CN105085673B - 用于检测柯萨奇病毒a16型病毒实心颗粒的单克隆抗体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及特异性结合柯萨奇病毒A16型(CA16)实心颗粒的单克隆抗体、其保守性变异体或活性片段。本发明还涉及该单克隆抗体用于检测CA16实心颗粒抗原的方法，以及利用所述单克隆抗体制备预防或检测或治疗CA16病毒的药物的用途。

Description

用于检测柯萨奇病毒A16型病毒实心颗粒的单克隆抗体及其 用途

技术领域

本发明涉及特异性结合柯萨奇病毒A16型病毒实心颗粒的单克隆抗 体，或其保守性变异体或活性片段及其编码核苷酸序列，或其简并性序 列。本发明还涉及一种检测柯萨奇病毒A16型病毒实心颗粒抗原的方法。 本发明还涉及该单克隆抗体，或其活性片段或保守性变异体用于制备诊 断、预防和/或治疗柯萨奇病毒A16型感染的药物的用途。

背景技术

柯萨奇病毒A16型(以下简称CA16)，属于小核糖核酸病毒科肠道 病毒属，是引起手足口病(以下简称HFMD)的主要病原体之一(Rabenau 等人，2010，医学微生物学与免疫学杂志(Med.Microbiol.Immunol). 199:45-51；Wang等人，2011，流行病学杂志(Epidemiology) 22:781-792)。基因组为单股正链RNA。其颗粒为正二十面体结构，无 包膜和突起，直径约30nm，其蛋白外壳由结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4 构成，中和表位主要在VP1、VP2、VP3上，VP4序列高度保守，包裹在 衣壳内部。

HFMD是由肠道病毒引起的传染病，多发生于婴幼儿，可引起手、足、 口腔等部位的疱疹，个别患者可出现心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜炎等 并发症。引发手足口病的肠道病毒有20多种(型)，其中以CA16和肠道 病毒71型(以下简称EV71)最为常见，二者都属于小核糖核酸病毒科 肠道病毒属，同属的还有脊髓灰质炎病毒。HFMD是全球性传染病，世界 大部分地区均有流行报导。美国、澳大利亚、意大利、法国、荷兰、西 班牙、罗马尼亚、巴西、加拿大、德国等国家经常发生由各型柯萨奇、 埃可病毒和EV71等引起的HFMD疫情。我国自1981年在上海发现本病， 以后北京、河北、天津、福建、吉林、山东、湖北、广东等十几个省(市) 均有报导。2008年3月在安徽阜阳地区HFMD疫情大爆发，引起社会对 该病的广泛关注，近几年HFMD病例数有逐年上升趋势。为了更好的监 控和预防HFMD，卫生部已经将该病列入传染病防治法规定的丙类传染 病。

CA16病毒是引起HFMD的重要病原体之一，目前CA16疫苗和 EV71/CA16联合疫苗基本都处于临床前研究阶段。相关研究发现CA16 病毒存在两种类型的病毒颗粒：实心颗粒(含RNA，有感染性)，空心 颗粒(无RNA，无感染性)(Chong等人，2012，PloS one,2012,7(11): e49973)。同属于肠道病毒属的脊髓灰质炎病毒也存在类似现象，即存 在实心和空心两种类型的颗粒，并且实心颗粒抗原可激发人体产生中和 抗体，是主要的保护性抗原(Mayer等人，1957，免疫学杂志(Journal of Immunology)78,435-455.)，因此脊髓灰质炎疫苗的有效成分是以实 心颗粒抗原的含量来衡量的。相关研究提示CA16病毒实心颗粒也可激 发小鼠产生较强的中和抗体，而空心颗粒难于激发小鼠产生较强的中和 抗体(Chong等人，2012，PloS one,2012,7(11):e49973)。CA16 实心颗粒抗原可能在CA16疫苗有效性方面起着非常重要的作用。开展 对CA16病毒实心颗粒抗原检测方面的研究是十分必要的。目前还没有 关于CA16实心颗粒抗原检测方法的报道。因此，获得可特异结合CA16 病毒实心颗粒的单克隆抗体并建立CA16实心颗粒抗原相关检测方法， 对CA16疫苗的研发及质控具有非常重要的意义。

