WO2007086526A1 - 遺伝子多型およびその用途 - Google Patents

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WO2007086526A1
WO2007086526A1 PCT/JP2007/051309 JP2007051309W WO2007086526A1 WO 2007086526 A1 WO2007086526 A1 WO 2007086526A1 JP 2007051309 W JP2007051309 W JP 2007051309W WO 2007086526 A1 WO2007086526 A1 WO 2007086526A1
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cancer
ltbp
base
nucleic acid
base sequence
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PCT/JP2007/051309
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Tomomi Higashi
Kiyofumi Saijo
Satoru Kyo
Masaki Inoue
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National University Corporation Kanazawa University
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to a novel gene polymorphism that can serve as a prognostic marker for cancer, and to prognosis of cancer by detecting the polymorphism.
  • the invention also relates to the treatment of cancer by inhibiting the activity or expression of the gene.
  • TGF- ⁇ Transforming growth factor ⁇
  • 8 is a potent growth inhibitor in most cell types including epithelial cells. Secretion of TGF-
  • TGF- ⁇ is synthesized as a latent high molecular weight complex consisting of TGF- ⁇ , the amino terminal portion of the TGF- ⁇ precursor and a latent TGF- ⁇ binding protein (L TBP).
  • L TBP latent TGF- ⁇ binding protein
  • LTBP is a glycoprotein with a molecular weight greater than 190 kDa, with several repeats of a unique motif containing 16-18 EGF-like domains and 8 cysteine residues.
  • LTBP-1-LTBP-4 four isoforms (L TBP-1-LTBP-4) have been found in mammalian species.
  • LTBP-1 binds to TGF-181 via one of the 8 cysteine motifs, and assembles and secretes TGF-181 (see, eg, Non-Patent Document 1) and activates (eg, Non-Patent Document 2). See).
  • LTBP is one of the extracellular microfiber components, and TGF-
  • LTBP-1 is known to have two major isoforms, called LTBP-IS (short) and LTBP-1L (long), respectively, which are distinct promoters and LTBP-1S codons.
  • Alternative splicing ducers between 1 and 146 Non-patent Document 4
  • LTBP-1L has an N-terminal extension of 346 amino acids not found in LTBP-1S (Non-patent Document 5). This N-terminal extension contains an EGF-like domain that promotes matrix binding, and LTBP-1L Has been confirmed to bind to the extracellular matrix more efficiently than LTBP-1S.
  • Non-Patent Document 6 This overexpression may affect the function of TGF-
  • Non-patent document 1 Miyazono K. et al., “EMBO J.”, UK, No. 10, pp. 1091-1101, 1991
  • Non-Patent Document 2 Fraumenhaf HFraumenhaft R.) et al., “The 'Journal' of Cell 'Biology”, USA, 120th, pp. 995-1002, 1993
  • Non-Patent Document 3 Taipale J. et al., “The Journal of Cell Biol. J, USA, No. 124, pp. 171-181, 1994.
  • Non-Patent Document 4 Koski C. et al., “The 'Journal' of 'Biological' Chemistry”, USA, No. 274, pp. 32619-32630, 1999
  • Non-Patent Document 5 Olofsson A. et al., “The 'Journal' of 'Biological' Chemistry”, USA, No. 270, pp. 31294-31297, 1995
  • Non-Patent Document 6 Higashi T. et al., “Japanese 'Journal' of 'Cancer' Research J, Japan, No. 92, pp. 506-515, 2001. Year
  • an object of the present invention is to clarify the molecular mechanism of LTBP-1L overexpression in ovarian cancer and to elucidate the clinical significance of the overexpression.
  • the present inventors have found that two novel SNPs (-202G / C and + 20A /) present in the 5'-regulatory region of the LTBP-1L gene.
  • C the number indicates the position relative to the transcription start point +1
  • the present inventors have correlated these SNPs with susceptibility to cancers such as endometrial cancer, gastric cancer and lung cancer, and surprisingly alleles that cause poor prognosis in these cancers are rather protected in terms of sensitivity. It has been found that an allele that is (affected) and has a relatively good prognosis is a disease (susceptible) allele.
  • human LTBP-1L gene 5 represented by SEQ ID NO: 1,-in the nucleotide sequence of the regulatory region of base sequence 2014 and Z or 2235
  • a test method for the prognosis of cancer characterized by testing polymorphisms
  • cancer selected from the group consisting of ovarian cancer, cervical cancer, endometrial cancer, stomach cancer, colon cancer and lung cancer,
  • a partial base sequence of the human LTBP-1L gene the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, including a base represented by base numbers 2014 and Z or 2235, and a continuous sequence of about 15 to about 500 bases
  • a nucleic acid comprising the base sequence obtained,
  • Human LTBP-1L gene represented by SEQ ID NO: 1
  • a test kit for prognosis of cancer comprising Z or a primer
  • the nucleic acid probe comprises the base of the polymorphic site represented by base numbers 2014 and Z or 2235 in the base sequence of the human LTBP-1L gene 5′-regulatory region represented by SEQ ID NO: 1 in the base sequence of about 1
  • a nucleic acid comprising a continuous base sequence of 5 to about 500 bases, wherein the nucleic acid primer is a partial base sequence of the human LTBP-1L gene, and the base group in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1
  • the kit according to [5] or [6] above selected from the group consisting of ovarian cancer, cervical cancer, endometrial cancer, stomach cancer, colon cancer and lung cancer, [8] The kit according to [7] above, wherein the cancer is ovarian cancer, endometrial cancer or lung cancer
  • a cancer therapeutic agent comprising a nucleic acid comprising a nucleotide sequence complementary or substantially complementary to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or a part thereof,
  • a nucleic acid comprising a base sequence complementary to or substantially complementary to the partial base sequence represented by base numbers 1 to 1038 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or a part thereof,
  • a cancer therapeutic agent comprising a neutralizing antibody against a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, or a partial peptide thereof,
  • a cancer therapeutic agent comprising the nucleic acid according to [4] above,
  • cancer selected from the group consisting of ovarian cancer, cervical cancer, endometrial cancer, stomach cancer, colon cancer and lung cancer,
  • the human LTBP-1L gene 5 represented by SEQ ID NO: 1,-in the base sequence of the regulatory region, the base number 2014 and the number indicated by Z or 2235
  • a test method for susceptibility to cancer selected from the group consisting of endometrial cancer, gastric cancer and lung cancer, characterized by testing the type;
  • the nucleic acid probe comprises a base of the polymorphic site represented by base numbers 2014 and Z or 2235 in the base sequence of the human LTBP-1L gene 5′-regulatory region represented by SEQ ID NO: 1 in the base sequence of about 1
  • a nucleic acid comprising a continuous base sequence of 5 to about 500 bases, wherein the nucleic acid primer is a partial base sequence of the human LTBP-1L gene, and the base group in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 About 50 to about 1,000 including the base of the polymorphic site indicated by the numbers 2014 and Z or 2235
  • a kit according to the above [17] which is a pair of nucleic acids capable of amplifying a base sequence having a continuous base is provided.
  • Two SNPs in the LTBP-1L gene 5'-regulatory region affect the transcriptional activity of the gene; and-other cancer genes with homozygous genotypes of 202G and + 20A. Since the expression of LTBP-1 is increased and the life prognosis is poorer than that of a patient having a child type, the prognosis of cancer can be made by examining the SNPs in cancer patients. In addition, by inhibiting the expression or activity of the LTBP-1L protein, the treatment of cancer has an effect of suppressing progression.
  • these SNPs correlate with susceptibility to cancers such as neoadjuvant cancer, gastric cancer, and lung cancer, and the -202C and + 20C alleles are more effective against these cancers than the -202G and + 20A alleles. More susceptible (susceptible). Therefore, the sensitivity to these cancers can be predicted by examining the SNPs in the subject.
  • FIG. 1A schematically shows two novel SNPs in the LTBP-1L promoter.
  • ATG represents the start codon.
  • Figure 1B shows the results of polymorphism analysis by PCR-RFLP method. The upper row shows the restriction enzyme cleavage sites for each haplotype and the length of each fragment generated, and the lower row shows the band pattern of EcoRII and Cspl digests for each genotype.
  • M represents a molecular weight marker
  • D represents a heteroduplex produced by annealing with a heteroallelic mismatch.
  • FIG. 2A schematically shows a luciferase reporter construct comprising an LTBP-1L promoter region having different haplotypes at the SNP site.
  • Figure 2B shows the relative luciferase activity of reporter plasmids with various haptic types. Each column represents the average of three independent experiments (each performed in triplicate), and error bars indicate standard deviation. In the figure, * indicates P ⁇ 0.01 (vs. CC construct).
  • C It is a figure which shows the effect of Spl on LTBP-1L promoter activity. Blank indicates empty vector, Spl indicates Spl expression vector, DN-SP1 indicates co-transformation of Sp3 dominant negative expression vector. Each column represents the average of three independent experiments (each performed in triplicate) Error bars indicate standard deviation. In the figure, * indicates P ⁇ 0.0001 (vs. GA blank), and # indicates P ⁇ 0. 0001 (vs. CC blank).
  • FIG. 3 shows the results of EMSA regarding the binding of Spl to the LTBP-1L promoter.
  • B represents a probe-Spl complex
  • S represents a probe-Spl-anti-Spl antibody complex
  • F represents a band corresponding to a free probe.
  • FIG. 4 shows survival curves for LTBP-1L promoter genotypes in ovarian cancer patients.
  • ⁇ indicates the occurrence of death cases.
  • FIG. 5 shows the survival curves of LTBP-1L promoter by genotype in patients with epilepsy cancer.
  • ⁇ indicates the occurrence of death cases.
  • FIG. 6 shows survival curves for LTBP-1L promoter genotypes in lung cancer patients.
  • ⁇ indicates the occurrence of death cases.
  • Cancer prognosis method of the present invention (hereinafter, sometimes simply referred to as “diagnostic method of the present invention.”
  • “examination method for prognosis” constitutes a medical decision stage by a doctor.
  • “prognostic method” and a method for predicting susceptibility to cancers such as endometrial cancer, stomach cancer and lung cancer (hereinafter simply referred to as “prediction method of the present invention”).
  • the “sensitivity test method” is synonymous with the “sensitivity prediction method” except that the medical decision stage by the doctor is not included in the configuration, and the LTBP-1L gene of the subject. 5 '-characterized by detecting polymorphisms in the regulatory region.
  • the polymorphism that can be used in the diagnosis and prediction method of the present invention includes the novel polymorphism found in the present invention ["GenBank accession number AF171934 (AF171934.1 GI: 6424 997 ) ”, A single base substitution (SNP) polymorphism (SEQ ID NO: 1)] in which C and 2235 shown by base number 2014 are G and A, respectively.
  • SNP single base substitution polymorphism
  • the position of the nucleotide (base) of the polymorphic site is indicated by the base number 2216 in the base of the estimated transcription start point (SEQ ID NO: 1).
  • Base (+1) ie, the polymorphism at base number 2014 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 is -202G / C, the polymorphism at base number 2235 is + 20A / C
  • Other polymorphisms that can be used in the diagnosis and prediction method of the present invention include -2 02G / C or + 20A / C and a linkage disequilibrium coefficient D 'of 0.9 or more in a linkage disequilibrium state. Polymorphism can be mentioned.
  • linkage disequilibrium coefficient D ′ means that for each of the two SNPs, the allele of the first SNP is (A, a), the allele of the second SNP is (B, b), and the four haplotypes (AB , Ab, a B, ab) are represented by the following equations, where P 1, P 2, P 3, and P 4 are P 1, P 2, P 3, and P 4, respectively.
  • D ′ is 0.95 or more, more preferably 0.99 or more, and most preferably 1 is mentioned.
  • D ′ is 0.95 or more, more preferably 0.99 or more, and most preferably 1 is mentioned.
  • the prognostic marker polymorphisms -202G / C and +20 A / C used in the diagnosis and prediction method of the present invention include LTBP-1L gene transcriptional activity, transcription factor Spl, as shown in Examples below. This results in a difference between alleles in the binding activity of (-202G / C overlaps with the Spl binding motif GC box and + 20A / C is adjacent to the GC box). In other words, the -202G and + 20A alleles showed a marked increase in both activities compared to the -202C and + 20C alleles (-202G / C has a greater effect on both activities).
  • the GA allele was a major allele in certain cancer (eg, ovarian cancer, colon cancer) patient populations and healthy populations, and there was no significant difference in allele frequency in these populations. .
  • cancer patients with GA / GA homozygous genotypes compared to patients with CC-CC / GA homozygous and CC / CC homozygous genotypes, Cumulative survival rate tends to be low.
  • LTBP-1L expression plays an important role in cancer progression, and GA / GA genotype holders have Spl binding activity to LTBP-1L promoter and LTBP-1L transcription activity. It is strongly suggested that cancer is likely to progress! / ⁇ (poor prognosis). Therefore, the -202G / C and + 20A / C polymorphisms are polymorphisms that define the quality of life prognosis in cancer patients.
  • the CC allele frequency is significantly higher in the patient group of certain other cancers (for example, child body cancer, gastric cancer, lung cancer) than in the healthy population (p 0.1).
  • CC-allele holders C-C / GA heterozygous and C-C / C-C homozygous non-carriers (G-A / G-A)
  • the odds ratio for homozygous) is 2! And 3 or more (p ⁇ 0.05), suggesting that the CC allele is one of the genetic risk factors for these cancers.
  • the risk of developing epilepsy and gastric cancer is significantly lower.
  • the -202G / C and + 20A / C polymorphisms are polymorphisms that can predict the risk of developing cancers such as epilepsy, gastric and lung cancers in humans.
  • LTBP-1L forms a complex with latent TGF- ⁇ 1 and plays an important role in the activation of TGF- ⁇ 1.
  • 8 can act as both a tumor suppressor and a stimulator of cancer progression. At the early stage of carcinogenesis, since the growth inhibitory response of cells to TGF-
  • the diagnostic method of the present invention comprises ovarian cancer, cervical cancer, endometrial cancer, stomach cancer, colon cancer, lung cancer, and other solid cancers (eg, liver cancer, spleen cancer, gallbladder cancer, kidney cancer, etc.), More preferably, it is useful for prognosis of ovarian cancer, cervical cancer, endometrial cancer, stomach cancer, colon cancer and lung cancer, particularly preferably ovarian cancer, endometrial cancer and lung cancer.
  • solid cancers eg, liver cancer, spleen cancer, gallbladder cancer, kidney cancer, etc.
  • examples of cancers whose sensitivity can be predicted by the prediction method of the present invention include endometrial cancer, stomach cancer and lung cancer.
  • the polymorphism detected in the diagnosis and prediction method of the present invention may be either one or both of the polymorphisms described above.
  • any of the known SNP detection methods can be used for polymorphism detection.
  • genomic DNA extracted from a subject's cell force is used as a sample, and the human LTBP-1L gene 5′-regulatory region represented by SEQ ID NO: 1 in the base numbers 2014 and Z Or salt of polymorphic site shown by 2235
  • a nucleic acid containing a continuous base sequence of about 15 to about 500 bases containing a group is used as a probe.
  • Wallace et al. Proc. Natl. Acad. Sci.
  • hybridization is performed while accurately controlling the stringency, and only the sequence that is completely complementary to the probe is detected, or the polymorphic site base ( (-202G and Z or + 20A) is labeled with one of the other bases (-202C and Z or + 20C).
  • Examples include a method in which hybridization is performed while gradually lowering the reaction temperature, a sequence completely complementary to one probe is first hybridized, and cross-reaction with a probe having mismatch is prevented.
  • the labeling agent for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance and the like are used.
  • radioisotope e.g., [12 3 ⁇ 4, [131 1], [], it is used like [14 C].
  • enzymes those which are stable and have high specific activity are preferred, for example, j8-galactosidase, ⁇ -darcosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase and the like are used.
  • fluorescent material for example, fluorescamine, fluorescein isothiocyanate and the like are used.
  • luminescent substance for example, luminol, luminol derivatives, luciferin, lucigenin and the like are used.
  • the detection of polymorphism is performed by, for example, various methods described in WO 03/023063, for example, RFLP method, PCR-SSCP method, ASO hybridization, direct sequence method, ARMS method , Denaturing gradient gel electrophoresis, RNaseA cleavage method, chemical cleavage method, DOL method, TaqMan PCR method, invader method, MALDI—TOF / MS method, TDI method, molecular ⁇ ⁇ beacon method, dynamic 'allele spe It can be carried out by the CIific nodification method, the nodlock probe method, the UCAN method, the nucleic acid hybridization method using a DNA chip or DNA microarray, and the ECA method (WO 03/023063, (See page 17, line 5 to page 28, line 20).
  • the TaqMan PCR method and the invader method will be described in more detail as representative methods.
  • the TaqMan PCR method uses a fluorescently labeled allele-specific oligonucleotide (TaqMan probe) and PCR using Taq DNA polymerase.
  • TaqMan probe For example, an oligonucleotide having a partial base sequence of the human LTBP-1L gene and comprising a continuous base sequence of about 15 to about 30 bases including the base at any of the polymorphic sites described above is used.
  • the probe is labeled with a fluorescent dye such as FAM or VIC at the 5 ′ end and labeled with a quencher (quenching substance) such as TA MRA at the 3 ′ end. In this state, the quencher emits fluorescence energy. Fluorescence is not detected due to absorption.
  • the probes are preferably prepared for both alleles and labeled with fluorescent pixels having different fluorescence wavelengths (for example, one allele is FAM and the other is VIC) for batch detection.
  • the 3 'end is phosphorylated so that no PCR extension reaction occurs with Taq Man probe.
  • the TaqMan probe hybridized by the 5 'nuclease activity of Taq DNA polymerase is cleaved, the fluorescent dye is released and is no longer affected by quenching, and fluorescence is detected.
  • the fluorescence intensity increases exponentially due to the vertical amplification.
  • allele-specific oligonucleotides containing the relevant base about 15 to about 30 bases in length; G allele is FAM, C allele is VIC, 5 are end-labeled, 3
  • TAMRA as a TaqMan probe
  • the subject's genotype is GG or CC, strong fluorescence intensity of FAM or VIC is observed, and the other fluorescence is hardly observed.
  • the subject's genotype is GC, both FAM and VIC fluorescence are detected.
  • the invader method does not label the allele-specific oligonucleotide (allele probe) itself, and has a sequence (flap) that is not complementary to the truncated DNA on the 5 'side of the base of the polymorphic site. However, it has a complementary sequence specific to the cocoon on the 3 ′ side.
  • an oligonucleotide with a specific complementary sequence on the 3 'side of the polymorphic site of the saddle type Invader probe; any base corresponding to the polymorphic site at the 5' end of the probe is optional.
  • 5 ′ side has a sequence that can take a hairpin structure, and forms a hairpin structure.
  • the FRET (fluorescence resonance energy transfer) probe is characterized in that the base sequence that is paired with the 5'-end base is a sequence complementary to the allele probe flap. Used.
  • the 5 'end of the FRET probe is fluorescently labeled (eg, FAM, VIC, etc.), and a quencher (eg, TAMRA, etc.) is bound in the vicinity thereof, and fluorescence is not detected as it is (hairpin structure). ,.
  • the 3 'end of the invader probe enters the polymorphic site when the three are complementary-bonded.
  • the enzyme that recognizes the structure of this polymorphic site cleavase
  • the single-stranded part of the allele probe that is, the 5'-side flap part of the polymorphic site
  • the flap is complementary to the FRET probe. Binds and the flap polymorphic site enters the hairpin structure of the FRET probe.
  • the allele probe is not cleaved by cleavase !, but is not cleaved !, and the allele probe can also hybridize with the FRET probe, so fluorescence is detected in the same way.
  • the allele probe that matches the base of the polymorphic site does not match! The fluorescence intensity is significantly stronger than the allele probe.
  • the LTBP-1L gene has a difference in restriction enzyme fragment length due to the -202G / C and + 20A / C polymorphisms, and this polymorphism can be easily detected using this. That is, -202G allele is cleaved by EcoRII -202C allele is not cleaved. On the other hand, + 20A allele is not cleaved by Cspl, but + 20C allele is cleaved by Cspl. Therefore, as shown in the examples below, the LTBP-1L gene fragment containing _202 to +20 is amplified by PCR and double-digested with EcoRII and Cspl to compare the lengths of the restriction enzyme fragments.
  • the polymorphism can be detected.
  • the polymorphism As a result of examining the polymorphism as described above, if it is determined that the -202G and Z or + 20A alleles are possessed as V, it is determined that the alleles are particularly homozygotes. If so, the subject can be diagnosed with a high probability of a poor prognosis for cancer.
  • the subject when it is determined that the subject possesses the ⁇ 2 02C and Z or + 20C alleles, it can be predicted that the subject is susceptible to cancer such as eclampsia cancer, stomach cancer, and lung cancer.
  • the -202G / C and + 20A / C polymorphisms are novel polymorphisms found for the first time in the present invention, and can be used for prognosis of cancer and prediction of sensitivity of specific cancers. It is a polymorphism. More specifically, in the base sequence represented by GenBank accession number AF171934, the base represented by base number 2014 and the base represented by base number 2235 are both C. We identified new SNPs in which the latter was replaced by force G, respectively.
  • the present invention also provides a partial base sequence of the human LTBP-1L gene, comprising a base sequence represented by base numbers 2014 and Z or 2235 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, about 15 to about 500
  • a nucleic acid comprising a continuous base sequence of bases (preferably about 15 to about 200 bases, more preferably about 15 to about 50 bases).
  • a novel nucleic acid containing a strong SNP site can be preferably used to detect a polymorphism in the base in the diagnosis and prediction method of the present invention described above.
  • the present invention also provides a kit for use in the diagnosis and prediction method of the present invention. That is, the diagnostic and prediction kit of the present invention comprises each of the polymorphisms at the bases indicated by base numbers 2014 and 2235 in the base sequence of the human LTBP-1L gene 5′-regulatory region represented by SEQ ID NO: 1. It includes one or more sets of nucleic acid probes and Z or primers that can detect.
  • the nucleic acid probe used in the diagnostic and prediction kit of the present invention has the human LTBP-1L gene 5, represented by SEQ ID NO: 1, the base number 2014 in the base sequence of the regulatory region.
  • About 15 or more bases preferably about 15 to about 500 bases, more preferably about 15 to about 200 bases, and more preferably about 15 to about 50 bases.
  • a nucleic acid containing a base sequence is G or C
  • the base shown by base number 2235 (ie position +20) is A or C, depending on the polymorphism detection method used.
  • nucleic acid having one of the bases for each polymorphic site can be used, or two kinds of nucleic acids having a base corresponding to each allele can be used.
  • the base of the polymorphic site (that is, the base at the 3 ′ end) may be any base.
  • the probe may contain an additional sequence suitable for detection of polymorphism (a sequence that is not complementary to genomic DNA).
  • the allele probe used in the invader method has an additional sequence called a flap at the 5 ′ end of the base at the polymorphic site.
  • the probe may be a suitable labeling agent such as a radioisotope (eg, 125 I, 131 I, 3 H, 14 C, etc.), an enzyme (eg, / 3 galactosidase, 13-darcosidase, alkaline phosphatase, etc. , Peroxidase, malate dehydrogenase, etc.), fluorescent substances (eg, fluorescamine, fluorescene isothiocyanate, etc.), luminescent substances (eg, luminol, luminol derivatives, luciferin, lucigenin, etc.) It may be.
  • a radioisotope eg, 125 I, 131 I, 3 H, 14 C, etc.
  • an enzyme eg, / 3 galactosidase, 13-darcosidase, alkaline phosphatase, etc. , Peroxidase, malate dehydrogenase, etc.
  • fluorescent substances eg,
  • a quencher quenching substance
  • the fluorescence is detected by separating the fluorescent material and the quencher during the detection reaction.
  • the nucleic acid primer used in the diagnostic and prediction kit of the present invention can specifically amplify a region of genomic DNA containing the base of the polymorphic site to be detected in the diagnostic and prediction method of the present invention. If it is designed, it can be good.
  • the nucleic acid primer is a partial base sequence of the human LTBP-1L gene, and is a polymorphic site to be detected, that is, a polymorphism represented by base number 2014 or 2235 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • a nucleic acid comprising a base sequence of about 15 to about 50 bases, preferably about 15 to about 30 bases, which hybridizes to a part of the complementary strand sequence 5 'to the site, and a nucleic acid 3 or more side of the base of the polymorphic site
  • a pair of nucleic acids having a fragment length of about 50 to about 1,000 bases, preferably about 50 to about 500 bases, more preferably about 50 to about 200 bases.
  • the primer may contain an additional sequence suitable for detection of polymorphism (sequence not complementary to genomic DNA), for example, a linker sequence.
  • the primer is labeled with an appropriate labeling agent, for example, a radioactive isotope (eg: 125 I, 131 I, 3 H, 1 4 C , etc.), enzymes (eg / 3-galactosidase, 13 Darukoshidaze, alkaline phosphatase over peptidase , Peroxidase, malate dehydrogenase, etc.), fluorescent substances (eg, fluorescamine, fluorescein isothiocyanate, etc.), luminescent substances (eg, luminol, luminol derivatives, luciferin, lucigenin, etc.) Well, okay.
  • a radioactive isotope eg: 125 I, 131 I, 3 H, 1 4 C , etc.
  • enzymes eg / 3-galactosidase, 13 Darukoshidaze, alkaline phosphatase over peptidase , Peroxidase, malate dehydrogenas
  • the nucleic acid probe or primer used in the diagnostic and prediction kit of the present invention may be DNA or RNA, and may be single-stranded or double-stranded.
  • double-stranded DNA any of double-stranded DNA, double-stranded RNA, and DNAZRNA hybrid may be used. Therefore, in the present specification, when describing a nucleic acid having a certain base sequence, unless otherwise specified, a single-stranded nucleic acid having the base sequence, a single-stranded nucleic acid having a sequence complementary to the base sequence, and a hybrid thereof It should be understood that it is used in the sense of including all double-stranded nucleic acids.
  • the nucleic acid probe or primer can be synthesized according to a conventional method using a DNA / RNA automatic synthesizer based on the information of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, for example. it can.
  • the nucleic acid probe and Z or primer are each separately (or mixed if possible) in water or in an appropriate buffer (eg, TE buffer) at an appropriate concentration (eg, 2 X to It can be dissolved at a concentration of 20 X at 1-50 ⁇ and stored at about -20 ° C.
  • an appropriate buffer eg, TE buffer
  • concentration eg, 2 X to It can be dissolved at a concentration of 20 X at 1-50 ⁇ and stored at about -20 ° C.
  • the kit for diagnosis and prediction of the present invention may further contain other components necessary for carrying out the method as a component depending on the polymorphism detection method.
  • the kit is for detection of polymorphisms by TaqMan PCR
  • the kit contains 10 X PCR reaction buffer, lO X MgCl
  • kits 2 It can further contain aqueous solution, lO X dNTPs aqueous solution, Taq DNA polymerase (5U / L) and the like.
  • kit when the kit is for polymorphism detection by the RFLP method, the kit is used for restriction fermentation. Elemental EcoRII and Cspl, the restriction enzyme reaction buffer, and the like may further be included.
  • the present invention also provides a cancer, preferably a stage advanced cancer, for example, ovarian cancer, cervical cancer, cadaver cancer, gastric cancer, by inhibiting LTBP-1L expression and Z or activity.
  • a cancer preferably a stage advanced cancer, for example, ovarian cancer, cervical cancer, cadaver cancer, gastric cancer, by inhibiting LTBP-1L expression and Z or activity.
  • Colorectal cancer, lung cancer, other solid cancers eg, liver cancer, spleen cancer, gallbladder cancer, kidney cancer, etc.
  • more ovarian cancer, cervical cancer, endometrial cancer, stomach cancer, colon cancer, and lung cancer particularly preferably Relates to the treatment of ovarian cancer, endometrial cancer and lung cancer.
  • the human LTBP-1L protein which is a therapeutic target in the present invention is a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.
  • the protein is a human cell [eg, hepatocyte, spleen cell, nerve cell, glial cell, spleen j8 cell, bone marrow cell, mesangial cell, Langerhans cell, epidermal cell, epithelial cell, goblet cell, endothelial cell, smooth muscle cell , Fibroblasts, fibroblasts, muscle cells, adipocytes, immune cells (eg: McPhph phage, T cells, B cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes) ), Megakaryocytes, synoviocytes, chondrocytes, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, mammary cells or stromal cells, or precursor cells, stem cells or cancer cells of these cells
  • amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 is SEQ ID NO:
  • Amino acid sequence having about 80% or more, preferably about 90% or more, more preferably about 95% or more, most preferably about 98% or more homology with the amino acid sequence represented by 3, wherein the amino acid sequence A protein having a protein having substantially the same activity as a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.
  • “homology” means in the technical field.
  • V optimal alignment when aligning two amino acid sequences using a known mathematical algorithm (preferably the algorithm considers the introduction of gaps in one or both of the sequences for optimal alignment) The percentage of identical and similar amino acid residues to all overlapping amino acid residues.
