DE69228247T2 - Behandlung von Zellpopulationen - Google Patents
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft die Behandlung von Zellpopulationen und Verfahren zur Behandlung von Zellpopulationen, z. B. zur Analyse der Verbindung von Genen innerhalb einzelner Zellen einer heterologen Population, neue Protein- und Nukleinsäure- Kombinationen sowie Sets zur Durchführung derartiger Verfahren.
- Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Behandlung von Zellpopulationen, typischerweise heterogenen Zellpopulationen und findet insbesondere, aber nicht ausschließlich, Anwendung bei der Behandlung von Lymphozyten, wie z. B. jenen, die Antikörper erzeugen.
- Antikörper sind in Serum vorhanden und binden sich an diverse Pathogene, wie z. B. Toxine, Bakterien und Viren, und tragen dazu bei, diese zu eliminieren. Sie bestehen aus einem Y-förmigen Protein, das aus zwei schweren Ketten und zwei leichten Ketten zusammengesetzt ist. Jede Kette weist Modulkonstruktion auf: jede leichte Kette besteht aus zwei Domänen, und jede schwere Kette weist zumindest vier Domänen auf. Die Antigen-Bindungsstelle wird von einer Domäne der schweren Kette (VH-Domäne) und einer Domäne der leichten Kette (VL-Kette) bereitgestellt. Es können sogar kleine Antigen-Bindungsfragmente hergestellt werden, die nur aus diesen beiden Domänen bestehen: entweder nicht-kovalent oder über Disulfidbindungen oder über eine Peptidbindung miteinander verbunden. Die Antigen-Bindungsdomänen sind in ihrer Aminosäuresequenz variabler als andere Domänen des Antikörpers und werden daher als variable (V) Domänen im Gegensatz zu konstanten (C) Domänen bezeichnet. Die konstanten Domänen des Antikörpers sind für die Auslösung von Antikörper-Effektormechanismen, wie z. B. Komplementlyse und zellvermittelte Abtötung, verantwortlich.
- Antikörper werden bei einem Verfahren zur Gen-Neuanordnung von B-Lymphozyten gebildet. Während der Entwicklung dieser Zellen werden die für die variablen Domänen kodierenden Gene aus genetischen Elementen zusammengesetzt. Im Fall der VH- Domänen gibt es drei Elemente, das nicht-neugeordnete VH-Gen, das D-Segment und das JH-Segment. Im Fall der VL-Domänen gibt es zwei Elemente, das nicht-neugeordnete VL-(V-λ- oder V-κ-)Gen und das JL-(J-λ- oder J-κ-)Segment. Statistische Kombination dieser Gensegmente und statistische Kombination der neugeordneten VH- und VL-Domänen erzeugt ein großes Repertoire diverser Antikörper, die zur Bindung an diverse Antigene fähig sind. Die potentielle Vielfalt ist groß (das primäre Repertoire bei Mäusen liegt bei über 10¹&sup0;), obwohl das jeweils exprimierte Repertoire geringer als die Gesamtanzahl an Lymphozyten sein muß (bei Mäusen unter 10&sup8;).
- Im ersten Schritt der Immunreaktion wird Antigen von Lymphozyten erkannt, und sie vermehren und scheiden Antikörper aus, die üblicherweise geringe Affinität aufweisen (weniger als 10&sup6; M&supmin;¹). Beim weiteren Zusammentreffen mit Antigen (wie bei Hyperimmunisierung) durchlaufen die V-Gene dieser Zellen Mutationen, und Lymphozyten, die Antikörper mit erhöhter Affinität aufweisen, werden selektiert. Dieses Verfahren, bei dem Antikörper mit hoher Affinität in zwei Schritten aus einem primären Repertoire und daraufhin aus einem Hyperimmunrepertoire erzeugt werden, ist höchst effizient. Es weist gegenüber der Selektion von Antikörpern in einem einzigen Schritt Vorteile auf, weil diese ein viel größeres primäres Repertoire erfordern würde (das potentielle Hyperimmunrepertoire ist möglicherweise größer als 10³&sup0;).
- Traditionellerweise sind Zell-Linien, die Antikörper mit hoher Affinität erzeugen, durch Fusion von B-Lymphozyten eines hyperimmunisierten Tieres mit einer Myelom-Zell-Linie hergestellt worden. Diese immortalisiert die B-Lymphozyten und ermöglicht Klonierung und Screenen von Zellen bezüglich der Produktion monospezifischer Antikörper, die sich an Antigen binden. Derartige monoklonale Antikörper finden bei Therapie und Diagnose vielfältige Anwendungsmöglichkeiten. Die Plasmazellen (letzte Stufe der Differenzierung von B-Lymphozyten), die im wesentlichen Fabriken zur Ausscheidung von Antikörpern sind, fusionieren aber nicht. Daher ist das Repertoire an Antikörper-Spezifitäten, das von Plasmazellen beigetragen wird, der Hybridom-Technologie nicht zugänglich. Das ist eine mögliche Erklärung dafür, weshalb polyklonale Antiseren von Tieren höhere durchschnittliche Affinitäten aufweisen können als monoklonale Antikörper, die vom selben Tier stammen. Die Hybridom-Technologie weist noch andere Nachteile auf, einschließlich der geringen Effizienz der Zellfusion, der zeitaufwendigen Schritte, die zum Klonieren von Hybridomen mit den gewünschten Antigen-Bindungsaktivitäten erforderlich sind, und manchmal der Instabilität von Hybridomen.
- In letzter Zeit sind andere auf Gentechnologie basierende Verfahren vorgeschlagen worden, um Antikörper aus B-Lymphozyten herzustellen (für einen Überblick und Verweise siehe Milstein und Winter, Nature 349, 293-299 (1991) (Verweis Nr. 11). Der Schlüsselschritt ist das Klonieren jener Gene, die für die VH- und VL-Gene kodieren, direkt aus B-Lymphozyten (oder Hybridomen) in Expressionsvektoren. Die Gene können als einzelne variable Domänen oder Fv- und Fab-Fragmente oder Antikörper entweder in Bakterien- oder Säugetierzellen exprimiert werden. Der Schlüssel für diese Rekombinations-Verfahren auf DNA-Basis ist das rasche Klonieren der V-Gene direkt in Expressionsvektoren. Das ist durch Kopieren und Amplifizieren der V-Gene durch Polymerase- Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung "universeller" Primer, die an die 5'- und 3'-Enden von V-Genen hybridisieren, erreicht worden. Die Primer umfassen Restriktionsstellen, um das Klonieren der Gene direkt in Expressionsvektoren zu ermöglichen.
- Diese Verfahren sind bestens geeignet, um Antikörper aus Klonen von Zellen oder tatsächlich einzelnen Lymphozyten herzustellen. Sie erfordern jedoch getrennte Amplifikations- und Klonierschritte für jeden einzelnen Lymphozyten oder jeden einzelnen Klon, da die einzelnen VH- oder VL-Elemente zusammen gehalten werden müssen. Alternativ dazu ist gezeigt worden, daß Antigen-Bindungsaktivitäten durch Kombinieren an willkürlichen VH- und VL-Genen gewonnen werden können, die aus einem großen Repertoire von einem immunisierten Tier entnommen werden. Dies basiert auf der Tatsache, daß es gegebenenfalls nicht notwendig ist, die genauen VH- und VL-Kombinationen des B-Lymphozyten zu reproduzieren, um Antigen-Bindungsaktivität zu gewinnen. Tatsächlich entsprechen die VH- und VL-Genkombinationen, die von einem großen, vielfältigen Hyperimmunrepertoire stammen, im allgemeinen nicht der ursprünglichen Kombination von VH- und VL-Genen, die in B-Lymphozyten vorhanden sind. Nehmen wir an, die VH- und VL-Gene von nur 1.000 verschiedenen Lymphozyten würden neu kombiniert. Vermutlich wäre das Screenen von mehr als 1.000.000 VH- und VL-Genkombinationen erforderlich, um eine vernünftige Chance zu haben, die ursprüngliche VH- und VL-Genkombination einer beliebigen Zelle herauszufinden. Diese Berechnung geht davon aus, daß die VH- und VL-Gene der gewählten Zelle einzigartig sind: das gilt insbesondere bei einer Hyperimmunreaktion. Daher ist es wahrscheinlich, daß VH- und VL-Genkombinationen, die aus einem großen Repertoire von V-Genen ausgewählt sind, künstliche Kombinationen sind. Es ist jedoch möglich, daß einige künstliche Kombinationen mit Bindungsaktivität zur ursprünglichen Kombination ähnlich sind, vielleicht mit einigen wenigen Aminosäure-Substitutionen. Es wird jedoch erwartet, daß der Großteil derartiger künstlicher Antikörper geringere Affinität aufweist als die ursprüngliche Kombination (obwohl einige wenige sogar verbesserte Affinität aufweisen können). Um ihre Affinitäten zu verbessern, ist es im allgemeinen notwendig, weitere Schritte durchzuführen, beispielsweise indem eine der Ketten mit einem Repertoire vielfältiger Partner rekombiniert oder Mutationen in den VH- und VL-Genen vorgenommen werden und Mutanten mit verbesserter Affinität selektiert werden (und dadurch der Vorgang der Affinitätsreifung bei der Hyperimmunreaktion nachgeahmt wird). Es wäre daher wünschenswert, die korrekten Kombinationen von VH- und VL-Elementen gemeinsam aus heterogenen und großen Zellpopulationen zu klonieren, ohne daß eigene Klonierschritte für jede Zelle notwendig sind, oder ohne daß auf die vollständig statistische Paarung von VH- und VL-Elementen zurückgegriffen wird. Es ist auch notwendig, die ursprüngliche Kombination aus VH- und VL-Genen zu klonieren, wenn gewünscht wird, die natürliche Antikörperreaktion auf ein Antigen zu untersuchen.
- Die vorliegende Erfindung basiert teilweise auf dem Vorschlag, daß die Kombination aus VH- und VL-Genen, die in jeder Zelle vorhanden sind, beibehalten werden kann, wenn sie kopiert und die Kopien jeweils bevorzugt miteinander verbunden werden. Die verbundenen Kopien könnten dann direkt in Expressionsvektoren kloniert werden. Aber je nach der Effizienz der Verbindungs- und Kopiervorgänge kann es nötig sein, vor dem Klonieren zunächst weitere Kopien der verbundenen Gene zu machen.
- Eine Art, die Verbindung der VH- und VL-Gene herbeizuführen, ist durch in situ-PCR entweder der Gene selbst oder von cDNA-Kopien ihrer mRNA-Transkripte.
- Das Prinzip der PCR "in der Zelle" ist bekannt und wurde beispielsweise von Haase et al., 1990 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 4.971-4.975) (Verweis Nr. 15) und von Bagasra et al., 1992 (New Engl. J. Med. 326, 1.385-1.391) (Verweis Nr. 31) geoffenbart. Diese Arbeiten betreffen jedoch den Einsatz von in situ-PCR zum Nachweisen der Gegenwart viraler DNA-Sequenzen innerhalb infizierter Zellen. Haase et al. beschreiben ein PCR- System, bei dem überlappende Primer verwendet werden, um bereits benachbarte amplifizierte Abschnitte von Visna Virus-DNA zu verbinden, um einen vollständigen viralen Genomabschnitt zusammenzusetzen. Das unterscheidet sich jedoch wesentlich von der vorliegenden Erfindung, welche die Erkenntnis beinhaltet, daß nicht-fortlaufende Genom-Sequenzen oder cDNA (durch PCR) bevorzugt innerhalb derselben Zelle verbunden werden können, wodurch ursprüngliche Kombinationen beibehalten werden können, die innerhalb einzelner Zellen in einer heterogenen Population vorhanden sind.
- Gemäß einem ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Behandlung einer heterogenen Zellpopulation bereit, um zwei oder mehr Kopien nicht-fortlaufender DNA-Sequenzen zumindest einiger der Zellen miteinander zu verbinden, umfassend die folgenden Schritte:
- (i) Amplifizieren der nicht-fortlaufenden DNA-Sequenzen; und
- (ii) Verbinden der Kopien der nicht-fortlaufenden DNA-Sequenzen, worin das Verbinden vorzugsweise in der Nähe der nicht-fortlaufenden DNA-Sequenzen erfolgt, so daß das Miteinander-Verbinden zweier oder mehrerer Kopien nicht-fort laufender DNA-Sequenzen derselben Zelle wahrscheinlicher ist als das Verbinden mit Kopien, die von einer Nukleinsäuresequenz einer anderen Zelle stammen.
