JP5804521B2 - コレクション及びその使用方法 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１０年１月２９日に出願された米国特許仮出願第６１／２９９，４０１号及び２００９年５月２９日に出願された米国特許仮出願第６１／１８２，３５０号の利益を主張するものであり、これらは両方とも、参照によりこれらの全体が組み込まれる。

医薬品開発、特に治療用抗体の分野が進歩したことにより、多くの疾患の治療が急速に可能に及び／又は向上しつつある。これらの進歩は、新規の標的空間に到達すること及び新規の作用機構を提供することによるものであり、最も重篤で最も困難な疾患でさえ、患者の生活の質を次第に向上させている。医療制度一般及び特に患者に関する１つの課題は、これら医薬品の進歩により可能になった新薬の価格も、急速に増大しているということである。価格が高いのは、医薬品、特に抗体の開発には、今や上市製品１つ当たり１０億ドルを超える投資が必要とされることの結果である。開発は失敗するリスクが高く、開発スケジュールは非常に長期にわたるため、こうした投資は避けられないものとなっている。潜在的な治療用抗体が特定されてから、それが上市され患者に有益性を与えることができるようになるまで、１５年を超える時間がかかる場合がある。特定、前臨床、臨床から上市までの開発の各段階には、難問及びリスクが待ち構えている。製薬会社は、絶えず評価を行って、最も有効な薬を迅速に患者の手に届けるために、及びそれらを手に入れ易いものにするために、スケジュール及び失敗のリスクを抑えることにより開発コストを低減する方法を決定している。

以下の開示は、ほぼ間違いなくあらゆる疾患を治療するための最適な治療用抗体のより迅速な特定を可能にする有用な進歩を提供する。治療用抗体候補は、長期安定性及び高発現収率等の、上市するための多数の開発基準を満たさなければならない。本開示の進歩により、厳しい開発基準を全て最初から満たすことができる抗体を特定する確率及び速度が増大する。その結果生じる抗体は、生産がより安価であり、多くの疾患の治療に有効及び安全であるだろう。

治療用抗体を特定するためのある周知の方法は、ファージディスプレイ技術の使用による。ファージディスプレイでは、細菌中で増殖するウイルス様粒子を利用して抗体を提示させる。この技術の１つの利点は、使用されるライブラリーが、最大１×１０^１０個の抗体と膨大であるということであり、それら抗体は、任意の疾患に関連する任意の標的に対する結合を迅速に試験することができる。例えば、Ｋｎａｐｐｉｋら、（２０００年）、“Ｆｕｌｌｙ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｈｕｍａｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ（ＨｕＣＡＬ）ｂａｓｅｄ ｏｎ ｍｏｄｕｌａｒ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｆｒａｍｅｗｏｒｋｓ ａｎｄ ＣＤＲｓ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｗｉｔｈ ｔｒｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１；２９６巻（１号）：５７〜８６頁を参照されたい。そのような多数の抗体を用いて作業することの利点は、標的に対するスクリーニングの結果として、治療標的に結合しそれらの全てが治療に関連する可能性のある数百個の抗体がもたらされるということである。しかしながら、問題は、これら抗体のうちほんの少数のみが開発可能であることが多く、つまりほんの少数の抗体だけが上市に必要とされる厳しい基準を全て満たすことができるということである。

新しいファージディスプレイライブラリーが特定のためのスケジュールを急速に短縮し固有のリスクを低減するためには、ライブラリーには、選択及び臨床開発に必要な特性、及び安全で有効な治療を患者にもたらすことになる特性を有する抗体が含まれているべきである。そのような特性には、以下のものが含まれる：１）ファージディスプレイ率が高く、その結果、コレクションの全ての抗体を、目的標的に対して試験することができること；２）発現レベルが高く、そのため抗体又は断片を効率的に再生産することができること；３）熱安定性が高く、そのため抗体を有効な形態で患者に到達させることができること；４）血清安定性が高く、そのため抗体が、治療に適切な時間体内に残存することができること；５）免疫原性のリスクが低く、そのため安全性が増加すること；及び５）多様性が高く、そのため１つのライブラリーを使用して任意の治療標的に対する抗体を特定することができること。

ライブラリーは、本質的な点でヒト免疫系を模倣し、非常に有用な又は最適な解決策でさえあるはずである。ヒト免疫系は、生殖系遺伝子によりコードされる抗体で構成される。抗体は、部分的には、可変重鎖及び変数軽鎖で構成される。およそ５０個の可変重鎖生殖系遺伝子及びおよそ５０個の可変軽鎖生殖系遺伝子が存在しており、それらが組み合わされて、約２，５００通りの組み合わせの様々な可変重鎖及び軽鎖対が提供される。ヒトでは、２５００通りのこれら組み合わせ全てが産生されると考えられている。しかしながら、ある特定の可変重鎖、可変軽鎖、及び／又は可変重鎖と可変軽鎖との組み合わせ（対）が、他よりも高いレベルで発現されることが見出されている。あるものが他よりも多く発現されるのには何らかの理由があるはずであり、もしそうならば、高度に発現される生殖系遺伝子は、好ましい機能的特性を有している可能性があると仮定された。従って、好ましい機能的特性を有する抗体のライブラリーを提供する１つの方法は、ヒト免疫レパートリーに由来する豊富な可変重鎖、可変軽鎖、及び／又は可変重鎖生殖系と可変軽鎖生殖系との生殖系対を含むライブラリーを生成することである。

加えて、ヒトに存在する生殖系遺伝子配列は、明白な理由で、非常に低い免疫原性を有すると考えられ、従ってこれら配列を、組換え抗体中に再現して、免疫原性のリスクを低下させることができる。

ヒト免疫レパートリーに多く出現する可変重鎖及び可変軽鎖生殖系遺伝子対形成体を評価する手法が試みられてきた。その全体が参照により組み込まれる、ｄｅ Ｗｉｌｄｔら、Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｅａｖｙ ａｎｄ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｐａｉｒｉｎｇｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ｔｈａｔ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｄｉｔｉｎｇ ｓｈａｐｅｓ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２２；２８５巻（３号）：８９５〜９０１頁（１９９９年１月）を参照されたい。Ｗｉｌｄｔらは、ヒト供与体から血液試料を採取し、体細胞超変異を起こしたＩｇＧ＋Ｂ細胞を選別し、ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅し、各ｃＤＮＡを配列決定し、各配列を、既知のヒト可変ドメイン生殖系遺伝子に対してアラインした。Ｗｉｌｄｔらは、ほんの少数の生殖系遺伝子が免疫レパートリーの大多数を占めており、高頻度で発現される重鎖及び軽鎖遺伝子セグメントが対を形成することが多いことを観察した。

個々のＢ細胞の重鎖及び軽鎖可変ドメイン対形成体を維持する試みもなされている。例えば、可変ドメイン「同種対」のライブラリーが開示されている。Ｍｅｉｊｅｒら、Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ ｗｉｔｈ ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎａｔｕｒａｌ ｈｅａｖｙ ａｎｄ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｐａｉｒｉｎｇ、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，３５８巻（３号）：７６４〜７２頁（２００６年５月５日）、及び国際公開第２００５０４２７７４号を参照されたい。Ｍｅｉｊｅｒらに記載の技術によるライブラリーは、免疫された宿主に由来する個々のＢ細胞から生成された。一般的に、体細胞超変異した細胞を表すＣＤ３８^ＨＩ Ｂ細胞が選択されるように、Ｂ細胞がＦＡＣＳで選別され、それらのｃＤＮＡがＰＣＲ増幅され、抗体遺伝子産物が、選択用のＦａｂベクターに挿入される。そのような同種対ライブラリーには、制限がないわけではない。例えば、Ｂ細胞を提供する宿主は、典型的には免疫されており、選別されたＢ細胞集団は超変異しており、従ってその結果生じたライブラリーは、特定の免疫原に偏っている。

加えて、ライブラリーを生成するために、顕著な可変重鎖又は可変軽鎖を使用する試みがなされている。例えば、Ｓｈｉら、“Ｄｅ Ｎｏｖｏ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｉｇｈ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｆａｂ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ Ｄｉｓｐｌａｙｅｄ ｏｎ Ｐｈａｇｅ ａｓ ｐＩＸ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ；Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，３９７巻（２号）：３８５〜９６頁（２０１０年３月２６日）（これを、本発明が関する従来技術と認めるものではない）及び対応する特許出願である国際公開第２００９０８５４６２号、並びに国際公開第２００６０１４４９８号においては、可変重鎖又は可変軽鎖生殖系タンパク質配列は、ヒト免疫レパートリーにおけるそれらの出現頻度に基づいてライブラリーに組み込まれた。

特定の生殖系対をライブラリーに組み込む追加的な試みもなされている。例えば、国際公開第１９９９０２０７４９号には、そのメンバーが、ヒト生殖系重鎖遺伝子セグメントＤＰ−４７（ＩＧＨＶ３−２３）によりコードされた超可変ループの基準構造を有する重鎖、及び／又はその生殖系遺伝子によりコードされたフレームワーク領域、及び／又はヒト生殖系軽鎖遺伝子セグメントＯ２／Ｏ１２（ＩＧＫＶ１−３９／１Ｄ−３９）によりコードされた超可変ループの基準構造を有する軽鎖、及び／又はその生殖系遺伝子によりコードされたフレームワーク領域を含むライブラリーが記述されている。

追加的な手法により、Ｂ細胞から直接的に又はＢ細胞に由来するライブラリーが生成されている。例えば、Ｇｌａｎｖｉｌｌｅら、Ｐｒｅｃｉｓｅ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ａ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｇｉｖｅｓ Ｉｎｓｉｇｈｔ ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １；１０６巻（４８号）：２０２１６〜２１頁（２００９年１２月）（これを、本発明が関する従来技術と認めるわけでない）、これには、多様な６５４個のヒト供与体免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）レパートリーから構築された抗体ライブラリーが記述されている。具体的には、６５４個のヒト供与体に由来する重鎖及び軽鎖Ｖ遺伝子ｃＤＮＡを、別々にＰＣＲ増幅し（可変重鎖及び軽鎖対を分離して）、その後重鎖及び軽鎖ドメインを無作為に再結合させた。国際公開第２００３０５２４１６号には、微生物による感染又はワクチンによる処理のいずれかから生じた目的病原体に対して顕著な応答を示す宿主からＢ細胞を単離することが記述されている。国際公開第２００３０５２４１６号では、可変領域のＣＤＲ３領域をコードするｃＤＮＡが配列決定され、優勢なＣＤＲ３を含む抗体断片が設計された。国際公開第２００９１００８９６号には、免疫された宿主からのＢ細胞の単離が記述されており、可変重鎖及び軽鎖領域をコードするｃＤＮＡが配列決定され、未対形成の可変重鎖及び可変軽鎖配列の量が決定された。国際公開第２００９１００８９６号（これを、本発明が関する従来技術と認めるものではない）では、無作為に再結合された可変重鎖及び可変軽鎖を含むライブラリーが合成され、そこでは抗体は、１つの免疫原に対して特異的だった。これらの手法及び更なる手法の要約は、Ｆｕｈら、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｓ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．，７巻（１号）：７３〜８７頁（２００７年１月）に見出される。

従って、ヒト免疫レパートリーで発現された可変重鎖及び可変軽鎖生殖系遺伝子対が組み込まれており、好ましい生物物理学的特性を有し、患者に安全及び有効である、容易に開発可能な抗体に結び付く抗体又はそれらの断片のコレクションに対する高い必要性が存在する。これら必要性及び他の必要性は、本発明により満たされる。

本開示は、開発可能であり患者に安全及び有効である任意の標的に対する抗体を効率的に特定するという問題に対する有用な解決策を提供する。その最も一般的な意味において、本発明者らは、ヒト免疫系を模倣する抗体ライブラリーが本質的な点で有利であり得るというアイデアから出発した。１つのレベルでは、本発明者らは、ヒト免疫レパートリーに由来する最適な生殖系遺伝子配列を抗体に組み込むことにより、ヒト免疫系を模倣することを試みた。そのため、幾つかの実施形態では、ライブラリーの抗体は、配列が生殖系である部分、例えばフレームワーク領域を含む。生殖系配列を使用することにより、患者における治療用組換え抗体の免疫原性のリスクが劇的に減少されるはずである。

加えて、本発明者らは、ヒト免疫レパートリーに豊富に存在する可変重鎖及び可変軽鎖生殖系遺伝子対が、より効率的な臨床開発に結び付き、その結果生じた抗体の患者における安全性及び効能を増加させることになる好ましい生物物理学的特性を有する可能性が高いという自らの仮説に基づき研究を行った。背景情報として、各Ｂ細胞は１つの抗体をコードし、各抗体は可変重鎖及び可変軽鎖を含む。抗体の可変重鎖及び変数軽鎖の各々は、生殖系配列とアラインして抗体の由来を決定することができ、つまり、生殖系遺伝子から可変重鎖及び可変軽鎖がコードされる。従って、各抗体につき、可変重鎖及び可変軽鎖は生殖系対で構成されており、例えばＶＨ３−２３はＶＫ１−５と対になる。

顕著な生殖系遺伝子対は、好ましい生物物理学的特性を有する可能性が高いという仮説を証明するための最初のステップは、ヒト免疫レパートリーに存在する可変重鎖及び可変軽鎖生殖系遺伝子対を特定することだった。これは、公的に入手可能な文献を広範囲に探索することにより、及びヒト宿主からＢ細胞をサンプリングすることにより実施した。次のステップとして、生データを統合し、分析し、ヒト免疫レパートリーに存在する可変重鎖及び可変軽鎖生殖系対を、それらの出現率で順位付けした。このデータから、ある特定の可変重鎖及び可変軽鎖生殖系遺伝子対が、ヒト免疫レパートリー中で他よりも高頻度で存在したことは明らかだった。

加えて、本発明者らは、ある特定の可変重鎖及び可変軽鎖生殖系遺伝子対が、抗原経験済Ｂ細胞と比べて、未感作Ｂ細胞（抗原未経験）で差別的に発現される可能性があると考え、従って統合データを、サンプリングしたＢ細胞の発生又は分化に基づいて分析した。本発明者らの分析から、ある特定の生殖系遺伝子対が、抗原経験済Ｂ細胞集団と比べて、未感作Ｂ細胞集団で差別的に発現されることは明らかである。

次のステップとして、ヒト免疫レパートリーには約２５００対が存在するため、どの生殖系タンパク質対を試験すべきかを決定しなければならなかった。１つに方法は、ヒト免疫レパートリーで最も顕著に生じる可変重鎖及び可変軽鎖生殖系タンパク質対を試験することであろう。例えば、表１８を参照されたい。例えば、試験用に上位４００対を選択してもよく、又はある閾値濃度を超えて発現された可変重鎖及び可変軽鎖生殖系遺伝子対を選択してもよい。この手法では、多数の可変重鎖及び可変軽鎖生殖系タンパク質対配列の合成及び試験が必要とされることになり、従って、そのような手法は、あまり効率的ではない場合がある。

代替的な手法として、本発明者らは、ヒト免疫レパートリーから顕著に発現された対の大多数を代表するか、正確に再現するか、又は包含する可変重鎖及び可変軽鎖生殖系対のサブセットを選択した。この手法は、少数の可変重鎖、可変κ軽鎖、及び可変λ軽鎖生殖系遺伝子が、ヒト免疫レパートリーにおいて優勢であるという観察に、部分的に基づいていた。この現象は、Ｗｉｌｄｔらの８９５〜８９６頁に記述されている。Ｗｉｌｄｔらは、高頻度で発現された重鎖及び軽鎖遺伝子セグメントが対を形成することが多いということも述べており、サンプリングされた対形成体の半分は、わずか５つの生殖系対に対応するに過ぎないことも観察された。従って、少数の顕著に発現された重鎖及び軽鎖生殖系遺伝子（未対形成）を組み合わせて、ヒト免疫レパートリーを代表する一群の対を生成することができる。

この手法は、以下のように行われた。統合データ及び追加的データ（結合している対ではなく、ＶＨ又はＶＬのみの発現を特定）を分析して、ヒト免疫レパートリーでの可変重鎖、可変κ軽鎖、及び可変λ軽鎖生殖系遺伝子の発現を決定した。次のステップとして、顕著に発現された可変重鎖、可変κ軽鎖、及び可変λ軽鎖生殖系タンパク質配列（未対形成）を評価して、開発に関連するそれらの生物物理学的特性を決定した。可変重鎖、可変κ軽鎖、及び可変λ軽鎖生殖系タンパク質配列を、以下の特性についてｉｎ ｓｉｌｉｃｏで評価した：（ｉ）ＣＤＲの長さ、（ｉｉ）等電点（ｐＩ）（好ましい等電点は、中性製剤緩衝液中での安定性を提供するはずであるため、８以上である）、（ｉｉｉ）翻訳後修飾（ＰＴＭ）（具体的には、Ｎ−結合グリコシル化部位（ＮｘＳ又はＮｘＴ）又はＡｓｐ切断（多くの場合、ＤＰにおける）等の化学的修飾、（ｉｖ）Ａｓｐ異性化（ＤＤ、ＤＧ）、（ｖ）脱アミド化（ＮＳ、ＮＧ）、これは、ｉｎ ｖｉｖｏ（血清中）で又は製剤緩衝液中での保管時に生じ、抗体結合の喪失に結び付く場合がある、（ｖｉ）ＣＤＲにおけるメチオニンの存在（溶媒との接触時に酸化される場合がある）、（ｖｉｉ）未対形成システインの存在（任意の他の未対形成システインとジスルフィド結合を形成することになり、従ってタンパク質の架橋及び／又は発現レベルの低下に結び付く）、（ｖｉｉｉ）生殖系からの逸脱、（ｉｘ）潜在的なＴ細胞エピトープの存在、及び（ｘ）理論上の凝集傾向。

次のステップとして、好ましい生物物理学的特徴を有する可変重鎖、可変κ軽鎖、及び可変λ軽鎖生殖系対を組み合わせて、可変重鎖及び可変軽鎖対を形成した。この対のサブセットは、表２３に示されているような、ヒト免疫レパートリーから顕著に発現された対の大多数を代表するか、正確に再現するか、又は包含する。これは、可変重鎖及び軽鎖生殖系遺伝子を合成し、それらを組み合わせて対にし、それら対をタンパク質として発現させ、各々を試験して、それらの生物物理学的特性を特定することにより実施した。以下の特性を試験した：（ｉ）ファージでのＦａｂ型の相対的提示率、（ｉｉ）例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でのＦａｂ型の相対的発現レベル、（ｉｉｉ）Ｆａｂ型の熱安定性、（ｉｖ）Ｆａｂ型のウシ又はマウス血清安定性、（ｖ）ＩｇＧ型の相対的発現レベル、（ｖｉ）ＩｇＧ型のウシ血清安定性。

好ましい生物物理学的特性を有する生殖系タンパク質対が特定されたならば、その後、それら対を含むようにコレクションを設計した。本開示の態様は、開発可能性を増強する有利な特性を有する可変重鎖及び軽鎖生殖系遺伝子対を含むが、それらがヒト免疫レパートリーで顕著に発現される場合でさえ、そのような特性を有していない可変重鎖及び軽鎖生殖系遺伝子対が除外されている、抗体又は機能的断片のコレクションである。このように、コレクションは、有利な機能的特性を有していない自然に生じる可変重鎖及び軽鎖の組み合わせ又は対（２，５００対の中から）を除外するように設計した。例えば、ＶＨ４−３４は、表２０に示されているようにヒト免疫レパートリーで高頻度に生じているが、この重鎖生殖系遺伝子に由来する抗体は、Ｂ細胞細胞毒性であることも知られており、従ってこの遺伝子に由来する抗体を、ライブラリー設計から除外することができる。Ｂｈａｔら、Ｒａｐｉｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｂ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＶＨ４−３４（ＶＨ４．２１）ｇｅｎｅ−ｅｎｃｏｄｅｄ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０５巻（１号）：１８３〜９０頁（１９９６年７月）を参照されたい。

幾つかの実施形態では、本コレクションには、多数の機能的に有利な可変重鎖及び軽鎖の組み合わせ又は対を含む抗体が含まれ、その結果、コレクションの抗体は、非常に多様であり、従って任意の治療標的に対する抗体を特定するために使用することができるコレクションが提供される。

そのようなコレクションは、従来技術の問題の多くを克服する。例えば、そのようなライブラリーに存在するＶＨ及びＶＬクラス対形成体は、Ｂ細胞試料に存在するクラス対形成体と同一であるため、Ｂ細胞に由来する同種ライブラリーは、この概念を具現化しない。十分に大きなＢ細胞試料が得られれば、およそ５０個のＶＨ及び５０個のＶＬクラス対形成の各々の組み合わせ（２５００通り）が存在するであろう。本開示におけるＶＨ及びＶＬ対の広範な試験により、ＶＨ及びＶＬ生殖系遺伝子対の多くは、臨床における開発可能性を可能にすることになる特性を有していないことが示される。従って、そのような同種ライブラリーは、開発可能ではない可能性が高い多くのＶＨ及びＶＬ対を含んでいる。従って、有利な機能的特性を有するＶＨ及びＶＬクラス対のみを含む大きな多様性の高いライブラリーを生成することが望ましい場合があるが、同種ライブラリーの手法では、それは可能ではない。

加えて、幾つかの実施形態では、コレクションに含まれる生殖系遺伝子対は、未感作又は抗原未経験のＢ細胞の試料に基づいており、従って、代表的な生殖系遺伝子対は特定の免疫原に偏っておらず、コレクションは、任意の免疫原に対するスクリーニングにおいてより優れている場合がある。

ＶＨ３−２３重鎖（上段パネル）及びＶＨ１−６９重鎖（下段パネル）を有し、各抗体が、Ｃ−末端制限部位ＡｆｌＩＩ（ＶＬＳ）、ＮｈｅＩ（ＶＬＡ）、及びＡｖｒＩＩ（ＶＬＧ）を含む３つの修飾ｐｈｏＡシグナル配列のうちの１つを保持する抗体の周辺質抽出後の抗Ｆｄ発現ＥＬＩＳＡの結果を、野生型（ＴＫＡ）シグナル配列と比較して示す図である。ＶＨ３−２３群では、修飾ｐｈｏＡシグナル配列は全て、野生型（ＴＫＡ）の範囲の発現レベルを維持した。 ＶＫ１−３９軽鎖（左上段パネル）、ＶＫ３−１１軽鎖（右上段パネル）、ＶＬ１−４０軽鎖（左下段パネル）、及びＶＬ３−１軽鎖（右下段パネル）を有し、各抗体が、Ｃ末端制限部位ＮｄｅＩ（ＡＹＧ）、ＮｄｅＩ（ＡＹＡ）、及びＢｓｉＷＩ（ＴＹＡ）を含む３つの修飾ｏｍｐＡシグナル配列のうちの１つを保持する抗体の周辺質抽出後の抗Ｆｄ発現ＥＬＩＳＡの結果を、野生型（ＡＱＡ）シグナル配列と比較して示す図である。Ｃ末端制限部位を含む修飾ｏｍｐＡシグナル配列及び野生型シグナル配列を、Ｖκ及びＶλＦａｂ断片の両方を使用して試験した。ＮｄｅＩ（ＡＹＡ）を含むシグナル配列は、野生型（ＡＱＡ）と一致して同等な又はより良好な発現を示す。 実施例１〜１．３に詳述されているようにｐｈｏＡ及びｏｍｐＡ大腸菌シグナル配列をＣ末端に組み込むために選択された制限部位を示す図であり、この図には、ＣＤＲ３付近のシグナル配列及びそれらのそれぞれの方向性が含まれている。この図は、大腸菌シグナル配列を示す一方で、実施例１．５に詳述されているように、ＩｇＧ発現で使用されるヒト重鎖及びカッパ鎖リーダー配列に組み込むために選択されたＣ末端制限部位も表す。 Ｔｓｕｉｊｉ Ｍ．ら（２００６年）で単離及び記述されたＢ細胞のＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対を示す図である。 Ｔｓｕｉｊｉ Ｍ．ら（２００６年）で単離及び記述されたＢ細胞のＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対を示す図である。 Ｔｓｕｉｊｉ Ｍ．ら（２００６年）で単離及び記述されたＢ細胞のＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対を示す図である。 Ｔｓｕｉｊｉ Ｍ．ら（２００６年）で単離及び記述されたＢ細胞のＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対を示す図である。 Ｔｓｕｉｊｉ Ｍ．ら（２００６年）で単離及び記述されたＢ細胞のＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対を示す図である。 Ｔｓｕｉｊｉ Ｍ．ら（２００６年）で単離及び記述されたＢ細胞のＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対を示す図である。 Ｔｉｌｌｅｒ Ｔ．ら（２００７年）で単離及び記述されたＢ細胞のＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対を示す図である。 Ｔｉｌｌｅｒ Ｔ．ら（２００７年）で単離及び記述されたＢ細胞のＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対を示す図である。 Ｔｉｌｌｅｒ Ｔ．ら（２００７年）で単離及び記述されたＢ細胞のＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対を示す図である。 Ｍｉｅｔｚｎｅｒ Ｂ．ら（２００８年）で単離及び記述されたＢ細胞のＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対を示す図である。 Ｍｉｅｔｚｎｅｒ Ｂ．ら（２００８年）で単離及び記述されたＢ細胞のＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対を示す図である。 Ｍｉｅｔｚｎｅｒ Ｂ．ら（２００８年）で単離及び記述されたＢ細胞のＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対を示す図である。 Ｍｉｅｔｚｎｅｒ Ｂ．ら（２００８年）で単離及び記述されたＢ細胞のＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対を示す図である。 Ｍｉｅｔｚｎｅｒ Ｂ．ら（２００８年）で単離及び記述されたＢ細胞のＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対を示す図である。 Ｗａｒｄｅｍａｎｎ Ｈ．ら（２００３年）で単離及び記述されたＢ細胞のＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対を示す図である。 Ｗａｒｄｅｍａｎｎ Ｈ．ら（２００３年）で単離及び記述されたＢ細胞のＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対を示す図である。 Ｗａｒｄｅｍａｎｎ Ｈ．ら（２００３年）で単離及び記述されたＢ細胞のＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対を示す図である。 Ｙｕｒａｓｏｖ Ｓ．ら（２００５年）で単離及び記述されたＢ細胞のＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対を示す図である。 Ｙｕｒａｓｏｖ Ｓ．ら（２００５年）で単離及び記述されたＢ細胞のＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対を示す図である。 Ｙｕｒａｓｏｖ Ｓ．ら（２００５年）で単離及び記述されたＢ細胞のＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対を示す図である。 Ｙｕｒａｓｏｖ Ｓ．ら（２００６年）で単離及び記述されたＢ細胞のＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対を示す図である。 Ｙｕｒａｓｏｖ Ｓ．ら（２００６年）で単離及び記述されたＢ細胞のＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対を示す図である。 Ｙｕｒａｓｏｖ Ｓ．ら（２００６年）で単離及び記述されたＢ細胞のＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対を示す図である。 実施例２．２に詳述されているように、ヒト宿主から単離された、単一の選別された成熟未感作（ｍｎ）Ｂ細胞及び抗体分泌細胞（ａｓｃ）のｃＤＮＡの増幅に使用されたＰＣＲ戦略を示す図である。 実施例２．２に詳述されているように、ヒト試料から単離されたＢ細胞のＶＨ／ＶＬ対を示す図である。 実施例２．２に詳述されているように、ヒト試料から単離されたＢ細胞のＶＨ／ＶＬ対を示す図である。 実施例２．２に詳述されているように、ヒト試料から単離されたＢ細胞のＶＨ／ＶＬ対を示す図である。 実施例２．２に詳述されているように、ヒト試料から単離されたＢ細胞のＶＨ／ＶＬ対を示す図である。 実施例２．２に詳述されているように、ヒト試料から単離されたＢ細胞のＶＨ／ＶＬ対を示す図である。 実施例２．２に詳述されているように、ヒト試料から単離されたＢ細胞のＶＨ／ＶＬ対を示す図である。 実施例２．２に詳述されているように、ヒト試料から単離されたＢ細胞のＶＨ／ＶＬ対を示す図である。 実施例２．２に詳述されているように、ヒト試料から単離されたＢ細胞のＶＨ／ＶＬ対を示す図である。 実施例２．２に詳述されているように、ヒト試料から単離されたＢ細胞のＶＨ／ＶＬ対を示す図である。 実施例４〜４．１に詳述されているように、合成、組み合わせ、及び機能的特徴付けのために選択された２０個のＶＨ生殖系遺伝子を示す図である。この図は、各生殖系遺伝子のｉｎ ｓｉｌｉｃｏ分析の結果も示しており、ｐＩは等電点を表し、ＰＴＭは、本明細書中に記述されているような、相補性決定領域における翻訳後修飾であり、ＮｘＳ／Ｔは、Ｎ結合グリコシル化部位であり、ＣＤＲにおけるＭｅｔは、メチオニンである。 実施例４〜４．１に詳述されているように、合成、組み合わせ、及び機能的特徴付けのために選択された８個のＶλ及び１２個のＶκ生殖系遺伝子を示す図である。この図は、各生殖系遺伝子のｉｎ ｓｉｌｉｃｏ分析の結果も示しており、ｐＩは等電点を表し、ＰＴＭは、本明細書中に記述されているような、相補性決定領域における翻訳後修飾であり、ＮｘＳ／Ｔは、Ｎ結合グリコシル化部位であり、ＣＤＲにおけるＭｅｔは、メチオニンである。 図４〜２６に示されている実施例２．１及び図２８〜３６に示されている実施例２．２からの統合データのＶＨ／Ｖκ対を示す図である。数値入力は、統合データで特定された個々のＢ細胞に由来する各ＶＨ／Ｖκ生殖系遺伝子対の数を表す。Ｙ軸は、統合データにおける発現頻度の点で上（ＶＨ３−２３）から下（ＶＨ３−２０）に順位付けられたＶＨ生殖系遺伝子を示す。Ｘ軸は、統合データにおける発現頻度の点で左（ＩＧＫＶ３−２０）から右（ＩＧＫＶ１Ｄ−１７）に順位付けられたＶκ生殖系遺伝子を示す。１３５８という数字は、サンプリングされたＢ細胞の数である。 図４〜２６に示されている実施例２．１及び図２８〜３６に示されている実施例２．２からの統合データのＶＨ／Ｖλ対を示す図である。数値入力は、統合データで特定された個々のＢ細胞に由来する各ＶＨ／Ｖλ生殖系遺伝子対の数を表す。Ｙ軸は、統合データにおける発現頻度の点で上（ＶＨ３−２３）から下（ＶＨ３−２０）に順位付けられたＶＨ生殖系遺伝子を示す。Ｘ軸は、統合データにおける発現頻度の点で左（ＩＧＬＶ２−１４）から右（ＩＧＬＶ４−６０）に順位付けられたＶλ生殖系遺伝子を示す。７７９という数字は、サンプリングされたＢ細胞の数である。 図４〜２６に示されている実施例２．１、及び図２８〜３６に示されている実施例２．２からの統合データのＶＨ／Ｖκ対を示す図であるが、未感作ヒト免疫レパートリーで顕著なＶＨ／Ｖκ対を特定するために、未熟Ｂ細胞、新しく移動してきたＢ細胞、及び成熟未感作Ｂ細胞の抗原未経験Ｂ細胞集団のみが含まれている。数値入力は、統合データで特定された個々のＢ細胞に由来する各ＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対の数を表す。Ｙ軸は、統合データにおける発現頻度の点で上（ＶＨ３−２３）から下（ＶＨ３−２０）に順位付けられたＶＨ生殖系遺伝子を示す。Ｘ軸は、統合データにおける発現頻度の点で左（ＩＧＫＶ３−２０）から右（ＩＧＫＶ１Ｄ−１７）に順位付けられたＶκ生殖系遺伝子を示す。８８８という数字は、サンプリングされたＢ細胞の数である。 図４〜２６に示されている実施例２．１、及び図２８〜３６に示されている実施例２．２からの統合データのＶＨ／Ｖλ対を示す図であるが、未感作ヒト免疫レパートリーで顕著なＶＨ／Ｖλ対を特定するために、未熟Ｂ細胞、新しく移動してきたＢ細胞、及び成熟未感作Ｂ細胞の抗原未経験Ｂ細胞集団のみが含まれている。数値入力は、統合データで特定された個々のＢ細胞に由来する各ＶＨ／Ｖλ生殖系遺伝子対の数を表す。Ｙ軸は、統合データにおける発現頻度の点で上（ＶＨ３−２３）から下（ＶＨ３−２０）に順位付けられたＶＨ生殖系遺伝子を示す。Ｘ軸は、統合データにおける発現頻度の点で左（ＩＧＬＶ２−１４）から右（ＩＧＬＶ４−６０）に順位付けられたＶλ生殖系遺伝子を示す。４５７という数字は、サンプリングされたＢ細胞の数である。 図４〜２６に示されている実施例２．１及び図２８〜３６に示されている実施例２．２からの統合データのＶＨ／Ｖκ対を示す図であるが、ＩｇＧ抗体分泌細胞並びにＩｇＭ及びＩｇＧ記憶Ｂ細胞の抗原経験済Ｂ細胞集団のみが含まれている。数値入力は、統合データで特定された個々のＢ細胞に由来する各ＶＨ／Ｖκ生殖系遺伝子対の数を表す。Ｙ軸は、統合データにおける発現頻度の点で上（ＶＨ３−２３）から下（ＶＨ３−２０）に順位付けられたＶＨ生殖系遺伝子を示す。Ｘ軸は、統合データにおける発現頻度の点で左（ＩＧＫＶ３−２０）から右（ＩＧＫＶ１Ｄ−１７）に順位付けられたＶκ生殖系遺伝子を示す。４７０という数字は、サンプリングされたＢ細胞の数である。 図４〜２６に示されている実施例２．１及び図２８〜３６に示されている実施例２．２からの統合データのＶＨ／Ｖλ対を示す図であるが、ＩｇＧ抗体分泌細胞並びにＩｇＭ及びＩｇＧ記憶Ｂ細胞の抗原経験済Ｂ細胞集団のみが含まれている。数値入力は、統合データで特定された個々のＢ細胞に由来する各ＶＨ／Ｖλ生殖系遺伝子対の数を表す。Ｙ軸は、統合データにおける発現頻度の点で上（ＶＨ３−２３）から下（ＶＨ３−２０）に順位付けられたＶＨ生殖系遺伝子を示す。Ｘ軸は、統合データにおける発現頻度の点で左（ＩＧＬＶ２−１４）から右（ＩＧＬＶ４−６０）に順位付けられたＶλ生殖系遺伝子を示す。３２２という数字は、サンプリングされたＢ細胞の数である。 Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、（１９９２年）“Ｔｈｅ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｒｍｌｉｎｅ Ｖｈ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ Ｒｅｖｅａｌｓ ａｂｏｕｔ Ｆｉｆｔｙ Ｇｒｏｕｐｓ ｏｆ Ｖｈ Ｓｅｇｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ Ｌｏｏｐ”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７巻、７７６〜７９８頁；Ｍａｔｓｕｄａら、（１９９８年）、“Ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ ｌｏｃｕｓ”Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８８巻（１１号）：２１５１〜６２頁；及びＬｅＦｒａｎｃ ＭＰ（２００１年）“Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｈｅａｖｙ（ＩＧＨ）ｇｅｎｅｓ．”Ｅｘｐ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．１８巻（２号）：１００〜１６頁に記述されているような、ＶＨ生殖系遺伝子によりコードされたアミノ酸配列を示す図である。 Ｓｃｈａｂｌｅ及びＺａｃｈａｕ（１９９３年）、“Ｔｈｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ｇｅｎｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｋａｐｐａ ｌｏｃｕｓ，”Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ Ｈｏｐｐｅ Ｓｅｙｌｅｒ．３７４巻（１１号）：１００１〜２２頁；Ｂｒｅｎｓｉｎｇ−Ｋｕｐｐｅｒｓら、（１９９７年）、“Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｋａｐｐａ ｌｏｃｕｓ ｏｎ ｙｅａｓｔ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ（ＹＡＣｓ）”Ｇｅｎｅ．１９１巻（２号）：１７３〜８１頁；Ｋａｗａｓａｋｉら、（２００１年）、“Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｋａｐｐａ ｌｏｃｕｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｖｋａｐｐａ ｇｅｎｅｓ”Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３１巻（４号）：１０１７〜２８頁；及びＬｅｆｒａｎｃ ＭＰ（２００１年）“Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｋａｐｐａ（ＩＧＫ） ｇｅｎｅｓ”Ｅｘｐ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．、１８巻、１６１〜１７４頁に記述されているような、Ｖκ生殖系遺伝子によりコードされたアミノ酸配列を示す図である。 Ｋａｗａｓａｋｉら、（１９９７年）“Ｏｎｅ−Ｍｅｇａｂａｓｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｌａｍｂｄａ Ｇｅｎｅ Ｌｏｃｕｓ”Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７巻（３号）：２５０〜６１頁；Ｆｒｉｐｐｉａｔら、（１９９５年）Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｌａｍｂｄａ ｌｉｇｈｔ−ｃｈａｉｎ ｌｏｃｕｓ ｏｎ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ２２ｑ１１．２” Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．、４巻、９８３〜９９１頁；及びＬｅＦｒａｎｃ ＭＰ（２００１年）“Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｌａｍｂｄａ（ＩＧＬ）ｇｅｎｅｓ．Ｅｘｐ Ｃｌｉｎ ｌｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．；１８巻：２４２〜２５４頁に記述されているような、Ｖλ生殖系遺伝子によりコードされたアミノ酸配列を示す図である。 ｐＪＰｄ１トリシストロンファージディスプレイベクターを示す図である。 ｐＪＰｘ１ Ｆａｂ発現ベクターを示す図である。 ｐＭｘ１１（ｐＭＯＲＰＨＸ１１）Ｆａｂ発現ベクターを示す図である。 ｐＭＯＲＰＨ３０ Ｆａｂディスプレイベクターを示す図である。 ｐＪＰ＿ｈ＿ＩｇＧ１ｆ可変重鎖ＩｇＧ発現ベクターを示す図である。 ｐＪＰ＿ｈ＿Ｉｇ＿ｋａｐｐａ可変κ軽鎖ＩｇＧ発現ベクターを示す図である。 ｐＪＰ＿ｈ＿Ｉｇ＿ｌａｍｂｄａ２可変λ軽鎖ＩｇＧ発現ベクターを示す図である。 試験した４００個のＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対の相対的Ｆａｂ提示率を示す図である。より高い数値は、より高い提示レベルを示す。 試験した４００個のＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対の相対的Ｆａｂ発現レベルを示す図である。より高い数値は、より高いＦａｂ発現レベルを示す。 試験した４００個のＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対のＦａｂ型での温度安定性データを示す図である。６０及び７０という数字は、試験設定において６０又は７０℃にて４５分間安定しているＶＨ／ＶＬ対を示す。４という数字は、温度不安定対を示し、ｂｇは低発現レベルを示す。 試験した４００個のＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対のＦａｂ型でのウシ血清安定性データを示す図である。Ｓは、試験条件において安定していること、Ｕは不安定であることを表す。 試験した４００個のＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対のマウス血清安定性データを示す図である。Ｓは、試験条件において安定していること、Ｕは不安定であることを表す。 試験した４００個のＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対の相対的ＩｇＧ発現率を示す図である。より高い数値は、より高いＩｇＧ１発現レベルを示す。 試験した４００個のＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対のＩｇＧ型での血清安定性データを示す図である。Ｓは、試験条件において安定していること、Ｕは不安定であることを表す。

定義
本発明についての理解を容易にするために、以下の定義及び説明を提供する。

基本用語
数値及び範囲の文脈における用語「約」又は「およそ」は、当業者であれば本明細書に含まれている教示から明らかなように、所望の数又は割合の配列相同性を有すること等、本発明を意図されている通りに実施することができるような、提示されている値又は範囲を近似するか又はそれに近い数値又は範囲を指す。これは、少なくとも部分的には、培養条件の変動及び生物系の変異性による。従って、これら用語は、系統誤差から生じる誤差を超える値を包含する。これら用語は、暗示的なものを明示的にする。典型的には、「約」は、記載値の±１０％を包含する。従って、用語「約」は、範囲を記述するために使用することができる。

本明細書中で本発明の概要及び説明に示されている全ての範囲は、範囲の数値の付近にある又はその間にある全ての数又は値を含む。本発明の範囲は、その範囲にある全ての整数値、小数値、及び分数値を明示的に表記及び表示する。

用語「対象体」には、ヒト及び非ヒト動物が含まれる。非ヒト動物には、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、及び爬虫類等の脊椎動物、例えば哺乳動物及び非哺乳動物が全て含まれる。注記がある場合を除き、用語「患者」又は「対象体」は、本明細書では同義的に使用される。

用語「治療」には、組成物又は抗体を投与して、疾患の徴候、合併症、又は生化学的兆候の発症を予防又は遅延させて、徴候を緩和するか、又は疾患、症状、又は障害の更なる進行を停止又は阻害することが含まれる。従って、治療は「治癒」包含するが、それに限定されない。治療は、予防的であってもよく（疾患の発症を予防又は遅延させること、又はその臨床的又は無症状的徴候の顕在化を予防又は遅延すること）又は疾患が発症した後での徴候の治療的抑制又は軽減であってもよい。

「データベース又は読取可能媒体」は、本明細書で使用される場合、配列データを保存するためのあらゆるフォーマットを指し、従ってデータベースファイル、参照表、又はＥｘｃｅｌスプレッドシート等のあらゆる情報の蓄積を指す。ある実施形態では、データベースは、コンピュータ読取可能メモリデバイス等の電子的形態で保存される。これには、サーバー、クライアント、ハードディスク、ＣＤ、ＤＶＤ、Ｐａｌｍ Ｐｉｌｏｔ等の携帯情報端末、テープ、ジップディスク、コンピューターの内部ＲＯＭ（読出し専用メモリ）、又はインターネット若しくはワールドワイドウェブ等の媒体が含まれる。コンピューターによりアクセス可能なファイルを保存するための他の媒体は、当業者であれば明らかであろう。

「ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ」は、コンピューター上で実施される操作、分析、及び設計を指すが、同様に紙の上で又は頭の中で実施することもできる。

抗体及びそれらの特性
用語「抗体」は、本明細書で使用される場合、抗体全体を含む。抗体は、ポリクローナル抗体であってもよく、親和性精製されたポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、完全ヒト抗体、マウス又はげっ歯動物抗体、キメラ抗体、ラクダ抗体、又はヒト化抗体であってもよい。抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ（ヒトサブクラスＩｇＡ１及びＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、又はＩｇＭ等の抗体クラスのいずれに属していてもよい。天然「抗体」は、ジスルフィド結合により相互に結合された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。

用語「その機能的断片」は、本明細書で使用される場合、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｃ部分を含む単一鎖、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）、及び可変フレームワーク領域以外のスキャフォールドを有する他の抗体様構造等のあらゆる抗原結合断片を含む。用語「その機能的断片」は、抗体のあらゆる機能的部分を含むが、それに限定されず、機能には、免疫原の結合又はエフェクター機能が含まれる。

本明細書で使用される場合、用語「親和性」は、抗原性部位における抗体と抗原との相互作用の強度を指す。各抗原性部位内では、抗体「アーム」の可変領域は、非共有結合力により多数の部位で抗原と相互作用し、相互作用がより多ければ、親和性はより強くなる。本明細書で使用される場合、ＩｇＧ抗体等の抗体又はその機能的断片に関する「高親和性」という用語は、抗体が、１０^−８Ｍ以下、１０^−９Ｍ以下、又は１０^−１０Ｍ、又は１０^−１１Ｍ以下の標的抗原に対するＫＤを有することを指す。しかしながら「高親和性」結合は、他の抗体アイソタイプの場合は、異なる場合がある。例えば、ＩｇＭアイソタイプの「高親和性」結合は、抗体が、１０^−７Ｍ以下又は１０^−８Ｍ以下のＫＤを有することを指す。

用語「Ｋａｓｓｏｃ」又は「Ｋａ」は、本明細書で使用される場合、特定の抗体−抗原相互作用の結合速度を指し、用語「Ｋｄｉｓ」又は「Ｋｄ」は、本明細書で使用される場合、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を指すことが意図されている。用語「ＫＤ」は、本明細書で使用される場合、解離定数を指すことが意図されており、解離定数は、Ｋａに対するＫｄの比率（つまり、Ｋｄ／Ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される。抗体のＫＤ値は、当技術分野で十分に確立された方法を使用して決定することができる。抗体のＫＤを決定するための方法は、表面プラズモン共鳴法の使用によるか、又はＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システム等のバイオセンサーシステムの使用による。

用語「交差阻止する」、「交差阻止された」、及び「交差阻止」は、本明細書では同義的に使用されており、抗体又は他の結合物質が、標準的競合結合アッセイにおいて、同じ標的に対する他の抗体又は結合物質の結合を妨害する能力を意味する。抗体又は他の結合物質が、同じ標的に対する別の抗体又は結合分子の結合を妨害することができる能力又は程度は、従ってそれが本発明による交差阻止と呼ぶことができるかどうかは、標準的競合結合アッセイを使用して決定することができる。１つの好適なアッセイには、表面プラズモン共鳴技術を使用して相互作用の程度を測定することができるＢｉａｃｏｒｅ技術の使用（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ ３０００型装置（Ｂｉａｃｏｒｅ社製、ウプサラ、スウェーデン）の使用による）が伴う。交差阻止を測定するための別のアッセイには、ＥＬＩＳＡに基づく手法が使用される。

用語「エピトープ」は、抗体に対して特異的に結合することが可能なタンパク質決定因子を意味する。エピトープは、通常はアミノ酸又は糖側鎖等の分子の化学的活性表面基で構成されており、通常は特異的な３次元構造特徴並びに特異的電荷特徴を有する。立体構造性エピトープ及び非立体構造性エピトープは、前者に対する結合が、変性溶媒の存在下で失われるが、後者に対する結合は失われないという点で識別される。
用語「キメラ抗体」は、（ａ）定常領域又はその部分が変更されているか、置換されているか、又は交換されている抗体分子であり、その結果抗原結合部位（可変領域）は、異なるか又は変更されているクラス、エフェクター機能、及び／又は種の定常領域に結合されている。

用語「アイソタイプ」は、重鎖定常域遺伝子により提供される抗体クラス（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４等のＩｇＧ）を指す。アイソタイプは、これらクラスのうちの１つの修飾型も含み、修飾は、Ｆｃ機能を変更して、例えばエフェクター機能又はＦｃ受容体に対する結合を増強又は低減するようになされる。

用語「生殖系」は、親から子孫に受け継がれる、抗体又はそれらの機能的断片をコードする核酸配列を意味する。

用語「生殖系タンパク質配列」は、ａ）生殖系遺伝子によりコードされた抗体又はその機能的断片の可変領域のアミノ酸配列、ｂ）生殖系遺伝子によりコードされた抗体又はその機能的断片の可変領域と同じアミノ酸配列を有する抗体又はその機能的断片の可変領域をコードする修飾アミノ酸配列によりコードされており、核酸配列が、例えばコドン最適化、所望の制限部位の付加、ＧＣ含有量の最適化、望ましくないスプライス部位の除去、又はｍＲＮＡ不安定化モチーフの除去により修飾されているアミノ酸配列、又はｃ）生殖系遺伝子によりコードされているが、アミノ酸配列に、望ましくないシステインを除去するため又は所望の制限部位、例えばＢｂｓＩを導入するための等の点突然変異を有するか、又は合成、増幅、若しくはクローニングにおけるエラーに起因する点突然変異を有するアミノ酸配列を意味する。

用語「生殖系遺伝子配列」は、ａ）抗体又はその機能的断片の可変領域をコードする生殖系遺伝子の核酸配、又はｂ）生殖系遺伝子によりコードされた抗体又はその機能的断片の可変領域と同じアミノ酸配列を有する抗体又はその機能的断片の可変領域をコードしており、核酸配列が、例えばコドン最適化、所望の制限部位の付加、ＧＣ含有量の最適化、望ましくないスプライス部位の除去、又はｍＲＮＡ不安定化モチーフの除去により修飾されている修飾核酸配列を意味する。

