JP2015173601A - がん幹細胞の増殖抑制物質のスクリーニング方法 - Google Patents

Abstract

【課題】がん幹細胞の増殖抑制物質のスクリーニング方法を提供すること。【解決手段】Ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ライトオープンリーディングフレームキナーゼ２（ＲＩＯＫ２）タンパク質の機能を阻害する物質を選択する工程を含む、がん幹細胞の増殖抑制物質のスクリーニング方法。【選択図】なし

Description

本発明は、がん幹細胞の増殖抑制物質のスクリーニング方法に関する。さらに詳しくは、がん幹細胞の形成に関与するリン酸化酵素ＲＩＯＫ２（ライトオープンリーディングフレームキナーゼ２(right open reading frame kinase 2)）の機能を特異的に阻害する物質のスクリーニング方法に関する。

ＲＩＯＫ２は、非典型的キナーゼファミリーであるライトオープンリーディングフレーム（ＲＩＯ）ファミリーの一員である。ＲＩＯファミリーの遺伝子は、酵母から哺乳動物まで広く保存されている。ヒトにおいてはＲＩＯＫ１、ＲＩＯＫ２、ＲＩＯＫ３の３種類のキナーゼが存在する。ＲＩＯＫ２の生理機能としては、１８ＳリボソーマルＲＮＡのプロセシング、４０Ｓリボソーマルサブユニットの成熟化への関与、タンパク質の翻訳開始の阻害等が報告されている（非特許文献１）。また、ＲＩＯＫ２がグリオーマ細胞の細胞増殖を制御することは知られているものの（非特許文献２）、がん幹細胞及び腫瘍形成との関連を示唆する報告はなされていない。

Ａ Ｆａｍｉｌｙ Ｐｏｒｔｒａｉｔ ｏｆ ｔｈｅ ＲＩＯ Ｋｉｎａｓｅｓ（ＪＢＣ Ｖｏｌ．２８０，Ｎｏ．４５，ｐ．３７２９７−３７３００，２００５） Ａ Ｋｉｎｏｍｅ−Ｗｉｄｅ ＲＮＡｉ Ｓｃｒｅｅｎ ｉｎ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｇｌｉａ Ｒｅｖｅａｌｓ Ｔｈａｔ ｔｈｅ ＲＩＯ Ｋｉｎａｓｅｓ Ｍｅｄｉａｔｅ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｔｈｒｏｕｇｈ ＴＯＲＣ２−Ａｋｔ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ（ＰＬＯＳ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ｅ１００３２５３，ｖｏｌ．９，Ｉｓｓｕｅ２，２０１３）

がんの根治を可能にすると期待される、がん幹細胞を標的とした薬剤の開発が切望されている中、本発明の目的は、がん幹細胞の増殖抑制物質のスクリーニング方法を提供することである。

がん幹細胞は、幹細胞ニッシェと呼ばれる外部微小環境由来のシグナルによって、その増殖及び形成が制御されている。このことから、本発明者らは、がん幹細胞の増殖及び形成を制御する因子が細胞内情報伝達因子の中に存在するのではないかと着想した。本発明者らは、がん幹細胞を含む複数の細胞株を用いて、ＲＮＡｉ法によって候補の細胞内情報伝達因子をノックダウンし、がん幹細胞の増殖及び形成の指標であるスフェアの形成能を評価した。その結果、ＲＩＯＫ２の発現量を低下させることによって各種がん幹細胞のスフェアの形成能を特異的に抑制できることを確認した。さらに、ＲＩＯＫ２の特徴を調べた結果、自己リン酸化機能を有することを見出し、それを用いて、スクリーニング系を構築できることを見出し、本願発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下の通りのものである。
［１］Ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ライトオープンリーディングフレームキナーゼ２（ＲＩＯＫ２）タンパク質の機能を阻害する物質を選択する工程を含む、がん幹細胞の増殖抑制物質のスクリーニング方法。
［２］上記機能が自己リン酸化活性を含む、上記［１］に記載のスクリーニング方法。
［３］上記ＲＩＯＫ２タンパク質又はその部分配列を含むペプチド断片と、被検物質とを接触させる工程、
上記ＲＩＯＫ２タンパク質又はその部分配列を含むペプチド断片の自己リン酸化活性を測定する工程、及び
上記被検物質の非存在下において測定した対照と比較して、上記ＲＩＯＫ２タンパク質又はその部分配列を含むペプチド断片の自己リン酸化活性を低下させる物質を選択する工程、
を含む、上記［２］に記載のスクリーニング方法。
［４］上記機能が上記ＲＩＯＫ２タンパク質の基質タンパク質に対する結合活性又はリン酸化活性を含む、上記［１］に記載のスクリーニング方法。
［５］上記ＲＩＯＫ２タンパク質又はその部分配列を含むペプチド断片及び上記基質タンパク質と、被検物質とを接触させる工程、
上記ＲＩＯＫ２タンパク質又はその部分配列を含むペプチドの上記基質タンパク質に対する結合活性又はリン酸化活性を測定する工程、及び
上記被検物質の非存在下において測定した対照と比較して、上記結合活性又は上記リン酸化活性を低下させる物質を選択する工程、
を含む、上記［４］に記載のスクリーニング方法。
［６］細胞内における、ライトオープンリーディングフレームキナーゼ２（ＲＩＯＫ２）タンパク質をコードする遺伝子の発現、ＲＩＯＫ２タンパク質の発現又はＲＩＯＫ２タンパク質の機能を阻害する物質を選択する工程を含む、がん幹細胞の増殖抑制物質のスクリーニング方法。
［７］上記ＲＩＯＫ２タンパク質をコードする遺伝子又は上記ＲＩＯＫ２タンパク質をコードする遺伝子の転写調節領域の制御下にあるレポーター遺伝子を発現する細胞に、被検物質を接触させる工程、
上記細胞における上記ＲＩＯＫ２タンパク質をコードする遺伝子又は上記レポーター遺伝子の発現量を測定する工程、及び
上記被検物質の非存在下において測定した対照と比較して、上記発現量を低下させる物質を選択する工程、
を含む、上記［６］に記載のスクリーニング方法。
［８］上記ＲＩＯＫ２タンパク質をコードする遺伝子を発現する細胞に、被検物質を接触させる工程、
上記細胞における上記ＲＩＯＫ２タンパク質の産生量を測定する工程、及び
上記被検物質の非存在下において測定した対照と比較して、上記産生量を低下させる物質を選択する工程、
を含む、上記［６］に記載のスクリーニング方法。
［９］上記ＲＩＯＫ２タンパク質をコードする遺伝子を発現するがん幹細胞を含む細胞集団に、被検物質を接触させる工程、
上記細胞集団を培養することによる上記がん幹細胞の含有率又はスフェアの形成量を測定する工程、及び
上記被検物質の非存在下において測定した対照と比較して、上記含有率又は上記形成量を低下させる物質を選択する工程、
を含む、上記［６］に記載のスクリーニング方法。
［１０］上記機能が自己リン酸化活性、又は上記ＲＩＯＫ２タンパク質の基質タンパク質に対する結合活性若しくはリン酸化活性を含む、上記［６］に記載のスクリーニング方法。
［１１］上記ＲＩＯＫ２タンパク質をコードする遺伝子を発現する細胞に、被検物質を接触させる工程、
上記細胞に含まれる上記ＲＩＯＫ２タンパク質の自己リン酸化活性、又は上記基質タンパク質に対する結合活性若しくはリン酸化活性を測定する工程、及び
上記被検物質の非存在下において測定した対照と比較して、上記自己リン酸化活性又は上記基質タンパク質に対する結合活性若しくはリン酸化活性を低下させる物質を選択する工程、
を含む、上記［１０］に記載のスクリーニング方法。
［１２］上記がん幹細胞の増殖抑制物質が抗がん剤である、上記［１］〜［１１］のいずれかに記載のスクリーニング方法。

本発明によれば、がん幹細胞の増殖抑制物質のスクリーニング方法を提供することが可能になる。本発明のスクリーニング方法を用いた結果、低分子化合物もヒットし、該化合物が、がん幹細胞を特異的に増殖阻害することを見出し、該スクリーニング方法の有効性も確認できた。

各種がん細胞におけるスフェアの形成量を示すグラフである。 各種がん細胞における内在性ｒｉｏｋ２遺伝子のｍＲＮＡの産生量を示すグラフである。 Ｕ２５１細胞における内在性ＲＩＯＫ２タンパク質の産生量を示すウエスタンブロッティングの写真である。 Ｕ２５１細胞におけるがん幹細胞の含有率を示すグラフである。 組換ヒトＲＩＯＫ２タンパク質の自己リン酸化活性を示すグラフである。 スタウロスポリンによるＲＩＯＫ２タンパク質のキナーゼ活性の阻害率を示すグラフである。 組換ヒトＲＩＯＫ２タンパク質の自己リン酸化活性を示すイムノブロットの写真である。 本実施形態に係るスクリーニング方法によってスクリーニングされた被験物質の存在下における、がん幹細胞の含有率を示すグラフである。

本実施形態に係るがん幹細胞の増殖抑制物質のスクリーニング方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ライトオープンリーディングフレームキナーゼ２（ＲＩＯＫ２）タンパク質の機能を阻害する物質を選択する工程を含む。また、本実施形態に係るがん幹細胞の増殖抑制物質のスクリーニング方法は、細胞内における、ライトオープンリーディングフレームキナーゼ２（ＲＩＯＫ２）タンパク質をコードする遺伝子の発現、ＲＩＯＫ２タンパク質の発現又はＲＩＯＫ２タンパク質の機能を阻害する物質を選択する工程を含む。

ＲＩＯＫ２タンパク質は、キナーゼ活性を有するタンパク質であり、その活性を維持しているタンパク質を含む。ＲＩＯＫ２タンパク質は、がん幹細胞の増殖に関与（促進／増強）する新規因子である。該因子を用いることで、がん幹細胞の増殖抑制物質をスクリーニングすることが可能になる。具体的には、ＲＩＯＫ２タンパク質は、配列番号２に記載のアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質である。本明細書において、タンパク質及びペプチドは、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）で記載される。

ＲＩＯＫ２タンパク質は、ヒト又は他の温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ウシ及びサル等）の細胞又はそれらの細胞が存在するあらゆる組織等から、公知のタンパク質の分離精製技術によって単離、精製されるものであってもよい。ヒト又は他の温血動物の細胞としては、例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、肺細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球等）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞及び間質細胞、並びに、これら細胞の前駆細胞、幹細胞及び癌細胞等が挙げられる。これらの細胞が存在する組織としては、例えば、脳、脳の各部位（例えば、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳等）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉（例えば、平滑筋、骨格筋等）、肺、消化管（例えば、大腸、小腸等）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節及び脂肪組織（例えば、白色脂肪組織、褐色脂肪組織等）等が挙げられる。

「配列番号２に記載のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列」とは、
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と約８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１〜５０個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるヒトタンパク質の他の哺乳動物におけるオルソログのアミノ酸配列；又は
（ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるヒトタンパク質若しくは上記（ｃ）のオルソログのスプライスバリアント、アレル変異体又は多型におけるアミノ酸配列
を意味する。

ここで「相同性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方若しくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸及び類似アミノ酸残基の割合（％）を意味する。「類似アミノ酸」とは物理化学的性質において類似したアミノ酸を意味し、例えば、芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ）、脂肪族アミノ酸（Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ）、極性アミノ酸（Ｇｌｎ、Ａｓｎ）、塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）、酸性アミノ酸（Ｇｌｕ、Ａｓｐ）、水酸基を有するアミノ酸（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）、側鎖の小さいアミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ）等の同じグループに分類されるアミノ酸が挙げられる。このような類似アミノ酸による置換はタンパク質の表現型に変化をもたらさない（即ち、保存的アミノ酸置換である）ことが予測される。保存的アミノ酸置換の具体例は当該技術分野で周知であり、種々の文献に記載されている（例えば、Ｂｏｗｉｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７：１３０６−１３１０ （１９９０）を参照）。

アミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；フィルタリング＝ＯＦＦ）にて計算することができる。アミノ酸配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、例えば、Ｋａｒｌｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３−５８７７（１９９３）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ２．０）に組み込まれている（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２（１９９７））］、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４４−４５３（１９７０）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムに組み込まれている］、Ｍｙｅｒｓ及びＭｉｌｌｅｒ，ＣＡＢＩＯＳ，４：１１−１７（１９８８）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＣＧＣ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ２．０）に組み込まれている］、Ｐｅａｒｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：２４４４−２４４８（１９８８）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＦＡＳＴＡプログラムに組み込まれている］等が挙げられ、それらも同様に好ましく用いられ得る。

上記（ａ）において、より好ましくは、「配列番号２に記載のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列」とは、配列番号２に記載のアミノ酸配列と、約８０％以上、好ましくは約８５％以上、より好ましくは約９０％以上、更により好ましくは約９５％以上、いっそう好ましくは約９７％以上、特に好ましくは約９８％以上、最も好ましくは約９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列である。「同一性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方若しくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸残基の割合（％）を意味する。

「配列番号２に記載のアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質」は、配列番号２に記載のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含み、かつ配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質である。

ここで「活性」とは、がん幹細胞の増殖を促進（又は増強）する活性をいう。「実質的に同質」とは、例えば生理学的に、又は薬理学的にみて、その性質が定性的に同じであることを意味する。したがって、がん幹細胞の増殖を促進する活性が同等であることが好ましいが、これらの活性の程度（例えば、約０．１〜約１０倍）、タンパク質の分子量等の量的要素は異なっていてもよい。

がん幹細胞の増殖を促進（又は増強）する活性の測定は、公知の方法に準じて、対象となるＲＩＯＫ２タンパク質の存在下及び非存在下でがん幹細胞のスフェアの形成能、又はがん幹細胞の含有率を測定し、比較することによって行うことができる。

ＲＩＯＫ２タンパク質としては、上記（ｂ）に示すとおり、例えば、
（ｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列中の１〜５０個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜数（５、４、３又は２）個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列に１〜５０個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜数（５、４、３又は２）個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列に１〜５０個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜数（５、４、３又は２）個のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、
（ｉｖ）配列番号２に記載のアミノ酸配列中の１〜５０個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜数（５、４、３又は２）個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、及び
（ｖ）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのいわゆるムテイン、が含まれる。上述のようにアミノ酸配列が置換、欠失、挿入又は付加されている場合、その置換、欠失、挿入又は付加の位置は、がん幹細胞の増殖活性が保持される限り、特に限定されない。