- Mit dem Begriff "bevorzugt verbunden" ist gemeint, daß jene Nukleinsäurekopien, die von einer Nukleinsäuresequenz innerhalb derselben Zelle stammen, mit größerer Wahrscheinlichkeit miteinander als mit einer Kopie verbunden werden, die von einer Nukleinsäuresequenz von einer anderen Zelle stammt. Daher besteht die Tendenz, daß die ursprüngliche Kombination genetischer Elemente, die in einer bestimmten Zelle vorhanden sind, konserviert wird.
- Diese bevorzugte Bindung tritt in der "Nachbarschaft" der Nukleinsäuresequenz auf, von der die Kopien stammen. Mit der Verwendung dieses Begriffs ist gemeint, daß die oben definierte bevorzugte Bindung relativ lokal, nahe der Stelle der Synthese der kopierten Nukleinsäuren, erfolgt. Der Durchmesser einer Säugetierzelle liegt typischerweise im Bereich von 5 bis 15 um. Da der Schlüsselfaktor die bevorzugte Bindung zwischen Nukleinsäuren ist, die von Templaten innerhalb derselben Zelle kopiert werden, variiert das Volumen oder die "Nachbarschaft", innerhalb der Bindung auftreten kann, vorzugsweise je nach der Dichte von Nukleinsäure-Synthesestellen. Aus nachstehend beschriebenen Gründen müssen derartige Foci oder Stellen nicht immer intakte Zellen sein. Die Synthesestellen sollten jedoch im allgemeinen um zumindest einen typischen Zelldurchmesser (5 bis 30 um) voneinander getrennt sein, weil eine gewisse Diffusion der synthetisierten Nukleinsäurekopien erfolgen kann, bevor Bindung auftritt. Daher hilft Teilung oder "Abteilbildung" der Synthesestellen bei der Beibehaltung des Merkmals der bevorzugten Bindung. Diese praktischen Einschränkungen machen es erforderlich, daß die Bindung im allgemeinen innerhalb von 30 bis 60 um der Synthesestelle erfolgt, obwohl, wie oben erklärt, wenn die Trennung der Abteile, innerhalb der Synthese erfolgt, erhöht wird, auch das für die bevorzugte Bindung verfügbare wirksame Volumen erhöht wird.
- Es gibt zwei geeignete Verfahren, um diese Abteilbildung zu erzielen, welche die bevorzugte Bindung zuläßt. Eines besteht darin, die Reaktionen innerhalb intakter oder im wesentlichen intakter Zellen durchzuführen, und das andere sieht vor, die Reaktionen an diskreten, physisch getrennten Positionen durchzuführen.
- Die Genelemente von Zellen können gemeinsam eingekapselt und dann die einzelnen Gene kopiert und die Kopien innerhalb der Kapsel miteinander verbunden werden. Die Kapsel muß robust genug sein, um den Kopiervorgang zu überleben und die einzelnen Genkopien ausreichend festhalten, um Verbinden der Genkopien von derselben Zelle zu ermöglichen. Die Kapsel kann für Reagenzien, wie Oligonukleotidprimer und Polymerase, durchlässig oder undurchlässig sein, wobei die Reagenzien im letzteren Fall in die Kapsel eingebracht werden müssen. Die Kapsel könnte die Nuklearmembran, die Plasmamembran oder eine um die Zelle konstruierte künstliche Membran sein. Die künstliche Kapsel könnte eine eigene künstliche Membran oder eine andere flüssige Phase sein, beispielsweise ein organisches Lösungsmittel. So kann die Zellmembran die Kapsel bilden, wenn sie mit Formaldehyd fixiert und für Reagens durchlässig gemacht wird.
- Ein Beispiel stellt die in situ-PCR "in der Zelle" dar. Das allgemeine Verfahren der PCR in der Zelle ist bekannt und umfaßt typischerweise das Fixieren (d. h. Stabilisieren in bezug auf die Temperatur) und Permeabilisieren der Zellen (damit PCR-Reagenzien in die Zelle gelangen können) sowie die Durchführung von PCR auf herkömmliche Weise. Es kann zu gewisser Diffusion der PCR-Produkte in das äußere Medium kommen. Beim Verfahren gemäß vorliegender Erfindung können diese Produkte und überschüssige PCR-Reagenzien jedoch durch Waschen entfernt werden.
- Alternativ dazu können die Zellen und Reagenzien gemeinsam in Tröpfchen eingebracht und in einer organischen Phase als Emulsion dispergiert werden, und in diesem Fall ist es notwendig, zu gewährleisten, daß die Mehrzahl der Tröpfchen im Durchschnitt von einer einzelnen Zelle besetzt ist.
- Als weitere Möglichkeit, wenn Zellen voneinander weg dispergiert sind, beispielsweise an einer Oberfläche aus Glas oder Kunststoff oder in einem inerten festen Medium, wie z. B. Agar oder Kieselgel, oder in einem viskosen Medium, wie z. B. Glycerin oder Glucoselösungen, gibt es eine begrenzte Diffusion (oder Konvektion) der Genkopien von einer Zelle zur nächsten. Daher besteht die Tendenz, daß das Genelement einer Zelle an das Genelement derselben Zelle gebunden wird, obwohl es auch gewisse Bindung an die Genelemente anderer Zellen geben kann.
- Daher wird gemäß einem zweiten Aspekt ein Verfahren zur Behandlung einer Zellpopulation bereitgestellt, um Kopien zweier oder mehrerer nicht-fortlaufender DNA-Sequenzen zumindest einiger der Zellen miteinander zu verbinden, umfassend die folgenden Schritte:
- (i) Behandeln der Zellen, um sie in bezug auf die Temperatur zu stabilisieren und sie für Reagenzien durchlässig zu machen;
- (ii) Zusatz von Primern zur Durchführung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) auf solche Weise, daß die Primer in das Innere der Zellen diffundieren;
- (iii) Unterziehen der Zellen einer geeigneten Behandlung, so daß die nicht-fortlaufenden DNA-Sequenzen einer bestimmten Zelle innerhalb dieser Zelle mittels PCR kopiert werden; und
- (iv) Miteinander-Verbinden der Kopien der nicht-fortlaufenden DNA-Sequenzen, wobei das Verbinden vorzugsweise in der Nähe der nicht-fortlaufenden DNA-Sequenzen erfolgt, von denen die Kopien stammen, so daß das Miteinander-Verbinden zweier oder mehrerer Kopien nicht-fortlaufender DNA-Sequenzen derselben Zelle wahrscheinlicher ist als das Verbinden mit Kopien, die von der Nukleinsäuresequenz einer anderen Zelle stammen.
- Das bevorzugte Verbinden kann nach geeigneten Verfahren erfolgen, z. B. durch Ligation unter Verwendung von DNA-Ligase (mit oder ohne vorherige Spaktung mit Restriktionsenzymen). Geeigneter erfolgt das bevorzugte Verbinden jedoch mittels PCR. Das kann durch Verwendung von Primersätzen erfolgen, wobei ein Ende eines Primers, der die Synthese einer Nukleinsäuresequenz primt, zu einem Ende eines Primers komplementär ist, der die Synthese einer zweiten Nukleinsäuresequenz primt.
- Vorzugsweise stammt die PCR unterzogene DNA-Sequenz von mRNA der Zelle. Dies wird geeigneterweise durch reverse Transkription der mRNA erzielt.
- Die Verwendung von fluoreszenzmarkierten PCR-Primern ermöglicht die Analyse einer Zellpopulation beispielsweise durch Zählen jener Zellen, die ein bestimmtes Gen oder eine Kombination von Genen exprimieren.
- Daher umfassen manche Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung einen zusätzlichen Schritt des Überwachens der Fluoreszenzmarkierung.
- Typischerweise eignet sich eine Zellpopulation, die diesem Behandlungsverfahren unterzogen wird, zur Analyse durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS).
- Fluoreszenzmarkierung von amplifizierter DNA ist besonders vorteilhaft, weil sie die Sortierung markierter Zellen (z. B. durch FACS) und das direkte Klonieren der amplifizierten DNA aus sortierten Zellen ermöglichen kann.
- Geeigneterweise werden zwei verschiedene Primer eingesetzt, die mit verschiedenen Fluoreszenzmarkierungen markiert sind. Das ermöglicht die Analyse zweier verschiedener Sub-Populationen innerhalb einer heterogenen Population in einem Versuch. Typischerweise ermöglicht Fluoreszenzmarkierung das Zählen markierter Zellen, was ein bevorzugtes Merkmal dieses Aspekts der Erfindung darstellt.
- Geeigneterweise können Zellen durch "Fixieren" mit Formaldehyd in bezug auf Wärme stabilisiert werden. Ein geeignetes Verfahren, um Zellen zu permeabilisieren, besteht darin, sie mit einem Detergens, typischerweise dem nicht-ionogenen Detergens Nonidet P40 (NP40), zu behandeln.
- Es kann wünschenswert sein, daß die oben definierten Verfahren weiters einen oder mehrere PCR-Durchgänge oder weitere PCR-Durchgänge umfassen. Vorzugsweise werden jegliche weitere PCR-Durchgänge unter Verwendung "gebündelter" Primer durchgeführt, die zu Sequenzen komplementär sind, die bei der vorherigen Amplifikation kopiert wurden.
- Es kann nützlich sein, bei jedem der oben definierten Verfahren, insbesondere bei jenen, bei denen PCR in der Zelle eingesetzt wird, nach dem Verbindungsschritt einen Waschschritt durchzuführen, um von der Außenfläche oder den Außenschichten der Zellen unerwünschtes Material, z. B. verbundene Kopien von anderen Zellen, zu entfernen, um das Hintergrund-"Rauschen" zu verringern. Das ist besonders nützlich, wenn eine oder mehrere weitere PCR-Durchgänge durchgeführt werden sollen.
- Alle bisher definierten Verfahren sind besonders nützlich für die Anwendung auf die Untersuchung von Immunglobulin-VH- und -VL-Domänen. Geeigneterweise kann es sich bei den kopierten Nukleinsäuresequenzen daher um genomische DNA-Sequenzen handeln (wie jene, die für Immunglobulin-VH- und -VL-Domänen kodieren). Aufgrund der höheren tatsächlichen Konzentration an mRNA (in bezug auf genomische DNA) in einer Zelle, die aktiv ein bestimmtes Protein kodiert, wird jedoch bevorzugt, daß mRNA in situ revers zu cDNA transkribiert und die resultierende cDNA durch PCR in der Zelle amplifiziert wird. Weiters spiegelt die Analyse von mRNA und nicht genomischer DNA die Aktivität der Zelle genauer wider.
- Die verschiedenen Verfahrensaspekte der vorliegenden Erfindung lassen sich auch leicht auf die Untersuchung der T-Zellen-Rezeptor-(TCR-)V-Gene in Zeltpopulationen anwenden.
- Natürlich kann es vorteilhaft sein, die nach den Verfahrensaspekten der vorliegenden Erfindung erzeugte Nukleinsäure zu isolieren. Daher werden die Produkte typischerweise in geeignete Vektoren insertiert. Das insertierte Nukleinsäureprodukt wird dann im allgemeinen sequenziert oder an Nukleinsäuresonden anneliert, um seine Identität zu bestätigen. Besonders geeignet sind Vektoren, die die Nukleinsäuresequenz als Polypeptid exprimieren können. Das ist von besonderem Interesse, wenn Sequenzen isoliert werden, die für VH- und/oder VL-Domänen kodieren, da es ein Verfahren zur Herstellung monospezifischer Antikörper-Bindungsfragemente darstellt. Derartige Klonier- und Expressionsvektoren sind Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Besonders bevorzugt wird ein Verfahren, nach dem VH/VL-Kombinationen auf der Oberfläche eines Phagen exprimiert werden (McCafferty et al. (9)), was ein wirksames Selektionsverfahren darstellt.
- Expression an der Oberfläche eines Phagen ist eine spezielle Ausführungsform eines allgemein bevorzugten Merkmals: der Expression des klonierten Nukleinsäureprodukts als Fusionsprotein. Als Alternative zur Fusion mit dem Hüllenprotein eines Phagen könnte das klonierte Nukleinsäureprodukt zur Detektion als Fusionsprotein mit einem Peptidmarker exprimiert werden.
- Somit erstreckt sich die Erfindung auf Proteine, die nach den Verfahrensaspekten der Erfindung exprimiert werden.
- Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine Zusammensetzung bereit, die. Kopien zweier oder mehrerer Nukleinsäuresequenzen, bevorzugt in der Nähe der Nukleinsäuresequenzen verbunden, umfaßt, von denen die Kopien stammen.
- Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Set zur Durchführung eines der Verfahrensaspekte der Erfindung bereit, das zumindest einen PCR-Primer zum Kopieren einer DNA-Sequenz von Interesse und eine Gebrauchsanweisung umfaßt.
- Optionale Komponenten, die im Set enthalten sein können, sind weiters überlappende und/oder gebündelte PCR-Primer, markierte Oligonukleotide, die als PCR-Primer oder als Sonden verwendet werden können, andere PCR-Reagenzien (wie z. B. Taq-Polymerase, Puffer) oder Reagenzien zum Fixieren und Permeabilisieren von Zellen.
- Es ist klar, daß die erfindungsgemäßen Verfahren eine große Bandbreite potentieller Anwendungsmöglichkeiten haben. Normalerweise wäre zu erwarten, daß derartige Verfahren für heterogene Zellpopulationen eingesetzt werden, aber es gibt keinen Grund, weshalb das Verfahren nicht für eine einheitliche Population eingesetzt wird, wenn das Informationen von Interesse liefert. Zu diesen Anwendungen gehört die Konstruktion von monoklonalen Antikörpern (oder Fragmenten davon) aus Populationen von B-Lymphozyten, aber sie sind keineswegs auf diese Anwendung beschränkt. Beispielsweise kann es zur Analyse der Kombinationen von Chromosomen verwendet werden, die in Somazellen-Hybridpopulationen vorhanden sind. Alternativ dazu könnte das Verfahren nicht zur Analyse diploider Zellpopulationen, sondern zur Untersuchung haploider Zellpopulationen, wie z. B. Spermazellen, verwendet werden. So könnte das Verfahren eingesetzt werden, um beispielsweise die Bindung zwischen genetischen Markierungen in menschlichem Sperma auf eine Weise untersuchen, die eine Verbesserung gegenüber der von Li et al. (1988, Nature 345, 414-417) (Verweis Nr. 39) beschriebenen darstellt, was Fachleuten klar sein wird.
- Die Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden veranschaulichenden Beispiele und unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen besser verstanden werden, in denen:
- Fig. 1 schematisch bestimmte Schritte eines Verfahrens gemäß vorliegender Erfindung veranschaulicht;
- die Fig. 2 bis 5 DNA-Sequenzen von Oligonukleotiden zeigen, die in Beispiel 1 als Primer verwendet werden,
- Fig. 6 schematisch die Zusammensetzung und Bündel-Amplifikation von Ig-V-Genen von Hybridomen zur Klonierung veranschaulicht;
- Fig. 7 schematisch die Bündel-Amplifikation zusammengesetzter Ig-V-Gene für Fluoreszenzmarkierung darstellt;
- Fig. 8 ein Photo der Ergebnisse von Gelelektrophorese von PCR-Produkten ist;
- Fig. 9 die intrazelluläre Lokalisierung von amplifizierter cDNA in Zellen unter Einsatz von Fluoreszenzmarkierung zeigt; und
- Fig. 10 die Durchflußzytometrie von K562-Zellen mit bcr-abl, amplifiziert nach dem erfindungsgemäßen Verfahren, zeigt.
- Die VH- und VL-Gene einer Hybridom-Zell-Linie können unter Einsatz der Polymerase- Kettenreaktion und von Primern kopiert werden, die sich am 5'- und 3'-Ende des VH- und auch des Vk-Gens befinden (Fig. 1). Die amplifizierte VH- und Vk-DNA wird dank einer Übereinstimmung zwischen den Primern am 3'-Ende des VH-Gens und am 5'-Ende des Vk-Gens während der PCR-Reaktion ebenfalls in der Reihenfolge 5' VH-Vk 3' verbunden (Schritt 1). Um die verbundenen Spezies aus den unverbundenen Spezies herauszufischen, wird ein zweiter Satz "gebündelter" PCR-Primer verwendet (Schritt 2).
- Die VH- und Vk-Gene werden wie folgt bevorzugt innerhalb derselben Zelle verbunden. Die Zelle wird zunächst mit Formaldehyd fixiert, um sie für den Temperaturzyklus zu stabilisieren, und mit Nonidet P40 behandelt, um die durch Sondieren und Sequenzieren analysierten Zeltklone zu permeabilisieren.
- Die Nukleotidsequenzen der reifen Schwerketten-VH-Domänen und der Leichtketten- Vk-Gene der Anti-Phenyloxazolon-Hybridome NQ2/12.4 und NQ10/12.5 sowie die kodierten Proteinsequenzen sind in den Fig. 2 bis 5 angeführt. In den Fig. 2 und 4 sind die VH- und Vk-Gene über eine Nukleotidsequenz verbunden, die für einen Polypeptid- Spacer kodiert, der eine flexible Polypeptidkette aufweist, um die beiden Domänen zu verbinden. Somit kodiert die komplette Nukleotidsequenz in den Fig. 2 und 4 für ein Einzelketten-Fv-Fragment. Der Spacer ist in den PCR-Primern MoVhlnk3 und MoVklnk3 enthalten, die zusammen mit einem VH-Rück-(NQ10/12.5- oder NQ2/12.4-)Primer und einem Vk-Vorwärtsprimer (MoJkFOR2) eingesetzt werden, um die VH- und Vk-Gene in einer Form zu amplifizieren und zu verbinden, die für die Expression geeignet ist. Die Fig. 3 und 5 sind ähnlich und zeigen einen kürzeren Linker, der ein einzelne Restriktionsstelle enthält, um das Klonieren eines längeren Polypeptidlinkers durch Einfügen eines synthetischen Oligonukleotids zu ermöglichen. Zur Identifizierung der verbundenen Gene werden weitere PCR-Zyklen zusammen mit einem gebündelten VH-Rück- (NQ10/12.5 BKNES- oder NQ2/12.4BNKES-)Primer und einem gebündelten Vk-Vorwärts-(Mok FORNES-)Primer eingesetzt.
- Im nachstehenden Beispiel war die Sequenz der Hybridom-Gene bereits bekannt, und es wurden für die Hybridome spezifische Promer konstruiert. Es können jedoch prinzipiell allgemeinere Primer eingesetzt werden, um beispielsweise allgemein variable Domänen mittels PCR zu klonieren (Verweis 5). Auch der zweite Durchgang der PCR- Amplifikation im Beispiel liefert ein sowohl am N- als auch am C-Terminus verkürztes einkettiges Fv. Ein unterschiedlicher Primer-Satz sollte diese Probleme allerdings lösen. Beispielsweise könnte für den ersten Schritt der PCR-Amplifikation-Kombination eine Familie von Vk-Vorwärts-Primern direkt an die 3'-Seite der J-Bereiche konstruiert werden: für RNA-Template entweder in der konstanten Cκ- oder Cλ-Domäne oder, für Genom-DNA-Template, im nähesten DNA-Bereich zur Spleißstelle. Es werden üblicherweise Linkprimer eingesetzt, die für eine Polypeptid-Sequenz (wie oben) kodieren, um beispielsweise VH und Vk als einkettiges Fv-Fragment zu verbinden. Der VH-Rück-Primer umfaßt eine Restriktionsstelle zum Klonieren in Expressionsvektoren. Zur Amplifi kation der verbundenen VH- und Vk-Gene des zweiten Schritts können ein oder mehrere Vk-Vorwärts-Primer, die innerhalb des Jk-Bereichs selbst eingebettet sind (und Restriktionsstellen zum Klonieren in Expressionsvektoren umfassen), in Verbindung mit dem VH-Rück-Primer eingesetzt werden.
- NQ2/12.4- oder NQ10/12.5-Hybridomzellen wurden in Gewebekulturkolben in Dulbecco's modifiziertem Eagle's-Medium gezüchtet, das 5% fötales Rinderserum enthielt. Kulturen in der späten logarithmischen Wachstumsphase wurden durch Abspülen anhaftender Zellen in das Überstandsmedium und Zentrifugieren des Mediums bei 800 U/min für 5 min bei Raumtemperatur geerntet. Der Überstand wurde entfernt, und die Zellen wurden in 5 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, pH 7,2) bei Raumtemperatur resuspendiert und erneut 5 min lang mit 800 U/min zentrifugiert (1. Wäsche). Zwei weitere Wäschen in 5 ml PBS erfolgten unter den gleichen Bedingungen. Die Zellpellets wurden dann in 10% Formal-Kochsalzlösung (10% Formalin [d. h. 4% Formaldehyd] und 0,15 M NaCl in destilliertem Wasser) suspendiert, wobei 1 ml pro 10-15 ml ursprüngliche Kultur verwendet wurde, und in 2 ml Eppendorf-Safe-Lock-Röhrchen übergeführt. Sie wurden 1 h lang unter heftigem Rühren auf einem Vortex-Mischer auf Eis inkubiert Die Zellen wurden dann mit 13.000 U/min in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert und dreimal in 1 ml eiskaltem PBS gewaschen, wobei sie durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren bei jeder Wäsche dispergiert wurden. Nach Entfernen des PBS nach der dritten Wäsche wurden die Pellets in 1 ml eiskaltem Nonidet P40 in Wasser resuspendiert und auf Eis eine weitere Stunde lang unter häufigem Rühren inkubiert. Die Zellen wurden unter heftigem Pipettieren vier weitere Male in 1 ml eiskaltem PBS gewaschen und in 0,2-0,5 ml kaltem PBS suspendiert, das 0,1 M Glycin enthielt. Eine Probe wurde mikroskopisch in einem Haemozytometer untersucht, und wenn Klumpen vorhanden waren, wurden sie durch heftiges Pipettieren oder wiederholtes Hindurchschicken durch eine Injektionsnadel mit 26 Gauge in einzelne Zellen dispergiert. Die Zellen wurden dann gezählt und auf 10&sup7; pro ml in PBS + 0,1M Glycin eingestellt und in 0,5 ml-Röhrchen aliquotiert (üblicherweise 0,05-0,1 ml pro Röhrchen) und in Trockeneis eingefroren. Die gefrorenen Allquote wurden bei -70ºC gelagert.
- Variable Schwer- und Leichtketten-Bereiche wurden durch 2-stufige Polymerase-Kettenreaktion kombiniert und amplifiziert. Im ersten Schritt wurden VH- und Vk-Gene miteinander verbunden, und im zweiten Schritt wurde das zusammengesetzte Produkt aus dem Zelltemplat amplifiziert. Reaktionen wurden in Techne HI-TEMP 96-Polycarbonat- Mikroplatten unter Verwendung eines programmierbaren Techne PHC-3-Heizblocks oder in 0,5 ml Sarstedt-Röhrchen unter Einsatz eines Biotherm Inc. BioOven durchgeführt.
- Wasser 26,5 ul
- Vorwärts-Vk-Primer 2,5 ul
- Rück-Vh-Primer 2,5 ul
- Vorwärts-Linkprimer 0,5 ul
- Rück-Linkprimer 0,5 ul
- dNTPs (5mM) 2,0 ul
- 10 · PCR-Puffer 5,0 ul
- Zelltemplat (in PBS/Glycin) 10,0 ul
- Taq-Polymerase (5 Einheiten/ul) 0,5 ul
- Ein Tropfen Öl wurde zugegeben, wenn Techne-Platten verwendet wurden, aber nicht, wenn Röhrchen im BioOven eingesetzt wurden. Die Zykluszeiten und -temperaturen waren folgende:
- Techne PHC-4-Block: 94ºC 30 s
- 65ºC 1 min
- 72ºC 1 min 30 Zyklen
- BioOven: 95ºC 30 s
- 65ºC 30 s
- 72ºC 30 s 30 Zyklen
- VhRück NQ2/12.4 RÜCK
- 5' CAG GTG CAG CTG AAG GAG TCA GG 3'
- 5' TGC AGC TGG TGG AGT CTG GGG G 3'
- VkVorwärts MoJk5FOR2'
- 5' CTT ACG TTT CAG CTC CAG CTT GG 3'
- Vorwärts-Link MoVh 1 nk3
- 5'CCA CTG CCG CCA CCA CCG CTA CCA CCA
- CCA CCT GCA GAG ACA GTG ACC AG 3'
- 5' CAA TTT Ggc tag cTG CAG AGA CAG TGA (Nhe I)
- CCA GAG TCC CTT GGC CCC A 3'
- Rück-Link MoVklnk3
- 5'GCG GTG GTG GCG GCA GTG GCG GCG GCG
- GCT CTC AAA TTG TTC TCA CCC AGT CTC CAG C 3'
- 5'CAG TGT CTC TGC gct agc cCA AAT TGT TCT
- CAC CCA GTC TCC AG 3'
- (Die Ink3-Primer wurden als Paar eingesetzt; ebenso die LNK4-Primer.)