用語「生殖系遺伝子対（複数可）」は、抗体又はその機能的断片の可変重鎖及び可変軽鎖をコードする核酸配列及びそれらの対応する生殖系遺伝子の対を意味する。例えば、生殖系遺伝子対は、ＶＨ３−２３／Ｖκ１−５であってもよく、ＶＨ３−２３／Ｖκ１−５によりコードされた抗体は、生殖系遺伝子ＶＨ３−２３によりコードされた可変重鎖又はその部分及び生殖系遺伝子Ｖκ１−５によりコードされた可変軽鎖又はその部分を含む。

用語「生殖系タンパク質対」は、可変重鎖又はその部分及び可変軽鎖又はその部分が、ａ）特定の生殖系遺伝子により各々コードされているか、又はｂ）特定の生殖系遺伝子によりコードされた抗体の可変領域と同じアミノ酸配列を有する抗体又はその機能的断片の可変領域をコードしており、核酸配列が、例えばコドン最適化、所望の制限部位の付加、ＧＣ含有量の最適化、望ましくないスプライス部位の除去、又はｍＲＮＡ不安定化モチーフの除去により修飾されている修飾核酸配列により各々コードされているか、又はｃ）生殖系遺伝子によりコードされているが、アミノ酸配列に、望ましくないシステインを除去するため又は所望の制限部位、例えばＢｂｓＩを導入するための点突然変異を有するか、又は合成、増幅、若しくはクローニングにおけるエラーに起因する点突然変異を有するアミノ酸配列を各々含む抗体又はその機能的断片を意味する。例えば、生殖系遺伝子対は、ＶＨ３−２３／Ｖκ１−５によりコードされた抗体又はその機能的断片であってもよく、抗体は、生殖系遺伝子ＶＨ３−２３によりコードされた可変重鎖又はその部分、及び生殖系遺伝子Ｖκ１−５によりコードされた可変軽鎖又はその部分を含む。「生殖系タンパク質対」は、実施例５で調製された構築体を含み、それらは以下のものを含む：
ａ）ＶＨの場合：リーダー配列（図３に示されているように、ＮｈｅＩ ＲＥ部位が組み込まれている修飾ｐｈｏＡ）；生殖系ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、及びＦＲ３（図３に示されているように、ＢｓｓＨＩＩ制限部位が組み込まれている）；Ｅｗｅｒｔ Ｓ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００３年）３２５巻、５３１〜５５３頁で使用された４Ｄ５抗体のＣＤＲ−Ｈ３（ＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹ）；及びＪＨ４ ＦＲ４（図３に示されているように、ＸｈｏＩ／ＳａｌＩ制限部位が組み込まれている）；
ｂ）Ｖｋの場合：リーダー配列（ｏｍｐＡには、図３に示されているように、ＮｄｅＩ制限部位が組み込まれている）；生殖系ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、及びＦＲ３（図３に示されているように、ＢｂｓＩ制限部位が組み込まれている）、Ｅｗｅｒｔ Ｓ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００３年）３２５巻、５３１〜５５３頁によるカッパ様ＣＤＲ−Ｌ３（ＱＱＨＹＴＴＰＰＴ）；及びＪｋ１ ＦＲ４（図３に示されているように、ＫｐｎＩ制限部位が組み込まれている）；及び
ｃ）Ｖλの場合：リーダー配列（ｏｍｐＡには、図３に示されているように、ＮｄｅＩ制限部位が組み込まれている）；生殖系ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、及びＦＲ３（図３に示されているように、ＢｂｓＩ制限部位が組み込まれている）、Ｅｗｅｒｔ Ｓ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００３年）３２５巻、５３１〜５５３頁によるラムダ様ＣＤＲ−Ｌ３（ＱＳＹＤＳＳＬＳＧＶＶ）；及びＪｌ２／３ ＦＲ４（図３に示されているように、ＫｐｎＩ制限部位が組み込まれている）。

これら構築体の各々を、実施例６及び７に記述されているように、Ｆａｂ及びＩｇＧとして合成し、発現させ、以下の機能的特性に関して試験した：ａ）ファージ産生及びファージＥＬＩＳＡ後のＦａｂ型の相対的提示；ｂ）大腸菌でＦａｂを産生させ、大腸菌細胞を溶解し、産生されたＦａｂをＥＬＩＳＡで検出した後の相対的Ｆａｂ発現レベル；ｃ）大腸菌でＦａｂを産生させ、大腸菌細胞を溶解し、高温でインキュベーションした後で非変性ＦａｂをＥＬＩＳＡで検出した後のＦａｂの温度安定性；ｄ）ウシ／マウス血清中でインキュベーションした後で非変性ＦａｂをＥＬＩＳＡで検出することによる、大腸菌溶解産物由来のＦａｂのウシ／マウス血清安定性；ｅ）哺乳動物細胞でＩｇＧ１を産生させ、細胞培養上清由来の分泌ＩｇＧ１をＥＬＩＳＡで検出した後の相対的ヒトＩｇＧ１発現レベル；及びｆ）ウシ／マウス血清中でインキュベーションした後で非変性ＦａｂをＥＬＩＳＡで検出することによるヒトＩｇＧ１のウシ血清安定性。

用語「実質的生殖系タンパク質配列」は、生殖系遺伝子によりコードされているが、アミノ酸配列に、望ましくないシステインを除去するため又は所望の制限部位、例えばＢｂｓＩを導入するため等の点突然変異、又は合成、増幅、若しくはクローニングでのエラーに起因する点突然変異を有するアミノ酸配列を意味する。

「生殖系遺伝子」は、以下の文献に開示されている抗体又はそれらの機能的断片をコードする生殖系遺伝子の核酸であり、ＶＨについては：Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、（１９９２年）、“Ｔｈｅ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｒｍｌｉｎｅ Ｖｈ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ Ｒｅｖｅａｌｓ ａｂｏｕｔ Ｆｉｆｔｙ Ｇｒｏｕｐｓ ｏｆ Ｖｈ Ｓｅｇｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ Ｌｏｏｐ”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７巻、７７６〜７９８頁；Ｍａｔｓｕｄａら、（１９９８年）、“Ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ ｌｏｃｕｓ”Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８８巻（１１号）：２１５１〜６２頁；及びＬｅＦｒａｎｃ ＭＰ（２００１年）“Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｈｅａｖｙ（ＩＧＨ）ｇｅｎｅｓ．”Ｅｘｐ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．１８巻（２号）：１００〜１６頁；Ｖλについては：Ｋａｗａｓａｋｉら、（１９９７年）“Ｏｎｅ−Ｍｅｇａｂａｓｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｌａｍｂｄａ Ｇｅｎｅ Ｌｏｃｕｓ”Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７巻（３号）：２５０〜６１頁；Ｆｒｉｐｐｉａｔら、（１９９５年）“Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｌａｍｂｄａ ｌｉｇｈｔ−ｃｈａｉｎ ｌｏｃｕｓ ｏｎ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ２２ｑ１１．２”Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．４巻、９８３〜９９１頁；及びＬｅＦｒａｎｃ ＭＰ（２００１年）“Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｌａｍｂｄａ（ＩＧＬ）ｇｅｎｅｓ．Ｅｘｐ Ｃｌｉｎ ｌｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．；１８巻：２４２〜２５４頁；Ｖκについては：Ｓｃｈａｂｌｅ及びＺａｃｈａｕ（１９９３年）、“Ｔｈｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ｇｅｎｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｋａｐｐａ ｌｏｃｕｓ，”Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ Ｈｏｐｐｅ Ｓｅｙｌｅｒ．３７４巻（１１号）：１００１〜２２頁；Ｂｒｅｎｓｉｎｇ−Ｋｕｐｐｅｒｓら（１９９７年）“Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｋａｐｐａ ｌｏｃｕｓ ｏｎ ｙｅａｓｔ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ（ＹＡＣｓ）”Ｇｅｎｅ．１９１巻（２号）：１７３〜８１頁；Ｋａｗａｓａｋｉら（２００１年）“Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｋａｐｐａ ｌｏｃｕｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｖｋａｐｐａ ｇｅｎｅｓ”Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３１巻（４号）：１０１７〜２８頁；及びＬｅｆｒａｎｃ ＭＰ（２００１年）“Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｋａｐｐａ（ＩＧＫ）ｇｅｎｅｓ”Ｅｘｐ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．１８巻１６１〜１７４頁であり、これらは、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。

可変重鎖用のＪＨ４、可変κ軽鎖用のＪκ１、及び可変λ軽鎖領域用のＪλ２／３の配列は、以下の文献に記述されている：Ｓｃａｖｉｎｅｒら（１９９９年）“Ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｉｓｐｌａｙｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｈｅａｖｙ，ｋａｐｐａ ａｎｄ ｌａｍｂｄａ ｖａｒｉａｂｌｅ ａｎｄ ｊｏｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ”Ｅｘｐ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．１６巻（４号）：２３４〜４０頁；ＪＨについては：Ｒａｖｅｔｃｈ ｅｔ ａｌ．ら（１９８１年）“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｍｕ ｌｏｃｕｓ：ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｄ ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ Ｊ ａｎｄ Ｄ ｇｅｎｅｓ．”Ｃｅｌｌ ２７巻（３ｐｔ２）：５８３〜９１；ＪＫについては：Ｈｉｅｔｅｒら（１９８２年）“Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｋａｐｐａ Ｊ ｒｅｇｉｏｎ ｇｅｎｅｓ．”Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５７巻（３号）：１５１６〜２２頁；ＪＬについては：Ｋａｗａｓａｋｉら（１９９７年）“Ｏｎｅ−Ｍｅｇａｂａｓｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｌａｍｂｄａ Ｇｅｎｅ Ｌｏｃｕｓ”Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７巻（３号）：２５０〜６１頁、これらは全て、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。ＪＨ４配列は、（ＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）であり、Ｊκ１配列は、（ＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ）であり、Ｊλ２／３配列は、（ＶＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ）である。

用語「位置依存性アミノ酸使用頻度」は、ポリペプチドの所与の位置における特定のアミノ酸配列の出現可能性を指す。本発明では、位置依存性アミノ酸使用頻度は、個々の生殖系遺伝子により分類された再編成アミノ酸配列について決定した。これにより、その天然生殖系の状況内でＣＤＲを個々に正確に設計することが可能になる。

用語「可変ドメイン／領域（ＶＨ又はＶＬ）」は、それぞれ軽鎖（κ及びλを含む）及び重鎖免疫グロブリン遺伝座を構成するＶＬ（Ｖκ及びＶλを含む）、ＶＨ、ＪＬ（Ｊκ及びＪλを含む）、及びＪＨ核酸のいずれかにより実質的にコードされた１つ又は複数のＩｇドメインを含む免疫グロブリンの領域を意味する。軽鎖又は重鎖の可変領域（ＶＬ及びＶＨ）は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」と呼ばれる３つの超可変領域が挿入されている「フレームワーク」又は「ＦＲ」領域で構成される。フレームワーク領域及びＣＤＲの範囲は、正確に画定されている（Ｋａｂａｔ、１９９１年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７巻、９１５〜９２０頁；Ｃｈｏｔｈｉａ ＆ Ｌｅｓｋ、１９８７年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６巻：９０１〜９１７頁；Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９年、Ｎａｔｕｒｅ ３４２巻：８７７〜８８３頁；Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉら、１９９７年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３巻：９２７〜９４８頁を参照）。抗体のフレームワーク領域、すなわち構成体軽鎖及び重鎖の組み合わせフレームワーク領域は、主として抗原に対する結合に関与するＣＤＲの位置を決めてアラインさせる役目を果たす。

用語「フレームワーク領域」は、この可変ドメインの抗原結合ループのスキャフォールドの役目を果たす可変ドメインの一部として、Ｋａｂａｔら（１９９１年）により画定されるような抗体可変ドメインを意味する。フレームワーク領域の例には、可変重鎖又は可変軽鎖のいずれのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４も含まれる。

用語「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」は、Ｋａｂａｔら（１９９１年）により画定されるような抗体の抗原結合ループを意味する。抗体Ｆｖ断片の２つの可変ドメインの各々は、３つのＣＤＲを含有する。相補性決定領域の例には、可変重鎖又は可変軽鎖のいずれのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３も含まれる。

「好ましいＶＨ及びＶＬ」クラス対とは、免疫レパートリー、例えば、ヒト免疫レパートリーにおいて、一組の閾値基準に従って好ましいＶＨ及びＶＬクラス対を意味する。例えば、豊富に存在するか若しくは低免疫原性、安定性等の好ましい生物物理学的特性を有するＶＨ−ＶＬ対、又は約２５００個のヒトＢ細胞の試料中少なくとも０．０５％の濃度で出現するＶＨ−ＶＬ対は、容易に提示及び／又は発現される。ヒト免疫レパートリーの好ましいＶＨ及びＶＬクラス対は、他のＶＨ及びＶＬクラス対より好ましい特徴を有している場合がある。

用語「未感作」とは、抗原未経験であることを意味する。

用語「未感作Ｂ細胞」は、抗体又はそれらの機能的断片をコードする核酸が、体細胞超変異を起こしておらず、従ってＶ（Ｄ）Ｊ遺伝子セグメント再編成が発生した生殖系遺伝子の核酸を含むとみなされるＢ細胞を意味する。未感作であるとみなされるＢ細胞の集団は、未熟Ｂ細胞、新たに移動してきたＢ細胞、及び成熟未感作Ｂ細胞である。

用語「未感作ヒト免疫レパートリー」は、ヒトの免疫系に由来する抗原未経験Ｂ細胞から単離され、抗体又はそれらの機能的断片をコードする核酸が、体細胞超変異を起こしておらず、従ってＶ（Ｄ）Ｊ遺伝子セグメント再編成が発生した生殖系遺伝子の核酸を含むとみなされる核酸のレパートリーを意味する。レパートリーは、個体のレパートリーであってもよく又は集団のレパートリーであってもよい。本発明は、十分なＢ細胞が得られるならば、一人の個体から免疫レパートリーを決定することが可能である。好ましくは、免疫レパートリーは、試料の偏りを回避するために複数の個体から取得される。

用語「ヒト免疫レパートリー」は、ヒト免疫系に由来するＢ細胞から単離された核酸のレパートリーを意味する。レパートリーは、個体のレパートリーであってもよく、又は集団のレパートリーであってもよく、未感作Ｂ細胞に由来してもよく、及び／又は抗原経験済Ｂ細胞に由来してもよい。本発明は、十分なＢ細胞が得られるならば、一人の個体から免疫レパートリーを決定することが可能である。好ましくは、免疫レパートリーは、試料の偏りを回避するために複数の個体から取得される。

「抗原」及び「免疫原」は抗体と特異的に結合するあらゆる分子であると定義される。

用語「免疫原に特異的」は、抗体と対応する分子との特異的結合を意味する。

「ＣＤＲ多様化」又は「多様化されたＣＤＲ」とは、本明細書で使用される場合、任意の好適な方法によるＣＤＲを有するアミノ酸配列の修飾である。ＣＤＲは、一般的に免疫原結合領域であることが知られており、従ってコレクションが、ＣＤＲ内に大きな多様性を示すメンバーを含むことにより、コレクションが、任意の免疫原に対する特異性及び最適な特性を有する抗体又はそれらの断片を含むことになる可能性が大きくなる。多様性は、１つ又は複数のＣＤＲのアミノ酸組成を変化させることにより得られる。これは、本明細書に記載の方法を含む、当業者に公知である任意の方法により達成することができる。

「抗体又はそれらの断片をコードする合成核酸のコレクション」は、抗体又はその断片をコードする核酸が全て合成であることを意味するが、そのような合成核酸と作用可能に連結させることができるベクター等の他の核酸を指すものではない。

分子生物学の状況で使用される用語
用語「合成」又は「合成された」は、核酸配列が、ポリヌクレオチドを含む物理的ＤＮＡに合成される遺伝子合成を意味する。標準的ＤＮＡ合成は、一本鎖オリゴヌクレオチドが生成され、その後重複するオリゴヌクレオチドがＰＣＲ様構築を使用してライゲーションされる単一ヌクレオチド合成を含む。Ｓｌｏｎｉｎｇ社（プッフハイム、ドイツ）、Ｇｅｎｅａｒｔ社（レーゲンスブルク、ドイツ）、ＤＮＡ２．０社（メンローパーク、カリフォルニア州、米国）、及びＧｅｎｓｃｒｉｐｔ社（ピスカタウエイ、ニュージャージー州、米国）等の会社は、遺伝子合成技術を提供している。例えば、Ｓｌｏｎｉｎｇ社は、１組の既製二本鎖三連ヌクレオチド（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ｔｒｉｐｌｅｔ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を使用し、それらをアニーリングし、その後ライゲーションする。

用語「合成」は、合成により製作されるか又は合成される分子を記述する。

用語「コレクション」又は「ライブラリー」は、少なくとも２つのメンバーがあることを意味する。用語「メンバー」は、これらに限定されないが、抗体又はそれらの断片をコードする核酸、又は抗体若しくはそれらの断片自体を含む。

用語「宿主」は、ヒト、マウス、又はげっ歯動物、マウス、ラット、リス、シマリス、ホリネズミ、ヤマアラシ、ビーバー、ハムスター、アレチネズミ、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、又はウマ等の哺乳動物を含む任意の宿主を指す。

用語「核酸」は、本明細書では、用語「ポリヌクレオチド」と同義的に使用され、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、及びそれらの一本鎖又は二本鎖形態のいずれのポリマーも指す。この用語は、合成、天然、及び非天然であり、基準核酸と同様の結合特性を有する、既知のヌクレオチド類似体又は修飾骨格残基又は連結を含有する核酸を包含する。そのような類似体の例には、限定ではないが、ホスホロチオアート、ホスホロアミダート、メチルホスホナート、キラルメチルホスホナート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、及びペプチド−核酸（ＰＮＡ）が含まれる。

別様の指定がない限り、特定の核酸配列は、明示的に示されている配列だけでなく、その保守的に修飾された変異体（例えば、縮重コドン置換）及び相補的配列も暗示的に包含する。具体的には、下記に詳述されているように、縮重コードン置換は、１つ又は複数の選択された（又は全ての）コドンの３番目の位置が、混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基と置換されている配列を生成することにより達成することができる（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９巻：５０８１頁、１９９１年；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０巻：２６０５〜２６０８巻、１９８５年；及びＲｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８巻：９１〜９８頁、１９９４年）。

用語「作用可能に連結された」は、２つ以上のポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）セグメント間の機能的関係性を指す。典型的には、この用語は、転写される配列に対する転写調節配列の機能的関係性を指す。例えば、プロモーター又はエンハンサー配列は、それが適切な宿主細胞又は他の発現系においてコード配列の転写を刺激又は調節する場合、コード配列に作用可能に連結されている。一般的に、転写される配列に作用可能に連結されているプロモーター転写調節配列は、転写される配列と物理的に連続しており、つまりそれらはシス作用性である。しかしながら、エンハンサー等の幾つかの転写調節配列は、それらがその転写を増強するコード配列に物理的に連続しているか又は接近して配置されている必要はない。

本明細書で使用される場合、用語「最適化されたコドン」又は「コドン最適化」は、ヌクレオチド配列を変更して、産生細胞又は生物中で優先されるコドンを使用してアミノ酸配列をコードすることを意味する。最適化されたヌクレオチド配列は、最初のヌクレオチド配列により元々コードされていたアミノ酸配列を保持するように操作されている。加えて、ヌクレオチド配列は、阻害モチーフ、スプライス部位、ｍＲＮＡ不安定化モチーフ、及び望ましくない制限部位を完全に又は可能な限り回避するように設計されてもよい。ヌクレオチド配列は、ＧＣ含有量、所望の制限部位、及び他のパラメーターについて最適化することもできる。配列は、細菌又は真核細胞を含む様々な宿主で発現させるために最適化することができる。最適化されたヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列も、最適化されているという。

用語「アミノ酸」は、天然及び合成アミノ酸、並びに天然アミノ酸と類似した様式で機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体を指す。天然アミノ酸は、遺伝コードによりコードされたアミノ酸であり、並びに後に修飾されるアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、及びＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然アミノ酸と同じ基本的化学構造を有する化合物、つまり水素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基に結合されているアルファ炭素、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。そのような類似体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）又は修飾されたペプチド骨格を有するが、天然アミノ酸と同じ基本的化学構造を保持する。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の一般的化学構造とは異なるが、天然アミノ酸と類似した様式で機能する構造を有する化学化合物を指す。

用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書では同義的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、１つ又は複数のアミノ酸残基が、対応する天然アミノ酸の人工的化学模倣体であるアミノ酸ポリマー、並びに天然アミノ酸ポリマー及び非天然アミノ酸ポリマーに適用される。別様の指定がない限り、特定のポリペプチド配列は、保守的に修飾されたその変異体も暗示的に包含する。

用語「保守的に修飾された変異体」は、アミノ酸及び核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保守的に修飾された変異体は、本質的に同一の配列に対して、同一の又は本質的に同一のアミノ酸配列をコードするか、又は核酸がアミノ酸配列をコードしない核酸を指す。遺伝子コードに縮重性があるため、多数の機能的に同一な核酸が、任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、及びＧＣＵは全て、アミノ酸アラニンをコードする。従って、あるコドンによりアラニンが指定されている全ての位置で、コードされているポリペプチドを変更せずに、そのコドンを既述の対応コドンのうちのいずれかに変更することができる。そのような核酸変異は「サイレント変異」であり、これは保守的に修飾された変異の一種である。ポリペプチドをコードする本明細書のあらゆる核酸配列は、核酸のありとあらゆるサイレント変異も表している。当業者であれば、核酸中の各コドン（通常はメチオニン用の唯一のコドンであるＡＵＧ、及び通常はトリプトファン用の唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を修飾して、機能的に同一な分子を産出することができることを認識するだろう。このように、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、各々の記述されている配列に暗示されている。

ポリペプチド配列の場合、「保守的に修飾された変異体」は、あるアミノ酸が、化学的に類似したアミノ酸に置換されることがもたらされる、ポリペプチド配列への個々の置換、欠失、又は付加が含まれる。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換表は、当技術分野で周知である。そのような保守的に修飾された変異体には、本発明の多形性変異体、異種間相同体、及び対立遺伝子が追加され、それらは除外されない。以下の８つの群は、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；及び８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４年）を参照）。幾つかの実施形態では、用語「保守的な配列修飾」は、アミノ酸配列を含有する抗体の結合特性に著しく影響を与えないか又は変更しないアミノ酸修飾を指すために使用される。

２つ以上の核酸又はポリペプチド配列の状況における用語「同一の」又はパーセント「同一性」は、同じである２つ以上の配列又は部分配列を指す。以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用して、又は手作業によるアラインメント及び目視検査により測定して、比較窓又は指定領域にわたって対応が最大になるように比較又はアラインした際に、２つの配列が、指定されたパーセントの同一アミノ酸又はヌクレオチドを有する場合（つまり、指定領域にわたる、又は指定されていない場合は配列全体にわたる６０％同一性、随意に６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％同一性）、２つの配列は「実質的に同一」である。随意に、同一性は、長さが少なくとも約５０個のヌクレオチド（又は１０個のアミノ酸）である領域にわたって、又はより好ましくは長さが１００〜５００個の若しくは１０００個以上のヌクレオチド（又は２０、５０、又は２００個以上アミノ酸）である領域にわたって存在する。配列比較の場合、典型的には、１つの配列が基準配列としての役割を果たし、それが試験配列と比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び基準配列をコンピューターに入力し、必要に応じて部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。初期設定のプログラムパラメータを使用してもよく、又は代替的パラメーターを指定してもよい。その後、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、基準配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を算出する。

「比較窓」は、本明細書で使用される場合、２０〜６００、通常は約５０〜約２００、より通常は約１００〜約１５０からなる群から選択される連続位置の数のうちの任意の１つのセグメントの参照を含み、そこで２つの配列を最適にアラインした後、配列を同数の連続位置の基準配列と比較することができる。比較するための配列アラインメント法は、当技術分野で周知である。比較するための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ（１９７０年）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２巻：４８２ｃ頁の局部相同性アルゴリズム（ｌｏｃａｌ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）により、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８巻：４４３頁、１９７０年の相同性アラインメントアルゴリズム（ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）により、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５巻：２４４４頁、１９８８年の類似性探索法（ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｍｅｔｈｏｄ）により、これらアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、遺伝学コンピューターグループ、５７５サイエンスドライブ、マディソン、ウィスコンシン州のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）のコンピューター実装により、又は手作業でのアラインメント及び目視検査（例えば、Ｂｒｅｎｔら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００３年）を参照）により、実施することができる。

パーセント配列同一性及び配列類似性を決定するのに好適なアルゴリズムの２つの例は、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、それらは、それぞれＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５巻：３３８９〜３４０２頁、１９７７年；及びＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５巻：４０３〜４１０頁、１９９０年に記述されている。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センターから公的に入手可能である。このアルゴリズムには、クエリー配列内の長さＷの短いワードを特定することにより、データベース配列内の同じ長さのワードとアラインした際にある正の値の閾値スコアＴと一致するか又は満たすかのいずれかである高スコアの配列対（ＨＳＰ）を最初に特定することが伴う。Ｔは、隣接ワードスコア閾値（ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ ｗｏｒｄ ｓｃｏｒｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、上記）。これら初期近接ワードヒット（ｉｎｉｔｉａｌ ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ ｗｏｒｄ ｈｉｔ）は、それらを含有するより長いＨＳＰを見出すための探索を開始するための種としての役目を果たす。ワードヒットは、累積アラインメントスコアを増加させることができる限り、各配列に沿って両方向に伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列、パラメーターＭ（１対の一致残基のリワードスコア；常に＞０）及びＮ（不一致残基のペナルティスコア；常に＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列の場合、スコア化マトリックスを使用して、累積スコアを計算する。各方向へのワードヒットの伸長は、累積アラインメントスコアが、その最大獲得値からＸ量だけ減少する時；累積スコアが、１つ又は複数の負のスコアを示す残基アラインメントのために０以下になる時、又は一方の配列の端部に到達する時に停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、及びＸは、配列の感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）では、初期設定として、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両鎖の比較が使用される。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムでは、初期設定として、ワード長３、及び期待値（Ｅ）１０、ＢＬＯＳＵＭ６２スコア化マトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９巻：１０９１５頁、１９８９年を参照）、アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両鎖の比較が使用される。

ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計的分析も実施する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０巻：５８７３〜５７８７頁、１９９３年を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１つの尺度は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間の一致が偶然に生じる確率の指標を提供する。例えば、試験核酸を基準核酸と比較した際の最小合計確率が、約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、及び最も好ましくは約０．００１未満である場合、核酸は、基準配列と類似しているとみなされる。

２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＰＡＭ１２０荷重残基表、ギャップ長ペナルティ１２、及びギャップペナルティ４を用いて、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＥ．Ｍｅｙｅｒｓ及びＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，４巻：１１〜１７頁、１９８８年）のアルゴリズムを使用して決定することもできる。加えて、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、Ｂｌｏｓｓｏｍ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、及び１６、１４、１２、１０、８、６、又は４のギャップ荷重、及び１、２、３、４、５、又は６の長さ荷重を用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）に組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８巻：４４４〜４５３頁、１９７０年）アルゴリズムを使用して決定することができる。

上記の配列同一性のパーセント以外に、２つの核酸配列又はポリペプチドが実質的に同一であることの別の指標は、下述のように、第１の核酸によりコードされたポリペプチドが、第２の核酸によりコードされたポリペプチドに対する抗体と免疫学的に交差反応性であることである。従って、例えば２つのペプチドの違いが保存的置換のみである場合、ポリペプチドは、一般的に第２のポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であることの別の指標は、下述のように、２つの分子又はそれらの相補体が、ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズするということである。２つの核酸配列が実質的に同一であることの更に別の指標は、同じプライマーを使用して配列を増幅することができるということである。

用語「組換え宿主細胞」（又は単に「宿主細胞」）は、組換え発現ベクターが導入された細胞を指す。そのような用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫も指すことが意図されていると理解されるべきである。突然変異又は環境影響のいずれかのため、ある修飾が後続の世代に生じる場合があるため、そのような子孫は、実際は親細胞と同一でない場合があるが、本明細書で使用される場合は、用語「宿主細胞」の範囲内に依然として含まれる。典型的な宿主細胞は、原核生物（大腸菌を含むが、それに限定されない細菌等）、又は真核生物（酵母、及び哺乳動物細胞等を含む）である。

用語「ベクター」は、それが連結されている別のポリヌクレオチドを輸送することが可能なポリヌクレオチド分子を指すことが意図されている。好ましいベクターは、それらが連結されている核酸を自律複製及び／又は発現することが可能なベクターである。それらが作用可能に連結されている核酸の発現を指図することが可能なベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。１つのタイプのベクターは、「プラスミド」であり、これは環状二本鎖ＤＮＡループを指し、それには追加的なＤＮＡセグメントがライゲーションされている場合がある。別のタイプのベクターは、ウイルスベクターであり、そこには追加的なＤＮＡセグメントが、ウイルスゲノムにライゲーションされている場合がある。あるベクターは、それらが導入されている宿主細胞中で自律複製が可能である（例えば、細菌性複製開始点を有する細菌ベクター及びエピゾーム性哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピゾーム性哺乳動物ベクター）は、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、それにより宿主ゲノムと共に複製される。更に、あるベクターは、それらが作用可能に連結されている遺伝子の発現を指図することが可能である。そのようなベクターは、本明細書では「組換え発現ベクター」（又は単に「発現ベクター」）と呼ばれる。一般的に、組換ＤＮＡ技術で有用な発現ベクターは、プラスミドの形態をしていることが多い。本明細書では、「プラスミド」及び「ベクター」は、プラスミドがベクターの最も一般的に用いられている形態であるため、同義的に使用される場合がある。しかしながら、本発明は、同等の機能を果たすウイルスベクター等の（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）、発現ベクターのそのような他の形態を含むことが意図されている。

ベクターは、典型的には原核生物レプリコンを含んでおり、原核生物レプリコンは、それにより形質転換された大腸菌等の細菌宿主細胞中で、ＶＨ及び／又はＶＬをコードする相同体の発現（転写及び翻訳）を指図することが可能な原核生物プロモーターを含んでいてもよい。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの結合及び転写の生起を可能にするＤＮＡ配列により形成された発現制御エレメントである。細菌宿主と適合するプロモーター配列は、典型的には、ＤＮＡセグメントを挿入するための便利な制限部位を含有するプラスミドベクターに提供されている。そのようなベクタープラスミドの例には、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２、及びｐＢＲ３２９、ｐＰＬ、及びｐＫＫ２２３が含まれ、それらは商業的に入手可能である。

「ディスプレイベクター」は、それにより形質転換された細菌宿主細胞等の宿主細胞において、染色体以外の組換えＤＮＡ分子の複製及び維持を指図する能力を有するＤＮＡ配列を含む。そのようなＤＮＡ配列は、当技術分野で周知である。ディスプレイベクターは、例えば、ｆｄ、Ｍ１３、又はｆｌ繊維状バクテリオファージの種類に由来するファージベクター又はファージミドベクターである。そのようなベクターは、繊維状バクテリオファージの表面に、例えば結合タンパク質又はその断片を含むタンパク質の提示を促進することが可能である。ファージ、リボソーム、ＤＮＡ、細菌細胞、又は真核細胞、例えば酵母又は哺乳動物細胞上での提示に好適なベクターも、当技術分野で公知であり、例えばウイルスベクター又はキメラタンパク質をコードするベクターも公知である。

「固有」の制限部位とは、所与の核酸分子に１つだけ存在するか又は１回だけ出現する制限部位である。

コレクション並びにそれを産生及び使用する方法
本開示は、任意の標的に対する治療用抗体の特定に使用することができる抗体又はそれらの機能的断片のコレクションを可能にし、それら抗体は、臨床的に開発可能であり、患者に安全及び有効である。背景として、本発明者らは、ヒト免疫レパートリーに豊富に存在する可変重鎖及び可変軽鎖生殖系遺伝子対が、より効率的な臨床開発に結び付き、その結果生じた抗体の患者における安全性及び効能を増加させることになる好ましい生物物理学的特性を有する可能性が高いと仮定した。各Ｂ細胞は、１つの抗体をコードし、各抗体は、可変重鎖及び可変軽鎖を含む。抗体の可変重鎖及び可変軽鎖の各々は、生殖系遺伝子配列とアラインして抗体の由来を決定することができ、つまり、生殖系遺伝子から可変重鎖及び可変軽鎖が形成される。従って、各抗体について、可変重鎖及び可変軽鎖は生殖系対で構成され、例えばＶＨ３−２３はＶＫ１−５と対になるということができる。そのような好ましい生物物理学的特性には、以下のものが含まれていてもよい：ａ）Ｆａｂ型での相対的提示率が高いこと、ｂ）相対的Ｆａｂ発現レベルが高いこと、ｃ）Ｆａｂが温度安定性であること、ｄ）Ｆａｂがウシ／マウス血清安定性であること、ｅ）相対的ヒトＩｇＧ１発現レベルが高いこと、及びｆ）ヒトＩｇＧ１がウシ血清安定性であること。

生殖系遺伝子対は、好ましい生物物理学的特性を有する可能性が高いという仮説を証明するための最初のステップは、ヒト免疫レパートリーで発現される可変重鎖及び可変軽鎖生殖系遺伝子対を特定することだった。幾つかの態様では、本発明は、合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクションを産生する方法であって、ヒト免疫レパートリーに存在する可変重鎖及び可変軽鎖生殖系遺伝子対を含むデータを取得するステップを含む方法を含む。幾つかの実施形態では、データは、可変重鎖及び可変軽鎖生殖系遺伝子対を提供する公的に入手可能な文献から取得される。一般的に、関連する公的に入手可能な文献では、以下の方法に従った：Ｂ細胞をヒト供与体から単離し、Ｂ細胞を選別してそれらの発生又は分化の段階を決定し、各Ｂ細胞由来の抗体をコードするＤＮＡを表すｃＤＮＡを生成及び増幅し、ｃＤＮＡを配列決定し、可変重鎖及び可変軽鎖をコードするｃＤＮＡを、既知の生殖系遺伝子配列とアラインし、各Ｂ細胞に由来する生殖系遺伝子対を決定した。幾つかの実施形態では、データは、ヒトＢ細胞のサンプリング及び単離から取得され、それは文献で使用された方法に類似した方法を含んでいた。これらの態様では、合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクションを産生する方法は、ヒト免疫レパートリーに存在する可変重鎖及び可変軽鎖生殖系遺伝子対を含むデータを取得するステップを含み、取得ステップは、ａａ）試料からヒトＢ細胞を単離するステップ、ａｂ）Ｂ細胞由来のｃＤＮＡを生成するステップ、ａｃ）Ｂ細胞由来のｃＤＮＡをＰＣＲ増幅するステップ、ａｄ）ＰＣＲ産物を配列決定するステップ、及びａｅ）ＰＣＲ産物の生殖系遺伝子を特定するステップを更に含む。両組のデータは、ヒト免疫レパートリーに存在する可変重鎖及び可変軽鎖生殖系遺伝子対を提供した。

次のステップとして、生データを統合し、分析し、ヒト免疫レパートリーに存在する可変重鎖及び可変軽鎖生殖系対を、発現レベルの点で順位付けした。これらの態様では、本発明は、抗体又はそれらの機能的断片のコレクションを産生する方法であって、ヒト免疫のレパートリーで顕著に発現される可変重鎖及び可変軽鎖生殖系遺伝子対を特定することを含む方法を含む。

ヒト免疫レパートリーで顕著に発現される生殖系遺伝子対
このデータから、ある特定の可変重鎖及び可変軽鎖生殖系遺伝子対が、ヒト免疫レパートリーで他よりも高頻度で存在したことは明らかだった。これら顕著な対は、より優れた生物物理学的特性を有すると予想されるため、本発明の態様は、ヒト免疫レパートリーで顕著な生殖系遺伝子対に由来する合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクションを含み、幾つかの実施形態では、抗体又はそれらの機能的断片のフレームワーク領域及び／又は相補性決定領域の１つ又は複数は、ヒト免疫レパートリーで顕著な生殖系遺伝子対に由来する。他の態様では、本発明は、ヒト免疫レパートリーで顕著に発現される生殖系遺伝子対の実質的生殖系タンパク質配列を含む合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクションを含み、幾つかの実施形態では、抗体又はそれらの機能的断片のフレームワーク領域及び／又は相補性決定領域の１つ又は複数は、ヒト免疫レパートリーで顕著に発現される生殖系遺伝子対の実質的生殖系タンパク質配列を含む。他の態様では、本発明は、ヒト免疫レパートリーで顕著に発現される生殖系遺伝子対の生殖系タンパク質配列を含む合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクションを含み、幾つかの実施形態では、抗体又はそれらの機能的断片のフレームワーク領域及び／又は相補性決定領域の１つ又は複数は、ヒト免疫レパートリーで顕著に発現される生殖系遺伝子対の生殖系タンパク質配列を含む。幾つかの態様では、本発明は、可変重鎖及び可変軽鎖フレームワーク領域を含む合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクションを含み、前記フレームワーク領域は、生殖系タンパク質対の生殖系タンパク質配列を含み、前記生殖系遺伝子は、ヒト免疫レパートリーで顕著に発現される。

幾つかの実施形態では、本発明は、合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクションを含み、前記可変重鎖及び可変軽鎖フレームワーク領域は、ヒト免疫レパートリーで顕著に発現される生殖系遺伝子対の生殖系タンパク質配列から本質的になる。幾つかの実施形態では、抗体又はそれらの機能的断片は、ヒト免疫レパートリーで顕著に発現される生殖系遺伝子対から本質的になり、幾つかの実施形態では、１つ又は複数のＣＤＲは、ヒト免疫レパートリーで顕著に発現される生殖系遺伝子対の生殖系タンパク質配列から本質的になる。幾つかの実施形態では、本発明は、合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクションを含み、前記可変重鎖及び可変軽鎖フレームワーク領域は、ヒト免疫レパートリーで顕著に発現される生殖系遺伝子対の生殖系タンパク質配列からなる。幾つかの実施形態では、抗体又はそれらの機能的断片は、ヒト免疫レパートリーで顕著に発現される生殖系遺伝子対によりコードされる生殖系タンパク質対からなり、幾つかの実施形態では、１つ又は複数のＣＤＲは、ヒト免疫レパートリーで顕著に発現される生殖系遺伝子対の生殖系タンパク質配列から本質的になる。幾つかの実施形態では、コレクションの抗体又はそれらの機能的断片の大多数又は実質的に全ては、ヒト免疫レパートリーで顕著に発現される生殖系遺伝子対の生殖系タンパク質配列を含む。

幾つかの実施形態では、ヒト免疫レパートリーで豊富に又は顕著に発現される生殖系遺伝子対は、ヒト免疫レパートリー中少なくとも０．０５％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも０．０９％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも０．１４％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも０．１９％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも０．２３％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも０．２８％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも０．３３％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも０．３７％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも０．４２％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも０．４７％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも０．５１％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも０．５６％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも０．６１％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも０．６６％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも０．７０％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも０．８４％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも０．８９％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも０．９４％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも１．０３％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも１．１２％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも１．１７％、又はヒト免疫レパートリー中少なくとも１．２６％の濃度で発現される。

本発明の追加的な態様は、任意の免疫原に対する抗体又はそれらの機能的断片の特定に有用なコレクションの能力である。ヒト免疫レパートリーで顕著に発現される少なくとも２つの可変重鎖及び可変軽鎖生殖系タンパク質対を有するコレクションを生成することにより、コレクション内、特にコレクションの抗体の相補性決定領域内に、立体構造又は基準構造中のＣＤＲの長さ及び多様性の点で、多様性が提供されるだろうと考えられた。これは、本発明のコレクションが、任意の免疫原に対する抗体又はそれらの機能的断片の特定に有用になることを可能にする。従って、本発明の幾つかの態様は、ヒト免疫レパートリーの顕著に発現される生殖系タンパク質対から選択される少なくとも２個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも３個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも４個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも５個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも６個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも７個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも８個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも９個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも１０個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも１１個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも１２個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも１３個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも１４個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも１５個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも１６個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも１７個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも１８個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも１９個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも２０個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも２１個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも２２個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも２３個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも２４個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも２５個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも２６個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも２７個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも２８個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質、少なくとも２９個の異なる生殖系タンパク質対配列、少なくとも３０個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも３１個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも３２個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも３３個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも３４個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも３５個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも３６個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも３７個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも３８個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも３９個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも４０個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも４１個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも４２個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも４３個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも４４個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質、少なくとも４５個の異なる生殖系タンパク質対配列、少なくとも４６個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも４７個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも４８個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも４９個の異なる生殖系タンパク質対、又は少なくとも５０個の異なる生殖系タンパク質対を含む抗体又はそれらの機能的断片を含むコレクションを含む。

幾つかの実施形態では、コレクションは、表１８に示されている生殖系遺伝子対から選択される１つ又は複数の生殖系タンパク質対を含む可変重鎖及び可変軽鎖フレームワーク領域を含む。

幾つかの実施形態では、本発明は、生殖系遺伝子対の生殖系タンパク質配列を含むＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、及びＦＲ３を含む可変重鎖ドメイン及び可変軽鎖ドメインを含む単離された抗体又はその機能的断片を含み、生殖系遺伝子対は、表１８の生殖系遺伝子対から選択される。

未感作ヒト免疫レパートリーで顕著に発現される生殖系遺伝子対
ある特定の可変重鎖及び可変軽鎖生殖系遺伝子対は、抗原経験済Ｂ細胞と比べて、未感作Ｂ細胞（抗原未経験）において差別的に発現される可能性があることも企図され、従ってデータを、サンプリングしたＢ細胞の発生又は分化に基づいて分析した。未感作Ｂ細胞で差別的に発現される生殖系遺伝子対の生殖系タンパク質対を含むコレクションは、任意の免疫原に対する抗体又はそれらの機能的断片の選択に有利である場合がある。従って、本発明の態様は、未感作ヒト免疫レパートリーで顕著に発現される生殖系遺伝子対に由来する合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクションを含み、幾つかの実施形態では、抗体又はそれらの機能的断片のフレームワーク領域及び／又は相補性決定領域の１つ又は複数は、未感作ヒト免疫レパートリーで顕著に発現される生殖系遺伝子対に由来する。他の態様では、本発明は、未感作ヒト免疫レパートリーで顕著に発現される生殖系遺伝子対の実質的生殖系タンパク質配列を含む合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクションを含み、幾つかの実施形態では、抗体又はそれらの機能的断片のフレームワーク領域及び／又は相補性決定領域の１つ又は複数は、未感作ヒト免疫レパートリーで顕著に発現される生殖系遺伝子対の実質的生殖系タンパク質配列を含む。他の態様では、本発明は、未感作ヒト免疫レパートリーで顕著に発現される生殖系遺伝子対の生殖系タンパク質配列を含む合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクションを含み、幾つかの実施形態では、抗体又はそれらの機能的断片のフレームワーク領域及び／又は相補性決定領域の１つ又は複数は、未感作ヒト免疫レパートリーで顕著に発現される生殖系遺伝子対の生殖系タンパク質配列を含む。幾つかの態様では、本発明は、可変重鎖及び可変軽鎖フレームワーク領域を含む合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクションを含み、前記フレームワーク領域は、生殖系タンパク質配列を含み、前記生殖系タンパク質配列は、可変重鎖及び可変軽鎖生殖系タンパク質対を含み、前記生殖系タンパク質対は、未感作ヒト免疫レパートリーで顕著に発現される生殖系遺伝子対によりコードされる。

幾つかの実施形態では、本発明は、合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクションを含み、前記可変重鎖及び可変軽鎖フレームワーク領域は、未感作ヒト免疫レパートリーで顕著に発現される生殖系遺伝子対の生殖系タンパク質配列から本質的になる。幾つかの実施形態では、抗体又はそれらの機能的断片は、未感作ヒト免疫レパートリーで顕著に発現される生殖系遺伝子対によりコードされる生殖系タンパク質対から本質的になる。幾つかの実施形態では、本発明は、合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクションを含み、前記可変重鎖及び可変軽鎖フレームワーク領域は、未感作ヒト免疫レパートリーで顕著に発現される生殖系遺伝子対の生殖系タンパク質配列からなる。幾つかの実施形態では、抗体又はそれらの機能的断片は、未感作ヒト免疫レパートリーで顕著に発現される生殖系遺伝子対によりコードされる生殖系タンパク質対からなる。幾つかの実施形態では、コレクションの抗体又はそれらの機能的断片の大多数又は実質的に全ては、未感作ヒト免疫レパートリーで顕著に発現される生殖系遺伝子対の生殖系タンパク質配列を含む。

幾つかの実施形態では、未感作ヒト免疫レパートリーで豊富に又は顕著に発現される生殖系遺伝子対は、未感作ヒト免疫レパートリー中少なくとも０．０７％、未感作ヒト免疫レパートリー中少なくとも０．１５％、未感作ヒト免疫レパートリー中少なくとも０．２２％、未感作ヒト免疫レパートリー中少なくとも０．３０％、未感作ヒト免疫レパートリー中少なくとも０．３７％、未感作ヒト免疫レパートリー中少なくとも０．４５％、未感作ヒト免疫レパートリー中少なくとも０．５２％、未感作ヒト免疫レパートリー中少なくとも０．５９％、未感作ヒト免疫レパートリー中少なくとも０．６７％、未感作ヒト免疫レパートリー中少なくとも０．７４％、未感作ヒト免疫レパートリー中少なくとも０．８２％、未感作ヒト免疫レパートリー中少なくとも０．８９％、未感作ヒト免疫レパートリー中少なくとも０．９７％、未感作ヒト免疫レパートリー中少なくとも１．１９％、又は未感作ヒト免疫レパートリー中少なくとも１．５６％の濃度で発現される。

本発明の追加的な態様は、任意の免疫原に対する抗体又はそれらの機能的断片の特定に有用なコレクションの能力である。未感作ヒト免疫レパートリーで顕著に発現される生殖系遺伝子対によりコードされる少なくとも２つの可変重鎖及び可変軽鎖生殖系タンパク質対を有するコレクションを生成することにより、コレクション内、特にコレクションの抗体の相補性決定領域内に、立体構造又は基準構造中のＣＤＲの長さ及び多様性の点で、多様性が提供されるだろうと考えられた。これは、本発明のコレクションが、任意の免疫原に対する抗体又はそれらの機能的断片の特定に有用になることを可能にする。従って、本発明の幾つかの態様は、少なくとも２個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも３個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも４個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも５個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも６個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも７個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも８個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも９個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも１０個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも１１個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも１２個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも１３個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも１４個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも１５個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも１６個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも１７個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも１８個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも１９個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも２０個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも２１個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも２２個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも２３個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも２４個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも２５個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも２６個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも２７個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも２８個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質、少なくとも２９個の異なる生殖系タンパク質対配列、少なくとも３０個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも３１個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも３２個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも３３個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも３４個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも３５個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも３６個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも３７個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも３８個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも３９個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも４０個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも４１個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも４２個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも４３個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも４４個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質、少なくとも４５個の異なる生殖系タンパク質対配列、少なくとも４６個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも４７個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも４８個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも４９個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも４９個の異なる生殖系タンパク質対、又は少なくとも５０個の異なる生殖系タンパク質対を含む抗体又はそれらの機能的断片を含むコレクションを含む。

幾つかの実施形態では、コレクションは、表１９の生殖系遺伝子対から選択される１つ又は複数の生殖系タンパク質対を含む可変重鎖及び可変軽鎖フレームワーク領域を含む。

幾つかの実施形態では、本発明は、生殖系遺伝子対を含む生殖系タンパク質配列を含むＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、及びＦＲ３を含む可変重鎖ドメイン及び可変軽鎖ドメインを含む単離された抗体又はその機能的断片を含み、生殖系遺伝子対は、表１９の生殖系遺伝子対から選択される。

