JP2011105669A

JP2011105669A - 抗腫瘍剤および抗腫瘍剤のスクリーニング方法

Info

Publication number: JP2011105669A
Application number: JP2009264123A
Authority: JP
Inventors: Noriyuki Sato; 昇志佐藤; Toshihiko Torigoe; 俊彦鳥越; Yoshihiko Hirohashi; 良彦廣橋; Munehide Nakatsugawa; 宗秀中津川
Original assignee: Sumitomo Dainippon Pharma Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Pharma Co Ltd
Priority date: 2009-11-19
Filing date: 2009-11-19
Publication date: 2011-06-02

Abstract

【課題】癌治療薬・予防薬等の医薬として有用な物質及びそのスクリーニング方法を提供する。
【解決手段】Lengsinの発現を抑制する物質を有効成分として含有する、抗腫瘍剤を提供する。また、Lengsin又はLengsinをコードする遺伝子の発現量を低下させる化合物を選択することを特徴とする、抗腫瘍剤のスクリーニング方法を提供する。
【選択図】なし

Description

本発明は、癌治療薬・予防薬等の医薬として有用な物質及びそのスクリーニング方法等に関する。

癌の治療法は、大きく「局所療法」と「全身療法」に分けることができる。局所療法は「手術療法」と「放射線療法」があり、全身療法は抗癌剤、ホルモン剤などの薬剤を、内服や静脈内注射などで投与する薬物療法が主体になる。
現状では、局所療法による治療で40 ％前後が治癒し、7〜10％で何らかの形で抗癌剤の寄与により治癒している。つまり約50％の人は手術療法、放射線療法あるいは化学療法で治癒可能であるが、それ以外は治らないというのが現状である。特に肺癌患者の 5 年生存率は依然として低い。

新しい治療法としては、近年これまでの抗癌剤で認められた骨髄抑制に代表される重篤な副作用を持たない治療薬として、新しいコンセプトを有した分子標的治療薬が多く開・上市されている。例えば、乳癌で高発現するHer2分子に対する抗体薬であるハーセプチンまた肺癌で高発現する上皮成長因子受容体（EGF-R）のチロシンキナーゼ阻害剤であるイレッサ等がある。その効果は顕著であり、強い抗腫瘍効果が報告されている。

しかしながら、有害事象が少なくなく、また間質性肺炎など重篤な副作用が報告されていることから、分子標的治療薬とはいえ、未だ満足できる薬剤が無いのが現状であり、新たな癌特異的な分子を標的とした薬剤、あるいは新たな治療法の研究、開発が望まれている。

Lengsin(Glutamate-ammonia ligase (glutamine synthase) domain containing 1 (GLULD1) Gene ID 51557)は、ヒトレンズで多く発現する新規遺伝子として同定され、そのアミノ酸配列の類似性からグルタミン合成酵素のファミリーに属する可能性が報告されているがグルタミン合成酵素活性は有しておらず、生理的機能については不明である（非特許文献1,2,3,4を参照）。またヒト肺癌細胞株に高発現していることが報告されている（特許文献1）。
しかし、Lengsinの癌細胞増殖への影響等については何も知られておらず、 Lengsin の発現を抑制することによって腫瘍細胞の増殖が抑制されることは知られていなかった。

特開２００８−８１４１４号公報国際公開第２００７／１１９５１５号パンフレット

Mol. Vis. Jun. 15;8:185-95 (2002) Biochemical Biophysical Research Communications, 350:424-429 (2006) Structure 14:1823-1834 (2006) J. Biol.Chemistry. 283: 6607-6615(2008)

本発明が解決しようとする課題は、癌治療薬・予防薬等の医薬として有用な物質及びそのスクリーニング方法を提供することにある。

本発明は、癌疾患の予防、改善または治療に有効な薬物をスクリーニングする方法、並びに該疾患の予防、改善または治療に有効な薬物を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行っていたところ、正常の組織における発現量に比して肺癌組織における発現量および／あるいは発現頻度が有意に促進されているLengsinのバリアントを同定した。

更に、本発明者は、癌細胞株におけるLengsinの発現を抑制することにより癌細胞株の増殖が抑制されることを明らかにした。

これらのことから、本発明者は、Lengsinのバリアントもしくはその発現産物（タンパク質）が肺癌疾患患者に特異的に見いだされる、肺癌細胞増殖に必要な分子であることを確信した。
上記Legsin遺伝子の発現抑制や、当該遺伝子によりコードされる蛋白質の発現抑制や機能（活性）抑制を指標としたスクリーニング系は、新たなメカニズムに基づく癌疾患の予防、改善または治療薬の探索に有効である。
本発明は、以上のような知見を基礎として完成されたものである。
即ち本発明は、
〔１〕 Lengsinの発現を抑制する物質を有効成分として含有する、抗腫瘍剤;
〔２〕 Lengsinの発現を抑制する物質が、以下の（１）〜（３）からなる群より選択される物質である、〔１〕に記載の剤：
（１）Lengsinをコードする遺伝子の転写産物に対するアンチセンス核酸、
（２）Lengsinをコードする遺伝子の転写産物に対するリボザイム核酸、
（３）Lengsinをコードする遺伝子の転写産物に対してRNAi活性を有する核酸もしくはその前駆体;
〔３〕 Lengsinが、以下の（ａ）〜（ｅ）から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質である、〔１〕又は〔２〕に記載の剤：
（ａ）配列番号２又は配列番号４で示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２又は配列番号４で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加、挿入もしくは置換されたアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号２又は配列番号４で示されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号１又は配列番号３で示される塩基配列を有するDNAによりコードされるアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号１又は配列番号３で示される塩基配列を有するDNAに対し相補性を有するDNAと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるアミノ酸配列、
但し（ｂ）〜（ｅ）のアミノ酸配列を有するタンパク質は、配列番号２又は配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質を特異的に認識する抗体によって認識され得る;
〔４〕肺癌治療剤である、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の剤;
〔５〕 Lengsin又はLengsinをコードする遺伝子の発現量を低下させる化合物を選択することを特徴とする、抗腫瘍剤のスクリーニング方法;
〔６〕以下の（１）〜（３）の工程を含む、〔５〕に記載のスクリーニング方法：
（１）Lengsinをコードする遺伝子もしくはLengsinをコードする遺伝子の転写調節領域の制御下にあるレポーター遺伝子を発現する細胞に、被検物質を接触させる工程、
（２）前記細胞におけるLengsinをコードする遺伝子もしくはレポーター遺伝子の発現量を測定する工程、及び
（３）被検物質の非存在下において測定した場合と比較して、発現量を低下させる化合物を抗腫瘍剤の候補として選択する工程;
〔７〕配列番号５に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド;
〔８〕二重鎖RNA部分の一方の鎖が、配列番号５に記載の塩基配列からなる、siRNA;
〔９〕３’末端に２〜４塩基のオーバーハングが付加されていることを特徴とする、〔８〕に記載のsiRNA;
〔１０〕少なくとも１つの塩基が化学的に修飾されている〔８〕又は〔９〕に記載のsiRNA;
〔１１〕少なくとも１つのホスホジエステル結合が化学的に修飾されている〔８〕〜〔１０〕のいずれかに記載のsiRNA;
〔１２〕〔８〕〜〔１１〕いずれかに記載のsiRNAを有効成分として含有する抗腫瘍剤;
に関する。

本発明は、前述するようにLengsin遺伝子、詳しくは野生型及びバリアント（スプライシングバリアント４）が、肺癌疾患患者の癌組織において発現量および／あるいは発現頻度が有意に上昇し、しかもLengsin遺伝子の発現を抑制することにより癌細胞増殖が抑制されることを見出したことに基づくものである。
従って、これらの遺伝子及びその発現産物［タンパク質、（ポリ）（オリゴ）ペプチド］は癌疾患の解明、診断、予防及び治療に有効に利用することができ、かかる利用によって医学並びに臨床学上、有用な情報や手段を得ることができる。さらに、個体（生体組織）における、上記遺伝子の発現またはその発現産物の検出、または該遺伝子の変異またはその発現不全の検出は、癌疾患の解明に有効に利用することができる。
また、これらの遺伝子及びその発現産物並びにそれらからの派生物（例えば、遺伝子断片、抗体など）は、Lengsin遺伝子の発現を抑制する物質、およびLengsinの発現量、機能若しくは活性を抑制する物質のスクリーニングに有用であり、該スクリーニングによって得られる物質は、癌疾患の予防、改善及び治療薬として有効である。さらに、これらの遺伝子のアンチセンス核酸（アンチセンスポリヌクレオチド）及びsiRNA、リボザイムは、癌疾患の予防、改善及び治療薬として有用である。
上述のとおり、本発明により、癌治療薬・予防薬等の医薬として有用な物質及びそのスクリーニング方法等を提供することが可能になった。

図１は、ヒトLengsin遺伝子の肺癌患者の肺組織でのmRNA量をRT-PCR法を用いて解析した図である。図中 Tはprimary lung cancer Nは non-concerous tissueを示す。またcase#1,4,7は、squamous cell carcinomas（肺扁平上皮癌）患者の組織サンプル、case#2,5,6は、adenocarcinomas（肺腺癌）患者の組織サンプル、case#3は、large cell carcinomas（肺大細胞癌）患者の組織サンプルを示す。

図2(a)ヒト肺癌患者の肺組織のヒトLengsinタンパクの免疫染色の図である（倍率は200倍）。それぞれ、Adenocarcinomas（肺腺癌）、Squamous cell carcinomas（肺扁平上皮癌）、Large cell carcinomas（肺大細胞癌）、Small cell carcinomas（肺小細胞癌）患者の組織切片サンプルを示している。図2(b)はヒト正常liverおよびplacentaの組織切片サンプルでのヒトLengsinタンパクの免疫染色の図である（倍率は200倍）。

図3(a)ヒトLengsinに対するsiRNAをヒト肺癌細胞株1-87へ導入し、ヒトLengsin遺伝子の発現の抑制をRT-PCR法を用いて解析した図である。内部標準としてGAPDHのmRNA量を測定している。図3(b)ヒト肺癌細胞株1-87でヒトLengsinの遺伝子発現を抑制した状態でのCell ViabilityをWST-1アッセイで測定した結果である（n=3の平均）。*p<0.01 図3(c)ヒト肺癌細胞株1-87でヒトLengsinの遺伝子発現を抑制した時の細胞の顕微鏡写真である（倍率200倍）。図3(d)propidium iodideを用いたフローサイトメトリー結果であり、図中のバーはsub-G1期の細胞を示している。

図4(a)ヒトLengsin遺伝子のゲノム構造を示した図である。図4(b)ヒトLengsin遺伝子のバリアントを示した図である。図4(c)各種ヒト肺癌細胞でのヒトLengsin遺伝子のmRNA量を図4(a)中のprimer pairIIを用いて、RT-PCR法を用いて解析した図である。内部標準としてGAPDHのmRNA量を測定している。図4(d)は図4(c)のA549細胞の結果を拡大したものである。

本明細書において、タンパク質およびペプチドは、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）で記載される。

本発明は、Lengsinの発現を抑制する物質またはLengsinの機能を抑制する物質を含有してなる、抗腫瘍剤を提供する。
I. Lengsin又はこれをコードするLengsin遺伝子
本明細書において、Lengsinとは、野生型Lengsinおよびそのスプライシングバリアントと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質である。Lengsinは公知の蛋白質であり、Genbank Accession No.：NP_057655として知られている配列番号：２で表されるヒトLengsinのアミノ酸配列からなるタンパク質が野生型として知られている。また、そのスプライシングバリアントとしては、Genbank Accession No.： NP_001137412として知られているスプライシングバリアント２(又はアイソフォームＢ）、Genbank Accession No.：DQ682605として知られているスプライシングバリアント１、Genbank Accession No.：DQ682606として知られているスプライシングバリアント３が知られている。図4a及び図4bで示されているとおり、野生型Ｌｅｎｇｓｉｎは、エクソン１、２、４ａ、４ｂ、５ａ、５ｂ、５ｃ及び５ｄからなるアミノ酸を有する。前記スプライシングバリアント１は、エクソン１、２、４ａ、４ｂ、５ａ、５ｂ及び５ｄからなるアミノ酸配列を有し、スプライシングバリアント３は、エクソン１、２及び３からなるアミノ酸配列を有する。
尚、スプライシングバリアント２（又はアイソフォームＢ）は、前記スプライシングバリアント１における第８１番目のアミノ酸がセリンに置換されたものである。