- Nach Beendigung des ersten Schritts wurden die Zelltemplate von den übrigen Reagenzien abgetrennt und gewaschen. In Techne-Platten wurde das Überstands-PCR-Gemisch und das überstehende Öl sorgfältig abpipettiert, wodurch die Zellen am Boden des Napfes zurückblieben. Die Zellen wurden dann in 0,2 ml PBS/0,1 M Glycin suspendiert und in einer Mikrozentrifuge bei 13.000 U/min zentrifugiert. Nach dem Resuspendieren im selben Puffer wurden sie als zweite Wäsche erneut zentrifugiert und dann zur Verwendung als Templat im zweiten Schritt in 10 ul PBS/Glycin resuspendiert. Röhrchen aus dem BioOven wurden mit 13.000 U/min zentrifugiert, das Überstands-PCR-Gemisch entfernt und die Zellen vor dem abschließenden Resuspendieren in 10 ul PBS/Glycin zur Verwendung als Template des zweiten Schritts zweimal in 0,2 ml PBS/Glycin gewaschen. Alle ersten PCR-Uberstände wurden aufbewahrt.
- Wasser 27,5 ul
- gebündelter Vorwärtsprimer (10 umol/ul) 2,5 ul
- gebündelter Rückprimer 2,5 ul
- dNTPs (5 mM) 2,0 ul
- 10 · PCR-Puffer 5,0 ul
- gewaschenes Zelltemplat aus Schritt 1 10,0 ul
- Taq-Polymerase (5 Einheiten/ ul) 0,5 ul
- Die Zyklusbedingungen waren die gleichen wie bei der Reaktion des ersten Schritts, umfaßten aber abschließende 10 min bei 65º.
- Primer des zweiten Schritts (10 pmol/ul):
- gebündelter Vorwärtsprimer Mok5FORNES
- 5'CCC AGC ACC GAA CGT GAG TGG 3'
- gebündelter Rückprimer NQ2/12.4BKNES
- 5'CGC CCT CAC AGA GCC TGT CCA 3'
- ODER NQ10/12.5BKNES
- 5' AGC CTG GAG GGT CCC GGA AAC 3'
- (zusammen mit dem jeweiligen Zelltemplat eingesetzt).
- Die Produkte sowohl des ersten als auch des zweiten PCR-Schritts wurden in 2%-igem Agarosegel laufen gelassen, das in 0,5 · TBE-Puffer hergestellt wurde und 0,5 ug/ml Ethidiumbromid enthielt, wobei phiX174 HaeIII als Marker diente. Die Ergebnisse wiesen darauf hin, daß bei der PCR des ersten Schritts Fragmente jener Größe zu erkennen sind, die für einzelne VH- und Vk-Gene erwartet werden, aber nach der PCR des zweiten Schritts Fragmente zu sehen sind, die den zusammengesetzten Fragmenten entsprechen (siehe Schema aus Fig. 1).
- Die mutmaßlichen Sequenzen der verbundenen Fragmente werden in den Fig. 2 bis 5 gezeigt.
- In diesem Beispiel wird gezeigt, daß es möglich ist, eine Wasser-in-Öl-Emulsion herzustellen, die während der gesamten PCR stabil ist und in der es möglich ist, Plasmid-DNA zu amplifizieren.
- Nachdem eine Reihe von Detergenzien mit einem HLB-(Hydrophilie-Lipophilie-Gleichgewichts-)Wert von 3,5-6 (von Triton-X15 bis Brij52) und eine Reihe von Ölen (n-Dodecan bis zu schwerem Mineralöl (Sigma)) ausprobiert worden war, wurde festgestellt, daß Span-60 (Sigma) und weißes Leichtöl (Sigma) eine Emulsion ergaben, die zumindest 30 PCR-Zyklusdurchgänge überdauerte. Es wurde geschätzt, daß eine Tröpfchengröße von 25-50 um Durchmesser ausreichte, um eine Zelle zu beinhalten. Die für PCR in Emulsionen geeigneten Bedingungen sind nachstehend angeführt. Die Sequenzen der Primer sind in Beispiel 1 angeführt.
- 5 ul 10 · PCR-Puffer [10 · PCR = 100 mM Tris-HCl pH 8,3/500 mM, KCl/25 mM MgCl&sub2;]
- 4 ul 2,5 mM Desoxynukleotidtriphosphate (pH 7,5)
- 2 ul NQ10/12.5 RÜCK-Primer (10 pmol/ul)
- 2 ul Mojk5FOR2-Primer (10 pmol/ul)
- 2 ul MoVHLNK4 (1 pmol/ul)
- 2 ul MoVkLNK4 (1 pmol/ul)
- 5 ul Taq-DNA-Polymerase (Cetus 5 U/ul)
- 1 ul Plasmid, das NQ10/12.5 VH-Gen (3 ng pBluescriptIIKS von Stratagene) enthielt
- 1 ul Plasmid, das NQ10/12.5 Vk-Gen (3 ng pBluescriptIIKS von Stragene) enthielt
- H&sub2;O (HPLC-Reinheit) auf 50 ul
- Das Gemisch wurde 5 min lang bei 64ºC inkubiert.
- 100 ul frisch zubereitetes 2% Span 60 in Light White Oil wurde bei 64ºC zugegeben. Die beiden Phasen wurden durch heftiges Rühren für 30 s vermischt, dann sofort auf einen PCR-Block (Techne PHC-3) mit 64ºC übertragen und 30 Zyklen bei 94ºC (1 min), 62ºC (1 min), 72ºC (2 min) unterzogen, dann bei 64ºC gehalten Die Emulsion wurde visuell überprüft und schien stabil zu sein, war aber cremig geworden. Die überschüssige Ölphase wurde entfernt und verbleibendes Öl und Span 60 durch Extraktion bei 64ºC mit Diethylether und dann zwei weitere Extraktionen bei Raumtemperatur entfernt. Die Röhrchen wurden bei 64ºC inkubiert, um den überschüssigen Ether zu entfernen, und dann wurde 1 ul der DNA für einen zweiten PCR-Durchgang wie in Beispiel 1 mit den gebündelten Primern entfernt. Die Analyse der DNA auf 2% Agarosegel mit hoher Geliertemperatur zeigte, daß es zur Verbindung gekommen war.
- Es ist hilfreich, die Taq-Polymerase vor Denaturierung zu schützen, die in den Mikrotröpfchen oder bei der Bildung der Tröpfchen stattfindet. So haben die Erfinder des vorliegenden Anmeldungsgegenstandes festgestellt, daß die Ausbeuten zusammengesetzter Gene verbessert werden können, indem eingekapseltes Enzym verwendet wird, beispielsweise unter Verwendung von E.coli-Bakterien, in denen das Enzym kloniert wurde und exprimiert wird (Engelke et al., Anal. Biochem. 191, 396-400 (1990) (Ver weis Nr. 40). Indem an der obigen Vorschrift Änderungen vorgenommen werden, zu denen Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung in der Lage sind, ist zu erwarten, daß die VH- und Vk-Gene aus Zellpopulationen amplifiziert und zusammengesetzt werden können.
- Monoklonale Antikörper stellen Reagenzien zur Identifizierung von Markerproteinen (sowie Lipiden und Kohlenhydraten) bereit, die innerhalb von Zellen (1), an der Oberfläche von Zellen (2) exprimiert oder aus Zellen ausgeschieden (3) werden. Diese Reagenzien haben diverse Verwendungsmöglichkeiten, von der Lokalisierung von Zellen in histologischen Schnitten (1) bis zur Verwendung von fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) von Zellpopulationen (4). In Anbetracht der Nukleotidsequenz, die für einen gewünschten Marker kodiert, könnte jedoch im Prinzip die mRNA-Spezies als Markierung für eine Zelle verwendet werden. Daher ist ein Verfahren untersucht worden, bei dem die mRNA innerhalb der Zelle revers transkribiert wird, die cDNA unter Einsatz der Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert wird und in der Zelle unter Einsatz von fluoreszierenden PCR-Primern detektiert wird.
- Im Prinzip könnte ein solches Verfahren auch eingesetzt werden, um Kombinationen von mRNAs zu detektieren und zu klonieren, indem die PCR-amplifizierten cDNAs innerhalb derselben Zelle verbunden werden. Insbesondere könnte es bei der Klonierung von Ig-V-Gen-Kombinationen aus immunisierten oder autoimmunen Quellen unter Einsatz von DNA-Rekombinations-Techniken helfen. Zur Zeit werden Repertoires von Antikörper-Schwer- und -Leichtketten aus Lymphozyten-Populationen durch PCR hergestellt (5, 6, 7), statistisch kombiniert (8) und als lösliche Fragmente in Bakterien zum Screenen mit Antigen exprimiert (8), oder an der Oberfläche von filamentösen Phagen freigelegt und durch Panning selektiert (9, 10). Die ursprünglichen Kombinationen aus schweren und leichten Ketten der B-Lymphozyten werden jedoch zerstört (11, 12), und die künstlichen Kombinationen können von Misch-Ketten dominiert werden (10, 13), was zu unterschiedlichen Affinitäten (10) und Spezifitäten (14) führt. PCR in der Zelle und Verbindung schwerer und leichter Ketten würde ermöglichen, daß die ursprünglichen Kombinationen der B-Lymphozyten beibehalten werden.
- Frühere Arbeiten hatten gezeigt, daß Lentivirus-DNA in situ unter Verwendung von PCR amplifiziert werden kann und die infizierten Zellen durch Autoradiografie detektiert werden können (15). Die Erfinder des vorliegenden Anmeldungsgegenstandes haben einen ähnlichen Ansatz zur Herstellung und Amplifikation von cDNAs innerhalb derselben Zelle entwickelt, wie mit zwei Hybridom-Zell-Linien, B1-8 (16) und NQ10/12.5 (17), und der K562-Erythroleukämie-Linie (18) gezeigt. Die Zellen wurden mit Formalin fixiert und mit dem Detergens NP40 permeabilisiert, um den Zugang für Nukleotide, Primer und Enzyme zu ermöglichen. Zum Verbinden der Ig-Schwer- und -Leichtketten- V-Gene derselben Zelle während PCR in der Zelle wurde ein Primer dazu konstruiert, am 3'-Ende des VH-Gens zu primen, und ein weiterer dazu, am 5'-Ende des VL-Gens zu primen, aber mit komplementären Schwänzen, um eine Selbst-Kombination der VH- und VL-Gene zu ermöglichen.
- NQ10/12.5-Maus-Hybridomzellen wurden in Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium, ergänzt mit 5% fötalem Rinderserum (FBS), und B1-8 Hybridomzellen in RPMI 140-Medium, ergänzt mit 5% FBS, vermehrt. Zellen wurden in der späten Log-Phase verwendet oder durchgehen gelassen, als beinahe alle lebensfähig waren. NQ10/12.5 sekretiert eine κ-Leichtkette und B1-8 eine λ-Leichtkette (16, 17). Die Sequenzen der VH- und VL-Gene für beide dieser Hybridome sind bekannt (16, 17). Die menschliche Myeloid-Leukämie-Zell-Linie K562 wurde in RPMI mit 5 % FBS gezüchtet. Diese Linie trägt das Philadelphia-Chromosom, das durch ein bcr-abl-Fusionsgen als Ergebnis einer Translokation zwischen dem abl-proto-Onkogen auf Chromosom 9 und dem bcr-Gen auf Chromosom 22 gekennzeichnet ist (19).
