JPWO2008111520A1 - 寿命延長関連遺伝子およびその用途 - Google Patents

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Abstract

本発明は、WDR6の発現もしくは活性を抑制する物質、好ましくは、(a) WDR6をコードする核酸に対するアンチセンス核酸、(b) WDR6に対する中和抗体、(c) WDR6に対してアンタゴニスト活性を示す低分子化合物を含有してなる、インスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用増強剤を提供する。本発明はまた、WDR6もしくはその部分ペプチドまたはそれを発現する細胞を試験化合物と接触させ、WDR6もしくはその部分ペプチドの発現もしくは活性を変化させる化合物を選択する、インスリン/IGF-１シグナル伝達系の作用を調節する物質のスクリーニング方法を提供する。

Description

本発明は、寿命延長に関連する遺伝子およびその創薬ターゲットとしての用途に関する。より詳細には、本発明は、寿命延長モデルの視床下部で低発現するWDR6をターゲットとする抗老化薬および生活習慣病、癌、神経変性疾患等の予防・治療薬、並びに該薬剤のスクリーニングに関する。本発明はまた、摂食後と比較して絶食後に視床下部での発現が増加する遺伝子および絶食後に脳の他の部位と比較して視床下部での発現が増加する遺伝子、並びにそれらの用途に関する。
不老長寿は人類にとって永遠のテーマである。老化のメカニズム解明のための分子生物学的アプローチとして、長寿命変異動物を用いた寿命延長メカニズムの解析が精力的に行われている。例えば、線虫やショウジョウバエの長寿命変異種の解析から、インスリン/インスリン様成長因子 (IGF-1) シグナル伝達系が寿命延長に関連することが明らかとなった。哺乳動物でも、IGF-1受容体ノックアウトマウスで寿命が延長することが報告されている (非特許文献１)。また、下垂体成長ホルモン (GH) 欠損マウスやGH受容体ノックアウトマウスでも寿命の延長が認められるが (非特許文献２、３)、これらのマウスでは血中IGF-1レベルが低下している。本発明者らは以前、GHのアンチセンス遺伝子を導入したトランスジェニックラット (GH-IGF-1抑制ラット) のヘテロ接合体において、やはり寿命が延長することを報告している (非特許文献４)。
一方、ヒトを含む種々の動物において、生活習慣病、癌、アルツハイマー病等の神経変性疾患などの老化に伴う疾患の発症遅延や寿命延長を引き起こす、最も確実な介入方法として、カロリー制限 (CR) が以前から知られていた。CRモデルにおいても血中のインスリンおよびIGF-1レベルが低下することから、CRの効果の一部は、インスリンおよびGH-IGF-1シグナル伝達系を介して発揮されることが示唆されているが、その詳細な分子メカニズムは未だ不明である。本発明者らは、前記GH-IGF-1抑制ラットに対するCRの解析から、CRの寿命延長効果は、部分的にはGH-IGF-1軸の抑制以外のメカニズムを介して発揮されていることを示した（非特許文献４）。
ヒトにCRを行うことは忍耐を要することから困難であるが、糖尿病患者やメタボリックシンドローム等の代謝疾患をもつ患者においては症状の抑制やQOL改善のためにCRは必須である。従って、精神的苦痛を伴うことなくCRと同様の効果をもたらし得るCR模倣物(CR mimetics) を開発することは病気を未然に防ぐことや進行を抑制させる点から、産業的に非常に大きなインパクトを有していると考えられる。しかしながら、これまでそのような物質の手がかりは限られていた。
ホルツェンベルガー (Holzenerger, M.) ら, 「ネイチャー (Nature)」, (英国), 2003年, 第421巻, p. 182-187 ブラウン-ボーグ (Brown-Borg, H.M.) ら, 「ネイチャー (Nature)」, (英国), 1996年, 第384巻, p. 33 コシガノ (Coschigano, K.T.) ら, 「エンドクリノロジー (Endocrinology)」, (米国), 2000年, 第141巻, p. 2608-2613 下川 (Shimokawa, I.) ら, 「ザ・ファセブ・ジャーナル (FASEB J.)」, (米国), 2003年, 第17巻, p. 1108-1109
したがって、本発明の目的は、CRと同様の効果をもたらし得るCR模倣物のターゲット分子を同定し、それを用いてCR模倣物、ひいては抗老化薬および生活習慣病、癌、神経変性疾患等の予防・治療薬を提供することである。
上記の課題を解決するために、本発明者らはまず、摂食や代謝に重要な役割を持ついくつかの神経核が集合して組織化されている視床下部に着目し、食餌制限による該組織における遺伝子発現の変動を調べた。即ち、ラット脳の各部位のcDNAライブラリーを調製し、遺伝子サブトラクション法を用いて、摂食後と比較して絶食後に視床下部での発現が増加する遺伝子 (以下、単に「絶食誘導性遺伝子」という場合もある)と、絶食後に脳の他の部位 (大脳皮質、小脳および海馬) と比較して視床下部での発現が増加する遺伝子 (以下、単に「視床下部特異的遺伝子」という場合もある) とを探索した。その結果、ラット視床下部における絶食誘導性遺伝子として4つの遺伝子 (E2D3、PKAb、EAAC1、Fth1) を、また、絶食後における視床下部特異的遺伝子として4つの遺伝子 (WDR6、ASS、BF396681、BF394337) をそれぞれ同定することに成功した。これらの遺伝子の大部分は、神経細胞障害を誘導する種々のストレスに対する防御反応に重要な遺伝子であった。
これまで配列のみが報告されていたWD repeat protein 6 (WDR6) について、さらに解析を進めた結果、この分子は視床下部において遺伝子およびタンパク質の発現が高く、ラット脳においてインスリン受容体基質-4 (IRS-4) と結合することを明らかにした。さらに、本発明者らは、長寿命を示すCRラットおよび前記GH-IGF-I抑制ラットのヘテロ接合体(tg/-) の視床下部弓状核において、WDR6の遺伝子発現が減少していることを見出した。また、インスリン/IGF-1の投与により、マウス視床下部由来細胞株においてWDR6の発現は上昇した。
一方、肥満・糖尿病モデルであるZucker obeseラットでは、正常のleanラットと比較して肝臓におけるWDR6の発現が低下しており、CRを実施することによりobese、leanとも肝臓でのWDR6の発現が上昇した。また、視床下部球状核においてもZucker obeseラットは、正常のleanラットと比較してWDR6の発現が低下していた。
これらの知見は、WDR6が、インスリン/IGF-1シグナル伝達系において、IRS-4のリン酸化調節を介してインスリンシグナルを負に制御する分子であることを支持している。本発明者らは、上記の知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、
［１］WDR6の発現もしくは活性を抑制する物質を含有してなる医薬または動物薬、
［２］WDR6の発現もしくは活性を抑制する物質が下記(a)〜(c)から選ばれる、上記［１］記載の医薬または動物薬、
(a) WDR6をコードする核酸に対するアンチセンス核酸
(b) WDR6に対する中和抗体
(c) WDR6に対してアンタゴニスト活性を示す低分子化合物
［３］インスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用増強剤である、上記［１］または［２］記載の医薬または動物薬、
［４］インスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用がIRS-4の介在するものである、上記［３］記載の医薬または動物薬、
［５］インスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用が、神経細胞保護、摂食抑制、糖代謝促進、脂肪酸合成促進、脂肪分解抑制、糖の細胞内取り込み、アポトーシス抑制、細胞増殖促進および細胞分化促進からなる群より選択される１以上である、上記［３］記載の医薬または動物薬、
［６］老化、神経変性疾患、摂食障害および代謝疾患からなる群より選択される病態または疾患の予防または改善/治療剤である、上記［１］〜［５］のいずれかに記載の医薬または動物薬、
［７］WDR6の発現もしくは活性を抑制する物質を含有してなる食品または飼料、
［８］WDR6の発現もしくは活性を抑制する物質が下記(a)〜(c)から選ばれる、上記［７］記載の食品または飼料、
(a) WDR6をコードする核酸に対するアンチセンス核酸
(b) WDR6に対する中和抗体
(c) WDR6に対してアンタゴニスト活性を示す低分子化合物
［９］WDR6の発現もしくは活性を増強する物質を含有してなる医薬または動物薬、
［１０］WDR6の発現もしくは活性を増強する物質が下記(a)〜(d)から選ばれる、上記［９］記載の医薬または動物薬、
(a) WDR6またはその部分ペプチド
(b) WDR6またはその部分ペプチドをコードする核酸
(c) WDR6に対するアゴニスト抗体
(c) WDR6に対してアゴニスト活性を示す低分子化合物
［１１］インスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用抑制剤である、上記［９］または［１０］記載の医薬または動物薬、
［１２］インスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用が、摂食抑制、糖代謝促進、脂肪酸合成促進、脂肪分解抑制、アポトーシス抑制、細胞増殖促進および細胞分化促進からなる群より選択される１以上である、上記［１１］記載の医薬または動物薬、
［１３］摂食障害、代謝疾患、癌および自己免疫疾患からなる群より選択される疾患の予防または治療剤である、上記［９］〜［１２］のいずれかに記載の医薬または動物薬、
［１４］WDR6に対する抗体またはWDR6をコードする塩基配列もしくはその一部を含む核酸を含有してなる、インスリン/IGF-1シグナル伝達系の異常の診断剤、
［１５］WDR6もしくはその部分ペプチドを用いることを特徴とする、インスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用を調節する物質のスクリーニング方法、
［１６］インスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用がIRS-4の介在するものである、上記［１５］記載の方法、
［１７］インスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用が、神経細胞保護、摂食抑制、糖代謝促進、脂肪酸合成促進、脂肪分解抑制、糖の細胞内取り込み、アポトーシス抑制、細胞増殖促進および細胞分化促進からなる群より選択される、上記［１５］記載の方法、
［１８］老化、神経変性疾患、摂食障害、代謝疾患、癌および自己免疫疾患からなる群より選択される病態または疾患の予防または改善/治療活性を有する物質を選択するための、上記［１５］〜［１７］のいずれかに記載の方法、
［１９］WDR6もしくはその部分ペプチドがそれを産生する細胞の形態で提供されることを特徴とする、上記［１５］〜［１８］のいずれかに記載の方法、
［２０］WDR6を産生する細胞がそれを含む動物組織、臓器または個体の形態で提供されることを特徴とする、上記［１９］記載の方法、
［２１］下記(a)〜(d)の工程を含む、上記［１５］〜［２０］のいずれかに記載の方法、
(a) WDR6もしくはその部分ペプチドまたはそれを発現する細胞を被験物質と接触させる工程
(b) WDR6もしくはその部分ペプチドの発現もしくは活性を測定する工程
(c) 被験物質の非存在下におけるWDR6もしくはその部分ペプチドの発現もしくは活性と比較する工程
(d) 被験物質の存在下でのWDR6もしくはその部分ペプチドの発現もしくは活性が、被験物質の非存在下と比較して有意に変化した場合に、該被験物質をインスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用を調節する物質として選択する工程
［２２］WDR6をコードする塩基配列もしくはその一部を含む核酸、あるいはWDR6に対する抗体をさらに用いることを特徴とする、上記［１９］または［２０］記載の方法、
［２３］IRS-4もしくはその部分ペプチドをさらに用いることを特徴とする、上記［１５］〜［２２］のいずれかに記載の方法、
［２４］WDR6もしくはその部分ペプチドの活性が、IRS-4もしくはその部分ペプチドとの結合性またはIRS-4もしくはその部分ペプチドのリン酸化の程度を指標として測定される、上記［２３］記載の方法、
［２５］WDR6の発現もしくは活性を抑制する物質の有効量を動物に投与することを含む、該動物におけるインスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用を増強する方法、
［２６］WDR6の発現もしくは活性を増強する物質の有効量を動物に投与することを含む、該動物におけるインスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用を抑制する方法、
［２７］投与が中枢もしくは末梢への局所投与である、上記［２５］または［２６］記載の方法、および
［２８］被験物質を動物に投与し、該動物の視床下部における、E2D3、PKCβ、EAAC1、Fth1およびASSからなる群より選択される１以上の遺伝子、並びに／あるいは配列番号：１３で表される塩基配列を含む核酸および／または配列番号：１４で表される塩基配列を含む核酸の発現を調べることを含む、該物質の神経細胞保護作用の評価方法、
などを提供する。
WDR6はIRS-4との相互作用を介してインスリン/IGF-1シグナルを負に調節しているので、中枢におけるWDR6の発現および／または活性を抑制することにより、摂食を抑制したり、神経保護作用を増強したりすることができ、老化を防止し、肥満、糖尿病などの代謝疾患をはじめとする生活習慣病、摂食障害あるいは神経変性疾患を予防・治療等することができる。また、肝臓などの末梢におけるWDR6の発現および／または活性を抑制することにより、糖新生抑制、脂肪酸合成亢進などの効果を得ることができ、インスリン抵抗性を改善したりすることができる。一方、WDR6の発現および／または活性を増強することにより、食欲を増進したり、脂肪酸合成を抑制したり、あるいはアポトーシスを促進、細胞増殖・分化を抑制することができるので、摂食障害や脂肪代謝異常が関与する代謝疾患、癌、自己免疫疾患などを予防・治療することができる。さらに、WDR6および必要に応じてIRS-4を用いることにより、インスリン/IGF-1シグナルの作用を調節し得る物質、ひいては上記疾患の予防・治療薬を探索することができる。
本発明で得られた他の視床下部特異的遺伝子および絶食誘導性遺伝子は、神経細胞死に対する保護作用があることが考えられる。これらの遺伝子の発現変化をマーカーとした神経変性疾患に対する治療薬等の評価を行うことができる。
48時間絶食後にラット視床下部において発現が上昇した遺伝子群を示す図である。β-actinは内部標準。 48時間絶食後の視床下部において大脳皮質、海馬、小脳と比較して発現が高い遺伝子群を示す図である。β-actinは内部標準。 ラット脳由来タンパク質をもちいた免疫沈降法によるIRS-4とWDR6の結合解析の結果を示す図である。lys：粗抽出物、IgG：免疫グロブリン（ネガティブコントロール）、IP：免疫沈降、IB：免疫ブロット。 IRS-4とWDR6の結合とIRS-4のリン酸化の関係を示す図である。*、**はリン酸化により移動度が変化したIRS-4のバンドを示す。lys：粗抽出物、WDR6:IP：WDR6による免疫沈降。 CRおよびGH/IGF-I抑制ラット視床下部弓状核におけるWDR6遺伝子発現変化を示す図である。-/-：対照Wistar rat、tg/-：成長ホルモンアンチセンストランスジェニックラット（ヘテロ接合体）。CR1は給餌後、CR2は給餌前に屠殺しサンプルを調整した。 レプチン脳室内投与によるWDR6の遺伝子発現変化を示す図である。 マウス視床下部由来GT1-7細胞株におけるIGF-I(10ng/ml)およびinsulin(50μg/ml)投与によるWDR6遺伝子発現変化を示す図である。左から投与後0、0.5、1および2時間。 Zuckerラット肝臓におけるWDR6遺伝子発現とCRの影響を示す図である。Zucker lean ラット：+/+、Zucker obeseラット：fa/fa。CR1は給餌後、CR2は給餌前に屠殺しサンプルを調整した。 Zuckerラット視床下部弓状核におけるWRD6遺伝子発現を示す図である。Zucker lean ラット：+/+、Zucker obeseラット：fa/fa。摂食後ラットとしては、自由摂食ラット、絶食後ラットとしては、絶食後２４時間のラットを用いた。
本発明におけるWDR6蛋白質は、配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質である。
WDR6は、例えば、温血動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー、トリなど）の細胞［例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞など］、あるいはそれらの細胞が存在するあらゆる組織もしくは臓器［例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆嚢、骨髄、副腎、皮膚、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、脂肪組織（例、褐色脂肪組織、白色脂肪組織）、骨格筋など］等から単離・精製される蛋白質であってもよい。また、化学合成もしくは無細胞翻訳系で生化学的に合成された蛋白質であってもよいし、あるいは上記アミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸を導入された形質転換体から産生される組換え蛋白質であってもよい。
配列番号：２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：２で表されるアミノ酸配列と約60％以上、好ましくは約70％以上、さらに好ましくは約80％以上、特に好ましくは約90％以上、最も好ましくは約95％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。ここで「相同性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸および類似アミノ酸残基の割合（％）を意味する。「類似アミノ酸」とは物理化学的性質において類似したアミノ酸を意味し、例えば、芳香族アミノ酸（Phe、Trp、Tyr）、脂肪族アミノ酸（Ala、Leu、Ile、Val）、極性アミノ酸（Gln、Asn）、塩基性アミノ酸（Lys、Arg、His）、酸性アミノ酸（Glu、Asp）、水酸基を有するアミノ酸（Ser、Thr）、側鎖の小さいアミノ酸（Gly、Ala、Ser、Thr、Met）などの同じグループに分類されるアミノ酸が挙げられる。このような類似アミノ酸による置換は蛋白質の表現型に変化をもたらさない（即ち、保存的アミノ酸置換である）ことが予測される。保存的アミノ酸置換の具体例は当該技術分野で周知であり、種々の文献に記載されている（例えば、Bowieら，Science, 247：1306-1310 (1990)を参照）。
本明細書におけるアミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値=10；ギャップを許す；マトリクス=BLOSUM62；フィルタリング=OFF）にて計算することができる。アミノ酸配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、例えば、Karlinら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90： 5873-5877 (1993)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはNBLASTおよびXBLASTプログラム（version 2.0）に組み込まれている（Altschulら, Nucleic Acids Res., 25： 3389-3402 (1997)）］、Needlemanら, J. Mol. Biol., 48： 444-453 (1970)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラムに組み込まれている］、MyersおよびMiller, CABIOS, 4: 11-17 (1988)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはCGC配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム（version 2.0）に組み込まれている］、Pearsonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-2448 (1988)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のFASTAプログラムに組み込まれている］等が挙げられ、それらも同様に好ましく用いられ得る。
より好ましくは、配列番号：２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とは、配列番号：２で表されるアミノ酸配列と約60％以上、好ましくは約70％以上、さらに好ましくは約80％以上、特に好ましくは約90％以上、最も好ましくは約95％以上の同一性を有するアミノ酸配列である。
配列番号：２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質としては、例えば、前記の配列番号：２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含み、配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。ここで「活性」とは、IRS-4との結合活性および該分子のリン酸化制御活性などをいう。「実質的に同質」とは、それらの活性が定性的（例えば、生理学的または薬理学的）に同じであることを示す。したがって、IRS-4との結合活性および該分子のリン酸化制御活性などの活性は同等であることが好ましいが、これらの活性の程度（例えば、約0.1〜約10培、好ましくは約0.5〜約2倍）や蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
IRS-4との結合活性および該分子のリン酸化制御活性の測定は、自体公知の方法に準じて行なうことができるが、例えば、後述する方法等に従って行うことができる。
また、本発明のWDR6には、例えば、(1)配列番号：２で表されるアミノ酸配列のうち1または2個以上（好ましくは、1〜100個程度、好ましくは1〜50個程度、さらに好ましくは1〜10個程度、特に好ましくは1〜数（2、3、4もしくは5）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、(2)配列番号：２で表されるアミノ酸配列に1または2個以上（好ましくは、1〜100個程度、好ましくは1〜50個程度、さらに好ましくは1〜10個程度、特に好ましくは1〜数（2、3、4もしくは5）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、(3)配列番号：２で表されるアミノ酸配列に1または2個以上（好ましくは、1〜50個程度、好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは1〜数（2、3、4もしくは5）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、(4)配列番号：２で表されるアミノ酸配列のうち1または2個以上（好ましくは、1〜50個程度、好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは1〜数（2、3、4もしくは5）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または(5)それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有する蛋白質なども含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置は、蛋白質の活性が保持される限り特に限定されない。
本発明のWDR6は、好ましくは、配列番号：２で表されるアミノ酸配列を有するヒトWDR6蛋白質（GenBankアクセッション番号：AAF80244）、あるいは他の哺乳動物におけるそのホモログ［例えば、GenBankにそれぞれアクセッション番号AAK31166およびXP_516448として登録されているマウスおよびチンパンジーホモログ等］である。
本明細書において、蛋白質およびペプチドは、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）で記載される。配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質をはじめとする、本発明のWDR6は、Ｃ末端がカルボキシル基（-COOH）、カルボキシレート(-COO-）、アミド（-CONH2）またはエステル（-COOR）の何れであってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチルなどのC1-6アルキル基；例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのC3-8シクロアルキル基；例えば、フェニル、α-ナフチルなどのC6-12アリール基；例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−C1-2アルキル基；α−ナフチルメチルなどのα-ナフチル−C1-2アルキル基などのC7-14アラルキル基；ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
本発明のWDR6がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明の蛋白質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明のWDR6には、Ｎ末端のアミノ酸残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのC1-6アルカノイルなどのC1-6アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成し得るＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば-OH、-SH、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのC1-6アルカノイル基などのC1-6アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる。