ＲＩＯＫ２タンパク質の好ましい例としては、例えば、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるヒトＲＩＯＫ２タンパク質（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｎｏ．ＮＰ＿００１１５３２２１．１）、又は他の哺乳動物におけるそれらのオルソログ（例えば、マウス（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｎｏ．ＮＰ＿０８０２１０．１）、チンパンジー（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｎｏ．ＸＰ＿５１７８４３．２）、イヌ（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｎｏ．ＸＰ＿５３６２９１．３）、さらにはそれらのスプライスバリアント（例えば、ＮＰ＿０６０８１３．２等）、アレル変異体、多型等があげられる。

ＲＩＯＫ２タンパク質をコードする遺伝子（ｒｉｏｋ２遺伝子）としては、例えば、配列番号１に記載の塩基配列と同一又は実質的に同一の塩基配列を含み、かつ配列番号１に記載の塩基配列がコードするアミノ酸配列からなるタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。

「配列番号１に記載の塩基配列と実質的に同一の塩基配列」とは、
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列と約８０％以上の同一性を有する塩基配列；
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列において、１〜５０個の塩基が置換、欠失、挿入及び／若しくは付加された塩基配列；
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列からなるヒト遺伝子の他の哺乳動物におけるオルソログの塩基配列；又は
（ｄ）配列番号１に記載の塩基配列からなるヒト遺伝子又は上記（ｃ）のオルソログのスプライスバリアント、アレル変異体若しくは多型における塩基配列
を意味する。

上記（ａ）において、より好ましくは、配列番号１に記載の塩基配列と、約８０％以上、好ましくは約８５％以上、より好ましくは約９０％以上、更により好ましくは約９５％以上、いっそう好ましくは約９７％以上、特に好ましくは約９８％以上、最も好ましくは約９９％以上の同一性を有する塩基配列である。

また、ｒｉｏｋ２遺伝子として、上記（ｂ）に示すとおり、例えば、
（ｉ）配列番号１に記載の塩基配列中の１〜５０個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜数（５、４、３若しくは２）個の塩基が欠失した塩基配列、
（ｉｉ）配列番号１に記載の塩基配列に１〜５０個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜数（５、４、３若しくは２）個の塩基が付加した塩基配列、
（ｉｉｉ）配列番号１に記載の塩基配列に１〜５０個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜数（５、４、３若しくは２）個の塩基が挿入された塩基配列、
（ｉｖ）配列番号１に記載の塩基配列中の１〜５０個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜数（５、４、３若しくは２）個の塩基が他の塩基で置換された塩基配列、及び
（ｖ）それらを組み合わせた塩基配列、
を含む遺伝子等が挙げられる。上記のように塩基配列が置換、欠失、挿入又は付加されている場合、置換、欠失、挿入又は付加の位置は、がん幹細胞の増殖活性が保持される限り、特に限定されない。

ｒｉｏｋ２遺伝子の好ましい例としては、配列番号１に記載の塩基配列を含むヒトｒｉｏｋ２遺伝子（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１５９７４９．１）、又は他の哺乳動物におけるそれらのオルソログ（例えば、マウス（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｎｏ．ＮＭ＿０２５９３４．２）、チンパンジー（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｎｏ．ＸＭ＿５１７８４３．３）、イヌ（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｎｏ．ＸＭ＿５３６２９１．４等）、さらにはそれらのスプライスバリアント、アレル変異体、多型等の遺伝子配列が挙げられる。

「ＲＩＯＫ２タンパク質をコードする遺伝子の発現を阻害する」、「ＲＩＯＫ２タンパク質の発現を阻害する」とは、ＲＩＯＫ２タンパク質をコードするｒｉｏｋ２遺伝子の転写レベル、転写後調節のレベル、ＲＩＯＫ２タンパク質への翻訳レベル、翻訳後修飾のレベル等のいずれかの段階で作用することで、発現を阻害することを意味する。

「ＲＩＯＫ２タンパク質の機能を阻害する」とは、いったん機能的に産生されたＲＩＯＫ２タンパク質が、がん幹細胞の増殖を促進又は増強するのを阻害する限りいかなる作用であってもよい。このような阻害の態様としては、例えば、ＲＩＯＫ２タンパク質に結合してがん幹細胞の増殖を阻害すること、ＲＩＯＫ２タンパク質のキナーゼ活性（自己リン酸化活性、基質タンパク質に対するリン酸化活性等）を阻害すること、ＲＩＯＫ２タンパク質と他のタンパク質との結合を阻害すること（例えば、ＲＩＯＫ２タンパク質の基質タンパク質に対する結合を阻害する又はモジュレートすること、ＲＩＯＫ２タンパク質とＲＩＯＫ２タンパク質のキナーゼ活性を促進させるタンパク質との結合若しくは複合体形成を阻害する又はモジュレートすること等）、ＲＩＯＫ２タンパク質の分解を促進すること（例えば、ＲＩＯＫ２タンパク質のユビキチン化を促進すること、ＲＩＯＫ２タンパク質を安定化するタンパク質を阻害すること等）、ＲＩＯＫ２タンパク質の核内への移行を阻害すること等が挙げられる。ここで、モジュレートとは、リン酸化活性等の機能の上方制御、下方制御に加えて、リン酸化されるアミノ酸の変化、基質タンパク質の選択性の変化等のリン酸化に係るあらゆる変化を含む。上記機能は、好ましくは、自己リン酸化活性、又はＲＩＯＫ２タンパク質の基質タンパク質に対する結合活性若しくはリン酸化活性を含む。

以下、がん幹細胞の増殖抑制物質のスクリーニング方法の詳細について説明する。
スクリーニングに使用できる細胞
上記スクリーニング方法において用いられる、ＲＩＯＫ２タンパク質を産生する能力を有する細胞としては、それらを生来発現しているヒト若しくは他の哺乳動物細胞又はそれを含む生体試料（例えば、血液、組織、臓器等）であってもよいし、大腸菌及び枯草菌等の細菌、酵母及び昆虫細胞等の非哺乳動物細胞であってもよく、特に制限はない。非ヒト動物由来の血液、組織、臓器等の場合は、それらを生体から単離して培養してもよい。好ましくは、哺乳動物細胞、昆虫細胞及び酵母等の真核細胞を挙げることができる。ＲＩＯＫ２タンパク質を産生する能力を有する細胞はがん幹細胞を含有してもよい。

ＲＩＯＫ２タンパク質又はその部分配列を含むペプチド断片を産生する能力を有する細胞としては、公知慣用の遺伝子工学的手法によって作製された各種の形質転換体が例示される。具体的には、ＲＩＯＫ２タンパク質若しくはその部分配列を含むペプチド断片をコードするＤＮＡ（即ち、配列番号１に記載の塩基配列、若しくは該塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし且つ配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同質の活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、を含むＤＮＡ）又は、上記タンパク質の活性が損なわれないように、上記塩基配列にグルタチオンＳトランスフェラーゼ、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ等をコードする塩基配列を付加した塩基配列を、適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結して宿主動物細胞に導入することによって調製することができる。

ＲＩＯＫ２タンパク質又はその部分配列を含むペプチド断片をコードするＤＮＡは、例えば、配列番号１に記載の塩基配列に基づいて、適当なオリゴヌクレオチドをプローブ又はプライマーとして合成し、上述したＲＩＯＫ２タンパク質を産生する細胞、組織由来のｃＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーから、ハイブリダイゼーション法又はＰＣＲ法を用いてクローニングすることができる。ハイブリダイゼーション法は、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）第２版（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法等に従って行なうことができる。市販のｃＤＮＡライブラリーを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、該ライブラリーに添付された使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。

クローン化されたＤＮＡは、公知のキット、例えば、Ｍｕｔａｎ（商標）−ｓｕｐｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｋｍ（宝酒造株式会社製）、Ｍｕｔａｎ（商標）−Ｋ（宝酒造株式会社製）等を用いて、ＯＤＡ−ＬＡ ＰＣＲ法、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法、Ｋｕｎｋｅｌ法等の公知の方法又はそれらに準じる方法に従って塩基配列の変換を行うことができる。

クローン化されたＤＮＡは、目的に応じてそのまま、所望によって制限酵素で消化するか、又はリンカーを付加した後に、使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧの塩基配列を有し、又３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡ又はＴＡＧの塩基配列を有していてもよい。これらの翻訳開始コドン又は翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することができる。

発現ベクターとしては、動物細胞用の発現プラスミド（例えば、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ等）；昆虫細胞用の発現プラスミド（例えば、ｐＩＥｘ／Ｂａｃ−１、ｐＢＡＣ−１、ｐＴｒｉＥｘ−１．１等）λファージ等のバクテリオファージ；レトロウイルス、ワクシニアウイルス及びアデノウイルス等の動物ウイルスベクター、並びに、バキュロウイルス等の昆虫ウイルス等が挙げられる。プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応した適切なプロモーターであればいかなるプロモーターであってもよい。上記プロモーターとしては、例えば、Ｐｏｌｈプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）ＬＴＲ、ＨＳＶ−ＴＫ（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーター等が挙げられる。なかでも、Ｐｏｌｈプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーター等が好ましい。

発現ベクターは、上記の他に、所望によってエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製起点（以下、「ＳＶ４０ ｏｒｉ」と略称する場合がある。）等を含有してもよい。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下、「ｄｈｆｒ」と略称する場合がある、メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性遺伝子。）、アンピシリン耐性遺伝子（以下、「ａｍｐ^ｒ」と略称する場合がある。）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、「ｎｅｏ^ｒ」と略称する場合がある、Ｇ４１８耐性遺伝子。）等が挙げられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用い、ｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、チミジンを含まない培地によって目的遺伝子を選択することができる。

上記発現ベクターを導入する宿主としては、例えば、ＨｅｐＧ２細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ヒトＦＬ細胞、サルＣＯＳ−７細胞、サルＶｅｒｏ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（以下、「ＣＨＯ細胞」と略記する場合がある。）、ｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞（以下、「ＣＨＯ（ｄｈｆｒ⁻）細胞」と略記する場合がある。）、マウスＬ細胞、マウスＡｔＴ−２０細胞、マウスミエローマ細胞、ラットＨ４ＩＩＥ−Ｃ３細胞及びラットＧＨ３細胞等の哺乳動物細胞が挙げられる。

形質転換の方法は、例えば、リン酸カルシウム共沈殿法、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法及びリポフェクション法等が挙げられる。例えば、細胞工学別冊８ 新細胞工学実験プロトコール，２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），５２巻，４５６（１９７３）に記載の方法を用いることができる。ウイルス感染は所定のタイターのウイルス粒子を宿主細胞に振り掛け、一定期間培養する通常の方法で感染させればよい。

上述のようにして得られる形質転換体、生来ＲＩＯＫ２タンパク質を産生する能力を有する哺乳動物細胞又は該細胞を含む組織若しくは臓器は、例えば、約５〜２０％の胎仔牛血清を含む最小必須培地（ＭＥＭ）〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２巻，５０１（１９５２）〕、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８巻，３９６（１９５９）〕、ＲＰＭＩ １６４０培地〔Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９巻，５１９（１９６７）〕、１９９培地〔Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３巻，１（１９５０）〕等の培地中で培養することができる。培地のｐＨは約６〜８であることが好ましい。培養は通常約３０〜４０℃で行ない、必要に応じて通気、撹拌を加えることができる。

がん幹細胞を含む細胞集団の場合には、例えば、以下の実施例で使用するスフェア形成用培地で培養することによって、スフェアの形成能（スフェア形成能）が発揮されるため、スフェア形成能を指標としたがん幹細胞の増殖能力を評価する場合には、有利である。具体的には、ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地に、メチルセルロース、Ｂ２７（登録商標）サプリメント、ＥＧＦ（上皮成長因子）、ｂａｓｉｃ ＦＧＦ（繊維芽細胞増殖因子）及びインスリンを加えた培地、メチルセルロースに換えてソフトアガーを加えた培地、並びに、ＮｅｕｒｏＣｕｌｔ培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ社製）にＮｅｕｒｏＣｕｌｔ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ社製）及びＥＧＦを加えた培地等が挙げられる。

スクリーニングに使用できるＲＩＯＫ２タンパク質又はその部分配列を含むペプチド断片
ＲＩＯＫ２タンパク質又はその部分配列を含むペプチド断片は、上記形質転換体（大腸菌及び枯草菌等の細菌、酵母並びに昆虫細胞等にｒｉｏｋ２遺伝子を導入して得られる非哺乳動物細胞でもよい）又は、生来ＲＩＯＫ２タンパク質を産生する能力を有する哺乳動物細胞を培養して得られる培養物から、公知の方法に従って分離精製することができる。

ＲＩＯＫ２タンパク質の部分配列を含むペプチド断片は、例えば、基質タンパク質に対する結合活性を有するペプチド断片、リン酸化活性を有するペプチド断片等が挙げられる。上記ペプチド断片は、配列番号２に記載のアミノ酸配列における第９７〜２６６番目に対応するアミノ酸配列を含み基質タンパク質に対する結合活性を有するペプチド断片、又は、配列番号２に記載のアミノ酸配列における第９７〜２６６番目に対応するアミノ酸配列を含みリン酸化活性を有するペプチド断片であることが好ましい。

例えば、ＲＩＯＫ２タンパク質又はその部分配列を含むペプチド断片を培養菌体又は細胞の細胞質から抽出する場合、培養物から公知の方法で集めた菌体又は細胞を適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチーム及び／又は凍結融解等によって菌体又は細胞を破壊した後、遠心分離又はろ過によって可溶性タンパク質の粗抽出液を得る方法等が適宜用いられる。一方、膜画分からＲＩＯＫ２タンパク質又はその部分配列を含むペプチド断片を抽出する場合は、上述の方法と同様に菌体又は細胞を破壊した後、低速遠心で細胞デブリスを沈澱除去し、上清を高速遠心して細胞膜を含有する画分を沈澱させる（必要に応じて密度勾配遠心法等によって細胞膜の画分を精製する）等の方法が用いられる。ＲＩＯＫ２タンパク質又はその部分配列を含むペプチド断片が菌体外又は細胞外に分泌される場合には、培養物から遠心分離又はろ過等によって培養上清を分取する等の方法が用いられる。