ヒト免疫のレパートリーで顕著に発現される可変重鎖、可変κ軽鎖、及び可変λ軽鎖生殖系遺伝子
次のステップとして、統合データ及び追加的データを分析して、ヒト免疫レパートリーにおける可変重鎖、可変κ軽鎖、及び可変λ軽鎖生殖系遺伝子の発現を決定した。従って、本発明の追加的な態様は、抗体又はそれらの機能的断片のコレクションを産生する方法であって、ヒト免疫のレパートリーで顕著に発現される可変重鎖、可変κ軽鎖、及び可変λ軽鎖生殖系遺伝子を特定するステップを含む方法を含む。これを行う１つの方法は、可変重鎖、可変κ軽鎖、及び可変λ軽鎖生殖系遺伝子を、それらの発現レベルに基づいて順位付けすることである。

ヒト免疫レパートリーで顕著に発現される生殖系遺伝子によりコードされる可変重鎖又は可変軽鎖生殖系タンパク質配列を含む抗体は、開発、並びに患者での安全性及び効能を増強する好ましい生物物理学的特性を有する可能性が高い。従って、本発明の態様は、ヒト免疫レパートリーで顕著に発現される可変重鎖又は可変軽鎖生殖系遺伝子に由来する合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクションを含み、幾つかの実施形態では、抗体又はそれらの機能的断片のフレームワーク領域及び／又は相補性決定領域の１つ又は複数は、ヒト免疫レパートリーで顕著に発現される可変重鎖又は可変軽鎖生殖系遺伝子に由来する。他の態様では、本発明は、ヒト免疫レパートリーで顕著に発現される可変重鎖又は可変軽鎖生殖系遺伝子の実質的生殖系タンパク質配列を含む合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクションを含み、幾つかの実施形態では、抗体又はそれらの機能的断片のフレームワーク領域及び／又は相補性決定領域の１つ又は複数は、未感作ヒト免疫レパートリーで顕著に発現される可変重鎖又は可変軽鎖生殖系遺伝子の実質生殖系タンパク質配列を含む。他の態様では、本発明は、ヒト免疫レパートリーで顕著に発現される可変重鎖又は可変軽鎖生殖系遺伝子の生殖系タンパク質配列を含む合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクションを含み、幾つかの実施形態では、抗体又はそれらの機能的断片のフレームワーク領域及び／又は相補性決定領域の１つ又は複数は、ヒト免疫レパートリーで顕著に発現される可変重鎖又は可変軽鎖生殖系遺伝子の生殖系タンパク質配列を含む。幾つかの態様では、本発明は、可変重鎖及び可変軽鎖フレームワーク領域を含む合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクションを含み、前記フレームワーク領域は、生殖系タンパク質配列を含み、前記生殖系タンパク質配列は、ヒト免疫レパートリーで顕著に発現される可変重鎖又は可変軽鎖生殖系遺伝子によりコードされる。

幾つかの実施形態では、本発明は、合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクションを含み、前記可変重鎖及び可変軽鎖フレームワーク領域は、ヒト免疫レパートリーで顕著に発現される可変重鎖又は可変軽鎖生殖系遺伝子の生殖系タンパク質配列から本質的になる。幾つかの実施形態では、抗体又はそれらの機能的断片は、未感作ヒト免疫レパートリーで顕著に発現される生殖系遺伝子によりコードされる可変重鎖又は可変軽鎖生殖系タンパク質配列から本質的になる。幾つかの実施形態では、本発明は、合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクションを含み、前記可変重鎖及び可変軽鎖フレームワーク領域は、ヒト免疫レパートリーで顕著に発現される可変重鎖又は可変軽鎖生殖系遺伝子の生殖系タンパク質配列からなる。幾つかの実施形態では、抗体又はそれらの機能的断片は、ヒト免疫レパートリーで顕著に発現される生殖系遺伝子によりコードされる可変重鎖又は可変軽鎖生殖系タンパク質配列からなる。幾つかの実施形態では、コレクションの抗体又はそれらの機能的断片の大多数又は実質的に全ては、未感作ヒト免疫レパートリーで顕著に発現される生殖系遺伝子によりコードされる生殖系タンパク質配列を含む。

幾つかの実施形態では、ヒト免疫レパートリーで豊富に又は顕著に発現される可変重鎖生殖系遺伝子は、ヒト免疫レパートリー中少なくとも０．１％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも０．２％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも０．３％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも０．４％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも０．５％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも０．６％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも１．０％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも１．６％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも２．１％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも２．２％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも２．６％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも２．７％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも３．０％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも３．２％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも３．３％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも４．０％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも４．１％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも４．５％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも４．６％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも５．３％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも５．８％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも６．８％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも７．６％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも８．０％、又はヒト免疫レパートリー中少なくとも１０．６％の濃度で発現される。

幾つかの実施形態では、ヒト免疫レパートリーで豊富に又は顕著に発現される可変κ軽鎖生殖系遺伝子は、ヒト免疫レパートリー中少なくとも０．１％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも０．２％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも０．３％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも０．４％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも０．５％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも０．７％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも１．０％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも１．１％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも１．３％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも１．９％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも２．２％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも２．４％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも２．６％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも４．６％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも６．０％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも７．６％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも８．５％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも１１．１％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも１１．２％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも１４．２％、又はヒト免疫レパートリー中少なくとも１６．２％の濃度で発現される。

幾つかの実施形態では、ヒト免疫レパートリーで豊富に又は顕著に発現される可変λ軽鎖生殖系遺伝子は、ヒト免疫レパートリー中少なくとも０．１％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも０．３％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも０．５％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも０．６％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも１．０％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも１．２％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも１．５％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも１．７％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも４．５％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも５．１％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも５．３％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも６．５％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも８．１％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも１０．０％、ヒト免疫レパートリー中少なくとも１１．３％、又はヒト免疫レパートリー中少なくとも１８．１％の濃度で発現される。

本発明の追加的な態様は、任意の免疫原に対する抗体又はそれらの機能的断片の特定に有用なコレクションの能力である。ヒト免疫レパートリーで顕著に発現される可変重鎖、可変κ軽鎖、及び可変λ軽鎖生殖系遺伝子の１つ又は複数を有するコレクションを生成することにより、コレクション内で、特にＣＤＲの長さ及び立体構造又は基準構造において多様性が生成されることになり、従ってコレクションを、任意の免疫原に対する抗体又はそれらの機能的断片の特定に有用にすることができる。本発明の実施形態は、少なくとも２個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも３個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも４個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも５個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも６個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも７個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも８個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも９個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも１０個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも１１個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも１２個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも１３個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも１４個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも１５個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも１６個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも１７個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも１８個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも１９個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも２０個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも２１個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも２２個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも２３個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも２４個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも２５個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも２６個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも２７個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも２８個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質、少なくとも２９個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも３０個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも３１個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも３２個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも３３個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも３４個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも３５個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも３６個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも３７個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも３８個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも３９個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも４０個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも４１個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも４２個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも４３個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも４４個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質、少なくとも４５個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも４６個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも４７個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも４８個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも４９個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列を含む抗体又はそれらの機能的断片を含むコレクションを含む。

本発明の実施形態は、少なくとも２個の異なる可変κ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも３個の異なる可変κ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも４個の異なる可変κ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも５個の異なる可変κ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも６個の異なる可変κ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも７個の異なる可変κ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも８個の異なる可変κ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも９個の異なる可変κ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも１０個の異なる可変κ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも１１個の異なる可変κ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも１２個の異なる可変κ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも１３個の異なる可変κ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも１４個の異なる可変κ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも１５個の異なる可変κ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも１６個の異なる可変κ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも１７個の異なる可変κ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも１８個の異なる可変κ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも１９個の異なる可変κ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも２０個の異なる可変κ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも２１個の異なる可変κ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも２２個の異なる可変κ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも２３個の異なる可変κ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも２４個の異なる可変κ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも２５個の異なる可変κ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも２６個の異なる可変κ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも２７個の異なる可変κ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも２８個の異なる可変κ軽鎖生殖系タンパク質、少なくとも２９個の異なる可変κ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも３０個の異なる可変κ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも３１個の異なる可変κ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも３２個の異なる可変κ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも３３個の異なる可変κ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも３４個の異なる可変κ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも３５個の異なる可変κ軽鎖生殖系タンパク質配列を含む抗体又はそれらの機能的断片を含むコレクションを含む。

本発明の実施形態は、少なくとも２個の異なる可変λ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも３個の異なる可変λ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも４個の異なる可変λ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも５個の異なる可変λ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも６個の異なる可変λ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも７個の異なる可変λ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも８個の異なる可変λ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも９個の異なる可変λ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも１０個の異なる可変λ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも１１個の異なる可変λ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも１２個の異なる可変λ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも１３個の異なる可変λ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも１４個の異なる可変λ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも１５個の異なる可変λ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも１６個の異なる可変λ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも１７個の異なる可変λ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも１８個の異なる可変λ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも１９個の異なる可変λ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも２０個の異なる可変λ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも２１個の異なる可変λ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも２２個の異なる可変λ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも２３個の異なる可変λ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも２４個の異なる可変λ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも２５個の異なる可変λ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも２６個の異なる可変λ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも２７個の異なる可変λ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも２８個の異なる可変λ軽鎖生殖系タンパク質、少なくとも２９個の異なる可変λ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも３０個の異なる可変λ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも３１個の異なる可変λ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも３２個の異なる可変λ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも３３個の異なる可変λ軽鎖生殖系タンパク質配列を含む抗体又はそれらの機能的断片を含むコレクションを含む。

幾つかの実施形態では、コレクションは、可変重鎖及び可変軽鎖フレームワーク領域を含む抗体又はそれらの機能的断片を含み、前記フレームワーク領域は、以下のものからなる群から選択される１つ又は複数の可変重鎖生殖系タンパク質配列を含む：ＩＧＨＶ３−２３、ＩＧＨＶ３−３０、ＩＧＨＶ４−３９、ＩＧＨＶ４−３４、ＩＧＨＶ４−５９、ＩＧＨＶ１−６９、ＩＧＨＶ５−５１、ＩＧＨＶ３−７、ＩＧＨＶ１−１８、ＩＧＨＶ３−４８、ＩＧＨＶ３−１５、ＩＧＨＶ３−２１、ＩＧＨＶ１−２、ＩＧＨＶ３−３３、ＩＧＨＶ４−３１、ＩＧＨＶ３−５３、ＩＧＨＶ３−１１、ＩＧＨＶ３−９、ＩＧＨＶ４−４、ＩＧＨＶ１−４６、ＩＧＨＶ３−７４、ＩＧＨＶ１−２４、ＩＧＨＶ４−６１、ＩＧＨＶ１−８、ＩＧＨＶ１−３、ＩＧＨＶ３−４９、ＩＧＨＶ３−４３、ＩＧＨＶ４−２８、ＩＧＨＶ３−６４、及びＩＧＨＶ７−８１。

幾つかの実施形態では、コレクションは、可変重鎖及び可変軽鎖フレームワーク領域を含む抗体又はそれらの機能的断片を含み、前記フレームワーク領域は、以下のものからなる群から選択される１つ又は複数の可変κ軽鎖生殖系タンパク質配列を含む：ＩＧＫＶ３−２０、ＩＧＫＶ１−３９／１Ｄ−３９、ＩＧＫＶ１−５、ＩＧＫＶ３−１５、ＩＧＫＶ４−１、ＩＧＫＶ３−１１、ＩＧＫＶ２−２８／２Ｄ−２８、ＩＧＫＶ１−３３／１Ｄ−３３、ＩＧＫＶ２−３０、ＩＧＫＶ１−９、ＩＧＫＶ１−１７、ＩＧＫＶ１−２７、ＩＧＫＶ１−８、ＩＧＫＶ１−１６、ＩＧＫＶ１−６、ＩＧＫＶ１−１２、ＩＧＫＶ２Ｄ−２９、ＩＧＫＶ１−１３、ＩＧＫＶ１Ｄ−８、及びＩＧＫＶ２−２４。

幾つかの実施形態では、コレクションは、可変重鎖及び可変軽鎖フレームワーク領域を含む抗体又はそれらの機能的断片を含み、前記フレームワーク領域は、以下のものからなる群から選択される１つ又は複数の可変λ軽鎖生殖系タンパク質配列を含む：ＩＧＬＶ２−１４、ＩＧＬＶ１−４０、ＩＧＬＶ１−４４、ＩＧＬＶ１−５１、ＩＧＬＶ２−２３、ＩＧＬＶ３−２１、ＩＧＬＶ１−４７、ＩＧＬＶ３−１、ＩＧＬＶ２−１１、ＩＧＬＶ２−８、ＩＧＬＶ６−５７、ＩＧＬＶ３−２５、ＩＧＬＶ７−４６、ＩＧＬＶ１−３６、ＩＧＬＶ７−４３、ＩＧＬＶ９−４９、ＩＧＬＶ４−６９、ＩＧＬＶ２−１８、ＩＧＬＶ３−１０、及びＩＧＬＶ３−２７。

幾つかの実施形態では、本発明は、以下のものからなる群から選択される生殖系タンパク質配列を含むＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、及びＦＲ３を含む単離された抗体又はその機能的断片を含む：ＩＧＨＶ３−２３、ＩＧＨＶ３−３０、ＩＧＨＶ４−３９、ＩＧＨＶ４−３４、ＩＧＨＶ４−５９、ＩＧＨＶ１−６９、ＩＧＨＶ５−５１、ＩＧＨＶ３−７、ＩＧＨＶ１−１８、ＩＧＨＶ３−４８、ＩＧＨＶ３−１５、ＩＧＨＶ３−２１、ＩＧＨＶ１−２、ＩＧＨＶ３−３３、ＩＧＨＶ４−３１、ＩＧＨＶ３−５３、ＩＧＨＶ３−１１、ＩＧＨＶ３−９、ＩＧＨＶ４−４、ＩＧＨＶ１−４６、ＩＧＨＶ３−７４、ＩＧＨＶ１−２４、ＩＧＨＶ４−６１、ＩＧＨＶ１−８、ＩＧＨＶ１−３、ＩＧＨＶ３−４９、ＩＧＨＶ３−４３、ＩＧＨＶ４−２８、ＩＧＨＶ３−６４、ＩＧＨＶ７−８１、ＩＧＫＶ３−２０、ＩＧＫＶ１−３９／１Ｄ−３９、ＩＧＫＶ１−５、ＩＧＫＶ３−１５、ＩＧＫＶ４−１、ＩＧＫＶ３−１１、ＩＧＫＶ２−２８／２Ｄ−２８、ＩＧＫＶ１−３３／１Ｄ−３３、ＩＧＫＶ２−３０、ＩＧＫＶ１−９、ＩＧＫＶ１−１７、ＩＧＫＶ１−２７、ＩＧＫＶ１−８、ＩＧＫＶ１−１６、ＩＧＫＶ１−６、ＩＧＫＶ１−１２、ＩＧＫＶ２Ｄ−２９、ＩＧＫＶ１−１３、ＩＧＫＶ１Ｄ−８、ＩＧＫＶ２−２４、ＩＧＬＶ２−１４、ＩＧＬＶ１−４０、ＩＧＬＶ１−４４、ＩＧＬＶ１−５１、ＩＧＬＶ２−２３、ＩＧＬＶ３−２１、ＩＧＬＶ１−４７、ＩＧＬＶ３−１、ＩＧＬＶ２−１１、ＩＧＬＶ２−８、ＩＧＬＶ６−５７、ＩＧＬＶ３−２５、ＩＧＬＶ７−４６、ＩＧＬＶ１−３６、ＩＧＬＶ７−４３、ＩＧＬＶ９−４９、ＩＧＬＶ４−６９、ＩＧＬＶ２−１８、ＩＧＬＶ３−１０、及びＩＧＬＶ３−２７。

好ましい生物物理学的特性を有する可変重鎖、可変κ軽鎖、及び可変λ軽鎖生殖系遺伝子
次のステップとして、顕著な可変重鎖、可変κ軽鎖、及び可変λ軽鎖生殖系タンパク質配列を評価して、開発に関連するそれらの生物物理学的特性を決定した。可変重鎖、可変κ軽鎖、及び可変λ軽鎖生殖系タンパク質配列を、以下の特性についてｉｎ ｓｉｌｉｃｏで評価した：ＣＤＲの長さ；等電点（ｐＩ）、好ましい等電点は、標準的なｐＨ５．５〜ｐＨ７製剤緩衝液中での安定性を提供するはずであるため、７．５以上である；相補性決定領域における翻訳後修飾（ＰＴＭ）（具体的には、Ｎ−結合グリコシル化部位（ＮｘＳ又はＮｘＴ）又はＡｓｐ切断（多くの場合、ＤＰでの）、Ａｓｐ異性化（ＤＤ、ＤＧ）、脱アミド化（ＮＳ、ＮＧ）等の化学的修飾、これらはｉｎ ｖｉｖｏ（血清中）で又は製剤緩衝液中での保管時に生じる場合があり、抗体結合の喪失に結び付く場合がある）；ＣＤＲにおけるメチオニンの存在（溶媒との接触時に酸化される場合がある）；未対形成システインの存在（任意の他の未対形成システインとジスルフィド結合を形成することになり、従ってタンパク質の架橋及び／又は発現レベルの低下に結び付く）；生殖系からの逸脱；潜在的なＴ細胞エピトープの存在；及び理論上の凝集傾向。

幾つかの実施形態では、本発明は、合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクションを産生する方法であって、ａ）以下の特性：ｉ）相補性決定領域における翻訳後修飾が４つ以下であること、ｉｉ）相補性決定領域におけるメチオニンが２つ以下であること、ｉｉｉ）未対形成システインが１つ以下であること、ｉｖ）潜在的なＴ細胞エピトープが１つ以下であること、ｖ）凝集傾向が中程度又は低いこと、及びｖｉ）等電点が少なくとも７．５であることを含む可変重鎖及び／又は可変軽鎖生殖系タンパク質配列を特定するステップと、ｂ）ａ）で特定された可変重鎖及び／又は可変軽鎖生殖系遺伝子配列を含む抗体又はそれらの機能的断片のコレクションを生成するステップとを含む方法を含む。

本発明の態様は、以下の特性：ｉ）相補性決定領域における翻訳後修飾が４つ以下であること、ｉｉ）相補性決定領域におけるメチオニンが２つ以下であること、ｉｉｉ）未対形成システインが１つ以下であること、ｉｖ）潜在的なＴ細胞エピトープが１つ以下であること、ｖ）凝集傾向が中程度又は低いこと、又はｖｉ）等電点は少なくとも７．５であることの１つ又は複数を含む可変重鎖及び／又は可変軽鎖生殖系タンパク質配列に由来する合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクションを含み、幾つかの実施形態では、抗体又はそれらの機能的断片のフレームワーク領域及び／又は相補性決定領域の１つ又は複数は、そのような特性を有する可変重鎖及び／又は可変軽鎖生殖系タンパク質配列に由来する。

本発明の態様は、以下の特性：ｉ）相補性決定領域における翻訳後修飾が４つ以下であること、ｉｉ）相補性決定領域におけるメチオニンが２つ以下であること、ｉｉｉ）未対形成システインが１つ以下であること、ｉｖ）潜在的なＴ細胞エピトープが１つ以下であること、ｖ）凝集傾向が中程度又は低いこと、又はｖｉ）等電点が少なくとも７．５であることの１つ又は複数を含む可変重鎖及び／又は可変軽鎖生殖系タンパク質配列の実質的生殖系タンパク質配列を含む合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクションを含み、幾つかの実施形態では、抗体又はそれらの機能的断片のフレームワーク領域及び／又は相補性決定領域の１つ又は複数は、そのような特性を有する可変重鎖及び／又は可変軽鎖生殖系タンパク質配列に由来する実質的生殖系タンパク質配列を含む。

本発明の態様は、以下の特性：ｉ）相補性決定領域における翻訳後修飾が４つ以下であること、ｉｉ）相補性決定領域におけるメチオニンが２つ以下であること、ｉｉｉ）未対形成システインが１つ以下であること、ｉｖ）潜在的なＴ細胞エピトープが１つ以下であること、ｖ）凝集傾向が中程度又は低いこと、又はｖｉ）等電点が少なくとも７．５であることの１つ又は複数を含む可変重鎖及び／又は可変軽鎖生殖系タンパク質配列の生殖系タンパク質配列を含む合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクションを含み、幾つかの実施形態では、抗体又はそれらの機能的断片のフレームワーク領域及び／又は相補性決定領域の１つ又は複数は、そのような特性を有する可変重鎖及び／又は可変軽鎖生殖系タンパク質の生殖系タンパク質配列を含む。

本発明の態様は、未対形成システインを含まない可変重鎖及び／又は可変軽鎖生殖系タンパク質配列を含む合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクションを含む。

本発明の態様は、相補性決定領域に４つ以下の翻訳後修飾を含むか、相補性決定領域に３つ以下の翻訳後修飾を含むか、相補性決定領域に２つ以下の翻訳後修飾を含むか、相補性決定領域に１つ以下の翻訳後修飾を含むか、又は相補性決定領域に翻訳後修飾を含まない可変重鎖及び／又は可変軽鎖生殖系タンパク質配列を含む合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクションを含む。

本発明の態様は、少なくとも７．５の、少なくとも８．０の、少なくとも８．５の、少なくとも９の、又は少なくとも９．５の等電点を含む可変重鎖及び／又は可変軽鎖生殖系タンパク質配列に由来する合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクションを含む。

本発明の態様は、可変重鎖及び／又は可変軽鎖フレームワーク領域を含む合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクションを含み、前記フレームワーク領域は、以下の特性の１つ又は複数を含む可変重鎖及び／又は可変軽鎖生殖系タンパク質配列を含む：ｉ）相補性決定領域における翻訳後修飾が４つ以下であること、ｉｉ）相補性決定領域におけるメチオニンが２つ以下であること、ｉｉｉ）未対形成システインが１つ以下であること、ｉｖ）潜在的なＴ細胞エピトープが１つ以下であること、ｖ）凝集傾向が中程度又は低いこと、又はｖｉ）等電点が少なくとも７．５であること。

幾つかの実施形態では、合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクションは、以下の特性の少なくとも２つを含む可変重鎖及び／又は可変軽鎖生殖系タンパク質配列を含む：ｉ）相補性決定領域における翻訳後修飾が４つ以下であること、ｉｉ）相補性決定領域におけるメチオニンが２つ以下であること、ｉｉｉ）未対形成システインが１つ以下であること、ｉｖ）潜在的なＴ細胞エピトープが１つ以下であること、ｖ）凝集傾向が中程度又は低いこと、又はｖｉ）等電点が少なくとも７．５であること。

幾つかの実施形態では、合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクションは、以下の特性の少なくとも４つを含む可変重鎖及び／又は可変軽鎖生殖系タンパク質配列を含む：ｉ）相補性決定領域における翻訳後修飾が４つ以下であること、ｉｉ）相補性決定領域におけるメチオニンが２つ以下であること、ｉｉｉ）未対形成システインが１つ以下であること、ｉｖ）潜在的なＴ細胞エピトープが１つ以下であること、ｖ）凝集傾向が中程度又は低いこと、又はｖｉ）等電点が少なくとも７．５であること。

幾つかの実施形態では、合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクションは、以下の特性の少なくとも４つを含む可変重鎖及び／又は可変軽鎖生殖系タンパク質配列を含む：ｉ）相補性決定領域における翻訳後修飾が４つ以下であること、ｉｉ）相補性決定領域におけるメチオニンが２つ以下であること、ｉｉｉ）未対形成システインが１つ以下であること、ｉｖ）潜在的なＴ細胞エピトープが１つ以下であること、ｖ）凝集傾向が中程度又は低いこと、又はｖｉ）等電点が少なくとも７．５であること。

幾つかの実施形態では、合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクションは、以下の特性の少なくとも５つを含む可変重鎖及び／又は可変軽鎖生殖系タンパク質配列を含む：ｉ）相補性決定領域における翻訳後修飾が４つ以下であること、ｉｉ）相補性決定領域におけるメチオニンが２つ以下であること、ｉｉｉ）未対形成システインが１つ以下であること、ｉｖ）潜在的なＴ細胞エピトープが１つ以下であること、ｖ）凝集傾向が中程度又は低いこと、又はｖｉ）等電点が少なくとも７．５であること。

幾つかの実施形態では、合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクションは、以下の特性を含む可変重鎖及び／又は可変軽鎖生殖系タンパク質配列を含む：ｉ）相補性決定領域における翻訳後修飾が４つ以下であること、ｉｉ）相補性決定領域におけるメチオニンが２つ以下であること、ｉｉｉ）未対形成システインが１つ以下であること、ｉｖ）潜在的なＴ細胞エピトープが１つ以下であること、ｖ）凝集傾向が中程度又は低いこと、及びｖｉ）等電点が少なくとも７．５であること。

幾つかの実施形態では、合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクションは、可変重鎖及び可変軽鎖フレームワーク領域を含み、前記フレームワーク領域は、以下の特性の１つ又は複数を含む可変重鎖及び／又は可変軽鎖生殖系タンパク質配列から本質的になる：ｉ）相補性決定領域における翻訳後修飾が４つ以下であること、ｉｉ）相補性決定領域におけるメチオニンが２つ以下であること、ｉｉｉ）未対形成システインが１つ以下であること、ｉｖ）潜在的なＴ細胞エピトープが１つ以下であること、ｖ）凝集傾向が中程度又は低いこと、又はｖｉ）等電点が少なくとも７．５であること。

幾つかの実施形態では、合成抗体又はそれらの機能的断片は、以下の特性の１つ又は複数を含む可変重鎖及び／又は可変軽鎖生殖系タンパク質配列から本質的になる：ｉ）相補性決定領域における翻訳後修飾が４つ以下であること、ｉｉ）相補性決定領域におけるメチオニンが２つ以下であること、ｉｉｉ）未対形成システインが１つ以下であること、ｉｖ）潜在的なＴ細胞エピトープが１つ以下であること、ｖ）凝集傾向が中程度又は低いこと、又はｖｉ）等電点が少なくとも７．５であること。

幾つかの実施形態では、合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクションは、可変重鎖及び可変軽鎖フレームワーク領域を含み、前記フレームワーク領域は、以下の特性の１つ又は複数を含む可変重鎖及び／又は可変軽鎖生殖系タンパク質配列からなる：ｉ）相補性決定領域における翻訳後修飾が４つ以下であること、ｉｉ）相補性決定領域におけるメチオニンが２つ以下であること、ｉｉｉ）未対形成システインが１つ以下であること、ｉｖ）潜在的なＴ細胞エピトープが１つ以下であること、ｖ）凝集傾向が中程度又は低いこと、又はｖｉ）等電点が少なくとも７．５であること。

幾つかの実施形態では、合成抗体又はそれらの機能的断片は、以下の特性の１つ又は複数を含む可変重鎖及び／又は可変軽鎖生殖系タンパク質配列からなる：ｉ）相補性決定領域における翻訳後修飾が４つ以下であること、ｉｉ）相補性決定領域におけるメチオニンが２つ以下であること、ｉｉｉ）未対形成システインが１つ以下であること、ｉｖ）潜在的なＴ細胞エピトープが１つ以下であること、ｖ）凝集傾向が中程度又は低いこと、又はｖｉ）等電点が少なくとも７．５であること。

幾つかの実施形態では、コレクションの合成抗体又はそれらの機能的断片の大多数又は実質的に全ては、以下の特性の１つ又は複数を含む可変重鎖及び／又は可変軽鎖生殖系タンパク質配列を含む：ｉ）相補性決定領域における翻訳後修飾が４つ以下であること、ｉｉ）相補性決定領域におけるメチオニンが２つ以下であること、ｉｉｉ）未対形成システインが１つ以下であること、ｉｖ）潜在的なＴ細胞エピトープが１つ以下であること、ｖ）凝集傾向が中程度又は低いこと、又はｖｉ）等電点が少なくとも７．５であること。

幾つかの実施形態は、可変重鎖及び可変軽鎖フレームワーク領域を含む合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクションを含み、前記フレームワーク領域は、生殖系タンパク質配列を含み、前記生殖系タンパク質配列は、以下の特性を含む：ｉ）相補性決定領域における翻訳後修飾が４つ以下であること、ｉｉ）相補性決定領域におけるメチオニンが２つ以下であること、ｉｉｉ）未対形成システインが１つ以下であること、ｉｖ）潜在的なＴ細胞エピトープが１つ以下であること、及びｖ）等電点が少なくとも７．５であること。

幾つかの実施形態は、可変重鎖及び可変軽鎖のフレームワーク領域を含む合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクションを含み、前記フレームワーク領域は、生殖系タンパク質配列を含み、前記生殖系タンパク質配列は、以下の特性を含む：ｉ）未対形成システインが１つ以下であること。

幾つかの実施形態は、可変重鎖及び可変軽鎖のフレームワーク領域を含む合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクションを含み、前記フレームワーク領域は、生殖系タンパク質配列を含み、前記生殖系タンパク質配列は、以下の特性を含む：ｉ）未対形成システインが１つ以下であること、ｉｉ）潜在的なＴ細胞エピトープが１つ以下であること。

幾つかの実施形態は、可変重鎖及び可変軽鎖のフレームワーク領域を含む合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクションを含み、前記フレームワーク領域は、生殖系タンパク質配列を含み、前記生殖系タンパク質配列は、以下の特性を含む：ｉ）未対形成システインが１つ以下であること、ｉｉ）潜在的なＴ細胞エピトープが１つ以下であること、及びｉｉｉ）等電点が少なくとも７．５であること。

幾つかの実施形態は、可変重鎖及び可変軽鎖フレームワーク領域を含む合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクションを含み、前記フレームワーク領域は、生殖系タンパク質配列を含み、前記生殖系タンパク質配列は、以下の特性を含む：ｉ）相補性決定領域におけるメチオニンが２つ以下であること、ｉｉ）未対形成システインが１つ以下であること、ｉｉｉ）潜在的なＴ細胞エピトープが１つ以下であること、及びｉｖ）等電点が少なくとも７．５であること。

本発明の追加的な態様は、任意の免疫原に対する抗体又はそれらの機能的断片の特定に有用なコレクションの能力である。１つ又は複数の可変重鎖、可変κ軽鎖、及び可変λ軽鎖生殖系タンパク質配列を有するコレクションを生成することにより、コレクション内で、特にＣＤＲの長さ及び立体構造又は基準構造において多様性が生成されることになり、従ってコレクションを、任意の免疫原に対する抗体又はそれらの機能的断片の特定に有用にすることができる。

本発明の実施形態は、以下の特性、ｉ）相補性決定領域における翻訳後修飾が４つ以下であること、ｉｉ）相補性決定領域におけるメチオニンが２つ以下であること、ｉｉｉ）未対形成システインが１つ以下であること、ｉｖ）潜在的なＴ細胞エピトープが１つ以下であること、ｖ）凝集傾向が中程度又は低いこと、又はｖｉ）等電点が少なくとも７．５であることを含む少なくとも２つの異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも３個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも４個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも５個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも６個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも７個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも８個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも９個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも１０個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも１１個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも１２個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも１３個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも１４個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも１５個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも１６個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも１７個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも１８個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも１９個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列、又は少なくとも２０の異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列を含む抗体又はそれらの機能的断片を含むコレクションを含む。

本発明の実施形態は、以下の特性、ｉ）相補性決定領域における翻訳後修飾が４つ以下であること、ｉｉ）相補性決定領域におけるメチオニンが２つ以下であること、ｉｉｉ）未対形成システインが１つ以下であること、ｉｖ）潜在的なＴ細胞エピトープが１つ以下であること、ｖ）凝集傾向が中程度又は低いこと、又はｖｉ）等電点が少なくとも７．５であることを含む少なくとも２個の異なる可変κ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも３個の異なる可変κ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも４個の異なる可変κ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも５個の異なる可変κ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも６個の異なる可変κ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも７個の異なる可変κ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも８個の異なる可変κ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも９個の異なる可変κ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも１０個の異なる可変κ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも１１個の異なる可変κ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも１２個の異なる可変κ軽鎖生殖系タンパク質配列を含む抗体又はそれらの機能的断片を含むコレクションを含む。

本発明の実施形態は、以下の特性、ｉ）相補性決定領域における翻訳後修飾が４つ以下であること、ｉｉ）相補性決定領域におけるメチオニンが２つ以下であること、ｉｉｉ）未対形成システインが１つ以下であること、ｉｖ）潜在的なＴ細胞エピトープが１つ以下であること、ｖ）凝集傾向が中程度又は低いこと、又はｖｉ）等電点が少なくとも７．５であることを含む少なくとも２個の異なる可変λ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも３個の異なる可変λ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも４個の異なる可変λ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも５個の異なる可変λ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも６個の異なる可変λ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも７個の異なる可変λ軽鎖生殖系タンパク質配列、少なくとも８個の異なる可変λ軽鎖生殖系タンパク質配列を含む抗体又はそれらの機能的断片を含むコレクションを含む。

幾つかの実施形態では、コレクションは、可変重鎖及び可変軽鎖フレームワーク領域を含む抗体又はそれらの機能的断片を含み、前記フレームワーク領域は、以下のものからなる群から選択される１つ又は複数の可変重鎖生殖系タンパク質配列を含む：ＩＧＨＶ１−２、ＩＧＨＶ１−１８、ＩＧＨＶ１−６９、ＩＧＨＶ１−４６、ＩＧＨＶ３−７、ＩＧＨＶ３−１１、ＩＧＨＶ３−１５、ＩＧＨＶ３−２１、ＩＧＨＶ３−２３、ＩＧＨＶ３−３０、ＩＧＨＶ３−３３、ＩＧＨＶ３−４８、ＩＧＨＶ３−５３、ＩＧＨＶ３−７３、ＩＧＨ３−７４、ＩＧＨＶ４−４、ＩＧＨＶ４−３１、ＩＧＨＶ４−３９、ＩＧＨＶ５−５１、及びＩＧＨＶ６−１。

幾つかの実施形態では、コレクションは、可変重鎖及び可変軽鎖フレームワーク領域を含む抗体又はそれらの機能的断片を含み、前記フレームワーク領域は、以下のものからなる群から選択される１つ又は複数の可変κ軽鎖生殖系タンパク質配列を含む：ＩＧＫＶ１−５、ＩＧＫＶ１−６、ＩＧＫＶ１−９、ＩＧＫＶ１−１２、ＩＧＫＶ１−１６、ＩＧＫＶ１−１７、ＩＧＫＶ１−２７、ＩＧＫＶ１−３９、ＩＧＫＶ２−３０、ＩＧＫＶ３−１１、ＩＧＫＶ３−１５、及びＩＧＫＶ３−２０。

幾つかの実施形態では、コレクションは、可変重鎖及び可変軽鎖フレームワーク領域を含む抗体又はそれらの機能的断片を含み、前記フレームワーク領域は、以下のものからなる群から選択される１つ又は複数の可変λ軽鎖生殖系タンパク質配列を含む：ＩＧＬＶ１−４０、ＩＧＬＶ１−４７、ＩＧＬＶ１−５１、ＩＧＬＶ２−１１、ＩＧＬＶ２−２３、ＩＧＬＶ２−１４、ＩＧＬＶ３−１、及びＩＧＬＶ３−２１。

幾つかの実施形態では、本発明は、以下のものからなる群から選択される生殖系タンパク質配列を含むＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、及びＦＲ３を含む単離された抗体又はその機能的断片を含む：ＩＧＨＶ１−２、ＩＧＨＶ１−１８、ＩＧＨＶ１−６９、ＩＧＨＶ１−４６、ＩＧＨＶ３−７、ＩＧＨＶ３−１１、ＩＧＨＶ３−１５、ＩＧＨＶ３−２１、ＩＧＨＶ３−２３、ＩＧＨＶ３−３０、ＩＧＨＶ３−３３、ＩＧＨＶ３−４８、ＩＧＨＶ３−５３、ＩＧＨＶ３−７３、ＩＧＨ３−７４、ＩＧＨＶ４−４、ＩＧＨＶ４−３１、ＩＧＨＶ４−３９、ＩＧＨＶ５−５１、ＩＧＨＶ６−１、ＩＧＫＶ１−５、ＩＧＫＶ１−６、ＩＧＫＶ１−９、ＩＧＫＶ１−１２、ＩＧＫＶ１−１６、ＩＧＫＶ１−１７、ＩＧＫＶ１−２７、ＩＧＫＶ１−３９、ＩＧＫＶ２−３０、ＩＧＫＶ３−１１、ＩＧＫＶ３−１５、ＩＧＫＶ３−２０、ＩＧＬＶ１−４０、ＩＧＬＶ１−４７、ＩＧＬＶ１−５１、ＩＧＬＶ２−１１、ＩＧＬＶ２−２３、ＩＧＬＶ２−１４、ＩＧＬＶ３−１、及びＩＧＬＶ３−２１。

好ましい生物物理学的特性を有する生殖系遺伝子対
ヒト免疫レパートリーには約２５００対が存在するため、次のステップとして、どの生殖系タンパク質対を試験すべきかを決定しなければならなかった。１つに方法は、ヒト免疫レパートリーで最も顕著に生じる可変重鎖及び可変軽鎖生殖系タンパク質対を試験することであろう。例えば、表１８を参照されたい。例えば、試験用に上位４００対を選択してもよく、又はある閾値濃度を超えて発現された可変重鎖及び可変軽鎖生殖系遺伝子対を選択してもよい。従って、本発明の態様は、合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクションを産生する方法であって、産生ステップが、ヒト免疫レパートリー中少なくとも０．０５％の濃度で発現される可変重鎖及び可変軽鎖生殖系遺伝子対を特定するステップと、特定された生殖系タンパク質対を含む抗体又はそれらの機能的断片を生成するステップと、前記生殖系タンパク質対の以下の特性を評価するステップとを更に含む方法を含む：ｉ）Ｆａｂ型の相対的提示率、ｉｉ）Ｆａｂ型の発現レベル；ｉｉｉ）Ｆａｂ型の熱安定性が６０℃以上にて少なくとも４５分間であること、ｉｖ）Ｆａｂ型のウシ血清安定性が３７℃にて１０日間を超えること、ｖ）ＩｇＧ型の発現レベル、及びｖｉ）ＩｇＧ型のウシ血清安定性が３７℃にて１４日間であること。

この手法では、多数の可変重鎖及び可変軽鎖生殖系タンパク質対配列の合成及び試験が必要とされることになり、従って、そのような手法は、あまり効率的ではないだろう。

代替的な手法として、本発明者らは、ヒト免疫レパートリーから顕著に発現される対の大多数を代表するか、正確に再現するか、又は包含する可変重鎖及び可変軽鎖生殖系対のサブセットを選択した。この手法は、少数の可変重鎖、可変κ軽鎖、及び可変λ軽鎖生殖系遺伝子が、ヒト免疫レパートリーにおいて優勢であるという観察に、部分的に基づいていた。この現象は、Ｗｉｌｄｔらの８９５〜８９６頁に記述されている。Ｗｉｌｄｔらは、高頻度に発現される重鎖及び軽鎖遺伝子セグメントが対を形成することが多いということも述べており、サンプリングされた対形成体の半分は、わずか５つの生殖系対に対応するに過ぎないことも観察された。従って、少数の顕著に発現される重鎖及び軽鎖生殖系遺伝子（未対形成）を組み合わせて、ヒト免疫レパートリーを代表する一群の対を生成することができる。

従って、本発明の態様は、ヒト免疫レパートリー又は未感作ヒト免疫レパートリーの顕著に発現される可変重鎖及び可変軽鎖生殖系遺伝子対の大多数を代表するか、正確に再現するか、又は包含する生殖系タンパク質対を含む抗体又はそれらの断片のコレクションを含む。下述されているように、本発明者らの手法は、好ましい生物物理学的特性に関して可変重鎖及び可変軽鎖生殖系タンパク質対を最初に試験し、その後これら好ましい生物物理学的特性の１つ又は複数を含む生殖系タンパク質対が含まれるようにコレクションを設計するため、十分に開発可能な抗体又はそれらの断片を含むコレクションに結び付く。

本発明の態様は、抗体又はそれらの機能的断片のコレクションを産生する方法であって、以下の特性の１つ又は複数を含む可変重鎖及び可変軽鎖生殖系タンパク質対を特定するステップを含む方法を含む：ｉ）Ｆａｂ型の相対的提示率が、サンプリングしたＦａｂの上位７５％以内の値を含むこと、ｉｉ）Ｆａｂ型の発現レベルが、Ｆａｂ ｐＭｘ１１＿ＦＨＶＨ１−６９ ＶＬＡ＿Ｖｌ１−４０ ＡＹＡと比較して、少なくとも０．４であること、ｉｉｉ）Ｆａｂ型の熱安定性が、６０℃以上にて少なくとも４５分間であること、ｉｖ）Ｆａｂ型のウシ又はマウス血清安定性が３７℃にて１０日間を超えること、ｖ）ＩｇＧ型の発現レベルが、ＭＯＲ０３０８０と比較して少なくとも０．４であること、及びｖｉ）ＩｇＧ型のウシ血清安定性が３７℃にて１４日間であること。

幾つかの態様では、本発明は、抗体又はそれらの機能的断片のコレクションを産生する方法であって、可変重鎖及び可変軽鎖フレームワーク領域を含む抗体又はそれらの機能的断片のコレクションを生成することを含み、前記１つ又は複数のフレームワーク領域が、生殖系タンパク質配列対の生殖系タンパク質配列を含み、前記生殖系タンパク質対が、１つ又は複数の以下の特性を含む方法を含む：ｉ）Ｆａｂ型の相対的提示率が、サンプリングしたＦａｂの上位７５％以内の値を含むこと、ｉｉ）Ｆａｂ型の発現レベルが、Ｆａｂ ＶＨ１−６９ ＶＬＡ＿Ｖｌ１−４０ ＡＹＡと比較して少なくとも０．４であること、ｉｉｉ）Ｆａｂ型の熱安定性が、６０℃以上にて少なくとも４５分間であること、ｉｖ）Ｆａｂ型のウシ又はマウス血清安定性が３７℃にて１０日間を超えること、ｖ）ＩｇＧ型の発現レベルが、ＭＯＲ０３０８０と比較して少なくとも０．４であること、及びｖｉ）ＩｇＧ型のウシ血清安定性が３７℃にて１４日間であること。幾つかの実施形態では、ＦＲ１、ＦＲ２、及びＦＲ３領域は、生殖系タンパク質配列を含む。

幾つかの実施形態では、ＦＲ１、ＦＲ２、及びＦＲ３領域は、生殖系タンパク質対の生殖系タンパク質配列を含む。幾つかの実施形態では、抗体又はそれらの機能的断片は、生殖系タンパク質配列を含む１つ又は複数の相補性決定領域を含む。幾つかの実施形態では、抗体又はそれらの機能的断片は、生殖系タンパク質対の生殖系タンパク質配列を含む１つ又は複数の相補性決定領域を含む。幾つかの実施形態では、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域は、生殖系タンパク質配列を含む。幾つかの実施形態では、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域は、生殖系タンパク質対の生殖系タンパク質配列を含む。幾つかの実施形態では、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、及びＦＲ３領域は、生殖系タンパク質配列を含む。幾つかの実施形態では、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、及びＦＲ３領域は、生殖系タンパク質対の生殖系タンパク質配列を含む。幾つかの実施形態では、ＦＲ４領域は、ＪＨ４重鎖領域を含む。幾つかの実施形態では、ＦＲ４領域は、Ｊκ１軽鎖領域を含む。幾つかの実施形態では、ＦＲ４領域は、Ｊλ２／３軽鎖領域を含む。

他の実施形態では、本発明は、抗体又はそれらの機能的断片のコレクションを産生する方法であって、コレクションを生成することを含み、生成が、抗体又はそれらの機能的断片をコードする核酸を合成するステップと、核酸をベクターにクローニングするステップと、抗体又はそれらの機能的断片を発現させるステップとを更に含む方法を含む。

可変重鎖及び可変軽鎖生殖系タンパク質対の顕著に発現される又は代表的な群が合成及び試験されれば、好ましい生物物理学的特性を含む生殖系タンパク質対を含むようにコレクションを設計することができる。

本発明の態様は、以下の特性：ｉ）Ｆａｂ型の相対的提示率が、サンプリングしたＦａｂの上位７５％以内の値を含むこと、ｉｉ）Ｆａｂ型の発現レベルが、Ｆａｂ ＶＨ１−６９ ＶＬＡ＿Ｖｌ１−４０ ＡＹＡと比較して少なくとも０．４であること、ｉｉｉ）Ｆａｂ型の熱安定性が、６０℃以上にて少なくとも４５分間であること、ｉｖ）Ｆａｂ型のウシ又はマウス血清安定性が３７℃にて１０日間を超えること、ｖ）ＩｇＧ型の発現レベルが、ＭＯＲ０３０８０と比較して少なくとも０．４であること、及びｖｉ）ＩｇＧ型のウシ血清安定性が３７℃にて１４日間であることのうちの１つ又は複数を含む生殖系タンパク質対に由来する合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクションを含み、幾つかの実施形態では、抗体又はそれらの機能的断片のフレームワーク領域及び／又は相補性決定領域の１つ又は複数は、そのような特性を有する生殖系タンパク質対に由来する。

本発明の態様は、以下の特性：ｉ）Ｆａｂ型の相対的提示率が、サンプリングしたＦａｂの上位７５％以内の値を含むこと、ｉｉ）Ｆａｂ型の発現レベルが、Ｆａｂ ＶＨ１−６９ ＶＬＡ＿Ｖｌ１−４０ ＡＹＡと比較して少なくとも０．４であること、ｉｉｉ）Ｆａｂ型の熱安定性が、６０℃以上にて少なくとも４５分間であること、ｉｖ）Ｆａｂ型のウシ又はマウス血清安定性が３７℃にて１０日間を超えること、ｖ）ＩｇＧ型の発現レベルが、ＭＯＲ０３０８０と比較して少なくとも０．４であること、及びｖｉ）ＩｇＧ型のウシ血清安定性が３７℃にて１４日間であることのうちの１つ又は複数を含む生殖系タンパク質対の実質的生殖系タンパク質配列を含む合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクションを含み、幾つかの実施形態では、抗体又はそれらの機能的断片のフレームワーク領域及び／又は相補性決定領域の１つ又は複数は、そのような特性を有する生殖系タンパク質対の実質的生殖系タンパク質配列を含む。

本発明の態様は、以下の特性：ｉ）Ｆａｂ型の相対的提示率が、サンプリングしたＦａｂの上位７５％以内の値を含むこと、ｉｉ）Ｆａｂ型の発現レベルが、Ｆａｂ ＶＨ１−６９ ＶＬＡ＿Ｖｌ１−４０ ＡＹＡと比較して少なくとも０．４であること、ｉｉｉ）Ｆａｂ型の熱安定性が、６０℃以上にて少なくとも４５分間であること、ｉｖ）Ｆａｂ型のウシ又はマウス血清安定性が３７℃にて１０日間を超えること、ｖ）ＩｇＧ型の発現レベルが、ＭＯＲ０３０８０と比較して少なくとも０．４であること、及びｖｉ）ＩｇＧ型のウシ血清安定性が３７℃にて１４日間であることのうちの１つ又は複数を含む生殖系タンパク質対の生殖系タンパク質配列を含む合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクションを含み、幾つかの実施形態では、抗体又はそれらの機能的断片のフレームワーク領域及び／又は相補性決定領域の１つ又は複数は、そのような特性を有する生殖系タンパク質対の生殖系タンパク質配列を含む。