要解决的技术问题

CA16的实心颗粒可激发起更高的中和抗体滴度，CA16病毒实心颗 粒抗原可能是CA16疫苗的主要保护性抗原。目前还没有关于CA16实心 颗粒抗原检测方法的报道。

发明内容

本发明人经过了深入的研究和创造性的劳动，例如利用不同时间、 不同地点分离到的CA16不同的代表株免疫小鼠，进行单克隆抗体的制 备，已制备出100余株杂交瘤细胞株，其均能够产生对CA16有特异性 反应的单抗(单克隆抗体)。发明人通过蔗糖密度梯度离心纯化方法获 得CA16病毒实心颗粒，进一步利用ELISA方法分别检测上述CA16单克 隆抗体与CA16病毒实心颗粒的反应性，筛选与CA16病毒实心颗粒具有 高结合活性的单克隆抗体。最终发现有1株单克隆抗体可特异性结合 CA16病毒实心颗粒，即也获得了能够分泌该可特异性结合CA16病毒实 心颗粒的抗体的单克隆细胞系，并进一步建立了可特异性检测CA16病 毒实心颗粒的检测方法，以及证明该单克隆抗体具有制备抗CA16药物 或疫苗的潜力。由此提供了下述发明：

本发明提供一种可以特异性结合CA16实心颗粒抗原的单克隆抗体 NA10B9，或其保守型变异体或活性片段；

其中，所述保守型变异体或活性片段的氨基酸序列与本发明所述单 克隆抗体之氨基酸序列相比，可以存在一个或多个保守型氨基酸替换、 添加或删除而仍能保持与CA16实心颗粒抗原特异性结合。

具体的，本发明所要求保护的特异性结合CA16实心颗粒抗原的单 克隆抗体，或其保守型变异体或活性片段，其特征为：重链可变区的 CDR1、CDR2、CDR3的序列分别如序列表中SEQ ID：5、SEQ ID：6、SEQ ID：7所示；轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的序列分别如序列表中 SEQ ID：8、SEQ ID：9、SEQ ID：10所示。

更具体的，本发明所要求保护的特异性结合CA16实心颗粒抗原的 单克隆抗体，或其保守型变异体或活性片段，其特征为：具有氨基酸序 列为SEQ ID NO：1的重链可变区和具有氨基酸序列为SEQ ID No：2的 轻链可变区。本领域普通技术人员显然知晓，在本发明所具体公开的单 克隆抗体的重链和轻链可变区氨基酸序列基础上，可通过常规蛋白质工程方法进行一个或多个氨基酸的添加、删除、替换等修饰，获得保守型 变异体或其片段，而仍能保持与CA16实心颗粒抗原特异性结合。

在本发明所具体公开的单克隆抗体的重链和轻链的可变区氨基酸 序列基础上，本领域普通技术人员也完全知晓可以通过常规的基因工程 和蛋白质工程方法，将本发明所述的重链可变区氨基酸序列和/或轻链 可变区氨基酸序列，或将如前述得到的其保守型变异体和/或其片段， 组装成的单链抗体，其仍能保留特异性结合CA16实心颗粒抗原的能力。

在本发明所具体公开的单克隆抗体的重链和轻链可变区氨基酸序 列基础上，本领域普通技术人员也知晓如何装配所述重链可变区氨基酸 序列和/或轻链可变区氨基酸序列或其保守型变异体的嵌合单克隆抗 体，或改型单克隆抗体或其他人源化形式的单克隆抗体或抗体片段，其 仍保留特异性结合CA16实心颗粒抗原的能力。

本发明的另一方面，涉及编码所述单克隆抗体重链可变区的核苷酸 序列SEQ IDNO：3和轻链可变区核苷酸序列SEQ ID NO：4，或其简并 性序列的核酸分子。

本发明又一方面还涉及，上述核苷酸序列经一个或多个核苷酸添 加、删除、替换、修饰等突变后得到的重链可变区核苷酸序列和/或轻 链可变区核苷酸序列的变异序列，其所编码的氨基酸序列组成的单链抗 体或嵌合单克隆抗体或改型单克隆抗体或其他人源化形式的单克隆抗 体或抗体片段，仍保留特异性结合CA16实心颗粒抗原的能力。

本发明的再一方面涉及一种单克隆抗体偶联物，包括单克隆抗体和 偶联部分，其中，所述单克隆抗体为本发明任一方面所述的单克隆抗体， 所述偶联部分为选自放射性核素、药物、毒素、细胞因子、酶、荧光素、 载体蛋白、脂类、和生物素中的一种或多种；具体地，所述单克隆抗体 偶联物为融合或偶联的蛋白；在一个实施方案中，所述偶联部分为辣根过氧化物酶(HRP)。