このようにして得られた可溶性画分、膜画分又は培養上清の中に含まれるＲＩＯＫ２タンパク質又はその部分配列を含むペプチド断片の単離精製は、公知の方法に従って行うことができる。このような方法としては、例えば、塩析法及び溶媒沈澱法等の溶解度を利用する方法；透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法及びＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法等の主として分子量の差を利用する方法；イオン交換クロマトグラフィー法等の荷電の差を利用する方法；アフィニティークロマトグラフィー等の特異的親和性を利用する方法；逆相高速液体クロマトグラフィー等の疎水性の差を利用する方法；等電点電気泳動法等の等電点の差を利用する方法等が挙げられる。これらの方法は、適宜組み合わせることもできる。

このようにして得られるＲＩＯＫ２タンパク質又はその部分配列を含むペプチド断片が遊離体である場合には、公知の方法又はそれに準じる方法によって、該遊離体を塩に変換することができ、ＲＩＯＫ２タンパク質又はその部分配列を含むペプチド断片が塩として得られた場合には、公知の方法又はそれに準じる方法によって、該塩を遊離体又は他の塩に変換することができる。形質転換体が産生するＲＩＯＫ２タンパク質又はその部分配列を含むペプチド断片を、精製前又は精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることによって、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。該タンパク質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼ等が挙げられる。

さらに、ＲＩＯＫ２タンパク質又はその部分配列を含むペプチドは、それをコードするＲＮＡを鋳型として、ウサギ網状赤血球ライセート、コムギ胚芽ライセート、大腸菌ライセート等からなる無細胞タンパク質翻訳系を用いてインビトロ合成することができる。さらにＲＮＡポリメラーゼを含む無細胞転写／翻訳系を用いて、ＲＩＯＫ２タンパク質又はその部分配列を含むペプチドをコードするＤＮＡを鋳型としても合成することができる。

Ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるスクリーニング法
Ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、がん幹細胞の増殖抑制物質をスクリーニングする場合、該スクリーニング方法は、ＲＩＯＫ２タンパク質又はその部分配列を含むペプチド断片を、被検物質の存在下又は非存在下でインキュベートし、両条件下におけるＲＩＯＫ２タンパク質の機能を比較することを含む。以下、具体的なスクリーニング方法について説明する。

スクリーニング法（Ｉ）
好ましい一実施態様においては、ＲＩＯＫ２タンパク質の機能として自己リン酸化の活性を指標にしてスクリーニングすることができる。具体的には、当該スクリーニング方法は、
（Ｉ−ａ）ＲＩＯＫ２タンパク質又はその部分配列を含むペプチド断片と、被検物質とを接触させる工程、
（Ｉ−ｂ）上記ＲＩＯＫ２タンパク質又はその部分配列を含むペプチド断片の自己リン酸化活性を測定する工程、及び
（Ｉ−ｃ）上記被検物質の非存在下において測定した対照と比較して、上記ＲＩＯＫ２タンパク質又はその部分配列を含むペプチド断片の自己リン酸化活性を低下又はモジュレートさせる物質を選択する工程、を含む。

被検物質としては、例えば各種核酸、タンパク質、ペプチド、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液等が挙げられ、これらの物質は新規なものであってもよいし、公知のものであってもよい。

被検物質との接触は、例えば、各種緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ緩衝液、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水、トリス塩酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酢酸緩衝液等）の中に被検物質を添加して、ＲＩＯＫ２タンパク質又はその部分配列を含むペプチド断片を一定時間インキュベートすることによって実施することができる。添加される被検物質の濃度は化合物の種類（溶解度、毒性等）によって異なるが、例えば、約０．１ｎＭ〜約１００ｎＭの範囲で適宜選択される。インキュベート時間としては、例えば、約１０分〜約２４時間が挙げられる。添加されるＲＩＯＫ２タンパク質又はその部分配列を含むペプチド断片の濃度は、例えば、約０．１〜約１００μｇ／ｍｌの範囲で適宜選択される。

自己リン酸化は、公知の方法でＲＩＯＫ２タンパク質等に付加されたリン酸基の量を測定することによって行うことができる。ＲＩＯＫ２タンパク質等に付加されたリン酸基の量は、被験試料中の反応物量を例えば、Ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ Ｔｈｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ抗体及び、ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅを用いたＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロッティング等の各種免疫学的手法、質量分析法等を用いて測定することによって算出することができる。具体的には、例えば、抗リン酸化ＲＩＯＫ２タンパク質抗体を用いたＥＬＩＳＡ法が挙げられる。

例えば、上記スクリーニング方法において、被検物質の存在下における自己リン酸化活性が、被検物質の非存在下における対照の活性に比べて、約１０％以上、好ましくは約２０％以上、より好ましくは３０％以上、さらに好ましくは約５０％以上低下された場合に、該被検物質を、ＲＩＯＫ２タンパク質の機能阻害物質、従って、がん幹細胞の増殖抑制作用を有する物質（増殖抑制物質）の候補として選択することができる。

スクリーニング法（ＩＩ）
別の好ましい一実施形態においては、ＲＩＯＫ２タンパク質の機能としてＲＩＯＫ２タンパク質の基質タンパク質に対する結合活性又はリン酸化活性を指標にしてスクリーニングすることができる。具体的には、当該スクリーニング方法は、
（ＩＩ−ａ）ＲＩＯＫ２タンパク質又はその部分配列を含むペプチド断片及び前記基質タンパク質と、被検物質とを接触させる工程、
（ＩＩ−ｂ）上記ＲＩＯＫ２タンパク質又はその部分配列を含むペプチドの上記基質タンパク質に対する結合活性又はリン酸化活性を測定する工程、及び
（ＩＩ−ｃ）上記被検物質の非存在下において測定した対照と比較して、上記結合活性又は上記リン酸化活性を低下させる物質を選択する工程、を含む。

結合活性の指標としては、リン酸化活性の亢進で測定するか、下記に示すごとく、結合量を測定することが例示できる（前者については、上記スクリーニング法（Ｉ）に準じて行うことができる）。ＲＩＯＫ２タンパク質の部分配列を含むペプチド断片は、キナーゼ活性を有していてもよく、また、キナーゼ活性を有していなくても基質タンパク質と結合可能な部分配列を含むペプチド断片であれば、使用することができる。

より具体的には、上記スクリーニング方法は、
（ＩＩ−１）標識したＲＩＯＫ２タンパク質又はその部分配列を含むペプチド断片と、基質タンパク質とを、被検物質の存在下及び非存在下で接触させた場合における、標識したＲＩＯＫ２タンパク質の基質タンパク質に対する結合量を測定し、比較する、又は、
（ＩＩ−２）標識したＲＩＯＫ２タンパク質又はその部分配列を含むペプチド断片と、基質タンパク質を産生する細胞またはその膜画分とを、被検物質の存在下及び非存在下で接触させた場合における、標識したＲＩＯＫ２タンパク質の該細胞または膜画分に対する結合量を測定し、比較することが挙げられる。

ＲＩＯＫ２タンパク質又はその部分配列を含むペプチド断片は、常法に従って、例えば放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質等で標識することができる。放射性同位元素としては、例えば、〔^１２５Ｉ〕、〔^１３１Ｉ〕、〔^３Ｈ〕、〔^１４Ｃ〕等が挙げられる。酵素としては、安定で比活性の大きな酵素が好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等が挙げられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネート等が挙げられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニン等が挙げられる。基質タンパク質として、例えば、ミエリン結合タンパク質を挙げることができる。

例えば、上記（ＩＩ−１）及び（ＩＩ−２）のスクリーニング法において、被検物質の存在下における基質タンパク質に結合する標識量（ＲＩＯＫ２タンパク質の量）が、被検物質の非存在下における対照に比べて、約１０％以上、好ましくは約２０％以上、より好ましくは約３０％以上、さらに好ましくは約５０％以上低下された場合、該被検物質をＲＩＯＫ２タンパク質と基質タンパク質との結合活性を低下する物質、従って、がん幹細胞の増殖抑制作用を有する物質の候補として選択することができる。

ＲＩＯＫ２タンパク質又はその部分配列を含むペプチドの、基質タンパク質に対する結合活性を測定する、その他の方法としては、表面プラズモン共鳴法、水晶発振子マイクロバランス等の生体分子間相互作用を測定する方法が挙げられる。これらの方法は、相互作用を検出したい物質（生体分子等）を標識物質で標識を行う必要がない点で優れている。

表面プラズモン共鳴は、一方の結合パートナー（通常レセプター）が「チップ」（センサ表面）に固定され、他方の結合パートナー（通常リガンド）（これは可溶であり、チップ上を流される）の結合が検出される界面光学アッセイである。例えば、ＲＩＯＫ２タンパク質又はその部分配列を含むペプチドをチップに固定し、被験物質の存在下又は非存在下において、基質タンパク質を上記チップ上に流すことで、上記結合活性を測定することができる。生体分子相互作用の表面プラズモン共鳴の検出及びデータ分析を可能にするシステムは市販されている。例えば、Ｉａｓｙｓ（商標）装置（Ｆｉｓｏｎｓ）及びＢｉａｃｏｒｅ（商標）装置が挙げられる。

水晶発振子とは、水晶の結晶を極薄い板状に切り出した切片の両側に金属薄膜を取り付けた構造をしたもので、それぞれの金属薄膜に交流電場を印加するとある一定の周波数（共鳴周波数）で振動する性質を示す。金属薄膜上にナノグラム程度の物質が吸着すると物質の質量に比例して共鳴周波数が減少するため微量天秤として利用することができ、このような方法論はＱＣＭ（Ｑｕａｒｔｚ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂａｌａｎｃｅ：水晶発振子マイクロバランス）と呼ばれる。例えば、まず、ＱＣＭセンサーチップ表面にＲＩＯＫ２タンパク質又はその部分配列を含むペプチドを固定化する。ＰＢＳ等の緩衝液が入った反応槽に上記ＱＣＭセンサーチップを浸漬し、被験物質の存在下又は非存在下において、当該反応槽に基質タンパク質を添加することで、上記結合活性をリアルタイムで共鳴周波数の減少として評価することができる。

細胞を用いたスクリーニング方法
細胞を用いて、がん幹細胞の増殖抑制物質をスクリーニングする場合、該スクリーニング方法は、ＲＩＯＫ２タンパク質をコードする遺伝子等を発現する細胞を、被検物質の存在下又は非存在下で培養し、両条件下における、がん幹細胞の含有率若しくはスフェアの形成量、ＲＩＯＫ２タンパク質をコードする遺伝子の発現の量、ＲＩＯＫ２タンパク質の発現の量又はＲＩＯＫ２タンパク質の機能を比較することを含む。以下、具体的なスクリーニング方法について説明する。

スクリーニング法（ＩＩＩ）
好ましい一実施形態においては、がん幹細胞の含有率又はスフェアの形成量を指標にしてスクリーニングすることができる。具体的には、当該スクリーニング方法は、
（ＩＩＩ−ａ）ＲＩＯＫ２タンパク質をコードする遺伝子を発現するがん幹細胞を含む細胞集団に、被検物質を接触させる工程、
（ＩＩＩ−ｂ）上記細胞集団を培養することによる上記がん幹細胞の含有率又はスフェアの形成量を測定する工程、及び
（ＩＩＩ−ｃ）上記被検物質の非存在下において測定した対照と比較して、上記含有率又は上記形成量を低下させる物質を選択する工程、を含む。

被検物質としては、例えば各種核酸、タンパク質、ペプチド、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液等が挙げられ、これらの物質は新規なものであってもよいし、公知のものであってもよい。

がん幹細胞を含む細胞集団としては、例えば、腎臓がん由来ＡＣＨＮ細胞、グリオーマ由来Ｕ２５１細胞、大腸がん由来ＨＣＴ１１６細胞、膵臓がん由来ＭＩＡＰａＣａ−２細胞、肺がん由来Ａ５４９細胞、膵臓がん由来ＢｘＰＣ３細胞、子宮頸がん由来ＨＥＣ１Ａ細胞及び頭頸部がん由来Ｆａｄｕ細胞等を含む細胞集団が挙げられる。

スフェアの形成量の測定方法としては、スフェア数の測定、アラマーブルー細胞増殖アッセイ、細胞内ＡＴＰ測定アッセイ等が好ましく用いられる。

がん幹細胞の含有率の測定方法としては、がん細胞全体に占めるがん幹細胞性を有するがん細胞の存在比率を測定する方法であれば、特に制限はない。具体的には、公知のがん幹細胞マーカー（例えば、ＣＤ１３３、ＣＤ４４等）を高発現するがん細胞の存在比率の測定、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）活性の高いがん細胞の存在比率の測定、薬剤排出能の高いがん細胞（例えば、サイドポピュレーション細胞）の存在比率の測定、造腫瘍性の高いがん細胞の存在比率の測定等が挙げられる。

被検物質と上記細胞集団との接触は、例えば、上述の培地又は各種緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ緩衝液、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水、トリス塩酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酢酸緩衝液等）の中に被検物質を添加して、細胞を一定時間インキュベートすることによって実施することができる。添加される被検物質の濃度は化合物の種類（溶解度、毒性等）によって異なるが、例えば、約０．１ｎＭ〜約１００ｎＭの範囲で適宜選択される。インキュベート時間としては、例えば、約１０分〜約２４時間が挙げられる。

例えば、上記スクリーニング方法において、被検物質の存在下におけるがん幹細胞の含有率又はスフェアの形成量が、被検物質の非存在下における対照に比べて、約２５％以上、好ましくは約５０％以上、より好ましくは約７５％以上、さらに好ましくは約９０％以上低下された場合に、該被検物質を、がん幹細胞の増殖抑制作用を有する物質の候補として選択することができる。