幾つかの態様では、合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクションは、可変重鎖及び可変軽鎖フレームワーク領域を含み、フレームワーク領域は、以下の特性の１つ又は複数を含む生殖系タンパク質対の生殖系タンパク質配列を含む：ｉ）Ｆａｂ型の相対的提示率が、サンプリングしたＦａｂの上位７５％以内の値を含むこと、ｉｉ）Ｆａｂ型の発現レベルが、Ｆａｂ ＶＨ１−６９ ＶＬＡ＿Ｖｌ１−４０ ＡＹＡと比較して少なくとも０．４であること、ｉｉｉ）Ｆａｂ型の熱安定性が、６０℃以上にて少なくとも４５分間であること、ｉｖ）Ｆａｂ型のウシ又はマウス血清安定性が３７℃にて１０日間を超えること、ｖ）ＩｇＧ型の発現レベルが、ＭＯＲ０３０８０と比較して少なくとも０．４であること、及びｖｉ）ＩｇＧ型のウシ血清安定性が３７℃にて１４日間であること。

幾つかの実施形態では、生殖系タンパク質対の生殖系タンパク質配列を含むフレームワーク領域は、ＦＲ１、ＦＲ２、及びＦＲ３領域を含む。幾つかの実施形態では、抗体又はそれらの機能的断片は、生殖系タンパク質配列を含む１つ又は複数の相補性決定領域を含む。幾つかの実施形態では、抗体又はそれらの機能的断片は、生殖系タンパク質対の生殖系タンパク質配列を含む１つ又は複数の相補性決定領域を含む。幾つかの実施形態では、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域は、生殖系タンパク質配列を含む。幾つかの実施形態では、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域は、生殖系タンパク質対の生殖系タンパク質配列を含む。幾つかの実施形態では、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、及びＦＲ３領域は、生殖系タンパク質配列を含む。幾つかの実施形態では、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、及びＦＲ３領域は、生殖系タンパク質対の生殖系タンパク質配列を含む。幾つかの実施形態では、ＦＲ４領域は、ＪＨ４重鎖領域を含む。幾つかの実施形態では、ＦＲ４領域は、Ｊκ１軽鎖領域を含む。幾つかの実施形態では、ＦＲ４領域は、Ｊλ２／３軽鎖領域を含む。

幾つかの実施形態では、合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクションは、可変重鎖及び可変軽鎖フレームワーク領域を含み、フレームワーク領域は、以下の特性の少なくとも２つを含む生殖系タンパク質対の生殖系タンパク質配列を含む：ｉ）Ｆａｂ型の相対的提示率が、サンプリングしたＦａｂの上位７５％以内の値を含むこと、ｉｉ）Ｆａｂ型の発現レベルが、Ｆａｂ ＶＨ１−６９ ＶＬＡ＿Ｖｌ１−４０ ＡＹＡと比較して少なくとも０．４であること、ｉｉｉ）Ｆａｂ型の熱安定性が、６０℃以上にて少なくとも４５分間であること、ｉｖ）Ｆａｂ型のウシ又はマウス血清安定性が３７℃にて１０日間を超えること、ｖ）ＩｇＧ型の発現レベルが、ＭＯＲ０３０８０と比較して少なくとも０．４であること、及びｖｉ）ＩｇＧ型のウシ血清安定性が３７℃にて１４日間であること。

幾つかの実施形態では、合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクションは、可変重鎖及び可変軽鎖フレームワーク領域を含み、フレームワーク領域は、以下の特性の少なくとも３つを含む生殖系タンパク質対の生殖系タンパク質配列を含む：ｉ）Ｆａｂ型の相対的提示率が、サンプリングしたＦａｂの上位７５％以内の値を含むこと、ｉｉ）Ｆａｂ型の発現レベルが、Ｆａｂ ＶＨ１−６９ ＶＬＡ＿Ｖｌ１−４０ ＡＹＡと比較して少なくとも０．４であること、ｉｉｉ）Ｆａｂ型の熱安定性が、６０℃以上にて少なくとも４５分間であること、ｉｖ）Ｆａｂ型のウシ又はマウス血清安定性が３７℃にて１０日間を超えること、ｖ）ＩｇＧ型の発現レベルが、ＭＯＲ０３０８０と比較して少なくとも０．４であること、及びｖｉ）ＩｇＧ型のウシ血清安定性が３７℃にて１４日間であること。

幾つかの実施形態では、合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクションは、可変重鎖及び可変軽鎖フレームワーク領域を含み、フレームワーク領域は、以下の特性の少なくとも４つを含む生殖系タンパク質対の生殖系タンパク質配列を含む：ｉ）Ｆａｂ型の相対的提示率が、サンプリングしたＦａｂの上位７５％以内の値を含むこと、ｉｉ）Ｆａｂ型の発現レベルが、Ｆａｂ ＶＨ１−６９ ＶＬＡ＿Ｖｌ１−４０ ＡＹＡと比較して少なくとも０．４であること、ｉｉｉ）Ｆａｂ型の熱安定性が、６０℃以上にて少なくとも４５分間であること、ｉｖ）Ｆａｂ型のウシ又はマウス血清安定性が３７℃にて１０日間を超えること、ｖ）ＩｇＧ型の発現レベルが、ＭＯＲ０３０８０と比較して少なくとも０．４であること、及びｖｉ）ＩｇＧ型のウシ血清安定性が３７℃にて１４日間であること。

幾つかの実施形態では、合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクションは、可変重鎖及び可変軽鎖フレームワーク領域を含み、フレームワーク領域は、以下の特性の少なくとも５つを含む生殖系タンパク質対の生殖系タンパク質配列を含む：ｉ）Ｆａｂ型の相対的提示率が、サンプリングしたＦａｂの上位７５％以内の値を含むこと、ｉｉ）Ｆａｂ型の発現レベルが、Ｆａｂ ＶＨ１−６９ ＶＬＡ＿Ｖｌ１−４０ ＡＹＡと比較して少なくとも０．４であること、ｉｉｉ）Ｆａｂ型の熱安定性が、６０℃以上にて少なくとも４５分間であること、ｉｖ）Ｆａｂ型のウシ又はマウス血清安定性が３７℃にて１０日間を超えること、ｖ）ＩｇＧ型の発現レベルが、ＭＯＲ０３０８０と比較して少なくとも０．４であること、及びｖｉ）ＩｇＧ型のウシ血清安定性が３７℃にて１４日間であること。

幾つかの実施形態では、合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクションは、可変重鎖及び可変軽鎖フレームワーク領域を含み、フレームワーク領域は、以下の特性を含む生殖系タンパク質対の生殖系タンパク質配列を含む：ｉ）Ｆａｂ型の相対的提示率が、サンプリングしたＦａｂの上位７５％以内の値を含むこと、ｉｉ）Ｆａｂ型の発現レベルが、Ｆａｂ ＶＨ１−６９ ＶＬＡ＿Ｖｌ１−４０ ＡＹＡと比較して少なくとも０．４であること、ｉｉｉ）Ｆａｂ型の熱安定性が、６０℃以上にて少なくとも４５分間であること、ｉｖ）Ｆａｂ型のウシ又はマウス血清安定性が３７℃にて１０日間を超えること、ｖ）ＩｇＧ型の発現レベルが、ＭＯＲ０３０８０と比較して少なくとも０．４であること、及びｖｉ）ＩｇＧ型のウシ血清安定性が３７℃にて１４日間であること。

幾つかの実施形態では、合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクションは、可変重鎖及び可変軽鎖フレームワーク領域を含み、フレームワーク領域は、以下の特性の１つ又は複数を含む生殖系タンパク質対の生殖系タンパク質配列から本質的になる：ｉ）Ｆａｂ型の相対的提示率が、サンプリングしたＦａｂの上位７５％以内の値を含むこと、ｉｉ）Ｆａｂ型の発現レベルが、Ｆａｂ ＶＨ１−６９ ＶＬＡ＿Ｖｌ１−４０ ＡＹＡと比較して少なくとも０．４であること、ｉｉｉ）Ｆａｂ型の熱安定性が、６０℃以上にて少なくとも４５分間であること、ｉｖ）Ｆａｂ型のウシ又はマウス血清安定性が３７℃にて１０日間を超えること、ｖ）ＩｇＧ型の発現レベルが、ＭＯＲ０３０８０と比較して少なくとも０．４であること、及びｖｉ）ＩｇＧ型のウシ血清安定性が３７℃にて１４日間であること。

幾つかの実施形態では、合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクションは、以下の特性の１つ又は複数を含む生殖系タンパク質対の生殖系タンパク質配列から本質的になる：ｉ）Ｆａｂ型の相対的提示率が、サンプリングしたＦａｂの上位７５％以内の値を含むこと、ｉｉ）Ｆａｂ型の発現レベルが、Ｆａｂ ＶＨ１−６９ ＶＬＡ＿Ｖｌ１−４０ ＡＹＡと比較して少なくとも０．４であること、ｉｉｉ）Ｆａｂ型の熱安定性が、６０℃以上にて少なくとも４５分間であること、ｉｖ）Ｆａｂ型のウシ又はマウス血清安定性が３７℃にて１０日間を超えること、ｖ）ＩｇＧ型の発現レベルが、ＭＯＲ０３０８０と比較して少なくとも０．４であること、及びｖｉ）ＩｇＧ型のウシ血清安定性が３７℃にて１４日間であること。

幾つかの実施形態では、合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクションは、可変重鎖及び可変軽鎖フレームワーク領域を含み、フレームワーク領域は、以下の特性の１つ又は複数を含む生殖系タンパク質対の生殖系タンパク質配列からなる：ｉ）Ｆａｂ型の相対的提示率が、サンプリングしたＦａｂの上位７５％以内の値を含むこと、ｉｉ）Ｆａｂ型の発現レベルが、Ｆａｂ ＶＨ１−６９ ＶＬＡ＿Ｖｌ１−４０ ＡＹＡと比較して少なくとも０．４であること、ｉｉｉ）Ｆａｂ型の熱安定性が、６０℃以上にて少なくとも４５分間であること、ｉｖ）Ｆａｂ型のウシ又はマウス血清安定性が３７℃にて１０日間を超えること、ｖ）ＩｇＧ型の発現レベルが、ＭＯＲ０３０８０と比較して少なくとも０．４であること、及びｖｉ）ＩｇＧ型のウシ血清安定性が３７℃にて１４日間であること。

幾つかの実施形態では、抗体又はそれらの機能的断片は、以下の特性の１つ又は複数を含む生殖系タンパク質対の生殖系タンパク質配列からなる：ｉ）Ｆａｂ型の相対的提示率が、サンプリングしたＦａｂの上位７５％以内の値を含むこと、ｉｉ）Ｆａｂ型の発現レベルが、Ｆａｂ ＶＨ１−６９ ＶＬＡ＿Ｖｌ１−４０ ＡＹＡと比較して少なくとも０．４であること、ｉｉｉ）Ｆａｂ型の熱安定性が、６０℃以上にて少なくとも４５分間であること、ｉｖ）Ｆａｂ型のウシ又はマウス血清安定性が３７℃にて１０日間を超えること、ｖ）ＩｇＧ型の発現レベルが、ＭＯＲ０３０８０と比較して少なくとも０．４であること、及びｖｉ）ＩｇＧ型のウシ血清安定性が３７℃にて１４日間であること。

幾つかの実施形態では、コレクションの抗体又はそれらの機能的断片の大多数又は実質的に全ては、以下の特性の１つ又は複数を含む生殖系タンパク質対の生殖系タンパク質配列を含む：ｉ）Ｆａｂ型の相対的提示率が、サンプリングしたＦａｂの上位７５％以内の値を含むこと、ｉｉ）Ｆａｂ型の発現レベルが、Ｆａｂ ＶＨ１−６９ ＶＬＡ＿Ｖｌ１−４０ ＡＹＡと比較して少なくとも０．４であること、ｉｉｉ）Ｆａｂ型の熱安定性が、６０℃以上にて少なくとも４５分間であること、ｉｖ）Ｆａｂ型のウシ又はマウス血清安定性が３７℃にて１０日間を超えること、ｖ）ＩｇＧ型の発現レベルが、ＭＯＲ０３０８０と比較して少なくとも０．４であること、及びｖｉ）ＩｇＧ型のウシ血清安定性が３７℃にて１４日間であること。

幾つかの態様では、コレクションの抗体又はそれらの機能的断片は、以下の特性の１つ又は複数を含む生殖系タンパク質対の生殖系タンパク質配列を含む：ｉ）Ｆａｂ型の相対的提示率が、サンプリングしたＦａｂの上位７５％以内の値を含むこと、ｉｉ）Ｆａｂ型の発現レベルが、Ｆａｂ ＶＨ１−６９ ＶＬＡ＿Ｖｌ１−４０ ＡＹＡと比較して少なくとも０．４であること、ｉｉｉ）Ｆａｂ型の熱安定性が、６０℃以上にて少なくとも４５分間であること、ｉｖ）Ｆａｂ型のウシ又はマウス血清安定性が３７℃にて１０日間を超えること、ｖ）ＩｇＧ型の発現レベルが、ＭＯＲ０３０８０と比較して少なくとも０．４であること、及びｖｉ）ＩｇＧ型のウシ血清安定性が３７℃にて１４日間であること。

幾つかの実施形態では、抗体又はそれらの機能的断片は、以下の特性を含む生殖系タンパク質対の生殖系タンパク質配列から本質的になる：ｉ）Ｆａｂ型の相対的提示率が、サンプリングしたＦａｂの上位７５％以内の値を含むこと、ｉｉ）Ｆａｂ型の発現レベルが、Ｆａｂ ＶＨ１−６９ ＶＬＡ＿Ｖｌ１−４０ ＡＹＡと比較して少なくとも０．４であること、ｉｉｉ）Ｆａｂ型の熱安定性が、６０℃以上にて少なくとも４５分間であること、ｉｖ）Ｆａｂ型のウシ又はマウス血清安定性が３７℃にて１０日間を超えること、ｖ）ＩｇＧ型の発現レベルが、ＭＯＲ０３０８０と比較して少なくとも０．４であること、及びｖｉ）ＩｇＧ型のウシ血清安定性が３７℃にて１４日間であること。

幾つかの実施形態では、抗体又はそれらの機能的断片は、以下の特性を含む生殖系タンパク質対の生殖系タンパク質配列からなる：ｉ）Ｆａｂ型の相対的提示率が、サンプリングしたＦａｂの上位７５％以内の値を含むこと、ｉｉ）Ｆａｂ型の発現レベルが、Ｆａｂ ＶＨ１−６９ ＶＬＡ＿Ｖｌ１−４０ ＡＹＡと比較して少なくとも０．４であること、ｉｉｉ）Ｆａｂ型の熱安定性が、６０℃以上にて少なくとも４５分間であること、ｉｖ）Ｆａｂ型のウシ又はマウス血清安定性が３７℃にて１０日間を超えること、ｖ）ＩｇＧ型の発現レベルが、ＭＯＲ０３０８０と比較して少なくとも０．４であること、及びｖｉ）ＩｇＧ型のウシ血清安定性が３７℃にて１４日間であること。

幾つかの実施形態では、合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクションは、可変重鎖及び可変軽鎖フレームワーク領域を含み、前記可変重鎖フレームワーク領域及び可変軽鎖フレームワーク領域は、生殖系タンパク質対の生殖系タンパク質配列を含み、前記生殖系タンパク質対は、以下の特性を含む：ｉ）Ｆａｂ型の熱安定性が、６０℃以上にて少なくとも４５分間であること、及びｉｉ）ＩｇＧ型の血清安定性が３７℃にて１４日間であること。

幾つかの実施形態では、合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクションは可変重鎖及び可変軽鎖フレームワーク領域を含み、前記可変重鎖フレームワーク領域及び可変軽鎖フレームワーク領域は、生殖系タンパク質対の生殖系タンパク質配列を含み、前記生殖系タンパク質対は、以下の特性を含む：ｉ）Ｆａｂ型の熱安定性が、６０℃以上にて少なくとも４５分間であること、ｉｉ）Ｆａｂ型のウシ又はマウス血清安定性が３７℃にて１０日間を超えること、及びｉｉｉ）ＩｇＧ型の血清安定性が３７℃にて１４日間であること。

幾つかの実施形態では、合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクションは、可変重鎖及び可変軽鎖フレームワーク領域を含み、前記可変重鎖フレームワーク領域及び可変軽鎖フレームワーク領域は、生殖系タンパク質対の生殖系タンパク質配列を含み、前記生殖系タンパク質対は、以下の特性を含む：ｉ）Ｆａｂ型の相対的提示率が、サンプリングしたＦａｂの上位７５％以内の値を含むこと、ｉｉ）Ｆａｂ型の熱安定性が、６０℃以上にて少なくとも４５分間であること、ｉｉｉ）Ｆａｂ型のウシ又はマウス血清安定性が３７℃にて１０日間を超えること、及びｉｖ）ＩｇＧ型の血清安定性が３７℃にて１４日間であること。

幾つかの実施形態では、合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクションは、可変重鎖及び可変軽鎖フレームワーク領域を含み、前記可変重鎖フレームワーク領域及び可変軽鎖フレームワーク領域は、生殖系タンパク質対の生殖系タンパク質配列を含み、前記生殖系タンパク質対は、以下の特性を含む：ｉ）Ｆａｂ型の発現レベルが、Ｆａｂ ＶＨ１−６９ ＶＬＡ＿Ｖｌ１−４０ ＡＹＡと比較して少なくとも０．４であること、ｉｉ）Ｆａｂ型の熱安定性が、６０℃以上にて少なくとも４５分間であること、ｉｉｉ）Ｆａｂ型のウシ又はマウス血清安定性が３７℃にて１０日間を超えること、ｉｖ）ＩｇＧ型の発現レベルが、ＭＯＲ００３０８０と比較して少なくとも０．４であること、及びｖ）ＩｇＧ型の血清安定性が３７℃にて１４日間であること。

他の実施形態では、本発明のコレクションは、可変重鎖及び可変軽鎖フレームワーク領域を含む合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクションを含み、前記可変重鎖フレームワーク領域及び可変軽鎖フレームワーク領域は、生殖系タンパク質対の生殖系タンパク質配列を含み、前記生殖系タンパク質対は、以下の特性を含む：ｉ）Ｆａｂ型の熱安定性が、６０℃以上にて少なくとも４５分間であること、ｉｉ）Ｆａｂ型のウシ又はマウス血清安定性が３７℃にて１０日間を超えること、ｉｉｉ）ＩｇＧ型の発現レベルが、ＭＯＲ００３０８０と比較して少なくとも０．４であること、及びｉｖ）ＩｇＧ型の血清安定性が３７℃にて１４日間であること。

他の実施形態では、本発明のコレクション及び／又はそのようなコレクションを産生する方法は、可変重鎖及び可変軽鎖フレームワーク領域を含む抗体又はそれらの機能的断片を含み、前記フレームワーク領域は、対照と比較して少なくとも０．１の、対照と比較して少なくとも０．２の、対照と比較して少なくとも０．３の、対照と比較して少なくとも０．４の、対照と比較して少なくとも０．５の、対照と比較して少なくとも０．６の、対照と比較して少なくとも０．７の、対照と比較して少なくとも０．８の、対照と比較して少なくとも０．９の、対照と比較して少なくとも１．０の、対照と比較して少なくとも１．１の、対照と比較して少なくとも１．２の、対照と比較して少なくとも１．３の、対照と比較して少なくとも１．４の、対照と比較して少なくとも１．５の、対照と比較して少なくとも１．６の、対照と比較して少なくとも１．７の、対照と比較して少なくとも１．８の、対照と比較して少なくとも１．９の、対照と比較して少なくとも２．０の、対照と比較して少なくとも２．１の、対照と比較して少なくとも２．２の、対照と比較して少なくとも２．３の、対照と比較して少なくとも２．４の、対照と比較して少なくとも２．５の、対照と比較して少なくとも２．６の、対照と比較して少なくとも２．７の、対照と比較して少なくとも２．８の、対照と比較して少なくとも２．９の、対照と比較して少なくとも３．０の、対照と比較して少なくとも３．２の、対照と比較して少なくとも３．３の、対照と比較して少なくとも３．４の、対照と比較して少なくとも３．５の、対照と比較して少なくとも３．６の、対照と比較して少なくとも３．７の、対照と比較して少なくとも３．８の、対照と比較して少なくとも４．１の、対照と比較して少なくとも４．３の、対照と比較して少なくとも４．４の、対照と比較して少なくとも４．５の、対照と比較して少なくとも４．６の、対照と比較して少なくとも４．７の、対照と比較して少なくとも５．０の、対照と比較して少なくとも５．１の、対照と比較して少なくとも５．２の、対照と比較して少なくとも５．４の、対照と比較して少なくとも５．５の、対照と比較して少なくとも５．７の、対照と比較して少なくとも５．９の、対照と比較して少なくとも６．０の、対照と比較して少なくとも６．１の、対照と比較して少なくとも６．３の、対照と比較して少なくとも６．４の、対照と比較して少なくとも６．７の、対照と比較して少なくとも６．９の、対照と比較して少なくとも７．０の、対照と比較して少なくとも７．１の、対照と比較して少なくとも７．２の、対照と比較して少なくとも７．３の、対照と比較して少なくとも７．４の、対照と比較して少なくとも８．１の、対照と比較して少なくとも８．２の、対照と比較して少なくとも８．３の、対照と比較して少なくとも８．４の、対照と比較して少なくとも８．５の、対照と比較して少なくとも８．６の、対照と比較して少なくとも８．７の、対照と比較して少なくとも８．８の、対照と比較して少なくとも８．９の、対照と比較して少なくとも９．１の、対照と比較して少なくとも９．２の、対照と比較して少なくとも９．３の、対照と比較して少なくとも９．４の、対照と比較して少なくとも９．５の、対照と比較して少なくとも９．７の、対照と比較して少なくとも９．８の、対照と比較して少なくとも１０．０の、対照と比較して少なくとも１０．２の、対照と比較して少なくとも１０．３の、対照と比較して少なくとも１０．５の、対照と比較して少なくとも１０．６の、対照と比較して少なくとも１０．７の、対照と比較して少なくとも１０．８の、対照と比較して少なくとも１１．０の、対照と比較して少なくとも１１．２の、対照と比較して少なくとも１１．３の、対照と比較して少なくとも１１．５の、対照と比較して少なくとも１１．７の、対照と比較して少なくとも１１．８の、対照と比較して少なくとも１２．１の、対照と比較して少なくとも１２．３の、対照と比較して少なくとも１２．４の、対照と比較して少なくとも１２．９の、対照と比較して少なくとも１３．０の、対照と比較して少なくとも１３．６の、対照と比較して少なくとも１４．４の、対照と比較して少なくとも１４．５の、対照と比較して少なくとも１６．１の、対照と比較して少なくとも１６．６の、対照と比較して少なくとも１６．７の、対照と比較して少なくとも１７．１の、対照と比較して少なくとも１９．４の、対照と比較して少なくとも２７．３の、又は対照と比較して少なくとも２９．０のＦａｂ型の相対的提示率を含む生殖系タンパク質対の生殖系タンパク質配列を含む。

幾つかの実施形態では、合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクションは可変重鎖及び可変軽鎖フレームワーク領域を含み、前記可変重鎖フレームワーク領域及び可変軽鎖フレームワーク領域は、生殖系タンパク質対の生殖系タンパク質配列を含み、前記生殖系タンパク質対は、サンプリングしたＦａｂの上位１０％以内の値、サンプリングしたＦａｂの上位１５％以内の値、サンプリングしたＦａｂの上位２０％以内の値、サンプリングしたＦａｂの上位２５％以内の値、サンプリングしたＦａｂの上位３０％以内の値、サンプリングしたＦａｂの上位３５％以内の値、サンプリングしたＦａｂの上位４０％以内の値、サンプリングしたＦａｂの上位４５％以内の値、サンプリングしたＦａｂの上位５０％以内の値、サンプリングしたＦａｂの上位５５％以内の値、サンプリングしたＦａｂの上位６０％以内の値、サンプリングしたＦａｂの上位６５％以内の値、サンプリングしたＦａｂの上位７０％以内の値、サンプリングしたＦａｂの上位７５％以内の値、サンプリングしたＦａｂの上位８０％以内の値、サンプリングしたＦａｂの上位８５％以内の値、又はサンプリングしたＦａｂの上位９０％以内の値を含むＦａｂ型の相対的提示率を含む。

他の実施形態では、本発明のコレクション及び／又はそのようなコレクションを産生する方法は、可変重鎖及び可変軽鎖フレームワーク領域を含む抗体又はそれらの機能的断片を含み、前記フレームワーク領域は、Ｆａｂ ＶＨ１−６９ ＶＬＡ＿Ｖｌ１−４０ ＡＹＡと比較して少なくとも０．１の、Ｆａｂ ＶＨ１−６９ ＶＬＡ＿Ｖｌ１−４０ ＡＹＡと比較して少なくとも０．２の、Ｆａｂ ＶＨ１−６９ ＶＬＡ＿Ｖｌ１−４０ ＡＹＡと比較して少なくとも０．３の、Ｆａｂ ＶＨ１−６９ ＶＬＡ＿Ｖｌ１−４０ ＡＹＡと比較して少なくとも０．４の、Ｆａｂ ＶＨ１−６９ ＶＬＡ＿Ｖｌ１−４０ ＡＹＡと比較して少なくとも０．５の、Ｆａｂ ＶＨ１−６９ ＶＬＡ＿Ｖｌ１−４０ ＡＹＡと比較して少なくとも０．６の、Ｆａｂ ＶＨ１−６９ ＶＬＡ＿Ｖｌ１−４０ ＡＹＡと比較して少なくとも０．７の、Ｆａｂ ＶＨ１−６９ ＶＬＡ＿Ｖｌ１−４０ ＡＹＡと比較して少なくとも０．８の、Ｆａｂ ＶＨ１−６９ ＶＬＡ＿Ｖｌ１−４０ ＡＹＡと比較して少なくとも０．９の、Ｆａｂ ＶＨ１−６９ ＶＬＡ＿Ｖｌ１−４０ ＡＹＡと比較して少なくとも１．０の、Ｆａｂ ＶＨ１−６９ ＶＬＡ＿Ｖｌ１−４０ ＡＹＡと比較して少なくとも１．１の、Ｆａｂ ＶＨ１−６９ ＶＬＡ＿Ｖｌ１−４０ ＡＹＡと比較して少なくとも１．２の、又はＦａｂ ＶＨ１−６９ ＶＬＡ＿Ｖｌ１−４０ ＡＹＡと比較して少なくとも１．３の、Ｆａｂ型の相対的発現レベルを含む。

他の実施形態では、本発明のコレクション及び／又はそのようなコレクションを産生する方法は、可変重鎖及び可変軽鎖フレームワーク領域を含む抗体又はそれらの機能的断片を含み、前記フレームワーク領域は、７０℃以上にて少なくとも４５分間のＦａｂ型の熱安定性、又は８０℃以上にて少なくとも４５分間のＦａｂ型の熱安定性を含む生殖系タンパク質対の生殖系タンパク質配列を含む。

他の実施形態では、本発明のコレクション及び／又はそのようなコレクションを産生する方法は、可変重鎖及び可変軽鎖フレームワーク領域を含む抗体又はそれらの機能的断片を含み、前記フレームワーク領域は、ＭＯＲ０３０８０と比較して少なくとも０．１の、ＭＯＲ０３０８０と比較して少なくとも０．２の、ＭＯＲ０３０８０と比較して少なくとも０．３の、ＭＯＲ０３０８０と比較して少なくとも０．４の、ＭＯＲ０３０８０と比較して少なくとも０．５の、ＭＯＲ０３０８０と比較して少なくとも０．６の、ＭＯＲ０３０８０と比較して少なくとも０．７の、ＭＯＲ０３０８０と比較して少なくとも０．８の、ＭＯＲ０３０８０と比較して少なくとも０．９の、ＭＯＲ０３０８０と比較して少なくとも１．０の、ＭＯＲ０３０８０と比較して少なくとも１．１の、ＭＯＲ０３０８０と比較して少なくとも１．２の、ＭＯＲ０３０８０と比較して少なくとも１．３の、ＭＯＲ０３０８０と比較して少なくとも１．４の、ＭＯＲ０３０８０と比較して少なくとも１．５の、ＭＯＲ０３０８０と比較して少なくとも１．６の、ＭＯＲ０３０８０と比較して少なくとも１．７の、ＭＯＲ０３０８０と比較して少なくとも１．８の、ＭＯＲ０３０８０と比較して少なくとも１．９のＩｇＧ型の相対的発現レベルを含む生殖系タンパク質対の生殖系タンパク質配列を含む。

ある態様では、本発明は、生殖系タンパク質配列、実質的生殖系配列、又は生殖系タンパク質配列に由来する配列を含む１つ又は複数の相補性決定領域を含む抗体又はそれらの機能的断片のコレクション、及び該コレクションを産生又は使用する方法を含む。ある実施形態では、抗体又はそれらの機能的断片は、生殖系タンパク質配列を含むＣＤＲ１及びＣＤＲ２を含む。ある実施形態では、抗体又はそれらの機能的断片は、生殖系タンパク質対の生殖系タンパク質配列を含むＣＤＲ１及びＣＤＲ２を含む。

幾つかの態様では、１つ又は複数のフレームワーク領域は、生殖系タンパク質対の生殖系タンパク質配列を含む。幾つかの態様でのように、ＦＲ４は、ＪＨ４、Ｊκ１、及びＪλ２／３からなる群から選択される。図４５Ａ〜４７Ｂで示されているように、生殖系タンパク質配列は、ＦＲ１〜ＦＲ３のみを含む。従って、ある態様では、前記可変重鎖フレームワーク領域及び可変軽鎖フレームワーク領域が、生殖系タンパク質配列を含む場合、ＦＲ１、ＦＲ２、及び／又はＦＲ３は、生殖系タンパク質配列を含む。幾つかの態様では、１つ又は複数のフレームワーク領域は、生殖系タンパク質配列を含み、１つ又は複数の相補性決定領域の多様化を可能にする。幾つかの実施形態では、本発明は、多様化されたＨＣＤＲ３領域を含む合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクション、及び前記コレクションを産生及び製作する方法を含む。幾つかの実施形態では、本発明は、多様化されたＬＣＤＲ３領域を含む合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクション、及び前記コレクションを産生及び使用する方法を含む。

本発明の追加的な態様は、任意の免疫原に対する抗体又はそれらの機能的断片の特定に有用なコレクションの能力である。上記の機能的特性を含む少なくとも２つの可変重鎖及び可変軽鎖生殖系タンパク質対を有するコレクションを生成することにより、コレクション内、特にコレクションの抗体の相補性決定領域内に、立体構造又は基準構造中のＣＤＲの長さ及び多様性の点で多様性が提供されるだろうと考えられた。これは、本発明のコレクションが、任意の免疫原に対する抗体又はそれらの機能的断片の特定に有用になることを可能にする。

本発明の幾つかの態様は、可変重鎖及び可変軽鎖フレームワーク領域を含む抗体又はそれらの機能的断片を含むコレクションを含み、前記フレームワーク領域が、以下の特性：ｉ）Ｆａｂ型の相対的提示率が、サンプリングしたＦａｂの上位７５％以内の値を含むこと、ｉｉ）Ｆａｂ型の発現レベルが、Ｆａｂ ＶＨ１−６９ ＶＬＡ＿Ｖｌ１−４０ ＡＹＡと比較して少なくとも０．４であること、ｉｉｉ）Ｆａｂ型の熱安定性が６０℃にて少なくとも４５分間であること、ｉｖ）Ｆａｂ型のウシ又はマウス血清安定性が３７℃にて１０日間を超えること、ｖ）ＩｇＧ型の発現レベルが、ＭＯＲ０３０８０と比較して少なくとも０．４であること、及びｖｉ）ＩｇＧ型のウシ血清安定性が３７℃にて１４日間であることを含む生殖系遺伝子対の生殖系タンパク質配列を含み、前記コレクションが、少なくとも２個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも３個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも４個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも５個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも６個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも７個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも８個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも９個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも１０個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも１１個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも１２個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも１３個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも１４個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも１５個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも１６個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも１７個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも１８個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも１９個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも２０個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも２１個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも２２個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも２３個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも２４個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも２５個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも２６個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも２７個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも２８個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質、少なくとも２９個の異なる生殖系タンパク質対配列、少なくとも３０個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも３１個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも３２個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも３３個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも３４個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも３５個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも３６個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも３７個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも３８個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも３９個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも４０個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも４１個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも４２個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも４３個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも４４個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質、少なくとも４５個の異なる生殖系タンパク質配列対、少なくとも４６個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも４７個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも４８個の異なる生殖系タンパク質対、少なくとも４９個の異なる生殖系タンパク質対、又は少なくとも５０個の異なる生殖系タンパク質対を含む抗体又はそれらの機能的断片を含むコレクションを含む。

生殖系遺伝子配列を含む抗体又はそれらの機能的断片
加えて、生殖系タンパク質配列を使用することにより、患者に投与した際に抗体の免疫原性リスクが低下されるはずであることが考えられた。従って、本発明の態様は、可変重鎖及び可変軽鎖フレームワーク領域を含み、前記フレームワーク領域が生殖系タンパク質配列を含む合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクション、及び前記コレクションを産生及び使用する方法を含む。幾つかの実施形態では、抗体又はそれらの機能的断片の可変重鎖及び可変軽鎖フレームワーク領域は、実質的生殖系配列を含む。幾つかの実施形態では、抗体又はそれらの機能的断片の可変重鎖及び可変軽鎖フレームワーク領域は、生殖系配列に由来する。幾つかの実施形態では、前記抗体又はそれらの機能的断片は、生殖系タンパク質配列、実質的生殖系配列を含むか、又は生殖系タンパク質配列に由来するＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４領域を含む。ある実施形態では、前記抗体又はそれらの機能的断片は、生殖系タンパク質対の生殖系タンパク質配列を含むＦＲ１、ＦＲ２、及びＦＲ３を含む。幾つかの実施形態では、使用されるＦＲ４領域は、可変重鎖についてはＪＨ４、可変κ軽鎖についてはＪκ１、及び可変λ軽鎖についてはＪλ２／３である。

また、生殖系タンパク質配列を使用することにより、患者に投与した際に抗体の免疫原性リスクが低下されるはずであるため、本発明のある態様は、生殖系タンパク質配列、実質的生殖系配列を含むか、又は生殖系タンパク質配列に由来する１つ又は複数の相補性決定領域を含む抗体又はそれらの機能的断片のコレクション、及び該コレクションを産生又は使用する方法を含む。ある実施形態では、抗体又はそれらの機能的断片は、生殖系タンパク質配列を含むＣＤＲ１及びＣＤＲ２を含む。ある実施形態では、抗体又はそれらの機能的断片は、生殖系タンパク質対の生殖系タンパク質配列を含むＣＤＲ１及びＣＤＲ２を含む。

幾つかの態様では、１つ又は複数のフレームワーク領域は、生殖系タンパク質配列を含み、１つ又は複数の相補性決定領域の多様化を可能にする。幾つかの実施形態では、本発明は、多様化されたＨＣＤＲ３領域を含む合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクション、及び前記コレクションを産生及び製作する方法を含む。幾つかの実施形態では、本発明は、多様化されたＬＣＤＲ３領域を含む合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクション、及び前記コレクションを産生及び使用する方法を含む。ＣＤＲは、Ｋｎａｐｐｉｋら、２０００年、国際公開第９７／０８３２０号、国際公開第２００８０５３２７５号、国際公開第２００９０３６３７９号、国際公開第２００７０５６４４１号、国際公開第２００９１１４８１５号に記述されているものを含む、当技術分野で周知の方法により設計することができ、これら文献は全て、参照によりそれらの全体が組み込まれる。

加えて、免疫原性のリスクが低い抗体又はそれらの機能的断片を含むコレクションを生成するために、ある態様では、本発明のコレクション及びそれを産生及び使用する方法は、ヒト配列を含む抗体又はそれらの機能的断片を含む。

幾つかの態様では、本発明のコレクションは、少なくとも１×１０^４個、少なくとも１×１０^５個、少なくとも１×１０^６個、少なくとも１×１０^７個、少なくとも１×１０^８個、少なくとも１×１０^９個、少なくとも１×１０^１０個、又は少なくとも１×１０^１１個の、抗体若しくはそれらの機能的断片をコードする核酸配列、又は抗体もしくはそれらの機能的断片を含む。

幾つかの態様では、コレクションの抗体又はそれらの機能的断片は、合成である。

幾つかの態様では、コレクションは、抗体又はそれらの機能的断片をコードする核酸を含む。

本発明の追加的実施形態
幾つかの態様では、本発明は、可変重鎖及び可変軽鎖フレームワーク領域を含む合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクションを含み、前記可変重鎖フレームワーク領域及び可変軽鎖フレームワーク領域は、生殖系タンパク質対の生殖系タンパク質配列を含み、
前記生殖系タンパク質対は、以下の特性：
ｉ）Ｆａｂ型の相対的提示率が、サンプリングしたＦａｂの上位７５％以内の値を含むこと、
ｉｉ）Ｆａｂ型の発現レベルが、Ｆａｂ ＶＨ１−６９ ＶＬＡ＿Ｖｌ１−４０ ＡＹＡと比較して少なくとも０．４であること、
ｉｉｉ）Ｆａｂ型の熱安定性が６０℃にて少なくとも４５分間であること、
ｉｖ）Ｆａｂ型のウシ又はマウス血清安定性が３７℃にて１０日間を超えること、
ｖ）ＩｇＧ型の発現レベルが、ＭＯＲ０３０８０と比較して少なくとも０．４であること、及び
ｖｉ）ＩｇＧ型の血清安定性が３７℃にて１４日間であることを含み、
前記抗体又はそれらの機能的断片のコレクションは、少なくとも２個の異なる生殖系タンパク質対の生殖系タンパク質配列を含み、前記生殖系タンパク質対は、生殖系遺伝子対によりコードされている。

幾つかの実施形態では、本発明は、合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクションを含み、前記可変重鎖及び可変軽鎖フレームワーク領域は、以下の特性を含む生殖系タンパク質対の生殖系タンパク質配列から本質的になる：ｉ）Ｆａｂ型の相対的提示率が、サンプリングしたＦａｂの上位７５％以内の値を含むこと、
ｉｉ）Ｆａｂ型の発現レベルが、Ｆａｂ ＶＨ１−６９ ＶＬＡ＿Ｖｌ１−４０ ＡＹＡと比較して少なくとも０．４であること、
ｉｉｉ）Ｆａｂ型の熱安定性が６０℃以上にて少なくとも４５分間であること、
ｉｖ）Ｆａｂ型のウシ又はマウス血清安定性が３７℃にて１０日間を超えること、
ｖ）ＩｇＧ型の発現レベルが、ＭＯＲ０３０８０と比較して少なくとも０．４であること、及びｖｉ）ＩｇＧ型のウシ血清安定性が３７℃にて１４日間であること。

幾つかの実施形態では、本発明は、合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクションを含み、前記可変重鎖及び可変軽鎖フレームワーク領域は、以下の特性を含む生殖系タンパク質対の生殖系タンパク質配列からなる：ｉ）Ｆａｂ型の相対的提示率が、サンプリングしたＦａｂの上位７５％以内の値を含むこと、
ｉｉ）Ｆａｂ型の発現レベルが、Ｆａｂ ＶＨ１−６９ ＶＬＡ＿Ｖｌ１−４０ ＡＹＡと比較して少なくとも０．４であること、
ｉｉｉ）Ｆａｂ型の熱安定性が６０℃以上にて少なくとも４５分間であること、
ｉｖ）Ｆａｂ型のウシ又はマウス血清安定性が３７℃にて１０日間を超えること、
ｖ）ＩｇＧ型の発現レベルが、ＭＯＲ０３０８０と比較して少なくとも０．４であること、及び
ｖｉ）ＩｇＧ型のウシ血清安定性が３７℃にて１４日間であること。

幾つかの実施形態では、前記生殖系遺伝子対は、ヒト免疫レパートリー中少なくとも０．０５％の濃度で存在する。幾つかの実施形態では、前記生殖系遺伝子対は、ヒト免疫レパートリー中少なくとも０．２３％の濃度で存在する。幾つかの実施形態では、前記生殖系遺伝子対は、ヒト免疫レパートリー中少なくとも０．５１％の濃度で存在する。幾つかの実施形態では、前記生殖系遺伝子対は、未感作ヒト免疫レパートリー中少なくとも０．０７％の濃度で存在する。幾つかの実施形態では、前記生殖系遺伝子対は、未感作ヒト免疫レパートリー中少なくとも０．５２％の濃度で存在する。幾つかの実施形態では、前記生殖系遺伝子対は、未感作ヒト免疫レパートリー中少なくとも０．８８％の濃度で存在する。幾つかの実施形態では、前記抗体又はそれらの機能的断片は、ヒト配列を含む。幾つかの実施形態では、前記抗体又はそれらの機能的断片のコレクションは、少なくとも１７個の異なる生殖系タンパク質対の生殖系タンパク質配列を含む。

幾つかの実施形態では、前記抗体又はそれらの機能的断片は、生殖系タンパク質配列を含む１つ又は複数の相補性決定領域を含む。幾つかの実施形態では、前記抗体又はそれらの機能的断片は、生殖系タンパク質配列を含むＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、及びＦＲ３領域を含む。幾つかの実施形態では、前記抗体又はそれらの機能的断片は、ＪＨ４、Ｊκ１、及びＪλ２／３からなる群から選択されるＦＲ４領域を含む。幾つかの実施形態では、前記抗体又はそれらの機能的断片は、多様化されたＨＣＤＲ３領域を含む。幾つかの実施形態では、前記抗体又はそれらの機能的断片は、多様化されたＬＣＤＲ３領域を含む。

幾つかの実施形態では、コレクションは、１×１０^４個の抗体又はそれらの機能的断片を含む。幾つかの実施形態では、前記生殖系タンパク質対は、サンプリングしたＦａｂの上位６０％以内の値を含むＦａｂ型の相対的提示率を含む。幾つかの実施形態では、前記生殖系タンパク質対は、Ｆａｂ ＶＨ１−６９ ＶＬＡ＿Ｖｌ１−４０ ＡＹＡと比較して、少なくとも０．６のＦａｂ型の発現レベルを含む。幾つかの実施形態では、前記生殖系タンパク質対は、７０℃以上にて少なくとも４５分間のＦａｂ型の熱安定性を含む。幾つかの実施形態では、前記生殖系タンパク質対は、ＭＯＲ０３０８０と比較して、少なくとも０．６のＩｇＧ型の発現レベルを含む。

幾つかの実施形態では、可変重鎖及び可変軽鎖フレームワーク領域は、以下のものからなる群から選択される生殖系タンパク質対の生殖系タンパク質配列を含む：ＩＧＨＶ３−２３／ＩＧＫＶ１−５、ＩＧＨＶ３−２３／ＩＧＫＶ３−２０、ＩＧＨＶ４−３９／ＩＧＫＶ３−１５、ＩＧＨＶ３−２３／ＩＧＫＶ３−１５、ＩＧＨＶ４−３９／ＩＧＫＶ１−３９／１Ｄ−３９、ＩＧＨＶ１−１８／ＩＧＫＶ３−２０、ＩＧＨＶ３−３０／ＩＧＫＶ３−２０、ＩＧＨＶ４−３９／ＩＧＫＶ１−５、ＩＧＨＶ１−６９／ＩＧＫＶ１−３９／１Ｄ−３９、ＩＧＨＶ５−５１／ＩＧＬＶ１−４０、ＩＧＨＶ４−３９／ＩＧＫＶ３−２０、ＩＧＨＶ３−２３／ＩＧＬＶ２−１４、ＩＧＨＶ４−３９／ＩＧＬＶ３−２１、ＩＧＨＶ３−２３／ＩＧＫＶ１−３９／１Ｄ−３９、ＩＧＨＶ３−３０／ＩＧＫＶ１−３９／１Ｄ−３９、ＩＧＨＶ１−６９／ＩＧＫＶ３−２０、ＩＧＨＶ３−４８／ＩＧＫＶ３−２０、ＩＧＨＶ１−２／ＩＧＫＶ３−２０、ＩＧＨＶ３−３０／ＩＧＫＶ４−１、ＩＧＨＶ５−５１／ＩＧＬＶ２−１４、ＩＧＨＶ５−５１／ＩＧＫＶ３−２０、ＩＧＨＶ３−７／ＩＧＫＶ１−３９／１Ｄ−３９、ＩＧＨＶ３−７／ＩＧＫＶ１−５、ＩＧＨＶ３−１５／ＩＧＫＶ３−２０、ＩＧＨＶ４−３９／ＩＧＬＶ２−１４、ＩＧＨＶ３−２３／ＩＧＫＶ３−１１、ＩＧＨＶ３−３０／ＩＧＫＶ１−５、ＩＧＨＶ３−３０／ＩＧＫＶ３−１５、ＩＧＨＶ３−２１／ＩＧＫＶ１−５、ＩＧＨＶ３−２１／ＩＧＫＶ３−１５、ＩＧＨＶ３−３０／ＩＧＬＶ１−５１、ＩＧＨＶ３−２１／ＩＧＬＶ１−５１、及びＩＧＨＶ１−６９／ＩＧＫＶ３−１１。

幾つかの実施形態では、前記抗体の前記機能的断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、及びｓｃＦｖからなる群から選択される。

幾つかの態様では、本発明は、開示された抗体のコレクションをコードする核酸のコレクションを含む。幾つかの態様では、本発明は、開示された抗体のコレクションをコードする核酸を含むベクターを含む。幾つかの態様では、本発明は、開示された抗体のコレクションをコードする核酸を含む組換え宿主細胞を含む。幾つかの実施形態では、組換え宿主細胞は、原核生物又は真核生物である。幾つかの実施形態では、組換え宿主細胞は、大腸菌又は哺乳動物である。

幾つかの態様では、本発明は、可変重鎖及び可変軽鎖フレームワーク領域を含む合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクションを含み、
前記フレームワーク領域は、生殖系タンパク質配列を含み、
前記生殖系タンパク質配列は、以下の特性：
ｉ）相補性決定領域における翻訳後修飾が４つ以下であること、
ｉｉ）相補性決定領域におけるメチオニンが２つ以下であること、
ｉｉｉ）未対形成システインが１つ以下であること、
ｉｖ）潜在的なＴ細胞エピトープが１つ以下であること、
ｖ）凝集傾向が中程度又は低いこと、及び
ｖｉ）等電点が少なくとも７．５であることを含み、
前記抗体又はそれらの機能的断片のコレクションは、少なくとも２個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列を含み、
前記生殖系タンパク質配列は、生殖系遺伝子配列によりコードされている。

幾つかの実施形態では、前記可変重鎖又は可変軽鎖生殖系遺伝子配列は、ヒト免疫レパートリー中少なくとも０．５％の濃度で存在する。幾つかの実施形態では、前記抗体又はそれらの機能的断片のコレクションは、少なくとも５個の異なる可変重鎖生殖系タンパク質配列を含む。幾つかの実施形態では、前記抗体又はそれらの機能的断片は、ヒト配列を含む。幾つかの実施形態では、前記可変重鎖又は可変軽鎖生殖系遺伝子配列は、ヒト免疫レパートリー中少なくとも５．０％の濃度で存在する。幾つかの実施形態では、前記抗体又はそれらの機能的断片は、生殖系タンパク質配列を含む１つ又は複数の相補性決定領域を含む。幾つかの実施形態では、前記抗体又はそれらの機能的断片は、生殖系タンパク質配列を含むＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、及びＦＲ３を含む。幾つかの実施形態では、前記抗体又はそれらの機能的断片は、ＪＨ４、Ｊκ１、及びＪλ２／３からなる群から選択されるＦＲ４領域を含む。幾つかの実施形態では、前記抗体又はそれらの機能的断片は、多様化されたＨＣＤＲ３領域を更に含む。幾つかの実施形態では、前記抗体又はそれらの機能的断片は、多様化されたＬＣＤＲ３領域を更に含む。幾つかの実施形態では、コレクションは、１×１０^４個の抗体又はそれらの機能的断片を含む。

