JP2008253188A - エンドサイトーシス依存性dna取り込み抑制剤、エンドサイトーシス依存性dna取り込み促進剤、ウイルス感染阻害剤、ウイルス感染予防剤、及びウイルス感染促進剤、並びに、遺伝子マーカー、モノクローナル抗体、ハイブリドーマ、及びそれらの使用方法。 - Google Patents
エンドサイトーシス依存性dna取り込み抑制剤、エンドサイトーシス依存性dna取り込み促進剤、ウイルス感染阻害剤、ウイルス感染予防剤、及びウイルス感染促進剤、並びに、遺伝子マーカー、モノクローナル抗体、ハイブリドーマ、及びそれらの使用方法。 Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】DNaseXタンパク質の機能を増強することによって、エンドサイトーシス依存性のDNAの取り込みを抑制することができる。ここで、DNaseXタンパク質の機能を増強する因子としては、DNaseX遺伝子発現ベクター等である。一方、DNaseXタンパク質の機能を抑制することによって、エンドサイトーシス依存性のDNAの取り込みを促進することができる。ここで、DNaseXタンパク質の機能を抑制する因子としては、例えば、DNaseX遺伝子を標的とするsiRNA等である。また、DNaseX遺伝子のhmRNA、mRNA、タンパク質等の発現レベルによって、ウイルス感染に対する易感染性予測やウイルス感染後の病状推定を行うこともできる。
【選択図】なし
Description
Shiokawa, D., and Tanuma, S., Biochemistry, 40, 143-152 (2001) Shiokawa, D., Shika, Y., Saito, K., Yamazaki, K. and Tanuma, S., Biochem. J., 392, 511-517 (2005) 特表2006―510363号公報
本発明者らが明らかにしたように、DNaseXタンパク質は、GPI結合性膜タンパク質であり、外来DNAのエンドサイトーシス依存性取り込みを抑制する機能を有する。
従って、DNaseXタンパク質の機能を増強する物質は、エンドサイトーシス依存性DNA取り込み抑制剤として有用である。エンドサイトーシスによってDNAが細胞内に取り込まれる場合としては、例えば、ウイルスが細胞に感染した場合等が挙げられる。そこで、DNaseXタンパク質の機能を増強する物質を有効成分として含有する薬剤は、ウイルス感染を阻害できるウイルス感染阻害剤や、ウイルス感染予防剤や、ウイルス感染に対するワクチンとして有用である。なお、ウイルスの種類は、特に限定されない。
一方、DNaseXタンパク質の機能を抑制する物質を有効成分として含有する薬剤は、ウイルス感染を促進することができる。従って、DNaseXタンパク質の機能を抑制する物質は、エンドサイトーシス依存性DNA取り込み促進剤として有用であり、DNaseXタンパク質の機能を抑制する物質を有効成分として含有する薬剤は、ウイルス感染を促進できるウイルス感染促進剤として有用である。ここで、「DNaseXタンパク質の機能を抑制する」とは、細胞全体でDNaseXタンパク質の機能が抑制されれば良く、例えばDNaseXタンパク質分子の活性が低下することにより機能が抑制されるだけでなく、細胞内でDNaseXタンパク質分子の量が減少することにより機能が抑制されてもよい。
(1)疾患モデル動物の作製
本発明の疾患モデル動物は、脊椎動物個体に対し、体の全部又は一部でDNaseXタンパク質の機能を異所的に又は過剰に増強させる処理を施すこと、又は体の全部又は一部でDNaseXタンパク質の機能を抑制する処理を施すことにより作製することができる。
DNaseXタンパク質の機能を増強させた動物は、ウイルス等に感染しにくくなるため、感染症抵抗性を示すモデルとして有用である。一方、DNaseXタンパク質のDNaseX活性を抑制した動物は、ウイルス等に感染しやすくなるため、易感染性を示すモデルとして有用である。ここで、感染症とは、ウイルス等の病原体が感染して増殖し、病的症状を発症する疾患のことをいう。
DNaseXタンパク質の機能を増強する化合物をスクリーニングすることにより、エンドサイトーシス依存性DNA取り込み抑制剤、ウイルス感染阻害剤、ウイルス感染予防剤及びワクチン等に用いられる化合物を得ることができる。
なお、本発明にかかるDNaseXタンパク質は、以下の(a)又は(b)のタンパク質である。
(a)ヒトDNaseXタンパク質(配列番号1のアミノ酸配列を有するタンパク質)及びそのホモログ。
(b)(a)に記載のタンパク質のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加したアミノ酸配列からなり、DNaseX活性を有するタンパク質。
