλ2−11、Vλ3−12、Vλ2−14、Vλ3−16、Vλ2−18、Vλ3−19、Vλ3−21、Vλ3−22、Vλ2−23、Vλ3−25、Vλ3−27、Vλ1−36、Vλ5−37、Vλ5−39、Vλ1−40、Vλ7−43、Vλ1−44、Vλ5−45、Vλ7−46、Vλ1−47、Vλ9−49、Vλ1−51、Vλ5−52、Vλ6−57、Vλ4−60、Vλ8−61、及びVλ4−69からなる群から選択される、(ヒト生殖系)Vλ遺伝子セグメントである。一部のある実施形態では、VL遺伝子セグメントは、Vλ2−14、例えばヒト生殖系Vλ2−14遺伝子セグメントである。
一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列中のJL遺伝子セグメントは、Jλ1、Jλ2、Jλ3、及びJλ7からなる群から選択される。
一部のある実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、Vλ2−14Jλ1を含む。一部のある実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、Vλ2−14Jλ2である。一部のある実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、Vλ2−14Jλ3である。一部のある実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、Vλ2−14Jλ7である。一部の実施形態では、非ヒト動物は齧歯類であり、軽鎖定常領域核酸配列は、ラット又はマウスのCλ定常領域核酸配列である。
一部の実施形態では、非ヒト動物は齧歯類であり、重鎖定常領域核酸配列は、それぞれが機能性CH1ドメインをコードする、Igμ、Igδ、Igγ、Igε、Igα、及びそれらの組合せからなる群から選択される、ラット又はマウスの定常領域配列である。
一部の実施形態では、実質的にすべての内因性の機能性可変重鎖VH、D、JH遺伝子セグメントは、非ヒト動物の内因性の免疫グロブリン重鎖遺伝子座から欠失されるか、又は、非機能性にされる。一部の実施形態では、実質的にすべての内因性の機能性軽鎖VL及びJL遺伝子セグメントは、非ヒト動物の内因性の免疫グロブリン軽鎖遺伝子座から欠失されるか、又は、非機能性にされる。
一部の実施形態では、非ヒト動物は、組み込まれたAdam6a遺伝子、Adam6b遺伝子、又はその両方を含む。一部の実施形態では、非ヒト動物は、機能的、異所性マウスAdam6遺伝子を含む。
一部の実施形態では、第1の免疫グロブリン遺伝子座は、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変ヌクレオチド配列の複数の複製を含む。
一部の実施形態では、本発明は、非ヒト動物を作製する方法を提供し、その方法は、一般に、非ヒト動物の生殖系のゲノムを、(i)免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列と、(ii)免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された再配列されたヒトVL/JL遺伝子配列を形成するように再配列することが可能な、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント(VL及びJL)と、を含むように改変することを含む。一部の実施形態では、その方法は、(a)非ヒト動物のゲノムを、すべて又は実質的にすべての(i)内因性の機能性免疫グロブリン重鎖VH、D、及びJH遺伝子セグメント、並びに(ii)内因性の機能性軽鎖VL及びJL遺伝子セグメントを、欠失するか又は非機能性にするように改変することと、(b)再配列されていない軽鎖可変遺伝子セグメントが、重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されるように、再配列されていないヒト免疫グロブリンVL及びJL遺伝子セグメントを、ゲノム中に配置することと、(c)再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列が、軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されるように、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を、ゲノム中に配置することと、を含む。一部の実施形態では、その方法は、(a)再配列されていない軽鎖可変遺伝子セグメントが、内因性の重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されるように、内因性の重鎖遺伝子座にあるすべての内因性の機能性免疫グロブリン重鎖VH、D、及びJH遺伝子セグメントを、再配列されていないヒト免疫グロブリンVL及びJL遺伝子セグメントで置き換えること、及び(b)再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列が、内因性の軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されるように、内因性の軽鎖遺伝子座にあるすべての内因性の機能性軽鎖VL及びJL遺伝子セグメントを、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列で置き換えることを含む。
一部の実施形態では、非ヒト動物は哺乳類又は鳥類である。一部のある実施形態では、鳥類はニワトリである。一部のある実施形態では、哺乳類は、齧歯類である。一部の実施形態では、齧歯類は、マウス、ラット、及びハムスターからなる群から選択される。
一部の実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリンVL及びJL遺伝子セグメントは、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列は、マウス又はラットの免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列である。一部の実施形態では、非ヒト動物は齧歯類であり、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変VL及びJL遺伝子セグメントは、ヒト重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている。
一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、非ヒト軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、非ヒト軽鎖定常領域核酸配列は、マウス又はラットの軽鎖定常領域核酸配列である。一部の実施形態では、非ヒト動物は齧歯類であり、かつ再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒト軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている。一部のある実施形態では、軽鎖定常領域核酸配列は、κ配列である。一部のある実施形態では、軽鎖定常領域核酸配列は、λ配列である。一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、κ軽鎖遺伝子座に配置されている。一部のある実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、λ軽鎖遺伝子座に配置されている。
一部のある実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリンVL及びJL遺伝子セグメントは、Vκ及びJκ遺伝子セグメントである。一部のある実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリンVL及びJL遺伝子セグメントは、Vλ及びJλ遺伝子セグメントである。
一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒトκ軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒトλ軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリンVL遺伝子セグメントは、Vκ1−5、Vκ1−6、Vκ1−8、Vκ1−9、Vκ1−12、Vκ1−13、Vκ1−16、Vκ1−17、Vκ1−22、Vκ1−27、Vκ1−32、Vκ1−33、Vκ1−35、Vκ1−37、Vκ1−39、Vκ1D−8、Vκ1D−12、Vκ1D−13、Vκ1D−16、Vκ1D−17、Vκ1D−22、Vκ1D−27、Vκ1D−32、Vκ1D−33、Vκ1D−35、Vκ1D−37、Vκ1D−39、Vκ1D−42、Vκ1D−43、Vκ1−NL1、Vκ2−4、Vκ2−10、Vκ2−14、Vκ2−18、Vκ2−19、Vκ2−23、Vκ2−24、Vκ2−26、Vκ2−28、Vκ2−29、Vκ2−30、Vκ2−36、Vκ2−38、Vκ2−40、Vκ2D−10、Vκ2D−14、Vκ2D−18、Vκ2D−19、Vκ2D−23、Vκ2D−24、Vκ2D−26、Vκ2D−28、Vκ2D−29、Vκ2D−30、Vκ2D−36、Vκ2D−38、Vκ2D−40、Vκ3−7、Vκ3−11、Vκ3−15、Vκ3−20、Vκ3−25、Vκ3−31、Vκ3−34、Vκ3D−7、Vκ3D−7、Vκ3D−11、Vκ3D−15、Vκ3D−15、Vκ3D−20、Vκ3D−25、Vκ3D−31、Vκ3D−34、Vκ3−NL1、Vκ3−NL2、Vκ3−NL3、Vκ3−NL4、Vκ3−NL5、Vκ4−1、Vκ5−2、Vκ6−21、Vκ6D−21、Vκ6D−41、及びVκ7−3のうちの1つ以上を含む。一部の実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリンJL遺伝子セグメントは、Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4、及びJκ5を含む。
一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、VL及びJL遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域中のVL遺伝子セグメントは、Vκ1−5、Vκ1−6、Vκ1−8、Vκ1−9、Vκ1−12、Vκ1−13、Vκ1−16、Vκ1−17、Vκ1−22、Vκ1−27、Vκ1−32、Vκ1−33、Vκ1−35、Vκ1−37、Vκ1−39、Vκ1D−8、Vκ1D−12、Vκ1D−13、Vκ1D−16、Vκ1D−17、Vκ1D−22、Vκ1D−27、Vκ1D−32、Vκ1D−33、Vκ1D−35、Vκ1D−37、Vκ1D−39、Vκ1D−42、Vκ1D−43、Vκ1−NL1、Vκ2−4、Vκ2−10、Vκ2−14、Vκ2−18、Vκ2−19、Vκ2−23、Vκ2−24、Vκ2−26、Vκ2−28、Vκ2−29、Vκ2−30、Vκ2−36、Vκ2−38、Vκ2−40、Vκ2D−10、Vκ2D−14、Vκ2D−18、Vκ2D−19、Vκ2D−23、Vκ2D−24、Vκ2D−26、Vκ2D−28、Vκ2D−29、Vκ2D−30、Vκ2D−36、Vκ2D−38、Vκ2D−40、Vκ3−7、Vκ3−11、Vκ3−15、Vκ3−20、Vκ3−25、Vκ3−31、Vκ3−34、Vκ3D−7、Vκ3D−7、Vκ3D−11、Vκ3D−15、Vκ3D−15、Vκ3D−20、Vκ3D−25、Vκ3D−31、Vκ3D−34、Vκ3−NL1、Vκ3−NL2、Vκ3−NL3、Vκ3−NL4、Vκ3−NL5、Vκ4−1、Vκ5−2、Vκ6−21、Vκ6D−21、Vκ6D−41、及びVκ7−3からなる群から選択される、(ヒト生殖系)Vκ遺伝子セグメントである。一部のある実施形態では、VL遺伝子セグメントは、Vκ1−39及びVκ3−20からなる群から選択される。一部の実施形態では、Vκ遺伝子セグメントは、ヒト生殖系Vκ遺伝子セグメント、例えばヒト生殖系Vκ1−39遺伝子セグメント又はヒト生殖系Vκ3−20遺伝子セグメントである。一部の実施形態では、JL遺伝子セグメントは、Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4、及びJκ5からなる群、例えば、ヒト生殖系Jκ1遺伝子セグメント、ヒト生殖系Jκ2遺伝子セグメント、ヒト生殖系Jκ3遺伝子セグメント、ヒト生殖系Jκ4遺伝子セグメント、及びヒト生殖系Jκ5遺伝子セグメントからなる群から選択される。一部のある実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変ヌクレオチド配列は、Vκ1−39及びJκ5を含む(例えば、Vκ1−39は、Jκ5によって再配列される)。一部の実施形態では、再配列された免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、配列番号1と記載される配列を含む。一部のある実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変ヌクレオチド配列は、Vκ3−20及びJκ1を含む(例えば、Vκ3−20は、Jκ1によって再配列される)。一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、配列番号2と記載される配列を含む。
一部の実施形態では、非ヒト動物は齧歯類であり、軽鎖定常領域核酸配列は、ラット又はマウスのCκ定常領域核酸配列である。一部の実施形態では、非ヒト動物は齧歯類であり、重鎖定常領域核酸配列は、それぞれが機能性CH1ドメインをコードする、Igμ、Igδ、Igγ、Igε、Igα、及びそれらの組合せからなる群から選択される、ラット又はマウスの定常領域配列である。
一部の実施形態では、非ヒト動物は、Vλ3−1、Vλ4−3、Vλ2−8、Vλ3−9、Vλ3−10、Vλ2−11、Vλ3−12、Vλ2−14、Vλ3−16、Vλ2−18、Vλ3−19、Vλ3−21、Vλ3−22、Vλ2−23、Vλ3−25、Vλ3−27、Vλ1−36、Vλ5−37、Vλ5−39、Vλ1−40、Vλ7−43、Vλ1−44、Vλ5−45、Vλ7−46、Vλ1−47、Vλ9−49、Vλ1−51、Vλ5−52、Vλ6−57、Vλ4−60、Vλ8−61、及びVλ4−69からなる群から選択される、1つ以上の再配列されていないヒト免疫グロブリンVL遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、非ヒト動物は、Jλ1、Jλ2、Jλ3、及びJλ7を含む、再配列されていないヒト免疫グロブリンJL遺伝子セグメントを含む。
一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列中のVL遺伝子セグメントは、Vλ3−1、Vλ4−3、Vλ2−8、Vλ3−9、Vλ3−10、Vλ2−11、Vλ3−12、Vλ2−14、Vλ3−16、Vλ2−18、Vλ3−19、Vλ3−21、Vλ3−22、Vλ2−23、Vλ3−25、Vλ3−27、Vλ1−36、Vλ5−37、Vλ5−39、Vλ1−40、Vλ7−43、Vλ1−44、Vλ5−45、Vλ7−46、Vλ1−47、Vλ9−49、Vλ1−51、Vλ5−52、Vλ6−57、Vλ4−60、Vλ8−61、及びVλ4−69からなる群から選択される、(ヒト生殖系)Vλ遺伝子セグメントである。一部のある実施形態では、VL遺伝子セグメントは、Vλ2−14、例えば、ヒト生殖系Vλ2−14遺伝子セグメントである。一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列中のJL遺伝子セグメントは、Jλ1、Jλ2、Jλ3、及びJλ7からなる群から選択される。一部のある実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、Vλ2−14Jλ1である。一部のある実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、Vλ2−14Jλ2を含む。一部のある実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、Vλ2−14Jλ3を含む。一部のある実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、Vλ2−14Jλ7を含む。
一部の実施形態では、非ヒト動物は齧歯類であり、軽鎖定常領域核酸配列は、ラット又はマウスのCλ定常領域核酸配列である。
一部の実施形態では、非ヒト動物は齧歯類であり、重鎖定常領域核酸配列は、それぞれが機能性CH1ドメインをコードする、Igμ、Igδ、Igγ、Igε、Igα、及びそれらの組合せからなる群から選択される、ラット又はマウスの定常領域配列である。
一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ゲノム中の内因性の免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に配置されている。一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、非ヒト動物の生殖系のゲノムに存在している。一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ゲノム中の異所性遺伝子座に配置されている。一部の実施形態では、非ヒト動物は、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列の複数の複製を含む。
一部の実施形態では、非ヒト動物は、Adam6a遺伝子、Adam6b遺伝子、又はその両方を含む。一部の実施形態では、非ヒト動物は、機能的、異所性マウスAdam6遺伝子を含む。
一部の実施形態では、ユニバーサル軽鎖をコードする核酸配列は、対応するヒト生殖系軽鎖可変遺伝子セグメントによってコードされていない、1つ以上のヒスチジンコドンを含む。
一部の実施形態では、本発明は、本明細書において提供されるか又は本明細書において開示される方法によって作製される、遺伝子改変非ヒト動物を用いるための方法を提供し、その方法は一般に、非ヒト動物から、重鎖定常領域に融合されるVL/CHxULCドメインを含む、ハイブリッドの免疫グロブリン鎖(ユニバーサル軽鎖と同種のもの)を発現する細胞、例えばリンパ球、例えばB細胞を単離することと、かつ/又は、細胞から、ハイブリッドの免疫グロブリン鎖のVL/CHxULCドメインをコードする核酸を得ることを含む。一部の実施形態では、免疫グロブリン軽鎖可変VL/CHxULCドメインをコードする核酸配列を得るための方法は、(a)任意選択で、そのゲノムに、(i)免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列と、(ii)非ヒト動物が免疫反応を起こすように、免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント(VL及びJL)とを含む非ヒト動物に、エピトープ又はその免疫原性部分を含む抗原で免疫を与えること;及び、免疫を与えられた非ヒト動物から、抗原を結合することができる軽鎖可変VL/CHxULCドメインをコードする核酸配列を発現する細胞、及び/又は抗原を結合することができる軽鎖可変VL/CHxULCドメインをコードする核酸配列を単離することを含む。
一部の実施形態では、抗原を結合することができる軽鎖可変VL/CHxULCドメインをコードする核酸配列は、重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント(VL及びJL)に由来する。
一部の実施形態では、単離するステップは、蛍光活性化細胞選別(FACS)又はフローサイトメトリーを介して実行される。一部の実施形態では、単離するステップは、免疫を与えられた非ヒト動物から、細胞を得ることと、その細胞から、抗原を結合することができる軽鎖VL/CHxULCドメインをコードする核酸配列を得ることとを含み、その細胞はリンパ球である。一部のある実施形態では、リンパ球は、ナチュラルキラー細胞、T細胞、又はB細胞を含む。
一部の実施形態では、その方法は、リンパ球を、癌細胞と融合させて、ハイブリドーマを形成することを更に含む。一部のある実施形態では、癌細胞は骨髄腫細胞である。
一部の実施形態では、単離された核酸配列は、免疫グロブリン定常領域核酸配列をコードする核酸配列と融合される。
一部の実施形態では、非ヒト動物は哺乳類又は鳥類である。一部のある実施形態では、鳥類はニワトリである。一部のある実施形態では、哺乳類は、齧歯類である。一部の実施形態では、齧歯類は、マウス、ラット、及びハムスターからなる群から選択される。
一部の実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変VL及びJL遺伝子セグメントは、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列は、例えば、それぞれが機能性CH1ドメインをコードする配列を含む1つ以上の重鎖定常領域遺伝子、例えば、少なくともインタクトなIgμ遺伝子と、インタクトなIgδ遺伝子、インタクトなIgγ遺伝子、インタクトなIgε遺伝子、及びインタクトなIgα遺伝子のうちの少なくとも1つとを含む、マウス又はラットの免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列である。
一部の実施形態では、非ヒト動物は齧歯類であり、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変VL及びJL遺伝子セグメントは、例えば、それぞれが機能性CH1ドメインをコードする配列を含む1つ以上の重鎖定常領域遺伝子、例えば、少なくともインタクトなIgμ遺伝子と、インタクトなIgδ遺伝子、インタクトなIgγ遺伝子、インタクトなIgε遺伝子、及びインタクトなIgα遺伝子のうちの少なくとも1つとを含む、ヒト重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている。
一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、非ヒト軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、非ヒト軽鎖定常領域核酸配列は、マウス又はラットの軽鎖定常領域核酸配列である。
一部の実施形態では、非ヒト動物は齧歯類であり、かつ再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒト軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている。一部のある実施形態では、軽鎖定常領域核酸配列は、κ配列である。一部のある実施形態では、軽鎖定常領域核酸配列は、λ配列である。
一部の実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリンVL及びJL遺伝子セグメントは、ヒトVκ及びJκ遺伝子セグメントである。一部の実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリンVL及びJL遺伝子セグメントは、ヒトVλ及びJλ遺伝子セグメントである。
一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒトκ軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒトλ軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリンVL遺伝子セグメントは、Vκ1−5、Vκ1−6、Vκ1−8、Vκ1−9、Vκ1−12、Vκ1−13、Vκ1−16、Vκ1−17、Vκ1−22、Vκ1−27、Vκ1−32、Vκ1−33、Vκ1−35、Vκ1−37、Vκ1−39、Vκ1D−8、Vκ1D−12、Vκ1D−13、Vκ1D−16、Vκ1D−17、Vκ1D−22、Vκ1D−27、Vκ1D−32、Vκ1D−33、Vκ1D−35、Vκ1D−37、Vκ1D−39、Vκ1D−42、Vκ1D−43、Vκ1−NL1、Vκ2−4、Vκ2−10、Vκ2−14、Vκ2−18、Vκ2−19、Vκ2−23、Vκ2−24、Vκ2−26、Vκ2−28、Vκ2−29、Vκ2−30、Vκ2−36、Vκ2−38、Vκ2−40、Vκ2D−10、Vκ2D−14、Vκ2D−18、Vκ2D−19、Vκ2D−23、Vκ2D−24、Vκ2D−26、Vκ2D−28、Vκ2D−29、Vκ2D−30、Vκ2D−36、Vκ2D−38、Vκ2D−40、Vκ3−7、Vκ3−11、Vκ3−15、Vκ3−20、Vκ3−25、Vκ3−31、Vκ3−34、Vκ3D−7、Vκ3D−7、Vκ3D−11、Vκ3D−15、Vκ3D−15、Vκ3D−20、Vκ3D−25、Vκ3D−31、Vκ3D−34、Vκ3−NL1、Vκ3−NL2、Vκ3−NL3、Vκ3−NL4、Vκ3−NL5、Vκ4−1、Vκ5−2、Vκ6−21、Vκ6D−21、Vκ6D−41、及びVκ7−3のうちの1つ以上を含む。一部の実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリンJL遺伝子セグメントは、Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4、及びJκ5のうちの1つ以上を含む。
一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域中のVL遺伝子セグメントは、Vκ1−5、Vκ1−6、Vκ1−8、Vκ1−9、Vκ1−12、Vκ1−13、Vκ1−16、Vκ1−17、Vκ1−22、Vκ1−27、Vκ1−32、Vκ1−33、Vκ1−35、Vκ1−37、Vκ1−39、Vκ1D−8、Vκ1D−12、Vκ1D−13、Vκ1D−16、Vκ1D−17、Vκ1D−22、Vκ1D−27、Vκ1D−32、Vκ1D−33、Vκ1D−35、Vκ1D−37、Vκ1D−39、Vκ1D−42、Vκ1D−43、Vκ1−NL1、Vκ2−4、Vκ2−10、Vκ2−14、Vκ2−18、Vκ2−19、Vκ2−23、Vκ2−24、Vκ2−26、Vκ2−28、Vκ2−29、Vκ2−30、Vκ2−36、Vκ2−38、Vκ2−40、Vκ2D−10、Vκ2D−14、Vκ2D−18、Vκ2D−19、Vκ2D−23、Vκ2D−24、Vκ2D−26、Vκ2D−28、Vκ2D−29、Vκ2D−30、Vκ2D−36、Vκ2D−38、Vκ2D−40、Vκ3−7、Vκ3−11、Vκ3−15、Vκ3−20、Vκ3−25、Vκ3−31、Vκ3−34、Vκ3D−7、Vκ3D−7、Vκ3D−11、Vκ3D−15、Vκ3D−15、Vκ3D−20、Vκ3D−25、Vκ3D−31、Vκ3D−34、Vκ3−NL1、Vκ3−NL2、Vκ3−NL3、Vκ3−NL4、Vκ3−NL5、Vκ4−1、Vκ5−2、Vκ6−21、Vκ6D−21、Vκ6D−41、及びVκ7−3からなる群から選択される、(ヒト生殖系)Vκ遺伝子セグメントである。一部のある実施形態では、VL遺伝子セグメントは、Vκ1−39(例えば、ヒト生殖系Vκ1−39遺伝子セグメント)及びVκ3−20(例えば、ヒト生殖系Vκ3−20遺伝子セグメント)からなる群から選択される。一部の実施形態では、JL遺伝子セグメントは、Jκ1(例えば、ヒト生殖系Jκ1遺伝子セグメント)、Jκ2(例えば、ヒト生殖系Jκ2遺伝子セグメント)、Jκ3(例えば、ヒト生殖系Jκ3遺伝子セグメント)、Jκ4(例えば、ヒト生殖系Jκ4遺伝子セグメント)、及びJκ5(例えば、ヒト生殖系Jκ5遺伝子セグメント)からなる群から選択される。一部のある実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変ヌクレオチド配列は、Vκ1−39及びJκ5を含む(例えば、Vκ1−39は、Jκ5によって再配列され、例えば、ヒト生殖系Vκ1−38遺伝子セグメントは、ヒト生殖系Jκ5遺伝子セグメントによって再配列されている)。一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、配列番号1と記載される配列を含む。一部のある実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変ヌクレオチド配列は、Vκ3−20及びJκ1を含む(例えば、Vκ3−20は、Jκ1によって再配列され、例えば、ヒト生殖系Vκ3−20遺伝子セグメントは、ヒト生殖系Jκ1遺伝子セグメントによって再配列されている)。一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、配列番号2と記載される配列を含む。一部の実施形態では、非ヒト動物は齧歯類であり、軽鎖定常領域核酸配列は、ラット又はマウスのCκ定常領域核酸配列である。
一部の実施形態では、非ヒト動物は齧歯類であり、重鎖定常領域核酸配列は、それぞれが機能性CH1ドメインをコードする、Igμ、Igδ、Igγ、Igε、Igα、及びそれらの組合せからなる群から選択される、ラット又はマウスの定常領域配列である。
一部の実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリンVL遺伝子セグメントは、Vλ3−1、Vλ4−3、Vλ2−8、Vλ3−9、Vλ3−10、Vλ2−11、Vλ3−12、Vλ2−14、Vλ3−16、Vλ2−18、Vλ3−19、Vλ3−21、Vλ3−22、Vλ2−23、Vλ3−25、Vλ3−27、Vλ1−36、Vλ5−37、Vλ5−39、Vλ1−40、Vλ7−43、Vλ1−44、Vλ5−45、Vλ7−46、Vλ1−47、Vλ9−49、Vλ1−51、Vλ5−52、Vλ6−57、Vλ4−60、Vλ8−61、及びVλ4−69のうちの1つ以上を含む。一部の実施形態では、非ヒト動物は、Jλ1、Jλ2、Jλ3、及びJλ7を含む、再配列されていないヒト免疫グロブリンJL遺伝子セグメントを含む。
一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列中のVL遺伝子セグメントは、Vλ3−1、Vλ4−3、Vλ2−8、Vλ3−9、Vλ3−10、Vλ2−11、Vλ3−12、Vλ2−14、Vλ3−16、Vλ2−18、Vλ3−19、Vλ3−21、Vλ3−22、Vλ2−23、Vλ3−25、Vλ3−27、Vλ1−36、Vλ5−37、Vλ5−39、Vλ1−40、Vλ7−43、Vλ1−44、Vλ5−45、Vλ7−46、Vλ1−47、Vλ9−49、Vλ1−51、Vλ5−52、Vλ6−57、Vλ4−60、Vλ8−61、及びVλ4−69からなる群から選択される、(ヒト生殖系)Vλ遺伝子セグメントである。一部のある実施形態では、VL遺伝子セグメントは、Vλ2−14、例えば、ヒト生殖系Vλ2−14遺伝子セグメントである。一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列中のJL遺伝子セグメントは、Jλ1、Jλ2、Jλ3、及びJλ7からなる群から選択される。一部のある実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、Vλ2−14Jλ1を含む。一部のある実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、Vλ2−14Jλ2を含む。一部のある実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、Vλ2−14Jλ3を含む。一部のある実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、Vλ2−14Jλ7を含む。一部の実施形態では、非ヒト動物は齧歯類であり、軽鎖定常領域核酸配列は、ラット又はマウスのCλ定常領域核酸配列である。
一部の実施形態では、非ヒト動物は齧歯類であり、重鎖定常領域核酸配列は、それぞれが機能性CH1ドメインをコードする、Igμ、Igδ、Igγ、Igε、Igα、及びそれらの組合せからなる群から選択される、ラット又はマウスの定常領域配列である。
一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ゲノム中の内因性の免疫グロブリン軽鎖遺伝子座にある。一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、非ヒト動物の生殖系のゲノムに存在している。一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ゲノム中の、転写的に活性な遺伝子座に組み込まれている。一部の実施形態では、非ヒト動物は、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列の複数の複製を含む。
一部の実施形態では、非ヒト動物は、組み込まれたAdam6a遺伝子、Adam6b遺伝子、又はその両方を含む。一部の実施形態では、非ヒト動物は、機能的、異所性マウスAdam6遺伝子を含む。
一部の実施形態では、ユニバーサル軽鎖をコードする核酸配列は、対応するヒト生殖系軽鎖可変遺伝子セグメントによってコードされていない、1つ以上のヒスチジンコドンを含む。
一部の実施形態では、本発明は、VL/CHxULC(VκOHxULC又はVλOHxULC)ドメインを含む抗原結合タンパク質を作製するための方法を提供し、その方法は一般に、宿主細胞内で、VL/CHxULCドメインをコードする核酸配列を含み、任意選択で、機能性CH1ドメインをコードする配列を含む重鎖定常領域遺伝子、又は軽鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結された第1の核酸を発現させることを含み、VL/CHxULCドメインは、ユニバーサル軽鎖可変ドメインと同種のものであり、かつ、抗原結合タンパク質は、単一のドメイン抗原結合タンパク質ではない。一部の実施形態では、VL/CHxULCドメインをコードする核酸配列が、そのゲノムに、(i)免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列と、(ii)免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント(VL及びJL)と、を含む非ヒト動物から単離され、VL/CHxULCドメインをコードする核酸配列は、例えば、それぞれが、機能性CH1ドメインをコードする配列を含む、1つ以上の重鎖定常領域遺伝子、例えば、少なくともインタクトなIgμ遺伝子と、インタクトなIgδ遺伝子、インタクトなIgγ遺伝子、インタクトなIgε遺伝子、及びインタクトなIgα遺伝子のうちの少なくとも1つとを含む、免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント(VL及びJL)に由来する。一部の実施形態では、その方法は、(a)そのゲノムに、(i)免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列と、(ii)免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された、再配列されたVL/JL遺伝子配列を形成するように再配列可能な、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント(VL及びJL)と、を含む非ヒト動物が、エピトープ又はその免疫原性部分に対して免疫反応を起こすように、任意選択で、その非ヒト動物に、エピトープ又はその免疫原性部分を含む抗原で免疫を与えることと、その後で、(b)非ヒト動物から、エピトープ又はその免疫原性部分を特異的に結合する軽鎖可変ドメインであって、免疫グロブリン重鎖定常領域核酸に作動可能に連結された、再配列されたVL/JL遺伝子配列に由来する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を単離することと、を更に含む。追加的な実施形態は、(c)単離された核酸配列を、任意選択で、ヒト免疫グロブリン定常領域核酸配列に作動可能に連結された発現構築物に採用することと、その後で、(d)核酸配列、又はそれを含む発現構築物を生成細胞系、例えば宿主細胞に発現させて、抗原結合タンパク質を得ることと、を含む方法を含む。
一部の実施形態では、VL/CHxULCドメインを含む抗原結合タンパク質を作製する方法は、宿主細胞に、(i)任意選択で、機能性CH1ドメインをコードする配列を含む第1の重鎖定常領域遺伝子又は第1の軽鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結された第1のエピトープに対して特異的な、第1の可変ドメイン、例えば、VL/CHxULCドメインを含む第1の結合成分をコードする核酸配列を含む第1の核酸と、(ii)第2のエピトープに対して特異的な第2の可変ドメインを含む、第2の成分をコードする第2の核酸と、を同時発現させることを含み、第2の可変ドメインは、第2のVL/CHxULCドメイン又はVHxULCドメインのいずれか一方であり、第1及び第2のエピトープは同一ではなく、しかも、第1及び第2の可変ドメインはそれぞれ、同じ単一の、再配列された軽鎖可変領域遺伝子配列に由来するユニバーサル軽鎖可変ドメインと同種のものであり、かつそれゆえに、同一であるか、又は体細胞超変異された変異体である、例えば、体細胞超変異を介してのみ、アミノ酸配列が異なる。
そのため、一部の実施形態では、その方法は(a)そのゲノムに、(i)免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列、及び(ii)再配列して、(第2の結合成分の第2のVL/CHxULCドメインをコードする)再配列されたVL/JL遺伝子配列を形成可能な、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント(VL及びJL)、又は再配列して、免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された、(第2の結合成分のVHxULCドメインをコードする)再配列されたVH/D/JH遺伝子配列を形成可能な、再配列されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメント(VH、D、及びJH)のいずれか一方を含む第2の非ヒト動物が、エピトープ又はその免疫原性部分に対して免疫反応を起こすように、その第2の非ヒト動物に、エピトープ又はその免疫原性部分を含む抗原によって免疫を与えることと、その後で、(b)その非ヒト動物から、第2のエピトープ又はその免疫原性部分を特異的に結合する第2のVL/CHxULC又はVHxULCドメインをコードする、第2の核酸配列を単離することと、を含む。追加的な実施形態は、(c)単離された第2の核酸配列を、任意選択で、ヒト免疫グロブリン定常領域核酸配列に作動可能に連結された発現構築物に採用することと、その後に、(d)第1及び第2の核酸配列、又はそれらを含む発現構築物を、生成細胞系、例えば宿主細胞に発現させて、単一ドメイン抗原結合タンパク質ではない抗原結合タンパク質を得ることと、を含む方法を含む。
追加的な実施形態では、その方法は、生成宿主細胞に、第1のVL/CHxULCドメイン(又はそれを含む発現構築物)をコードする第1の核酸と、任意選択で、第2のVL/CHxULCドメイン又はVHxULCドメイン(又はそれを含む発現構築物)をコードする第2の核酸と、VL/CHxULCドメインと、任意選択の、第2のVL/CHxULCドメイン又はVHxULCドメインと同種の、ヒトユニバーサル軽鎖可変ドメイン、又はその体細胞超変異された変異体をコードする、再配列されたVL/JL遺伝子配列を含むヌクレオチド配列と、を同時発現することを更に含む。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、ヒト軽鎖定常ドメインに融合された、ユニバーサル軽鎖可変ドメインをコードする。
第1の核酸配列及び、第2の核酸配列と、ヒトユニバーサル軽鎖可変ドメインをコードする、再配列されたVL/JL遺伝子配列を含む、ヌクレオチド配列とのうちの一方又は両方が、同じ又は異なる発現構築物に用いられ得るが、1つ以上の発現構築物は、抗原結合タンパク質、例えば、第1の結合成分、及び第2の結合成分と、Fab様構造、scFab様構造、二重特異性抗体様構造、scFv様構造、scFv−Fc様構造、scFv−ジッパー様構造、及び典型的な抗体と同様で、かつ同種のユニバーサル軽鎖を含む四量体型構造、からなる群から選択されるフォーマットの、ユニバーサル軽鎖とのいずれか一方又は両方とを発現する。したがって、一部の実施形態では、第1及び第2の核酸配列のいずれか一方又は両方が、定常領域、例えば、機能性CH1ドメイン又は(ヒト)軽鎖定常ドメインを含む(ヒト)重鎖定常領域に融合されていても、されていなくてもよい、第1の可変VL/CHxULC及び第2の可変(VL/CHxULC又はVHxULC)ドメインをそれぞれコードし得る。
一部の実施形態では、第1及び第2の核酸配列のいずれか一方又は両方が、IgM、IgD、IgG、IgE、及びIgAからなる群から選択されるアイソタイプを有するヒト重鎖定常領域、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4からなる群から選択される下位クラスを有する、IgG重鎖定常領域をコードする重鎖定常領域核酸を含む。一部の実施形態では、第1及び第2の核酸配列は、同一のアイソタイプ及び/又は下位クラスを有する重鎖定常領域に融合されている第1の可変ドメインVL/CHxULC及び第2の可変ドメイン(VL/CHxULC又はVHxULC)をコードするが、任意選択で、重鎖定常領域は、そのAタンパク質に対する親和性が異なっている。第1の可変ドメインVL/CHxULCと、第2の可変ドメイン(VL/CHxULC又はVHxULC)ドメインとの両方が、ヒトIgG1、IgG2、又はIgG4重鎖定常領域に融合されている一部の実施形態では、第1の可変ドメインVL/CHxULCと第2の可変ドメイン(VL/CHxULC又はVHxULC)とのうちの一方のみが、CH3ドメインのAタンパク質に対する結合を減少させるか、又は消滅させる突然変異、例えば、IMGT番号付けシステムにおける(a)95R、並びに(b)95R及び96F、又はEU番号付けシステムにおける、(a’)435R、並びに(b’)435R及び436Fからなる群から選択される突然変異を、CH3ドメインに含む、ヒトIgG1、IgG2、又はIgG4重鎖定常領域に融合される。一部の実施形態では、ヒト重鎖定常領域は、ヒトIgG1定常領域であり、かつIMGTエキソン番号付けシステムにおける、16E、18M、44S、52N、57M、及び82I、又はEU番号付けシステムにおける、356E、358M、384S、392N、397M、及び422Iからなる群から選択される、1〜5つの一時変異を更に含む。一部の実施形態では、ヒト重鎖定常領域は、ヒトIgG2定常領域であり、かつIMGTエキソン番号付けシステムにおける、44S、52N、及び82I、又はEU番号付けシステムにおける、348S、392N、及び422Iからなる群から選択される、1つ又は2つの一時変異を更に含む。他の実施形態では、ヒト重鎖定常領域は、ヒトIgG4定常領域であり、かつ、IMGTエキソン番号付けシステムにおける、15R、44S、52N、57M、69K、79Q、及び82I、又は、EU番号付けシステムにおける、355R、384S、392N、397M、409K、419Q、422Iからなる群から選択される1〜7つの一時変異、及び/又は、IMGTエキソン番号付けシステムにおける105P若しくはEU番号付けシステムにおける445Pを更に含む。
一部の実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖VL又はJL遺伝子セグメントの少なくとも一方が、対応するヒト生殖系軽鎖可変遺伝子セグメントによってコードされていない1つ以上のヒスチジン残基をコードする。
一部の実施形態では、第1及び第2の核酸配列がそれに由来する第1及び/又は第2の非ヒト動物は、哺乳類又は鳥類である。一部のある実施形態では、鳥類はニワトリである。一部のある実施形態では、哺乳類は、齧歯類である。一部の実施形態では、齧歯類は、マウス、ラット、及びハムスターからなる群から選択される。
一部の実施形態では、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変VL及びJL遺伝子セグメントは、それぞれが、機能性CH1ドメインをコードする配列を含む、例えば、少なくともインタクトなIgμ遺伝子と、インタクトなIgδ遺伝子、インタクトなIgγ遺伝子、インタクトなIgε遺伝子、及びインタクトなIgα遺伝子のうちの少なくとも1つとをコードする配列を含む、例えば1つ以上の重鎖定常領域遺伝子を含む、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列は、例えば、それぞれが機能性CH1ドメインをコードする配列を含む1つ以上の重鎖定常領域遺伝子、例えば、少なくともインタクトなIgμ遺伝子と、インタクトなIgδ遺伝子、インタクトなIgγ遺伝子、インタクトなIgε遺伝子、及びインタクトなIgα遺伝子のうちの少なくとも1つとを含む、マウス又はラットの免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列である。一部の実施形態では、非ヒト動物は齧歯類であり、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変VL及びJL遺伝子セグメントは、例えば、それぞれが機能性CH1ドメインをコードする配列を含む1つ以上の重鎖定常領域遺伝子、例えば、少なくともインタクトなIgμ遺伝子と、インタクトなIgδ遺伝子、インタクトなIgγ遺伝子、インタクトなIgε遺伝子、及びインタクトなIgα遺伝子のうちの少なくとも1つとを含む、ヒト重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている。