幾つかの実施形態では、前記可変重鎖生殖系タンパク質配列は、以下のものからなる群から選択される：ＩＧＨＶ３−２３、ＩＧＨＶ３−３０、ＩＧＨＶ４−３９、ＩＧＨＶ４−３４、ＩＧＨＶ４−５９、ＩＧＨＶ１−６９、ＩＧＨＶ５−５１、ＩＧＨＶ３−７、ＩＧＨＶ１−１８、ＩＧＨＶ３−４８、ＩＧＨＶ３−１５、ＩＧＨＶ３−２１、ＩＧＨＶ１−２、ＩＧＨＶ３−３３、ＩＧＨＶ４−３１、ＩＧＨＶ３−５３、ＩＧＨＶ３−１１、ＩＧＨＶ３−９、ＩＧＨＶ４−４、ＩＧＨＶ１−４６、ＩＧＨＶ３−７４、ＩＧＨＶ１−２４、ＩＧＨＶ４−６１、ＩＧＨＶ１−８、ＩＧＨＶ１−３、ＩＧＨＶ３−４９、ＩＧＨＶ３−４３、ＩＧＨＶ４−２８、ＩＧＨＶ３−６４、及びＩＧＨＶ７−８１。

幾つかの実施形態では、前記可変κ軽鎖生殖系タンパク質配列は、以下のものからなる群から選択される：ＩＧＫＶ３−２０、ＩＧＫＶ１−３９／１Ｄ−３９、ＩＧＫＶ１−５、ＩＧＫＶ３−１５、ＩＧＫＶ４−１、ＩＧＫＶ３−１１、ＩＧＫＶ２−２８／２Ｄ−２８、ＩＧＫＶ１−３３／１Ｄ−３３、ＩＧＫＶ２−３０、ＩＧＫＶ１−９、ＩＧＫＶ１−１７、ＩＧＫＶ１−２７、ＩＧＫＶ１−８、ＩＧＫＶ１−１６、ＩＧＫＶ１−６、ＩＧＫＶ１−１２、ＩＧＫＶ２Ｄ−２９、ＩＧＫＶ１−１３、ＩＧＫＶ１Ｄ−８、及びＩＧＫＶ２−２４。

幾つかの実施形態では、前記可変λ軽鎖生殖系タンパク質配列は、以下のものからなる群から選択される：ＩＧＬＶ２−１４、ＩＧＬＶ１−４０、ＩＧＬＶ１−４４、ＩＧＬＶ１−５１、ＩＧＬＶ２−２３、ＩＧＬＶ３−２１、ＩＧＬＶ１−４７、ＩＧＬＶ３−１、ＩＧＬＶ２−１１、ＩＧＬＶ２−８、ＩＧＬＶ６−５７、ＩＧＬＶ３−２５、ＩＧＬＶ７−４６、ＩＧＬＶ１−３６、ＩＧＬＶ７−４３、ＩＧＬＶ９−４９、ＩＧＬＶ４−６９、ＩＧＬＶ２−１８、ＩＧＬＶ３−１０、及びＩＧＬＶ３−２７。

幾つかの態様では、本発明は、開示された合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクションを産生する方法を含む。幾つかの実施形態では、産生ステップは、可変重鎖及び可変軽鎖フレームワーク領域を含む抗体又はそれらの機能的断片のコレクションを生成することを更に含み、
前記可変重鎖フレームワーク領域及び可変軽鎖フレームワーク領域は、生殖系タンパク質対の生殖系タンパク質配列を含み、
前記生殖系タンパク質対は、以下の特性：
ｉ）Ｆａｂ型の相対的提示率が、サンプリングしたＦａｂの上位７５％以内の値を含むこと、
ｉｉ）Ｆａｂ型の発現レベルが、Ｆａｂ ＶＨ１−６９ ＶＬＡ＿Ｖｌ１−４０ ＡＹＡと比較して少なくとも０．４であること、
ｉｉｉ）Ｆａｂ型の熱安定性が６０℃にて少なくとも４５分間であること、
ｉｖ）Ｆａｂ型のウシ又はマウス血清安定性が３７℃にて１０日間を超えること、
ｖ）ＩｇＧ型の発現レベルが、ＭＯＲ０３０８０と比較して少なくとも０．４であること、及び
ｖｉ）ＩｇＧ型のウシ血清安定性が３７℃にて１４日間であることを含み、
前記抗体又はそれらの機能的断片のコレクションは、少なくとも２個の異なる生殖系タンパク質対を含む。

幾つかの実施形態では、産生ステップは、
ａ）ヒト免疫レパートリーに存在する可変重鎖及び可変軽鎖生殖系遺伝子対を含むデータを取得するステップと、
ｂ）以下の特性：
ｉ）Ｆａｂ型の相対的提示率が、サンプリングしたＦａｂの上位７５％以内の値を含むこと、
ｉｉ）Ｆａｂ型の発現レベルが、Ｆａｂ ｐＭｘ１１＿ＦＨ ＶＨ１−６９ ＶＬＡ＿Ｖｌ１−４０ ＡＹＡと比較して少なくとも０．４であること、
ｉｉｉ）Ｆａｂ型の熱安定性が６０℃にて少なくとも４５分間であること、
ｉｖ）Ｆａｂ型のウシ又はマウス血清安定性が３７℃にて１０日間を超えること、
ｖ）ＩｇＧ型の発現レベルが、ＭＯＲ０３０８０と比較して少なくとも０．４であること、及び
ｖｉ）ＩｇＧ型のウシ血清安定性が３７℃にて１４日間であることを含む可変重鎖及び可変軽鎖生殖系タンパク質対を特定するステップと、
ｃ）ステップｂ）で特定された生殖系タンパク質対の可変重鎖及び可変軽鎖生殖系タンパク質配列を含む抗体又はそれらの機能的断片のコレクションを生成するステップとを更に含む。

幾つかの実施形態では、ステップｂ）は、
ｂａ）ヒト免疫レパートリー中少なくとも０．０５％の濃度で存在する可変重鎖及び可変軽鎖生殖系遺伝子対を特定するステップと、
ｂｂ）ステップｂａ）で特定された生殖系タンパク質対を含む抗体又はそれらの機能的断片を生成するステップと、
ｂｃ）前記生殖系タンパク質対の以下の特性：
ｉ）Ｆａｂ型の相対的提示率、
ｉｉ）Ｆａｂ型の発現レベル、
ｉｉｉ）６０℃以上でのＦａｂ型の熱安定性、
ｉｖ）Ｆａｂ型のウシ又はマウス血清安定性が３７℃にて１０日間を超えること、
ｖ）ＩｇＧ型の発現レベル、及び
ｖｉ）ＩｇＧ型のウシ血清安定性が３７℃にて１４日間であることを評価するステップとを更に含む。

幾つかの実施形態では、ステップａ）は、以下のステップ：
ａａ）試料からヒトＢ細胞を単離するステップ、
ａｂ）Ｂ細胞由来のｃＤＮＡを生成するステップ、
ａｃ）Ｂ細胞由来のｃＤＮＡをＰＣＲ増幅するステップ、
ａｄ）ＰＣＲ産物を配列決定するステップ、
ａｅ）各ＰＣＲ産物の生殖系遺伝子を特定するステップを更に含む。

幾つかの実施形態では、コレクションを生成するステップは、以下のステップ：
ｃａ）抗体又はそれらの機能的断片をコードする核酸を合成するステップ、
ｃｂ）核酸をベクターにクローニングするステップ、
ｃｃ）抗体又はそれらの機能的断片を発現させるステップを更に含む。

幾つかの実施形態では、前記生殖系遺伝子対は、ヒト免疫レパートリー中少なくとも０．０５％の濃度で存在する。幾つかの実施形態では、前記生殖系遺伝子対は、ヒト免疫レパートリー中少なくとも０．２３％の濃度で存在する。幾つかの実施形態では前記生殖系遺伝子対は、ヒト免疫レパートリー中少なくとも０．５１％の濃度で存在する。幾つかの実施形態では、前記生殖系遺伝子対は、未感作ヒト免疫レパートリー中少なくとも０．０７％の濃度で存在する。幾つかの実施形態では、前記生殖系遺伝子対は、未感作ヒト免疫レパートリー中少なくとも０．５２％の濃度で存在する。幾つかの実施形態では、前記生殖系遺伝子対は、未感作ヒト免疫レパートリー中少なくとも０．８８％の濃度で存在する。幾つかの実施形態では、前記抗体又はそれらの機能的断片は、ヒト配列を含む。幾つかの実施形態では、前記抗体又はそれらの機能的断片は、少なくとも１７個の異なる生殖系タンパク質対の生殖系タンパク質配列を含む。幾つかの実施形態では、前記抗体又はそれらの機能的断片は、生殖系タンパク質配列を含む１つ又は複数の相補性決定領域を含む。

幾つかの実施形態では、前記抗体又はそれらの機能的断片は、生殖系タンパク質配列を含むＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、及びＦＲ３を含む。幾つかの実施形態では、前記抗体又はそれらの機能的断片は、ＪＨ４、Ｊκ１、及びＪλ２／３からなる群から選択されるＦＲ４領域を含む。幾つかの実施形態では、前記抗体又はそれらの機能的断片は、多様化されたＨＣＤＲ３領域を含む。幾つかの実施形態では、前記抗体又はそれらの機能的断片は、多様化されたＬＣＤＲ３領域を含む。幾つかの実施形態では、コレクションは、１×１０^４個の抗体又はそれらの機能的断片を含む。

幾つかの実施形態では、前記生殖系タンパク質対は、サンプリングされたＦａｂの上位６０％以内の値を含むＦａｂ型の相対的提示率を含む。幾つかの実施形態では、前記生殖系タンパク質対は、Ｆａｂ ＶＨ１−６９ ＶＬＡ＿Ｖｌ１−４０ ＡＹＡと比較して、少なくとも０．６のＦａｂ型の発現レベルを含む。幾つかの実施形態では、前記生殖系タンパク質対は、７０℃以上にて少なくとも４５分間のＦａｂ型の熱安定性を含む。幾つかの実施形態では、前記生殖系タンパク質対は、ＭＯＲ０３０８０と比較して、少なくとも０．６のＩｇＧ型の発現レベルを含む。

幾つかの実施形態では、可変重鎖及び可変軽鎖フレームワーク領域は、以下のものからなる群から選択される生殖系タンパク質対の生殖系タンパク質配列を含む：ＩＧＨＶ３−２３／ＩＧＫＶ１−５、ＩＧＨＶ３−２３／ＩＧＫＶ３−２０、ＩＧＨＶ４−３９／ＩＧＫＶ３−１５、ＩＧＨＶ３−２３／ＩＧＫＶ３−１５、ＩＧＨＶ４−５９／ＩＧＫＶ１−３９／１Ｄ−３９、ＩＧＨＶ４−３９／ＩＧＫＶ１−３９／１Ｄ−３９、ＩＧＨＶ４−５９／ＩＧＫＶ３−２０、ＩＧＨＶ１−１８／ＩＧＫＶ３−２０、ＩＧＨＶ３−３０／ＩＧＫＶ３−２０、ＩＧＨＶ４−３９／ＩＧＫＶ１−５、ＩＧＨＶ１−６９／ＩＧＫＶ１−３９／１Ｄ−３９、ＩＧＨＶ５−５１／ＩＧＬＶ１−４０、ＩＧＨＶ３−２３／ＩＧＫＶ４−１、ＩＧＨＶ４−３９／ＩＧＫＶ３−２０、ＩＧＨＶ３−２３／ＩＧＬＶ２−１４、ＩＧＨＶ４−３９／ＩＧＬＶ３−２１、ＩＧＨＶ３−２３／ＩＧＫＶ１−３９／１Ｄ−３９、ＩＧＨＶ３−３０／ＩＧＫＶ１−３９／１Ｄ−３９、ＩＧＨＶ３−３０／ＩＧＫＶ３−１１、ＩＧＨＶ１−６９／ＩＧＫＶ３−２０、ＩＧＨＶ３−４８／ＩＧＫＶ３−２０、ＩＧＨＶ１−２／ＩＧＫＶ３−２０、ＩＧＨＶ３−３０／ＩＧＫＶ４−１、ＩＧＨＶ５−５１／ＩＧＬＶ２−１４、ＩＧＨＶ４−５９／ＩＧＫＶ４−１、ＩＧＨＶ５−５１／ＩＧＫＶ３−２０、ＩＧＨＶ３−７／ＩＧＫＶ１−３９／１Ｄ−３９、ＩＧＨＶ３−７／ＩＧＫＶ１−５、ＩＧＨＶ３−１５／ＩＧＫＶ３−２０、ＩＧＨＶ４−３９／ＩＧＬＶ２−１４、ＩＧＨＶ４−３９／ＩＧＬＶ２−８、ＩＧＨＶ３−２３／ＩＧＫＶ３−１１、ＩＧＨＶ３−３０／ＩＧＫＶ１−５、ＩＧＨＶ３−３０／ＩＧＫＶ３−１５、ＩＧＨＶ３−２１／ＩＧＫＶ１−５、ＩＧＨＶ３−２１／ＩＧＫＶ３−１５、ＩＧＨＶ３−３０／ＩＧＬＶ１−５１、ＩＧＨＶ３−２１／ＩＧＬＶ１−５１、ＩＧＨＶ３−５３／ＩＧＬＶ１−４４、ＩＧＨＶ４−５９／ＩＧＫＶ３−１５、ＩＧＨＶ５−５１／ＩＧＫＶ４−１、ＩＧＨＶ１−６９／ＩＧＫＶ４−１、及びＩＧＨＶ１−６９／ＩＧＫＶ３−１１。

幾つかの態様では、前記抗体の前記機能的断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、及びｓｃＦｖからなる群から選択される。

幾つかの態様では、本発明は、Ｃ末端制限部位を含むシグナル配列又はリーダー配列をコードする単離された核酸を含む。幾つかの実施形態では、制限部位はＮｈｅＩである。幾つかの実施形態では、シグナル配列又はリーダー配列は、ｐｈｏＡ又はヒト重鎖リーダー配列を含む。幾つかの実施形態では、制限部位はＮｄｅＩである。幾つかの実施形態では、シグナル配列は、ｏｍｐＡ又はヒトカッパリーダー配列を含む。

幾つかの態様では、本発明は、Ｃ末端制限部位を含むシグナル配列又はリーダー配列をコードする核酸を含むベクターを含む。幾つかの態様では、本発明は、ベクターを含む宿主細胞を含む。幾つかの実施形態では、宿主細胞は、原核生物又は真核生物である。幾つかの実施形態では、宿主細胞は大腸菌である。幾つかの実施形態では、宿主細胞は哺乳動物である。

幾つかの態様では、本発明は、生殖系タンパク質対の生殖系タンパク質配列を含むＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、及びＦＲ３を含む単離された抗体又はその機能的断片を含み、前記生殖系タンパク質対は、以下のものからなる群から選択される：ＩＧＨＶ３−２３／ＩＧＫＶ１−５、ＩＧＨＶ３−２３／ＩＧＫＶ３−２０、ＩＧＨＶ４−３９／ＩＧＫＶ３−１５、ＩＧＨＶ３−２３／ＩＧＫＶ３−１５、ＩＧＨＶ４−３９／ＩＧＫＶ１−３９／１Ｄ−３９、ＩＧＨＶ１−１８／ＩＧＫＶ３−２０、ＩＧＨＶ３−３０／ＩＧＫＶ３−２０、ＩＧＨＶ４−３９／ＩＧＫＶ１−５、ＩＧＨＶ１−６９／ＩＧＫＶ１−３９／１Ｄ−３９、ＩＧＨＶ５−５１／ＩＧＬＶ１−４０、ＩＧＨＶ４−３９／ＩＧＫＶ３−２０、ＩＧＨＶ３−２３／ＩＧＬＶ２−１４、ＩＧＨＶ４−３９／ＩＧＬＶ３−２１、ＩＧＨＶ３−２３／ＩＧＫＶ１−３９／１Ｄ−３９、ＩＧＨＶ３−３０／ＩＧＫＶ１−３９／１Ｄ−３９、ＩＧＨＶ１−６９／ＩＧＫＶ３−２０、ＩＧＨＶ３−４８／ＩＧＫＶ３−２０、ＩＧＨＶ１−２／ＩＧＫＶ３−２０、ＩＧＨＶ３−３０／ＩＧＫＶ４−１、ＩＧＨＶ５−５１／ＩＧＬＶ２−１４、ＩＧＨＶ５−５１／ＩＧＫＶ３−２０、ＩＧＨＶ３−７／ＩＧＫＶ１−３９／１Ｄ−３９、ＩＧＨＶ３−７／ＩＧＫＶ１−５、ＩＧＨＶ３−１５／ＩＧＫＶ３−２０、ＩＧＨＶ４−３９／ＩＧＬＶ２−１４、ＩＧＨＶ３−２３／ＩＧＫＶ３−１１、ＩＧＨＶ３−３０／ＩＧＫＶ１−５、ＩＧＨＶ３−３０／ＩＧＫＶ３−１５、ＩＧＨＶ３−２１／ＩＧＫＶ１−５、ＩＧＨＶ３−２１／ＩＧＫＶ３−１５、ＩＧＨＶ３−３０／ＩＧＬＶ１−５１、ＩＧＨＶ３−２１／ＩＧＬＶ１−５１、及びＩＧＨＶ１−６９／Ｉ。

１つの態様では、本開示は、生殖系配列を含む可変重鎖及び軽鎖フレームワーク領域、特にＦＲ１を含む抗体のコレクションを記述する。生殖系フレームワーク領域を有することにより、患者に投与した際に、抗体の免疫原性リスクが低下されるはずであることが期待される。しかしながら、免疫原に対して抗体をスクリーニングすることができるように、ディスプレイベクター及び／又は発現ベクターへの、抗体のコレクションをコードする核酸の標準的クローニングを可能にするためには、制限部位を使用しなければならない。過去において、クローニング用に使用された制限部位は、フレームワーク領域内に配置されていたことが多く、従って核酸配列が修飾され生殖系と異なることになった。本開示の抗体の各々の少なくともフレームワーク１（ＦＲ１）領域が、生殖系配列を維持することを保証するために、ＦＲ１内には、いかなる非天然制限部位も存在するべきではない。従って、本開示の態様は、原核生物シグナル配列及びヒトリーダー配列のＣ末端内、特にＣ末端３残基内に制限部位を組み込むことである。加えて、制限部位を含むシグナル配列及びリーダー配列は、機能性であり、原核生物及び哺乳動物の両発現系において、抗体又はそれらの断片の良好な提示及び発現レベルを可能にしなければならない。

幾つかの態様では、本発明は、Ｃ末端制限部位を含むシグナル配列又はリーダー配列をコードする単離された核酸を含む。幾つかの実施形態では、制限部位は、ＮｈｅＩ又はＮｄｅＩである。幾つかの実施形態では、シグナル配列又はリーダー配列は、ｐｈｏＡ又はヒト重鎖リーダー配列を含む。幾つかの実施形態では、シグナル配列又はリーダー配列は、ｏｍｐＡ又はヒトカッパリーダー配列を含む。幾つかの態様では、本発明は、Ｃ末端制限部位を含むシグナル配列又はリーダー配列をコードする単離された核酸を含むベクターを含む。幾つかの態様では、本発明は、Ｃ末端制限部位を含むシグナル配列又はリーダー配列をコードする単離された核酸を含む宿主細胞、又はＣ末端制限部位を含むシグナル配列又はリーダー配列をコードする単離された核酸を含むベクターを含む宿主細胞を含む。幾つかの実施形態では、従って、宿主細胞は、原核生物、例えば大腸菌、又は真核生物、例えば哺乳動物である。

本開示は、未感作ヒト免疫レパートリーに最も多く出現するＶＨ及びＶＬクラス対が、より高い安定性及びより低い免疫原性等の好ましい特徴を有している可能性が高いという概念を初めて開示するものである。本開示は、初めてこの概念をコレクション設計に取り入れ、全遺伝子合成を使用して、そのようなコレクションを生成する。本開示は、未感作及び抗原経験済ヒト免疫のレパートリー中のＶＨ及びＶＬクラス対を特定し、最も多く出現するＶＨ及びＶＬクラス対を決定し、その後それらＶＨ及びＶＬクラス対を含むコレクションを生成する方法を可能にする。より具体的には、本開示のコレクションは、高度に多様化されたＣＤＲを有する最も多く出現する及び／又は好ましいＶＨ及びＶＬクラス対形成体を含む。この戦略は、安定しており、免疫原性が低く、特定の抗原に対する親和性が高い、任意の免疫原に対する抗体又はそれらの断片を、コレクションが含む確率を増加させる。その結果として、治療目的又は診断目的に使用することができる、任意の免疫原に対する高度に効果的な抗体又はそれらの断片をコレクションが含む確率が、劇的に増加される。

従って、ヒト宿主由来の未感作Ｂ細胞から得られる抗体又はそれらの断片をコードする核酸配列（又はその選択された部分）を配列決定することができる。これら配列データから、免疫レパートリーで代表的な生殖系ファミリーＶＨ／ＶＬ鎖クラス対形成体を特定することができる。出現率及び／又は好ましい生物物理学的特性等の、ある基準に基づいて、重鎖及び軽鎖クラス対を、コレクションに組み込むために選択する。その後、遺伝子合成によりコレクションを合成することができる。幾つかの実施形態では、合成コレクションは、実質的生殖系ＶＨ及びＶＬフレームワーク領域を含み、複数のＣＤＲが多様化されているか、又はＶＨ及び／若しくはＶＬの１つのＣＤＲのみが多様化されている。

本開示は、ヒト宿主の未感作Ｂ細胞から得られるＤＮＡ配列を「鋳型」として使用して、最も多く出現するＶＨ及びＶＬ対を特定する方法を可能にする。ＶＨ及びＶＬクラス対形成体の相対的存在量が解明されれば、最も多く出現する及び／又は好ましいＶＨ及びＶＬクラス対形成体を含む抗体又はそれらの断片の高度に多様なコレクションを生成することができる。当業者であれば、この情報を使用して、最も多く出現する及び／又は好ましいＶＨ及びＶＬクラス対の組み合わせに起因する重要な有益性を犠牲にすることなく、高度な多様性を生成することができる。本開示の以前には、最も多く出現する及び／又は好ましいＶＨ及びＶＬクラス対形成体を解明した者も、又はその知見をライブラリー生成技術に応用することを試みた者もいない。従って、この手法は、未感作ヒト免疫系を代表する抗体又はそれらの断片をコードする核酸の包括的なコレクションを提供する。

本明細書で開示されたコレクション設計及び提示方法を使用して、幾つかの実施形態が少なくとも１×１０^１０個のメンバーのコレクションを含むような、大きな多様性コレクションを生成することができる。

幾つかの態様では、本開示は、開示されている核酸のコレクションを含むベクター及び宿主細胞を可能にする。

幾つかの態様では、本開示は、そのようなコレクションを産生する方法を可能にする。

幾つかの実施形態では、ヒト免疫レパートリーを代表する未感作ＤＮＡ配列は、別々のステップで取得され、データベースに格納され、従ってコレクション設計は、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで容易に改変、最適化、及びカスタマイズすることができ、合成ライブラリーにおいて典型的に実現することができるレベルのカスタマイズが可能になる。

幾つかの態様では、本開示は、開示されているコレクションを使用して抗体又はそれらの断片を特定する方法を可能にする。

幾つかの態様では、本発明は、免疫レパートリーに豊富に存在する及び／又は好ましいＶＨ及びＶＬ生殖系ファミリー及び／又は遺伝子によりコードされた生殖系タンパク質配列を含む抗体又はそれらの断片をコードするコレクション又はライブラリーに関する。幾つかの実施形態では、抗体又はそれらの断片をコードする核酸は、生殖系であるか、実質的に生殖系であるか、又はそれらのコドン最適化変異体である。そのようなコレクション又はライブラリーは、ファージで高度に提示されること、大腸菌においてＦａｂ型で高度に発現されること、哺乳動物細胞においてＩｇＧ型で高度に発現されること、熱安定性が高いこと、血清安定性であること、凝集傾向が低いこと（つまり、溶解性が高いこと）、及び免疫原性のリスクが低いことを含む、有利な生物物理学的特性を有するＶＨ及びＶＬ生殖系ファミリー及び／又は遺伝子を含むことができる。幾つかの実施形態では、コレクション又はライブラリーは、未感作ヒト免疫レパートリーに存在するＶＨ及びＶＬ生殖系ファミリー及び／又は遺伝子を含むことができる。関連実施形態には、そのようなコレクションを製作及び使用する方法が含まれる。

幾つかの態様では、本発明は、免疫レパートリーに豊富に存在する及び／又は好ましいＶＨ／ＶＬクラス対と共に、免疫レパートリーに豊富に存在する及び／又は好ましいＶＨ及びＶＬ生殖系ファミリー及び／又は遺伝子によりコードされた生殖系タンパク質配列を含む抗体又はそれらの断片をコードするコレクション又はライブラリーに関する。幾つかの実施形態では、抗体又はそれらの断片をコードする核酸は、生殖系であるか、実質的に生殖系であるか、又はそれらのコドン最適化変異体である。そのようなコレクション又はライブラリーは、ファージで高度に提示されること、大腸菌においてＦａｂ型で高度に発現されること、哺乳動物細胞においてＩｇＧ型で高度に発現されること、熱安定性が高いこと、血清安定性であること、凝集傾向が低いこと（つまり、溶解性が高いこと）、及び免疫原性のリスクが低いことを含む、有利な生物物理学的特性を有するＶＨ及びＶＬ生殖系ファミリー及び／又は遺伝子、及び／又はＶＨ／ＶＬクラス対によりコードされる生殖系タンパク質配列を含むことができる。幾つかの実施形態では、コレクション又はライブラリーは、未感作ヒト免疫レパートリーに存在するＶＨ及びＶＬ生殖系ファミリー及び／又は遺伝子、及び／又はＶＨ／ＶＬクラス対によりコードされた生殖系タンパク質配列を含むことができる。関連実施形態には、そのようなコレクションを製作及び使用する方法が含まれる。

従って、本発明は、免疫レパートリーを実質的に代表する抗体又はそれらの断片をコードする核酸のコレクションを含み、各抗体又はその断片は、ＶＨ／ＶＬクラス対を含み、免疫レパートリーを実質的に代表するとは、コレクションに存在する各ＶＨ／ＶＬクラス対が、免疫レパートリー中のＶＨ／ＶＬクラス対の少なくとも０．０５％、少なくとも１％、又は少なくとも２％の濃度で存在するＶＨ／ＶＬクラス対であるということである。免疫レパートリーは、個体の免疫レパートリーであってもよく又は集団の免疫レパートリーであってもよく、未感作であってもよい。そのような免疫レパートリーは、例えば、個体に由来する少なくとも１×１０^５個のＢ細胞中のＶＨ／ＶＬクラス対の、個体の集団に由来する少なくとも１×１０^５個のＢ細胞中のＶＨ／ＶＬクラス対の、又は少なくとも１×１０^５個の抗体に存在するＶＨ／ＶＬクラス対の免疫レパートリーとして決定されてもよい。免疫レパートリーは、未感作Ｂ細胞の、又は抗原未経験Ｂ細胞の免疫レパートリーであってもよい。個体又は集団は、ヒトであってもよい。免疫レパートリーは、公的に入手可能なデータベース及び／又は文献を分析することにより決定してもよい。

幾つかの実施形態では、抗体又はそれらの断片をコードする核酸は、全遺伝子合成により生成される等の合成である。関連実施形態では、核酸は、生殖系配列、実質的生殖系配列、又は生殖系配列若しくは実質的生殖系配列のコドン最適化変異体である。幾つかの実施形態では、ＣＤＲの少なくとも１つは、高度に多様化されている。

幾つかの実施形態では、本開示のコレクションは、抗体又はそれらの断片を含み、ＶＨ及びＶＬの両方のＦＲ１、ＦＲ２、及びＦＲ３は、好ましい特徴を有するＶＨ及びＶＬクラス対の生殖系タンパク質配列を含む。もっとも好ましくは、本開示のコレクションは、抗体又はそれらの断片を含み、ＶＨ及びＶＬの両方のＦＲ１、ＦＲ２、及びＦＲ３は、好ましい特徴を有するＶＨ及びＶＬクラス対の生殖系タンパク質配列を含み、ＶＨ及びＶＬの両方のＣＤＲ３は、高度に多様化されている。

関連実施形態では、抗体又はそれらの断片をコードする前記核酸のコレクションは、ベクターにクローニングされる。好適なベクターは当技術分野で公知であり、ファージディスプレイベクター等のディスプレイベクター、プラスミドベクター、ファージミドベクター、細菌発現ベクター又は哺乳動物発現ベクターを含む発現ベクターが含まれる。更なる関連実施形態では、コレクション、又はベクターにクローニングされたコレクションは、宿主細胞に形質転換される。従って、本発明は、宿主細胞のコレクションを含む。好適な宿主細胞には、原核生物宿主細胞（大腸菌等）及び真核生物宿主細胞（哺乳動物宿主細胞等）が含まれる。

別の実施形態では、本発明は、約１３４５個の未感作ヒトＢ細胞に由来するＶＨ／ＶＬクラス対、又は読取可能な媒体にある公的に入手可能な配列に由来するＶＨ／ＶＬクラス対を含むデータベースである。そのようなデータベースは、本発明のコレクション及びライブラリーの設計及び構築に有用である。

本発明は、免疫レパートリーを実質的に代表する抗体又はそれらの断片をコードする核酸のコレクションを産生する方法も含む。免疫レパートリーは、一人又は複数のヒトの未感作Ｂ細胞の免疫レパートリーであってもよく、又は一人若しくは複数のヒトの抗原経験済Ｂ細胞の免疫レパートリーであってもよい。そのような方法は、以下のステップを含んでいてもよい：（ａ）免疫レパートリーのＶＨ／ＶＬクラス対の少なくとも０．０５％、少なくとも１％、又は少なくとも２％の濃度で存在するＶＨ／ＶＬクラス対を特定するステップ、（ｂ）免疫レパートリーのＶＨ／ＶＬクラス対の少なくとも０．０５％、少なくとも１％、又は少なくとも２％の濃度で存在するＶＨ／ＶＬクラス対を含む抗体又はそれらの断片をコードする核酸のコレクションを合成するステップ。

特定ステップは、様々な方法で実施することができる。例えば、ＶＨ／ＶＬクラス対の特定は、未感作Ｂ細胞を１つ又は複数のヒト宿主から単離すること、及びＶＨ／ＶＬクラス対をコードするＤＮＡ、ｍＲＮＡ、又はｃＤＮＡを単離及び配列決定することにより、又は各ＶＨ及びＶＬに対して特異的な１つ又は複数の核酸プローブで探索することにより、各Ｂ細胞のＶＨ／ＶＬクラス対を決定すること、及びその後ＶＨ／ＶＬクラス対を分析することを含んでいてもよい。代替的又は補完的な実施形態では、ＶＨ／ＶＬクラス対は、抗体配列のデータベース等の既存のデータベースから決定してもよい。代替的又は補完的な実施形態では、ＶＨ／ＶＬクラス対は、文献から特定してもよい。従って、１つの実施形態では、本発明は、抗体核酸配列（既存でも又は新規生成でもよい）を取得すること、配列アラインメントによりＶＨ／ＶＬクラス対を決定すること、及びそのような配列を照合して免疫レパートリーに存在するＶＨ／ＶＬクラス対を特定することを含む。

幾つかの実施形態では、本方法は、大多数のメンバーが、抗体又はそれらの断片の産生及び発現（ファージで、又は細胞から等）を促進する好ましい生物物理学的特性を有するコレクションを生成し、可溶性で熱安定性の抗体を産生するために使用される。より詳しくは、そのような特性には、以下のものが含まれる：（ｉ）ファージで効率的に提示されること、（ｉｉ）哺乳動物細胞で効率的に提示されること、（ｉｉｉ）大腸菌においてＦａｂ型で良好に発現されること、（ｉｖ）哺乳動物細胞においてＩｇＧ型で良好に発現されること、（ｖ）熱安定性、（ｖｉ）溶解度、及び（ｖｉｉ）低免疫原性。これら特性の幾つか又は全てを有するＶＨ／ＶＬクラス対を決定することにより、その後、そのような特性を有するそれら核酸のみを合成すること等により、大多数のメンバーがそのような生物物理学的特性を有するコレクションを構築することができる。従って、本発明は、そのようなコレクション、及びそのようなコレクションを製作する方法を含む。

幾つかの実施形態では、合成された核酸は、生殖系であるか、実質的生殖系であるか、又はそれらのコドン最適化変異体である。変異は、少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）に導入することができる。あらゆるＣＤＲ、特にＣＤＲ３が適切である。好ましくは、ＣＤＲに付加された配列変異は、インフレームの配列に限定され、システイン及び終止コドンを含んでおらず、従ってライブラリーの全メンバーが正確に発現されることが保証される。

核酸が合成されれば、それらをベクター（ディスプレイベクター、ファージディスプレイベクター；ファージミドベクター；又は哺乳動物発現ベクター等）にクローニングすることができ、宿主細胞に形質転換することができる。好適な宿主細胞には、原核生物宿主細胞（例えば大腸菌）及び真核生物宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）が含まれる。

更なる実施形態では、本発明は、免疫原に特異的な抗体を特定する方法を提供する。そのような方法は１つの実施形態では、免疫レパートリーのＶＨ／ＶＬクラス対の少なくとも０．０５％、少なくとも１％、又は少なくとも２％の濃度で存在するＶＨ／ＶＬクラス対を特定すること；免疫レパートリーのＶＨ／ＶＬクラス対の少なくとも０．０５％、少なくとも１％、又は少なくとも２％の濃度で存在するＶＨ／ＶＬクラス対を含む抗体又はそれらの断片をコードする核酸のコレクションを合成すること；コレクションに由来する抗体又はその断片を提示又は発現させること；特定の免疫原に対してコレクションをスクリーニングすること；及び前記免疫原に特異的な少なくとも１つの抗体又はその断片を選択することを含む。本発明の方法及びコレクションは、好ましい生物物理学的特性に関して構築することができるため、本発明は、そのような好ましい特性を有する抗体又はそれらの断片をコードする核酸のコレクションを製作し、特定の免疫原に対してスクリーニングして、そのような免疫原に結合する抗体を特定することにより、疾患又は状態を治療するための抗体又はその抗体断片を特定するのに特に有用である。

幾つかの態様では、本発明は、ＶＨ／ＶＬ対を含む抗体又はそれらの断片のコレクション又はライブラリーに関する。幾つかの実施形態では、抗体又はそれらの断片のコレクション又はライブラリーは、免疫レパートリーに豊富に存在するＶＨ及びＶＬ生殖系ファミリー及び／又は遺伝子によりコードされた生殖系タンパク質配列を含む。幾つかの実施形態では、本発明は、ある好ましい生物物理学的特徴を有するＶＨ及びＶＬ生殖系ファミリー及び／又は遺伝子によりコードされた生殖系タンパク質配列を含む抗体又はそれらの断片のコレクション又はライブラリーに関する。幾つかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬ生殖系ファミリー及び／又は遺伝子は、免疫レパートリーにおいて天然で生じ、レパートリーにより豊富に存在するか又はより多く出現するものである。幾つかの実施形態では、抗体又はそれらの断片のコレクション又はライブラリーは、ＶＨ及びＶＬ生殖系ファミリー及び／又は遺伝子によりコードされた生殖系タンパク質配列を含む。幾つかの実施形態では、抗体又はそれらの断片のコレクション又はライブラリーは、生殖系の、実質的に生殖系の、又はコドン最適化されたＶＨ及びＶＬ生殖系ファミリー及び／又は遺伝子に由来するフレームワーク領域及び／又はＣＤＲ領域を含む。幾つかの実施形態では、抗体又はそれらの断片のコレクション又はライブラリーは、合成であり全遺伝子合成により構築されたＶＨ及びＶＬ生殖系ファミリー及び／又は遺伝子によりコードされた生殖系タンパク質配列を含む。幾つかの実施形態では、抗体又はそれらの断片のコレクション又はライブラリーは、合成であり全遺伝子合成により構築されたＶＨ及びＶＬ生殖系ファミリー及び／又は遺伝子の部分を含む。幾つかの実施形態では、抗体又はそれらの断片のコレクション又はライブラリーは、特に治療の状況において、抗体のスクリーンニング及び更なる開発を支援する好ましい生物物理学的特性を有するＶＨ及びＶＬ生殖系ファミリー及び／又は遺伝子によりコードされた生殖系タンパク質配列を含む。好ましい生物物理学的特性には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：（ｉ）それらは、ファージにおいてＦａｂ型で良好に提示されること、（ｉｉ）それらは、哺乳動物細胞においてＩｇＧ型で良好に提示されること、（ｉｉｉ）それらは、例えば大腸菌ではＦａｂ型で、及び哺乳動物細胞ではＩｇＧ型で大量に発現されること、（ｉｖ）熱力学的に安定していること、（ｖ）高い血清安定性を有すること、（ｖｉ）低い凝集傾向（つまり、高い溶解度）を有すること、及び（ｖｉｉ）低リスクの免疫原性を有すること。

他の態様では、本開示のコレクションは、好ましいＶＨ及びＶＬクラス対の生殖系タンパク質配列を含む抗体又はそれらの断片を含む。本開示のコレクションは、好ましくは、抗体又はそれらの断片を含み、１つ又は複数のフレームワーク領域は、好ましい特徴を有するＶＨ及びＶＬクラス対によりコードされた生殖系タンパク質配列を含み、特にＶＨ及びＶＬの両方のＦＲ１、ＦＲ２、及びＦＲ３は、好ましい特徴を有するＶＨ及びＶＬクラス対の生殖系タンパク質配列を含む。ＣＤＲは、高度に多様化されていてもよい。好ましくは、ＶＨ及びＶＬの両方のＣＤＲ３は、高度に多様化されている。幾つかの実施形態では、ＶＨ及び／又はＶＬのＣＤＲ１及びＣＤＲ２は、配列が生殖系又は実質的に生殖系である。

コレクションに存在する大多数の抗体又はそれらの断片は、上記の好ましい特徴を有するＶＨ及びＶＬ対の生殖系配列を含むため、この戦略は、本開示のコレクションが、治療使用用に開発することのできる任意の免疫原に対する抗体又はそれらの断片を含む可能性を増加させる。選択された抗体は、低免疫原性及び特定の抗原に対する高親和性も有するだろう。結果は、開示されたコレクションから選択される抗体又はそれらの断片が、任意の免疫原に対して高度に効果的であり、治療又は診断目的のために開発することができる確率が劇的に増加するということである。

そのようなコレクションは、従来技術の問題の多くを克服する。例えば、Ｂ細胞に由来する同種ライブラリーでは、ライブラリーに存在するＶＨ及びＶＬクラス対形成体は、試料に存在するクラス対形成体に依存する。十分に大きなＢ細胞試料が採取されれば、およそ５０個のＶＨ及び５０個のＶＬクラス対形成の各々の組み合わせ（約２５００通り）が存在するであろう。非常に多くのＶＨ及びＶＬクラス対の存在は、背景ノイズに類比することができる。最も多く出現するＶＨ及びＶＬクラス対のみを含む大きな多様性のあるライブラリーを生成することが望ましい場合があるが、同種ライブラリーの手法では、それは可能ではない。

加えて、幾つかの実施形態では、コレクションが基づくＤＮＡ配列は、抗原未経験である未感作Ｂ細胞の試料から取得され、従って、発現されるメンバーは、特定の免疫原に偏っておらず、コレクションを使用して、任意の免疫原に対してスクリーニングを行うことができる。

従って、ヒト宿主由来の未感作（抗原未経験）Ｂ細胞から得られる抗体又はそれらの断片をコードする核酸配列（又はその選択された部分）を配列決定することができる。これら配列データから、免疫レパートリーで主に代表される生殖系ファミリーＶＨ／ＶＬ鎖クラス対形成体を特定することができる。出現率等の、ある基準に基づいて、重鎖及び軽鎖クラス対が、コレクションに組み込むために選択される。その後、コレクションは、遺伝子合成により合成することができる。幾つかの実施形態では、合成コレクションは、実質的生殖系ＶＨ及びＶＬフレームワーク領域を含み、ＣＤＲは多様化されている。

例えば、ヒト宿主に由来するか又は「テンプレート」として公的に入手可能なデータベース又は文献に由来する未感作（抗原未経験）Ｂ細胞から得られたＤＮＡ配列を使用して、本開示は、最も多く出現するＶＨ及びＶＬ生殖系ファミリー及び／又は遺伝子及び／又はクラス対を特定する方法を可能にする。ＶＨ及びＶＬ生殖系ファミリー及び／又は遺伝子及び／又はクラス対の相対的存在量が解明されれば、ＶＨ及びＶＬ生殖系ファミリー及び／又は遺伝子及び／又はクラス対によりコードされた生殖系タンパク質配列を含む抗体又はそれらの断片を、以下の好ましい特徴に関して試験することができる：（ｉ）それらは、ファージにおいてＦａｂ型で良好に提示されること、（ｉｉ）それらは、Ｆａｂ型及びＩｇＧ型で大量に及び可溶性形態で発現されること、及び（ｉｉｉ）それらは、熱力学的に安定していること。最も多く出現するＶＨ及びＶＬ生殖系ファミリー及び／又は遺伝子及び／又はクラス対によりコードされた生殖系タンパク質配列を試験することにより、好ましい特徴を有するものを特定することができる。当業者であれば、この情報を使用して、最も多く出現するＶＨ及びＶＬ生殖系ファミリー及び／又は遺伝子及び／又はクラス対の組み合わせに起因する重要な有益性を犠牲にすることなく、高度な多様性を生成することができる。

本明細書で開示されたコレクション設計及び提示方法を使用して、幾つかの実施形態が少なくとも１×１０^１０個のメンバーのコレクション含むような、大きな多様性コレクションを生成することができる。

本開示は、一般的に、最も好ましい特徴を有するＶＨ及びＶＬクラス対を含む合成抗体コレクションに関する。幾つかの実施形態では、コレクションは、クラス対により代表されるＶＨ及びＶＬファミリーによりコードされた生殖系タンパク質配列を含む。

本開示は、一般的に、好ましい特徴を有する１つ又は複数のＶＨ及びＶＬクラス対を含む合成抗体コレクションに関する。幾つかの態様では、コレクションは、クラス対により代表されるＶＨ及びＶＬファミリーによりコードされた生殖系タンパク質配列を含む。

幾つかの態様では、本開示は、免疫レパートリーに最も多く出現するＶＨ及びＶＬ生殖系遺伝子を特定し、最も多く出現するＶＨ及びＶＬ生殖系遺伝子の配列を有する抗体を試験して、好ましい特徴を有するＶＨ及びＶＬ生殖系遺伝子を特定し、その後好ましい特徴を有するＶＨ及びＶＬクラスを含むコレクションを生成する方法を可能にする。本開示は、未感作であってもよいヒト免疫レパートリーのＶＨ及びＶＬクラス対を特定し、最も多く出現するＶＨ及びＶＬクラス対を決定し、ＶＨ及びＶＬクラス対を試験して好ましい特徴を有するＶＨ及びＶＬクラス対を特定し、その後好ましいＶＨ及びＶＬクラス対、並びに／又は好ましいＶＨ及びＶＬ生殖系遺伝子に由来する抗体を含むコレクションを生成する方法を可能にする。ＶＨ及びＶＬ、並びに／又はＶＨ及びＶＬクラス対が特定されれば、それらのそれぞれの生殖系配列が特定され、その結果、生殖系配列をコレクション設計に組み込むことができる。

幾つかの態様では、本開示は、開示された核酸のコレクションを含むベクター及び宿主細胞を可能にする。

幾つかの態様では、本開示は、そのようなコレクションを産生する方法を可能にする。

幾つかの実施形態では、ヒト免疫レパートリーを代表するＤＮＡ配列は、別々のステップで取得され、データベースに格納され、従ってコレクション設計は、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで容易に改変、最適化、及びカスタマイズすることができ、合成ライブラリーにおいて典型的に実現することができるレベルのカスタマイズが可能になる。

幾つかの態様では、本開示は、開示されたコレクションを使用して抗体又はそれらの断片を特定する方法を可能にする。

方法、核酸、タンパク質、ベクター、宿主細胞
１つの態様では、本開示は、全遺伝子合成により産生された核酸のコレクションを可能にする。遺伝子合成技術は、近年かなり進歩しており、核酸の非常に大きなコレクションを生成することができる。以下の会社がそのような合成サービスを提供している：Ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎ社（レーゲンスブルク、ドイツ）、Ｇｅｎｅａｒｔ社（レーゲンスブルク、ドイツ）、及びＳｌｏｎｉｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（プッフハイム、ドイツ）。遺伝子合成会社がコレクションを生成するために、コレクションの各メンバーの配列を提供してもよい。

幾つかの実施形態では、本開示は、少なくとも１×１０^５個のＢ細胞の試料に存在するＶＨ及びＶＬクラス対の少なくとも０．０５％の濃度で存在するＶＨ及びＶＬクラス対を含む抗体又はそれらの断片をコードする合成核酸のコレクションを可能にする。他の実施形態では、本開示のコレクションは、少なくとも１×１０^５個のＢ細胞の試料に存在するＶＨ及びＶＬクラス対の少なくとも１％の濃度で存在するＶＨ及びＶＬクラス対を含む。他の実施形態では、本開示のコレクションは、少なくとも１×１０^５個のＢ細胞の試料に存在するＶＨ及びＶＬクラス対の少なくとも１．５％の濃度で存在するＶＨ及びＶＬクラス対を含む。他の実施形態では、本開示のコレクションは、少なくとも１×１０^５個のＢ細胞の試料に存在するＶＨ及びＶＬクラス対の少なくとも２％の濃度で存在するＶＨ及びＶＬクラス対を含む。他の実施形態では、本開示のコレクションは、少なくとも１×１０^５個のＢ細胞の試料に存在するＶＨ及びＶＬクラス対の少なくとも３％の濃度で存在するＶＨ及びＶＬクラス対を含む。他の実施形態では、本開示のコレクションは、少なくとも１×１０^５個のＢ細胞の試料に存在するＶＨ及びＶＬクラス対の少なくとも４％の濃度で存在するＶＨ及びＶＬクラス対を含む。他の実施形態では、本開示のコレクションは、少なくとも１×１０^５個のＢ細胞の試料に存在するＶＨ及びＶＬクラス対の少なくとも５％の濃度で存在するＶＨ及びＶＬクラス対を含む。

幾つかの実施形態では、本開示は、ＶＨ及びＶＬクラス対が、ヒト宿主から単離されたＢ細胞から特定されるコレクションを可能にする。幾つかの実施形態では、Ｂ細胞は未感作である。幾つかの実施形態では、核酸のコレクションは、生殖系ＶＨ及びＶＬフレームワーク領域を含む抗体又はそれらの断片をコードする。好ましい実施形態では、核酸のコレクションは、多様化されたＣＤＲを有する生殖系ＶＨ及びＶＬフレームワーク領域を含むように合成される。生殖系フレームワーク領域を含む抗体又はそれらの断片は、免疫原ではない可能性が高いため、生殖系フレームワーク領域が望ましい。

本明細書で開示されたコレクション設計及び提示方法を使用して、幾つかの実施形態が少なくとも１×１０^４個の核酸配列のコレクションを含み、幾つかの実施形態が少なくとも１×１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、又は１０^１２個の核酸配列のコレクションを含むような、大きな多様性コレクションを生成することができる。そのような多様性は、多様化されたＣＤＲを有する、多く出現するＶＨ及びＶＬクラス対を含むメンバーを含むコレクションを合成することにより生成される。