所述偶联可以是MBS法、戊二醛法、活泼酯法、碳二亚胺法、卤代 硝基苯法及亚胺酸脂法等。所述载体有例如人血清白蛋白、牛血清白蛋 白、牛甲状腺球蛋白、钥孔血白蛋白及其他γ球蛋白等蛋白类载体，另 有重组载体可以为多聚赖氨酸、二软脂酰赖氨酸、三软脂酸2S甘油半 胱氨酰2丝氨酰基丝氨酸、多聚谷氨酸及多聚混合氨基酸等。

本发明还涉及一种检测CA16病毒实心颗粒抗原的方法，其包括使 用本发明任一项所述的单克隆抗体或单克隆抗体偶联物或抗体变体或 其抗原结合片段来检测CA16病毒实心颗粒抗原，具体地，所述方法是 免疫学检测方法；在一个实施方案中，所述方法是酶联免疫检测方法 (ELISA)。

本发明还涉及一种用于检测CA16疫苗中CA16病毒实心颗粒抗原的 方法，所述方法包括使用本发明任一项所述的单克隆抗体或单克隆抗体 偶联物或抗体变体或其抗原结合片段来检测CA16疫苗或包括CA16病毒 的多价疫苗中的CA16病毒实心颗粒抗原。具体地，所述方法是免疫学 检测方法；在一个实施方案中，所述方法是酶联免疫检测方法(ELISA)。

本发明的再一方面涉及一种药物组合物，其包含本发明任一项所述 的抗体或者本发明任一项所述的抗体偶联物；可选地，所述药物组合物 还包含药学上可接受的载体或辅料。

本发明的再一方面涉及一种试剂盒，其包含本发明任一项所述的抗 体或者本发明任一项所述的抗体偶联物。

本发明的再一方面涉及本发明任一项所述的抗体或者本发明任一 项所述的抗体偶联物或者本发明任一项所述的药物组合物在制备治疗 和/或预防和/或诊断CA16病毒所致疾病特别是HFMD的药物或者抗CA16 病毒的药物中的用途。

在本发明中，所述抗体是指通常由两对相同的多肽链(每对具有一 条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)组成的免疫球蛋白分子。抗体 轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分 别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包 含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重 链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。 各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结 构域CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包 括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分 (C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决 定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末 端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区 (VH和VL)分别形成抗体结合部位。氨基酸至各区域或结构域的分配遵 循Kabat Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest (National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987 and 1991))， 或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等 人(1989)Nature 342:878-883的定义。术语“抗体”不受任何特定的 产生抗体的方法限制。例如，其包括，特别地，重组抗体、单克隆抗体 和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。

在本发明中，所述中和抗体是指可与细菌毒素、病原体(如病毒)及 其产物特异性结合并发挥中和作用的抗体，其能中和毒素的毒性作用或 阻断病毒感染靶细胞。

在本发明中，所述中和作用是指特异性抗体通过与相应抗原决定簇 结合，使毒素失去毒性、病毒失去感染敏感细胞能力、毒性酶失去酶活 性等，防止病毒进入宿主细胞。

在本发明中，所述抗原结合部分是指全长抗体的一个或多个部分， 所述部分保持结合抗体所结合的相同抗原的能力，与完整抗体竞争对抗 原的特异性结合。通常参见，Fundamental Immunology,Ch.7(Paul, W.,ed.,第2版，Raven Press,N.Y.(1989)，其以其全文通过引用 合并入本文，用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶 促或化学断裂产生抗原结合部分。在一些情况下，抗原结合部分包括 Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体 (例如，scFv)、嵌合抗体、双抗体(diabody)和这样的多肽，其包含足 以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。

可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组DNA技术或酶 促或化学断裂法)从给定的抗体(例如单克隆抗体NT14B10)获得抗体 的抗原结合部分(例如，上述抗体片段)，并且以与对于完整抗体的方 式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合部分。

如本文中所使用的，术语“特异性结合”是指抗体对预先确定的抗 原上的表位的结合。通常，抗体以小于大约10^-7M，例如小于大约10^-8M、 10^-9M或10^-10M或更小的亲和力(KD)结合抗原表位。

在本发明中，20种常规氨基酸和其缩写遵从常规用法。参见 Immunology ASynthesis(第2版,E.S.Golub和D.R.Gren,Eds., Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991)),其通过引用合并 入本文。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