- Zellen (10&sup7; bis 10&sup8;) wurden mit 50 · g 5 min lang sedimentiert, dreimal in 5 ml PBS, pH 7,2, bei Raumtemperatur gewaschen und dann in 1 ml eiskalter 10%-iger Formaldehyd- Lösung in 0,15 M NaCl (Formal-Kochsalzlösung) suspendiert. Sie wurden 1 h lang auf Eis gehalten, wobei gelegentlich auf einem Vortex-Mischer gerührt wurde. Dann wurden sie mit 13.000 U/min in einer Mikrozentrifuge 2,5 min lang zentrifugiert und dreimal in eiskaltem PBS gewaschen, unter heftigem Pipettieren mit einer Pasteur-Pipette, um jegliche mit freiem Auge sichtbare Klumpen zu resuspendieren und zu dispergieren. Die Zellen wurden als nächstes in 0,5% Nonidet P40 (NP40, B. D. H.) in Wasser suspendiert. Nach einer weiteren Stunde Inkubation auf Eis unter häufigem Rühren wurden sie wieder dreimal unter heftigem Pipettieren in eiskaltem PBS gewaschen. Eine abschließende Wäsche erfolgte in PBS, das 0,1 M Glycin enthielt, und die Zellen wurden in 0,2 bis 0,5 ml des gleichen Puffers resuspendiert, wobei eine 1 ml-Injektionsnadel mit 26 Gauge verwendet wurde, um die unter einem Lichtmikroskop sichtbaren Klumpen zu dispergieren. Die Zellen wurden gezählt und bei den meisten Versuchen auf eine Endkonzentration von 10&sup7; pro ml eingestellt. Sie wurden in kleinen Aliquoten in Trockeneis eingefroren und bei -7ºC bis zu einem Monat lang eingefroren.
- Die Oligonukleotide sind gemäß ihrer Verwendung als Primer oder Sonden gelistet. Die Sequenzen basierten auf der Sequenz der Hybridom-V-Gene (16, 17) und des bcr-abl- Gens (20) und wurden unter Verwendung des Applied Biosystems 394 DNA-Synthesizers synthetisiert und ohne Reinigung weiterverwendet.
- MOLFOR (5' CTT ACG TTT CAG CTC CAG CTT GG 3'), MOJH3FOR
- (5' TAG GAC TCA CCT GCA GAG ACA GTG 3'), B1-8LFOR (5' GCC
- TAG GAC AGT CAG TTT GGT TC 3'), B1-BVHLINK3 (5' CCA CTG
- CCG CCA CCA CCG CTA CCA CCA CTG AGG AGA CTG TGA GAG TGG
- TGC 3').
- MOLFOR, MOJH3FOR, B1-8LFOR, B1-8VHLINK3, NQ2BK (5' CAG GTG
- CAG CTG AAG GAG TCA GG 3'), NQ10BK (5' TGC AGC TGG TGG AGT
- CTG GGG G 3'), B1-8BK (5' CAG GTC CAA CTG CAG CAG CCT G
- 3'), BCRIA (5' AGT TAC ACG TTC CTG ATC TC 3'), ABL2C (5'
- TTA TCT CCA CTG GCC ACA AA 3'), MOVHLINK3 (5' CCA CTG CCG
- CCA CCA CCG CTA CCA CCA CCA CCT GCA GAG ACA GTG ACC AG
- 3'), MOVRLINK3 (5' GCG GTG GTG GCG GCA GTG GCG GCG GCG GCT
- CTC AAA TTG TTC TCA CCC AGT CTC CAG C 3'), B 1-BVLLINK3 (5'
- GCG GTG GTG GCG GCA GTG GCG GCG GCG GCT CTC AGG CTG TTG
- TGA CTC AGG AAT CTG C 3').
- B1-BVLLINK3, B1-BVHLINK3, MOVHLINK3, MOVLLINK3.
- NQ10BKNES (5' AGC CTG GAG GGT CCC GGA AAC 3'), B1-8BKNES
- (S' GAG CTT GTG AAG CCT GGG GCT T 3'), MOLFORNES (5' CCC
- AGC ACC GAA CGT GAG TGG 3'), B1-8FORNES (5' CCA CCG AAC
- ACC CAA TGG TTG CT 3'), V186.2 (5' AGA CAA ACC CTC CAG
- 3').
- M13B1-8BKNES (5' CAG GAA ACA GCT ATG ACC GAG CTT GTG AAG
- CCT GGG GCT 3'), M13B1-8FORNES (5' CAG GAA ACA GCT ATG ACC
- CCA CCG AAC ACC CAA TGG TTG CT 3'), -21MOLFORNES (5' TGT
- AAA ACG ACG GCC AGT CCC AGC ACC GAA CGT GAG TGG 3'), -
- 21NQ10BKNES (5' TGT AAA ACG ACG GCC AGT ACG CTG GAG GGT
- CCC GGA AAC 3'), -21BCR1B (5' TGT AAA ACG ACG GCC AGT TCT
- GAC TAT GAG CGT GCA GA 3'), -21ABL2D (5' TGT AAA ACG ACG
- GCC AGT AGT GCA ACG AAA AGG TTG GG 3').
- - 21ROX or -21FAM (5' TGT AAA ACG ACG GCC CAG 3'), M13ROX
- (5' CAG GAA ACA GCT ATG AC 3')
- im Handel von Applied Biosystems erhältlich.
- B1-8LPRB (5' CTG TAC CAT AGA GCA CAG 3'), NQ10PRB (5' GAG
- TTT CCG GGA CCC TCC AG 3'), NQ10KPRB (5' TTG GAA CCA GTT
- CAT GTA C 3'), V186.2.
- Für cDNA-Synthese in der Zelle von Ig V-Genen der Hybridome wurden 10&sup6; fixierte Zellen aufgetaut, zentrifugiert, mit 200 ul Wasser gewaschen und dann in 20 ul Wasser resuspendiert. Es wurde ein "Erster Strang"-Gemisch frisch zubereitet, das 5 ul 10 · "Erster Strang"-Puffer (1,4 M KCl, 0,5M Tris-HCl pH 8,1 bei 42ºC, 90 mM MgCl&sub2;) 5 ul 0,1 M Dithiothreitol (DTT), 5 ul 5 mM dNTPs, 25 umol jedes Vorwärtsprimers, 80 Einheiten RNase-Inhibitor (RNasin, Promega) und Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 28 ul enthielt. Die Zellen wurden für 3 min auf 65ºC erhitzt, dann auf Eis abgekühlt. Das "Erster Strang"-Gemisch wurde zugegeben, gefolgt von 40 Einheiten Reverse Transkriptase Super RT AMV (HT Biotechnology Ltd., Cambridge, GB). Die Zellen und Reagenzien wurden vermischt und bei 42ºC 1 h lang inkubiert, dann wurden die Zellen zentrifugiert, in 200 ul PBS (pH 7,2) mit 0,1 M Glycin (PBS/0,1 M Glycin) gewaschen und in 20 ul des gleichen Puffers resuspendiert, um sie sofort in der PCR einzusetzen. Für K562-Zellen erfolgte die cDNA-Synthese wie oben, mit der Ausnahme, daß statistische Primer und Oligo (dT) verwendet wurden (21).
- Für die cDNA-Synthese von Hybridom-Zell-Lysaten wurden lebensfähige Zellen (5 · 10&sup6;) 5 min lang in 100 ul Wasser gekocht, das 0,1% Diethylpyrocarbonat enthielt, und 2 min lang bei 13.000 U/min in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert. Ein "Erster Strang"- Gemisch wurde hergestellt, das 10 ul 10 · "Erster Strang"-Puffer, 5 ml 5 mM dNTPs, 5 ul 100 mM DTT und jeweils 25 umol Vorwärtsprimer enthielt. Es wurde einem Volumen von 62-67 ul Überstand von den gekochten Zellen zugegeben und das Gemisch 3 min lang auf 65ºC erhitzt und 15 min lang auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. RNasin (160 Einheiten) und Reverse Transkriptase (100 Einheiten) wurden zugegeben, um das Gesamtvolumen auf 100 ul zu bringen, gefolgt von 1-stündiger Inkubation bei 42ºC. Zur PCR-Amplifikation wurden die Reaktionen wie nachstehend beschrieben durchgeführt, aber mit 5 ul des löslichen Templats pro Röhrchen.
- Reaktionen wurden in 50 ul-Volumina in 0,5 ml Sarstedt-Röhrchen mit 10 ul fixierten Templatzellen in PBS/0,1 M Glycin-Puffer, 25 umol Rückprimer, 25 umol Vorwärtsprimer, 200 uM dNTPs, 5 ul 10x Taq-Polymerase-Puffer (Promega) und 2,5 Einheiten Taq- Polymerase durchgeführt. Die Röhrchen wurden bis zu 40 PCR-Zyklen unter Denaturierung bei 95ºC und Verlängerung bei 72ºC für jeweils 1 min unterzogen. Das Annelieren erfolgt für 1 min bei Temperaturen im Bereich von 60ºC bis 72ºC. Falls Zell-Gewinnung erforderlich war, wurde ein Thermozyklus-Ofen ("BioOven", Biotherm Corp.) verwendet, der keine Verwendung einer Mineralöl-Überschichtung erforderte. Falls keine Zell-Gewinnung erforderlich war, wurden die Zyklen auf einem Zyklus-Heizblock (Techne PHC-3) mit einer Überschichtung mit 50 ul Mineralöl durchgeführt.
- Die cDNAs wurden mittels PCR amplifiziert und in derselben Reaktion unter Verwendung von Primern mit komplementären Schwänzen verbunden (22) (Fig. 6).
- Fig. 6 veranschaulicht die Kombination und die gebündelte Amplifikation von Ig-V-Genen aus Hybridomen zur Klonierung, cDNA-Synthese und Verbindung von VH- und VL- Gen aus den Hybridomen NQ10/12.5 und B1.8. Die angegebenen Sequenzen von Primern (kleine Pfeile) sind wie zuvor beschrieben. In jedem Schritt ist der Templatstrang mit einer dicken Linie und der neu synthetisierte (erste) Strang mit einer dünnen Linie markiert; in einigen Fällen sind in der Figur zwei Schritte kombiniert, und der zweite synthetisierte Strang (unter Verwendung des ersten als Templat) ist dann mit einer strichlierten Linie markiert. Sequenz-Markierungen zum Verbinden sind als Blöcke markiert. (1) cDNA-Synthese, (2) erste PCR, (3) weitere Durchgänge erster PCR, was VH und VL mit "markierten" und komplementären Enden liefert, (4) Verbinden von VH und VL während der ersten PCR, (5) zweite "gebündelte" PCR, (6) zusammengesetzte und amplifizierte VH- und VL-Gene. Es ist anzumerken, daß für die cDNA-Synthese von B1- 8-Zellen der markierte Primer B1-8VHLINK3 verwendet wurde, aber die Markierung ist in der Figur nicht gekennzeichnet.
- Die Reaktionen wurden in 50 ul-Volumina in Röhrchen wie folgt durchgeführt.
- 25 umol VH-Rückprimer, 25 umol VL-Vowärtsprimer, 10 umol VH-Vorwärtsprimer mit Linkersequenz, 10 umol VL-Rückprimer mit Linkersequenz, 200 uM dNTPs, 5 ul 10 · Taq-Polymerase-Puffer, 2,5 Einheiten Taq-Polymerase und 10 ul fixierte Zellen in PBS/0,1 M Glycinpuffer. Generell wurden 10&sup5; (aber manchmal bis zu 5 · 10&sup5;) Zellen pro Röhrchen verwendet, und die Röhrchen wurden 30 Zyklen mit 95ºC für 30 s, 65 ºC für 30 s und 72ºC für 30 s unterzogen. Die Zellen wurden mit 13.000 U/min zentrifugiert, zweimal in 200 ul PBS/0,1 M Glycin gewaschen und in 10 ul PBS/Glycin resuspendiert. Um die zusammengesetzten Produkte zu amplifizieren, wurde eine zweite PCR mit den gewaschenen Zellen, gebündelten Primern (23), wobei 25 umol gebündelter VH-Rückprimer und 25 umol gebündelter VL-Vorwärtsprimer verwendet wurden, 200 uM dNTPs, 5 ul 10 · PCR-Puffer und 2,5 Einheiten Taq-Polymerase durchgeführt. Die Zellen wurden 30 weiteren PCR-Zyklen unterzogen, und DNA zum Klonieren wurde aus dem Überstand isoliert.