本開示のコレクションは、免疫レパートリーを実質的に代表する配列データから設計される。幾つかの実施形態では、配列データは、公的に入手可能な免疫グロブリン配列表を探索することにより取得される。例えば、Ｉｇ−Ｂｌａｓｔを使用してＮＣＢＩを探索してもよく、又は公的に入手可能な文献を探索してもよい。２００５年の時点で、データベースは、ＦＡＳＴＡ形式で少なくとも２５，０００個の再編成ヒト抗体配列を含有していた。２２，５００個のエントリーのうち、１３，２３５個はＶＨ配列であり、１，５０６個はＶκであり、２，２５９個はＶλであった。これら配列から、ＶＨ、Ｖκ、及びＶλを、それらのそれぞれの生殖系ファミリー及び／又は遺伝子に分類することができる。Ｉｇ−Ｂｌａｓｔの幾つかは完全な抗体配列を含んでいるため、各ＶＨ及びＶＬドメインクラス対形成体の正確な生殖系ファミリー及び／又は遺伝子を、データベース配列から決定することができる。この手法を使用する場合、各ＶＨ及びＶＬ生殖系ファミリー及び／又は遺伝子の出現率、並びに／又は各ＶＨ及びＶＬドメインクラス対の生殖系ファミリー及び／又は遺伝子は、当業者により容易に決定することができる。どのＶＨ及びＶＬ、並びに／又はＶＨ及びＶＬクラス対をライブラリーに組み込むかの選択は、多くの方法で達成することができる。幾つかの実施形態では、出現率が最も高いＶＨ及びＶＬが、コレクション又はライブラリーに組み込むために選択される。幾つかの実施形態では、好ましい生物物理学的特性を有するＶＨ及びＶＬが、コレクション又はライブラリーに組み込むために選択される。幾つかの実施形態では、最も高い出現率を有するＶＨ及びＶＬクラス対が、コレクション又はライブラリーに組み込むために選択される。幾つかの実施形態では、好ましい生物物理学的特性を有するＶＨ及びＶＬクラス対が、コレクション又はライブラリーに組み込むために選択される。幾つかの実施形態では、最も高い出現率及び／又は好ましい生物物理学的特性を有するＶＨ及びＶＬ、並びに／又は最も高い出現率を有するＶＨ及びＶＬクラス対、並びに／又は好ましい生物物理学的特性を有するＶＨ及びＶＬクラス対の両方が、コレクション又はライブラリーに組み込むために選択される。

この手法の欠点の１つは、公的に入手可能なデータベースが、特定の免疫原に対して生成された抗体の配列で占められていることが多く、従って配列に偏りがあるということである。加えて、ほとんどのデータベースでは、重鎖及び軽鎖の配列は結合されておらず、従ってＶＨ及びＶＬクラス対形成体を特定することができない。

幾つかの実施形態では、核酸配列は、１つ又は複数の宿主からＢ細胞を回収し、Ｂ細胞からＤＮＡを単離し、好ましくはＤＮＡを配列決定することにより取得される。好ましくは、Ｂ細胞は未感作である。Ｂ細胞の試料は、１つ又は複数のヒト供与体から回収される。以下は、Ｂ細胞を単離するために使用することができる技術である。休止Ｂリンパ球（Ｂ細胞）を、抗ＣＤ４３及び抗Ｍａｃ−１／ＣＤ１１ｂモノクローナル抗体を用いた他の細胞タイプに対するネガティブ選択を使用することにより、例えば磁気マイクロビーズによって脾臓から単離する。この戦略は、脾細胞の混合集団から非Ｂ細胞を枯渇させるものであり、ほとんどの成熟白血球は、休止脾臓Ｂ細胞を除いて、ＣＤ４３を発現するという事実に依存する（実際、ＣＤ４３の発現は、顆粒球、単球、マクロファージ、血小板、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、胸腺細胞、及び末梢ＣＤ８＋、及びほとんどのＣＤ４＋Ｔ細胞に加えて、未熟Ｂ細胞、形質細胞、及び幾つかの成熟細胞で実証されている）。骨髄性細胞の除去を向上させるために、抗Ｍａｃ−１／ＣＤ１１ｂマイクロビーズが、ネガティブ選択に加えられる。Ｂ細胞単離は、ＡｕｔｏＭＡＣＳ自動磁気ビーズ細胞選別器（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製）を使用することにより自動化することができる。Ｂ２２０＋細胞の蛍光分析により評価されるように、そのような単離は、＞９５％純粋な、脾臓１つ当たりおよそ４×１０ｅ７個のＢ細胞を日常的にもたらす。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｓ、Ｍｕｌｌｅｒ Ｗ、Ｗｅｉｃｈｅｌ Ｗ、及びＲａｄｂｒｕｃｈ Ａ．（１９９０年）Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ １１巻（２号）、２３１〜２３８頁も参照されたい。

回収されたＢ細胞の数は、免疫レパートリーを実質的に代表する。幾つかの実施形態では、少なくとも１×１０^４個のＢ細胞が宿主から単離され、より好ましくは少なくとも１０^５個のＢ細胞、より好ましくは少なくとも１０^６個のＢ細胞、最も好ましくは１０^７個のＢ細胞が宿主から単離される。

各Ｂ細胞に由来する抗体及びそれらの断片をコードするＤＮＡが単離及び増幅され、例えば、重鎖及び軽鎖は、ＰＣＲ反応により連結される。好ましくは、ＤＮＡは配列決定される。配列決定されたＤＮＡは、Ｂ細胞ｍＲＮＡから生成されたｃＤＮＡであってもよい。Ｂ細胞等の真核細胞からのｍＲＮＡ抽出は、周知の技術的手順である。多数のプロトコールが存在し、市販のキットが入手可能である。ＰｏｌｙＡＴｔｒａｃｔ（登録商標）ｍＲＮＡ単離システム（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、マディソン、ウィスコンシン州、米国）又は種々のＲＮｅａｓｙ及びＯｌｉｇｏｔｅｘ ＤｉｒｅｃｔｍＲＮＡキット（両方ともＱｉａｇｅｎ社製、ヒルデン、ドイツから）等である。これら技術の多くは、真核生物ｍＲＮＡのｐｏｌｙＡ末端を、例えば、オリゴ（ｄＴ）セルロース等のオリゴ（ｄＴ）マトリックスに対する親和性精製のために利用する。

ｃＤＮＡは、特異的プライマーを使用して逆転写し、その後従来のＰＣＲを行うことにより、単離ｍＲＮＡから選択的に増幅することができる。特異的プライマーは、可変重鎖及び軽鎖ドメイン核酸を増幅するために使用される。Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｒｖ．１９９７年；３０巻：２１〜４４頁、Ｊ Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．１９９４年；４７巻：４９３〜６頁、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．１９９０年；４３巻：８８８〜９０頁、又はＭｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．２００２年４月；５５巻（２号）：９８〜１０１頁を参照されたい。

可変ドメイン重鎖及び軽鎖クラス対形成体を特定することができるように、１つのＢ細胞に由来する可変及び軽鎖ドメインを両方ともコードするＤＮＡが共に維持される。個々のＢ細胞に由来する可変ドメイン対形成体をコードする核酸を単離するための技術は、当技術分野で周知である。例えば、以下を参照されたい：国際公開第０１／９２２９１号；国際公開第９２／１５６７８号；国際公開第９３／０３１５１号，国際公開第２００５／０４２７７４号；Ｍｕｌｌｉｎａｘ ＲＬら、１９９２年 Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １２巻：６号 ８６４〜８６８頁；Ｃｈａｐａｌ，Ｎ．ら、１９９７年 Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３巻、５１８〜５２４頁；Ｅｍｂｌｅｔｏｎ ＭＪら、１９９２年 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０巻：１５号、３８３１〜３８３７頁；Ｃｏｒｏｎｅｌｌａ，Ｊ．Ａ．ら、２０００年 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８巻：２０号、Ｅ８５頁；Ｔｈｉｒｉｏｎ Ｓら、１９９６年 Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ５巻：６号 ５０７〜５１１頁；及びＷａｎｇ，Ｘら、２０００年 Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０巻、２１７〜２２５頁。

これら技術は、単独で又は他の方法と組み合わせて使用することができる。例えば、大きな試料の可変重鎖及び軽鎖ドメイン配列を、それらのそれぞれのＢ細胞から共に特定することが成功しない場合、正確な可変重鎖及び可変軽鎖ドメインクラス対を特定するために、以下の方法を実施することができる。各個々のＢ細胞の単一細胞ＰＣＲが実施される。

好ましくは、Ｂ細胞の各々に由来するＤＮＡは、配列決定される。全ゲノムを配列決定することができる会社は、Ｈｅｌｉｃｏｓ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社（ケンブリッジ、マサチューセッツ州、米国）等、種々存在する。Ｈｅｌｉｃｏｓは、自社のＴｒｕｅ Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（商標）技術を用いて、ＤＮＡ又はＲＮＡの単一の分子を高速及び効率的に直接配列解析することができる。同様の配列解析試行を実施することができる他の会社には、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社（サンディエゴ、カリフォルニア州、米国；Ｓｏｌｅｘａシステム）及びＲｏｃｈｅ社（バーゼル、スイス；４５４システム）が含まれる。配列決定の前に、クローニングステップは必要ではない。

別の態様では、本開示は、免疫レパートリーに存在する重鎖及び軽鎖可変ドメイン対の生殖系ファミリーを特定する方法を可能にする。抗体又はそれらの断片は全て、当業者に公知の方法を使用して、それらの生殖系ファミリーにまでさかのぼることができる。抗体又はその断片をコードする核酸の配列を分析することにより、ＶＨ及びＶＬの両方の生殖系ファミリーを、当業者に公知の方法により決定することができる。例えば、Ｗｉｌｄｔら、（１９９９年）では、３人の患者からＢ細胞がサンプリングされ、３６５個のＶＨ及びＶＬクラス対形成体が特定された。各Ｂ細胞に由来するＲＮＡが、ｃＤＮＡ合成のために使用され、ＶＨ及びＶＬ領域をコードするｃＤＮＡが、ＰＣＲ増幅され、配列決定された。Ｗｉｌｄｔの図１に示されているように、ある種のＶＨ及びＶＬクラスが、他よりも高頻度で対になっており、例えば、ＶＨ３−８とＶκ３−１、Ｖκ３−１９、Ｖκ４−１、Ｖλ２−３、又はＶλ１−２との対、及びＶＨ３−９とＶκ３−１、Ｖκ３−３、又はＶλ１−５との対である。

別の態様では、本開示は、コレクションを合成する前に、多様化された相補性決定領域を設計する方法を可能にする。ＣＤＲは、Ｋｎａｐｐｉｋら、２０００年；国際公開第９７／０８３２０号に開示されているものを含む、当技術分野で周知の方法により設計することができる。

別の態様では、本開示は、抗体又はそれらの断片をコードする核酸のコレクションに含まれていることが望ましい可変ドメインクラス対形成体を選択する方法を可能にする。幾つかの実施形態では、本開示方法により特定されたＶＨ及びＶＬドメインクラス対を全て含む核酸のコレクションが合成される。

加えて、ＶＨ及びＶＬクラス対の出現率を、種々の統計的検定により決定することができる。その最も容易な形態では、個々のＶＨ及びＶＬクラス対は単に数えられる。より精巧な統計的検定では、種々の他のパラメーターを考慮に入れることができる。非限定的な例として、以下の統計的検定及び文献は、そのような又は類似の分析で行われてきた多くの手法の例として指針となり得る：ベイズ収縮評価（例えば、Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ ５９巻（２００３年）：４７６〜４８６頁を参照）、ＤＡＤＡ（ｃＤＮＡ含有量のデジタル分析（Ｄｉｇｉｔａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃＤＮＡ Ａｂｕｎｄａｎｃｅ）、例えば、ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２００２年３巻：７頁を参照）、線形モデリング（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ、１９９９年 ４巻：４１〜５２頁）、及び種々のクラスタリング法（ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２００６年、７巻：３９７頁、Ｆｏｕｒｔｈ ＩＥＥＥ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｄａｔａ Ｍｉｎｉｎｇ （ＩＣＤＭ’０４）、４０３〜４０６頁）。

他の態様では、本開示は、抗体又はそれらの断片をコードする核酸のコレクションを含むベクターのコレクションを可能にする。幾つかの実施形態では、ベクターには、発現ベクター、ディスプレイベクター、ファージディスプレイベクター、又はファージミドベクターが含まれる。

真核生物発現ベクターは、当技術分野で周知であり、商業的に入手可能でもある。典型的には、所望のＤＮＡを挿入するための便利な制限部位を含有するそのようなベクターが提供される。そのようなベクターの例には、ｐＳＶＬ及びｐＫＳＶ−１０、ｐＢＰＶ−１／ＰＭＬ２ｄ、及びｐＴＤＴ１（ＡＴＣＣ、受入番号３１２５５）が含まれる。

他の態様では、本開示は、開示されたベクターのコレクションで形質転換された宿主細胞のコレクションを可能にする。宿主細胞は、原核生物又は真核生物のいずれであってもよい。細菌細胞は、好ましい原核生物宿主細胞であり、典型的には、例えばＢｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．社、ベテスダ、メリーランド州から入手可能な大腸菌菌株ＤＨ５等の大腸菌の菌株である。好ましい真核生物宿主細胞には、酵母、並びにマウス及びげっ歯動物を含む哺乳動物細胞、好ましくは、マウス、ラット、サル、又はヒト細胞系に由来する細胞等の脊椎動物細胞が含まれる。

宿主細胞へのベクターの導入は、リン酸カルシウム沈殿法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リポソーム融合法、ＲＢＣゴースト融合法、プロトプラスト融合法、及びウイルス感染法等を含む、当業者に公知の多数の形質転換法又は形質移入法により達成することができる。モノクローナル全長抗体、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、及びｓｃＦｖ断片の産生は、周知である。

組換えＤＮＡ分子を用いた適切な細胞宿主の形質転換は、典型的には、使用されるベクターのタイプに応じた方法により達成される。原核生物宿主細胞の形質転換に関しては、例えば、Ｃｏｈｅｎら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ＵＳＡ、６９巻、２１１０頁（１９７２年）；及びＭａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８２年）を参照されたい。ｒＤＮＡを含有するレトロウイルスベクターを用いた脊椎動物細胞の形質転換に関しては、例えば、Ｓｏｒｇｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、４巻：１７３０〜１７３７頁（１９８４年）；Ｇｒａｈａｍら、Ｖｉｒｏｌ．、５２巻：４５６頁（１９７３年）；及びＷｉｇｌｅｒら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ、７６巻、１３７３〜１３７６頁（１９７９年）を参照されたい。

別の態様では、本開示は、少なくとも１×１０^５個の未感作ヒトＢ細胞の試料に存在する核酸を含む抗体又はそれらの断片をコードする核酸を例示する配列データを含み、前記配列データが読取可能な媒体にあるキット又はデータベースを可能にする。

別の態様では、本開示は、抗体又はそれらの断片をコードする合成核酸のコレクションを産生する方法であって、少なくとも約２５００個のＢ細胞の試料に存在するＶＨ及びＶＬクラス対の少なくとも０．０５％の濃度で存在するＶＨ及びＶＬクラス対を含む抗体又はそれらの断片をコードする核酸のコレクションを合成することを含む方法を可能にする。幾つかの実施形態では、本開示は、免疫レパートリーを実質的に代表する抗体又はそれらの断片をコードする核酸のコレクションを産生する方法であって、（ａ）免疫レパートリー中のＶＨ／ＶＬクラス対の少なくとも０．０５％、少なくとも１％、又は少なくとも２％の濃度で存在するＶＨ／ＶＬクラス対を特定すること；（ｂ）免疫レパートリー中のＶＨ／ＶＬクラス対の少なくとも０．０５％、少なくとも１％、又は少なくとも２％の濃度で存在するＶＨ／ＶＬクラス対を含む抗体又はそれらの断片をコードする核酸のコレクションを合成することを含む方法を可能にする。幾つかの実施形態では、ＶＨ／ＶＬクラス対の特定は、（ｉ）１つ又は複数のヒト宿主からＢ細胞を単離すること；（ｉｉ）（Ａ）ＶＨ／ＶＬクラス対をコードするＤＮＡ、ｍＲＮＡ、又はｃＤＮＡを単離及び配列決定すること、又は（Ｂ）各ＶＨ及びＶＬに特異的な１つ又は複数の核酸プローブを用いて探索することから選択されるプロセスにより各Ｂ細胞のＶＨ／ＶＬクラス対を決定すること；及び（ｉｉｉ）ＶＨ／ＶＬクラス対を分析することを含む。幾つかの実施形態では、ＶＨ／ＶＬクラス対の特定は、（ｉ）抗体核酸配列を得ること、（ｉｉ）ＶＨ／ＶＬクラス対を配列アラインメントにより決定すること、（ｉｉｉ）少なくとも１００個の抗体に由来するそのような配列を照合して、免疫レパートリーに存在するＶＨ／ＶＬクラス対を特定することを含む。幾つかの実施形態では、本方法は、（ｉ）ファージで効率的に提示されること、（ｉｉ）哺乳動物細胞で効率的に提示されること、（ｉｉｉ）大腸菌においてＦａｂ型で良好に発現されること、（ｉｖ）哺乳動物細胞においてＩｇＧ型で良好に発現されること、（ｖ）熱安定性、（ｖｉ）溶解度、及び（ｖｉｉ）低免疫原性からなる群から選択される少なくとも１つの生物物理学的特性を示すＶＨ／ＶＬクラス対を選択すること、及び少なくとも１つの生物物理学的特性を示す抗体又はそれらの断片をコードする核酸のコレクションを合成することを含む。幾つかの実施形態では、抗体又はそれらの断片をコードする核酸のコレクションは、生殖系であるか、実質的に生殖系であるか、又は生殖系核酸のコドン最適化変異体である。幾つかの実施形態では、ＶＨ／ＶＬクラス対を含む抗体又はそれらの断片をコードする核酸のコレクションを合成中に、少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）に、配列変異が導入される。幾つかの実施形態では、配列変異は、終止コドンを含まない配列に限定される。幾つかの実施形態では、本方法は、核酸のコレクションをベクターにクローニングすることを更に含む。幾つかの実施形態では、ベクターは、（ｉ）ディスプレイベクター、（ｉｉ）ファージディスプレイベクター、（ｉｉｉ）ファージミドベクター、及び（ｉｖ）哺乳動物発現ベクターからなる群から選択される。幾つかの実施形態では、本方法は、宿主細胞への形質転換を更に含む。幾つかの実施形態では、宿主細胞は、（ｉ）原核生物宿主細胞、（ｉｉ）真核生物宿主細胞、（ｉｉｉ）大腸菌宿主細胞、及び（ｉｖ）哺乳動物宿主細胞からなる群から選択される。

幾つかの実施形態は、前記核酸をベクターのコレクションに挿入すること、及び宿主細胞に形質転換／形質移入すること、及び抗体又はそれらの断片を提示させることを更に含む。幾つかの実施形態では、ベクターは、発現ベクター、ファージミドベクター等のディスプレイベクターである。幾つかの実施形態は、前記ベクターを好適な宿主細胞に形質移入することを更に含む。幾つかの実施形態では、宿主細胞は、大腸菌等の原核生物であるか、又は哺乳動物等の真核生物である。

別の態様では、本開示は、免疫原に特異的な抗体又はその抗体断片を特定する方法であって、少なくとも約２５００個のＢ細胞の試料に存在するＶＨ及びＶＬクラス対の少なくとも０．０５％の濃度で存在するＶＨ及びＶＬクラス対を含む抗体又はそれらの断片をコードする核酸のコレクションを合成するステップ；及び前記免疫原に特異的な１つ又は複数の抗体又はそれらの断片を選択するステップを含む方法を可能にする。幾つかの実施形態は、ある免疫原に特異的な抗体又はその抗体断片を特定する方法であって、（ａ）免疫レパートリー中のＶＨ／ＶＬクラス対の少なくとも０．０５％、少なくとも１％、又は少なくとも２％の濃度で存在するＶＨ／ＶＬクラス対を特定ステップ、（ｂ）免疫レパートリー中のＶＨ／ＶＬクラス対の少なくとも０．０５％、少なくとも１％、又は少なくとも２％の濃度で存在するＶＨ／ＶＬクラス対を含む抗体又はそれらの断片をコードする核酸のコレクションを合成するステップ、（ｃ）コレクションに由来する抗体又はその断片を提示又は発現させるステップ、（ｄ）特定の免疫原に対してコレクションをスクリーニングするステップ、及び（ｅ）前記免疫原に特異的な少なくとも１つの抗体又はそれらの断片を選択するステップを含む方法を含む。幾つかの実施形態は、疾患又は状態を治療するための抗体又は抗体断片を特定する方法であって、（ａ）免疫レパートリー中のＶＨ／ＶＬクラス対の少なくとも０．０５％、少なくとも１％、又は少なくとも２％の濃度で存在するＶＨ／ＶＬクラス対を特定するステップ、（ｂ）（ｉ）ファージで効率的に提示されること、（ｉｉ）哺乳動物細胞で効率的に提示されること、（ｉｉｉ）大腸菌においてＦａｂ型で良好に発現されること、（ｉｖ）哺乳動物細胞においてＩｇＧ型で良好に発現されること、（ｖ）熱安定性、（ｖｉ）溶解度、及び（ｖｉｉ）低免疫原性からなる群から選択される少なくとも１つの生物物理学的特性を示すＶＨ／ＶＬクラス対を特定するステップ、（ｃ）免疫レパートリー中のＶＨ／ＶＬクラス対の少なくとも０．０５％、少なくとも１％、又は少なくとも２％の濃度で存在するＶＨ／ＶＬクラス対を含み、（ｉ）〜（ｖｉｉ）のうちの少なくとも１つの生物物理学的特性を示す抗体又はそれらの断片をコードする核酸のコレクションを合成するステップ、（ｄ）コレクションに由来する抗体又はその断片を提示又は発現させるステップ、（ｅ）疾患又は状態に関連する特定の免疫原に対してコレクションをスクリーニングするステップ、及び（ｆ）前記免疫原に特異的な少なくとも１つの抗体又はそれらの断片を選択するステップを含む方法を含む。

幾つかの実施形態では、Ｂ細胞は、ヒト宿主から単離される。幾つかの実施形態では、Ｂ細胞は未感作である。幾つかの実施形態では、少なくとも１×約２５００個のＢ細胞の試料に存在するＶＨ及びＶＬクラス対は、１つ又は複数のヒト宿主から未感作Ｂ細胞を回収すること、及び回収したＢ細胞からＤＮＡを単離すること、及び単離されたＤＮＡを分析することを含む方法により特定される。幾つかの実施形態では、ＤＮＡを分析するステップは、ＤＮＡを配列決定することを含む。幾つかの実施形態では、ＤＮＡを分析するステップは、各ＶＨ及びＶＬクラス対が試料に存在する頻度を特定することを更に含む。

幾つかの実施形態は、前記核酸をベクターのコレクションに挿入すること、及び宿主細胞に形質転換／形質移入すること、及び抗体又はそれらの断片を提示させることを更に含む。

別の態様では、本開示は、ある免疫原に特異的な抗体又はその抗体断片を特定する方法であって、少なくとも約２５００個のＢ細胞の試料に存在するＶＨ及びＶＬクラス対の少なくとも０．０５％の濃度で存在するＶＨ及びＶＬクラス対を含む抗体又はそれらの断片をコードする核酸のコレクションを合成するステップ；及び前記免疫原に特異的な１つ又は複数の抗体又はそれらの断片を選択するステップを含む方法を可能にする。

幾つかの実施形態では、Ｂ細胞は、ヒト宿主から単離される。幾つかの実施形態では、Ｂ細胞は未感作である。幾つかの実施形態では、少なくとも約２５００個のＢ細胞の試料にあるＶＨ及びＶＬクラス対は、１つ又は複数のヒト宿主からＢ細胞を回収すること、回収したＢ細胞からＤＮＡを単離すること、及び単離されたＤＮＡを分析することを含む方法により特定される。幾つかの実施形態では、ＤＮＡを分析するステップは、ＤＮＡを配列決定することを含む。幾つかの実施形態では、ＤＮＡを分析するステップは、各ＶＨ及びＶＬクラス対が試料に存在する頻度を特定することを更に含む。

幾つかの実施形態では、コレクションは、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、リボソームディスプレイ、細菌ディスプレイ、又は真核生物ディスプレイを使用して、試験／スクリーニングの前に提示される。幾つかの実施形態では、コレクションは、原核細胞又は真核細胞で提示される。幾つかの実施形態では、コレクションは、Ｆａｂ型又はＩｇＧ型又は当業者に公知の他の型で提示される。

スクリーニングは、結合をスクリーニングするためのファージディスプレイ法、選択的感染性ファージ法、ポリソーム技術、及び酵素活性又はタンパク質安定性のためのアッセイ系等の、当技術分野で周知の方法のうちの１つを使用することにより実施することができる。多数のそのような方法が当業者に公知であり、例示的な文献として、以下のものが提供される：Ｖａｌｌｅ ＲＰら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｄｅｖｅｌ．２００３年３月；６巻（２号）：１９７〜２０３頁；Ａｃｋｅｒｍａｎｎ ＢＬ Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．２００７年４月；４巻（２号）：１７５〜８６頁；及びＡｎｄｅｒｓｏｎ ＫＳ Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ．２００５年、７月〜８月；４巻（４号）：１１２３〜３３頁。

１つの実施形態では、スクリーニングアッセイは、抗体によるリガンドの結合が、検出可能なシグナルを直接的又は間接的のいずれかで生成するように実施される。そのようなシグナルには、例えば、複合体の産生、触媒反応生成物の形成、及びエネルギーの放出又は取り込み等が含まれる。対象組換えＤＮＡを用いた形質転換にかけられた集団に由来する細胞は、例えば、クローニングして、単クローンコロニーを形成させることができる。それらコロニーに由来する細胞を回収及び溶解し、それらのＤＮＡ含量を、例えばＳｏｕｔｈｅｒｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、９８巻：５０３頁（１９７５年）又はＢｅｒｅｎｔら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．３巻：２０８頁（１９８５年）に記述されているような当技術分野で公知の方法を使用して、組換えＤＮＡの存在について調査することができる。

生物物理学的特性
本発明は、ＶＨ／ＶＬクラス対が望ましい生物物理学的特性を有するコレクション、及びそのようなコレクションを製作する方法も含む。好ましい及び望ましい生物物理学的特性には、より高い安定性、より高い発現レベル、及び低い凝集傾向が含まれる。

好適な生物物理学的特性は、様々な段階でのコレクションの使用を容易にする。例えば、コレクションのスクリーニングは、抗体又はそれらの断片が可溶性であり、凝集せず、ファージ等のスクリーニングバックグラウンドで良好に発現される場合、容易である。動物試験及び治療使用等の抗体のその後の開発は、抗体溶解度、熱安定性、高レベルの発現（特に哺乳動物細胞でＩｇＧとして）、及び低免疫原性等の特性により容易となる。

抗体又はそれらの断片の全て又は少なくとも大多数が、そのような好ましい生物物理学的特性を有することを保証するために、ＶＨ／ＶＬクラス対を前もってスクリーニングして、どのクラス対がどの特性を示すかを特定することができる。その後、ライブラリーは、そのような好ましい生物物理学的特性を有するそれら抗体のみをコードする核酸を合成することにより構築される。

無論、全てのＶＨ／ＶＬクラス対が、全ての生物物理学的特性を同じ程度に示すとは限らず、当業者であれば、どのＶＨ／ＶＬクラス対を合成すべきかを決定する前に、どの特性がより関連するか及び／又は各特性のバランスを決定することになるだろう。

従って、ある態様では、本発明は、ファージの表面又は他のディスプレイ技術等で効率的に提示されるＶＨ／ＶＬ組み合わせが選択された合成抗体ライブラリーを提供する。好ましくは全て、本質的に全て、又は実質的に全てのＶＨ／ＶＬ組み合わせが、効率的に提示される。提示の効率性は、本発明に記述されているようなサンドイッチファージＥＬＩＳＡにより測定することができる。

他の態様では、本発明は、大腸菌においてＦａｂ型で良好に発現されるＶＨ−ＶＬ組み合わせが選択された合成抗体ライブラリーを提供する。好ましくは全て、本質的に全て、又は実質的に全てのＶＨ／ＶＬ組み合わせは、大腸菌においてＦａｂ型で良好に発現される。大腸菌でのＦａｂ型の発現は定量化することができ、好ましくは、細菌培養中２ｍｇ／Ｌ超、５ｍｇ／Ｌ超、１０ｍｇ／Ｌ超、又は１５ｍｇ／Ｌ超である。ある態様では、全てのＶＨ−ＶＬが、２ｍｇ／Ｌ超で発現され、本質的に全てのＶＨ−ＶＬ組み合わせが、５ｍｇ／Ｌ超のレベルで発現され、ほとんどのＶＨ−ＶＬ組み合わせが、細菌培養中１０ｍｇ／Ｌ超のレベルで発現され、及び／又は少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、又は少なくとも５つのＶＨ−ＶＬ組み合わせが、細菌培養中１５ｍｇ／Ｌ超のレベルで発現される。

ある態様では、本発明は、哺乳動物系においてＩｇＧ型で良好に発現されるＶＨ−ＶＬ組み合わせが選択された合成抗体ライブラリーを提供する。現在上市されている抗体に基づく治療用生物製剤の大多数は、以下の様々な理由でＩｇＧ型である：（ｉ）ヒト体内におけるＩｇＧ分子の半減期が、新生児受容体（ＦｃＲｎ）とＩｇＧとの相互作用のため非常に長い（約３週間）；（ｉｉ）ＩｇＧ分子は、高度に可溶性であり、熱力学的に安定しており、血液中でのプロテアーゼに比較的抵抗性である；及び（ｉｉｉ）ＩｇＧは、腫瘍細胞の除去に必要なＡＤＣＣ（抗体依存性細胞性細胞毒性）及び／又はＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）活性を有する。特定のＶＬ／ＶＨ組み合わせがＦａｂ型で発現されることは、同じＶＬ／ＶＨ組み合わせがＩｇＧ型で発現されることと必ずしも相関せず、従ってＩｇＧ型のＶＬ／ＶＨ組み合わせの発現及び溶解度も、重要な独立因子である。

哺乳動物系には、例えば、哺乳動物浮遊培養、哺乳動物接着細胞培養、ＨＫＢ１１細胞、ＰＥＲＣ．６細胞、又はＣＨＯ細胞が含まれていてもよい。好ましくは全て、本質的に全て、又は実質的に全てのＶＨ／ＶＬ組み合わせが、哺乳動物系においてＩｇＧ型で良好に発現される。ある態様では、本発明は、全てのＶＨ−ＶＬ組み合わせが、哺乳動物系において１０ｍｇ／Ｌ超のレベルでＩｇＧ型で発現される合成ヒト抗体ライブラリー、本質的に全てのＶＨ−ＶＬ組み合わせが、哺乳動物系において１５ｍｇ／Ｌ超のレベルでＩｇＧ型で発現される合成ヒト抗体ライブラリー、ほとんどのＶＨ−ＶＬ組み合わせが、哺乳動物系において２０ｍｇ／Ｌ超のレベルでＩｇＧ型で発現される合成ヒト抗体ライブラリー、及び／又は少なくとも３つの、少なくとも４つの、又は少なくとも５つのＶＨ−ＶＬ組み合わせが、哺乳動物系において２５ｍｇ／Ｌ超のレベルでＩｇＧ型で発現される合成ヒト抗体ライブラリーを提供する。

ある態様では、本発明は、熱安定性のＶＨ／ＶＬ組み合わせが選択された合成抗体ライブラリーを提供する。好ましくは全て、本質的に全て、又は実質的に全ての組み合わせが、熱安定性であり、Ｔｍは、少なくとも６８、７０、７２、７４、又は７６℃である。熱安定性は、本明細書に記述されているように測定することができる。ある態様では、本発明は、本質的に全てのＶＨ−ＶＬ組み合わせが、６８℃を超えるＴｍを有する合成ヒト抗体ライブラリー、本質的に全てのＶＨ−ＶＬ組み合わせが、７０℃を超える又は７２℃を超えるＴｍを有する合成ヒト抗体ライブラリー、ほとんどのＶＨ−ＶＬ組み合わせが、７４℃を超えるＴｍを有する合成ヒト抗体ライブラリー、及び／又は多くのＶＨ−ＶＬ組み合わせが、７６℃を超えるＴｍを有する合成ヒト抗体ライブラリーを提供する。ある態様では、少なくとも３つの、少なくとも４つの、又は少なくとも５つのＶＨ−ＶＬ組み合わせが、７０℃を超えるＴｍを有する。

ある態様では、本発明は、熱安定性である、つまり凝集傾向のないＶＨ−ＶＬ組み合わせが選択された合成抗体ライブラリーを提供する。溶解度は、例えば、細菌性宿主で試験されたＦａｂ型又は真核生物宿主で試験されたＩｇＧ１の好ましい折り畳み及び発現特徴により、又は分析用サイズ排除クロマトグラフィにより決定されるような精製後の凝集により決定することができる。

低免疫原性は、当技術分野で公知の方法により推定又は直接試験してもよいが、所与のＶＨ／ＶＬクラス対がレパートリーで最も豊富であるという事実及び使用されたタンパク質配列が実質的生殖系タンパク質配列であるという事実により推論することもできる。

本明細書に記述されているように、抗体配列データは、Ｂ細胞から、例えば未感作Ｂ細胞から、公的に入手可能なデータベース及び／又は文献から取得することができる。抗体配列の各々は、最も近い生殖系ファミリー及び／又は遺伝子とアラインすることができる。このデータから、豊富に存在するＶＨ及びＶＬ生殖系ファミリー及び／又は遺伝子及び／又はＶＨ／ＶＬクラス対を決定することができる。

、豊富に存在するＶＨ及びＶＬ生殖系ファミリー及び／又は遺伝子及び／又はＶＨ／ＶＬクラス対が決定されれば、どのＶＨ及びＶＬ生殖系ファミリー及び／又は遺伝子及び／又はＶＨ／ＶＬクラス対を、好ましい生物物理学的特性に関して試験するかを選択することができる。１つの手法は、ＶＨ及びＶＬ生殖系ファミリー及び／又は遺伝子を存在量により順位付けし、その後、最も豊富な、例えば上位２０位の最も豊富なＶＨ及びＶＬ生殖系ファミリー及び／又は遺伝子であるＶＨ及びＶＬ生殖系ファミリー及び／又は遺伝子を試験することであろう。加えて、上位２０位の最も豊富なＶＨ及びＶＬ生殖系ファミリー及び／又は遺伝子を組み合わせることにより、例えばＶＨ及びＶＬの４００通りの組み合わせがもたらされ、好ましい生物物理学的特性に関してそれらを試験することができる。加えて又は補完的に、最も豊富なＶＨ／ＶＬクラス対を、好ましい生物物理学的特性について試験することができる。

好ましい生物物理学的特性には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：（ｉ）それらは、ファージにおいてＦａｂ型で良好に提示されること、（ｉｉ）それらは、哺乳動物細胞においてＩｇＧ型で良好に提示されること、（ｉｉｉ）それらは、例えば大腸菌ではＦａｂ型で、及び例えば哺乳動物細胞ではＩｇＧ型で大量に発現されること、（ｉｖ）熱力学的に安定していること、（ｖ）高い血清安定性を有すること、（ｖｉ）低い凝集傾向（つまり、高い溶解度）を有すること、及び（ｖｉｉ）低リスクの免疫原性を有すること。

幾つかの態様では、本発明は、少なくとも１×１０^５個のＢ細胞の試料に存在するＶＨ及びＶＬクラス対の少なくとも０．５％の濃度で存在するＶＨ及びＶＬクラス対を含む抗体又はそれらの断片をコードする合成核酸のコレクションを含む。幾つかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬクラス対は、少なくとも１×１０^５個のＢ細胞の試料に存在するＶＨ及びＶＬクラス対の少なくとも１％の濃度で存在する。幾つかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬクラス対は、少なくとも１×１０^５個のＢ細胞の試料に存在するＶＨ及びＶＬクラス対の少なくとも２％の濃度で存在する。幾つかの実施形態では、Ｂ細胞は、ヒト宿主から単離される。幾つかの実施形態では、Ｂ細胞は未感作である。幾つかの態様では、コレクションは、生殖系ＶＨ及びＶＬフレームワーク領域を含む抗体又はそれらの断片をコードする核酸を含む。幾つかの実施形態では、コレクションは、少なくとも１×１０^４個の核酸配列、少なくとも１×１０^６個の核酸配列、少なくとも１×１０^８個の核酸配列、少なくとも１×１０^１０個の核酸配列、又は少なくとも１×１０^１１個の核酸配列を含む。

幾つかの態様では、本発明は、少なくとも１×１０^５個の未感作ヒトＢ細胞の試料に存在する核酸を含む、抗体又はそれらの断片をコードする核酸を例示する配列データを含み、前記配列データが読取可能な媒体にあるキットを含む。幾つかの態様では、本発明は、抗体又はそれらの機能的断片をコードする核酸のコレクションを含む。幾つかの実施形態では、ベクターは、ファージディスプレイベクターである。幾つかの実施形態では、ベクターは、ファージミドベクターである。幾つかの態様では、本発明は、抗体又はそれらの機能的断片をコードする核酸のコレクションを含むコレクションベクターで形質転換された宿主細胞を含む。幾つかの実施形態では、宿主細胞は、原核生物である。幾つかの実施形態では、宿主細胞は、大腸菌である。幾つかの実施形態では、宿主細胞は、真核生物である。幾つかの実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物である。

幾つかの態様では、本発明は、抗体又はそれらの断片をコードする合成核酸のコレクションを産生する方法であって、少なくとも約１×１０^５個のＢ細胞の試料に存在するＶＨ及びＶＬクラス対の少なくとも０．５％の濃度で存在するＶＨ及びＶＬクラス対を含む抗体又はそれらの断片をコードする核酸のコレクションを合成することを含む方法を含む。幾つかの実施形態では、Ｂ細胞は、ヒト宿主から単離される。幾つかの実施形態では、Ｂ細胞は未感作である。幾つかの実施形態では、少なくとも１×１０^５個のＢ細胞の試料に存在するＶＨ及びＶＬクラス対は、以下のステップを含む方法により特定される：
ａａ）１つ又は複数のヒト宿主から未感作Ｂ細胞を回収するステップ、
ａｂ）ステップａａ）で回収されたＢ細胞からＤＮＡを単離するステップ、及び
ａｃ）ステップａｂ）で単離されたＤＮＡを分析するステップ。

幾つかの実施形態では、ＤＮＡを分析するステップは、ＤＮＡを配列決定することを含む。幾つかの実施形態では、ＤＮＡを分析するステップは、各ＶＨ及びＶＬクラス対が試料に存在する頻度を特定することを更に含む。幾つかの実施形態では、本方法は、核酸をベクターのコレクションに挿入することを更に含む。幾つかの実施形態では、ベクターは、発現ベクターである。幾つかの実施形態では、ベクターは、ディスプレイベクターである。幾つかの実施形態では、ディスプレイベクターは、ファージミドベクターである。幾つかの実施形態では、本方法は、前記ベクターを好適な宿主細胞に形質移入することを更に含む。幾つかの実施形態では、宿主細胞は、原核生物である。幾つかの実施形態では、宿主細胞は、大腸菌である。幾つかの実施形態では、宿主細胞は、真核生物である。幾つかの実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物である。

幾つかの態様では、本発明は、ある免疫原に特異的な抗体又はその抗体断片を特定する方法であって、ａ）少なくとも約１×１０^５個のＢ細胞の試料に存在するＶＨ及びＶＬクラス対の少なくとも０．５％の濃度で存在するＶＨ及びＶＬクラス対を含む抗体又はそれらの断片をコードする核酸のコレクションを合成するステップ、ｂ）特定の免疫原に対してコレクションをスクリーニングするステップ、及びｃ）前記免疫原には特異的な１つ又は複数の抗体又はそれらの断片を選択するステップを含む方法を含む。幾つかの実施形態では、Ｂ細胞は、ヒト宿主から単離される。幾つかの実施形態では、Ｂ細胞は未感作である。幾つかの実施形態では、少なくとも１×１０^５個のＢ細胞の試料に存在するＶＨ及びＶＬクラス対は、以下のステップを含む方法により特定される：
ａａ）１つ又は複数のヒト宿主から未感作Ｂ細胞を回収するステップ、
ａｂ）ステップａａ）で回収されたＢ細胞からＤＮＡを単離するステップ、及び
ａｃ）ステップａｂ）で単離されたＤＮＡを分析するステップ。

幾つかの実施形態では、ＤＮＡを分析するステップは、ＤＮＡを配列決定することを含む。幾つかの実施形態では、ＤＮＡを分析するステップは、各ＶＨ及びＶＬクラス対が試料に存在する頻度を特定することを更に含む。幾つかの実施形態では、コレクションを合成するステップは前記核酸をベクターのコレクションに挿入することを更に含む。幾つかの実施形態では、本方法は、前記ベクターを好適な宿主細胞に形質移入することを更に含む。幾つかの実施形態では、本方法は、前記コレクションを提示させることを更に含む。

実施例
実施例１：原核生物シグナル配列及びヒトリーダー配列のＣ末端における、完全生殖系ＦＲ１領域を提供する制限部位の生成
１つの態様では、本開示は、生殖系配列を含むフレームワーク領域、特にＦＲ１を含む抗体のコレクションを記述する。生殖系配列を有することにより、ヒトに投与した際に、抗体の免疫原性リスクが低下されるはずであることが期待される。しかしながら、免疫原に対して抗体をスクリーニングすることができるように、ディスプレイベクター及び／又は発現ベクターへの、抗体のコレクションをコードする核酸の標準的クローニングを可能にするためには、制限部位を使用しなければならない。過去において、クローニングに使用された制限部位は、フレームワーク領域内に配置されていることが多く、従って核酸配列及び／又はアミノ酸配列が修飾され生殖系と異なることになった。本開示の抗体の各々の少なくともフレームワーク１（ＦＲ１）領域が、生殖系タンパク質配列を維持することを保証するために、ＦＲ１内には、いかなる非天然制限部位も存在するべきではない。従って、本開示の態様は、原核生物シグナル配列及びヒトリーダー配列のＣ末端内、特にＣ末端３残基内に、同一の又は少なくとも同様の制限部位を組み込むことである。加えて、同一の又は同様の制限部位を含むシグナル配列及びリーダー配列は、機能性であり、原核生物及び哺乳動物の両発現系において、抗体又はそれらの断片の良好な提示及び発現レベルを可能にしなければならない。

実施例１．１：大腸菌シグナル配列のＣ末端に豊富なアミノ酸残基の分析
以下では、シグナル配列、大腸菌ｏｍｐＡ及びｐｈｏＡの両方のＣ末端に組み込まれる制限部位の選択、及びその結果生じたシグナル配列の機能性の評価が記述されている。

第１のステップとして、シグナル配列（−３〜−１）のＣ末端の３個のアミノ酸の共通アミノ酸残基を分析し、表１に示されているようなコンセンサス配列を生成した。Ｃｈｏｕら、Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｉｇｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．３巻（６号）：６１５〜２２頁（２００２年１２月）を参照されたい。

−３位には、主にＡ、Ｓ、Ｖ、及びＴアミノ酸が観察された。−２位には、主にＬ、Ａ、Ｓ、及びＱアミノ酸が観察された。−１位には、主にＡ、Ｇ、及びＳアミノ酸が観察された。

実施例１．２：重鎖大腸菌シグナル配列（ｐｈｏＡ）用の制限部位の選択
表１に示されているコンセンサス配列を、既知の制限部位と比較した後で、以下の３つの制限部位：ＡｆｌＩＩ、ＮｈｅＩ、及びＡｖｒＩＩを、ｐｈｏＡ Ｃ末端に組み込んで後に発現レベルを研究するために選択した。野生型ヌクレオチド配列を修飾ヌクレオチド配列に変更することにより、アミノ酸配列が何に変化するかにも留意することが重要である。選択された制限部位の核酸配列及び対応するアミノ酸配列は、表２に示されている。

対照として、野生型ｐｈｏＡシグナル配列を、発現レベルについて研究した。３個のＣ末端配列を含む野生型ｐｈｏＡシグナル配列の核酸及びアミノ酸配列は、表３に示されている。

発現レベルを評価するために、表２に示されている制限部位をｐｈｏＡシグナル配列に組み込み、それにより野生型アミノ酸配列も修飾した。その結果生じたシグナル配列を使用して、ａ）ＶＨ３−２３又はｂ）ＶＨ１−６９生殖系タンパク質配列のいずれかを含むＦａｂ断片を発現させた。これら生殖系遺伝子は、安定しており良好に発現されることが知られているため、選択された。ＶＨ３−２３及びＶＨ１−６９生殖系遺伝子配列の両方に、４Ｄ５抗体のＣＤＲ−Ｈ３（ＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹ）を組み込み、ＪＨ４生殖系遺伝子配列をＦＲ４に使用した。４Ｄ５抗体は、（ＰＤＢエントリー １ＦＶＣ；Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．、Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．、Ｇｏｒｍａｎ，Ｃ．Ｍ．、Ｒｉｄｇｗａｙ，Ｊ．Ｂ．、Ｈｅｎｎｅｒ，Ｄ．、Ｗｏｎｇ，Ｗ．Ｌ．ら、（１９９２年）；Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｏｍａｉｎｓ ５５１ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉ−ｐ１８５ＨＥＲ２ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９巻、４２８５〜４２８９頁）に開示されている。ａ）表２のＣ末端制限部位及びアミノ酸配列を含むｐｈｏＡシグナル配列、ｂ）上述のようにＣＤＲ−Ｈ３及びＪＨ４が組み込まれたＶＨ３−２３及びＶＨ１−６９のＶＨ配列、及びｃ）ＭＯＲ０３２０７に由来する安定的で良好に発現する軽鎖を含む、ｐＭＯＲＰＨＸ１１（図５０に表示）に基づくプラスミドを生成した。遺伝子は全て、Ｇｅｎｅａｒｔ社（レーゲンスブルク、ドイツ）で生成された。

発現及び周辺質輸送は、周辺質抽出後に抗Ｆｄ ＥＬＩＳＡを実施することにより点検した。ＢＢＳ緩衝液を使用した周辺質抽出後の抗Ｆｄ発現ＥＬＩＳＡの結果は、図１に示されている。ＶＨ３−２３群に示されているように、Ｃ末端制限部位、ＡｆｌＩＩ（ＶＬＳ）、ＮｈｅＩ（ＶＬＡ）、及びＡｖｒＩＩ（ＶＬＧ）を含むシグナル配列は、野生型（ＴＫＡ）の範囲の発現レベルを維持し、ＮｈｅＩ（ＶＬＡ）は、野生型（ＴＫＡ）より良好に機能した。

加えて、大腸菌でのＦａｂ発現を、振とうフラスコで一晩培養した後で実施し、Ｆａｂ産生を、アフィニティークロマトグラフィー及び緩衝液交換によりＦａｂを精製した後で決定した。結果は、表４に示されている。

表示されている通り、野生型（ＴＫＡ）と比較して、Ｃ末端制限部位ＡｆｌＩＩ（ＶＬＳ）、ＮｈｅＩ（ＶＬＡ）、及びＡｖｒＩＩ（ＶＬＧ）を含むシグナル配列は、同じ様な量のＦａｂを発現する。

上記のデータに基づいて、ＮｈｅＩ（ＶＬＡ）制限部位を、重鎖シグナル配列（ｐｈｏＡ）に組み込むために選択した。修飾ＮｈｅＩ（ＶＬＡ）ｐｈｏＡシグナル配列の核酸及びアミノ酸配列は、表５に示されている。

実施例１．３：カッパ及びラムダ軽鎖大腸菌シグナル配列（ｏｍｐＡ）用の制限部位の選択：
実施例１．２に記述した方法に類似した方法を使用して、カッパ及びラムダの両方の軽鎖シグナル配列（ｏｍｐＡ）のＣ末端に組み込むための制限部位を選択した。

表１に示されているコンセンサス配列を既知の制限部位と比較した後で、ｏｍｐＡ Ｃ末端に組み込み、それによりアミノ酸配列も修飾し、後に発現レベルを研究するために、以下の３つの制限部位：ＮｄｅＩ（ＡＹＧ）、ＮｄｅＩ（ＡＹＡ）、及びＢｓｉＷＩ（ＴＹＡ）を選択した。選択された制限部位の配列は、表６に示されている。