また、配列番号：３で示される塩基配列からなるDNAによりコードされる、配列番号：４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、本願発明者らにより見出されたLengsinの新規スプライシングバリアント（スプライシングバリアント４）であり、かかるタンパク質と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質もまた本明細書においてＬｅｎｇｓｉｎに含まれる。そして、配列番号：３で示される塩基配列からなる核酸、及びこれによりコードされる配列番号：４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質もまた、本願発明の範疇である。図4ａ及び図４ｂで示されているとおり、前記スプライシングバリアント４は、エクソン１、２、３、４ａ、４ｂ、５ａ、５ｂ、５ｃ及び５ｄからなるアミノ酸を有する。

本明細書において、Lengsinはヒトや他の温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の細胞もしくはそれらの細胞が由来する組織［例えば、肺癌細胞など］又は生体内で発現している組織［例えば、レンズなど］等から、公知のタンパク質分離精製技術により単離・精製されるものであってよい。

「配列番号：２で表されるアミノ酸配列またはこれと実質的に同一のアミノ酸配列」として具体的には、以下の（ａ）〜（ｅ）が挙げられる：
（ａ）配列番号：２又は配列番号：４で示されるアミノ酸配列；
（ｂ) 配列番号：２又は配列番号：４で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加、挿入もしくは置換されたアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号：２又は配列番号：４で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号１又は配列番号３で示される塩基配列を有するDNAによりコードされるアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号１又は配列番号３で示される塩基配列を有するDNAに対し相補性を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされ流アミノ酸配列。
具体的には、配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるヒトタンパク質の他の哺乳動物におけるオルソログのアミノ酸配列、または配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるヒトタンパク質もしくはそのオルソログのスプライスバリアント（例えば配列番号：４）、アレル変異体もしくは多型におけるアミノ酸配列が挙げられる。

ここで「相同性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸および類似アミノ酸残基の割合（％）を意味する。「類似アミノ酸」とは物理化学的性質において類似したアミノ酸を意味し、例えば、芳香族アミノ酸（Phe、Trp、Tyr）、脂肪族アミノ酸（Ala、Leu、Ile、Val）、極性アミノ酸（Gln、Asn）、塩基性アミノ酸（Lys、Arg、His）、酸性アミノ酸（Glu、Asp）、水酸基を有するアミノ酸（Ser、Thr）、側鎖の小さいアミノ酸（Gly、Ala、Ser、Thr、Met）などの同じグループに分類されるアミノ酸が挙げられる。このような類似アミノ酸による置換はタンパク質の表現型に変化をもたらさない（即ち、保存的アミノ酸置換である）ことが予測される。保存的アミノ酸置換の具体例は当該技術分野で周知であり、種々の文献に記載されている（例えば、Bowieら，Science, 247： 1306-1310 (1990)を参照）。

本明細書におけるアミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値=10；ギャップを許す；マトリクス=BLOSUM62；フィルタリング=OFF）にて計算することができる。アミノ酸配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、例えば、Karlinら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90： 5873-5877 (1993)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはNBLASTおよびXBLASTプログラム（version 2.0）に組み込まれている（Altschulら, Nucleic Acids Res., 25： 3389-3402 (1997)）］、Needlemanら, J. Mol. Biol., 48： 444-453 (1970)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラムに組み込まれている］、MyersおよびMiller, CABIOS, 4: 11-17 (1988)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはCGC配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム（version 2.0）に組み込まれている］、Pearsonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-2448 (1988)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のFASTAプログラムに組み込まれている］等が挙げられ、それらも同様に好ましく用いられ得る。

上記（ｅ）におけるストリンジェントな条件とは、例えば、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons,6.3.1-6.3.6, 1999に記載される条件、例えば、6×SSC（sodium chloride/sodium citrate）／45℃でのハイブリダイゼーション、次いで0.2×SSC／0.1％ SDS／50〜65℃での一回以上の洗浄等が挙げられるが、当業者であれば、これと同等のストリンジェンシーを与えるハイブリダイゼーションの条件を適宜選択することができる。

より好ましくは、「配列番号：２又は配列番号：４で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列」として、配列番号：２又は配列番号：４で表されるアミノ酸配列と、約80%以上、好ましくは約90%以上、より好ましくは約95%以上、いっそう好ましくは約97%以上、特に好ましくは約98%以上、最も好ましくは約99%以上の同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。

「配列番号：２又は配列番号：４で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質」は、配列番号：２又は配列番号：４で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含み、かつ配列番号：２又は配列番号：４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と実質的に同質の機能を有するタンパク質である。

ここで「実質的に同質の機能」とは、例えば生理学的に、あるいは薬理学的にみて、その性質が定性的に同じであることを意味し、機能の程度（例、約0.1〜約10倍、好ましくは0.5〜2倍）や、タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。また、現時点でLengsinの生体内での役割、すなわち生理機能は未知であるが、配列番号：２又は配列番号４で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質を特異的に認識する抗体によって認識され得るタンパク質を、「実質的に同一の機能を有するタンパク質」と見なすことができる。

本発明におけるタンパク質：Lengsinとして、例えば、（i）配列番号：２又は配列番号：４で表されるアミノ酸配列中の1〜50個、好ましくは1〜30個、より好ましくは1〜10個、さらに好ましくは1〜数（5、4、3もしくは2）個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ii）配列番号：２又は配列番号：４で表されるアミノ酸配列に1〜50個、好ましくは1〜30個、より好ましくは1〜10個、さらに好ましくは1〜数（5、4、3もしくは2）個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（iii）配列番号：２又は配列番号：４で表されるアミノ酸配列に1〜50個、好ましくは1〜30個、より好ましくは1〜10個、さらに好ましくは1〜数（5、4、3もしくは2）個のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（iv）配列番号：２又は配列番号：４で表されるアミノ酸配列中の1〜50個、好ましくは1〜30個、より好ましくは1〜10個、さらに好ましくは1〜数（5、4、3もしくは2）個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（v）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのいわゆるムテインも含まれる。

上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失、付加または置換されている場合、その挿入、欠失、付加または置換の位置は、配列番号：２又は配列番号：４で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質を特異的に認識する抗体によって認識され得る限り、特に限定されない。

ここでアミノ酸の欠失、付加、挿入又は置換を人為的に行う場合の手法としては、例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードするDNAに対して慣用の部位特異的変異導入を施し、その後このDNAを常法により発現させる手法が挙げられる。ここで部位特異的変異導入法としては、例えば、アンバー変異を利用する方法（ギャップド・デュプレックス法、Nucleic Acids Res., 12,9441-9456(1984)）、変異導入用プライマーを用いたPCRによる方法等が挙げられる。

Lengsinの好ましい例としては、例えば、配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるヒトタンパク質（Genbank Accession No. NP_057655）、配列番号：４で表されるアミノ酸配列からなるヒトタンパク質、あるいは他の哺乳動物におけるそれらのオルソログ（例えば、マウスLengsinタンパク質（Genbank Accession No. NP_705829）、ラットLengsin（Genbank Accession No. NP_852048)等）、アレル変異体、多型などがあげられる。

「Lengsinをコードする遺伝子」は、上記(ａ)〜（ｅ）で示される、配列番号：２又は配列番号：４で表されるアミノ酸配列またはこれと実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質であって、配列番号：２又は配列番号：４で表されるアミノ酸配列と実質的に同一の機能を示すタンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子を表す。ここで「実質的に同一の機能を示す」とは、上記と同意である。
具体的には、以下の（ｆ）〜（ｊ）：
（ｆ）配列番号：２又は４で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｇ）配列番号：２又は４で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加、挿入もしくは置換されたアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｈ）配列番号：２又は４で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｉ）配列番号１又は配列番号３で示される塩基配列、
（ｊ）配列番号１又は配列番号３で示される塩基配列を有するDNAに対し相補性を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAの塩基配列、但し上記（ｇ）〜（ｊ）の塩基配列は、配列番号：２又は配列番号：４で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質を特異的に認識する抗体によって認識され得るアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする塩基配列である、
を有する遺伝子が挙げられる。

尚、ここで遺伝子とは、cDNAもしくはゲノムDNA等のDNA、又はmRNA等のRNAのいずれでもよく、また一本鎖の核酸配列及び二本鎖の核酸配列を共に含む概念である。また、本明細書において、配列番号：１、配列番号：３等に示される核酸配列は、便宜的にDNA配列であるが、mRNAなどRNA配列を示す場合には、チミン（Ｔ）をウラシル（Ｕ）として解する。

II．Lengsinの発現を抑制する物質
本発明において「Lengsinの発現を抑制する物質」とは、Lengsinをコードする遺伝子（Lengsin遺伝子）の転写レベル、転写後調節のレベル、Lengsinへの翻訳レベル、翻訳後修飾のレベル等のいかなる段階で作用するものであってもよい。従って、Lengsinの発現を抑制する物質としては、例えば、Lengsin遺伝子の転写を阻害する物質（例、アンチジーン）、初期転写産物からmRNAへのプロセッシングを阻害する物質、mRNAの細胞質への輸送を阻害する物質、mRNAからLengsinの翻訳を阻害するか（例、アンチセンス核酸、miRNA）あるいはmRNAを分解する（例、siRNA、リボザイム）物質、初期翻訳産物の翻訳後修飾を阻害する物質などが含まれる。いずれの段階で作用するものであっても好ましく用いることができるが、mRNAに相補的に結合してLengsinへの翻訳を阻害するかあるいはmRNAを分解する物質が好ましい。

Lengsin遺伝子のmRNAからLengsinへの翻訳を特異的に阻害する（あるいはmRNAを分解する）物質として、好ましくは、Lengsin遺伝子のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸が挙げられる。

Lengsin遺伝子のmRNAの塩基配列と実質的に相補的な塩基配列とは、哺乳動物の標的組織である肺癌の生理的条件下において、該mRNAの標的配列に結合してその翻訳を阻害し得る（あるいは該標的配列を切断する）程度の相補性を有する塩基配列を意味し、具体的には、例えば、該mRNAの塩基配列と完全相補的な塩基配列（すなわち、mRNAの相補鎖の塩基配列）と、オーバーラップする領域に関して、約80％以上、好ましくは約90％以上、より好ましくは約95％以上、特に好ましくは約97％以上の相同性を有する塩基配列である。

本発明における「塩基配列の相同性」は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値=10；ギャップを許す；フィルタリング=ON；マッチスコア=1；ミスマッチスコア=-3）にて計算することができる。

より具体的には、Lengsin遺伝子のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列としては、以下の（ｋ）又は（ｌ）：
(ｋ)配列番号：１又は配列番号：３で表される塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列；
(ｌ)配列番号：１又は配列番号：３で表される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、かつ配列番号：２又は配列番号：４で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質を特異的に認識する抗体によって認識され得るタンパク質をコードする配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列；
が挙げられる。
ストリンジェントな条件は、前述のとおりである。

Lengsin遺伝子のmRNAの好ましい例としては、配列番号：１で表される野生型Lengsinの塩基配列（Genbank Accession No. NM_016571）、NM_001143940として知られているスプライシングバリアント２(又はアイソフォームＢ）の塩基配列、Genbank Accession No.：DQ682605として知られているスプライシングバリアント１の塩基配列、Genbank Accession No.：DQ682606として知られているスプライシングバリアント３の塩基配列、又は配列番号：３で表される塩基配列を含むヒトLengsinのスプライシングバリアント４の塩基配列等が挙げられる。また、他の哺乳動物におけるそれらのオルソログ（例えば、マウスLengsin（Genbank Accession No. NM_153601）、ラットLengsin（Genbank Accession No. NM_181383）等）、さらにはそれらのスプライスバリアント、アレル変異体、多型等が挙げられる。