图1，利用蔗糖梯度密度离心方法分离CA16病毒不同类型的颗粒 (透射电镜)。

图2，单克隆抗体NA10B9特异性结合CA16实心颗粒抗原。

图3，单克隆抗体NA10B9用于检测被CA16病毒感染的细胞(免疫 荧光试验)。

图4，单克隆抗体NA10B9用于检测CA16病毒实心颗粒(双抗体夹 心ELISA)。

图5，单克隆抗体NA10B9体内预防小鼠被CA16感染实验。

图6，单克隆抗体NA10B9体内治疗实验。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域 技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本 发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议 的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获 得的常规产品。这里所用的命名和在细胞培养、分子生物学、生物化学、 免疫学实验操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规命名和步骤。

实施例1：CA16病毒实心颗粒的制备

病毒的培养：本发明所用的CA16毒株为2007-00190(GenBank No. JF420555)，培养病毒用细胞为人横纹肌瘤细胞RD(CCL-136^TM)。 首先将RD细胞培养于10cm培养皿(NEST)中，培养基为含10％胎牛血 清(PAA)的MEM培养基(GIBCO)。细胞汇合率达到80％时，换成无血 清MEM培养基，按MOI＝0.1的量来接种病毒。37℃培养，3天后待细胞 完全病变后，收获病毒。病毒收获方法为：将细胞刮下后冻融3次，离 心去除细胞碎片，取细胞裂解上清，经0.22μm滤膜过滤后获得病毒原 液，-80℃冻存备用。

蔗糖密度梯度离心分离获得不同性质的病毒颗粒：

通过PEG8000对上述获得的病毒原液进行浓缩沉淀，沉淀条件为8％ PEG8000,0.5mol/L NaCl，4℃沉淀过夜。再经10000g离心取沉淀，沉 淀用PBS重悬。参考相关文献(Ren,Jingshan,et al.，2013)的方 法进行蔗糖梯度离心，蔗糖梯度为10％-40％,SW41Ti转头103614g离心 3小时，实心颗粒层和空心颗粒层分别取样，进行电镜负染观察，结果(图1)显示蔗糖梯度离心可有效分离获得CA16实心颗粒抗原和空心颗 粒抗原。

实施例2：单克隆抗体的制备

取实施例1制备的CA16病毒原液与弗氏完全佐剂混合乳化均匀， 对6-8周龄BALB/c雌鼠进行多点注射，包括背部皮下注射、腹股沟皮 下注射、足垫注射、四肢肌肉注射等途径注射免疫原，注射剂量为500 μL/只次。后每隔2周加强一次，以相同方式进行加强免疫，免疫原为 实施例1制备的CA16病毒原液与弗氏非完全佐剂的混合物，每次免疫 前采集20μL尾静脉血或200μL眼球静脉血以备滴度测定。用间接ELISA 测定血清滴度，当小鼠血清滴度达到平台期后，小鼠停止免疫并休息两 个月后进行融合。融合前72小时，直接向小鼠脾脏注射100μLCA16病 毒原液(不加佐剂)，进行免疫加强。72小时后，处死小鼠收集小鼠抗血清(小鼠多抗血清)，同时取小鼠脾脏制成细胞悬液(悬于RPMI 1640 培养基中)，细胞计数板计数。按1/6于脾细胞的数量与小鼠骨髓瘤细 胞Sp2/0混合，随后使用50％聚乙二醇(PEG)进行细胞融合。将细胞悬 液与等体积的饲养细胞(BALB/c小鼠巨噬细胞及胸腺细胞)混合后，置 入96孔细胞培养板中(200μL/孔)，5％CO₂，37℃。3天后，用含次 黄嘌呤、氨基蝶呤与胸腺嘧啶核苷的1640培养基半换液。七天后，用 CA16病毒原液包被ELISA板，用间接ELISA方法检测杂交瘤细胞培养上 清。对于ELISA阳性的细胞孔，利用有限稀释法进行克隆化。