一部の実施形態では、重鎖定常領域核酸配列は、CH1、ヒンジ、CH2、CH3、又はそれらの組合せをコードするヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、重鎖定常領域核酸配列は、機能性CH1ドメインをコードする配列を含む。
一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、非ヒト軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、非ヒト軽鎖定常領域核酸配列は、マウス又はラットの軽鎖定常領域核酸配列である。一部の実施形態では、非ヒト動物は齧歯類であり、かつ再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒト軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている。一部のある実施形態では、軽鎖定常領域核酸配列は、κ配列である。一部のある実施形態では、軽鎖定常領域核酸配列は、λ配列である。
一部の実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変VL及びJL遺伝子セグメントは、Vκ及びJκ遺伝子セグメントである。一部の実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変VL及びJL遺伝子セグメントは、Vλ及びJλ遺伝子セグメントである。
一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒトκ軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒトλ軽鎖可変ドメイン遺伝子配列を含む。
一部の実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリンVL遺伝子セグメントは、Vκ1−5、Vκ1−6、Vκ1−8、Vκ1−9、Vκ1−12、Vκ1−13、Vκ1−16、Vκ1−17、Vκ1−22、Vκ1−27、Vκ1−32、Vκ1−33、Vκ1−35、Vκ1−37、Vκ1−39、Vκ1D−8、Vκ1D−12、Vκ1D−13、Vκ1D−16、Vκ1D−17、Vκ1D−22、Vκ1D−27、Vκ1D−32、Vκ1D−33、Vκ1D−35、Vκ1D−37、Vκ1D−39、Vκ1D−42、Vκ1D−43、Vκ1−NL1、Vκ2−4、Vκ2−10、Vκ2−14、Vκ2−18、Vκ2−19、Vκ2−23、Vκ2−24、Vκ2−26、Vκ2−28、Vκ2−29、Vκ2−30、Vκ2−36、Vκ2−38、Vκ2−40、Vκ2D−10、Vκ2D−14、Vκ2D−18、Vκ2D−19、Vκ2D−23、Vκ2D−24、Vκ2D−26、Vκ2D−28、Vκ2D−29、Vκ2D−30、Vκ2D−36、Vκ2D−38、Vκ2D−40、Vκ3−7、Vκ3−11、Vκ3−15、Vκ3−20、Vκ3−25、Vκ3−31、Vκ3−34、Vκ3D−7、Vκ3D−7、Vκ3D−11、Vκ3D−15、Vκ3D−15、Vκ3D−20、Vκ3D−25、Vκ3D−31、Vκ3D−34、Vκ3−NL1、Vκ3−NL2、Vκ3−NL3、Vκ3−NL4、Vκ3−NL5、Vκ4−1、Vκ5−2、Vκ6−21、Vκ6D−21、Vκ6D−41、及びVκ7−3のうちの1つ以上を含む。一部の実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリンJL遺伝子セグメントは、Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4、及びJκ5を含む。
一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、VL及びJL遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域中のVL遺伝子セグメントは、Vκ1−5、Vκ1−6、Vκ1−8、Vκ1−9、Vκ1−12、Vκ1−13、Vκ1−16、Vκ1−17、Vκ1−22、Vκ1−27、Vκ1−32、Vκ1−33、Vκ1−35、Vκ1−37、Vκ1−39、Vκ1D−8、Vκ1D−12、Vκ1D−13、Vκ1D−16、Vκ1D−17、Vκ1D−22、Vκ1D−27、Vκ1D−32、Vκ1D−33、Vκ1D−35、Vκ1D−37、Vκ1D−39、Vκ1D−42、Vκ1D−43、Vκ1−NL1、Vκ2−4、Vκ2−10、Vκ2−14、Vκ2−18、Vκ2−19、Vκ2−23、Vκ2−24、Vκ2−26、Vκ2−28、Vκ2−29、Vκ2−30、Vκ2−36、Vκ2−38、Vκ2−40、Vκ2D−10、Vκ2D−14、Vκ2D−18、Vκ2D−19、Vκ2D−23、Vκ2D−24、Vκ2D−26、Vκ2D−28、Vκ2D−29、Vκ2D−30、Vκ2D−36、Vκ2D−38、Vκ2D−40、Vκ3−7、Vκ3−11、Vκ3−15、Vκ3−20、Vκ3−25、Vκ3−31、Vκ3−34、Vκ3D−7、Vκ3D−7、Vκ3D−11、Vκ3D−15、Vκ3D−15、Vκ3D−20、Vκ3D−25、Vκ3D−31、Vκ3D−34、Vκ3−NL1、Vκ3−NL2、Vκ3−NL3、Vκ3−NL4、Vκ3−NL5、Vκ4−1、Vκ5−2、Vκ6−21、Vκ6D−21、Vκ6D−41、及びVκ7−3からなる群から選択される、(ヒト生殖系)Vκ遺伝子セグメントである。一部のある実施形態では、VL遺伝子セグメントは、Vκ1−39(例えば、ヒト生殖系Vκ1−39遺伝子セグメント)及びVκ3−20(例えば、ヒト生殖系Vκ3−20遺伝子セグメント)からなる群から選択される。一部の実施形態では、JL遺伝子セグメントは、Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4、及びJκ5からなる群から選択される。一部のある実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変ヌクレオチド配列は、Vκ1−39及びJκ5を含む(例えば、Vκ1−39は、Jκ5によって再配列され、例えば、ヒト生殖系Vκ1−39遺伝子セグメントは、ヒト生殖系Jκ5遺伝子セグメントによって再配列されている)。一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列は、配列番号1と記載される配列を含む。一部のある実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変ヌクレオチド配列は、Vκ3−20及びJκ1を含む(例えば、Vκ3−20は、Jκ1によって再配列され、例えば、ヒト生殖系Vκ3−20遺伝子セグメントは、ヒト生殖系Jκ1遺伝子セグメントによって再配列されている)。一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、配列番号2と記載される配列を含む。
一部の実施形態では、非ヒト動物は齧歯類であり、軽鎖定常領域核酸配列は、ラット又はマウスのCκ定常領域核酸配列である。一部の実施形態では、非ヒト動物は齧歯類であり、重鎖定常領域核酸配列は、それぞれが少なくとも機能性CH1ドメインをコードする、Igμ、Igδ、Igγ、Igε、Igα、及びそれらの組合せからなる群から選択される、ラット又はマウスの定常領域配列である。
一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ゲノム中の内因性の免疫グロブリン軽鎖遺伝子座にある。一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、非ヒト動物の生殖系のゲノムに存在している。一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ゲノム中の、転写的に活性な遺伝子座にある。
一部の実施形態では、非ヒト動物は、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列の複数の複製を含む。
一部の実施形態では、非ヒト動物は、Adam6a遺伝子、Adam6b遺伝子、又はその両方を含む。一部の実施形態では、非ヒト動物は、機能的、異所性マウスAdam6遺伝子を含む。
一部の実施形態では、本発明は、そのゲノムが、(a)免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変VL及びJL遺伝子セグメントを含む第1の免疫グロブリン遺伝子座と、(b)免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された、再配列された非ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む、第2の免疫グロブリン遺伝子座とを含む、非ヒト動物を提供する。
一部の実施形態では、非ヒト動物は哺乳類又は鳥類である。一部のある実施形態では、鳥類はニワトリである。一部のある実施形態では、哺乳類は、齧歯類である。一部の実施形態では、齧歯類は、マウス、ラット、及びハムスターからなる群から選択される。
一部の実施形態では、再配列された非ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、齧歯類免疫グロブリンVκ及びJκ遺伝子セグメントを含む。一部のある実施形態では、齧歯類免疫グロブリンVκ及びJκ遺伝子セグメントは、マウス遺伝子セグメントである。一部のある実施形態では、齧歯類免疫グロブリンVκ及びJκ遺伝子セグメントは、ラット遺伝子セグメントである。
一部の実施形態では、本発明は、非ヒト動物を作製する方法を提供するが、その方法は、(a)非ヒト動物のゲノムを、すべて又は実質的にすべての(i)内因性の機能性免疫グロブリン重鎖VH、D、及びJH遺伝子セグメント、並びに(ii)内因性の機能性軽鎖VL及びJL遺伝子セグメントを、欠失するか又は非機能性にするように改変することと、(b)再配列されていない軽鎖可変遺伝子セグメントが、重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されるように、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変VL及びJL遺伝子セグメントを、ゲノム中に配置することと、(c)再配列された非ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列が、軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されるように、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を、ゲノム中に配置することと、を含む。
一部の実施形態では、本発明は、重鎖可変ドメインとは独立に抗原を結合可能である免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン(VL)をコードする核酸配列を得るための方法を提供し、その方法は、(a)そのゲノムに(i)免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された、再配列された非ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列と、(ii)免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント(VL及びJL)とを含む非ヒト動物に、エピトープ又はその免疫原性部分を含む抗原によって免疫を与えることと、(b)その非ヒト動物が免疫反応を起こすのを可能にすることと、(c)免疫を与えられた非ヒト動物から、抗原を結合することが可能な軽鎖可変ドメイン(VLドメイン)をコードする核酸配列を得ることと、を含む。
一部の実施形態では、本発明は、重鎖可変ドメインとは独立に抗原を結合可能である免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質を作製するための方法を提供し、その方法は、(a)そのゲノムに(i)免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された、再配列された非ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列と、(ii)免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント(VL及びJL)とを含む非ヒト動物に、エピトープ又はその免疫原性部分を含む抗原によって免疫を与えることと、(b)その非ヒト動物が、第1のエピトープ又はその免疫原性部分に対して、免疫反応を起こすのを可能にすることと、(c)その非ヒト動物から、エピトープ又はその免疫原性部分を特異的に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を得ることと、(d)(c)の核酸配列を、ヒト免疫グロブリン定常領域核酸配列に融合されている発現構築物に用いることと、(e)(c)の核酸配列を、生成細胞系において発現させて、その軽鎖が(c)の核酸によってコードされ、かつ重鎖とは独立にエピトープ又はその免疫原性部分を結合する、抗原結合タンパク質を形成することと、を含む。
一部の実施形態では、本発明は、非ヒト動物を提供する。その生殖系のゲノムに、(a)重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変VL及びJL遺伝子セグメントを含む、ハイブリッドの免疫グロブリン鎖遺伝子座と、(b)免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された、2つ以上であるが野生型のものの数よりも少ないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含む、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座とを含む。
一部の実施形態では、非ヒト動物は哺乳類又は鳥類である。一部のある実施形態では、鳥類はニワトリである。一部のある実施形態では、哺乳類は、齧歯類である。一部の実施形態では、齧歯類は、マウス、ラット、及びハムスターからなる群から選択される。
一部の実施形態では、非ヒト動物は、免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された2つ以上であるが野生型のものの数よりも少ないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントについて、ホモ接合型である。
一部の実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子セグメントは、非ヒト重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている。一部のある実施形態では、非ヒト重鎖定常領域核酸配列は、マウス又はラットの重鎖定常領域核酸配列である。一部の実施形態では、非ヒト動物は齧歯類であり、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子セグメントは、ヒト重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、重鎖定常領域核酸配列は、CH1、ヒンジ、CH2、CH3、又はそれらの組合せをコードするヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、2つ以上であるが野生型のものの数よりも少ないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントは、非ヒト軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、非ヒト軽鎖定常領域核酸配列は、マウス又はラットの軽鎖定常領域核酸配列である。
一部の実施形態では、非ヒト動物は齧歯類であり、かつ2つ以上であるが野生型のものの数よりも少ないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントは、ヒト軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、軽鎖定常領域核酸配列は、κ配列である。一部の実施形態では、軽鎖定常領域核酸配列は、λ配列である。一部の実施形態では、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、κ遺伝子座である。一部の実施形態では、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、λ遺伝子座である。
一部の実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリンVL及びJL遺伝子セグメントは、ヒトVκ及びJκ遺伝子セグメントである。一部の実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリンVL及びJL遺伝子セグメントは、ヒトVλ及びJλ遺伝子セグメントである。
一部の実施形態では、2つ以上であるが野生型のものの数よりも少ないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントは、ヒトκ軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、2つ以上であるが野生型のものの数よりも少ないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントは、ヒトλ軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変VL遺伝子セグメントは、Vκ1−5、Vκ1−6、Vκ1−8、Vκ1−9、Vκ1−12、Vκ1−13、Vκ1−16、Vκ1−17、Vκ1−22、Vκ1−27、Vκ1−32、Vκ1−33、Vκ1−35、Vκ1−37、Vκ1−39、Vκ1D−8、Vκ1D−12、Vκ1D−13、Vκ1D−16、Vκ1D−17、Vκ1D−22、Vκ1D−27、Vκ1D−32、Vκ1D−33、Vκ1D−35、Vκ1D−37、Vκ1D−39、Vκ1D−42、Vκ1D−43、Vκ1−NL1、Vκ2−4、Vκ2−10、Vκ2−14、Vκ2−18、Vκ2−19、Vκ2−23、Vκ2−24、Vκ2−26、Vκ2−28、Vκ2−29、Vκ2−30、Vκ2−36、Vκ2−38、Vκ2−40、Vκ2D−10、Vκ2D−14、Vκ2D−18、Vκ2D−19、Vκ2D−23、Vκ2D−24、Vκ2D−26、Vκ2D−28、Vκ2D−29、Vκ2D−30、Vκ2D−36、Vκ2D−38、Vκ2D−40、Vκ3−7、Vκ3−11、Vκ3−15、Vκ3−20、Vκ3−25、Vκ3−31、Vκ3−34、Vκ3D−7、Vκ3D−7、Vκ3D−11、Vκ3D−15、Vκ3D−15、Vκ3D−20、Vκ3D−25、Vκ3D−31、Vκ3D−34、Vκ3−NL1、Vκ3−NL2、Vκ3−NL3、Vκ3−NL4、Vκ3−NL5、Vκ4−1、Vκ5−2、Vκ6−21、Vκ6D−21、Vκ6D−41、及びVκ7−3からなる群から選択される。一部の実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変JL遺伝子セグメントは、Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4、及びJκ5からなる群から選択される。
一部の実施形態では、2つ以上であるが野生型のものの数よりも少ないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントは、VL及びJL遺伝子セグメントを含む。
一部の実施形態では、2つ以上の可変領域遺伝子セグメントのVL遺伝子セグメントは、Vκ1−5、Vκ1−6、Vκ1−8、Vκ1−9、Vκ1−12、Vκ1−13、Vκ1−16、Vκ1−17、Vκ1−22、Vκ1−27、Vκ1−32、Vκ1−33、Vκ1−35、Vκ1−37、Vκ1−39、Vκ1D−8、Vκ1D−12、Vκ1D−13、Vκ1D−16、Vκ1D−17、Vκ1D−22、Vκ1D−27、Vκ1D−32、Vκ1D−33、Vκ1D−35、Vκ1D−37、Vκ1D−39、Vκ1D−42、Vκ1D−43、Vκ1−NL1、Vκ2−4、Vκ2−10、Vκ2−14、Vκ2−18、Vκ2−19、Vκ2−23、Vκ2−24、Vκ2−26、Vκ2−28、Vκ2−29、Vκ2−30、Vκ2−36、Vκ2−38、Vκ2−40、Vκ2D−10、Vκ2D−14、Vκ2D−18、Vκ2D−19、Vκ2D−23、Vκ2D−24、Vκ2D−26、Vκ2D−28、Vκ2D−29、Vκ2D−30、Vκ2D−36、Vκ2D−38、Vκ2D−40、Vκ3−7、Vκ3−11、Vκ3−15、Vκ3−20、Vκ3−25、Vκ3−31、Vκ3−34、Vκ3D−7、Vκ3D−7、Vκ3D−11、Vκ3D−15、Vκ3D−15、Vκ3D−20、Vκ3D−25、Vκ3D−31、Vκ3D−34、Vκ3−NL1、Vκ3−NL2、Vκ3−NL3、Vκ3−NL4、Vκ3−NL5、Vκ4−1、Vκ5−2、Vκ6−21、Vκ6D−21、Vκ6D−41、及びVκ7−3からなる群から選択される。一部のある実施形態では、VL遺伝子セグメントは、Vκ1−39、Vκ3−20、及びそれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、JL遺伝子セグメントは、Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4、Jκ5、及びそれらの組合せからなる群から選択される。
一部の実施形態では、2つ以上であるが野生型のものの数よりも少ないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントは、2つ以上であるが野生型のものの数よりも少ないヒトVL遺伝子セグメントと、1つ以上のヒトJL遺伝子セグメントを含む。一部のある実施形態では、2つ以上であるが野生型のものの数よりも少ないVL遺伝子セグメントは、Vκ1−39及びVκ3−20遺伝子セグメントを含み、かつJL遺伝子セグメントは、Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4、Jκ5、又はそれらの組合せのうちの1つ以上のものを含む。
一部の実施形態では、非ヒト動物は齧歯類であり、軽鎖定常領域核酸配列は、ラット又はマウスのCκ定常領域核酸配列である。
一部の実施形態では、非ヒト動物は齧歯類であり、重鎖定常領域核酸配列は、それぞれが機能性CH1ドメインをコードする、Igμ、Igδ、Igγ、Igε、Igα、及びそれらの組合せからなる群から選択される、ラット又はマウスの定常領域配列である。
一部の実施形態では、実質的にすべての内因性の可変重鎖VH、D、及びJH遺伝子セグメントが、非ヒト動物の免疫グロブリン重鎖遺伝子座から欠失されるか、又は非機能性にされる。
一部の実施形態では、実質的にすべての内因性の軽鎖VL及びJL遺伝子セグメントが、非ヒト動物の免疫グロブリン軽鎖遺伝子座から欠失されるか、又は非機能性にされる。
一部の実施形態では、非ヒト動物は、Adam6a遺伝子、Adam6b遺伝子、又はその両方を含む。一部の実施形態では、非ヒト動物は、機能的、異所性マウスAdam6遺伝子を含む。
一部の実施形態では、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、2つ以上であるが野生型のものの数よりも少ないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント(VL及びJL)の複数の複製を含む。
一部の実施形態では、本発明は、非ヒト動物を作製する方法を提供するが、その方法は、(a)非ヒト動物のゲノムを、すべて又は実質的にすべての(i)内因性の免疫グロブリン重鎖VH、D、及びJH遺伝子セグメント、並びに(ii)内因性の軽鎖VL及びJL遺伝子セグメントを、欠失するか又は非機能性にするように改変することと、(b)再配列されていない軽鎖可変遺伝子セグメントが、重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されるように、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変VL及びJL遺伝子セグメントを、ゲノム中に配置することと、(c)ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントが、軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されるように、2つ以上であるが野生型のものの数よりも少ないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントを、ゲノム中に配置することと、を含む。
一部の実施形態では、非ヒト動物は哺乳類又は鳥類である。一部のある実施形態では、鳥類はニワトリである。一部のある実施形態では、哺乳類は、齧歯類である。一部の実施形態では、齧歯類は、マウス、ラット、及びハムスターからなる群から選択される。
一部の実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変VL及びJL遺伝子セグメントは、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている。一部のある実施形態では、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列は、マウス又はラットの免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列である。
一部の実施形態では、非ヒト動物は齧歯類であり、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変VL及びJL遺伝子セグメントは、ヒト重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、重鎖定常領域核酸配列は、CH1、ヒンジ、CH2、CH3、又はそれらの組合せをコードするヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、重鎖定常領域核酸配列は、機能性CH1ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、2つ以上であるが野生型のものの数よりも少ないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントは、非ヒト軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、非ヒト軽鎖定常領域核酸配列は、マウス又はラットの軽鎖定常領域核酸配列である。
一部の実施形態では、非ヒト動物は齧歯類であり、かつ2つ以上であるが野生型のものの数よりも少ないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントは、ヒト軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、軽鎖定常領域核酸配列は、κ配列である。一部の実施形態では、軽鎖定常領域核酸配列は、λ配列である。
一部の実施形態では、2つ以上であるが野生型のものの数よりも少ないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントは、κ軽鎖遺伝子座に配置されている。一部の実施形態では、2つ以上であるが野生型のものの数よりも少ないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントは、λ軽鎖遺伝子座に配置されている。
一部の実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリンVL及びJL遺伝子セグメントは、ヒトVκ及びJκ遺伝子セグメントである。一部の実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリンVL及びJL遺伝子セグメントは、ヒトVλ及びJλ遺伝子セグメントである。
一部の実施形態では、2つ以上であるが野生型のものの数よりも少ないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントは、ヒトκ軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、2つ以上であるが野生型のものの数よりも少ないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントは、ヒトλ軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変VL遺伝子セグメントは、Vκ1−5、Vκ1−6、Vκ1−8、Vκ1−9、Vκ1−12、Vκ1−13、Vκ1−16、Vκ1−17、Vκ1−22、Vκ1−27、Vκ1−32、Vκ1−33、Vκ1−35、Vκ1−37、Vκ1−39、Vκ1D−8、Vκ1D−12、Vκ1D−13、Vκ1D−16、Vκ1D−17、Vκ1D−22、Vκ1D−27、Vκ1D−32、Vκ1D−33、Vκ1D−35、Vκ1D−37、Vκ1D−39、Vκ1D−42、Vκ1D−43、Vκ1−NL1、Vκ2−4、Vκ2−10、Vκ2−14、Vκ2−18、Vκ2−19、Vκ2−23、Vκ2−24、Vκ2−26、Vκ2−28、Vκ2−29、Vκ2−30、Vκ2−36、Vκ2−38、Vκ2−40、Vκ2D−10、Vκ2D−14、Vκ2D−18、Vκ2D−19、Vκ2D−23、Vκ2D−24、Vκ2D−26、Vκ2D−28、Vκ2D−29、Vκ2D−30、Vκ2D−36、Vκ2D−38、Vκ2D−40、Vκ3−7、Vκ3−11、Vκ3−15、Vκ3−20、Vκ3−25、Vκ3−31、Vκ3−34、Vκ3D−7、Vκ3D−7、Vκ3D−11、Vκ3D−15、Vκ3D−15、Vκ3D−20、Vκ3D−25、Vκ3D−31、Vκ3D−34、Vκ3−NL1、Vκ3−NL2、Vκ3−NL3、Vκ3−NL4、Vκ3−NL5、Vκ4−1、Vκ5−2、Vκ6−21、Vκ6D−21、Vκ6D−41、及びVκ7−3からなる群から選択される。一部の実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリンJL遺伝子セグメントは、Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4、及びJκ5からなる群から選択される。
一部の実施形態では、2つ以上であるが野生型のものの数よりも少ないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントは、VL及びJL遺伝子セグメントを含む。
一部の実施形態では、2つ以上のヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントのVL遺伝子セグメントは、Vκ1−5、Vκ1−6、Vκ1−8、Vκ1−9、Vκ1−12、Vκ1−13、Vκ1−16、Vκ1−17、Vκ1−22、Vκ1−27、Vκ1−32、Vκ1−33、Vκ1−35、Vκ1−37、Vκ1−39、Vκ1D−8、Vκ1D−12、Vκ1D−13、Vκ1D−16、Vκ1D−17、Vκ1D−22、Vκ1D−27、Vκ1D−32、Vκ1D−33、Vκ1D−35、Vκ1D−37、Vκ1D−39、Vκ1D−42、Vκ1D−43、Vκ1−NL1、Vκ2−4、Vκ2−10、Vκ2−14、Vκ2−18、Vκ2−19、Vκ2−23、Vκ2−24、Vκ2−26、Vκ2−28、Vκ2−29、Vκ2−30、Vκ2−36、Vκ2−38、Vκ2−40、Vκ2D−10、Vκ2D−14、Vκ2D−18、Vκ2D−19、Vκ2D−23、Vκ2D−24、Vκ2D−26、Vκ2D−28、Vκ2D−29、Vκ2D−30、Vκ2D−36、Vκ2D−38、Vκ2D−40、Vκ3−7、Vκ3−11、Vκ3−15、Vκ3−20、Vκ3−25、Vκ3−31、Vκ3−34、Vκ3D−7、Vκ3D−7、Vκ3D−11、Vκ3D−15、Vκ3D−15、Vκ3D−20、Vκ3D−25、Vκ3D−31、Vκ3D−34、Vκ3−NL1、Vκ3−NL2、Vκ3−NL3、Vκ3−NL4、Vκ3−NL5、Vκ4−1、Vκ5−2、Vκ6−21、Vκ6D−21、Vκ6D−41、及びVκ7−3からなる群から選択される。一部のある実施形態では、VL遺伝子セグメントは、Vκ1−39、Vκ3−20、及びそれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、JL遺伝子セグメントは、Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4、Jκ5、及びそれらの組合せからなる群から選択される。
一部の実施形態では、2つ以上であるが野生型のものの数よりも少ないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントは、2つ以上であるが野生型のものの数よりも少ないヒトVL遺伝子セグメントと、1つ以上のJL遺伝子セグメントを含む。一部のある実施形態では、2つ以上であるが野生型のものの数よりも少ないヒトVL遺伝子セグメントは、Vκ1−29及びVκ3−20遺伝子セグメントを含む。
一部の実施形態では、非ヒト動物は齧歯類であり、軽鎖定常領域核酸配列は、ラット又はマウスのCκ定常領域核酸配列である。
一部の実施形態では、非ヒト動物は齧歯類であり、重鎖定常領域核酸配列は、それぞれが、機能性CH1ドメインをコードする、Igμ、Igδ、Igγ、Igε、Igαからなる群から選択される、ラット又はマウスの定常領域配列である。
一部の実施形態では、2つ以上であるが野生型のものの数よりも少ないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントは、ゲノム中の内因性の免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に配置されている。一部の実施形態では、2つ以上であるが野生型のものの数よりも少ないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントは、非ヒト動物の生殖系のゲノムに存在している。一部の実施形態では、2つ以上であるが野生型のものの数よりも少ないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントは、ゲノム中の異所性遺伝子座に存在している。
一部の実施形態では、非ヒト動物は、Adam6a遺伝子、Adam6b遺伝子、又はその両方を含む。一部の実施形態では、非ヒト動物は、機能的、異所性マウスAdam6遺伝子を含む。
本発明の他の特徴、目的、及び利点は、下記の詳細な説明において明らかである。しかしながら、この詳細な説明は、本発明の実施形態を示すものの、限定ではなく、説明のみを目的とすることを理解するべきである。本発明の範囲内での様々な変更及び改変は、詳細な説明から当業者に明らかとなるであろう。
下記の図面からなる本明細書に含まれる図面は、限定ではなく、説明のみを目的とする。
(定義)
記載の特定の方法又は実験条件は変化し得るため、本発明はかかる方法及び条件に限定されるものではない。また、本発明の範囲は特許請求の範囲によって定められるため、本明細書で使用した用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図するものではないことを理解するべきである。
記載の特定の方法又は実験条件は変化し得るため、本発明はかかる方法及び条件に限定されるものではない。また、本発明の範囲は特許請求の範囲によって定められるため、本明細書で使用した用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図するものではないことを理解するべきである。
別途定義しない限り、本明細書で使用するすべての用語及び語句は、これらの用語及び語句が当該技術分野で得た意味を含む。ただし、その反対が明確に示されるか、用語及び語句を使用する文脈から明らかである場合は除く。本発明の実施又は試験では、本明細書に記載の方法及び材料に類似、又は等価の任意の方法及び材料を使用できる。ここで、特定の方法及び材料について説明する。記載のすべての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用するとき、用語「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互接続された4つのポリペプチド鎖、2つの重(H)鎖、及び2つの軽(L)鎖を含む免疫グロブリン分子を含む。各重鎖は、重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域(CH)を含む。重鎖定常領域は、数個のドメイン、例えば、CH1、ヒンジ領域、CH2、CH3、及び任意選択で、CH4を含む。各軽鎖は、軽鎖可変ドメインと軽鎖定常領域(CL)とを含む。重鎖及び軽鎖可変ドメインは、超可変性のいわゆる相補性決定領域(CDR)、より保存されている領域が組み入れられている、いわゆるフレームワーク領域(FR)の領域へと更に細分化され得る。各重及び軽鎖可変ドメインは、FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順でアミノ末端からカルボキシ末端まで配列された、3つのCDR及び4つのFRを含む(重鎖CDRは、HCDR1、HCDR2、及びHCDR3と省略することができ、軽鎖CDRは、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3と省略することができる)。「高親和性」抗体という用語は、標的エピトープに対するKDが約10−9M以下である抗体を指す(例えば、約1×10−9M、1×10−10M、1×10−11M、又は約1×10−12M)。1つの実施形態では、KDは、例えば、BIACORE(商標)によって測定される表面プラズモン共鳴であり;別の1つの実施形態では、KDは、ELISAによって測定される。
本明細書で使用するとき、用語「生物学的に活性な」は、生物系、in vitro、又はin vivo(例えば、有機体内)で活性を有する任意の作用物質の特性を含む。例えば、作用物質が有機体内に存在するとき、その有機体内で生物学的効果を有する作用物質は、生物学的に活性であるとみなされる。タンパク質又はポリペプチドが生物学的に活性である特定の実施形態では、そのタンパク質又はポリペプチドの少なくとも1つの生物学的活性を共有するタンパク質又はポリペプチドの部分は、通常、「生物学的に活性な」部分と呼ぶ。
「抗原結合タンパク質」という語句には、それぞれ、選択的に、1つ、2つ、又はそれより多くの抗原決定基を結合する、単一特異性の、二重特異性の、又はそれより高次の抗原結合タンパク質が含まれる。二重特異性の抗原結合タンパク質は一般に、2つの非同一的な結合成分を含み、それぞれの結合成分は、2つの異なる分子上の異なるエピトープ(例えば、2つの異なる免疫原上の異なるエピトープ)、又は同じ分子上の異なるエピトープ(例えば、同じ免疫原上の異なるエピトープ)の、いずれかを特異的に結合する。二重特異性抗原結合タンパク質が、選択的に2つの異なるエピトープ(第1のエピトープ及び第2のエピトープ)を結合することが可能な場合には、第1の結合成分の、第1のエピトープに対する親和性は一般的に、少なくとも1〜2、又は3、又は4、又はそれより多くの桁だけ、第1の結合成分の、第2のエピトープに対する親和性よりも低くなるか、その逆の関係になっている。二重特異性抗原結合タンパク質によって特異的に結合されるエピトープは、同じ又は異なる標的上(例えば、同じ又は異なるタンパク質上)に存在し得る。例示的二重特異性抗原結合タンパク質には、腫瘍抗原に対して特異的な第1の結合成分と、細胞毒性のマーカーに対して特異的な第2の結合成分とを有するものがあり、例えば、Fc受容体(例えば、FcγRI、FcγRII、FcγRIII等)又はT細胞マーカー(例えば、CD3、CD28等)がある。更に、第2の結合成分は、異なる所望の特異性を有する結合成分によって置換されることが可能である。例えば、腫瘍抗原に対して特異的な第1の結合成分と、毒素に対して特異的な第2の結合成分とを有する二重特異性抗原結合タンパク質は、毒素(例えば、サポリン、ビンカアルカロイドなど)を腫瘍細胞に送達するように、対にすることができる。他の例示的二重特異性抗原結合タンパク質には、活性化受容体に対して特異的な第1の結合成分(例えば、B細胞受容体、FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIA、FcγRI、FcεRI、T細胞受容体等)と、阻害性受容体に対して特異的な第2の結合成分(例えば、FcγRIIB、CD5、CD22、CD72、CD300a等)とを有するものが挙げられる。そのような二重特異性抗原結合タンパク質は、細胞活性化(例えば、アレルギー及び喘息)に関連する治療的状態を求めて構成され得る。二重特異性抗原結合タンパク質は、例えば、同じ免疫原の異なるエピトープを認識する結合成分を組み合わせることによって作製され得る。例えば、同じ免疫原の異なるエピトープを認識する結合成分をコードする核酸配列(例えば、軽鎖又は重鎖可変配列)は、同じ又は異なる重鎖定常領域、同じ又は異なる軽鎖、又はそれぞれに重鎖定常領域及び軽鎖定常領域をコードする核酸配列に融合され得るが、そのような配列は、Fab構造、scFab構造、二重特異性抗体構造、scFv構造、scFv−Fc構造、scFv−ジッパー構造、又は同種のユニバーサル軽鎖を含む典型的な抗体と類似の四量体型構造と類似のあるフォーマットの多重特異性抗原結合タンパク質として、細胞中に発現され得る。ある例示的な二重特異性抗原結合タンパク質は、それぞれ3つの軽鎖CDRを有する2つの重鎖、続いて(N末端からC末端へ)CH1ドメイン、ヒンジ、CH2ドメイン、及びCH3ドメイン、並びにエピトープ結合特異性を付与しないが各軽鎖と結合することができる、又は各軽鎖と結合することができ、軽鎖エピトープ結合性領域によって結合されたエピトープのうち1つ以上に結合することができる、又は各軽鎖と結合することができ、軽鎖の一方若しくは両方をエピトープの一方若しくは両方に結合可能である、のいずれかである免疫グロブリン軽鎖を有する。同様に、「三重特異性抗体」という用語には、3つ以上のエピトープを選択的に結合することが可能な、抗原結合タンパク質が含まれる。
「相補的決定領域」という語句又は「CDR」という用語は、通常(即ち野生動物において)免疫グロブリン分子(例えば、抗体又はT細胞受容体)の軽又は重鎖の様々な領域で2つのフレームワーク領域間に現れる有機体の免疫グロブリン遺伝子の核酸配列によってコードされているアミノ酸配列を含む。例えば、生殖細胞系配列又は再配列された若しくは再配列されていない配列によって、及び、例えば、無感作又は成熟B細胞又はT細胞によって、CDRをコードすることができる。CDRは、体細胞変異(例えば、動物の生殖細胞系でコードされている配列と異なる)、ヒト化、及び/又はアミノ酸の置換、付加、若しくは欠失によって改変され得る。いくつかの状況では(例えば、CDR3について)、(例えば、再配列されていない核酸配列では)隣接していないが、例えば、配列のスプライシング又は接続(例えば、重鎖CDR3を形成するためのV−D−J組み換え)の結果としてB細胞核酸配列で隣接している2つ以上の配列(例えば、生殖細胞系配列)によってCDRをコードすることができる。
本明細書で使用するとき、用語「同等」は、互いに同一ではないかもしれないが、これらを比較できるほど十分に類似しており、観察した相違点又は類似点に基づいて合理的に結論を出すことができる、2つ以上の作用物質、実体、状況、条件セット等を含む。当業者は、文脈において、任意の所与の状況で2つ以上のかかる作用物質、実体、状況、条件セットなどを同等とみなすために必要とされる同一性の程度を理解するであろう。