WDR6の部分ペプチド（以下、単に「本発明の部分ペプチド」と略称する場合もある）は、上記したWDR6の部分アミノ酸配列を有するペプチドであり、且つWDR6と実質的に同質の活性を有する限り、何れのものであってもよい。ここで「実質的に同質の活性」とは上記と同意義を示す。また、「実質的に同質の活性」の測定はWDR6の場合と同様に行なうことができる。
具体的には、本発明の部分ペプチドとして、例えば、配列番号：２で表されるアミノ酸配列のうち、IRS-4との結合に関わる領域（例えばヒトWDR6の場合、例えば配列番号：２で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号114-142、155-188、207-237、256-284、296-326、611-641、772-815、857-892、908-945、978-1011、1043-1072で示される、いわゆるWD-repeatsの全部または一部など）およびIRS-4のリン酸化制御に関わる領域（例えばヒトWDR6の場合、例えば配列番号：２で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号498-518、729-756で示される、Protein phosphatase 2A regulatory subunit PR55 signatureと相同性を有する領域など）を含む部分アミノ酸配列を有するものなどが用いられる。本発明の部分ペプチドは、上記のIRS-4との結合に関与する領域とIRS-4のリン酸化制御に関与する領域を含む限りそのサイズに特に制限はないが、好ましくは300個以上の部分アミノ酸配列を含むもの、より好ましくは500個以上の部分アミノ酸配列を含むものが挙げられる。該部分アミノ酸配列は一個の連続した部分アミノ酸配列であってもよく、あるいは不連続な複数の部分アミノ酸配列が連結されたものであってもよい。
一方、WDR6の部分アミノ酸配列を含むがWDR6と実質的に同質の活性を有しないペプチド、例えば、配列番号：２で表されるアミノ酸配列のうち、IRS-4との結合に関与する領域を含むが、リン酸化制御に関与する領域を含まない部分アミノ酸配列を有するものなどは、「本発明の部分ペプチド」には含まれない。しかしながら、かかるペプチドは、IRS-4と結合することによりWDR6を介したインスリン/IGF-1シグナル伝達作用の抑制を遮断することができるので、該シグナル伝達作用を促進したい場合等に有用であり得る。
また、本発明の部分ペプチドはＣ末端がカルボキシル基（-COOH）、カルボキシレート（-COO-）、アミド（-CONH2）またはエステル（-COOR）の何れであってもよい。ここでエステルにおけるＲとしては、WDR6について前記したと同様のものが挙げられる。本発明の部分ペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明の部分ペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば、Ｃ末端のエステルと同様のものなどが用いられる。
さらに、本発明の部分ペプチドには、上記したWDR6と同様に、Ｎ末端のアミノ酸残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
本発明で用いられるWDR6またはその部分ペプチドは塩の形態であってもよい。例えば、生理学的に許容される酸（例：無機酸、有機酸）や塩基（例：アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
WDR6は、前述した哺乳動物の細胞または組織から自体公知の蛋白質の精製方法によって製造することができる。具体的には、哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズし、低速遠心により細胞デブリスを除去した後、上清を高速遠心して細胞膜含有画分を沈澱させ（必要に応じて密度勾配遠心などにより細胞膜画分を精製し）、該画分を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー等に付すことによりWDR6またはその塩を調製することができる。
WDR6またはその部分ペプチドは、公知のペプチド合成法に従って製造することもできる（以下、これらの化学合成の説明においては、特にことわらない限り、WDR6およびその部分ペプチドを包括して、単にWDR6という）。
ペプチド合成法は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれであってもよい。WDR6を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合し、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的とする蛋白質を製造することができる。
ここで、縮合や保護基の脱離は、自体公知の方法、例えば、以下の(1)および(2)に記載された方法に従って行われる。
(1) M. BodanszkyおよびM.A. Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966年)
(2) SchroederおよびLuebke, The Peptide, Academic Press, New York (1965年)
このようにして得られたWDR6は、公知の精製法により精製単離することができる。ここで、精製法としては、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶、これらの組み合わせなどが挙げられる。
上記方法で得られるWDR6が遊離体である場合には、該遊離体を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆にWDR6が塩として得られた場合には、該塩を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
WDR6の合成には、通常市販の蛋白質合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、4-ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、4-メチルベンズヒドリルアミン樹脂、PAM樹脂、4-ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、4-(2’,4’-ジメトキシフェニル-ヒドロキシメチル)フェノキシ樹脂、4-(2’,4’-ジメトキシフェニル-Fmocアミノエチル)フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、α-アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするWDR6の配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂から蛋白質等を切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のWDR6またはそのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、蛋白質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、DCC、N,N’-ジイソプロピルカルボジイミド、N-エチル-N’-(3-ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、HOBt、HOOBt)とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するか、または、対称酸無水物またはHOBtエステルあるいはHOOBtエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒は、蛋白質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、N,N-ジメチルホルムアミド，N,N-ジメチルアセトアミド，N-メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジンなどのアミン類，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度は蛋白質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約-20℃〜50℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常1.5〜4倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することができる。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Z、Boc、ターシャリーペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、4-メトキシベンジルオキシカルボニル、Cl-Z、Br-Z、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、2-ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Fmocなどが用いられる。
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ターシャリーブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、2-アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、4-ニトロベンジルエステル、4-メトキシベンジルエステル、4-クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ターシャリーブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、t-ブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Bzl、Cl2-Bzl、2-ニトロベンジル、Br-Z、ターシャリーブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Tos、4-メトキシ-2,3,6-トリメチルベンゼンスルホニル、DNP、ベンジルオキシメチル、Bum、Boc、Trt、Fmocなどが用いられる。
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Pd-黒あるいはPd-炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約-20℃〜40℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、1,4-ブタンジチオール、1,2-エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる2,4-ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の1,2-エタンジチオール、1,4-ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、2,4,5-トリクロロフェノール、2,4-ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、HONB、N-ヒドロキシスクシミド、N-ヒドロキシフタルイミド、HOBt）とのエステル〕などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
WDR6のアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα-カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα-アミノ基の保護基のみを除いた蛋白質（ペプチド）とＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去した蛋白質（ペプチド）とを製造し、この両蛋白質（ペプチド）を上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護蛋白質（保護ペプチド）を精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗蛋白質（粗ペプチド）を得ることができる。この粗蛋白質（粗ペプチド）は既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のWDR6のアミド体を得ることができる。
WDR6のエステル体は、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα-カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、上記WDR6のアミド体の場合と同様にして得ることができる。
本発明の部分ペプチドは、WDR6の全長蛋白質を適当なペプチダーゼで切断することによっても製造することができる。
さらに、WDR6は、それをコードする核酸を含有する形質転換体を培養し、得られる培養物からWDR6を分離精製することによって製造することもできる。WDR6またはその部分ペプチドをコードする核酸はDNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA/RNAキメラであってもよい。好ましくはDNAが挙げられる。また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖DNA、二本鎖RNAまたはDNA:RNAのハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（即ち、コード鎖）であっても、アンチセンス鎖（即ち、非コード鎖）であってもよい。
WDR6またはその部分ペプチドをコードするDNAとしては、ゲノムDNA、温血動物（例えば、ヒト、ウシ、サル、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、モルモット、ラット、マウス、ウサギ、ハムスター、トリなど）のあらゆる細胞［例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞など］もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織［例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆嚢、骨髄、副腎、皮膚、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、脂肪組織（例、褐色脂肪組織、白色脂肪組織）、骨格筋など］由来のcDNA、合成DNAなどが挙げられる。WDR6またはその部分ペプチドをコードするゲノムDNAおよびcDNAは、上記した細胞・組織より調製したゲノムDNA画分および全RNAもしくはmRNA画分をそれぞれ鋳型として用い、Polymerase Chain Reaction（以下、「PCR法」と略称する）およびReverse Transcriptase-PCR（以下、「RT-PCR法」と略称する）によって直接増幅することもできる。あるいは、WDR6またはその部分ペプチドをコードするゲノムDNAおよびcDNAは、上記した細胞・組織より調製したゲノムDNAおよび全RNAもしくはmRNAの断片を適当なベクター中に挿入して調製されるゲノムDNAライブラリーおよびcDNAライブラリーから、コロニーもしくはプラークハイブリダイゼーション法またはPCR法などにより、それぞれクローニングすることもできる。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。
WDR6をコードするDNAとしては、例えば、配列番号：１で表される塩基配列を含有するDNA、または配列番号：１で表される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、前記したWDR6と実質的に同質の活性（例：IRS-4への結合活性、IRS-4のリン酸化制御活性など）を有する蛋白質をコードするDNAなどが挙げられる。
配列番号：１で表される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるDNAとしては、例えば、配列番号：１で表される塩基配列と約60％以上、好ましくは約70％以上、さらに好ましくは約80％以上、特に好ましくは約90％以上の相同性を有する塩基配列を含有するDNAなどが用いられる。
本明細書における塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値=10；ギャップを許す；フィルタリング=ON；マッチスコア=1；ミスマッチスコア=-3）にて計算することができる。塩基配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、上記したアミノ酸配列の相同性計算アルゴリズムが同様に好ましく例示される。
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）第２版（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。ハイブリダイゼーションは、好ましくは、ストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件としては、例えば、6×SSC（sodium chloride/sodium citrate）中45℃でのハイブリダイゼーション反応の後、0.2×SSC／0.1％ SDS中65℃での一回以上の洗浄などが挙げられる。当業者は、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、ハイブリダゼーション反応の温度、プローブ濃度、プローブの長さ、ミスマッチの数、ハイブリダイゼーション反応の時間、洗浄液の塩濃度、洗浄の温度等を適宜変更することにより、所望のストリンジェンシーに容易に調節することができる。
WDR6をコードするDNAは、好ましくは配列番号：１で表される塩基配列で示されるヒトWDR6蛋白質をコードする塩基配列を含有するDNA（GenBankアクセッション番号：AF099100）、あるいは他の哺乳動物におけるそのホモログ［例えば、GenBankにそれぞれアクセッション番号AF348591およびXM_516448として登録されているマウスおよびチンパンジーホモログ等］である。
本発明の部分ペプチドをコードするDNAは、配列番号：２で表されるアミノ酸配列の一部と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するペプチドをコードする塩基配列を含むものであればいかなるものであってもよい。具体的には、本発明の部分ペプチドをコードするDNAとしては、例えば、（１）配列番号：１で表される塩基配列の部分塩基配列を有するDNA、または（２）配列番号：１で表される塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、前記したWDR6と実質的に同質の活性（例：IRS-4への結合活性、IRS-4のリン酸化制御活性など）を有するペプチドをコードするDNAなどが用いられる。
WDR6またはその部分ペプチドをコードするDNAは、該WDR6またはその部分ペプチドをコードする塩基配列の一部分を有する合成DNAプライマーを用いてPCR法によって増幅するか、または適当な発現ベクターに組み込んだDNAを、WDR6蛋白質の一部あるいは全領域をコードするDNA断片もしくは合成DNAを標識したものとハイブリダイゼーションすることによってクローニングすることができる。ハイブリダイゼーションは、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）第２版（前述）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、該ライブラリーに添付された使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
DNAの塩基配列は、公知のキット、例えば、MutanTM-super Express Km（宝酒造（株））、MutanTM-K（宝酒造（株））等を用いて、ODA-LA PCR法、Gapped duplex法、Kunkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って変換することができる。
クローン化されたDNAは、目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化するか、リンカーを付加した後に、使用することができる。該DNAはその5’末端側に翻訳開始コドンとしてのATGを有し、また3’末端側には翻訳終止コドンとしてのTAA、TGAまたはTAGを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成DNAアダプターを用いて付加することができる。
WDR6またはその部分ペプチドをコードするDNAを含む発現ベクターは、例えば、WDR6をコードするDNAから目的とするDNA断片を切り出し、該DNA断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、pBR322，pBR325，pUC12，pUC13）；枯草菌由来のプラスミド（例、pUB110，pTP5，pC194）；酵母由来プラスミド（例、pSH19，pSH15）；昆虫細胞発現プラスミド（例：pFast-Bac）；動物細胞発現プラスミド（例：pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo）；λファージなどのバクテリオファージ；バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクター（例：BmNPV、AcNPV）；レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなどの動物ウイルスベクターなどが用いられる。
プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。
例えば、宿主が動物細胞である場合、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMV（サイトメガロウイルス）プロモーター、RSV（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、MoMuLV（モロニーマウス白血病ウイルス）LTR、HSV-TK（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーターなどが用いられる。なかでも、CMVプロモーター、SRαプロモーターなどが好ましい。
宿主がエシェリヒア属菌である場合、trpプロモーター、lacプロモーター、recAプロモーター、λPLプロモーター、lppプロモーター、T7プロモーターなどが好ましい。
宿主がバチルス属菌である場合、SPO1プロモーター、SPO2プロモーター、penPプロモーターなどが好ましい。
宿主が酵母である場合、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーターなどが好ましい。
宿主が昆虫細胞である場合、ポリヘドリンプロモーター、P10プロモーターなどが好ましい。
発現ベクターとしては、上記の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、SV40複製起点（以下、SV40 oriと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下、dhfrと略称する場合がある、メソトレキセート（MTX）耐性）、アンピシリン耐性遺伝子（以下、amprと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、neorと略称する場合がある、G418耐性）等が挙げられる。特に、dhfr遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用い、dhfr遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、チミジンを含まない培地によって目的遺伝子を選択することもできる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列をコードする塩基配列（シグナルコドン）を、WDR6またはその部分ペプチドをコードするDNAの5’末端側に付加（またはネイティブなシグナルコドンと置換）してもよい。例えば、宿主がエシェリヒア属菌である場合、PhoA・シグナル配列、OmpA・シグナル配列などが；宿主がバチルス属菌である場合、α-アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが；宿主が酵母である場合、MFα・シグナル配列、SUC2・シグナル配列などが；宿主が動物細胞である場合、インスリン・シグナル配列、α-インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ用いられる。
上記したWDR6またはその部分ペプチドをコードするDNAを含む発現ベクターで宿主を形質転換し、得られる形質転換体を培養することによって、WDR6またはその部分ペプチドを製造することができる。
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）K12・DH1〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），60巻，160 (1968)〕，エシェリヒア・コリJM103〔ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Research），9巻，309 (1981)〕，エシェリヒア・コリJA221〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Journal of Molecular Biology），120巻，517 (1978)〕，エシェリヒア・コリHB101〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，41巻，459 (1969)〕，エシェリヒア・コリC600〔ジェネティックス（Genetics），39巻，440 (1954)〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス（Bacillus subtilis）MI114〔ジーン (Gene)，24巻，255 (1983)〕，バチルス・サブチルス207-21〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Journal of Biochemistry），95巻，87 (1984)〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）AH22，AH22R-，NA87-11A，DKD-5D，20B-12、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）NCYC1913，NCYC2036、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）KM71などが用いられる。