单克隆抗体的纯化：取10周龄的健康BALB/c小鼠，腹腔注射石蜡 油，每只0.5mL。2-7天后，收集克隆化的杂交瘤细胞，离心去上清， 加入不含血清的1640HT培养基，调节细胞密度至2x10⁵-2x10⁶个/mL,每 只小鼠注射0.5mL。7-10天后小鼠腹部增大，开始收集腹水。3000rpm 离心15分钟，吸取中间澄清的液体，-20℃保存。腹水采集完毕后进行 抗体纯化。将腹水用0.02mol/L、pH7.4的PBS对倍稀释，搅拌下缓慢 加入等体积的饱和硫酸铵，4℃过夜。4℃，12000rpm离心15分钟，弃 上清。将沉淀溶于适量的PBS中，装入透析袋中，放入50-100倍体积 的0.02mol/L PB(pH7.4)中，4℃下搅拌脱盐12小时左右，期间更换 3次透析液。将透析过得抗体用Protein A柱(GE)在AKTA纯化系统下 纯化，0.02mol/L PB(pH7.4)条件下亲和挂柱，用0.1M的柠檬酸洗脱， 洗脱液即为纯化的抗体。将洗脱液透析至0.02mol/LPB(pH7.4)中， -20℃保存。

实施例3：可特异结合CA16病毒实心颗粒抗原的抗体的筛选

间接ELISA实验：将实施例1制备的CA16病毒不同颗粒抗原分别 用20mM PB7.4稀释100倍，包被96孔酶标板，100μL/孔，37℃包被2 小时，用PBST洗板1次，用相关封闭液(20mM PB7.4含150mM NaCL,0.5％ 酪蛋白，0.002％明胶)封闭非特异性结合位点，200μL/孔，4℃封闭过 夜。将实施例2制备的待测单克隆抗体样品(1mg/mL)稀释200倍(稀 释液配方同封闭液)，取100μL加入酶标板，37℃孵育1h。PBST洗板 5次，加入GAM-HRP(辣根过氧化酶标记的羊抗鼠抗体，购自美国bio-rad 公司，稀释液配方同封闭液)，37℃孵育30min。PBST洗板5次，加入TMB显色液显色15min，终止液终止，酶标仪(TECAN sunrise)读值。 最终从100余株单克隆抗体中筛选获得1株单克隆抗体NA10B9，该抗体 可以特异性的结合CA16实心颗粒抗原，而与CA16空心颗粒抗原无明显 反应(图2)。

实施例:4：单克隆抗体NA10B9可特异性结合CA16病毒实心颗粒抗 原

NA10B9抗体标记辣根过氧化酶：

取HRP、NaIO₄各1mg，加超纯水溶解；然后向HRP溶液中逐滴加入 NaIO₄溶液，边加边摇晃混匀，并将混好的溶液置于4℃，避光30分钟； 取1μL乙二醇溶于超纯水中，逐滴加入，边加边摇晃混匀，室温避光 静置30分钟，至此酶氧化过程完成。在氧化HRP的过程中，用pH9.6 的50mM CB缓冲液透析纯化的抗体NA10B9。HRP氧化完后，将透析好的 NA10B9抗体与HRP按所需比例混合，于50mM CB缓冲液中透析6小时以 上；然后用新鲜配制的NaBH₄溶液终止，NaBH₄量为0.2mg；摇匀，4℃静 置2小时。然后用pH7.2的10mM PBS透析过夜。

ELISA实验(直接法)：

将实施例1制备的CA16病毒实心颗粒抗原和空心颗粒抗原分别用 20mM PB7.4稀释100倍，包被96孔酶标板，100μL/孔，37℃包被2 小时，用PBST洗板1次，用相关封闭液(20mM PB7.4含150mM NaCL,0.5％ 酪蛋白，0.002％明胶)封闭非特异性结合位点，200μL/孔，4℃封闭过 夜。取标记辣根过氧化酶的NA10B9单抗稀释2000倍，取100μL加入 酶标板，37℃孵育30min。PBST洗板5次，加入TMB显色液显色15min， 终止液终止，酶标仪(TECANsunrise)读值。结果显示在直接ELISA 体系中，NA10B9可特异性的结合CA16实心颗粒抗原，而与空心颗粒抗 原无明显反应(图2)。

实施例5：NA10B9抗体亚型的鉴定

将实施例1制备的CA16病毒实心颗粒抗原用20mM PB7.4稀释100 倍，包被96孔酶标板，100μL/孔，37℃包被2小时，用PBST洗板1 次，用相关封闭液(20mM PB7.4含150mMNaCL,0.5％酪蛋白，0.002％明 胶)封闭非特异性结合位点，200μL/孔，4℃封闭过夜。取稀释500倍 的NA10B9单抗100μL加入酶标板，37℃孵育1h。PBST洗板5次，分 别加入标记HRP的抗IgG1,IgG2a,IgG2b,IgG3和IgM的羊抗鼠二抗 (Thermo)。37℃孵育30min。PBST洗板5次，加入TMB显色液显色15min， 终止液终止，酶标仪(TECAN sunrise)读值。结果显示NA10B9抗体为 IgG2a亚型(表1)。