保存的アミノ酸置換を説明するために本明細書で使用するとき、用語「保存的」は、類似の化学的性質(例えば、電荷又は疎水性)を有する側鎖R基を有するアミノ酸残基による、別のアミノ酸残基の置換を含む。概して、保存的アミノ酸置換は、対象タンパク質の機能特性、例えば、リガンドに対する受容体の結合能力を実質的に変化させない。類似の化学的性質を有する側鎖を有するアミノ酸基の例としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンなどの脂肪族側鎖;セリン及びスレオニンなどの脂肪族水酸基側鎖;アスパラギン及びグルタミンなどのアミド含有側鎖;フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンなどの芳香族側鎖;リジン、アルギニン、及びヒスチジンなどの塩基性側鎖;アスパラギン酸及びグルタミン酸などの酸性側鎖;並びにシステイン及びメチオニンなどの硫黄含有側鎖が挙げられる。保存的アミノ酸置換基としては、例えば、バリン/ロイシン/イソロイシン、フェニルアラニン/チロシン、リジン/アルギニン、アラニン/バリン、グルタミン酸/アスパラギン酸、及びアスパラギン/グルタミンが挙げられる。一部の実施形態では、保存的アミノ酸置換は、例えば、アラニンスキャニング突然変異で使用するように、タンパク質中の任意の天然残基と、アラニンとの置換であり得る。一部の実施形態では、保存的置換とは、参照により本明細書に組み込まれる、Gonnetらの、Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database,Science 256:1443〜45(1992)に開示されたPAM250対数尤度行列内の正の値を有するものである。一部の実施形態では、置換が、PAM250対数尤度マトリックスにおいて負ではない値を有する場合、その置換は「中程度に保存的な」ものと考えられる。
一部の実施形態では、免疫グロブリン軽鎖又は重鎖中の残基の位置は、1つ以上の保存的アミノ酸置換により異なる。一部の実施形態では、免疫グロブリン軽鎖又はその機能性断片(例えば、B細胞からの発現及び分泌を可能にする断片)中の残基の位置は、そのアミノ酸配列が本明細書に列挙されている軽鎖と同一ではなく、1つ以上の保存的アミノ酸置換によって異なっている。
本明細書において用いられる場合、「破壊」という用語は、(例えば、相同的組み換えを介して)DNAを中断する事象の結果を含む。一部の実施形態では、破壊は、DNA配列の欠失、挿入、反転、改変、交換、置換、又はそれらの任意の組合せを実現又は意味し得る。一部の実施形態では、破壊は、DNA内のコード配列における、突然変異の導入、例えば、ミスセンス変異、ナンセンス変異、又はフレームシフト突然変異、又はそれらの任意の組合せを実現又は意味し得る。一部の実施形態では、破壊は、細胞にとって内因性の遺伝子又は遺伝子座において起こり得る。一部の実施形態では、挿入は、遺伝子全体又は遺伝子の断片、例えばエキソンの、細胞内又はゲノム内の内因性の部位への挿入を含み得る。一部の実施形態では、挿入は、ある配列をある内因性の配列に導入し得るが、その配列は、それが挿入される内因性の配列の起源以外の起源のものである。一部の実施形態では、破壊は、遺伝子又は遺伝子産物(例えば、遺伝子でコードされているタンパク質)の発現、及び/又は活性を増強させてよい。一部の実施形態では、破壊は、遺伝子又は遺伝子産物の発現、及び/又は活性を低減させてよい。一部の実施形態では、破壊は、遺伝子又は遺伝子産物(例えば、コードされているタンパク質)の配列を変更させ得る。一部の実施形態では、破壊は、遺伝子又は遺伝子産物(例えば、コードされているタンパク質)を、切断又は断片化し得る。一部の実施形態では、破壊は、遺伝子又は遺伝子産物を延長させ得るが、一部のそのような実施形態では、破壊により、融合タンパク質の集合体を実現し得る。一部の実施形態では、破壊は、遺伝子又は遺伝子産物のレベルに影響を及ぼしてよいが、これらの活性には影響を及ぼさない。一部の実施形態では、破壊は、遺伝子又は遺伝子産物の活性に影響を及ぼしてよいが、これらのレベルには影響を及ぼさない。一部の実施形態では、破壊は、遺伝子又は遺伝子産物のレベルに対する有意な作用を有さなくてよい。一部の実施形態では、破壊は、遺伝子又は遺伝子産物の活性に対する有意な作用を有さなくてよい。一部の実施形態では、破壊は、遺伝子又は遺伝子産物のレベル又は活性にいずれに対しても有意な作用を有さなくてよい。
本明細書において用いられる場合、「内因性の遺伝子座」又は「内因性の遺伝子」という語句は、親又は参照有機体で、破壊(本明細書に記載されるように、例えば、欠失、挿入、反転、改変、交換、置換、又はそれらの組合せ)の導入に先立って見いだされた遺伝子座を含む。一部の実施形態では、内因性遺伝子座は天然に見出される配列を有する。一部の実施形態では、内因性遺伝子座は野生型ものである。一部の実施形態では、本明細書に記載の内因性の遺伝子座を含む参照有機体は、野生型の有機体である。一部の実施形態では、本明細書に記載の内因性の遺伝子座を含む参照有機体は、遺伝子操作された有機体である。一部の実施形態では、本明細書に記載の内因性の遺伝子座を含む参照有機体は、実験室で培養された有機体(野生型又は遺伝子操作を受けた有機体のいずれか)である。
語句「内因性プロモーター」は、例えば野生型有機体内で、内因性遺伝子と天然で関連しているプロモーターを含む。
「エピトープ結合タンパク質」という語句は、少なくとも1つのCDRを有するタンパク質で、選択的にエピトープを認識することが可能な、例えば、約1マイクロモル以下の濃度のKD(例えば、約1×10−6M、1×10−7M、1×10−8M、1×10−9M、1×10−10M、1×10−11M、又は約1×10−12MのKD)で、エピトープを結合することが可能なタンパク質を含む。治療用エピトープ結合タンパク質(例えば、治療用抗体)はしばしば、ナノモル又はピコモルの範囲の濃度のKDを必要とする。
例えば、機能性ポリペプチドに関連してなど、本明細書で使用するとき「機能性」は、通常天然タンパク質に関連する少なくとも1つの生物活性を維持するポリペプチドを含む。別の1つの例では、機能性免疫グロブリン遺伝子セグメントは、生産的再配列をして、再配列された免疫グロブリン遺伝子配列を生成することが可能である、可変遺伝子セグメントを含み得る。
「機能性断片」という語句は、発現され、分泌され、マイクロモル、ナノモル又はピコモルの範囲のKDで、エピトープに特異的に結合することができるエピトープ結合タンパク質の断片を含む。特異的認識は、KDが少なくともマイクロモルの範囲、ナノモルの範囲、又はピコモルの範囲であるものを含む。
免疫グロブリン核酸配列に関する用語「生殖細胞系」には、子孫に継承できる核酸配列が含まれる。
本明細書で使用するとき、用語「異種」は異なる供給源からの作用物質又は実体を含む。例えば、特定の細胞又は有機体内に存在するポリペプチド、遺伝子、又は遺伝子産物への言及で使用するとき、この用語は、関連するポリペプチド、遺伝子、又は遺伝子産物が、1)人為的な遺伝子操作を受けたこと、2)人為的に(例えば、遺伝子操作によって)細胞若しくは有機体(若しくはこれらの前駆体)に導入されたこと、及び/又は3)関連する細胞若しくは有機体(例えば、関連する細胞型若しくは有機体型)によって天然に産生されたものではないこと、若しくはこれらに存在しないことを明確にする。
本明細書で使用する場合、用語「宿主細胞」は、異種(例えば、外因性)核酸又はタンパク質が導入されている細胞を含む。本開示を読んだ当業者は、かかる用語が、特定の対象細胞を指すだけではなく、かかる細胞の子孫を指すためにも使用されることを理解するであろう。特定の改変は、突然変異又は環境の影響により後の世代で生じ得るため、かかる子孫は、実際には親細胞と同一ではないことがあるが、それでもなお、本明細書で使用するとき、用語「宿主細胞」の範囲内にそれでもなお含まれると当業者によって理解される。一部の実施形態では、宿主細胞は、原核細胞若しくは真核細胞であるか、又はこれらを含む。概して、宿主細胞は、細胞が指定されている生物界にかかわらず、異種の核酸若しくはタンパク質を受容する、及び/又は産生するのに好適な任意の細胞である。本開示に従って、宿主細胞として使用され得る例示的細胞としては、原核細胞及び真核細胞(単細胞又は多細胞)、細菌性細胞(例えば、大腸菌、バチルス属、ストレプトミセス属などの菌株)、ミコバクテリア細胞、真菌細胞、酵母細胞(例えば、S.セレビシエ、S.ポンベ、P.パストリス、P.メタノリカ等)、植物細胞、昆虫細胞(例えば、SF−9、SF−21、バキュロウイルス感染昆虫細胞、イラクサギンウワバなど)、非ヒト動物細胞、ヒト細胞、又は細胞融合(例えば、ハイブリドーマ又はクアドローマ)が挙げられる。一部の実施形態では、この細胞は、ヒト、サル、類人猿、ハムスター、ラット、又はマウス細胞である。一部の実施形態では、この細胞は真核細胞であり、以下の細胞、つまりCHO(例えば、CHO K1、DXB−11 CHO、Veggie−CHO)、COS(例えば、COS−7)、網膜細胞、ベロ、CV1、腎臓(例えば、HEK293、293EBNA、MSR293、MDCK、HaK、BHK)、Hela、HepG2、WI38、MRC5、Colo205、HB8065、HL−60(例えば、BHK21)、Jurkat、Daudi、A431(表皮性)、CV−1、U937、3T3、L細胞、C127細胞、SP2/0、NS−0、MMT060562、セルトリ細胞、BRL3A細胞、HT1080細胞、骨髄腫細胞、腫瘍細胞、及び前述の細胞に由来する細胞株から選択される。一部の実施形態では、この細胞は、例えば、ウイルス遺伝子(例えば、PER.C6(商標)細胞)を発現する網膜細胞など、1つ以上のウイルス遺伝子を含む。一部の実施形態では、宿主細胞は単離された細胞であるか、これを含む。一部の実施形態では、宿主細胞は組織の一部である。一部の実施形態では、宿主細胞は有機体の一部である。
「ヒト化(された)」という用語は、本明細書においては、当該技術分野で理解される意味に従って用いられ、ある核酸又はタンパク質の構造(即ち、ヌクレオチド又はアミノ酸配列)が、自然界で非ヒト動物に見いだされる関連する核酸又はタンパク質のバージョンに実質的に又は同一的に対応し、かつ自然界でヒトに見いだされる対応するバージョンから区別可能である部位を含み、かつその構造が、非ヒト動物バージョンに存在する構造とは異なり、むしろヒトバージョンに見いだされる同等の構造とより近く対応する部位をも含む場合に、そのような核酸又はタンパク質を、「ヒト化(された)」という用語は含む。一部の実施形態では、「ヒト化」遺伝子は、ヒトポリペプチド(例えば、ヒトタンパク質又はその部分、例えば、その特性部分)のアミノ酸配列のようなアミノ酸配列を実質的に有するポリペプチドをコードする遺伝子である。1つだけ例を挙げると、膜受容体の場合、「ヒト化」遺伝子は、そのアミノ酸配列が、ヒト細胞外部分のアミノ酸配列と、同一であるか又は実質的に同一であり、かつその残りの配列が、非ヒト(例えば、マウス)のポリペプチドの配列と同一であるか又は実質的に同一である細胞外部分を有するポリペプチドをコードし得る。一部の実施形態では、ヒト化遺伝子は、ヒト遺伝子のDNA配列の少なくとも一部を含む。一部の実施形態では、ヒト化遺伝子は、ヒト遺伝子に見いだされるDNA配列全体を含む。一部の実施形態では、ヒト化タンパク質は、ヒトタンパク質中に現れる部分を含むアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、ヒト化タンパク質は、その配列全体がヒトタンパク質に見いだされるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、(例えば、ヒト化タンパク質は、その配列全体がヒトタンパク質に見いだされるアミノ酸配列を有する一部の実施形態を含む)、ヒト化タンパク質は、非ヒト動物の内因性の遺伝子座から発現され、その内因性の遺伝子座は、タンパク質をコードする関連するヒト遺伝子のホモログ又はオルソログに対応する。
配列比較に関して本明細書で使用する場合、用語「同一性」は、ヌクレオチド配列及び/又はアミノ酸配列の同一性の測定に使用できる、当該技術分野において公知のいくつかの異なるアルゴリズムのうちのいずれかによって判定される同一性を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の同一性は、オープンギャップペナルティ10.0、伸長ギャップペナルティ0.1を使用したClustalW v.1.83(slow)アライメント及びGonnet類似性マトリックス(MACVECTOR(商標)10.0.2,MacVector社製、2008)を使用して判定される。本明細書において用いられる場合、「同一性」という用語は、ポリマー分子どうしの間の、例えば、核酸分子(例えば、DNA分子及び/又はRNA分子)どうしの間の、及び/又はポリペプチド分子どうしの間の全体的な関連性を指す。一部の実施形態では、ポリマー分子は、その配列が、少なくとも25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、又は99%同一である場合に、互いに「実質的に同一である」と見なされる。当業者によって理解されるように、異なる配列において、どの残基が互いに「対応」しているかを考える際に、ある1つの配列において、別の1つの配列に対して、指定された長さのギャップを許すことによる方法を含む、配列の相同性の程度を判定するために配列の比較を可能にする様々なアルゴリズムが利用可能である。例えば、2つの核酸配列どうしの間のパーセント同一性を計算することは、最適な比較目的で2つの配列を位置揃えすることにより実行可能である(例えば、最適な位置揃えのため、第1及び第2の核酸配列の一方又は両方に、ギャップを導入することが可能であり、かつ非対応配列は、比較目的では無視し得る)。ある実施形態では、比較目的で位置揃えされた配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は実質的に100%である。次に、対応するヌクレオチド位置にあるヌクレオチドどうしを比較する。第1の配列中の位置が、第2の配列中の対応する位置を占めているのと同じヌクレオチドによって占められている場合には、その場所で、分子同士が同一である。2つの配列どうしの間のパーセント同一性は、配列により共有されている同一的な位置の数の関数であり、2つの配列の最適な位置揃えのために導入される必要があるギャップの数と各ギャップの長さとを考慮する。2つのヌクレオチド配列どうしの間のパーセント同一性を判定するのに有用な、代表的なアルゴリズム及びコンピュータープログラムには、例えば、Meyers and Millerのアルゴリズム(CABIOS、1989、4:11〜17)が挙げられ、これは、PAM120重量残基表、12であるギャップ長ペナルティ、及び4であるギャップペナルティを用いて、ALIGNプログラム(バージョン2.0)に既に組み込まれている。あるいは、2つのヌクレオチド配列どうしの間のパーセント同一性は、例えば、NWSgapdna.CMPマトリックスを用い、GCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラムを用いて判定可能である。
本明細書で使用するとき、「単離(された)」という用語は、(1)(天然及び/若しくは実験環境において)最初に産生されたときに関係していた成分の少なくとも一部から分離されており、並びに/又は(2)人為的にデザイン、産生、調製、及び/若しくは製造された物質及び/若しくは実体を含む。単離された物質及び/又は実体は、最初に会合していた他の成分の約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、又は約99%超から分離されてよい。一部の実施形態では、単離された作用物質は、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、又は約99%超純粋である。本明細書で使用するとき、物質が他の成分を実質的に含まない場合、その物質は「純粋」である。一部の実施形態では、当業者によって理解されるように、物質は、例えば、1つ以上の担体又は賦形剤(例えば、緩衝液、溶媒、水など)など特定の他の成分と組み合わせた後、依然として「単離された」又は更に「純粋」とみなすことができる。かかる実施形態において、物質の単離率及び純度は、かかる担体又は賦形剤を含めずに計算する。1つだけ例を挙げると、一部の実施形態では、ポリペプチド又はポリヌクレオチドのような、自然界に産出する生物学的ポリマーは、次の場合に「単離された」と見なされる:a)その誘導の起源又は源ゆえに、その生物学的ポリマーが、自然界における天然の状態でそれに伴う成分の一部又はすべてに関連づけられていない;b)その生物学的ポリマーが、自然界でそれを生成する種と同じ種の他のポリペプチド又は核酸を実質的に含まない;c)その生物学的ポリマーが、細胞又は他の発現系からの成分によって発現されているか、又はそうでない場合には、自然界でその生物学的ポリマーを産生する種と同じではない細胞又は他の発現系からの成分に関連している。したがって、例えば、一部の実施形態では、化学合成されるか、天然にそのポリペプチドが産生される細胞系と異なる細胞系で合成されるポリペプチドは、「単離された」ポリペプチドとみなす。あるいは又は加えて、一部の実施形態では、1つ以上の精製技術に供されたあるポリペプチドが、a)自然界では関連づけられている他の成分であって、かつ/又は、b)最初に産生された際に関連付けられていた他の成分、から分離されている程度まで、そのポリペプチドを「単離された」ポリペプチドとみなしてよい。
語句「軽鎖」には、あらゆる生物由来の免疫グロブリン軽鎖配列が含まれ、特に明記しない限り、ヒトκ及びλ軽鎖及びVpreB、並びに代替軽鎖が含まれる。特に明記しない限り、軽鎖可変ドメインは典型的には3つの軽鎖CDR及び4つのフレームワーク(FR)領域を含む。通常、全長軽鎖は、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、FR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3−CDR3−FR4を含む可変ドメインと、軽鎖定常領域と、を含む。軽鎖可変ドメインは、軽鎖可変領域遺伝子配列によってコードされ、通常、生殖細胞系に存在するV及びJセグメントのレパートリーに由来するVL及びJLセグメントを含む。様々な有機体のV及びJ軽鎖セグメント用の配列、位置、及び命名法は、IMGTデータベース(www.imgt.org)に見出すことが可能である。軽鎖には、例えば、それが出現するエピトープ結合タンパク質によって選択的に結合される、第1又は第2のエピトープのいずれかと選択的に結合しないものが含まれる。軽鎖にはまた、それが出現するエピトープ結合タンパク質によって、選択的に結合される1つ以上のエピトープと結合及び認識するもの、又は重鎖又は別の1つの軽鎖が当該抗原決定基を結合及び認識することを補助するものが含まれる。コモン又はユニバーサル軽鎖には、ヒトVκ1−39Jκ遺伝子、又はヒトVκ3−20Jκ遺伝子に由来するもの、及びその体細胞変異(例えば、親和性が成熟した)バージョンが挙げられる。例示的ヒトVLセグメントには、ヒトVκ1−39遺伝子セグメント、ヒトVκ3−20遺伝子セグメント、ヒトVλ1−40遺伝子セグメント、ヒトVλ1−44遺伝子セグメント、ヒトVλ2−8遺伝子セグメント、ヒトVλ2−14遺伝子セグメント、及びヒトVλ3−21遺伝子セグメントが挙げられ、かつそれらの、体細胞変異(例えば、親和性が成熟した)バージョンも挙げられる。軽鎖は、1つの有機体(例えば、ヒト、又は齧歯類(例えば、ラット若しくはマウス)、又は鳥類(例えばニワトリ))からの可変ドメインと、同じ又は別の有機体((例えば、ヒト、又は齧歯類(例えば、ラット若しくはマウス)、又は鳥類(例えばニワトリ))からの定常領域とを含むように作製することが可能である。
「中性のpH」には、約7.0〜約8.0の間のpHが含まれ、例えば約7.0〜約7.4の間のpH、例えば約7.2〜約7.4の間のpHが含まれ、例えば生理学的pHが含まれる。「酸性のpH」には、6.0以下のpHが含まれ、例えば約5.0〜約6.0の間のpH、約5.75〜約6.0の間のpHが含まれ、例えばエンドソーム又はリソソームコンパートメントのpHが含まれる。
本明細書で使用するとき、「非ヒト動物」という語句は、ヒトではない脊椎動物有機体を含む。一部の実施形態では、非ヒト動物は、円口類、硬骨魚類、軟骨魚類(例えばサメ又はエイ)、両生類、爬虫類、哺乳類(例えば齧歯類(例えばマウス又はラット))、又は鳥類(例えばニワトリ)である。一部の実施形態では、非ヒト哺乳類は、霊長類、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ウシ、又は齧歯類である。一部の実施形態では、非ヒト動物は、ラット又はマウスなどの齧歯類である。
本明細書において用いられる場合、「作動可能に連結された」という語句は、直接又は間接的に互いに相互作用するか、あるいはそうでない場合には、互いに調和協調して、生物学的事象に参加する、成分又は要素を物理的に近くに配置すること(例えば、三次元空間に)であって、相互作用及び/又は調和協調は、近くに配置することにより実現又は可能になる状況を含む。1つだけ例を挙げると、核酸中の対照配列(例えば、発現対照配列)は、コード化配列に対して、自身の存在又は不存在がコード化配列の発現及び/又は活性に影響を及ぼすように配置された場合に、コード化配列に「作動可能に連結されている」と言われている。多くの実施形態では、「作動可能な連結」には、関連する成分又は要素どうしの、共有結合性の連結が伴う。しかしながら当業者ならば、一部の実施形態では、共有結合性の連結は、効果的な作動可能な連結を実現するのに必要ではないということを即座に理解するであろう。例えば、一部の実施形態では、核酸対照配列が自身が制御するコード化配列と作動可能に連結されている場合、その核酸対照配列は、目的の遺伝子と隣接している。あるいは又は加えて、一部の実施形態では、1つ以上のそのような対照配列が、トランス又はある距離で、目的のコード化配列を制御するために作用する。一部の実施形態では、本明細書で使用される「発現対照配列」は、ライゲーションされるコード化配列の発現及びプロセッシングに影響を及ぼすのに必要かつ/又は十分なポリヌクレオチド配列を指す。一部の実施形態では、発現対照配列は、適切な転写開始、終了、プロモーター、及び/又はエンハンサー配列;効率的なRNAプロセシングシグナル(スプライシングシグナル及びポリアデニル化シグナルなど);細胞質mRNAを安定化する配列;翻訳効率を向上させる配列(例えば、Kozakコンセンサス配列);タンパク質の安定性を向上させる配列;及び/又は、一部の実施形態では、タンパク質の分泌を向上させる配列であり得るか、又は含み得る。一部の実施形態では、1つ以上の対照配列は、優先的に又は排他的に、特定の宿主細胞若しくは有機体内、又はそれらのタイプで、活性である。1つだけ例を挙げると、原核生物においては、対照配列は典型的には、プロモーター、リボソーム結合部位、及び転写終結配列を含み、真核生物においては、多くの実施形態において、対照配列は典型的には、プロモーター、エンハンサー、及び/又は転写終結配列を含む。当業者は、文脈から、多くの実施形態において、「対照配列」という用語は、ある成分の存在が、発現及びプロセッシングにとって必要不可欠である場合に、その成分を指し、一部の実施形態では、ある成分の存在が発現にとって有利な場合に、その成分(例えば、リーダー配列、標的化配列、及び/又は融合パートナー配列)を含むということを理解するであろう。
本明細書において用いられる場合、「組み換え体」という用語は、組み換え手段により、設計され、遺伝子操作され、調製され、発現され、作製され、又は単離されたポリペプチド(例えば、本明細書に記載されるような、B細胞活性化因子タンパク質)を含み、例としては、宿主細胞にトランスフェクトされた組み換え発現ベクターを用いて発現されたポリペプチド、組み換え、組合せのヒトポリペプチドライブラリ(Hoogenboom H.R、(1997)TIB Tech.15:62〜70;Azzazy H、及びHighsmith(2002)Clin.Biochem.35:425〜445;Gavilondo J.V.及びLarryck J.W.(2003)Bio Techniques 29:128〜145;Hoogenboom H.及びChames P.(2000)Immunology Today 21:371〜378)から単離されたポリペプチド、動物(例えば、マウス)から単離され、ヒト免疫グロブリン遺伝子に対して遺伝子導入された抗体(例えば、Taylor、L.D.らの、(1992) Nucl.Acids.Res.20:6287〜6295;Kellermann S−A、及びGreen L.L.(2002)Current Opinion in Biotechnology 13:593〜597;Little M.ら(2000)Immunology Today 21:364〜370参照)、又は任意の他の方法で調製され、発現され、創り出され、又は互いのスプライシング選択配列要素を伴う任意の他の手段で単離されたポリペプチド、を含む。一部の実施形態では、かかる選択した配列要素の1つ以上は天然に見出される。一部の実施形態では、そのような選択された配列要素のうちの1つ以上は、インシリコで設計されている。一部の実施形態では、かかる選択した配列要素の1つ以上は、例えば、天然又は合成供給源由来の、既知の配列要素の突然変異誘発(例えば、in vivo又はin vitro)に起因する。例えば、一部の実施形態では、組み換えポリペプチドは、目的の供給源有機体(例えば、ヒト、マウスなど)のゲノムに見出される配列を含む。一部の実施形態では、組み換えポリペプチドは、突然変異誘発(例えば、in vitro又はin vivo、例えば、非ヒト動物における)に起因するアミノ酸配列を有し、したがって、組み換えポリペプチドのアミノ酸配列は、ポリペプチド配列を起源とし、これに関連する一方で、in vivoで非ヒト動物のゲノム内に天然に存在しないかもしれない配列である。
用語「交換」は、宿主遺伝子座(例えば、ゲノム)で見出された「交換された」核酸配列(例えば、遺伝子)が遺伝子座から除去され、異なる「交換」核酸がその位置に位置するプロセスを指すために本明細書で使用する。一部の実施形態では、交換された核酸配列及び交換核酸配列は、例えば、互いに相同である、及び/又は対応する要素(例えば、タンパク質コーディング要素、調節要素など)を含むという点で互いに同等である。一部の実施形態では、交換された核酸配列は、プロモーター、エンハンサー、スプライスドナー部位、スプライスレシーバー部位、イントロン、エキソン、非翻訳領域(UTR)のうち1つ以上を含み、一部の実施形態では、交換核酸配列は、1つ以上のコード化配列を含む。一部の実施形態では、交換核酸配列は、交換された核酸配列のホモログである。一部の実施形態では、交換核酸配列は、交換された配列のオルソログである。一部の実施形態では、交換核酸配列は、ヒト核酸配列であるか、これを含む。一部の実施形態では、交換核酸配列がヒト核酸配列であるか、これを含む場合、交換された核酸配列は、齧歯類配列(例えば、マウス配列)であるか、これを含む。このように配置された核酸配列は、このように配置された配列(例えば、プロモーター、エンハンサー、5’−又は3’−非翻訳領域など)を得るために使用した起源核酸配列の一部である、1つ以上の制御配列を含んでよい。例えば、様々な実施形態では、交換とは、内因性の配列の、異種配列での置換であり、その結果として遺伝子生成物が、このように配置された(異種配列を含む)核酸配列から生成するが、内因性の配列は発現しない;その交換は、内因性のゲノム配列を、内因性の配列によってコードされているタンパク質と類似の機能を有するタンパク質をコードする核酸配列(例えば、内因性のゲノム配列は、可変ドメインをコードし、DNA断片は、1つ以上のヒト可変ドメインをコードする)によって交換することである。様々な実施形態では、内因性遺伝子又はその断片は、対応するヒト遺伝子又はその断片で交換される。対応するヒト遺伝子又はその断片は、オルソログである、又は、交換される内因性遺伝子若しくはその断片と構造及び/若しくは機能が実質的に類似する、若しくは同一である、ヒト遺伝子又は断片である。
「重鎖のみ抗体」、「重鎖のみ抗原結合タンパク質」、「単一ドメイン抗原結合タンパク質」、「単一ドメイン結合タンパク質」等の用語は、典型的には機能性CH1ドメインを欠くために軽鎖に連結できない重鎖定常領域に、作動可能に連結された可変ドメインを含む免疫グロブリン様の鎖を含む、単量体又はホモ二量体型免疫グロブリン分子を指す。したがって、「重鎖のみ抗体」、「重鎖のみ抗原結合タンパク質」、「単一ドメイン抗原結合タンパク質」、「単一ドメイン結合タンパク質」等の用語は、(i)機能性CH1ドメインを欠く重鎖定常領域に作動可能に連結された可変ドメインを含む免疫グロブリン様の鎖の1つを含む単量体単一ドメイン抗原結合タンパク質、又は(ii)それぞれが、機能性CH1ドメインを欠く重鎖定常領域に作動可能に連結された可変ドメインを含む、2つの免疫グロブリン様の鎖を含むホモ二量体型単一ドメイン抗原結合タンパク質、の両方を含むものである。様々な態様では、ホモ二量体型単一ドメイン抗原結合タンパク質は、2つの同一な免疫グロブリン様の鎖を含み、そのそれぞれが、機能性CH1ドメインを欠く同一な重鎖定常領域に作動可能に連結された同一な可変ドメインを含む。また、単一ドメイン抗原結合タンパク質のそれぞれの免疫グロブリン様の鎖は、可変ドメインを含み、その可変ドメインは、重鎖定常領域遺伝子(例えば、IgG、IgA、IgE、IgD、又はそれらの組合せ)のCH1コード化配列(及び、任意選択で、ヒンジ領域)における突然変異の欠失又は不活性化を含む、重鎖定常領域(CH)遺伝子配列に連結された重鎖可変領域遺伝子セグメント(例えば、VH、DH、JH)、軽鎖遺伝子セグメント(例えば、VL、JL)、又はそれらの組合せ、に由来し得る。重鎖遺伝子セグメントに由来する可変ドメインを含む単一ドメイン抗原結合タンパク質は、「VH−単一ドメイン抗体」又は「VH−単一ドメイン抗原結合タンパク質」と呼び得るものであるが、それについては、例えば、米国特許第8,754,287号、並びに米国特許出願公開第20140289876号、同第20150197553号、同第20150197554号、同第20150197555号、同第20150196015号、同第20150197556号、及び同第20150197557号を参照のこと(なお、それぞれの全体が、参照により本明細書に組み込まれる)。軽鎖遺伝子セグメントに由来する可変ドメインを含む、単一ドメイン抗原結合タンパク質は、「VL−単一ドメイン抗原結合タンパク質」と呼び得るものであるが、それについて詳しくは、例えば、米国特許出願公開第20150289489号を参照のこと(なお、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる)。
「体細胞変異した」は、B細胞内の対応する、親和性成熟していない免疫グロブリン可変領域配列(即ち、生殖系細胞のゲノム中の配列)と同一ではない親和性成熟B細胞由来の核酸又はアミノ酸配列への言及を含む。「体細胞変異した」という語句はまた、目的のエピトープにさらした後のB細胞由来の免疫グロブリン可変領域核酸又はアミノ酸配列への言及を含むが、この核酸又はアミノ酸配列は、B細胞が目的のエピトープにさらされる前の対応する核酸又はアミノ酸配列とは異なる。「体細胞変異した」という語句は、免疫原の刺激に反応して、ヒト免疫グロブリン可変領域核酸配列を有する動物(例えばマウス)に生成された、そのような動物において、生得的に動作する選択プロセスから生じる結合タンパク質由来の配列に言及するものである。
本明細書で使用するとき、用語「実質的に」は、対象とする特徴又は特性の全体、又はほぼ全体の範囲又は程度を示す、定性的状態を含む。生物学的分野における当業者は、生物学的及び化学的現象が、仮にあるとしてもめったに完了しない、及び/若しくは完了に向かわない、又は絶対的結果に達成しない、若しくは回避しないことを理解するだろう。したがって、用語「実質的に」は、多くの生物学的及び化学的現象に固有の、完全性を欠くという可能性を捕捉するために本明細書では使用する。
本明細書で使用するとき、「実質的な相同性」という語句は、アミノ酸又は核酸配列間の比較を含む。当業者に理解されるように、2つの配列が対応する位置に相同残基を含有する場合、通常、「実質的に相同」であるとみなされる。相同残基は、同一残基であってよい。あるいは、相同残基は、構造的及び/又は機能的特徴が適切に類似する非同一残基であってよい。例えば、当業者に周知であるように、特定のアミノ酸は、通常、「疎水性」若しくは「親水性」アミノ酸として、及び/又は「極性」若しくは「非極性」側鎖を有するものとして分類される。1つのアミノ酸を別の同一種類のアミノ酸と置換すると、「相同」置換とみなさ得ることが多い。当該技術分野において周知であるように、アミノ酸又は核酸配列は、ヌクレオチド配列に対するBLASTN、並びにアミノ酸配列に対するBLASTP、Gapped BLAST、及びPSI−BLASTなど市販のコンピュータープログラムで使用可能なアルゴリズムなど、任意の様々なアルゴリズムを用いて比較してよい。そのようなプログラムの例は、Altschulらの、Basic local alignment search tool、J.Mol.Biol.、215(3):403〜410、1990;Altschulらの、Methods in Enzymology;Altschulらの、「Gapped BLAST and PSI−BLAST:a new generation of protein database search programs」、Nucleic Acids Res.25:3389〜3402、1997;Baxevanisらの、Bioinformatics:A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins、Wiley、1998;及びMisenerら編集の、Bioinformatics Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology、Vol.132)、Humana Press、1999に記載されている。相同性配列の同定に加えて、上記プログラムは、通常、相同性の程度の指標を提供する。一部の実施形態では、対応する残基の少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又はそれ超が、関連する残基長にわたって相同である場合、2つの配列は実質的に相同であるとみなされる。一部の実施形態では、関連する残基長は完全配列である。一部の実施形態では、関連する残基長は、少なくとも9、10、11、12、13、14、15、16、17、又はそれ超の残基である。一部の実施形態では、関連する残基長は、完全配列に沿った隣接残基を含む。一部の実施形態では、関連する残基長は、完全配列に沿った不連続な残基を含む。一部の実施形態では、関連する残基長は、少なくとも10、15、20、25、30、35、40、45、50、又はそれ超の残基である。
本明細書で使用するとき、語句「実質的な同一性」は、アミノ酸又は核酸配列間の比較を含む。当業者に理解されるように、2つの配列が対応する位置に同一残基を含有する場合、通常、「実質的に同一」であるとみなされる。当該技術分野において周知であるように、アミノ酸又は核酸配列は、ヌクレオチド配列に対するBLASTN、並びにアミノ酸配列に対するBLASTP、Gapped BLAST、及びPSI−BLASTなど市販のコンピュータープログラムで使用可能なアルゴリズムなど、任意の様々なアルゴリズムを用いて比較してよい。そのようなプログラムの例は、Altschulらの、Basic local alignment search tool、J.Mol.Biol.、215(3):403〜410、1990;Altschulらの、Methods in Enzymology;Altschulらの、Nucleic Acids Res.25:3389〜3402、1997;Baxevanisらの、Bioinformatics:A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins、Wiley、1998;及びMisenerら編集の、Bioinformatics Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology、Vol.132)、Humana Press、1999に記載されている。同一配列の同定に加えて、上記プログラムは、通常、同一性の程度の指標を提供する。一部の実施形態では、対応する残基の少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又はそれ超が、関連する残基長にわたって同一である場合、2つの配列は実質的に同一であるとみなされる。一部の実施形態では、関連する残基長は完全配列である。一部の実施形態では、関連する残基長は、少なくとも10、15、20、25、30、35、40、45、50、又はそれ超の残基である。
本明細書で使用するとき、語句「標的ベクター」又は「標的化構築物」は、標的化領域を含むポリヌクレオチド分子を含む。標的化領域は、標的細胞、組織、又は動物内の配列と同一であるか、実質的に同一である配列を含み、相同組み換えによって、細胞、組織又は動物のゲノム内の位置への標的化構築物の組み込みをもたらす。部位特異的リコンビナーゼ認識部位(例えば、loxP又はFrt部位)を用いて標的化する標的化領域も含まれる。一部の実施形態では、本発明の標的化構築物は、特に対象とする核酸配列又は遺伝子、選択マーカー、対照及び/又は制御配列、かかる配列を含む組み換えを補助する、又は促進するタンパク質を外来的に付加することによって介在される、組み換えを可能とする他の核酸配列を更に含む。一部の実施形態では、本発明の標的化構築物は、対象とする遺伝子の全体又は一部を更に含み、対象とする遺伝子は、内因性配列によってコードされるタンパク質と類似の機能を有する、タンパク質の全体又は一部をコードする異種遺伝子である。
核酸配列に言及する際の「再配列されていない」という用語は、例えば、動物細胞の野生型生殖細胞系に存在する、核酸配列を含む。
「可変ドメイン」という語句は、以下のアミノ酸領域:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4を、(他に特に断らない限り)N−末端からC−末端に順に含む、免疫グロブリン軽鎖又は重鎖(必要に応じて改変されたもの)のアミノ酸配列を含む。
本明細書で使用するとき、用語「変異体」は、参照実体との顕著な構造的同一性を示すが、参照実体と比較して、1つ以上の化学的部分の存在又はそのレベルにおいて参照実体と構造的に異なる実体を含む。多くの実施形態では、「変異体」は参照実体と機能的にも異なる。概して、特定の実体が厳密に参照実体の「変異体」であるとみなされるかどうかは、参照実体との構造的同一性の程度に基づいている。当業者に理解されるように、任意の生物学的又は化学的参照実体は、特定の特徴的構造要素を有する。「変異体」は、定義によると、1つ以上のかかる特徴的構造要素を共有する、異なる化学的実体である。いくつかだけ例を挙げると、小分子は、特徴的コア構造要素(例えば、大環状コア)及び/又は1つ以上の特徴的ペンダント部分を有してよく、したがって、小分子の変異体は、コア構造要素及び特徴的ペンダント部分を共有するが、他のペンダント部分、及び/又はコア内に存在する結合の種類(一重対二重、E対Zなど)が異なるものであってよく、ポリペプチドは、線形若しくは三次元空間内に互いに相対的な指定位置を有する、及び/又は、特定の生物学的機能に寄与する、複数のアミノ酸からなる特徴的配列要素を有してよく、核酸は、線形又は三次元空間に互いに相対的な指定位置を有する、複数のヌクレオチド残基からなる特徴的配列要素を有してよい。例えば、「変異体ポリペプチド」は、アミノ酸配列中の1つ以上の差異、及び/又は、ポリペプチド骨格に共有結合される化学的部分(例えば、炭水化物、脂質など)の1つ以上の差異の結果、参照ポリペプチドと異なっていてよい。一部の実施形態では、「変異体ポリペプチド」は、少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、又は99%である参照ポリペプチドとの総配列同一性を示す。あるいは又は加えて、一部の実施形態では、「変異体ポリペプチド」は、少なくとも1つの特徴的配列要素を参照ポリペプチドと共有しない。一部の実施形態では、参照ポリペプチドは、1つ以上の生物学的活性を有する。一部の実施形態では、「変異体ポリペプチド」は、参照ポリペプチドの1つ以上の生物学的活性を共有する。一部の実施形態では、「変異体ポリペプチド」は、参照ポリペプチドの1つ以上の生物学的活性を欠く。一部の実施形態では、「変異体ポリペプチド」は、参照ポリペプチドと比較して、低下したレベルの1つ以上の生物学的活性を示す。多くの実施形態では、対象とするポリペプチドが、親の配列と同一であるアミノ酸配列を有しているが、特定の位置において少数の配列が変更している場合、対象とするポリペプチドは、親又は参照ポリペプチドの「変異体」であるとみなされる。通常、変異体の20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%未満の残基が、親と比べて置換されている。一部の実施形態では、「変異体」は、親と比べて10、9、8、7、6、5、4、3、2、又は1個の置換された残基を有する。多くの場合、「変異体」は、非常に少数(例えば、5、4、3、2、又は1未満)の置換された機能性残基(即ち、特定の生物活性に関与する残基)を有する。更に、「変異体」は、親と比較して、通常、付加又は欠失を有するとしても、それは5個を超えず、4、3、2、又は1個であり、多くの場合、そのような付加又は欠失を有さない。更に、任意の付加又は欠失残基は、通常、約25、約20、約19、約18、約17、約16、約15、約14、約13、約10、約9、約8、約7、約6個未満であり、一般には約5、約4、約3、又は約2個未満である。一部の実施形態では、親又は参照ポリペプチドは天然に見出されるものである。当業者に理解されるように、対象とする特定のポリペプチドの複数の変異体は、特に対象とするポリペプチドが感染因子のポリペプチドであるとき、通常、天然に見出され得る。
本明細書で使用するとき、用語「ベクター」は、関連する別の核酸を運搬可能な核酸分子を含む。一部の実施形態では、ベクターは、染色体外複製、並びに/又は、真核及び/若しくは原核細胞など宿主細胞中で連結される核酸の発現が可能である。作動可能に連結される遺伝子の発現の方向付けが可能なベクターは、本明細書で「発現ベクター」と称する。
本明細書で使用される場合、用語「野生型」は、(変異した、病気になった、変更された等の状態とは対照的に)「正常」状態又は状況において、天然に見出される、構造及び/又は活性を有する実体を含む。当業者は、野生型遺伝子及びポリペプチドは、多くの場合、多くの異なる形態(例えば、対立遺伝子)で存在することを理解するだろう。
(特定の実施形態の詳細な説明)
本発明はとりわけ、ヒト遺伝物質コード化軽鎖可変ドメイン(例えば、VL領域)を有する、改良された及び/又は遺伝子操作された非ヒト動物を提供する。ある実施形態では、そのような非ヒト動物は、例えば、抗原を独立に結合する(ヒト)VLドメインを生産したり、単離したりするのに有用である。そのような非ヒト動物は、独特な抗原結合特性を示すヒトVLドメインの生成と親和性成熟のための新たなin vivo系を提供するものと考えられる。したがって、本発明は、非ヒト動物内で独特な抗原結合タンパク質を開発するのに特に有用である。特に、本発明は、齧歯類の免疫グロブリン座をヒト化して、ヒト化の結果として、天然起源の免疫グロブリンにその構造が似ているものの、結合特性において異なる抗原結合タンパク質を発現させること、かつヒト化の結果として、非ヒト動物の細胞の膜表面上にその抗原結合タンパク質を発現させることを含む。そのような抗原結合タンパク質は、抗原結合タンパク質により提供される独特な結合表面を生成する際に、天然の免疫グロブリンを逃れ得る異質な抗原を認識する能力を有する。一部の実施形態では、本発明の非ヒト動物は、同種の可変ドメイン(例えば、重鎖可変ドメイン)と独立な、抗原に結合する(ヒト)VL/CHxULCドメインを生成することが可能であるが、一部の実施形態では、そのような非ヒト動物は、免疫グロブリンと構造が似ているものの、いかなる重鎖可変配列も有しない結合タンパク質を発現させるB細胞集団を発達させ、かつ/又は有する。一部の実施形態では、そのような非ヒト動物により発現させられた抗原結合タンパク質は、抗原結合部分が、(ヒト)VLxULCドメインのみからなることに特徴付けられている。一部の実施形態では、本発明の非ヒト動物は、非ヒト動物及び異なる種(例えば、ヒト)由来の遺伝物質を含む内因性の免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含み、かつ非ヒト動物及び異なる種(例えば、ヒト)由来の遺伝物質を含む内因性の免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含む。一部の実施形態では、本発明の非ヒト動物は、配列をコードする重鎖定常領域に作動可能に連結された、再配列されていないヒトVL及びJL遺伝子セグメントを含むハイブリッドの免疫グロブリン鎖遺伝子座と、単一の、再配列されたヒト又は非ヒトVLJL配列を含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座とを含む。一部の実施形態では、抗原結合タンパク質の発現は、非ヒト免疫グロブリン遺伝物質(例えば、非ヒト免疫グロブリンプロモーター及び/又はエンハンサー)の制御下にある。