対照として、野生型ｏｍｐＡシグナル配列を、発現レベルについて研究した。３個のＣ末端配列を含む野生型ｏｍｐＡシグナル配列の核酸及びアミノ酸配列は、表７に示されている。

発現レベルを評価するために、表６に示されている制限部位をｏｍｐＡシグナル配列に組み込んだ。その結果生じた修飾シグナル配列を使用して、ａ）カッパ１ Ｏ１２（ＩＧＫＶ１−３９）、ｂ）カッパ３ Ｌ６（ＩＧＫＶ３−１１）、又はｃ）ラムダ１ Ｖ１−１３（ＩＧＬＶ１−４０）生殖系遺伝子配列を含むＦａｂ断片を発現させた。これら生殖系遺伝子は、安定しており良好に発現されることが知られているため、選択された。ａ）カッパ１ Ｏ１２（ＩＧＫＶ１−３９）及びｂ）カッパ３ Ｌ６（ＩＧＫＶ３−１１）には、ＣＤＲ−Ｌ３領域：ＱＱＨＹＴＴＰＰＴ（カッパ用）を組み込み、ｃ）ラムダ１ Ｖ１−１３（ＩＧＬＶ１−４０）には、ＣＤＲ−Ｌ３領域：ＱＳＹＤＳＳＬＳＧＶＶ（ラムダ用）を組み込み、ａ）〜ｃ）では、Ｊｋ１生殖系遺伝子配列をＦＲ４としてカッパ軽鎖に使用し、Ｊｌ２／３生殖系遺伝子配列を、ＦＲ４としてラムダ軽鎖に使用した。ａ）表６のＣ末端制限部位を含むｏｍｐＡシグナル配列、ｂ）上述のようにＣＤＲ−Ｌ３及びＦＲ４が組み込まれたカッパ１ Ｏ１２（ＩＧＫＶ１−３９）、ｂ）カッパ３ Ｌ６（ＩＧＫＶ３−１１）、又はｃ）ラムダ１ Ｖ１−１３（ＩＧＬＶ１−４０）のＶＬ生殖系配列、及びｃ）実施例１．２に記述されている重鎖としてＩＧＨＶＨ３−２３ ＴＫＡ構築体を含むｐＭＯＲＰＨＸ１１（図５０に表示）プラスミドを生成した。遺伝子は全て、Ｇｅｎｅａｒｔ社（レーゲンスブルク、ドイツ）で生成された。

発現及び周辺質輸送は、大腸菌で一晩Ｆａｂを産生させ、周辺質抽出し、周辺質抽出後に抗Ｆｄ ＥＬＩＳＡを実施することにより点検した。ＢＢＳ緩衝液を使用した周辺質抽出後の抗Ｆｄ発現ＥＬＩＳＡの結果は、図２に示されている。表示されているように、ＮｄｅＩ（ＡＹＡ）を含むシグナル配列は、野生型（ＡＱＡ）と同等な又はより良好な発現を示す。

加えて、大腸菌でのＦａｂ発現は、振とうフラスコで一晩培養した後で実施し、Ｆａｂ産生は、アフィニティークロマトグラフィー及び緩衝液交換によりＦａｂを精製した後で決定した。結果は、表８に示されている。

上記のデータに基づいて、ＮｄｅＩ（ＡＹＡ）制限部位を、カッパ及びラムダシグナル配列（ｏｍｐＡ）に組み込むために選択した。修飾ＮｄｅＩ（ＡＹＡ）ｏｍｐＡシグナル配列の核酸及びアミノ酸配列は、表９に示されている。

実施例１．４：ファージディスプレイでのシグナル配列によるＦａｂ断片の提示効率の評価
実施例１．２及び１．３に記述されているように、Ｆａｂシグナル配列及びＩｇＧリーダー配列のＣ末端に組み込むために、以下の制限部位を選択した：
重鎖可変領域（ｐｈｏＡ及び重鎖リーダー）：ＮｈｅＩ（ＶＬＡ）
軽鎖可変領域（κ及びλ）（ｏｍｐＡ及びカッパリーダー）：ＮｄｅＩ（ＡＹＡ）

図３は、選択された制限部位及び対応するアミノ酸配列を示す。

これら修飾シグナル配列が、Ｆａｂ断片の効率的な輸送及び産生を媒介することを示すために、ＶＨ、ＶＬ、及びｐＩＩＩ（ファージディスプレイに使用されるファージ外殻タンパク質ｐＩＩＩ）をコードするトリシストロンディスプレイベクターに、選択されたシグナル配列が組み込まれたベクター構築体を生成した。これは、選択されたシグナル配列を含むそのようなベクターが、有用なファージディスプレイ率を提供することができたことを確認するために行った。ＶＨ３−２３若しくはＶＨ１−６９生殖系遺伝子のＶＨ、又はＶＬ１−４０、ＶＫ３−１１、若しくはＶＫ１−３９生殖系遺伝子のＶＬ、並びに選択された重鎖（ｐｈｏＡ）制限部位：ＮｈｅＩ（ＶＬＡ）及び対照としての野生型ｐｈｏＡ（ＴＫＡ）、又は選択された軽鎖（ｏｍｐＡ）制限部位：ＮｄｅＩ（ＡＹＡ）及び対照としての野生型ｏｍｐＡ（ＡＱＡ）を含むｐＪＰｄ１（図４８に表示）トリシストロンベクター構築体を生成した。加えて、同じものを含むｐＭＯＲＰＨ３０（図５１に表示）トリシストロンベクター構築体を、対照として生成した。相対的提示率は、表１０に示されている。

表示されている通り、選択されたシグナル配列が組み込まれたｐＪＰｄ１ベクターは、ｐＭＯＲＰＨ３０ベクターと同等な相対的提示率をもたらし、ハイパーファージをヘルパーファージとしてファージ産生に使用した場合、ｐＭＯＲＰＨ３０ベクターより優れた相対的提示率が検出された。従って、修飾シグナル配列を含むｐＪＰｄ１ベクターは、標的抗原に対する抗体又はそれらの機能的断片のファージディスプレイ選択用に良好に機能するはずである。

実施例１．２〜１．４には、本開示の抗体又はそれらの機能的断片のコレクションを生成、発現、及び提示させるために必要なツールが記述されており、同様に、生殖系タンパク質配列を有するＦＲ１領域を可能にする制限部位を含むシグナル配列及びリーダー配列が記述されており、抗体又はそれらの機能的断片の本開示コレクションを、任意の免疫原に対する抗体を特定するためのファージディスプレイ選択系又は哺乳動物発現系に組み込むのに有用なベクター骨格が記述されている。更に、シグナル配列は、Ｆａｂファージディスプレイ及び発現プラスミド並びに対応するＩｇＧ発現プラスミドの両方との完全な適合性を可能にする制限部位を保持する。

実施例１．５：選択されたＣ末端制限部位を含むＩｇＧ発現用ヒト重鎖及びカッパリーダー配列の試験
大腸菌で発現されるＦａｂから哺乳動物で発現されるＩｇＧ型への容易な切替えを可能にするために、ｏｍｐＡ（ＮｄｅＩ（ＡＹＡ））及びｐｈｏＡ（ＮｈｅＩ（ＶＬＡ））シグナル配列のＣ末端と同じ制限部位を含有し、それにより３個のＣ末端アミノ酸配列の幾つかも修飾されるように、ＩｇＧ軽鎖（ヒトカッパリーダー）及びＩｇＧ重鎖（ヒト重鎖リーダー）のヒトリーダー配列を生成した。

大腸菌に基づくＦａｂ発現プラスミドから哺乳動物ＩｇＧ発現ベクターへのＶＨの移行は、（ａ）ｐｈｏＡシグナル配列のＣ末端に、並びに（ｂ）ヒト重鎖リーダーのＣ末端の対応する位置に配置されている既述のＮｈｅＩ制限部位を使用して実施することができる。これを提供するために、ｐｈｏＡシグナル配列の最後の３個のアミノ酸を修飾し（ＴＫＡからＶＬＡに）、野生型アミノ酸配列（−３〜−１）をＶＬＳから、ｐｈｏＡに適合するＶＬＡに変更することにより、ヒト重鎖リーダーのＣ末端を改造した。

大腸菌に基づくＦａｂ発現プラスミドから哺乳動物ＩｇＧ発現ベクターへのＶＬの移行は、（ａ）ｏｍｐＡシグナル配列のＣ末端に、並びに（ｂ）ヒトカッパリーダーのＣ末端の対応する位置に配置されている既述のＮｄｅＩ制限部位を使用して実施することができる。これを提供するために、ｏｍｐＡシグナル配列の最後の３個のアミノ酸を修飾し（ＡＱＡからＡＹＡに）、野生型アミノ酸配列（−３〜−１）をＡＹＧから、ｏｍｐＡに適合するＡＹＡに変更することにより、ヒトカッパリーダーのＣ末端を改造した。野生型配列及び修飾ヒト重鎖リーダー配列及びヒトカッパリーダー配列は、表１１に示されている。

これら修飾シグナル／リーダー配列が、ヒトＩｇＧ１タンパク質の効率的な輸送及び産生を媒介することを示すために、修飾ヒト重鎖リーダー及び修飾ヒトカッパリーダーを両方とも、全長ヒトＩｇＧ１の哺乳動物発現用のｐＪＰ＿Ｉｇプラスミド（図５２〜５４に表示）にクローニングし、野生型リーダー配列を置換した。修飾リーダー配列、表１２に示されている可変領域遺伝子、及びカッパ又はラムダのいずれかの軽鎖及び重鎖の定常領域を含有するその結果生じた発現ベクターをＨＫＢ１１細胞に形質移入し、プロテインＡクロマトグラフィーを使用することにより、形質移入した数日後に細胞培養上清からヒトＩｇＧ１を精製した。ＩｇＧ１含有量は、精製及び緩衝液交換後に決定した。発現収量は表１２に示されている。

試験した構築体は全て大量のヒトＩｇＧ１を発現し、修飾リーダー配列が発現レベルを維持することを示す。選択された修飾リーダー配列は、（ａ）使用されたベクター系により、高収量のＩｇＧタンパク質をもたらし、（ｂ）原核生物系と哺乳動物系との間で抗体の構成、ベクター、及び発現系を切替えるための完全な適合性を提供し、（ｃ）シグナル／リーダー配列に配置されており、それによりＦＲ１の完全な生殖系配列が維持される。

実施例２：ヒトレパートリーにおいて最も豊富なＶＨ／ＶＬ対の特定
本開示の態様は、ヒト免疫レパートリーに最も豊富に存在する生殖系遺伝子対の生殖系タンパク質配列を含む抗体又はそれらの機能的断片のコレクション又はライブラリーであり、各抗体又はその機能的断片は、それぞれの生殖系タンパク質対の生殖系タンパク質配列を含み、コレクションに組み込むために選択された生殖系タンパク質対は、コレクションから選択された抗体又はそれらの機能的断片の各々が臨床的に開発可能であり、商業的に成功をおさめることになる可能性を増加させる生物物理学的特性を含む。そのようなコレクションを生成するためには、多くの基準を評価しなければならなかった。

一般的に、以下のステップを実施した：ヒト免疫レパートリーに由来する主な生殖系遺伝子対を特定し；ヒト免疫レパートリーに由来する主な生殖系遺伝子対のｃＤＮＡを合成し、種々のベクターバックグラウンドにクローニングし、抗体又はそれらの機能的断片を産生し；主な生殖系遺伝子対の生殖系タンパク質配列を含む抗体又はそれらの機能的断片を機能的に試験して、それらの生物物理学的特性を決定し；及びそれぞれの生殖系タンパク質対を含む抗体又はそれらの機能的断片の生物物理学的特性を比較し；その後生殖系タンパク質対のサブセットを、コレクションに組み込むために選択した。幾つかの実施形態では、選択された生殖系タンパク質対の生殖系タンパク質配列は、スキャフォールドとしての役割を果たす。それら実施形態では、スキャフォールドは、選択された生殖系タンパク質対の生殖系タンパク質配列を含み、ＶＨ及びＶＬは両方とも、少なくともＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、及びＦＲ３にそれぞれの対の生殖系タンパク質配列を含む。特定の実施形態では、ＣＤＲ３は、多様化されていてもよい。特定の実施形態では、ＦＲ４は固定されており、例えばＶＨにはＪＨ４配列を使用することができ、カッパＶＬにはＪｋ１配列を使用することができ、ラムダＶＬにはＪｌ２／３を使用することができる。

実施例２．１：ＶＨ／ＶＬ対生殖系遺伝子使用頻度の決定
ヒト免疫レパートリーに由来する主なＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対を特定するために、公的に入手可能なデータを分析し、ヒトＢ細胞をサンプリングした。第１のステップとして、公的に入手可能なデータを調査して、Ｂ細胞から単離されたＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対を記述している文献を特定した。言及したように、多くの公的に入手可能なデータベースが抗体配列を提供しているが、多くは、可変ドメイン、ＶＨ又はＶＬのいずれかの配列のみを提供しており、ＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対の関連性を提供するものはほとんどない。以下の文献を特定し、詳細に分析した：Ｗａｒｄｅｍａｎｎ Ｈ．ら（２００３年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０１巻、１３７４〜１３７７頁、及びそれを裏付けるあらゆる表；Ｙｕｒａｓｏｖ Ｓ．ら（２００５年）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０１巻、７０３〜７１２頁、及びそれを裏付けるあらゆる表；Ｔｓｕｉｊｉ Ｍ．ら（２００６年）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０３巻、３９３〜４０１頁、及びそれを裏付けるあらゆる表；Ｙｕｒａｓｏｖ Ｓ．ら（２００６年）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０３巻、２２５５〜２２６２頁、及びそれを裏付けるあらゆる表；Ｔｉｌｌｅｒ Ｔ．ら（２００７年）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２６巻、２０５〜２１３頁、及びそれを裏付けるあらゆる表；及びＭｉｅｔｚｎｅｒ Ｂ．ら（２００８年）ＰＮＡＳ １０５巻、９７２７〜９７３２頁、及びそれを裏付けるあらゆる表。

図４〜９は、Ｔｓｕｉｊｉ Ｍ．ら（２００６年）で単離されたＢ細胞のＶＨ／ＶＬ対を示す。

図１０〜１２は、Ｔｉｌｌｅｒ Ｍ．ら（２００７年）で単離されたＢ細胞のＶＨ／ＶＬ対を示す。

図１３〜１７は、Ｍｉｅｔｚｎｅｒ Ｂ．ら（２００８年）で単離されたＢ細胞のＶＨ／ＶＬ対を示す。

図１８〜２０は、Ｗａｒｄｅｍａｎｎ Ｈ．ら（２００３年）で単離されたＢ細胞のＶＨ／ＶＬ対を示す。

図２１〜２３は、Ｙｕｒａｓｏｖ Ｓ．ら（２００５年）で単離されたＢ細胞のＶＨ／ＶＬ対を示す。

図２４〜２６は、Ｙｕｒａｓｏｖ Ｓ．ら（２００６年）で単離されたＢ細胞のＶＨ／ＶＬ対を示す。

追加的なＶＨ／ＶＬ対データを、下述のようにヒトＢ細胞の試料から特定した。

実施例２．２：ヒト試料に由来するＶＨ／ＶＬ対生殖系遺伝子使用頻度の決定
追加的なＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対使用頻度データを取得するために、ＰＢＭＣをヒト宿主から単離した。ＰＢＭＣを選別し、ＰＣＲを使用してＢ細胞のｃＤＮＡを増幅し、Ｂ細胞に由来するＤＮＡを配列決定し、その後、配列をＩｇＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩ）で探索して、各Ｂ細胞に由来するＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対を特定した。

実施例２．２（ａ）：ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の単離及び選別
静脈血からヒトＰＢＭＣを、及び骨髄から単核細胞を単離及び選別する一般的方法は、Ｔｉｌｌｅｒら、ＪＩＭ ２００８年に記述されている。ＰＢＭＣを、以下のように単離した。４０ｍｌの静脈血をヒト供与体から（Ｐａｎｄｅｍｒｉｘ（商標）ワクチン接種（Ｈ１Ｎ１ワクチン、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ社製）の７日後）、４ｘＬｉヘパリン血液採取チューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ社製）に採取した（各１０ｍｌ）。各モノベット（ｍｏｎｏｖｅｔｔｅ）の内容物を、単一の５０ｍｌファルコン（合計４０ｍｌ）中で一緒にし、その後１００μｌのＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）（２．５μｌ／ｍｌ）を添加し、ローターで十分に混合し（５ｒｐｍ）、室温で３０分間インキュベートした。血液／ＲｏｓｅｔｔａＳｅｐの混合物を、等容積の１×ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で希釈した。１５ｍｌのＦｉｃｏｌｌＰａｑｕｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を、新しい５０ｍｌ円錐底チューブに添加し、合計で２０ｍｌの希釈血液を、ＦｉｃｏｌｌＰａｑｕｅの上に層を形成するように加えた（４本のチューブ：各々１５ｍｌのＦｉｃｏｌｌＰａｑｕｅ＋２０ｍｌの血液）。チューブを、室温、４００ｇで（シグマ社製実験室用遠心機で１４００ｒｐｍ）３０分間遠心機で遠心し、ブレーキをかけなかった。遠心分離後、濃縮されたＰＢＭＣは、血漿とＦｉｃｏｌｌＰａｑｕｅとの界面でバンドを形成した。ＰＢＭＣを、ピペットを用いて各チューブから取り除き、新しい５０ｍｌチューブに移し換えた。ＰＢＭＣを、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、３％ＦＣＳ）で４０ｍｌに希釈することにより洗浄し、４０℃、１２５０ｒｐｍで１０分間遠心機で遠心した。ＰＢＭＣを、トリパンブルー（１０μｌ試料＋９０μｌトリパンブルー（ＰＢＳで１：１０に希釈））を用いて計数した。

約５ｍｌの氷冷ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁することにより、ＰＢＭＣを染色した。等量の細胞を染色用に調製した。蛍光体を試験用に調製した。等量を１２５０ｒｐｍ、４℃で遠心し、上清を廃棄した。染色用の抗体を、表１３に記述されているスキームに従って細胞ペレットに添加した。

その後、血球計算器の閉塞を回避するために、細胞をＦＡＣＳチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製）上で細胞ストレーナーに通した。細胞を氷上に置き、暗所で維持した。

細胞を、目的の表現型の細胞表面マーカーにより単一選別した。例えば、抗体分泌細胞は、ＣＤ１９^＋ＣＤ２０^ｌｏｗＣＤ２７^ｈｉＣＤ３８^ｈｉであり、成熟未感作Ｂ細胞は、ＣＤ１９^＋ＣＤ２７^ｎｅｇＣＤ１０^ｎｅｇＩｇＭ^＋である。細胞表面マーカーの存在は、マウス抗ヒト抗体（ＡｂＤ：ＣＤ１９、ＣＤ２７、ＣＤ３８、ＣＤ−２０、及びＣＤ１０）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製：ＩｇＭ）を使用して特定した。細胞は、前方散乱対側方散乱（二重識別を用いた生細胞ゲート）で、４μｌの０．５×ＰＢＳ、１０ｍＭのＤＴＴ、８ＵのＲＮＡｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を含有する単一細胞９６穴ＰＣＲプレート（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製）へと選別した。

ＰＣＲプレートは、表１４に示されているように調製した。

選別した後、各プレートを、マイクロシールホイル（ＢｉｏＲａｄ社製）で直ちに密閉し、ドライアイス上に置いた。細胞選別が完了した後、プレートは全て−８０℃で冷凍した。

実施例２．２（ｂ）：ヒトＢ細胞ＤＮＡのＰＣＲ増幅
ＰＢＭＣを、実施例２．２（ａ）に記述されているように単離及び選別した。その後、単一選別された成熟未感作（ｍｎ）Ｂ細胞及び抗体分泌細胞（ａｓｃ）のＩｇ遺伝子転写物を、ＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対形成体を決定するためにＰＣＲ増幅した。Ｂ細胞のｃＤＮＡをＰＣＲ増幅する一般的方法、及びそれに有用なプライマーは、Ｔｉｌｌｅｒら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２００８年に記述されている。

全体的なＰＣＲ戦略は、図２７に示されている。使用した特異的プライマーは、表１５に示されている。

単一選別された成熟未感作（ｍｎ）Ｂ細胞及び抗体分泌細胞（ａｓｃ）のｃＤＮＡを、以下のように合成した。最初に、ＲＨＰ混合物、ＲＴ混合物、及びＲＴ混合物を氷上で調製した。ＲＨＰ混合物を、以下のもので調製した：１１５μｌの無作為六量体プライマー（Ｒｏｃｈｅ社製）（３００ｎｇ／μｌ）、１１５μｌのＮＰ−４０（Ｓｉｇｍａ社製）（１０％）、３５μｌのＲＮＡｓｉｎ、及び５４２μｌの水。ＲＴ混合物を、以下のもので調製した：６６０μｌの５ｘＲＴ緩衝液、１１０μｌのｄＮＴＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）（各２５ｍＭ）、４５０μｌの水、２２０μｌの０．１Ｍ ＤＴＴ、４４μｌのＲＮＡｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、５５μｌのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ（逆転写酵素）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）。

次に、プレートをドライアイス上に置き、３．５μｌのＲＨＰ混合物を添加した。プレートをホイルで覆い、６８℃の水浴で１分間インキュベートした。その後プレートを、普通の氷上に置いた。その後、７μｌのＲＴ混合物を添加し、ウエルをアルミニウムホイルで塞いだ。ＲＴ増幅プログラムを、以下の温度及び以下の継続時間で実行した：４２℃で５分間、２５℃で１０分間、５０℃で６０分間、９４℃で５分間、及び４０℃を維持。ｃＤＮＡは−２０℃で保管した。

ネステッドＰＣＲを、以下のように実施した。ヒトＩｇＨ、Ｉｇｋ、及びＩｇＬ Ｖ遺伝子転写物を、独立してＰＣＲ増幅した。３．５μｌのｃＤＮＡをテンプレートとして使用した。ＰＣＲ反応は全て、１ウエル当たり４０μｌの全容積の９６穴プレートで実施した。各プレートについて、以下のものを用いて３本の反応チューブを各々準備した：１１５４μｌの水、１５０μｌの１０×緩衝液、１６μｌのｄＮＴＰ、５μｌの５’プライマー混合物、５μｌの３’プライマー、及び７μｌのＨｏｔＳｔａｒ Ｔａｑ（Ｑｉａｇｅｎ社製）。遺伝子特異的プライマー又はプライマー混合物によるネステッドＰＣＲ反応は全て、３．５μｌの未精製第１ＰＣＲ産物を用いて実施した。ＰＣＲの各ラウンドは、表１６に示されているように実施した。

次に、３μｌ等量の第２のＰＣＲを、１ｘＴＢＥ緩衝液中に臭化エチジウムを含有する２％アガロースゲルで、同量のローディング緩衝液を用いて４５分間１５０Ｖで泳動した。ＤＮＡバンドを、紫外線下で視覚化した。予測されたＰＣＲ産物サイズは、Ｉｇγの場合およそ４５０ｂｐ、Ｉｇκの場合５１０ｂｐ、及びＩｇλの場合４０５ｂｐだった。

４μｌのＶＨ、ＶＫ、及びＶＬ ＰＣＲ産物（一致する対応ＶＨ又はＶＬ産物を有する）を、９６穴プレート中で１６μｌのｄｄＨ_２Ｏと混合し、プレート配列決定のために、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎ社、エーバースベルク、ドイツに提出した。配列決定用プライマーは、１０ｐｍｏｌ／μｌ（原液は、５０ｐｍｏｌ／μｌ、１：５希釈）で提供され、表１７に示されている。

配列決定の結果を、ＩｇＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩ）で探索して、図２８Ａ〜Ｃ（２８〜３６）に示されているＶＨ、ＶＫ、及びＶＬ生殖系遺伝子を特定した。

実施例２．３ ヒト免疫レパートリーで特定されたＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対
実施例２．１に記述され、図４〜２６に示されているような、公的に入手可能な文献から特定されたＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対データを、実施例２．２に記述され、図２８〜３６に示されているような、ヒト試料から特定されたデータと統合した。

統合データを分析し、表１８に順位表として、つまりヒト免疫レパートリーで特定されたＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対の濃度（％）の順位表として示されている。

実施例２．４ 「未感作」ヒト免疫レパートリーにおけるＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対使用頻度
加えて、実施例２．１に記述され、図４〜２６に示されているような、公的に入手可能な文献から特定されたＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対データ、及び実施例２．２に記述され、図２８〜３６に示されているような、ヒト試料から特定されたＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対データを含む統合データを、未感作ヒトレパートリーにおける生殖系遺伝子使用頻度を特定するために分析した。未感作で抗原未経験のＢ細胞集団と抗原経験済Ｂ細胞集団を区別することが重要である。未感作で抗原未経験のＢ細胞には、これらに限定されないが、未熟Ｂ細胞、新しく移動してきたＢ細胞、及び成熟未感作Ｂ細胞が含まれ、抗体配列は依然として生殖系である。抗原経験済Ｂ細胞には、これらに限定されないが、ＩｇＧ抗体分泌細胞、並びにＩｇＭ及びＩｇＧ記憶Ｂ細胞が含まれ、大多数の抗体は、体細胞超変異を含む。

様々な生殖系遺伝子対が、未感作で抗原未経験のＢ細胞の２つのＢ細胞集団間で、及び抗原経験済Ｂ細胞集団と比較して、過剰出現すると考えられている。本開示の態様は、任意の免疫原に対する抗体又はそれらの機能的断片を特定するために使用することができる抗体又はそれらの機能的断片のコレクションを生成することであり、従って、未感作で抗原未経験の免疫レパートリーで主に発現されたＶＨ／ＶＬ生殖系タンパク質対を含むコレクションを産生することが好ましい場合がある。

未感作で抗原未経験の免疫レパートリーで主に発現されたＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対を特定するために、実施例２．１に記述され、図４〜２６に示されているような、公的に使用可能な文献からの統合データ、及び実施例２．２に記述され、図２８〜３６に示されているような、ヒト試料から特定されたＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対データを分析して、未熟Ｂ細胞、新しく移動してきたＢ細胞、及び成熟未感作Ｂ細胞の抗原未経験Ｂ細胞集団を、抗原経験済Ｂ細胞集団から分離した。未感作ヒト免疫レパートリーを代表するＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対の順位は、表１９に示されている。

実施例３：ＶＨ及びＶＬ生殖系遺伝子使用頻度の決定
実施例２．３〜４の表１８〜１９を調査することにより、少数のＶＨ、Ｖκ、及びＶλ生殖系遺伝子が、生殖系遺伝子の全数と比較して、ヒト免疫レパートリー及び未感作ヒト免疫レパートリーにおいて優勢であることが示される。Ｗｉｌｄｔらの８９５〜８９６頁にも、この現象が記述されている。Ｗｉｌｄｔらは、高頻度で発現される重鎖及び軽鎖遺伝子セグメントが対を形成することが多いということも述べており、サンプリングされた対形成体の半分は、わずか５つのＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対に対応するに過ぎないことも観察された。

加えて、統合データを評価して、ヒト免疫レパートリーで独立して高度に発現されるＶＨ、Ｖκ、及びＶλ生殖系遺伝子を特定した。従って、実施例２．１に記述され、図４〜２６に示されているような、公的に入手可能な文献から特定されたＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対；実施例２．２に記述され、図２８〜３６に示されているような、ヒト試料から特定されたＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対；及び追加的な参考文献を含み、未対形成ＶＨ及び／又はＶＬ生殖系遺伝子発現が含まれているデータ（Ｂｒｅｚｉｎｓｃｈｅｋ Ｈ．Ｐ．ら、（１９９７年）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９９巻、２４８８頁、Ｄｅｍａｉｓｏｎ Ｃ．ら、（１９９５年）ｌｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ４２巻、３４２頁、及びＦｏｓｔｅｒ ＳＪ．ら、（１９９７年）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９９巻、１６１４頁を参照。これらの文献は両方とも参照によりそれらの全体が組み込まれる）を、どのＶＨ、Ｖκ、及びＶλ生殖系遺伝子がヒト免疫レパートリーの中で最も高度に発現されるかを決定するために、統合して順位付けした。表２０は、ＶＨ、Ｖλ、及びＶκ生殖系遺伝子の出現率の順位を示す。

未結合ＶＨ、Ｖλ、及びＶκ生殖系遺伝子出現率を示す表２０、並びにヒト免疫レパートリー及び未感作ヒト免疫レパートリー内の結合ＶＨ／ＶＬ対生殖系遺伝子出現率を示す表１８〜１９を比較すると、結合又は対形成とは無関係に評価した場合に高度に代表的なＶＨ、Ｖλ、及びＶκ生殖系遺伝子の多くは、ＶＨ／ＶＬ対形成体で評価した場合でも高度に代表的だったことは明らかだった。

この観察は、ヒト免疫レパートリーのＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対を示す図３９〜４０、及び未感作ヒト免疫レパートリーのＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対を示す図４１〜４２に示されているプロットにより確認される。これらの図は、統合データから特定された各ＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対の、マトリックスでプロットされた実際の数を示し、Ｙ軸はＶＨ生殖系遺伝子の順位を含み、Ｘ軸はＶＬ生殖系遺伝子の順位を含む。

実施例４：それらの生物物理学的特性を更に評価するためのＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対形成体の選択
次のステップとして、ヒト免疫レパートリーには約２５００対が存在し、本発明者らの目的は、生殖系タンパク質対のうちのどれが、選択及び開発を支援することになる好ましい生物物理学的特性を含みているかを特定することであったため、どの生殖系タンパク質対を試験すべきかを決定しなければならなかった。１つの方法は、ヒト免疫レパートリーで最も顕著に生じる可変重鎖及び可変軽鎖生殖系タンパク質対を試験することであろう。例えば表１８を参照されたい。例えば、試験用に上位４００対を選択してもよく、又はある閾値濃度を超えて発現された可変重鎖及び可変軽鎖生殖系遺伝子対を選択してもよい。この手法では、多数の可変重鎖及び可変軽鎖生殖系タンパク質対配列の合成及び試験が必要とされることになり、従って、そのような手法は、あまり効率的ではない場合がある。

代替的な手法として、本発明者らは、ヒト免疫レパートリーから顕著に発現された対の大多数を代表するか、正確に再現するか、又は包含する可変重鎖及び可変軽鎖生殖系対のサブセットを選択した。この手法は、少数の可変重鎖、可変κ軽鎖、及び可変λ軽鎖生殖系遺伝子が、ヒト免疫レパートリーにおいて優勢であるという上記の観察に、部分的に基づいていた。従って、少数の顕著に発現された重鎖及び軽鎖生殖系遺伝子（未対形成）を組み合わせて、ヒト免疫レパートリーを代表する一群の対を生成することができる。

この手法は、以下のように行われた。実施例３では、可変重鎖、可変κ軽鎖、及び可変λ軽鎖生殖系遺伝子発現を決定した。次のステップとして、顕著なＶＨ、Ｖλ、及びＶκ生殖系遺伝子のｉｎ ｓｉｌｉｃｏ分析を実施し、少なくとも以下の要因を評価した：ＣＤＲの長さ、等電点（ｐＩ）（好ましい等電点は、標準的なｐＨ５．５〜ｐＨ７製剤緩衝液中での安定性を提供するはずであるため、７．５以上である）、翻訳後修飾（ＰＴＭ）（具体的には、Ｎ−結合グリコシル化部位（ＮｘＳ又はＮｘＴ）又はＡｓｐ切断（多くの場合、ＤＰでの）、Ａｓｐ異性化（ＤＤ、ＤＧ）、脱アミド化（ＮＳ、ＮＧ）等の化学的修飾（これらはｉｎ ｖｉｖｏ（血清中）で又は製剤緩衝液中での保管時に生じる場合があり、抗体結合の喪失に結び付く場合がある）、ＣＤＲにおけるメチオニンの存在（溶媒との接触時に酸化される場合がある）、未対形成システインの存在（任意の他の未対形成システインとジスルフィド結合を形成することになり、従ってタンパク質の架橋及び／又は発現レベルの低下に結び付く）、生殖系からの逸脱、潜在的なＴ細胞エピトープの存在、及び理論上の凝集傾向。ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ分析からの選択されたデータは、図３７〜３８に示されている。

最も顕著なＶＨ、Ｖλ、及びＶκ生殖系遺伝子のｉｎ ｓｉｌｉｃｏ分析に基づいて、これらのサブセットを、合成、組み合わせ、及びその後の機能性試験のために選択し、このサブセットは図３７〜３８に示されている。表示されている通り、最も顕著なＶＨ、Ｖλ、及びＶκ生殖系遺伝子の全てが、更なる試験のために選択されるとは限らなかった。表２０に示されているように、最も顕著なＶＨ生殖系遺伝子のうち、ＩＧＨＶ４−３４、ＩＧＨＶ４−５９、及びＩＧＨＶ３−９は選択しなかった。その代りに、図３７〜３８及び表２１に示されているように、ＩＧＨＶ３−７４、ＩＧＨＶ３−７３、及びＩＧＨＶ６−１を選択した。合計で、２０個のＶＨ生殖系遺伝子を選択した。表２０に示されているように、最も顕著なＶκ生殖系遺伝子のうち、ＩＧＫＶ４−１、ＩＧＫＶ２−２８／２Ｄ−２８、ＩＧＫＶ１−３３／１Ｄ−３３、及びＩＧＫＶ１−８は選択しなかった。合計で、１２個のＶκ生殖系遺伝子を選択した。表２０に示されているように、最も顕著なＶＨ生殖系遺伝子のうち、ＩＧＬＶ１−４４は選択しなかった。合計で、８個のＶλ生殖系遺伝子を選択した。

表２１もまた、ヒト免疫レパートリーに由来するＶＨ、Ｖκ、及びＶλ生殖系遺伝子使用頻度の順位を示し、更なる機能性試験のために選択された生殖系遺伝子は太字及び下線で示されている。

実施例４．１：ヒト免疫レパートリーで最も顕著なＶＨ／ＶＬの代表をもたらす豊富なＶＨ、Ｖκ、及びＶλ生殖系遺伝子の組換え
上記で考察されているように、並びに表２１及び図３９〜４０、４１〜４２に示されているように、組み合わせた場合に、ヒト免疫レパートリー及び未感作ヒト免疫レパートリーに由来する顕著に発現されたＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対の大多数を正確に再現又は包含するように、２０個のＶＨ、１２個のＶκ、及び８個のＶλを選択した。

次のステップとして、ＶＨ、Ｖκ、及びＶλ生殖系遺伝子から選択された２０個のＶＨ、１２個のＶκ、及び８個のＶλを合成し、組み合わせて、ヒト免疫レパートリーで顕著に発現されたＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対の大多数を正確に再現又は包含する４００個のＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対を生成した。その後、４００個のＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対を、それらの生物物理学的特性について試験した。

表２２は、４００個のＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対を生成するために組み合わせた、選択されたＶＨ、Ｖκ、及びＶλ生殖系遺伝子を示す。

機能性試験のために生成された４００個のＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対が、実際に、ヒト免疫レパートリーで顕著に発現されたＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対の大多数を正確に再現又は包含することを示すために、表１８を、表２３として下記にもう一度示し、表２３では、試験した４００個のＶＨ／ＶＬ対は、太字及び下線で示されている。

実施例４．２
実施例２．４で考察されているように、未感作で抗原未経験のＢ細胞集団と抗原経験済Ｂ細胞集団を区別することが重要であると考えられた。従って、未感作ヒト免疫レパートリーで特定されたＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対の順位を示す表１９を、表２４として下記にもう一度示し、表２４では、更なる機能性試験のために合成及び組み合わされた４００個のＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対は、太字及び下線で示されている。

実施例５：機能分析のための生殖系遺伝子の産生
次のステップとして、表２５に示されているような、組み合わせ及びその後の試験のために選択されたＶＨ、Ｖλ、及びＶκ生殖系遺伝子を、大腸菌発現についてのコドン最適化（哺乳動物発現には中立的）及び合成のために、Ｇｅｎｅａｒｔ社（レーゲンスブルク、ドイツ）に送付した。

ＶＨ、Ｖλ、及びＶκ生殖系遺伝子の各々の生殖系遺伝子配列は、図４５〜４７に示されている。各生殖系遺伝子配列を、以下のものを含むように合成した：
ａ）ＶＨの場合：リーダー配列（図３に示されているようなＮｈｅＩ制限部位が組み込まれた修飾ｐｈｏＡシグナル配列）；生殖系ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、及びＦＲ３（図３に示されているようなＢｓｓＨＩＩ制限部位が組み込まれている）；Ｅｗｅｒｔ Ｓ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００３年）３２５巻、５３１〜５５３頁で使用されているような４Ｄ５抗体のＣＤＲ−Ｈ３（ＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹ）；及びＪＨ４ ＦＲ４（図３に示されているようなＸｈｏＩ／ＳａｌＩ制限部位が組み込まれている）；
ｂ）Ｖκの場合：リーダー配列（図３に示されているようなＮｄｅＩ制限部位が組み込まれた修飾ｏｍｐＡシグナル配列）；生殖系ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、及びＦＲ３（図３に示されているようなＢｂｓＩ制限部位が組み込まれている）；Ｅｗｅｒｔ Ｓ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００３年）３２５巻、５３１〜５５３頁によるカッパ様ＣＤＲ−Ｌ３（ＱＱＨＹＴＴＰＰＴ）；及びＪｋ１ ＦＲ４（図３に示されているようなＫｐｎＩ制限部位が組み込まれている）；
ｃ）Ｖλの場合：リーダー配列（図３に示されているようなＮｄｅＩ制限部位が組み込まれた修飾ｏｍｐＡシグナル配列）；生殖系ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、及びＦＲ３（図３に示されているようなＢｂｓＩ制限部位が組み込まれている）；Ｅｗｅｒｔ Ｓ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００３年）３２５巻、５３１〜５５３頁によるラムダ様ＣＤＲ−Ｌ３（ＱＳＹＤＳＳＬＳＧＶＶ）；及びＪｌ２／３ ＦＲ４（図３に示されているようなＫｐｎＩ制限部位が組み込まれている）。

実施例６：ヒト免疫レパートリーを代表するＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対の機能性試験
その後４００個のＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対を、以下の機能的特性に関して試験した：ａ）ファージ産生及びファージＥＬＩＳＡ後のＦａｂ型の相対的提示；ｂ）大腸菌でＦａｂを産生させ、大腸菌細胞を溶解し、産生されたＦａｂをＥＬＩＳＡで検出した後の相対的Ｆａｂ発現レベル；ｃ）大腸菌でＦａｂを産生させ、大腸菌細胞を溶解し、高温でインキュベーションした後で非変性ＦａｂをＥＬＩＳＡで検出した後のＦａｂの温度安定性；ｄ）ウシ／マウス血清中でインキュベーションした後で非変性ＦａｂをＥＬＩＳＡで検出することによる、大腸菌溶解産物由来のＦａｂのウシ／マウス血清安定性；ｅ）哺乳動物細胞でＩｇＧ１を産生させ、細胞培養上清由来の分泌ＩｇＧ１をＥＬＩＳＡで検出した後の相対的ヒトＩｇＧ１発現レベル；及びｆ）ウシ／マウス血清中でインキュベーションした後で非変性ＦａｂをＥＬＩＳＡで検出することによるヒトＩｇＧ１のウシ血清安定性。

実施例６．１：機能的特徴付けのためのファージで提示されたＦａｂ貯留の産生
表２５に示されているような、実施例５で合成された抗体又は抗体断片を、機能性試験のためにトリシストロンＦａｂディスプレイベクターｐＪＰｄ１（図４８）にクローニングした。４００通りの組み合わせをもたらし、表１８及び図３９〜４０に示されているような、ヒト免疫レパートリーに由来する最も顕著なＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対の圧倒的大多数を代表するマスター遺伝子の各々の組み合わせ、８個のＶλ及び１２個のＶκと組み合された２０個のＶＨを含有していたＦａｂ貯留を生成した。

上記の遺伝子対を含むファージを、９６穴プレートを使用して小規模で産生させた。ウエルの各々に２ｘＹＴ／ＣＡＭ／ＴＥＴ／Ｇｌｕｃ培地を充填することによりマスタープレートを生成し、４００通りのＶＨ／ＶＬ組み合わせに由来するクローンを播種し、ｐＭＯＲＰＨ３０＿Ｖｋ３−１１＿ＡＱＡ／ＶＨ３−２３＿ＴＫＡ又はｐＭＯＲＰＨ３０＿Ｖｋ３−１１＿ＡＹＡ／ＶＨ３−２３＿ＶＬＡ（ｐＭＯＲＰＨ３０は図５１に示されている）を対照として使用した。プレートを３７℃で振とうしながら一晩インキュベートした。マスタープレートを、１５％グリセロールの終濃度で保管し、−８０℃で冷凍した。

２ｘＹＴ／ＣＡＭ／ＴＥＴ／Ｇｌｕｃを培地として使用し、上述のマスタープレートに由来するクローンを播種して、ファージ産生のための追加的な９６穴プレートを生成した。ＯＤ６００ｎｍが約０．５に到達するまで、プレートを、３７℃で約２〜４時間４００ｒｐｍで振とうしながらインキュベートした。

プレートを、１ウエル当たり５μｌのヘルパーファージに感染させた（ハイパーファージ；ＰＲＯＧＥＮ社製；１×１０１２ｐｆｕ／ｍｌ）。プレートを、３７℃で振とうさせずに４５分間インキュベートし、その後４００ｒｐｍで振とうさせながら６０分間インキュベートした。細菌を、４０℃で５分間２２００ｇで遠心沈降させた。

ヘルパーファージを含有する上清を廃棄し、感染大腸菌ペレットを、無グルコースの２ｘＹＴ／Ｃａｍ／ＴＥＴ／Ｋａｎ／ＩＰＴＧで再懸濁した。再懸濁したペレットを、２ｘＹＴ／Ｃｍ／ＴＥＴ／Ｋａｎ／ＩＰＴＧが予め満たされていた新しい９６深穴プレートに移した。プレートを、２２℃で振とうしながら一晩インキュベートした。大腸菌細胞及び残屑を遠心沈降して廃棄することにより、ファージを含有する上清を回収した。

実施例６．２：ＥＬＩＳＡを使用したＦａｂファージ提示順位の評価
実施例６．１に記述されているように調製したファージ上清を、ファージＥＬＩＳＡでＦａｂファージ提示を順位付けするために使用した。 Ｆａｂ断片の提示を、２つの異なる捕捉抗体を使用したファージＥＬＩＳＡで評価した：
（１）抗Ｍ１３抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製 ＃２７−９４２０−０１）を、主要外殻タンパク質ｇ８ｐによるファージ粒子の捕捉に使用した；従ってファージ力価を決定することができる。
（２）提示されたＦａｂに結合する抗Ｆｄ抗体（Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ社製 ＃ＰＣ０７５）を使用した；従ってマスター遺伝子を含むファージを提示するＦａｂのみが捕捉される。

抗Ｍ１３抗体の場合は、７．５μｇ／ｍｌ濃度の１００μｌ抗体溶液を、及び抗Ｆｄ抗体の場合は、１．０μｇ／ｍｌ濃度の１００μｌ抗体溶液を別々のウエルに分注し、積層ホイルでプレートを密閉し、４℃で一晩インキュベートすることにより、それぞれの捕捉抗体を黒色９６穴ウェルＭａｘｉｓｏｒｐ（商標）プレートに固定化した。翌日に、プレートをＴＢＳＴで２回洗浄し、各ウエルを、３００μｌのＣＴＢＳＴで１時間室温にてブロッキングした。

ファージ上清及び参照試料の両方を、以下のように検出のために移し換えた。ブロッキングしたＥＬＩＳＡプレートを、ＴＢＳＴで２回洗浄した。ＣＴＢＳＴで適切に希釈された１００μｌのファージ上清を、希釈プレートからコーティングされたＥＬＩＳＡプレートに移し換え、室温で１〜２時間インキュベートし、ＴＢＳＴで５回洗浄した。ＣＴＢＳＴで１：５０００に希釈された１００μｌ／ウエルの抗Ｍ１３ペルオキシダーゼ結合体（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を添加し、室温で１〜２時間インキュベートした。Ｑｕａｎｔａ Ｂｌｕ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）作業用溶液を、１部（例えば、０．５ｍｌ）のペルオキシド溶液と９部（例えば、４．５ｍｌ）の基質溶液と混合することにより調製し、それを少なくとも３０分間室温に平衡化させた。ＥＬＩＳＡプレートをＴＢＳＴで５回洗浄し、１００μｌ／ウエルのＱｕａｎｔａＢｌｕ作業用溶液を添加した。約２分間のインキュベーション時間後に、及びその後は５分間隔で、蛍光（励起：３２０ｎｍ、発光：４３０ｎｍ）を測定した。

ＥＬＩＳＡデータの評価は以下のように実施した：ＨｕＣＡＬ ＧＯＬＤ基準ファージ調製物（ＶＨ３カッパ＋ラムダ）を使用することにより検量線を作成し、ファージ上清及び対照の力価を計算した。各試料について、抗Ｆｄに対する力価を、抗Ｍ１３（抗ｐＶＩＩＩ）に対する力価で除算し、その結果生じた比率が、相対的提示率である。

Ｆａｂの相対的提示率は、公的に入手可能ではない内部標準物（ＨｕＣＡＬ ＧＯＬＤファージ調製物ＶＨ３カッパ＋ラムダ）を使用して計算されたため、相対的提示率は、順位として評価した。相対的提示値を順位付けすることにより、当業者であれば、任意の対照を使用して上記の方法を再現することができる。例えば、各生殖系タンパク質対は、対照に対する量を示す。従って、本発明者らの対照と比較して最も高い相対的提示率を有する生殖系タンパク質対も、具体的な相対的提示率は異なる可能性が高いだろうという事実にもかかわらず、任意の対照と比較して最も高い相対的提示率を示すだろう。従って、図５５に示されており、表３２にも示されている相対的提示データを使用して値の順位表を作成し、その順位表では、データを最高値から最低値に順位付けした。この順位表は、表２６に示されている。この表から、サンプリングしたＦａｂの上位１０％、２０％、３０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、及び９０％以内の相対的提示率を含む生殖系タンパク質対を特定することができる。

具体的には、試験した４００対から、１９６対の相対的提示値を得た。表２６を参照されたい。従って、当業者であれば、どの生殖系タンパク質対が、サンプリングしたＦａｂの上位１０％、２０％、３０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、又は９０％以内にあるかを正確に決定することができる。例えば、上位７５％には、表２６の１〜１４７番に順位付けられた生殖系タンパク質対が含まれている。

図５５は、４００個のＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対のほとんどの相対的提示率を示す。

実施例６．３：大腸菌溶解産物中のＦａｂ発現レベルを決定するための、４００個のＶＨ／ＶＬ組み合わせのスクリーニングＥＬＩＳＡ
マスタープレート（ＭＰ）は、Ｆａｂ発現ベクターｐＪＰｘ１（図４９に表示）にあるＶＨ／ＶＬ組み合わせの貯留により形質転換されたクローンを選択し、ウエル毎に２ＹＴ／Ｃａｍ／１％Ｇｌｕｃ培地に入れることにより播種した。プレートを、３７℃で振とうしながら一晩インキュベートした。発現プレート（ＥＰ）は、ＭＰからの２．５μｌの培養物をウエル毎に２ＹＴ／Ｃａｍ／０．１％グルコースに入れて播種した。対照（表２７を参照）は、グリセロール原液から播種した。これらプレートを、３７℃で６時間インキュベートし、振とうし、その後Ｆａｂ発現を、ＩＰＴＧを添加することにより誘導し、振とうしながら一晩２２℃でインキュベートした。大腸菌細胞溶解産物を、ホウ酸／ＥＤＴＡ／リゾチーム緩衝液をＥＰに添加することにより産生し（２２℃で１時間のインキュベーション、振とう）、その後細菌溶解産物を１２．５％のＭＰＢＳＴでブロッキングし、少なくとも３０分間室温で振とうした。発現プレートからの大腸菌溶解産物を、０．５％のＭＰＢＳで適切に希釈し、次のアッセイで使用した。