- Bei Versuchen mit einem Gemisch zweier Zell-Linien waren alle vier PCR-Primer für jede Zell-Linie (insgesamt 8 Primer) sowohl in der ersten als auch der zweiten "gebündelten" PCR enthalten, wobei ein 10 ul-Reaktionsvolumen verwendet wurde cDNA wurde aus einem 1 : 1-Gemisch aus mit B1-8 und NQ10/12.5 (Nq10) fixierten Zellen unter Verwendung der Primer MOLFOR, MOJH3FOR, B1-8LFOR und B1-8VHLINK3 synthetisiert und die Zellen zur PCR-Verbindung in PBS/0,1 M Glycin resuspendiert. Die erste PCR wurde unter Verwendung der VL-Vorwärtsprimer MOLFOR und B1-8LFOR sowie der VH-Rückprimer NQ10BK und B1-8BK durchgeführt. Um die beiden Gensätze zu verbinden, waren auch die PCR-Linkerprimer MOVHLINK3, MOVKLINK3, B1- 8VLLINK3 und B1-8VHLINK3 enthalten. Die 3'-Enden der PCR-Linkerprimer sind komplementär zu den Enden des DNA-Templats, umfassen aber eine 5' "Markierung", um Zusammensetzung der VH- und VL-Gene zu ermöglichen (Fig. 6). Die Markierungen waren sowohl für NQ10- als auch B1-8-Linkerprimer identisch, so daß alle möglichen Kombinationen aus VH und VL gebildet werden konnten. Bei der zweiten PCR wurden die gebündelten Primer NQ10BKNES, MOLFORNES, B1-8BNEKS und B1-8FORNES verwendet.
- cDNA in den B1-81 und NQ10-Zellen wurde PCR unterzogen, um VH-Gene zu amplifizieren, wobei die in Tabelle 1 angeführten Primer verwendet wurden. Sie wurden dann zweimal gewaschen und die Gene weiter mit gebündelten PCR-Primern amplifiziert, die mit Sequenzen markiert waren, die zu diesen fluoreszenzmarkierten Primern (-21ROX, -21FAM, M13ROX, die für die DNA-Sequenzierung verwendet wurden) komplementär waren (Tabelle 1). Nach dem Waschen wurde eine dritte PCR mit 3 umol M13- oder -21-Primern, markiert mit 6 Carboxy-X-Rhodamin (ROX) (Applied Biosystems) verwendet. Die Bedingungen für jede PCR waren 94ºC für 40 s, 58ºC für 40 s und 72ºC für 40 s. Nach dem letzten Schritt wurden die Zellen dreimal in TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,4) gewaschen und im gleichen Puffer suspendiert. Eine ähnliche Vorschrift wurde eingesetzt, um zusammengesetzte VW-VL-DNA zu amplifizieren (Tabelle 1). Die cDNA von K562-Zellen wurde der Amplifikation unter Verwendung von PCR- Primern unterzogen, die für das bcr-abl-Fusionsgen spezifisch waren (Tabelle 1). Zur Fluoreszenzmikroskopie von K562 wurden ROX-markierte Primer in der dritten PCR eingesetzt, und zur Durchflußzytometrie wurden sowohl mit ROX als auch mit 5'-Carboxyfluorescein (FAM) markierte Primer (Applied Biosystems) in getrennten Präparaten verwendet (Fig. 7).
- Fig. 7 veranschaulicht die gebündelte Amplifikation von zusammengesetzten Ig-V-Genen für Fluoreszenzmarkierung. In dieser Figur zeigt (1) die zweite "gebündelte" PCR mit markierten Primern, um Primerstellen für "universelle" Fluoreszenzprimer einzuführen, und (2) zeigt die dritte PCR mit Fluoreszenzprimern. Die gleichen Fluoreszenzprimer können sowohl am 5'- als auch am 3'-Ende der markierten Sequenzen primen.
- Die Zellen wurden auf einem MRC 500 konfokalen Laserrastermikroskop (BioRad) untersucht und photographiert. Zwischen 10³ und 10&sup4; Zellen in 10 ml TE wurden auf einem Glasplättchen ausgebreitet, mit einem Deckplättchen abgedeckt und an den Enden mit Nagellack abgedichtet. Außerdem wurde zytofluorographische Analyse mittels eines FACScan-Durchflußzytometer (Becton Dickinson) durchgeführt. Die Fluoreszenzdaten wurden als logarithmische Überlagerungshistogramme unter Verwendung von Consort 30 Software (Becton Dickinson) angezeigt. Zellbruchstücke wurden ausgeblendet, und pro Probe wurden 10&sup5; Zellen analysiert.
- DNA aus den Überständen von Zellen nach dem Verbinden und Amplifizieren wurde über 1,5% Agarosegele in 0,5 · Tris-Borat-EDTA-(TBE-)Puffer (pH 8,0) gereinigt, wobei Ethidiumbromid (0,5 ug/ml) in den Gelen enthalten war. Die Banden von zusammengesetzter DNA mit etwa 600 bp wurden mit Geneclean II (Bio 101 Inc.) eluiert, wobei Geneclean "TBE-Modifikator" zugegeben wurde. Die gereinigte DNA wurde in einen "T-Vektor" ligiert, der von Bluescript KS&spplus; (Stratagene) abgeleitet war (24), und der Vektor durch Elektroporation in E.coli CMK603 transfiziert. Die Zellen wurden über Nacht auf TYE-Platten (25) mit 100 ug/ml Ampicillin, 5-Brom-4-chlorindolyl-B-D-galactosid (26) und Isopropyl-B-D-1-thiogalactopyranosid (27) vermehrt. Weiße Kolonien wurden mehrfach plattiert, um Kolonie-Lifts zur Hybridisierung herzustellen, oder zur Verwendung als Template für PCR-Screening.
- Zum PCR-Screening von Kolonien (28) wurden die Reaktionen in 20 ul Volumina in einzelnen Näpfen von Hi-temp-Platten (Techne) durchgeführt, sowie 8 umol Vorwärts- und Rückprimer, 200 uM dNTPS, 2 ul 10 · Taq-Puffer und 0,4 Einheiten Taq-Polymerase pro Napf enthielten. Um beispielsweise Klone aus der PCR in der Zelle der gemischten Hybridome NQ10 und B1-8 zu identifizieren, wurde jeder Klon mit den Primern NQ10BKNES und MOLFORNES, B1-8BKNES und B1-8FORNES, NQ10BKNES und B1- 8FORNES sowie B1-8BKNES und MOLFORNES gescreent. Jeder Napf wurde mittels eines Zahnstochers mit Bakterien aus einer einzigen mehrfachplattierten Kolonie beimpft und mit 50 ul Mineralöl überschichtet. Die Platten wurden 30 Zyklen von 95ºC für 30 s, 65ºC für 1 min und 72ºC für 1 min auf einem Techne PHC-3-Heizblock unterzogen, der für Mehrfach-Napfplatten bestimmt war. Die PCR-Produkte wurden auf 1,5% Agarosegelen (10 ul pro Spur) laufen gelassen.
- Zur Koloniehybridisierung wurden Bakterienkolonie-Lifts unter Verwendung von Hybond-N-Nylonmembranen (Millipore) durchgeführt. Die Bakterien wurden mit Natriumdodecylsulfat lysiert, und die DNA mit Mikrowellen denaturiert und an der Membran fixiert (29), gefolgt von UV-Vernetzung. Oligonukleotid-Sonden für schwere (V186.2) und leichte (B1-8LPRB) Ketten des B1-8-Hybridoms sowie schwere (NQ10PRB) und leichte (NQ10KPRB) Ketten des NQ10/12.5 Hybridoms wurden mit γ-³²P-ATP unter Einsatz von Polynukleotidkinase (New England BioLabs) markiert und für 16 bis 60 h an die Nylonfilter hybridisiert. Die Filter wurden mit Lösungen gewaschen, die Tetramethylammoniumchlorid (21) enthielten, und auf Kodak XAR 5-Film belichtet.
- In einer früheren Arbeit waren mit Lentivirus infizierte Zellen mit Paraformaldehyd fixiert und in Ethanol gelagert worden (15). Die Erfinder des vorliegenden Anmeldungsgegenstandes fixierten die Hybridom- und Leukämie-Zellen mit Formal-Kochsalzlösung, machten sie mit NP40 durchlässig und lagerten die Zellen gefroren in PBS/0,1 M Glycin. Sie stellten fest, daß ihr Verfahren bei diesen Zellen zu hohen Ausbeuten ah amplifizierter DNA führte, was im Zellüberstand detektiert wurde (siehe unten). Die fixierten und permeabilisierten Zellen blieben während des Temperaturzyklus intakt, und bei PCRs von genomischer DNA mit Primern, die für die VH- und Vk-Bereiche der Hybridomlinien NQ2/12.4 und NQ10/12.5 (NQ10) spezifisch waren, wurden routinemäßig amplifizierte Produkte mit etwa 300 bp in den Zellüberständen erhalten. Permeabilisierung war ein notwendiger Schritt (Fig. 8), aber Formaldehyd-Konzentrationen im Bereich von 4 bis 10% waren gleichermaßen für die Fixierung wirksam. Fixierte und permeabilisierte Zellen, die cDNA-Synthese unterzogen worden waren, erwiesen sich als viel besseres Templat zur PCR-Amplifikation (wie anhand der Beispiele in Fig. 8 gezeigt), was die Gelelektrophorese der PCR-Produkte zeigt. In dieser Figur wurden Überstände von cDNA-Amplifikationen über ein 1,5% Agarasegel in TBE-Puffer laufen gelassen. Diese sind von links nach rechts: Spuren 1 und 11, phi X174 HaeIII-Marker; Spur 2, PCR von B1-8 VH von fixierten Zeilen (nur Formalin); Spur 3, PCR von B1-8 VH von fixierten und permeabilisierten Zellen (Formalin und NP40); Spur 4, PCR-Verbindung von B1-8 VH und Vλ von fixierten und permeabilisierten Zellen; Spur 5, wie Spur 4, mit der Ausnahme, daß in der zweiten PCR gebündelte Primer verwendet wurden; Spur 6, wie Spur 5, aber mit fixierten Zellen; Spur 7, Blindprobe; Spuren 8, 9 und 10, wie die Spuren 3, 4 und 5, aber mit NQ10/12.5-Hybridom.
- Durchwegs höhere Ausbeuten an amplifizierter DNA wurden erzielt, wenn die Zellen der Reaktion in ihrem Lagerpuffer (PBS/0,1 M Glycin) und nicht in Wasser zugesetzt wurden. In NQ10-Zellen, die zweistufiger PCR-Kombination unterzogen wurden, bei der 10 uCi (25 umol) ³&sup5;S-dATP zugegeben wurden, um die erste PCR zu markieren, wurden im Überstand nach der zweiten PCR 70% des radiomarkierten Produkts festgestellt, und 30% wurden innerhalb der Zellen zurückgehalten.
- Die amplifizierte DNA innerhalb der Zellen konnte durch die Aufnahme eines Fluoreszenz-PCR-Primers in einem dritten PCR-Schritt (30) durch Konfokalmikroskopie (oder herkömmliche Fluoreszenzmikroskopie) sichtbar gemacht werden.
- Konfokalmikroskopie wurde eingesetzt, um die mit fluoreszierenden PCR-Primern amplifizierte cDNA zu detektieren (siehe Tabelle 1 bezüglich Details der Primer und Vergleiche). Die Ergebnisse werden in Fig. 9 gezeigt, in der (A) PCR-Amplifikation von VH- Gen in NQ10/12.5-Zellen zeigt, (B) die Amplifikation von VH-Gen in B1-8-Zellen zeigt, (C) die PCR-Kombination und gebündelte Amplifikation von VH- und Vk-Genen in NQ10/12.5-Zellen zeigt, (D) die PCR-Amplifikation von VH-Gen in NQ10/12.5-Zellen und die Markierung unter Verwendung von -21NQ10-Primern in der zweiten PCR und M13ROX in der dritten PCR zeigt, (E) die PCR-Kombination und gebündelte Amplifikation von VH- und Vλ in B1-8-Zellen zeigt und (F) das PCR-amplifizierte bcr-abl in K562- Zellen zeigt.
- Durchflußzytometrie von K562-Zellen mit amplifiziertem bcr-abl wurde ebenfalls durchgeführt, und die Ergebnisse werden in Fig. 10 für PCR-Amplifikation und Markierung von Zellen mit spezifischen (-21) und nichtspezifischen (M13) ROX- oder FAM-markierten Primern gezeigt, wie in Tabelle 1. In der Figur zeigt (A) die im roten Kanal detektierte Anregung, -21ROX (durchgehende Linie) und M13ROX (gepunktete Linie); und (B) zeigt die im grünen Kanal detektierte Anregung, FAM-markierte Primer -21FAM (durchgehende Linie) und M13FAM (gepunktete Linie).