本発明はとりわけ、ヒト遺伝物質コード化軽鎖可変ドメイン(例えば、VL領域)を有する、改良された及び/又は遺伝子操作された非ヒト動物を提供する。ある実施形態では、そのような非ヒト動物は、例えば、抗原を独立に結合する(ヒト)VLドメインを生産したり、単離したりするのに有用である。そのような非ヒト動物は、独特な抗原結合特性を示すヒトVLドメインの生成と親和性成熟のための新たなin vivo系を提供するものと考えられる。したがって、本発明は、非ヒト動物内で独特な抗原結合タンパク質を開発するのに特に有用である。特に、本発明は、齧歯類の免疫グロブリン座をヒト化して、ヒト化の結果として、天然起源の免疫グロブリンにその構造が似ているものの、結合特性において異なる抗原結合タンパク質を発現させること、かつヒト化の結果として、非ヒト動物の細胞の膜表面上にその抗原結合タンパク質を発現させることを含む。そのような抗原結合タンパク質は、抗原結合タンパク質により提供される独特な結合表面を生成する際に、天然の免疫グロブリンを逃れ得る異質な抗原を認識する能力を有する。一部の実施形態では、本発明の非ヒト動物は、同種の可変ドメイン(例えば、重鎖可変ドメイン)と独立な、抗原に結合する(ヒト)VL/CHxULCドメインを生成することが可能であるが、一部の実施形態では、そのような非ヒト動物は、免疫グロブリンと構造が似ているものの、いかなる重鎖可変配列も有しない結合タンパク質を発現させるB細胞集団を発達させ、かつ/又は有する。一部の実施形態では、そのような非ヒト動物により発現させられた抗原結合タンパク質は、抗原結合部分が、(ヒト)VLxULCドメインのみからなることに特徴付けられている。一部の実施形態では、本発明の非ヒト動物は、非ヒト動物及び異なる種(例えば、ヒト)由来の遺伝物質を含む内因性の免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含み、かつ非ヒト動物及び異なる種(例えば、ヒト)由来の遺伝物質を含む内因性の免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含む。一部の実施形態では、本発明の非ヒト動物は、配列をコードする重鎖定常領域に作動可能に連結された、再配列されていないヒトVL及びJL遺伝子セグメントを含むハイブリッドの免疫グロブリン鎖遺伝子座と、単一の、再配列されたヒト又は非ヒトVLJL配列を含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座とを含む。一部の実施形態では、抗原結合タンパク質の発現は、非ヒト免疫グロブリン遺伝物質(例えば、非ヒト免疫グロブリンプロモーター及び/又はエンハンサー)の制御下にある。
本発明の様々な態様を以下のセクションに詳述する。これらのセクションの使用は、本発明を制限することを意図するものではない。各セクションは、本発明の任意の態様に適用できる。
再配列されていない軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含有する高多様性ハイブリッド鎖遺伝子座、及び再配列された軽鎖可変領域配列を含有する低多様性軽鎖遺伝子座を含む非ヒト動物
再配列されていない軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含有する高多様性ハイブリッド鎖遺伝子座、及び再配列された軽鎖可変領域配列を含有する低多様性軽鎖遺伝子座を含む非ヒト動物
同種の鎖可変領域とは独立に抗原を結合する能力を有する軽鎖可変領域を生成することは、抗原結合分子内で使われる軽鎖可変ドメイン(VL)を作製するために有用であり得る。
同種の鎖可変領域とは独立に抗原を結合することができるそのような軽鎖可変ドメインを生産するためのアプローチの1つは、軽鎖(VL)の可変領域又はドメインをコードするヌクレオチド配列に選択的圧力をかけて、より多様な抗原結合レパートリーを有する軽鎖CDR3を生成することである。本明細書において開示されるように、上のことを実現可能にするには、高多様性の再配列されていない軽鎖遺伝子セグメントを含有する免疫グロブリンハイブリッド鎖遺伝子座と、遺伝子座が単一の、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を含有するという意味で低多様性の、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座とをそのゲノムに含有する、遺伝子改変非ヒト動物を生成することが必要で、それについては、例えば米国特許出願公開第20120096572号(参照により、本明細書に組み込まれる)を参照のこと。あるいは、一部の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物は、遺伝子座が、2つ以上であるが野生型の数よりも少ない数(例えば、2、3、又は4つ)の、再配列されていないヒトVL遺伝子セグメントしか含有しないという意味で低多様性の免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含む。免疫グロブリン軽鎖遺伝子座にある軽鎖配列(又は限られた数のVL遺伝子セグメント)は、これらの動物内の、コモン又はユニバーサル(すなわち、同じ又は非常に類似した)配列に限定され、ハイブリッドの遺伝子座にある再配列されていない軽鎖可変領域ヌクレオチド配列(すなわち、遺伝子)は、より多様性があり効率的な抗原結合特性を有し、同系の可変領域とは独立に、抗原決定基を結合することが可能な軽鎖CDR3を作るように強いられる。更に、本明細書において開示されるように、生殖系可変領域遺伝子セグメントの正確な交換(例えば、相同的組換により媒介される遺伝子標的化)により、部分的にヒトの免疫グロブリン座を有する動物(例えば、マウス、ラット、又はニワトリ)を作製することが可能になる。部分的にヒトの免疫グロブリン座は、正常に、再配列、超変異、及び体細胞変異(例えば、クラス転換)するので、部分的にヒトの免疫グロブリン座は、ヒト可変ドメイン(すなわち、ヒトVLドメイン)を含む動物に、結合タンパク質を生成する。これらの動物は、野生型の動物と実質的に類似の体液性免疫系を示し、かつその動物が、(免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に)ヒト可変領域遺伝子セグメントの完全なレバートリーを有していない場合でさえも、正常な細胞集団と正常なリンパ器官構造とを示す。これらの動物(例えば、マウス、ラット、又はニワトリ)に免疫をもたせた結果、幅広い多様性のある、軽鎖可変遺伝子セグメントの使用を示す、強い液性応答が得られる。可変領域をコードするヌクレオチド配列は、同定され、クローニングされ、次に、(例えば、in vitroの系において)任意の好みの配列、例えば、特定の使用に好適な任意の免疫グロブリンアイソタイプと融合されることが可能で、その結果、完全にヒト配列由来の抗体又は抗原結合タンパク質が得られる。
加えて、制約のある(制限された)免疫グロブリン軽鎖遺伝子座、例えば、再配列された軽鎖可変領域ヌクレオチド配列(例えば、ユニバーサル軽鎖又は「ULC」、これについては、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第2011−0195454A1号、同第2012−0021409A1号、同第2012−0192300A1号、同第2013−0045492A1号、同第2013−0185821A1号、及び同第2013−0302836A1号を参照のこと)を含む、制約のある免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を有する動物(例えば、マウス、ラット、又はニワトリ)、又は制約のある(制限された)免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントレパートリー(例えば、2以上であるが野生型の数よりは少ない数のヒトVL遺伝子セグメントしか含まない、制約のある免疫グロブリン軽鎖可変セグメントレパートリー;例えば、デュアル軽鎖、又は「DLC」、これについては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第2013−0198880A1号を参照のこと。)を、上述の、再配列されていない軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含有する、高多様性ハイブリッド免疫グロブリン鎖遺伝子座と組み合わせて有する、動物(例えば、マウス、ラット、又はニワトリ)を使用することにより、重鎖可変ドメインの不在下で抗原を結合する、免疫グロブリン軽鎖可変(VL/CHxULC)ドメインが生成され得る。更に、ヒスチジンコドンを、例えば、1つ以上のヒスチジンコドンの付加を介して、又は1つ以上の非ヒスチジンコドンのヒスチジンコドンによる置換を介して、本明細書に記載の、非ヒト動物のゲノム中の、再配列された軽鎖可変領域ヌクレオチド配列に(又は制限されたVL遺伝子セグメントに)導入することにより、改善されたpH依存リサイクル性を抗原結合タンパク質に与えることが可能な軽鎖可変領域アミノ酸配列を生成することが可能である。
一部の実施形態では、本明細書に記載の遺伝子改変非ヒト動物は、多様性が制限されるものの、結合タンパク質の収率が上がり、それゆえに、同種の可変ドメインとは独立に抗原を結合するハイブリッドの遺伝子座から、軽鎖可変ドメインの生成に成功する蓋然性が高まる。一部の実施形態では、軽鎖は、それ自身、抗原結合特性を示し得る。一部の実施形態では、非ヒト動物は、その軽鎖にある抗原特異性を示す抗原結合タンパク質を生成するように誘導され得る(例えば、マウス又はラットの免疫グロブリン軽鎖レパートリーを制限し、免疫グロブリンハイブリッド鎖レパートリーを最大化することにより;例えば、ハイブリッドの免疫グロブリン鎖レパートリーを創り出すことにより、例えば、マウス又はラットの重鎖可変領域遺伝子座を、高多様性の再配列されていないヒトVL及びJL遺伝子セグメントを含む遺伝子座と交換することにより、かつマウス又はラットの軽鎖可変領域遺伝子座を、単一の再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列と交換することにより)。一部の実施形態では、そのような動物内で生成される抗原結合タンパク質(例えば、抗体)は、その軽鎖結合を通じて、特定のエピトープ(例えば、エフェクター抗原、細胞毒性分子、Fc受容体、毒素、活性化又は阻害性受容体、T細胞毒性マーカー、免疫グロブリン輸送体等)に対して特異性がある。
様々な態様では、配列をコードする重鎖定常領域に作動可能に連結された再配列されていない(ヒト)VL及びJL遺伝子セグメントを含む、ハイブリッドの免疫グロブリン鎖遺伝子座、及び再配列されたヒト又は非ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列(即ち、再配列された軽鎖VJ配列)を含む、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を、その生殖系ゲノム中に含む、非ヒト動物が提供される。一部の実施形態では、再配列されていない(ヒト)VL及びJL遺伝子セグメントは、そのそれぞれが、少なくとも機能性CH1ドメインをコードする1つ以上の重鎖定常領域遺伝子を含む、ヒト又は非ヒト重鎖定常領域配列に作動可能に連結され、かつ再配列された(ヒト)免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒト又は非ヒト軽鎖定常領域配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、再配列された軽鎖可変領域ヌクレオチド配列によってコードされている免疫グロブリン軽鎖可変ドメインは、非ヒト動物に対して免疫原性のものではない。一部の実施形態では、非ヒト動物は改変されて、軽鎖定常ドメインに作動可能に連結された再配列された軽鎖可変ドメインを、2部、3部、4部又はそれ超コードするヌクレオチド配列を含むようになっている。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、再配列された(ヒト)免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を複数部コードする。例えば、ヌクレオチド配列は、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を、少なくとも1部、2部、3部、4部、5部コードすることが可能である。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、再配列された(ヒト)免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10部コードする。一部の実施形態では、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された、再配列された(ヒト)免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を、複数部含む。
様々な態様では、本明細書に記載の非ヒト動物の免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、単一の再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列、例えば、非ヒト軽鎖定常領域ヌクレオチド配列(例えば、非ヒト軽鎖定常領域核酸配列)に作動可能に連結された、再配列されたヒトVLJL配列を含む。このようにして、そのゲノム中に、(i)ヒト又は非ヒト重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された、再配列されていないヒトVL及びJL遺伝子セグメントを含むハイブリッドの免疫グロブリン鎖遺伝子座と、(ii)軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された、再配列されたヒト軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座と、を含む遺伝子改変非ヒト動物が提供される。一部の実施形態では、軽鎖定常領域は、ラット又はマウスの定常領域、例えば、ラット又はマウスのCκ定常領域である。一部の実施形態では、免疫グロブリン重鎖遺伝子座(例えば、ハイブリッドの免疫グロブリン鎖遺伝子座)にある、ヒトVL及びJL遺伝子セグメントは、複数の遺伝子セグメント(2つ以上のヒトVLと、2つ以上のヒトJL遺伝子セグメント)として存在し、かつ抗体の重鎖定常領域の関連において、ヒトVLドメインを再配列かつコードすることが可能であり、しかも非ヒト動物は、内因性のVH及び/又はVL遺伝子セグメントを含まない。一部の実施形態では、非ヒト動物は、6、16、30、40、又はそれより多くの再配列されていないヒトVκ遺伝子セグメントを、免疫グロブリン重鎖遺伝子座(例えば、ハイブリッドの免疫グロブリン鎖遺伝子座)に含む。一部の実施形態では、非ヒト動物は、5つの再配列されていないヒトJκ遺伝子セグメント、例えば、Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4、及びJκ5遺伝子セグメントを、免疫グロブリン重鎖遺伝子座(例えば、ハイブリッドの免疫グロブリン鎖遺伝子座)に含む。一部の実施形態では、非ヒト動物は、12、28、40、又はそれより多くの再配列されていないヒトVλ遺伝子セグメントを、免疫グロブリン重鎖遺伝子座(例えば、ハイブリッドの免疫グロブリン鎖遺伝子座)に含む。一部の実施形態では、非ヒト動物は、1、2、3、4、又はそれより多くの再配列されていないヒトJλ遺伝子セグメント、例えば、Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ7等を、免疫グロブリン重鎖遺伝子座(例えば、ハイブリッドの免疫グロブリン鎖遺伝子座)に含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物の免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、再配列されたヒトVκJκヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、再配列されたヒトVλJλヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、再配列されたヒトVκJκヌクレオチド配列又は再配列されたヒトVλJλヌクレオチド配列は、内因性の軽鎖遺伝子座、例えば、内因性のκ軽鎖遺伝子座に存在する。一部の実施形態では、マウスは、機能性λ軽鎖遺伝子座を含む。一部の実施形態では、マウスは、非機能性λ軽鎖遺伝子座を含む。一部の実施形態では、免疫グロブリン重鎖遺伝子座にある、1つ以上のヒトVL及び1つ以上のヒトJL遺伝子セグメントは、(例えば、ハイブリッドの免疫グロブリン鎖遺伝子座中の)マウス又はラットの重鎖定常領域配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、再配列されたヒトVκJκヌクレオチド配列は、再配列されたヒトVκ1−39Jκヌクレオチド配列、例えば、Vκ1−39Jκ5配列(例えば、配列番号1に記載のもの)である。一部の実施形態では、再配列されたヒトVκJκヌクレオチド配列は、再配列されたヒトVκ3−20Jκヌクレオチド配列、例えば、Vκ3−20Jκ1配列(例えば、配列番号2に記載のもの)である。一部の実施形態では、再配列されたヒトVλJλヌクレオチド配列は、再配列されたヒトVλ2−14Jλ1ヌクレオチド配列である。当業者ならば、他のJL配列の使用も、再配列された軽鎖配列に採用し得るということを認識するであろう。
様々な態様では、本明細書に記載の非ヒト動物の免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子セグメントの制限されたレパートリー、例えば、1つ以上であるが野生型の数よりは少ない数のヒトVL遺伝子セグメントと、非ヒト軽鎖定常領域ヌクレオチド配列に作動可能に連結された、1つ以上のヒトJL遺伝子セグメントと、を含む。このようにして、そのゲノム中に(i)ヒト又は非ヒト重鎖定常領域核酸配列(例えば、CH1、ヒンジ、CH2、CH3、CH4、又はそれらの組合せ、例えば、CH1、ヒンジ、CH2、及びCH3、をコードする非ヒト重鎖定常領域核酸配列)に作動可能に連結された、再配列されていないヒトVL及びJL遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座(例えば、ハイブリッドの免疫グロブリン鎖遺伝子座)と、(ii)軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された、2つ以上であるが野生型の数よりは少ない数のヒト免疫グロブリンVL及びJL遺伝子セグメントを含む、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座と、を含む、遺伝子改変非ヒト動物が提供される。一部の実施形態では、軽鎖定常領域は、ラット又はマウスの定常領域、例えば、ラット又はマウスのCκ定常領域である。一部の実施形態では、免疫グロブリン重鎖遺伝子座(例えば、ハイブリッドの免疫グロブリン鎖遺伝子座)にある、ヒトVL及びJL遺伝子セグメントは、複数の遺伝子セグメント(2つ以上のヒトVLと、2つ以上のヒトJL遺伝子セグメント)として存在し、かつ抗体の重鎖定常領域の関連において、ヒトVLドメインを再配列かつコードすることが可能であり、しかも非ヒト動物は、内因性のVH及び/又はVL遺伝子セグメントを含まない。一部の実施形態では、非ヒト動物は、6、16、30、40、又はそれより多くの再配列されていないヒトVκ遺伝子セグメントを、免疫グロブリン重鎖遺伝子座(例えば、ハイブリッドの免疫グロブリン鎖遺伝子座)に含む。一部の実施形態では、非ヒト動物は、5つの再配列されていないヒトJκ遺伝子セグメント、例えば、Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4、及びJκ5遺伝子セグメントを、免疫グロブリン重鎖遺伝子座(例えば、ハイブリッドの免疫グロブリン鎖遺伝子座)に含む。一部の実施形態では、非ヒト動物は、12、28、40、又はそれより多くの再配列されていないヒトVλ遺伝子セグメントを、免疫グロブリン重鎖遺伝子座(例えば、ハイブリッドの免疫グロブリン鎖遺伝子座)に含む。一部の実施形態では、非ヒト動物は、1、2、3、4、又はそれより多くの再配列されていないヒトJλ遺伝子セグメント、例えば、Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ7等を、免疫グロブリン重鎖遺伝子座(例えば、ハイブリッドの免疫グロブリン鎖遺伝子座)に含む。一部の実施形態では、非ヒト動物は、2つの再配列されていないヒトVκ遺伝子セグメントを、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に含む。一部の実施形態では、非ヒト動物は、2つの再配列されていないヒトVλ遺伝子セグメントを、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に含む。
一部の実施形態では、そのゲノム中に、(i)ヒト又は非ヒト重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された再配列されていないヒトVL及びJL遺伝子セグメントを含む、免疫グロブリン重鎖遺伝子座(例えば、ハイブリッドの免疫グロブリン鎖遺伝子座)と、(ii)軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された、再配列されたヒト軽鎖可変領域核酸配列を含む、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座と、を含む、遺伝子改変マウスが、野生型のマウス又は他の免疫グロブリン座の一時変異を含むマウス(即ち、遺伝子改変対照マウス;例えば、マウスの体液性免疫系が、野生型マウスの体液性免疫系のように機能する、VELOCIMMUNE(登録商標)ヒト化マウス)に見られるCD19+B細胞数、及び成熟B細胞数と実質的に同じ数を示す。一部の実施形態では、そのようなマウスはまた、脾臓のB細胞中の内因性λ軽鎖の機能の発現停止を示す。一部の実施形態では、マウスは、骨髄及び脾臓における、正常又はほぼ正常なB細胞の発達を示す。一部の実施形態では、そのようなマウスは、遺伝子改変対照マウスと比較した場合に、λ軽鎖の、検出可能な発現及び/又は使用の欠如(又は機能の発現停止)を示す。
別の1つの態様では、非ヒト動物が提供され、その非ヒト動物が(a)遺伝子改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含み、その遺伝子座は、軽鎖可変ドメインをコードする第1のヌクレオチド配列(例えば、そこでは、第1のヌクレオチド配列が再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含む)を含み、その第1のヌクレオチド配列は、それぞれが機能性CH1ドメインをコードする配列を含む1つ以上の重鎖定常領域遺伝子を含む、例えば、少なくともインタクトなIgμ遺伝子と、インタクトなIgδ遺伝子、インタクトなIgγ遺伝子、インタクトなIgε遺伝子、及びインタクトなIgα遺伝子のうちの少なくとも1つと、を含む(その結果、例えば、ハイブリッドの免疫グロブリン鎖遺伝子座が生じる)重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結され、またその非ヒト動物は、(b)遺伝子改変免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含み、その遺伝子座は、ヒト軽鎖可変ドメインをコードする第2のヌクレオチド配列を含み、(例えば、そこでは、第2のヌクレオチド配列は、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列であるか、又はそこでは第2のヌクレオチド配列は、制限された数のヒトVL遺伝子セグメント、例えば、2つ以上であるが野生型の数よりは少ない数のヒトVL遺伝子セグメントを含み)、第2のヌクレオチド配列は、軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されている。例えば、一部の実施形態では、予め設計されたVJ領域(即ち、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列、即ちコモン又はユニバーサル軽鎖配列)から、又は有限数のヒトVL遺伝子セグメント(例えば、2つ以上であるが野生型ヒトVL遺伝子セグメント未満の数のヒトVL遺伝子セグメント)からの再配列された軽鎖は、再配列された軽鎖配列をマウス軽鎖遺伝子座κ又はλ中に標的化することにより、軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結され得る。このように、他の実施形態と同様に、この遺伝子操作された免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、非ヒト動物の生殖系ゲノム中に存在し得る。重鎖定常領域遺伝子配列との作動可能な連結に、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む、遺伝子改変非ヒト動物が、米国特許出願公開第2012−0096572A1号に記載されており、同文書は、参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、ヒト軽鎖可変ドメインをコードする第2のヌクレオチド配列が、κ軽鎖定常(即ち、Cκ)領域遺伝子配列に、作動可能に連結されている。一部の実施形態では、ヒト軽鎖可変ドメインをコードする第2のヌクレオチド配列が、マウス又はラットのCκ領域遺伝子配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、軽鎖可変ドメインをコードする第2のヌクレオチド配列が、ヒトのCκ領域遺伝子配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、ヒト軽鎖可変ドメインをコードする第2のヌクレオチド配列が、Cλ領域遺伝子配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、ヒト軽鎖可変ドメインをコードする第2のヌクレオチド配列が、マウス又はラットのCλ領域遺伝子配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、ヒト鎖可変ドメインをコードする第2のヌクレオチド配列が、ヒトのCλ領域遺伝子配列に作動可能に連結されている。
一部の実施形態では、非ヒト動物は哺乳類である。再配列されたヒト軽鎖可変領域(又は有限数のヒトVL遺伝子セグメント)と、再配列されていないヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメントとをマウスに採用した(即ち、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列(又は、有限数のヒトVL遺伝子セグメント)を含む、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座と、再配列されていないヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメント)を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座と(例えば、ハイブリッドの免疫グロブリン鎖遺伝子座)を有するマウスの)実施形態は、本明細書において広範囲にわたって論じられているが、本明細書に記載の、遺伝子改変免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子座を含む、他の非ヒト動物もまた提供される。そのような非ヒト動物には、本明細書において開示されるように、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列(又は、有限数のヒトVL遺伝子セグメントからのヒト軽鎖可変ドメイン)を発現するように遺伝子改変され得る任意のものが挙げられるが、例えば、哺乳類、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ(例えば、牝牛、雄牛、野牛)、シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長類(例えば、マーモセット、アカゲザル)等が含まれる。例えば、好適な遺伝子改変されたES細胞がすぐには入手できないそれらの非ヒト動物の場合には、遺伝子改変を含む非ヒト動物を作製するために他の方法が採用される。そのような方法としては、例えば、非ES細胞ゲノム(例えば、線維芽細胞又は誘導多能性細胞)を改変すること、及び体細胞核移植(SCNT)を用いて、除核した卵母細胞など好適な細胞に遺伝子改変ゲノムを移植し、好適な条件下で非ヒト動物内で改変細胞(例えば、改変卵母細胞)を成熟させて胚を形成することが挙げられる。非ヒト動物のゲノム(例えば、ブタ、雌牛、齧歯類、ニワトリなどのゲノム)を改変するための方法には、例えば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ(ZFN)又は転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)を用いてゲノムを改変して、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列(又は有限数、例えば2つ以上であるが野生型ヒトVL遺伝子セグメント未満の数のヒトVL遺伝子セグメント)免疫グロブリン軽鎖遺伝子座と、再配列されていないヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含む、免疫グロブリン重鎖遺伝子座(例えば、ハイブリッドの免疫グロブリン鎖遺伝子座)と、を含むようにすることが挙げられる。
一部の実施形態では、非ヒト動物は、例えば、トビネズミ上科又はネズミ上科の小型哺乳類である。一部の実施形態では、遺伝子改変動物は、齧歯類である。一部の実施形態では、齧歯類は、マウス、ラット、及びハムスターから選択される。一部の実施形態では、齧歯類は、ネズミ上科から選択される。一部の実施形態では、遺伝子改変動物は、カンガルーハムスター科(例えば、マウス様ハムスター)、キヌゲネズミ科(例えば、ハムスター、新世界ラット及びマウス、ハタネズミ)、ネズミ科(真正マウス及びラット、スナネズミ、トゲマウス、タテガミネズミ)、アシナガマウス科(キノボリマウス、イワマウス、オジロラット、マダガスカルラット及びマウス)、トゲヤマネ科(例えば、トゲヤマネ)、及びメクラネズミ科(例えば、デバネズミ、タケネズミ、及びモグラネズミ)から選択される科に属する。1つの具体的な実施形態では、遺伝子改変齧歯類は、真正マウス又はラット(ネズミ科)、スナネズミ、トゲマウス、及びタテガミネズミから選択される。一部の実施形態では、遺伝子改変マウスはネズミ科に属する。一部の実施形態では、動物は、齧歯類である。ある具体的な実施形態では、齧歯類は、マウス及びラットから選択される。一部の実施形態では、非ヒト動物はマウスである。
一部の実施形態では、非ヒト動物は、C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6N、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr、及びC57BL/Olaから選択される、C57BL系統のマウスである齧歯類である。別の1つの実施形態では、マウスは129系統である。一部の実施形態では、129P1、129P2、129P3、129X1、129S1(例えば、129S1/SV、129S1/SvIm)、129S2、129S4、129S5、129S9/SvEvH、129S6(129/SvEvTac)、129S7、129S8、129T1、129T2からなる群から選択される(例えば、Festingら(1999)による、Revised nomenclature for strain 129 mice、Mammalian Genome 10:836を参照のこと、また、Auerbachら(2000)による、Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv− and C57BL/6−Derived Mouse Embryonic Stem Cell Linesを参照のこと)。一部の実施形態では、遺伝子改変マウスは、上記の129系統と、上記のC57BL系統(例えば、C57BL/6系統)との混合体である。別の1つの実施形態では、マウスは、上記の129系統の混合体、又は上記のC57BL/6系統の混合体である。一部の実施形態では、混合体の129系統は、129S6(129/SvEvTac)系統である。別の1つの実施形態では、マウスは、129/SvEv由来の系統と、C57BL/6由来の系統との混合体である。1つの具体的な実施形態では、マウスは、Auerbachら(2000)の、BioTechniques 29:1024〜1032に記載されているように、129/SvEv由来の系統と、C57BL/6由来の系統との混合体である。別の1つの実施形態では、このマウスは、BALB系統、例えばBALB/c系統である。別の1つの実施形態では、マウスは、BALB系統(例えば、BALB/c系統)と、上記の別の1つの系統との混合体である。
一部の実施形態では、非ヒト動物は、ラットである。一部の実施形態では、ラットは、ウィスターラツト、LEA系統、Sprague Dawley系統、Fischer系統、F344、F6、ACI、及びDark Agoutiから選択される(DA)。一部の実施形態では、ラット系統は、ウィスター、LEA、Sprague Dawley、Fischer、F344、F6、ACI、及びDark Agouti(DA)から選択される群から選択される、2つ以上の系統の混合体である。
一部の実施形態では、そのような遺伝子改変されたマウスは、λ遺伝子配列が野生型において用いられる頻度の半分以下の頻度で、λ遺伝子配列を用いる。
様々な実施形態では、本明細書に記載されるように、再配列された軽鎖可変ドメインは、ヒトVL及びJL遺伝子配列又はセグメントに由来する。他の実施形態では、再配列された軽鎖可変ドメインは、非ヒトVL及びJL遺伝子配列又はセグメントに由来する。一部の実施形態では、再配列された軽鎖可変ドメインは、ヒト生殖系VLセグメント及びヒト生殖系JLセグメントに由来する。一部の実施形態では、ヒトVLセグメントは、ヒト集団における観察された変異体に対応する。
様々な実施形態では、本明細書に記載されるように、再配列された軽鎖可変領域ヌクレオチド配列のヒトVL遺伝子セグメントは、ヒトVκ遺伝子セグメントである。一部の実施形態では、ヒトVκ遺伝子セグメントは、Vκ4−1、Vκ5−2、Vκ7−3、Vκ2−4、Vκ1−5、Vκ1−6Vκ3−7、Vκ1−8、Vκ1−9、Vκ2−10、Vκ3−11、Vκ1−12、Vκ1−13、Vκ2−14、Vκ3−15、Vκ1−16、Vκ1−17、Vκ2−18、Vκ2−19、Vκ3−20、Vκ6−21、Vκ1−22、Vκ1−23、Vκ2−24、Vκ3−25、Vκ2−26、Vκ1−27、Vκ2−28、Vκ2−29、Vκ2−30、Vκ3−31、Vκ1−32、Vκ1−33、Vκ3−34、Vκ1−35、Vκ2−36、Vκ1−37、Vκ2−38、Vκ1−39、Vκ2−40、及びそれらの多型変異体からなる群から選択される一部の実施形態では、ヒトVκセグメントは、Vκ1−39又はその多型変異体である。一部の実施形態では、ヒトVκ遺伝子セグメントは、Vκ3−20である。
様々な実施形態では、本明細書に記載されるように、制約された(制限された)免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントレパートリー(例えば、2つ以上であるが野生型の数よりは少ない数のヒトVL遺伝子セグメントを含む、制約された免疫グロブリン軽鎖可変セグメントレパートリー)のヒトVL遺伝子セグメントは、ヒトVκ遺伝子セグメントである。一部の実施形態では、ヒトVκ遺伝子セグメントは、本明細書に記載のヒトVκ遺伝子セグメントから選択される。一部のある実施形態では、制約された(制限された)免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントレパートリーのヒトVκ遺伝子セグメントは、ヒトVκ1−39遺伝子セグメント及びヒトVκ3−20遺伝子セグメントを含む。非ヒト動物の制約された(制限された)免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子セグメントの様々な実施形態では、制約された軽鎖可変遺伝子セグメント(例えば、ヒトVκ1−39遺伝子セグメント及びヒトVκ3−20遺伝子セグメント)は、1、2、3、4、又はそれより多くのヒトJL遺伝子セグメントに作動可能に連結され、制約された免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子セグメントが、1、2、3、4、又はそれより多くの、ヒトJL遺伝子セグメント(即ち、Jκ遺伝子セグメント)で組み換えを行い、再配列されたVκJκ軽鎖可変遺伝子を形成する。
様々な実施形態では、本明細書に記載されるように、再配列された軽鎖可変領域ヌクレオチド配列のヒトVL遺伝子セグメントは、ヒトVλ遺伝子セグメントである。一部の実施形態では、ヒトVλ遺伝子セグメントは、Vλ3−1、Vλ4−3、Vλ2−8、Vλ3−9、Vλ3−10、Vλ2−11、Vλ3−12、Vλ2−14、Vλ3−16、Vλ2−18、Vλ3−19、Vλ3−21、Vλ3−22、Vλ2−23、Vλ3−25、Vλ3−27、Vλ1−36、Vλ5−37、Vλ5−39、Vλ1−40、Vλ7−43、Vλ1−44、Vλ5−45、Vλ7−46、Vλ1−47、Vλ9−49、Vλ1−51、Vλ5−52、Vλ6−57、Vλ4−60、Vλ8−61、Vλ4−69、及びそれらの多型変異体からなる群から選択される。一部の実施形態では、ヒトVλセグメントは、Vλ2−14である。
様々な実施形態では、本明細書に記載されるように、制約された(制限された)免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントレパートリー(例えば、2つ以上であるが野生型の数よりは少ない数のヒトVL遺伝子セグメントを含む、制約された免疫グロブリン軽鎖可変セグメントレパートリー)のヒトVL遺伝子セグメントは、ヒトVλ遺伝子セグメントである。一部の実施形態では、ヒトVλ遺伝子セグメントは、本明細書に記載のヒトVλ遺伝子セグメントから選択される。一部のある実施形態では、制約された(制限された)免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントレパートリーのヒトVλ遺伝子セグメントは、ヒトVλ2−14遺伝子セグメントを含む。
様々な実施形態では、本明細書に記載されるように、再配列された軽鎖可変領域ヌクレオチド配列のヒトJL遺伝子セグメントは、Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4、Jκ5、Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ7、及びそれらの多型変異体からなる群から選択される。
様々な実施形態では、本明細書に記載されるように、制約された(制限された)免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントレパートリーのヒトJL遺伝子セグメントは、ヒトJκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4、Jκ5、及びそれらの多型変異体を含む。様々な実施形態では、本明細書に記載されるように、制約された(制限された)免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントレパートリーのヒトJL遺伝子セグメントは、ヒトJλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ7、及びそれらの多型変異体を含む。
一部の実施形態では、ヒト又は非ヒト動物軽鎖定常領域配列は、Cκ及びCλ領域から選択された配列を含む。
様々な実施形態は、VELOCIMMUNE(登録商標)ヒト化マウス由来の特徴又は配列情報を用いるか、又は含む。VELOCIMMUNE(登録商標)ヒト化マウスは、マウス免疫グロブリン重鎖(IgH)及び免疫グロブリン軽鎖(例えば、κ軽鎖、Igκ)の生殖系可変領域を、対応するヒト免疫グロブリン可変領域により、内因性の遺伝子座において正確に、大規模に交換することを含む(例えば、米国特許第6,596,541号及び同第8,502,018号を参照のこと、なお、両者の内容全体が、参照により本明細書に組み込まれる)。合計で、約6メガベースのマウス遺伝子座が、約1.5メガベースのヒトゲノム配列で交換される。この正確な交換の結果、ヒト可変領域とマウス定常領域とを有する重鎖及び軽鎖を作る、ハイブリッドの免疫グロブリン座を有するマウスが得られる。マウスVH−D−JH及びVκ−Jκセグメントの正確な交換により、フランキングマウス配列は操作されずに、ハイブリッドの免疫グロブリン座に機能的なまま残される。マウスの体液性免疫系は、野生型マウスの体液性免疫系のように機能する。B細胞の発達は、いかなる重要な点でも妨げられることなく、抗原の刺激を受けてマウスに、ヒト可変領域の豊かな多様性が生成される。しかも、VELOCIMMUNE(登録商標)ヒト化マウスは、免疫付与に対して、本質的に正常な野生型の反応を示し、唯一、重要な点で野生型のマウスと異なるのは、免疫付与に反応して生成される可変領域が、完全にヒトのものであるということである。VELOCIMMUNE(登録商標)ヒト化マウスが可能なのは、重鎖及びκ軽鎖用の免疫グロブリン遺伝子セグメントが、ヒト及びマウスにおいて同様に再配列するためである。遺伝子座は同一のものではないが、重鎖可変遺伝子座のヒト化が、すべてのVH、D、及びJH遺伝子セグメントを含む、隣接するマウス配列の約300万個の塩基対を、ヒト免疫グロブリン遺伝子座からの同等の配列を基本的にカバーする、隣接するヒトゲノム配列の約100万個の塩基と交換することによって実現可能な程度には十分類似している。
ある特定の実施形態では、再配列されていないヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む(即ち、再配列されていないヒト免疫グロブリンVL及びJL遺伝子セグメントを含む、免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む)ヒト化マウスが提供される。そのように改変されたヒト化マウスは、マウス免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントを、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント、(即ち、内因性の重鎖遺伝子座にある、再配列されていないVL及びJL遺伝子)によって交換することと、マウス免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子セグメントを、再配列されたヒトVLJLヌクレオチド配列によって交換すること、又は、マウス免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子セグメントを、制約された(制限された)免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントレパートリー(例えば、2つ以上であるが、野生型の数よりは少ない数の、ヒトVL遺伝子セグメント)によって、交換することを含む。