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがAcNPVの場合、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell；Sf細胞）、Trichoplusia niの中腸由来のMG1細胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh FiveTM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞、Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイルスがBmNPVの場合、昆虫細胞としては、蚕由来株化細胞（Bombyx mori N 細胞；BmN細胞）などが用いられる。該Sf細胞としては、例えば、Sf9細胞（ATCC CRL1711）、Sf21細胞（以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィボ（In Vivo）,13, 213-217,(1977)）などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー（Nature），315巻，592 (1985)〕。
動物細胞としては、例えば、サルCOS-7細胞、サルVero細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（以下、CHO細胞と略記）、dhfr遺伝子欠損CHO細胞（以下、CHO(dhfr-)細胞と略記）、マウスL細胞，マウスAtT-20細胞、マウスミエローマ細胞，ラットGH3細胞、ヒトFL細胞などが用いられる。
形質転換は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。
エシェリヒア属菌は、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），69巻，2110 (1972)やジーン（Gene），17巻，107 (1982)などに記載の方法に従って形質転換することができる。
バチルス属菌は、例えば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Molecular ＆ General Genetics），168巻，111 (1979)などに記載の方法に従って形質転換することができる。
酵母は、例えば、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology），194巻，182-187 (1991)、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），75巻，1929 (1978)などに記載の方法に従って形質転換することができる。
昆虫細胞および昆虫は、例えば、バイオ／テクノロジー（Bio/Technology）,6巻，47-55 (1988)などに記載の方法に従って形質転換することができる。
動物細胞は、例えば、細胞工学別冊８ 新細胞工学実験プロトコール，263-267 (1995)（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Virology），52巻，456 (1973)に記載の方法に従って形質転換することができる。
形質転換体の培養は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。
例えば、宿主がエシェリヒア属菌またはバチルス属菌である形質転換体を培養する場合、培養に使用される培地としては液体培地が好ましい。また、培地は、形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物などを含有することが好ましい。ここで、炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖などが；窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質が；無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどがそれぞれ挙げられる。また、培地には、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のpHは、好ましくは約5〜約8である。
宿主がエシェリヒア属菌である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むM9培地〔ミラー（Miller），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス (Journal of Experiments in Molecular Genetics), 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972〕が好ましい。必要により、プロモーターを効率よく働かせるために、例えば、3β-インドリルアクリル酸のような薬剤を培地に添加してもよい。
宿主がエシェリヒア属菌である形質転換体の培養は、通常約15〜約43℃で、約3〜約24時間行なわれる。必要により、通気や撹拌を行ってもよい。
宿主がバチルス属菌である形質転換体の培養は、通常約30〜約40℃で、約6〜約24時間行なわれる。必要により、通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が酵母である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、バークホールダー（Burkholder）最小培地〔Bostian, K.L.ら，プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），77巻，4505 (1980)〕や0.5％カザミノ酸を含有するSD培地〔Bitter, G.A.ら，プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA），81巻，5330 (1984)〕などが挙げられる。培地のpHは、好ましくは約5〜約8である。培養は、通常約20℃〜約35℃で、約24〜約72時間行なわれる。必要に応じて、通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えばGrace's Insect Medium〔Grace, T.C.C.，ネイチャー（Nature），195巻，788 (1962)〕に非働化した10％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは、好ましくは約6.2〜約6.4である。培養は、通常約27℃で、約3〜約5日間行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、約5〜約20%の胎児ウシ血清を含む最小必須培地（MEM）〔サイエンス（Science），122巻，501 (1952)〕，ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）〔ヴィロロジー（Virology），8巻，396 (1959)〕，RPMI 1640培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（The Journal of the American Medical Association），199巻，519 (1967)〕，199培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Proceeding of the Society for the Biological Medicine），73巻，1 (1950)〕などが用いられる。培地のpHは、好ましくは約6〜約8である。培養は、通常約30℃〜約40℃で、約15〜約60時間行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
以上のようにして、形質転換体の細胞内または細胞外にWDR6（またはRAIG3）類を製造せしめることができる。
前記形質転換体を培養して得られる培養物からWDR6またはその部分ペプチドを自体公知の方法に従って分離精製することができる。
例えば、WDR6またはその部分ペプチドを培養菌体あるいは細胞の細胞質から抽出する場合、培養物から公知の方法で集めた菌体あるいは細胞を適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊した後、遠心分離やろ過により可溶性蛋白質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。該緩衝液は、尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトンX-100TMなどの界面活性剤を含んでいてもよい。一方、膜画分からWDR6またはその部分ペプチドを抽出する場合は、上記と同様に菌体あるいは細胞を破壊した後、低速遠心で細胞デブリスを沈澱除去し、上清を高速遠心して細胞膜含有画分を沈澱させる（必要に応じて密度勾配遠心などにより細胞膜画分を精製する）などの方法が用いられる。また、WDR6またはその部分ペプチドが菌体（細胞）外に分泌される場合には、培養物から遠心分離またはろ過等により培養上清を分取するなどの方法が用いられる。
このようにして得られた可溶性画分、膜画分あるいは培養上清中に含まれるWDR6またはその部分ペプチドの単離精製は、自体公知の方法に従って行うことができる。このような方法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法；透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法；イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法；アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法；逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法；等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法；などが用いられる。これらの方法は、適宜組み合わせることもできる。
かくして得られる蛋白質またはペプチドが遊離体である場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって、該遊離体を塩に変換することができ、蛋白質またはペプチドが塩として得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、該塩を遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、形質転換体が産生するWDR6またはその部分ペプチドを、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。該蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
かくして得られるWDR6またはその部分ペプチドの存在は、WDR6に対する抗体を用いたエンザイムイムノアッセイやウエスタンブロッティングなどにより確認することができる。
さらに、WDR6またはその部分ペプチドは、上記のWDR6またはその部分ペプチドをコードするDNAに対応するRNAを鋳型として、ウサギ網状赤血球ライセート、コムギ胚芽ライセート、大腸菌ライセートなどからなる無細胞蛋白質翻訳系を用いてインビトロ合成することができる。あるいは、さらにRNAポリメラーゼを含む無細胞転写／翻訳系を用いて、WDR6またはその部分ペプチドをコードするDNAを鋳型としても合成することができる。無細胞蛋白質転写／翻訳系は市販のものを用いることもできるし、それ自体既知の方法、具体的には大腸菌抽出液はPratt J.M.ら, “Transcription and Tranlation”, Hames B.D.およびHiggins S.J.編, IRL Press, Oxford 179-209 (1984) に記載の方法等に準じて調製することもできる。市販の細胞ライセートとしては、大腸菌由来のものはE.coli S30 extract system (Promega社製) やRTS 500 Rapid Tranlation System (Roche社製) 等が挙げられ、ウサギ網状赤血球由来のものはRabbit Reticulocyte Lysate System (Promega社製) 等、さらにコムギ胚芽由来のものはPROTEIOSTM (TOYOBO社製) 等が挙げられる。このうちコムギ胚芽ライセートを用いたものが好適である。コムギ胚芽ライセートの作製法としては、例えばJohnston F.B.ら, Nature, 179, 160-161 (1957) あるいはErickson A.H.ら, Meth. Enzymol., 96, 38-50 (1996) 等に記載の方法を用いることができる。
蛋白質合成のためのシステムまたは装置としては、バッチ法(Pratt,J.M.ら (1984) 前述)や、アミノ酸、エネルギー源等を連続的に反応系に供給する連続式無細胞蛋白質合成システム（Spirin A.S.ら, Science, 242, 1162-1164 (1988)）、透析法（木川ら、第21回日本分子生物学会、WID6）、あるいは重層法（PROTEIOSTMWheat germ cell-free protein synthesis core kit取扱説明書：TOYOBO社製）等が挙げられる。さらには、合成反応系に、鋳型のRNA、アミノ酸、エネルギー源等を必要時に供給し、合成物や分解物を必要時に排出する方法（特開2000-333673）等を用いることができる。
本発明において「WDR6の発現を抑制する物質」とは、WDR6遺伝子の転写レベル、転写後調節のレベル、蛋白質への翻訳レベル、翻訳後修飾のレベル等のいかなる段階で作用するものであってもよい。従って、WDR6の発現を抑制する物質としては、例えば、該遺伝子の転写を阻害する物質、初期転写産物からmRNAへのプロセッシングを阻害する物質、mRNAの細胞質への輸送を阻害する物質、mRNAの分解を促進する物質、mRNAから蛋白質への翻訳を阻害する物質、WDR6ポリペプチドの翻訳後修飾を阻害する物質などが含まれる。いずれの段階で作用するものであっても好ましく用いることができるが、WDR6蛋白質の産生を直接的に阻害するという意味では、mRNAから蛋白質への翻訳を阻害する物質が好ましい。
WDR6のmRNAから蛋白質への翻訳を特異的に阻害する物質として、好ましくは、該mRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸が挙げられる。
WDR6蛋白質、即ち配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質、をコードする塩基配列またはその一部、あるいは該塩基配列と相補的な塩基配列またはその一部を含有する核酸とは、前述のWDR6またはその部分ペプチドをコードする核酸だけではなく、フレームの合わない塩基配列をも含む意味で用いられる。
目的核酸の標的領域と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列を含む核酸、即ち、目的核酸とハイブリダイズすることができる核酸は、該目的核酸に対して「アンチセンス」であるということができる。一方、目的核酸の標的領域と相同性を有する塩基配列を含む核酸は、該目的核酸に対して「センス」であるということができる。ここで「相同性を有する」とは、塩基配列間で約70％以上、好ましくは約80％以上、より好ましくは約90％以上、最も好ましくは約95％以上の同一性または相補性を有することをいい、「実質的に相補的である」とは、塩基配列間で約70％以上、好ましくは約80％以上、より好ましくは約90％以上、最も好ましくは約95％以上の相補性を有することをいう。
好ましくは、WDR6蛋白質をコードする塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列としては、(a)配列番号：１で表される塩基配列または(b)該塩基配列の相補鎖配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードする配列と、相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列が挙げられる。ここで「実質的に同質の活性」とは前記と同義である。
ハイストリンジェントな条件としては、例えば、6×SSC（sodium chloride/sodium citrate）中45℃でのハイブリダイゼーション反応の後、0.2×SSC／0.1％ SDS中65℃での一回以上の洗浄などが挙げられる。
より好ましくは、WDR6蛋白質をコードする塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列としては、(a)配列番号：１で表されるヒトWDR6 mRNAの塩基配列、または他の哺乳動物におけるそのホモログ、さらにはそれらの天然のアレル変異体のmRNA配列と、相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列が挙げられる。
「WDR6のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列の一部」とは、WDR6のmRNAに特異的に結合することができ、且つ該mRNAからのタンパク質の翻訳を阻害し得るものであれば、その長さや位置に特に制限はないが、配列特異性の面から、標的配列に相補的もしくは実質的に相補的な部分を少なくとも10塩基以上、好ましくは約15塩基以上、より好ましくは約20塩基以上含むものである。
具体的には、WDR6のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸（以下、「WDR6に対するアンチセンス核酸」、「本発明のアンチセンス核酸」ともいう）として、以下の(i)〜(iii)のいずれかのものが好ましく例示される。
(i) WDR6のmRNAに対するアンチセンス核酸（＝狭義のアンチセンス核酸）
(ii) WDR6のmRNAに対するsiRNA
(iii) WDR6のmRNAに対するsiRNAを生成し得る核酸
(i) WDR6のmRNAに対する（狭義の）アンチセンス核酸
本発明における、WDR6のmRNAに対する「狭義の」アンチセンス核酸とは、該mRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸であって、標的mRNAと特異的かつ安定した二重鎖を形成して結合することにより、タンパク質合成を抑制する機能を有するものである（以下、本項目(i)において「本発明のアンチセンス核酸」という場合は、狭義のWDR6に対するアンチセンス核酸を意味し、それ以外の部分で「本発明のアンチセンス核酸」という場合は、特に断らない限り、WDR6のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸を包括的に指す用語として用いられる）。
アンチセンス核酸は、2-デオキシ-D-リボースを含有しているポリデオキシリボヌクレオチド、D-リボースを含有しているポリリボヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のN-グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例えば、市販のタンパク質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー）または特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーはDNAやRNA中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などが挙げられる。それらは、二本鎖DNA、一本鎖DNA、二本鎖RNA、一本鎖RNA、DNA:RNAハイブリッドであってもよく、さらに非修飾ポリヌクレオチド（または非修飾オリゴヌクレオチド）、公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合（例、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えばタンパク質（例、ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ-L-リジンなど）や糖（例、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレント化合物（例、アクリジン、ソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、α-アノマー型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。このような修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌクレオシドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、例えば、１個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されていたり、またはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。
上記の通り、アンチセンス核酸はDNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA/RNAキメラであってもよい。アンチセンス核酸がDNAの場合、標的RNAとアンチセンスDNAとによって形成されるRNA:DNAハイブリッドは、内在性RNase Hに認識されて標的RNAの選択的な分解を引き起こすことができる。したがって、RNase Hによる分解を指向するアンチセンスDNAの場合、標的配列は、mRNA中の配列だけでなく、WDR6遺伝子の初期翻訳産物におけるイントロン領域の配列であってもよい。例えば、ヒトの場合、WDR6遺伝子は第3番染色体の3p21.31領域に存在するので、この領域のゲノム配列と、配列番号：１で表されるヒトWDR6 cDNA塩基配列とをBLAST、FASTA等のホモロジー検索プログラムを用いて比較して、イントロン配列を決定することができる。
本発明のアンチセンス核酸の標的領域は、該アンチセンス核酸がハイブリダイズすることにより、結果としてWDR6タンパク質への翻訳が阻害されるものであればその長さに特に制限はなく、これらタンパク質をコードするmRNAの全配列であっても部分配列であってもよく、短いもので約10塩基程度、長いものでmRNAもしくは初期転写産物の全配列が挙げられる。合成の容易さや抗原性、細胞内移行性の問題等を考慮すれば、約10〜約40塩基、特に約15〜約30塩基からなるオリゴヌクレオチドが好ましいが、それに限定されない。具体的には、WDR6遺伝子の5'端ヘアピンループ、5'端６−ベースペア・リピート、5'端非翻訳領域、翻訳開始コドン、タンパク質コード領域、ORF翻訳終止コドン、3'端非翻訳領域、3'端パリンドローム領域または3'端ヘアピンループなどが、アンチセンス核酸の好ましい標的領域として選択しうるが、それらに限定されない。
さらに、本発明のアンチセンス核酸は、WDR6のmRNAや初期転写産物とハイブリダイズしてタンパク質への翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖DNAであるこれらの遺伝子と結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、RNAへの転写を阻害し得るもの（アンチジーン）であってもよい。
アンチセンス核酸を構成するヌクレオチド分子は、天然型のDNAもしくはRNAでもよいが、安定性（化学的および／または対酵素）や比活性（RNAとの親和性）を向上させるために、種々の化学修飾を含むことができる。例えば、ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンス核酸を構成する各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）を、例えば、ホスホロチオエート（PS)、メチルホスホネート、ホスホロジチオネートなどの化学修飾リン酸残基に置換することができる。また、各ヌクレオチドの糖（リボース）の2'位の水酸基を、-OR（Rは、例えばCH3（2'-O-Me）、CH2CH2OCH3（2'-O-MOE）、CH2CH2NHC(NH)NH2、CH2CONHCH3、CH2CH2CN等を示す）に置換してもよい。さらに、塩基部分（ピリミジン、プリン）に化学修飾を施してもよく、例えば、ピリミジン塩基の5位へのメチル基やカチオン性官能基の導入、あるいは2位のカルボニル基のチオカルボニルへの置換などが挙げられる。
RNAの糖部のコンフォーメーションはC2'-endo（S型）とC3'-endo（N型）の２つが支配的であり、一本鎖RNAではこの両者の平衡として存在するが、二本鎖を形成するとN型に固定される。したがって、標的RNAに対して強い結合能を付与するために、2'酸素と4’炭素を架橋することにより、糖部のコンフォーメーションをN型に固定したRNA誘導体であるBNA(LNA)（Imanishi, T. et al., Chem. Commun., 1653-9, 2002; Jepsen, J.S. et al., Oligonucleotides, 14, 130-46, 2004）やENA（Morita, K. et al., Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids, 22, 1619-21, 2003）もまた、好ましく用いられ得る。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、WDR6のcDNA配列もしくはゲノミックDNA配列に基づいてmRNAもしくは初期転写産物の標的配列を決定し、市販のDNA/RNA自動合成機（アプライド・バイオシステムズ社、ベックマン社等）を用いて、これに相補的な配列を合成することにより調製することができる。また、上記した各種修飾を含むアンチセンス核酸も、いずれも自体公知の手法により、化学的に合成することができる。
(ii) WDR6のmRNAに対するsiRNA