表２７は、使用した未標識コーティング抗体及びＡＰ標識検出抗体を示す。

表２８には、使用した対照が記述されている。

スクリーニングＥＬＩＳＡは、以下のステップを含んでいた：ＭａｘｉＳｏｒｐプレートの３８４個のウエルを、ＰＢＳで希釈された抗ヒトＩｇＧ Ｆｄ特異的抗体でコーティングするステップ、及び４℃で一晩インキュベートするステップ。翌日、プレートをＰＢＳＴで２回洗浄し、各ウエルに（ＰＢＳ中５％の粉乳）を添加し、振とうしながら室温で１〜２時間インキュベートすることによりブロッキングした。その後プレートをＰＢＳＴで再び洗浄し、０．５％のＭＰＢＳで希釈されたブロッキング済の大腸菌溶解産物を添加し、振とうしながら室温で１時間インキュベートした。対照＃３及び＃５も添加した。その後プレートをＰＢＳＴで洗浄し、ＡＰ標識検出抗体を、０．５％のＭＰＢＳで希釈した。希釈した検出抗体を添加し、その後ゆっくりと振とうさせながら室温で１時間インキュベートした。シグナルは、以下のようにして特定した：ウエルをＴＢＳＴで洗浄し、２０μｌのＡｔｔｏＰｈｏｓ（ｄｄＨ２Ｏで１：５に希釈）を添加し、Ｔｅｃａｎ社製（ｉｎｆｉｎｉＴｅ Ｆ２００型）プログラムＰｒｉｍｅＳｃｒｅｅｎを使用して、５分及び７〜８分の時点で測定した。

相対的Ｆａｂ発現レベルは、基準Ｆａｂ ｐＭｘ１１＿ＦＨ ＶＨ１−６９ ＶＬＡ＿Ｖｌ１−４０ ＡＹＡのＥＬＩＳＡシグナルにより、それぞれのＶＨ／ＶＬ対のＥＬＩＳＡシグナルを除算することにより計算する。これにより、同様に高いＥＬＩＳＡシグナルは、相対的Ｆａｂ発現レベルが１という結果となる。基準Ｆａｂは、以下を含むｐＭＯＲＰＨＸ１１プラスミド（図５０に表示）で発現される：ａ）Ｃ末端ＮｈｅＩ制限部位を含む修飾ｐｈｏＡ重鎖シグナル配列；ｂ）Ｃ末端ＮｄｅＩ制限部位を含む修飾ｏｍｐＡ軽鎖シグナル配列；ｃ）図４５Ａに示されているようなＶＨ１−６９＊０１生殖系遺伝子の可変重鎖生殖系タンパク質配列；ｄ）図４７Ａに示されているようなＩＧＬＶ１−４０生殖系遺伝子の可変軽鎖生殖系タンパク質配列；ｅ）ｈｕ４Ｄ５−８抗体のＣＤＲ−Ｈ３（ＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹ）及び重鎖ＦＲ４のＪＨ４生殖系タンパク質配列が組み込まれていること；ｆ）ＣＤＲ−Ｌ３領域（ＱＳＹＤＳＳＬＳＧＶＶ）及び軽鎖ＦＲ４のＪｌ２／３生殖系タンパク質配列が組み込まれていること。ｈｕ４Ｄ５−８は、Ｃａｒｔｅｒ Ｐ．ら、（１９９２年）”Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉ−ｐ１８５Ｈｅｒ２ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９巻、４２８５〜４２８９頁）に記述されている。遺伝子は全て、Ｇｅｎｅａｒｔ社（レーゲンスブルク、ドイツ）で生成された。

結果は、表５６に示されている。

実施例６．４：ＢＥＬ溶解産物中のＦａｂの温度安定性を決定するための、４００個のＶＨ／ＶＬ組み合わせのスクリーニングＥＬＩＳＡ
発現プレートを、実施例６．３のように生成した。発現プレートからの希釈大腸菌溶解産物を、様々な温度で４５分間インキュベートし、次のアッセイで使用した。

表２９は、使用した未標識コーティング抗体及びＡＰ標識検出抗体を示す。

スクリーニングＥＬＩＳＡは、以下のステップを含んでいた：ＭａｘｉＳｏｒｐプレートの３８４個のウェルを、ＰＢＳで希釈されたコーティング抗体（上記の表を参照）でコーティングした。プレートを、４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートをＰＢＳＴで洗浄し、各ウエルに５％ＭＰＢＳを添加し、振とうしながら室温で１〜２時間インキュベートすることによりブロッキングした。その後、発現プレートからの希釈大腸菌溶解産物を、４つの９６穴ＰＣＲプレートに分注し（各々約４０μｌ）、各温度で４５分間、ＰＣＲサイクラーで様々な温度（４℃（氷上）、６０℃、７０℃、８０℃、その後氷上）にかけた。ブロッキングされた３８４穴プレートをＰＢＳＴで洗浄し、その後事前インキュベートされたＦａｂ溶解産物をプレートに添加した。その後プレートを、室温で振とうしながら１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで洗浄し、ＡＰ標識検出抗体を、０．５％のＭＰＢＳで希釈した。２０μｌ／ウエルの希釈検出抗体を添加し、ゆっくりと振とうさせながら室温で１時間インキュベートした。シグナルは、以下のように特定した：ウエルをＴＢＳＴで洗浄し、全てのウエルにＡｔｔｏＰｈｏｓ（ｄｄＨ２Ｏで１：５に希釈）を添加した。シグナルは、様々な時点で（５分〜１０分）、Ｔｅｃａｎ社製（ｉｎｆｉｎｉＴｅ Ｆ２００型）プログラムＰｉｍｅＳｃｒｅｅｎを使用して測定した。

結果は、表５７に示されている。

実施例６．５：大腸菌溶解産物中のＦａｂの血清安定性を決定するための、４００個のＶＨ／ＶＬ組み合わせのスクリーニングＥＬＩＳＡ
発現プレートを、実施例６．３のように生成した。Ｆａｂ含有大腸菌溶解産物を、以下のステップを使用してウシ及びマウス血清で希釈及びインキュベートした：発現プレートからの大腸菌溶解産物を５０％血清（全容積は１００μｌ）で希釈し、１：１０００のＣａｍを添加して細菌増殖を防止し、溶解産物を、２つの９６穴プレートに分割し、プレートを両方とも冷凍した。第１のプレートを解凍し、１２〜１３日間３７℃でインキュベートした。第２のプレートは、ＥＬＩＳＡを実施するまで−８０℃で保管した（３７℃でのインキュベーション０日）。

表３０は、使用した未標識コーティング抗体及びＡＰ標識検出抗体を示す。

１１又は１２日目に、ＭａｘｉＳｏｒｐプレートの３８４個のウエルを、ＰＢＳ希釈された２０μｌのコーティング抗体でコーティングした。プレートを、４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートをＰＢＳＴで洗浄し、各ウエルに５％ＭＰＢＳを添加し、振とうしながら室温で１〜２時間インキュベートすることによりブロッキングした。その後、ブロッキングされた３８４穴ウエルプレートを、ＰＢＳＴで洗浄した。−８０℃及び３７℃試料からの血清中大腸菌溶解を、コーティングされたＥＬＩＳＡプレートに移し、振とうさせながら室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで洗浄し、ＡＰ標識検出抗体を、０．５％のＭＰＢＳで希釈した。ＡＰ標識検出抗体を添加し、その後プレートを、振とうさせながら室温で１時間インキュベートした。シグナルは、以下のように特定した：ウエルをＴＢＳＴで洗浄し、全てのウエルにＡｔｔｏＰｈｏｓ（ｄｄＨ２Ｏで１：５に希釈）を添加した。シグナルは、様々な時点で（５分〜１０分）、Ｔｅｃａｎ社製（ｉｎｆｉｎｉＴｅ Ｆ２００型）プログラムＰｒｉｍｅＳｃｒｅｅｎを使用して測定した。

ウシ血清安定性試験の結果は、図５８に示されている。

マウス血清安定性試験の結果は、図５９に示されている。

実施例７：生物物理学的特性を評価するためのＩｇＧの産生
４００個のＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対を産生する場合、２０個の可変領域重鎖遺伝子を、図５２に示されているヒトＩｇＧ１発現ベクターｐＪＰ＿ｈＩｇＧ１にサブクローニングした。同時に、１２個の可変領域カッパ遺伝子を、図５３に示されている哺乳動物カッパ軽鎖発現ベクターｐＪＰ＿ｈＩｇｋａｐｐａにサブクローニングし、８個の可変領域ラムダ遺伝子を、図５４に示されている哺乳動物ラムダ軽鎖発現ベクターｐＪＰ＿ｈＩｇｌａｍｂｄａにサブクローニングした。

各々重鎖及び軽鎖発現プラスミドを同時形質移入することにより、４００個のＶＨ／ＶＬ対全てを、単に４０個の発現構築体をクローニングすることにより別々に産生させることができる。従って、２０個の重鎖構築体全てを、軽鎖発現構築体の各々を用いてＨＥＫ．ＥＢＮＡ細胞に同時形質移入した。ヒトＩｇＧ１を、形質移入の数日後に細胞培養上清から回収又は検出した。

実施例７．１：ＩｇＧ発現順位
ライブラリーに含めるべきＶＨ／ＶＬ対形成体の選択基準の１つは、４００個の異なるＶＨ／ＶＬ対形成体のＩｇＧ型での発現レベルである。ヒトＩｇＧ１型の各ＶＨ／ＶＬ対形成体の発現レベルを、サンドイッチＥＬＩＳＡにより評価した。従って、ヒトＩｇＧ１型の４００個のＶＨ／ＶＬ組み合わせ全てを、ＨＥＫ．ＥＢＮＡ細胞に形質移入し、小規模で発現させた。細胞培養上清を数日後に回収し、ＩｇＧレベルを評価した。

以下の手順を実施した。３８４穴ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）プレートを、ＰＢＳ中２．５μｇ／ｍｌのＦｃγ−ｐａｎ Ｒ１０Ｚ８Ｅ９マウス抗ヒトＩｇＧでコーティングした。プレートを、４℃で一晩インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで洗浄した。プレートを、ＰＢＳＴ中５％のＢＳＡ又は１×Ｃｈｅｍｉｂｌｏｃｋｅｒでブロッキングし、振とうさせながら室温で１時間インキュベートし、再びＰＢＳＴで洗浄した。ＩｇＧ発現上清を、２．５％ＢＳＡ−ＰＢＳＴで希釈し、希釈試料を、ブロッキング及び洗浄されたＥＬＩＳＡプレートに添加した。以下の対照を使用した：何も入っていない上清、並びに低発現抗体、中程度発現抗体、及び高発現抗体を有する上清。プレートを、室温で振とうしながら２時間インキュベートした。その後プレートをＴＢＳＴで洗浄した。１％ＢＳＡ−ＴＢＳＴで適切に希釈されたＦｃγ−ｐａｎ Ｒ１０Ｚ８Ｅ９マウス抗ヒトＩｇＧビオチン結合体を添加した。プレートを、室温で１時間インキュベートした。プレートをＴＢＳＴで洗浄した。０．５％ＢＳＡ−ＴＢＳＴで１：２０００に希釈されたストレプトアビジン−ＡＰを添加し、プレートを、振とうさせながら室温で１時間インキュベートした。プレートをＴＢＳＴで洗浄した。使用前にＴＢＳＴで直接的に希釈されたＡｔｔｏＰｈｏｓ（商標）蛍光基質（製造業者の説明書に従って調製した）を添加した。５及び１０分後に、Ｔｅｃａｎ社製マイクロプレートリーダで蛍光を測定した。

相対的ＩｇＧ１発現レベルを、基準ＩｇＧ１ ＭＯＲ０３０８０（表３１に表示）のＥＬＩＳＡシグナルにより、それぞれのＶＨ／ＶＬ対のＥＬＩＳＡシグナルを除算することにより計算した。これにより、同様に高いＥＬＩＳＡシグナルは、相対的ＩｇＧ発現レベルが１となる結果となる。

結果は、図６０に示されている。

実施例７．２：ＩｇＧ１血清安定性順位
ライブラリーに含めるべき可変重鎖及び可変軽鎖対形成体の選択基準の１つは、４００個の異なる可変重鎖及び可変軽鎖対形成体のＩｇＧ型の血清安定性である。各ＩｇＧ抗体上清の血清安定性は、５０％マウス血清中で１４日間インキュベーションし、その後マウス抗ヒトＩｇＧ（ＣＨ２）クローンＲ１０Ｚ８Ｅ９を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより評価した。従って、ヒトＩｇＧ１型の４００個のＶＨ／ＶＬ組み合わせ全てを、ＨＥＫ．ＥＢＮＡ細胞に形質移入し、小規模で発現させた。細胞培養上清を数日後に回収し、上清中のＩｇＧを血清安定性に関して試験した。

以下の手順を実施した。３８４穴ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）プレートを、ＰＢＳ中２．５μｇ／ｍｌのＦｃγ−ｐａｎ Ｒ１０Ｚ８Ｅ９マウス抗ヒトＩｇＧでコーティングした。プレートを、４℃で一晩インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで洗浄し、その後５％ＢＳＡ−ＰＢＳＴ又は１×Ｃｈｅｍｉｂｌｏｃｋｅｒを用いて室温で振とうさせながら１時間ブロッキングした。プレートをＰＢＳＴで洗浄した。ＩｇＧ１含有細胞培養上清を、ａ）２．５％ＢＳＡ−ＰＢＳＴ及びｂ）５０％マウス血清で希釈し、３７℃で少なくとも１４日間インキュベートし、これら試料を、ブロッキング及び洗浄されたＥＬＩＳＡプレートに添加した。以下の対照を使用した：何も入っていない上清、並びに低発現抗体、中程度発現抗体、及び高発現抗体を有する上清。プレートを、室温で振とうしながら２時間インキュベートした。プレートをＴＢＳＴで洗浄した。１％ＢＳＡ−ＴＢＳＴで０．８μｇ／ｍｌに希釈されたＦｃγ−ｐａｎ Ｒ１０Ｚ８Ｅ９マウス抗ヒトＩｇＧビオチン結合体を添加した。プレートを、室温で振とうしながら１時間インキュベートした。プレートをＴＢＳＴで洗浄した。０．５％ＢＳＡ−ＴＢＳＴで１：２０００に希釈されたストレプトアビジン−ＡＰを添加した。プレートを、室温で振とうしながら１時間インキュベートした。プレートをＴＢＳＴで洗浄した。使用前にＴＢＳＴで直接的に１：５に希釈されたＡｔｔｏＰｈｏｓ（商標）蛍光基質（製造業者の説明書に従って調製した）を添加した。５及び１０分後に、Ｔｅｃａｎ社製マイクロプレートリーダで蛍光を測定した。

結果は、図６１に示されている。

実施例８：コレクション組み込むための、好ましい生物物理学的特性を有するＶＨ／ＶＬ対の選択
４００個のＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対を、以下の特性：ａ）ファージ産生及びファージＥＬＩＳＡ後のＦａｂ型の相対的提示；ｂ）大腸菌でＦａｂを産生させ、大腸菌細胞を溶解し、産生されたＦａｂをＥＬＩＳＡで検出した後の相対的Ｆａｂ発現レベル；ｃ）大腸菌でＦａｂを産生させ、大腸菌細胞を溶解し、高温でインキュベーションした後で非変性ＦａｂをＥＬＩＳＡで検出した後のＦａｂの温度安定性；ｄ）ウシ／マウス血清中でインキュベーションした後で非変性ＦａｂをＥＬＩＳＡで検出することによる、大腸菌溶解産物由来のＦａｂのウシ／マウス血清安定性；ｅ）哺乳動物細胞でＩｇＧ１を産生させ、細胞培養上清由来の分泌ＩｇＧ１をＥＬＩＳＡで検出した後の相対的ヒトＩｇＧ１発現レベル；及びｆ）ウシ／マウス血清中でインキュベーションした後で非変性ＦａｂをＥＬＩＳＡで検出することによるヒトＩｇＧ１のウシ血清安定性に関して試験したら、次のステップは、どのＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対をコレクションに組み込むべきかを選択することだった。

ＶＨ／ＶＬ生殖系タンパク質対に関する機能性試験の結果は、表３２に示されている。

前述の例に記述されているように、優勢なＶＨ及びＶＬ生殖系遺伝子、及び優勢なＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対を、ヒト免疫レパートリー及び未感作ヒト免疫レパートリーから特定し、その後好ましい生物物理学的特性を有する可変重鎖及び可変軽鎖生殖系タンパク質配列選択するために、優勢なＶＨ及びＶＬ生殖系タンパク質配列をｉｎ ｓｉｌｉｃｏで分析した。表２１及び図３７〜３８に一般的に示されているように、上位２０個のＶＨ、上位８個のＶλ、及び上位１２個のＶκを、合成、組み合わせ、及びその後の機能分析のために選択した。生殖系遺伝子配列を合成し、その後、可変領域の各々が、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで特定されたように好ましい生物物理学的特性を有する、免疫レパートリーに見出される豊富な生殖系遺伝子対を代表する４００個の生殖系タンパク質対を生成するために組み合わせた。４００個のＶＨ／ＶＬ生殖系遺伝子対を、以下の機能的特性に関して試験した：ａ）ファージ産生及びファージＥＬＩＳＡ後のＦａｂ型の相対的提示；ｂ）大腸菌でＦａｂを産生させ、大腸菌細胞を溶解し、産生されたＦａｂをＥＬＩＳＡで検出した後の相対的Ｆａｂ発現レベル；ｃ）大腸菌でＦａｂを産生させ、大腸菌細胞を溶解し、高温でインキュベーションした後で非変性ＦａｂをＥＬＩＳＡで検出した後のＦａｂの温度安定性；ｄ）ウシ／マウス血清中でインキュベーションした後で非変性ＦａｂをＥＬＩＳＡで検出することによる、大腸菌溶解産物由来のＦａｂのウシ／マウス血清安定性；ｅ）哺乳動物細胞でＩｇＧ１を産生させ、細胞培養上清由来の分泌ＩｇＧ１をＥＬＩＳＡで検出した後の相対的ヒトＩｇＧ１発現レベル；及びｆ）ウシ／マウス血清中でインキュベーションした後で非変性ＦａｂをＥＬＩＳＡで検出することによるヒトＩｇＧ１のウシ血清安定性。

表３２に提供されたデータを使用して、当業者であれば、好ましい生物物理学的特性を有する生殖系タンパク質対を容易に特定することができる。

一般的に、各機能的特性における閾値を有する生殖系タンパク質対を、コレクションに組み込むために選択した。例えば、幾つかの実施形態では、以下の特性の全てを含む生殖系タンパク質対を、コレクションに組み込むために選択した：ｉ）Ｆａｂ型の相対的提示率が、サンプリングしたＦａｂの上位７５％以内の値を含むこと、ｉｉ）Ｆａｂ型の発現レベルが、Ｆａｂ ＶＨ１−６９ ＶＬＡ＿Ｖｌ１−４０ ＡＹＡと比較して少なくとも０．４であること、ｉｉｉ）Ｆａｂ型の熱安定性が６０℃以上にて少なくとも４５分間であること、ｉｖ）Ｆａｂ型のウシ又はマウス血清安定性が３７℃にて１０日間を超えること、ｖ）ＩｇＧ型の発現レベルが、ＭＯＲ０３０８０と比較して少なくとも０．４であること、及びｖｉ）ＩｇＧ型の血清安定性が３７℃にて１４日間であること。表３２では、これら機能的特性を全て含む生殖系タンパク質対は、太字及び下線で示されている。

しかしながら、上述されているように、機能的特性の１つ又は複数を有する生殖系タンパク質対を、コレクションに組み込むために選択してもよい。本明細書では、試験した４００個の生殖系タンパク質対の総合順位表を作成し、その結果、試験した機能的特性の各々に重みを加えて、各生殖系タンパク質対を他に対して順位付けすることができた。これは、本発明者らが、列挙された機能的特性の１つ若しくは複数又は全てを有する１つ又は複数の生殖系タンパク質対を選択することを可能にした。幾つかの実施形態では、コレクションは、上記の特徴を有する生殖系タンパク質対の全てを含む。幾つかの実施形態では、コレクションは、試験した４００対の中で最も高い総合スコアを有する生殖系タンパク質対を含む。幾つかの実施形態では、試験した４００対の上位１０％、上位２０％、又は上位３０％以内の総合スコアを有する生殖系タンパク質対を、コレクションに組み込むために選択した。

記述、特定の例、及びデータは、例示的な実施形態を示しているが、説明のために提供されているものであり、本発明を限定することは意図されていないことが理解されるべきである。本発明内の種々の変更及び改変は、当業者であれば、本明細書に含まれている考察、開示、及びデータから明白になるだろう。従って、それらは本発明の一部であるとみなされる。

Claims (50)

1. 可変重鎖及び可変軽鎖フレームワーク領域を含む合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクションであって、
   前記可変重鎖フレームワーク領域及び可変軽鎖フレームワーク領域が、生殖系タンパク質対の生殖系タンパク質配列を含み、
   前記生殖系タンパク質対が、以下の特性：
   ｉ）Ｆａｂ型の相対的提示率が、サンプリングしたＦａｂの上位７５％以内の値を含むこと、
   ｉｉ）Ｆａｂ型の発現レベルが、Ｆａｂ ＶＨ１−６９ ＶＬＡ＿Ｖｌ１−４０ ＡＹＡと比較して少なくとも０．４であること、
   ｉｉｉ）Ｆａｂ型の熱安定性が、６０℃以上にて少なくとも４５分間であること、
   ｉｖ）Ｆａｂ型のウシ又はマウス血清安定性が、３７℃にて１０日間を超えていること、
   ｖ）ＩｇＧ型の発現レベルが、ＭＯＲ０３０８０と比べて少なくとも０．４であること、及び
   ｖｉ）ＩｇＧ型の血清安定性が、３７℃にて１４日間であることを含み、
   前記抗体又はそれらの機能的断片のコレクションが、少なくとも２個の異なる生殖系タンパク質対の生殖系タンパク質配列を含み、
   前記生殖系タンパク質対が、生殖系遺伝子対によりコードされ、前記生殖系タンパク質対がＩＧＨＶ１−１８（配列番号６５）／ＩＧＫＶ１−０５（配列番号１１８）、ＩＧＨＶ１−１８（配列番号６５）／ＩＧＬＶ２−２３（配列番号１７４）、ＩＧＨＶ１−４６（配列番号６８）／ＩＧＫＶ１−０９（配列番号１２１）、ＩＧＨＶ１−４６（配列番号６８）／ＩＧＫＶ１−３９（配列番号１２９）、ＩＧＨＶ１−４６（配列番号６８）／ＩＧＫＶ３−１５（配列番号１５３）、ＩＧＨＶ１−６９＊０１（配列番号７０）／ＩＧＫＶ１−０５（配列番号１１８）、ＩＧＨＶ３−０７（配列番号７７）／ＩＧＫＶ１−０９（配列番号１２１）、ＩＧＨＶ３−０７（配列番号７７）／ＩＧＫＶ１−１２（配列番号１２２）、ＩＧＨＶ３−０７（配列番号７７）／ＩＧＫＶ１−２７（配列番号１２６）、ＩＧＨＶ３−０７（配列番号７７）／ＩＧＫＶ３−１５（配列番号１５３）、ＩＧＨＶ３−０７（配列番号７７）／ＩＧＬＶ２−２３（配列番号１７４）、ＩＧＨＶ３−０７（配列番号７７）／ＩＧＬＶ３−０１（配列番号１７６）、ＩＧＨＶ３−１１（配列番号７９）／ＩＧＫＶ１−０５（配列番号１１８）、ＩＧＨＶ３−１１（配列番号７９）／ＩＧＫＶ１−０６（配列番号１１９）、ＩＧＨＶ３−１１（配列番号７９）／ＩＧＫＶ１−１２（配列番号１２２）、ＩＧＨＶ３−１１（配列番号７９）／ＩＧＫＶ１−１６（配列番号１２４）、ＩＧＨＶ３−１１（配列番号７９）／ＩＧＫＶ３−１５（配列番号１５３）、ＩＧＨＶ３−１１（配列番号７９）／ＩＧＬＶ２−２３（配列番号１７４）、ＩＧＨＶ３−１５（配列番号８１）／ＩＧＫＶ１−０５（配列番号１１８）、ＩＧＨＶ３−１５（配列番号８１）／ＩＧＫＶ１−０６（配列番号１１９）、ＩＧＨＶ３−１５（配列番号８１）／ＩＧＫＶ１−０９（配列番号１２１）、ＩＧＨＶ３−１５（配列番号８１）／ＩＧＫＶ１−１２（配列番号１２２）、ＩＧＨＶ３−１５（配列番号８１）／ＩＧＫＶ１−１６（配列番号１２４）、ＩＧＨＶ３−１５（配列番号８１）／ＩＧＫＶ１−２７（配列番号１２６）、ＩＧＨＶ３−１５（配列番号８１）／ＩＧＫＶ１−３９（配列番号１２９）、ＩＧＨＶ３−１５（配列番号８１）／ＩＧＫＶ３−１５（配列番号１５３）、ＩＧＨＶ３−１５（配列番号８１）／ＩＧＬＶ１−５１（配列番号１６９）、ＩＧＨＶ３−１５（配列番号８１）／ＩＧＬＶ２−１１（配列番号１７１）、ＩＧＨＶ３−２１（配列番号８４）／ＩＧＫＶ１−０６（配列番号１１９）、ＩＧＨＶ３−２１（配列番号８４）／ＩＧＫＶ１−１２（配列番号１２２）、ＩＧＨＶ３−２１（配列番号８４）／ＩＧＫＶ１−２７（配列番号１２６）、ＩＧＨＶ３−２１（配列番号８４）／ＩＧＫＶ１−３９（配列番号１２９）、ＩＧＨＶ３−２１（配列番号８４）／ＩＧＬＶ２−１４（配列番号１７２）、ＩＧＨＶ３−２１（配列番号８４）／ＩＧＬＶ２−２３（配列番号１７４）、ＩＧＨＶ３−３０（配列番号８６）／ＩＧＬＶ２−２３（配列番号１７４）、ＩＧＨＶ３−３０（配列番号８６）／ＩＧＬＶ３−１（配列番号１７６）、ＩＧＨＶ３−３３（配列番号８９）／ＩＧＫＶ３−１５（配列番号１５３）、ＩＧＨＶ３−３３（配列番号８９）／ＩＧＬＶ２−２３（配列番号１７４）、ＩＧＨＶ３−４８（配列番号９３）／ＩＧＫＶ１−２７（配列番号１２６）、ＩＧＨＶ３−５３（配列番号９５）／ＩＧＫＶ１−０９（配列番号１２１）、ＩＧＨＶ３−５３（配列番号９５）／ＩＧＬＶ１−５１（配列番号１６９）、ＩＧＨＶ３−５３（配列番号９５）／ＩＧＬＶ２−２３（配列番号１７４）、ＩＧＨＶ３−５３（配列番号９５）／ＩＧＬＶ３−１（配列番号１７６）、ＩＧＨＶ３−７４（配列番号１００）／ＩＧＫＶ１−０６（配列番号１１９）、ＩＧＨＶ３−７４（配列番号１００）／ＩＧＫＶ１−０９（配列番号１２１）、ＩＧＨＶ３−７４（配列番号１００）／ＩＧＫＶ１−２７（配列番号１２６）、ＩＧＨＶ３−７４（配列番号１００）／ＩＧＫＶ３−１５（配列番号１５３）、ＩＧＨＶ３−７４（配列番号１００）／ＩＧＬＶ１−５１（配列番号１６９）、ＩＧＨＶ４−０４（配列番号１０２）／ＩＧＬＶ２−２３（配列番号１７４）、ＩＧＨＶ４−０４（配列番号１０２）／ＩＧＬＶ３−１（配列番号１７６）、ＩＧＨＶ４−０４（配列番号１０２）／ＩＧＬＶ３−２１（配列番号１８２）、ＩＧＨＶ４−３９（配列番号１０９）／ＩＧＬＶ２−１４（配列番号１７２）、ＩＧＨＶ４−３９（配列番号１０９）／ＩＧＬＶ３−１（配列番号１７６）、ＩＧＨＶ５−５１（配列番号１１３）／ＩＧＫＶ１−０９（配列番号１２１）、ＩＧＨＶ５−５１（配列番号１１３）／ＩＧＬＶ２−２３（配列番号１７４）、ＩＧＨＶ５−５１（配列番号１１３）／ＩＧＬＶ３−１（配列番号１７６）、ＩＧＨＶ６−１（配列番号１１５）／ＩＧＫＶ１−０６（配列番号１１９）、及びＩＧＨＶ６−１（配列番号１１５）／ＩＧＬＶ２−２３（配列番号１７４）から選択されるコレクション。
2. 前記生殖系遺伝子対が、ヒト免疫レパートリー中少なくとも０．０５％の濃度で存在する、請求項１に記載のコレクション。
3. 前記抗体又はそれらの機能的断片が、ヒト配列を含む、請求項１又は２に記載のコレクション。
4. 前記抗体又はそれらの機能的断片のコレクションが、少なくとも８の異なる生殖系タンパク質対の生殖系タンパク質配列を含む、請求項１乃至３のいずれか１項に記載のコレクション。
5. 前記抗体又はそれらの機能的断片のコレクションが、少なくとも１０の異なる生殖系タンパク質対の生殖系タンパク質配列を含む、請求項４に記載のコレクション。
6. 前記抗体又はそれらの機能的断片のコレクションが、少なくとも１５の異なる生殖系タンパク質対の生殖系タンパク質配列を含む、請求項５に記載のコレクション。
7. 前記抗体又はそれらの機能的断片のコレクションが、少なくとも２０の異なる生殖系タンパク質対の生殖系タンパク質配列を含む、請求項６に記載のコレクション。
8. 前記抗体又はそれらの機能的断片のコレクションが、少なくとも２５の異なる生殖系タンパク質対の生殖系タンパク質配列を含む、請求項７に記載のコレクション。
9. 前記抗体又はそれらの機能的断片のコレクションが、少なくとも３０の異なる生殖系タンパク質対の生殖系タンパク質配列を含む、請求項８に記載のコレクション。
10. 前記抗体又はそれらの機能的断片のコレクションが、少なくとも３５の異なる生殖系タンパク質対の生殖系タンパク質配列を含む、請求項９に記載のコレクション。
11. 前記抗体又はそれらの機能的断片のコレクションが、少なくとも４０の異なる生殖系タンパク質対の生殖系タンパク質配列を含む、請求項１０に記載のコレクション。
12. 前記抗体又はそれらの機能的断片のコレクションが、少なくとも４５の異なる生殖系タンパク質対の生殖系タンパク質配列を含む、請求項１１に記載のコレクション。
13. 前記抗体又はそれらの機能的断片のコレクションが、少なくとも５０の異なる生殖系タンパク質対の生殖系タンパク質配列を含む、請求項１２に記載のコレクション。
14. 前記抗体又はそれらの機能的断片が、生殖系タンパク質配列を含む１つ又は複数の相補性決定領域を含む、請求項１乃至１３のいずれか１項に記載のコレクション。
15. 前記抗体又はそれらの機能的断片が、生殖系タンパク質配列を含むＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、及びＦＲ３領域を含む、請求項１乃至１４のいずれか１項に記載のコレクション。
16. 前記抗体又はそれらの機能的断片が、ＪＨ４、Ｊκ１、及びＪλ２／３からなる群から選択されるＦＲ４領域を含む、請求項１乃至１５のいずれか１項に記載のコレクション。
17. 前記抗体又はそれらの機能的断片が、多様化されたＨＣＤＲ３領域を含む、請求項１乃至１６のいずれか１項に記載のコレクション。
18. 前記抗体又はそれらの機能的断片が、多様化されたＬＣＤＲ３領域を含む、請求項１乃至１７のいずれか１項に記載のコレクション。
19. 前記コレクションが、１×１０^４個の抗体又はそれらの機能的断片を含む、請求項１乃至１８のいずれか１項に記載のコレクション。
20. 前記生殖系タンパク質対が、サンプリングしたＦａｂの上位６０％以内の値を含むＦａｂ型の相対的提示率を含む、請求項１乃至１９のいずれか１項に記載のコレクション。
21. 前記生殖系タンパク質対が、Ｆａｂ ＶＨ１−６９ ＶＬＡ＿Ｖｌ１−４０ ＡＹＡと比較して、少なくとも０．６のＦａｂ型の発現レベルを含む、請求項１乃至２０のいずれか１項に記載のコレクション。
22. 前記生殖系タンパク質対が、７０℃以上にて少なくとも４５分間のＦａｂ型の熱安定性を含む、請求項１乃至２１のいずれか１項に記載のコレクション。
23. 前記生殖系タンパク質対が、ＭＯＲ０３０８０と比較して、少なくとも０．６のＩｇＧ型の発現レベルを含む、請求項１乃至２２のいずれか１項に記載のコレクション。
24. 前記抗体の前記機能的断片が、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、及びｓｃＦｖからなる群から選択される、請求項１乃至２３のいずれか１項に記載のコレクション。
25. 請求項１乃至２４のいずれか１項に記載のコレクションをコードする核酸のコレクション。
26. 請求項２５に記載の核酸のコレクションを含むベクターのコレクション。
27. 請求項２５に記載の核酸のコレクション又は請求項２６に記載のベクターのコレクションを含む組換え宿主細胞のコレクション。
28. 原核生物又は真核生物である、請求項２７に記載の組換え宿主細胞のコレクション。
29. 大腸菌又は哺乳動物である、請求項２８に記載の組換え宿主細胞のコレクション。
30. 請求項１に記載の合成抗体又はそれらの機能的断片のコレクションを産生する方法。
31. 前記産生ステップが、可変重鎖及び可変軽鎖フレームワーク領域を含む抗体又はそれらの機能的断片のコレクションを生成することを更に含み、
    前記可変重鎖フレームワーク領域及び可変軽鎖フレームワーク領域が、生殖系タンパク質対の生殖系タンパク質配列を含み、
    前記生殖系タンパク質対が、以下の特性：
    ｉ）Ｆａｂ型の相対的提示率が、サンプリングしたＦａｂの上位７５％以内の値を含むこと、
    ｉｉ）Ｆａｂ型の発現レベルが、Ｆａｂ ＶＨ１−６９ ＶＬＡ＿Ｖｌ１−４０ ＡＹＡと比較して少なくとも０．４であること、
    ｉｉｉ）Ｆａｂ型の熱安定性が、６０℃以上にて少なくとも４５分間であること、
    ｉｖ）Ｆａｂ型のウシ又はマウス血清安定性が、３７℃にて１０日間を超えていること、
    ｖ）ＩｇＧ型の発現レベルが、ＭＯＲ０３０８０と比べて少なくとも０．４であること、及び
    ｖｉ）ＩｇＧ型のウシ血清安定性が、３７℃にて１４日間であることを含み、
    前記抗体又はそれらの機能的断片のコレクションが、少なくとも２つの異なる生殖系タンパク質対を含む、請求項３０に記載の方法。
32. 前記産生ステップが、
    ａ）前記ヒト免疫レパートリーに存在する前記可変重鎖及び可変軽鎖生殖系遺伝子対を含むデータを取得するステップと、
    ｂ）以下の特性：
    ｉ）Ｆａｂ型の相対的提示率が、サンプリングしたＦａｂの上位７５％以内の値を含むこと、
    ｉｉ）Ｆａｂ型の発現レベルが、Ｆａｂ ｐＭｘ１１＿ＦＨ ＶＨ１−６９ ＶＬＡ＿Ｖｌ１−４０ ＡＹＡと比較して少なくとも０．４であること、
    ｉｉｉ）Ｆａｂ型の熱安定性が、６０℃以上にて少なくとも４５分間であること、
    ｉｖ）Ｆａｂ型のウシ又はマウス血清安定性が、３７℃にて１０日間を超えていること、
    ｖ）ＩｇＧ型の発現レベルが、ＭＯＲ０３０８０と比べて少なくとも０．４であること、及び
    ｖｉ）ＩｇＧ型のウシ血清安定性が、３７℃にて１４日間であることを含む前記可変重鎖及び可変軽鎖生殖系タンパク質対を特定するステップと、
    ｃ）ステップｂ）で特定された前記生殖系タンパク質対の前記可変重鎖及び可変軽鎖生殖系タンパク質配列を含む抗体又はそれらの機能的断片のコレクションの生成するステップとを更に含む、請求項３０又は３１に記載の方法。
33. ステップｂ）が、
    ｂａ）前記ヒト免疫レパートリー中少なくとも０．０５％の濃度で存在する前記可変重鎖及び可変軽鎖生殖系遺伝子対を特定するステップと、
    ｂｂ）ステップｂａ）で特定された前記生殖系タンパク質対を含む抗体又はそれらの機能的断片を生成するステップと、
    ｂｃ）前記生殖系タンパク質対の以下の特性：
    ｉ）Ｆａｂ型の相対的提示率、
    ｉｉ）Ｆａｂ型の発現レベル、
    ｉｉｉ）６０℃以上におけるＦａｂ型の熱安定性、
    ｉｖ）３７℃にて１０日間を超えるＦａｂ型のウシ又はマウス血清安定性、
    ｖ）ＩｇＧ型の発現レベル、及び
    ｖｉ）３７℃にて１４日間のＩｇＧ型のウシ血清安定性を評価するステップとを更に含む、請求項３２に記載の方法。
34. ステップａ）が、
    ａａ）試料からヒトＢ細胞を単離するステップと、
    ａｂ）前記Ｂ細胞に由来するｃＤＮＡを生成するステップと、
    ａｃ）前記Ｂ細胞に由来する前記ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅するステップと、
    ａｄ）前記ＰＣＲ産物を配列決定するステップと、
    ａｅ）各ＰＣＲ産物の前記生殖系遺伝子を特定するステップとを更に含む、請求項３２又は３３に記載の方法。
35. コレクションを生成する前記ステップが、
    ｃａ）前記抗体又はそれらの機能的断片をコードする前記核酸を合成するステップと、
    ｃｂ）前記核酸をベクターにクローニングするステップと、
    ｃｃ）前記抗体又はそれらの機能的断片を発現させるステップとを更に含む、請求項３０乃至３３のいずれか１項に記載の方法。
36. 前記生殖系遺伝子対が、前記ヒト免疫レパートリー中少なくとも０．０５％の濃度で存在する、請求項３０乃至３５のいずれか１項に記載の方法。
37. 前記抗体又はそれらの機能的断片が、ヒト配列を含む、請求項３０乃至３６のいずれか１項に記載の方法。
38. 前記抗体又はそれらの機能的断片が、少なくとも８の異なる生殖系タンパク質対の生殖系タンパク質配列を含む、請求項３０乃至３７のいずれか１項に記載の方法。
39. 前記抗体又はそれらの機能的断片が、生殖系タンパク質配列を含む１つ又は複数の相補性決定領域を含む、請求項３０乃至３８のいずれか１項に記載の方法。
40. 前記抗体又はそれらの機能的断片が、生殖系タンパク質配列を含むＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、及び、ＦＲ３を含む、請求項３０乃至３９のいずれか１項に記載の方法。
41. 前記抗体又はそれらの機能的断片が、ＪＨ４、Ｊκ１、及びＪλ２／３からなる群から選択されるＦＲ４領域を含む、請求項３０乃至４０のいずれか１項に記載の方法。
42. 前記抗体又はそれらの機能的断片が、多様化されたＨＣＤＲ３領域を含む、請求項３０乃至４１のいずれか１項に記載の方法。
43. 前記抗体又はそれらの機能的断片が、多様化されたＬＣＤＲ３領域を含む、請求項３０乃至４２のいずれか１項に記載の方法。
44. 前記コレクションが、１×１０^４個の抗体又はそれらの機能的断片を含む、請求項３０乃至４３のいずれか１項に記載の方法。
45. 前記生殖系タンパク質対が、サンプリングしたＦａｂの上位６０％以内の値を含むＦａｂ型の相対的提示率を含む、請求項３０乃至４４のいずれか１項に記載の方法。
46. 前記生殖系タンパク質対が、Ｆａｂ ＶＨ１−６９ ＶＬＡ＿Ｖｌ１−４０ ＡＹＡと比較して、少なくとも０．６のＦａｂ型の発現レベルを含む、請求項３０乃至４５のいずれか１項に記載の方法。
47. 前記生殖系タンパク質対が、７０℃以上にて少なくとも４５分間のＦａｂ型の熱安定性を含む、請求項３０乃至４６のいずれか１項に記載の方法。
48. 前記生殖系タンパク質対が、ＭＯＲ０３０８０と比較して、少なくとも０．６のＩｇＧ型の発現レベルを含む、請求項３０乃至４７のいずれか１項に記載の方法。
49. 前記抗体の前記機能的断片が、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、及びｓｃＦｖからなる群から選択される、請求項３０乃至４８のいずれか１項に記載の方法。
50. 生殖系タンパク質対の生殖系タンパク質配列を含むＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、及びＦＲ３を含む単離された抗体又はその機能的断片であって、前記生殖系タンパク質対がＩＧＨＶ１−１８（配列番号６５）／ＩＧＫＶ１−０５（配列番号１１８）、ＩＧＨＶ１−１８（配列番号６５）／ＩＧＬＶ２−２３（配列番号１７４）、ＩＧＨＶ１−４６（配列番号６８）／ＩＧＫＶ１−０９（配列番号１２１）、ＩＧＨＶ１−４６（配列番号６８）／ＩＧＫＶ１−３９（配列番号１２９）、ＩＧＨＶ１−４６（配列番号６８）／ＩＧＫＶ３−１５（配列番号１５３）、ＩＧＨＶ１−６９＊０１（配列番号７０）／ＩＧＫＶ１−０５（配列番号１１８）、ＩＧＨＶ３−０７（配列番号７７）／ＩＧＫＶ１−０９（配列番号１２１）、ＩＧＨＶ３−０７（配列番号７７）／ＩＧＫＶ１−１２（配列番号１２２）、ＩＧＨＶ３−０７（配列番号７７）／ＩＧＫＶ１−２７（配列番号１２６）、ＩＧＨＶ３−０７（配列番号７７）／ＩＧＫＶ３−１５（配列番号１５３）、ＩＧＨＶ３−０７（配列番号７７）／ＩＧＬＶ２−２３（配列番号１７４）、ＩＧＨＶ３−０７（配列番号７７）／ＩＧＬＶ３−０１（配列番号１７６）、ＩＧＨＶ３−１１（配列番号７９）／ＩＧＫＶ１−０５（配列番号１１８）、ＩＧＨＶ３−１１（配列番号７９）／ＩＧＫＶ１−０６（配列番号１１９）、ＩＧＨＶ３−１１（配列番号７９）／ＩＧＫＶ１−１２（配列番号１２２）、ＩＧＨＶ３−１１（配列番号７９）／ＩＧＫＶ１−１６（配列番号１２４）、ＩＧＨＶ３−１１（配列番号７９）／ＩＧＫＶ３−１５（配列番号１５３）、ＩＧＨＶ３−１１（配列番号７９）／ＩＧＬＶ２−２３（配列番号１７４）、ＩＧＨＶ３−１５（配列番号８１）／ＩＧＫＶ１−０５（配列番号１１８）、ＩＧＨＶ３−１５（配列番号８１）／ＩＧＫＶ１−０６（配列番号１１９）、ＩＧＨＶ３−１５（配列番号８１）／ＩＧＫＶ１−０９（配列番号１２１）、ＩＧＨＶ３−１５（配列番号８１）／ＩＧＫＶ１−１２（配列番号１２２）、ＩＧＨＶ３−１５（配列番号８１）／ＩＧＫＶ１−１６（配列番号１２４）、ＩＧＨＶ３−１５（配列番号８１）／ＩＧＫＶ１−２７（配列番号１２６）、ＩＧＨＶ３−１５（配列番号８１）／ＩＧＫＶ１−３９（配列番号１２９）、ＩＧＨＶ３−１５（配列番号８１）／ＩＧＫＶ３−１５（配列番号１５３）、ＩＧＨＶ３−１５（配列番号８１）／ＩＧＬＶ１−５１（配列番号１６９）、ＩＧＨＶ３−１５（配列番号８１）／ＩＧＬＶ２−１１（配列番号１７１）、ＩＧＨＶ３−２１（配列番号８４）／ＩＧＫＶ１−０６（配列番号１１９）、ＩＧＨＶ３−２１（配列番号８４）／ＩＧＫＶ１−１２（配列番号１２２）、ＩＧＨＶ３−２１（配列番号８４）／ＩＧＫＶ１−２７（配列番号１２６）、ＩＧＨＶ３−２１（配列番号８４）／ＩＧＫＶ１−３９（配列番号１２９）、ＩＧＨＶ３−２１（配列番号８４）／ＩＧＬＶ２−１４（配列番号１７２）、ＩＧＨＶ３−２１（配列番号８４）／ＩＧＬＶ２−２３（配列番号１７４）、ＩＧＨＶ３−３０（配列番号８６）／ＩＧＬＶ２−２３（配列番号１７４）、ＩＧＨＶ３−３０（配列番号８６）／ＩＧＬＶ３−１（配列番号１７６）、ＩＧＨＶ３−３３（配列番号８９）／ＩＧＫＶ３−１５（配列番号１５３）、ＩＧＨＶ３−３３（配列番号８９）／ＩＧＬＶ２−２３（配列番号１７４）、ＩＧＨＶ３−４８（配列番号９３）／ＩＧＫＶ１−２７（配列番号１２６）、ＩＧＨＶ３−５３（配列番号９５）／ＩＧＫＶ１−０９（配列番号１２１）、ＩＧＨＶ３−５３（配列番号９５）／ＩＧＬＶ１−５１（配列番号１６９）、ＩＧＨＶ３−５３（配列番号９５）／ＩＧＬＶ２−２３（配列番号１７４）、ＩＧＨＶ３−５３（配列番号９５）／ＩＧＬＶ３−１（配列番号１７６）、ＩＧＨＶ３−７４（配列番号１００）／ＩＧＫＶ１−０６（配列番号１１９）、ＩＧＨＶ３−７４（配列番号１００）／ＩＧＫＶ１−０９（配列番号１２１）、ＩＧＨＶ３−７４（配列番号１００）／ＩＧＫＶ１−２７（配列番号１２６）、ＩＧＨＶ３−７４（配列番号１００）／ＩＧＫＶ３−１５（配列番号１５３）、ＩＧＨＶ３−７４（配列番号１００）／ＩＧＬＶ１−５１（配列番号１６９）、ＩＧＨＶ４−０４（配列番号１０２）／ＩＧＬＶ２−２３（配列番号１７４）、ＩＧＨＶ４−０４（配列番号１０２）／ＩＧＬＶ３−１（配列番号１７６）、ＩＧＨＶ４−０４（配列番号１０２）／ＩＧＬＶ３−２１（配列番号１８２）、ＩＧＨＶ４−３９（配列番号１０９）／ＩＧＬＶ２−１４（配列番号１７２）、ＩＧＨＶ４−３９（配列番号１０９）／ＩＧＬＶ３−１（配列番号１７６）、ＩＧＨＶ５−５１（配列番号１１３）／ＩＧＫＶ１−０９（配列番号１２１）、ＩＧＨＶ５−５１（配列番号１１３）／ＩＧＬＶ２−２３（配列番号１７４）、ＩＧＨＶ５−５１（配列番号１１３）／ＩＧＬＶ３−１（配列番号１７６）、ＩＧＨＶ６−１（配列番号１１５）／ＩＧＫＶ１−０６（配列番号１１９）、及びＩＧＨＶ６−１（配列番号１１５）／ＩＧＬＶ２−２３（配列番号１７４）からなる群から選択される、単離された抗体又はその機能的断片。

Images