表1单克隆抗体NA10B9亚型的鉴定

	HRP-IgG1	HRP-IgG2a	HRP-IgG2b	HRP-IgG3	HRP-IgM
						重链亚型	-	+	-	-	-
轻链亚型	κ	κ	κ	κ	κ

实施例6：单克隆抗体NA10B9可用于在免疫荧光实验中检测CA16 感染的细胞

将RD细胞铺于24孔细胞培养板中(500uL，5×10⁴/孔)，孔内预 先铺上圆形盖玻片。待细胞贴壁后，接种CA16病毒，5000TCID₅₀/孔， 同时设置细胞空白对照。12h后，用枪尖吸去上清，用PBS洗液洗一次， 1ml/孔。吸去PBS，加4％多聚甲醛，1mL/孔，常温避光固定15min。通 透：0.5％TritonX-100(PBS配制)通透，1ml/孔，室温，10min。PBS 洗三次，每次3min。把一张封口膜拉平固定在24孔细胞培养板板盖上， 在封口膜上对应每孔滴加50uL山羊血清。加好后，用弯针头将铺有细 胞的盖玻片掀起，镊子夹住边缘，细胞面朝下盖在膜上，放入湿盒，37 ℃，1h。将盖玻片按原孔放回24孔板中，细胞面朝上，PBS洗三次，每 次3min。取NA10B9抗体(1mg/mL)用2％BSA稀释200倍，加至细胞上(操 作方法同封闭过程)，37℃封闭1h。将盖玻片按原孔放回24孔板中， 细胞面朝上，PBS洗三次，每次3min。用2％BSA稀释二抗GAM-FITC (Sigma)，1:500倍稀释，湿盒避光37℃孵育30min(操作方法同封闭 过程)。将盖玻片按原孔放回24孔板中，细胞面朝上，PBS洗三次，每 次3min。用PBS按1:2000比例稀释DAPI(Invitrogen)，加至细胞上 (操作方法同封闭过程)，室温避光5min。将盖玻片按原孔放回24孔 板中，细胞面朝上，PBS洗三次，每次3min。避光。在干净载玻片上做 好标记，将封片剂(70％甘油，2.5％防促灭剂)30μL左右滴于擦净的载 玻片上盖上有细胞的盖玻片，指甲油封边缘，避光晾干。荧光显微镜下 观察并拍照。结果显示被CA16病毒感染的细胞有绿色荧光，而空白对 照无绿色荧光(图3)。说明NA10B9可用于检测CA16感染的细胞。

实施例7：CA16实心颗粒抗原检测方法的建立

将NA10B9作为包被单抗，与其他可与CA16病毒颗粒结合的CA16 抗血清或多克隆抗体或单克隆抗体组合建立双抗体夹心酶联免疫检测 方法，来检测CA16实心颗粒抗原。具体方法如下：将NA10B9单抗用20mM PB7.4稀释至10μg/mL浓度，包被96孔酶标板，100μL/孔，37℃包被 2小时。用PBST洗板1次，用相关封闭液(20mM PB7.4含150mM NaCl,0.5％ 酪蛋白，0.002％明胶)封闭非特异性结合位点，200μL/孔，4℃封闭过 夜。将不同的CA16病毒样品用封闭液稀释100倍，按100μL/孔加入酶 标板，37℃孵育1小时。PBST洗板5次，加入HRP标记的可与CA16病 毒颗粒结合的鼠多抗(实施例2中制备的小鼠多抗血清)或单克隆抗体(本实施例中以一株实施例2中制备的可与CA16病毒结合的单抗 NA14B9为例，可以采用其它可与CA16病毒结合的单克隆抗体，可参考 文献：贾继宗等人，2012，中国免疫学杂志28.4:351-354.)，37℃ 孵育30min。PBST洗板5次，加入TMB显色液显色15min，终止液终止，酶标仪(TECAN sunrise)读值。结果如图4所示，NA10B9无论与多抗 配对还是与单克隆抗体配对，都可检测出CA16实心颗粒抗原，而检测 不出空心颗粒抗原活性。说明以NA10B9为包被抗体的双抗体夹心方法， 可以用于CA16实心颗粒抗原的检测。