(a)ヒトDNaseX遺伝子のcDNA(配列番号2の塩基配列を有するDNA、Accession No. X90392)及びDNaseX遺伝子ホモログのcDNA。
(b)(a)に記載のcDNAの塩基配列において、1もしくは数個の塩基が欠失、置換、又は付加した塩基配列を有し、DNaseX活性を有するタンパク質をコードするDNA。
本発明の抗ヒトDNaseXモノクローナル抗体は、ハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体である。本発明のモノクローナル抗体は、公知の技術を用いて作製することができる。
本発明のモノクローナル抗体の作製には、DNaseXタンパク質のうち抗原性を有するタンパク質を免疫原として用いることが好ましい。抗原性を有するタンパク質としては、例えば、ヒトDNaseXの237-254位に対応するペプチド(RSLLHTAAAFDFPTSFQL(配列番号3)が挙げられる。このペプチドは、化学合成によって作製することができる。なお、免疫原には、DNaseXタンパク質を発現している細胞そのものを用いてもよい。
(i)易感染性予測マーカー
一般に、ウイルスは、細胞表面に吸着し、その細胞自身が持っているエンドサイトーシス機構によって、エンドソーム小胞として細胞内に取り込まれることが知られている。これより、細胞のエンドサイトーシス機構を抑制すれば、ウイルス感染は阻害され、一方、細胞のエンドサイトーシス機構を促進すれば、ウイルス感染は助長される。
一般に、ウイルスが細胞に感染すると、そのウイルスは細胞内で大量に増殖し、細胞本来の生理機能が破錠したり細胞膜の破壊が起きたりして、宿主細胞は死に至る場合がある。また、ウイルスによっては、短期間で大量のウイルスを作って直ちに宿主細胞を殺すのではなく、むしろ宿主細胞へのダメージが少なくなるよう、少量のウイルスを長期間にわたって持続的に産生(持続感染)する場合もある。
上記(i)及び(ii)のウイルスとしては、例えば、インフルエンザウイルス、肝炎ウイルス、HIVウイルス、ATLウイルス、エボラウイルス、黄熱病ウイルス、狂犬病ウイルス、サイトメガロウイルス、SARSウイルス、JCウイルス、水痘・帯状疱疹ウイルス、コクサッキーA16型・エンテロウイルス71ウイルス、デング熱ウイルス、パルボウイルス、EBウイルス、天然痘ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、マールブルグウイルス、フィロウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ラッサウイルス、フニンウイルス、新大陸アレナウイルス、ハンタウイルス、リフトバレー熱ウイルス、ムンプスウイルス、ウエストナイルウイルス、単純ヘルペスウイルス、コクサッキーウイルス、ロタウイルス、ノロウイルス、チクングニアウイルス、トガウイルス等が挙げられるが、これらに限定されない。
上記のように、ヒト又はヒト以外の脊椎動物のDNaseX遺伝子の発現レベルより、易感染性予測又はウイルス感染後の病状推定をすることができる。従って、DNaseX遺伝子の発現レベルを測定できるキットは、ウイルスに対する易感染性予測又はウイルス感染後の病状推定に有用である。このキットは、DNaseX遺伝子の発現レベルを測定するために、DNaseXタンパク質に対する抗体、あるいはDNaseXのcDNAを増幅するためのPCR用プライマーを含有することが好ましい。なお、この抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体が、RSLLHTAAAFDFPTSFQLの一部又は全部をエピトープとしてもよい。なお、簡便さの点から、このキットは、免疫クロマトグラフ測定法等の装置状になっていることが好ましいが抗原抗体反応を利用した方法であれば特に限定されない。
<実施例1:新規モノクローナル抗体の作製と特異性の確認>
本実施例で作製したモノクローナル抗体は、実施例2において使用した。