  • Similar amino acids '' mean amino acids that are similar in physical properties, such as aromatic amino acids (Phe, Trp, Tyr), aliphatic amino acids (Ala, Leu, Ile, Val), polar Amino acids (Gln, Asn), basic amino acids (Lys, Arg, His), acidic amino acids (Glu, Asp), amino acids with hydroxyl groups (Ser, Thr), amino acids with small side chains (Gly, Ala, Ser) , Thr, Met) and other amino acids that fall into the same group. It is expected that such substitutions with similar amino acids do not change the protein phenotype (ie, are conservative amino acid substitutions).
  • substantially the same activity examples include binding activity with latent TGF- ⁇ 1, activity of promoting TGF- ⁇ 1 activity, and the like. “Substantially homogeneous” means that their properties are qualitative (Eg, physiologically or pharmacologically) equivalent. Thus, the quantitative factors such as the above-mentioned degree of activity are preferably equivalent, but may be different (for example, about 0.01 to about 100 times, preferably about 0.1 to about 10 times, more preferably about 0.5 to about 2 times).
  • the activity of LTBP-1L can be measured according to a method known per se. Examples include, but are not limited to, binding tests with TGF-j81.
  • LTBP-1L used in the present invention, for example, (1) 1 or 2 or more (preferably about 1 to 30) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 Preferably, about 1 to 10 amino acids, more preferably 1 to 5 amino acid sequences deleted.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 An amino acid sequence to which about 30 amino acids, preferably about 1 to 10, more preferably 1 to 5 amino acids are added; (3) one or more amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 3 (preferably 1 to 30 amino acids, preferably 1 to 10 amino acids, more preferably 1 to 5 amino acid sequences inserted, (4) 1 or 2 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 More than one (preferably about 1 to 30, preferably about 1 to 10, more preferably 1 to 5 ) Amino acid sequence in which an amino acid is substituted with another amino acid, or (5) a protein containing an amino acid sequence combining them, and substantially a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3. In particular, proteins having the same activity are also included.
  • the position of the insertion, deletion or substitution is not particularly limited as long as the activity of the protein is not impaired.
  • the protein specified by the amino acid sequence is the N-terminus (amino terminus) at the left end and the C-terminus (carboxyl terminus) at the right end according to the convention of peptide designation.
  • the LTBP-1L used in the present invention including the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, has a C-terminal carboxyl group (—COOH), carboxylate (—COO—), amide. (-CONH) or ester (-COOR)! / ⁇ .
  • R in the ester is, for example, C alkyl group such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, for example, cyclopentyl, cyclohexyl, etc.
  • C cycloalkyl group for example, C aryl group such as phenyl, a naphthyl, for example Such as benzyl, phenethyl, etc.
  • ⁇ -naphthyl-C alkyl group such as C alkyl group, pivaloyloxy
  • a methyl group or the like is used.
  • the amino acid residue at the terminal amino acid eg, methionine residue
  • a protecting group for example, C alkanol such as formyl group, acetyl group, etc.
  • Glutamine residues that are pyroglutamate, or substituents on the side chain of amino acids in the molecule are suitable protecting groups (eg -OH, -SH, amino groups, imidazole groups, indole groups, guanidino groups, etc.) are suitable protecting groups ( For example, C alkanoyl groups such as formyl and acetyl groups
  • a specific example of the protein used in the present invention is, for example, human LTBP-1L (GenBank accession registration number: NP_996826.1) consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.
  • the LTBP-1L partial peptide used in the present invention has the same or substantially the same amino acid sequence as the partial amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3. As long as it can be an antigenic peptide for the production of antibodies with specific affinity! /.
  • a peptide containing at least 3 or more, preferably 6 or more consecutive amino acid sequences among the constituent amino acid sequences of LTBP-1L used in the present invention is used.
  • LTBP-1 has two isoforms produced from separate promoters, and LTBP-1 L is characterized by containing an extension of 346 amino acids on the N-terminal side compared to LTBP-1S. To do. Therefore, LTBP-1L is targeted as a cancer therapeutic and inhibits its expression and Z or activity. In this case, it is preferable to target the N-terminal 346 amino acids. Therefore, it is preferable that the partial peptide of LTBP-1L used in the present invention contains all or part of the N-terminal 346 amino acids.
  • the C-terminus is either a carboxyl group (-COO H), a carboxylate (-COO-), an amide (-CONH) or an ester (-COOR).
  • R in the ester includes the same as described above for LTBP-1L.
  • the LTBP-1L partial peptide used in the present invention also includes those in which the carboxyl group is amidated or esterified. included. Examples of the ester in this case are the same as the C-terminal ester.
  • the partial peptide has an amino group of the N-terminal amino acid residue (eg, methionine residue) protected with a protecting group, and the N-terminal side is in vivo.
  • the resulting dartamine residue cleaved in step 1 is pyroglutamic acid, the substituent on the side chain of the amino acid in the molecule is protected with an appropriate protecting group, or the sugar chain is bound.
  • Complex peptides such as loose glycopeptides are also included.
  • LTBP-1L or a partial peptide thereof used in the present invention may be in the form of a salt.
  • a salt with a physiologically acceptable acid eg, inorganic acid, organic acid
  • a base eg, alkali metal salt
  • a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable.
  • examples of such salts include salts with inorganic acids (for example, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid), or organic acids (for example, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid).
  • inorganic acids for example, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids for example, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid.
  • LTBP-1L or a salt thereof used in the present invention can be prepared from the aforementioned human cells or tissues by a known protein purification method. Specifically, after homogenizing the animal tissue or cells, extraction with acid or the like is performed, and the extract is purified and isolated from a combination of chromatography such as reverse phase chromatography and ion exchange chromatography. be able to.
  • LTBP-1L or a partial peptide or a salt thereof used in the present invention is a known peptide. It can also be produced according to the method of synthesis of a process.
  • the peptide synthesis method may be, for example, either a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method.
  • the target protein can be produced by removing the protecting group.
  • the condensation and the removal of the protecting group are carried out according to a method known per se, for example, the method described in the following (1) to (5).
  • a partial peptide of LTBP-1L or a salt thereof used in the present invention is obtained by cleaving LTBP-1L or a salt thereof obtained by any of the methods described above or below with an appropriate peptidase. Can also be manufactured.
  • the thus obtained LTBP-1L or a partial peptide thereof can be purified and isolated by a known purification method.
  • the purification method include solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, recrystallization, and combinations thereof.
  • the free form can be converted to an appropriate salt by a known method or a method analogous thereto, and conversely, the protein can be obtained as a salt.
  • the salt can be converted into a free form or other salt by a known method or a method analogous thereto.
  • Human LTBP-1L (or a partial peptide thereof; hereinafter simply referred to as LTBP-1L! May be obtained by culturing a transformant into which an expression vector containing a nucleic acid encoding them has been introduced. It can be produced by producing TBP-1L and separating and purifying the resulting culture strength LTBP-1L.
  • the nucleic acid encoding human LTBP-1L or a partial peptide thereof may be any nucleic acid as long as it contains the aforementioned LTBP-1L amino acid sequence or a base sequence encoding the partial amino acid sequence.
  • the nucleic acid may be DNA, RNA, or a DNAZRNA chimera, preferably DNA.
  • the nucleic acid may be double-stranded or single-stranded. If double-stranded, it can be double-stranded DNA, double-stranded RNA or DNA: RNA hybrid! / ⁇ .
  • DNA encoding LTBP-1L or its partial peptide is genomic DNA, human cells [eg, hepatocytes, splenocytes, neurons, glial cells, spleen j8 cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermis Cells, epithelial cells, goblet cells, endothelial cells, smooth muscle cells, fibroblasts, fibroblasts, myocytes, adipocytes, immune cells (eg macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, mast cells, Neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes, synoviocytes, chondrocytes, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, mammary cells or stromal cells, or precursor cells of these cells , Stem cells or cancer cells] or any tissue or organ in which those cells are present [eg, brain, brain regions (eg, olfactory bulb, amygd
  • genomic DNA and cDNA encoding LTBP-1L or its partial peptide use the genomic DNA fraction prepared from the above-mentioned cell tissue and the total RNA or mRNA fraction as a cage, respectively. (Hereinafter abbreviated as “method”) and Reverse Transcriptase-PCR (hereinafter abbreviated as “RT-PCR method”).
  • genomic DNA and cDNA encoding LTBP-1L or a partial peptide thereof can be prepared by inserting genomic DNA prepared from the above-mentioned cell 'tissue and total RNA or mRNA fragment into an appropriate vector. It can also be cloned from a library and cDNA library by colony or plaque hybridization method or PCR method, respectively.
  • the vectors used for the library are nocteriophages, plasmids, and cosmids. Any of phagemid and the like may be used.
  • the DNA encoding human LTBP-1L is, for example, a DNA containing the base sequence shown as the coding region in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, or a stringent condition with the base sequence. Containing a base sequence that hybridizes underneath and having substantially the same activity as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 (for example, binding activity to TGF-181, TGF-
  • DNA that can be hybridized under stringent conditions with the base sequence shown as the coding region in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 include, for example, the coding region in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • DNA containing a base sequence having a homology of about 80% or more, preferably about 90% or more, and more preferably about 95% or more is used.
  • NCBI BLAST National and enter for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool
  • the above-mentioned homology calculation algorithm for amino acid sequences is also preferably exemplified.
  • hybridization may be carried out according to a method known per se or a method analogous thereto, for example, Molecular Cloning, Second Edition (J. Sambrook et al, Cold Spring Harbor Lab. Press , 1989).
  • hybridization can be performed according to the method described in the attached instruction manual. Hybridization can be performed preferably according to stringent conditions.
  • Stringent conditions include, for example, a hybridization reaction at 45 ° C in 6 X SSC (sodium chloride / sodium citrate), and at least once at 65 ° C in 0.2 X SSC / 0.1% SDS. Cleaning.
  • X SSC sodium chloride / sodium citrate
  • the salt concentration of the hybridization solution the temperature of the hybridization reaction, the probe concentration, the length of the probe, the number of mismatches, The desired stringency can be easily adjusted by appropriately changing the time of the hybridization reaction, the salt concentration of the washing solution, the washing temperature, and the like.
  • the DNA encoding LTBP-1L is preferably a human LTBP-1L cDNA (GenBank accession number: NM_206943.1) containing the base sequence shown as the coding region in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2. ) Or allelic variants thereof.
  • the DNA encoding the partial peptide of LTBP-1L may be any DNA as long as it contains a base sequence encoding the same or substantially the same amino acid sequence as part of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3. It may be a thing.
  • any of genomic DNA, cDNA derived from the above-mentioned cell 'tissue, and synthetic DNA may be used.
  • the DNA encoding the partial peptide for example,
  • DNA encoding LTBP-1L or a partial peptide thereof is amplified by PCR using a synthetic DNA primer having a part of the base sequence encoding the protein or peptide, or incorporated into an appropriate expression vector.
  • DNA can be cloned by hybridizing with a fragment of LTBP-1L or a DNA fragment encoding the entire region or labeled with synthetic DNA. Hybridization can be performed, for example, according to the method described in Molecular 'Cloning 2nd Edition' (described above). When a commercially available library is used, hybridization can be performed according to the method described in the instruction manual attached to the library.
  • the DNA nucleotide sequence can be determined using a known kit such as Mutan TM -super Express Km (Takara Shuzo), Mutan TM -K (Takara Shuzo), etc.
  • the conversion can be carried out according to a method known per se such as duplex method, Kunkel method or the like, or a method analogous thereto.
  • the cloned DNA can be used as it is depending on the purpose or, if desired, after adding a digestion force and a linker that can be digested with a restriction enzyme.
  • the DNA may have ATG as a translation initiation codon on the 5 ′ end side, and may have TAA, TGA or TAG as a translation termination codon on the 3 ′ end side. These translation initiation codon and translation termination codon can be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
  • the protein or peptide can be produced by transforming a host with an expression vector containing DNA encoding the above LTBP-1L or a partial peptide thereof, and culturing the resulting transformant.
  • An expression vector containing DNA encoding LTBP-1L or a partial peptide thereof is, for example, excising a target DNA fragment from DNA encoding LTBP-1L and ligating the DNA fragment downstream of a promoter in an appropriate expression vector.
  • a promoter can be manufactured. Any promoter can be used as long as it is appropriate for the host used for gene expression! /.
  • cytomegalovirus (CMV) -derived promoter eg, CMV immediate early promoter
  • HSV human immunodeficiency virus
  • RSV Rous sarcoma winoles
  • MMTV mouse breast cancer Winores
  • MoMLV Moro-1 mouse leukemia virus
  • HSV simple herpesvirus
  • HSV HSV -derived promoters
  • TK thymidine kinase
  • SV40-derived promoters eg, SV40 early promoter
  • ESV Epstein-Barrinore
  • EBV Epstein-Barrinore
  • AAV adeno-associated virus
  • AdV adeno-associated virus
  • trp promoter When the host is Escherichia, trp promoter, lac promoter, recA promoter, ⁇ promoter, lpp promoter, T7 promoter and the like are preferable.
  • SP01 promoter When the host is Bacillus, SP01 promoter, SP02 promoter, penP probe motor, etc. are preferred.
  • the host When the host is yeast, PH05 promoter, PGK promoter, GAP promoter 1. ADH promoter and the like are preferable.
  • polyhedrin promoter When the host is an insect cell, polyhedrin promoter, P10 promoter, etc. are preferred.
  • the expression vector in addition to the above, those containing an enzyme, a splicing signal, a poly A addition signal, a selection marker, an SV40 origin of replication and the like can be used as desired.
  • the selection marker include dihydrofolate reductase (dhfr) gene [methotrexate (MTX) resistance], ampicillin resistance (Amp 1 ”) gene, neomycin resistance (Neo f ) gene (G418 resistance), and the like.
  • the target gene can also be selected using a medium not containing thymidine.
  • a nucleotide sequence (signal codon) encoding a signal sequence suitable for the host may be attached to the 5, terminal side of the DNA encoding LTBP-1L or a partial peptide thereof.
  • the host is Escherichia, PhoA signal sequence, OmpA signal sequence, etc.
  • the host is Bacillus, ⁇ -amylase signal sequence, subtilisin signal sequence, etc.
  • yeast MF a signal sequence
  • the host is an animal cell, an insulin signal sequence, an ⁇ -interferon signal sequence, an antibody molecule signal sequence, and the like are used.
  • the host for example, Escherichia, Bacillus, yeast, insect cells, insects, animal cells and the like are used.
  • Examples of the genus Escherichia include Escherichia coli K12, DH1, JM103, JA221, HB101, C600, and the like.
  • Bacillus subtilis MI114, 20 7-21 and the like are used as the bacterium belonging to the genus Bachinoles.
  • yeast examples include Saccharomyces cerevisiae A H22, AH22R-, NA87-11A, DKD-5D, 20B-12, Schizosaccharomyces pombe NCYC1913, NCYC2036, Pichia Pichia pastoris) K M71 is used.
  • Insect cells for example, when the virus is AcNPV, are cell lines derived from night stealing larvae. Cells (Spodoptera frugiperda cells; Slla cells), Trichoplusia ni midgut-derived MG1 cells, Trichoplusia ni egg-derived High Five cells, Mamestra brassicae-derived Itoda vesicles, Estigmen a acrea-derived cells, and the like. In the case of virus power 3 ⁇ 4 mNPV, insect-derived cell lines (Bombyx mori N cells; BmN cells) and the like are used as insect cells. Examples of the Slf cells include S19 cells (ATCC CRL1711), S121 cells (above, Vaughn, J ⁇ . Et al., In Vivo, 13, 213-217 (1977)). It is done.
  • insects examples include silkworm larvae.
  • animal cells examples include monkey-derived cells (eg, COS-l, COS-7, CV-1, Vero) and hamster-derived cells (eg, BHK, CHO, CHO-Kl, CHO-dhfr— ), Mouse-derived cells (eg: NI H3T3, L, L929, CTLL-2, AtT-20), rat-derived cells (eg: H4IIE, PC-12, 3Y1, NBT- ⁇ ), human-derived cells (eg: HEK293 A549, HeLa, HepG2, HL-60, Jurkat, U937).
  • monkey-derived cells eg, COS-l, COS-7, CV-1, Vero
  • hamster-derived cells eg, BHK, CHO, CHO-Kl, CHO-dhfr—
  • Mouse-derived cells eg: NI H3T3, L, L929, CTLL-2, AtT-20
  • rat-derived cells eg: H4IIE, PC-12, 3Y
  • Transformation can be performed according to a known method depending on the type of host.
  • Escherichia can be transformed according to the method described in, for example, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972) and Gene, 17, 107 (1982).
  • Batinoles can be transformed according to the method described in, for example, Molecular and General Genetics, 168, 111 (1979).
  • Yeast can be transformed, for example, according to the method described in Methods in Enzymology, 194, 182-187 (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978). Insect cells and insects can be transformed according to the method described in, for example, Bio / Technology, 6, 47-55 (1988).
  • Animal cells can be transformed, for example, according to the method described in Cell Engineering Supplement 8 New Cell Engineering Experimental Protocol, 263-267 (1995) (published by Shujunsha), Virology, 52, 456 (1973).
  • Culture of the transformant can be performed according to a known method depending on the type of the host.
  • a liquid medium is preferable as a medium used for the culture.
  • the medium is transformed It is preferable to contain a carbon source, a nitrogen source, an inorganic substance and the like necessary for body growth.
  • the carbon source for example, glucose, dextrin, soluble starch, sucrose, etc .
  • the nitrogen source for example, ammonium salt, nitrates, corn steep liquor, peptone, casein, meat extract.
  • examples include inorganic or organic substances such as soybean meal and potato extract; examples of inorganic substances include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, and magnesium chloride.
  • the medium may be supplemented with yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like.
  • the pH of the medium is preferably about 5-8.
  • M9 medium containing glucose, casamino acid is preferred. If necessary, an agent such as 3
  • the culture is usually performed at about 15 to 43 ° C for about 3 to 24 hours. If necessary, aeration or agitation may be performed.
  • the transformant whose host is Bacillus is usually cultured at about 30 to 40 ° C for about 6 to 24 hours. If necessary, aeration or agitation may be performed.
  • Examples of a medium for culturing a transformant whose host is yeast include a Burkholder minimum medium and an SD medium containing 0.5% casamino acid.
  • the pH of the medium is preferably about 5-8.
  • the culture is usually performed at about 20 ° C to 35 ° C for about 24 to 72 hours. Aeration and agitation may be performed as necessary.
  • a medium for culturing a transformant whose host is an insect cell or an insect for example, a medium obtained by appropriately adding an additive such as 10% sushi serum inactivated to Grace's Insect Medium is used.
  • the pH of the medium is preferably about 6.2 to 6.4. Cultivation is usually carried out at about 27 ° C for about 3 to 5 days. You may perform ventilation
  • a medium for culturing a transformant whose host is an animal cell for example, a minimum essential medium (MEM) containing about 5 to 20% fetal bovine serum, Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM), RPMI1640 medium, 199 medium or the like is used.
  • the pH of the medium is preferably about 6-8.
  • the culture is usually performed at about 30 ° C to 40 ° C for about 15 to 60 hours. Aeration and agitation may be performed as necessary.
  • LTBP-1L can be separated and purified from a culture obtained by culturing the transformant according to a method known per se.
  • LTBP-1L when LTBP-1L is also extracted from cultured cells or cell force, the cells or cells collected from the culture by a known method are suspended in an appropriate buffer, and ultrasonic, lysozyme and Z or freeze-thawed, etc.
  • the buffer solution may contain a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-100 TM.
  • LTBP-1L is secreted extracellularly, collect the culture supernatant from the culture by centrifugation or filtration.
  • Isolation and purification of LTBP-1L contained in the soluble fraction or culture supernatant thus obtained can be performed according to a method known per se.
  • Such methods include methods that utilize solubility, such as salting-out solvent precipitation; dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • a method using a difference in charge such as ion exchange chromatography; a method utilizing a specific affinity such as affinity chromatography; and a difference in hydrophobicity such as reversed-phase high-performance liquid chromatography.
  • a method using a difference in isoelectric point such as isoelectric focusing method; These methods can be combined as appropriate.
  • LTBP-1L obtained by force or its partial peptide is a free form
  • the free form can be converted to a salt by a method known per se or a method analogous thereto
  • the protein or peptide is When obtained as a salt, the salt can be converted into a free form or other salt by a method known per se or a method analogous thereto.
  • the LTBP-1L produced by the transformant can be arbitrarily modified or the polypeptide can be partially removed by applying an appropriate protein modifying enzyme before or after purification.
  • protein modifying enzyme include trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like.
  • LTBP-1L obtained by force is due to the presence of a specific antibody. It can be confirmed by Western blotting.
  • LTBP-1L or a partial peptide thereof has a cell-free protein translation system such as rabbit reticulocyte lysate, wheat germ lysate, and E. coli lysate, with the RNA corresponding to the DNA encoding it as a saddle type. It can also be synthesized by using in vitro translation. Alternatively, a DNA encoding LTBP-1L or a partial peptide thereof can also be synthesized as a cage using a cell-free transcription Z translation system further containing RNA polymerase.
  • the cell-free protein (transcription Z) translation system can be a commercially available one, or a method known per se, such as Pratt JM et al., "Transcription and Translation", Hames BD and Higgins SJ. Ed., IRL Press, Oxford 179-209 (1984).
  • Examples of commercially available cell lysates include E. coli S30 extract system (Promega) and RTS 500 Rapid Tranlation Sy stem (Roche) derived from E. coli, and Rabbit Reticulocyt derived from rabbit reticulocytes.
  • e Lysate System manufactured by Promega
  • those derived from wheat germ include PROTEIOS TM (manufactured by TOYOBO).
  • wheat germ lysate those using wheat germ lysate are preferred.
  • a method for producing wheat germ lysate for example, the method described in Johnston FB et al., Nature, 179, 160-161 (1957) or Erickson AH et al., Meth. EnzymoL, 96, 38-50 (1996), etc. should be used. Can do.
  • the Notch method PratU.M. Et al. (1984) mentioned above
  • a continuous cell-free protein synthesis system that continuously supplies amino acids, energy sources, etc. to the reaction system.
  • dialysis Kikawa et al., 21st Japan Molecular Biology Society, WID6
  • multi-layer method PROTEIOS TM Wheat germ cell-free protein synthesis core kit handling Manual: manufactured by TOYOBO.
  • a method of supplying a synthetic RNA, amino acid, energy source, etc. to the synthesis reaction system when necessary, and discharging the synthesized product or degradation product when necessary
  • Japanese Patent Laid-Open No. 2000-333673 Japanese Patent Laid-Open No. 2000-333673
  • an antibody to the LTBP-1L protein or a partial peptide thereof used in the present invention can recognize the LTBP-1L protein or a partial peptide thereof.
  • an antibody either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody may be used.
  • the isotype of the antibody is not particularly limited, but is preferably IgG, IgM or IgA Particularly preferred is IgG.
  • the antibody of the present invention is not particularly limited as long as it has at least a complementarity determining region (CDR) for specifically recognizing and binding a target antigen.
  • CDR complementarity determining region
  • a derivative molecule modified with a molecule having a protein stabilizing action such as polyethylene glycol (PEG) or the like.
  • An antibody against an LTBP-1L protein or a partial peptide thereof (hereinafter, in the description of an antibody, these may be simply abbreviated as an LTBP-1L protein) is known in accordance with a known method for producing an antibody or antiserum. Can be manufactured.
  • antigen used for preparing the antibody of the present invention examples include the above-described LTBP-1L protein or a partial peptide thereof, or a (synthetic) peptide having one or more of the same antigenic determinants. Any of these can be used (hereinafter, these may be simply referred to as the antigen of the present invention).
  • human LTBP-1L protein or a partial peptide thereof can be prepared, for example, by using (a) a human tissue or cell force known method or a method equivalent thereto, and (b) a peptide synthesizer or the like. (C) culturing a transformant containing DNA encoding human L TBP-1L protein or a partial peptide thereof, or (d) human LTBP-1L protein Alternatively, it is produced by biochemical synthesis using a cell-free transcription Z translation system with a nucleic acid encoding the partial peptide as a saddle type.
  • the crude fraction e.g., membrane fraction, soluble fraction
  • extraction is performed with an acid, a surfactant or alcohol, and the extracted solution is subjected to salting out, dialysis, gel filtration, reverse phase chromatography, ion exchange chromatography. It can also be purified and isolated by combining chromatography such as affinity chromatography.
  • the obtained LTBP-1L protein can be used as an immunogen as it is, or by preparing a partial peptide by limited degradation using peptidase or the like and using it as an immunogen.
  • the synthetic peptide includes, for example, a peptide having the same structure as the LTBP-1L protein purified from a natural material using the method (a) described above. Specifically, a peptide containing one or two or more amino acid sequences identical to the amino acid sequence at any position having at least 3 amino acids, preferably 6 amino acids in the amino acid sequence of the protein is used. It is done.
  • the cloning method includes (1) the ability to isolate DNA encoding the antigen from a human cDNA library by a hybridization method using a DNA probe designed based on the gene sequence encoding human LTBP-1L protein, (2) Using a DNA primer designed based on the gene sequence encoding human LTBP-1L protein, using human cDNA as a saddle, prepare DNA encoding the antigen by PCR, and adapt the DNA to the host And a method of inserting it into the expression vector.
  • a desired antigen can be obtained by culturing a transformant obtained by transforming a host with the expression vector in an appropriate medium.
  • an expression vector inserted with a DNA encoding an antigen prepared by the same method as in (c) above (for example, control of T7, SP6 promoter, etc.)
  • the expression vector shown below is used as a saddle type, and mRNA is synthesized using a transcription reaction solution containing RNA polymerase and substrates (NTPs) compatible with the promoter.
  • NTPs RNA polymerase and substrates
  • Examples include a method in which a translation reaction is performed using a cell-free translation system (eg, an extract of Escherichia coli, rabbit reticulocytes, wheat germ, etc.). By appropriately adjusting the salt concentration, etc., the transcription reaction and the translation reaction can be performed in the same reaction solution.
  • an immunogen a complete human LTBP-1L protein molecule or a peptide having a partial amino acid sequence thereof can be used.
  • partial amino acid sequences include those having 3 or more consecutive amino acid residue strengths, preferably 4 or more, more preferably 5 or more, and even more preferably 6 or more consecutive amino acid residue strengths. Can be mentioned.
  • the amino acid sequence may have, for example, 20 or less consecutive amino acid residue strengths, preferably 18 or less, more preferably 15 or less, and even more preferably 12 or less consecutive amino acid residue strengths. The thing which becomes. Some of these amino acid residues (eg, 1 or several) may be substituted with a replaceable group (eg, Cys, hydroxyl group, etc.).
  • the peptide used as an immunogen V has an amino acid sequence containing one or several such partial amino acid sequences.
  • the human cell itself expressing the LTBP-1L protein can be directly used as the antigen of the present invention.
  • human cells natural cells as described in the above section (a), cells transformed by the method as described in the above section (c), and the like can be used.
  • any cell can be used as long as it has collected force, such as human, monkey, rat, mouse, mouse, muster, and chicken.
  • ⁇ 293, COS7, CHO-Kl, NIH3T3, Balb3T3, FM 3A, L929, SP2 / 0, P3U1, B16, or P388 is preferably used.
  • Natural human cells or transformed warm-blooded animal cells expressing the human LTBP-1L protein were suspended in medium (eg, RPMI1640) or buffer (eg, Hanks' Balanced Salt Solution) used for tissue culture.
  • the immunized animal can be injected in a state.
  • any method that can promote antibody production may be used, and intravenous injection, intraperitoneal injection, intramuscular injection, or subcutaneous injection are preferably used.
  • the antigen of the present invention has immunogenicity, it can directly immunize insoluble matter, but it has a low molecular weight (only one to several antigenic determinants in the molecule (for example, when using antigens with a molecular weight of about 3,000 or less (ie, LTBP-1L partial peptides), these antigens are usually less immunogenic hapten molecules, so they can be bound to an appropriate carrier. Immunization can be performed as an adsorbed complex.
  • the carrier a natural or synthetic polymer can be used as the carrier.
  • Natural polymers include, for example, serum albumin from mammals such as rabbits, rabbits and humans, and thyroglobulin from mammals such as rabbits and rabbits, For example, ovalbumin from chickens, such as hemoglobin from mammals such as rabbits, rabbits, humans, and hidges, and moyanin (KLH) to keyhole limpets.
  • synthetic polymer include various latexes such as polymers or copolymers such as polyamino acids, polystyrenes, polyacryls, polyvinyls, and polypropylenes.
  • the mixing ratio of the carrier and the hapten may be any ratio that allows the antibody to be bound or adsorbed to the antigen bound to or adsorbed to the carrier at any ratio. It is possible to use the above-mentioned natural or synthetic polymer carrier, which is commonly used for the production of antibodies against normal haptens, bound or adsorbed at a ratio of 0.1 to 100 with respect to nopten 1 by weight. .
  • Various condensing agents can be used for force pulling of the hapten and the carrier.