实施例8：单抗NA10B9的中和效价

中和实验：用传统中和实验方法鉴定杂交瘤细胞培养上清或粗纯抗 体的中和活性。将人横纹肌肉瘤细胞(RD)铺于96孔细胞培养板中(5 ×10³/孔)。10小时后将待测样品用无血清MEM培养基进行倍比稀释(以 8倍稀释为起点，进行2倍比稀释，稀释10个梯度)，每份样品至少重 复4孔。用无血清MEM将CA162007-00190病毒稀释至100TCID₅₀/50uL 的浓度，取50uL加入上述已梯度稀释的单抗样品孔中。37℃孵育1小 时后，将单抗与病毒混合液100uL加入预铺有RD细胞的96孔细胞培养 板中。37℃，5％CO₂培养，连续观察7天并记录细胞病变。可以抑制 50％以上细胞孔病变的最大稀释倍数作为该样品的中和效价。结果显示单克隆抗体NA10B9具有较高的体外中和活性，中和效价约为8192。

实施例9：NA10B9在小鼠体内预防CA16感染实验。

实验新生鼠分组如下：选用一日龄BALB/c小鼠，设置NA10B9预防 组和PBS对照组，每组15只。新生鼠饥饿4小时后，对其腹腔注射NA10B9 单抗，剂量为10μg/只；PBS对照组腹腔注射同体积的PBS。4小时后， 对NA10B9预防组和PBS对照组的新生鼠灌胃感染CA16病毒，攻毒剂量 为1.0×10⁶TCID₅₀。以上动物均连续观察16天。

实验结果显示(图5)PBS对照组小鼠在攻毒后7天大部分死亡。 NA10B9预防组体症正常，未见异常。说明单抗NA10B9有预防CA16感染 的作用。

实施例10：NA10B9的体内治疗实验。

所述的广谱高中和活性单抗NA10B9对CA16多个毒株均有中和活 性，将其用于单抗治疗CA16感染动物模型试验中可以保护CA16感染鼠 免于发病。

实验新生鼠分组如下：选用一日龄BALB/c小鼠，设置NA10B9保护 组和PBS对照组，每组15只。新生鼠饥饿4小时后，对NA10B9保护组 和PBS对照组的新生鼠灌胃感染CA16病毒，攻毒剂量为1.0×10⁶ TCID₅₀。NA10B9保护组在攻毒后24小时，对其腹腔注射NA10B9单抗， 剂量为10μg/只；PBS对照组腹腔注射同体积的PBS。以上动物均连续 称重和观察16天。

实验结果见图6，PBS对照组小鼠，出现消瘦症状，攻毒后6天出 现后肢瘫痪症状，攻毒后7天大部分小鼠死亡。NA10B9保护组体症正常， 未见异常。说明单抗NA10B9可有效治疗被CA16感染的小鼠。

实施例11：单克隆抗体NA10B9互补结合区(CDR)基因调取

半贴壁培养10⁷个杂交瘤细胞NA10B9，用吹管吹起贴壁的细胞使之 悬浮，并将其转移至新的4mL离心管中。以1500rmp离心3min，收集沉 淀的细胞，并将其重悬有100μL无菌PBS(PH7.45)中。将细胞悬液转 移到一新的1.5mL离心管中，加入800μL Trizol(Roche,Germany)， 并轻轻颠倒混匀，静置10min。然后，加入200μL氯仿并剧烈震荡静置 15s，静置10min。之后，12000rpm、4℃离心15min，并转移上层液体 至一新的1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀并静置10min。 之后，12000rpm、4℃离心15min，弃上清；加入600μL75％乙醇进行 洗涤，12000rpm、4℃离心5min，弃上清。将沉淀于60℃真空抽干5min。 之后，将透明的沉淀溶于70μL DEPC水中，加入1μL反转录引物 Oligo(dT)_(12-18)(Promega)，1μLdNTP(上海生工)，然后与72℃水浴 10min，之后立即置于冰浴中5min；然后加入10μL 5X反转录缓冲液和 1μAMV反转录酶(Promega),1μRnasin(40U/μL，Promega)，混匀后 与42℃将RNA反转录成cDNA。

采用聚合酶链式反应(PCR)法分离抗体可变区的基因，使用根据 Novagen公司的Ig-Prime Kits合成的引物组(深圳华大公司合成)，模 板为以上合成的cDNA.