ＲＩＯＫ２タンパク質をコードする遺伝子を発現するがん幹細胞を含む細胞集団は、非ヒト哺乳動物個体の形態であってもよい。該動物個体の状態は特に制限されないが、例えば、ｐ５３変異マウスなどのがん自然発症モデルマウスであってもよい。使用される動物の飼育条件に特に制限はないが、ＳＰＦグレード以上の環境下で飼育されたものであることが好ましい。被検物質の該細胞との接触は、該動物個体への被検物質の投与によって行われる。投与経路は特に制限されないが、例えば、静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、皮内投与、腹腔内投与、経口投与、気道内投与、直腸投与、鼻腔内投与、脳室内投与等が挙げられる。投与量も特に制限はないが、例えば、１回量として約０．５〜２０ｍｇ／ｋｇを、１日１〜５回、１日〜６ヶ月程度投与することができる。

上記スクリーニング方法において、対照（コントロール）として、常法を用いて作製される、ｒｉｏｋ２遺伝子がノックアウト若しくはノックダウンされた細胞又は動物を用いて、被験細胞または動物とコントロールとにおける、被検物質存在下でのＲＩＯＫ２タンパク質の活性を測定、比較することによってもがん幹細胞増殖抑制物質を選択することができる。

スクリーニング法（ＩＶ）
別の好ましい一実施形態においては、ＲＩＯＫ２タンパク質をコードする遺伝子の発現又はＲＩＯＫ２タンパク質の発現を指標にしてスクリーニングすることができる。具体的には、
方法ＩＶ−１
（ＩＶ−１ａ）ＲＩＯＫ２タンパク質をコードする遺伝子又は上記ＲＩＯＫ２タンパク質をコードする遺伝子の転写調節領域の制御下にあるレポーター遺伝子を発現する細胞に、被検物質を接触させる工程、
（ＩＶ−１ｂ）上記細胞における上記ＲＩＯＫ２タンパク質をコードする遺伝子又は上記レポーター遺伝子の発現量を測定する工程、及び
（ＩＶ−１ｃ）上記被検物質の非存在下において測定した対照と比較して、上記発現量を低下させる物質を選択する工程、
を含むスクリーニング方法、
方法ＩＶ−２
（ＩＶ−２ａ）ＲＩＯＫ２タンパク質をコードする遺伝子を発現する細胞に、被検物質を接触させる工程
（ＩＶ−２ｂ）上記細胞における上記ＲＩＯＫ２タンパク質の産生量を測定する工程、及び
（ＩＶ−２ｃ）上記被検物質の非存在下において測定した対照と比較して、上記産生量を低下させる物質を選択する工程、
を含むスクリーニング方法、
が例示できる。

ＲＩＯＫ２タンパク質をコードする遺伝子又はＲＩＯＫ２タンパク質の発現量は、上述したＲＩＯＫ２タンパク質をコードするＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸、即ち、配列番号１に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸（以下、「検出用核酸」という場合がある。）を用いて、ｒｉｏｋ２遺伝子のｍＲＮＡを検出することによって、ＲＮＡレベルで測定することができる。該発現量は、上述したＲＩＯＫ２タンパク質に対する抗体（以下、「検出用抗体」という場合がある。）を用いて、これらのタンパク質を検出することによって、タンパク質レベルで測定することもできる。

従って、より具体的には、
（ＩＶ−ａ）ＲＩＯＫ２タンパク質を産生する能力を有する細胞を被検物質の存在下及び非存在下において培養し、両条件下における該タンパク質をコードするｍＲＮＡの量を、上記検出用核酸を用いて測定、比較する工程を含む、がん幹細胞の増殖抑制物質のスクリーニング方法、並びに、
（ＩＶ−ｂ）ＲＩＯＫ２タンパク質を産生する能力を有する細胞を被検物質の存在下及び非存在下に培養し、両条件下における該タンパク質の量を、上記検出用抗体を用いて測定、比較する工程を含む、がん幹細胞の増殖抑制物質のスクリーニング方法が例示される。

例えば、ＲＩＯＫ２タンパク質のｍＲＮＡの量又はＲＩＯＫ２タンパク質の量の測定は、具体的には以下のようにして行うことができる。

（ＩＶ−ｉ）正常モデル非ヒト哺乳動物又は疾患モデル非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル等）に対して薬剤等の被験物質を与え、一定時間経過した後に、血液、特定の臓器（例えば、脳等）、又は臓器から単離した組織若しくは細胞を得る。
得られた細胞に含まれるＲＩＯＫ２タンパク質のｍＲＮＡは、例えば、通常の方法によって細胞等からｍＲＮＡを抽出し、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ等の手法を用いることによって定量することができる。あるいは、ＲＩＯＫ２タンパク質のｍＲＮＡは、公知のノーザンブロット解析によって定量することもできる。一方、ＲＩＯＫ２タンパク質の量は、ウェスタンブロット解析又は以下に詳述する各種イムノアッセイ法を用いて定量することができる。

（ＩＶ−ｉｉ）ｒｉｏｋ２遺伝子を導入した形質転換体を上述の方法に従って作製し、該形質転換体に含まれるＲＩＯＫ２タンパク質又はそれをコードするｍＲＮＡを、上記（ＩＶ−ｉ）と同様にして定量、解析することができる。

ＲＩＯＫ２タンパク質の発現量を変化させる物質のスクリーニング方法は、
（ｉ）正常モデル非ヒト哺乳動物又は疾患モデル非ヒト哺乳動物に対して、薬剤を与える一定時間前（３０分前〜２４時間前、好ましくは３０分前〜１２時間前、より好ましくは１時間前〜６時間前）若しくは一定時間後（３０分後〜３日後、好ましくは１時間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜２４時間後）、又は、薬剤と同時に被検物質を投与し、投与から一定時間が経過した後（３０分後〜３日後、好ましくは１時間後〜２日後、より好ましくは１時間後〜２４時間後）、該動物から単離した細胞に含まれるＲＩＯＫ２タンパク質をコードするｍＲＮＡの量、又はＲＩＯＫ２タンパク質の量を定量、解析することによって行う、あるいは
（ｉｉ）形質転換体を常法に従って、培養する際に被検物質を培地若しくは緩衝液中に添加し、一定時間インキュベート後（１日後〜７日後、好ましくは１日後〜３日後、より好ましくは２日後〜３日後）、該形質転換体に含まれるＲＩＯＫ２タンパク質をコードするｍＲＮＡの量、又はＲＩＯＫ２タンパク質の量を定量、解析することによって行うことができる。

上記（ＩＶ−ｂ）のスクリーニング方法におけるＲＩＯＫ２タンパク質の量の測定は、具体的には、例えば、
（ＩＶ−ｂｉ）上記検出用抗体と、試料液及び標識化されたＲＩＯＫ２タンパク質とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化されたタンパク質を検出することによって試料液中のＲＩＯＫ２タンパク質を定量する方法や、
（ＩＶ−ｂｉｉ）試料液と、担体上に不溶化した上記検出用抗体及び標識化された別の上記検出用抗体とを、同時又は連続的に反応させた後、不溶化担体上の標識剤の量（活性）を測定することによって、試料液中のＲＩＯＫ２タンパク質を定量する方法等が挙げられる。

上記（ＩＶ−ｂｉｉ）の定量法においては、２種の検出用抗体は、それぞれＲＩＯＫ２タンパク質の異なる部分を認識する抗体であることが好ましい。例えば、一方の検出用抗体がＲＩＯＫ２タンパク質のＮ末端部分を認識する抗体であれば、他方の検出用抗体として該タンパク質のＣ末端部分を認識する抗体であることが好ましい。

標識物質を利用する測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質等が挙げられる。上記放射性同位元素としては、例えば、〔^１２５Ｉ〕、〔^１３１Ｉ〕、〔^３Ｈ〕、〔^１４Ｃ〕等が挙げられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きな酵素が好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等が挙げられる。上記蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネート等が挙げられる。上記発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニン等が挙げられる。さらに、抗体又は抗原と上記標識剤との結合にビオチン−（ストレプト）アビジン系を用いることもできる。

上記検出用抗体を用いるＲＩＯＫ２タンパク質の定量法は、特に制限されず、試料液中の抗原の量に対応した、抗体、抗原若しくは抗体−抗原複合体の量を化学的又は物理的手段によって検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線よって算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法、サンドイッチ法等が好適に用いられる。感度、特異性の点で、例えば、後述するサンドイッチ法を用いるのが好ましい。

抗原又は抗体の不溶化にあたっては、物理吸着を用いてもよく、又通常タンパク質若しくは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いてもよい。不溶化するための担体（不溶化担体）としては、例えば、アガロース、デキストラン及びセルロース等の不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド及びシリコン等の合成樹脂、並びに、ガラスが挙げられる。

サンドイッチ法においては、まず不溶化した検出用抗体に試料液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した別の検出用抗体を反応させる（２次反応）。その後、不溶化担体上の標識剤の量若しくは活性を測定することによって、試料液中のＲＩＯＫ２タンパク質を定量することができる。１次反応と２次反応とは逆の順序で行っても、また、同時に行ってもよいし、時間をずらして行ってもよい。標識化剤及び不溶化の方法は上述のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相化抗体又は標識化抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。

上記検出用抗体は、サンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法、ネフロメトリー等にも用いることができる。

競合法では、試料液中のＲＩＯＫ２タンパク質（抗原）と標識したＲＩＯＫ２タンパク質（標識抗原）とを抗体に対して競合的に反応させた後、未反応の標識抗原（Ｆ）と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ、Ｆいずれかの標識量を測定することによって、試料液中のＲＩＯＫ２タンパク質を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、ポリエチレングリコール、又は前記抗体（１次抗体）に特異的に結合する２次抗体等を用いてＢ／Ｆ分離を行う液相法、１次抗体として固相化抗体を用いるか（直接法）、又は１次抗体は可溶性のものを用い、２次抗体として固相化抗体を用いる（間接法）固相化法が用いられる。

イムノメトリック法では、試料液中のＲＩＯＫ２タンパク質と固相化したＲＩＯＫ２タンパク質とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後、固相と液相を分離するか、又は試料液中のＲＩＯＫ２タンパク質と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化したＲＩＯＫ２タンパク質を加えて未反応の標識化抗体を固相に結合させた後、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識化抗体の量を測定し試料液中の抗原の量（ＲＩＯＫ２タンパク質の量）を定量する。

また、ネフロメトリーでは、ゲル内又は溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。試料液中のＲＩＯＫ２タンパク質の量がわずかであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリー等が好適に用いられる。

これら個々の免疫学的測定法を本実施形態の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えてＲＩＯＫ２タンパク質の測定方法を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書等を参照することができる。

例えば、入江寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ」Ｖｏｌ．７０（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ （Ｐａｒｔ Ａ））、同書Ｖｏｌ．７３（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ｂ））、同書Ｖｏｌ．７４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ｃ））、同書Ｖｏｌ．８４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ｄ：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ））、同書Ｖｏｌ．９２（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ｅ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ））、同書Ｖｏｌ．１２１（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ｉ：Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ））（以上、アカデミックプレス社発行）等を参照することができる。

以上のようにして、検出用抗体を用いることによって、細胞におけるＲＩＯＫ２タンパク質の量を感度よく定量することができる。

上記方法ＩＶ−１及び方法ＩＶ−２のスクリーニング法において、例えば、被検物質の存在下におけるＲＩＯＫ２タンパク質をコードする遺伝子又はＲＩＯＫ２タンパク質の発現量（ｍＲＮＡの量又はタンパク質の量）が、被検物質の非存在下における対照に比べて、約１０％以上、好ましくは約２０％以上、より好ましくは約３０％以上、さらに好ましくは約５０％以上低下された場合、該被検物質を、ＲＩＯＫ２タンパク質の発現抑制物質、従って、がん幹細胞の増殖抑制作用を有する物質の候補として選択することができる。

上記スクリーニング法において、ｒｉｏｋ２遺伝子（ＲＩＯＫ２タンパク質をコードする遺伝子）を発現する細胞に代えて、ｒｉｏｋ２遺伝子の内在の転写調節領域の制御下にあるレポーター遺伝子を含む細胞を用いることができる。このような細胞は、ｒｉｏｋ２遺伝子の転写調節領域の制御下にあるレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ等）を導入したトランスジェニック動物の細胞、組織、臓器又は個体であってもよい。上記細胞を用いる場合には、ＲＩＯＫ２タンパク質をコードする遺伝子又はＲＩＯＫ２タンパク質の発現量は、レポーター遺伝子の発現レベルを、常法を用いて測定することによって評価することができる。

上記スクリーニング方法において、コントロールとして、常法を用いて作製される、ｒｉｏｋ２遺伝子がノックアウト若しくはノックダウンされた細胞又は動物を用い、被験細胞又は動物とコントロールとにおける、被検物質存在下でのＲＩＯＫ２タンパク質をコードする遺伝子又ＲＩＯＫ２タンパク質の発現量を測定、比較することによってもがん幹細胞の増殖抑制物質を選択することができる。

スクリーニング法（Ｖ）
別の好ましい一実施形態においては、細胞内におけるＲＩＯＫ２タンパク質の機能として、自己リン酸化活性、又はＲＩＯＫ２タンパク質の基質タンパク質に対する結合活性若しくはリン酸化活性を指標にしてスクリーニングすることができる。具体的には、当該スクリーニング方法は、
（Ｖ−ａ）ＲＩＯＫ２タンパク質をコードする遺伝子を発現する細胞に、被検物質を接触させる工程、
（Ｖ−ｂ）上記細胞に含まれる上記ＲＩＯＫ２タンパク質の自己リン酸化活性、又は上記基質タンパク質に対する結合活性若しくはリン酸化活性を測定する工程、及び
（Ｖ−ｃ）上記被検物質の非存在下において測定した対照と比較して、上記自己リン酸化活性又は上記基質タンパク質に対する結合活性若しくはリン酸化活性を低下させる物質を選択する工程、を含む。

上記自己リン酸化活性及び上記基質タンパク質に対するリン酸化活性の測定は、上述のスクリーニング法（Ｉ）に準じて行うことができる。上記基質タンパク質に対する結合活性の測定は、上述のスクリーニング法（ＩＩ）に準じて行うことができる。