一部の実施形態では、そのように改変されたマウスは、マウス免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントを、少なくとも40個の再配列されていないヒトVκ遺伝子セグメント及び5個の再配列されていないヒトJκ遺伝子セグメントによって交換することを含む。一部の実施形態では、再配列されていないヒトVκ遺伝子セグメントは、Vκ1−5、Vκ1−6、Vκ1−8、Vκ1−9、Vκ1−12、Vκ1−13、Vκ1−16、Vκ1−17、Vκ1−22、Vκ1−27、Vκ1−32、Vκ1−33、Vκ1−35、Vκ1−37、Vκ1−39、Vκ1D−8、Vκ1D−12、Vκ1D−13、Vκ1D−16、Vκ1D−17、Vκ1D−22、Vκ1D−27、Vκ1D−32、Vκ1D−33、Vκ1D−35、Vκ1D−37、Vκ1D−39、Vκ1D−42、Vκ1D−43、Vκ1−NL1、Vκ2−4、Vκ2−10、Vκ2−14、Vκ2−18、Vκ2−19、Vκ2−23、Vκ2−24、Vκ2−26、Vκ2−28、Vκ2−29、Vκ2−30、Vκ2−36、Vκ2−38、Vκ2−40、Vκ2D−10、Vκ2D−14、Vκ2D−18、Vκ2D−19、Vκ2D−23、Vκ2D−24、Vκ2D−26、Vκ2D−28、Vκ2D−29、Vκ2D−30、Vκ2D−36、Vκ2D−38、Vκ2D−40、Vκ3−7、Vκ3−11、Vκ3−15、Vκ3−20、Vκ3−25、Vκ3−31、Vκ3−34、Vκ3D−7、Vκ3D−7、Vκ3D−11、Vκ3D−15、Vκ3D−15、Vκ3D−20、Vκ3D−25、Vκ3D−31、Vκ3D−34、Vκ3−NL1、Vκ3−NL2、Vκ3−NL3、Vκ3−NL4、Vκ3−NL5、Vκ4−1、Vκ5−2、Vκ6−21、Vκ6D−21、Vκ6D−41、及びVκ7−3からなる群から選択される。一部の実施形態では、ヒトVκ遺伝子セグメントは、Vκ4−1、Vκ5−2、Vκ7−3、Vκ2−4、Vκ1−5、及びVκ1−6を含む。1つの実施形態では、Vκ遺伝子セグメントは、Vκ3−7、Vκ1−8、Vκ1−9、Vκ2−10、Vκ3−11、Vκ1−12、Vκ1−13、Vκ2−14、Vκ3−15、及びVκ1−16を含む。一部の実施形態では、ヒトVκ遺伝子セグメントは、Vκ1−17、Vκ2−18、Vκ2−19、Vκ3−20、Vκ6−21、Vκ1−22、Vκ1−23、Vκ2−24、Vκ3−25、Vκ2−26、Vκ1−27、Vκ2−28、Vκ2−29、及びVκ2−30を含む。一部の実施形態では、ヒトVκ遺伝子セグメントは、Vκ3−31、Vκ1−32、Vκ1−33、Vκ3−34、Vκ1−35、Vκ2−36、Vκ1−37、Vκ2−38、Vκ1−39、及びVκ2−40を含む。ある具体的な実施形態では、Vκ遺伝子セグメントは、ヒト免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座にVκ4−1からVκ2−40まで広がる、隣接するヒト免疫グロブリンκ遺伝子セグメントを含み、かつJκ遺伝子セグメントは、ヒト免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座にJκ1からJκ5まで広がる、隣接する遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、再配列されたヒト軽鎖可変領域ヌクレオチド配列(即ち、再配列されたヒトVκJκヌクレオチド配列)は、マウス軽鎖定常領域配列(例えば、Cκ配列)に作動可能に連結されている。ヒト軽鎖可変ドメインをコードする免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む(即ち、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む)ヒト化マウスは、本明細書に記載の任意の態様、実施形態、方法等において使用し得る。
一部の実施形態では、そのように改変されたマウスは、マウス免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントを、少なくとも40個の再配列されていないヒトVλ遺伝子セグメントと、1つ以上の再配列されていないヒトJλ遺伝子セグメントと、によって交換することを含み、一部のある実施形態では、少なくとも40個の再配列されていないヒトVλ遺伝子セグメントと、4つの再配列されていないヒトJλ遺伝子セグメントと、によって交換することを含む。一部の実施形態では、再配列されていないヒトVκ遺伝子セグメントは、Vλ3−1、Vλ4−3、Vλ2−8、Vλ3−9、Vλ3−10、Vλ2−11、Vλ3−12、Vλ2−14、Vλ3−16、Vλ2−18、Vλ3−19、Vλ3−21、Vλ3−22、Vλ2−23、Vλ3−25、Vλ3−27、Vλ1−36、Vλ5−37、Vλ5−39、Vλ1−40、Vλ7−43、Vλ1−44、Vλ5−45、Vλ7−46、Vλ1−47、Vλ9−49、Vλ1−51、Vλ5−52、Vλ6−57、Vλ4−60、Vλ8−61、Vλ4−69、及びそれらの多型変異体からなる群から選択される。一部の実施形態では、再配列されていないヒトVλ遺伝子セグメントは、Vλ3−1、Vλ4−3、Vλ2−8、Vλ3−9、Vλ3−10、Vλ2−11、及びVλ3−12を含む。一部の実施形態では、再配列されていないヒトVλ遺伝子セグメントは、Vλ2−14、Vλ3−16、Vλ2−18、Vλ3−19、Vλ3−21、Vλ3−22、Vλ2−23、Vλ3−25、及びVλ3−27を含む。一部の実施形態では、再配列されていないヒトVλ遺伝子セグメントは、Vλ1−36、Vλ5−37、Vλ5−39、Vλ1−40、Vλ7−43、Vλ1−44、Vλ5−45、Vλ7−46、Vλ1−47、Vλ9−49、Vλ1−51、Vλ5−52、Vλ6−57、Vλ4−60、Vλ8−61、及びVλ4−69を含む。ある具体的な実施形態では、Vλ遺伝子セグメントは、ヒト免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座に、Vλ3−1からVλ3−12まで広がる隣接するヒト免疫グロブリンλ遺伝子セグメントを含み、かつJλ遺伝子セグメントは、Jλ1を含む。ある具体的な実施形態では、Vλ遺伝子セグメントは、隣接するヒト免疫グロブリンλ遺伝子セグメントは、Vλ3−12からJλ1まで広がるヒト免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座を含む。ある具体的な実施形態では、Vλ遺伝子セグメントは、Vλ3−1からVλ3−12まで、ヒト免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座に広がる隣接するヒト免疫グロブリンλ遺伝子セグメントを含み、かつJλ遺伝子セグメントは、Jλ1、Jλ2、Jλ3、及びJλ7を含む。ある具体的な実施形態では、Vλ遺伝子セグメントは、Vλ3−12からVλ3−27まで、ヒト免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座に広がる隣接するヒト免疫グロブリンλ遺伝子セグメントを含み、かつ、Jλ遺伝子セグメントは、Jλ1又はJλ1、Jλ2、Jλ3、及びJλ7を含む。ある具体的な実施形態では、Vλ遺伝子セグメントは、隣接するヒト免疫グロブリンλ遺伝子セグメントを、Vλ1−40からVλ5−52まで広がる、ヒト免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座に含み、Jλ遺伝子セグメントは、Jλ1又は、Jλ1、Jλ2、Jλ3、及びJλ7を含む。一部の実施形態では、再配列されたヒト軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、再配列されたヒトVλJλヌクレオチド配列であり、かつマウス軽鎖定常領域配列(例えば、Cλ配列)に作動可能に連結されている。ヒト軽鎖可変ドメインをコードする免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む(即ち、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む)ヒト化マウスは、本明細書に記載の任意の態様、実施形態、方法等において使用し得る。
様々な実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントは、ヒト又はマウス重鎖定常領域遺伝子配列(例えば、それぞれの重鎖定常領域遺伝子は、機能性CH1ドメインをコードする、IgM、IgD、IgA、IgE、IgG、及びそれらの組合せから選択される免疫グロブリンアイソタイプをコードする重鎖定常領域遺伝子配列)に作動可能に連結されている。例えば、遺伝子改変非ヒト動物が提供され、その動物は、(a)再配列されていないヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含み、ヒト又は非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された第1のヌクレオチド配列を含む(即ち、第1のヌクレオチド配列は、少なくとも40個のヒトVκ遺伝子セグメントと5個のヒトJκ遺伝子セグメントを含む)、免疫グロブリン重鎖遺伝子座(例えば、ハイブリッドの免疫グロブリン鎖遺伝子座)と、(b)それぞれが、少なくともインタクトなIgμ遺伝子と、インタクトなIgδ遺伝子、インタクトなIgγ遺伝子、インタクトなIgε遺伝子、及びインタクトなIgα遺伝子の少なくとも1つを含む機能性CH1ドメインをコードする配列を含む、1つ以上の重鎖定常領域遺伝子を含む、ヒト又は非ヒト軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結され、軽鎖可変ドメインをコードする第2のヌクレオチド配列(即ち、第2のヌクレオチド配列は、再配列され、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列であるか、又は第2のヌクレオチド配列は、有限数のヒトVL遺伝子セグメントを含み;例えば、2以上であるが野生型の数よりは少ない数のヒトVL遺伝子セグメントを含み)を含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座と、を含む。一部の実施形態では、ヒト重鎖定常領域遺伝子は、ヒンジ、CH2、CH3、及びそれらの組合せを、更にコードする。一部の実施形態では、マウス重鎖定常領域遺伝子は、ヒンジ、CH2、CH3、及びそれらの組合せを、更にコードする。一部の実施形態では、ある非ヒト動物定常領域遺伝子配列を、ヒト遺伝子配列によって更に交換すること(例えば、マウスCH1配列を、ヒトCH1配列と交換すること、及びマウスCL配列を、ヒトCL配列と交換すること)は、その結果として、ヒト可変領域と部分的にヒト定常領域とを有する抗体を、例えば、完全なヒト抗体断片、例えば、完全にヒトFabを作るのに好適なものとする、キメラ(そしてハイブリッド)免疫グロブリン座を有する、遺伝子改変非ヒト動物が得られる。一部の実施形態では、再配列されていない、ヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメントは、それぞれが、機能性CH1ドメイン、例えば、少なくともインタクトなIgμ遺伝子と、インタクトなIgδ遺伝子、インタクトなIgγ遺伝子、インタクトなIgε遺伝子、及びインタクトなIgα遺伝子のうちの少なくとも1つとを含む配列を含む、1つ以上の重鎖定常領域遺伝子を含む、ラットの重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、ラット重鎖定常領域遺伝子は、CH2、CH3、及びそれらの組合せを、更にコードする。一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列(又は有限数のヒトVL遺伝子セグメント)は、ヒトCκ領域配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列(又は有限数のヒトVL遺伝子セグメント)マウス又はラットのCκ領域配列に作動可能に連結されている。様々な実施形態では、非ヒト動物の遺伝子改変免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結され、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を2部、3部、4部、又はそれより多く含む。ある特定の実施形態では、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列の複数の複製を含む。
様々な実施形態では、(ヒト)IgG1、IgG2、又はIgG4重鎖定常領域遺伝子(例えば、発現ベクター中に、内因性の遺伝子座でクローニングされた)等は、遺伝子のCH3コード化配列中の1つ以上の改変を含み、その改変により、Aタンパク質に対する、改変されたコーディング配列によってコードされているCH3ドメインの親和性を減少させ又は消滅させる。(例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第8,586,713号参照を参照のこと)。そのような改変には、(a)IMGT番号付けシステムにおける、95R、並びに(b)95R及び96F、又はEU番号付けシステムにおける、(a’)435R、並びに(b’)435R及び436Fからなる群から選択される突然変異が挙げられるが、それらに限られない。一部の実施形態では、(ヒト及び)突然変異した重鎖定常領域は、(ヒト及び)突然変異したIgG1定常領域であり、かつ(a)(IMGT番号付けシステムにおける)95R又は(b)95R及び96Fの突然変異に加えて、IMGTエキソン番号付けシステムにおける、16E、18M、44S、52N、57M、及び82I、又はEU番号付けシステムにおける、356E、358M、384S、392N、397M、及び422Iからなる群から選択される、1〜5個の一時変異を更に含む。一部の実施形態では、重鎖定常遺伝子は、(ヒト)IgG2定常遺伝子であり、かつ(a)95R又は(b)95R及び96F(IMGT番号付けシステムで)の突然変異に加えて、IMGTエキソン番号付けシステムにおける、44S、52N、82I、又は、EU番号付けシステムにおける、348S、392N、及び422Iからなる群から選択される、1〜2つの一時変異を更に含む。他の実施形態では、(ヒト)重鎖定常遺伝子は、(ヒト)IgG4定常遺伝子であり、かつ(a)95R又は(b)95R及び96F(IMGT番号付けシステムで)の突然変異に加えて、IMGTエキソン番号付けシステムにおける、15R、44S、52N、57M、69K、79Q、及び82I、又はEU番号付けシステムにおける、355R、384S、392N、397M、409K、419Q、及び422Iからなる群から選択される、1〜7つの一時変異、及び/又は、IMGTエキソン番号付けシステムにおける105P、又はEU番号付けシステムにおける445Pの一時変異を更に含む。
様々な実施形態では、重鎖定常領域ヌクレオチド配列は、CH2又はCH3における改変を含み、その改変により、酸性環境下で(例えば、pHが約5.5〜約6.0の範囲のエンドソーム中で)、重鎖定常領域アミノ酸配列の、FcRnに対する親和性が増加する。一部の実施形態では、重鎖定常領域ヌクレオチド配列は、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードし、そのヒト重鎖定常領域アミノ酸配列は、EU番号付けにおける位置250(Kabat番号付けにおける263)に改変(例えば、E又はQ)を含み、EU番号付けにおける位置250(Kabat番号付けにおける263)及びEU番号付けにおける位置428(Kabat番号付けにおける459)に改変(例えば、L又はF)を含み、EU番号付けにおける位置252(Kabat番号付けにおける265)に改変(例えば、L/Y/F/W又はT)を含み、EU番号付けにおける位置254(Kabat番号付けにおける267)に改変(例えば、S又はT)を含み、及びEU番号付けにおける位置256(Kabat番号付けにおける269)に改変(例えば、S/R/Q/E/D、又はT)を含み、あるいは、EU番号付けにおける位置428(Kabat番号付けにおける459)に改変を含み、及び/又はEU番号付けにおける位置433(Kabat番号付けにおける464)に改変(例えば、L/R/S/P/Q又はK)を含み、及び/又はEU番号付けにおける位置434(Kabat番号付けにおける465)に改変(例えば、H/F又はY)を含み、あるいは、EU番号付けにおける位置250(Kabat番号付けにおける263)に改変を含み、及び/又はEU番号付けにおける位置428(Kabat番号付けにおける459)に改変を含み、又はEU番号付けにおける位置307(Kabat番号付けにおける326)に改変を含み、又はEU番号付けにおける位置308(Kabat番号付けにおける327)に改変(例えば、308F、V308F)を含み、更にEU番号付けにおける位置434(Kabat番号付けにおける465)に改変を含む。1つの実施形態では、改変は、EU番号付けにおける428L(例えば、M428L)と434S(例えば、N434S)の改変を含み、(459、例えば、M459L、及びKabat番号付けで465S(例えば、N465S)の改変を含み、EU番号付けにおける、428L、259I(例えば、V259I)、及び308F(例えば、V308F)の改変を含み、(459L、272I(例えば、V272I)、及びKabat番号付けで327F(例えば、V327F)の改変を含み、EU番号付けにおける、433K(例えば、H433K)改変を含み、及び434(例えば、434Y)改変を含み、及びKabat番号付けにおける(464K(例えば、H464K)改変を含み、465(例えば、465Y)改変を含み、EU番号付けにおける、252、254、及び256の位置に(例えば、252Y、254T、及び256E)改変を含み、Kabat番号付けで(265、267、269(例えば、265Y、267T、及び269E)に、改変を含み、EU番号付けにおける、250Q及び428L改変(例えば、T250Q及びM428L)、(Kabat番号付けにおける、263Q及び459L改変、例えば、T263Q及びM459L)を含み、更に、EU番号付けにおける、307及び/又は308に改変(例えば、307F又は308P)を含み、(Kabat番号付けにおける、326及び/又は327の改変、例えば、326F又は308Pを含み)、改変は、酸性環境(例えば、pHが約5.5〜約6.0の範囲のエンドソーム中で)下で、重鎖定常領域アミノ酸配列のFcRnへの親和性を高める。一部の実施形態では、重鎖定常領域ヌクレオチド配列は、ヒトCH2アミノ酸配列をコードし、少なくとも1つの改変を、アミノ酸残基間、EU番号付けにおける、位置252と257との間に(即ち、少なくとも1つの改変を、Kabat番号付けにおけるアミノ酸位置265と270との間に)含み、その改変は、酸性環境下で(例えば、pHが約5.5〜約6.0の範囲のエンドソーム中で)、FcRnに対するヒトCH2アミノ酸配列の親和性を高める。一部の実施形態では、重鎖定常領域ヌクレオチド配列は、ヒトCH2アミノ酸配列をコードし、少なくとも1つの改変を、アミノ酸残基間、位置307と311との間に(即ち、少なくとも1つの改変を、Kabat番号付けにおけるアミノ酸位置326と330との間に)含み、その改変は、酸性環境下で(例えば、pHが約5.5〜約6.0の範囲のエンドソーム中で)、FcRnに対するCH2アミノ酸配列の親和性を高める。一部の実施形態では、重鎖定常領域ヌクレオチド配列は、ヒトCH3アミノ酸配列をコードし、ヒトCH3アミノ酸配列は、少なくとも1つの改変を、アミノ酸残基間、EU番号付けにおける、位置433と436との間に(即ち、少なくとも1つの改変を、Kabat番号付けにおけるアミノ酸残基間、位置464と467との間に)含み、その改変は、酸性環境下で(例えば、pHが約5.5〜約6.0の範囲のエンドソーム中で)、FcRnに対するCH3アミノ酸配列の親和性を高める。一部の実施形態では、重鎖定常領域ヌクレオチド配列は、EU番号付けにおけるM428L(Kabat番号付けにおける459)、EU番号付けにおけるN434S(Kabat番号付けにおける465)、及びそれらの組合せからなる群から選択される突然変異を含む、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。一部の実施形態では、重鎖定常領域ヌクレオチド配列は、EU番号付けにおけるM428L(Kabat番号付けにおけるM459L)、EU番号付けにおけるV259I(Kabat番号付けにおけるV272I)、EU番号付けにおけるV308F(Kabat番号付けにおけるV327)、及びそれらの組合せからなる群から選択される突然変異を含む、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。一部の実施形態では、重鎖定常領域ヌクレオチド配列は、EU番号付けにおけるN434A突然変異(Kabat番号付けにおけるN465A突然変異)を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。一部の実施形態では、重鎖定常領域ヌクレオチド配列は、EU番号付けにおけるM252Y(Kabat番号付けにおけるM265Y)、EU番号付けにおけるS254T(Kabat番号付けにおけるS267T)、EU番号付けにおけるT256E(Kabat番号付けにおけるT269E)、及びそれらの組合せからなる群から選択される突然変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。一部の実施形態では、重鎖定常領域ヌクレオチド配列は、EU番号付けにおけるT250Q(Kabat番号付けにおけるT263Q)、EU番号付けにおけるM428L(Kabat番号付けにおけるM459L)、及びそれらの組合せからなる群から選択される突然変異を含む、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。一部の実施形態では、重鎖定常領域ヌクレオチド配列は、EU番号付けにおけるH433K(Kabat番号付けにおけるH464K)、EU番号付けにおけるN434Y(Kabat番号付けにおけるN465Y)、及びそれらの組合せからなる群から選択される突然変異を含む、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。
様々な実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物は、目的の抗原で免疫を与えられ、目的の抗原に特異的に結合している抗原結合タンパク質を発現しているB細胞が同定され、重鎖定常領域を含むポリペプチド中の軽鎖可変ドメインをコードする、B細胞の核酸配列が同定され、判定される。軽鎖可変ドメインの核酸配列は、好適な細胞内に発現し、好適な発現ベクターを採用しており、重鎖定常核酸配列は、1、2、3個、又はそれ超の一時変異を含む。一部の実施形態では、軽鎖可変領域はヒトのものであり、重鎖配列はヒトのものである。一部の実施形態では、重鎖定常領域ヌクレオチド配列は、CH2又はCH3における改変を含み、その改変により、酸性環境下で(例えば、pHが約5.5〜約6.0の範囲のエンドソーム中で)、重鎖定常領域アミノ酸配列の、FcRnに対する親和性が増加する。一部の実施形態では、重鎖定常領域ヌクレオチド配列は、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードし、そのヒト重鎖定常領域アミノ酸配列は、EU番号付けにおける位置250(Kabat番号付けにおける263)に改変(例えば、E又はQ)を含み、EU番号付けにおける位置250(Kabat番号付けにおける263)及びEU番号付けにおける位置428(Kabat番号付けにおける459)に改変(例えば、L又はF)を含み、EU番号付けにおける位置252(Kabat番号付けにおける265)に改変(例えば、L/Y/F/W又はT)を含み、EU番号付けにおける位置254(Kabat番号付けにおける267)に改変(例えば、S又はT)を含み、及びEU番号付けにおける位置256(Kabat番号付けにおける269)に改変(例えば、S/R/Q/E/D、又はT)を含み、あるいは、EU番号付けにおける位置428(Kabat番号付けにおける459)に改変を含み、及び/又はEU番号付けにおける位置433(Kabat番号付けにおける464)に改変(例えば、L/R/S/P/Q又はK)を含み、及び/又はEU番号付けにおける位置434(Kabat番号付けにおける465)に改変(例えば、H/F又はY)を含み、あるいは、EU番号付けにおける位置250(Kabat番号付けにおける263)に改変を含み、及び/又はEU番号付けにおける位置428(Kabat番号付けにおける459)に改変を含み、又はEU番号付けにおける位置307(Kabat番号付けにおける326)に改変を含み、又はEU番号付けにおける位置308(Kabat番号付けにおける327)に改変(例えば、308F、V308F)を含み、更にEU番号付けにおける位置434(Kabat番号付けにおける465)に改変を含む。1つの実施形態では、改変は、EU番号付けにおける428L(例えば、M428L)と434S(例えば、N434S)の改変を含み、(459、例えば、M459L、及びKabat番号付けで465S(例えば、N465S)の改変を含み、EU番号付けにおける、428L、259I(例えば、V259I)、及び308F(例えば、V308F)の改変を含み、(459L、272I(例えば、V272I)、及びKabat番号付けで327F(例えば、V327F)の改変を含み、EU番号付けにおける、433K(例えば、H433K)改変を含み、及び434(例えば、434Y)改変を含み、及びKabat番号付けにおける(464K(例えば、H464K)改変を含み、465(例えば、465Y)改変を含み、EU番号付けにおける、252、254、及び256の位置に(例えば、252Y、254T、及び256E)改変を含み、Kabat番号付けで(265、267、269(例えば、265Y、267T、及び269E)に、改変を含み、EU番号付けにおける、250Q及び428L改変(例えば、T250Q及びM428L)、(Kabat番号付けにおける、263Q及び459L改変、例えば、T263Q及びM459L)を含み、更に、EU番号付けにおける、307及び/又は308に改変(例えば、307F又は308P)を含み、(Kabat番号付けにおける、326及び/又は327の改変、例えば、326F又は308Pを含み)、改変は、酸性環境(例えば、pHが約5.5〜約6.0の範囲のエンドソーム中で)下で、重鎖定常領域アミノ酸配列のFcRnへの親和性を高める。一部の実施形態では、重鎖定常領域ヌクレオチド配列は、ヒトCH2アミノ酸配列をコードし、少なくとも1つの改変を、アミノ酸残基間、EU番号付けにおける、位置252と257との間に(即ち、少なくとも1つの改変を、Kabat番号付けにおけるアミノ酸位置265と270との間に)含み、その改変は、酸性環境下で(例えば、pHが約5.5〜約6.0の範囲のエンドソーム中で)、FcRnに対するヒトCH2アミノ酸配列の親和性を高める。一部の実施形態では、重鎖定常領域ヌクレオチド配列は、ヒトCH2アミノ酸配列をコードし、少なくとも1つの改変を、アミノ酸残基間、位置307と311との間に(即ち、少なくとも1つの改変を、Kabat番号付けにおけるアミノ酸位置326と330との間に)含み、その改変は、酸性環境下で(例えば、pHが約5.5〜約6.0の範囲のエンドソーム中で)、FcRnに対するCH2アミノ酸配列の親和性を高める。一部の実施形態では、重鎖定常領域ヌクレオチド配列は、ヒトCH3アミノ酸配列をコードし、ヒトCH3アミノ酸配列は、少なくとも1つの改変を、アミノ酸残基間、EU番号付けにおける、位置433と436との間に(即ち、少なくとも1つの改変を、Kabat番号付けにおけるアミノ酸残基間、位置464と467との間に)含み、その改変は、酸性環境下で(例えば、pHが約5.5〜約6.0の範囲のエンドソーム中で)、FcRnに対するCH3アミノ酸配列の親和性を高める。一部の実施形態では、重鎖定常領域ヌクレオチド配列は、EU番号付けにおけるM428L(Kabat番号付けにおける459)、EU番号付けにおけるN434S(Kabat番号付けにおける465)、及びそれらの組合せからなる群から選択される突然変異を含む、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。一部の実施形態では、重鎖定常領域ヌクレオチド配列は、EU番号付けにおけるM428L(Kabat番号付けにおけるM459L)、EU番号付けにおけるV259I(Kabat番号付けにおけるV272I)、EU番号付けにおけるV308F(Kabat番号付けにおけるV327)、及びそれらの組合せからなる群から選択される突然変異を含む、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。一部の実施形態では、重鎖定常領域ヌクレオチド配列は、EU番号付けにおけるN434A突然変異(Kabat番号付けにおけるN465A突然変異)を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。一部の実施形態では、重鎖定常領域ヌクレオチド配列は、EU番号付けにおけるM252Y(Kabat番号付けにおけるM265Y)、EU番号付けにおけるS254T(Kabat番号付けにおけるS267T)、EU番号付けにおけるT256E(Kabat番号付けにおけるT269E)、及びそれらの組合せからなる群から選択される突然変異を含むヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。一部の実施形態では、重鎖定常領域ヌクレオチド配列は、EU番号付けにおけるT250Q(Kabat番号付けにおけるT263Q)、EU番号付けにおけるM428L(Kabat番号付けにおけるM459L)、及びそれらの組合せからなる群から選択される突然変異を含む、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。一部の実施形態では、重鎖定常領域ヌクレオチド配列は、EU番号付けにおけるH433K(Kabat番号付けにおけるH464K)、EU番号付けにおけるN434Y(Kabat番号付けにおけるN465Y)、及びそれらの組合せからなる群から選択される突然変異を含む、ヒト重鎖定常領域アミノ酸配列をコードする。
様々な実施形態では、Fcドメインは改変され(非ヒト動物において;あるいは、単一のポリペプチド内で、本明細書に記載の非ヒト動物の重鎖に由来する軽鎖可変ドメインと、重鎖定常配列(例えば、ヒト配列)とを一緒に発現させる発現系において)、変更されたFc受容体結合を有するようになっており、これがエフェクターの機能に影響を及ぼす。一部の実施形態では、Fcドメインを含む、遺伝子操作された重鎖定常領域(CH)は、キメラである。したがって、キメラCH領域は、2つ以上の免疫グロブリンアイソタイプに由来するCHドメインを組み合わせる。例えば、キメラCH領域は、ヒトIgG1、ヒトIgG2、又はヒトIgG4分子に由来するCH3ドメインの一部又は全部と組み合わされた、ヒトIgG1、ヒトIgG2、又はヒトIgG4分子に由来するCH2ドメインの一部又は全部を含む。一部の実施形態では、キメラCH領域は、キメラヒンジ領域を含む。例えば、キメラヒンジは、ヒトIgG1、ヒトIgG2、又はヒトIgG4ヒンジ領域に由来する、「ロワーヒンジ」配列(EU番号付けによる位置228から236にあるアミノ酸残基;Kabat番号付けによる、位置241から249にあるアミノ酸残基)と組み合わされた、ヒトIgG1、ヒトIgG2、又はヒトIgG4ヒンジ領域に由来する、「アッパーヒンジ」アミノ酸配列(EU番号付けによる位置216から227にあるアミノ酸残基;Kabat番号付けによる、位置226から240にあるアミノ酸残基)を含み得る。一部の実施形態では、キメラヒンジ領域は、ヒトIgG1又はヒトIgG4のアッパーヒンジに由来するアミノ酸残基と、ヒトIgG2のロワーヒンジに由来するアミノ酸残基とを含む。
一部の実施形態では、Fcドメインは、Fc含有タンパク質の(例えば抗体の)所望の薬物力学的特性に影響を及ぼすことなく、正常なFcエフェクターの機能の全部若しくは一部を活性化するか、又はそれらを1つも活性化させないように、遺伝子操作され得る。キメラCH領域を含み、かつ変更されたエフェクター機能を有するタンパク質の例については、2014年1月31日出願の、国際特許出願第PCT/US2014/14175号を参照のこと(なお、同文献はその全体が、本明細書に組み込まれる)。
様々な態様では、非ヒト動物のゲノムが改変され、(i)欠失する又は非機能性にする(例えば、ヌクレオチド配列(例えば、外因性ヌクレオチド配列)の挿入を介して)免疫グロブリン遺伝子座中で、全部、若しくは実質的に全部の内因性の機能性免疫グロブリンVH、D、JH遺伝子セグメントの非機能性再配列、又は反転を介する;(ii)再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含ませる、遺伝子セグメントは、内因性の遺伝子座に存在する、(即ち、遺伝子セグメントは、野生型の非ヒト動物にある)。一部の実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントが、ゲノムに組み込まれる(例えば、そのゲノム内の内因性の免疫グロブリン重鎖遺伝子座とは異なる遺伝子座で、又はその内因性の遺伝子座内で、例えば、免疫グロブリン可変遺伝子座内で、なお、内因性の遺伝子座は、ゲノム内の別の場所に配置したり、移動したりする)。一部の実施形態では、例えば、すべての内因性の機能性重鎖V、D、又はJ遺伝子セグメントの約80%以上、約85%以上、約90%以上、約95%以上、約96%以上、約97%以上、約98%以上、又は約99%以上が欠失されたり、あるいは非機能性にされる。一部の実施形態では、例えば、内因性の機能性重鎖V、D、又はJ遺伝子セグメントの、少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%が欠失されたり、非機能性にされる。一部の実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントは、ヒト又は非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されている。
一部の実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、内因性の機能性VH、D、及びJH重鎖可変遺伝子セグメントと、内因性の機能性軽鎖可変VL及びJL遺伝子セグメントとを、欠失する又は非機能性にする改変を含み;かつ(i)再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列(又は有限数のヒトVL遺伝子セグメント、例えば、2つ以上であるが野生型の数よりは少ない数のヒトVL遺伝子セグメント)、及び(ii)再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖V遺伝子セグメント(VL)と、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖J遺伝子セグメント(JL)と、をコードするヌクレオチド配列を、内因性の免疫グロブリン遺伝子座で含む(例えば、それぞれが、機能性CH1ドメインをコードする配列を含む、1つ以上の重鎖定常領域遺伝子を含む、例えば、少なくともインタクトなIgμ遺伝子と、インタクトなIgδ遺伝子、インタクトなIgγ遺伝子、インタクトなIgε遺伝子、及びインタクトなIgα遺伝子のうちの少なくとも1つを含む、内因性の免疫グロブリン重鎖遺伝子座)又はゲノム内のどこか他の場所で統合して含む(例えば、ゲノム内の、内因性の免疫グロブリン遺伝子座とは異なる遺伝子座内、又はその内因性の遺伝子座内、例えば、免疫グロブリン可変領域遺伝子座内で、なお、内因性の遺伝子座は、ゲノム内で、別の場所に配置したり、移動したりできる)。一部の実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、内因性のVH、D、及びJH重鎖可変遺伝子セグメントと、内因性の軽鎖可変VL及びJL遺伝子セグメントとを、欠失する又は非機能性にする改変を含み;かつ(i)再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列(又は有限数のヒトVL遺伝子セグメント、例えば、2つ以上であるが野生型の数よりは少ない数のヒトVL遺伝子セグメント)を含み、かつ(ii)1つ以上の再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント(VL及びJL)を内因性の場所(例えば、内因性の免疫グロブリン重鎖遺伝子座)に含むか、又はゲノム内の他の場所で統合して含む(例えば、ゲノム内の内因性の免疫グロブリン鎖遺伝子座とは異なる遺伝子座、又はその内因性の遺伝子座内、例えば、免疫グロブリン可変領域遺伝子座内、なお、内因性の遺伝子座は、ゲノム内で、別の場所に配置したり、移動したりできる)。一部の実施形態では、例えば、すべての内因性の機能性重鎖V、D、又はJ遺伝子セグメントの約80%以上、約85%以上、約90%以上、約95%以上、約96%以上、約97%以上、約98%以上、又は約99%以上が欠失されたり、あるいは非機能性にされる。一部の実施形態では、例えば、内因性の機能性重鎖V、D、又はJ遺伝子セグメントの、少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%が欠失されたり、非機能性にされる。一部の実施形態では、再配列されていない、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントは、それぞれが、機能性CH1ドメイン、例えば、少なくともインタクトなIgμ遺伝子と、インタクトなIgδ遺伝子、インタクトなIgγ遺伝子、インタクトなIgε遺伝子、及びインタクトなIgα遺伝子のうちの少なくとも1つとを含む配列を含む、1つ以上の重鎖定常領域遺伝子を含む、ヒト又は非ヒトの重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列(又は有限数のヒトVL遺伝子セグメント、例えば、2つ以上であるが野生型の数よりは少ない数のヒトVL遺伝子セグメント)が、ヒト又は非ヒト軽鎖定常領域遺伝子配列(ただしκ又はλのいずれか)に作動可能に連結される。
様々な実施形態は、ハイブリッドの免疫グロブリン遺伝子座によってコードされている免疫グロブリンハイブリッド鎖由来の軽鎖可変ドメインを含む。軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列は、本明細書に記載の、遺伝子改変非ヒト動物を作る際に使用され得、そのような動物により発現され得、かつ/又は、そのような動物により生成される(又は、そのような動物により多様化された配列に由来する)抗体内に存在するアミノ酸をコードし得る。一部の実施形態では、軽鎖可変ドメインは、ヒトVκドメインである。一部の実施形態では、軽鎖可変ドメインは、マウスVκドメインである。一部の実施形態では、軽鎖可変ドメインは、ラットVκドメインである。一部の実施形態では、軽鎖可変ドメインは、ヒトVλドメインである。一部の実施形態では、軽鎖可変ドメインは、マウスVλドメインである。一部の実施形態では、軽鎖可変ドメインは、ラットVλドメインである。
様々な実施形態では、本明細書に記載の遺伝子改変非ヒト動物によって生成された軽鎖可変ドメインは、1つ以上のマウス又はヒトの免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメントによってコードされる。一部の実施形態では、1つ以上のマウス免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメントは、約3メガベースのマウス免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含む。一部の実施形態では、1つ以上のマウス免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメントは、少なくとも137個のVκ遺伝子セグメント、少なくとも5個のJκ遺伝子セグメント、又は、マウス免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座のそれらの組合せを含む。一部の実施形態では、1つ以上のヒト免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメントは、約1.5メガベースのヒト免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含む。ある具体的な実施形態では、1つ以上のヒト免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメントは、ヒト免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座の近位反復(免疫グロブリンκ定常領域について)を含む。一部の実施形態では、1つ以上のヒト免疫グロブリンκ軽鎖可変遺伝子セグメントは、ヒト免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座の、少なくとも40個のVκ遺伝子セグメント、少なくとも5個のJκ遺伝子セグメント、又はそれらの組合せを含む。
ある特定の実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖(VL)遺伝子セグメントと再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖(JL)遺伝子セグメントとをコードするヌクレオチド配列を更に含む。一部の実施形態では、再配列されていない軽鎖V遺伝子セグメントと再配列されていない軽鎖J遺伝子セグメントとをコードするヌクレオチド配列は、免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖V(VL)遺伝子セグメントと、再配列されていないヒト免疫グロブリンJ(JL)遺伝子セグメントとは、内因性の齧歯類遺伝子座で、齧歯類免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子に、作動可能に連結され;例えば、それぞれが、機能性CH1ドメインをコードする、IgM又はIgG重鎖定常領域遺伝子に、作動可能に連結される。
様々な実施形態では、再配列されていないヒト可変領域遺伝子セグメント(例えば、ヒトVκ遺伝子セグメント)は、抗体のヒト可変ドメインを再配置し、コードすることが可能である。一部の実施形態では、非ヒト動物は、内因性のVL遺伝子セグメントを含まない。一部の実施形態では、非ヒト動物によって発現された、ヒトVκ遺伝子セグメントは、Vκ1−5、Vκ1−6、Vκ1−8、Vκ1−9、Vκ1−12、Vκ1−13、Vκ1−16、Vκ1−17、Vκ1−22、Vκ1−27、Vκ1−32、Vκ1−33、Vκ1−35、Vκ1−37、Vκ1−39、Vκ1D−8、Vκ1D−12、Vκ1D−13、Vκ1D−16、Vκ1D−17、Vκ1D−22、Vκ1D−27、Vκ1D−32、Vκ1D−33、Vκ1D−35、Vκ1D−37、Vκ1D−39、Vκ1D−42、Vκ1D−43、Vκ1−NL1、Vκ2−4、Vκ2−10、Vκ2−14、Vκ2−18、Vκ2−19、Vκ2−23、Vκ2−24、Vκ2−26、Vκ2−28、Vκ2−29、Vκ2−30、Vκ2−36、Vκ2−38、Vκ2−40、Vκ2D−10、Vκ2D−14、Vκ2D−18、Vκ2D−19、Vκ2D−23、Vκ2D−24、Vκ2D−26、Vκ2D−28、Vκ2D−29、Vκ2D−30、Vκ2D−36、Vκ2D−38、Vκ2D−40、Vκ3−7、Vκ3−11、Vκ3−15、Vκ3−20、Vκ3−25、Vκ3−31、Vκ3−34、Vκ3D−7、Vκ3D−7、Vκ3D−11、Vκ3D−15、Vκ3D−15、Vκ3D−20、Vκ3D−25、Vκ3D−31、Vκ3D−34、Vκ3−NL1、Vκ3−NL2、Vκ3−NL3、Vκ3−NL4、Vκ3−NL5、Vκ4−1、Vκ5−2、Vκ6−21、Vκ6D−21、Vκ6D−41、及びVκ7−3からなる群から選択される。一部の実施形態では、本明細書に記載の、遺伝子改変非ヒト動物は、すべての機能性ヒトVκ遺伝子を発現する。一部の実施形態では、ヒトVκ遺伝子セグメントは、Vκ4−1、Vκ5−2、Vκ7−3、Vκ2−4、Vκ1−5、及びVκ1−6を含む。一部の実施形態では、Vκ遺伝子セグメントは、Vκ3−7、Vκ1−8、Vκ1−9、Vκ2−10、Vκ3−11、Vκ1−12、Vκ1−13、Vκ2−14、Vκ3−15、及びVκ1−16を含む。一部の実施形態では、ヒトVκ遺伝子セグメントは、Vκ1−17、Vκ2−18、Vκ2−19、Vκ3−20、Vκ6−21、Vκ1−22、Vκ1−23、Vκ2−24、Vκ3−25、Vκ2−26、Vκ1−27、Vκ2−28、Vκ2−29、及びVκ2−30を含む。一部の実施形態では、ヒトVκ遺伝子セグメントは、Vκ3−31、Vκ1−32、Vκ1−33、Vκ3−34、Vκ1−35、Vκ2−36、Vκ1−37、Vκ2−38、Vκ1−39、及びVκ2−40を含む。様々な実施形態では、非ヒト動物は、5個のヒトJκ遺伝子セグメント、例えば、Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4、及びJκ5遺伝子セグメントを含む。ある具体的な実施形態では、Vκ遺伝子セグメントは、隣接するヒト免疫グロブリンκ遺伝子セグメントを、ヒト免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座に、Vκ4−1からVκ2−40まで含み、かつJκ遺伝子セグメントは、隣接する遺伝子セグメントを、ヒト免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座に、Jκ1からJκ5まで含む。一部の実施形態では、非ヒト動物の免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、2個のヒトVL遺伝子セグメント、Vκ1−39及びVκ3−20を含む。一部の実施形態では、1つ以上の(例えば、2、3、4、5個、又はそれより多くの)ヒトVL遺伝子セグメントと、2つ以上のヒトJL遺伝子セグメントとが、内因性の重鎖遺伝子座に存在している。一部の実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、機能性λ軽鎖遺伝子座を含む、マウスである。他の実施形態では、マウスは、非機能性λ軽鎖遺伝子座を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載の、遺伝子改変非ヒト動物(例えば、マウス又はラット)は、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を発現し(即ち、再配列された軽鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質を生成し)、かつ、Vκ1−5、Vκ1−6、Vκ1−8、Vκ1−9、Vκ1−12、Vκ1−13、Vκ1−16、Vκ1−17、Vκ1−22、Vκ1−27、Vκ1−32、Vκ1−33、Vκ1−35、Vκ1−37、Vκ1−39、Vκ1D−8、Vκ1D−12、Vκ1D−13、Vκ1D−16、Vκ1D−17、Vκ1D−22、Vκ1D−27、Vκ1D−32、Vκ1D−33、Vκ1D−35、Vκ1D−37、Vκ1D−39、Vκ1D−42、Vκ1D−43、Vκ1−NL1、Vκ2−4、Vκ2−10、Vκ2−14、Vκ2−18、Vκ2−19、Vκ2−23、Vκ2−24、Vκ2−26、Vκ2−28、Vκ2−29、Vκ2−30、Vκ2−36、Vκ2−38、Vκ2−40、Vκ2D−10、Vκ2D−14、Vκ2D−18、Vκ2D−19、Vκ2D−23、Vκ2D−24、Vκ2D−26、Vκ2D−28、Vκ2D−29、Vκ2D−30、Vκ2D−36、Vκ2D−38、Vκ2D−40、Vκ3−7、Vκ3−11、Vκ3−15、Vκ3−20、Vκ3−25、Vκ3−31、Vκ3−34、Vκ3D−7、Vκ3D−7、Vκ3D−11、Vκ3D−15、Vκ3D−15、Vκ3D−20、Vκ3D−25、Vκ3D−31、Vκ3D−34、Vκ3−NL1、Vκ3−NL2、Vκ3−NL3、Vκ3−NL4、Vκ3−NL5、Vκ4−1、Vκ5−2、Vκ6−21、Vκ6D−21、Vκ6D−41、及びVκ7−3からなる群から選択されるVκ遺伝子によってコードされている1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上等の軽鎖可変ドメインを発現する。