本明細書においては、WDR6のmRNAに相補的なオリゴRNAとその相補鎖とからなる二本鎖RNA、いわゆるsiRNAもまた、WDR6のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸に包含されるものとして定義される。短い二本鎖RNAを細胞内に導入するとそのRNAに相補的なmRNAが分解される、いわゆるRNA干渉（RNAi）と呼ばれる現象は、以前から線虫、昆虫、植物等で知られていたが、この現象が動物細胞でも広く起こることが確認されて以来［Nature, 411(6836): 494-498 (2001)］、リボザイムの代替技術として汎用されている。siRNAは標的となるmRNAの塩基配列情報に基づいて、市販のソフトウェア（例：RNAi Designer; Invitrogen）を用いて適宜設計することができる。
siRNAを構成するリボヌクレオシド分子もまた、安定性、比活性などを向上させるために、上記のアンチセンス核酸の場合と同様の修飾を受けていてもよい。但し、siRNAの場合、天然型RNA中のすべてのリボヌクレオシド分子を修飾型で置換すると、RNAi活性が失われる場合があるので、RISC複合体が機能できる最小限の修飾ヌクレオシドの導入が必要である。
siRNAは、mRNA上の標的配列のセンス鎖及びアンチセンス鎖をDNA/RNA自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中、約90〜約95℃で約1分程度変性させた後、約30〜約70℃で約1〜約8時間アニーリングさせることにより調製することができる。また、siRNAの前駆体となるショートヘアピンRNA（shRNA）を合成し、これをダイサー（dicer）を用いて切断することにより調製することもできる。
(iii) WDR6のmRNAに対するsiRNAを生成し得る核酸
本明細書においては、生体内で上記のWDR6のmRNAに対するsiRNAを生成し得るようにデザインされた核酸もまた、WDR6のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸に包含されるものとして定義される。そのような核酸としては、上記したshRNAやそれを発現するように構築された発現ベクターなどが挙げられる。shRNAは、mRNA上の標的配列のセンス鎖およびアンチセンス鎖を適当なループ構造を形成しうる長さ（例えば15から25塩基程度）のスペーサー配列を間に挿入して連結した塩基配列を含むオリゴRNAをデザインし、これをDNA/RNA自動合成機で合成することにより調製することができる。shRNAの発現カセットを含む発現ベクターは、上記shRNAをコードする二本鎖DNAを常法により作製した後、適当な発現ベクター中に挿入することにより調製することができる。shRNAの発現ベクターとしては、U6やH1などのPol III系プロモーターを有するものが用いられ得る。この場合、該発現ベクターを導入された動物細胞内で転写されたshRNAは、自身でループを形成した後に、内在の酵素ダイサー（dicer）などによってプロセシングされることにより成熟siRNAが形成される。
WDR6のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸の他の好ましい例としては、該mRNAをコード領域の内部で特異的に切断し得るリボザイムが挙げられる。「リボザイム」とは、狭義には、核酸を切断する酵素活性を有するRNAをいうが、本明細書では配列特異的な核酸切断活性を有する限りDNAをも包含する概念として用いるものとする。リボザイムとして最も汎用性の高いものとしては、ウイロイドやウイルソイド等の感染性RNAに見られるセルフスプライシングRNAがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型等が知られている。ハンマーヘッド型は約40塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーヘッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ（合わせて約10塩基程度）をmRNAの所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、標的mRNAのみを特異的に切断することが可能である。このタイプのリボザイムは、RNAのみを基質とするので、ゲノムDNAを攻撃することがないというさらなる利点を有する。WDR6 mRNAが自身で二本鎖構造をとる場合には、RNAヘリカーゼと特異的に結合し得るウイルス核酸由来のRNAモチーフを連結したハイブリッドリボザイムを用いることにより、標的配列を一本鎖にすることができる［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98(10): 5572-5577 (2001)］。さらに、リボザイムを、それをコードするDNAを含む発現ベクターの形態で使用する場合には、転写産物の細胞質への移行を促進するために、tRNAを改変した配列をさらに連結したハイブリッドリボザイムとすることもできる［Nucleic Acids Res., 29(13): 2780-2788 (2001)］。
WDR6のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸は、リポソーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療に適用されたり、付加された形態で与えられることができうる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例、ホスホリピド、コレステロールなど）などの疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の3'端または5'端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の3'端または5'端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、RNaseなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
これらの核酸のWDR6タンパク質発現阻害活性は、WDR6遺伝子を導入した形質転換体、生体内や生体外のWDR6遺伝子発現系、または生体内や生体外のWDR6タンパク質翻訳系を用いて調べることができる。
本発明におけるWDR6の発現を抑制する物質は、上記のようなWDR6のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸に限定されず、WDR6タンパク質の産生を直接的または間接的に阻害する限り、低分子化合物などの他の物質であってもよい。そのような物質は、例えば、後述する本発明のスクリーニング方法により取得することができる。
本発明において「WDR6の活性を抑制する物質」とは、いったん機能的に産生されたWDR6タンパク質が、IRS-4と相互作用して該分子のリン酸化を制御する作用を抑制する限り、いかなるものであってもよく、例えば、WDR6とIRS-4との複合体形成を阻害する物質や、WDR6のIRS-4に対するリン酸化制御活性を阻害する物質等が挙げられる。
具体的には、WDR6の活性を抑制する物質として、例えば、WDR6に対する中和抗体が挙げられる。該抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。これらの抗体は、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。抗体のアイソタイプは特に限定されないが、好ましくはIgG、IgMまたはIgA、特に好ましくはIgGが挙げられる。また、該抗体は、標的抗原を特異的に認識し結合するための相補性決定領域（CDR）を少なくとも有するものであれば特に制限はなく、完全抗体分子の他、例えばFab、Fab'、F(ab’)2等のフラグメント、scFv、scFv-Fc、ミニボディー、ダイアボディー等の遺伝子工学的に作製されたコンジュゲート分子、あるいはポリエチレングリコール（PEG）等のタンパク質安定化作用を有する分子等で修飾されたそれらの誘導体などであってもよい。
以下に、本発明の抗体の免疫原調製法、および該抗体の製造法について説明する。
（１）抗原の調製
本発明の抗体を調製するために使用される抗原としては、上記したWDR6蛋白質またはその部分ペプチド（以下、抗体の説明においては、特にことわらない限り、これらを包括して単に「WDR6」という）、あるいはそれと同一の抗原決定基を１種あるいは２種以上有する（合成）ペプチドなど、何れのものも使用することができる（以下、これらを単に本発明の抗原と称することもある）。
WDR6は、上記した通り、例えば、（a）哺乳動物の組織または細胞から公知の方法あるいはそれに準ずる方法を用いて調製、（b）ペプチド・シンセサイザー等を使用する公知のペプチド合成方法で化学的に合成、（c）WDR6をコードするDNAを含有する形質転換体を培養、あるいは（d）WDR6をコードする核酸を鋳型として無細胞転写／翻訳系を用いて生化学的に合成することによって製造される。
（a）哺乳動物の組織または細胞からWDR6を調製する場合、その組織または細胞をホモジナイズした後、粗分画物（例、膜画分、可溶性画分）をそのまま抗原として用いることもできる。あるいは酸、界面活性剤またはアルコールなどで抽出を行い、該抽出液を、塩析、透析、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することもできる。得られたWDR6をそのまま免疫原とすることもできるし、ペプチダーゼ等を用いた限定分解により部分ペプチドを調製してそれを免疫原とすることもできる。
（b）化学的に本発明の抗原を調製する場合、該合成ペプチドとしては、例えば上述の（a）の方法を用いて天然材料より精製したWDR6と同一の構造を有するもの、具体的には、WDR6のアミノ酸配列において少なくとも3個以上、好ましくは6個以上のアミノ酸からなる任意の箇所のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を１種あるいは２種以上含有するペプチドなどが用いられる。
（c）DNAを含有する形質転換体を用いて本発明の抗原を製造する場合、該DNAは、公知のクローニング方法〔例えば、Molecular Cloning 2nd ed.（J. Sambrook et al., Cold Spring HarborLab. Press, 1989）に記載の方法など〕に従って作製することができる。該クローニング方法とは、（1）WDR6をコードする遺伝子配列に基づきデザインしたDNAプローブを用い、ヒトcDNAライブラリーからハイブリダイゼーション法により該抗原をコードするDNAを単離するか、（2）WDR6をコードする遺伝子配列に基づきデザインしたDNAプライマーを用い、哺乳動物由来のcDNAを鋳型としてPCR法により該抗原をコードするDNAを調製し、該DNAを宿主に適合する発現ベクターに挿入する方法などが挙げられる。該発現ベクターで宿主を形質転換して得られる形質転換体を適当な培地中で培養することにより、所望の抗原を得ることができる。
（d）無細胞転写／翻訳系を利用する場合、上記（c）と同様の方法により調製した抗原をコードするDNAを挿入した発現ベクター（例えば、該DNAがT7、SP6プロモーター等の制御下におかれた発現ベクターなど）を鋳型とし、該プロモーターに適合するRNAポリメラーゼおよび基質（NTPs）を含む転写反応液を用いてmRNAを合成した後、該mRNAを鋳型として公知の無細胞翻訳系（例：大腸菌、ウサギ網状赤血球、コムギ胚芽等の抽出液）を用いて翻訳反応を行わせる方法などが挙げられる。塩濃度等を適当に調整することにより、転写反応と翻訳反応を同一反応液中で一括して行うこともできる。
免疫原としては完全なWDR6蛋白質分子やその部分アミノ酸配列を有するペプチドを用いることができる。部分アミノ酸配列としては、例えば3個以上の連続するアミノ酸残基からなるもの、好ましくは4個以上、より好ましくは5個以上、いっそう好ましくは6個以上の連続するアミノ酸残基からなるものが挙げられる。あるいは、該アミノ酸配列としては、例えば20個以下の連続するアミノ酸残基からなるもの、好ましくは18個以下、より好ましくは15個以下、いっそう好ましくは12個以下の連続するアミノ酸残基からなるものが挙げられる。これらのアミノ酸残基の一部（例：1ないし数個）は置換可能な基（例：Cys、水酸基等）によって置換されていていもよい。免疫原として用いられるペプチドは、このような部分アミノ酸配列を1ないし数個含むアミノ酸配列を有する。
あるいは、WDR6を発現する哺乳動物細胞自体を、本発明の抗原として直接用いることもできる。哺乳動物細胞としては、上記（a）項で述べたような天然の細胞、上記（c）項で述べたような方法で形質転換した細胞などを用いることができる。形質転換に用いる宿主としては、ヒト、サル、ラット、マウス、ハムスター、ニワトリなどから採取した細胞であれば何れのものでも良く、HEK293、COS7、CHO-K1、NIH3T3、Balb3T3、FM3A、L929、SP2/0、P3U1、B16、またはP388などが好ましく用いられる。WDR6を発現する天然の哺乳動物細胞または形質転換した温血動物細胞は、組織培養に用いられる培地（例、RPMI1640）または緩衝液（例、Hanks’ Balanced Salt Solution）に懸濁された状態で免疫動物に注射することができる。免疫方法としては、抗体産生を促すことのできる方法であれば何れの方法でも良く、静脈内注射、腹腔内注射、筋肉内注射または皮下注射などが好ましく用いられる。
本発明の抗原は、免疫原性を有していれば不溶化したものを直接免疫することもできるが、分子内に１ないし数個の抗原決定基しか有しない低分子量（例えば、分子量約3,000以下）の抗原（即ち、WDR6の部分ペプチド）を用いる場合には、これらの抗原は通常免疫原性の低いハプテン分子なので、適当な担体（キャリアー）に結合または吸着させた複合体として免疫することができる。担体としては天然もしくは合成の高分子を用いることができる。天然高分子としては、例えばウシ、ウサギ、ヒトなどの哺乳動物の血清アルブミンや例えばウシ、ウサギなどの哺乳動物のサイログロブリン、例えばニワトリのオボアルブミン、例えばウシ、ウサギ、ヒト、ヒツジなどの哺乳動物のヘモグロビン、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）などが用いられる。合成高分子としては、例えばポリアミノ酸類、ポリスチレン類、ポリアクリル類、ポリビニル類、ポリプロピレン類などの重合物または共重合物などの各種ラテックスなどが挙げられる。
該キャリアーとハプテンとの混合比は、担体に結合あるいは吸着させた抗原に対する抗体が効率よく産生されれば、どのようなものをどのような比率で結合あるいは吸着させてもよく、通常ハプテンに対する抗体の作製にあたり常用されている上記の天然もしくは合成の高分子キャリアーを、重量比でハプテン1に対し0.1〜100の割合で結合あるいは吸着させたものを使用することができる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができる。例えば、チロシン、ヒスチジン、トリプトファンを架橋するビスジアゾ化ベンジジンなどのジアゾニウム化合物、アミノ基同士を架橋するグルタルアルデビトなどのジアルデヒド化合物、トルエン-2,4-ジイソシアネートなどのジイソシアネート化合物、チオール基同士を架橋するN,N’-o-フェニレンジマレイミドなどのジマレイミド化合物、アミノ基とチオール基を架橋するマレイミド活性エステル化合物、アミノ基とカルボキシル基とを架橋するカルボジイミド化合物などが好都合に用いられる。また、アミノ基同志士を架橋する際にも、一方のアミノ基にジチオピリジル基を有する活性エステル試薬（例えば、3-(2-ピリジルジチオ)プロピオン酸N-スクシンイミジル（SPDP）など）を反応させた後還元することによりチオール基を導入し、他方のアミノ基にマレイミド活性エステル試薬によりマレイミド基を導入後、両者を反応させることもできる。
（２）モノクローナル抗体の作製
（ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明の抗原は、温血動物に対して、例えば腹腔内注入、静脈注入，皮下注射、皮内注射などの投与方法によって、抗体産生が可能な部位にそれ自体単独で、あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常1〜6週毎に1回ずつ、計2〜10回程度行われる。用いられる温血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ハムスター、ヒツジ、ヤギ、ロバ、ニワトリが挙げられる。抗Ig抗体産生の問題を回避するためには投与対象と同一種の哺乳動物を用いることが好ましいが、モノクローナル抗体作製には一般にマウスおよびラットが好ましく用いられる。
ヒトに対する人為的免疫感作は倫理的に困難であることから、本発明の抗体がヒトを投与対象とする場合には、(i)後述する方法に従って作製されるヒト抗体産生動物（例：マウス）を免疫してヒト抗体を得る、(ii)後述する方法に従ってキメラ抗体、ヒト化抗体もしくは完全ヒト抗体を作製する、あるいは(iii)体外免疫法とウイルスによる細胞不死化、ヒト−ヒト（もしくはマウス）ハイブリドーマ作製技術、ファージディスプレイ法等とを組み合わせてヒト抗体を得ることが好ましい。尚、体外免疫法は、通常の免疫では抗体産生が抑制される抗原に対する抗原を取得できる可能性があることの他、ng〜μgオーダーの抗原量で抗体を得ることが可能であること、免疫が数日間で終了することなどから、不安定で大量調製の困難な抗原に対する抗体を得る方法として、非ヒト動物由来の抗体を調製する場合にも好ましく用いられ得る。
体外免疫法に用いられる動物細胞としては、ヒトおよび上記した温血動物（好ましくはマウス、ラット）の末梢血、脾臓、リンパ節などから単離されるリンパ球、好ましくはＢリンパ球等が挙げられる。例えば、マウスやラット細胞の場合、4〜12週齢程度の動物から脾臓を摘出・脾細胞を分離し、適当な培地（例：ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、RPMI1640培地、ハムF12培地等））で洗浄した後、抗原を含む胎仔ウシ血清（FCS；5〜20%程度）添加培地に浮遊させて4〜10日間程度CO2インキュベーターなどを用いて培養する。抗原濃度としては、例えば0.05〜5μgが挙げられるがこれに限定されない。同一系統の動物（1〜2週齢程度が好ましい）の胸腺細胞培養上清を常法に従って調製し、培地に添加することが好ましい。
ヒト細胞の体外免疫では、胸腺細胞培養上清を得ることは困難なので、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6等数種のサイトカインおよび必要に応じてアジュバント物質（例：ムラミルジペプチド等）を抗原とともに培地に添加して免疫感作を行うことが好ましい。
モノクローナル抗体の作製に際しては、抗原を免疫された温血動物（例：マウス、ラット）もしくは動物細胞（例：ヒト、マウス、ラット）から抗体価の上昇が認められた個体もしくは細胞集団を選択し、最終免疫の2〜5日後に脾臓またはリンパ節を採取もしくは体外免疫後4〜10日間培養した後に細胞を回収して抗体産生細胞を単離し、これと骨髄腫細胞とを融合させることにより抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。血清中の抗体価の測定は、例えば標識化抗原と抗血清とを反応させた後、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行うことができる。
骨髄腫細胞は多量の抗体を分泌するハイブリドーマを産生し得るものであれば特に制限はないが、自身は抗体を産生もしくは分泌しないものが好ましく、また、細胞融合効率が高いものがより好ましい。また、ハイブリドーマの選択を容易にするために、HAT（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）感受性の株を用いることが好ましい。例えばマウス骨髄腫細胞としてはNS-1、P3U1、SP2/0、AP-1等が、ラット骨髄腫細胞としてはR210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3等が、ヒト骨髄腫細胞としてはSKO-007、GM 1500-6TG-2、LICR-LON-HMy2、UC729-6等が挙げられる。
融合操作は既知の方法、例えばケーラーとミルスタインの方法［ネイチャー（Nature）、256巻、495頁(1975年)］に従って実施することができる。融合促進剤としては、ポリエチレングリコール（PEG）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはPEGなどが用いられる。PEGの分子量は特に制限はないが、低毒性で且つ粘性が比較的低いPEG1000〜PEG6000が好ましい。PEG濃度としては例えば10〜80%程度、好ましくは30〜50%程度が例示される。PEGの希釈用溶液としては無血清培地（例：RPMI1640）、5〜20%程度の血清を含む完全培地、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、トリス緩衝液等の各種緩衝液を用いることができる。所望によりDMSO（例：10〜20％程度）を添加することもできる。融合液のpHとしては、例えば4〜10程度、好ましくは6〜8程度が挙げられる。
抗体産生細胞（脾細胞）数と骨髄細胞数との好ましい比率は、通常1:1〜20:1程度であり、通常20〜40℃、好ましくは30〜37℃で通常1〜10分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
抗体産生細胞株はまた、リンパ球をトランスフォームし得るウイルスに抗体産生細胞を感染させて該細胞を不死化することによっても得ることができる。そのようなウイルスとしては、例えばエプスタイン−バー（EB）ウイルス等が挙げれらる。大多数の人は伝染性単核球症の無症状感染としてこのウイルスに感染した経験があるので免疫を有しているが、通常のEBウイルスを用いた場合にはウイルス粒子も産生されるので、適切な精製を行うべきである。ウイルス混入の可能性のないEBシステムとして、Ｂリンパ球を不死化する能力を保持するがウイルス粒子の複製能力を欠損した組換えEBウイルス（例えば、潜伏感染状態から溶解感染状態への移行のスイッチ遺伝子における欠損など）を用いることもまた好ましい。
マーモセット由来のB95-8細胞はEBウイルスを分泌しているので、その培養上清を用いれば容易にＢリンパ球をトランスフォームすることができる。この細胞を例えば血清及びペニシリン／ストレプトマイシン（P/S）添加培地（例：RPMI1640）もしくは細胞増殖因子を添加した無血清培地で培養した後、濾過もしくは遠心分離等により培養上清を分離し、これに抗体産生Ｂリンパ球を適当な濃度（例：約107細胞/mL）で浮遊させて、通常20〜40℃、好ましくは30〜37℃で通常0.5〜2時間程度インキュベートすることにより抗体産生Ｂ細胞株を得ることができる。ヒトの抗体産生細胞が混合リンパ球として提供される場合、大部分の人はEBウイルス感染細胞に対して傷害性を示すＴリンパ球を有しているので、トランスフォーメーション頻度を高めるためには、例えばヒツジ赤血球等とＥロゼットを形成させることによってＴリンパ球を予め除去しておくことが好ましい。また、可溶性抗原を結合したヒツジ赤血球を抗体産生Ｂリンパ球と混合し、パーコール等の密度勾配を用いてロゼットを分離することにより標的抗原に特異的なリンパ球を選別することができる。さらに、大過剰の抗原を添加することにより抗原特異的なＢリンパ球はキャップされて表面にIgGを提示しなくなるので、抗IgG抗体を結合したヒツジ赤血球と混合すると抗原非特異的なＢリンパ球のみがロゼットを形成する。従って、この混合物からパーコール等の密度勾配を用いてロゼット非形成層を採取することにより、抗原特異的Ｂリンパ球を選別することができる。
トランスフォーメーションによって無限増殖能を獲得したヒト抗体分泌細胞は、抗体分泌能を安定に持続させるためにマウスもしくはヒトの骨髄腫細胞と戻し融合させることができる。骨髄腫細胞としては上記と同様のものが用いられ得る。
ハイブリドーマのスクリーニング、育種は通常HAT（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加して、5〜20% FCSを含む動物細胞用培地（例：RPMI1640）もしくは細胞増殖因子を添加した無血清培地で行われる。ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンの濃度としては、例えばそれぞれ約0.1mM、約0.4μMおよび約0.016mM等が挙げられる。ヒト−マウスハイブリドーマの選択にはウワバイン耐性を用いることができる。ヒト細胞株はマウス細胞株に比べてウワバインに対する感受性が高いので、10-7〜10-3M程度で培地に添加することにより未融合のヒト細胞を排除することができる。
ハイブリドーマの選択にはフィーダー細胞やある種の細胞培養上清を用いることが好ましい。フィーダー細胞としては、ハイブリドーマの出現を助けて自身は死滅するように生存期間が限られた異系の細胞種、ハイブリドーマの出現に有用な増殖因子を大量に産生し得る細胞を放射線照射等して増殖力を低減させたもの等が用いられる。例えば、マウスのフィーダー細胞としては、脾細胞、マクロファージ、血液、胸腺細胞等が、ヒトのフィーダー細胞としては、末梢血単核細胞等が挙げられる。細胞培養上清としては、例えば上記の各種細胞の初代培養上清や種々の株化細胞の培養上清が挙げられる。
また、ハイブリドーマは、抗原を蛍光標識して融合細胞と反応させた後、蛍光活性化セルソータ（FACS）を用いて抗原と結合する細胞を分離することによっても選択することができる。この場合、標的抗原に対する抗体を産生するハイブリドーマを直接選択することができるので、クローニングの労力を大いに軽減することが可能である。
標的抗原に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのクローニングには種々の方法が使用できる。
アミノプテリンは多くの細胞機能を阻害するので、できるだけ早く培地から除去することが好ましい。マウスやラットの場合、ほとんどの骨髄腫細胞は10〜14日以内に死滅するので、融合2週間後からはアミノプテリンを除去することができる。但し、ヒトハイブリドーマについては通常融合後4〜6週間程度はアミノプテリン添加培地で維持される。ヒポキサンチン、チミジンはアミノプテリン除去後1週間以上後に除去するのが望ましい。即ち、マウス細胞の場合、例えば融合7〜10日後にヒポキサンチンおよびチミジン（HT）添加完全培地（例：10% FCS添加RPMI1640）の添加または交換を行う。融合後8〜14日程度で目視可能なクローンが出現する。クローンの直径が1mm程度になれば培養上清中の抗体量の測定が可能となる。