本法では、ヒトDNaseXの237-254位に対応するペプチド(RSLLHTAAAFDFPTSFQL(配列番号3))のN末端にCysを付加した合成ペプチドとチオグロブリンとをN末端のCysによって結合したペプチドを免疫原として用いた。まず、6週齢雌BDF1マウスに、上記抗原50μgを完全フロイントアジュバントと共に皮下注射して初回免疫を行った。初回免疫から2週後、3週後、4週後に、上記抗原50μgを不完全フロイントアジュバントと共に皮下注射して追加免疫を行った。最後に、上記抗原50μgを静脈注射して最終免疫を行った。最終免疫から4日後、上記マウスから脾臓を取り出して脾細胞を調製し、ポリエチレングリコールを用いて、調製した脾細胞とX63-Ag8-653マウスミエローマ細胞(Kinebuchi, M., Ide, T., Lupin, D., Tamatani, T., Miyasaka, M., Matsuura, A., Nagai, Y., Kikuchi, K. and Uede, T., J. Immunol., 146, 3721-3728 (1991))とを細胞融合した。その後、HAT培地を用いてハイブリドーマをスクリーニングし、限界希釈法によってクローニングを行い、最終的にクローン化したハイブリドーマ株1B1を得た(寄託受領番号:FERM AP-21282)。なお、1B1ハイブリドーマから産生される抗ヒトDNaseXモノクローナル抗体のサブクラスはIgG1/κであった。
サルDNaseX(センスプライマー):5’-CCACCATGCACTATCCAACTGCACTC-3'(配列番号5)
(アンチセンスプライマー):5’- GGTGGCAGGGCACAGTTGAGG-3’(配列番号6)
ブタDNaseX(センスプライマー):5’-CCACCATGGATTCCTCTGGAGGGTT CC -3’(配列番号7)
(アンチセンスプライマー):5’-GGCCGCCAGGCCCAGCTGTGG-3’(配列番号8)
ウシDNaseX(センスプライマー):5’-CCACCATGCATTCCTCTGGAGGGTTCC-3’(配列番号9)
(アンチセンスプライマー):5’-GGCCACCAGGCCCAGCTGGGG-3'(配列番号10)
マウスDNaseX(センスプライマー):5’-CCACCATGCCCTTTGGACAACCTGGA-3'(配列番号11)
(アンチセンスプライマー):5’-GTCCAGCTGAGATGGCAGGAG-3’(配列番号12)
ラットDNaseX(センスプライマー):5’-CCACCATGCCCTCTGGACAGCCTGTA-3'(配列番号13)
(アンチセンスプライマー):5’-GCCCAGCTGAGATAGTGACAG-3’(配列番号14)
ハムスターDNaseX(センスプライマー):5’-CCACCATGCCATATATGGCCATGCAT-3’(配列番号15)
(アンチセンスプライマー):5’-GCTCAGTTGAGATGGCAAAAG-3’(配列番号16)
上記(1)と同様の方法を用いて、抗ヒトDNaseIモノクローナル抗体を作製し、最終的にクローン化したハイブリドーマ株10A2を得た。なお、免疫原には、ヒトDNaseIの245-262位に対応するペプチド(GAVVPDSALPFNFQAAYG(配列番号4))のN末端にCysを付加した合成ペプチドとチオグロブリンとを結合させたペプチドを用いた。得られた抗ヒトDNaseIモノクローナル抗体のサブクラスはIgG1/κであった。
ブタDNaseI(センスプライマー):5’-CCACCATGAGGGCGGCCAGGCTGATG-3’(配列番号17)
(アンチセンスプライマー):5’-GGCTCTCTTCAGTGTCACCTC-3’(配列番号18)
マウスDNaseI(センスプライマー):5’-CCACCATGCGGTACACAGGGCTAATG-3’(配列番号19)
(アンチセンスプライマー):5’-GATTTTTCTGAGTGTCACCTC-3’(配列番号20)
その結果、作製した抗ヒトDNaseIモノクローナル抗体は、DNaseIに対して特異的に反応し(図2A)、ヒトDNaseIに対して特異的に反応した(図2B)。
本実施例では、DNaseXタンパク質の機能増強又は機能抑制が、それぞれエンドサイトーシス依存性DNA取り込みの抑制又は増強をもたらすことを示す。
(1)細胞の調製
HeLa S3細胞、COS-7細胞、及びCHO-KI細胞は、10%胎仔ウシ血清(FCS)、100単位/mlペニシリン及び0.1mg/mlストレプトマイシン含有ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)で培養した。また、RD細胞は、増殖培地(GM)(20%FCS、100単位/mlペニシリン及び0.1mg/mlストレプトマイシン含有DMEM)で培養した。なお、RD細胞は、ヒューマンサイエンス研究資源バンクから入手した。
抗ヒトDNaseXモノクローナル抗体及び抗ヒトDNaseIモノクローナル抗体は、実施例1で作製したものを使用した。