Lengsin遺伝子のmRNAの塩基配列と「相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列の一部」とは、Lengsin遺伝子のmRNAに特異的に結合することができ、且つ該mRNAからのタンパク質の翻訳を阻害（あるいは該mRNAを分解）し得るものであれば、その長さや位置に特に制限はないが、配列特異性の面から、標的配列に相補的もしくは実質的に相補的な部分を少なくとも10塩基以上、好ましくは約15塩基以上を含むものである。

具体的には、Lengsin遺伝子のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸として、以下の(１)〜(３）のいずれかのものが好ましく例示される：
(１) Lengsin遺伝子のmRNAに対するアンチセンス核酸、
(２) Lengsin遺伝子のmRNAに対するリボザイム核酸、
(３) Lengsin遺伝子のmRNAに対してRNAi活性を有する核酸もしくはその前駆体。

(１) Lengsin遺伝子のmRNAに対するアンチセンス核酸
本発明における「Lengsin遺伝子のmRNAに対するアンチセンス核酸」とは、該mRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸であって、標的mRNAと特異的かつ安定した二重鎖を形成して結合することにより、タンパク質合成を抑制する機能を有するものである。

アンチセンス核酸は、2-デオキシ-D-リボースを含有しているポリデオキシリボヌクレオチド、D-リボースを含有しているポリリボヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のN-グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例えば、市販のタンパク質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー）または特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーはDNAやRNA中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などが挙げられる。それらは、二本鎖DNA、一本鎖DNA、二本鎖RNA、一本鎖RNA、DNA:RNAハイブリッドであってもよく、さらに非修飾ポリヌクレオチド（または非修飾オリゴヌクレオチド）、公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合（例、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えばタンパク質（例、ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ-L-リジンなど）や糖（例、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレント化合物（例、アクリジン、ソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。このような修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌクレオシドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、例えば、１個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されていたり、またはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていたりしてよい。

上記の通り、アンチセンス核酸はDNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA/RNAキメラであってもよい。アンチセンス核酸がDNAの場合、標的RNAとアンチセンスDNAとによって形成されるRNA:DNAハイブリッドは、内在性RNase Hに認識されて標的RNAの選択的な分解を引き起こすことができる。したがって、RNase Hによる分解を指向するアンチセンスDNAの場合、標的配列は、mRNA中の配列だけでなく、Lengsin遺伝子の初期翻訳産物におけるイントロン領域の配列であってもよい。イントロン配列は、ゲノム配列と、Lengsin遺伝子のcDNA塩基配列とをBLAST、FASTA等のホモロジー検索プログラムを用いて比較することにより、決定することができる。

本発明のアンチセンス核酸の標的領域は、該アンチセンス核酸がハイブリダイズすることにより、結果としてタンパク質：Lengsinへの翻訳が阻害されるものであればその長さに特に制限はなく、LengsinをコードするmRNAの全配列であっても部分配列であってもよく、短いもので約10塩基程度、長いものでmRNAもしくは初期転写産物の全配列が挙げられる。合成の容易さや抗原性、細胞内移行性の問題等を考慮すれば、約10〜約40塩基、特に約15〜約30塩基からなるオリゴヌクレオチドが好ましいが、それに限定されない。具体的には、Lengsin遺伝子の5’端ヘアピンループ、5’端６−ベースペア・リピート、5’端非翻訳領域、翻訳開始コドン、タンパク質コード領域、ORF翻訳終止コドン、3’端非翻訳領域、3’端パリンドローム領域または3’端ヘアピンループなどが、アンチセンス核酸の好ましい標的領域として選択しうるが、それらに限定されない。

さらに、本発明のアンチセンス核酸は、Lengsin遺伝子のmRNAや初期転写産物とハイブリダイズしてタンパク質への翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖DNAであるこれらの遺伝子と結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、RNAへの転写を阻害し得るもの（アンチジーン）であってもよい。

アンチセンス核酸を構成するヌクレオチド分子は、天然型のDNAもしくはRNAでもよいが、安定性（化学的および／または対酵素）や比活性（RNAとの親和性）を向上させるために、種々の化学修飾を含むことができる。例えば、ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンス核酸を構成する各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）を、例えば、ホスホロチオエート（PS)、メチルホスホネート、ホスホロジチオネートなどの化学修飾リン酸残基に置換することができる。また、各ヌクレオチドの糖（リボース）の2’位の水酸基を、-OR（R=CH₃（2’-O-Me）、CH₂CH₂OCH₃（2’-O-MOE）、CH₂CH₂NHC(NH)NH₂、CH₂CONHCH₃、CH₂CH₂CN等）に置換してもよい。さらに、塩基部分（ピリミジン、プリン）に化学修飾を施してもよく、例えば、ピリミジン塩基の5位へのメチル基やカチオン性官能基の導入、あるいは2位のカルボニル基のチオカルボニルへの置換などが挙げられる。

RNAの糖部のコンフォーメーションはC2’-endo（S型）とC3’-endo（N型）の２つが支配的であり、一本鎖RNAではこの両者の平衡として存在するが、二本鎖を形成するとN型に固定される。したがって、標的RNAに対して強い結合能を付与するために、2’酸素と4’炭素を架橋することにより、糖部のコンフォーメーションをN型に固定したRNA誘導体であるBNA(LNA)（Imanishi, T. et al., Chem. Commun., 1653-9, 2002; Jepsen, J.S. et al., Oligonucleotides, 14, 130-46, 2004）やENA（Morita, K. et al., Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids, 22, 1619-21, 2003）もまた、好ましく用いられ得る。

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、Lengsin遺伝子のcDNA配列もしくはゲノミックDNA配列に基づいてmRNAもしくは初期転写産物の標的配列を決定し、市販のDNA/RNA自動合成機（アプライド・バイオシステムズ社、ベックマン社等）を用いて、これに相補的な配列を合成することにより調製することができる。また、上記した各種修飾を含むアンチセンス核酸も、いずれも自体公知の手法により、化学的に合成することができる。

(２) Lengsin遺伝子のmRNAに対するリボザイム核酸
Lengsin遺伝子のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸の他の好ましい例としては、該mRNAをコード領域の内部で特異的に切断し得るリボザイム核酸が挙げられる。「リボザイム」とは、狭義には、核酸を切断する酵素活性を有するRNAをいうが、本明細書では配列特異的な核酸切断活性を有する限りDNAをも包含する概念として用いるものとする。リボザイム核酸として最も汎用性の高いものとしては、ウイロイドやウイルソイド等の感染性RNAに見られるセルフスプライシングRNAがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型等が知られている。ハンマーヘッド型は約40塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーヘッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ（合わせて約10塩基程度）をmRNAの所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、標的mRNAのみを特異的に切断することが可能である。このタイプのリボザイム核酸は、RNAのみを基質とするので、ゲノムDNAを攻撃することがないというさらなる利点を有する。Lengsin遺伝子のmRNAが自身で二本鎖構造をとる場合には、RNAヘリカーゼと特異的に結合し得るウイルス核酸由来のRNAモチーフを連結したハイブリッドリボザイムを用いることにより、標的配列を一本鎖にすることができる［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98(10): 5572-5577 (2001)］。さらに、リボザイムを、それをコードするDNAを含む発現ベクターの形態で使用する場合には、転写産物の細胞質への移行を促進するために、tRNAを改変した配列をさらに連結したハイブリッドリボザイムとすることもできる［Nucleic Acids Res., 29(13): 2780-2788 (2001)］。

(３) Lengsin遺伝子のmRNAに対してRNAi活性を有する核酸もしくはその前駆体
本明細書においては、Lengsin遺伝子のmRNAに対してRNAi活性を有する核酸、即ちLengsin遺伝子のmRNAに相補的なオリゴRNAとその相補鎖とからなる二本鎖RNA、いわゆるsiRNAもまた、Lengsin遺伝子のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸に包含されるものとして定義される。短い二本鎖RNAを細胞内に導入するとそのRNAに相補的なmRNAが分解される、いわゆるRNA干渉（RNAi）と呼ばれる現象は、以前から線虫、昆虫、植物等で知られていたが、この現象が動物細胞でも広く起こることが確認されて以来［Nature, 411(6836): 494-498 (2001)］、上記のアンチセンス核酸やリボザイムの代替技術として汎用されている。

siRNAは、標的遺伝子のcDNA配列情報に基づいて、例えば、Elbashirら（Genes Dev., 15, 188-200 (2001)）、Teramotoら（FEBS Lett. 579(13):p2878-82(2005)）の提唱する規則に従って設計することができる。siRNAの標的配列としては、原則的には19〜27塩基の長さを有しており、例えばAA+(N)19、AA+(N)21もしくはA+(N)21であってもよい。
すなわち、配列番号１で示される野生型Lengsin遺伝子のｍRNAの塩基配列、配列番号３で示されるLengsinのスプライシングバリアント４遺伝子のｍRNAの塩基配列、又は前述のLengsinのスプライシングバリアント１遺伝子、スプライシングバリアント２遺伝子及びスプライシングバリアント３遺伝子のｍRNAの塩基配列から選ばれる連続する19〜50塩基、好ましくは19〜27塩基、更に好ましくは19〜23塩基の部分配列から設計することができる。
本発明の核酸は、5’又は3’末端に、付加的な塩基を有していてもよい。該付加的塩基の長さは、通常２〜４塩基程度であり、siRNAの全長として１９塩基以上である。該付加的塩基は、DNAでもRNAでもよいが、DNAを用いると核酸の安定性を向上させることができる場合がある。このような付加的塩基の配列としては、例えばug-3’、uu-3’、tg-3’、tt-3’、ggg-3’、guuu-3’、gttt-3’、ttttt-3’、uuuuu-3’などの配列が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

また、siRNAは、3'末端に突出部配列（オーバーハング）を有していてもよく、具体的には、dTdT（dTはデオキシリボ核酸を表わす）を付加したものが挙げられる。また、末端付加がない平滑末端（ブラントエンド）であってもよい。
また、siRNAは、センス鎖とアンチセンス鎖が異なる塩基数であってもく、例えば、アンチセンス鎖が3'末端及び5'末端に突出部配列（オーバーハング）を有している「aiRNA」を挙げることができる。典型的なaiRNAは、アンチセンス鎖が21塩基からなり、センス鎖が15塩基からなり、アンチセンス鎖の両端で各々３塩基のオーバーハング構造をとる（Sun, X.ら著、Nature Biotechnology Vol26 No.12 p1379、国際公開第WO2009/029688号パンフレット）。

具体的には、実施例３に記載されているような、二本鎖部分の一方の鎖が25塩基長のブラントエンド型のsiRNA（配列番号５）が例示される。標的配列部分が19塩基長で3'末端にdTdTを付加された合計21塩基長さのsiRNAもまた好適に用いられる。

標的配列の位置は特に制限されるわけではないが、5’-UTR及び開始コドンから約50塩基まで、並びに3’-UTR以外の領域から標的配列を選択することが望ましい。上述の規則その他に基づいて選択された標的配列の候補群について、標的以外のmRNAにおいて16-17塩基の連続した配列に相同性がないかどうかを、BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）等のホモロジー検索ソフトを用いて調べ、選択した標的配列の特異性を確認する。特異性の確認された標的配列について、AA（もしくはNA）以降の19-21塩基にTTもしくはUUの3’末端オーバーハングを有するセンス鎖と、該１９−２１塩基に相補的な配列及びTTもしくはUUの3’末端オーバーハングを有するアンチセンス鎖とからなる2本鎖RNAをsiRNAとして設計してもよい。また、siRNAの前駆体であるショートヘアピンRNA（shRNA）は、ループ構造を形成しうる任意のリンカー配列（例えば、5-25塩基程度）を適宜選択し、上記センス鎖とアンチセンス鎖とを該リンカー配列を介して連結することにより設計することができる。

siRNA及び／又はshRNAの配列は、種々のwebサイト上に無料で提供される検索ソフトを用いて検索が可能である。このようなサイトとしては、例えば、Ambionが提供するsiRNA Target Finder（http://www.ambion.com/jp/techlib/misc/siRNA_finder.html）及びpSilencer（登録商標） Expression Vector用インサートデザインツール（http://www.ambion.com/jp/techlib/misc/psilencer_converter.html）、RNAi Codexが提供するGeneSeer（http://codex.cshl.edu/scripts/newsearchhairpin.cgi）があるがこれらに限定されない。

siRNAを構成するリボヌクレオシド分子もまた、安定性、比活性などを向上させるために、上記のアンチセンス核酸の場合と同様の修飾を受けていてもよい。但し、siRNAの場合、天然型RNA中のすべてのリボヌクレオシド分子を修飾型で置換すると、RNAi活性が失われる場合があるので、RISC複合体が機能できる最小限の修飾ヌクレオシドの導入が必要である。