抗体量の測定は、例えば標的抗原またはその誘導体あるいはその部分ペプチド（抗原決定基として用いた部分アミノ酸配列を含む）を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質（例：125I,131I,3H,14C）、酵素（例：β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素）、蛍光物質（例：フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネート）、発光物質（例：ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニン）などで標識した抗免疫グロブリン（IgG）抗体（もとの抗体産生細胞が由来する動物と同一種の動物由来のIgGに対する抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合した標的抗原（抗原決定基）に対する抗体を検出する方法、抗IgG抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、上記と同様の標識剤で標識した標的抗原またはその誘導体あるいはその部分ペプチドを加え、固相に結合した標的抗原（抗原決定基）に対する抗体を検出する方法などによって行うことができる。
クローニング方法としては限界希釈法が通常用いられるが、軟寒天を用いたクローニングやFACSを用いたクローニング（上述）も可能である。限界希釈法によるクローニングは、例えば以下の手順で行うことができるがこれに限定されない。
上記のようにして抗体量を測定して陽性ウェルを選択する。適当なフィーダー細胞を選択して96ウェルプレートに添加しておく。抗体陽性ウェルから細胞を吸い出し、完全培地（例：10% FCSおよびP/S添加RMPI1640）中に30細胞/mLの密度となるように浮遊させ、フィーダー細胞を添加したウェルプレートに0.1mL（3細胞/ウェル）加え、残りの細胞懸濁液を10細胞/mLに希釈して別のウェルに同様にまき（1細胞/ウェル）、さらに残りの細胞懸濁液を3細胞/mLに希釈して別のウェルにまく（0.3細胞/ウェル）。目視可能なクローンが出現するまで2〜3週間程度培養し、抗体量を測定・陽性ウェルを選択し、再度クローニングする。ヒト細胞の場合はクローニングが比較的困難なので、10細胞/ウェルのプレートも調製しておく。通常2回のサブクローニングでモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得ることができるが、その安定性を確認するためにさらに数ヶ月間定期的に再クローニングを行うことが望ましい。
ハイブリドーマはインビトロまたはインビボで培養することができる。
インビトロでの培養法としては、上記のようにして得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを、細胞密度を例えば105〜106細胞/mL程度に保ちながら、また、FCS濃度を徐々に減らしながら、ウェルプレートから徐々にスケールアップしていく方法が挙げられる。
インビボでの培養法としては、例えば、腹腔内にミネラルオイルを注入して形質細胞腫（MOPC）を誘導したマウス（ハイブリドーマの親株と組織適合性のマウス）に、5〜10日後に106〜107細胞程度のハイブリドーマを腹腔内注射し、2〜5週間後に麻酔下に腹水を採取する方法が挙げられる。
（ｂ）モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、自体公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法［例：塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例：DEAE、QEAE）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法など］に従って行うことができる。
以上のようにして、ハイブリドーマを温血動物の生体内又は生体外で培養し、その体液または培養物から抗体を採取することによって、モノクローナル抗体を製造することができる。
WDR6の活性を阻害するためには、WDR6に対する抗体はWDR6の機能を中和するものでなければならないので、得られたモノクローナル抗体の中和活性について調べる必要がある。中和活性は、抗体の存在下および非存在下におけるWDR6とIRS-4との結合性や、IRS-4のリン酸化の程度を比較することにより測定することができる。
好ましい一実施態様において、本発明の抗体はヒトを投与対象とする医薬品として使用されることから、本発明の抗体（好ましくはモノクローナル抗体）はヒトに投与した場合に抗原性を示す危険性が低減された抗体、具体的には、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、マウス−ヒトキメラ抗体などであり、特に好ましくは完全ヒト抗体である。ヒト化抗体およびキメラ抗体は、後述する方法に従って遺伝子工学的に作製することができる。また、完全ヒト抗体は、上記したヒト−ヒト（もしくはマウス）ハイブリドーマより製造することも可能ではあるが、大量の抗体を安定に且つ低コストで提供するためには、後述するヒト抗体産生動物（例：マウス）またはファージディスプレイ法を用いて製造することが望ましい。
（ｉ）キメラ抗体の作製
本明細書において「キメラ抗体」とは、Ｈ鎖およびＬ鎖の可変領域（VHおよびVL）の配列がある哺乳動物種に由来し、定常領域（CHおよびCL）の配列が他の哺乳動物種に由来する抗体を意味する。可変領域の配列は、例えばマウス等の容易にハイブリドーマを作製することができる動物種由来であることが好ましく、定常領域の配列は投与対象となる哺乳動物種由来であることが好ましい。
キメラ抗体の作製法としては、例えば米国特許第6,331,415号に記載される方法あるいはそれを一部改変した方法などが挙げられる。具体的には、まず、上述のようにして得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ（例えば、マウス−マウスハイブリドーマ）から、常法に従ってmRNAもしくは全RNAを調製し、cDNAを合成する。該cDNAを鋳型として、適当なプライマー（例えば、センスプライマーとしてVHおよびVLの各Ｎ末端配列をコードする塩基配列を含むオリゴＤＮＡ、アンチセンスプライマーとしてCHおよびCLのＮ末端配列をコードする塩基配列とハイブリダイズするオリゴＤＮＡ（例えばBio/Technology, 9: 88-89, 1991参照））を用い、常法に従ってPCRでVHおよびVLをコードするDNAを増幅・精製する。同様の方法により、他の哺乳動物（例：ヒト）のリンパ球等より調製したRNAからRT-PCRによりCHおよびCLをコードするDNAを増幅・精製する。常法を用いてVHとCH、VLとCLをそれぞれ連結し、得られたキメラＨ鎖DNAおよびキメラＬ鎖DNAを、それぞれ適当な発現ベクター（例えば、CHO細胞、COS細胞、マウス骨髄腫細胞等で転写活性を有するプロモーター（例：CMVプロモーター、SV40プロモーター等）を含むベクターなど）に挿入する。両鎖をコードするDNAは別個のベクターに挿入してもよいし、1個のベクターにタンデムに挿入してもよい。得られたキメラＨ鎖およびキメラＬ鎖発現ベクターで宿主細胞を形質転換する。宿主細胞としては、動物細胞、例えば上記したマウス骨髄腫細胞の他、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、サル由来のCOS-7細胞、Vero細胞、ラット由来のGHS細胞などが挙げられる。形質転換は動物細胞に適用可能ないかなる方法を用いてもよいが、好ましくはエレクトロポレーション法などが挙げられる。宿主細胞に適した培地中で一定期間培養後、培養上清を回収して上記と同様の方法で精製することにより、キメラモノクローナル抗体を単離することができる。あるいは、宿主細胞としてウシ、ヤギ、ニワトリ等のトランスジェニック技術が確立し、且つ家畜（家禽）として大量繁殖のノウハウが蓄積されている動物の生殖系列細胞を用い、常法によってトランスジェニック動物を作製することにより、得られる動物の乳汁もしくは卵から容易に且つ大量にキメラモノクローナル抗体を得ることもできる。さらに、トウモロコシ、イネ、コムギ、ダイズ、タバコなどのトランスジェニック技術が確立し、且つ主要作物として大量に栽培されている植物細胞を宿主細胞として、プロトプラストへのマイクロインジェクションやエレクトロポレーション、無傷細胞へのパーティクルガン法やTiベクター法などを用いてトランスジェニック植物を作製し、得られる種子や葉などから大量にキメラモノクローナル抗体を得ることも可能である。
得られたキメラモノクローナル抗体をパパインで分解すればFabが、ペプシンで分解すればF(ab’)2がそれぞれ得られる。
また、マウスVHおよびVLをコードするDNAを適当なリンカー、例えば1〜40アミノ酸、好ましくは3〜30アミノ酸、より好ましくは5〜20アミノ酸からなるペプチド（例：[Ser-(Gly)m]nもしくは[(Gly)m-Ser]n（mは0〜10の整数、nは1〜5の整数）等）をコードするDNAを介して連結することによりscFvとすることができ、さらにCH3をコードするDNAを適当なリンカーを介して連結することによりminidodyモノマーとしたり、CH全長をコードするDNAを適当なリンカーを介して連結することによりscFv-Fcとすることもできる。このような遺伝子工学的に修飾（共役）された抗体分子をコードするDNAは、適当なプロモーターの制御下におくことにより大腸菌や酵母などの微生物で発現させることができ、大量に抗体分子を生産することができる。
マウスVHおよびVLをコードするDNAを1つのプロモーターの下流にタンデムに挿入して大腸菌に導入すると、モノシストロニックな遺伝子発現によりFvと呼ばれる二量体を形成する。また、分子モデリングを用いてVHおよびVLのFR中の適当なアミノ酸をCysに置換すると、両鎖の分子間ジスルフィド結合によりdsFvと呼ばれる二量体が形成される。
（ii）ヒト化抗体
本明細書において「ヒト化抗体」とは、可変領域に存在する相補性決定領域（CDR）以外のすべての領域（即ち、定常領域および可変領域中のフレームワーク領域（FR））の配列がヒト由来であり、CDRの配列のみが他の哺乳動物種由来である抗体を意味する。他の哺乳動物種としては、例えばマウス等の容易にハイブリドーマを作製することができる動物種が好ましい。
ヒト化抗体の作製法としては、例えば米国特許第5,225,539号、第5,585,089号、第5,693,761号および第5,693,762号に記載される方法あるいはそれらを一部改変した方法などが挙げられる。具体的には、上記キメラ抗体の場合と同様にして、ヒト以外の哺乳動物種（例：マウス）由来のVHおよびVLをコードするDNAを単離した後、常法により自動DNAシークエンサー（例：Applied Biosystems社製等）を用いてシークエンスを行い、得られる塩基配列もしくはそこから推定されるアミノ酸配列を公知の抗体配列データベース［例えば、Kabat database (Kabatら,「Sequences of Proteins of Immunological Interest」，US Department of Health and Human Services, Public Health Service, NIH編, 第5版, 1991参照) 等］を用いて解析し、両鎖のCDRおよびFRを決定する。決定されたFR配列に類似したFR配列を有するヒト抗体のＬ鎖およびＨ鎖をコードする塩基配列［例：ヒトκ型Ｌ鎖サブグループIおよびヒトＨ鎖サブグループIIもしくはIII（Kabatら，1991（上述）を参照）］のCDRコード領域を、決定された異種CDRをコードする塩基配列で置換した塩基配列を設計し、該塩基配列を20〜40塩基程度のフラグメントに区分し、さらに該塩基配列に相補的な配列を、前記フラグメントと交互にオーバーラップするように20〜40塩基程度のフラグメントに区分する。各フラグメントをDNAシンセサイザーを用いて合成し、常法に従ってこれらをハイブリダイズおよびライゲートさせることにより、ヒト由来のFRと他の哺乳動物種由来のCDRを有するVHおよびVLをコードするDNAを構築することができる。より迅速かつ効率的に他の哺乳動物種由来CDRをヒト由来VHおよびVLに移植するには、PCRによる部位特異的変異誘発を用いることが好ましい。そのような方法としては、例えば特開平5-227970号公報に記載の逐次CDR移植法等が挙げられる。このようにして得られるVHおよびVLをコードするDNAを、上記キメラ抗体の場合と同様の方法でヒト由来のCHおよびCLをコードするDNAとそれぞれ連結して適当な宿主細胞に導入することにより、ヒト化抗体を産生する細胞あるいはトランスジェニック動植物を得ることができる。
ヒト化抗体もキメラ抗体と同様に遺伝子工学的手法を用いてscFv、scFv-Fc、minibody、dsFv、Fvなどに改変することができ、適当なプロモーターを用いることで大腸菌や酵母などの微生物でも生産させることができる。
ヒト化抗体作製技術は、例えばハイブリドーマの作製技術が確立していない他の動物種に好ましく投与し得るモノクローナル抗体を作製するのにも応用することができる。例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリなどの家畜（家禽）として広く繁殖されている動物やイヌやネコなどのペット動物などが対象として挙げられる。
（iii）ヒト抗体産生動物を用いた完全ヒト抗体の作製
内因性免疫グロブリン（Ig）遺伝子をノックアウト（KO）した非ヒト温血動物に機能的なヒトIg遺伝子を導入し、これを抗原で免疫すれば、該動物由来の抗体の代わりにヒト抗体が産生される。従って、マウス等のようにハイブリドーマ作製技術が確立している動物を用いれば、従来のマウスモノクローナル抗体の作製と同様の方法によって完全ヒトモノクローナル抗体を取得することが可能となる。まず、ヒトIgのＨ鎖およびＬ鎖のミニ遺伝子を通常のトランスジェニック（Tg）技術を用いて導入したマウスと、内因性マウスIg遺伝子を通常のKO技術を用いて不活性化したマウスとを交配して得られたヒト抗体産生マウス（Immunol. Today, 17: 391-397, 1996を参照）を用いて作製されたヒトモノクローナル抗体のいくつかは既に臨床段階にあり、現在までのところ抗ヒトIgヒト抗体（HAHA）の産生は報告されていない。
その後、Abgenix社［商品名：XenoMouose（Nat. Genet., 15: 146-156, 1997; 米国特許第5,939,598号等を参照）］やMedarex社［商品名：Hu-Mab Mouse（Nat. Biotechnol., 14: 845-851, 1996; 米国特許第5,545,806号等を参照）］が酵母人工染色体（YAC）ベクターを用いてより大きなヒトIg遺伝子を導入したTgマウスを作製し、よりレパートリーに富んだヒト抗体を産生し得るようになった。しかしながら、ヒトIg遺伝子は、例えばＨ鎖の場合、約80種のＶ断片、約30種のＤ断片および6種のＪ断片が様々に組み合わされたVDJエクソンが抗原結合部位をコードすることによりその多様性を実現しているため、その全長はＨ鎖が約1.5Mb（14番染色体）、κＬ鎖が約2Mb（2番染色体）、λＬ鎖が約1Mb（22番染色体）に達する。ヒトにおけるのと同様の多様な抗体レパートリーを他の動物種で再現するためには、各Ig遺伝子の全長を導入することが望ましいが、従来の遺伝子導入ベクター（プラスミド、コスミド、BAC、YAC等）に挿入可能なDNAは通常数kb〜数百kbであり、クローニングしたDNAを受精卵に注入する従来のトランスジェニック動物作製技術では全長の導入は困難であった。
Tomizukaら（Nat. Genet., 16: 133-143, 1997）は、Ig遺伝子を担持するヒト染色体の自然断片（hCF）をマウスに導入して（染色体導入（TC）マウス）、完全長ヒトIg遺伝子を有するマウスを作製した。即ち、まず、Ｈ鎖遺伝子を含む14番染色体およびκＬ鎖遺伝子を含む2番染色体を例えば薬剤耐性マーカー等で標識したヒト染色体を有するヒト−マウスハイブリッド細胞を48時間程度紡錘糸形成阻害剤（例：コルセミド）で処理して、１〜数本の染色体もしくはその断片が核膜に被包されたミクロセルを調製し、微小核融合法によりマウスES細胞に染色体を導入する。薬剤を含む培地を用いてヒトIg遺伝子を有する染色体もしくはその断片を保持するハイブリッドES細胞を選択し、通常のKOマウス作製の場合と同様の方法によりマウス胚へ顕微注入する。得られるキメラマウスからコートカラーを指標にする等して生殖系列キメラを選択し、ヒト14番染色体断片を伝達するTCマウス系統（TC(hCF14)）およびヒト2番染色体断片を伝達するTCマウス系統（TC(hCF2)）を樹立する。常法により内因性Ｈ鎖遺伝子およびκＬ鎖遺伝子をKOされたマウス（KO(IgH)およびKO(Igκ)）を作製し、これら4系統の交配を繰り返すことにより、４種の遺伝子改変をすべて有するマウス系統（ダブルTC/KO）を樹立することができる。
上記のようにして作製されるダブルTC/KOマウスに、通常のマウスモノクローナル抗体を作製する場合と同様の方法を適用すれば、抗原特異的ヒトモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作製することができる。しかしながら、κＬ鎖遺伝子を含むhCF2がマウス細胞内で不安定なため、ハイブリドーマ取得効率は通常のマウスの場合に比べて低いという欠点がある。
一方、前記Hu-Mab MouseはκＬ鎖遺伝子の約50%を含むが、可変領域クラスターが倍加した構造を有するため完全長を含む場合と同等のκ鎖の多様性を示し（他方、Ｈ鎖遺伝子は約10%しか含まないのでＨ鎖の多様性は低く、抗原に対する応答性が不十分である）、
且つYACベクター（Igκ-YAC）によりマウス染色体中に挿入されているので、マウス細胞内で安定に保持される。この利点を生かし、TC(hCF14)マウスとHu-Mab Mouseとを交配してhCF14とIgκ-YACとを安定に保持するマウス（商品名：KMマウス）を作製することにより、通常のマウスと同等のハイブリドーマ取得効率および抗体の抗原親和性を得ることができる。
さらに、より完全にヒトにおける多様な抗体レパートリーを再現するために、λＬ鎖遺伝子をさらに導入したヒト抗体産生動物を作製することもできる。かかる動物は、上記と同様の方法でλＬ鎖遺伝子を担持するヒト22番染色体もしくはその断片を導入したTCマウス（TC(hCF22)）を作製し、これと上記ダブルTC/KOマウスやKMマウスとを交配することにより得ることもできるし、あるいは、例えばＨ鎖遺伝子座とλＬ鎖遺伝子座とを含むヒト人工染色体（HAC）を構築してマウス細胞に導入することにより得ることもできる（Nat. Biotechnol., 18: 1086-1090, 2000）。
本発明の抗体を医薬品として利用する場合はモノクローナル抗体であることが望ましいが、ポリクローナル抗体であってもよい。本発明の抗体がポリクローナル抗体である場合には、ハイブリドーマの利用を要しないので、ハイブリドーマ作製技術は確立されていないがトランスジェニック技術は確立されている動物種、好ましくはウシ等の有蹄動物やニワトリ等を用いて、上記と同様の方法によりヒト抗体産生動物を作製すれば、より大量のヒト抗体を安価に製造することも可能である（例えば、Nat. Biotechnol., 20: 889-894,2002参照）。得られるヒトポリクローナル抗体は、ヒト抗体産生動物の血液、腹水、乳汁、卵など、好ましくは乳汁、卵を採取し、上記と同様の精製技術を組み合わせることによって精製することができる。
（iv）ファージディスプレイヒト抗体ライブラリーを用いた完全ヒト抗体の作製
完全ヒト抗体を作製するもう１つのアプローチはファージディスプレイを用いる方法である。この方法はPCRによる変異がCDR以外に導入される場合があり、そのため臨床段階で少数のHAHA産生の報告例があるが、その一方で宿主動物に由来する異種間ウイルス感染の危険性がない点や抗体の特異性が無限である（禁止クローンや糖鎖などに対する抗体も容易に作製可能）等の利点を有している。
ファージディスプレイヒト抗体ライブラリーの作製方法としては、例えば、以下のものが挙げられるが、これに限定されない。
用いられるファージは特に限定されないが、通常繊維状ファージ（Ffバクテリオファージ）が好ましく用いられる。ファージ表面に外来蛋白質を提示する方法としては、g3p、g6p〜g9pのコート蛋白質のいずれかとの融合蛋白質として該コート蛋白質上で発現・提示させる方法が挙げられるが、よく用いられるのはg3pもしくはg8pのＮ末端側に融合させる方法である。ファージディスプレイベクターとしては、1)ファージゲノムのコート蛋白質遺伝子に外来遺伝子を融合した形で導入して、ファージ表面上に提示されるコート蛋白質をすべて外来蛋白質との融合蛋白質として提示させるものの他、2)融合蛋白質をコードする遺伝子を野生型コート蛋白質遺伝子とは別に挿入して、融合蛋白質と野生型コート蛋白質とを同時に発現させるものや、3)融合蛋白質をコードする遺伝子を有するファージミドベクターを持つ大腸菌に野生型コート蛋白質遺伝子を有するヘルパーファージを感染させて融合蛋白質と野生型コート蛋白質とを同時に発現するファージ粒子を産生させるものなどが挙げられるが、1)の場合は大きな外来蛋白質を融合させると感染能力が失われるため、抗体ライブラリーの作製のためには2)または3)のタイプが用いられる。
具体的なベクターとしては、Holtら（Curr. Opin. Biotechnol., 11: 445-449, 2000）に記載されるものが例示される。例えば、pCES1（J. Biol. Chem., 274: 18218-18230, 1999参照）は、1つのラクトースプロモーターの制御下にg3pのシグナルペプチドの下流にκＬ鎖定常領域をコードするDNAとg3pシグナルペプチドの下流にCH3をコードするDNA、His-tag、c-myc tag、アンバー終止コドン(TAG)を介してg3pコード配列とが配置されたFab発現型ファージミドベクターである。アンバー変異を有する大腸菌に導入するとg3pコート蛋白質上にFabを提示するが、アンバー変異を持たないHB2151株などで発現させると可溶性Fab抗体を産生する。また、scFv発現型ファージミドベクターとしては、例えばpHEN1（J. Mol. Biol., 222:581-597, 1991）等が用いられる。
一方、ヘルパーファージとしては、例えばM13-KO7、VCSM13等が挙げられる。
また、別のファージディスプレイベクターとして、抗体遺伝子の３’末端とコート蛋白質遺伝子の５’末端にそれぞれシステインをコードするコドンを含む配列を連結し、両遺伝子を同時に別個に（融合蛋白質としてではなく）発現させて、導入されたシステイン残基同士によるS-S結合を介してファージ表面のコート蛋白質上に抗体を提示し得るようにデザインされたもの（Morphosys社のCysDisplayTM技術）等も挙げられる。
ヒト抗体ライブラリーの種類としては、ナイーブ／非免疫ライブラリー、合成ライブラリー、免疫ライブラリー等が挙げられる。
ナイーブ／非免疫（non-immunized）ライブラリーは、正常なヒトが保有するVHおよびVL遺伝子をRT-PCRにより取得し、それらをランダムに上記のファージディスプレイベクターにクローニングして得られるライブラリーである。通常、正常人の末梢血、骨髄、扁桃腺などのリンパ球由来のmRNA等が鋳型として用いられる。疾病履歴などのＶ遺伝子のバイアスをなくすため、抗原感作によるクラススイッチが起こっていないIgM由来のmRNAのみを増幅したものを特にナイーブライブラリーと呼んでいる。代表的なものとしては、CAT社のライブラリー（J. Mol. Biol., 222: 581-597, 1991; Nat. Biotechnol., 14: 309-314, 1996参照）、MRC社のライブラリー（Annu. Rev. Immunol., 12: 433-455, 1994参照）、Dyax社のライブラリー（J. Biol. Chem., 1999 (上述); Proc. Natl. Acad. Sci. USA，14: 7969-7974, 2000参照）等が挙げられる。
合成ライブラリーは、ヒトＢ細胞内の機能的な特定の抗体遺伝子を選び、Ｖ遺伝子断片の、例えばCDR3等の抗原結合領域の部分を適当な長さのランダムなアミノ酸配列をコードするDNAで置換し、ライブラリー化したものである。最初から機能的なscFvやFabを産生するVHおよびVL遺伝子の組み合わせでライブライリーを構築できるので、抗体の発現効率や安定性に優れているとされる。代表的なものとしては、Morphosys社のHuCALライブラリー（J．Mol. Biol., 296: 57-86, 2000参照）、BioInvent社のライブラリー（Nat. Biotechnol., 18: 852, 2000参照）、Crucell社のライブラリー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 3938, 1995; J. Immunol. Methods, 272: 219-233, 2003参照）等が挙げられる。
免疫（immunized）ライブラリーは、標的抗原に対する血中抗体価が上昇したヒトから採取したリンパ球、あるいは上記体外免疫法により標的抗原を人為的に免疫したヒトリンパ球等から、上記ナイーブ／非免疫ライブラリーの場合と同様にしてmRNAを調製し、RT-PCR法によってVHおよびVL遺伝子を増幅し、ライブラリー化したものである。最初から目的の抗体遺伝子がライブラリー中に含まれるので、比較的小さなサイズのライブラリーからでも目的の抗体を得ることができる。
ライブラリーの多様性は大きいほどよいが、現実的には、以下のパンニング操作で取り扱えるファージ数（1011〜1013ファージ）と通常のパンニングでクローンの単離および増幅に必要なファージ数（100〜1,000ファージ／クローン）を考慮すれば、108〜1011クローン程度が適当であり、約108クローンのライブラリーで通常10-9オーダーのKd値を有する抗体をスクリーニングすることができる。
標的抗原に対する抗体をファージディスプレイ法で選別する工程をパンニングという。具体的には、例えば、抗原を固定化した担体とファージライブラリーとを接触させ、非結合ファージを洗浄除去した後、結合したファージを担体から溶出させ、大腸菌に感染させて該ファージを増殖させる、という一連の操作を3〜5回程度繰り返すことにより抗原特異的な抗体を提示するファージを濃縮する。抗原を固定化する担体としては、通常の抗原抗体反応やアフィニティークロマトグラフィーで用いられる各種担体、例えばアガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス、金属などからなるマイクロプレート、チューブ、メンブレン、カラム、ビーズなど、さらには表面プラズモン共鳴（SPR）のセンサーチップなどが挙げられる。抗原の固定化には物理的吸着を用いてもよく、また、通常蛋白質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。例えばビオチン−（ストレプト）アビジン系等が好ましく用いられる。標的抗原であるWDR6がオリゴペプチドなどの小分子である場合には、抗原決定基として用いた部分が担体との結合により被覆されないように特に注意する必要がある。非結合ファージの洗浄には、BSA溶液などのブロッキング液（1-2回）、Tween等の界面活性剤を含むPBS（3-5回）などを順次用いることができる。クエン酸緩衝液（pH5）などの使用が好ましいとの報告もある。特異的ファージの溶出には、通常酸（例：0.1M塩酸など）が用いられるが、特異的プロテアーゼによる切断（例えば、抗体遺伝子とコート蛋白質遺伝子との連結部にトリプシン切断部位をコードする遺伝子配列を導入することができる。この場合、溶出するファージ表面には野生型コート蛋白質が提示されるので、コート蛋白質のすべてが融合蛋白質として発現しても大腸菌への感染・増殖が可能となる）や可溶性抗原による競合的溶出、あるいはS-S結合の還元（例えば、前記したCysDisplayTMでは、パンニングの後、適当な還元剤を用いて抗体とコート蛋白質とを解離させることにより抗原特異的ファージを回収することができる）による溶出も可能である。酸で溶出した場合は、トリスなどで中和した後で溶出ファージを大腸菌に感染させ、培養後、常法によりファージを回収する。