また、マウス抗SERCA-1モノクローナル抗体(Ve121G9)はLab vision社から、抗GAPDHモノクローナル抗体(MAB374)はChemicon社から、抗Myc tag抗体(R950-25)はInvitrogen社から購入した。さらに、ヤギ抗GM130(P-20)ポリクローナル抗体はSanta Cruz Biotechnology社から、ウサギ抗マウスFas(341289)ポリクローナル抗体はCalbiochem社から、抗EEA1(PA1-063)抗体はAffinity BioReagents社から、抗LAMP-1(H228)抗体はSanta Cruz Biotechnology社から、抗カルレティキュリン(C4606)抗体及び抗pan-cadherin(C3678)抗体はSigma社から購入した。
i) hDNaseXΔC発現ベクター(phDNaseXΔC)
PCRによって以下のプライマーを用いてhDNaseXΔC cDNAを合成し、このcDNAをpcDNA3.1 myc-His B(Invitrogen社)(挿入配列がコードするペプチドのC末端にMycタグとHisタグを付加し得る)のEco RVサイトへサブクローニングして、hDNaseXΔC発現ベクターを構築した。
hDNaseXΔC(センスプタイマー):5’-CCACCATGCACTACCCAACTGCACTC--3'(センスプライマー)(配列番号21)
(アンチセンスプライマー): 5'-CTGGCTCAGCTTCAGCTCCAC-3'(配列番号22)
PCRによって以下のプライマーを用いてmFasΔC cDNAを合成し、このcDNAをpcDNA3.1 myc-His B(Invitrogen社)のEco RVサイトへサブクローニングして、mFasΔC発現ベクターを構築した。
mFasΔC(センスプライマー): 5'-CCACCATGCTGTGGATCTGGGCTGTC-3'(配列番号23)
(アンチセンスプライマー): 5’-TTCCTGGATTGTCATGTCTTCAGC-3’(配列番号24)
PCRによって以下のプライマーを用いて、hDNase Iと疎水性ドメイン(HD)を含むDNase Xの外部末端領域(アミノ酸配列256-284位)をコードするcDNAを作製し、このcDNAをpcDNA3.1 myc-His B(Invitrogen社)のEco RVサイトへサブクローニングして、hDNase I-HD発現ベクターを構築した。
hDNase I(センスプライマー):5’-CCACCATGAGGGGCATGAAGCTGCTG-3’(配列番号25)
(アンチセンスプライマー):5'-CTTCAGCATCACCTCCACTGG-3'(配列番号26)
HD(センスプライマー):5’-CTGAGCCAGGCGCACAGCGTC-3’(配列番号27)
(アンチセンスプライマー):5'-GGCAGCAGGGCACAGCTGAGG-3'(配列番号28)
phDNase X H148Aは、LA PCR in vitro mutagenesisキット(タカラバイオ株式会社)を用いた部位特異的突然変異誘発法によって148番目のHisをAlaに置換し、phDNase Xと同様に作製した。
hDNaseI(phDNase I-myc-His)、hNaseX(phDNase X-myc-His)、DNaseγ(phDNase γ-myc-His)、及びhDNAS1L2(phDNAS1L2-myc-His)は、Shiokawaらの方法(Shiokawa, D., and Tanuma, S. Biochemistry, 2001, vol.40, p.143-152)に従って作製した。また、pcDNA 3.1/myc-His/lacZ(placZ)(βガラクトシダーゼ発現ベクター)は、Invitrogen社から購入した。
(1)筋管細胞への分化誘導方法
継代培養したRD細胞を、タイプIコラーゲンでコートされた培養皿(Iwaki社製)に播種し、GM培地で培養した。次に、GM培地を分化培地(DM)(2%ウマ血清、100単位/mlペニシリン及び0.1mg/mlストレプトマイシン含有DMEM)に変更して、培地交換をしながらRD細胞を培養し、筋管細胞へ分化誘導した。
ウエスタンブロッティング法に用いた各抗体の希釈濃度は、抗ヒトDNaseXモノクローナル抗体は500ng/ml、抗DNaseIモノクローナル抗体は100ng/ml、抗Myc tag抗体は1000倍希釈、抗GAPDHモノクローナル抗体は250倍希釈、マウス抗SERCA-1モノクローナル抗体は100倍希釈、ウサギ抗マウスFasポリクローナル抗体は2000倍希釈、抗pan-cadherin抗体は400倍希釈であった。
ホルマリンで固定したサンプルをパラフィンで包埋し、10μmの切片を作製した。なお、パラフィン包埋された正常ヒト組織は、BioChain社から購入した。