例えば、上記スクリーニング方法（Ｖ）において、被検物質の存在下における自己リン酸化活性（例えば、被験試料中の自己リン酸化により生成された３，３’，５，５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ反応物）、又はＲＩＯＫ２タンパク質の基質タンパク質に対する結合活性若しくはリン酸化活性が、被検物質の非存在下における対照の活性に比べて、約１０％以上、好ましくは約２０％以上、より好ましくは３０％以上、さらに好ましくは約５０％以上低下された場合に、該被検物質を、ＲＩＯＫ２タンパク質の機能阻害物質、従って、がん幹細胞の増殖抑制作用を有する物質の候補として選択することができる。

上述のスクリーニング法（Ｉ）〜（Ｖ）を用いて選択される、ＲＩＯＫ２タンパク質をコードする遺伝子若しくはＲＩＯＫ２タンパク質の発現又は機能を阻害する物質は、がん幹細胞が関与する各種がん疾患の予防剤及び／又は治療剤として有用である。すなわち、上記がん幹細胞の増殖抑制物質が抗がん剤となりうる。以下、上述のスクリーニング方法を用いて選択されうるがん幹細胞の増殖抑制物質の一例について説明するが、上記がん幹細胞の増殖抑制物質は、これらの例示になんら限定されるものではない。

がん幹細胞の増殖抑制物質のスクリーニング方法によって選択される物質
「ＲＩＯＫ２タンパク質をコードする遺伝子の発現を阻害する物質」、「ＲＩＯＫ２タンパク質の発現を阻害する物質」とは、ＲＩＯＫ２タンパク質をコードするｒｉｏｋ２遺伝子の転写レベル、転写後調節のレベル、ＲＩＯＫ２タンパク質への翻訳レベル、翻訳後修飾のレベル等のいかなる段階で作用する物質であってもよい。したがって、ＲＩＯＫ２タンパク質をコードする遺伝子又はＲＩＯＫ２タンパク質の発現を阻害する物質としては、例えば、ｒｉｏｋ２遺伝子の転写を阻害する物質（例えば、アンチジーン）、初期転写産物からｍＲＮＡへのプロセッシングを阻害する物質、ｍＲＮＡの細胞質への輸送を阻害する物質、ｍＲＮＡからＲＩＯＫ２タンパク質への翻訳を阻害するか（例えば、アンチセンス核酸、ｍｉＲＮＡ）又はｍＲＮＡを分解する物質（例えば、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、ｍｉＲＮＡ等）、初期翻訳産物の翻訳後修飾を阻害する物質等が含まれる。いずれの段階で作用する物質であっても好ましく用いることができるが、ｒｉｏｋ２遺伝子のｍＲＮＡに相補的に結合してＲＩＯＫ２タンパク質への翻訳を阻害するか又はｍＲＮＡを分解する物質が好ましい。

ｒｉｏｋ２遺伝子のｍＲＮＡからＲＩＯＫ２タンパク質への翻訳を特異的に阻害する（又はｍＲＮＡを分解する）物質として、好ましくは、これらのｍＲＮＡの塩基配列と相補的若しくは実質的に相補的な塩基配列又はその一部を含む核酸が挙げられる。

「ｒｉｏｋ２遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列と実質的に相補的な塩基配列」とは、哺乳動物の生理的条件下において、該ｍＲＮＡの標的配列に結合してその翻訳を阻害し得る（又は該標的配列を切断する）程度の相補性を有する塩基配列を意味し、具体的には、例えば、該ｍＲＮＡの塩基配列と完全相補的な塩基配列（すなわち、ｍＲＮＡの相補鎖の塩基配列）と、オーバーラップする領域に関して、約８０％以上、好ましくは約８５％以上、より好ましくは約９０％以上、更により好ましくは約９５％以上、特に好ましくは約９７％以上の相同性を有する塩基配列である。

「塩基配列の相同性」は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝−３）にて計算することができる。

より具体的には、ｒｉｏｋ２遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列と相補的若しくは実質的に相補的な塩基配列としては、（ａ）配列番号１に記載の塩基配列と相補的若しくは実質的に相補的な塩基配列、又は（ｂ）「配列番号１に記載の塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードする配列」と、相補的若しくは実質的に相補的な塩基配列が挙げられる。ここで「実質的に同質の活性」とは上記と同義である。

ストリンジェントな条件とは、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，６．３．１−６．３．６，１９９９に記載される条件、例えば、６×ＳＳＣ（ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ／ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）／４５℃でのハイブリダイゼーション、次いで０．２×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ／５０〜６５℃での一回以上の洗浄等が挙げられるが、当業者であれば、これと同等のストリンジェンシーを与えるハイブリダイゼーションの条件を適宜選択することができる。

ｒｉｏｋ２遺伝子のｍＲＮＡの好ましい例としては、配列番号１に記載の塩基配列を含むヒトＲＩＯＫ２（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１５９７４９．１）、又は他の哺乳動物におけるそれらのオルソログ（例えば、マウス（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｎｏ．ＮＭ＿０２５９３４．２）、チンパンジー（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｎｏ．ＸＭ＿５１７８４３．３）、イヌ（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ｎｏ．ＸＭ＿５３６２９１．４等）、さらにはそれらのスプライスバリアント、アレル変異体、多型等のｍＲＮＡが挙げられる。

「ｒｉｏｋ２遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列と相補的若しくは実質的に相補的な塩基配列の一部」とは、ｒｉｏｋ２遺伝子のｍＲＮＡに特異的に結合することができ、且つ該ｍＲＮＡからのタンパク質の翻訳を阻害（又は該ｍＲＮＡを分解）し得るものであれば、その長さ、位置に特に制限はないが、配列特異性の面から、標的配列に相補的若しくは実質的に相補的な部分を少なくとも１０塩基以上、好ましくは約１５塩基以上、より好ましくは約２０塩基以上含むものである。

具体的には、ｒｉｏｋ２遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列と相補的若しくは実質的に相補的な塩基配列又はその一部を含む核酸として、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの核酸が好ましく例示される。
（ａ）ｒｉｏｋ２遺伝子のｍＲＮＡに対するアンチセンス核酸
（ｂ）ｒｉｏｋ２遺伝子のｍＲＮＡに対するリボザイム核酸
（ｃ）ｒｉｏｋ２遺伝子のｍＲＮＡに対してＲＮＡｉ活性を有する核酸又はその前駆体

（ａ）ｒｉｏｋ２遺伝子のｍＲＮＡに対するアンチセンス核酸
「ｒｉｏｋ２遺伝子のｍＲＮＡに対するアンチセンス核酸」とは、該ｍＲＮＡの塩基配列と相補的若しくは実質的に相補的な塩基配列又はその一部を含む核酸であって、標的ｍＲＮＡと特異的かつ安定した二重鎖を形成して結合することによって、タンパク質の合成を抑制する機能を有するものである。

アンチセンス核酸は、２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有しているポリデオキシリボヌクレオチド、Ｄ−リボースを含有しているポリリボヌクレオチド、プリン又はピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例えば、市販のタンパク質核酸及び合成配列特異的な核酸ポリマー）又は特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーはＤＮＡ又はＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリング又は塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）等が挙げられる。それらは、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであってもよく、更に非修飾ポリヌクレオチド（又は非修飾オリゴヌクレオチド）、公知の修飾化合物が付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾がされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメート等）を持つもの、電荷を有する結合又は硫黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）を持つもの、例えばタンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼインヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジン等）又は糖（例えば、モノサッカライド等）等の側鎖基を有しているもの、インターカレント化合物（例えば、アクリジン、ソラレン等）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属等）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸等）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」及び「核酸」とは、プリン及びピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基を含んでいてもよい。このような修飾物は、メチル化されたプリン及びピリミジン、アシル化されたプリン及びピリミジン、並びに、その他の複素環を含むものであってもよい。修飾されたヌクレオシド及び修飾されたヌクレオチドは糖部分が修飾されていてもよく、例えば、１個以上の水酸基がハロゲン、脂肪族基等で置換されていたり、又はエーテル、アミン等の官能基に変換されていてもよい。

上述の通り、アンチセンス核酸はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよい。アンチセンス核酸がＤＮＡである場合、標的ＲＮＡとアンチセンスＤＮＡとによって形成されるＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドは、内在性ＲＮａｓｅ Ｈに認識されて標的ＲＮＡの選択的な分解を引き起こすことができる。したがって、ＲＮａｓｅ Ｈによる分解を指向するアンチセンスＤＮＡの場合、標的配列は、ｍＲＮＡ中の配列だけでなく、ｒｉｏｋ２遺伝子の初期翻訳産物におけるイントロン領域の配列であってもよい。イントロン配列は、ゲノム配列と、ｒｉｏｋ２遺伝子のｃＤＮＡ塩基配列とをＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等のホモロジー検索プログラムを用いて比較することによって、決定することができる。

アンチセンス核酸の標的領域は、該アンチセンス核酸がハイブリダイズすることによって、結果としてＲＩＯＫ２タンパク質への翻訳が阻害されるものであればその長さに特に制限はなく、ＲＩＯＫ２タンパク質をコードするｍＲＮＡの全配列であっても部分配列であってもよい。例えば、標的領域としては、短いもので約１０塩基程度、長いものでｍＲＮＡ又は初期転写産物の全配列が挙げられる。合成の容易さ、抗原性、細胞内移行性の観点等を考慮すれば、約１０〜約４０塩基、特に約１５〜約３０塩基からなるオリゴヌクレオチドが好ましいが、それに限定されない。具体的には、ｒｉｏｋ２遺伝子の５’末端ヘアピンループ、５’末端６−ベースペア・リピート、５’末端非翻訳領域、翻訳開始コドン、タンパク質コード領域、ＯＲＦ翻訳終止コドン、３’末端非翻訳領域、３’末端パリンドローム領域又は３’末端ヘアピンループ等が、アンチセンス核酸の好ましい標的領域として選択しうるが、それらに限定されない。

さらに、上記アンチセンス核酸は、ｒｉｏｋ２遺伝子のｍＲＮＡ又は初期転写産物とハイブリダイズしてタンパク質への翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖ＤＮＡであるこれらの遺伝子と結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、ＲＮＡへの転写を阻害し得るもの（アンチジーン）であってもよい。

アンチセンス核酸を構成するヌクレオチド分子は、天然型のＤＮＡ若しくはＲＮＡであってもよいが、安定性（化学的及び／又は対酵素）又は比活性（ＲＮＡとの親和性）を向上させるために、種々の化学修飾を含むことができる。例えば、ヌクレアーゼ等の加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンス核酸を構成する各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）を、例えば、ホスホロチオエート（ＰＳ）、メチルホスホネート及びホスホロジチオネート等の化学修飾リン酸残基に置換することができる。また、各ヌクレオチドの糖（リボース）の２’位の水酸基を、−ＯＲ（Ｒ＝ＣＨ_３（２’−Ｏ−Ｍｅ）、ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、ＣＨ_２ＣＨ_２ＨＣ（ＮＨ）ＮＨ_２、ＣＨ_２ＣＯＮＨＣＨ_３、ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＮ等）に置換してもよい。さらに、塩基部分（ピリミジン、プリン）に化学修飾を施してもよく、例えば、ピリミジン塩基の５位へのメチル基若しくはカチオン性官能基の導入、又は２位のカルボニル基のチオカルボニルへの置換等が挙げられる。

ＲＮＡの糖部のコンフォーメーションはＣ２’−ｅｎｄｏ（Ｓ型）とＣ３’−ｅｎｄｏ（Ｎ型）の２つが支配的であり、一本鎖ＲＮＡではこの両者の平衡として存在するが、二本鎖を形成するとＮ型に固定される。したがって、標的ＲＮＡに対して強い結合能を付与するために、２’酸素と４’炭素とを架橋することによって、糖部のコンフォーメーションをＮ型に固定したＲＮＡ誘導体であるＢＮＡ（ＬＮＡ）（Ｉｍａｎｉｓｈｉ，Ｔ． ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１６５３−９，２００２；Ｊｅｐｓｅｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１４，１３０−４６，２００４）又はＥＮＡ（Ｍｏｒｉｔａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，２２，１６１９−２１，２００３）もまた、好ましく用いられ得る。

アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｒｉｏｋ２遺伝子のｃＤＮＡ配列又はゲノミックＤＮＡ配列に基づいてｍＲＮＡ又は初期転写産物の標的配列を決定し、市販のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機（アプライド・バイオシステムズ社、ベックマン社等）を用いて、これに相補的な配列を合成することによって調製することができる。上述した各種修飾を含むアンチセンス核酸も、いずれも公知の手法によって、化学的に合成することができる。

（ｂ）ｒｉｏｋ２遺伝子のｍＲＮＡに対するリボザイム核酸
ｒｉｏｋ２遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列に対して相補的若しくは実質的に相補的な塩基配列又はその一部を含む核酸の他の好ましい例としては、該ｍＲＮＡをコード領域の内部で特異的に切断し得るリボザイム核酸が挙げられる。「リボザイム」とは、狭義には、核酸を切断する酵素活性を有するＲＮＡをいうが、本明細書では配列特異的な核酸切断活性を有する限りＤＮＡも包含する概念として用いるものとする。リボザイム核酸として最も汎用性の高いものとしては、ウイロイド及びウイルソイド等の感染性ＲＮＡに見られるセルフスプライシングＲＮＡが挙げられる。セルフスプライシングＲＮＡは、ハンマーヘッド型、ヘアピン型等が知られている。ハンマーヘッド型は約４０塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーヘッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ（合わせて約１０塩基程度）をｍＲＮＡの所望の切断部位と相補的な配列にすることによって、標的ｍＲＮＡのみを特異的に切断することが可能である。このタイプのリボザイム核酸は、ＲＮＡのみを基質とするので、ゲノムＤＮＡを攻撃することがないという更なる利点を有する。ｒｉｏｋ２遺伝子のｍＲＮＡが自身で二本鎖構造をとる場合には、ＲＮＡヘリカーゼと特異的に結合し得るウイルス核酸由来のＲＮＡモチーフを連結したハイブリッドリボザイムを用いることによって、標的配列を一本鎖にすることができる［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９８（１０）：５５７２−５５７７（２００１）］。さらに、リボザイムを、それをコードするＤＮＡを含む発現ベクターの形態で使用する場合には、転写産物の細胞質への移行を促進するために、ｔＲＮＡを改変した配列を更に連結したハイブリッドリボザイムとすることもできる［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２９（１３）：２７８０−２７８８（２００１）］。