パンニングにより抗原特異的抗体を提示するファージが濃縮されると、これらを大腸菌に感染させた後プレート上に播種してクローニングを行う。再度ファージを回収し、上述の抗体価測定法（例：ELISA、RIA、FIA等）やFACSあるいはSPRを利用した測定により抗原結合活性を確認する。
選択された抗原特異的抗体を提示するファージクローンからの抗体の単離・精製は、例えば、ファージディスプレイベクターとして抗体遺伝子とコート蛋白質遺伝子の連結部にアンバー終止コドンが導入されたベクターを用いる場合には、該ファージをアンバー変異を持たない大腸菌（例：HB2151株）に感染させると、可溶性抗体分子が産生されペリプラズムもしくは培地中に分泌されるので、細胞壁をリゾチームなどで溶解して細胞外画分を回収し、上記と同様の精製技術を用いて行うことができる。His-tagやc-myc tagを導入しておけば、IMACや抗c-myc抗体カラムなどを用いて容易に精製することができる。また、パンニングの際に特異的プロテアーゼによる切断を利用する場合には、該プロテアーゼを作用させると抗体分子がファージ表面から分離されるので、同様の精製操作を実施することにより目的の抗体を精製することができる。
ヒト抗体産生動物およびファージディスプレイヒト抗体ライブラリーを用いた完全ヒト抗体作製技術は、他の動物種のモノクローナル抗体を作製するのにも応用することができる。例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリなどの家畜（家禽）として広く繁殖されている動物やイヌやネコなどのペット動物などが対象として挙げられる。非ヒト動物においては標的抗原の人為的免疫に対する倫理的問題が少ないので、免疫ライブラリーの利用がより有効である。
（３）ポリクローナル抗体の作製
本発明のポリクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じる方法に従って製造することができる。例えば、免疫抗原（蛋白質もしくはペプチド抗原）自体、あるいはそれとキャリアー蛋白質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行い、該免疫動物からWDR6に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行うことにより製造することができる。
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリアー蛋白質の種類およびキャリアー蛋白質とハプテンとの混合比は、キャリアー蛋白質に架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どのようなものをどのような比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン1に対し、約0.1〜約20、好ましくは約1〜約5の割合でカプルさせる方法が用いられる。
また、ハプテンとキャリアー蛋白質のカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約1〜約6週毎に1回ずつ、計約2〜約10回程度行われる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行うことができる。
別の好ましい態様においては、WDR6の活性を阻害する物質は、WDR6に対してアンタゴニスト活性を示す低分子化合物である。ここで「アンタゴニスト活性」とは、WDR6に結合してWDR6とIRS-4との結合を阻害するか、WDR6のIRS-4に対するリン酸化制御活性を阻害する活性を意味する。中枢におけるインスリン/IGF-1シグナルの作用を増強する目的においては、WDR6の活性を阻害する物質は血液脳関門（BBB）を通過できるものである必要があるので、低分子化合物は、脳内移行性において抗体のような大きな分子に比べて有利である。そのような化合物は、例えば、後述する本発明のスクリーニング法を用いて取得することができる。
本発明において「WDR6の発現を増強する物質」とは、生体内でのWDR6の量を増大させる物質をいい、例えば、上記したWDR6蛋白質もしくはその部分ペプチド、それをコードする核酸などが挙げられる。
本発明において「WDR6の活性を増強する物質」とは、WDR6のIRS-4との結合性を増大させるか、あるいはWDR6のIRS-4に対するリン酸化制御活性を増大させる物質をいい、例えば、WDR6に対するアゴニスト抗体やWDR6に対してアゴニスト活性を示す低分子化合物等が挙げられる。ここで「アゴニスト活性」とは、WDR6に結合してWDR6とIRS-4との結合を促進するか、WDR6のIRS-4に対するリン酸化制御活性を促進する活性を意味する。
WDR6に対するアゴニスト抗体は、上記したWDR6に対する中和抗体と同様の手法を用いて取得されるモノクローナル抗体について、抗体の存在下および非存在下におけるWDR6とIRS-4との結合性やIRS-4のリン酸化の程度を比較して、そのアゴニスト活性を試験することにより得ることができる。また、WDR6に対してアゴニスト活性を示す低分子化合物は、例えば、後述する本発明のスクリーニング法を用いて取得することができる。
WDR6はIRS-4と結合してインスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用を負に制御する。従って、WDR6またはその部分ペプチド、それをコードする核酸またはその一部、WDR6に対する中和抗体またはアゴニスト抗体、WDR6をコードする核酸に対するアンチセンス核酸、WDR6に対してアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性を示す低分子化合物等は、以下の用途を有している。
（I）インスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用調節剤等
WDR6は、IRS-4と結合してインスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用を負に制御する。中枢におけるインスリン/IGF-1シグナルの作用は、神経細胞の保護および分化促進、摂食抑制（摂食抑制ホルモン前駆体（プロオピオメラノコルチン）の転写活性化および摂食促進ホルモン（神経ペプチドY）の転写抑制、GLUT2活性化による糖取り込みの促進による神経興奮等）などであり、末梢における該シグナルの作用は、肝臓における糖新生抑制、グリコーゲンの合成亢進や分解抑制などによる糖代謝促進、脂肪酸合成亢進、脂肪細胞における糖取り込み促進、脂肪分化抑制、筋肉におけるグリコーゲン合成亢進や糖取り込み促進などである。したがって、WDR6の発現もしくは活性を抑制する物質、例えば、WDR6をコードする核酸に対するアンチセンス核酸、WDR6に対する中和抗体、WDR6に対してアンタゴニスト活性を示す低分子化合物等は、インスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用を増強し、老化；神経変性疾患（例：アルツハイマー病、ダウン症、ポリグルタミン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、プリオン病、小脳変性症等）；摂食障害（例：過食症、拒食症からの反転による過食等）；肥満、インスリン抵抗性、糖尿病、糖尿病合併症（例：ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症）、耐糖能異常、高脂血症等の代謝疾患；高血圧、動脈硬化、虚血性心疾患、脳血管障害等の他の生活習慣病などの病態または疾患の予防および改善/治療剤などとして使用することができる。
さらに、IRS-4はFGFやNGFなどの下流に位置しており、神経細胞の分化や保護に重要な役割を果たしていると考えられる。WDR6はIRS-4のリン酸化制御を介してそのシグナルを負に調節するので、WDR6の発現もしくは活性を阻害する物質はまた、FGFやNGFからのシグナルを介しても神経細胞保護作用を発揮し得ると考えられる。
本発明のアンチセンス核酸を含有する医薬または動物薬は低毒性であり、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは他の温血動物（例、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル、トリなど）に対して経口的または非経口的（例、血管内投与、皮下投与など）に投与することができる。
本発明のアンチセンス核酸を上記のインスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用増強剤、抗老化剤、神経細胞保護剤、抗肥満剤、インスリン抵抗性改善剤、糖尿病の予防・治療剤などの医薬または動物薬として使用する場合、自体公知の方法に従って製剤化し、投与することができる。即ち、本発明のアンチセンス核酸を、単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当な哺乳動物細胞用の発現ベクターに機能可能な態様で挿入した後、常套手段に従って製剤化することができる。該核酸は、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与することができる。あるいは、エアロゾル化して吸入剤として気管内に局所投与することもできる。
さらに、体内動態の改良、半減期の長期化、細胞内取り込み効率の改善を目的に、前記核酸を単独またはリポソームなどの担体とともに製剤（注射剤）化し、静脈、皮下等に投与してもよい。
本発明のアンチセンス核酸は、それ自体を投与してもよいし、または適当な医薬または動物薬組成物（以下、単に「医薬組成物」と略記する）として投与してもよい。投与に用いられる医薬組成物としては、本発明のアンチセンス核酸と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものであってよい。このような医薬組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。このような注射剤は、公知の方法に従って調製できる。注射剤の調製方法としては、例えば、上記本発明のアンチセンス核酸を通常注射剤に用いられる無菌の水性液、または油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製できる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（polyoxyethylene（50mol）adduct of hydrogenated castor oil）〕等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。直腸投与に用いられる坐剤は、上記アンチセンス核酸を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製されてもよい。
経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。このような組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。錠剤用の担体、賦形剤としては、例えば、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムが用いられる。
上記の非経口用または経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。このような投薬単位の剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤が挙げられる。本発明のアンチセンス核酸は、例えば、投薬単位剤形当たり通常5〜500mg、とりわけ注射剤では5〜100mg、その他の剤形では10〜250mg含有されていることが好ましい。
本発明のアンチセンス核酸を含有する上記医薬または動物薬の投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、成人の糖尿病の治療・予防のために使用する場合には、本発明のアンチセンス核酸を１回量として、通常0.01〜20mg/kg体重程度、好ましくは0.1〜10mg/kg体重程度、さらに好ましくは0.1〜5mg/kg体重程度を、1日1〜5回程度、好ましくは1日1〜3回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
なお、前記した各組成物は、本発明のアンチセンス核酸との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
さらに、本発明のアンチセンス核酸は、他の薬剤、例えば、インスリン抵抗性改善薬（例、トログリタゾン、ビオグリタゾン等のチアドリジン誘導体等）、血糖降下薬（例、トルブタミド、グリコピラミド、アセトヘキサミド等のスルホニルウレア薬、グリミジン、グリブゾール等のスルホンアミド薬、メトフォルミン、ブフォルミン等のビグアナイド薬等）、アルドース還元酵素阻害薬（例、エパルレスタット等）、α-グルコシダーゼ阻害薬（例、ボグリボース、アカルボース等）ソマトメジンＣ製剤（例、メカセルミン等）などの抗糖尿病薬；中枢性抗肥満薬（例、デキスフェンフルラミン、フェンフルラミン、フェンテルミン等）、ＭＣＨ受容体拮抗薬（例、SB-568849、SNAP-7941等）、ニューロペプチドＹ拮抗薬（例、CP-422935等）、カンナビノイド受容体拮抗薬（例、SR-141716、SR-147778等）、グレリン拮抗薬、レプチン、β３アゴニストなどの抗肥満薬；アリセプトなどのアルツハイマー病治療薬などと併用してもよい。本発明のアンチセンス核酸および上記薬剤は、同時または異なった時間に患者に投与すればよい。
WDR6に対する中和抗体や、WDR6に対してアンタゴニスト活性を示す低分子化合物を含有する医薬または動物薬は低毒性であり、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは他の温血動物（例、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル、トリなど）に対して経口的または非経口的（例、血管内投与、皮下投与など）に投与することができる。
上記の抗体や低分子化合物は、それ自体を投与してもよいし、または適当な医薬組成物として投与してもよい。投与に用いられる医薬組成物としては、上記の抗体もしくは低分子化合物またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものであってもよい。このような医薬組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。このような注射剤は、公知の方法に従って調製できる。注射剤の調製方法としては、例えば、上記本発明の抗体もしくは低分子化合物またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性液、または油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製できる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（polyoxyethylene（50mol）adduct of hydrogenated castor oil）〕等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。直腸投与に用いられる坐剤は、上記抗体または低分子化合物を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製されても良い。
経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。このような組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。錠剤用の担体、賦形剤としては、例えば、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムが用いられる。
上記の非経口用または経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。このような投薬単位の剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤が挙げられる。抗体や低分子化合物は、投薬単位剤形当たり通常5〜500mg、とりわけ注射剤では5〜100mg、その他の剤形では10〜250mg含有されていることが好ましい。
上記の抗体または低分子化合物を含有する上記医薬または動物薬の投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、成人の糖尿病の治療・予防のために使用する場合には、抗体または低分子化合物を1回量として、通常0.01〜20mg/kg体重程度、好ましくは0.1〜10mg/kg体重程度、さらに好ましくは0.1〜5mg/kg体重程度を、1日1〜5回程度、好ましくは1日1〜3回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
なお、前記した各組成物は、上記抗体や低分子化合物との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
さらに、上記の抗体または低分子化合物は、本発明のアンチセンス核酸を含有する医薬において前記したと同様の他の薬剤と併用してもよい。上記の抗体または低分子化合物とそれらの他の薬剤とは、同時または異なった時間に患者に投与すればよい。
WDR6の発現もしくは活性を抑制する物質は、中枢におけるインスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用を増強し、神経細胞の分化・再生・保護や、摂食抑制などの作用を通じて、寿命延長効果を奏することから、老化防止などの目的で、各種の加工食品や飲料のような一般食品や、特定保健用食品、栄養機能食品等の保健機能食品、あるいは飼料へ添加し、あるいはサプリメントとして利用することができる。
本発明において「食品」とは、食品全般（飲料を含む）を意味するが、いわゆる健康食品を含む一般食品の他、厚生労働省の保健機能食品制度に規定される特定保健用食品や栄養機能食品をも含むものであり、さらにサプリメントも包含される。
本発明における食品は、WDR6の発現もしくは活性を抑制する物質を、適宜の食品として許容される担体、例えば、各種加工用食材、調味料、香料、甘味料等とともに使用して、自体公知の方法で製造し、また、散剤、錠剤、カプセル剤、ドリンク剤等の製剤とすることができる。食品として許容される担体には、前記の医薬組成物において薬学的に許容される担体が含まれる。
本発明の食品の製造に際しては、さらに、抗酸化剤等の老化防止に効果のある他の成分、ビタミン類、他の栄養補給用添加剤等を適宜配合することができる。
WDR6の発現もしくは活性を抑制する物質は、上記本発明の食品と同様の目的で、ペット動物や家畜・家禽などの非ヒト動物用の飼料として利用することができる。本発明における飼料は、適宜の飼料として許容される担体、例えば、通常の飼料材等を使用して自体公知の方法で製造できる。飼料として許容される担体には、前記の医薬組成物において薬学的に許容される担体が含まれる。動物への投与は、前記したヒトへの投与と同様か、あるいは通常の飼料に添加することによって行うことができる。
本発明の食品および飼料に含まれる、WDR6の発現もしくは活性を抑制する物質の量は、特に限定されないが、１日あたりの摂取量が上記した本発明の医薬または動物薬における投与量と同様の範囲となるようにするのが好ましい。
前述の通り、インスリン/IGF-1シグナル伝達系は、中枢において、摂食抑制ホルモン前駆体の転写活性化および摂食促進ホルモンの転写抑制や、GLUT2活性化による糖取り込み促進により神経を興奮させることで摂食抑制などに関与し、末梢においては、例えば、肝臓における脂肪酸合成亢進や脂肪細胞における脂肪分解抑制などに関与している。したがって、WDR6の発現もしくは活性を増強する物質、例えば、WDR6またはその部分ペプチド、それをコードする核酸、WDR6に対するアゴニスト抗体、WDR6に対してアンタゴニスト活性を示す低分子化合物等は、インスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用を抑制して、摂食促進、脂肪代謝促進等の効果を発揮することにより、摂食障害（例、拒食症、過食症からの反転による拒食等）や代謝疾患（例、血中脂質濃度を改善することによる）等の疾患の予防・治療剤などとして使用することができる。
さらに、IRS-4はインスリン刺激によりPI3-キナーゼ、PKB/Aktを活性化してアポトーシスを抑制し、細胞生存を促進する役割を果たすと考えられる。WDR6はIRS-4のリン酸化制御を介してインスリンからのシグナルを負に調節するので、WDR6の発現もしくは活性を増強する物質はまた、アポトーシス促進剤、細胞増殖/分化抑制剤などとして、癌や自己免疫疾患（例、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎等）などの疾患の予防・治療に効果を発揮し得ると考えられる。
WDR6またはその部分ペプチド、それをコードする核酸、WDR6に対するアゴニスト抗体、またはWDR6に対してアンタゴニスト活性を示す低分子化合物を含有する医薬または動物薬は低毒性であり、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは他の温血動物（例、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル、トリなど）に対して経口的または非経口的（例、血管内投与、皮下投与など）に投与することができる。
WDR6またはその部分ペプチド、WDR6に対するアゴニスト抗体、またはWDR6に対してアンタゴニスト活性を示す低分子化合物を上記の摂食障害、代謝疾患、癌、自己免疫疾患の予防・治療剤などの医薬または動物薬として使用する場合、上記のWDR6に対する中和抗体やWDR6に対してアンタゴニスト活性を示す低分子化合物と同様の方法により製剤化し、同様の投与経路・用量で投与することができる。また、WDR6またはその部分ペプチドをコードする核酸を上記の医薬または動物薬として使用する場合、上記の本発明のアンチセンス核酸と同様の方法により製剤化し、同様の投与経路・用量で投与することができる。
但し、WDR6の発現もしくは活性を増強する物質は、インスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用を抑制するので、神経細胞保護作用を抑制したり、末梢における糖代謝を変化させたりして、投与対象にとって望ましくない副作用を生じる可能性がある。したがって、WDR6の発現もしくは活性を増強する物質は、インスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用もしくはIRS-4の下流因子の活性化を抑制すべき部位（例えば、視床下部等の中枢や、肝臓、脂肪組織、骨格筋などの末梢）に、局所的に投与されることがより安全であり得る。
（II）インスリン/IGF-1シグナル伝達系の異常等の診断剤
WDR6をコードする核酸またはその一部（以下、「本発明のセンス核酸」という場合がある）および本発明のアンチセンス核酸は、プローブやプライマーとして使用することにより、ヒトまたは他の温血動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル、トリなど）におけるWDR6をコードするDNAまたはmRNAの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該DNAまたはmRNAの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該DNAまたはmRNAの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断剤として有用である。
本発明のセンスまたはアンチセンス核酸を用いる上記の遺伝子診断は、例えば、自体公知のノーザンハイブリダイゼーションやPCR-SSCP法（ゲノミックス（Genomics），第5巻，874〜879頁（1989年）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ユーエスエー（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America），第86巻，2766〜2770頁（1989年））などにより実施することができる。
例えば、ノーザンハイブリダイゼーション等によりWDR6の発現低下が検出された場合は、例えば、WDR6の機能不全が関与する疾患に罹患している可能性が高いか、あるいは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。WDR6の機能不全が関与する疾患としては、例えば、インスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用の異常亢進に関連する疾患、例えば、摂食障害、低血糖、脂肪代謝異常が関与する代謝疾患、癌、自己免疫疾患（例、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎等）などが挙げられる。
また、ノーザンハイブリダイゼーション等によりWDR6の発現過多が検出された場合は、例えば、WDR6の過剰発現が関与する疾患に罹患している可能性が高いか、あるいは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。WDR6の過剰発現が関与する疾患としては、例えば、インスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用の不全に関連する疾患、例えば、神経変性疾患（例：アルツハイマー病、ダウン症、ポリグルタミン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、プリオン病、小脳変性症等）；摂食障害；肥満、インスリン抵抗性、糖尿病、糖尿病合併症（例：ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症）、耐糖能異常、高脂血症等の代謝疾患；高血圧、動脈硬化、虚血性心疾患、脳血管障害などの他の生活習慣病などが挙げられる。
本発明の抗体は、WDR6を特異的に認識することができるので、被験試料中のWDR6の検出に使用することができる。
すなわち、本発明は、
（ｉ）本発明の抗体と、被験試料および標識化されたWDR6とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化されたWDR6の割合を測定することを特徴とする被験試料中のWDR6の定量法、および