  • diazo-um compounds such as bis-diazotized benzidine that crosslinks tyrosine, histidine, and tryptophan; N, N, — o Di-maleimide compounds such as phenol-dialemaleimide that cross-links groups, maleimide active ester compounds that cross-link an amino group and thiol group, and carpositimide compounds that cross-link an amino group and a carboxyl group
  • diazo-um compounds such as bis-diazotized benzidine that crosslinks tyrosine, histidine, and tryptophan
  • N N, — o
  • Di-maleimide compounds such as phenol-dialemaleimide that cross-links groups, maleimide active ester compounds that cross-link an amino group and thiol group, and carpositimide compounds that cross-link an amino group and a carboxyl group
  • an active ester reagent having a dithiopyridyl group on one amino group for example, N-succ
  • the antigen of the present invention can be administered to a warm-blooded animal by itself, for example, at a site where antibody production is possible by a method such as intraperitoneal injection, intravenous injection, subcutaneous injection, or intradermal injection, or a carrier, Administered with diluent.
  • a method such as intraperitoneal injection, intravenous injection, subcutaneous injection, or intradermal injection, or a carrier, Administered with diluent.
  • complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered.
  • Administration is usually 1
  • mice and rats are preferably used for the production of monoclonal antibodies.
  • human immunization to humans is ethically difficult, when the antibody of the present invention is to be administered to humans (0, human antibody-producing animals prepared according to the method described below (examples) : Mice) to obtain human antibodies, GO to produce chimeric antibodies, humanized antibodies or fully human antibodies according to the method described later, or (iii) in vitro immunization and virus cell immortalization, human —It is preferable to obtain human antibodies in combination with human (or mouse) hyperpridoma production technology, phage display method, etc. It should be noted that in vitro immunization can obtain antigens against antigens that suppress antibody production in normal immunization.
  • antibodies with antigen amounts on the order of ng to ⁇ g it is possible to obtain antibodies with antigen amounts on the order of ng to ⁇ g, and immunization can be completed within a few days.
  • a method of obtaining antibodies to be used preferably also in the case of preparing antibodies from non-human animals.
  • Animal cells used for in vitro immunization include lymphocytes isolated from humans and the above-mentioned warm-blooded animals (preferably mice and rats), such as peripheral blood, spleen and lymph nodes, preferably B lymphocytes. Examples include spheres.
  • lymphocytes isolated from humans and the above-mentioned warm-blooded animals (preferably mice and rats), such as peripheral blood, spleen and lymph nodes, preferably B lymphocytes.
  • Examples include spheres.
  • the spleen is removed from an animal of about 4-12 weeks of age, and the spleen cells are isolated, and an appropriate medium (eg Dulbecco's modified Eagle medium (D MEM), RPMI 1640 medium, Ham F12 medium, etc. ), And then suspended in a medium supplemented with fetal urine serum (FCS; about 5-20%) containing the antigen for about 4-10 days. CO incubator, etc.
  • D MEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • FCS fetal urine serum
  • Incubate with Examples of the antigen concentration include, but are not limited to, 0.05 to 5 g. It is preferable to prepare a thymocyte culture supernatant of an animal of the same strain (preferably about 1 to 2 weeks of age) according to a conventional method and add it to the medium.
  • antibody titers In the production of monoclonal antibodies, there are individuals in which antibody titers have been increased from warm-blooded animals (eg, mice, rats) or animal cells (eg, humans, mice, rats) immunized with the antigen. Or select a cell population and collect spleen or lymph nodes 2-5 days after the final immunization or After culturing for 4 to 10 days after in vitro immunization, the cells are recovered, antibody-producing cells are isolated, and this is fused with myeloma cells to prepare antibody-producing hyperpridoma.
  • the antibody titer in serum can be measured, for example, by reacting a labeled antigen with antiserum and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody.
  • the myeloma cells are not particularly limited as long as they can produce a hyperidoma that secretes a large amount of antibody, but cells that themselves do not produce or secrete antibodies are preferred, and cell fusion efficiency is also preferred. A higher one is more preferable.
  • a HAT hyperxanthine, aminopterin, thymidine
  • mouse myeloma cells are NS-1, P3U1, SP2 / 0, AP-1 isobaric rat myeloma cells are R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3 isotropic human myeloma cells are SKO-007, GM 1500-6TG-2, LICR-LON-HMy2, UC729-6, etc.
  • the fusion operation can be performed according to a known method, for example, the method of Kohler and Milstein [Nature, 256 ⁇ , 495 (1975)].
  • the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG), Sendai virus, and the like, preferably PEG.
  • the molecular weight of PEG is not particularly limited, but PEG1000 to PEG6000 having low toxicity and relatively low viscosity are preferable.
  • Examples of the PEG concentration include about 10 to 80%, preferably about 30 to 50%.
  • Use various buffer solutions such as serum-free medium (eg RPMI16 40), complete medium containing about 5-20% serum, phosphate buffered saline (PBS), Tris buffer, etc. Can do.
  • DMSO eg, about 10 to 20%
  • the pH of the fusion solution is, for example, about 4 to 10, preferably about 6 to 8.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of bone marrow cells is usually about 1: 1-20: 1, usually 20-40 ° C, preferably 30-37 ° C, usually 1-10 minutes. By incubating, cell fusion can be carried out efficiently.
  • Antibody-producing cell lines can also be obtained by infecting antibody-producing cells with a virus capable of transforming lymphocytes to immortalize the cells.
  • viruses include Epstein Barr (EB) virus.
  • EB Epstein Barr
  • Recombinant EB viruses that retain the ability to immortalize B lymphocytes but lack the ability to replicate viral particles (e.g., transition from a latent infection state to a lytic infection state) as an EB system without the possibility of viral contamination It is also preferred to use a deficiency in the switch gene).
  • B lymphocytes can be easily transformed using the culture supernatant. After culturing these cells in serum and a medium supplemented with penicillin Z streptomycin (P / S) (eg, RPMI1640) or a serum-free medium supplemented with cell growth factor, the culture supernatant is separated by filtration or centrifugation, The antibody-producing B lymphocytes are suspended at an appropriate concentration (eg, about 10 7 cells / mL), and incubated at 20 to 40 ° C, preferably 30 to 37 ° C, usually for about 0.5 to 2 hours. Thus, an antibody-producing B cell line can be obtained.
  • P / S penicillin Z streptomycin
  • a serum-free medium supplemented with cell growth factor
  • T lymphocytes that are toxic to EB virus-infected cells, so in order to increase the frequency of transformation, For example, it is preferable to remove T lymphocytes in advance by forming E rosette with Hedgeh erythrocytes and the like.
  • Hedge erythrocytes bound with a soluble antigen can be mixed with antibody-producing B lymphocytes, and lymphocytes specific for the target antigen can be selected by separating rosettes using a density gradient such as Percoll.
  • antigen-specific B lymphocytes are capped and do not present IgG on the surface, so when mixed with anti-IgG antibody-bound Hedge erythrocytes, antigen-nonspecific B lymphocytes are added. Only the ball forms a rosette. Therefore, antigen-specific B lymphocytes can also be selected by collecting the rosette non-forming layer using a density gradient such as Percoll.
  • Human antibody-secreting cells that have acquired infinite proliferation ability by transformation can be back-fused with mouse or human myeloma cells in order to stably maintain the antibody-secreting ability.
  • myeloma cells the same ones as described above can be used.
  • HAT hyperxanthine, aminopterin, thymidine
  • the medium for animal cells containing 5-20% FCS eg RPMI1640
  • cell growth factor eg RPMI1640
  • Hypoxanthine, aminopterin and Examples of the concentration of thymidine include about 0.1 mM, about 0.4 / z M, and about 0.016 mM, respectively.
  • Tubine resistance can be used to select human-mouse hyperpridoma. Since the human cell lines are more sensitive to Uwabain compared to mouse cell line, can be eliminated unfused human cells by adding to the culture medium at about 10 to 10-3 M.
  • feeder cells or a certain type of cell culture supernatant for selection of cells and hybridomas.
  • a feeder cell radiation is applied to a cell line that can produce a large amount of a growth factor useful for the appearance of a hyperidoma, which is a heterogeneous cell type with a limited survival period so that it can die by helping the appearance of the hyperidoma.
  • those with reduced proliferation ability are used.
  • mouse feeder cells include spleen cells, macrophages, blood, thymic cells and the like
  • human feeder cells include peripheral blood mononuclear cells and the like.
  • the cell culture supernatant include primary culture supernatants of various cells described above and culture supernatants of various cell lines.
  • Hypridoma can also be selected by separating the cells that bind to the antigen using a fluorescence activated cell sorter (FACS) after the antigen is fluorescently labeled and reacted with the fused cells.
  • FACS fluorescence activated cell sorter
  • aminopterin inhibits many cell functions, it is preferable to remove the medium force as soon as possible. In mice and rats, most myeloma cells die within 10-14 days, so aminopterin can be removed after 2 weeks of fusion. However, human hyperpridoma is usually maintained in a medium supplemented with aminopterin for about 4 to 6 weeks after fusion. It is desirable to remove hypoxanthine and thymidine at least 1 week after aminopterin removal. That is, in the case of mouse cells, for example, after addition or replacement, a complete medium supplemented with hypoxanthine and thymidine (HT) (for example, RPMI1640 supplemented with 10% FCS) is added or replaced 10 days after the fusion. Visible clones appear about 8-14 days after fusion. If the clone has a diameter force of about 1 mm, the amount of antibody in the culture supernatant can be measured.
  • hypoxanthine and thymidine for example, RPMI1640 supplemente
  • Measurement of the amount of antibody is performed by, for example, target antigen or a derivative thereof or a partial peptide thereof ( Hypridoma culture supernatant is added to a solid phase (eg, microplate) directly or with a carrier containing a partial amino acid sequence used as an antigenic determinant, and then radioactive material (eg, 125 I, m I, 3 H, 14 C), enzymes (eg, ⁇ -galatatosidase, ⁇ -darcosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase), fluorescent substances (eg, fluorescamine, fluorescein isothiocyanate)
  • the limiting dilution method is commonly used. Cloning using soft agar and cloning using FACS (described above) are also possible. Cloning by the limiting dilution method can be performed, for example, by the following procedure, but is not limited thereto.
  • Antibody-positive querca also draws out cells, floats in complete medium (eg 10% FCS and P / S supplemented RMPI1640) to a density of 30 cells / mL, and is fed to feeder cells. Add O.lmL (3 cells / well) to the plate, dilute the remaining cell suspension to 10 cells / mL, and sprinkle in another tube (1 cell / well). Dilute the solution to 3 cells / mL and spread to another well (0.3 cells / well). Incubate for 2 to 3 weeks until a visible clone appears. Measure the amount of antibody. Select positive wells and clone again.
  • complete medium eg 10% FCS and P / S supplemented RMPI1640
  • Nobridoma can be cultured in vitro or in vivo.
  • the culture method in vivo for example, by injecting mineral oil intraperitoneally to mice induced transformed fine cell tumor (MOPC) (Nono hybridoma parent histocompatible mouse), after 5-10 days 10 6
  • MOPC mice induced transformed fine cell tumor
  • a method of intraperitoneally injecting about 10 to 7 cells of hyperidoma and collecting ascites under anesthesia 2 to 5 weeks later is mentioned.
  • Monoclonal antibodies can be separated and purified by methods known per se, such as immunoglobulin separation and purification methods [eg, salting out, alcohol precipitation, isoelectric precipitation, electrophoresis, ion exchangers (eg, DEAE, QEAE) adsorption / desorption method, ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen-binding solid phase or specific purification by collecting active antibody such as protein A or protein G and dissociating the binding to obtain the antibody Can be done according to law etc.].
  • immunoglobulin separation and purification methods eg, salting out, alcohol precipitation, isoelectric precipitation, electrophoresis, ion exchangers (eg, DEAE, QEAE) adsorption / desorption method, ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen-binding solid phase or specific purification by collecting active antibody such as protein A or protein G and dissociating the binding to obtain the antibody Can be done according to law etc.
  • active antibody such as
  • a hybridoma can be produced by culturing the hyperidoma in vivo or in vitro of a warm-blooded animal and collecting the antibody from the body fluid or culture.
  • the antibody of the present invention When the antibody of the present invention is used for cancer prevention and treatment, the antibody must have anti-tumor activity! /, So the degree of anti-tumor activity of the obtained monoclonal antibody is high! It is necessary to investigate. Antitumor activity can be measured by comparing cancer cell growth, apoptosis induction, etc. in the presence and absence of antibodies.
  • the antibody of the present invention since the antibody of the present invention is used as a pharmaceutical for human administration, the antibody of the present invention (preferably a monoclonal antibody) has a risk of showing antigenicity when administered to a human.
  • Antibodies having reduced properties specifically, fully human antibodies, humanized antibodies, mouse-human chimeric antibodies, etc., particularly preferably fully human antibodies.
  • Humanized antibodies and chimeric antibodies can be prepared by genetic engineering according to the methods described below.
  • a fully human antibody can be produced from the above-described human-human (or mouse) hyperidoma.
  • a human antibody-producing animal described later
  • phage display method Is desirable.
  • chimeric antibody refers to the variable region (V and V) of the heavy and light chains.
  • sequence is derived from one mammalian species, and the constant region (C and C) sequences are from other mammalian species
  • variable region Means an antibody derived from The sequence of the variable region is preferably derived from an animal species that can be used to easily produce a hybridoma such as a mouse, and the constant region sequence is preferably derived from the mammalian species to be administered.
  • Examples of the method for producing a chimeric antibody include the method described in US Pat. No. 6,331,415 or a method obtained by partially modifying the method. Specifically, first, mRNA or total RNA is prepared from a monoclonal antibody-producing hybridoma (for example, mouse mouse hybridoma) obtained as described above according to a conventional method, and cDNA is synthesized. Using the cDNA as a saddle type, appropriate primers (for example, each of V and V as sense primers)
  • Oligo DNA containing nucleotide sequence encoding N-terminal sequence, oligo DNA hybridizing with nucleotide sequence encoding C and C N-terminal sequence as antisense primer eg
  • chimeric L chain DNA are inserted into appropriate expression vectors (for example, vectors containing promoters (eg, CMV promoter, SV40 promoter, etc.) that have transcriptional activity in CHO cells, COS cells, mouse myeloma cells, etc.) To do. DNAs encoding both strands may be inserted into separate vectors or tandemly inserted into one vector. Host cells are transformed with the resulting chimeric H chain and chimeric L chain expression vectors. Examples of host cells include animal cells such as mouse myeloma cells as described above, Chinese hamster ovary (CHO) cells, monkey-derived COS-7 cells, Vero cells, and rat-derived GHS cells.
  • appropriate expression vectors for example, vectors containing promoters (eg, CMV promoter, SV40 promoter, etc.) that have transcriptional activity in CHO cells, COS cells, mouse myeloma cells, etc.
  • appropriate expression vectors for example, vectors containing promoters (e
  • any method applicable to animal cells may be used, and preferred examples include the electopore position method.
  • the culture supernatant is recovered and purified in the same manner as described above to obtain a chimera.
  • Monoclonal antibodies can be isolated.
  • using germline cells of animals that have established transgenic technologies such as ushi, goats, and chickens as host cells, and have accumulated large-scale breeding knowhow as domestic animals (poultry)
  • a chimeric monoclonal antibody can be obtained easily and in large quantities from the milk or egg of the animal obtained by preparing a transgenic animal.
  • transgene technologies such as corn, rice, wheat, soybean, and bamboo shoots
  • plant cells that are cultivated in large quantities as major crops are used as host cells, microinjection into protoplasts, electo-poration, It is also possible to produce a transgenic plant using a particle gun method for intact cells, a sputum vector method, etc., and obtain a large amount of chimeric monoclonal antibody such as seeds and leaves obtained.
  • DNA encoding mouse V and V can also be converted to an appropriate linker, such as 1
  • HL -40 amino acids preferably 3-30 amino acids, more preferably 5-20 amino acids (eg, [Ser- (Gly) m] n or [(Gly) m- Ser] n (m is 0-10) , N is an integer from 1 to 5), etc.), and can be converted to scFv by ligating via DNA.
  • DNA encoding such genetically modified (conjugated) antibody molecules can be expressed in microorganisms such as Escherichia coli and yeast under the control of appropriate promoters. Can be produced.
  • V and V FRs When introduced into E. coli, a dimer called Fv is formed by monocistronic gene expression. Also, using molecular modeling, the appropriate amino acids in V and V FRs are
  • dsFv dimer When substituted with s, a dimer called dsFv is formed by an intermolecular disulfide bond between both chains.
  • a “humanized antibody” refers to a complementarity determining region (CDR) present in a variable region. It means an antibody in which the sequence of all regions other than (ie, the framework region (FR) in the constant region and variable region) is derived from human and only the sequence of CDR is derived from other mammalian species. As other mammalian species, for example, an animal species that can easily produce a hyperidoma such as a mouse is preferred.
  • Examples of the method for producing a humanized antibody include the methods described in US Pat. Nos. 5,225,539, 5,585,089, 5,693,761 and 5,693,762, or methods obtained by partially modifying them. Specifically, in the same manner as in the case of the above chimeric antibody, DNAs encoding V and V derived from mammal species other than humans (eg, mice) are isolated, and then used in a conventional manner.
  • Examples of such a method include a sequential CDR transplantation method described in JP-A-5-227970. DN that encodes V and V obtained in this way
  • A is a DNA encoding human C and C in the same manner as in the case of the above chimeric antibody.
  • Humanized antibodies can also be modified into scFv, scFv-Fc, minibody, dsFv, Fv, etc. using genetic engineering techniques in the same way as chimeric antibodies. Can also be produced.
  • the humanized antibody production technology can be applied to production of monoclonal antibodies that can be preferably administered to other animal species, for example, after the production technology of hyperidoma has been established.
  • animals that are widely bred as domestic animals (poultry) such as rabbits, pigs, hidges, goats, and -birds, and pet animals such as cat cats.
  • the VDJ exon in which various combinations of about 80 V fragments, about 30 D fragments, and 6 J fragments encode the antigen-binding site.
  • the total length reaches about 1.5 Mb (Chromosome 14) for the H chain, about 2 Mb (Chromosome 2) for the KL chain, and about 1 Mb (Chromosome 22) for the chain.
  • DNA that can be inserted into conventional gene transfer vectors is usually several kb to several hundred kb, and conventional transgenic animals that inject cloned DNA into fertilized eggs. It was difficult to introduce the full length by the production technique.
  • Example: Colcemide to prepare microcells in which 1 to several chromosomes or fragments thereof are encapsulated in the nuclear membrane, and introduce the chromosomes into mouse ES cells by the micronucleus fusion method.
  • Hybrid ES cells that retain the chromosome with the Hg gene or a fragment thereof are selected using a medium containing the drug and microinjected into the mouse embryo in the same manner as in normal KO mouse production.
  • Chimera mouse power to be obtained Select germline chimera using coat color as an index, etc., and transmit TC mouse strain (TC (hCF14)) that transmits human chromosome 14 fragment and human chromosome 2 fragment
  • TC mouse strain TC (hCF2)
  • an antigen-specific human monoclonal antibody-producing hyperidoma can be produced.
  • hCF2 containing a KL chain gene is unstable in mouse cells, there is a disadvantage that the efficiency of obtaining a hyperidoma is lower than that in a normal mouse.
  • the Hu-Mab Mouse contains about 50% of the ⁇ L chain gene, but exhibits a diversity of ⁇ chains equivalent to that of the full length because the variable region cluster has a doubled structure (the other side). Since the H chain gene is about 10% and does not contain cocoon, the H chain diversity is low and the responsiveness to the antigen is insufficient), and it is inserted into the mouse chromosome by the YAC vector (Ig ⁇ -YAC). Therefore, it is stably maintained in mouse cells.
  • TC (hCF14) mouse By cross-breeding with Hu-Mab Mouse, a mouse (trade name: KM mouse) that stably retains hCF14 and Ig ⁇ -YAC can be obtained. Antigen affinity can be obtained.
  • TC mouse into which human chromosome 22 carrying a chain gene or a fragment thereof was introduced was prepared in the same manner as described above, and this was combined with the above-mentioned double TC / KO mouse or KM mouse. It can be obtained by mating, or can be obtained by constructing a human artificial chromosome (HAC) containing, for example, an H chain locus and a chain locus and introducing it into a mouse cell (Nat. (BiotechnoL, 18: 1086-1090, 2000) 0
  • the antibody of the present invention is used as a medicine, it is preferably a monoclonal antibody, but may be a polyclonal antibody.
  • the antibody of the present invention is a polyclonal antibody, it is not necessary to use a hyperidoma. Therefore, a technique for producing a hyperidoma should be established, but a transgenic technique has been established, and animal species, preferably a tumor.
  • a human antibody-producing animal can be produced at a low cost by producing a human antibody-producing animal using an ungulate such as rhinoceros by the same method as described above (for example, Nat. BiotechnoL, 20: 889-894, 2002).
  • the obtained human polyclonal antibody can be purified by collecting blood, ascites, milk, eggs, etc., preferably milk and eggs of human antibody-producing animals, and combining the same purification techniques as described above.
  • phage display Another approach to making fully human antibodies is to use phage display.
  • PCR mutations may be introduced in addition to CDRs, so there are few reports of HAHA production in clinical stages, while there is no risk of infection with heterologous viruses derived from host animals. !, And has the advantage that the specificity of the point and antibody is infinite (antibodies against prohibited clones and sugar chains can be easily produced)! /
  • Examples of methods for preparing a phage display human antibody library include, but are not limited to, the following.
  • the phage used is not particularly limited, but is usually filamentous phage (Ff pacteriophage) Are preferably used.
  • Ff pacteriophage filamentous phage
  • a phage display vector 1) Introduce a foreign gene fused to the coat protein gene of the phage genome, and display all the coat proteins displayed on the phage surface as a fusion protein with the foreign protein.
  • a gene that encodes the fusion protein is inserted separately from the wild-type coat protein gene, and the fusion protein and the wild-type coat protein are expressed at the same time. 3) It has a gene that encodes the fusion protein. For example, in the case of 1) Infection ability is lost when large foreign proteins are fused. Type 2) or 3) is used.
  • pCESl is a DNA that encodes the ⁇ light chain constant region downstream of the g3p signal peptide under the control of a single ratatose promoter and g3p It is a Fab-expressing phagemid vector in which DNA encoding CH3, His-tag, c-myc tag, and g3p coding sequence are arranged via an amber stop codon (TAG) downstream of the signal peptide.
  • TAG amber stop codon
  • Fab When introduced into Escherichia coli with an amber mutation, Fab is displayed on the g3p coat protein, but when expressed in strain HB2151 without the amber mutation, soluble Fab antibodies are produced.
  • scFv expression type phagemid betater for example, pHENl (J. Mol. Biol, 222: 581-597, 1991) is used.
  • examples of the helper phage include M13-K07, VCSM13 and the like.
  • a sequence containing a codon encoding cysteine is linked to the 3 'end of the antibody gene and the 5' end of the coat protein gene, respectively, and both genes are separated simultaneously (not as a fusion protein).
  • human antibody libraries include naive Z non-immune libraries, synthetic libraries, and immune libraries.
  • a naive Z non-immunized library is one of the V and normal human possessed V and
  • V genes were obtained by RT-PCR, and they were randomly displayed as described above.
  • mRNA derived from lymphocytes such as tonsils is used as a sputum type.
  • a naive library In order to eliminate the V gene bias such as disease history, the amplification of only IgM-derived mRNA that has not undergone class switching due to antigen sensitization is called a naive library.
  • Representative examples include the CAT library (see J. Mol. Biol, 222: 581-597, 1991; Nat. Biotechnol, 14: 309-314, 1996), and the MRC library (Annu. Rev. Immunol, 12: 4 33-455, 1994), Dyax library (J. Biol. Chem., 1999 (supra); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 14: 7969-7974, 2000 For example).
  • a synthetic library is a DNA that encodes a random amino acid sequence of an appropriate length, selecting a specific antibody gene that is functional in human B cells, and the portion of the V gene fragment, for example, the antigen binding region such as CDR3. Replaced and made into a library. Since a library can be constructed from a combination of V and V genes that produce functional scFv and Fab from the beginning
  • the immunized library is a lymphocyte collected from humans with increased blood antibody titers against the target antigen, such as patients with cancer, autoimmune diseases, infectious diseases, etc.
  • MRNA is prepared from human lymphocytes, etc., artificially immunized with the target antigen by the same method as in the above naive Z non-immune library, and V and V genes are amplified by RT-PCR and libraryed It is a thing. Purpose from the beginning
  • the target antibody can be obtained even from a relatively small size library.
  • phage number 100 to 1,000 phage / clone
  • about 10 8 to 10 1 1 clone are suitable, screening the antibodies with Kd values of usually 10-9 ordered in library of about 10 8 clones can do.
  • the process of selecting an antibody against a target antigen by the phage display method is called Panjung! Specifically, for example, a carrier in which an antigen is immobilized and a phage library are brought into contact with each other, and after washing away unbound phage, the bound phage is eluted with carrier force, and the phage is propagated by infecting E. coli.
  • the phage displaying antigen-specific antibodies is concentrated by repeating a series of operations 3 to 5 times.
  • a carrier for immobilizing an antigen various carriers used in normal antigen-antibody reaction and affinity chromatography, for example, insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose, synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon
  • insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose
  • synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon
  • microplates, tubes, membranes, columns, beads, etc. which have power such as glass and metal, and surface plus, sensor chip of Mon Resonance (SPR).
  • SPR sensor chip of Mon Resonance
  • For the immobilization of the antigen physical adsorption may be used, or a method using a chemical bond usually used for insolubilizing and immobilizing proteins or enzymes may be used.
  • a piotin (Strebto) avidin system is preferably used.
  • the endogenous ligand that is the target antigen is a small molecule such as a peptide
  • special care must be taken to ensure that the moiety used as the antigenic determinant is not covered by binding to the carrier.
  • blocking solution such as BSA solution (1-2 times), PBS containing surfactant such as Tween (3-5 times), etc.
  • citrate buffer pH 5
  • acids eg 0.1M hydrochloric acid
  • cleavage by specific proteases for example, a gene sequence encoding a trypsin cleavage site at the junction between the antibody gene and the coat protein gene).
  • the wild-type coat protein is displayed on the surface of the eluted phage, so that even if the coat protein is expressed as a fusion protein, it is possible to infect and propagate E. coli.
  • competitive elution with soluble antigen, or reduction of SS binding eg, CysDisplay TM as described above, after panning, using an appropriate reducing agent
  • Elution by antigen-specific phage can be recovered by dissociating the antibody from the coat protein. If it is eluted with acid, neutralize it with Tris, etc., and then infect the eluted phage with E. coli, and after incubation, collect the phage by a conventional method.
  • the phages presenting antigen-specific antibodies are concentrated by panning, they are infected with colon bacteria and then seeded on a plate to perform cloning. Collect the phages again, and confirm the antigen binding activity by the above-mentioned antibody titer measurement method (eg ELISA, RIA, FIA, etc.) or measurement using FACS or SPR.
  • the above-mentioned antibody titer measurement method eg ELISA, RIA, FIA, etc.
  • Isolation and purification of phage-cloning antibodies that display selected antigen-specific antibodies can be performed, for example, as phage display vectors in which an amber stop codon is introduced at the junction of an antibody gene and a coat protein gene. If the phage is infected with E. coli that does not have an amber mutation (eg, strain HB2151), soluble antibody molecules are produced and secreted into the periplasm or medium, so that the cell wall is lysed with lysozyme. Then, the extracellular fraction can be recovered and purified using the same purification technique as described above. If His-tag or c-myc tag is introduced, IMAC can be easily purified using an anti-c-myc antibody column. Also,
  • the target antibody can be obtained by carrying out the same purification procedure. Can be purified.
  • the technology for producing fully human antibodies using human antibody-producing animals and phage display human antibody libraries can be applied to the production of monoclonal antibodies of other animal species.
  • animals that are widely bred as domestic animals (poultry) such as ushi, pigs, hidges, goats, and -birds, and pet animals such as cats and cats.
  • domestic animals such as ushi, pigs, hidges, goats, and -birds
  • pet animals such as cats and cats.
  • the use of immune libraries is more effective because there are few ethical problems with respect to artificial immunity of the target antigen.
  • the polyclonal antibody of the present invention can be produced according to a method known per se or a method analogous thereto.
  • an immune antigen protein or peptide antigen itself, a certain V ⁇ , forms a complex with it and a carrier protein to produce the above monoclonal antibody. It can be produced by immunizing a warm-blooded animal in the same manner as described above, collecting an antibody-containing material against the immunized animal LTBP-1L protein, and separating and purifying the antibody.
  • the type of carrier protein and the mixing ratio of carrier protein and hapten were immunized by crosslinking to a carrier protein.
  • Any antibody can be cross-linked at any ratio as long as the antibody can be efficiently produced against the nopten.
  • ushi serum albumin, thyroglobulin, hemocyanin, etc. can be cross-linked to hapten 1 by weight. , About 0.1 to about 20, preferably about 1 to about 5 are used.
  • various condensing agents can be used for force pulling of the hapten and the carrier protein, and active ester reagents containing dartalaldehyde, carbodiimide, maleimide active ester, thiol group, and dithiobilidyl group are used. It is done.
  • the condensation product is administered to warm-blooded animals at the site where antibody production is possible, together with the carrier or diluent.
  • complete Freund adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered.
  • Administration is usually performed once every about 1 to about 6 weeks, for a total of about 2 to about 10 times.