（ｃ）ｒｉｏｋ２遺伝子のｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ
本明細書においては、ｒｉｏｋ２遺伝子のｍＲＮＡに対して相補的なオリゴＲＮＡとその相補鎖とからなる二本鎖ＲＮＡ、いわゆるｓｉＲＮＡもまた、ｒｉｏｋ２遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列と相補的若しくは実質的に相補的な塩基配列又はその一部を含む核酸に包含されるものとして定義される。短い二本鎖ＲＮＡを細胞内に導入するとそのＲＮＡに相補的なｍＲＮＡが分解される。このようなＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれる現象は、以前から線虫、昆虫、植物等で知られていたが、動物細胞でも広く起こることが確認されて以来［Ｎａｔｕｒｅ，４１１（６８３６）：４９４−４９８（２００１）］、リボザイムの代替技術として汎用されている。

ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子のｃＤＮＡ配列情報に基づいて、例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒら（Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，１５，１８８−２００（２００１））の提唱する規則に従って設計することができる。ｓｉＲＮＡの標的配列としては、例えばＡＡ＋（Ｎ）_１９、ＡＡ＋（Ｎ）_２１若しくはＮＡ＋（Ｎ）_２１（Ｎは任意の塩基）等が挙げられるが、それらに限定されない。標的配列の位置も特に制限されるわけではない。選択された標的配列の候補群について、標的以外のｍＲＮＡにおいて１６−１７塩基の連続した配列に相同性がないかどうかを、ＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）等のホモロジー検索ソフトを用いて調べ、選択した標的配列の特異性を確認する。例えば、ＡＡ＋（Ｎ）_１９、ＡＡ＋（Ｎ）_２１若しくはＮＡ＋（Ｎ）_２１（Ｎは任意の塩基）を標的配列とする場合、特異性の確認された標的配列について、ＡＡ（又はＮＡ）以降の１９−２１塩基にＴＴ若しくはＵＵの３’末端オーバーハングを有するセンス鎖と、該１９−２１塩基に相補的な配列及びＴＴ若しくはＵＵの３’末端オーバーハングを有するアンチセンス鎖とからなる２本鎖ＲＮＡをｓｉＲＮＡとして設計してもよい。また、ｓｉＲＮＡの前駆体であるショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、ループ構造を形成しうる任意のリンカー配列（例えば、５−２５塩基程度）を適宜選択し、上記センス鎖とアンチセンス鎖とを該リンカー配列を介して連結することによって設計することができる。

ｓｉＲＮＡ及び／又はｓｈＲＮＡの配列は、種々のｗｅｂサイト上に無料で提供される検索ソフトを用いて検索が可能である。このようなサイトとしては、例えば、Ａｍｂｉｏｎが提供するｓｉＲＮＡ Ｔａｒｇｅｔ Ｆｉｎｄｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ／ｊｐ／ｔｅｃｈｌｉｂ／ｍｉｓｃ／ｓｉＲＮＡ＿ｆｉｎｄｅｒ．ｈｔｍｌ）及びｐＳｉｌｅｎｃｅｒ（商標） Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ用インサートデザインツール（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ／ｊｐ／ｔｅｃｈｌｉｂ／ｍｉｓｃ／ｐｓｉｌｅｎｃｅｒ＿ｃｏｎｖｅｒｔｅｒ．ｈｔｍｌ）、ＲＮＡｉ Ｃｏｄｅｘが提供するＧｅｎｅＳｅｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｃｏｄｅｘ．ｃｓｈｌ．ｅｄｕ／ｓｃｒｉｐｔｓ／ｎｅｗｓｅａｒｃｈｈａｉｒｐｉｎ．ｃｇｉ）が挙げられるが、これらに限定されない。

ｓｉＲＮＡを構成するリボヌクレオシド分子もまた、安定性、比活性等を向上させるために、上記のアンチセンス核酸の場合と同様の修飾を受けていてもよい。

ｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡ上の標的配列のセンス鎖及びアンチセンス鎖をＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中、約９０〜約９５℃で約１分程度変性させた後、約３０〜約７０℃で約１〜約８時間アニーリングさせることによって調製することができる。ｓｉＲＮＡの前駆体となるシングルヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を合成し、これをダイサー（ｄｉｃｅｒ）を用いて切断することによって調製することもできる。

本明細書においては、生体内でｒｉｏｋ２遺伝子のｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡを生成し得るようにデザインされた核酸もまた、ｒｉｏｋ２遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列と相補的若しくは実質的に相補的な塩基配列又はその一部を含む核酸に包含されるものとして定義される。そのような核酸としては、上述したｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡを発現するように構築された発現ベクター等が挙げられる。ｓｈＲＮＡは、ｍＲＮＡ上の標的配列のセンス鎖及びアンチセンス鎖を適当なループ構造を形成しうる長さ（例えば５〜２５塩基程度）のスペーサー配列を間に挿入して連結した塩基配列を含むオリゴＲＮＡをデザインし、これをＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機で合成することによって調製することができる。ｓｈＲＮＡを発現するベクターには、タンデムタイプとステムループ（ヘアピン）タイプとがある。前者はｓｉＲＮＡのセンス鎖の発現カセットとアンチセンス鎖の発現カセットとをタンデムに連結したもので、細胞内で各鎖が発現してアニーリングすることによって２本鎖のｓｉＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を形成するというものである。一方、後者はｓｈＲＮＡの発現カセットをベクターに挿入したもので、細胞内でｓｈＲＮＡが発現しｄｉｃｅｒによるプロセシングを受けてｄｓＲＮＡを形成するというものである。プロモーターとしては、ｐｏｌＩＩ系プロモーター（例えば、ＣＭＶ前初期プロモーター）を使用することもできるが、短いＲＮＡの転写を正確に行わせるために、ｐｏｌＩＩＩ系プロモーターを使用するのが一般的である。ｐｏｌＩＩＩ系プロモーターとしては、マウス及びヒトのＵ６−ｓｎＲＮＡプロモーター、ヒトＨ１−ＲＮａｓｅ Ｐ ＲＮＡプロモーター、ヒトバリン−ｔＲＮＡプロモーター等が挙げられる。転写終結シグナルとして４個以上Ｔが連続した配列が用いられる。

このようにして構築したｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ発現カセットを、次いでプラスミドベクター又はウイルスベクターに挿入する。このようなベクターとしては、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス及びセンダイウイルス等のウイルスベクター又は、動物細胞用発現プラスミド等が用いられる。

ｒｉｏｋ２遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列と相補的若しくは実質的に相補的な塩基配列又はその一部を含む核酸は、リポソーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療に適用されたり、付加された形態で与えられることができうる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例えば、ホスホリピド、コレステロール等）等の疎水性の物質が挙げられる。付加するのに好ましい脂質としては、例えば、コレステロール及びその誘導体（例えば、コレステリルクロロホルメート、コール酸等）が挙げられる。こうしたものは、核酸の３’末端又は５’末端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の３’末端又は５’末端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ等のヌクレアーゼによる分解を阻止するための基が挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール及びテトラエチレングリコール等のグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それらに限定されるものではない。

これらの核酸のＲＩＯＫ２タンパク質の発現阻害活性は、ｒｉｏｋ２遺伝子を導入した形質転換体、生体内若しくは生体外のｒｉｏｋ２遺伝子発現系、又は生体内若しくは生体外のＲＩＯＫ２タンパク質翻訳系を用いて調べることができる。

ＲＩＯＫ２タンパク質の発現を阻害する物質は、上述のようなｒｉｏｋ２遺伝子のｍＲＮＡの塩基配列と相補的若しくは実質的に相補的な塩基配列又はその一部を含む核酸に限定されず、ＲＩＯＫ２タンパク質の産生を直接的又は間接的に阻害する限り、低分子化合物等の他の物質であってもよい。そのような物質は、例えば、上述したスクリーニング方法によって取得することができる。

「ＲＩＯＫ２タンパク質の機能を阻害する物質」とは、いったん機能的に産生されたＲＩＯＫ２タンパク質が、がん幹細胞の増殖を促進又は増強するのを抑制する限りいかなるものであってもよく、例えば、ＲＩＯＫ２タンパク質に結合してがん幹細胞の増殖を抑制する物質、ＲＩＯＫ２タンパク質のキナーゼ活性を阻害する物質、ＲＩＯＫ２タンパク質と他のタンパク質との結合を阻害する物質（例えば、ＲＩＯＫ２タンパク質と基質タンパク質との結合を阻害又はモジュレートする物質、ＲＩＯＫ２タンパク質とＲＩＯＫ２タンパク質のキナーゼ活性を促進させるタンパク質との結合若しくは複合体の形成を阻害又はモジュレートする物質等）、ＲＩＯＫ２タンパク質の分解を促進する物質（例えば、ＲＩＯＫ２タンパク質のユビキチン化を促進する物質、ＲＩＯＫ２タンパク質を安定化するタンパク質に結合する物質等）ＲＩＯＫ２タンパク質の核内への移行を阻害する物質等が挙げられる。

具体的には、ＲＩＯＫ２タンパク質の機能を阻害する物質として、例えば、ＲＩＯＫ２タンパク質に対する抗体が挙げられる。該抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであってもよい。これらの抗体は、公知の抗体又は抗血清の製造法に従って製造することができる。抗体のアイソタイプは特に限定されないが、好ましくはＩｇＧ、ＩｇＭ又はＩｇＡ、特に好ましくはＩｇＧが挙げられる。該抗体は、標的抗原を特異的に認識し結合するための相補性決定領域（ＣＤＲ）を少なくとも有するものであれば特に制限はなく、完全抗体分子の他、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２等のフラグメント、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ミニボディー、ダイアボディー等の遺伝子工学的に作製されたコンジュゲート分子、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等のタンパク質を安定化する作用を有する分子等で修飾されたそれらの誘導体等であってもよい。

好ましい一実施態様において、ＲＩＯＫ２タンパク質に対する抗体はヒトを投与対象とする医薬品として使用されることから、該抗体（好ましくはモノクローナル抗体）はヒトに投与した場合に抗原性を示す危険性が低減された抗体、具体的には、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、マウス−ヒトキメラ抗体等であることが好ましく、完全ヒト抗体であることがより好ましい。ヒト化抗体及びキメラ抗体は、常法に従って遺伝子工学的に作製することができる。完全ヒト抗体は、ヒト−ヒト（又はマウス）ハイブリドーマから製造することも可能ではあるが、大量の抗体を安定に且つ低コストで提供するためには、ヒト抗体産生マウス又はファージディスプレイ法を用いて製造することが好ましい。

ＲＩＯＫ２タンパク質は、がん幹細胞の増殖において重要な役割を担っているので、ＲＩＯＫ２タンパク質の機能を阻害する物質は、細胞膜透過性に優れた物質であることが好ましい。したがって、より好ましいＲＩＯＫ２タンパク質の機能を阻害する物質は、Ｌｉｐｉｎｓｋｉ’ｓ Ｒｕｌｅに見合った低分子化合物である。そのような化合物は、例えば、上述したスクリーニング方法を用いて取得することができる。

ＲＩＯＫ２タンパク質をコードする遺伝子若しくはＲＩＯＫ２タンパク質の発現又はＲＩＯＫ２タンパク質の機能を阻害する物質は、がん幹細胞の増殖を抑制するので、がん幹細胞に由来する各種癌の病態の改善に有用である。したがって、ＲＩＯＫ２タンパク質をコードする遺伝子若しくはＲＩＯＫ２タンパク質の発現又はＲＩＯＫ２タンパク質の機能を阻害する物質を含有する医薬は、がん幹細胞の増殖抑制剤、がん幹細胞が関与する各種がん疾患の予防剤及び／又は治療剤として使用することができる。

ＲＩＯＫ２タンパク質をコードする遺伝子若しくはＲＩＯＫ２タンパク質の発現又はＲＩＯＫ２タンパク質の機能を阻害する物質は１種のみを用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。２種以上の、ＲＩＯＫ２タンパク質をコードする遺伝子若しくはＲＩＯＫ２タンパク質の発現又はＲＩＯＫ２タンパク質の機能を阻害する物質は、それぞれ別個の医薬として製剤化してもよいし、同一の医薬組成物中に配合してもよい。２種以上の、ＲＩＯＫ２タンパク質をコードする遺伝子若しくはＲＩＯＫ２タンパク質の発現又はＲＩＯＫ２タンパク質の機能を阻害する物質が、それぞれ別個の医薬として製剤化される場合、各製剤を同時に投与してもよいし、時間をおいて投与してもよい。また、投与経路は同一であってもよいし、異なっていてもよい。後述する投与量は、１種の、ＲＩＯＫ２タンパク質をコードする遺伝子若しくはＲＩＯＫ２タンパク質の発現又はＲＩＯＫ２タンパク質の機能を阻害する物質の投与量を示すが、２種以上の物質を組み合わせて用いる場合でも、投与対象に好ましくない影響を与えない範囲で、それぞれの物質について同様の投与量を用いることができる。

（１）アンチセンス核酸、リボザイム核酸、ｓｉＲＮＡ及びその前駆体を含有する医薬
ｒｉｏｋ２遺伝子の転写産物に相補的に結合し該転写産物からのタンパク質の翻訳を抑制することができるアンチセンス核酸、ｒｉｏｋ２遺伝子の転写産物における相同な（又は相補的な）塩基配列を標的として該転写産物を切断し得るｓｉＲＮＡ（又はリボザイム）、該ｓｉＲＮＡの前駆体であるｓｈＲＮＡ等（以下、包括的に「ｒｉｏｋ２遺伝子の発現を阻害する核酸」という場合がある。）は、がん幹細胞の増殖抑制剤、がん幹細胞が関与する各種がんの予防剤及び／又は治療剤として使用することができる。

ｒｉｏｋ２遺伝子の発現を阻害する核酸を含有する医薬はそのまま液剤として、又は適当な剤型の医薬組成物として、ヒト又は非ヒト哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的又は非経口的（例えば、血管内投与、皮下投与等）に投与することができる。