- Die korrekten Kombinationen von Primern für NQ10/12.5 erzeugte starke Fluoreszenz in NQ10/12.5 (und nicht in B1-8-Zellen) und umgekehrt für B1-8 (Tabelle 1, Fig. 9). Die Fluoreszenz war für PCR-zusammengesetzte DNA stärker als für PCR-amplifizierte VH- DNA, möglicherweise aufgrund der Verwendung von zwei fluoreszierenden PCR-Primern oder der höheren Zurückhaltung der längeren DNA-Spezies innerhalb der Zelle (15). Obwohl es Differenzen in der Fluoreszenzintensität zwischen verschiedenen Zellen gab, waren die meisten mit den korrekten Primern amplifizierten Zellen fluoreszierend. Die Amplifikation des bcr-abl-Gens unter Verwendung der ausgewählten Primer bestätigte die Synthese von cDNA in der Zelle vor der PCR, da der amplifizierte Abschnitt (318 bp) drei Introns enthielt (21).
- B1-8- und NQ10-Zellen wurden fixiert, permeabilisiert und in gleichen Anteilen vermischt. Die Gemische wurden dann zur cDNA-Synthese und PCR-Amplifikation und -Kombination behandelt (Fig. 6), und die verbundenen Produkte aus dem Überstand isoliert und kloniert. Die Klone wurden dann bezüglich der vier verschiedenen Kombinationen von schweren und leichten Ketten gescreent (wie an anderer Stelle beschrieben). Die Ergebnisse von drei unabhängigen Versuchen werden in Tabelle 2 für 1 : 1- Gemische gezeigt. In allen Fällen führten die PCRs in der Zelle zur Verbindung von NQ10-VH mit Vκ, oder B1-8-VH mit Vλ, was den Kombinationen der Hybridome entsprach; in den 104 ausgewerteten Klonen waren keine "Überkreuzungen" zu sehen. Im Gegensatz dazu führten mit löslicher cDNA durchgeführte PCRs zusätzlich zu Überkreuzungs-Kombinationen von NQ10-VH mit Vλ und B1-8-VH mit Vκ.
- Diese Ergebnisse wurden für Kolonien aus dem ersten Versuch in Tabelle 2 bestätigt, indem Blots von mehrfach plattierten Bakterienkolonien mit ³²P-markierten Oligonukleotidsonden für innere Sequenzen der vier V-Gene (V186.2, B1-8LPRB, NQ10PRB und NQ10KPRB) hybridisiert wurden. Wieder führten PCRs in der Zelle zu Klonen mit den Kombinationen der Hybridome, während Klone der löslichen cDNA zu zusätzlichen Überkreuzungs-Kombinationen führten (Tabelle 2).
- Ein genauerer Test der VH- und VL-Verbindung wurde durch PCR von Zell- und löslichen cDNA-Templaten für ein Gemisch durchgeführt, das 10% B1-8-Zellen und 90% NQ10/12.5 Zellen enthielt (Tabelle 3). In diesem Fall wurden 450 Klone für jede PCR- Kombination zunächst mit mit ³²P-Kinase markierter V186.2 Oligonukleotidsonde sondiert, um jene Klone zu identifizieren, die B1-8 VH-Kette exprimieren. Die positiven. Klone wurden dann auf Agarosegelen gescreent, um entweder Vκ oder Vλ-Gene unter Verwendung von PCR mit den Primern MOVKLINK3 und MOLFORNES bzw. B1- 8VLLINK3 und B1-8FORNES zu detektieren. Aufgrund der PCR in der Zelle waren alle B1-B8-VH-Klone (27) mit der Vλ-Kette verbunden. Aufgrund der Kombination von löslichen cDNAs waren 3 der 34 B1-8-VH-positiven Klone mit der Vλ-Kette und 31 mit der Vκ-Kette verbunden.
- Es wird ein weiteres Beispiel beschrieben, bei dem die Gene des variablen Bereichs (VH und VL) menschlicher Immunglobuline innerhalb einzelner Zellen in einer Lymphozytenpopulation verbunden werden, so daß die zusammengesetzten Produkte in einen Vektor kloniert und als lösliche Antikörperfragmente exprimiert oder auf der Phagen- Oberfläche freigelegt werden können. Im wesentlichen umfaßt es die Synthese von cDNA unter Verwendung von Vorwärtsprimern, die an das Ck-Gen und das JH-Segment annelieren, gefolgt vom Verbinden mit Linkerprimern, VH-Rückprimern auf Basis der VH3-Leadersequenzen und einem Vorwärts-Ck-Primer, der in bezug auf den für cDNA verwendeten Primer gebündelt ist (Fig. 11). Das zusammengesetzte Produkt innerhalb der Zellen wird dann mit gebündelten Primern amplifiziert, die an das 5'-Ende des VH- Gens und das 3'-Ende des Jk-Segments annelieren.
- Heparinisiertes menschliches Blut wurde auf Lymphocyten-Trennmedium Lymphoprep (Nycomed) in einem 50 ml-Zentrifugenröhrchen geschichtet, wobei gleiche Volumina an unverdünntem Blut und Lymphoprep verwendet wurden. Die Röhrchen wurden mit 4.000 · g 20 min lang zentrifugiert, woraufhin mononukleare Zellen (die Lymphozyten umfassen) als Bande sichtbar waren, die das Blutplasma (obere Schicht) und den Lymphoprep (untere Schicht) trennt.
- Die Zellen wurden entfernt und dreimal in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, pH 7,2) gewaschen und in 10% Formaldehyd in 0,15M NaCl-Lösung auf Eis 1 h lang inkubiert. Sie wurden erneut dreimal in PBS gewaschen, gefolgt von Inkubation auf Eis in 0,5% Nonidet P40 (BDH) in Wasser. Nach drei weiteren Wäschen in PBS wurden die Zellen in PBS suspendiert, das 0,1 M Glycin enthielt, und gezählt. Sie wurden bei -70ºC gefroren gelagert.
- Die folgenden Primer wurden bei der Synthese des ersten cDNA-Stranges und den PCRs verwendet. Ihre Annelierungspositionen in bezug auf die VH- und VL-Gene sind in Fig. 11 dargestellt.
- VH3LDR1 5' GCT (A/C)TT TTA A(G/A)A CGT GTC CAG TGT 3'
- VH3LDR2 5' GGT ATT TTA CAA GGT GTC CAG TGT 3'
- VH3LDR3 5' GCT ATA TTA (A/G)(A/G)A GGT GCC CAG TGT 3'
- VH3a 5' GAG CTG CAG CTG CTG GAG TCT GG 3'
- VH3aSfi 5' GTC CTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC GAG CTG CAG CTG CTG GAG TCT GG 3'
- JH4-5A 5' GAA CCC TGG TCA CCG TCT CCT CAG GTG G 3'
- JH6AFOR 5' GGA CCA CGG TCA CCG TCT CCT CAG GTG C 3'
- Ck5'FOR 5' GGA AGA TGA AGA CAG ATG GTG CAG 3'
- CkEXTF 5' CAG ATT TCA ACT GCT CAT CAG ATG G 3'
- Jk1FOR 5' ACG TTT GAT TTC CAC CTT GGT CCC 3'
- Jk2FOR 5' ACG TTT GAT CTC CAG CTT GGT CCC 3'
- Jk3FOR 5' ACG TTT GAT ATC CAC TTT GGT CCC 3'
- Jk4FOR 5' ACG TTT GAT CTC CAC CTT GGT CCC 3'
- Jk5FOR 5' ACG TTT AAT CTC CAG TCG TGT CCC 3'
- Jk1FORNot 5' GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC ACG TTT GAT TTC CAC CTT GGT CCC 3'
- Jk2FORNot 5' GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC ACG TTT GAT CTC CAG CTT GGT CCC 3'
- Jk3FORNot 5' GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC ACG TTT GAT ATC CAC TTT GGT CCC 3'
- Jk4FORNot 5' GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC ACG TTT GAT CTC CAC CTT GGT CCC 3'
- Jk5FORNot 5' GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC ACG TTT AAT CTC CAG TCG TGT CCC 3'
- JHLINK 1, 2 5' CCA GAG CCA CCT CCG CCT GAA CCG CCT CCA CCT GAG GAG ACG GTG ACC AGG GT(C/T) CC 3'
- JH3LINK 5' CCA GAG CCA CCT CCG CCT GAA CCG CCT CCA CCT GAA GAG ACG GTG ACC ATT GTC CC 3'
- JH6LINK 5' CCA GAG CCA CCT CCG CCT GAA CCG CCT CCA CCT GAG GAG ACG GTG ACC GTG GTC CC 3'
- VkLINK 5' CAG GCG GAG GTG GCT CTG GAG GTG GCG GAT CGG AAA TTG TGT TGA CGC AGT CTC C 3'
- VkLINK1 5' CAG GCG GAG GTG GCT CTG GAG GTG GCG GAT CGG ACA TCC AGA TGA CCC AGT CTC C 3'
- Aliquoten von 5 · 10&sup5; fixierten und permeabilisierten Zellen wurden aufgetaut und einmal in Wasser gewaschen und in 20 ul Wasser resuspendiert. Das folgende "Erste Strang"-Gemisch wurde hergestellt: 5 ul 10 · "Erster Strang"-Puffer (1,4 M KCl, 0,5 Tris- HCl, pH 8,1, bei 42ºC, 80 mM MgCl&sub2;), 5 ul 0,1 M Dithiothreitol, 5 ul 5 mM dNTPs, jeweils 25 pmol der Primer JH4-5A, JH6AFOR und CkEXTF, 80 Einheiten RNase-Inhibi tor (RNasin, Promega) und Wasser auf 28 ul. Die Zellen wurden 3 min lang auf 65ºC erhitzt und auf Eis abgekühlt. Dann wurden sie dem "Erster Strang"-Gemisch zusammen mit 40 Einheiten Reverser Transkriptase Super RT AMV zugegeben und das gesamte Gemisch bei 42ºC 1 h lang inkubiert. Die Zellen wurden dann zentrifugiert, einmal in PBS/0,1 M Glycin gewaschen und im selben Puffer zur PCR resuspendiert.
- Die Reaktionen wurden in 50 ul Volumina in 0,5 ml Sarstedt-Röhrchen durchgeführt, wobei 10&sup5; cDNA-Templatzellen in 10 ul zusammen mit einem Gemisch verwendet wurden, das 25 umol VH-Rückprimer-Gemisch (VH3LDR1 + VH3LDR2 + VH3LDR3), 25 pmol Ck5'FOR, 10 umol Linkerprimer-Gemisch (JHLINK 1, 2 + JH3LINK + JH6LINK + VkLINK + VkLINKI), 200 uM dNTPs, 5 ul 10 · Taq-Polymerase-Puffer (Progema) und 2,5 Einheiten Taq-Polymerase enthielt. Die Röhrchen wurden in einem Thermozyklusofen (BioTherm Corp., "BioOven") ohne Öl-Überschichtung 30 Zyklen PCR unter Denaturierung bei 95ºC für 30 s, Annelierung bei 58 oder 65ºC für 30 s und Verlängerung bei 72ºC für 3 s unterzogen. Dies wurde als "erste PCR" bezeichnet.
- Die Zellen wurden zentrifugiert und zweimal in PBS/0,1M-Glycin gewaschen und für eine zweite PCR zusammen mit folgendem Gemisch in 10 ul dieses Puffers suspendiert: 200 uM dNTPs, 5 ul 10x Taq-Puffer, 2,5 Einheiten Taq-Polymerase und entweder die Primer-Kombinationen (a) 25 pmol VH3A und 25 pmol eines Gemischs aus Jk1FOR + Jk2FOR + Jk3FOR + Jk4FOR + Jk5FOR oder (b) 25 pmol VH3ASfi und 25 pmol eines Gemischs aus Jk1FORNot + Jk2FORNot + Jk3FORNot + Jk4FORnot + Jk5FORNot. Wasser wurde zugegeben, um die Zellen und Reagenzien auf 50 ul zu bringen, und zyklische PCR wurde wie im ersten Schritt durchgeführt. Als die Primerkombination (a) in der zweiten PCR eingesetzt wurde, wurden die Zellen gewonnen und gewaschen und für eine dritte PCR mit Primerkombination (b) behandelt, um Restriktionsstellen für die Klonierung anzubringen.
- Die PCR-Produkte wurden analysiert, indem sie auf 1,5% Agarosegelen in 0,5 · Tris- Borat-EDTA-Puffer mit 0,5 ug/ml Ethidiumbromid laufen gelassen und unter UV-Licht betrachtet wurden.