  • the polyclonal antibody can be preferably collected from blood, ascites, etc. of warm-blooded animals immunized by the above method.
  • the polyclonal antibody titer in the antiserum can be measured in the same manner as the antibody titer in the antiserum described above.
  • the separation and purification of the polyclonal antibody can be performed according to the same immunoglobulin separation and purification method as the above-described separation and purification of the monoclonal antibody.
  • a nucleic acid containing a base sequence complementary to a target region of a target nucleic acid that is, a nucleic acid that can hybridize with the target nucleic acid can be said to be "antisense" to the target nucleic acid.
  • nucleotide sequence of a nucleic acid encoding human LTBP-1L protein e.g., DNA (hereinafter, in the description of antisense nucleic acid, DNA encoding human LTBP-1L may be abbreviated as DNA of the present invention)
  • An antisense nucleic acid having a complementary or substantially complementary nucleotide sequence or a part thereof is complementary or substantially complementary to the nucleotide sequence of a nucleic acid (eg, DNA) encoding human LTBP-1L.
  • a nucleic acid sequence or a part thereof, and Any antisense nucleic acid may be used as long as it has an action capable of suppressing the present.
  • the base sequence substantially complementary to the DNA of the present invention is, for example, an overlap with the base sequence of a base sequence complementary to the DNA of the present invention (that is, the complementary strand of the DNA of the present invention).
  • homology is synonymous with the DNA of the present invention described above.
  • the base sequence of the portion encoding the ⁇ terminal site of the LTBP-1L protein (for example, the start)
  • an antisense nucleic acid having a homology of about 80% or more, preferably about 90% or more, more preferably about 95% or more with the complementary strand of the entire base sequence of the DNA of the present invention containing introns. are preferred.
  • an antisense nucleic acid comprising a nucleotide sequence complementary or substantially complementary to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or a part thereof, preferably, for example, SEQ ID NO: 2 And an antisense nucleic acid containing a base sequence complementary to the base sequence represented by or a part thereof.
  • an antisense nucleic acid having a base sequence complementary to or substantially complementary to the base sequence of the DNA of the present invention or a part thereof was cloned. Alternatively, it can be designed and synthesized based on the determined base sequence information of DNA encoding LTBP-1L.
  • a powerful antisense nucleic acid can inhibit the replication or expression of the LTBP-1L gene. That is, the antisense nucleic acid of the present invention can hybridize with RNA (mRNA or initial transcription product) transcribed from the LTBP-1L gene, and can synthesize mRNA (processing) or function (translation into protein). Can be inhibited.
  • the length of the target region of the antisense nucleic acid of the present invention is such that the antisense nucleic acid hybridizes, and as a result, translation into the LTBP-1L protein is inhibited.
  • an oligonucleotide having a strength of about 10 to about 40 bases, particularly about 15 to about 30 bases is preferable, but not limited thereto.
  • LTBP-1L gene 5 end hairpin loop, 5, end 6-base pair 'repeat', 5 'end untranslated region, translation start codon, protein coding region, ORF translation stop codon, 3' end non A translation region, a 3′-end palindromic region, or a 3′-end hairpin loop can be selected as a preferred target region of an antisense nucleic acid.
  • Any region in the LTBP-1L gene can be selected as a target.
  • the intron portion of the gene can be used as the target region.
  • the antisense nucleic acid of the present invention binds to the LTBP-1L gene, which is a double-stranded DNA that only hybridizes with the mRNA or initial transcription product of LTBP-1L and inhibits translation into a protein.
  • a triplex that can inhibit RNA transcription.
  • it may form a DNA: RNA nobled to induce degradation by RNaseH.
  • the phosphate residue (phosphate) of each nucleotide constituting the antisense nucleic acid is, for example, phosphorothioate, methylphosphonate, phosphorodithionate, etc. It may be substituted with a chemically modified phosphate residue.
  • the sugar (deoxyribose) of each nucleotide may be substituted with a chemically modified sugar structure such as 2,1-O-methyli ⁇ , and the base moiety (pyrimidine, purine) is also chemically modified. As long as it hybridizes to the DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, it may be misaligned.
  • Antisense nucleic acids are 2Doxy D-ribose-containing polynucleotides, D-ribose-containing polynucleotides, other types of polynucleotides that are purine or pyrimidine base N-glycosides, non-nucleotide backbones
  • Other polymers having a specific bond eg, commercially available protein nucleic acids and synthetic sequence-specific nucleic acid polymers
  • other polymers containing special linkages provided that the polymer is a base such as found in DNA or RNA Containing nucleotides with configurations that allow pairing and base attachment Etc.
  • nucleoside may include those having other heterocyclic bases that are modified in addition to purine and pyrimidine bases. Such modifications may include methylated purines and pyrimidines, acylated purines and pyrimidines, or other heterocycles. Modified nucleosides and modified nucleotides may also have modified sugar moieties, e.g. one or more hydroxyl groups are replaced by halogens or aliphatic groups, or ethers, amines, etc. Converted to a functional group! Come on! /
  • the antisense nucleic acid of the present invention is RNA, DNA or a modified nucleic acid (RNA, DNA).
  • modified nucleic acids include nucleic acid sulfur derivatives, thiophosphate derivatives, polynucleoside amides and those that are resistant to degradation of oligonucleoside amides.
  • the antisense nucleic acid of the present invention can be designed, for example, as follows. That is, to make the antisense nucleic acid more stable in the cell, to increase the cell permeability of the antisense nucleic acid, to increase the affinity for the target sense strand, In such a case, the toxicity of the antisense nucleic acid is made smaller. Such modifications are described in, for example, Pharm Tech Japan, 8 ⁇ , 247 or 395, 1992, Antise Many reports have been published in nse Research and Applications, CRC Press, 1993, etc.
  • the antisense nucleic acid of the present invention may be altered, or may be provided in a special form such as a ribosome or microsphere that may contain a modified sugar, base, or bond, or by gene therapy. It can be applied or provided in an added form. In this way, the additional form can be used to increase the interaction with polycations such as polylysine, which acts to neutralize the charge of the phosphate group skeleton, the cell membrane, and increase the uptake of nucleic acids.
  • Hydrophobic lipids eg, phospholipids, cholesterol, etc.
  • Preferred lipids for addition include cholesterol and its derivatives (eg, cholesteryl chloroformate, cholic acid, etc.).
  • nucleic acids can be attached via bases, sugars, intramolecular nucleoside bonds.
  • groups include cap groups that are specifically arranged at the 3 ′ end or 5 ′ end of nucleic acids, and that prevent degradation by nucleases such as exonuclease and RNase.
  • capping groups include, but are not limited to, hydroxyl protecting groups known in the art, including glycols such as polyethylene glycol and tetraethylenedaricol.
  • the ribozyme capable of specifically cleaving the mRNA or initial transcript encoding LTBP-1L within the coding region is also an antisense of the present invention. It can be included in a nucleic acid.
  • “Ribozyme” refers to RNA having an enzyme activity that cleaves nucleic acids. Recently, it has been clarified that oligo DNA having the base sequence of the enzyme active site also has a nucleic acid cleavage activity. In the specification, as long as it has a sequence-specific nucleic acid cleavage activity, it is used as a concept including DNA.
  • ribozymes are self-splicing RNAs found in infectious RNAs such as viroids and virsoids, and hammerhead and hairpin types are known.
  • the hammerhead type exhibits enzyme activity at about 40 bases, and several bases at both ends adjacent to the part of the hammerhead structure (about 10 bases in total) are complementary to the desired cleavage site of mRNA. By doing so, it is possible to specifically cleave only the target mRNA.
  • This type of ribozyme has the additional advantage of not attacking genomic DNA because it uses only RNA as a substrate.
  • the target sequence can be identified by using a hybrid ribozyme linked to an RNA motif derived from a viral nucleic acid that can specifically bind to an RNA helicase. It can be made into a single chain [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98 (10): 5572-5 577 (2001)]. Furthermore, when the ribozyme is used in the form of an expression vector containing the DNA that encodes it, a hybrid ribosome further linked with a tRNA-modified sequence is added to facilitate the transfer of the transcript to the cytoplasm. It can also be Zym [Nucleic Acids Res., 29 (13): 2780-2788 (2001)].
  • RNA interference RNA interference
  • siRNA can be designed appropriately using commercially available software (eg, RNAi Designer; Invitrogen) based on the base sequence information of the target mRNA.
  • the antisense oligonucleotide and ribozyme of the present invention determine the target sequence of mRNA or the initial transcript based on the LTBP-1L cDNA sequence or genomic DNA sequence, and use a commercially available DNAZRNA automatic synthesizer (Applied). It can be prepared by synthesizing a sequence complementary to this using “Biosystems, Beckman, etc.”. For siRNA, the sense strand and the antisense strand are respectively synthesized by a DNAZRNA automatic synthesizer, denatured in an appropriate annealing buffer at about 90 to about 95 ° C for about 1 minute, and then about 30 to about 70 °. It can be prepared by annealing with C for about 1 to about 8 hours.
  • siRNA may be RNA (shRNA linking the sense and antisense strands through a linker of appropriate length (eg, about 3 to about 10 bases). ) And can be designed to be processed by an enzyme dicer or the like in the animal cell to be introduced.
  • an expression vector in which DNAs encoding the sense strand and the antisense strand are separately controlled by Pol III promoters such as U6 and HI, or the above-mentioned sense strand and antisense strand are linked. It may be prepared as an expression vector placed under the control of a Pol III promoter that encodes an RNA chain linked via a single gene, and expressed in animal cells to form siRNA.
  • the inhibitory activity of the antisense nucleic acid of the present invention is that the transformant into which the LTBP-1L gene is introduced, the LTBP-1L gene expression system in vivo or in vitro, or the LTBP-1L protein translation in vivo or in vitro It can be examined using the system.
  • LTBP-1L protein is increased in tissues of cancer patients with poor prognosis, and is considered to be a direct or indirect exacerbation factor particularly in advanced cancers.
  • cancer preferably ovarian cancer, cervical cancer, endometrial cancer, stomach cancer, colon cancer, lung cancer, other solid cancers (for example, Liver cancer, spleen cancer, gallbladder cancer, kidney cancer, etc.), more preferably ovarian cancer, cervical cancer, endometrial cancer, stomach cancer, large intestine cancer and lung cancer, particularly preferably ovarian cancer, endometrial cancer and lung cancer
  • It can be used as a therapeutic agent.
  • the cancer therapeutic agent containing the antibody of the present invention has low toxicity and is orally or parenterally administered to humans (for example, intravascular administration, subcutaneous) as a solution or as a pharmaceutical composition of an appropriate dosage form. Administration).
  • the antibody of the present invention may be administered per se or may be administered as an appropriate pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition used for administration may contain the antibody of the present invention and a salt thereof and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient.
  • Such pharmaceutical compositions are provided as dosage forms suitable for oral or parenteral administration.
  • compositions for parenteral administration for example, injections, suppositories and the like are used, and injections are intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, intravenous injections, etc.
  • the dosage form It may be included.
  • Such an injection can be prepared according to a known method.
  • a method for preparing an injection it can be prepared, for example, by dissolving, suspending or emulsifying the antibody of the present invention or a salt thereof in a sterile aqueous liquid or oily liquid usually used for injections.
  • an aqueous solution for injection for example, physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants, etc.
  • solubilizers such as alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, , Propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants (eg, polysorbate 80, HCO-50 (polyoxyethylene (50 mol) adduct of hydrogenated castor oil)) and the like.
  • alcohol eg, ethanol
  • polyalcohol eg, , Propylene glycol, polyethylene glycol
  • nonionic surfactants eg, polysorbate 80, HCO-50 (polyoxyethylene (50 mol) adduct of hydrogenated castor oil)
  • oily liquid for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol and the like may be used in combination as a solubilizing agent.
  • the prepared injection solution is preferably filled in a suitable ampoule.
  • a suppository used for rectal administration may be prepared by mixing the above-mentioned antibody or a salt thereof with an
  • compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including dragees and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (soft turnips). Cell agents), syrups, emulsions, suspensions and the like.
  • Such a composition is produced by a known method and may contain a carrier, a diluent or an excipient usually used in the pharmaceutical field.
  • a carrier and excipient for tablets for example, lactose, starch, sucrose, and magnesium stearate are used.
  • parenteral or oral pharmaceutical compositions described above are conveniently prepared in dosage unit forms that are compatible with the dosage of the active ingredient.
  • dosage form of such a dosage unit include tablets, pills, capsules, injections (ampoules), and suppositories.
  • the antibody content is usually 5 to 500 mg per dosage unit dosage form, especially 5 to 100 mg for injections, and 10 to 250 mg for other dosage forms! ,.
  • the dosage of the above-mentioned preparation containing the antibody of the present invention varies depending on the administration subject, the target cancer type, symptom, administration route, etc., but is used, for example, for the treatment of adult ovarian cancer.
  • the antibody of the present invention is usually about 0.01 to 20 mg / kg body weight, preferably about 0.1 to 10 mg / kg body weight, more preferably about 0.1 to 5 mg / kg body weight per day. It is convenient to administer the dose by intravenous injection, preferably about 1 to 3 times a day. Other non In the case of oral administration and oral administration, an equivalent amount can be administered. If the symptoms are particularly severe, you can increase the dose according to the symptoms.
  • the antibody of the present invention can be administered per se or as an appropriate pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition used for the administration comprises the antibody or a salt thereof and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient.
  • a composition is provided as a dosage form suitable for oral or parenteral administration (eg, intravascular injection, subcutaneous injection, etc.).
  • parenteral administration eg, intravascular injection, subcutaneous injection, etc.
  • Each of the above-described compositions is preferable when blended with the antibody, and may contain other active ingredients as long as they do not cause an interaction.
  • the antibody of the present invention may be used for other drugs such as alkylating agents (eg, cyclophosphamide, ifosfamide, etc.), antimetabolites (eg, methotrexate, 5-fluorouracil, etc.), anticancer antibiotics (eg, , Mitomycin, adriamycin, etc.), plant-derived anticancer agents (eg, bincristine, vindesine, taxol, etc.), cisplatin, carboplatin, etopoxide, irinotecan, etc.
  • the antibody of the present invention and the drug may be administered to a patient at the same time or at different times.
  • the antisense nucleic acid of the present invention that can complementarily bind to the transcription product of the LTBP-1L gene and suppress the expression of the gene has low toxicity, and is an LTBP-1L protein or LTBP-1L gene in vivo.
  • Cancer ovarian cancer, uterine cervix cancer, endometrial cancer, stomach cancer, colon cancer, lung cancer, other solid cancers (eg, liver cancer, spleen cancer, gallbladder cancer, kidney cancer) Etc.), more preferably ovarian cancer, cervical cancer, endometrial cancer, stomach cancer, colon cancer and lung cancer, particularly preferably ovarian cancer, endometrial cancer and lung cancer).
  • the antisense nucleic acid of the present invention when used as a cancer therapeutic agent, it can be formulated and administered according to a method known per se.
  • antisense nucleic acid for example, after inserting the above-mentioned antisense nucleic acid alone or into an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, etc., a human or mammal (eg, , Rats, rabbits, hidges, pigs, mice, cats, dogs, monkeys, etc.) orally or parenterally be able to.
  • the antisense nucleic acid can be formulated as it is or with a physiologically recognized carrier such as an adjuvant for promoting ingestion, and can be administered through a catheter such as a gene gun or a hyde mouth gel catheter. Alternatively, it can be administered locally as an inhaler in the form of an aerosol.
  • the above-mentioned antisense nucleic acid is formulated alone or with a carrier such as ribosome (injection) and administered intravenously, subcutaneously, etc. May be.
  • the dosage of the antisense nucleic acid varies depending on the target cancer type, administration subject, administration route, etc.
  • the antisense nucleic acid of the present invention is administered for the purpose of treating ovarian cancer.
  • an adult body weight 60 kg
  • about 0.1 to about 1 OO mg of the antisense nucleic acid is administered every day.
  • a short fragment (oligo DNA) of the human LTBP-1L gene containing the -202G and Z or + 20A polymorphisms described above becomes an LTBP-1L promoter in cancer patients with the -202G and / or + 20A alleles Spl binding can be competitively inhibited, so that it can be used as a decoy nucleic acid that suppresses overexpression of the LTBP-1L gene. Therefore, the present invention also provides a partial base sequence of the human LTBP-1L gene, which comprises the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, wherein the base sequence is represented by base numbers 2014 and Z or 2235.
  • Cancer ovarian cancer, cervical cancer, endometrial cancer, gastric cancer, colon cancer, lung cancer, other solid cancers (for example, liver cancer, spleen cancer) containing nucleic acids comprising a continuous base sequence of 500 bases , Gallbladder cancer, kidney cancer, etc.), more preferably ovarian cancer, cervical cancer, endometrial cancer, gastric cancer, colon cancer and lung cancer, particularly preferably ovarian cancer, endometrial cancer and lung cancer).
  • solid cancers for example, liver cancer, spleen cancer
  • nucleic acids comprising a continuous base sequence of 500 bases , Gallbladder cancer, kidney cancer, etc.
  • ovarian cancer, cervical cancer, endometrial cancer, gastric cancer, colon cancer and lung cancer particularly preferably ovarian cancer, endometrial cancer and lung cancer.
  • the nucleic acid can be formulated in the same manner as the antisense nucleic acid of the present invention and can be administered to cancer patients.
  • DNA Deoxyribonucleic acid
  • cDNA complementary deoxyribonucleic acid
  • RNA Ribonucleic acid
  • RNA Messenger ribonucleic acid
  • dATP Deoxyadenosine triphosphate
  • dTTP Deoxythymidine triphosphate
  • dGTP Deoxyguanosine triphosphate
  • dCTP Deoxycytidine triphosphate
  • EDTA ethylenediamine tetraacetic acid
  • Trt Trityl
  • sequence numbers in the sequence listing of the present specification indicate the following sequences.
  • the nucleotide sequence of the human LTBP-1L gene 5,-regulatory region is shown.
  • the nucleotide sequence of human LTBP-1L cDNA is shown.
  • 1 shows the amino acid sequence of human LTBP-1L protein.
  • Tissue specimens were surgically obtained from a series of 66 ovarian cancer patients, 66 endometrial cancer patients, 55 stomach cancer patients, 81 colorectal cancer patients, and 90 lung cancer patients from Kanazawa University Hospital. Stored at -80 ° C for analysis or fixed with formaldehyde for immunohistochemical analysis.
  • Written informed consent was obtained from patients for the use of patient tissue in this study. All patients were newly diagnosed and received histological confirmation without prior treatment (ie physiotherapy or radiotherapy). Healthy control DNA samples were obtained from oral epithelial cells of 156 Japanese individuals, including Kanazawa University staff and students, with written informed consent.
  • Oral epithelial cells were collected by modifying the previously reported oral cleansing method (Lancet 1988, 1: 1356-8; Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 1998, 7: 719-24).
  • participants rub the mouth vigorously with 10 mL of oral cleaning solution Mondamine (registered trademark; Earth Pharmaceutical) for 10 seconds, and then spit it into a conical tube.
  • Oral by centrifuging for 10 minutes at g Cells were collected. Total genomic DNA was purified using Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega).
  • the LTBP-1L promoter region ranging from 2164 to +130 was analyzed by direct sequencing.
  • the PCR primer sequences used are as follows.
  • R (Rivese)-1 5, -GAGGATTGAGGTGAGTCACAAGG-3 '(SEQ ID NO: 5);
  • F- -2 5, -GTAGAACAAGGAATTGGATCCGT-3, (SEQ ID NO: 6) and
  • R--2 5, -TTGATTTGGCAGGCAGGGCCTC-3 '(SEQ ID NO: 7);
  • R- -3 5, -GAAAGTCCACAGTCATAGCAGTC-3 '(SEQ ID NO: 9);
  • F- -4 5, -CAAAGCCTTGGAAACACACCATC-3, (SEQ ID NO: 10) and
  • R- -4 5, -TTAGGGTAGGACTAGAGTTCA-3 '(SEQ ID NO: 11);
  • R--5 5, -TTACTGAACGATCCTGTCCTTTC-3,; (SEQ ID NO: 13) and
  • F- -6 5, -AGTATCACAGCAAACACGGAT-3, (SEQ ID NO: 14) and
  • R- -6 5, -GGTGCACCACGTAGGTGATCCTCC-3, (SEQ ID NO: 15)
  • -202G / C and + 20A / C haplotypes were analyzed by PCR-based restriction fragment length polymorphism (RF LP) method.
  • RF LP restriction fragment length polymorphism
  • -The LTBP-1L promoter region ranging from 392 to +154 was amplified using F-7: 5, -TTGGCTGCTCAGGTCTGACA-3, (SEQ ID NO: 16) and R-6 primers.
  • PCR was performed at 94 ° C for 2 min followed by 94 ° C for 1 min; 56 ° C, 1 min and 72 ° C for 1 min under 31 cycles, with 72 ° C in the last step 10 minutes, all PCR fragments Completely extended. This number of cycles was within the range where the PCR reaction was exponential.
  • the 546 bp PCR product was double digested with EcoRII and Cspl (both manufactured by Toyobo) and the resulting DNA fragments were separated on a 3% agarose gel.
  • the haplotype was determined by detecting the band with the length shown in Fig. 1B.
  • LTBP-1L promoter genotyping in various cancer patients and healthy subjects controls
  • ⁇ thick flour LTBP-1L promoter genotype individuals /%)
  • Allele frequency p-value ⁇ 3 ⁇ 4 determined
  • Example 1 The effect of the polymorphism identified in Example 1 on the activity of the LTBP-1L promoter was examined by luciferase reporter assay.
  • the LTBP-1L promoter luciferase reporter plasmid was provided by Dr. Jorma Keski-Oja, University of Helsinki (J. Biol. Chem. 1999, 274: 32619-30). This plasmid was obtained by inserting the LTBP-1L gene 5, -regulatory region (-2211 to +54) into a luciferase reporter vector pGL3-Basic (Promega). Mutant plasmids were generated using GeneTanor Site-Directed Mutagenesis system (Invitrogen Life Technologies).
  • the primer for introducing 202G is 5,-TGCGCGGCCCGCTCCCCTGGC CCCTCCCCGCTCCC-3, (SEQ ID NO: 17) and 5, -AGGGGAGCGGGCCGCGCA AGGTGAGGGTCC-3 '(SEQ ID NO: 18), and primer for introducing + 20A
  • 5 -GGCCGGGGGAGGGGGCCGGACAGCGCGCGACC-3 '(SEQ ID NO: 19) and 5, -GTCCGGCCCCCTCCCCCGGCCGTGCGGCTCGCCT-3' SEQ ID NO: 20
  • Plasmids pM, pM-Spl (Spl expression vector), and pCMV-DNsp3 (Dominant negative expression vector of S p3) were provided by Dr. Yoshihiro Tsuwa from Kyoto Prefectural University of Medicine.
  • Ovarian cancer-derived RMUG-S cell line obtained from JCRB was maintained in Ham F12 medium (Sigma-Aldrich) containing 10% FBS (containing 100 U / ml penicillin and 100 ⁇ g / ml streptomycin), One day before transfer, the cells were seeded on a 24 well plate at a density of 5 ⁇ 10 4 cells. Cells were transfected with 0.4 g of each reporter plasmid alone or with the same amount of effector plasmid using FuGENE6 transfection reagent (Roche Molecular Biochemicals). To calibrate transfer efficiency, the Renilla luciferase plasmid phRL-tk was co-transformed.
  • the LTBP-IL promoter contains a GC box, a Spl-binding motif, one of which overlaps -202 and the other is adjacent to +20 (Figure 2A). Therefore, it was examined whether Spl controls the LTBP-1L promoter! When the reporter plasmid carrying the G-A haplotype and the Spl expression vector were cotransfected, the transcriptional activity was significantly increased (Fig. 2C). In contrast, transcriptional activity was markedly inhibited when cotransfected with Sp3 dominant negative expression vectors known to inhibit Spl function. A similar effect with Spl was observed for the C-C haplotype, but the observed force was less efficient. These results suggest that Spl activates the transcription of the LTBP-1L gene, especially to the G-A norotype.
  • EMSA was performed as previously described (Cancer Res. 1999, 59: 551-7).
  • -202 C and -202G corresponding to double-stranded oligonucleotides 5, -GCGGCCCGCTC CCCTCGCCCCTCCCCGCT-3 '(SEQ ID NO: 2 and 5,-GCGGCCCGCTCCCC TGGCCCCTCCCCGCT-3' (SEQ ID NO: 22) as MEGALABEL Kit (TaKaRa) with.
  • the effect of SNPs on the expression level of LTBP-1L protein was analyzed immunohistochemically using surgical specimens collected from 36 ovarian cancer patients with various genotypes.
  • Atsey was performed on formalin-fixed paraffin-embedded ovarian tissue using the VECTASTAIN ABC Elite kit (Vector Laboratories) according to the method described in Am. J. Pathol. 2003, 163: 859-67.
  • Antigen recovery was performed in 1 X antigen recovery solution (Biogenex) for 10 minutes, and the endogenous peroxidase was quenched in methanol containing 3% H0.
  • mice were incubated with mouse anti-LTBP-1L monoclonal antibody (R & D Systems) (dilution 1: 1000) or whole serum of non-immunized mice at 4 ° C for 16 hours. After washing, the sections were reacted with a piotinylated secondary antibody, and streptavidin pyotin horseradish sabiperoxidase complex, pyotinytyramide, streptavidin-labeled peroxidase and 3,3, -diaminobenzidine (Dako Cytomation) and the reaction were sequentially detected. Sections were counterstained with hematoxylin.
  • Staining degree is negative 0 (no staining), low 1 + (5-25% cells are positive or very weak in staining intensity), medium 2+ (25-75% cells are positive, strong positive), high 3+ (75% or more cells were positive and staining intensity was very strong). Two pathologists judged the results and excluded the analysis power if the results did not match.
  • the G-A homozygous type significantly increased LTBP-1L expression compared to the heterozygous type and C-C homozygous type! (P 0.05).
  • Example 5 Effects of LTBP-1L SNPs on clinical features and results in various cancer patients
  • cancers particularly cancers such as ovarian cancer, endometrial cancer and lung cancer.
  • antibodies against LTBP-1L, LTBP-1L antisense nucleic acid and the like are useful as therapeutic agents for cancer, particularly ovarian cancer.
  • susceptibility to cancers such as endometrial cancer, gastric cancer and lung cancer can be predicted, which is useful for examining the risk of developing these cancers.