様々な実施形態では、再配列されたヒト軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、対応するヒト生殖系軽鎖可変遺伝子セグメントによってコードされていない1つ以上のヒスチジンコドンをコードする。一部の実施形態では、本明細書に記載の軽鎖可変ドメインは、中性のpHと比べて、酸性のpHで、少なくとも約2倍、少なくとも約3倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、少なくとも約10倍、少なくとも約15倍、少なくとも約20倍、少なくとも約25倍、又は少なくとも約30倍の解離半減期(t1/2)の減少を示す。一部の実施形態では、中性のpHでの値と比べて酸性のpHでのt1/2が減少しているのは、約30倍以上である。一部の実施形態では、再配列されたヒト軽鎖可変領域ヌクレオチド配列(又は少なくとも、有限数のヒトVL遺伝子セグメントのうちの1つ)は、対応するヒト生殖系VL遺伝子セグメントによってコードされている少なくとも1つの非ヒスチジンコドンの、ヒスチジンコドンによる置換を含む。一部の実施形態では、置換は、1個、2個、3個、又は4個のコドン分(例えば、3個又は4個のコドン)の置換である。一部の実施形態では、置換は、CDR3コドン内である。一部の実施形態では、ヒトVL遺伝子セグメントは、ヒトVκ1−39又はヒトVκ3−20遺伝子セグメントであり、かつヒトVκ1−39又はヒトVκ3−20遺伝子セグメントは、対応するヒト生殖系VL遺伝子セグメントによってコードされている、少なくとも1つの非ヒスチジンコドンの、ヒスチジンコドンによる置換を含む。一部の実施形態では、ヒトVκ1−39又はヒトVκ3−20遺伝子セグメントは、3個又は4個のヒスチジンコドンによる置換を含む。一部の実施形態では、3個又は4個の置換は、CDR3領域内で起こる。一部の実施形態では、置換は、ヒトVκ1−39遺伝子セグメントの3個の非ヒスチジンコドンの置換であり、その置換は、ヒスチジンを、位置106、108、及び111で発現するように設計されている。一部の実施形態では、置換は、ヒトVκ1−39遺伝子セグメントの4個の非ヒスチジンコドンの置換であり、その置換は、ヒスチジンを、位置105、106、108、及び111で発現するように設計されている(例えば、米国特許出願公開第2013−0247234A1号及び国際特許出願公開第WO2013/138680号を参照のこと。なお、両文献は参照により、本明細書に組み込まれる)。一部の実施形態では、置換は、ヒトVκ3−20遺伝子セグメントの3個の非ヒスチジンコドンの置換であり、その置換は、ヒスチジンを、位置105、106、及び109で発現するように設計されている。更に別の追加的実施形態では、置換は、ヒトVκ3−20遺伝子セグメントの4個の非ヒスチジンコドンの置換であり、その置換は、ヒスチジンを、位置105、106、107、及び109で発現するように設計されている。一部の実施形態では、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、再配列されたヒト軽鎖可変領域ヌクレオチド配列(又は有限数のヒトVL遺伝子セグメント、例えば、2つ以上であるが野生型の数よりは少ない数のヒトVL遺伝子セグメント)を含み、ヌクレオチド配列(又は有限数のヒトVL遺伝子セグメントの少なくとも1つ)は、対応するヒト生殖系VL遺伝子セグメントによってコードされている少なくとも1つのヒスチジンコドンを含む。様々な実施形態では、本明細書に記載されるように、遺伝子改変免疫グロブリン座を含む非ヒト動物は、目的の抗原によって刺激されると、ヒトVL遺伝子セグメント由来のアミノ酸配列を含む抗原結合タンパク質を発現するが、その抗原結合タンパク質は、少なくとも1つのヒスチジン残基を、再配列されたヒト軽鎖可変領域ヌクレオチド配列(又は有限数のヒトVL遺伝子セグメントのうちの少なくとも1つ)に導入された少なくとも1つのヒスチジンコドンによってコードされているアミノ酸位置に保持している。一部の実施形態では、動物は、抗原に反応して抗原結合タンパク質の集団を発現し、集団内のそのすべての抗原結合タンパク質は、(a)ヒトVL遺伝子セグメントとJL遺伝子セグメントとの再配列に由来する免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン、及び(b)再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列によってコードされている(又は有限数のヒトVL遺伝子セグメントの1つによってコードされている)ヒト軽鎖可変ドメインを含む、免疫グロブリン軽鎖を含み、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列(又は有限数のヒトVL遺伝子セグメントの少なくとも1つ)は、対応するヒト生殖系VL遺伝子セグメントによってコードされていない1つ以上のヒスチジンコドンをコードする。
様々な実施形態が、軽鎖定常領域配列を含む。一部の実施形態では、例えば、ヒト軽鎖可変ドメインをコードする第1のヌクレオチド配列(即ち、第1のヌクレオチド配列が、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含む場合)は、重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結され、ヒト軽鎖可変ドメインをコードする第2のヌクレオチド配列(即ち、第2のヌクレオチド配列が再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変ヌクレオチド配列である場合、又は第2のヌクレオチド配列が有限数のヒトVL遺伝子セグメント、例えば、2つ以上であるが野生型の数よりは少ない数のヒトVL遺伝子セグメントを含む場合)は、軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。様々な実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列(又は有限数のヒトVL遺伝子セグメント)に作動可能に連結される軽鎖定常領域配列は、ヒトκ軽鎖定常領域配列である。一部の実施形態では、再配列された軽鎖可変領域ヌクレオチド配列(有限数のヒトVL遺伝子セグメント)に作動可能に連結された軽鎖定常領域配列は、マウスκ軽鎖定常領域配列である。一部の実施形態では、再配列された軽鎖可変領域ヌクレオチド配列(有限数のヒトVL遺伝子セグメント)に作動可能に連結された軽鎖定常領域配列は、ラットκ軽鎖定常領域配列である。一部の実施形態では、再配列された軽鎖可変領域ヌクレオチド配列(有限数のヒトVL遺伝子セグメント)に作動可能に連結された軽鎖定常領域配列は、ヒトλ軽鎖定常領域配列である。一部の実施形態では、再配列された軽鎖可変領域ヌクレオチド配列(有限数のヒトVL遺伝子セグメント)に作動可能に連結された軽鎖定常領域配列は、マウスλ軽鎖定常領域配列である。一部の実施形態では、再配列された軽鎖可変領域ヌクレオチド配列(有限数のヒトVL遺伝子セグメント)に作動可能に連結された軽鎖定常領域配列は、ラットλ軽鎖定常領域配列である。
様々な態様では、再配列された軽鎖可変ドメインをコードする、遺伝子改変免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物が提供され(例えば、免疫グロブリン遺伝子座が、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列又は制約された(限られた)数のヒトVL遺伝子セグメントを含む場合には)、再配列された軽鎖可変ドメインは、軽鎖Jセグメント(JL)配列に作動可能に連結された、軽鎖可変(VL)配列を含む。一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列(又は有限数のヒトVL遺伝子セグメント)は、非ヒト軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、非ヒト軽鎖定常領域遺伝子配列は、マウス又はラットの定常領域遺伝子配列である。一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列(又は有限数のヒトVL遺伝子セグメント)は、ヒト軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されている。
別の1つの態様では、遺伝子改変非ヒト動物と、そのような動物を作製するための方法が提供されるが、その動物は、機能性ユニバーサル軽鎖(「ULC」)免疫グロブリン遺伝子座を含むか(例えば、米国特許出願公開第2011−0195454A1号、同第2012−0021409A1号、同第2012−0192300A1号、同第2013−0045492A1号、同第2013−0185821A1号、及び同第2013−0302836A1号を参照のこと。なお、これらは、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる)又は、機能性デュアル軽鎖(「DLC」)免疫グロブリン遺伝子座を含む(例えば、米国特許出願公開第2013−0198880A1号を参照のこと。なお、これはその全体が、参照により本明細書に組み込まれる)。一部の実施形態では、そのような動物は、ヒト又は非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結された再配列されていない軽鎖可変領域遺伝子セグメント(即ち、IgM、IgG等に作動可能に連結されたヒトVL及びJL遺伝子セグメント)を更に含む。本明細書に記載の実施形態において使われる場合、ULC又はDLCは、その多様性が、主として体細胞突然変異のプロセスの結果生じる抗体可変鎖配列を生成するためにも使用され得るが、それにより、その抗原結合能力が、ポストゲノムの事象から利益を得る抗体可変鎖配列を明らかにする。
再配列されていない軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含有する高多様性ハイブリッド鎖遺伝子座、及び再配列された軽鎖可変領域配列を含有する低多様性軽鎖遺伝子座を含む非ヒト動物を作製、使用する方法
再配列されていない軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含有する高多様性ハイブリッド鎖遺伝子座、及び再配列された軽鎖可変領域配列を含有する低多様性軽鎖遺伝子座を含む非ヒト動物を作製、使用する方法
本明細書に記載の遺伝子改変非ヒト動物を作製、使用する方法を提供する。再配列したヒト軽鎖可変領域核酸配列(又は有限数、例えば2つ以上であるが野生型ヒトVL遺伝子セグメント未満の数、のヒトVL遺伝子セグメント)を、非ヒト動物ゲノム内の免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列と作動可能な連結状態で配置する方法を提供する。様々な実施形態では、定常領域核酸配列は、ヒト又は非ヒトであり、非ヒト動物は、齧歯類である。様々な実施形態では、方法は、非ヒト動物を作製する方法を含み、非ヒト動物は、ハイブリッド免疫グロブリン鎖遺伝子座、例えば、ヒト若しくは非ヒト重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結している、1つ以上のヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメント、例えば40個のヒトVκ遺伝子セグメント及び5個のヒトJκ遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン遺伝子座を更に含む。様々な態様では、方法は、例えば遺伝子導入技術を用いて、非ヒト動物、例えば齧歯類の生殖系内に上述の配列を配置することを含み、遺伝子導入技術には、例えば、宿主胚、生殖細胞(例えば卵母細胞)を有する改変多能性又は全能性ドナー細胞(例えばES細胞若しくはiPS細胞)を用いることなどを含む。したがって、実施形態には、非ヒトハイブリッド免疫グロブリン鎖遺伝子座、例えば、非ヒト生殖細胞ゲノム内の免疫グロブリン鎖遺伝子座を含み、この免疫グロブリン鎖遺伝子座は、重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されている、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含み、定常領域遺伝子配列は、非ヒト配列、ヒト配列、又はそれらの組合せを含む。一部の実施形態では、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列(又は有限数のヒトVL遺伝子セグメント)は、内因性非ヒト免疫グロブリン定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、内因性非ヒト免疫グロブリン定常領域遺伝子配列は、マウス又はラットの軽鎖定常領域遺伝子配列である。
様々な態様では、遺伝子改変免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物を作製する方法を提供し、方法は、(a)内因性機能性免疫グロブリン重鎖V、D及びJ遺伝子セグメントを欠失させるか又は非機能性にするために非ヒト動物ゲノムを改変することと、(b)ゲノム内に、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントを配置することと、を含む。そのような一態様では、非ヒト動物生殖系内の再配列された軽鎖遺伝子配列から単一の免疫グロブリン軽鎖を発現する(又は有限数、例えば2つ以上であるが野生型ヒトVL遺伝子セグメント未満の数、のヒトVL遺伝子セグメントから免疫グロブリン軽鎖を発現する)非ヒト動物を作製する方法を提供するものであり、方法は、非ヒト動物の遺伝子を改変し、その抗体発現成熟B細胞集団全体が軽鎖を発現するようにするステップを含み、この軽鎖は、(i)単一のVL遺伝子セグメント、及び(ii)単一のJL遺伝子セグメント又は(iii)有限数(例えば2つ以上であるが野生型ヒトVL遺伝子セグメント未満の数)のヒトVL遺伝子セグメントに由来する。いくつかの態様では、方法は、内因性軽鎖免疫グロブリン可変遺伝子座を不活性化するか、又は本明細書に記載の単一の再配列された軽鎖遺伝子(若しくは有限数のヒトVL遺伝子セグメント)と交換することを含む。
別の態様では、遺伝子改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む非ヒト動物を作製する方法を提供し、そのような方法は、(a)内因性機能性免疫グロブリン重鎖V、D及びJ遺伝子セグメントを欠失させるか又は非機能性にするために非ヒト動物ゲノムを改変することと、(b)ゲノム内に、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントを配置することと、を含む。一部の実施形態では、実質的にすべての内因性機能性VH、D及びJH遺伝子セグメントは、非ヒト動物の免疫グロブリン重鎖遺伝子座から欠失されるか、又は(例えば、ヌクレオチド配列(例えば、免疫グロブリン遺伝子座内の外因性ヌクレオチド配列)の挿入を介して、又は内因性VH、D、JHセグメントの非機能性再配列又は転化を介して)非機能性にされる。一部の実施形態では、方法は、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントを内因性位置(例えば、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座)に挿入することを含む。一部の実施形態では、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントは、ゲノム内の他の場所に存在する(例えば、内因性免疫グロブリン鎖遺伝子座とは異なるゲノム内の遺伝子座、又はその内因性遺伝子座内、例えば、内因性遺伝子座がゲノム内の異なる位置に位置するか又は移動している免疫グロブリン可変遺伝子座内)。一部の実施形態では、例えば、約80%以上、約85%以上、約90%以上、約95%以上、約96%以上、約97%以上、約98%以上、又は約99%以上のすべての内因性機能性V、D、若しくはJ遺伝子セグメントは、欠失されるか又は非機能性にされる。一部の実施形態では、例えば、少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%の内因性機能性重鎖V、D、若しくはJ遺伝子セグメントは、欠失されるか又は非機能性にされる。
別の態様では、遺伝子改変免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物を作製する方法を提供し、方法は、(a)内因性機能性免疫グロブリン軽鎖V及びJ遺伝子セグメントを欠失するか又は非機能性にするために非ヒト動物ゲノムを改変することと、(b)内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座内に、再配列されたヒト若しくは非ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列(即ち、再配列された軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列)、又は有限数(例えば2つ以上であるが野生型ヒトVL遺伝子セグメント未満の数)のヒト若しくは非ヒトVL遺伝子セグメントを配置することと、を含み、ヌクレオチド配列(又は有限数のヒト若しくは非ヒトVL遺伝子セグメント)は、軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結している。一部の実施形態では、遺伝子操作された免疫グロブリン遺伝子座は、非ヒト動物の生殖系ゲノム内に存在する。一部の実施形態では、再配列したヒト又は非ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列(又は有限数のヒト若しくは非ヒトVL遺伝子セグメント)は、κ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、再配列したヒト又は非ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列(又は有限数のヒト若しくは非ヒトVL遺伝子セグメント)は、マウス又はラットのκ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、再配列したヒト又は非ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列(又は有限数のヒト若しくは非ヒトVL遺伝子セグメント)は、ヒトのκ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、再配列したヒト又は非ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列(又は有限数のヒト若しくは非ヒトVL遺伝子セグメント)は、λ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、再配列したヒト又は非ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列(又は有限数のヒト若しくは非ヒトVL遺伝子セグメント)は、マウス又はラットのλ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、再配列したヒト又は非ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列(又は有限数のヒト若しくは非ヒトVL遺伝子セグメント)は、ヒトのλ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されている。
一部の実施形態では、有限数のヒト又は非ヒトVL遺伝子セグメントは、1つ以上のヒト又は非ヒトJL遺伝子セグメントに作動可能に連結している。
別の態様では、遺伝子改変免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物を作製する方法を提供し、方法は、(a)(i)内因性機能性免疫グロブリン重鎖V、D、及びJ遺伝子セグメント、並びに(ii)内因性機能性免疫グロブリン軽鎖V及びJ遺伝子セグメントを欠失させるか又は非機能性にするために非ヒト動物ゲノムを改変することと、(b)ゲノム内に、(i)再配列された軽鎖可変ドメインをコードする第1のヌクレオチド配列(例えば、第1のヌクレオチド配列は、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列であるか、又は第1のヌクレオチド配列は、有限数、例えば、2つ以上であるが野生型ヒトVL遺伝子セグメント未満の数、のヒトVL遺伝子セグメントを含有し、第1のヌクレオチド配列は、軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結している)、及び(ii)ヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインをコードする第2のヌクレオチド配列(即ち、第2のヌクレオチド配列は、再配列したヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列である)を配置することと、を含み、第2のヌクレオチド配列は、1つ以上の重鎖定常領域遺伝子を含む重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結しており、各重鎖定常領域遺伝子配列は、機能性CH1ドメインをコードする配列を含み、例えば、少なくともインタクトなIgμ遺伝子、並びにインタクトなIgδ遺伝子、インタクトなIgγ遺伝子、インタクトなIgε遺伝子、及びインタクトなIgα遺伝子のうちの少なくとも1つを含む。一部の実施形態では、遺伝子操作された免疫グロブリン遺伝子座は、非ヒト動物の生殖系ゲノム内に存在する。一部の実施形態では、再配列した軽鎖可変領域をコードする(又は有限数のヒトVL遺伝子セグメントを含有する)第1のヌクレオチド配列は、κ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、再配列した軽鎖可変領域をコードする(又は有限数のヒトVL遺伝子セグメントを含有する)第1のヌクレオチド配列は、マウス又はラットのκ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、再配列した軽鎖可変ドメインをコードする(又は有限数のヒトVL遺伝子セグメントを含有する)第1のヌクレオチド配列は、ヒトのκ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、再配列した軽鎖可変ドメインをコードする(又は有限数のヒトVL遺伝子セグメントを含有する)第1のヌクレオチド配列は、λ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、再配列した軽鎖可変ドメインをコードする(又は有限数のヒトVL遺伝子セグメントを含有する)第1のヌクレオチド配列は、マウス又はラットのλ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、再配列した軽鎖可変ドメインをコードする(又は有限数のヒトVL遺伝子セグメントを含有する)第1のヌクレオチド配列は、ヒトのλ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、ヒトの免疫グロブリン軽鎖可変ドメインはκ軽鎖可変ドメインである。したがって、一部の実施形態では、第2のヌクレオチド配列は、ヒトκ軽鎖可変領域ヌクレオチド配列である。一部の実施形態では、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインは、λ軽鎖可変ドメインである。したがって、一部の実施形態では、第2のヌクレオチド配列は、ヒトλ軽鎖可変領域ヌクレオチド配列である。一部の実施形態では、重鎖定常領域遺伝子配列は、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列である。一部の実施形態では、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列は、マウス又はラットの重鎖定常領域遺伝子配列である。一部の実施形態では、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列は、インタクトなIgμ遺伝子、インタクトなIgδ遺伝子、インタクトなIgγ遺伝子、インタクトなIgα遺伝子、及び/又はインタクトなIgε遺伝子を含む。
非ヒト動物を作製する方法を提供し、方法は、(a)(i)内因性免疫グロブリン重鎖VH、D、及び/又はJH遺伝子セグメント、並びに(ii)内因性免疫グロブリン軽鎖V及びJ遺伝子セグメントを欠失させるか又は非機能性にするために非ヒト動物ゲノムを改変することと、(b)(i)再配列された軽鎖可変領域ヌクレオチド配列(若しくは有限数、例えば、2つ以上であるが野生型ヒトVL遺伝子セグメント未満の数、のヒトVL遺伝子セグメント)を軽鎖遺伝子座に配置し(再配列された軽鎖可変領域ヌクレオチド配列(若しくは有限数のヒトVL遺伝子セグメント)は、軽鎖J遺伝子セグメント(JL)配列に作動可能に連結した軽鎖V遺伝子セグメント(VL)配列を含む)、(ii)1つ以上の再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント(例えば、40個のヒトVκ遺伝子セグメント及び少なくとも1つのヒトJκ遺伝子セグメント)を重鎖遺伝子座に配置することと、を含み、これにより、遺伝子セグメントが、1つ以上の重鎖定常領域遺伝子を含むヒト若しくは非ヒト重鎖定常領域ヌクレオチド配列に作動可能に連結するようにし、各重鎖定常領域遺伝子配列は、機能性CH1ドメインをコードする配列を含み、例えば、インタクトなIgμ遺伝子、インタクトなIgδ遺伝子、インタクトなIgγ遺伝子、インタクトなIgε遺伝子、及び/又はインタクトなIgα遺伝子を含む。一部の実施形態では、再配列された軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、対応するヒト生殖系軽鎖可変遺伝子セグメントによってはコードされない1つ以上のヒスチジンコドンをコードする。
いくつかの態様では、遺伝子改変免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物を作製する方法を提供し、方法は、(a)内因性免疫グロブリン軽鎖V及びJ遺伝子セグメントを欠失させるか又は非機能性にするために非ヒト動物ゲノムを改変することと、(b)非ヒト動物ゲノム内に、再配列されたヒト若しくは非ヒト軽鎖可変領域ヌクレオチド配列(又は有限数のヒト若しくは非ヒトVL遺伝子セグメント)を、軽鎖定常領域ヌクレオチド配列に作動可能に連結した状態で配置することと、を含む。
様々な実施形態では、非ヒト動物は、齧歯類、例えばマウス、ラット又はハムスターである。一部の実施形態では、この齧歯類はマウスである。一部の実施形態では、軽鎖定常領域は、ラット又はマウス定常領域、例えば、ラット又はマウスCκ定常領域である。
別の態様では、遺伝子改変免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物を作製する方法を提供し、方法は、(a)(i)内因性免疫グロブリン重鎖V、D、及び/又はJ遺伝子セグメント、及び(ii)内因性免疫グロブリン軽鎖V及びJ遺伝子セグメントを欠失させるか又は非機能性にするために非ヒト動物ゲノムを改変することと、(b)非ヒト動物ゲノム内に、(i)再配列された軽鎖可変ドメインをコードする第1のヌクレオチド配列(例えば、第1のヌクレオチド配列は、再配列されたヒト若しくは非ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列であるか、又は第1のヌクレオチド配列は、有限数、例えば、2つ以上であるが野生型ヒトVL遺伝子セグメント未満の数、のヒトVL遺伝子セグメントを含有し、第1のヌクレオチド配列は、軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結している)を配置し、(ii)ヒト若しくは非ヒト軽鎖可変ドメインをコードする第2のヌクレオチド配列(即ち、第2のヌクレオチド配列は、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列である)を配置することと、を含み、第2のヌクレオチド配列は、重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結している。一部の実施形態では、重鎖定常領域遺伝子配列は、インタクトなIgμ遺伝子、インタクトなIgδ遺伝子、インタクトなIgγ遺伝子、インタクトなIgα遺伝子、及び/又はインタクトなIgε遺伝子を含む。
様々な実施形態では、非ヒト動物は、齧歯類、例えばマウス、ラット又はハムスターである。一部の実施形態では、この齧歯類はマウスである。一部の実施形態では、軽鎖定常領域は、ラット又はマウス定常領域、例えば、ラット又はマウスCκ定常領域である。一部の実施形態では、第2のヌクレオチド配列は、CH1、ヒンジ、CH2、CH3、又はそれらの組合せをコードするヌクレオチド配列を含むマウス又はラット重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結している。一部の実施形態では、第2のヌクレオチド配列は、CH1、ヒンジ、CH2、CH3、又はそれらの組合せをコードするヌクレオチド配列を含むヒト重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結している。
別の態様では、遺伝子改変免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物を作製する方法を提供し、方法は、(a)(i)内因性免疫グロブリン重鎖V、D、及び/又はJ遺伝子セグメント、並びに(ii)内因性免疫グロブリン軽鎖V及びJ遺伝子セグメントを欠失させるか又は非機能性にするために非ヒト動物ゲノムを改変することと、(b)非ヒト動物ゲノム内に、(i)軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結している、再配列された軽鎖可変ドメインをコードする第1のヌクレオチド配列を含む第1の対立遺伝子を配置し(例えば、第1のヌクレオチド配列は、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列であるか、又は第1のヌクレオチド配列は、有限数、例えば2つ以上であるが野生型ヒトVL遺伝子セグメント未満の数、のヒトVL遺伝子セグメントを含有する)、(ii)重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結している、軽鎖可変ドメインをコードする第2のヌクレオチド配列を含む第2の対立遺伝子を配置すること(即ち、第2のヌクレオチド配列は、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列である)と、を含む。
別の態様では、遺伝子改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座(例えば、ハイブリッド免疫グロブリン鎖遺伝子座)及び改変免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含む非ヒト動物を作製する方法を提供し、方法は、(a)内因性免疫グロブリン重鎖V、D、及び/又はJ遺伝子セグメントを欠失させるか又は非機能性にするために非ヒト動物ゲノムを改変することと、(b)非ヒト動物の内因性重鎖遺伝子座内に、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントを重鎖定常領域と作動可能に連結した状態で配置することであって、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントは、ヒトVκ及びヒトJκ遺伝子セグメントを含む、配置することと、(c)内因性免疫グロブリン軽鎖V及び/又はJ遺伝子セグメントを欠失させるか又は非機能性にするために非ヒト動物ゲノムを改変することと、(d)非ヒト動物の内因性軽鎖遺伝子座内に、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列(又は有限数、例えば2つ以上であるが野生型ヒトVL遺伝子セグメント未満の数、のヒトVL遺伝子セグメント)を軽鎖定常領域と作動可能に連結した状態で配置することと、を含み、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列(又は有限数のヒトVL遺伝子セグメント)は、再配列されたヒトVκJκ配列(又は2、3、若しくは4ヒトVL遺伝子セグメント)を含む。一部の実施形態では、再配列されたヒトVκJκ配列は、ヒトVκ1−39Jκ5配列(例えば、配列番号1に示す)である。一部の実施形態では、再配列されたヒトVκJκ配列は、ヒトVκ3−20Jκ1配列(例えば、配列番号2に示す)である。一部の実施形態では、有限数のヒトVL遺伝子セグメントは、ヒトVκ1−39遺伝子セグメント及びヒトVκ3−20遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、重鎖定常領域遺伝子配列は、インタクトなIgμ遺伝子、インタクトなIgδ遺伝子、インタクトなIgγ遺伝子、インタクトなIgα遺伝子、及び/又はインタクトなIgε遺伝子を含む。
様々な実施形態では、非ヒト動物は、齧歯類、例えばマウス、ラット又はハムスターである。一部の実施形態では、この齧歯類はマウスである。一部の実施形態では、軽鎖定常領域は、ラット又はマウス定常領域、例えば、ラット又はマウスCκ定常領域である。一部の実施形態では、再配列されていないヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメントは、CH1、ヒンジ、CH2、CH3、又はそれらの組合せをコードするヌクレオチド配列を含むマウス又はラット重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結している。一部の実施形態では、再配列されていない軽鎖可変領域遺伝子セグメントは、CH1、ヒンジ、CH2、CH3、又はそれらの組合せをコードするヌクレオチド配列を含むヒト重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結している。一部の実施形態では、再配列されていない軽鎖可変領域遺伝子セグメントは、CH1、ヒンジ、CH2、CH3ドメインのそれぞれをコードするヌクレオチド配列を含むヒト重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結している。
別の態様では、遺伝子改変免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物を作製する方法を提供し、方法は、(a)(i)内因性免疫グロブリン重鎖V、D、及び/又はJ遺伝子セグメント、並びに(ii)内因性免疫グロブリン軽鎖V及びJ遺伝子セグメントを欠失させるか又は非機能性にするために非ヒト動物ゲノムを改変することと、(b)非ヒト動物ゲノム内に、(i)再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列(又は有限数、例えば2つ以上であるが野生型ヒトVL遺伝子セグメント未満の数、のヒトVL遺伝子セグメント)を軽鎖定常領域ヌクレオチド配列に作動可能に連結した状態で配置し、(ii)1つ以上のヒト免疫グロブリン軽鎖可変VL及びJL遺伝子セグメントを重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結した状態で配置することと、を含み、重鎖定常領域核酸配列は、1つ以上の重鎖定常領域遺伝子を含み、各重鎖定常領域遺伝子配列は、機能性CH1ドメインをコードする配列を含み、例えば、インタクトなIgμ遺伝子、インタクトなIgδ遺伝子、インタクトなIgγ遺伝子、インタクトなIgε遺伝子、及び/又はインタクトなIgα遺伝子を含む。
様々な実施形態では、非ヒト動物は、齧歯類、例えばマウス、ラット又はハムスターである。一部の実施形態では、この齧歯類はマウスである。一部の実施形態では、軽鎖定常領域は、ラット又はマウス定常領域、例えば、ラット又はマウスCκ定常領域である。
別の態様では、再配列された軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を提供する。一部の実施形態では、核酸配列は、ヒトVκ及びJκ遺伝子セグメントに由来する。一部の実施形態では、核酸配列は、ヒト生殖系Vκセグメント及びヒト生殖系Jκセグメントに由来する。一部の実施形態では、ヒトVκセグメントは、ヒト集団内の観察された変異体に対応する。様々な実施形態では、核酸配列は、Vκ1−5、Vκ1−6、Vκ1−8、Vκ1−9、Vκ1−12、Vκ1−13、Vκ1−16、Vκ1−17、Vκ1−22、Vκ1−27、Vκ1−32、Vκ1−33、Vκ1−35、Vκ1−37、Vκ1−39、Vκ1D−8、Vκ1D−12、Vκ1D−13、Vκ1D−16、Vκ1D−17、Vκ1D−22、Vκ1D−27、Vκ1D−32、Vκ1D−33、Vκ1D−35、Vκ1D−37、Vκ1D−39、Vκ1D−42、Vκ1D−43、Vκ1−NL1、Vκ2−4、Vκ2−10、Vκ2−14、Vκ2−18、Vκ2−19、Vκ2−23、Vκ2−24、Vκ2−26、Vκ2−28、Vκ2−29、Vκ2−30、Vκ2−36、Vκ2−38、Vκ2−40、Vκ2D−10、Vκ2D−14、Vκ2D−18、Vκ2D−19、Vκ2D−23、Vκ2D−24、Vκ2D−26、Vκ2D−28、Vκ2D−29、Vκ2D−30、Vκ2D−36、Vκ2D−38、Vκ2D−40、Vκ3−7、Vκ3−11、Vκ3−15、Vκ3−20、Vκ3−25、Vκ3−31、Vκ3−34、Vκ3D−7、Vκ3D−7、Vκ3D−11、Vκ3D−15、Vκ3D−15、Vκ3D−20、Vκ3D−25、Vκ3D−31、Vκ3D−34、Vκ3−NL1、Vκ3−NL2、Vκ3−NL3、Vκ3−NL4、Vκ3−NL5、Vκ4−1、Vκ5−2、Vκ6−21、Vκ6D−21、Vκ6D−41、及びVκ7−3、並びにそれらの多形変異体からなる群から選択されるヒトVκ遺伝子を含む。一部の実施形態では、核酸配列は、CH1、ヒンジ、CH2、CH3、及びそれらの組合せをコードするヌクレオチド配列から選択されるヒト又は非ヒト動物重鎖定常領域遺伝子配列を更に含む。特定の実施形態では、核酸は、CH1、ヒンジ、CH2、及びCH3をコードするヌクレオチド配列を含む定常領域遺伝子配列を含む。様々な実施形態では、核酸配列は、Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4、Jκ5、及びそれらの多形変異体からなる群から選択されるヒトJκ遺伝子セグメントを含む。
別の態様では、本明細書に記載の再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列(例えば、再配列されていないヒトVL及びJL遺伝子セグメントを含有するヌクレオチド配列)を含む核酸構築物を提供する。一部の実施形態では、核酸構築物は、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列がヒト若しくは非ヒト動物重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結するように設計し、ヒト若しくは非ヒト動物重鎖定常領域遺伝子配列は、1つ以上の重鎖定常領域遺伝子を含み、各重鎖定常領域遺伝子配列は、機能性CH1ドメインをコードする配列を含み、例えば、インタクトなIgμ遺伝子、インタクトなIgδ遺伝子、インタクトなIgγ遺伝子、インタクトなIgε遺伝子、及び/又はインタクトなIgα遺伝子を含む。一部の実施形態では、核酸構築物は、重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結した、2、3、4つ又はそれ超の再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含有する。一部の実施形態では、重鎖定常領域遺伝子配列は、インタクトなIgμ遺伝子、インタクトなIgδ遺伝子、インタクトなIgγ遺伝子、インタクトなIgα遺伝子、及び/又はインタクトなIgε遺伝子を含む。一部の実施形態では、核酸構築物は標的ベクターである。一部の実施形態では、標的ベクターは、Adam6a遺伝子、Adam6b遺伝子、又は両方を含み、Adam6a/6b遺伝子の欠失に関連する受精問題を防止するようにする(例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第8,642,835号を参照)。一部の実施形態では、Adam6a及びAdam6b遺伝子は、再配列されていないヒト軽鎖遺伝子セグメントの転写単位の5’上流に配置される。一部の実施形態では、標的ベクターは、組み換え部位に隣接する選択カセットを含む。一部の実施形態では、標的ベクターは、1つ以上の部位特異的組み換え部位(例えば、loxP又はFRT部位)を含む。
別の態様では、重鎖可変領域アミノ酸配列とは独立に抗原を結合することができる軽鎖可変領域(VL/CHxULC)アミノ酸配列を得る方法を提供し、方法は、(a)本明細書に記載の遺伝子改変非ヒト動物を、目的の抗原により免疫化することであって(例えば、遺伝子改変動物は、そのゲノムが、重鎖定常領域遺伝子と作動可能に連結している、再配列されていないヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメント、及び軽鎖定常領域遺伝子と作動可能に連結している、再配列されたヒト若しくは非ヒト軽鎖可変領域ヌクレオチド配列(又は有限数のヒト若しくは非ヒトVL遺伝子セグメント)を含む)、非ヒト動物は、抗原に対する免疫応答を開始する、免疫化することと、(b)遺伝子改変非ヒト動物の細胞(例えば、B細胞)からの抗原を特異的に結合する軽鎖可変ドメインの再配列された軽鎖(VJ)核酸配列を得ることと、を含む。様々な実施形態では、そのような方法により生成した軽鎖可変領域を提供する。
いくつかの態様では、免疫グロブリン軽鎖可変領域(VL/CHxULC)ドメインをコードする核酸配列を得る方法は、(a)任意選択で、目的の抗原又はその免疫原により非ヒト動物を免疫化することであって、非ヒト動物は、そのゲノム内に、(i)1つ以上の重鎖定常領域遺伝子を含む重鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結した、再配列されていないヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメント(各重鎖定常領域遺伝子配列は、機能性CH1ドメインをコードする配列を含み、例えばインタクトなIgμ遺伝子、インタクトなIgδ遺伝子、インタクトなIgγ遺伝子、インタクトなIgε遺伝子、及び/又はインタクトなIgα遺伝子を含む)、及び(ii)軽鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結した、再配列されたヒト若しくは非ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列(又は有限数のヒト若しくは非ヒトVL遺伝子セグメント)を含む、免疫化することと、(b)非ヒト動物に免疫応答を開始させることと、(c)免疫化した非ヒト動物から、目的の抗原を結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、(d)細胞から、目的の抗原を結合する軽鎖可変ドメイン(VL/CHxULCドメイン)をコードする核酸配列を得ることと、を含む。一部の実施形態では、重鎖定常領域遺伝子配列は、マウス又はラット重鎖定常領域遺伝子配列である。一部の実施形態では、重鎖定常領域遺伝子配列は、ヒト重鎖定常領域遺伝子配列である。一部の実施形態では、遺伝子改変遺伝子座によって発現された再配列された軽鎖可変ドメインは、非ヒト動物に対し自己反応性ではない、即ち、非免疫原性である。一部の実施形態では、非ヒト動物は、そのゲノム内に1つ以上の(例えば、6、16、30又は40個の)再配列されていないヒトVL遺伝子セグメント及び1つ以上の(例えば、5個の)ヒトJL遺伝子セグメントを含む。一部の特定の実施形態では、再配列されていないヒトVL及びJL遺伝子セグメントは、Vκ及びJκ遺伝子セグメントである。一部の実施形態では、単離ステップ(c)は、蛍光活性化細胞選別(FACS)又はフローサイトメトリーを介して実行する。一部の実施形態では、目的の抗原を結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞は、リンパ球である。一部の実施形態では、リンパ球は、ナチュラルキラー細胞、T細胞、又はB細胞を含む。一部の実施形態では、方法は、リンパ球を癌細胞と融合するステップ(c)’を更に含む。一部の実施形態では、この癌細胞は骨髄腫細胞である。