ｒｉｏｋ２遺伝子の発現を阻害する核酸を上記がん幹細胞の増殖抑制剤、がん幹細胞が関与する疾患の予防剤及び／又は治療剤等として使用する場合、公知の方法に従って製剤化し、投与することができる。即ち、ｒｉｏｋ２遺伝子の発現を阻害する核酸を単独で用いてもよいし、又はレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクター等の適当な哺乳動物細胞用の発現ベクターに機能可能な態様で挿入することもできる。該核酸は、そのままで、又は摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃又はハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与することができる。エアロゾル化して吸入剤として気管内に局所投与することもできる。さらに、体内動態の改良、半減期の長期化、細胞内取り込み効率の改善を目的に、上記核酸を単独で又はリポソーム等の担体とともに製剤（注射剤）化し、静脈内、皮下等に投与してもよい。

ｒｉｏｋ２遺伝子の発現を阻害する核酸は、それ自体を投与してもよいし、適当な医薬組成物として投与してもよい。投与に用いられる医薬組成物としては、ｒｉｏｋ２遺伝子の発現を阻害する核酸と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤又は賦形剤を含むものであってよい。このような医薬組成物は、経口又は非経口投与に適する剤形として提供される。

非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤、鼻腔内投与剤等が挙げられる。注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含してもよい。このような注射剤は、公知の方法に従って調製できる。注射剤の調製方法としては、例えば、ｒｉｏｋ２遺伝子の発現を阻害する核酸を通常注射剤に用いられる無菌の水性液、又は油性液に溶解、懸濁又は乳化することによって調製できる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖、その他の補助薬を含む等張液等が挙げられる。注射用の水性液は、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（５０ｍｏｌ）ａｄｄｕｃｔ ｏｆ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ ｃａｓｔｏｒ ｏｉｌ）〕等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が挙げられる。油性液は、溶解補助剤、例えば、安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等と併用してもよい。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。直腸投与に用いられる坐剤は、上記核酸を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製されてもよい。

経口投与のための組成物としては、固体又は液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。このような組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤又は賦形剤を含有していてもよい。錠剤用の担体、賦形剤としては、例えば、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムが挙げられる。

上述の非経口用又は経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。このような投薬単位の剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤が挙げられる。ｒｉｏｋ２遺伝子の発現を阻害する核酸は、例えば、投薬単位剤形当たり通常０．０１〜５００ｍｇ程度含有されていることが好ましい。

ｒｉｏｋ２遺伝子の発現を阻害する核酸を含有する上記医薬の投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、がんの治療又は予防のために使用する場合には、ｒｉｏｋ２遺伝子の発現を阻害する核酸を１回量として、通常０．０００１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１日〜６ヶ月に１回程度、静脈注射によって投与するのが好都合である。他の非経口投与及び経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。

上述した各組成物は、ｒｉｏｋ２遺伝子の発現を阻害する核酸との配合によって好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。他の活性成分としては、例えば、他の抗がん剤等があげられる。

（２）ＲＩＯＫ２タンパク質に対する抗体、ＲＩＯＫ２タンパク質の発現又は機能を低下させる低分子化合物等を含有する医薬
ＲＩＯＫ２タンパク質に対する抗体、ＲＩＯＫ２タンパク質の発現又は機能を阻害する低分子化合物は、ＲＩＯＫ２タンパク質の産生若しくは機能を阻害したり、ＲＩＯＫタンパク質の分解を促進したり、又はＲＩＯＫ２タンパク質と基質タンパク質との相互作用（複合体形成）を阻害することができる。したがって、これらの物質は、生体内におけるＲＩＯＫ２タンパク質の発現又は機能を阻害するので、がん幹細胞が関与する各種がん疾患の予防剤及び／又は治療剤として使用することができる。上記抗体又は低分子化合物を含有する医薬は、そのまま液剤として、又は適当な剤型の医薬組成物として、ヒト又は哺乳動物（例えば、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル等）に対して経口的又は非経口的（例えば、血管内投与、皮下投与等）に投与することができる。

上記抗体又は低分子化合物は、それ自体を投与してもよいし、適当な医薬組成物として投与してもよい。投与に用いられる医薬組成物としては、上記抗体若しくは低分子化合物又はその塩と、薬理学的に許容され得る担体、希釈剤若しくは賦形剤とを含むものであってもよい。このような医薬組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。

非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤、鼻腔内投与剤等が挙げられる。注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含してもよい。このような注射剤は、公知の方法に従って調製できる。注射剤の調製方法としては、例えば、上記抗体若しくは低分子化合物又はその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性液、又は油性液に溶解、懸濁又は乳化することによって調製できる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖、その他の補助薬を含む等張液等が挙げられる。注射用の水性液は、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（５０ｍｏｌ）ａｄｄｕｃｔ ｏｆ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ ｃａｓｔｏｒ ｏｉｌ）〕等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が挙げられる。油性液は、溶解補助剤、例えば、安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等と併用してもよい。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。直腸投与に用いられる坐剤は、上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製されても良い。

経口投与のための組成物としては、固体又は液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。このような組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤又は賦形剤を含有していてもよい。錠剤用の担体、賦形剤としては、例えば、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムが挙げられる。

上述の非経口用又は経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。このような投薬単位の剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤が挙げられる。抗体又は低分子化合物は、投薬単位剤形当たり通常０．１〜５００ｍｇ、とりわけ注射剤では５〜１００ｍｇ、その他の剤形では１０〜２５０ｍｇ含有されていることが好ましい。

上記抗体若しくは低分子化合物又はその塩を含有する上記医薬の投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルート等によっても異なるが、例えば、がんの治療又は予防のために使用する場合には、抗体又は低分子化合物を１回量として、通常０．０００１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、低分子化合物であれば１日１〜５回程度、経口又は非経口で、抗体であれば１日〜数ヶ月に１回、静脈注射によって投与するのが好都合である。他の非経口投与及び経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。

上述した各組成物は、上記抗体又は低分子化合物との配合によって好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。他の活性成分としては、他の抗がん剤等があげられる。

以上説明したように、ＲＩＯＫ２タンパク質若しくはその部分配列を含むペプチド断片、又はそれを産生する細胞は、該タンパク質（遺伝子）の発現量及び／又は機能（活性）を指標とすることによって、がん幹細胞の増殖抑制作用を有する物質のスクリーニング方法のためのツールとして用いることができる。上記スクリーニング方法によって選択された物質は、がん幹細胞の増殖抑制剤、がん幹細胞が関与する各種がん疾患の予防剤及び／又は治療剤として使用することができる。

以下、実施例によって本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。

実施例１：ヒトＲＩＯＫ２タンパク質のノックダウンによるがん細胞のスフェアの形成抑制
各種培養がん細胞（腎臓がん由来ＡＣＨＮ細胞、グリオーマ由来Ｕ２５１細胞、大腸がん由来ＨＣＴ１１６細胞、膵臓がん由来ＭＩＡＰａＣａ−２細胞、肺がん由来Ａ５４９細胞、膵臓がん由来ＢｘＰＣ３細胞、子宮頸がん由来ＨＥＣ１Ａ細胞、頭頸部がん由来Ｆａｄｕ細胞）を、トリプシン処理を行った後に回収し、無血清ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地に最終細胞密度が７．２×１０^４個／ｍｌになるように懸濁した。その後、ｓｉＲＮＡ導入試薬を用いて、上記培養がん細胞に市販品のｓｉＲＮＡを導入した。具体的には、５．２６μｌのヒトＲＩＯＫ２タンパク質をコードする遺伝子（ｒｉｏｋ２遺伝子）に対するｓｉＲＮＡ（５ｎＭ、Ｓｉｌｅｎｃｅｒ Ｓｅｌｅｃｔ Ｐｒｅ−ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｓｉＲＮＡ（ＩＤ ｓ２２４３８７）：Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）（センス：ＣＡＡＵＣＡＡＧＣＵＵＵＡＧＡＡＧＡＡｔｔ（配列番号３）、アンチセンス：ＵＵＣＵＵＣＵＡＡＡＧＣＵＵＧＡＵＵＧａａ（配列番号４））と、４．４μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標） ＲＮＡｉＭＡＸ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）と、４４０μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）とを混合した。その後、混合液を室温で、２０分間放置することで、ｓｉＲＮＡ／ｌｉｐｏｓｏｍｅ複合体を形成した。次いで、４０μｌの当該ｓｉＲＮＡ／ｌｉｐｏｓｏｍｅ複合体と、２００μｌの上述の各種培養がん細胞の懸濁液とを混合した。その後、９６穴超低接着プレート（コーニング社製）に３０００細胞／ウェルで上記懸濁液を播種し、３７℃、５％ＣＯ_２存在下で４時間培養することで、トランスフェクションを実施した。続いて、各ウェルに５０μｌのスフェア形成用培地（ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地：１％ メチルセルロース（＃４００）、４％ Ｂ２７（登録商標）サプリメント、４０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、４０ｎｇ／ｍＬ ｂａｓｉｃ ＦＧＦ、１０μｇ／ｍＬ インスリン、２％ ペニシリン−ストレプトマイシン溶液）を添加、混合し、１０日間培養することで上記培養がん細胞のスフェアの形成を行った。

５０μｇ／ｍＬ ＭＴＴ試薬（和光純薬工業株式会社製）で細胞を染色した後、直径０．１μｍ以上のスフェアをイムノスポット（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ製）で計測することで、形成されたスフェアの数を求めた。図１に示すように、腎臓がん由来ＡＣＨＮ細胞、グリオーマ由来Ｕ２５１細胞、大腸がん由来ＨＣＴ１１６細胞、膵臓がん由来ＭＩＡＰａＣａ−２細胞、肺がん由来Ａ５４９細胞、膵臓がん由来ＢｘＰＣ３細胞、子宮頸がん由来ＨＥＣ１Ａ細胞、頭頸部がん由来Ｆａｄｕ細胞において、ｒｉｏｋ２遺伝子をノックダウンすると、スフェアの形成が抑制された。Ｍｏｃｋトランスフェクション細胞をコントロールに用いた。このことから、ＲＩＯＫ２タンパク質はがん幹細胞の性質を維持するために必要なキナーゼであること、ｒｉｏｋ２遺伝子に対するｓｉＲＮＡが、がん幹細胞の増殖抑制に有効であることが分かった。

スフェアの形成の測定と併せて、ｒｉｏｋ２遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（ＲＩＯＫ２ ｓｉＲＮＡ）を導入した細胞から、ＱｕｉｃｋＧｅｎｅ−８００（富士フイルム株式会社製）を使用してＲＮＡを抽出し、ＰｒｉｍｅｒＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｅｒａｓｅｒ（タカラバイオ株式会社製）を用いて、逆転写反応を行った。続いて、当該反応液を鋳型として、Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）、ｒｉｏｋ２遺伝子に特異的なプライマーセット（Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｐｒｉｍｅｒ（ＨＡ１８２８７７）；タカラバイオ株式会社製）及びヒトＧＡＰＤＨをコードする遺伝子に特異的なプライマーセット（Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｐｒｉｍｅｒ（ＨＡ０６７８１２）；タカラバイオ株式会社製）を用いてＰＣＲ反応（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７９００ＨＴ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製））を行った。上記ＰＣＲによってヒトＲＩＯＫ２（ｈＲＩＯＫ２）及びヒトＧＡＰＤＨ（ｈＧＡＰＤＨ）のｍＲＮＡの発現量をそれぞれ定量した結果、いずれのがん細胞においてもＲＩＯＫ２ ｓｉＲＮＡを導入したがん細胞でｈＲＩＯＫ２のｍＲＮＡのノックダウンが認められた（図２）。図２の縦軸はｈＲＩＯＫ２のｍＲＮＡの発現量を内部標準であるｈＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量で除した値を示している。

ＲＩＯＫ２のｍＲＮＡの発現量の測定に加えて、Ｕ２５１細胞については、ＲＩＯＫ２タンパク質の発現量の測定も行った。すなわち、まず上記ＲＩＯＫ２ ｓｉＲＮＡを導入したＵ２５１細胞とＭｏｃｋトランスフェクション細胞（コントロール）とをＤ−ＰＢＳ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）で洗浄した。その後、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（和光純薬工業株式会社製）を含有するＤ−ＰＢＳを用いて、洗浄した上記細胞からタンパク質抽出液を得た。次に、得られた抽出液中のタンパク質の濃度をＤＣプロテインアッセイキット（バイオラッド社製）を用いて測定した。１０μｇ相当の該タンパク質抽出液及び、抗ＲＩＯＫ２マウスモノクローナル抗体、クローン ３Ｅ１１抗体（オリジーン社製）を用いたイムノブロッティングを行ったところ、コントロールのタンパク質抽出液の場合には、ＲＩＯＫ２タンパク質を示すバンドが検出されているのに対して、ＲＩＯＫ２ ｓｉＲＮＡを導入した細胞由来のタンパク質抽出液の場合は何も検出されなかった（図３）。この結果、ＲＩＯＫ２ ｓｉＲＮＡの導入によってＲＩＯＫ２タンパク質の発現も抑制されることが分かった。

実施例２：ヒトＲＩＯＫ２タンパク質のノックダウンによるＵ２５１細胞のがん幹細胞の含有率の減少
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標） ＲＮＡｉＭＡＸ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを用いてＲＩＯＫ２ ｓｉＲＮＡをトランスフェクションしたＵ２５１細胞をＴ−７５フラスコで２日間培養した。なお、コントロールとして、ルシフェラーゼ遺伝子阻害ｓｉＲＮＡ（Ｌｕｃ ｓｉＲＮＡ）をトランスフェクションしたＵ２５１細胞を用いた。実施例１と同様にトリプシン処理によって回収したＵ２５１細胞を、ＡＬＤＨ ａｓｓａｙバッファーで２．０×１０^５細胞／ｍＬの細胞密度に調製した。その後、得られた細胞懸濁液に５μｌのＡＬＤＥＦＬＵＯＲ試薬（ＳＴＥＭＣＥＬＬ社製）を添加し、３７℃、４５分間インキュベートした。遠心分離後、余剰のＡＬＤＥＦＬＵＯＲ試薬を除去し、５００μｌのＡＬＤＨ ａｓｓａｙバッファーで再懸濁した。再懸濁した細胞をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ Ａｒｅａ：ＢＤバイオサイエンス社製）に供し、４８８ｎｍで励起し、ＦＩＴＣフィルターで各細胞の発光量を測定した。なお、データ解析はＦＡＣＳディーバソフトウェアを用いた。ＡＬＤＨ陽性細胞の割合をＦｌｏｗＪｏ解析ソフトで算出したところ、ＲＩＯＫ２ ｓｉＲＮＡを導入したＵ２５１細胞で減少していることが分かった（図４）。この結果、ＲＩＯＫ２をノックダウンすることで、Ｕ２５１細胞のがん幹細胞の含有率が減少することが分かった。