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Abstract

　本発明は、LTBP-1L遺伝子の5’-調節領域内に存在する多型（-202G/Cおよび+20A/C）を検定することによる癌、特に卵巣癌、子宮体癌および肺癌の予後診断方法、LTBP-1Lの発現もしくは活性を阻害することによる癌、特に卵巣癌、子宮体癌および肺癌の治療を提供する。 　さらに、本発明は、前記多型を検定することによる子宮体癌、胃癌および肺癌に対する感受性の予測方法を提供する。

Description

明 細 書
遺伝子多型およびその用途
技術分野
[0001] 本発明は、癌の予後診断マーカーとなり得る新規遺伝子多型および該多型を検出 することによる癌の予後診断に関する。本発明はまた、該遺伝子の活性もしくは発現 を阻害することによる癌の治療に関する。
背景技術
[0002] トランスフォーミング増殖因子 β (TGF- β )は、上皮細胞を含むほとんどの細胞種で 強力な増殖インヒビターである。腫瘍細胞による TGF- |8の分泌はオートクライン的な 増殖阻害による腫瘍抑制に寄与し得るが、一方で、腫瘍の侵襲および血管新生を刺 激し、免疫応答を阻害することにより、腫瘍の進行を促進することもあり得る。 TGF- β は、 TGF- β、 TGF- β前駆体のアミノ末端部分および潜在型 TGF- β結合蛋白質 (L TBP)からなる潜在型の高分子量複合体として合成される。 LTBPは 190kDaを超える 分子量を有する糖蛋白質であり、 16-18の EGF様ドメインと 8つのシスティン残基を含 むユニークなモチーフの数回のリピートを有する。 LTBPには、 4つのアイソフォーム（L TBP-1-LTBP-4)が哺乳動物種で見出されている。 LTBP-1は 8システィンのモチー フの 1つを介して TGF- 18 1に結合し、 TGF- 18 1のアッセンブリおよび分泌 (例えば、非 特許文献 1参照)および活性化 (例えば、非特許文献 2参照)を促進する。免疫電顕 観察の結果から、 LTBPが細胞外微小繊維成分の 1つであり、 TGF- |8 1を細胞外構 造にターゲッティングし、おそらくは活性ィ匕が起こる細胞表面上に潜在型 TGF- |8 1を 集結させること〖こよって、潜在型 TGF- |8 1の活性ィ匕に関与していると示唆されている (例えば、非特許文献 3参照)。
[0003] LTBP- 1には、それぞれ LTBP- IS (short)および LTBP- 1L (long)と呼ばれる 2つの主 要なァイソフォームが知られており、それらは別個のプロモーターおよび LTBP-1Sの コドン 145と 146の間のオルタナティブスプライシンダカゝら誘導される（非特許文献 4)。 LTBP-1Lは、 LTBP-1Sには見られない 346アミノ酸の N末端延長を有する（非特許文 献 5)。この N末端延長はマトリックス結合を促進する EGF様ドメインを含み、 LTBP- 1L は LTBP-1Sよりも細胞外マトリックスと効率よく結合することが確認されている。
[0004] 本発明者らは以前、主として LTBP-1S mRNAではなく LTBP-1L mRNAのアップレギ ユレーシヨンのために、数例の卵巣癌患者で LTBP-1および TGF- |8 1蛋白質が過剰 発現していることを示した (非特許文献 6)。この過剰発現は、卵巣癌の発癌に寄与し ているかもしれない、 TGF- |8 1の機能とそのシグナリングに影響を与えると考えられる 。し力しながら、これらの遺伝子の転写制御に関してはほとんど情報が得られていな い。
非特許文献 1 :宫園（Miyazono K.)ら、「ジ'ェンボ 'ジャーナル（EMBO J.)」、英国、 第 10卷、 pp. 1091-1101、 1991年
非特許文献 2 :フラウメンハフ HFraumenhaft R.)ら、「ザ'ジャーナル'ォヴ'セル'バイ ォロジ一（J. Cell Biol.)」、米国、第 120卷、 pp. 995-1002、 1993年
非特許文献 3：タイペイル (Taipale J.)ら、「ザ ·ジャーナル ·ォヴ ·セル ·バイオロジー（J . Cell Biol.) J ,米国、第 124卷、 pp. 171-181、 1994年
非特許文献 4:コスキ（Koski C.)ら、「ザ'ジャーナル'ォヴ 'バイオロジカル 'ケミストリ 一（J. Biol. Chem.)」、米国、第 274卷、 pp. 32619-32630、 1999年
非特許文献 5 :オロフソン（Olofsson A.)ら、「ザ'ジャーナル'ォヴ 'バイオロジカル'ケ ミストリー（J. Biol. Chem.)」、米国、第 270卷、 pp. 31294-31297、 1995年
非特許文献 6 :東 (Higashi T.)ら、「ジャパニーズ 'ジャーナル'ォヴ'キャンサー'リサ ーチ（Jpn. J. Cancer Res) J ,日本国、第 92卷、 pp. 506-515、 2001年
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] したがって、本発明の目的は、卵巣癌における LTBP-1L過剰発現の分子メカニズ ムを明らかにし、該過剰発現の臨床的意義を解明することである。
課題を解決するための手段
[0006] 本発明者らは、上記の目的を達成すべく鋭意検討を重ねた結果、 LTBP-1L遺伝子 の 5' -調節領域中に存在する 2つの新規 SNPs (-202G/Cおよび +20A/C ;数字は転写 開始点 +1を基準とした位置を示す)が、この遺伝子の過剰発現に寄与しており、それ らが卵巣癌、子宮体癌、肺癌等の癌患者の予後に影響していることを見出した。 さらに、本発明者らは、これらの SNPsが子宮体癌、胃癌、肺癌等の癌に対する感受 性と相関しており、意外にもこれらの癌で予後不良をもたらすアレルが感受性に関し てはむしろ保護 (難罹患性)アレルであり、逆に比較的予後が良好なアレルが疾患（ 易罹患性)アレルであることを見出した。
本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに検討を重ねた結果、本発明を完成 するに至った。すなわち、本発明は、
[1]癌患者より採取されたゲノム DNA含有試料において、配列番号： 1で表されるヒト LTBP-1L遺伝子 5， -調節領域の塩基配列中塩基番号 2014および Zまたは 2235で示 される塩基における多型を検定することを特徴とする、癌の予後診断のための検査 方法、
[2]癌が、卵巣癌、子宮頸癌、子宮体癌、胃癌、大腸癌および肺癌からなる群より選 択される、上記 [1]記載の方法、
[3]癌が卵巣癌、子宮体癌または肺癌である、上記 [2]記載の方法、
[4]ヒト LTBP-1L遺伝子の部分塩基配列であって、配列番号： 1で表される塩基配列 中塩基番号 2014および Zまたは 2235で示される塩基を含む、約 15〜約 500塩基の連 続した塩基配列を含有してなる核酸、
[5]配列番号： 1で表されるヒト LTBP-1L遺伝子 5 ' -調節領域の塩基配列中塩基番号 2014および 2235で示される塩基における多型の各々を検出し得る 1組以上の核酸プ ローブおよび Zまたはプライマーを含んでなる、癌の予後診断のための検査用キット
[6]核酸プローブが、配列番号： 1で表されるヒト LTBP-1L遺伝子 5' -調節領域の塩 基配列中塩基番号 2014および Zまたは 2235で示される多型部位の塩基を含む、約 1 5〜約 500塩基の連続した塩基配列を含有してなる核酸であり、核酸プライマーが、ヒ ト LTBP-1L遺伝子の部分塩基配列であって、配列番号： 1で表される塩基配列中塩 基番号 2014および Zまたは 2235で示される多型部位の塩基を含む約 50〜約 1,000 塩基の連続した塩基配列を増幅し得る一対の核酸である上記 [5]記載のキット、 [7]癌が、卵巣癌、子宮頸癌、子宮体癌、胃癌、大腸癌および肺癌からなる群より選 択される、上記 [5]または [6]記載のキット、 [8]癌が卵巣癌、子宮体癌または肺癌である、上記 [7]記載のキット、
[9]配列番号： 2で表される塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列 またはその一部を含む核酸を含有してなる癌治療剤、
[10]配列番号 : 2で表される塩基配列中塩基番号 1〜1038で示される部分塩基配列 に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸を含有して なる、上記 [9]記載の剤、
[11]配列番号： 3で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配 列を含む蛋白質またはその部分ペプチドに対する中和抗体を含有してなる癌治療 剤、
[12]中和抗体が、配列番号： 3で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号 1〜346で示さ れるアミノ酸配列の一部を認識するものである、上記 [ 11]記載の剤、
[ 13]上記 [4]記載の核酸を含有してなる癌治療剤、
[14]癌が、卵巣癌、子宮頸癌、子宮体癌、胃癌、大腸癌および肺癌からなる群より 選択される、上記 [9]〜 [13]の 、ずれかに記載の剤、
[15]癌が卵巣癌、子宮体癌または肺癌である、上記 [14]記載の剤、
[16]被験者より採取されたゲノム DNA含有試料において、配列番号： 1で表されるヒ ト LTBP-1L遺伝子 5， -調節領域の塩基配列中塩基番号 2014および Zまたは 2235で 示される塩基における多型を検定することを特徴とする、子宮体癌、胃癌および肺癌 からなる群より選択される癌に対する感受性の検査方法、
[17]配列番号： 1で表されるヒト LTBP-1L遺伝子 5 ' -調節領域の塩基配列中塩基番 号 2014および 2235で示される塩基における多型の各々を検出し得る 1組以上の核酸 プローブおよび Zまたはプライマーを含んでなる、子宫体癌、胃癌または肺癌に対 する感受性の検査用キット、および
[18]核酸プローブが、配列番号： 1で表されるヒト LTBP-1L遺伝子 5' -調節領域の塩 基配列中塩基番号 2014および Zまたは 2235で示される多型部位の塩基を含む、約 1 5〜約 500塩基の連続した塩基配列を含有してなる核酸であり、核酸プライマーが、ヒ ト LTBP-1L遺伝子の部分塩基配列であって、配列番号： 1で表される塩基配列中塩 基番号 2014および Zまたは 2235で示される多型部位の塩基を含む約 50〜約 1,000 塩基の連続した塩基配列を増幅し得る一対の核酸である上記 [17]記載のキット、 などを提供する。
発明の効果
[0007] LTBP-1L遺伝子 5' -調節領域における 2つの SNPsは、該遺伝子の転写活性に影響 を及ぼし、 - 202Gおよび +20Aのホモ接合型の遺伝子型を有する癌患者では、他の遺 伝子型を有する患者よりも LTBP-1の発現が増加し、生命予後が不良であることから、 癌患者における該 SNPsを調べることにより、癌の予後診断が可能となる。また、 LTBP -1L蛋白質の発現もしくは活性を阻害することにより、癌の治療'進行抑制効果を奏 する。
一方で、これらの SNPsは子宫体癌、胃癌、肺癌等の癌に対する感受性と相関して おり、 -202Cおよび +20Cのアレルは- 202Gおよび +20Aのアレルと比較して、これらの 癌に対してより感受性 (易罹患性)である。従って、被験者における該 SNPsを調べるこ とにより、これらの癌に対する感受性を予測することができる。
図面の簡単な説明
[0008] [図 1]図 1 Aは LTBP-1Lプロモーターにおける 2つの新規 SNPsを模式的に示す。図中 、 ATGは開始コドンを示す。図 1Bは PCR-RFLP法による多型分析の結果を示す。上 段は各ハプロタイプにおける制限酵素切断部位および生成する各フラグメントの長さ を示し、下段は各遺伝子型における EcoRIIおよび Cspl消化物のバンドパターンを示 す。図中、 Mは分子量マーカー、 Dはへテロアレルのミスマッチを有するアニーリング により生成するへテロ二重鎖を示す。
[図 2]図 2Aは SNP部位での異なるハプロタイプを有する LTBP-1Lプロモーター領域 を含むルシフェラーゼレポーターコンストラクトを模式的に示す。図 2Bは種々のハプ 口タイプを有するレポータープラスミドの相対ルシフェラーゼ活性を示す。各カラムは 3回の独立した実験 (それぞれ 3連で実施)の平均値を示し、エラーバーは標準偏差 を示す。図中、 *は P〈0.01 (vs. C-Cコンストラクト）を示す。 C : LTBP-1Lプロモーター 活性に及ぼす Splの効果を示す図である。 blankは空のベクター、 Splは Spl発現べク ター、 DN-SP1は Sp3のドミナントネガティブ体を発現するベクターをコトランスフエタト したことを示す。各カラムは 3回の独立した実験 (それぞれ 3連で実施）の平均値を示 し、エラーバーは標準偏差を示す。図中、 *は P〈0.0001 (vs. G-A blank)を、 #は P〈0. 0001 (vs. C-C blank)をそれぞれ示す。
[図 3]図 3は LTBP-1Lプロモーターへの Splの結合に関する EMSAの結果を示す。図 中、 Bはプローブ- Spl複合体、 Sはプローブ- Spl-抗 Spl抗体複合体、 Fは遊離のプ ローブにそれぞれ相当するバンドを示す。
[図 4]図 4は卵巣癌患者における LTBP-1Lプロモーターの遺伝子型ごとの生存曲線 を示す。図中、〇は死亡例の発生を示す。
[図 5]図 5は子宫体癌患者における LTBP-1Lプロモーターの遺伝子型ごとの生存曲 線を示す。図中、〇は死亡例の発生を示す。
[図 6]図 6は肺癌患者における LTBP-1Lプロモーターの遺伝子型ごとの生存曲線を 示す。図中、〇は死亡例の発生を示す。
発明を実施するための最良の形態
本発明の癌の予後診断方法 (以下、単に「本発明の診断方法」という場合がある。 尚、本明細書において「予後診断のための検査方法」とは、医師による医療決定段 階を構成に含まない点を除いて「予後診断方法」と同義である)および子宮体癌、胃 癌、肺癌等の癌に対する感受性の予測方法 (以下、単に「本発明の予測方法」という 場合がある。尚、本明細書において「感受性の検査方法」とは、医師による医療決定 段階を構成に含まな 、点を除 、て「感受性の予測方法」と同義である）は、被験者の LTBP-1L遺伝子 5' -調節領域における多型を検出することを特徴とする。本発明の 診断および予測方法にぉ 、て利用することができる多型としては、本発明にお 、て 見出された新規多型 [「GenBankァクセッション番号 AF171934 (AF171934.1 GI:6424 997)」で表される塩基配列中、塩基番号 2014で示される Cおよび 2235で示されるじが それぞれ Gおよび Aである 1塩基置換 (SNP)多型 (配列番号： 1) ]が挙げられる。以下 、本明細書において、特にことわらない限り、上記多型部位のヌクレオチド (塩基)の 位置は、推定の転写開始点 (配列番号： 1で表される塩基配列中塩基番号 2216で示 される塩基; +1)を基準として表記するものとする (即ち、配列番号：1で表される塩基 配列中塩基番号 2014における多型を- 202G/C、塩基番号 2235における多型を +20A /Cと表記する)。 [0010] 本発明の診断および予測方法において利用することができる他の多型としては、 -2 02G/Cまたは +20A/Cと連鎖不平衡係数 D'が 0.9以上の連鎖不平衡状態にある多型 が挙げられる。ここで「連鎖不平衡係数 D'」は、 2つの SNPsについて第一の SNPの各 アレルを (A, a)、第二の SNPの各アレルを（B, b)とし、 4つのハプロタイプ（AB, Ab, a B, ab)の各頻度を P , P , P , P とすると、下記式により得られる。
AB Ab aB ab
D， =(P P -P P )/Min [(P +P )(P +P ), (P +P )(P +P )]
AB ab Ab aB AB aB aB ab AB Ab Ab ab
[式中、 Min [(P +P )(P +P ), (P +P )(P +P )]は、 (P +P )(P +P )と(
AB aB aB ab AB Ab Ab ab AB aB aB ab
P +P )(P +P )
AB Ab Ab abとのうち、値の小さい方をとることを意味する。]
好ましくは、 D'が 0.95以上、より好ましくは 0.99以上、最も好ましくは 1である多型が 挙げられる。尚、 -202G/Cと +20A/Cとは、 日本人集団で調べた限りにおいては完全 連鎖する（D' =l)、即ち、 G-Aもしくは C- Cハプロタイプのみが存在する。
[0011] 本発明の診断および予測方法に利用される予後診断マーカー多型- 202G/Cと +20 A/Cは、後記実施例に示される通り LTBP-1L遺伝子の転写活性、転写因子 Splとの 結合活性におけるアレル間の差異をもたらす (-202G/Cは Spl結合モチーフである G Cボックスとオーバーラップし、 +20A/Cは GCボックスに隣接する）。即ち、 - 202Gおよ び +20Aアレルでは、 -202Cおよび +20Cアレルに比べて上記両活性が顕著に増大し ている（両活性に及ぼす影響は- 202G/Cの方がより大きい)。また、 G- Aアレルは、あ る特定の癌 (例えば、卵巣癌、大腸癌)患者集団および健常者集団においてメジャー アレルであり、これらの集団におけるアレル頻度に有意差はないことが示された。しか しながら、 G-A/G-Aのホモ接合型の遺伝子型を有する癌患者は、 C- C/G-Aのへテ 口接合型および C-C/C-Cのホモ接合型の遺伝子型を有する患者と比較して、累積 生存率が低い傾向を示す。以上の事実は、 LTBP-1Lの発現が癌の進行において重 要な役割を果たしており、 G-A/G-A遺伝子型保有者では、 LTBP-1Lプロモーターへ の Splの結合活性、 LTBP-1Lの転写活性が増大して 、るために癌が進行しやす!/ヽ（ 予後不良である）ことが強く示唆される。従って、 -202G/Cおよび +20A/Cの多型は、 癌患者における生命予後の良否を規定する多型である。
他方、別のある特定の癌 (例えば、子宫体癌、胃癌、肺癌）患者集団においては、 健常者集団に比べて C-Cアレル頻度が有意に高い (pく 0.1)。特に、後記実施例によ れば、子宫体癌および胃癌における C-Cアレル保有者 (C- C/G-Aのへテロ接合型 および C- C/C- Cのホモ接合型）の非保有者 (G- A/G- Aのホモ接合型）に対するォッ ズ比は 2な!、し 3以上（p〈0.05)であることから、 C-Cアレルはこれらの癌に対する遺伝 的な危険因子の 1つであるといえる。逆に、 G-A/G-A遺伝子型は、ステージの進行し た癌に対して予後不良を示すにもかかわらず、子宫体癌および胃癌の発症リスクは 顕著に低い。このことは、癌の発症前あるいは発症早期においては、 LTBP-1Lの高 発現はむしろ癌細胞の増殖抑制に寄与して 、ることを示唆して 、る力もしれな 、。 Vヽ ずれにせよ、 -202G/Cおよび +20A/Cの多型は、ヒトにおける子宫体癌、胃癌、肺癌 等の癌の発症リスクを予測し得る多型である。
[0012] LTBP-1Lは潜在型 TGF- β 1と複合体を形成し、 TGF- β 1の活性化に重要な役割 を果たしている。 TGF- |8は癌抑制因子としても、癌の進行の刺激因子としても作用し 得る。発癌の早いステージでは、細胞の TGF- |8に対する増殖阻害応答が維持され ているため、 TGF- |8は直接的に腫瘍増殖を抑制する力 ステージが進むと癌細胞 力 STGF- |8による増殖阻害に耐性となり、 TGF- |8はむしろ腫瘍の浸潤および転移に 寄与するようになると考えられている。したがって、本発明の診断方法により予後診断 が可能な癌として、例えばステージの進んだ癌が挙げられる力 それらに限定される ものではない。好ましくは、本発明の診断方法は、卵巣癌、子宮頸癌、子宮体癌、胃 癌、大腸癌、肺癌、その他の固形癌 (例えば、肝臓癌、脾臓癌、胆嚢癌、腎臓癌等） 、より好ましくは卵巣癌、子宮頸癌、子宮体癌、胃癌、大腸癌および肺癌、特に好まし くは卵巣癌、子宮体癌および肺癌の予後診断に有用である。
一方、本発明の予測方法により感受性の予測が可能な癌としては、子宮体癌、胃 癌、肺癌等が挙げられる。
[0013] 本発明の診断および予測方法において検出される多型は、上記した多型のうちの いずれか一方であってもよいし、両方であってもよい。
本発明の診断および予測方法において、多型の検出は公知の SNP検出方法のい ずれも使用することができる。古典的な検出方法としては、例えば、被験者の細胞等 力 抽出したゲノム DNAを試料とし、配列番号： 1で表されるヒト LTBP-1L遺伝子 5' - 調節領域の塩基配列中塩基番号 2014および Zまたは 2235で示される多型部位の塩 基を含む、約 15〜約 500塩基の連続した塩基配列を含有してなる核酸をプローブとし て用い、例えば Wallaceら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 278-282 (1983))の方法 に従って、ストリンジエンシーを正確にコントロールしながらハイブリダィゼーシヨンを 行い、プローブと完全相補的な配列のみを検出する方法や、上記核酸と上記核酸に ぉ ヽて多型部位の塩基 (-202Gおよび Zまたは +20A)が他の塩基 (-202Cおよび Zま たは +20C)に置換された核酸のいずれか一方を標識し、他方を未標識としたミックス プローブを用い、変性温度から徐々に反応温度を低下させながらハイブリダィゼーシ ヨンを行い、一方のプローブと完全相補的な配列を先にハイブリダィズさせ、ミスマツ チを有するプローブとの交差反応を防ぐ方法などが挙げられる。ここで標識剤として は、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射 性同位元素としては、例えば、〔12¾、〔1311〕、 〔 〕、 〔14C〕などが用いられる。上記酵 素としては、安定で比活性の大きなものが好ましぐ例えば、 j8—ガラクトシダーゼ、 β—ダルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーォキシダーゼ、リンゴ酸脱水素 酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルォレスカミン、フルォレツセ ンイソチォシァネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミ ノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。
[0014] 好ましくは、多型の検出は、例えば、 WO 03/023063に記載された種々の方法、例 えば、 RFLP法、 PCR- SSCP法、 ASOハイブリダィゼーシヨン、ダイレクトシークェンス法 、 ARMS法、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法、 RNaseA切断法、化学切断法、 DOL 法、 TaqMan PCR法、インベーダー法、 MALDI— TOF/MS法、 TDI法、モレキュラ^ ~ ·ビ ーコン法、ダイナミック 'アレルスぺシフィック'ノヽィブリダィゼーシヨン法、ノ ドロック.プ ローブ法、 UCAN法、 DNAチップまたは DNAマイクロアレイを用いた核酸ハイブリダィ ゼーシヨン法、および ECA法などにより実施することができる（WO 03/023063,第 17 頁第 5行〜第 28頁第 20行を参照)。以下、代表的な方法として、 TaqMan PCR法とィ ンベーダ一法について、より詳細に説明する。
[0015] (1) TaqMan PCR法
TaqMan PCR法は、蛍光標識したアレル特異的オリゴヌクレオチド（TaqManプロ一 ブ）と Taq DNAポリメラーゼによる PCRとを利用した方法である。 TaqManプローブとし ては、ヒト LTBP-1L遺伝子の部分塩基配列であって、上記したいずれかの多型部位 の塩基を含む約 15〜約 30塩基の連続した塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが用 いられる。該プローブは、その 5'末端が FAMや VICなどの蛍光色素で、 3'末端が TA MRAなどのクェンチヤ一（消光物質)でそれぞれ標識されており、そのままの状態で はクェンチヤ一が蛍光エネルギーを吸収するため蛍光は検出されない。プローブは 双方のアレルにつ!、て調製し、一括検出のために互いに蛍光波長の異なる蛍光色 素（例えば、一方のアレルを FAM、他方を VIC)で標識することが好ましい。また、 Taq Manプローブ力もの PCR伸長反応が起こらな 、ように 3 '末端はリン酸ィ匕されて 、る。 T aqManプローブとハイブリダィズする領域を含むゲノム DNAの部分配列を増幅するよ うに設計されたプライマーおよび Taq DNAポリメラーゼとともに PCRを行うと、 TaqMan プローブが铸型 DNAとハイブリダィズし、同時に PCRプライマーからの伸長反応が起 こるが、伸長反応が進むと Taq DNAポリメラーゼの 5'ヌクレア一ゼ活性によりハイブリ ダイズした TaqManプローブが切断され、蛍光色素が遊離してクェンチヤ一の影響を 受けなくなり、蛍光が検出される。铸型の増幅により蛍光強度は指数関数的に増大 する。
例えば、 -202G/C多型の検出において、当該塩基を含むアレル特異的オリゴヌタレ ォチド (約 15〜約 30塩基長； Gアレルは FAMで、 Cアレルは VICでそれぞれ 5，末端標 識し、 3'末端はいずれも TAMRAで標識）を TaqManプローブとして用いた場合、被験 者の遺伝子型が GG、あるいは CCであれば、それぞれ FAMあるいは VICの強い蛍光 強度を認め、他方の蛍光はほとんど認められない。一方、被験者の遺伝子型が GCで あれば、 FAMおよび VIC両方の蛍光が検出される。
(2)インベーダー法
インベーダー法では、 TaqMan PCR法と異なり、アレル特異的オリゴヌクレオチド（ァ レルプローブ）自体は標識されず、多型部位の塩基の 5'側に铸型 DNAと相補性のな い配列（フラップ）を有し、 3'側には铸型に特異的な相補配列を有する。インべーダ 一法では、さらに铸型の多型部位の 3'側に特異的な相補配列を有するオリゴヌタレ ォチド (インベーダープローブ；該プローブの 5 '末端である多型部位に相当する塩基 は任意である）と、 5'側がヘアピン構造をとり得る配列を有し、ヘアピン構造を形成し た際に 5 '末端の塩基と対をなす塩基力 3 '側に連続する配列がアレルプローブのフ ラップと相補的な配列であることを特徴とする FRET (fluorescence resonance energy t ransfer)プローブとが用いられる。 FRETプローブの 5'末端は蛍光標識（例えば、 FAM や VICなど）され、その近傍にはクェンチヤ一（例えば、 TAMRAなど）が結合しており 、そのままの状態 (ヘアピン構造)では蛍光は検出されな 、。
铸型であるゲノム DNAにアレルプローブおよびインベーダープローブを反応させる と、三者が相補結合した際に多型部位にインベーダープローブの 3'末端が侵入する 。この多型部位の構造を認識する酵素（cleavase)を用いてアレルプローブの一本鎖 部分 (即ち、多型部位の塩基力 5'側のフラップ部分)を切り出すと、フラップは FRE Tプローブと相補的に結合し、フラップの多型部位が FRETプローブのヘアピン構造 に侵入する。この構造を cleavaseが認識して切断することにより、 FRETプローブの末 端標識された蛍光色素が遊離してクェンチヤ一の影響を受けなくなって蛍光が検出 される。多型部位の塩基が铸型とマッチしな 、アレルプローブは cleavaseによって切 断されな!、が、切断されな!、アレルプローブも FRETプローブとハイブリダィズすること ができるので、同様に蛍光が検出される。但し、反応効率が異なるため、多型部位の 塩基がマッチするアレルプローブでは、マッチしな!、アレルプローブに比べて蛍光強 度が顕著に強い。
通常、 3種のプローブおよび cleavaseと反応させる前に、铸型 DNAはアレルプロ一 ブおよびインベーダープローブがハイブリダィズする部分を含む領域を増幅し得るプ ライマーを用いて PCRにより増幅しておくことが好まし 、。
(3) RFLP法
LTBP-1L遺伝子は、 -202G/Cおよび +20A/Cの多型により制限酵素断片長に差異 を生じるので、これを利用して上記多型を簡便に検出することができる。即ち、 -202G アレルは EcoRIIで切断される力 -202Cアレルは切断されない。一方、 +20Aアレルは Csplで切断されないが、 +20Cアレルは Csplで切断される。したがって、後記実施例に 示されるように、 _202〜+20を含む LTBP-1L遺伝子の断片を PCRで増幅し、これを Ec oRIIと Csplとで二重消化して制限酵素断片長を比較することにより、上記多型を検出 することができる。 [0018] 上記のようにして多型を調べた結果、 -202Gおよび Zまたは +20Aアレルを保有して V、ると判定された場合、特に該アレルにっ 、てホモ接合体であると判定された場合に は、被験者は癌の予後が不良である可能性が高いと診断することができる。また、 -2 02Cおよび Zまたは +20Cアレルを保有して 、ると判定された場合、被験者は子宫体 癌、胃癌、肺癌等の癌に易罹患性であると予測することができる。
尚、 2つの多型を調べた際に、 1つの結果が他の結果と相反する場合 (即ち、 G-C アレル、 C-Aアレルが検出された場合）には、 -202G/C多型の結果が優先される（伹 し、後記実施例において調べられた限りにおいては、 G-Cアレル、 C-Aアレルは検出 されていない）。
[0019] 上述のように、 -202G/Cおよび +20A/C多型は、本発明において初めて見出された 新規多型であり、且つ癌の予後診断および特定の癌の感受性予測に利用できるマ 一力一多型である。より詳細には、 GenBankァクセッション番号 AF171934で表される 塩基配列中、塩基番号 2014で示される塩基および塩基番号 2235で示される塩基は いずれも Cであるが、本発明者らは前者が C力 Gに、後者カ^カ Aにそれぞれ置換 された新規 SNPsを同定した。
従って、本発明はまた、ヒト LTBP-1L遺伝子の部分塩基配列であって、配列番号： 1で表される塩基配列中塩基番号 2014および Zまたは 2235で示される塩基を含む、 約 15〜約 500塩基 (好ましくは約 15〜約 200塩基、より好ましくは約 15〜約 50塩基）の 連続した塩基配列を含有してなる核酸を提供する。力かる SNP部位を含む新規核酸 は、上記した本発明の診断および予測方法において、当該塩基における多型を検 出するのに好ましく用いることができる。
[0020] 本発明はまた、上記本発明の診断および予測方法に用いるためのキットを提供す る。即ち、本発明の診断および予測用キットは、配列番号： 1で表されるヒト LTBP-1L 遺伝子 5 '-調節領域の塩基配列中塩基番号 2014および 2235で示される塩基におけ る多型の各々を検出し得る 1組以上の核酸プローブおよび Zまたはプライマーを含 むことを特徴とする。
[0021] 具体的には、本発明の診断および予測用キットに用いられる核酸プローブは、配列 番号： 1で表されるヒト LTBP-1L遺伝子 5， -調節領域の塩基配列中塩基番号 2014お よび Zまたは 2235で示される多型部位の塩基を含む、約 15以上、好ましくは約 15〜 約 500塩基、より好ましくは約 15〜約 200塩基、いっそう好ましくは約 15〜約 50塩基の 連続した塩基配列を含有してなる核酸である。ここで、塩基番号 2014 (即ち- 202位） で示される塩基は Gまたは C、塩基番号 2235 (即ち +20位)で示される塩基は Aまたは Cであり、使用する多型検出法に応じて、各多型部位についていずれか一方の塩基 を有する核酸を用いることもできるし、各アレルに対応する塩基を有する 2種類の核 酸を用いることもできる。尚、上記インベーダー法に使用されるインベーダープローブ については、多型部位の塩基 (即ち、 3'末端の塩基）は任意の塩基でよい。
[0022] 該プローブは、多型性の検出に適した付加的配列（ゲノム DNAと相補的でな 、配 列）を含んでいてもよい。例えば、上記インベーダー法に用いられるアレルプローブ は、多型部位の塩基の 5'末端にフラップと呼ばれる付加的配列を有する。
また、該プローブは、適当な標識剤、例えば、放射性同位元素 (例: 125I、 131I、 3H、 14 C等）、酵素（例： /3 ガラクトシダーゼ、 13—ダルコシダーゼ、アルカリフォスファタ一 ゼ、パーォキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等）、蛍光物質 (例：フルォレスカミン、フ ルォレツセンイソチオシァネート等）、発光物質 (例:ルミノール、ルミノール誘導体、 ルシフヱリン、ルシゲニン等)などで標識されていてもよい。あるいは、蛍光物質 (例： F AM、 VIC等）の近傍に該蛍光物質の発する蛍光エネルギーを吸収するクェンチヤ一 (消光物質）がさらに結合されていてもよい。力かる実施態様においては、検出反応 の際に蛍光物質とクェンチヤ一とが分離して蛍光が検出される。