轻链基因的分离使用K轻链的MuIgkV_L5’-A至G的7组上游引物， 下游引物为MuIgκV_L3'-1：(5’-ACTGGATGGTGGGAAGATGGA-3’)。分别使 用7组上游引物和MuIgκV_L3'-1下游引物组成引物对，在47℃至56℃之 间进行梯度PCR扩增。结果在MuIgkVL5’-D2 (5’-ATGGGC(A/T)TCAAGATG(A/G)AGTCACA(G/T)W(C/T)(C/T)C(A/T)GG-3’ )/MuIgκV_L3'-1引物对及以下条件的扩增获得一条单一的约400bp的DNA片段，PCR条件为：94℃5min；30个循环(98℃10s,55℃30s， 72℃30s)；72℃10min。回收目的片段，并克隆至pMD 18-T载体， 测序(上海英骏测序)。对测序序列进行Blast比对，以确定轻链可变 区的核苷酸序列，并进而确定相应的氨基酸序列。

重链基因的分离使用IgG的的MuIgGV_H5’-A至F的6组上游引物， 下游引物为MuIgMV_H3'-1：(5’-CCAGGG(A/G)CCA(A/G)(G/T)GGATA (A/G)ACIG(A/G)TGG-3’)。分别使用6组上游引物和MuIgMV_H3'-1 组成引物对，在47℃至56℃之间进行梯度PCR扩增。结果在MuIgGV_H5’-C2 (5’-ATGGCTGTC(C/T)T(A/G)G(C/G/T)GCTG(C/T)TC(C/T)TCTG-3’)/MuIgMV_H3'-1引物对及以下条件的扩增获得一条单一的约400bp的DNA 片段，PCR条件为：94℃5min；30个循环(98℃10s,55℃30s，72℃ 30s)；72℃10min。回收目的片段，并克隆至pMD18-T载体，测序(上 海英骏测序)。对测序序列进行Blast比对，以确定重链可变区的核苷酸序列，并进而确定相应的氨基酸序列。

按照上述方法，最终获得单克隆抗体NA10B9的可变区基因序列(重 链：SEQ IDNO：3；轻链：SEQ ID NO：4)，并确定了相应的氨基酸序 列(重链：SEQ ID NO：1；轻链：SEQ IDNO：2)。

Claims (10)

1.一种特异性结合柯萨奇病毒A16型病毒(CA16)天然实心颗粒抗原的单克隆抗体，其包括重链CDR1-3和轻链CDR1-3，其特征在于，所述重链CDR1-3的氨基酸序列为：

CDR1：如序列表中SEQ ID NO：5所示；

CDR2：如序列表中SEQ ID NO：6所示；

CDR3：如序列表中SEQ ID NO：7所示；

所述轻链CDR1-3的氨基酸序列为：

CDR1：如序列表中SEQ ID NO：8所示；

CDR2：如序列表中SEQ ID NO：9所示；

CDR3：如序列表中SEQ ID NO：10所示。

2.权利要求1所述的单克隆抗体，其特征为：其重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；其轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.由权利要求1所述单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列构建成的单链抗体、嵌合单克隆抗体、改型单克隆抗体或其他人源化形式的单克隆抗体，或其抗原结合片段。

4.编码权利要求1所述单克隆抗体的核酸分子或其简并性序列。

5.权利要求4中所述的核酸分子，其为SEQ ID NO：3所示的编码所述单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列和SEQ ID NO：4所示的编码所述单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列，或其简并性序列。

6.权利要求1所述的单克隆抗体或权利要求3所述的单链抗体、嵌合单克隆抗体、改型单克隆抗体或其他人源化形式的单克隆抗体，或其抗原结合片段用于制备预防和/或检测CA16病毒的药物的用途，用于制备预防和/或治疗HFMD的药物或者抗CA16病毒的药物中的用途。

7.包含权利要求1所述的单克隆抗体或权利要求3所述的单链抗体、嵌合单克隆抗体、改型单克隆抗体或其他人源化形式的单克隆抗体，或其抗原结合片段和药学上可接受的载体的药物组合物。

8.克隆载体或表达载体，其包含权利要求5的核酸分子。

9.宿主细胞，其包含权利要求8的克隆载体或表达载体。

10.制备权利要求1所述的单克隆抗体或权利要求3所述的单链抗体、嵌合单克隆抗体、改型单克隆抗体或其他人源化形式的单克隆抗体，或其抗原结合片段的方法，所述方法包括：在适合表达的条件下，培养权利要求9的宿主细胞。