当該修飾として具体的には、siRNAを構成するヌクレオチド分子の一部を、天然型のDNAや、安定性（化学的および／または対酵素）や比活性（RNAとの親和性）を向上させるために、種々の化学修飾を施したRNAに置換することができる（Usman and Cedergren,1992,TIBS 17,34;Usman et al.,1994,Nucleic Acids Symp.Ser.31,163を参照）。例えば、ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、siRNAを構成する各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）を、例えば、ホスホロチオエート（PS)、メチルホスホネート、ホスホロジチオネートなどの化学修飾リン酸残基に置換することができる。また、各ヌクレオチドの糖（リボース）の2’位の水酸基を、-OR（R=CH₃（2’-O-Me）、CH₂CH₂OCH₃（2’-O-MOE）、CH₂CH₂NHC(NH)NH₂、CH₂CONHCH₃、CH₂CH₂CN等）に置換してもよい。さらに、塩基部分（ピリミジン、プリン）に化学修飾を施してもよく、例えば、ピリミジン塩基の5位へのメチル基やカチオン性官能基の導入、あるいは2位のカルボニル基のチオカルボニルへの置換などが挙げられる。その他上記（１）に記載されたアンチセンス核酸における修飾方法を用いることができる。

siRNAは、mRNA上の標的配列のセンス鎖及びアンチセンス鎖をDNA/RNA自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中、約90〜約95℃で約1分程度変性させた後、約30〜約70℃で約1〜約8時間アニーリングさせることにより調製することができる。また、siRNAの前駆体となるショートヘアピンRNA（shRNA）を合成し、これを、ダイサー（dicer）を用いて切断することにより調製することもできる。

本明細書においては、生体内でLengsin遺伝子のmRNAに対するsiRNAを生成し得るようにデザインされた核酸もまた、Lengsin遺伝子のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸に包含されるものとして定義される。そのような核酸としては、上記したshRNAやsiRNAを発現するように構築された発現ベクターなどが挙げられる。shRNAは、mRNA上の標的配列のセンス鎖およびアンチセンス鎖を適当なループ構造を形成しうる長さ（例えば5〜25塩基程度）のスペーサー配列を間に挿入して連結した塩基配列を含むオリゴRNAをデザインし、これをDNA/RNA自動合成機で合成することにより調製することができる。shRNAを発現するベクターには、タンデムタイプとステムループ（ヘアピン）タイプとがある。前者はsiRNAのセンス鎖の発現カセットとアンチセンス鎖の発現カセットをタンデムに連結したもので、細胞内で各鎖が発現してアニーリングすることにより2本鎖のsiRNA（dsRNA）を形成するというものである。一方、後者はshRNAの発現カセットをベクターに挿入したもので、細胞内でshRNAが発現しdicerによるプロセシングを受けてdsRNAを形成するというものである。プロモーターとしては、polII系プロモーター（例えば、CMV前初期プロモーター）を使用することもできるが、短いRNAの転写を正確に行わせるために、polIII系プロモーターを使用するのが一般的である。polIII系プロモーターとしては、マウスおよびヒトのU6-snRNAプロモーター、ヒトH1-RNase P RNAプロモーター、ヒトバリン-tRNAプロモーターなどが挙げられる。また、転写終結シグナルとして4個以上Tが連続した配列が用いられる。

このようにして構築したsiRNAもしくはshRNA発現カセットを、次いでプラスミドベクターやウイルスベクターに挿入する。このようなベクターとしては、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、センダイウイルスなどのウイルスベクターや、動物細胞発現プラスミドなどが用いられる。

上記siRNAは、ヌクレオチド配列の情報に基づいて、例えば394 Applied Biosystems,Inc.合成機等のDNA/RNA自動合成機を用いて常法に従って化学的に合成することができる。例えばCaruthers et al.,1992,Methods in Enzymology 211,3-19,Thompson et al.,国際公開99/54459,Wincott et al.,1995,Nucleic Acids Res.23,2677-2684,Wincott et al.,1997,Methods Mol.Bio.,74,59,Brennan et al.,1998,Biotechnol Bioeng.,61,33-45，Usman et al.,1987 J.Am.Chem.Soc.,109,7845、Scaringe et al.,1990 Nucleic Acids Res.,18,5433)、Wincott et al.,1995 Nucleic Acids Res.23,2677-2684、Wincott et al.,1997,Methods Mol.Bio.,74,59、および米国特許第6001311号に記載される方法等が挙げられる。具体的には、当業者に公知の核酸保護基（例えば5’末端にジメトキシトリチル基）およびカップリング基（例えば3’末端にホスホルアミダイト）を用いて合成できる。すなわち、5'末端の保護基を、TCA（トリクロロ酢酸）等の酸で脱保護し、カップリング反応を行う。ついでアセチル基でキャッピングを行った後、次の核酸の縮合反応を行う。修飾されたRNAやDNAを含むsiRNAの場合には、原料として修飾されたRNA（例えば、2'-O-メチルヌクレオチド、2'-デオキシ−2'-フルオロヌクレオチド）を用いればよく、カップリング反応の条件は適宜調整できる。また、リン酸結合部分が修飾されたホスホロチオエート結合を導入する場合には、ボーケージ試薬（３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキシド）を用いることができる。

あるいは，オリゴヌクレオチドは，別々に合成し、合成後に例えばライゲーションにより一緒につなげてもよいし（Moore et al.,1992,Science 256,9923;Draper et al.国際公開WO93/23569;Shabarova et al.,1991,Nucleic Acids Research 19,4247;Bellon et al.,1997,Nucleosides&Nucleotides,16,951;Bellon et al.,1997,Nucleosides&Nucleotides,Bellon et al.,1997,Bioconjugate Chem.8,204）、または合成および／または脱保護の後にハイブリダイゼーションにより，一緒につなげてもよい。siRNA分子はまたタンデム合成法により合成することができる。すなわち、両方のsiRNA鎖を，切断可能なリンカーにより分離された単一の連続するオリゴヌクレオチドとして合成し，次にこれを切断して別々のsiRNAフラグメントを生成し，これをハイブリダイズさせて精製する。リンカーはポリヌクレオチドリンカーであっても非ヌクレオチドリンカーであってもよい。

合成したsiRNA分子は、当業者に公知の方法を用いて精製できる。例えばゲル電気泳動により精製する方法，または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣを用いて精製する方法が挙げられる。
また、siRNA分子をDNAまたはRNAベクター中に挿入させて、組換えベクターを用いて発現させることもできる。ベクターは，DNAプラスミドまたはウイルスベクターでありうる。siRNAを発現するウイルスベクターは，限定されないが，アデノウイルス等を用いることができる。

具体的なsiRNAとしては例えば、以下の群：
（１）二重鎖RNA部分の一方の鎖が、配列番号：５からなる塩基配列を含むsiRNA、
（２）３’末端に２〜４塩基のオーバーハングが付加されていることを特徴とする前記（１）に記載のsiRNAが付加された塩基配列、
（３）少なくとも１つの塩基が化学的に修飾されている前記（１）又は（２）に記載のsiRNA、又は、
（４）少なくとも１つのホスホジエステル結合が化学的に修飾されている前記（１）〜（３）のいずれかに記載のsiRNA、
等を例示することができる。ここでsiRNAの二重鎖RNA部分の塩基の長さは１９〜５０、好ましくは１９〜２７、更に好ましくは１９〜２３である。

Lengsin遺伝子のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸は、リポソーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療に適用されたり、付加された形態で与えられることができうる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大させたりするような脂質（例、ホスホリピド、コレステロールなど）などの疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の3’端または5’端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の3’端または5’端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、RNaseなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。

これらの核酸のタンパク質：Lengsin発現阻害活性は、Lengsin遺伝子を導入した形質転換体、生体内や生体外のLengsin遺伝子発現系、または生体内や生体外のタンパク質：Lengsinの翻訳系を用いて調べることができる。

本発明におけるLengsinの発現を阻害する物質は、上記のようなLengsin遺伝子のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸に限定されず、Lengsinの産生を直接的または間接的に阻害する限り、低分子化合物などの他の物質であってもよい。そのような物質は、例えば、後述する本発明のスクリーニング方法により取得することができる。

III. Lengsinの機能を抑制する物質
本発明において「Lengsinの機能を抑制する物質」とは、いったん機能的に産生されたLengsinの機能を発揮するのを抑制する限りいかなるものでもよい。

具体的には、Lengsinの機能を抑制する物質として、例えば、Lengsinに対する抗体が挙げられる。該抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。これらの抗体は、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。抗体のアイソタイプは特に限定されないが、好ましくはIgG、IgMまたはIgA、特に好ましくはIgGが挙げられる。また、該抗体は、標的抗原を特異的に認識し結合するための相補性決定領域（CDR）を少なくとも有するものであれば特に制限はなく、完全抗体分子の他、例えばFab、Fab'、F(ab’)₂等のフラグメント、scFv、scFv-Fc、ミニボディー、ダイアボディー等の遺伝子工学的に作製されたコンジュゲート分子、あるいはポリエチレングリコール（PEG）等のタンパク質安定化作用を有する分子等で修飾されたそれらの誘導体などであってもよい。

好ましい一実施態様において、Lengsinに対する抗体はヒトを投与対象とする医薬品として使用されることから、該抗体（好ましくはモノクローナル抗体）はヒトに投与した場合に抗原性を示す危険性が低減された抗体、具体的には、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、マウス−ヒトキメラ抗体などであり、特に好ましくは完全ヒト抗体である。ヒト化抗体およびキメラ抗体は、常法に従って遺伝子工学的に作製することができる。また、完全ヒト抗体は、ヒト−ヒト（もしくはマウス）ハイブリドーマより製造することも可能ではあるが、大量の抗体を安定に且つ低コストで提供するためには、ヒト抗体産生マウスやファージディスプレイ法を用いて製造することが望ましい。

Lengsinの発現もしくは機能を抑制する物質は、腫瘍の増殖抑制活性を示すことから、抗腫瘍剤として、癌に罹患した患者の病態を改善したり、癌への罹患、特には癌の転移・再発を予防したりするのに有用である。
従って、Lengsinの発現もしくは機能を抑制する物質を含有する医薬は、癌の予防および／または治療剤（抗腫瘍剤)特に肺癌の予防および／またが治療剤として使用することができる。

IV．アンチセンス核酸、リボザイム核酸、siRNAおよびその前駆体を含有する医薬
Lengsin遺伝子の転写産物に相補的に結合し、該転写産物からのタンパク質の翻訳を抑制することができる本発明のアンチセンス核酸や、Lengsin遺伝子の転写産物における相同な（もしくは相補的な）塩基配列を標的として該転写産物を切断し得るsiRNA（もしくはリボザイム）、さらに該siRNAの前駆体であるshRNAなど（以下、包括的に「本発明の核酸」という場合がある）は、生体内におけるLengsinの発現を抑制し、腫瘍の増殖抑制活性を示すことから抗腫瘍剤として使用することができる。

本発明の核酸を含有する医薬は低毒性であり、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは非ヒト哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的（例、血管内投与、皮下投与など）に投与することができる。