[0023] 本発明の診断および予測用キットに用いられる核酸プライマーは、上記本発明の 診断および予測方法において検出すべき多型部位の塩基を含むゲノム DNAの領域 を特異的に増幅し得るように設計されたものであれば 、かなるものであってもよ 、。例 えば、該核酸プライマーは、ヒト LTBP-1L遺伝子の部分塩基配列であって、検出す べき多型部位、即ち配列番号： 1で表される塩基配列中塩基番号 2014または 2235で 示される多型部位より 5'側の相補鎖配列の一部にハイブリダィズする、約 15〜約 50 塩基、好ましくは約 15〜約 30塩基の塩基配列を含む核酸と、該多型部位の塩基より 3 ，側の配列の一部にハイブリダィズする、約 15〜約 50塩基、好ましくは約 15〜約 30塩 基の塩基配列を含む核酸との組み合わせであり、それらによって増幅される核酸の 断片長が約 50〜約 1 ,000塩基、好ましくは約 50〜約 500塩基、より好ましくは約 50〜約 200塩基である、一対の核酸が挙げられる。
[0024] 該プライマーは、多型性の検出に適した付加的配列（ゲノム DNAと相補的でな 、配 列）、例えばリンカ一配列を含んでいてもよい。
また、該プライマーは、適当な標識剤、例えば、放射性同位元素 (例: 125I、 131I、 3H、 14C等）、酵素（例： /3 ガラクトシダーゼ、 13 ダルコシダーゼ、アルカリフォスファタ ーゼ、パーォキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等）、蛍光物質 (例：フルォレスカミン、 フルォレツセンイソチオシァネート等）、発光物質 (例:ルミノール、ルミノール誘導体、 ルシフェリン、ルシゲニン等）などで標識されて 、てもよ 、。
[0025] 本発明の診断および予測用キットに用いられる核酸プローブまたはプライマーは、 DNAであっても RNAであってもよぐまた、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。 二本鎖の場合は二本鎖 DNA、二本鎖 RNA、 DNAZRNAハイブリッドのいずれであつ てもよい。従って、本明細書においてある塩基配列を有する核酸について記載する 場合、特に断らない限り、該塩基配列を有する一本鎖核酸、該塩基配列と相補的な 配列を有する一本鎖核酸、それらのハイブリッドである二本鎖核酸をすベて包含する 意味で用いられて 、ると理解されるべきである。
上記核酸プローブまたはプライマーは、例えば、配列番号： 1および配列番号： 2で 表される塩基配列の情報に基づ!/、て、 DNA/RNA自動合成機を用いて常法に従って 合成することができる。
[0026] 上記核酸プローブおよび Zまたはプライマーは、各々別個に（あるいは可能であれ ば混合した状態で)水もしくは適当な緩衝液 (例: TEバッファーなど）中に適当な濃度 (例： 2 X〜20 X濃度で 1〜50 μ Μなど）となるように溶解し、約- 20°Cで保存することが できる。
本発明の診断および予測用キットは、多型検出法に応じて、当該方法の実施に必 要な他の成分を構成としてさらに含んでいてもよい。例えば、該キットが TaqMan PCR 法による多型検出用である場合には、該キットは、 10 X PCR反応緩衝液、 lO X MgCl
2 水溶液、 lO X dNTPs水溶液、 Taq DNAポリメラーゼ（5U/ L)等をさらに含むことがで きる。また、該キットが RFLP法による多型検出用である場合には、該キットは、制限酵 素 EcoRIIおよび Cspl、該制限酵素反応用緩衝液等をさらに含むことができる。
[0027] 本発明はまた、 LTBP-1Lの発現および Zまたは活性を阻害することによる、癌、好 ましくはステージの進行した癌、例えば、卵巣癌、子宮頸癌、子宫体癌、胃癌、大腸 癌、肺癌、その他の固形癌 (例えば、肝臓癌、脾臓癌、胆嚢癌、腎臓癌等）、より好ま しくは卵巣癌、子宮頸癌、子宮体癌、胃癌、大腸癌および肺癌、特に好ましくは卵巣 癌、子宮体癌および肺癌の治療に関する。
本発明で治療ターゲットとなるヒト LTBP-1L蛋白質は、配列番号： 3で表されるァミノ 酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質である。該蛋白質 は、ヒトの細胞 [例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、脾臓 j8細胞、骨髄 細胞、メサンギゥム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮 細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞 (例：マク 口ファージ、 T細胞、 B細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、 好酸球、単球)、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺 細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞など]ま たはそれらの細胞が存在するあらゆる組織もしくは器官 [例えば、脳、脳の各部位 (例 ：嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊 髄、下垂体、胃、脾臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆嚢、骨髄、副腎、皮膚、筋 肉、肺、消化管 (例:大腸、小腸)、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立 腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、椎間板、脂肪組織 (例:褐色脂肪組織、白 色脂肪組織)など]より単離された天然蛋白質であってもよぐまた、化学的に、もしく は無細胞蛋白質合成系を用 、て生化学的に合成された蛋白質であってもよ 、。ある いは、上記アミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸を導入された形質転換 体力も産生される組換え蛋白質であってもよい。
[0028] 配列番号： 3で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とは、配列番号
: 3で表されるアミノ酸配列と約 80%以上、好ましくは約 90%以上、より好ましくは約 95% 以上、最も好ましくは約 98%以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、該アミノ酸 配列を有する蛋白質が配列番号: 3で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質 的に同質の活性を有するような配列をいう。ここで「相同性」とは、当該技術分野にお V、て公知の数学的アルゴリズムを用いて 2つのアミノ酸配列をァラインさせた場合の、 最適なアラインメント (好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列 の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバー ラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸および類似アミノ酸残基の割合 (％) を意味する。「類似アミノ酸」とは物理ィ匕学的性質にぉ 、て類似したアミノ酸を意味し 、例えば、芳香族アミノ酸 (Phe、 Trp、 Tyr)、脂肪族アミノ酸 (Ala、 Leu、 Ile、 Val)、極 性アミノ酸（Gln、 Asn)、塩基性アミノ酸（Lys、 Arg、 His)、酸性アミノ酸（Glu、 Asp)、水 酸基を有するアミノ酸（Ser、 Thr)、側鎖の小さいアミノ酸（Gly、 Ala、 Ser、 Thr、 Met)な どの同じグループに分類されるアミノ酸が挙げられる。このような類似アミノ酸による置 換は蛋白質の表現型に変化をもたらさな 、 (即ち、保存的アミノ酸置換である)ことが 予測される。保存的アミノ酸置換の具体例は当該技術分野で周知であり、種々の文 献に記載されている（例えば、 Bowieら， Science, 247 : 1306-1310 (1990)を参照）。 本明細書におけるアミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズム NCBI BLAST (National Center for Biotecnnology Information Basic Local Alignment search οοΐ) を用い、以下の条件（期待値 =10；ギャップを許す；マトリクス =BLOSUM62；フィルタリ ング =OFF)にて計算することができる。アミノ酸配列の相同性を決定するための他の アルゴリズムとしては、例えば、 Karlinら， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 : 5873-5877 ersion 2.0)に組み込まれている（Altschulら， Nucleic Acids Res., 25 : 3389-3402 (19 97)) ]、 Needlemanら， J. Mol. Biol, 48 : 444-453 (1970)に記載のアルゴリズム [該ァ ルゴリズムは GCGソフトウェアパッケージ中の GAPプログラムに組み込まれて!/、る]、 Myersおよび Miller, CABIOS, 4: 11-17 (1988)に記載のアルゴリズム [該アルゴリズム は CGC配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部である ALIGNプログラム（versi on 2.0)に組み込まれている]、 Pearsonら， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-244 8 (1988)に記載のアルゴリズム [該アルゴリズムは GCGソフトウェアパッケージ中の FA STAプログラムに組み込まれて 、る]等が挙げられるが、それらに限定されな!、。 実質的に同質の活性としては、例えば、潜在型 TGF- β 1との結合活性、 TGF- β 1 の活性ィ匕促進活性などが挙げられる。「実質的に同質」とは、それらの性質が定性的 に (例：生理学的に、または薬理学的に）同等であることを意味する。したがって、上 記の活性の程度といった量的要素については同等であることが好ましいが、異なって いてもよい（例えば、約 0.01〜約 100倍、好ましくは約 0.1〜約 10倍、より好ましくは約 0 .5〜約 2倍)。
LTBP-1Lの活性の測定は自体公知の方法に準じて行うことができる。例えば、 TGF - j8 1との結合試験などが挙げられるが、それらに限定されない。
[0030] また、本発明で用いられる LTBP-1Lとしては、例えば、（1)配列番号： 3で表されるァ ミノ酸配列中の 1または 2個以上 (好ましくは、 1〜30個程度、好ましくは 1〜10個程度 、さらに好ましくは 1〜5個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（2)配列番号： 3で表さ れるアミノ酸配列に 1または 2個以上 (好ましくは、 1〜30個程度、好ましくは 1〜10個 程度、さらに好ましくは 1〜5個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（3)配列番号： 3で 表されるアミノ酸配列に 1または 2個以上 (好ましくは、 1〜30個程度、好ましくは 1〜10 個程度、さらに好ましくは 1〜5個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（4)配列番号 : 3で表されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 (好ましくは、 1〜30個程度、好ましく は 1〜 10個程度、さらに好ましくは 1〜5個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミ ノ酸配列、または (5)それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有する蛋白質であって、 配列番号: 3で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性を有す る蛋白質も含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠 失または置換の位置は、当該蛋白質の活性を損なわない限り、特に限定されない。
[0031] 本明細書においてアミノ酸配列により特定される蛋白質は、ペプチド標記の慣例に 従って、左端が N末端 (ァミノ末端)、右端が C末端 (カルボキシル末端)である。配列 番号 : 3で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質をはじめとする、本発明で用いられ る LTBP- 1Lは、 C末端がカルボキシル基（- COOH)、カルボキシレート (- COO— )、アミ ド（- CONH )またはエステル（- COOR)の何れであってもよ!/ヽ。
2
ここでエステルにおける Rとしては、例えば、メチル、ェチル、 n-プロピル、イソプロピ ル、 n-ブチルなどの C アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロへキシルなどの
1-6
C シクロアルキル基、例えば、フエニル、 a ナフチルなどの C ァリール基、例え ば、ベンジル、フエネチルなどのフエ-ルー C アルキル基もしくは OC—ナフチルメチ
1-2
ルなどの α—ナフチルー C アルキル基などの C ァラルキル基、ピバロィルォキシ
1-2 7-14
メチル基などが用いられる。
本発明で用いられる蛋白質力 末端以外にカルボキシル基 (またはカルボキシレー ト）を有して ヽる場合、カルボキシル基がアミド化またはエステルイ匕されて ヽるものも本 発明で用いられる蛋白質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記した c末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明で用いられる蛋白質には、 Ν末端のアミノ酸残基 (例:メチォニン残 基)のァミノ基が保護基 (例えば、ホルミル基、ァセチル基などの C アルカノィルなど
1-6
( C ァシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成する N末端の
1-6
グルタミン残基がピログルタミン酸ィ匕したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基 ( 例えば- OH、 -SH、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グァニジノ基など）が適 当な保護基 (例えば、ホルミル基、ァセチル基などの C アルカノィル基などの C 了
1-6 1-6 シル基など)で保護されて ヽるもの、ある ヽは糖鎖が結合した 、わゆる糖蛋白質など の複合蛋白質なども含まれる。
本発明で用いられる蛋白質の具体例としては、例えば、配列番号： 3で表されるアミ ノ酸配列からなるヒト LTBP-1L (GenBankァクセッション登録番号： NP_996826.1)があ げられる。
[0032] 本発明で用いられる LTBP-1Lの部分ペプチドは、配列番号： 3で表されるアミノ酸 配列の部分アミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有し、 LTBP-1 Lに対して特異的親和性を有する抗体を作製するための抗原ペプチドとなり得るもの であれば!/、ずれのものでもよ！/、。
具体的には、該部分ペプチドとしては、本発明で用いられる LTBP-1Lの構成ァミノ 酸配列のうち少なくとも 3個以上、好ましくは 6個以上の連続するアミノ酸配列を含む ペプチドなどが用いられる。
[0033] LTBP-1は別個のプロモーターから産生される 2つのアイソフォームを有し、 LTBP-1 Lは、 LTBP-1Sと比較して、 N末端側に 346アミノ酸の延長を含むことを特徴とする。し たがって、 LTBP-1Lを癌治療ターゲットとしてその発現および Zまたは活性を阻害す る場合、当該 N末端側の 346アミノ酸を標的にすることが好ましい。したがって、本発 明で用いられる LTBP-1Lの部分ペプチドは、 N末端側の 346アミノ酸の全部もしくは 一部の 、ずれかを含むものであることが好ま U、。
[0034] 本発明で用いられる LTBP-1Lの部分ペプチドは、 C末端がカルボキシル基 (-COO H)、カルボキシレート（- COO— )、アミド（- CONH )またはエステル（- COOR)の何れで
2
あってもよい。ここでエステルにおける Rとしては、 LTBP-1Lについて上記したと同様 のものが挙げられる。また、該部分ペプチドが C末端以外にカルボキシル基 (または カルボキシレート）を有している場合、該カルボキシル基がアミド化またはエステルイ匕 されているものも本発明で用いられる LTBP-1Lの部分ペプチドに含まれる。この場合 のエステルとしては、 C末端のエステルと同様のものが例示される。さらに、該部分べ プチドには、 LTBP- 1Lの場合と同様に、 N末端のアミノ酸残基 (例:メチォニン残基） のァミノ基が保護基で保護されて ヽるもの、 N端側が生体内で切断され生成したダル タミン残基がピログルタミン酸ィ匕したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適 当な保護基で保護されて ヽるもの、あるいは糖鎖が結合した ヽゎゆる糖ペプチドなど の複合ペプチドなども含まれる。
[0035] 本発明で用いられる LTBP-1Lまたはその部分ペプチドは塩の形態であってもよ 、。
例えば、生理学的に許容される酸 (例:無機酸、有機酸)や塩基 (例:アルカリ金属塩 )などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様 な塩としては、例えば、無機酸 (例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あ るいは有機酸 (例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、 酒石酸、クェン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸 )との塩などが用いられる。
[0036] 本発明で用いられる LTBP-1Lまたはその塩は、前述したヒトの細胞または組織から 自体公知の蛋白質の精製方法によって調製することができる。具体的には、該動物 の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行い、該抽出液を逆相クロ マトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせる こと〖こより精製単離することができる。
[0037] 本発明で用いられる LTBP-1Lもしくは部分ペプチドまたはその塩は、公知のぺプチ ド合成法に従って製造することもできる。
ペプチド合成法は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれであってもよい。本 発明の蛋白質を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合し、生 成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的とする蛋白質を製造 することができる。ここで、縮合や保護基の脱離は、自体公知の方法、例えば、以下 の (1)〜(5)に記載された方法に従って行われる。
(1) M. Bodanszkyおよび M.A. Ondetti,ペプチド 'シンセシス (Peptide Synthesis), In terscience Publishers, New York (196り年
(2) Schroederおよび Luebke,ザ、ペプチド (The Peptide), Academic Press, New Yor k (1965年）
(3)泉屋信夫他，ペプチド合成の基礎と実験，丸善 (株）（1975年）
(4)矢島治明および榊原俊平，生化学実験講座 1,蛋白質の化学 IV, 205, (1977年
)
(5)矢島治明監修，続医薬品の開発，第 14卷，ペプチド合成，広川書店
[0038] 本発明で用いられる LTBP-1Lの部分ペプチドまたはその塩は、上述もしくは後述の いずれかの方法により得られる LTBP-1Lまたはその塩を、適当なぺプチダーゼで切 断すること〖こよっても製造することができる。
[0039] このようにして得られた LTBP-1Lまたはその部分ペプチドは、公知の精製法により 精製単離することができる。ここで、精製法としては、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラム クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶、これらの組み合わせなどが挙げ られる。上記方法で得られる蛋白質または部分ペプチドが遊離体である場合には、 該遊離体を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換すること 力 Sできるし、逆に蛋白質が塩として得られた場合には、該塩を公知の方法あるいはそ れに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
[0040] ヒト LTBP- 1L (またはその部分ペプチド；以下、単に LTBP- 1Lと!、う場合がある）は、 それらをコードする核酸を含有する発現ベクターを導入した形質転換体を培養して L TBP-1Lを生成せしめ、得られる培養物力 LTBP-1Lを分離 '精製することによって 製造することちできる。 ヒト LTBP-1Lまたはその部分ペプチドをコードする核酸としては、前述した LTBP-1L のアミノ酸配列もしくはその部分アミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するもので あればいかなるものでもよい。該核酸は、 DNAであっても RNAであってもよぐあるい は DNAZRNAキメラであってもよいが、好ましくは DNAが挙げられる。また、該核酸は 二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖 DNA、二本鎖 R NAまたは DNA： RNAのハイブリッドでもよ!/ヽ。
LTBP-1Lまたはその部分ペプチドをコードする DNAは、ゲノム DNA、ヒトの細胞 [例 えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、脾臓 j8細胞、骨髄細胞、メサンギゥ ム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細 胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞 (例：マクロファージ、 T細 胞、 B細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球)、 巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞もしくは間 質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞など]またはそれらの 細胞が存在するあらゆる組織もしくは器官 [例えば、脳、脳の各部位 (例：嗅球、扁桃 核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、 胃、脾臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆嚢、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化 管 (例:大腸、小腸)、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵 巣、胎盤、子宮、骨、関節、椎間板、脂肪組織 (例:褐色脂肪組織、白色脂肪組織） など]由来の cDNA、合成 DNAなどが挙げられる。 LTBP-1Lまたはその部分ペプチド をコードするゲノム DNAおよび cDNAは、上記した細胞 '組織より調製したゲノム DNA 画分および全 RNAもしくは mRNA画分をそれぞれ铸型として用い、 Polymerase Chain Reaction (以下、「PCR法」と略称する）および Reverse Transcriptase- PCR (以下、「RT -PCR法」と略称する）によって直接増幅することもできる。あるいは、 LTBP-1Lまたは その部分ペプチドをコードするゲノム DNAおよび cDNAは、上記した細胞'組織より調 製したゲノム DNAおよび全 RNAもしくは mRNAの断片を適当なベクター中に挿入して 調製されるゲノム DNAライブラリーおよび cDNAライブラリーから、コロニーもしくはプラ ークハイブリダィゼーシヨン法または PCR法などにより、それぞれクローニングすること もできる。ライブラリーに使用するベクターは、ノ クテリオファージ、プラスミド、コスミド 、ファージミドなどいずれであってもよい。
[0041] ヒト LTBP-1Lをコードする DNAとしては、例えば、配列番号： 2で表される塩基配列 中コード領域として示される塩基配列を含有する DNA、ある ヽは該塩基配列とストリン ジェントな条件下でハイブリダィズする塩基配列を含有し、前記した配列番号： 3で表 されるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性 (例えば、 TGF- 18 1との 結合活性、 TGF- |8 1活性ィ匕促進活性など）を有する蛋白質をコードする DNAなどが 挙げられる。
配列番号: 2で表される塩基配列中コード領域として示される塩基配列とストリンジ ントな条件下でノヽイブリダィズできる DNAとしては、例えば、配列番号： 2で表される塩 基配列中コード領域として示される塩基配列と約 80%以上、好ましくは約 90%以上、よ り好ましくは約 95%以上の相同性を有する塩基配列を含有する DNAなどが用いられる 本明細書における塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズム NCBI BLAST (N ational し enter for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)を 用い、以下の条件（期待値 =10 ;ギャップを許す；フィルタリング =ON ;マッチスコア =1； ミスマッチスコア =-3)にて計算することができる。塩基配列の相同性を決定するため の他のアルゴリズムとしては、上記したアミノ酸配列の相同性計算アルゴリズムが同様 に好ましく例示される。
[0042] ノ、イブリダィゼーシヨンは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モ レキユラ一.クロー-ング（Molecular Cloning)第 2版（J. Sambrook et al, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989)に記載の方法などに従って行なうことができる。また、巿販 のライブラリーを使用する場合、ハイブリダィゼーシヨンは、添付の使用説明書に記載 の方法に従って行なうことができる。ハイブリダィゼーシヨンは、好ましくは、ストリンジ ェントな条件に従って行なうことができる。
ストリンジェントな条件としては、例えば、 6 X SSC (sodium chloride/sodium citrate) 中 45°Cでのハイブリダィゼーシヨン反応の後、 0.2 X SSC/0.1% SDS中 65°Cでの一 回以上の洗浄などが挙げられる。当業者は、ノ、イブリダィゼーシヨン溶液の塩濃度、 ハイブリダゼーシヨン反応の温度、プローブ濃度、プローブの長さ、ミスマッチの数、 ハイブリダィゼーシヨン反応の時間、洗浄液の塩濃度、洗浄の温度等を適宜変更す ることにより、所望のストリンジエンシーに容易に調節することができる。
[0043] LTBP-1Lをコードする DNAは、好ましくは配列番号： 2で表される塩基配列中コード 領域として示される塩基配列を含有するヒト LTBP-1L cDNA (GenBankァクセッション 番号： NM_206943.1)もしくはそのアレル変異体などが挙げられる。
[0044] LTBP-1Lの部分ペプチドをコードする DNAは、配列番号： 3で表されるアミノ酸配列 の一部と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むもの であればいかなるものであってもよい。また、ゲノム DNA、上記した細胞'組織由来の cDNA、合成 DNAのいずれでもよい。
具体的には、該部分ペプチドをコードする DNAとしては、例えば、
(1)配列番号: 2で表される塩基配列中コード領域として示される塩基配列を有する D NAの部分塩基配列、または
(2)配列番号： 2で表される塩基配列中コード領域として示される塩基配列を有する D NAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズする塩基配列を有するペプチドをコー ドする DNAなどが用いられる。
[0045] LTBP-1Lまたはその部分ペプチドをコードする DNAは、該蛋白質またはペプチドを コードする塩基配列の一部分を有する合成 DNAプライマーを用いて PCR法によって 増幅するか、または適当な発現ベクターに組み込んだ DNAを、 LTBP-1Lの一部ある いは全領域をコードする DNA断片もしくは合成 DNAを標識したものとハイブリダィゼ ーシヨンさせることによってクローユングすることができる。ハイブリダィゼーシヨンは、 例えば、モレキュラー 'クローユング (Molecular Cloning)第 2版 (前述）に記載の方法 などに従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダ ィゼーシヨンは、該ライブラリーに添付された使用説明書に記載の方法に従って行う ことができる。
[0046] DNAの塩基配列は、公知のキット、例えば、 Mutan™-super Express Km (宝酒造（ 株））、 Mutan™- K (宝酒造 (株））等を用いて、 ODA- LA PCR法、 Gapped duplex法、 K unkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って変換することがで きる。 [0047] クローンィ匕された DNAは、 目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化す る力、リンカ一を付加した後に、使用することができる。該 DNAはその 5'末端側に翻 訳開始コドンとしての ATGを有し、また 3'末端側には翻訳終止コドンとしての TAA、 T GAまたは TAGを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適 当な合成 DNAアダプターを用いて付加することができる。
[0048] 上記の LTBP-1Lまたはその部分ペプチドをコードする DNAを含む発現ベクターで 宿主を形質転換し、得られる形質転換体を培養することによって、該蛋白質またはべ プチドを製造することができる。
LTBP-1Lまたはその部分ペプチドをコードする DNAを含む発現ベクターは、例えば 、 LTBP- 1Lをコードする DNAから目的とする DNA断片を切り出し、該 DNA断片を適当 な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。 プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーター であれば!/、かなるものでもよ！/、。
例えば、宿主が動物細胞である場合、サイトメガロウィルス (CMV)由来プロモータ 一（例： CMV前初期プロモーター）、ヒト免疫不全ウィルス (HIV)由来プロモーター（ 例： HIV LTR)、ラウス肉腫ウイノレス (RSV)由来プロモーター（例： RSV LTR)、マウス 乳癌ウイノレス (MMTV)由来プロモーター（例： MMTV LTR)、モロ-一マウス白血病ゥ ィルス (MoMLV)由来プロモーター（例： MMTV LTR)、単純へルぺスウィルス（HSV) 由来プロモーター（例： HSVチミジンキナーゼ（TK)プロモーター）、 SV40由来プロモ 一ター（例： SV40初期プロモーター）、ェプスタインバーウイノレス (EBV)由来プロモー ター、アデノ随伴ウィルス（AAV)由来プロモーター（例： AAV p5プロモーター）、アデ ノウィルス (AdV)由来プロモーター（Ad2または Ad5主要後期プロモーター）などが用 いられる。
宿主がェシエリヒア属菌である場合、 trpプロモーター、 lacプロモーター、 recAプロモ 一ター、 λ Ρプロモーター、 lppプロモーター、 T7プロモーターなどが好ましい。
L
宿主がバチルス属菌である場合、 SP01プロモーター、 SP02プロモーター、 penPプ 口モーターなどが好まし 、。 宿主が酵母である場合、 PH05プロモーター、 PGKプロモーター、 GAPプロモータ 一、 ADHプロモーターなどが好ましい。