（ii）被験試料と、担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された別の本発明の抗体とを、同時あるいは連続的に反応させた後、不溶化担体上の標識剤の量（活性）を測定することを特徴とする被験試料中のWDR6の定量法を提供する。
上記（ii）の定量法においては、２種の抗体はWDR6の異なる部分を認識するものであることが望ましい。例えば、一方の抗体がWDR6のＮ端部を認識する抗体であれば、他方の抗体としてWDR6のＣ端部と反応するものを用いることができる。
また、WDR6に対するモノクローナル抗体を用いてWDR6の定量を行うことができるほか、組織染色等による検出を行うこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のF(ab')2、Fab'、あるいはFab画分を用いてもよい。
本発明の抗体を用いるWDR6の定量法は、特に制限されるべきものではなく、被験試料中の抗原量（例えば、WDR6量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔125I〕、〔131I〕、〔3H〕、〔14C〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−（ストレプト）アビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化にあたっては、物理吸着を用いてもよく、また通常蛋白質あるいは酵素等を不溶化・固定化するのに用いられる化学結合を用いてもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等があげられる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明の抗体に被験試料を反応させ（１次反応）、さらに標識化した別の本発明の抗体を反応させ（２次反応）た後、不溶化担体上の標識剤の量（活性）を測定することにより被験試料中のWDR6量を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序で行っても、また、同時に行ってもよいし、時間をずらして行ってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相化抗体あるいは標識化抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
サンドイッチ法によるWDR6の測定法においては、１次反応と２次反応に用いられる本発明の抗体は、WDR6の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。例えば、上述のように、２次反応で用いられる抗体が、WDR6のＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗体としては、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。
本発明の抗体は、サンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどにも用いることができる。
競合法では、被験試料中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させた後、未反応の標識抗原(Ｆ)と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被験試料中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、ポリエチレングリコールや前記抗体（１次抗体）に対する２次抗体などを用いてＢ／Ｆ分離を行う液相法、および、１次抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは１次抗体は可溶性のものを用い、２次抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
イムノメトリック法では、被験試料中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被験試料中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させた後、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被験試料中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被験試料中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えてWDR6の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
例えば、入江 寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」 Vol. 70(Immunochemical Techniques(Part A))、 同書 Vol. 73(Immunochemical Techniques(Part B))、 同書 Vol. 74(Immunochemical Techniques(Part C))、 同書 Vol. 84(Immunochemical Techniques(Part D : Selected Immunoassays))、 同書 Vol. 92(Immunochemical Techniques(Part E : Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、 同書 Vol. 121(Immunochemical Techniques(Part I : Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))(以上、アカデミックプレス社発行)などを参照することができる。
以上のようにして、本発明の抗体を用いることによって、WDR6を感度よく定量することができる。
したがって、被験温血動物由来の生体試料（例、血液、血漿、血清、リンパ液、脳脊髄液、関節液、精液、尿、生検サンプル等）を被験体とし、本発明の抗体を用いて該被験体中のWDR6の濃度を定量することによって、WDR6濃度の減少が検出された場合、例えば、インスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用の異常亢進に関連する疾患、例えば、摂食障害、低血糖、脂肪代謝異常が関与する代謝疾患、癌、自己免疫疾患（例、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎等）などの疾患に罹患しているか、あるいは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
一方、WDR6濃度の増加が検出された場合には、例えば、インスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用の不全に関連する疾患、例えば、神経変性疾患（例：アルツハイマー病、ダウン症、ポリグルタミン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、プリオン病、小脳変性症等）；摂食障害；肥満、インスリン抵抗性、糖尿病、糖尿病合併症（例：ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症）、耐糖能異常、高脂血症等の代謝疾患；高血圧、動脈硬化、虚血性心疾患、脳血管障害等の他の生活習慣病などの疾患に罹患しているか、あるいは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
（III）インスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用調節剤のスクリーニング
本発明はまた、WDR6を産生する能力を有する細胞における該タンパク質（遺伝子）の発現を、試験化合物の存在下と非存在下で比較することを特徴とする、インスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用を調節する物質のスクリーニング方法を提供する。
WDR6の発現量は、前記した本発明のセンス核酸または本発明のアンチセンス核酸（以下、これらを包括して「本発明の核酸」という）を用いて、WDR6のmRNAを検出することにより、RNAレベルで測定することができる。あるいは、該発現量は、前記した本発明の抗体を用いて、WDR6タンパク質を検出することにより、タンパク質レベルで測定することもできる。
従って、より具体的には、本発明は、
（a）WDR6を産生する能力を有する細胞を試験化合物の存在下および非存在下に培養し、両条件下における該タンパク質をコードするmRNAの量を、本発明の核酸を用いて測定、比較することを特徴とする、インスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用を調節する物質のスクリーニング方法、および
（b）WDR6を産生する能力を有する細胞を試験化合物の存在下および非存在下に培養し、両条件下における該タンパク質の量を、本発明の抗体を用いて測定、比較することを特徴とする、インスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用を調節する物質のスクリーニング方法を提供する。
例えば、WDR6のmRNA量またはタンパク質量の測定は、具体的には以下のようにして行うことができる。
（i）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど、あるいは、肥満/糖尿病マウス（例、ob/obマウス、db/dbマウス、Ayマウス、KKマウス等）、肥満/糖尿病ラット（例、Zucker obeseラット、GKラット等）、高血圧ラット、動脈硬化ウサギ、アルツハイマー病モデルマウス（例、Tg2576マウス等）など）に対して、薬剤（例えば、抗肥満薬、抗糖尿病薬、降圧薬、血管作用薬、神経細胞保護剤など）あるいは物理的ストレス（例えば、浸水ストレス、電気ショック、明暗、低温など）などを与え、一定時間経過した後に、血液、あるいは特定の臓器・組織（例えば、脳、視床下部、肝臓、脂肪組織、骨格筋など）、あるいは細胞（例えば、神経細胞、肝細胞、脂肪細胞、筋細胞など）を得る。
得られた細胞等に含まれるWDR6 mRNAは、例えば、通常の方法により該細胞等からmRNAを抽出し、例えば、TaqMan PCRなどの手法を用いることにより定量することができ、自体公知の手段によりノーザンブロットを行なうことにより解析することもできる。一方、WDR6タンパク質量は、ウェスタンブロット解析や以下に詳述する各種イムノアッセイ法を用いて定量することができる。
（ii）WDR6またはその部分ペプチドを発現する形質転換体を前述の方法に従って作製し、該形質転換体に含まれるWDR6またはその部分ペプチドあるいはそれをコードするmRNAを同様にして定量、解析することができる。
試験化合物としては、例えばタンパク質、ペプチド、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などが挙げられ、これらの物質は新規なものであってもよいし、公知のものであってもよい。
WDR6の発現量を変化させる物質のスクリーニングは、
（i）正常あるいは疾患モデル非ヒト哺乳動物に対して、薬剤あるいは物理的ストレスなどを与える一定時間前（30分前ないし24時間前、好ましくは30分前ないし12時間前、より好ましくは1時間前ないし6時間前）もしくは一定時間後（30分後ないし3日後、好ましくは1時間後ないし2日後、より好ましくは1時間後ないし24時間後）、または薬剤あるいは物理的ストレスと同時に試験化合物を投与し、投与後一定時間経過後（30分後ないし3日後、好ましくは1時間後ないし2日後、より好ましくは1時間後ないし24時間後）、該動物から単離した細胞に含まれるWDR6をコードするmRNA量、あるいはWDR6タンパク質量を定量、解析することにより、あるいは
（ii）形質転換体を常法に従い培養する際に試験化合物を培地中に混合させ、一定時間培養後（1日後ないし7日後、好ましくは1日後ないし3日後、より好ましくは2日後ないし3日後）、該形質転換体に含まれるWDR6をコードするmRNA量、あるいはWDR6タンパク質量を定量、解析することにより行うことができる。
上記（b）のスクリーニング方法におけるWDR6タンパク質の量の測定は、具体的には、例えば、
（i）本発明の抗体と、被験試料および標識化されたWDR6タンパク質とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化されたタンパク質を検出することにより該試料中のWDRタンパク質を定量する方法、
（ii）被験試料と、担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された別の本発明の抗体とを、同時あるいは連続的に反応させた後、不溶化担体上の標識剤の量（活性）を測定することにより、該試料中のWDR6タンパク質を定量する方法等が挙げられる。
具体的な測定は、前記した本発明の抗体を用いた診断法と同様にして行うことができる。
例えば、上記のスクリーニング方法において、試験化合物の存在下におけるWDR6の発現量が、試験化合物の非存在下における発現量に比べて、約20％以上、好ましくは30％以上、より好ましくは約50％以上阻害された場合に、該試験化合物を、WDR6の発現を抑制する物質として選択することができる。一方、試験化合物の存在下におけるWDR6の発現量が、試験化合物の非存在下における発現量に比べて、約20％以上、好ましくは30％以上、より好ましくは約50％以上増大した場合に、該試験化合物を、WDR6の発現を増強する物質として選択することができる。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、WDR6の発現量を変化させることにより、インスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用を調節するための安全で低毒性な医薬として有用である。
前述のとおり、WDR6の発現を抑制する物質は、WDR6とIRS-4との相互作用を抑制することによってインスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用を増強するので、老化；神経変性疾患（例：アルツハイマー病、ダウン症、ポリグルタミン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、プリオン病、小脳変性症等）；摂食障害；肥満、インスリン抵抗性、糖尿病、糖尿病合併症（例：ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症）、耐糖能異常、高脂血症等の代謝疾患；高血圧、動脈硬化、虚血性心疾患、脳血管障害等の他の生活習慣病などの病態または疾患の予防および改善/治療剤などとして使用することができる。また、WDR6の発現を抑制する物質は、IRS-4との相互作用を抑制することによって、FGFやNGFからのシグナルを介しても神経細胞保護作用を発揮し得る。
一方、WDR6の発現を増強する物質は、インスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用を抑制して、摂食促進、脂肪代謝促進等の効果を発揮することにより、摂食障害や脂肪代謝異常が関与する代謝疾患等の疾患の予防・治療剤などとして使用することができる。また、WDR6の発現を増強する物質は、インスリン刺激によるIRS-4を介したPI3-キナーゼ、PKB/Aktの活性化を阻害するので、アポトーシス促進剤、細胞増殖/分化抑制剤などとして、癌や自己免疫疾患（例、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎等）などの疾患の予防・治療に効果を発揮し得る。
WDR6の発現を調節する物質を上記医薬として使用する場合は、前記WDR6に対してアゴニストもしくはアンタゴニスト活性を示す低分子化合物等と同様にして製剤化し、同様の投与経路、用量で投与することができる。
本発明はまた、WDR6またはその部分ペプチド、あるいはそれを産生する細胞を用いることによる、インスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用を調節する物質のスクリーニング方法を提供する。該スクリーニング方法は、（A）WDR6とIRS-4の結合性を利用する方法、（B）IRS-4の活性化（リン酸化）の程度を指標とする方法に大別される。いずれの方法においても、IRS-4もしくはWDR6との結合能を保持するその部分ペプチド、あるいはそれを産生する細胞がさらに用いられる。
（A）WDR6とIRS-4の結合性を利用するスクリーニング方法
WDR6はIRS-4と結合してそのリン酸化を制御することができるので、WDR6またはその部分ペプチドとIRS-4またはその部分ペプチドを用いたバインディングアッセイ系を構築することによって、WDR6またはその部分ペプチドと同様の作用を有する化合物のスクリーニングや、WDR6またはその部分ペプチドの作用を阻害する化合物のスクリーニングを行うことができる。すなわち、本発明は、WDR6またはその部分ペプチドとIRS-4またはその部分ペプチドを用いる、インスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用を調節する物質のスクリーニング方法を提供する。
より具体的には、本発明は、
(a)(1)IRS-4またはその部分ペプチドに、WDR6またはその部分ペプチドを接触させた場合と(2)IRS-4またはその部分ペプチドに、WDR6またはその部分ペプチドおよび試験化合物を接触させた場合との、IRS-4またはその部分ペプチドとWDR6またはその部分ペプチドとの結合量の比較を行うことを特徴とする、インスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用を調節する物質のスクリーニング方法、
(b)(1)IRS-4またはその部分ペプチドを産生する細胞に、WDR6またはその部分ペプチドを接触させた場合と(2)IRS-4またはその部分ペプチドを産生する細胞に、WDR6またはその部分ペプチドおよび試験化合物を接触させた場合との、IRS-4またはその部分ペプチドとWDR6またはその部分ペプチドとの結合量の比較を行うことを特徴とする、インスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用を調節する物質のスクリーニング方法、および
（ｃ）IRS-4またはその部分ペプチドおよびWDR6またはその部分ペプチドを産生し、且つ両者が結合した場合にレポーター遺伝子の転写が活性化される細胞における該レポーター遺伝子の発現量を、試験化合物の存在下と非存在下とで比較することを特徴とする、インスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用を調節する物質のスクリーニング方法を提供する。
上記(a)または(b)のスクリーニング方法において用いられるIRS-4は、ヒトまたは他の温血動物の細胞から自体公知の方法（例えば、WDR6について上記したと同様の方法）を用いて単離精製することができる。IRS-4の部分ペプチドは、WDR6との結合に必要なドメインのアミノ酸配列を有する限り特に制限されず、インスリン受容体のチロシンキナーゼによりリン酸化されるリン酸化部位などを含んでいてもよい。該部分ペプチドはIRS-4を適当な蛋白質分解酵素を用いて消化することにより得ることができる。また、IRS-4およびその部分ペプチドは、自体公知の遺伝子工学的手法に従ってそれをコードするDNAをクローニングした後、前記したWDR6の発現方法に従って組換え生産することもできる。
WDR6およびその部分ペプチド（以下、単にWDR6という場合がある）は、上記の方法に従って調製することができる。
IRS-4を産生する細胞としては、それを発現するヒトまたは他の温血動物細胞であれば特に制限はない。また、IRS-4またはその部分ペプチド（以下、単にIRS-4という場合がある）を産生する細胞としては、上記の遺伝子工学的手法により作製された形質転換体が例示される。
試験化合物としては、例えばタンパク質、ペプチド、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などが挙げられ、これらの物質は新規なものであってもよいし、公知のものであってもよい。
結合量の測定は、例えば、標識した抗WDR6抗体および抗IRS-4抗体を用いたウェスタンブロット解析、WDR6またはIRS-4のいずれかを標識（例えば、〔3H〕、〔125I〕、〔14C〕、〔35S〕などで）しての結合アッセイやゲルシフトアッセイ、あるいは表面プラズモン共鳴（SPR）などにより行うことができる。
上記のスクリーニング方法において、IRS-4と結合してWDR6とIRS-4との結合を阻害する化合物を、インスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用を調節する物質として選択することができる。
本スクリーニング方法において、WDR6とIRS-4との反応は、通常約37℃で数時間程度行うことができる。
例えば、標識WDR6を用いた結合アッセイにより上記のスクリーニング方法を実施するには、まず、IRS-4またはそれを産生する細胞をスクリーニングに適したバッファーに懸濁することによりIRS-4標品を調製する。バッファーは、pH約4〜10（望ましくは、pH約6〜8）のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどの、WDR6とIRS-4との結合を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。また、非特異的結合を低減させる目的で、CHAPS、Tween-80TM（花王−アトラス社）、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性剤をバッファーに加えることもできる。さらに、プロテアーゼによるWDR6やIRS-4の分解を抑える目的で、PMSF、ロイペプチン、バシトラシン、アプロチニン、E-64（タンパク質研究所製）、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。
一方、細胞が固定化細胞の場合、培養器に固定化させたまま、つまり細胞を生育させた状態で、あるいはグルタルアルデヒドやパラホルムアルデヒドで固定した細胞を用いて、WDR6とIRS-4を結合させることができる。この場合、該緩衝液は培地やハンクス液などが用いられる。
そして、0.01ml〜10mlの該IRS-4標品に、一定量（例えば、2000Ci/mmolの場合、約10000cpm〜1000000cpm）の標識したWDR6（例えば、〔125I〕で標識したWDR6）を添加し、同時に10-4M〜10-10Mの被検物質を共存させる。非特異的結合量（NSB）を知るために大過剰の未標識のWDR6を加えた反応チューブも用意する。反応は0℃〜50℃、望ましくは4℃〜37℃で20分〜24時間、望ましくは30分〜3時間行う。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過（IRS-4産生細胞を用いる場合）またはＢ／Ｆ分離（精製IRS-4を用いる場合）し、適量の同バッファーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙または固相に残存する放射活性（例えば、〔125I〕の量）を液体シンチレーションカウンターまたはγ−カウンターで測定する。拮抗する物質がない場合のカウント(B0)から非特異的結合量（NSB）を引いたカウント（B0-NSB）を100%とした時、特異的結合量（B-NSB）が、例えばカウント（B0-NSB）の50%以下になる被検物質をIRS-4活性化調節物質として選択することができる。
本発明のスクリーニング用キットは、WDR6、好ましくはさらにIRS-4またはそれを産生する細胞を含有するものである。
本発明のスクリーニング用キットの例としては次のものが挙げられるが、これに限定されるものではない。
〔スクリーニング用試薬〕
1) 測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution（ギブコ社製）に、0.05%のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたもの。孔径0.45μmのフィルターで濾過滅菌し、4℃で保存するか、あるいは用時調製しても良い。
2) IRS-4標品
HeLa細胞またはHEK293細胞を12穴プレートに5×105個/穴で継代し、37℃、5%CO2、９５%airで2日間培養したもの。
3) 標識したWDR6標品
WDR6を〔3H〕、〔125I〕、〔14C〕、〔35S〕などで標識したもの。
4) WDR6標準液
WDR6を0.1%ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を含むPBSで0.1mMとなるように溶解し、-20℃で保存したもの。
〔測定法〕
1) 12穴組織培養用プレートにて培養したIRS-4産生細胞を、測定用緩衝液1mlで2回洗浄した後、490μlの測定用緩衝液を各穴に加える。
2) 10-3〜10-10Mの被検物質溶液を5μl加えた後、5nMの標識したWDR6を5μl加え、室温にて1時間反応させる。非特異的結合量を知るためには被検物質のかわりに10-4MのWDR6を５μｌ加えておく。
3) 反応液を除去し、1mlの洗浄用緩衝液で3回洗浄する。細胞に結合した標識WDR6を0.5mlの0.2N NaOH-1%SDSで溶解し、4mlの液体シンチレーターＡ（和光純薬製）と混合する。
4) 液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）を用いて放射活性を測定し、Percent Maximum Binding（PMB）を次式（数１）で求める。なお、〔125I〕で標識されている場合は、液体シンチレーターと混合することなしに直接ガンマーカウンターで測定できる。
PMB: Percent Maximum Binding
B : 検体を加えた時の結合量
NSB: Non-specific Binding（非特異的結合量）
B0: 最大結合量
上記(c)のスクリーニング法において用いられる細胞としては、(1)IRS-4またはその部分ペプチドと転写因子（例えば、GAL4、VP16等）の結合ドメインもしくは転写活性化ドメインのいずれか一方との融合蛋白質をコードする、(2)WDR6またはその部分ペプチドと転写因子の他方のドメインとの融合蛋白質をコードするDNA、および(3)該転写因子により活性化されるプロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子を含有する細胞、好ましくは酵母細胞、哺乳動物細胞等が挙げられる。レポーター遺伝子としては、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、アルカリフォスファターゼ遺伝子、ペルオキシダーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、グリーンフルオレセントプロテイン（GFP）遺伝子などが挙げられる。