免疫組織化学染色は、Cell and Tissue Staining kit(HRP-DAB)(R&D Systems社)を用いて行った。まず、組織切片を乗せたスライドをAntigen Retrieval Dewax Solution(BioChain社)で処理し、この組織切片に、3μg/mlの抗DNaseXモノクローナル抗体をのせて4℃、オーバーナイトでインキュベートした。次に、これらの組織切片にContrast BLUE Solution(KPL)をのせて対比染色を行った。なお、これらの画像は、CK40 light microscope system(Olympus)を用いて記録した。
免疫蛍光染色による解析は、従来の方法(Shiokawa et al., Biochem. J., 2005, vol. 392, p.511-517)を改良して行った。具体的には、以下の通りである。
まず、培養皿の底に敷いたカバーグラス上で細胞を培養した。培養後、これらの細胞を3.5%ホルムアルデヒドで固定し、Cytonin solution(R&D Systems社)を添加して、室温で30分間インキュベートした。次に、一次抗体の希釈液をカバーグラス上の細胞に滴下し、4℃、オーバーナイトでインキュベートした。ここで、各一次抗体は、抗ヒトDNaseXモノクローナル抗体は3μg/ml、抗DNase Iモノクローナル抗体は1μg/ml、抗カルレティキュリン抗体は2000倍希釈、マウス抗SERCA-1モノクローナル抗体は50倍希釈、ヤギ抗GM130(P-20)ポリクローナル抗体は50倍希釈、ウサギ抗マウスFas(341289)ポリクローナル抗体は100倍希釈、抗pan-cadherin抗体は400倍希釈、抗EEA1(PA1-063)抗体は1000倍希釈、抗LAMP-1(H228)抗体は100倍希釈の濃度に調製して使用した。
免疫組織化学染色には、カバーグラス上の細胞を、DPBSで2回リンスし、5 unit/ml Bacillus thuringiensisホスファチジルイノシトール特異性ホスホリパーゼ(PI-PLC)(Sigma社)含有Leibovidz培養培地で37℃、30分間インキュベートした後、(4)の通りに固定し、抗体で処理した。
カバーグラス上の細胞を、placZ-Transome IV複合体存在下で30分間インキュベートした。次に、これらの細胞をDPBSで2回洗浄し、3.7%ホルムアルデヒド含有DPBSをのせて室温で10分間固定した。次に、lacZプラスミドに生じる3’-OH末端を、Flow TACS in situ TUNEL Detection kit(R&D Systems社)を用いたTUNEL法によって検出した。なお、アッセイ全体は、FITC結合ストレプトアビジンをAlexa488結合ストレプトアビジン(Molecular Probes社)に変更した以外は、キット製造業者のプロトコールに従って行った。最後に、これらの細胞をDPBSで3回洗浄し、10μM Hoeschst 33342含有DPBSをのせて、エンドサイトーシスを起こしたDNAを室温で10分間対比染色させ、蛍光顕微鏡で観察した。
細胞核及びエンドサイトーシスを起こしたDNAを、Hoechst 33342で対比染色した。核DNAの観察には2種類のNDフィルター(U-ND6及びU-ND25)(オリンパス株式会社)を用いて、一方、エンドサイトーシスを起こしたDNAの観察には、NDフィルターを用いないで、それぞれのDNA画像を観察した。
(1)DNaseXタンパク質の発現
DNaseXタンパク質の発現がRD細胞の筋肉への分化段階に関連していること示すために、免疫組織化学染色を用いて、ヒト組織におけるDNaseXタンパク質の発現を調べたところ、図3Aに示すように、心筋細胞及び骨格筋線維では、DNaseXタンパク質の強いシグナルが得られたが、脳ではシグナルが検出できなかった。このように、DNaseXタンパク質は、筋細胞に強く発現している。
次に、低濃度のマイトジェン条件下でRD細胞を培養すると、筋管が形成される(図3B)ので、この系を用いて、DNaseXタンパク質の発現の筋肉分化における変化をウエスタンブロッティング法で調べたところ、図3Cに示すように、DNaseXタンパク質の発現は分化誘導3日目に増加し、分化誘導5日目にはさらに増加した。このDNaseXタンパク質の発現の変化は、筋肉分化マーカー(SERCA-1:筋小胞体Ca2+-ATPase1)の発現と同様の挙動を示した(図3C)。
このように、DNaseXタンパク質の発現は、未分化筋細胞では弱く、分化するにつれ強くなる。
次に、6日間低濃度のマイトジェン条件下で培養して分化させた筋管細胞に対し、抗DNaseX抗体及び抗カルレティキュリン抗体、抗SERCA-1抗体、又は抗GM130抗体で二重染色し、共焦点レーザー顕微鏡を用いてDNaseXタンパク質が膜に分布していることを示した。