本発明の核酸を上記の抗腫瘍剤として使用する場合、自体公知の方法に従って製剤化し、投与することができる。即ち、本発明の核酸を、単独あるいは核酸が組み込まれた哺乳動物細胞用の発現ベクターとして投与することができる。当該発現ベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクター（アデノ随伴ウイルスベクター）、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レンチウイルスベクター等のウイルスベクターが挙げられる。すなわち、有効成分である核酸を、発現ベクターに機能可能な態様で挿入した後、常套手段に従って製剤化することができる。
該核酸は、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与することができる。あるいは、エアロゾル化して吸入剤として気管内（患部）に局所投与することもできる。
さらに、体内動態の改良、半減期の長期化、細胞内取り込み効率の改善を目的に、前記核酸を単独またはリポソームなどの担体とともに製剤（注射剤）化し、静脈、皮下等に投与してもよい。具体的には、本発明の薬剤をリポソームなどのリン脂質小胞体に導入し、その小胞体を投与することも可能である。siRNAやshRNAを保持させた小胞体をリポフェクション法により所定の細胞に導入する。そして、得られる細胞を例えば静脈内、動脈内等に全身投与する。また、患部に局所的に投与することもできる。
また、siRNAのキャリアーとして、アテロコラーゲンを用いることもできる。アテロコラーゲンとは、コラーゲン分子をペプシンで消化することによって得られる抗原性のない分子である。生体親和性に富み、生体に投与した場合でも腸炎症を惹起する心配がなく、また生体内で生分解性があり、さらに核酸と相互作用が強いため生体への遺伝子ベクターのキャリアーとして有用であると注目されている（Takeshita F Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Aug 23;102(34):12177-82.）。
また、例えばコレステロールをキャリアーとして用い、化学修飾した２本鎖RNA(修飾siRNA）を静脈投与することにより、目的とする遺伝子の発現を抑制することができる(Soutschek et al., Nature, 432, 173-178, 2004)。

本発明の核酸は、それ自体を投与してもよいし、または適当な医薬組成物として投与してもよい。投与に用いられる医薬組成物としては、本発明の核酸と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものであってよい。このような医薬組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。

非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤、吸入剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。このような注射剤は、公知の方法に従って調製できる。注射剤の調製方法としては、例えば、上記本発明の核酸を通常注射剤に用いられる無菌の水性液、または油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製できる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（polyoxyethylene（50mol）adduct of hydrogenated castor oil）〕等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。直腸投与に用いられる坐剤は、上記核酸を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製されてもよい。気管内投与に用いられる吸入剤は、上記核酸を粉末または溶液として、吸入噴霧剤または担体中に配合し、例えば、定量噴霧式吸入器、ドライパウダー吸入器などの吸入容器を用いて投与することができる。吸入噴射剤としては、当業者に周知のものを使用することができ、例えば１，１，１，２−テトラフルオロエタンなどのフロン系ガス、ＨＦＡ−２２７などの代替フロンガス、プロパンＷなどの炭化水素系ガスなどがあげられる。担体としては、当業者に周知のものを使用でき、糖類、糖アルコール類、アミノ酸類などがあげられ、例えば乳糖、Ｄ−マンニトールなどを用いるとよい。

経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。このような組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。錠剤用の担体、賦形剤としては、例えば、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムが用いられる。

上記の非経口用または経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。このような投薬単位の剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤、吸入剤等が挙げられる。本発明の核酸は、例えば、投薬単位剤形当たり通常5〜500mg、とりわけ注射剤では5〜100mg、その他の剤形では10〜250mg含有されていることが好ましい。

本発明の核酸を含有する上記医薬の投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、癌の治療・予防のために使用する場合には、本発明の核酸を１回量として、通常0.01〜20mg/kg体重程度、好ましくは0.1〜10mg/kg体重程度、さらに好ましくは0.1〜5mg/kg体重程度を、1日1〜5回程度、好ましくは1日1〜3回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。

なお前記した各組成物は、本発明の核酸との配合により好ましくない相互作用を生じない限り適宜他の活性成分を含有してもよい。

V．Lengsinに対する抗体、Lengsinの発現もしくは機能を抑制する低分子化合物等を含有する医薬
Lengsinに対する抗体や、Lengsinの発現もしくは機能を抑制する低分子化合物は、Lengsinの産生または機能を阻害することができる。したがって、これらの物質は、生体内におけるLengsinの発現もしくは機能を抑制するので、癌の予防および／または治療剤として使用することができる。

上記の抗体や低分子化合物を含有する医薬は低毒性であり、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的（例、血管内投与、皮下投与など）に投与することができる。

上記の抗体や低分子化合物は、それ自体を投与してもよいし、または適当な医薬組成物として投与してもよい。投与に用いられる医薬組成物としては、上記の抗体もしくは低分子化合物またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものであってもよい。このような医薬組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。

非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。このような注射剤は、公知の方法に従って調製できる。注射剤の調製方法としては、例えば、上記本発明の抗体または低分子化合物もしくはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性液、または油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製できる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（polyoxyethylene（50mol）adduct of hydrogenated castor oil）〕等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。直腸投与に用いられる坐剤は、上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製されても良い。

上記の非経口用または経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。このような投薬単位の剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤が挙げられる。抗体や低分子化合物は、投薬単位剤形当たり通常5〜500mg、とりわけ注射剤では5〜100mg、その他の剤形では10〜250mg含有されていることが好ましい。

上記の抗体もしくは低分子化合物またはその塩を含有する上記医薬の投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、癌の治療・予防のために使用する場合には、抗体もしくは低分子化合物を1回量として、通常0.01〜20mg/kg体重程度、好ましくは0.1〜10mg/kg体重程度、さらに好ましくは0.1〜5mg/kg体重程度を、1日1〜5回程度、好ましくは1日1〜3回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
なお前記した各組成物は、上記抗体や低分子化合物との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。

上述のLengsinに対するアンチセンス核酸、リボザイム核酸、siRNAおよびその前駆体を含有する医薬や、Lengsinに対する抗体、Lengsinの発現もしくは機能を抑制する低分子化合物等を含有する医薬組成物は、抗腫瘍剤として、癌の治療、予防、または進行防止に用いることができる。すなわち、癌の増殖、転移、癌性腹水もしくは癌性胸水の蓄積を抑制するために用いることができる。癌として具体的には、固形癌、移行上皮癌、肺癌（小細胞癌）、肺癌（非小細胞肺癌）、肺癌（肺扁平上皮癌）等が挙げられる。

上述のLengsinに対するアンチセンス核酸、リボザイム核酸、siRNAおよびその前駆体を含有する医薬や、Lengsinに対する抗体、Lengsinの発現もしくは機能を抑制する低分子化合物等を含有する医薬組成物を癌の治療又は予防に使用する場合には、単独で使用してもよいが、１種又は２種以上の抗癌作用を有する薬剤及び／又は放射線療法と併用してもよい。

併用する薬剤としては、特に限定されるものではないが、例えば、Bevacizumab、Sunitinib、Sorafenib、Erlotinib、Erbitaxなどの血管新生阻害薬、ASA404をはじめとする血管破滅薬、5-FU（フルオロウラシル）、ゲムシタビン、シスプラチン、イリノテカン、カルボプラチン、パクリタキセル等の化学療法剤等が挙げられる。

疾病に対する医薬候補化合物のスクリーニング
上述の通り、Lengsinの発現および／または機能を抑制すると、腫瘍の増殖阻害活性を有する。従って、Lengsinの発現および／または機能を抑制する化合物またはその塩は、癌の予防および／または治療剤（抗腫瘍剤）として使用することができる。

したがって、Lengsinを産生する細胞は、Lengsin（又はLengsin遺伝子）の発現量および／または機能を指標とすることにより、腫瘍の増殖阻害活性を有する物質のスクリーニングのためのツールとして用いることができる。

Lengsinの発現および／または機能を抑制する化合物またはその塩をスクリーニングする場合、該スクリーニング方法は、Lengsinを産生する能力を有する細胞を、被検物質の存在下および非存在下に培養し、両条件下におけるLengsinの発現量および／または機能を比較することを含む。

上記のスクリーニング方法において用いられるLengsinを産生する能力を有する細胞としては、それらを生来発現しているヒトもしくは他の哺乳動物細胞またはそれを含む生体試料（例：血液、組織、臓器等）であれば特に制限はない。非ヒト動物由来の血液、組織、臓器等の場合は、それらを生体から単離して培養してもよいし、あるいは生体自体に被検物質を投与し、一定時間経過後にそれら生体試料を単離してもよい。

また、Lengsinを産生する能力を有する細胞としては、公知慣用の遺伝子工学的手法により作製された各種の形質転換体が例示される。宿主としては、例えば、H4IIE-C3細胞、HepG2細胞、HEK293細胞、COS7細胞、CHO細胞などの動物細胞が好ましく用いられる。
具体的には、LengsinをコードするDNA（即ち、配列番号：１もしくは配列番号：３で表される塩基配列又は該塩基配列に対し相補性を有する塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ配列番号：２もしくは配列番号：４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同質の機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列を含むDNA）を、適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結して宿主動物細胞に導入することにより調製することができる。

Lengsinをコードする遺伝子の調製方法について、以下に説明する。
Lengsinをコードする遺伝子は、通常の遺伝子工学的方法（例えば、Sambrook J., Frisch E. F., Maniatis T.著、モレキュラークローニング第2版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールドスプリングハーバーラボラトリー発行（Cold Spring Harbor Laboratory press）等に記載されている方法）に準じて取得することができる。すなわち、LengsinをコードするDNAは、例えば、配列番号：１もしくは配列番号：３で表される塩基配列に基づいて、適当なオリゴヌクレオチドをプローブもしくはプライマーとして合成し、前記したLengsinを産生する細胞・組織由来のcDNAもしくはcDNAライブラリーから、ハイブリダイゼーション法やPCR法を用いてクローニングすることができる。ハイブリダイゼーションは、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）第２版（上記）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、該ライブラリーに添付された使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。

DNAの塩基配列は、公知のキット、例えば、Mutan^TM-super Express Km（宝酒造（株））、Mutan^TM-K（宝酒造（株））等を用いて、ODA-LA PCR法、Gapped duplex法、Kunkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って変換することができる。

クローン化されたDNAは、目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化するか、リンカーを付加した後に、使用することができる。該DNAはその5’末端側に翻訳開始コドンとしてのATGを有し、また3’末端側には翻訳終止コドンとしてのTAA、TGAまたはTAGを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成DNAアダプターを用いて付加することができる。

次いで、得られたLengsin遺伝子を用いて、通常の遺伝子工学的方法に準じてLengsin (タンパク質）を製造・取得することができる。

例えば、Lengsin遺伝子が宿主細胞中で発現できるようなプラスミドを作製し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、さらに形質転換された宿主細胞（形質転換体）を培養することで得られる培養物からLengsinを取得すればよい。上記プラスミドとしては、例えば、宿主細胞中で複製可能な遺伝情報を含み、自立的に遊走できるものであって、宿主細胞からの単離・精製が容易であり、宿主細胞中で機能可能なプロモーターを有し、検出可能なマーカーをもつ発現ベクターに、Lengsinをコードする遺伝子が導入されたものを好ましく挙げることができる。

尚、発現ベクターとしては、各種のものが市販されている。
例えば、大腸菌での発現に使用される発現ベクターは、ｌａｃ、ｔｒｐ、ｔａｃなどのプロモーターを含む発現ベクターであって、これらはファルマシア社、タカラバイオ等から市販されている。当該発現ベクターにLengsinをコードする遺伝子を導入するために用いられる制限酵素もタカラバイオ等から市販されている。さらなる高発現を導くことが必要な場合には、タンパク質：Lengsinをコードする遺伝子の上流にリボゾーム結合領域を連結してもよい。用いられるリボゾーム結合領域としては、Guarente L.ら（Cell 20, p543）や谷口ら（Genetics of Industrial Microorganisms, p202, 講談社）による報告に記載されたものを挙げることができる。

また、動物細胞発現プラスミド（例：pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo）；λファージなどのバクテリオファージ；レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなどの動物ウイルスベクターなどを用いることもできる。プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMV（サイトメガロウイルス）プロモーター、RSV（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、MoMuLV（モロニーマウス白血病ウイルス）LTR、HSV-TK（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーター、βアクチン遺伝子プロモーター、ａＰ２遺伝子プロモーターなどが用いられる。なかでも、CMVプロモーター、SRαプロモーターなどが好ましい。