したがって、様々な態様では、重鎖可変ドメインとは独立に抗原を結合することができる免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン(VL/CHxULC)をコードする核酸配列を得る方法を提供し、方法は、(a)任意選択で、目的の抗原又はその免疫原により非ヒト動物を免疫化することであって、非ヒト動物は、そのゲノム内に(i)軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結している、再配列されたヒト若しくは非ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列(又は有限数のヒト若しくは非ヒトVL遺伝子セグメント)、及び(ii)重鎖定常領域ヌクレオチド配列に作動可能に連結している、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント(VL及びJL)を含む、免疫化することと、(b)非ヒト動物に免疫応答を開始させることと、(c)免疫化した非ヒト動物から、抗原を結合することができる軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、(d)細胞から、抗原を結合することができる軽鎖可変ドメイン(VL/CHxULCドメイン)をコードする核酸配列を得ることと、を含む。
一部の実施形態では、単離ステップ(c)は、蛍光活性化細胞選別(FACS)又はフローサイトメトリーを介して実行する。一部の実施形態では、抗原を結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞は、リンパ球である。特定の実施形態では、リンパ球は、ナチュラルキラー細胞、T細胞、又はB細胞を含む。一部の実施形態では、方法は、リンパ球を癌細胞と融合するステップ(c)’を更に含む。特定の実施形態では、この癌細胞は骨髄腫細胞である。一部の実施形態では、(d)の核酸配列は、免疫グロブリン定常領域核酸配列をコードする核酸配列と融合させる。一部の実施形態では、軽鎖定常領域核酸配列は、ヒトκ配列又はヒトλ配列である。一部の実施形態では、軽鎖定常領域核酸配列は、マウスκ配列又はマウスλ配列である。一部の実施形態では、軽鎖定常領域核酸配列は、ラットκ配列又はラットλ配列である。一部の実施形態では、重鎖定常領域核酸配列は、1つ以上の重鎖定常領域遺伝子を含むヒト配列であり、各重鎖定常領域遺伝子配列は、機能性CH1ドメインをコードする配列を含み、例えば、インタクトなIgμ遺伝子、インタクトなIgδ遺伝子、インタクトなIgγ遺伝子、インタクトなIgε遺伝子、及び/又はインタクトなIgα遺伝子を含む。一部の実施形態では、重鎖定常領域核酸配列は、1つ以上の重鎖定常領域遺伝子を含むマウス又はラット配列であり、各重鎖定常領域遺伝子配列は、機能性CH1ドメインをコードする配列を含み、例えば、インタクトなIgμ遺伝子、インタクトなIgδ遺伝子、インタクトなIgγ遺伝子、インタクトなIgε遺伝子、及び/又はインタクトなIgα遺伝子を含む。一部の実施形態では、(d)の核酸配列は、動物ゲノム内の再配列されていないVL遺伝子セグメントに由来する1つ以上のヒスチジンコドンの置換又は挿入を含む。
いくつかの態様では、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン(VL/CHxULC)をコードする核酸配列を得る方法を提供し、方法は、(a)任意選択で、目的の抗原により本明細書に記載の遺伝子改変免疫グロブリン遺伝子座を含有する非ヒト動物を免疫化することであって、非ヒト動物は、そのゲノム内に、軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結している、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域核酸配列(又は有限数のヒトVL遺伝子セグメント)、及び1つ以上の重鎖定常領域遺伝子を含む重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結している、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含み、各重鎖定常領域遺伝子配列は、機能性CH1ドメインをコードする配列を含み、例えば、インタクトなIgμ遺伝子、インタクトなIgδ遺伝子、インタクトなIgγ遺伝子、インタクトなIgε遺伝子、及び/又はインタクトなIgα遺伝子を含む、免疫化することと、(b)非ヒト動物に免疫応答を開始させることと、(c)免疫化した非ヒト動物からリンパ球(例えば、B細胞)を収集することと、(d)ハイブリドーマ細胞を生成するためにリンパ球と骨髄腫細胞とを融合することと、(e)ハイブリドーマ細胞から、抗原を結合することができる軽鎖可変ドメイン(VL/CHxULCドメイン)をコードする核酸配列を得ることと、を含む。
別の態様では、免疫グロブリン軽鎖可変領域(VL/CHxULC)アミノ酸配列を得る方法を提供し、方法は、(a)任意選択で、目的の抗原により本明細書に記載の遺伝子改変免疫グロブリン遺伝子座を含有する非ヒト動物を免疫化することであって、非ヒト動物は、そのゲノム内に、(i)再配列された軽鎖可変ドメインをコードする第1のヌクレオチド配列(即ち、第1のヌクレオチド配列は、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列であるか、又は第1のヌクレオチド配列は、有限数、例えば2つ以上であるが野生型ヒトVL遺伝子セグメント未満の数、のヒトVL遺伝子セグメントを含有し、第1のヌクレオチド配列は、軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結している)、及び(ii)ヒト若しくは非ヒト軽鎖可変ドメインをコードする第2のヌクレオチド配列(即ち、第2のヌクレオチド配列は、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変ヌクレオチド配列であり、第2のヌクレオチド配列は、1つ以上の重鎖定常領域遺伝子を含む重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結しており、各重鎖定常領域遺伝子配列は、機能性CH1ドメインをコードする配列を含み、例えば、インタクトなIgμ遺伝子、インタクトなIgδ遺伝子、インタクトなIgγ遺伝子、インタクトなIgε遺伝子、及び/又はインタクトなIgα遺伝子を含む)を含む、免疫化することと、(b)非ヒト動物に免疫応答を開始させることと、(c)免疫化した非ヒト動物からリンパ球(例えば、B細胞)を収集することと、(d)ハイブリドーマ細胞を生成するためにリンパ球と骨髄腫細胞とを融合することと、(e)ハイブリドーマ細胞から、抗原を結合することができる軽鎖可変ドメイン(VLドメイン)をコードする核酸配列を得ることと、を含む。
別の態様では、免疫グロブリンハイブリッド鎖の免疫グロブリン軽鎖可変領域(VL/CHxULC)核酸配列を得る方法を提供し、方法は、(a)任意選択で、目的の抗原により本明細書に記載の遺伝子改変免疫グロブリン遺伝子座を含有する非ヒト動物を免疫化することであって、非ヒト動物は、そのゲノム内に、(i)軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結している、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域核酸配列(又は有限数、例えば2つ以上であるが野生型ヒトVL遺伝子セグメント未満の数、のヒトVL遺伝子セグメント)、及び(ii)1つ以上の(例えば、6、16、30、40若しくはそれ超の)再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント(VL及びJL)を含む、免疫化することと、(b)非ヒト動物に免疫応答を開始させることと、(c)重鎖可変領域とは独立に抗原を結合するVL/CHxULCアミノ酸配列を発現する免疫化非ヒト動物からリンパ球(例えば、B細胞)を同定することと、(d)(c)のリンパ球から(c)のVL/CHxULCアミノ酸配列をコードする核酸配列をクローニングすることと、を含む。
追加の態様では、本明細書に記載の方法のいずれかにより入手可能な遺伝子改変免疫グロブリン遺伝子座を提供する。様々な実施形態では、本明細書に記載の方法により生成した軽鎖可変領域、及びそのような軽鎖可変領域をコードする核酸配列も提供する。
いくつかの態様では、非ヒト動物の生殖細胞系ゲノム内の免疫グロブリン重鎖(例えば、ハイブリッド免疫グロブリン鎖遺伝子座)及び軽鎖遺伝子座を提供し、前記軽鎖遺伝子座は、(1)軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結している、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列(又は有限数のヒトVL遺伝子セグメント)を含み、前記重鎖遺伝子座(例えば、ハイブリッド免疫グロブリン鎖遺伝子座)は、(2)重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結している、再配列していないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を含み、重鎖定常領域遺伝子配列は、1つ以上の重鎖定常領域遺伝子を含み、各重鎖定常領域遺伝子配列は、機能性CH1ドメインをコードする配列を含み、例えば、インタクトなIgμ遺伝子、インタクトなIgδ遺伝子、インタクトなIgγ遺伝子、インタクトなIgε遺伝子、及び/又はインタクトなIgα遺伝子を含む。一部の実施形態では、軽鎖定常領域遺伝子配列は、κ軽鎖定常領域遺伝子配列である。一部の実施形態では、軽鎖定常領域遺伝子配列は、λ軽鎖定常領域遺伝子配列である。一部の実施形態では、軽鎖定常領域遺伝子配列は、マウス又はラット軽鎖定常領域遺伝子配列である。一部の実施形態では、再配列された軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、κ軽鎖可変領域遺伝子配列である。一部の実施形態では、再配列された軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、λ軽鎖可変領域遺伝子配列である。一部の実施形態では、再配列された軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、マウス又はラット軽鎖可変領域遺伝子配列である。一部の実施形態では、重鎖定常領域遺伝子配列は、インタクトなIgμ遺伝子、インタクトなIgδ遺伝子、インタクトなIgγ遺伝子、インタクトなIgα遺伝子、及び/又はインタクトなIgε遺伝子を含む。
様々な実施形態では、有限数のヒト又は非ヒトVL遺伝子セグメントは、2つのヒト又は非ヒトVL遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、2つのヒト又は非ヒトVL遺伝子セグメントは、1つ以上、又は5つのヒト又は非ヒトJL遺伝子セグメントに作動可能に連結している。一部の実施形態では、有限数のヒト又は非ヒトVL遺伝子セグメントは、2つのVκ遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、2つのVκ遺伝子セグメントは、1つ以上、又は5つのJκ遺伝子セグメントに作動可能に連結している。
抗原結合タンパク質
抗原結合タンパク質
追加の態様は、本明細書に記載の遺伝子改変非ヒト動物により作製した抗原結合タンパク質(例えば抗体)を含む。同様に、本明細書に記載の遺伝子改変非ヒト動物に由来するか若しくはこれにより生成した(即ち、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントから発現した)軽鎖可変領域(VL/CHxULC)配列を有する抗原結合タンパク質(例えば、組み換え抗体)も提供する。一部の実施形態では、本明細書に記載の抗原結合タンパク質は、10−6、10−7、10−8、10−9又は10−10未満の親和性(KD)で、目的の抗原を特異的に結合することができる免疫グロブリン軽鎖を含む。一部の実施形態では、方法により生成した免疫グロブリン軽鎖は、重鎖可変領域の不在下、10−6、10−7、10−8、10−9、又は10−10未満の親和性(KD)で、目的の抗原を特異的に結合することができる。
様々な実施形態では、本明細書に記載のように生成した軽鎖可変ドメインは、標的分子(「T」)を特異的に結合する。1つの実施形態では、標的分子は、あらゆるタンパク質、ポリペプチド、又は活性若しくは細胞外濃度を減衰、低減若しくは除去することが望ましい他の巨大分子である。多くの例では、軽鎖可変領域が結合する標的分子は、タンパク質又はポリペプチド(即ち、「標的タンパク質」)である。しかし、標的分子(「T」)が、炭水化物、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、リポ多糖、又は軽鎖可変領域が結合する他の非タンパク質ポリマー若しくは分子である実施形態も提供する。様々な実施形態では、Tは、細胞表面発現標的タンパク質又は可溶性標的タンパク質とすることができる。抗原結合分子による標的結合は、細胞外又は細胞表面の状況で生じさせることができる。しかし、一部の実施形態では、抗原結合分子は、細胞内部、例えば、小胞体、ゴルジ、エンドソーム、リソソームなどの細胞内成分内で標的分子を結合する。細胞表面発現標的分子の例には、細胞表面発現受容体、膜結合リガンド、イオンチャンネル、及び細胞膜に付着若しくは会合する細胞外部分を有するあらゆる他の単量体若しくは多量体ポリペプチド成分を含む。
別の態様では、重鎖可変ドメインとは独立に抗原を結合することができる免疫グロブリン軽鎖可変VL/CHxULCドメインを含む抗原結合タンパク質を作製する方法を提供する。そのような方法は、(a)任意選択で、エピトープ若しくはその免疫原性部分を含む抗原により遺伝子改変非ヒト動物を免疫化することであって、非ヒト動物は、そのゲノム内に、(i)軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結している、再配列されたヒト軽鎖可変領域核酸配列(若しくは有限数、例えば、2つ以上であるが野生型ヒトVL遺伝子セグメント未満の数、のヒトVL遺伝子セグメント)、及び(ii)免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結している、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント(VL及びJL)を含む、免疫化することと、(b)非ヒト動物にエピトープ又はその免疫原性部分への免疫応答を開始させることと、(c)非ヒト動物から、エピトープ若しくはその免疫原性部分を特異的に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、及び/又は(d)(c)の細胞から、エピトープ又はその免疫原性部分を特異的に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を得ることと、(e)ヒト重鎖定常領域核酸配列に融合した発現構築物内、例えば、1つ以上の重鎖定常領域遺伝子を含むヒト免疫グロブリン定常領域核酸配列内で(d)の核酸配列を用いることと、を含み、各重鎖定常領域遺伝子配列は、機能性CH1ドメインをコードする配列を含み、例えば、インタクトなIgμ遺伝子、インタクトなIgδ遺伝子、インタクトなIgγ遺伝子、インタクトなIgε遺伝子、及び/又はインタクトなIgα遺伝子を含む。
一部の実施形態では、再配列されていないヒト軽鎖VL又はJL遺伝子セグメントの少なくとも1つは、対応するヒト生殖細胞系軽鎖可変遺伝子セグメントによってはコードされない、1つ以上のヒスチジンコドンをコードする。一部の実施形態では、再配列されたヒト軽鎖可変領域核酸配列(又は有限数のヒトVL遺伝子セグメントの少なくとも1つ)は、対応するヒト生殖系軽鎖可変遺伝子セグメントによってはコードされない1つ以上のヒスチジンコドンをコードする。一部の実施形態では、エピトープは、細胞表面受容体に由来する。
一部の実施形態では、ヒト軽鎖VL又はJL遺伝子セグメントの少なくとも1つは、対応するヒト生殖細胞系軽鎖可変遺伝子セグメントによってはコードされない1つ以上のヒスチジンコドンをコードする。
本明細書全体を通して明らかであるように、一部の実施形態では、提供するタンパク質可変ドメインは、免疫グロブリン型可変ドメインであるか又はそれらを含む(例えば、免疫グロブリン可変ドメインであるか又はそれらを含む)。一部の実施形態では、提供するタンパク質可変ドメインは、重鎖可変ドメインであるか又はそれらを含む。一部の実施形態では、提供するタンパク質可変ドメインは、軽鎖可変ドメインであるか又はそれらを含む。
当業者は、本明細書を読めば、様々な技術のいずれかを利用して、重鎖可変ドメインとは独立に抗原を結合することができる軽鎖を含む抗原結合タンパク質を生成、発生及び/又は構築できることは容易に了解するであろう。本明細書に記載する一部の実施形態では、生成する抗原結合タンパク質は、図19に示す抗原結合タンパク質を含む。これらの抗原結合タンパク質は、本明細書に記載する非ヒト動物内で生成される可変ドメインを含み、これらの可変ドメインをコードする配列を含む核酸配列は、細胞株内で同時発現させ、抗原結合タンパク質を生成する。
遺伝子改変非ヒト細胞及び胚
遺伝子改変非ヒト細胞及び胚
様々な態様では、様々なゲノム改変を含む非ヒト動物に由来する多能性細胞、誘導多能性、又は全能性幹細胞を本明細書で提供する。一部の実施形態では、多能性又は全能性細胞は、非ヒト動物に由来する。一部の実施形態では、非ヒト動物は、齧歯類、例えばマウス、ラット又はハムスターである。一部の実施形態では、この齧歯類はマウスである。特定の実施形態において、多能性細胞は、胚性幹(ES)細胞である。一部の実施形態では、多能性細胞は、そのゲノム内に、(i)軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結している、再配列されたヒト若しくは非ヒト軽鎖可変領域核酸配列(又は有限数、例えば2つ以上であるが野生型ヒト若しくは非ヒトVL遺伝子セグメント未満の数、のヒト若しくは非ヒトVL遺伝子セグメント)を含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座、及び(ii)重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結している、1つ以上の再配列されていないヒト免疫グロブリンVL及びJL遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座(例えば、ハイブリッド免疫グロブリン鎖遺伝子座)を含み、重鎖定常領域核酸配列は、1つ以上の重鎖定常領域遺伝子を含み、各重鎖定常領域遺伝子配列は、機能性CH1ドメインをコードする配列を含み、例えば、インタクトなIgμ遺伝子、インタクトなIgδ遺伝子、インタクトなIgγ遺伝子、インタクトなIgε遺伝子、及び/又はインタクトなIgα遺伝子を含む。一部の実施形態では、重鎖定常領域遺伝子配列は、インタクトなIgμ遺伝子、インタクトなIgδ遺伝子、インタクトなIgγ遺伝子、インタクトなIgα遺伝子、及び/又はインタクトなIgε遺伝子を含む。特定の実施形態では、多能性、誘導多能性、又は全能性幹細胞は、マウス又はラット胚性幹(ES)細胞である。一部の実施形態では、多能性、誘導多能性、又は全能性幹細胞は、XX核型又はXY核型を有する。
本明細書に記載の遺伝子改変、例えば、前核注入によって細胞に導入される改変、を含有する核を含む細胞も提供する。別の態様では、本明細書に記載の非ヒト動物細胞に由来するハイブリドーマ又はクアドローマを提供する。一部の実施形態では、非ヒト動物は、マウス、ラット又はハムスターなどの齧歯類である。
別の態様では、本明細書に記載の遺伝子改変非ヒト動物から単離したリンパ球を提供する。一部の実施形態では、リンパ球は、B細胞であり、B細胞は、ヒト若しくは非ヒト動物(例えば、マウス若しくはラット)軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結している、再配列されたヒト若しくは非ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列(又は有限数のヒト若しくは非ヒトVL遺伝子セグメント)を含む免疫グロブリンゲノム遺伝子座を含む。一部の実施形態では、B細胞は、ヒト若しくは非ヒト動物(例えば、マウス若しくはラット)重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結している、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む免疫グロブリンゲノム遺伝子座を更に含み、重鎖定常領域遺伝子配列は、1つ以上の重鎖定常領域遺伝子を含み、各重鎖定常領域遺伝子配列は、機能性CH1ドメインをコードする配列を含み、例えば、インタクトなIgμ遺伝子、インタクトなIgδ遺伝子、インタクトなIgγ遺伝子、インタクトなIgε遺伝子、及び/又はインタクトなIgα遺伝子を含む。一部の実施形態では、B細胞は抗体を生成することができ、本明細書に記載の再配列された軽鎖可変ドメインは、重鎖又は軽鎖定常ドメインに作動可能に連結している。
別の態様では、非ヒト動物胚は、そのゲノムが、(i)1つ以上の重鎖定常領域遺伝子を含む定常領域核酸配列に作動可能に連結している、再配列されていないヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座(例えば、ハイブリッド免疫グロブリン鎖遺伝子座)であって、各定常領域核酸配列が機能性CH1ドメインをコードする配列を含む、例えば、インタクトなIgμ遺伝子、インタクトなIgδ遺伝子、インタクトなIgγ遺伝子、インタクトなIgε遺伝子、及び/又はインタクトなIgα遺伝子を含む、免疫グロブリン重鎖遺伝子座、及び(ii)軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結している、再配列されたヒト若しくは非ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列(又は有限数のヒト若しくは非ヒトVL遺伝子セグメント)を含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含む細胞を含む。一部の実施形態では、定常領域核酸配列に作動可能に連結している、再配列されていないヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含むハイブリッド免疫グロブリン遺伝子座は、重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結しており、重鎖定常領域遺伝子配列は、インタクトなIgμ遺伝子、インタクトなIgδ遺伝子、インタクトなIgγ遺伝子、インタクトなIgα遺伝子、及び/又はインタクトなIgε遺伝子を含む。
様々な実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、再配列された軽鎖可変ドメイン(又は有限数のヒトVL遺伝子セグメントを含有するヌクレオチド配列)並びに複数の軽鎖Vセグメント(及び複数の軽鎖Jセグメント)をコードするヌクレオチド配列に由来する抗体のレパートリー(例えば、IgGレパートリー)を発現する。一部の実施形態では、遺伝子改変遺伝子座は、10−6、10−7、10−8、10−9又は10−10未満の親和性(KD)で目的の抗原を特異的に結合することができる免疫グロブリン軽鎖を含む抗体集団を生成する。一部の実施形態では、遺伝子改変遺伝子座によって発現した免疫グロブリン軽鎖は、重鎖可変領域の不在下、10−6、10−7、10−8、10−9又は10−10未満の親和性(KD)で目的の抗原を特異的に結合することができる。
様々な実施形態では、本明細書に記載の遺伝子改変は、非ヒト動物の受精に影響しない(例えば、その全体が参照により組み込まれる米国特許第8,642,835号を参照)。一部の実施形態では、重鎖遺伝子座、例えば、ハイブリッド鎖遺伝子座は、内因性Adam6a遺伝子、Adam6b遺伝子、又は両方を含み、遺伝子改変は、内因性Adam6a遺伝子、Adam6b遺伝子、又は両方の発現及び/又は機能に影響しない。一部の実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物ゲノムは、重鎖遺伝子座又はハイブリッド鎖遺伝子座の外側の位置でゲノム内に組み込まれたAdam6a遺伝子、Adam6b遺伝子、又は両方を含む。一部の実施形態では、Adam6a及び/又はAdam6b遺伝子は、再配列されていない軽鎖可変領域遺伝子セグメントの5’上流に配置される。一部の実施形態では、Adam6a及び/又はAdam6b遺伝子は、再配列されていない軽鎖可変領域遺伝子セグメントの3’下流に配置される。一部の実施形態では、重鎖遺伝子座は、機能性異所性マウスAdam6遺伝子を含む。
軽鎖可変領域又はドメイン(例えば、軽鎖CDR3)をコードする遺伝子又はポリヌクレオチドに選択的圧力を適用する本明細書に記載の遺伝子改変非ヒト動物の可能性は、様々な可変軽鎖遺伝子配列に適用することができる。言い換えれば、本明細書で開示する再配列された軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、重鎖遺伝子座の1つ以上の遺伝子改変、及び/又は軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列の重鎖遺伝子座への挿入と対合させることができる。このことは、例えば、本明細書に記載の(コモン若しくはユニバーサル軽鎖可変ドメインに制限された)非ヒト動物と、1つ以上の重鎖コード遺伝子座内に遺伝子改変を含む非ヒト動物とを接合すること(即ち、単一の改変を有する動物との交雑又は交雑受精)によって達成することができる。再配列された軽鎖可変領域ヌクレオチド配列(若しくは有限数のヒトVL遺伝子セグメント)を有する免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含む遺伝子改変非ヒト動物、及び1つ以上の重鎖遺伝子座改変は、同時若しくは連続的な多数の遺伝子座の標的化遺伝子交換によっても(例えば、胚性幹細胞内での連続的な組み換えにより)生成することができる。具体的に記さない限り、重鎖遺伝子座における改変の種別又は方法のいずれも本明細書に記載の実施形態を制限するものではない。そうではなく、本明細書に記載の実施形態によって促進される選択的圧力は、重鎖抗原結合配列として発現、機能させることができるほぼすべてのポリヌクレオチド配列に適用することができ、これにより、適合抗体可変領域の進化を駆動する。
例えば、本明細書に記載するように、再配列された軽鎖可変領域ヌクレオチド配列(又は有限数のヒトVL遺伝子セグメント)を有する免疫グロブリン遺伝子座を含む遺伝子改変非ヒト動物は、(例えば、交雑又は多数の遺伝子標的化方策を介して)WO2011/072204、WO2011/163311、WO2011/163314、WO2012/018764、WO2012/141798、WO2013/022782、WO2013/059230、WO2013/096142、WO2013/116609、WO2013/187953に記載の1つ以上の改変を更に含むことができる。これらの刊行物は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。特定の実施形態では、軽鎖遺伝子座(例えば、ヒト若しくは非ヒトκ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結している、再配列された軽鎖可変ドメイン遺伝子配列、若しくは2つのVL遺伝子セグメント)内に再配列された軽鎖可変領域核酸配列、又は有限数のVL遺伝子セグメントを含む遺伝子改変マウスは、ヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座(例えば、ハイブリッド免疫グロブリン鎖遺伝子座)を含む遺伝子改変マウスと交差される(例えば、マウス重鎖遺伝子座に挿入される40個のヒトVκ遺伝子及びすべてのヒトJκ遺伝子、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第2012−0096572A1号を参照)。特定の実施形態では、軽鎖遺伝子座(例えば、ヒト若しくは非ヒトκ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結している、再配列された軽鎖可変領域ヌクレオチド配列、若しくは2つのVL遺伝子セグメント)内に再配列された軽鎖可変領域核酸配列、又は有限数のVL遺伝子セグメントを含む遺伝子改変マウスは、1つ以上のヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座(例えば、ハイブリッド免疫グロブリン鎖遺伝子座)を含む遺伝子改変マウスに交差される。得られたマウスは、ゲノム軽鎖可変配列に由来する可変重鎖を有するIgκ+B細胞を生成することができるため、特異的標的に結合するVκドメインの同定を促進する。
以下の非限定的な実施例は、当業者に、本明細書に記載の非ヒト動物の作製及び使用方法の完全な開示及び記載を提供し、その理解を助けるために記載され、発明者が発明と見なすものの範囲を限定することを意図するものでもなく、以下の実験が実施されたすべて又は唯一の実験であることを示すことを意図するものでもない。実施例は、当業者に既知である従来の方法(分子クローニング技術など)の詳細な記載を含まない。使用される数値(例えば、量、温度など)に関して正確さを保つための努力がなされているが、いくつかの実験誤差及び偏差が考慮されるべきである。他に示さない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧又はそれに近い。
実施例1.修飾免疫グロブリン遺伝子座を有する非ヒト動物の生成
実施例1.修飾免疫グロブリン遺伝子座を有する非ヒト動物の生成
この実施例は、(a)免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列(例えば、ハイブリッド免疫グロブリン鎖遺伝子座)に作動可能に連結された、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖VL及びJL遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座;ならびに(b)免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含有する非ヒト動物の免疫グロブリン重鎖遺伝子座を操作する例示的な方法を示す。
軽鎖遺伝子セグメントによる免疫グロブリン重鎖遺伝子座の構築物
軽鎖遺伝子セグメントによる免疫グロブリン重鎖遺伝子座の構築物
野生型マウス重鎖及びヒトκ軽鎖遺伝子座は、図1に示されている。ヒト軽鎖V及びJ遺伝子セグメント(例えば、Vκ及びJκ)をマウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座に挿入するための例示的な標的ベクターの構築物を以下に記載する。図2は、相同的組み換えを用いてマウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座に挿入するための複数のヒトκ軽鎖遺伝子セグメントを含有する4つの例示的な標的ベクターを示す。
種々の標的構築物を、マウスゲノム細菌人工染色体(BAC)ライブラリーを改変するために、VELOCIGENE(登録商標)遺伝子組み換え技術を用いて作製した(例えば、米国特許第6,586,251号、及びValenzuela,D.M.,Murphy,A.J.,Frendewey,D.,Gale,N.W.,Economides,A.N.,Auerbach,W.,Poueymirou,W.T.,Adams,N.C.,Rojas,J.,Yasenchak,J.,Chernomorsky,R.,Boucher,M.,Elsasser,A.L.,Esau,L.,Zheng,J.,Griffiths,J.A.,Wang,X.,Su,H.,Xue,Y.,Dominguez,M.G.,Noguera,I.,Torres,R.,Macdonald,L.E.,Stewart,A.F.,DeChiara,T.M.,Yancopoulos,G.D.(2003)。High−throughput engineering of the mouse genome coupled with high−resolution expression analysis.Nat Biotechnol 21,652〜659を参照)。マウスBAC DNAは、再配列されていないヒトVL及びJL遺伝子セグメントのその後の挿入のための内因性VH、DH及びJH遺伝子セグメントを欠失させるために、相同的組み換えによって修飾され得る。あるいは、内因性VH、DH及びJH遺伝子セグメントは、無傷に保持され、不活性化されて、機能的可変領域を形成する内因性遺伝子セグメントの組み換えが阻害されてもよい(例えば、遺伝子セグメントの逆転又は破壊によって)。
遺伝子改変マウス、及びその作製方法(そのゲノムが、免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖VL及びJL遺伝子セグメントを含む免疫グロブリンハイブリッド鎖遺伝子座を含有する)は、米国特許公開公報第2012−0096572A1号に開示され、そのすべては参照により本明細書に組み込まれる。図2に示すように、4個の標的ベクターは、当該技術分野で認識されている標準分子技術を用いて、40個のヒトVκ遺伝子セグメント及び5個のヒトJκ遺伝子セグメントを、不活性な重鎖遺伝子座(例えば、欠失した内因性VH、DH及びJH遺伝子セグメント)及び/又は軽鎖定常領域、例えば、非ヒト軽鎖定常領域、例えば、内因性非ヒト軽鎖遺伝子座において、作動可能に連結された単一の再配列されたヒトVL/JL遺伝子配列を含む軽鎖遺伝子座を含む非ヒトES細胞に徐々に挿入するように操作された。表1は、マウス免疫グロブリン重鎖座に挿入するための様々なヒトκ軽鎖遺伝子セグメントを含有する各標的ベクターに含まれるヒトDNAのサイズを示す。任意の数のヒトVκ及びJκ遺伝子セグメントを標的ベクターに含めることができる。図2に示される例示的な標的ベクターは、生殖系列ヒトκ軽鎖遺伝子座の近位コンティグにおいて天然に見出されるヒトκ軽鎖遺伝子セグメントを含む(図1)。4個の標的ベクターのすべてを連続して挿入した後に得られた内因性重鎖遺伝子座を図2の下部に示す。
同様のアプローチを用いて、マウス重鎖定常領域と関連してヒト軽鎖可変ドメインの他の組合せを構築することができる。さらなる軽鎖可変ドメインは、ヒトVλ及びJλ遺伝子セグメントに誘導され得る。様々な数のヒトVλ及びJλ遺伝子セグメントを含むヒトDNAを含む例示的な標的ベクターを図3に示す。
ヒトλ軽鎖遺伝子座は、1,000kbを超え、可変(V)又は結合(J)セグメントをコードする80個を超える遺伝子を含む。ヒトλ軽鎖遺伝子座の70個のVλ遺伝子セグメントのうち、30〜38個は、公開された報告書によれば、機能性遺伝子セグメントであるようである。70個のVλ配列は3つのクラスターに配列されており、これらのすべては異なるV遺伝子ファミリーグループの異なるメンバー(クラスターA、B及びC)を含む。ヒトλ軽鎖遺伝子座内で、観察されたすべてのVλドメインの半分超が、遺伝子セグメント1−40、1−44、2−8、2−14及び3−21によってコードされている。7個のJλ遺伝子セグメントが存在し、そのうちの4個のみが概して機能的なJλ遺伝子セグメントJλ1、Jλ2、Jλ3及びJλ7と見なされる。いくつかの対立遺伝子では、第5のJλ−Cλ遺伝子セグメント対は、疑遺伝子(Cλ6)であると報告されている。本明細書に記載されているように、ハイブリッド重鎖遺伝子座への複数のヒトJλ遺伝子セグメントの組み込みは、デノボ合成によって構築され得る。このようにして、複数のヒトJλ遺伝子セグメントを生殖細胞系列の形態で含有するゲノム断片を複数のヒトVλ遺伝子セグメントで操作し、重鎖定常領域とからんで正常なV−J組み換えを可能にする。複数のJλ遺伝子セグメントを含む例示的な標的ベクターを図3に示す(標的ベクター1’)。
軽鎖可変ドメインを重鎖定常領域と結合させることは、非ヒト動物におけるヒトVL領域との独特のVL結合タンパク質を生成するための多様性の潜在的に豊富な供給源を表す。マウスにおけるヒトλ軽鎖遺伝子座(又は、上記のヒトκ遺伝子座)の多様性を利用することにより、独特のハイブリッド重鎖の操作がもたらされ、遺伝子組み換えされた動物の免疫レパートリーへの別次元のタンパク質の結合及び治療薬の生成のための次世代プラットフォームとしてそれらの後続の使用をもたらす。
上記の標的ベクターを用いて、VL結合タンパク質(即ち、マウス重鎖定常領域に作動可能に連結されたヒト軽鎖遺伝子セグメント)を発現するキメラマウスを生成するための作製した修飾ES細胞にマウス胚性幹(ES)細胞を電気穿孔する。再配列されていないヒト軽鎖遺伝子セグメントの挿入を含有するES細胞は、定量PCRアッセイ、TAQMAN(登録商標)によって同定される(Lie and Petropoulos,1998.Curr.Opin.Biotechnology 9:43〜48)。特定のプライマーセット及びプローブは、ヒト配列及び関連する選択カセットの挿入、マウス重鎖配列の損失ならびに内因性重鎖遺伝子座に隣接するマウス配列の保持のために設計される。
ヒト軽鎖遺伝子セグメントの挿入によって導入された任意の望ましくない選択カセットを除去するために、重鎖定常領域配列に作動可能に連結されたヒト軽鎖遺伝子セグメント(例えば、Vκ及びJκ)を有するES細胞は、リコンビナーゼを発現する構築物でトランスフェクトされ得る。選択的に、選択カセットは、リコンビナーゼを発現するマウスへの繁殖によって除去することができる(例えば、米国特許第6,774,279号)。任意選択で、選択カセットはマウスに保持される。
上記の標的ES細胞をドナーES細胞として使用し、VELOCIMOUSE(登録商標)法により8細胞期マウス胚に導入する(例えば、米国特許第7,294,754号、及びPoueymirou,W.T.,Auerbach,W.,Frendewey,D.,Hickey,J.F.,Escaravage,J.M.,Esau,L.,Dore,A.T.,Stevens,S.,Adams,N.C.,Dominguez,M.G.,Gale,N.W.,Yancopoulos,G.D.,DeChiara,T.M.,Valenzuela,D.M.(2007)。F0 generation mice fully derived from gene−targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses.Nat Biotechnol 25,91〜99を参照)。マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座でヒト軽鎖遺伝子セグメントを独立して有するVELOCIMOUSE(登録商標)(F0マウスは完全にドナーES細胞由来である)は、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座における独特のヒト軽鎖遺伝子セグメントの存在を検出する対立遺伝子アッセイの修飾を用いた遺伝子型同定(Valenzuela et al.,上記)によって同定される。子犬は遺伝子型が決定され、遺伝子組み換え免疫グロブリン重鎖遺伝子座についてヘテロ接合型又はホモ接合型の子犬が、VL含有重鎖の発現を特徴付けるために選択される。
ヒトVκ及びJκ遺伝子セグメントが内因性重鎖定常領域に作動可能に連結されるように、内因性遺伝子座への40個の再配列されていないヒトVκ及び5個のJκ遺伝子セグメントの挿入を含有するゲノムが免疫グロブリン重鎖対立遺伝子を含むマウスは、MAID1713と称される(その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許公開公報第2012−0096572A1を参照)。これを有するマウス及び統合されたマウスAdam6遺伝子は、MAID1994と称される(その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許公開公報第2013−0212719A1を参照)。
再配列されたヒト軽鎖ヌクレオチド配列を有する免疫グロブリン軽鎖遺伝子座の構築
再配列されたヒト軽鎖ヌクレオチド配列を有する免疫グロブリン軽鎖遺伝子座の構築
単一の再配列されたヒト軽鎖ヌクレオチド配列(例えば、単一の再配列されたヒトVL/JLヌクレオチド配列)のマウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座への挿入のための例示的な標的ベクターの構築は、以下に記載される。図4は、相同的組み換えを用いてマウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に挿入するための単一の再配列されたヒト軽鎖ヌクレオチド配列を含有する標的ベクターを示す。
遺伝子改変マウス、及びその作製方法(そのゲノムが、免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含有する)は、米国特許公開公報第2011−0195454A1号に開示され、そのすべては参照により本明細書に組み込まれる。図4に示すように、標的ベクターは、不活性なマウスκ軽鎖遺伝子座(例えば、欠失した内因性Vκ及びJκ遺伝子セグメント)ならびに任意に、当該技術分野分野で認識されている標準分子技術を用いたハイブリッド免疫遺伝子座を含むES細胞への挿入のための単一の再配列されたヒト軽鎖(つまり、再配列されたヒトVL/JL)を含有するように操作された。単一の再配列されたヒト軽鎖ヌクレオチド配列は、任意のヒトVL及びヒトJL配列を含み得る。使用することができる適切な例示的な再配列されたヒト軽鎖ヌクレオチド配列は、再配列されたヒトVκ1−39Jκ5ヌクレオチド配列(MAID1633、図5)、再配列されたヒトVκ3−20Jκ1ヌクレオチド配列(MAID1635、図5)から誘導されたものを含む。
あるいは、上記のように、一部の実施形態において、マウスは、ヒトVλ及びJλ遺伝子セグメントが、重鎖定常領域に作動可能に連結されるように、前記ヒトVλ及びJλ遺伝子セグメントの内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座への挿入を含むように操作されてもよい。そのような実施形態では、挿入されたヒトVλ及びJλ遺伝子セグメントの最適な発現及び使用を達成するために、当業者は、再配列されたヒトVλJλヌクレオチド配列のような再配列された配列を使用し得ることを認識する。そのような再配列されたヒトVλJλヌクレオチド配列は、軽鎖定常領域と関連して再配列されたヒトVλJλ配列と対になる重鎖定常領域と関連して再配列されたヒトVλJλ配列のより良好な能力を提供するだろう。重鎖定常領域と関連して再配列されたヒトVκJκ配列は、軽鎖定常領域と関連して再配列されたVλJλ配列と効果的に会合することができないかもしれない(米国特許公開公報第2012−0096572A1号参照)。したがって、例示的な再配列されたヒトVλJλ配列は、再配列されたヒトVλ2−14Jλ1ヌクレオチド配列を含む。
上記の標的ベクターは、単一の再配列されたヒト軽鎖ヌクレオチド配列(即ち、マウス軽鎖定常領域に作動可能に連結された単一のヒトVL/JLヌクレオチド配列)によってコードされる軽鎖を発現するキメラマウスを生成するための修飾ES細胞を作製するために、任意にハイブリッド免疫グロブリン遺伝子座を含み得るマウス胚性幹(ES)細胞を電気穿孔するために使用される。単一の再配列されたヒト軽鎖遺伝子ヌクレオチド配列の挿入を含有するES細胞は、定量PCRアッセイ、TAQMAN(登録商標)によって同定される(Lie and Petropoulos,1998.Curr.Opin.Biotechnology 9:43〜48)。特定のプライマーセット及びプローブは、単一の再配列されたヒト軽鎖ヌクレオチド配列及び関連する選択カセットの挿入、マウス軽鎖配列の損失ならびに内因性軽鎖遺伝子座に隣接するマウス配列の保持のために設計される。