さらに、浸透化処理無しで、免疫蛍光染色を行ったところ、図3E(蛍光顕微鏡像)及びF(共焦点レーザー顕微鏡像)に示すように、同様に分化した筋管細胞膜に局在することが観察され、DNaseXタンパク質は細胞外の膜表面に存在した。
このように、DNaseXタンパク質は、分化したRD由来の筋管において分泌経路に局在していることから、タンパク質合成後、細胞膜に送達されることが結論される。
DNaseXタンパク質の細胞膜における局在を確認するために、Fugene6 (Roche)を用いて、DNaseX発現ベクターとDNaseI発現ベクターをCOS-7細胞に導入し、免疫蛍光染色を用いて各DNaseの細胞内での分布を観察した。なお、マウスFas抗原の突然変異型(mFasΔC)は、膜貫通タンパクとして細胞表面に発現していることが知られているので、細胞膜における観察を容易にするために、mFasΔCを同時にCOS-7細胞に導入した。
図4Aに示すように、DNaseXタンパク質は、細胞膜に局在して発現し、mFasΔCと同様な分布を示していた(図4A上段)。一方、コントロールとして用いたDNaseIタンパク質は、細胞膜に発現していなかった(図4A下段)。
次に、疎水性のC端ドメインを欠失するDNaseXΔCの発現ベクターとDNaseXのC端ドメインを有するDNaseI-HDの発現ベクターを用いて、同様の実験を行ったところ、図4Bに示すように、DNaseXΔCタンパク質は膜に局在せず、DNaseI-HDタンパク質は膜に局在した。このことから、疎水性のC端ドメインは、DNaseXタンパク質が膜に局在するために必須の領域であることが結論される。
ここでは、GPIアンカーを解離する酵素として知られているPI-PLC(ホスファチジルイノシトール特異性ホスホリパーゼ)を用いて、以下の実験を行ない、DNaseXタンパク質がGPIアンカーで細胞膜に結合していることを示す。
ここでは、RD細胞が分化するに従い、DNaseXタンパク質によるエンドサイトーシス依存性DNA取り込み阻害が向上することを示す。
本実施例では、細胞内でDNaseXタンパク質を過剰発現させると、細胞のエンドサイトーシス依存性DNA取り込み能が低下することを示す。
本実施例では、細胞内でDNaseXタンパク質を発現抑制すると、細胞のエンドサイトーシス依存性DNA取り込み能が向上することを示す。
(1)RNA
ヒトDNaseX遺伝子(配列番号2)に対するsiRNA及びncRNA (ネガティブコントロールとして使用するRNA duplex)は、Invitrogen社から購入した。なお、本実施例にて用いるsiRNA(small interfering RNA)は、標的配列5'-CCTGCTTCGAGAACTCAATCGATTT-3(配列番号32)に対応する。
(2)siRNAを用いたDNaseX遺伝子の発現抑制
まず、継代培養しているRD細胞を60mm培養皿に播種し、DMEM培地で培養した。次に、培地を分化培地(DM)に変更し、Lipofectamine 2000 transfection regent(Invitrogen社)を用いて、120pmolのsiRNAをRD細胞にトランスフェクトした。その後も培地交換を行ながら、分化培地で4日間RD細胞の培養を行った。各細胞に対し、抗DNaseX抗体、抗SERCA-1抗体、抗GADPH抗体を用いてウエスタンブロッティング法を行った。ここで、SERCA-1は筋管細胞への分化マーカーであり、GADPHはポジティブコントロールである。なお、コントロールとして、何もトランスフェクトしないで、他の処理は同様に行った細胞を用いた。
Claims (42)
- DNaseXタンパク質の機能を増強するエンドサイトーシス依存性DNA取り込み抑制剤。
- DNaseXタンパク質の発現を増強することを特徴とする請求項1に記載のエンドサイトーシス依存性DNA取り込み抑制剤。
- DNaseXタンパク質の機能を増強するウイルス感染阻害剤。
- DNaseXタンパク質の発現を増強することを特徴とする請求項3に記載のウイルス感染阻害剤。
- 請求項3に記載のウイルス感染阻害剤を含有するウイルス感染予防剤。
- 請求項5に記載のウイルス感染阻害剤を含有するウイルス感染に対するワクチン。
- DNaseXタンパク質を強制発現させる発現ベクター。
- DNaseXタンパク質の機能が増強された細胞。
- DNaseXタンパク質を強制発現させる発現ベクターを有する請求項7に記載の細胞。
- 体の一部又は全部で、DNaseXタンパク質が異所的に又は過剰に機能が増強していることを特徴とする脊椎動物。
- DNaseXタンパク質を強制発現させる発現ベクターを細胞に導入することにより作製された請求項10に記載の脊椎動物。