宿主が昆虫細胞である場合、ポリヘドリンプロモーター、 P10プロモーターなどが好 ましい。
[0049] 発現ベクターとしては、上記の他に、所望によりェンノヽンサ一、スプライシングシグ ナル、ポリ A付加シグナル、選択マーカー、 SV40複製起点などを含有しているものを 用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr)遺 伝子 [メソトレキセート (MTX)耐性]、アンピシリン耐性 (Amp1")遺伝子、ネオマイシン 耐性 (Neof)遺伝子 (G418耐性)等が挙げられる。特に、 dhfr遺伝子欠損チャイニーズ ノ、ムスター (CHO-dhfr")細胞を用い、 dhfr遺伝子を選択マーカーとして使用する場 合、 目的遺伝子をチミジンを含まない培地によって選択することもできる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列をコードする塩基配列（シグナル コドン）を、 LTBP-1Lまたはその部分ペプチドをコードする DNAの 5，末端側に付カロし てもよい。宿主がェシエリヒア属菌である場合、 PhoAシグナル配列、 OmpAシグナル 配列など力 宿主がバチルス属菌である場合、 α -アミラーゼシグナル配列、サブチリ シンシグナル配列など力 宿主が酵母である場合、 MF aシグナル配列、 SUC2シグ ナル配列など力 宿主が動物細胞である場合、インシュリンシグナル配列、 α -インタ 一フエロンシグナル配列、抗体分子シグナル配列などがそれぞれ用いられる。
[0050] 宿主としては、例えば、エシ リヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、 動物細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌としては、例えば、ェシエリヒア'コリ（Escherichia coli) K12、 DH1、 J M103、 JA221、 HB101、 C600などが用いられる。
バチノレス属菌としては、例えば、バチノレス'サブチノレス（Bacillus subtilis) MI114、 20 7-21などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス 'セレビシェ (Saccharomyces cerevisiae)A H22、 AH22R―、 NA87- 11A、 DKD- 5D、 20B- 12、シゾサッカロマイセス'ボンべ（Schizo saccharomyces pombe) NCYC1913、 NCYC2036、ピキア'パストリス（Pichia pastoris) K M71などが用いられる。
[0051] 昆虫細胞としては、例えば、ウィルスが AcNPVの場合、夜盗蛾の幼虫由来株化細 胞（Spodoptera frugiperda cell;Slla胞）、 Trichoplusia niの中腸由来の MG1細胞、 Tri choplusia niの卵由来の High Five 細胞、 Mamestra brassicae由来の糸田胞、 Estigmen a acrea由来の細胞などが用いられる。ウィルス力 ¾mNPVの場合、昆虫細胞としては、 蚕由来株化細胞（Bombyx mori N細胞； BmN細胞）などが用いられる。該 Slf田胞とし ては、例えば、 S19細胞（ATCC CRL1711)、 S121細胞（以上、 Vaughn, J丄.ら、イン 'ヴ イボ（In Vivo) , 13, 213-217 (1977))などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる。
[0052] 動物細胞としては、例えば、サル由来細胞（例： COS-l、 COS-7、 CV-1、 Vero)、ハ ムスター由来細胞（例： BHK、 CHO、 CHO- Kl、 CHO- dhfr— )、マウス由来細胞（例： NI H3T3、 L、 L929、 CTLL- 2、 AtT- 20)、ラット由来細胞（例： H4IIE、 PC- 12、 3Y1、 NBT- Π)、ヒト由来細胞（例： HEK293、 A549、 HeLa、 HepG2、 HL- 60、 Jurkat、 U937)などが 用いられる。
[0053] 形質転換は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。
ェシエリヒア属菌は、例えば、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)や Gene, 17, 107 (1982)などに記載の方法に従って形質転換することができる。
バチノレス属菌は、例えば、 Molecular and General Genetics, 168, 111 (1979)などに 記載の方法に従って形質転換することができる。
酵母は、例えば、 Methods in Enzymology, 194, 182-187 (1991)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)などに記載の方法に従って形質転換することができる。 昆虫細胞および昆虫は、例えば、 Bio/Technology, 6, 47-55 (1988)などに記載の 方法に従って形質転換することができる。
動物細胞は、例えば、細胞工学別冊 8 新細胞工学実験プロトコール， 263-267 (19 95) (秀潤社発行）、 Virology, 52, 456 (1973)に記載の方法に従って形質転換すること ができる。
[0054] 形質転換体の培養は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することがで きる。
例えば、宿主がェシエリヒア属菌またはバチルス属菌である形質転換体を培養する 場合、培養に使用される培地としては液体培地が好ましい。また、培地は、形質転換 体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物などを含有することが好ましい。ここで、 炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖などが；窒素 源としては、例えば、アンモ-ゥム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ'リカー、ペプトン 、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質が；無機 物としては、例えば、塩ィ匕カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなど がそれぞれ挙げられる。また、培地には、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子など を添カ卩してもよい。培地の pHは、好ましくは約 5〜8である。
宿主がェシエリヒア属菌である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば
、グルコース、カザミノ酸を含む M9培地が好ましい。必要により、プロモーターを効率 よく働力せるために、例えば、 3 |8 -インドリルアクリル酸のような薬剤を培地に添加し てもよい。培養は、通常約 15〜43°Cで、約 3〜24時間行なわれる。必要により、通気 や撹拌を行ってもよい。
宿主がバチルス属菌である形質転換体の培養は、通常約 30〜40°Cで、約 6〜24時 間行なわれる。必要により、通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が酵母である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、バークホ 一ルダー (Burkholder)最小培地や 0.5%カザミノ酸を含有する SD培地などが挙げら れる。培地の pHは、好ましくは約 5〜8である。培養は、通常約 20°C〜35°Cで、約 24 〜72時間行なわれる。必要に応じて、通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する場合の培地としては、例 えば Grace's Insect Mediumに非働化した 10%ゥシ血清等の添加物を適宜加えたもの などが用いられる。培地の pHは、好ましくは約 6.2〜6.4である。培養は、通常約 27°C で、約 3〜5日間行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、約 5〜 20%の胎児牛血清を含む最小必須培地（MEM)、ダルベッコ改変イーグル培地（DME M)、 RPMI1640培地、 199培地などが用いられる。培地の pHは、好ましくは約 6〜8で ある。培養は、通常約 30°C〜40°Cで、約 15〜60時間行なわれる。必要に応じて通気 や撹拌を行ってもよい。
以上のようにして、形質転換体の細胞内または細胞外に LTBP-1Lを生成させること ができる。
[0055] 前記形質転換体を培養して得られる培養物から、 LTBP-1Lを自体公知の方法に従 つて分離精製することができる。
例えば、 LTBP-1Lを培養菌体あるいは細胞力も抽出する場合、培養物から公知の 方法で集めた菌体あるいは細胞を適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよ び Zまたは凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊した後、遠心分離やろ過 により可溶性蛋白質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。該緩衝液は、尿 素や塩酸グァ-ジンなどの蛋白質変性剤や、トリトン X- 100™などの界面活性剤を含 んでいてもよい。一方、 LTBP-1Lが細胞外に分泌される場合は、培養物から遠心分 離または濾過等により培養上清を回収する。
このようにして得られた可溶性画分もしくは培養上清中に含まれる LTBP-1Lの単離 精製は、自体公知の方法に従って行うことができる。このような方法としては、塩析ゃ 溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法;透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およ び SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方 法;イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法；ァフィユティークロ マトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法；逆相高速液体クロマトグラフィー などの疎水性の差を利用する方法;等電点電気泳動法などの等電点の差を利用す る方法;などが用いられる。これらの方法は、適宜組み合わせることもできる。
[0056] 力べして得られる LTBP-1Lまたはその部分ペプチドが遊離体である場合には、自体 公知の方法あるいはそれに準じる方法によって該遊離体を塩に変換することができ、 該蛋白質またはペプチドが塩として得られた場合には、自体公知の方法あるいはそ れに準じる方法により該塩を遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、形質転換体が産生する LTBP-1Lを、精製前または精製後に適当な蛋白質 修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除 去することもできる。該蛋白質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリブシン、 アルギニルエンドべプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられ る。
力べして得られる LTBP-1Lの存在は、特異的な抗体を用いたェンザィムィムノアッセ ィゃウェスタンブロッテイングなどにより確認することができる。
[0057] さらに、 LTBP-1Lまたはその部分ペプチドは、それをコードする DNAに対応する RN Aを铸型として、ゥサギ網状赤血球ライセート、コムギ胚芽ライセート、大腸菌ライセー トなど力 なる無細胞蛋白質翻訳系を用いてインビトロ翻訳することによつても合成す ることができる。あるいは、さらに RNAポリメラーゼを含む無細胞転写 Z翻訳系を用い て、 LTBP-1Lまたはその部分ペプチドをコードする DNAを铸型としても合成すること ができる。無細胞蛋白質 (転写 Z)翻訳系は市販のものを用いることもできるし、それ 自体既知の方法、具体的には大腸菌抽出液は Pratt J.M.ら， "Transcription and Tra nlation", Hames B.D.および Higgins S.J.編， IRL Press, Oxford 179-209 (1984)に記 載の方法等に準じて調製することもできる。市販の細胞ライセートとしては、大腸菌由 来のものは E.coli S30 extract system (Promega社製）や RTS 500 Rapid Tranlation Sy stem (Roche社製)等が挙げられ、ゥサギ網状赤血球由来のものは Rabbit Reticulocyt e Lysate System (Promega社製）等、さらにコムギ胚芽由来のものは PROTEIOS™ (T OYOBO社製）等が挙げられる。このうちコムギ胚芽ライセートを用いたものが好適で ある。コムギ胚芽ライセートの作製法としては、例えば Johnston F.B.ら， Nature, 179, 160-161 (1957)あるいは Erickson A.H.ら, Meth. EnzymoL, 96, 38-50 (1996)等に記 載の方法を用いることができる。
蛋白質合成のためのシステムまたは装置としては、ノ ツチ法 (PratU.M.ら（1984)前 述)や、アミノ酸、エネルギー源等を連続的に反応系に供給する連続式無細胞蛋白 質合成システム（Spirin A.S.ら， Science, 242, 1162-1164 (1988))、透析法（木川ら、 第 21回日本分子生物学会、 WID6)、あるいは重層法（PROTEIOS™ Wheat germ cell -free protein synthesis core kit取扱説明書： TOYOBO社製）等が挙げられる。さらに は、合成反応系に、铸型の RNA、アミノ酸、エネルギー源等を必要時に供給し、合成 物や分解物を必要時に排出する方法 (特開 2000-333673)等を用いることができる。
[0058] 本発明で用いられる、 LTBP-1L蛋白質またはその部分ペプチドに対する抗体 (以 下、本発明の抗体と略記することがある）は、 LTBP-1L蛋白質またはその部分べプチ ドを認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであ つてもよい。抗体のアイソタイプは特に限定されないが、好ましくは IgG、 IgMまたは IgA 、特に好ましくは IgGが挙げられる。
[0059] また、本発明の抗体は、標的抗原を特異的に認識し結合するための相補性決定領 域 (CDR)を少なくとも有するものであれば特に制限はなぐ完全抗体分子の他、例え ば Fab、 Fab'、 F(ab')等のフラグメント、 scFv、 scFv- Fc、ミニボディー、ダイァボディー
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等の遺伝子工学的に作製されたコンジュゲート分子、あるいはポリエチレングリコー ル (PEG)等の蛋白質安定化作用を有する分子等で修飾されたそれらの誘導体など であってもよい。
[0060] LTBP-1L蛋白質またはその部分ペプチド (以下、抗体の説明においては、これらを 単に LTBP-1L蛋白質と略記する場合がある）に対する抗体は、自体公知の抗体また は抗血清の製造法に従って製造することができる。
以下に、本発明の抗体の免疫原調製法、および該抗体の製造法について説明す る。
[0061] (1)抗原の調製
本発明の抗体を調製するために使用される抗原としては、上記した LTBP-1L蛋白 質またはその部分ペプチド、あるいはそれと同一の抗原決定基を 1種あるいは 2種以 上有する（合成)ペプチドなど、何れのものも使用することができる（以下、これらを単 に本発明の抗原と称することもある)。
ヒト LTBP-1L蛋白質またはその部分ペプチドは、上記した通り、例えば、（a)ヒトの組 織または細胞力 公知の方法あるいはそれに準ずる方法を用いて調製、（b)ぺプチ ド 'シンセサイザ一等を使用する公知のペプチド合成方法でィ匕学的に合成、 (c)ヒト L TBP-1L蛋白質またはその部分ペプチドをコードする DNAを含有する形質転換体を 培養、あるいは（d)ヒト LTBP-1L蛋白質またはその部分ペプチドをコードする核酸を 铸型として無細胞転写 Z翻訳系を用いて生化学的に合成することによって製造され る。
(a)ヒトの組織または細胞力も LTBP-1L蛋白質を調製する場合、その組織または細胞 をホモジナイズした後、粗分画物 (例、膜画分、可溶性画分)をそのまま抗原として用 いることもできる。あるいは酸、界面活性剤またはアルコールなどで抽出を行い、該抽 出液を、塩析、透析、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィ 一、ァフィ二ティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることによ り精製単離することもできる。得られた LTBP-1L蛋白質をそのまま免疫原とすることも できるし、ぺプチダーゼ等を用いた限定分解により部分ペプチドを調製してそれを免 疫原とすることちでさる。
(b)化学的に本発明の抗原を調製する場合、該合成ペプチドとしては、例えば上述 の（a)の方法を用いて天然材料より精製した LTBP-1L蛋白質と同一の構造を有する もの、具体的には、該蛋白質のアミノ酸配列において少なくとも 3個以上、好ましくは 6 個以上のアミノ酸力 なる任意の箇所のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を 1種ある いは 2種以上含有するペプチドなどが用いられる。
(c) DNAを含有する形質転換体を用いて本発明の抗原を製造する場合、該 DNAは
、公知のクロー-ング方法〔例えば、 Molecular Cloning 2nd ed. (J. Sambrook et al.，
Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989)に記載の方法など〕に従って作製することがで きる。該クローニング方法とは、（1)ヒト LTBP-1L蛋白質をコードする遺伝子配列に基 づきデザインした DNAプローブを用い、ヒト cDNAライブラリーからハイブリダィゼー シヨン法により該抗原をコードする DNAを単離する力、（2)ヒト LTBP-1L蛋白質をコー ドする遺伝子配列に基づきデザインした DNAプライマーを用い、ヒト cDNAを铸型と して PCR法により該抗原をコードする DNAを調製し、該 DNAを宿主に適合する発 現ベクターに挿入する方法などが挙げられる。該発現べクタ一で宿主を形質転換し て得られる形質転換体を適当な培地中で培養することにより、所望の抗原を得ること ができる。
(d)無細胞転写 Z翻訳系を利用する場合、上記 (c)と同様の方法により調製した抗 原をコードする DNAを挿入した発現ベクター（例えば、該 DNAが T7、 SP6プロモー ター等の制御下におかれた発現ベクターなど）を铸型とし、該プロモーターに適合す る RNAポリメラーゼおよび基質 (NTPs)を含む転写反応液を用いて mRNAを合成し た後、該 mRNAを铸型として公知の無細胞翻訳系（例：大腸菌、ゥサギ網状赤血球 、コムギ胚芽等の抽出液)を用いて翻訳反応を行わせる方法などが挙げられる。塩濃 度等を適当に調整することにより、転写反応と翻訳反応を同一反応液中で一括して 行うことちでさる。 [0062] 免疫原としては完全なヒト LTBP-1L蛋白質分子やその部分アミノ酸配列を有するぺ プチドを用いることができる。部分アミノ酸配列としては、例えば 3個以上の連続する アミノ酸残基力もなるもの、好ましくは 4個以上、より好ましくは 5個以上、いっそう好ま しくは 6個以上の連続するアミノ酸残基力もなるものが挙げられる。あるいは、該ァミノ 酸配列としては、例えば 20個以下の連続するアミノ酸残基力もなるもの、好ましくは 1 8個以下、より好ましくは 15個以下、いっそう好ましくは 12個以下の連続するアミノ酸 残基力 なるものが挙げられる。これらのアミノ酸残基の一部（例： 1な 、し数個）は置 換可能な基 (例: Cys、水酸基等）によって置換されていていもよい。免疫原として用 V、られるペプチドは、このような部分アミノ酸配列を 1な 、し数個含むアミノ酸配列を 有する。
[0063] あるいは、 LTBP-1L蛋白質を発現するヒト細胞自体を、本発明の抗原として直接用 いることもできる。ヒト細胞としては、上記 (a)項で述べたような天然の細胞、上記 (c) 項で述べたような方法で形質転換した細胞などを用いることができる。形質転換に用 いる宿主としては、ヒト、サル、ラット、マウス、ノ、ムスター、 -ヮトリなど力も採取した細 胞であれば何れのものでも良ぐ ΗΕΚ293, COS7、 CHO- Kl、 NIH3T3、 Balb3T3、 FM 3A、 L929、 SP2/0、 P3U1、 B16、または P388などが好ましく用いられる。ヒト LTBP-1L 蛋白質を発現する天然のヒト細胞または形質転換した温血動物細胞は、組織培養に 用いられる培地（例、 RPMI1640)または緩衝液（例、 Hanks' Balanced Salt Solution) に懸濁された状態で免疫動物に注射することができる。免疫方法としては、抗体産生 を促すことのできる方法であれば何れの方法でも良ぐ静脈内注射、腹腔内注射、筋 肉内注射または皮下注射などが好ましく用いられる。
[0064] 本発明の抗原は、免疫原性を有していれば不溶ィ匕したものを直接免疫することもで きるが、分子内に 1ないし数個の抗原決定基しか有しない低分子量 (例えば、分子量 約 3,000以下）の抗原 (即ち、 LTBP- 1Lの部分ペプチド）を用いる場合には、これらの 抗原は通常免疫原性の低いハプテン分子なので、適当な担体 (キャリアー）に結合ま たは吸着させた複合体として免疫することができる。担体としては天然もしくは合成の 高分子を用いることができる。天然高分子としては、例えばゥシ、ゥサギ、ヒトなどの哺 乳動物の血清アルブミンや例えばゥシ、ゥサギなどの哺乳動物のサイログロブリン、 例えば-ヮトリのオボアルブミン、例えばゥシ、ゥサギ、ヒト、ヒッジなどの哺乳動物の ヘモグロビン、キーホールリンペットへモシァニン（KLH)などが用いられる。合成高分 子としては、例えばポリアミノ酸類、ポリスチレン類、ポリアクリル類、ポリビニル類、ポリ プロピレン類などの重合物または共重合物などの各種ラテックスなどが挙げられる。
[0065] 該キャリアーとハプテンとの混合比は、担体に結合あるいは吸着させた抗原に対す る抗体が効率よく産生されれば、どのようなものをどのような比率で結合あるいは吸着 させてもよぐ通常ハプテンに対する抗体の作製にあたり常用されている上記の天然 もしくは合成の高分子キャリアーを、重量比でノヽプテン 1に対し 0.1〜100の割合で結 合あるいは吸着させたものを使用することができる。
[0066] また、ハプテンとキャリアーの力プリングには、種々の縮合剤を用いることができる。
例えば、チロシン、ヒスチジン、トリプトファンを架橋するビスジァゾ化べンジジンなど のジァゾ -ゥム化合物、アミノ基同志を架橋するダルタルアルデビトなどのジアルデヒ ド化合物、トルエン 2, 4 ジイソシァネートなどのジイソシァネート化合物、チォー ル基同志を架橋する N, N，— o フエ-レンジマレイミドなどのジマレイミド化合物、 ァミノ基とチオール基を架橋するマレイミド活性エステルイ匕合物、ァミノ基とカルボキ シル基とを架橋するカルポジイミドィ匕合物などが好都合に用いられる。また、アミノ基 同志を架橋する際にも、一方のァミノ基にジチォピリジル基を有する活性エステル試 薬（例えば、 3-(2-ピリジルジチォ)プロピオン酸 N-スクシンィミジル (SPDP)など）を反 応させた後還元することによりチオール基を導入し、他方のァミノ基にマレイミド活性 エステル試薬によりマレイミド基を導入後、両者を反応させることもできる。
[0067] (2)モノクローナル抗体の作製
(a)モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明の抗原は、温血動物に対して、例えば腹腔内注入、静脈注入，皮下注射、 皮内注射などの投与方法によって、抗体産生が可能な部位にそれ自体単独で、ある いは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全 フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよ 、。投与は通常 1
〜6週毎に 1回ずつ、計 2〜10回程度行われる。用いられる温血動物としては、例えば 、サル、ゥサギ、ィヌ、モノレモット、マウス、ラット、ハムスター、ヒッジ、ャギ、ロノく、ニヮ トリが挙げられる。抗 Ig抗体産生の問題を回避するためには投与対象と同一種の哺 乳動物を用いることが好ましいが、モノクローナル抗体作製には一般にマウスおよび ラットが好ましく用いられる。
[0068] ヒトに対する人為的免疫感作は倫理的に困難であることから、本発明の抗体がヒト を投与対象とする場合には、（0後述する方法に従って作製されるヒト抗体産生動物（ 例：マウス）を免疫してヒト抗体を得る、 GO後述する方法に従ってキメラ抗体、ヒト化抗 体もしくは完全ヒト抗体を作製する、ある 、は (iii)体外免疫法とウィルスによる細胞不 死化、ヒト—ヒト (もしくはマウス)ハイプリドーマ作製技術、ファージディスプレイ法等と を組み合わせてヒト抗体を得ることが好ましい。尚、体外免疫法は、通常の免疫では 抗体産生が抑制される抗原に対する抗原を取得できる可能性があることの他、 ng〜 μ gオーダーの抗原量で抗体を得ることが可能であること、免疫が数日間で終了する ことなどから、不安定で大量調製の困難な抗原に対する抗体を得る方法として、非ヒ ト動物由来の抗体を調製する場合にも好ましく用いられ得る。
[0069] 体外免疫法に用いられる動物細胞としては、ヒトおよび上記した温血動物 (好ましく はマウス、ラット）の末梢血、脾臓、リンパ節など力ゝら単離されるリンパ球、好ましくは B リンパ球等が挙げられる。例えば、マウスやラット細胞の場合、 4〜12週齢程度の動物 から脾臓を摘出，脾細胞を分離し、適当な培地 (例:ダルベッコ改変イーグル培地 (D MEM)、 RPMI1640培地、ハム F12培地等）で洗浄した後、抗原を含む胎仔ゥシ血清（ FCS ;5〜20%程度）添加培地に浮遊させて 4〜10日間程度 COインキュベーターなど
2
を用いて培養する。抗原濃度としては、例えば 0.05〜5 gが挙げられるがこれに限定 されない。同一系統の動物（1〜2週齢程度が好ましい）の胸腺細胞培養上清を常法 に従って調製し、培地に添加することが好ましい。
[0070] ヒト細胞の体外免疫では、胸腺細胞培養上清を得ることは困難なので、 IL-2、 IL-4 、 IL-5、 IL-6等数種のサイト力インおよび必要に応じてアジュバント物質 (例：ムラミル ジペプチド等）を抗原とともに培地に添加して免疫感作を行うことが好ま 、。
[0071] モノクローナル抗体の作製に際しては、抗原を免疫された温血動物（例：マウス、ラ ット)もしくは動物細胞 (例:ヒト、マウス、ラット)から抗体価の上昇が認められた個体も しくは細胞集団を選択し、最終免疫の 2〜5日後に脾臓またはリンパ節を採取もしくは 体外免疫後 4〜10日間培養した後に細胞を回収して抗体産生細胞を単離し、これと 骨髄腫細胞とを融合させることにより抗体産生ハイプリドーマを調製することができる 。血清中の抗体価の測定は、例えば標識化抗原と抗血清とを反応させた後、抗体に 結合した標識剤の活性を測定することにより行うことができる。
[0072] 骨髄腫細胞は多量の抗体を分泌するハイプリドーマを産生し得るものであれば特 に制限はないが、自身は抗体を産生もしくは分泌しないものが好ましぐまた、細胞融 合効率が高いものがより好ましい。また、ハイプリドーマの選択を容易にするために、 HAT (ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン)感受性の株を用いることが好ましい。 例えばマウス骨髄腫細胞としては NS-1、 P3U1、 SP2/0、 AP-1等力 ラット骨髄腫細胞 としては R210.RCY3、 Y3-Ag 1.2.3等力 ヒト骨髄腫細胞としては SKO- 007、 GM 1500 - 6TG- 2、 LICR- LON- HMy2、 UC729- 6等が挙げられる。
[0073] 融合操作は既知の方法、例えばケーラーとミルスタインの方法 [ネイチヤー（Nature )、 256卷、 495頁 (1975年)]に従って実施することができる。融合促進剤としては、ポリ エチレングリコール（PEG)やセンダイウィルスなどが挙げられる力 好ましくは PEGな どが用いられる。 PEGの分子量は特に制限はないが、低毒性で且つ粘性が比較的 低い PEG1000〜PEG6000が好ましい。 PEG濃度としては例えば 10〜80%程度、好まし くは 30〜50%程度が例示される。 PEGの希釈用溶液としては無血清培地（例： RPMI16 40)、 5〜20%程度の血清を含む完全培地、リン酸緩衝生理食塩水（PBS)、トリス緩衝 液等の各種緩衝液を用いることができる。所望により DMSO (例： 10〜20%程度）を添 カロすることもできる。融合液の pHとしては、例えば 4〜10程度、好ましくは 6〜8程度が 挙げられる。
抗体産生細胞 (脾細胞)数と骨髄細胞数との好ましい比率は、通常 1:1〜20:1程度 であり、通常 20〜40°C、好ましくは 30〜37°Cで通常 1〜10分間インキュベートすること により効率よく細胞融合を実施できる。
[0074] 抗体産生細胞株はまた、リンパ球をトランスフォームし得るウィルスに抗体産生細胞 を感染させて該細胞を不死化することによつても得ることができる。そのようなウィルス としては、例えばェプスタイン バー（EB)ウィルス等が挙げられる。大多数の人は伝 染性単核球症の無症状感染としてこのウィルスに感染した経験があるので免疫を有 しているが、通常の EBウィルスを用いた場合にはウィルス粒子も産生されるので、適 切な精製を行うべきである。ウィルス混入の可能性のない EBシステムとして、 Bリンパ 球を不死化する能力を保持するがウィルス粒子の複製能力を欠損した組換え EBウイ ルス (例えば、潜伏感染状態から溶解感染状態への移行のスィッチ遺伝子における 欠損など）を用いることもまた好ま 、。
[0075] マーモセット由来の B95-8細胞は EBウィルスを分泌して!/、るので、その培養上清を 用いれば容易に Bリンパ球をトランスフォームすることができる。この細胞を例えば血 清及びペニシリン Zストレプトマイシン (P/S)添加培地（例： RPMI1640)もしくは細胞 増殖因子を添加した無血清培地で培養した後、濾過もしくは遠心分離等により培養 上清を分離し、これに抗体産生 Bリンパ球を適当な濃度 (例:約 107細胞/ mL)で浮遊 させて、通常 20〜40°C、好ましくは 30〜37°Cで通常 0.5〜2時間程度インキュベートす ることにより抗体産生 B細胞株を得ることができる。ヒトの抗体産生細胞が混合リンパ 球として提供される場合、大部分の人は EBウィルス感染細胞に対して傷害性を示す Tリンパ球を有しているので、トランスフォーメーション頻度を高めるためには、例えば ヒッジ赤血球等と Eロゼットを形成させることによって Tリンパ球を予め除去しておくこ とが好ましい。また、可溶性抗原を結合したヒッジ赤血球を抗体産生 Bリンパ球と混合 し、パーコール等の密度勾配を用いてロゼットを分離することにより標的抗原に特異 的なリンパ球を選別することができる。さらに、大過剰の抗原を添加することにより抗 原特異的な Bリンパ球はキャップされて表面に IgGを提示しなくなるので、抗 IgG抗体 を結合したヒッジ赤血球と混合すると抗原非特異的な Bリンパ球のみがロゼットを形 成する。従って、この混合物力もパーコール等の密度勾配を用いてロゼット非形成層 を採取することにより、抗原特異的 Bリンパ球を選別することができる。
[0076] トランスフォーメーションによって無限増殖能を獲得したヒト抗体分泌細胞は、抗体 分泌能を安定に持続させるためにマウスもしくはヒトの骨髄腫細胞と戻し融合させるこ とができる。骨髄腫細胞としては上記と同様のものが用いられ得る。
[0077] ハイプリドーマのスクリーニング、育種は通常 HAT (ヒポキサンチン、アミノプテリン、 チミジン）を添加して、 5〜20% FCSを含む動物細胞用培地（例： RPMI1640)もしくは細 胞増殖因子を添加した無血清培地で行われる。ヒポキサンチン、アミノプテリンおよび チミジンの濃度としては、例えばそれぞれ約 0.1mM、約 0.4 /z Mおよび約 0.016mM等 が挙げられる。ヒト一マウスハイプリドーマの選択にはゥヮバイン耐性を用いることがで きる。ヒト細胞株はマウス細胞株に比べてゥヮバインに対する感受性が高いので、 10 〜10—3M程度で培地に添加することにより未融合のヒト細胞を排除することができる。