発現ベクターとしては、上記の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、SV40複製起点（以下、SV40 oriと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。

選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下、dhfrと略称する場合がある、メソトレキセート（MTX）耐性）、アンピシリン耐性遺伝子（以下、amp^rと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、neo^rと略称する場合がある、G418耐性）等が挙げられる。特に、dhfr遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用い、dhfr遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、チミジンを含まない培地によって目的遺伝子を選択することもできる。

上記したLengsinをコードするDNAを含む発現ベクターで宿主を形質転換することにより、Lengsin発現細胞を製造することができる。
宿主細胞としては、原核生物もしくは真核生物である微生物細胞、昆虫細胞又は哺乳動物細胞等を挙げることができる。哺乳動物細胞としては、例えば、HepG2細胞、HEK293細胞、HeLa細胞、ヒトFL細胞、サルCOS-7細胞、サルVero細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（以下、CHO細胞と略記）、dhfr遺伝子欠損CHO細胞（以下、CHO(dhfr^-)細胞と略記）、マウスL細胞，マウスAtT-20細胞、マウスミエローマ細胞，ラットH4IIE-C3細胞、ラットGH3細胞などが用いられ得る。例えば、Lengsinの大量調製が容易になるという観点では、大腸菌等を好ましく挙げることができる。
前記のようにして得られたプラスミドは、通常の遺伝子工学的方法により前記宿主細胞に導入することができる。形質転換体の培養は、微生物培養、昆虫細胞もしくは哺乳動物細胞の培養に使用される通常の方法によって行うことができる。例えば大腸菌の場合、適当な炭素源、窒素源およびビタミン等の微量栄養物を適宜含む培地中で培養を行う。培養方法としては、固体培養、液体培養のいずれの方法でもよく、好ましくは、通気撹拌培養法等の液体培養を挙げることができる。

形質転換は、リン酸カルシウム共沈殿法、PEG法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法などにより行うことができる。例えば、細胞工学別冊８新細胞工学実験プロトコール，263-267 (1995)（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Virology），52巻，456 (1973)に記載の方法を用いることができる。

上記のようにして得られる形質転換細胞や生来Lengsinを産生する能力を有する哺乳動物細胞または該細胞を含む組織・臓器は、例えば、約5〜20%の胎仔牛血清を含む最小必須培地（MEM）〔Science，122巻,501(1952)〕，ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）〔Virology,8巻,396(1959)〕，RPMI 1640培地〔The Journal of the American Medical Association,199巻,519(1967)〕，199培地〔Proceeding of the Society for the Biological Medicine,73巻,1(1950)〕などの培地中で培養することができる。培地のpHは約6〜8であるのが好ましい。培養は通常約30〜40℃で行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。

Lengsinの取得は、一般の蛋白質の単離・精製に通常使用される方法を組み合わせて実施すればよい。例えば、前記の培養により得られた形質転換体を遠心分離等で集め、該形質転換体を破砕または溶解せしめ、必要であれば蛋白質の可溶化を行い、イオン交換、疎水、ゲルろ過等の各種クロマトグラフィーを用いた工程を単独で、若しくは組み合わせることにより精製すればよい。精製された蛋白質の高次構造を復元する操作をさらに行ってもよい。また、例えば、前記の培養により得られた形質転換体を遠心分離などで除去し、培養上清からLengsinを前記と同様にして精製してもよい。

本発明のスクリーニングを実施するに当たり、被検物質としては、例えばタンパク質、ペプチド、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これらの物質は新規なものであってもよいし、公知のものであってもよい。
また、LengsinもしくはLengsin遺伝子の発現量を低下させる物質、又はLengsinの機能を低下させる物質を選択する際に、被検物質を接触させない対照細胞を比較対照として用いることもできる。ここで「被検物質を接触させない」とは、被検物質の代わりに被検物質と同量の溶媒（ブランク）を添加する場合や、LengsinもしくはLengsin遺伝子の発現量又はLengsinの機能に影響を与えないネガティブコントロール物質を添加する場合も含まれる。

被検物質の上記細胞との接触は、例えば、上記の培地や各種緩衝液（例えば、HEPES緩衝液、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水、トリス塩酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酢酸緩衝液など）の中に被検物質を添加して、細胞を一定時間インキュベートすることにより実施することができる。添加される被検物質の濃度は化合物の種類（溶解度、毒性等）により異なるが、例えば、約0.1nM〜約100μMの範囲で適宜選択される。インキュベート時間としては、例えば、約10分〜約24時間が挙げられる。

Lengsinを産生する細胞が、非ヒト哺乳動物個体の形態で提供される場合、該動物個体の状態は特に制限されないが、例えば、癌細胞を移植したモデルマウス〔例えば、A375SM(ヒト高転移性のメラノーマ細胞)を KSN /Slc nudeマウスの右背部皮下に移植して作成したマウス〕等のモデル動物であってもよい。使用される動物の飼育条件に特に制限はないが、SPFグレード以上の環境下で飼育されたものであることが好ましい。被検物質の該細胞との接触は、該動物個体への被検物質の投与によって行われる。投与経路は特に制限されないが、例えば、静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、皮内投与、腹腔内投与、経口投与、気道内投与、直腸投与等が挙げられる。投与量も特に制限はないが、例えば、１回量として約0.5〜20 mg／kgを、1日1〜5回、好ましくは1日1〜3回、1〜14日間投与することができる。
あるいは、上記のスクリーニング方法は、Lengsinを産生する能力を有する細胞に代えて、該細胞の抽出液、あるいは該細胞から単離精製したLengsinに、被検物質を接触させることにより行うこともできる。

（Lengsin遺伝子又はLengsinの発現量の測定）
本発明は、Lengsinを産生する能力を有する細胞における該タンパク質（遺伝子）の発現を、被検物質の存在下と非存在下で比較することを特徴とする、腫瘍の増殖抑制活性を有する物質のスクリーニング方法を提供する。本方法において用いられる細胞、被検物質の種類、被検物質と細胞との接触の態様などは、上記と同様である。

Lengsinの発現量は、前記したLengsinをコードするDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸、即ち、配列番号：１もしくは配列番号：３で表される塩基配列もしくはそれと相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸（DNA)（以下、「本発明の検出用核酸」という場合がある）を用いて、Lengsin遺伝子のmRNAを検出することにより、RNAレベルで測定することができる。あるいは、該発現量は、前記したLengsinに対する抗体（以下、「本発明の検出用抗体」とい場合がある）を用いて、これらのタンパク質を検出することにより、タンパク質レベルで測定することもできる。
従って、より具体的には、本発明は、
（a）Lengsinを産生する能力を有する細胞を被検物質の存在下および非存在下に培養し、両条件下における該タンパク質をコードするmRNAの量を、本発明の検出用核酸を用いて測定、比較することを特徴とする、腫瘍の増殖抑制活性を有する物質のスクリーニング方法、および
（b）Lengsinを産生する能力を有する細胞を被検物質の存在下および非存在下に培養し、両条件下における該タンパク質の量を、本発明の検出用抗体を用いて測定、比較することを特徴とする、腫瘍の増殖抑制活性を有する物質のスクリーニング方法を提供する。

すなわち、Lengsinの発現量を変化させる物質のスクリーニングは、以下のようにして行うことができる。
（i）正常あるいは疾患（例えば、肺癌などの移植モデルマウス:KSN /Slc nudeマウスの右背部皮下に癌細胞を移植したモデルマウスなど）モデル非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して被検物質を投与し、一定時間経過した後（30分後〜3日後、好ましくは1時間後〜2日後、より好ましくは1時間後〜24時間後）に、血液、あるいは特定の臓器（例えば、肺、レンズ等）、あるいは臓器から単離した組織または細胞を得る。
LengsinのmRNAは、通常の方法により細胞等からmRNAを抽出して定量することができ、あるいは自体公知のノーザンブロット解析により定量することもできる。一方、Lengsinのタンパク質量は、ウェスタンブロット解析や以下に詳述する各種イムノアッセイ法を用いて定量することができる。

（ii）Lengsin遺伝子を発現する細胞（例えば、Lengsinを導入した形質転換体）を上記の方法に従って作製し、常法に従って培養する際に被検物質を培地もしくは緩衝液中に添加し、一定時間インキュベート後（1日後〜7日後、好ましくは1日後〜3日後、より好ましくは2日後〜3日後）、該細胞に含まれるLengsinあるいはそれをコードするmRNAを、上記（i）と同様にして定量、解析することができる。

Lengsin遺伝子（mRNA)の発現レベルの検出及び定量は、前記細胞から調製したRNA又はそれから転写された相補的なポリヌクレオチドを用いて、ノーザンブロット法、RT-PCR法など公知の方法で実施できる。具体的には、Lengsin遺伝子の塩基配列において連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド及び／又はその相補的なポリヌクレオチドをプライマーまたはプローブとして用いることによって、RNA中のLengsin遺伝子の発現の有無やその発現レベルを検出、測定することができる。そのようなプローブもしくはプライマーは、Lengsin遺伝子の塩基配列をもとに、例えばprimer 3（ HYPERLINK http://www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi http://www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi）あるいはベクターNTI（Infomax社製）を利用して設計することができる。

ノーザンブロット法を利用する場合、前記プライマーもしくはプローブを放射性同位元素（32P、33Pなど：RI）や蛍光物質などで標識し、それを、常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーした細胞由来のRNAとハイブリダイズさせた後、形成された前記プライマーもしくはプローブ（DNAまたはRNA）とRNAとの二重鎖を、前記プライマーもしくはプローブの標識物（RI若しくは蛍光物質）に由来するシグナルとして放射線検出器（BAS-1800II、富士フィルム社製）または蛍光検出器で検出、測定する方法を例示することができる。また、AlkPhos Direct Labelling and Detection System (Amersham PharamciaBiotech社製)を用いて、該プロトコールに従って前記プローブを標識し、細胞由来のRNAとハイブリダイズさせた後、前記プローブの標識物に由来するシグナルをマルチバイオイメージャーSTORM860（Amersham Pharmacia Biotech社製）で検出、測定する方法を使用することもできる。

RT-PCR法を利用する場合は、細胞由来のRNAから常法に従ってcDNAを調製して、これを鋳型として標的のLengsin遺伝子の領域が増幅できるように、Lengsin遺伝子の配列に基づき調製した一対のプライマー（上記cDNA（−鎖）に結合する正鎖、＋鎖に結合する逆鎖）をこれとハイブリダイズさせて、常法に従ってRNA法を行い、得られた増幅二本鎖DNAを検出する方法を例示することができる。なお、増幅された二本鎖DNAの検出は、上記RNAを予めRIや蛍光物質で標識しておいたプライマーを用いて行うことによって産生される標識二本鎖DNAを検出する方法、産生された二本鎖DNAを常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーさせて、標識した前記プライマーをプローブとして使用してこれとハイブリダイズさせて検出する方法などを用いることができる。なお、生成された標識二本鎖DNA産物はアジレント2100バイオアナライザ（横河アナリティカルシステムズ社製）などで測定することができる。また、SYBR Green RT-PCR Reagents (Applied Biosystems 社製)で該プロトコールに従ってRT-PCR反応液を調製し、ABI PRIME 7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems 社製)で反応させて、該反応物を検出することもできる。
被検物質を添加した細胞におけるLengsin遺伝子の発現が被検物質を添加しない対照細胞での発現量と比較して2/3倍以下、好ましくは1/2倍以下、更に好ましくは1/3倍以下であれば、該被検物質はLengsin遺伝子の発現抑制物質として選択することができる。
また、Lengsinの発現量を変化させる物質のスクリーニングは、Lengsin遺伝子の発現制御領域を用いたレポーター遺伝子アッセイで行うことも可能である。ここで、「発現制御領域」とは、通常、当該染色体遺伝子の上流数ｋｂから数十ｋｂの範囲を指し、例えば、（i）５’-レース法（5'-RACE法）(例えば、５’full Race Core Kit（タカラバイオ社製）等を用いて実施されうる)、オリゴキャップ法、S1プライマーマッピング等の通常の方法により、５’末端を決定するステップ；（ii）Genome Walker Kit(クローンテック社製)等を用いて５’-上流領域を取得し、得られた上流領域について、プロモーター活性を測定するステップ；を含む手法等により同定することが出来る。