本スクリーニング方法において、上記の細胞を、使用する宿主細胞に適合した培養条件下で数時間〜1日程度培養した後、細胞抽出液または上清液を得て、常法によりレポーター遺伝子の検出を行う。
上記のスクリーニング方法において、レポーター遺伝子の発現を調節する化合物を、インスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用を調節する物質として選択することができる。
（B）IRS-4の活性化を指標とするスクリーニング方法
WDR6とIRS-4との相互作用に及ぼす試験化合物の効果をIRS-4の活性化を測定することにより調べれば、該物質がIRS-4の活性化を抑制するか、あるいは促進するかを直接評価することができる。すなわち、本発明は、IRS-4またはその部分ペプチドを産生する細胞における該蛋白質もしくは該ペプチドの活性化を、(1)WDR6またはその部分ペプチドの存在下と、(2)WDR6またはその部分ペプチドおよび試験化合物の存在下とで、測定・比較することによる、インスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用を調節する物質のスクリーニング方法を提供する。
本スクリーニング法において、IRS-4またはその部分ペプチドを産生する細胞（以下、単にIRS-4産生細胞という場合がある）としては、IRS-4を内因的に産生する細胞や、IRS-4またはその部分ペプチドをコードするDNAを導入された動物細胞などが挙げられる。
WDR6またはその部分ペプチド（以下、単にWDR6という場合がある）は外部から細胞に添加してもよいし、あるいはIRS-4産生細胞自体が産生するものであってもよい。後者の場合、WDR6は内因的に産生されてもよいし、IRS-4産生細胞を宿主として上記WDR6の発現方法に従って遺伝子工学的に作製された形質転換体であってもよい。
試験化合物としては、例えばタンパク質、ペプチド、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などが挙げられ、これらの物質は新規なものであってもよいし、公知のものであってもよい。
IRS-4の活性化は、IRS-4の自己リン酸化、IRS-4カスケードの下流に位置するキナーゼ（例えば、PI3K、PKB/Akt等）やIRS-4の基質となり得る他の蛋白質もしくは合成ペプチドのリン酸化などを測定することにより評価することができる。
具体的には、まずIRS-4産生細胞をマルチウェルプレート等に培養する。スクリーニングを行うにあたっては、前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、試験化合物（細胞がWDR6を産生しない場合はさらにWDR6）などを添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。
IRS-4や他の蛋白質もしくはペプチドのリン酸化の検出は、リン酸化蛋白質（ペプチド）特異的抗体を用いたウェスタンブロット解析や、基質蛋白質（ペプチド）における[32P]標識ATPの取込みをゲル電気泳動およびオートラジオグラフィーにより検出する等の方法により行うことができる。
上記のスクリーニング方法において、IRS-4産生細胞に試験化合物を添加した際にIRS-4の活性が増大（IRS-4や他の蛋白質もしくはペプチドのリン酸化の程度が増大）した場合、該化合物をインスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用を増強させる物質として選択することができる。一方、試験化合物を添加した際にIRS-4の活性が低下（IRS-4や他の蛋白質もしくはペプチドのリン酸化の程度が低減）した場合、該化合物をインスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用を抑制する物質として選択することができる。
例えば、上記のスクリーニング方法において、試験化合物の存在下におけるIRS-4のリン酸化の程度が、試験化合物の非存在下におけるそれに比べて、約20％以上、好ましくは30％以上、より好ましくは約50％以上増大した場合に、該化合物をインスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用を増強させる物質として選択することができる。一方、試験化合物の存在下におけるIRS-4のリン酸化の程度が、試験化合物の非存在下におけるそれに比べて、約20％以上、好ましくは30％以上、より好ましくは約50％以上低下した場合に、該化合物をインスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用を抑制する物質として選択することができる。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、インスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用を調節するための安全で低毒性な医薬として有用である。
前述のとおり、インスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用を増強させる物質は、老化；神経変性疾患（例：アルツハイマー病、ダウン症、ポリグルタミン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、プリオン病、小脳変性症等）；摂食障害；肥満、インスリン抵抗性、糖尿病、糖尿病合併症（例：ケトーシス、アシドーシス、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症）、耐糖能異常、高脂血症等の代謝疾患；高血圧、動脈硬化、虚血性心疾患、脳血管障害等の他の生活習慣病などの病態または疾患の予防および改善/治療剤などとして使用することができる。また、WDR6とIRS-4との相互作用を抑制することによって、FGFやNGFからのシグナルを介しても神経細胞保護作用を発揮し得る。
一方、インスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用を抑制する物質は、摂食促進、脂肪代謝促進等の効果を発揮することにより、摂食障害や脂肪代謝が関与する代謝疾患等の疾患の予防・治療剤などとして使用することができる。また、インスリン刺激によるIRS-4を介したPI3-キナーゼ、PKB/Aktの活性化を阻害するので、アポトーシス促進剤、細胞増殖/分化抑制剤などとして、癌や自己免疫疾患（例、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎等）などの疾患の予防・治療に効果を発揮し得る。
WDR6の活性を調節する物質を上記医薬として使用する場合は、前記WDR6に対してアゴニストもしくはアンタゴニスト活性を示す低分子化合物等と同様にして製剤化し、同様の投与経路、用量で投与することができる。
本発明はまた、被験物質を動物に投与し、該動物の視床下部における、E2D3、PKCβ、EAAC1、Fth1およびASSからなる群より選択される１以上の遺伝子、並びに／あるいは配列番号：１３で表される塩基配列を含む核酸および／または配列番号：１４で表される塩基配列を含む核酸の発現を調べることを含む、該物質の神経細胞保護作用の評価方法を提供する。
E2D3、PKCβ、EAAC1、Fth1およびASS遺伝子のcDNA配列、およびそれらにコードされる蛋白質のアミノ酸配列の例は、それぞれ配列番号：３および４、配列番号：５および６、配列番号：７および８、配列番号：９および１０、並びに配列番号：１１および１２に記載されている。また、配列番号：１３で表される塩基配列および配列番号：１４で表される塩基配列からなるESTは、GenBankにBF396681およびBF394337としてそれぞれ登録されている。
これらの遺伝子および／または核酸の発現は、WDR6について前記したと同様の方法で、それらをコードする核酸や、それらに対する抗体を用いて測定することができる。被験物質の投与や発現量の測定は、WDR6の発現量を変化させる化合物のスクリーニングにおいて前記したと同様の方法が適宜用いられる。
被験物質の投与群において、非投与群と比較してこれらの遺伝子および／または核酸の発現量が有意に変化した場合、該物質を神経細胞保護作用を有する物質の候補として選択することができる。
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
DNA ：デオキシリボ核酸
cDNA ：相補的デオキシリボ核酸
A ：アデニン
T ：チミン
G ：グアニン
C ：シトシン
RNA ：リボ核酸
mRNA ：メッセンジャーリボ核酸
dATP ：デオキシアデノシン三リン酸
dTTP ：デオキシチミジン三リン酸
dGTP ：デオキシグアノシン三リン酸
dCTP ：デオキシシチジン三リン酸
ATP ：アデノシン三リン酸
EDTA ：エチレンジアミン四酢酸
SDS ：ドデシル硫酸ナトリウム
Gly ：グリシン
Ala ：アラニン
Val ：バリン
Leu ：ロイシン
Ile ：イソロイシン
Ser ：セリン
Thr ：スレオニン
Cys ：システイン
Met ：メチオニン
Glu ：グルタミン酸
Asp ：アスパラギン酸
Lys ：リジン
Arg ：アルギニン
His ：ヒスチジン
Phe ：フェニルアラニン
Tyr ：チロシン
Trp ：トリプトファン
Pro ：プロリン
Asn ：アスパラギン
Gln ：グルタミン
pGlu ：ピログルタミン酸
Me ：メチル基
Et ：エチル基
Bu ：ブチル基
Ph ：フェニル基
TC ：チアゾリジン-4(R)-カルボキサミド基
また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記する。
Tos ：p-トルエンスルフォニル
CHO ：ホルミル
Bzl ：ベンジル
Cl2Bzl ：2,6-ジクロロベンジル
Bom ：ベンジルオキシメチル
Z ：ベンジルオキシカルボニル
Cl-Z ：2-クロロベンジルオキシカルボニル
Br-Z ：2-ブロモベンジルオキシカルボニル
Boc ：t-ブトキシカルボニル
DNP ：ジニトロフェノール
Trt ：トリチル
Bum ：t-ブトキシメチル
Fmoc ：N-9-フルオレニルメトキシカルボニル
HOBt ：1-ヒドロキシベンズトリアゾール
HOOBt ：3,4-ジヒドロ-3-ヒドロキシ-4-オキソ-1,2,3-ベンゾトリアジン
HONB ：1-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド
DCC ：N,N’-ジシクロヘキシルカルボジイミド
以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
実施例１ サブトラクションライブラリーの作製
8週齢の雄のWistarラットよりサブトラクションに使用したサンプルの抽出を行った。48時間絶食後および通常摂食中のラットを断頭により屠殺し、脳を取り出し、脳スライス作製ホルダーをもちいてPalkovitsとBrownsteinの方法に従い、弓状核を含む脳スライスをカミソリをもちいて取り出し、さらに視床下部、大脳皮質、海馬、そして小脳にわけて保存した。定法に従いmRNAを抽出し、サブトラクションキット（クロンテック社製）をもちいて絶食によって発現が上昇する遺伝子を含むライブラリー（絶食後視床下部−摂食後視床下部）および視床下部特異的遺伝子ライブラリー（視床下部−（大脳皮質+海馬+小脳）を作製した。
実施例２ スクリーニング
サブトラクションライブラリーからランダムにそれぞれ160個の大腸菌コロニーを単離してスクリーニングを行った。1次スクリーニングを、サブトラクションに使用したものと同じ2種類のcDNA（引き算するものとされるもの）をもちいてハイブリダイゼーション法により行った。そして、引き算されるもの由来のcDNAとハイブリダイゼーションさせた場合、引き算するもの由来cDNAとのそれよりも3倍以上のものを陽性と判断し、DNAシークエンスによって遺伝子配列決定後、特異的プライマーを作製し、2次スクリーニングを半定量的RT-PCR法により解析し、その結果発現量が有意に異なっていたものを同定した。結果を図１および２に示す。
48時間絶食後、および摂食後のラット視床下部由来cDNAをもちいて半定量的RT-PCRにより遺伝子の発現変化を解析したところ、図１に示される4つの遺伝子の発現が絶食後の視床下部において上昇していた。その発現増加量は1.3-1.6倍であった（表1参照）。
また、48時間絶食後のラット視床下部、海馬、大脳皮質、小脳由来cDNAをもちいて半定量的RT-PCRにより遺伝子発現を解析したところ、図２に示される4つの遺伝子の発現が絶食後の視床下部において他の脳領域と比較して上昇していた。その発現増加量は海馬、大脳皮質、小脳での発現量の平均の1.8-3倍であった（表2参照）。
表1および2で示した遺伝子群の多くはストレス応答に関与し、神経細胞死に対する保護作用があることが考えられる。これらの遺伝子の発現変化をマーカーとした神経変性疾患に対する治療薬等の評価を行うことができると考えられる。
実施例３ WDR6とIRS-4との相互作用
ラット脳由来タンパク質を用い、特異的抗体を用いた免疫沈降法により、IRS-4とWDR6が結合することがわかった。結果を図３および４に示す。IRS-4は特に脳視床下部弓状核におけるインスリンシグナルの重要な媒介役となっていることが示唆されており、WDR6がこの領域におけるインスリン/IGF-1の重要な制御因子であることを示唆している。
IRS-4はリン酸化の度合いによりSDSポリアクリルアミド電気泳動による移動度が変化することが知られている。図４において**で示したリン酸化IRS-4のバンドは、粗抽出物と比較してWDR6による免疫沈降により沈降するIRS-4において多く見られた。データベース検索の結果、WDR6はホスファターゼ制御領域と相同性のある領域を持っており、WDR6とIRS-4との結合により、IRS-4のリン酸化状態が変化する可能性を示唆している。絶食後と摂食後とで、IRS-4とWDR6の相互作用は変化していなかった（図４）。
実施例４ CRおよびGH/IGF-I抑制ラット視床下部弓状核におけるWDR6遺伝子発現変化
野生型Wistarラット（-/-）および成長ホルモンアンチセンストランスジェニック（tg/-）ラットの視床下部弓状核におけるWDR6の遺伝子発現を、自由摂食（AL）およびカロリー制限（CR）下で、リアルタイムPCR法により定量、比較した。CRはALの摂食量の70%になるように食餌を制限して6週齢より6ヶ月間飼育した。結果を図５に示す。
-/-ラットはCRによりその発現が低下していた。また、-/-ラットのALと比較してtg/-ラットではその発現が低下していた。tg/-ラットではCRによるWDR6遺伝子発現の変化は見られなかった。これらの発現変化は、-/-およびtg/-におけるCRでのインスリンおよびIGF-1の血中濃度の変化と似たパターンであり、インスリン/IGF-1シグナル伝達系との関連が示唆された。
実施例５ レプチン脳室内投与の効果
6週齢のFisher 344ラットをAL（自由摂食）またはCR（ALの70%の食餌量）下で飼育し、34週齢の時に第三脳室にレプチン(10ng/h)またはPBS（リン酸緩衝液）を浸透圧ポンプをもちいて14日間導入した。14日後に断頭により屠殺し、上記のように脳スライスを作製し、視床下部弓状核をマイクロダイセクションして切り出し、RNA抽出後、cDNAを合成してリアルタイムPCRによりWDR6遺伝子発現を解析した。PCRのプライマーおよびプローブはアプライドバイオシステムズ社のPrimerExpressソフトウエアをもちいて設計した。結果を図６に示す。CRはWDR6の遺伝子発現を減少させたが、レプチン投与による影響は見られなかった。このことから、CRおよびGH/IGF-I抑制ラットにおけるWDR6の発現低下はインスリン/IGF-1シグナル伝達系によるものであることが示唆された。
実施例６ GT1-7細胞株におけるIGF-1およびインスリン投与によるWDR6遺伝子発現変化
マウス視床下部由来GT1-7細胞株に対するIGF-1およびインスリン投与によるWDR6遺伝子の発現をリアルタイムPCRによって定量した。GT1-7細胞株においてIGF-1投与はWDR6遺伝子発現を投与後30分、1時間後において有意に上昇させた。インスリン投与もまた、2時間後にWDR6の遺伝子発現を有意に上昇させた（図７）。このことからも中枢におけるWDR6の発現低下と血中インスリン/IGF-1濃度との関連が示唆される。
実施例７ Zuckerラット肝臓におけるWDR6遺伝子発現とCRの影響
Zucker lean(+/+)およびobese(fa/fa)ラットに対するCRは肝臓におけるWDR6遺伝子発現を上昇させた（図８）。CRはALの摂食量の70%になるように食餌を制限して6週齢より6ヶ月間飼育した。+/+はfa/faと比較してWDR6の発現が高かった。
実施例８ Zuckerラット視床下部弓状核におけるWRD6遺伝子発現
Zucker lean(+/+)およびobese(fa/fa)ラットの視床下部弓状核におけるWDR6の遺伝子発現を、摂食後および絶食後で、定量的PCR法により定量、比較した。obese(fa/fa)ラットでは、lean(+/+)ラットに比べて、視床下部弓状核におけるWRD6遺伝子発現が減少していた（図９）。
本発明によれば、WDR6の発現および／または活性を抑制する物質は、抗老化剤、神経保護剤、抗肥満剤、抗糖尿病剤、インスリン抵抗性改善剤などとして有用である。一方、WDR6の発現および／または活性を増強する物質は、摂食障害、代謝疾患、低血糖症、癌、自己免疫疾患等の予防・治療剤として有用である。また、本発明のスクリーニング法は、上記疾患の予防・治療薬の探索に有用である。さらに、本発明で得られた他の視床下部特異的遺伝子および絶食誘導性遺伝子を用いた薬剤の評価方法は、神経変性疾患に対する薬効評価等に有用である。
本出願は、日本で出願された特願2007-061075（出願日：平成19年3月9日）を基礎としており、そこに開示される内容は本明細書にすべて包含されるものである。また、ここで述べられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。

Claims (28)

  1. WDR6の発現もしくは活性を抑制する物質を含有してなる医薬または動物薬。
  2. WDR6の発現もしくは活性を抑制する物質が下記(a)〜(c)から選ばれる、請求項１記載の医薬または動物薬。
    (a) WDR6をコードする核酸に対するアンチセンス核酸
    (b) WDR6に対する中和抗体
    (c) WDR6に対してアンタゴニスト活性を示す低分子化合物
  3. インスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用増強剤である、請求項１または２記載の医薬または動物薬。
  4. インスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用がIRS-4の介在するものである、請求項３記載の医薬または動物薬。
  5. インスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用が、神経細胞保護、摂食抑制、糖代謝促進、脂肪酸合成促進、脂肪分解抑制、糖の細胞内取り込み、アポトーシス抑制、細胞増殖促進および細胞分化促進からなる群より選択される１以上である、請求項３記載の医薬または動物薬。
  6. 老化、神経変性疾患、摂食障害、および代謝疾患からなる群より選択される病態または疾患の予防または改善/治療剤である、請求項１〜５のいずれかに記載の医薬または動物薬。
  7. WDR6の発現もしくは活性を抑制する物質を含有してなる食品または飼料。
  8. WDR6の発現もしくは活性を抑制する物質が下記(a)〜(c)から選ばれる、請求項７記載の食品または飼料。
    (a) WDR6をコードする核酸に対するアンチセンス核酸
    (b) WDR6に対する中和抗体
    (c) WDR6に対してアンタゴニスト活性を示す低分子化合物
  9. WDR6の発現もしくは活性を増強する物質を含有してなる医薬または動物薬。
  10. WDR6の発現もしくは活性を増強する物質が下記(a)〜(d)から選ばれる、請求項９記載の医薬または動物薬。
    (a) WDR6またはその部分ペプチド
    (b) WDR6またはその部分ペプチドをコードする核酸
    (c) WDR6に対するアゴニスト抗体
    (c) WDR6に対してアゴニスト活性を示す低分子化合物
  11. インスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用抑制剤である、請求項９または１０記載の医薬または動物薬。
  12. インスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用が、摂食抑制、糖代謝促進、脂肪酸合成促進、脂肪分解抑制、アポトーシス抑制、細胞増殖促進および細胞分化促進からなる群より選択される１以上である、請求項１１記載の医薬または動物薬。
  13. 摂食障害、代謝疾患、癌および自己免疫疾患からなる群より選択される疾患の予防または治療剤である、請求項９〜１２のいずれかに記載の医薬または動物薬。
  14. WDR6に対する抗体またはWDR6をコードする塩基配列もしくはその一部を含む核酸を含有してなる、インスリン/IGF-1シグナル伝達系の異常の診断剤。
  15. WDR6もしくはその部分ペプチドを用いることを特徴とする、インスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用を調節する物質のスクリーニング方法。
  16. インスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用がIRS-4の介在するものである、請求項１５記載の方法。
  17. インスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用が、神経細胞保護、摂食抑制、糖代謝促進、脂肪酸合成促進、脂肪分解抑制、糖の細胞内取り込み、アポトーシス抑制、細胞増殖促進および細胞分化促進からなる群より選択される、請求項１５記載の方法。
  18. 老化、神経変性疾患、摂食障害、代謝疾患、癌および自己免疫疾患からなる群より選択される病態または疾患の予防または改善/治療活性を有する物質を選択するための、請求項１５〜１７のいずれかに記載の方法。
  19. WDR6もしくはその部分ペプチドがそれを産生する細胞の形態で提供されることを特徴とする、請求項１５〜１８のいずれかに記載の方法。
  20. WDR6を産生する細胞がそれを含む動物組織、臓器または個体の形態で提供されることを特徴とする、請求項１９記載の方法。
  21. 下記(a)〜(d)の工程を含む、請求項１５〜２０のいずれかに記載の方法。
    (a) WDR6もしくはその部分ペプチドまたはそれを発現する細胞を被験物質と接触させる工程
    (b) WDR6もしくはその部分ペプチドの発現もしくは活性を測定する工程
    (c) 被験物質の非存在下におけるWDR6もしくはその部分ペプチドの発現もしくは活性と比較する工程
    (d) 被験物質の存在下でのWDR6もしくはその部分ペプチドの発現もしくは活性が、被験物質の非存在下と比較して有意に変化した場合に、該被験物質をインスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用を調節する物質として選択する工程
  22. WDR6をコードする塩基配列もしくはその一部を含む核酸、あるいはWDR6に対する抗体をさらに用いることを特徴とする、請求項１９または２０記載の方法。
  23. IRS-4もしくはその部分ペプチドをさらに用いることを特徴とする、請求項１５〜２２のいずれかに記載の方法。
  24. WDR6もしくはその部分ペプチドの活性が、IRS-4もしくはその部分ペプチドとの結合性またはIRS-4もしくはその部分ペプチドのリン酸化の程度を指標として測定される、請求項２３記載の方法。
  25. WDR6の発現もしくは活性を抑制する物質の有効量を動物に投与することを含む、該動物におけるインスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用を増強する方法。
  26. WDR6の発現もしくは活性を増強する物質の有効量を動物に投与することを含む、該動物におけるインスリン/IGF-1シグナル伝達系の作用を抑制する方法。
  27. 投与が中枢もしくは末梢への局所投与である、請求項２５または２６記載の方法。
  28. 被験物質を動物に投与し、該動物の視床下部における、E2D3、PKCβ、EAAC1、Fth1およびASSからなる群より選択される１以上の遺伝子、並びに／あるいは配列番号：１３で表される塩基配列を含む核酸および／または配列番号：１４で表される塩基配列を含む核酸の発現を調べることを含む、該物質の神経細胞保護作用の評価方法。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110124037B (zh) * 2019-04-29 2021-09-17 山东省立医院 Wdr6在降低甘油三酯水平中的用途
WO2024101406A1 (ja) * 2022-11-09 2024-05-16 学校法人早稲田大学 非アルコール性脂肪性肝疾患／非アルコール性脂肪肝炎及び肝がんの予防・治療剤

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5315412A (en) * 1976-07-27 1978-02-13 Ono Pharmaceut Co Ltd Suppository for diabetics
US20020025569A1 (en) * 1997-08-20 2002-02-28 Maureen Caligiuri Components of ubiquitin ligase complexes and uses related thereto
JP2005529083A (ja) * 2002-02-28 2005-09-29 コンセホ・スペリオール・デ・インベスティガシオネス・シエンティフィカス 神経変性疾患の治療および予防のためのｉｇｆ−１製剤

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1196575A2 (en) * 1999-07-19 2002-04-17 Incyte Genomics, Inc. Gtp-binding protein associated factors

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5315412A (en) * 1976-07-27 1978-02-13 Ono Pharmaceut Co Ltd Suppository for diabetics
US20020025569A1 (en) * 1997-08-20 2002-02-28 Maureen Caligiuri Components of ubiquitin ligase complexes and uses related thereto
JP2005529083A (ja) * 2002-02-28 2005-09-29 コンセホ・スペリオール・デ・インベスティガシオネス・シエンティフィカス 神経変性疾患の治療および予防のためのｉｇｆ−１製剤

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