実施例３：ヒトＲＩＯＫ２タンパク質の自己リン酸化活性を指標としたＲＩＯＫ２阻害剤のスクリーニング系
組換ヒトＲＩＯＫ２タンパク質として、全長のヒトＲＩＯＫ２タンパク質のＮ末端に、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼを融合したタンパク質を使用した。上記タンパク質は、カルナバイオ社のバキュロウイルス―Ｓｆ２１細胞発現システムを用いて調製した。２５μｇ／ｍＬの組換ヒトＲＩＯＫ２タンパク質と１００μＭのＡＴＰとを、２０μｌのキナーゼ反応バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ ＭｎＣｌ_２、１ｍＭ ＤＴＴ、０．０１％ Ｂｒｉｊ、１×ＰｈｏｓＳＴＯＰ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製））中で混合することでキナーゼ反応液を調製し、３０℃で１時間保温した。このキナーゼ反応液に３０μｌの４０ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を添加した後、上記キナーゼ反応液をＭＡＸＩＳＯＲＰ９６穴プレート（ＮＵＮＣ製）に移した。その後、上記プレートを冷蔵庫内で一晩放置することで、リン酸化ヒトＲＩＯＫ２タンパク質をウェル上に吸着させた。

翌日、上清を除去し、ＥＬＩＳＡバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２％ Ｔｗｅｅｎ−２０、０．１％ ＢＳＡ）で３回ウェルを洗浄した。その後、１００μｌのＢｌｏｃｋｉｎｇ−Ｏｎｅ Ｐ（ナカライテスク株式会社製、商品名）をウェルに加えて、室温で１時間ブロッキング処理を行った。上記と同様の方法でウェルを洗浄した後、ＥＬＩＳＡバッファーで１／４０００に希釈したＡｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ Ｔｈｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ（セルシグナリング社製）溶液をウェルに加えて室温で３０分間インキュベートした。更に、ウェルを洗浄した後に、２次抗体であるａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ社製）（１／４０００ ＥＬＩＳＡバッファー希釈液）をウェルに加えて室温で、３０分間インキュベートした。再びウェルを洗浄した後に、５０μｌのテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）水溶液（ナカライテスク株式会社製）をウェルに加えて、発色反応を室温で、３０分間行った。その後、５０μｌの２Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４をウェルに加えることで発色反応を停止した。ＡＲＶＯ ＳＸ（Ｗａｌｌａｃ社製）を用いて、各ウェルの４５０ｎｍの吸光光度を測定した。その結果、ＡＴＰが添加されていないときと比較して、４倍以上の自己リン酸化活性が認められた（図５）。

更に、上記キナーゼ反応が、一般的なキナーゼ阻害剤であるスタウロスポリンによって阻害されることを以下の方法で示した。すなわち、まず、所定の濃度のスタウロスポリン（和光純薬工業株式会社製）を、全長のヒトＲＩＯＫ２タンパク質と共にキナーゼ反応バッファーに加えた後に、３０℃、１時間保温の条件で反応を行った。その後、反応溶液における、ＲＩＯＫ２のキナーゼ活性（リン酸化活性）を測定したところ、図６に示すようにスタウロスポリンの濃度依存的にＲＩＯＫ２のキナーゼ活性が抑制されることが分かった。この結果、上記ＲＩＯＫ２のキナーゼ活性の測定系は、ＲＩＯＫ２の阻害剤の探索に利用できる手法であることが分かった。

実施例４：被験物質Ａ、被験物質ＢのＲＩＯＫ２タンパク質のキナーゼ活性阻害作用
上述の方法においてスタウロスポリンの代わりに、被験物質Ａ又は被験物質ＢのＤＭＳＯ溶液（最終濃度、１μＭ、０．３μＭ、０．１μＭ）を反応溶液に添加しキナーゼ反応を行い、４５０ｎｍの吸光光度を測定した。ここで、被験物質Ａは(Z)-N-(2-(diethylamino)ethyl)-2,4-dimethyl-5-((2-oxo-5-(1-phenyl-1H-pyrazol-5-yl)indolin-3-ylidene)methyl)-1H-pyrrole-3-carboxamideであり、被験物質Ｂは(Z)-2,4-dimethyl-5-((2-oxo-5-(1-(pyridin-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl)indolin-3-ylidene)methyl)-N-(2-(pyrrolidin-1-yl)ethyl)-1H-pyrrole-3-carboxamideである。一方で、被験物質の代わりに最終濃度１％となるようにＤＭＳＯを反応溶液に添加しキナーゼ反応を行ったコントロールを作製し、４５０ｎｍの吸光光度を測定した。被験物質における測定値をコントロールの測定値で除することで、それぞれの濃度における被験物質のキナーゼ活性阻害率を算出した。その後、上記阻害率に基づき被験物質Ａ及び、被験物質ＢがＲＩＯＫ２タンパク質のキナーゼ活性を５０％阻害する濃度（ＩＣ５０値）を算出した。その結果、被験物質ＡのＩＣ５０は０．８μＭ、被験物質ＢのＩＣ５０は０．９μＭであることが分かった。

実施例５：イムノブロット法によるＲＩＯＫ２の阻害剤のスクリーニング系
実施例３に記載のＲＩＯＫ２タンパク質の自己リン酸化活性は、以下に記載するイムノブロット法によっても評価可能である。すなわち、３０℃、１時間保温のキナーゼ反応を行ったＲＩＯＫ２タンパク質をＡｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ Ｔｈｒ ａｎｔｉｂｏｄｙを用いたイムノブロットに供したところ、ＡＴＰ無添加のサンプルと比較して、ＡＴＰ添加サンプルは明瞭にリン酸化ＲＩＯＫ２タンパク質が増加していることが分かった（図７）。このことから、イムノブロット法によっても、ＲＩＯＫ２の阻害剤をスクリーニングできることが分かった。

実施例６：ＲＩＯＫ２阻害剤のスフェアの形成抑制活性
ＡＣＨＮ細胞、Ｕ２５１細胞、ＢｘＰＣ３細胞のそれぞれを、トリプシン処理を行った後に回収し、無血清ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地に７．２×１０^４細胞／ｍｌの細胞密度になるように懸濁した。２００μｌの上述の細胞懸濁液に、最終濃度が１０μＭ、３μＭ、１μＭ、０．３μＭ、０．１μＭになるように被験物質Ａ又は被験物質ＢのＤＭＳＯ溶液を混合した。その後、上記細胞懸濁液を９６穴超低接着プレートに３０００細胞／ウェルで播種した。続いて、各ウェルに５０μｌのスフェア形成用培地を添加、混合し、１０日間培養することでスフェアの形成を行った。同時に、被験物質に換えて、最終濃度が０．１％となるようにＤＭＳＯを添加した細胞（コントロール）のスフェアの形成を行った。５０μｇ／ｍＬ ＭＴＴ試薬で細胞を染色した後、直径０．１μｍ以上のスフェアをイムノスポットで計測することで、形成されたスフェアの数を求めた。被験物質で処理した細胞のスフェアの数を、コントロールのスフェアの数で除することで、それぞれの濃度における被験物質のスフェアの形成阻害率を算出した。その後、上記阻害率に基づき被験物質Ａ、被験物質Ｂがスフェアの形成を５０％阻害する濃度（ＩＣ５０値）を算出した（表１）。その結果、被験物質Ａ、被験物質Ｂは、ＡＣＨＮ細胞、Ｕ２５１細胞、ＢｘＰＣ３細胞のスフェアの形成を阻害することが分かった。

実施例７：ＲＩＯＫ２阻害剤のがん幹細胞の含有率抑制活性
ＨＣＴ１１６細胞に、被験物質ＡのＤＭＳＯ溶液（最終濃度３μＭ、１μＭ、０．３μＭ）を添加した後、４日間培養した。得られた細胞をＦＡＣＳバッファー（５％ＢＳＡ、２ｍＭ ＥＤＴＡ含有Ｄ−ＰＢＳ）に懸濁し、４℃、１０分間ＦｃＲ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ試薬（ミルテニー社製）によってブロッキングを行った。その後、得られた細胞懸濁液に、抗ヒトＣＤ１３３／２（２９３Ｃ３）抗体（ミルテニー社製、最終希釈倍率１１倍）を加え、４℃で、３０分間保温した。４℃、５分間、３０００ｒｐｍで遠心分離することで、細胞を回収し、再度ＦＡＣＳバッファーに再懸濁した。得られた細胞をセルストレイナー（ベクトンディッキンソン社製）に供した。次いで、その細胞をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ Ａｒｅａ：ＢＤバイオサイエンス社製）に供し、６３３ｎｍのレッドレーザーで励起し、ＡＰＣフィルターで各細胞の発光量を測定した。なお、データ解析はＦＡＣＳディーバソフトウェアを用いた。ＣＤ１３３の発現量をＦｌｏｗＪｏ解析ソフトで算出したところ、被験物質Ａで処理した細胞においては、濃度依存的に、がん幹細胞の含有率が減少していることが分かった（図８）。縦軸は、被験物質Ａ無処理の細胞におけるＣＤ１３３の発現量に対する、被験物質Ａで処理した細胞におけるＣＤ１３３の発現量を百分率で示している。この結果、被験物質ＡはＨＣＴ１１６細胞のがん幹細胞の含有率を減少させることが分かった。

本発明によって提供されるスクリーニング法は、がん幹細胞を含有する各種がん疾患又はがん幹細胞に由来する各種がん疾患の予防薬及び治療薬のスクリーニング法として期待される。

Claims (12)

1. Ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ライトオープンリーディングフレームキナーゼ２（ＲＩＯＫ２）タンパク質の機能を阻害する物質を選択する工程を含む、がん幹細胞の増殖抑制物質のスクリーニング方法。
2. 前記機能が自己リン酸化活性を含む、請求項１に記載のスクリーニング方法。
3. 前記ＲＩＯＫ２タンパク質又はその部分配列を含むペプチド断片と、被検物質とを接触させる工程、
   前記ＲＩＯＫ２タンパク質又はその部分配列を含むペプチド断片の自己リン酸化活性を測定する工程、及び
   前記被検物質の非存在下において測定した対照と比較して、前記ＲＩＯＫ２タンパク質又はその部分配列を含むペプチド断片の自己リン酸化活性を低下させる物質を選択する工程、
   を含む、請求項２に記載のスクリーニング方法。
4. 前記機能が前記ＲＩＯＫ２タンパク質の基質タンパク質に対する結合活性又はリン酸化活性を含む、請求項１に記載のスクリーニング方法。
5. 前記ＲＩＯＫ２タンパク質又はその部分配列を含むペプチド断片及び前記基質タンパク質と、被検物質とを接触させる工程、
   前記ＲＩＯＫ２タンパク質又はその部分配列を含むペプチドの前記基質タンパク質に対する結合活性又はリン酸化活性を測定する工程、及び
   前記被検物質の非存在下において測定した対照と比較して、前記結合活性又は前記リン酸化活性を低下させる物質を選択する工程、
   を含む、請求項４に記載のスクリーニング方法。
6. 細胞内における、ライトオープンリーディングフレームキナーゼ２（ＲＩＯＫ２）タンパク質をコードする遺伝子の発現、ＲＩＯＫ２タンパク質の発現又はＲＩＯＫ２タンパク質の機能を阻害する物質を選択する工程を含む、がん幹細胞の増殖抑制物質のスクリーニング方法。
7. 前記ＲＩＯＫ２タンパク質をコードする遺伝子又は前記ＲＩＯＫ２タンパク質をコードする遺伝子の転写調節領域の制御下にあるレポーター遺伝子を発現する細胞に、被検物質を接触させる工程、
   前記細胞における前記ＲＩＯＫ２タンパク質をコードする遺伝子又は前記レポーター遺伝子の発現量を測定する工程、及び
   前記被検物質の非存在下において測定した対照と比較して、前記発現量を低下させる物質を選択する工程、
   を含む、請求項６に記載のスクリーニング方法。
8. 前記ＲＩＯＫ２タンパク質をコードする遺伝子を発現する細胞に、被検物質を接触させる工程、
   前記細胞における前記ＲＩＯＫ２タンパク質の産生量を測定する工程、及び
   前記被検物質の非存在下において測定した対照と比較して、前記産生量を低下させる物質を選択する工程、
   を含む、請求項６に記載のスクリーニング方法。
9. 前記ＲＩＯＫ２タンパク質をコードする遺伝子を発現するがん幹細胞を含む細胞集団に、被検物質を接触させる工程、
   前記細胞集団を培養することによる前記がん幹細胞の含有率又はスフェアの形成量を測定する工程、及び
   前記被検物質の非存在下において測定した対照と比較して、前記含有率又は前記形成量を低下させる物質を選択する工程、
   を含む、請求項６に記載のスクリーニング方法。
10. 前記機能が自己リン酸化活性、又は前記ＲＩＯＫ２タンパク質の基質タンパク質に対する結合活性若しくはリン酸化活性を含む、請求項６に記載のスクリーニング方法。
11. 前記ＲＩＯＫ２タンパク質をコードする遺伝子を発現する細胞に、被検物質を接触させる工程、
    前記細胞に含まれる前記ＲＩＯＫ２タンパク質の自己リン酸化活性、又は前記基質タンパク質に対する結合活性若しくはリン酸化活性を測定する工程、及び
    前記被検物質の非存在下において測定した対照と比較して、前記自己リン酸化活性又は前記基質タンパク質に対する結合活性若しくはリン酸化活性を低下させる物質を選択する工程、
    を含む、請求項１０に記載のスクリーニング方法。
12. 前記がん幹細胞の増殖抑制物質が抗がん剤である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。