Lengsin遺伝子の発現制御領域を機能可能な形で連結されてなるレポーター遺伝子は、当業者に公知の方法で調製すればよい。すなわち、「Molecular Cloning:A Laboratory Manual 2nd edition」(1989),Cold Spring Harbor Laboratory Press、「Current Protocols In Molecular Biology」(1987),John Wiley & Sons,Inc.等に記載される通常の遺伝子工学的手法に従って切り出されたLengsin遺伝子の発現調節領域を、レポーター遺伝子を含むプラスミド上に組み込むことができる。
レポーター遺伝子としては、グルクロニダーゼ（GUS）、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールトランスアセチラーゼ（CAT）、β-ガラクトシダーゼ及びグリーン蛍光タンパク質（GFP）等が挙げられる。
調製したLengsin遺伝子の発現制御領域を機能可能な形で連結されてなるレポーター遺伝子を、通常の遺伝子工学的手法を用いて、当該レポーター遺伝子を導入する細胞において使用可能なベクターに挿入し、プラスミドを作製し、適当な宿主細胞へ導入することができる。レポーター遺伝子に応じた選抜条件の培地で培養することにより、形質転換細胞を得ることができる。
また、レポーター遺伝子の発現量を測定する方法としては、個々のレポーター遺伝子に応じた方法を利用すればよい。例えば、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を用いる場合には、前記形質転換細胞を数日間培養後、当該細胞の抽出物を得、次いで当該抽出物をルシフェリンおよびＡＴＰと反応させて化学発光させ、その発光強度を測定することによりプロモーター活性を検出することができる。この際、ピッカジーンデュアルキット（登録商標；東洋インキ製）等の市販のルシフェラーゼ反応検出キットを用いることができる。

Lengsinのタンパク質量の測定方法としては、具体的には、例えば、
（i）本発明の検出用抗体と、試料液および標識化されたLengsinとを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化されたタンパク質を検出することにより試料液中のLengsinを定量する方法や、
（ii）試料液と、担体上に不溶化した本発明の検出用抗体および標識化された別の本発明の検出用抗体とを、同時あるいは連続的に反応させた後、不溶化担体上の標識剤の量（活性）を測定することにより、試料液中のLengsinを定量する方法等が挙げられる。

Lengsinのタンパク質発現レベルの検出及び定量は、Lengsinを認識する抗体を用いたウェスタンブロット法等の公知方法に従って定量できる。ウェスタンブロット法は、一次抗体としてLengsinを認識する抗体を用いた後、二次抗体として125Iなどの放射性同位元素、蛍光物質、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）等の酵素等で標識した一次抗体に結合する抗体を用いて標識し、これら標識物質由来のシグナルを放射線測定器（BAI-1800II：富士フィルム社製など）、蛍光検出器などで測定することによって実施できる。また、一次抗体としてLengsinを認識する抗体を用いた後、ECL Plus Western Blotting Detection System（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を利用して該プロトコールに従って検出し、マルチバイオメージャーSTORM860（アマシャムファルマシアバイオテク社製）で測定することもできる。

上記の抗体は、その形態に特に制限はなく、Lengsinを免疫抗原とするポリクローナル抗体であっても、またそのモノクローナル抗体であってもよく、さらにはLengsinを構成するアミノ酸配列のうち少なくとも連続する、通常8アミノ酸、好ましくは15アミノ酸、より好ましくは20アミノ酸からなるポリペプチドに対して抗原結合性を有する抗体を用いることもできる。具体的な抗体として、公開特許公報：第特開２００８−８１４１４号に記載された抗体が挙げられる。
これらの抗体の製造方法は、すでに周知であり、本発明の抗体もこれらの常法に従って製造することができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.12〜11.13）。

上記（ii）の定量法においては、２種の抗体はLengsinの異なる部分を認識するものであることが望ましい。例えば、一方の抗体がLengsinのＮ端部を認識する抗体であれば、他方の抗体として該タンパク質のＣ端部と反応するものを用いることができる。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔¹²⁵I〕、〔¹³¹I〕、〔³H〕、〔¹⁴C〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−（ストレプト）アビジン系を用いることもできる。

本発明の検出用抗体を用いるLengsinの定量法は、特に制限されるべきものではなく、試料液中の抗原量に対応した、抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられる。感度、特異性の点で、例えば、後述するサンドイッチ法を用いるのが好ましい。

抗原あるいは抗体の不溶化にあたっては、物理吸着を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは酵素等を不溶化・固定化するのに用いられる化学結合を用いてもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等があげられる。

サンドイッチ法においては不溶化した本発明の検出用抗体に試料液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した別の本発明の検出用抗体を反応させた（２次反応）後、不溶化担体上の標識剤の量もしくは活性を測定することにより、試料液中のLengsinを定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序で行っても、また、同時に行ってもよいし、時間をずらして行ってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相化抗体あるいは標識化抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。

本発明の検出用抗体は、サンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどにも用いることができる。
競合法では、試料液中のLengsinと標識したLengsinとを抗体に対して競合的に反応させた後、未反応の標識抗原(Ｆ)と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定することにより、試料液中のLengsinを定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、ポリエチレングリコールや前記抗体（１次抗体）に対する２次抗体などを用いてＢ／Ｆ分離を行う液相法、および、１次抗体として固相化抗体を用いるか（直接法）、あるいは１次抗体は可溶性のものを用い、２次抗体として固相化抗体を用いる（間接法）固相化法とが用いられる。

イムノメトリック法では、試料液中のLengsinと固相化したLengsinとを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後、固相と液相を分離するか、あるいは試料液中のLengsinと過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化したLengsinを加えて未反応の標識化抗体を固相に結合させた後、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し試料液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。試料液中のLengsinの量がわずかであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。

これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えてLengsinの測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
例えば、入江寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」 Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A))、同書 Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B))、同書 Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C))、同書 Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Part D: Selected Immunoassays))、同書 Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、同書 Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))（以上、アカデミックプレス社発行）などを参照することができる。
以上のようにして、本発明の検出用抗体を用いることによって、細胞におけるLengsinの量を感度よく定量することができる。

例えば、上記スクリーニング法において、被検物質の存在下におけるLengsinの発現量（mRNA量またはタンパク質量）が、被検物質の非存在下における場合に比べて、約20%以上、好ましくは約30％以上、より好ましくは約50％以上阻害された場合、該被検物質を、Lengsinの発現抑制物質、従って、腫瘍の増殖抑制活性を有する物質の候補として選択することができる。

あるいは、上記スクリーニング法において、Lengsin遺伝子を発現する細胞に代えて、Lengsin遺伝子の内在の転写調節領域の制御下にあるレポーター遺伝子を含む細胞を用いることができる。このような細胞は、Lengsin遺伝子の転写調節領域の制御下にあるレポーター遺伝子（例、ルシフェラーゼ、GFPなど）を導入したトランスジェニック動物の細胞、組織、臓器もしくは個体であってもよい。かかる細胞を用いる場合には、Lengsinの発現量は、レポーター遺伝子の発現レベルを、常法を用いて測定することにより評価することができる。

（Lengsinの機能の測定）
本発明のスクリーニング方法は、被検物質がLengsinの機能を抑制するか否かを指標として行うこともできる。
具体的には、被検物質の存在下及び非存在下に、Lengsinの存在下で生じる生理作用を測定し、被検物質がLengsinの生理作用を抑制するか否かを調べることができる。例えば、被検物質の非存在下における生理作用に比べて、約10％以上、好ましくは約20％以上、より好ましくは約30％以上、更に好ましくは約50％以上阻害された場合に、該被検物質を、Lengsinの機能抑制物質、従って、抗腫瘍活性を有する物質の候補として選択することができる。

上記のスクリーニング方法において、コントロールとして、常法を用いて作製される、Lengsin遺伝子がノックアウトされた細胞を用いることにより、被検物質がLengsin遺伝子を発現していないコントロール細胞において上記機能を示さないことを確認できる。すなわち、上記のスクリーニング方法において得られる腫瘍の増殖抑制活性を有する候補物質の作用機序が、LengsinもしくはLengsin遺伝子の発現抑制又はLengsinの機能抑制に基づくものであることが確認できる。

本発明の上記いずれかのスクリーニング方法を用いて得られる、Lengsinの発現または機能を抑制する物質は、癌の予防および／または治療用に、医薬として有用である。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物を上述の予防・治療剤として使用する場合、上記Lengsinの発現または機能を抑制する低分子化合物と同様に製剤化することができ、同様の投与経路および投与量で、ヒトまたは哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して、経口的にまたは非経口的に投与することができる。

以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。

〔実施例１〕
ヒト癌患者の肺癌組織でのLengsin mRNA発現解析（RT-PCR)
ヒト肺癌および正常組織サンプル、すなわちAdenocarcinomas（肺腺癌）組織サンプル、肺正常組織（肺腺癌患者由来）サンプル、Squamous cell carcinomas（肺扁平上皮癌）組織サンプル、肺正常組織（肺扁平上皮癌患者由来）サンプル、Large cell carcinomas（肺大細胞癌）組織サンプル、肺正常組織（肺大細胞癌患者由来）サンプル、Small cell carcinomas（肺小細胞癌）組織サンプル、肺正常組織（肺小細胞癌患者由来）サンプルからそれぞれRNeasykit(QIAGEN社)を用いて添付のプロトコールに従いトータルRNAを調製した。続いて、トータルRNA1μgをSuperscriptII逆転写キット（Life Technologies社）を用いてキットのプロトコールに従ってmRNAからcDNAを合成した。
合成したcDNA 0.25μlを、ヒトLengsin用primer pairI (センスプライマー)5’-CCCTGCTTTCTGCTTTCATC-3’(配列番号；６),(アンチセンスプライマー)5’-AATAACGCTTTCGGCAGCTA-3’ （配列番号；７）各12pmol、TaqDNA ポリメラーゼ(QIAGEN社)0.1μl、添付バッファー2μl、dNTPmix(2.5mM)1.6μlを含む20μlの反応液を調製した。PCRはまず、94℃で2分間保温し、ついで94℃で15秒間、60℃で30秒間、72℃で30秒間からなる保温サイクルを35回繰り返し、最後に72℃で2分間保温する条件にて実施した。PCR後アガロース電気泳動し、目的のバンド（395bp)を検出した。内部標準としてヒトGAPDHのprimer(センスプライマー)5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC -3’ (配列番号；８), (アンチセンスプライマー)5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3(配列番号；９)を用いて同様の条件でPCRし、アガロース電気泳動し、目的のバンド（452bp)を検出した。
その結果、Lengsin遺伝子はすべてのヒト肺癌組織部にのみで発現しており、ヒト正常組織サンプルでは発現が認められなかった。

〔実施例２〕
ヒト癌組織でのLengsinタンパクの発現(免疫染色）
（ヒトLengsinモノクローナル抗体の取得）
大腸菌発現ベクターpQE30（QIAGEN社）にヒトLengsinをコードするcDNA（配列番号１）を挿入し、大腸菌にHisタグ融合Lengsin蛋白質）を産生させた。続いて大腸菌を超音波によって破砕し、尿素HEPESバッファーに溶解させた。ニッケルNTAアガロースカラムにHisタグ融合リコンビナント蛋白質を結合させた後、イミダゾール添加尿素HEPESバッファーで溶出させた。この溶液をPBSで一晩透析し、変性凝集したリコンビナント蛋白質浮遊液を得た。

続いてこの蛋白浮遊液（約1 mg相当のリコンビナント蛋白質）と完全フロイドアジュバントとをエマルジョンにし、BALB/c miceの皮下に免疫した。２回目以後は不完全フロイドアジュバントとのエマルジョンを１週間おきに全８回免疫した。最終免疫の５日後、マウスの脾臓を摘出し、脾細胞をマウスミエローマ細胞株NS-1と細胞融合させた。HAT選択培養液の中で約１ヶ月培養し、ハイブリドーマコロニーを得た。これらの培養上清を回収し、１次スクリーニングを行った。