- Kombination unter Einsatz einer Zwei-PCR-Vorschrift mit Primern, die Restriktionsstellen in der zweiten PCR (Primerkombination (b)) oder einer Drei-PCR-Vorschrift mit Primerkombination (a) in der zweiten PCR und (b) in der dritten ergab eine DNA-Bande jener Größe, die für ein zusammengesetztes VH3-Vk-Antikörperfragment zu erwarten ist (etwa 700 bp). Da dieses Fragment VH3-Sfi und Vk-Not-Restriktionsstellen enthielt, konnte es mit den geeigneten Enzymen gespalten und in den Vektor pHEN kloniert werden (Bibliographie Nr. 38, 41). Dies ermöglichte die Expression als klonierte Fusionsprodukte, die an der Phagenoberfläche freigelegt wurden, wenn sie in einen Suppressor- E.coli-Stamm, wie z. B. TG1, eingebracht wurden, oder als lösliche Einzelketten-Fv-Fragmente mit einer C-terminalen Peptidmarkierung nach der Infektion eines Nichtsuppressorstammes, wie z. B. HB2151 (38). Obwohl bei diesem Beispiel Primer eingesetzt wurden, die für k-Leichtketten und die VH3-Familie konstruiert waren, ist das Verfahren auch auf andere menschliche Schwer- und Leichtketten-Familien anwendbar, und entsprechende Primer könnten konstruiert werden (38).
- Frühere Arbeiten hatten gezeigt, daß die DNA von mit Lentivirus infizierten Zellen in infizierten Zellen mittels PCR amplifiziert und durch Autoradiographie (15) detektiert werden konnte, und in jüngerer Vergangenheit ist HIV-Provirus durch PCR-Amplifikation und Peroxidase-Färbung in an Glasplättchen gebundenen Zellen detektiert worden (31). PCR in der Zelle ermöglicht das Amplifizieren der Gene einzelner Zellen, aber ohne die Notwendigkeit, jede Zelle in ein getrenntes Röhrchen zu füllen (32). Sie unterteilt die Amplifikation einer Zellpopulation, was viele unabhängige Reaktionen im selben Röhrchen ermöglicht. Die Erfinder des vorliegenden Anmeldungsgegenstandes haben die Anwendung von PCR in der Zelle durch reverse Transkription von mRNA zu cDNA innerhalb einzelner Zellen einer Suspension erweitert (Beispiel 3). Die cDNA wird innerhalb der Zelle zurückgehalten und ermöglicht PCR-Amplifikation. Weiters konnte die amplifizierte DNA unter Verwendung fluoreszierender PCR-Primer innerhalb der Zelle fluoreszenzmarkiert werden und sollte die Analyse großer und verschiedenartiger Zellpopulationen durch Fluoreszenz ermöglichen. Hierin wurden drei PCR-Amplifikationen eingesetzt, um die amplifizierte DNA zu markieren, und dann Fluoreszenzmarkierung und markierte DNA mit "universellen" fluoreszierenden PCR-Primern. Es sollte aber auch möglich sein, die cDNAs innerhalb der Zelle mit einer einzigen PCR- Amplifikation unter Verwendung eines Satzes von Fluoreszenz-PCR-Primern, die spezifisch für das Gen von Interesse hergestellt wurden, Fluoreszenzmarkierung zu unterziehen.
- PCR von cDNA in der Zelle scheint effizient zu sein, weil die meisten der Zellen der Hybridome und K562-Myeloidleukämie fluoreszenzmarkiert werden können, wie durch Konfokalmikroskopie (Fig. 9) oder FACS (Fig. 10) ermittelt, Ein potentieller Vorteil der Fluoreszenzmarkierung gegenüber der Verwendung radiomarkierter Sonden besteht darin, daß seltene positive Zellen mittels FACS isoliert und ihre Gene direkt oder nach weiteren PCR-Runden kloniert werden können.
- Den Erfindern des vorliegenden Anmeldungsgegenstandes ist es gelungen, die PCR- amplifizierte DNA von zwei mRNAs derselben Zelle zu verbinden und die zusammengesetzte DNA unter Verwendung gebündelter Primer zu amplifizieren, was ermöglicht, die Kombinationen verbundener Gene durch Fluoreszenz zu identifizieren (Tabelle 1) und zu klonieren. Für Gemische zweier Hybridome wurden die ursprünglichen Kombinationen de Hybridom-V-Gene auch mit einem Hybridom in zehnfachem Überschuß beibehalten. Der Ausmaß der Bindung zwischen zwei Markierungen hängt wahrscheinlich unter anderem davon ab, ob beide mRNAs effizient und bis zu einer hohen Kopien- Anzahl amplifiziert werden, oder ob es Konkurrenz von amplifizierter DNA gibt, die aus anderen Zellen austritt, um am Vorgang der Kombination teilzunehmen. Nach der ersten PCR wurden die Zellen daher gewaschen, um DNA von ihrer Oberfläche oder ihren Außenschichten zu entfernen, bevor die zweite "gebündelte" PCR eingesetzt wurde, um jene V-Gene zu amplifizieren, die innerhalb einzelner Zellen verbunden waren. Die starke Bindung, die zwischen den V-Genen innerhalb derselben Zelle festzustellen ist, kann ermöglichen, auch seltene Kombinationen von Genen aus einer großen Zellpopulation zu retten.
- PCR und Kombination in der Zelle hat viele Anwendungsmöglichkeiten für die Genbindungsanalyse, aber die wichtigste Anwendung ist wahrscheinlich das Klonieren von Genkombinationen, die innerhalb einer Zellpopulation polymorph sind, wie z. B. der umgeordneten Gene für Ig- oder TCR-V-Regionen. Die verbundenen Gene könnten zum Sondieren, Sequenzieren oder Exprimieren kloniert werden. Daher ermöglicht in Beispiel 4 die Art, wie die V-Gene kombiniert wurden, das Klonieren des verbundenen Produkts direkt in Expressionsvektoren. Ein solches Verfahren stellt Alternativen für B- und T-Zellen-Hybridome bereit, weil es dadurch möglich wird, die ursprünglichen V-Gen- Kombinationen direkt in Vektoren zur Expression in Säugetierzellen (5) oder Bakterien (33, 34, 35, 36, 37) zu klonieren oder an der Oberfläche von filamentösen Bakteriophagen freizulegen (9). Durch Antigen-Panning von filamentösen Bakteriophagen, die Antikörper-Fragmente aufweisen, können auch sehr seltene Klone isoliert werden (9, 38), was die Analyse der V-Gen-Kombinationen, smatischer Mutation, Affinitäten und Spezifitäten natürlicher, immuner und autoimmuner B-Zellen erleichtern sollte. Tabelle 1. PCR in der Zelle mit fluoreszenzmarkierten Primern Tabelle 2. Screening verbundener VH- und VL-Genkominationen aus 1 : 1-Gemischen von B1-8- und NQ10/12.5-Hybridomzellen
- Die PCR-Template stammten von einem 1 : 1-Gemisch aus NQ10/12.5 und B1-8-Zellen, das in zwei Teile aufgetrennt wurde. Ein Teil der Zellen wurde vor der cDNA-Synthese und PCR-Kombination und gebündelten Amplifikation fixiert (fixierte Zellen), und der andere wurde zur cDNA-Synthese und PCR-Kombination und gebündelten Amplifikation von löslicher mRNA in Wasser gekocht (statistische Kombination). Kolonien wurden für die Versuche 1, 2 und 3 gescreent, aber es wurden auch zusätzliche Kolonien von Versuch 1 sondiert. Tabelle 3. Screening bezüglich verbundener VH- und VL-Genkombinationen von 1 : 9- Gemischen von B1-8: NQ10/12.5-Hybridomzellen
- Zur Herstellung von PCR-Kombinations-Templaten wurde ein 1 : 9-Gemisch von B1- 8 : NQ10/12.5-Zellen in zwei Portionen geteilt. Eine Portion wurde zur cDNA-Synthese und PCR fixiert (fixierte Zellen), und der andere wurde zur cDNA-Synthese und PCR aus löslicher mRNA in Wasser gekocht (statistische Kombination). Klone wurden mit einer ³²P-markierten V186.2-Sonde sondiert, und die mit B1.8-VH-Genen identifizierten Klone wurden entweder auf Vλ- oder Vκ-Gene gescreent.
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Claims (18)
1. Verfahren zur Behandlung einer heterogenen Zellpopulation, um zwei oder mehr
Kopien nicht-fortlaufender DNA-Sequenzen zumindest einiger der Zellen miteinander
zu verbinden, umfassend die folgenden Schritte:
(i) Amplifizieren der nicht-fortlaufenden DNA-Sequenzen; und
(ii) Verbinden der Kopien der nicht-fortlaufenden DNA-Sequenzen,
worin das Verbinden vorzugsweise in der Nähe der nicht-fortlaufenden DNA-
Sequenzen erfolgt, so daß das Miteinander-Verbinden zweier oder mehrerer Kopien
nicht-fortlaufender DNA-Sequenzen derselben Zeile wahrscheinlicher ist als das
Verbinden mit Kopien, die von einer Nukleinsäuresequenz einer anderen Zelle stammen.
2. Verfahren zur Behandlung einer Zellpopulation, um Kopien zweier oder
mehrerer nicht-fortlaufender DNA-Sequenzen zumindest einiger der Zellen miteinander zu
verbinden, umfassend die folgenden Schritte:
(i) Behandeln der Zellen, um sie in bezug auf die Temperatur zu stabilisieren und
sie für Reagenzien durchlässig zu machen;
(ii) Zusatz von Primern zur Durchführung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
auf solche Weise, daß die Primer in das Innere der Zellen diffundieren;
(iii) Unterziehen der Zellen einer geeigneten Behandlung, so daß die
nichtfortlaufenden DNA-Sequenzen einer bestimmten Zelle innerhalb dieser Zelle durch PCR
kopiert werden; und
(iv) Miteinander-Verbinden der Kopien der nicht-fortlaufenden DNA-Sequenzen,
wobei das Verbinden vorzugsweise in der Nähe der nicht-fortlaufenden
DNA-Sequenzen erfolgt, von denen die Kopien stammen, so daß das Miteinander-Verbinden zweier
oder mehrerer Kopien nicht-fortlaufender DNA-Sequenzen derselben Zelle
wahrscheinlicher ist als das Verbinden mit Kopien, die von einer Nukleinsäuresequenz einer
anderen Zelle stammen.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die DNA-Sequenz-Kopien durch PCR
verbunden werden.
4. Verfahren nach Anspruch 2, worin die Primer fluoreszenzmarkiert sind und das
Verfahren den zusätzlichen Schritt des Überwachens der Fluoreszenzmarkierungen
umfaßt.
5. Verfahren nach Anspruch 4, worin die Zellen durch fluoreszenzaktivierte
Zellsortierung (FACS) sortiert werden.
6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, das weiters die Verwendung zweier
verschiedener Primer oder Sonden umfaßt, die mit unterschiedlichen
Fluoreszenmarkierungen markiert sind.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 4, 5 oder 6, worin das Überwachen der
Fluoreszenzmarkierungen die Zählung von markierten Zellen umfaßt.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 7, worin die PCR unterzogene DNA-
Sequenz von mRNA der Zelle stammt.
9. Verfahren nach Anspruch 8, worin die DNA-Sequenz durch reverse Transkription
von mRNA abgeleitete cDNA ist.
10. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, das weiters einen
Waschschritt nach dem Verbinden der DNA umfaßt.
11. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, das weiters eine oder
mehrere Durchgänge oder weitere Durchgänge von PCR umfaßt.
12. Verfahren nach Anspruch 11, worin weitere Durchgänge von PCR unter
Verwendung von Primern durchgeführt werden, die zu Sequenzen komplementär sind, die in
einem vorhergehenden Durchgang von PCR kopiert wurden.
13. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die
DNA-Sequenzen Sequenzen umfassen, die für Immunoglobulin VH- und VL-Domänen kodieren.
14. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die resultierende
DNA durch Insertion in einen geeigneten Vektor kloniert wird.
15. Verfahren nach Anspruch 14, wodurch die Klone sequenziert oder an
Nukleinsäure-Sonden anneliert werden.
16. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, das weiters das Exprimieren eines Proteins
umfaßt, für das die DNA eines Klons kodiert.
17. Verfahren nach Anspruch 16, worin das Protein als Teil eines Fusionsproteins
exprimiert wird.
18. Verfahren nach Anspruch 17, worin das Fusionsprotein das Hüllenprotein eines
filamentösen Phagen oder eine Peptidmarkierung umfaßt.
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