- DNaseXタンパク質を強制発現させる発現ベクターによって作製されたトランスジェニック脊椎動物である請求項11に記載の脊椎動物。
- DNaseXタンパク質の機能を増強する化合物をスクリーニングするスクリーニング方法。
- 配列番号3の一部又は全部をエピトープとするモノクローナル抗体。
- 請求項14に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
- 寄託受領番号FERM AP-21282である請求項15に記載のハイブリドーマ。
- 請求項16に記載のハイブリドーマから産出されるモノクローナル抗体。
- 請求項14又は17のいずれかに記載のモノクローナル抗体を用いて、DNaseXタンパク質を検出する検出方法。
- DNaseXタンパク質の機能を抑制するエンドサイトーシス依存性DNA取り込み促進剤。
- 請求項17に記載のモノクローナル抗体を有効成分として含有するエンドサイトーシス依存性DNA取り込み促進剤。
- DNaseXタンパク質の発現を抑制することを特徴とする請求項19に記載のエンドサイトーシス依存性DNA取り込み促進剤。
- DNaseXタンパク質の機能を抑制するウイルス感染促進剤。
- 請求項17に記載のモノクローナル抗体を有効成分として含有するウイルス感染促進剤。
- DNaseXタンパク質の発現を抑制することを特徴とする請求項22に記載のウイルス感染促進剤。
- DNaseX遺伝子に対するsiRNAを有効成分として含有することを特徴とする請求項24に記載のウイルス感染促進剤。
- 前記siRNAが、配列番号32を有することを特徴とする請求項25に記載のウイルス感染促進剤。
- DNaseX遺伝子に対するsiRNAを発現する発現ベクター。
- 内在性DNaseXタンパク質の機能が抑制されている細胞。
- DNaseX遺伝子に対するsiRNAを発現する発現ベクターを有することを特徴とする請求項28に記載の細胞。
- 体の一部又は全部で、内在性DNaseXタンパク質の機能が抑制されている脊椎動物。
- DNaseX遺伝子のノックダウン又はノックアウトによって作製された請求項30に記載の脊椎動物。
- DNaseXタンパク質の機能を抑制する化合物をスクリーニングするスクリーニング方法。
- 請求項32に記載の検出方法を用いて、DNaseXタンパク質の機能を抑制する化合物をスクリーニングするスクリーニング方法。
- DNaseX遺伝子関連物質である、遺伝子マーカー。
- ウイルスに対する易感染性予測マーカー、又はウイルス感染後の病状推定マーカーであることを特徴とする請求項34に記載の遺伝子マーカー。
- 前記ウイルスが、インフルエンザウイルス、肝炎ウイルス、HIVウイルス、ATLウイルス、エボラウイルス、黄熱病ウイルス、狂犬病ウイルス、サイトメガロウイルス、SARSウイルス、JCウイルス(進行性多巣性白質脳症)、水痘・帯状疱疹ウイルス、コクサッキーA16型・エンテロウイルス71ウイルス(手足口病)、デング熱ウイルス、パルボウイルス(伝染性紅斑)、EBウイルス(伝染性単核球症)、天然痘ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス(プール熱)、マールブルグウイルス(フィロウイルス科)、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ラッサウイルス、フニンウイルス等の新大陸アレナウイルス、ハンタウイルス、リフトバレー熱ウイルス、ムンプスウイルス(流行性耳下腺炎)、ウエストナイルウイルス、単純ヘルペスウイルス、コクサッキーウイルス、ロタウイルス、ノロウイルス、チクングニアウイルス(アルファウイルス属、トガウイルス科)からなる群から選ばれることを特徴とする請求項35に記載の遺伝子マーカー。
- 前記遺伝子関連物質がDNA、hnRNA、mRNA、及びタンパク質からなる群から選ばれることを特徴とする請求項34〜36のいずれかに記載の遺伝子マーカー。
- ウイルスに対する易感染性予測又はウイルス感染後の病状推定のためのキットであって、DNaseXタンパク質に対する抗体又はDNaseXcDNAを増幅するためのPCR用プライマーを含有することを特徴とするキット。
- 前記抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項38に記載のキット。
- 前記モノクローナル抗体が、配列番号3の一部又は全部をエピトープとすることを特徴とする請求項39に記載のキット。
- DNaseXタンパク質を抗原抗体反応を利用した方法で検出することを特徴とする請求項40に記載のキット。
- 前記抗原抗体反応を利用した方法が免疫クロマトグラフ測定法であることを特徴とする請求項41に記載のキット。