１次スクリーニングはELISA法によって、尿素変性リコンビナント蛋白質に反応するハ
イブリドーマを選択した。具体的には、ELISAプレートに尿素変性リコンビナント蛋白質
を固相化し、ハイブリドーマ培養上清を添加。２時間後、洗浄した後に、ペルオキシダー
ゼ標識抗マウス免疫グロブリン抗体を反応させ、洗浄した後にペルオキシダーゼ基質液で
発色させた。得られた陽性ハイブリドーマについて２次スクリーニングを行った。

２次スクリーニングはウエスタンブロッティングによって行った。ヒト細胞株293T細胞（ATCC）と、ヒトLengsinをコードする遺伝子（配列番号１）を導入した細胞株(293T-Len)の細胞溶解液を作成した。SDS電気泳動後、PVDF膜に転写した。この蛋白転写膜にハイブリドーマ培養上清を添加した。洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗マウス免疫グロブリン抗体を反応させ、洗浄した後にペルオキシダーゼ基質液で発色させた。陽性対照として免疫原であるリコンビナント蛋白質を泳動した。リコンビナント蛋白質及び抗原遺伝子導入293T細胞溶解液にLengsin蛋白質の特異的なバンドが検出されたものを陽性と判定した。

３次スクリーニングはホルマリン固定パラフィン包埋切片のヒト病理組織の免疫組織染
色によって行った。ヒト癌組織薄切標本にハイブリドーマ培養上清をそれぞれ添加。洗浄
後、ペルオキシダーゼ標識抗マウス免疫グロブリン抗体を反応させ、洗浄した後にペルオ
キシダーゼ基質液で発色させた。癌細胞が染色されたものを陽性とした。
以上３段階のスクリーニングによって、陽性ハイブリドーマEMRL656を選択した。

このハイブリドーマを限界希釈法によってクローニングし、サブクローンを得た。これ
らサブクローンの培養上清(#517)については、上記の２次スクリーニングと３次スクリーニングを再検し、変性したヒトLengsin蛋白質をそれぞれ特異的に認識することを確認した。
このハイブリドーマ（EMRL656）は、平成18年9月21日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託され、受領番号FERM AP-21033が付与された。
（ヒト癌組織でのLengsinタンパクの免疫染色）

#517モノクローナル抗体を用いてホルマリン固定ヒト組織の免疫組織染色を行った。その手順を以下に示す。
（１）20%ホルマリン固定液で固定されたヒト癌組織（ヒト乳癌組織、ヒト大腸癌組織、ヒト肺癌組織）のパラフィン包埋切片（いずれの組織も札幌医大病院病理部より入手）をエチルアルコールによって脱パラフィン処理した。
（２）抗原賦活化処理として、切片を0.01 mol/Lクエン酸buffer (pH6.0)に浸して、オートクレーブ処理（110℃、5分）した。
（３）一次抗体としてハイブリドーマ培養上清を0.5 ml切片上に滴下し、室温で１時間インキュベーションした。
（４）洗浄液PBS-T (0.05% Tween 20/PBS、pH 7.4)で３回洗浄した。
（５）二次抗体ペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG抗体（シンプルステインMAX-PO、NICHIREI）を切片上に滴下し、室温で30分間インキュベーションした。
（６）洗浄液PBS-T (0.05% Tween 20/PBS、pH 7.4)で３回洗浄した。
（７）切片を過酸化水素水とDAB基質の混合液（シンプルステインMAX-PO、NICHIREI）に浸し、１〜２分間発色反応させた。
（８）切片を流水で１分間洗浄した。
（９）Hematoxylin核染色(1〜2分)を行った。

図２に、ホルマリン固定された各種ヒト肺癌組織標本パラフィン包埋切片の免疫染色例を示す。各標本は肺癌患者より肺癌組織並びに正常組織標本を外科手術の際に取得したものである。#517抗体によって肺癌組織に発現しているLengsin抗原蛋白質が茶色に染色されていることを示している。すなわち、ヒトLengsinに対するモノクローナル抗体を用いた免疫組織染色法によって、ヒトLengsinタンパクがヒト肺癌患者の正常組織には発現しておらず、ヒト肺癌組織にのみ特異的に発現していることがわかる(図２(a))。一方、肝臓、胎盤においてはLengsinタンパクの発現は認められなかった(図２(b))。

〔実施例３〕
ヒト肺癌細胞における、Lengsinのノックダウン及び癌の縮小
（ヒト肺癌細胞でのLengsinの発現抑制）
ヒトLengsinに対するsiRNAは二本鎖のうちの一方の鎖が'5-CCUAAUGCCAGAGUUAUCAACCUUU-3’（配列番号：５）であるものを用いた（配列番号：１の４７８〜５０２に対応）。ネガティブコントロールとしてStealth RNA siRNA Negative control Hi GCを用いた。これらのsiRNAはBLOCK-it tRNAi デザイナーにてデザインした配列でありLife Technologies社により作成されたものである。siRNA 100pmolをLipofectamine2000（Life Technologies社）を用いて添付のプロトコールに従って、ヒト肺癌細胞株である1-89細胞へ導入し、DMEM培養液で37℃48時間培養し、実施例１記載の方法でRT-PCRによるmRNAの発現確認を実施した。さらにsiRNAを導入した細胞から、実施例２で使用したヒトLengsinに対するモノクローナル抗体を用いてウェスタンブロットした。その手順を以下に示す。

（１）1×10⁶の細胞を100 μLの細胞溶解液（RIPA buffer）に溶解し、可溶性分画を
ライゼートとして回収する。ライゼートにSDS sample bufferを加え、100℃５分間加熱処理した。
（２）蛋白試料を7.5% SDSポリアクリルアミドゲルにロードし、電気泳動した。
（３）ゲル中の蛋白質をPVDF膜に転写した。
（４）転写膜を5%スキムミルク・PBSに浸し、約１時間ブロッキングした。
（５）転写膜を一次抗体ハイブリドーマ培養上清に浸し、室温で１時間インキュベーションした。
（６）転写膜を洗浄液PBS-T (0.05% Tween 20/PBS、pH 7.4)で３回洗浄した。
（７）転写膜を二次抗体ペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG抗体に浸し、室温で１時間インキュベーションした。
（８）転写膜を洗浄液PBS-T (0.05% Tween 20/PBS、pH 7.4)で３回洗浄した。
（９）転写膜を過酸化水素水添加DAB発色試薬に浸し、約１分間発色反応させた。

ヒトLengsinに対するsiRNAを導入した細胞は、mRNAおよびタンパクとも顕著に発現が抑制されていた（図3(a)）。

（WST-1アッセイ）
同様の方法でヒトLengsinに対するsiRNAを導入48時間後の細胞を96ウェルプレートに1x10⁴ 個/ウェル巻き込みさらにDMEM培養液で37℃72時間培養した。続いて、WST-1キット(和光純薬社)を用いて添付のプロトコールに従って細胞の生存率を測定した。具体的には各ウェルにWST-1キット10μlを添加し、37℃2時間保温し、450nmの吸光度を測定した（リファレンスは655nm）。各実験は独立でぃて3回実施した。
その結果、ヒトLengsinに対するsiRNAを導入した細胞での生存率がコントロールに比較して顕著に低下していた。(図3(b)(c))

（フローサイトメトリー）
ヒトLengsinに対するsiRNAを導入5日後の細胞をPBSで洗浄したのち、70&エタノールで-20℃で一晩固定した。PBSで洗浄後、250ug/ml RNaseA（Sigma-Aldrich社）で37℃30分処理し、50μg/ml propidium iodide(PI)(Life Technologies社)を添加し、遮光下で4℃10分間処理した。この細胞をフローサイトメトリー（FACS Calibur Becton-Dickinson社）でsub-G1期の細胞数の割合を測定した。その結果、ヒトLengsinに対するsiRNAを導入した細胞はsub-G1期の細胞の割合が増加しており、アポトーシスを起こしている細胞の割合が増加していることが示された。

〔実施例４〕
ヒトLengsinバリアント４の同定
ヒトLengsinには複数のexonが存在することが報告されている（図4(a)。従来のLengsin遺伝子（NM_016571 配列番号１：野生型（wt）と命名）にはexson3は欠失している（図4(b)）。そこでexon3を含むバリアントの存在の有無をRT-PCR法にて検討した。ヒトLengsinバリアント検出用primer pairII(センスプライマー)5’-GGGAGAAACGGATATGTCCA-3’ (配列番号；１０), (アンチセンスプライマー)5’-CAGTCACAGTGAAGGTATCA-3’ (配列番号；１１)を用いた（PCR産物は584bp）

各種のヒト肺癌細胞株（Sq-1,Sq-19:Squamous cell carcinomas（肺扁平上皮癌）細胞株、LNY1,A549,LHK2,1-87,11-18：Adenocarcinomas（肺腺癌）細胞株、86-2: Large cell carcinomas（肺大細胞癌）細胞株、S2,Lu65,Lc817,LK79：Small cell carcinomas（肺小細胞癌）細胞株）での遺伝子発現を実施例１に記載の方法にて検討した。
その結果、多くの肺癌細胞株で、従来のwt以外にexon3を含むバリアント4(配列番号３)が高発現していることが示された（図4(c)（d））。

本発明のLengsin又はLengsin遺伝子の発現を抑制する物質は、癌の治療又は予防薬として有用である。また、本発明のスクリーニング方法は、癌の治療又は予防薬の候補物質を探索するために有用である。また、本発明の診断方法は、肺癌患者の診断方法として有用である。

Claims

Lengsinの発現を抑制する物質を有効成分として含有する、抗腫瘍剤。
Lengsinの発現を抑制する物質が、以下の（１）〜（３）からなる群より選択される物質である、請求項１に記載の剤：
（１）Lengsinをコードする遺伝子の転写産物に対するアンチセンス核酸、
（２）Lengsinをコードする遺伝子の転写産物に対するリボザイム核酸、
（３）Lengsinをコードする遺伝子の転写産物に対してRNAi活性を有する核酸もしくはその前駆体。
Lengsinが、以下の（ａ）〜（ｅ）から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項１又は２に記載の剤：
（ａ）配列番号２又は配列番号４で示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２又は配列番号４で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加、挿入もしくは置換されたアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号２又は配列番号４で示されるアミノ酸配列と80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号１又は配列番号３で示される塩基配列を有するDNAによりコードされるアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号１又は配列番号３で示される塩基配列を有するDNAに対し相補性を有するDNAと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるアミノ酸配列、
但し（ｂ）〜（ｅ）のアミノ酸配列を有するタンパク質は、配列番号２又は配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質を特異的に認識する抗体によって認識され得る。
肺癌治療剤である、請求項１〜３のいずれかに記載の剤。
Lengsin又はLengsinをコードする遺伝子の発現量を低下させる化合物を選択することを特徴とする、抗腫瘍剤のスクリーニング方法。
以下の（１）〜（３）の工程を含む、請求項５に記載のスクリーニング方法：
（１）Lengsinをコードする遺伝子もしくはLengsinをコードする遺伝子の転写調節領域の制御下にあるレポーター遺伝子を発現する細胞に、被検物質を接触させる工程、
（２）前記細胞におけるLengsinをコードする遺伝子もしくはレポーター遺伝子の発現量を測定する工程、及び
（３）被検物質の非存在下において測定した場合と比較して、発現量を低下させる化合物を抗腫瘍剤の候補として選択する工程。
配列番号５に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
二重鎖RNA部分の一方の鎖が、配列番号５に記載の塩基配列からなる、siRNA。
３’末端に２〜４塩基のオーバーハングが付加されていることを特徴とする、請求項８に記載のsiRNA。
少なくとも１つの塩基が化学的に修飾されている請求項８又は９に記載のsiRNA。
少なくとも１つのホスホジエステル結合が化学的に修飾されている請求項８〜１０
のいずれかに記載のsiRNA。
請求項８〜１１いずれかに記載のsiRNAを有効成分として含有する抗腫瘍剤。