単一の再配列されたヒト軽鎖ヌクレオチド配列の挿入によって導入された任意の望ましくない選択カセットを除去するために、単一の再配列されたヒト軽鎖ヌクレオチド配列を有するES細胞は、リコンビナーゼを発現する構築物でトランスフェクトされ得る。選択的に、選択カセットは、リコンビナーゼを発現するマウスへの繁殖によって除去することができる(例えば、米国特許第6,774,279号)。任意選択で、選択カセットはマウスに保持される。
上記の標的ES細胞をドナーES細胞として使用し、VELOCIMOUSE(登録商標)法により8細胞期マウス胚に導入する(例えば、米国特許第7,294,754号、及びPoueymirou,W.T.,Auerbach,W.,Frendewey,D.,Hickey,J.F.,Escaravage,J.M.,Esau,L.,Dore,A.T.,Stevens,S.,Adams,N.C.,Dominguez,M.G.,Gale,N.W.,Yancopoulos,G.D.,DeChiara,T.M.,Valenzuela,D.M.(2007)。F0 generation mice fully derived from gene−targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses.Nat Biotechnol 25,91〜99を参照)。マウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座で単一の再配列されたヒト軽鎖ヌクレオチド配列を独立して有するVELOCIMOUSE(登録商標)(F0マウスは完全にドナーES細胞由来である)は、内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座における独特の再配列されたヒト軽鎖ヌクレオチド配列の存在を検出する対立遺伝子アッセイの修飾を用いた遺伝子型同定(Valenzuela et al.,上記)によって同定される。子犬は遺伝子型が決定され、遺伝子組み換え免疫グロブリン軽鎖遺伝子座についてヘテロ接合型又はホモ接合型の子犬が、単一のヒト軽鎖の発現を特徴付けるために選択される。
実施例2.単一の再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖ヌクレオチド配列及び複数のヒトκ軽鎖遺伝子セグメントを含むマウスの特性決定
実施例2.単一の再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖ヌクレオチド配列及び複数のヒトκ軽鎖遺伝子セグメントを含むマウスの特性決定
軽鎖遺伝子座(ULCマウス:MAID1633、単一の再配列されたヒトVκ1−39/Jκ5又はMAID1635、単一の再配列されたヒトVκ3−20Jκ1)における再配列された軽鎖可変領域核酸配列を含むマウスを上記のように生成した。要約すると、ULCマウスにおいて、すべての内因性機能的軽鎖可変遺伝子セグメントを欠失させ、内因性軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている単一の再配列された軽鎖可変領域核酸配列(例えば、ヒトVκ1−39/Jκ5又はヒトVκ3−20Jκ1をコードする配列)で置き換えた。
重鎖遺伝子座(KOHマウス:MAID1713:40個のヒトVκ遺伝子セグメント及び5個のヒトJκ遺伝子セグメント;MAID1994:40個のヒトVκ遺伝子セグメント及び5個のヒトJκ遺伝子セグメント、ならびに組み込まれたAdam6遺伝子)に再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖VL及びJL遺伝子セグメントを含有する遺伝子操作された重鎖遺伝子座を含むマウスを上記のように生成した。要約すると、KOHマウスにおいて、すべての内因性機能的重鎖可変遺伝子セグメントが欠失され、免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている、40個の再配列されていないヒトVκ遺伝子セグメント及び5個の再配列されていないヒトJκ遺伝子セグメントで置き換えた。
上記のホモ接合型のULCマウス(MAID1633又はMAID1635)をホモ接合型のKOHマウス(MAID1713又はMAID1994)マウスに交配して、ULC対立遺伝子及びKOH対立遺伝子についてヘテロ接合型のマウスを産生した。この交配から生成したF1ヘテロ接合型のマウスを互いに交配して、各対立遺伝子(MAID1713HO 1633HO、MAID1713HO 1635HO、MAID1994HO 1633HO、又はMAID1994HO 1635HO;「KOH×ULC」)についてホモ接合型のマウスを得た。このようなマウスは、免疫グロブリンの構造に類似した構造を有するが、そのような結合タンパク質が重鎖可変ドメインを欠くという点で異なるVL結合タンパク質を発現する。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子座における遺伝子改変対立遺伝子の存在は、TAQMAN(商標)スクリーニング及び上記の特異的なプローブ及びプライマーを用いた核型分析によって確認された。ホモ接合型のKOH×ULCマウスは、本明細書に記載されているような再配列されていないヒト軽鎖遺伝子セグメント(例えば、ヒトVκ及びJκ)のマウス重鎖遺伝子座への挿入、ここで、すべての内因性可変重鎖VDJ遺伝子セグメントが欠失している、ならびに、マウスκ(κ)軽鎖遺伝子座への単一の再配列されたヒト軽鎖可変領域ヌクレオチド配列(MAID1633:再配列されたヒトVκ1−39Jκ5;MAID1635:再配列されたヒトVκ3−20Jκ1)の挿入、ここで、すべてのマウスVκ及びJκ遺伝子が欠失している(図6)、を含む。一部の実施形態では、KOH×ULCマウスは更に、組み込まれたAdam6遺伝子を含む。
あるいは、ULC対立遺伝子及びKOH対立遺伝子の両方を含むマウスを生成するために、ULC修飾を有するES細胞又はKOH修飾を有するES細胞を、それぞれKOH又はULC標的ベクターで標的化する。VELOCIMMUNE(登録商標)法により8期マウス胚にES細胞を導入し、実施例3で上記したようにスクリーニングすることにより、両方の修飾を有するES細胞からマウスを生成する。F1ヘテロ接合型のマウスを交配し、ホモ接合型のマウスを得る。
すべてのマウスを収容し、特定の病原体のない条件でRegeneron Pharmaceuticals,Incで交配した。3つのKOH(MAID1994HO 1242HO;参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開公報第2013−0212719A1号を参照)マウス(約11週齢、オス)及び3つのKOH×ULC(MAID1994HO 1633HO、約12週齢、メス;MAID1994HO 1635HO、約11週齢、2匹のオス及び1匹のメス)マウスのうちの2つの群を屠殺し、動物から脾臓及び骨髄を採取した。完全RPMI培地(ウシ胎仔血清、ピルビン酸ナトリウム、Hepes、2−メルカプトエタノール、非必須アミノ酸及びゲンタマイシンを補充したRPMI培地)でフラッシュすることにより、骨髄を大腿骨から集めた。脾臓及び骨髄調製物からの赤血球をACK溶解緩衝液で溶解し、完全RPMI培地で洗浄した。
フローサイトメトリー
フローサイトメトリー
遺伝子改変対立遺伝子から(例えば、軽鎖遺伝子座における再配列されたヒト軽鎖ヌクレオチド配列の単一コピーを含有する対立遺伝子ならびに重鎖遺伝子座における再配列されていないヒトVκ及びJκ遺伝子セグメントを含有する対立遺伝子から)誘導されたVL結合タンパク質を産生するための本明細書に記載の遺伝子改変ホモ接合型「KOH×ULC」(MAID1994HO 1633HO及びMAID1994HO 1635HO)のマウスの能力を試験するために、蛍光活性化細胞選別(FACS)分析を行った。再配列されていないヒトVL及びJL遺伝子セグメント(1994 HO 1242 HO)を含むKOHマウス、ならびにマウス重鎖及び軽鎖遺伝子座上の再配列されていないヒト重鎖及び軽鎖遺伝子セグメントを含むVELOCIMMUNE(登録商標)マウスをそれぞれ(VI3)対照として使用した。
要約すると、1×106個の細胞を、抗マウスCD16/CD32(クローン2.4G2、BD Pharmigen)と共に氷上で10分間インキュベートした後、以下の抗体カクテルで氷上で30分間標識化した:APC−H7コンジュゲート抗マウスCD19(クローン1D3、BD Pharmigen)、パシフィックブルーコンジュゲート抗マウスCD3(クローン17A2、BioLegend)、FITCコンジュゲート抗マウスIgκ(クローン187.1、BD Pharmigen)又は抗マウスCD43(クローン1B11、BioLegend)、PEコンジュゲート抗マウスIgλ(クローンRML−42、BioLegend)又は抗マウスc−kit(クローン2B8、BioLegend)、PerCP−Cy5.5コンジュゲート抗マウスIgD(BioLegend)、PE−Cy7コンジュゲート抗マウスIgM(クローンII/41、eBioscience)、APCコンジュゲート抗マウスB220(クローンRA3−6B2、eBioscience)。染色後、細胞を洗浄し、2%ホルムアルデヒドで固定した。データ取得をLSRIIフローサイトメーターで行い、FlowJo(Tree Star、Inc.)で分析した。ゲーティング:全B細胞(CD19+CD3−)、Igκ+B細胞(Igκ+Igλ−CD19+CD3−)、Igλ+B細胞(Igκ−Igλ+CD19+CD3−)。骨髄コンパートメントについての結果を図7〜10に示す。脾臓コンパートメントについての結果を図11〜15に示す。
成熟Bリンパ球のみが脾臓及びリンパ節のリンパ濾胞に侵入し、そのため免疫応答に効率的に関与することができる。成熟した、長命のBリンパ球は、骨髄で生成された短命の前駆体に由来する。成熟プールへの選択は能動的なプロセスであり、脾臓で行われる。脾臓B細胞の2つの集団が、成熟B細胞の前駆体として同定されている。1型(T1)の移行B細胞は、骨髄からの最近のイミグラントである。それらは、周期的であり、排他的に脾臓の原始卵胞に見出される2型(T2)の移行B細胞に発達する。成熟B細胞は、T1又はT2B細胞から生成され得る。Loder,F.et al.,J.Exp.Med.,190(1):75〜89,1999。
FACS分析(図7〜15)は、KOH×ULCマウスが骨髄区画(図7〜8)においてほぼ正常なB細胞集団を産生し得ることを示唆した。興味深いことに、KOH×ULCマウスは、骨髄におけるラムダ(λ)発現の欠如を示す(図10)。
脾臓区画では、KOH×ULCマウスはほぼ正常なB細胞集団を産生した(図11、12及び14)。骨髄区画のように、KOH×ULCマウスは、脾臓におけるラムダ(λ)発現の欠如を示した(図11及び12)。また、脾臓区画において、KOH×ULCマウスは、VELOCIMMUNE(登録商標)(VI3)マウスと比較して、ほぼ正常な移行及び成熟B細胞集団を示した(図13〜15)。
まとめると、これらのデータは、実施例1に記載の遺伝子改変を有するものなど、本発明により提供されるKOH×ULCマウスが健康であり、近野生型B細胞発生を示すことを示す。更に、このようなマウスは、構造において天然抗体に似ているが、重鎖可変領域配列を欠く結合タンパク質を発現する。
最後に、図16に示すように、本明細書に記載の遺伝子改変を含むマウスは、抗原1(細胞表面受容体)で免疫化した場合、抗原特異性力価を生成することができた。
実施例3.KOH×ULCマウス由来のVL/CHxULCドメインの抗原結合特性
実施例3.KOH×ULCマウス由来のVL/CHxULCドメインの抗原結合特性
この実施例は、同種可変ドメイン、例えば、同種ユニバーサル軽鎖可変ドメインとは独立して抗原に検出可能に結合することができる免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン(VL/CHxULC)をコードする核酸配列を得る例示的な方法を示す。同種可変ドメインから独立して抗原に検出可能に結合する例示的なVL/CHxULCドメインは、遺伝子改変非ヒト動物(例えば、マウス)から得られ、その非ヒト動物のゲノムは、重鎖定常領域配列に作動可能に連結された再配列されていないヒト軽鎖遺伝子セグメント(例えば、VL及びJL遺伝子セグメント)を含有する免疫グロブリン重鎖遺伝子座(ハイブリッド免疫グロブリン鎖遺伝子座)ならびに軽鎖定常領域配列に作動可能に連結された再配列された免疫グロブリン軽鎖可変配列(即ち、ユニバーサルな又は共通の軽鎖可変領域)を含有する免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含む。そのような非ヒト動物は、重鎖定常領域に作動可能に連結された免疫グロブリン軽鎖VL/CHxULC可変ドメイン及び軽鎖定常領域に作動可能に連結された共通の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含有する結合タンパク質を発現し、VL/CHxULC軽鎖は再配列されていないヒト軽鎖遺伝子セグメントから誘導され、共通の軽鎖可変ドメインは単一の再配列された軽鎖可変遺伝子配列によってコードされる。
無関係な、例えば非同種ヒトVHドメインと対になったときに抗原結合を保持するVL/CHxULC、具体的にはVκOHxULC免疫グロブリン軽鎖可変ドメインの調製を行った。KOH×ULCマウスを細胞表面タンパク質(抗原2)で免疫化した。2つのKOH×ULCマウス、MAID1712 1635(KOH×ULC:Vκ3−20Jκ1)から抗原陽性B細胞を選別した。抗原2に基づいて細胞を選別し、1536個のB細胞を収集した。384個のB細胞を、選別中に判断した「最良の」マウスから処理した。176個のKOH VLドメイン、例えば、Vκ/CHxULCドメインをFabプラスミドにクローニングした。ヒトVκ3−20生殖系列ULC配列をコードする配列と共に、176個のKOH VLドメインの1つをコードする個々の配列をFabプラスミドにクローニングした。KOH VL(VκOHxULC)ドメインをコードする各配列を、重鎖定常領域配列(即ち、CH1)と作動可能に連結してクローニングし、ULC配列を、軽鎖定常κ遺伝子配列と作動可能に連結させて閉じた。一過性トランスフェクションを行って、Ag+スクリーニングのためのタンパク質を産生した。抗原2結合のスクリーニングを、ELISA及びBIACORE(商標)によってアッセイした。図17に示すように、ELISAによって決定されるように、中性pHで抗原2に14個のサンプルが結合した。結合は、14個のELISA結合剤のうちの13個についてBIACORE(商標)によって確認された。
続いて、2つのKOH由来のVL(VκOHxULC)ドメインを選択し、独立してクローニングし、軽鎖定常領域(即ち、Cκ)で再フォーマットした。再フォーマットされたKOH VL/Cκ鎖のそれぞれは、重鎖CHでフォーマットされた非同種VHドメインと独立に対形成され、典型的な抗体構造体を形成した。注目すべきことに、非同種VHドメインは、単一の再配列された重鎖可変領域配列からすべてのVHドメインを生成するように遺伝子組み換えされたマウスにおいて生成され、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開公報第2の014024548号を参照、無関係の酵素(抗原3)で免疫化した。再フォーマットされたVLドメインを、BIACORE(商標)による抗原2結合について試験した。結果を図18に示す。
図18に示すように、抗体A及びBはそれぞれ、Cκ定常ドメインと融合した異なるKOH VL(VκOHxULC)を含む免疫グロブリン軽鎖及び無傷なCHドメインと融合したVHドメインを含む免疫グロブリン重鎖を含む。対照的に、抗体Cは、抗体A及びBと同じ免疫グロブリン重鎖を含むが、抗体Cは、Cκドメインと融合したVHドメインと同種であるVLドメインを含む免疫グロブリン軽鎖を含む。
結果は、単一の再配列された重鎖可変領域から誘導され、抗原3に対して惹起されたVHドメインが、同種軽鎖可変ドメインと対になった場合、抗原3への抗原結合が維持されることを示す(抗体Cは予想通り抗原3に結合することを示す、図18を参照)。驚くべきことではないが、同じVHドメインが非同種KOH VLドメインと対になった場合、抗原3の結合は検出されなかった(図18)。
対照的に、(1)Cκドメイン上に再フォーマットされ、(2)非同種VHドメインと対になるにもかかわらず、抗原2結合は、KOH VL(VκOHxULC)ドメイン(即ち、抗体A及びB VLドメイン)の両方について維持された。
この結果は、KOH×ULCマウスから単離されたKOH抗体が、1つのVLドメイン(即ちVκドメイン)のみを介して抗原に結合できることを示唆している。これは、KOH VL(VκOHxULC)ドメインを軽鎖主骨格(即ち、Cκ領域)に再フォーマットし、異なる抗原に対して惹起されたVHドメインと対になることによって確認される。このような分子は、親KOH抗体(即ち、VκOHxULCドメイン)が惹起された抗原への結合を保持することが示された。
まとめると、この実施例は、KOH×ULCマウスが、VL/CHxULCドメイン(例えば、Vκ/CHxULC)を介してのみ、即ち同種可変ドメインとは独立に抗原に結合する「抗体様」分子を選択するための頑強なインビボ系を提供することを示す。そのようなマウスは、同種可変ドメインの非存在下で及び/又は非同種可変ドメインと対になった場合に、抗原に結合するVLドメイン(Vκ/CHxULC又はVλ/CHxULC)を選択する機会を提供する。本明細書に記載のマウスによって発現されるVL結合タンパク質は、従来の抗体(例えば、HIV及びインフルエンザ)を回避するために進化する標的への新規なパラトープ又は結合表面を提供し得る。
実施例4.VL/CHxULCドメインを含む多重特異性抗原結合タンパク質の作製
実施例4.VL/CHxULCドメインを含む多重特異性抗原結合タンパク質の作製
この実施例は、ユニバーサル軽鎖と同種である免疫グロブリンハイブリッド鎖から誘導された軽鎖可変VL/CHxULCドメインを含む多重特異性抗原結合タンパク質を作製する例示的な方法を示す。実施例3に示すように、KOH VLドメイン、例えばVκ/CHxULCをコードする第1の核酸配列は、非ヒト動物のゲノムにおいて、重鎖定常領域配列に作動可能に連結された再配列されていないヒト軽鎖遺伝子セグメント(例えば、Vκ及びJκ遺伝子セグメント)を含有する免疫グロブリンハイブリッド鎖遺伝子座ならびに軽鎖定常領域配列に作動可能に連結された再配列された免疫グロブリン軽鎖可変配列(即ち、ユニバーサルな又は共通の軽鎖可変領域)を含有する免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含むように、遺伝子改変非ヒト動物から単離される。VL/CHxULCドメインをコードする第2の核酸はまた、非ヒト動物のゲノムにおいて、重鎖定常領域配列に作動可能に連結された再配列されていないヒト軽鎖遺伝子セグメント(例えば、VL及びJL遺伝子セグメント)を含有する免疫グロブリン重鎖遺伝子座ならびに軽鎖定常領域配列に作動可能に連結された再配列された免疫グロブリン軽鎖可変配列(即ち、ユニバーサルな又は共通の軽鎖可変領域)を含有する免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含むように、遺伝子改変非ヒト動物から単離され得る。あるいは、第2の抗原と結合し、ユニバーサル軽鎖と同種の重鎖可変VHxULCドメインをコードする第2の核酸は、ユニバーサル軽鎖(「ULC」)、例えば、本明細書に参考により組み込まれる、2011−0195454A1号、米国特許公開公報第2012−0021409A1号、米国特許公開公報第2012−0192300A1号、米国特許公開公報第2013−0045492A1号、米国特許公開公報第2013−0185821A1号、及び米国特許公開公報第2013−0302836A1号を参照、又は、制限された(限定された)免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントレパートリー(例えば、2以上であり野生型数未満のヒトVL遺伝子セグメント、例えば、二重軽鎖、又は「DLC」、参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開公報第US−2013−0198880−A1号を含む制限された免疫グロブリン軽鎖可セグメントレパートリー)で遺伝子改変非ヒト動物から単離され得る。
第1の抗原と結合する第1のVL/CHxULCドメインをコードする第1の核酸配列を含む核酸によりコードされている第1の結合成分は、第2の抗原と結合する第2の可変VL/CHxULCドメイン又はVH/CHxULCドメインをコードする核酸配列を含む第2の核酸によってコードされている第2の結合成分と共に細胞において共発現され得、第1及び第2の成分は多重特異性、例えば、二重特異性抗原結合タンパク質として発現される。例示的な対形成フォーマットは、Fvフォーマット、scFvフォーマット、Fabフォーマット、scFabフォーマット、四量体抗体型フォーマットにおいてそれぞれ対となる第1及び第2の結合成分を含み、第1及び第2の結合成分はそれぞれ、ユニバーサル軽鎖と会合する機能的CH1ドメインを含む重鎖、又は四量体型抗体フォーマットであり、第1又は第2の結合成分の1つは、機能的CH1ドメインを含む重鎖であり、軽鎖として第1又は第2の結合成分の他方と会合している。
再配列されていないヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含むKOH×ULCマウスを抗原A、多価高分子量タンパク質で免疫化して、抗原Aに特異的なVκ/CHxULC可変ドメインを形成した。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、2011−0195454A1号、米国特許公開公報第2012−0021409A1号、米国特許公開公報第2012−0192300A1号、米国特許公開公報第2013−0045492A1号、米国特許公開公報第2013−0185821A1号、及び米国特許公開公報第2013−0302836A1号に記載されている、再配列されていないヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントを含むULCマウスを、抗原Bに特異的なVHxULC可変ドメインを形成するために、単量体低分子量タンパク質である抗原Bで免疫化した。
抗原A又は抗原Bに結合することができる抗原結合タンパク質を発現するB細胞を、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第7,582,298号に記載されているようにKOH×ULC又はULCマウスからそれぞれ選別した。この研究で使用したKOH×ULC及びULCマウスの両方を、ヒトJκ1遺伝子セグメントで再配列されたヒトVκ3−20遺伝子セグメントを含む再配列された免疫グロブリン軽鎖によってコードされているULCで遺伝子改変した。
要約すると、赤血球を、溶解してその後採取した脾細胞をペレット化することによって除去した。再懸濁した脾細胞を、最初にヒトIgG、FITC−抗−mFc、及びビオチンで標識した抗原A又はビオチンで標識した抗原B(必要に応じて)のカクテルで1時間インキュベートした。染色した細胞をPBSで2回洗浄し、次いでヒト及びラットIgG、APC−抗−mIgM及びSA−PEのカクテルで1時間染色した。染色した細胞をPBSで1回洗浄し、Reflection(Sony)でのフローサイトメトリーで分析した。各IgG陽性、IgM陰性及び抗原陽性B細胞を選別し、384ウェルプレート上の別個のウェルに播種した。これらのB細胞からの抗体遺伝子のRT−PCRは、Wangら(2000)(J Immunol Methods 244:217〜225)の記載方法に従って実施された。
要約すると、各単一B細胞についてのcDNAを、逆転写(RT)を介して合成した。抗原Aで免疫化したKOHxULCマウスからのVκOHxULC領域DNA配列を、ヒトκ鎖可変領域リーダー配列に特異的な5’縮重プライマー及びマウス重鎖定常領域に特異的な3’プライマーを用いてPCRにより増幅してアンプリコンを形成した。次いで、アンプリコンを、ヒトκ可変領域配列のフレームワーク1に特異的な5’縮重プライマーセット及びマウス重鎖定常領域に特異的な入れ子3’プライマーを用いてPCRにより再度増幅した。VKOHXULC PCR生成物を、ヒトIgG1重鎖定常領域及び再配列されたVκ3−20Jκ1から誘導されたユニバーサル軽鎖の発現カセットを含有する第1のSapI線状抗体ベクターにクローニングした。抗原Bで免疫化したULCマウスからの重鎖可変領域DNA配列を、ヒトIgG重鎖可変領域リーダー配列に特異的な5’縮重プライマー及びマウス重鎖定常領域に特異的な3’プライマーを用いてPCRにより増幅してアンプリコンを形成した。次いで、アンプリコンを、ヒトIgG重鎖可変領域配列のフレームワーク1に特異的な5’縮重プライマーセット及びマウス重鎖定常領域に特異的な入れ子3’プライマーを用いてPCRにより再度増幅した。VH/CHxULC PCR生成物を、ヒトIgG1重鎖定常領域を含む第2のSapI線状抗体ベクターにクローニングした。
ヒトκ定常遺伝子に作動可能に連結された再配列されたVκ3−20Jκ1配列から誘導されたユニバーサル軽鎖をコードする再配列された遺伝子及びヒトIgG1定常領域配列に作動可能に連結されたVL/CHxULC配列を有する精製組み換えプラスミドと、ヒトIgG1定常領域配列に作動可能に連結されたVH/CHxULC配列を有する精製プラスミドとを合わせ、CHO宿主細胞株にトランスフェクトした。安定にトランスフェクトされたCHO細胞プールは、12日間の400μg/mlハイグロマイシンによる選択の後、単離された。CHO細胞プールを使用して、図19Aに示すような抗原結合タンパク質を産生した。
選択された抗体上清又は精製された抗体についての平衡解離定数(KD)を、Biacore T200又は4000機器(GE Healthcare)を用いてSPR(表面プラズモン共鳴)によって決定した。25℃又は37℃で、HBS−EP(10mM Hepes、150mM NaCl、0.3mM EDTA、0.05%界面活性剤P20、pH7.4)を使用して、泳動及びサンプル緩衝液の両方としてすべてのデータを得た。標準的なアミンカップリング化学剤を用いて高密度の抗ヒトFc抗体で予め誘導体化されたCM4又はCM5センサーチップ表面上の粗上清サンプル又は精製mAbから抗体を捕捉した。捕捉ステップの間に、上清又は精製されたmAbを抗ヒトFc表面に10μL/分の流速で合計0.5〜2.0分間注入した。捕捉ステップに続いて、流速30μL/分で1.5〜3.0分間、3.125nM〜100nMの濃度範囲の泳動緩衝液若しくは抗原A又は3.0分間、0.37nM〜90nMの濃度範囲の抗原Bのいずれかの注入を行った。捕捉された抗体からの抗原の解離を3.0〜5.0分間モニターした。捕捉された抗体は、10mMグリシン、pH1.5の短時間の注入によって除去された。すべてのセンサーグラムは、検体センサーグラムからの緩衝液注入からセンサーグラムを差し引くことによって二重に参照され、それにより、捕捉表面からの抗体の解離によって生じるアーチファクトを除去した。各抗体の結合データを、質量輸送制限を伴う1:1結合モデルに適合させた。
ユニバーサル軽鎖抗体の結合親和性を図4に示し、これは、ナノモル範囲のKD値を示す。具体的には、Vκ/CHxULC結合成分、VHxULC結合成分、及びユニバーサル軽鎖を含むすべての特異性抗体(B1〜B3)は、25℃で6.8〜9.6nM(図20)の範囲の親和性及び37℃で100〜140nMの範囲でかつ約1分未満のt1/2の値(データ示さず)で抗原Aに結合した。二重特異性抗体はまた、25℃で約5〜100nMの範囲の親和性(図20)及び37℃で174〜178nMの範囲の親和性で抗原Bに結合した(データ示さず)。
抗原Aに対して惹起され、それぞれクローニングして二重特異性抗体B1〜B3を産生する、二価のVκ/CHxULCドメインと対になるユニバーサル軽鎖可変ドメインを含む対照単一特異性抗体(抗体CKOH1〜CKOH3)は、25℃で2〜8nMの範囲の親和性で抗原Aに結合したが、抗原Bには結合しなかった(図20)。理論に縛られることを望まないが、二重特異性抗体(B1〜B3)と比較して二価抗体(CKOH1〜CKOH3)との抗原A相互作用について観察された25℃でのt1/2値の差異は、抗原Aの多価性による可能性があり、これは、主にアビディティ駆動相互作用に寄与し得る。解離定数(t1/2)は、37℃でCKOH1〜CKOH3抗体について測定されなかった。
抗原Bに対して惹起され、それぞれクローニングして二重特異性抗体B1〜B3を産生する、二価のhVHxULCドメインと対になるユニバーサル軽鎖可変度綿を含む対照単一特異性抗体(抗体CVH)は、25℃で5.2nMの親和性及び抗原Bが二重特異性抗体から解離したt1/2値(23〜31分)と同様のt1/2値(41.1分)で抗原Bと結合した(図20)。37℃での抗原BへのCVHの結合は試験しなかった。
アイソタイプ対照抗体(CI)は、抗原A又は抗原Bのいずれにも結合しなかった(図20)。例えば、CHドメインと融合したVHドメインをそれぞれ含む2つの重鎖、及びCLドメインと融合したVLドメインをそれぞれ含む2つの軽鎖を有する典型的な抗体フォーマットの別の対照抗B抗体(C)は、1.4nMの親和性で抗原Bに結合し、抗原Aに結合しなかった(図20)。
まとめると、この実施例は、KOH×ULC非ヒト動物において生成されたVL/CHxULCドメインが、第2の異なるエピトープに特異的な別の可変ドメインと多重特異性フォーマット中で抗原を結合し得ることを示す。
均等物
均等物
このように、本発明の少なくとも1つの実施形態のいくつかの態様を説明したので、当業者には様々な変更、修正、及び改変が容易に思い付くことが理解されるべきである。そのような変更、修正、及び改変は、この開示の一部であることが意図されており、本発明の精神及び範囲内にあることが意図されている。したがって、上記の説明及び図面は単なる例示であり、本発明は以下の特許請求の範囲によって詳細に説明される。
特定の排除が本明細書に列挙されているかどうかに関わらず、本発明の任意の実施形態又は態様を特許請求の範囲から明らかに排除し得ることも理解されるべきである。
当業者は、本明細書に記載のアッセイ又は他のプロセスで得られた値に起因する偏差又は誤差の典型的な水準を理解するであろう。
本発明の背景を説明し、その実施に関する追加の詳細を提供するために本明細書で参照される刊行物、ウェブサイト及び他の参考資料は、参照により本明細書に組み込まれる。
Claims (33)
- 第1のエピトープに結合する第1のヒト軽鎖可変ドメインを含む第1の結合成分を含む抗原結合タンパク質であって、
前記第1のヒト軽鎖可変VL/CHxULCドメインが、IgD、IgG、IgE、及びIgAからなる群から選択されるアイソタイプを有する第1の免疫グロブリンハイブリッド鎖の第1のヒト軽鎖可変ドメインと同一又はそれに由来し、機能性CH1ドメインを含み、かつ、再配列されたヒトユニバーサルVL/JL遺伝子配列に由来する第1のユニバーサル軽鎖可変ドメインと同種であり、
任意選択で、前記第1のVL/CHxULCドメインが、重鎖定常ドメイン又は軽鎖定常ドメインに融合され、かつ、
任意選択で、前記第1のVL/CHxULCドメインが、前記再配列されたヒトユニバーサルVL/JL遺伝子配列に由来する、第1のユニバーサル軽鎖可変ドメインに関連付けられている、抗原結合タンパク質。 - 第2のエピトープに結合する第2のヒト可変ドメインを含む第2の結合成分を更に含み、
前記第2のヒト可変ドメインが、
(i)前記再配列されたヒトユニバーサルVL/JL遺伝子配列に由来する、第2のユニバーサル軽鎖可変ドメインと同種の、第2のハイブリッドの免疫グロブリン鎖の第2のヒト軽鎖可変ドメインと同一又はそれに由来する、第2のヒト軽鎖可変VL/CHxULCドメイン、又は
(ii)前記再配列されたヒトユニバーサルVL/JL遺伝子配列に由来する、第2のユニバーサル軽鎖可変ドメインと同種の、ヒト重鎖可変VHxULCドメインの、いずれか一方であり;
任意選択で、前記第2のヒト(VL/CHxULC又はVHxULC)可変ドメインが、重鎖定常ドメイン又は軽鎖定常ドメインのいずれか一方に融合され、かつ、
任意選択で、前記第2のヒト(VL/CHxULC又はVHxULC)可変ドメインが、前記再配列されたヒトユニバーサルVL/JL遺伝子配列に由来する、第2のユニバーサル軽鎖可変ドメインに関係づけられている、請求項1に記載の抗原結合タンパク質。 - 前記第1の結合成分及び前記第2の結合成分が、scFv様のフォーマットで対になるように、前記第1の可変VL/CHxULCドメイン及び前記第2の可変ドメインが、ペプチドリンカーによって連結されている、請求項2に記載の抗原結合タンパク質。
- 前記第1の可変VL/CHxULCドメイン又は前記第2の可変ドメインのうちの一方が、機能性CH1ドメインに融合され、前記第1の可変VL/CHxULCドメイン又は前記第2の可変ドメインのうちの他方が、軽鎖定常(CL)ドメインに融合され、かつ、前記第1の結合成分及び前記第2の結合成分が、Fab様のフォーマット又はscFab様のフォーマットで対になるように、前記CH1ドメイン及び前記CLドメインが、ペプチドリンカー又はジスルフィド結合によってリンクされている、請求項2に記載の抗原結合タンパク質。
- 前記第1の結合成分が、
(a)第1の機能性CH1ドメイン、第1のヒンジ領域、第1のCH2ドメイン、第1のCH3ドメイン、及び任意選択で、第1のCH4ドメインに融合された、前記第1の可変VL/CHxULCドメインと、
(b)第1の軽鎖定常(CL)ドメインに融合された、前記第1のユニバーサル軽鎖可変ドメインと、を含み、
Fab様構造内で(a)と(b)とが対になるように、前記第1の機能性CH1ドメインが前記第1のCLドメインに、ジスルフィド結合又はペプチドリンカーによってリンクされ、
前記第2の結合成分が、
(a’)第2の機能性CH1ドメイン、第2のヒンジ領域、第2のCH2ドメイン、第2のCH3ドメイン、及び任意選択で、第2のCH4ドメインに融合された、前記第2の可変ドメインと、
(b’)第2の軽鎖定常(CL)ドメインに融合した、前記第2のユニバーサル軽鎖可変ドメインと、を含み、
Fab様構造内で(a’)と(b’)とが対になるように、前記第2の機能性CH1が前記第2の軽鎖定常ドメインに、ジスルフィド結合又はペプチドリンカーによってリンクされ、
前記抗原結合タンパク質が四量体型結合タンパク質を形成するように、前記第1の結合成分及び前記第2の結合成分が対になり、かつ
任意選択で、前記第1のCH3ドメインと、前記第2のCH3ドメインとが、Aタンパク質に対して異なる親和性を有する、請求項2に記載の抗原結合タンパク質。 - 前記第1及び第2の結合成分が同一である、請求項2〜5のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
- 第2のエピトープを結合する前記第2のヒト可変ドメインが、ヒト重鎖可変VHxULCドメインである、請求項2〜5のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
- 第2のエピトープを結合する前記第2のヒト可変ドメインが、第2の可変VL/CHxULCドメインであり、前記第1のエピトープと前記第2のエピトープとが同一ではない、請求項2〜5のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
- 前記再配列されたヒトユニバーサルVL/JL遺伝子配列が、再配列されたヒトユニバーサルVκ/Jκ遺伝子配列である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
- 前記再配列されたヒトユニバーサルVκ/Jκ遺伝子配列が、再配列されたヒトユニバーサルVκ1−39/Jκ遺伝子配列又は再配列されたヒトユニバーサルヒトVκ3−20/Jκ遺伝子配列である、請求項9に記載の抗原結合タンパク質。
- 前記再配列されたヒトVκ1−39/Jκ遺伝子配列が、再配列されたヒトVκ1−39/Jκ5遺伝子配列であるか、又は前記再配列されたヒトVκ3−20/Jκ遺伝子配列が、再配列されたヒトVκ3−20/Jκ1遺伝子配列である、請求項10に記載の抗原結合タンパク質。
- すべての重鎖定常領域及び軽鎖定常領域が、それぞれヒト重鎖定常領域及びヒト軽鎖定常領域である、請求項1〜11のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
- ヒトVL/CHxULCドメインを生成するのに有用な非ヒト動物であって、その生殖系のゲノムに:
(i)免疫グロブリンハイブリッド鎖をコードするハイブリッドの免疫グロブリン遺伝子座であって、そのそれぞれが少なくとも機能性CH1ドメインをコードする1つ以上の重鎖定常領域遺伝子を含む、免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント(VL及びJL)を前記ハイブリッドの免疫グロブリン遺伝子座が含み、前記VL及びJL遺伝子セグメントが、前記免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された再配列されたヒトVL/JL遺伝子配列を含むハイブリッドの配列を形成するように再配列することが可能である、前記ハイブリッドの免疫グロブリン遺伝子座と;
(ii)ヒトユニバーサル軽鎖をコードする軽鎖遺伝子座であって、免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された、再配列されたヒトユニバーサル軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む軽鎖遺伝子座と、を含み、
前記非ヒト動物が、前記ハイブリッドの遺伝子座に由来するヒト免疫グロブリンハイブリッド鎖と、前記軽鎖遺伝子座に由来する同種のヒトユニバーサル軽鎖とを含む抗原結合タンパク質を生成することが可能であり、前記ヒト免疫グロブリンハイブリッド鎖が、機能性CH1ドメインを含む、重鎖定常IgD、IgG、IgE、又はIgA領域に融合されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変(hVL/CHxULC)ドメインを含み、かつ前記ヒトユニバーサル軽鎖が、軽鎖定常ドメインに融合されたヒト免疫グロブリン軽鎖を含む、非ヒト動物。 - 前記抗原結合タンパク質を発現するB細胞を更に含む、請求項13に記載の非ヒト動物。
- 請求項13又は14に記載の非ヒト動物を作製する方法であって、
(i)免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む軽鎖遺伝子座と、
(ii)再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント(VL及びJL)を含み、インタクトなIgμ遺伝子、インタクトなIgδ遺伝子、インタクトなIgγ遺伝子、インタクトなIgα遺伝子、及び/又はインタクトなIgε遺伝子を含む免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された、再配列されたヒトVL/JL遺伝子配列を形成するように再配列することが可能なハイブリッドの免疫グロブリン鎖遺伝子座とを、前記非ヒト動物の生殖系のゲノムが含むように、前記非ヒト動物の生殖系のゲノムを改変することを含む、方法。 - 前記非ヒト動物の生殖系のゲノムを改変することが、
(a)内因性の重鎖遺伝子座にある、すべての内因性の機能性免疫グロブリン重鎖VH、D、及びJH遺伝子セグメントを、再配列されていないヒト免疫グロブリンVL及びJL遺伝子セグメントに交換し、前記再配列されていない軽鎖可変遺伝子セグメントを、内因性の重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結させることと、
(b)内因性の軽鎖遺伝子座にある、すべての内因性の機能性軽鎖VL及びJL遺伝子セグメントを、再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列に交換し、前記再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を、内因性の軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結させること、とを含む、請求項15に記載の方法。 - 前記ハイブリッドの免疫グロブリン鎖遺伝子座が、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された、再配列されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域(VL及びJL)遺伝子セグメントを含み、かつ前記軽鎖遺伝子座が、非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結された、前記再配列されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む、請求項13又は14に記載の動物、又は請求項15又は16に記載の方法に従って作製される動物。
- 前記非ヒト動物が齧歯類である、請求項17に記載の動物。
- 前記齧歯類がラット又はマウスである、請求項18に記載の動物。
- 免疫グロブリン軽鎖可変VL/CHxULCドメイン又は免疫グロブリン軽鎖可変VL/CHxULCドメインをコードする核酸を発現している細胞の単離のための、請求項13〜14及び17〜19のいずれか一項に記載の非ヒト動物の使用、又は請求項15又は16に記載の方法により作製された非ヒト動物の使用。
- ヒト免疫グロブリン軽鎖可変VL/CHxULCドメインを含む結合成分をコードする核酸であって、前記核酸が、非ヒト若しくはヒト免疫グロブリン重鎖定常遺伝子、又は非ヒト若しくはヒト免疫グロブリン軽鎖定常遺伝子に、作動可能に連結されている、再配列されたヒトVL/JL遺伝子配列を含む、核酸。
- 前記非ヒト免疫グロブリン重鎖定常遺伝子が、インタクトな齧歯類Igμ遺伝子、インタクトな齧歯類Igδ遺伝子、インタクトな齧歯類Igγ遺伝子、インタクトな齧歯類Igε遺伝子、インタクトな齧歯類Igα遺伝子、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項21に記載の核酸。
- 前記ヒト免疫グロブリン重鎖定常遺伝子が、ヒトIgμ遺伝子、ヒトIgδ遺伝子、ヒトIgγ遺伝子、ヒトIgε遺伝子、ヒトIgα遺伝子、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項21に記載の核酸。
- 前記ヒト免疫グロブリン重鎖定常遺伝子が、ヒトIgγ遺伝子である、請求項23に記載の核酸。
- 前記ヒトIgγ遺伝子が、IgG1、IgG2、及びIgG4からなる群から選択されるIgG下位クラスをコードする、請求項24に記載の核酸。
- 前記ヒトIgγ遺伝子が、前記CH3における、コードされている前記CH3ドメインの、Aタンパク質に対する結合親和性を、野生型のCH3ドメインと比較して減少させる配列をコードする突然変異を含む、請求項25に記載の核酸。
- 軽鎖定常領域に融合されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変VL/CHxULCドメインを含む結合成分をコードする核酸であって、前記核酸が、非ヒト若しくはヒト免疫グロブリン軽鎖定常遺伝子に、作動可能に連結されている、再配列されたヒトVL/JL遺伝子配列を含む、核酸。
- 請求項21〜27のいずれか一項に記載の核酸を含む細胞。
- 前記細胞がリンパ球である、請求項28に記載の細胞。
- 前記細胞が宿主細胞である、請求項29に記載の細胞。
- 多特異性の抗原結合タンパク質を作製する方法であって、宿主細胞内に、
(i)機能性CH1ドメインをコードする配列を含む、第1の非ヒト又はヒト重鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結されているヒトVL/CHxULCドメインをコードする核酸配列を含み、前記ヒトVL/CHxULCドメインが、同種の可変ドメインとは独立に、第1のエピトープに結合する、第1の核酸と、
(ii)機能性CH1ドメインをコードする配列を含む第2の非ヒト又はヒト重鎖定常領域遺伝子と融合された、ヒトVHxULCドメイン又は第2のヒトVL/CHxULCドメインのいずれか一方をコードする核酸配列を含み、前記VHxULCドメイン又は前記第2のVL/CHxULCドメインが、同種の可変ドメインとは独立に、前記第1の抗原決定基とは同一ではない第2のエピトープと結合する第2の核酸と、
(iii)非ヒト又はヒト軽鎖定常ドメインに融合されたヒトユニバーサル軽鎖可変ドメインをコードする第3核酸と、を共発現させることを含む方法。 - 前記第1の重鎖定常領域遺伝子及び前記第2の重鎖定常領域遺伝子が、ヒト重鎖定常領域遺伝子であり、かつ前記軽鎖定常ドメインがヒト軽鎖定常ドメインである、請求項31に記載の方法。
- 請求項31又は32に記載の方法にしたがって作製された抗原結合タンパク質。
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