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Cited By (5)
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---|---|---|---|---|
CN104610450A (zh) * | 2015-01-18 | 2015-05-13 | 北京工业大学 | 一种中和肠道病毒71型嵌合单克隆抗体的制备方法 |
CN105085673A (zh) * | 2014-05-19 | 2015-11-25 | 厦门大学 | 用于检测柯萨奇病毒a16型病毒实心颗粒的单克隆抗体及其用途 |
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DE102021204116A1 (de) | 2020-04-27 | 2021-10-28 | Tanaka Kikinzoku Kogyo K.K. | Anti-varicella-zoster-virus-antikörper, immunlogisches messverfahren und immunologische messvorrichtung |
WO2022118966A1 (ja) * | 2020-12-04 | 2022-06-09 | 国立大学法人京都大学 | 細胞内への核酸分子取り込み促進剤、医薬組成物、及び新規化合物 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2006510363A (ja) * | 2002-12-18 | 2006-03-30 | コイ,ヨハネス | 癌およびその前駆病変の検出のための化合物および方法 |
-
2007
- 2007-04-04 JP JP2007098925A patent/JP2008253188A/ja active Pending
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2006510363A (ja) * | 2002-12-18 | 2006-03-30 | コイ,ヨハネス | 癌およびその前駆病変の検出のための化合物および方法 |
Cited By (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105085673A (zh) * | 2014-05-19 | 2015-11-25 | 厦门大学 | 用于检测柯萨奇病毒a16型病毒实心颗粒的单克隆抗体及其用途 |
CN105085673B (zh) * | 2014-05-19 | 2018-09-11 | 厦门大学 | 用于检测柯萨奇病毒a16型病毒实心颗粒的单克隆抗体及其用途 |
CN104610450A (zh) * | 2015-01-18 | 2015-05-13 | 北京工业大学 | 一种中和肠道病毒71型嵌合单克隆抗体的制备方法 |
KR20180067682A (ko) | 2015-11-26 | 2018-06-20 | 다나카 기킨조쿠 고교 가부시키가이샤 | 수두 대상 포진 바이러스 검출용 면역 크로마토그래피 분석 장치 |
DE102021204116A1 (de) | 2020-04-27 | 2021-10-28 | Tanaka Kikinzoku Kogyo K.K. | Anti-varicella-zoster-virus-antikörper, immunlogisches messverfahren und immunologische messvorrichtung |
JP2021171007A (ja) * | 2020-04-27 | 2021-11-01 | 田中貴金属工業株式会社 | 抗水痘帯状疱疹ウイルス抗体、免疫学的測定方法及び免疫学的測定用装置 |
US11814424B2 (en) | 2020-04-27 | 2023-11-14 | Tanaka Kikinzoku Kogyo K.K. | Anti-varicella-zoster virus antibody, immunological measurement method, and immunological measurement device |
WO2022118966A1 (ja) * | 2020-12-04 | 2022-06-09 | 国立大学法人京都大学 | 細胞内への核酸分子取り込み促進剤、医薬組成物、及び新規化合物 |
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