[0078] ノ、イブリドーマの選択にはフィーダ一細胞やある種の細胞培養上清を用いることが 好ましい。フィーダ一細胞としては、ハイプリドーマの出現を助けて自身は死滅するよ うに生存期間が限られた異系の細胞種、ハイプリドーマの出現に有用な増殖因子を 大量に産生し得る細胞を放射線照射等して増殖力を低減させたもの等が用いられる 。例えば、マウスのフィーダ一細胞としては、脾細胞、マクロファージ、血液、胸腺細 胞等が、ヒトのフィーダ一細胞としては、末梢血単核細胞等が挙げられる。細胞培養 上清としては、例えば上記の各種細胞の初代培養上清や種々の株化細胞の培養上 清が挙げられる。
また、ハイプリドーマは、抗原を蛍光標識して融合細胞と反応させた後、蛍光活性 化セルソータ (FACS)を用いて抗原と結合する細胞を分離することによつても選択す ることができる。この場合、標的抗原に対する抗体を産生するハイブリドーマを直接選 択することができるので、クローニングの労力を大いに軽減することが可能である。
[0079] 標的抗原に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのクローユングに は種々の方法が使用できる。
アミノプテリンは多くの細胞機能を阻害するので、できるだけ早く培地力 除去する ことが好ましい。マウスやラットの場合、ほとんどの骨髄腫細胞は 10〜14日以内に死 滅するので、融合 2週間後からはアミノプテリンを除去することができる。但し、ヒトハイ プリドーマについては通常融合後 4〜6週間程度はアミノプテリン添加培地で維持さ れる。ヒポキサンチン、チミジンはアミノプテリン除去後 1週間以上後に除去するのが 望ましい。即ち、マウス細胞の場合、例えば融合?〜 10日後にヒポキサンチンおよび チミジン（HT)添加完全培地（例： 10% FCS添加 RPMI1640)の添加または交換を行う。 融合後 8〜14日程度で目視可能なクローンが出現する。クローンの直径力 lmm程度 になれば培養上清中の抗体量の測定が可能となる。
[0080] 抗体量の測定は、例えば標的抗原またはその誘導体あるいはその部分ペプチド（ 抗原決定基として用いた部分アミノ酸配列を含む)を直接あるいは担体とともに吸着 させた固相（例：マイクロプレート）にハイプリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物 質 (例：125I,mI,3H,14C)、酵素（例： β—ガラタトシダーゼ、 β—ダルコシダーゼ、アル カリフォスファターゼ、パーォキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素）、蛍光物質 (例：フル ォレスカミン、フルォレツセンイソチオシァネート）、発光物質（例：ルミノール、ルミノー ル誘導体、ルシフェリン、ルシゲニン)などで標識した抗免疫グロブリン (IgG)抗体 (も との抗体産生細胞が由来する動物と同一種の動物由来の IgGに対する抗体が用いら れる）またはプロテイン Aを加え、固相に結合した標的抗原 (抗原決定基）に対する抗 体を検出する方法、抗 IgG抗体またはプロテイン Aを吸着させた固相にハイプリドー マ培養上清を添加し、上記と同様の標識剤で標識した標的抗原またはその誘導体あ るいはその部分ペプチドを加え、固相に結合した標的抗原 (抗原決定基）に対する 抗体を検出する方法などによって行うことができる。
[0081] クローユング方法としては限界希釈法が通常用いられる力 軟寒天を用いたクロー ユングや FACSを用いたクローユング（上述)も可能である。限界希釈法によるクロー ニングは、例えば以下の手順で行うことができるがこれに限定されな 、。
上記のようにして抗体量を測定して陽性ゥ ルを選択する。適当なフィーダ一細胞 を選択して 96ゥエルプレートに添加しておく。抗体陽性ゥェルカも細胞を吸い出し、 完全培地（例： 10% FCSおよび P/S添カ卩 RMPI1640)中に 30細胞/ mLの密度となるよう に浮遊させ、フィーダ一細胞を添カ卩したゥエルプレートに O.lmL (3細胞/ゥエル)加え 、残りの細胞懸濁液を 10細胞/ mLに希釈して別のゥ ルに同様にまき（1細胞/ゥ ル )、さらに残りの細胞懸濁液を 3細胞/ mLに希釈して別のゥエルにまく（0.3細胞/ゥエル )。 目視可能なクローンが出現するまで 2〜3週間程度培養し、抗体量を測定'陽性ゥ エルを選択し、再度クローユングする。ヒト細胞の場合はクローユングが比較的困難な ので、 10細胞/ゥエルのプレートも調製しておく。通常 2回のサブクローユングでモノク ローナル抗体産生ハイプリドーマを得ることができる力 その安定性を確認するため にさらに数ケ月間定期的に再クローユングを行うことが望ましい。
[0082] ノ、イブリドーマはインビトロまたはインビボで培養することができる。
インビト口での培養法としては、上記のようにして得られるモノクローナル抗体産生 ノ、イブリドーマを、細胞密度を例えば 105〜106細胞/ mL程度に保ちながら、また、 FCS 濃度を徐々に減らしながら、ゥヱルプレートから徐々にスケールアップしていく方法が 挙げられる。
インビボでの培養法としては、例えば、腹腔内にミネラルオイルを注入して形質細 胞腫 (MOPC)を誘導したマウス (ノヽイブリドーマの親株と組織適合性のマウス）に、 5 〜10日後に 106〜107細胞程度のハイプリドーマを腹腔内注射し、 2〜5週間後に麻酔 下に腹水を採取する方法が挙げられる。
[0083] (b)モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、自体公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分 離精製法 [例:塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換 体 (例： DEAE、 QEAE)による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相ある いはプロテイン Aあるいはプロテイン Gなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、 結合を解離させて抗体を得る特異的精製法など]に従って行うことができる。
[0084] 以上のようにして、ハイプリドーマを温血動物の生体内又は生体外で培養し、その 体液または培養物から抗体を採取することによって、モノクローナル抗体を製造する ことができる。
[0085] 本発明の抗体を癌予防'治療に利用する場合、該抗体は抗腫瘍活性を持つもので なければならな!/、ので、得られたモノクローナル抗体の抗腫瘍活性の程度につ!、て 調べる必要がある。抗腫瘍活性は、抗体の存在下および非存在下における癌細胞 の増殖、アポトーシス誘導などを比較することにより測定することができる。
[0086] 好ましい一実施態様において、本発明の抗体はヒトを投与対象とする医薬品として 使用されることから、本発明の抗体 (好ましくはモノクローナル抗体）はヒトに投与した 場合に抗原性を示す危険性が低減された抗体、具体的には、完全ヒト抗体、ヒト化抗 体、マウス—ヒトキメラ抗体などであり、特に好ましくは完全ヒト抗体である。ヒト化抗体 およびキメラ抗体は、後述する方法に従って遺伝子工学的に作製することができる。 また、完全ヒト抗体は、上記したヒト—ヒト (もしくはマウス)ハイプリドーマより製造する ことも可能ではある力 大量の抗体を安定に且つ低コストで提供するためには、後述 するヒト抗体産生動物（例：マウス)またはファージディスプレイ法を用いて製造するこ とが望ましい。
[0087] (i)キメラ抗体の作製
本明細書において「キメラ抗体」とは、 H鎖および L鎖の可変領域 (Vおよび V )の
H L
配列がある哺乳動物種に由来し、定常領域 (Cおよび C )の配列が他の哺乳動物種
H L
に由来する抗体を意味する。可変領域の配列は、例えばマウス等の容易にハイプリ ドーマを作製することができる動物種由来であることが好ましぐ定常領域の配列は 投与対象となる哺乳動物種由来であることが好ましい。
[0088] キメラ抗体の作製法としては、例えば米国特許第 6,331,415号に記載される方法あ るいはそれを一部改変した方法などが挙げられる。具体的には、まず、上述のように して得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ（例えば、マウス マウスハイブリ ドーマ）から、常法に従って mRNAもしくは全 RNAを調製し、 cDNAを合成する。該 cDN Aを铸型として、適当なプライマー（例えば、センスプライマーとして Vおよび Vの各
H L
N末端配列をコードする塩基配列を含むオリゴ DNA、アンチセンスプライマーとして Cおよび Cの N末端配列をコードする塩基配列とハイブリダィズするオリゴ DNA (例
H L
えば Bio/Technology, 9: 88-89， 1991参照））を用い、常法に従って PCRで Vおよび V
H
をコードする DNAを増幅 '精製する。同様の方法により、他の哺乳動物 (例:ヒト）のリ し
ンパ球等より調製した RNAから RT- PCRにより Cおよび Cをコードする DNAを増幅'
H L
精製する。常法を用いて Vと C、 Vと Cをそれぞれ連結し、得られたキメラ H鎖 DNA
H H L L
およびキメラ L鎖 DNAを、それぞれ適当な発現ベクター（例えば、 CHO細胞、 COS細 胞、マウス骨髄腫細胞等で転写活性を有するプロモーター（例： CMVプロモーター、 SV40プロモーター等）を含むベクターなど）に挿入する。両鎖をコードする DNAは別 個のベクターに挿入してもよいし、 1個のベクターにタンデムに挿入してもよい。得ら れたキメラ H鎖およびキメラ L鎖発現ベクターで宿主細胞を形質転換する。宿主細胞 としては、動物細胞、例えば上記したマウス骨髄腫細胞の他、チャイニーズハムスタ 一卵巣（CHO)細胞、サル由来の COS-7細胞、 Vero細胞、ラット由来の GHS細胞など が挙げられる。形質転換は動物細胞に適用可能ないかなる方法を用いてもよいが、 好ましくはエレクト口ポレーシヨン法などが挙げられる。宿主細胞に適した培地中で一 定期間培養後、培養上清を回収して上記と同様の方法で精製することにより、キメラ モノクローナル抗体を単離することができる。あるいは、宿主細胞としてゥシ、ャギ、二 ヮトリ等のトランスジヱニック技術が確立し、且つ家畜（家禽）として大量繁殖のノウハ ゥが蓄積されている動物の生殖系列細胞を用い、常法によってトランスジヱニック動 物を作製することにより、得られる動物の乳汁もしくは卵から容易に且つ大量にキメラ モノクローナル抗体を得ることもできる。さらに、トウモロコシ、イネ、コムギ、ダイズ、タ ノ コなどのトランスジエニック技術が確立し、且つ主要作物として大量に栽培されてい る植物細胞を宿主細胞として、プロトプラストへのマイクロインジェクションやエレクト口 ポレーシヨン、無傷細胞へのパーティクルガン法や Ήベクター法などを用いてトランス ジェニック植物を作製し、得られる種子や葉などカゝら大量にキメラモノクローナル抗体 を得ることも可會である。
得られたキメラモノクローナル抗体をパパインで分解すれば Fab力 ペプシンで分解 すれば F(ab')がそれぞれ得られる。
2
[0089] また、マウス Vおよび Vをコードする DNAを適当なリンカ一、例えば 1
H L 〜40アミノ酸、 好ましくは 3〜30アミノ酸、より好ましくは 5〜20アミノ酸力 なるペプチド（例： [Ser-(Gly )m]nもしくは [(Gly)m- Ser]n (mは 0〜10の整数、 nは 1〜5の整数）等）をコードする DNA を介して連結することにより scFvとすることができ、さらに C をコードする DNAを適当
H3
なリンカ一を介して連結することにより minidodyモノマーとしたり、 C全長をコードする
H
DNAを適当なリンカ一を介して連結することにより scFv-Fcとすることもできる。このよう な遺伝子工学的に修飾 (共役)された抗体分子をコードする DNAは、適当なプロモー ターの制御下におくことにより大腸菌や酵母などの微生物で発現させることができ、 大量に抗体分子を生産することができる。
[0090] マウス Vおよび Vをコードする DNAを 1つのプロモーターの下流にタンデムに挿入
H L
して大腸菌に導入すると、モノシストロニックな遺伝子発現により Fvと呼ばれる二量体 を形成する。また、分子モデリングを用いて Vおよび Vの FR中の適当なアミノ酸を Cy
H L
sに置換すると、両鎖の分子間ジスルフイド結合により dsFvと呼ばれる二量体が形成さ れる。
[0091] (ii)ヒト化抗体
本明細書にぉ 、て「ヒト化抗体」とは、可変領域に存在する相補性決定領域 (CDR) 以外のすべての領域 (即ち、定常領域および可変領域中のフレームワーク領域 (FR) )の配列がヒト由来であり、 CDRの配列のみが他の哺乳動物種由来である抗体を意 味する。他の哺乳動物種としては、例えばマウス等の容易にハイプリドーマを作製す ることができる動物種が好ま 、。
ヒト化抗体の作製法としては、例えば米国特許第 5,225,539号、第 5,585,089号、第 5 ,693,761号および第 5,693,762号に記載される方法あるいはそれらを一部改変した方 法などが挙げられる。具体的には、上記キメラ抗体の場合と同様にして、ヒト以外の哺 乳動物種 (例：マウス）由来の Vおよび Vをコードする DNAを単離した後、常法により
H L
自動 DNAシークェンサ一（例： Applied Biosystems社製等）を用いてシークェンスを行 V、、得られる塩基配列もしくはそこ力 推定されるアミノ酸配列を公知の抗体配列デ ~~タへ. ~"ス [f列 は、 Kabat database (Kabatら,「Sequences of Proteins of Immunologi cal InterestJ , US Department of Health and Human Services, Public Health Service, NIH編，第 5版， 1991参照）等]を用いて解析し、両鎖の CDRおよび FRを決定する。 決定された FR配列に類似した FR配列を有するヒト抗体の L鎖および H鎖をコードす る塩基配列 [例：ヒト κ型 L鎖サブグループ Iおよびヒト H鎖サブグループ IIもしくは III ( Kabatら， 1991 (上述）を参照）]の CDRコード領域を、決定された異種 CDRをコードす る塩基配列で置換した塩基配列を設計し、該塩基配列を 20〜40塩基程度のフラグメ ントに区分し、さらに該塩基配列に相補的な配列を、前記フラグメントと交互にオーバ 一ラップするように 20〜40塩基程度のフラグメントに区分する。各フラグメントを DNAシ ンセサイザ一を用いて合成し、常法に従ってこれらをハイブリダィズおよびライゲート させることにより、ヒト由来の FRと他の哺乳動物種由来の CDRを有する Vおよび Vを
H L
コードする DNAを構築することができる。より迅速かつ効率的に他の哺乳動物種由来 CDRをヒト由来 Vおよび Vに移植するには、 PCRによる部位特異的変異誘発を用い
H L
ることが好ましい。そのような方法としては、例えば特開平 5-227970号公報に記載の 逐次 CDR移植法等が挙げられる。このよう〖こして得られる Vおよび Vをコードする DN
H L
Aを、上記キメラ抗体の場合と同様の方法でヒト由来の Cおよび Cをコードする DNA
H L
とそれぞれ連結して適当な宿主細胞に導入することにより、ヒトイ匕抗体を産生する細 胞あるいはトランスジエニック動植物を得ることができる。 [0092] ヒト化抗体もキメラ抗体と同様に遺伝子工学的手法を用いて scFv、 scFv-Fc, minibo dy、 dsFv、 Fvなどに改変することができ、適当なプロモーターを用いることで大腸菌 や酵母などの微生物でも生産させることができる。
ヒト化抗体作製技術は、例えばハイプリドーマの作製技術が確立して 、な 、他の動 物種に好ましく投与し得るモノクローナル抗体を作製するのにも応用することができる 。例えば、ゥシ、ブタ、ヒッジ、ャギ、 -ヮトリなどの家畜（家禽）として広く繁殖されてい る動物やィヌゃネコなどのペット動物などが対象として挙げられる。
[0093] (iii)ヒト抗体産生動物を用いた完全ヒト抗体の作製
内因性免疫グロブリン (Ig)遺伝子をノックアウト（KO)した非ヒト温血動物に機能的 なヒ Hg遺伝子を導入し、これを抗原で免疫すれば、該動物由来の抗体の代わりにヒ ト抗体が産生される。従って、マウス等のようにハイプリドーマ作製技術が確立してい る動物を用いれば、従来のマウスモノクローナル抗体の作製と同様の方法によって 完全ヒトモノクローナル抗体を取得することが可能となる。まず、ヒト Igの H鎖および L 鎖のミニ遺伝子を通常のトランスジエニック (Tg)技術を用いて導入したマウスと、内因 性マウス Ig遺伝子を通常の KO技術を用いて不活性ィ匕したマウスとを交配して得られ たヒト抗体産生マウス（Immunol. Today, 17: 391-397, 1996を参照）を用いて作製され たヒトモノクローナル抗体のいくつかは既に臨床段階にあり、現在までのところ抗ヒ Hg ヒト抗体 (HAHA)の産生は報告されて!、な!/、。
[0094] その後、 Abgenix社 [商品名：XenoMouose (Nat. Genet., 15: 146-156, 1997;米国 特許第 5, 939,598号等を参照）]や Medarex社 [商品名： Hu- Mab Mouse (Nat. Biotech nol., 14: 845-851, 1996;米国特許第 5,545,806号等を参照）]が酵母人工染色体 (Y AC)ベクターを用いてより大きなヒ Hg遺伝子を導入した Tgマウスを作製し、よりレバー トリーに富んだヒト抗体を産生し得るようになった。し力しながら、ヒ Hg遺伝子は、例え ば H鎖の場合、約 80種の V断片、約 30種の D断片および 6種の J断片が様々に組み 合わされた VDJェクソンが抗原結合部位をコードすることによりその多様性を実現し ているため、その全長は H鎖が約 1.5Mb (14番染色体）、 K L鎖が約 2Mb (2番染色体 ) , 鎖が約 1Mb (22番染色体）に達する。ヒトにおけるのと同様の多様な抗体レパ 一トリーを他の動物種で再現するためには、各 Ig遺伝子の全長を導入することが望ま しいが、従来の遺伝子導入ベクター（プラスミド、コスミド、 BAC、 YAC等）に挿入可能 な DNAは通常数 kb〜数百 kbであり、クローユングした DNAを受精卵に注入する従来 のトランスジヱニック動物作製技術では全長の導入は困難であった。
[0095] Tomizukaら（Nat. Genet., 16: 133-143, 1997)は、 Ig遺伝子を担持するヒト染色体の 自然断片 (hCF)をマウスに導入して (染色体導入 (TC)マウス)、完全長ヒ Hg遺伝子 を有するマウスを作製した。即ち、まず、 H鎖遺伝子を含む 14番染色体および κ L鎖 遺伝子を含む 2番染色体を例えば薬剤耐性マーカー等で標識したヒト染色体を有す るヒトーマウスハイブリッド細胞を 48時間程度紡錘糸形成阻害剤（例：コルセミド)で処 理して、 1〜数本の染色体もしくはその断片が核膜に被包されたミクロセルを調製し、 微小核融合法によりマウス ES細胞に染色体を導入する。薬剤を含む培地を用いてヒ Hg遺伝子を有する染色体もしくはその断片を保持するハイブリッド ES細胞を選択し、 通常の KOマウス作製の場合と同様の方法によりマウス胚へ顕微注入する。得られる キメラマウス力 コートカラーを指標にする等して生殖系列キメラを選択し、ヒト 14番染 色体断片を伝達する TCマウス系統 (TC(hCF14))およびヒト 2番染色体断片を伝達す る TCマウス系統 (TC(hCF2))を榭立する。常法により内因性 H鎖遺伝子および κ L鎖 遺伝子を KOされたマウス（KO(IgH)およ
び KO(Ig K ))を作製し、これら 4系統の交配を繰り返すことにより、 4種の遺伝子改変 をすベて有するマウス系統 (ダブル TC/KO)を榭立することができる。
上記のようにして作製されるダブル TC/KOマウスに、通常のマウスモノクローナル 抗体を作製する場合と同様の方法を適用すれば、抗原特異的ヒトモノクローナル抗 体産生ハイプリドーマを作製することができる。しかしながら、 K L鎖遺伝子を含む hC F2がマウス細胞内で不安定なため、ハイプリドーマ取得効率は通常のマウスの場合 に比べて低 、と 、う欠点がある。
[0096] 一方、前記 Hu-Mab Mouseは κ L鎖遺伝子の約 50%を含むが、可変領域クラスター が倍加した構造を有するため完全長を含む場合と同等の κ鎖の多様性を示し (他方 、 H鎖遺伝子は約 10%しカゝ含まないので H鎖の多様性は低ぐ抗原に対する応答性 が不十分である）、且つ YACベクター (Ig κ -YAC)によりマウス染色体中に挿入され ているので、マウス細胞内で安定に保持される。この利点を生かし、 TC(hCF14)マウ スと Hu-Mab Mouseとを交配して hCF14と Ig κ -YACとを安定に保持するマウス（商品 名： KMマウス）を作製することにより、通常のマウスと同等のハイプリドーマ取得効率 および抗体の抗原親和性を得ることができる。
[0097] さらに、より完全にヒトにおける多様な抗体レパートリーを再現するために、 鎖遺 伝子をさらに導入したヒト抗体産生動物を作製することもできる。かかる動物は、上記 と同様の方法で 鎖遺伝子を担持するヒト 22番染色体もしくはその断片を導入した TCマウス（TC(hCF22))を作製し、これと上記ダブル TC/KOマウスや KMマウスとを交 配すること〖こより得ることもできるし、あるいは、例えば H鎖遺伝子座と 鎖遺伝子 座とを含むヒト人工染色体 (HAC)を構築してマウス細胞に導入することにより得ること もできる（Nat. BiotechnoL , 18: 1086-1090, 2000) 0
[0098] 本発明の抗体を医薬品として利用する場合はモノクローナル抗体であることが望ま しいが、ポリクローナル抗体であってもよい。本発明の抗体がポリクローナル抗体であ る場合には、ハイプリドーマの利用を要しないので、ハイプリドーマ作製技術は確立 されて ヽな 、がトランスジ ニック技術は確立されて 、る動物種、好ましくはゥシ等の 有蹄動物を用いて、上記と同様の方法によりヒト抗体産生動物を作製すれば、より大 量のヒト抗体を安価に製造することも可能である（例えば、 Nat. BiotechnoL , 20: 889- 894, 2002参照）。得られるヒトポリクローナル抗体は、ヒト抗体産生動物の血液、腹水 、乳汁、卵など、好ましくは乳汁、卵を採取し、上記と同様の精製技術を組み合わせ ること〖こよって精製することができる。
[0099] (iv)ファージディスプレイヒト抗体ライブラリーを用いた完全ヒト抗体の作製
完全ヒト抗体を作製するもう 1つのアプローチはファージディスプレイを用いる方法 である。この方法は PCRによる変異が CDR以外に導入される場合があり、そのため臨 床段階で少数の HAHA産生の報告例がある力 その一方で宿主動物に由来する異 種間ウィルス感染の危険性がな!、点や抗体の特異性が無限である（禁止クローンや 糖鎖などに対する抗体も容易に作製可能)等の利点を有して！/、る。
[0100] ファージディスプレイヒト抗体ライブラリーの作製方法としては、例えば、以下のもの が挙げられるが、これに限定されない。
用いられるファージは特に限定されな 、が、通常繊維状ファージ (Ffパクテリオファ ージ）が好ましく用いられる。ファージ表面に外来蛋白質を提示する方法としては、 g3 p、 g6p〜g9pのコート蛋白質のいずれかとの融合蛋白質として該コート蛋白質上で発 現 ·提示させる方法が挙げられるが、よく用 、られるのは g3pもしくは g8pの N末端側に 融合させる方法である。ファージディスプレイベクターとしては、 1)ファージゲノムのコ ート蛋白質遺伝子に外来遺伝子を融合した形で導入して、ファージ表面上に提示さ れるコート蛋白質をすベて外来蛋白質との融合蛋白質として提示させるものの他、 2) 融合蛋白質をコードする遺伝子を野生型コート蛋白質遺伝子とは別に挿入して、融 合蛋白質と野生型コート蛋白質とを同時に発現させるものや、 3)融合蛋白質をコード する遺伝子を有するファージミドベクターを持つ大腸菌に野生型コート蛋白質遺伝 子を有するヘルパーファージを感染させて融合蛋白質と野生型コート蛋白質とを同 時に発現するファージ粒子を産生させるものなどが挙げられるが、 1)の場合は大きな 外来蛋白質を融合させると感染能力が失われるため、抗体ライブラリーの作製のため には 2)または 3)のタイプが用いられる。
具体的なベクターとしては、 Holtら（Curr. Opin. BiotechnoL, 11: 445-449, 2000)に 記載されるものが例示される。例えば、 pCESl (J. Biol. Chem., 274: 18218-18230, 19 99参照）は、 1つのラタトースプロモーターの制御下に g3pのシグナルペプチドの下流 に κ L鎖定常領域をコードする DNAと g3pシグナルペプチドの下流に CH3をコードす る DNA、 His-tag、 c-myc tag,アンバー終止コドン (TAG)を介して g3pコード配列とが 配置された Fab発現型ファージミドベクターである。アンバー変異を有する大腸菌に 導入すると g3pコート蛋白質上に Fabを提示するが、アンバー変異を持たな ヽ HB2151 株などで発現させると可溶性 Fab抗体を産生する。また、 scFv発現型ファージミドベタ ターとしては、例えば pHENl (J. Mol. Biol, 222:581-597, 1991)等が用いられる。 一方、ヘルパーファージとしては、例えば M13-K07、 VCSM13等が挙げられる。 また、別のファージディスプレイベクターとして、抗体遺伝子の 3'末端とコート蛋白 質遺伝子の 5'末端にそれぞれシスティンをコードするコドンを含む配列を連結し、両 遺伝子を同時に別個に (融合蛋白質としてではなく）発現させて、導入されたシスティ ン残基同士による S-S結合を介してファージ表面のコート蛋白質上に抗体を提示し得 るようにデザインされたもの（Morphosys社の CysDisplay™技術）等も挙げられる。 ヒト抗体ライブラリーの種類としては、ナイーブ Z非免疫ライブラリー、合成ライブラリ 一、免疫ライブラリ一等が挙げられる。
ナイーブ Z非免疫（non- immunized)ライブラリ一は、正常なヒトが保有する Vおよび
H
V遺伝子を RT-PCRにより取得し、それらをランダムに上記のファージディスプレイべ し
クタ一にクロー-ングして得られるライブラリーである。通常、正常人の末梢血、骨髄
、扁桃腺などのリンパ球由来の mRNA等が铸型として用いられる。疾病履歴などの V 遺伝子のバイアスをなくすため、抗原感作によるクラススィッチが起こっていない IgM 由来の mRNAのみを増幅したものを特にナイーブライブラリーと呼んでいる。代表的 なものとしては、 CAT社のライブラリー（J. Mol. Biol, 222: 581-597, 1991; Nat. Biote chnol, 14: 309-314, 1996参照）、 MRC社のライブラリー（Annu. Rev. Immunol, 12: 4 33-455, 1994参照）、 Dyax社のライブラリー（J. Biol. Chem., 1999 (上述)； Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 14: 7969-7974, 2000参照）等が挙げられる。
合成ライブラリ一は、ヒト B細胞内の機能的な特定の抗体遺伝子を選び、 V遺伝子 断片の、例えば CDR3等の抗原結合領域の部分を適当な長さのランダムなアミノ酸配 列をコードする DNAで置換し、ライブラリー化したものである。最初から機能的な scFv や Fabを産生する Vおよび V遺伝子の組み合わせでライブライリーを構築できるので
H L
、抗体の発現効率や安定性に優れているとされる。代表的なものとしては、 Morphosy s社の HuCALライブラリー（J. Mol. Biol, 296: 57-86, 2000参照）、 Biolnvent社のライ ブラリー（Nat. BiotechnoL, 18: 852, 2000参照）、 Crucell社のライブラリー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 3938, 1995; J. Immunol. Methods, 272: 219-233, 2003参照） 等が挙げられる。
免疫 (immunized)ライブラリ一は、癌、自己免疫疾患、感染症等の患者やワクチン 接種を受けた者など、標的抗原に対する血中抗体価が上昇したヒトから採取したリン パ球、あるいは上記体外免疫法により標的抗原を人為的に免疫したヒトリンパ球等か ら、上記ナイーブ Z非免疫ライブラリーの場合と同様にして mRNAを調製し、 RT-PCR 法によって Vおよび V遺伝子を増幅し、ライブラリー化したものである。最初から目的
H L
の抗体遺伝子がライブラリ一中に含まれるので、比較的小さなサイズのライブラリーか らでも目的の抗体を得ることができる。 [0103] ライブラリーの多様性は大きいほどよいが、現実的には、以下のパンユング操作で 取り扱えるファージ数（10u〜1013ファージ）と通常のパンユングでクローンの単離およ び増幅に必要なファージ数（100〜1,000ファージ/クローン）を考慮すれば、 108〜10 11クローン程度が適当であり、約 108クローンのライブラリーで通常 10— 9オーダーの Kd 値を有する抗体をスクリーニングすることができる。
[0104] 標的抗原に対する抗体をファージディスプレイ法で選別する工程をパンユングと!ヽ う。具体的には、例えば、抗原を固定ィ匕した担体とファージライブラリーとを接触させ 、非結合ファージを洗浄除去した後、結合したファージを担体力 溶出させ、大腸菌 に感染させて該ファージを増殖させる、 t ヽぅ一連の操作を 3〜5回程度繰り返すこと により抗原特異的な抗体を提示するファージを濃縮する。抗原を固定化する担体とし ては、通常の抗原抗体反応やァフィユティークロマトグラフィーで用いられる各種担 体、例えばァガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、 ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス、金属など力もなるマイクロ プレート、チューブ、メンブレン、カラム、ビーズなど、さらには表面プラス、モン共鳴 (S PR)のセンサーチップなどが挙げられる。抗原の固定ィ匕には物理的吸着を用いても よぐまた、通常蛋白質あるいは酵素等を不溶化、固定ィ匕するのに用いられる化学結 合を用いる方法でもよい。例えばピオチン （ストレブト)アビジン系等が好ましく用い られる。標的抗原である内因性リガンドがペプチドなどの小分子である場合には、抗 原決定基として用いた部分が担体との結合により被覆されな 、ように特に注意する必 要がある。非結合ファージの洗浄には、 BSA溶液などのブロッキング液（1-2回）、 Twe en等の界面活性剤を含む PBS (3-5回）などを順次用いることができる。クェン酸緩衝 液 (pH5)などの使用が好ましいとの報告もある。特異的ファージの溶出には、通常酸 (例： 0.1M塩酸など）が用いられるが、特異的プロテアーゼによる切断 (例えば、抗体 遺伝子とコート蛋白質遺伝子との連結部にトリプシン切断部位をコードする遺伝子配 列を導入することができる。この場合、溶出するファージ表面には野生型コート蛋白 質が提示されるので、コート蛋白質のすべてが融合蛋白質として発現しても大腸菌 への感染 ·増殖が可能となる）や可溶性抗原による競合的溶出、あるいは S-S結合の 還元（例えば、前記した CysDisplay™では、パンニングの後、適当な還元剤を用いて 抗体とコート蛋白質とを解離させることにより抗原特異的ファージを回収することがで きる）による溶出も可能である。酸で溶出した場合は、トリスなどで中和した後で溶出 ファージを大腸菌に感染させ、培養後、常法によりファージを回収する。
[0105] パンユングにより抗原特異的抗体を提示するファージが濃縮されると、これらを大腸 菌に感染させた後プレート上に播種してクローユングを行う。再度ファージを回収し、 上述の抗体価測定法 (例： ELISA、 RIA、 FIA等）や FACSあるいは SPRを利用した測定 により抗原結合活性を確認する。
[0106] 選択された抗原特異的抗体を提示するファージクローン力 の抗体の単離'精製は 、例えば、ファージディスプレイベクターとして抗体遺伝子とコート蛋白質遺伝子の連 結部にアンバー終止コドンが導入されたベクターを用いる場合には、該ファージをァ ンバー変異を持たない大腸菌 (例: HB2151株）に感染させると、可溶性抗体分子が 産生されペリブラズムもしくは培地中に分泌されるので、細胞壁をリゾチームなどで溶 解して細胞外画分を回収し、上記と同様の精製技術を用いて行うことができる。 His-t agや c-myc tagを導入しておけば、 IMACゃ抗 c-myc抗体カラムなどを用いて容易に 精製することができる。また、
パン-ングの際に特異的プロテアーゼによる切断を利用する場合には、該プロテア ーゼを作用させると抗体分子がファージ表面から分離されるので、同様の精製操作 を実施することにより目的の抗体を精製することができる。
[0107] ヒト抗体産生動物およびファージディスプレイヒト抗体ライブラリーを用いた完全ヒト 抗体作製技術は、他の動物種のモノクローナル抗体を作製するのにも応用すること ができる。例えば、ゥシ、ブタ、ヒッジ、ャギ、 -ヮトリなどの家畜（家禽）として広く繁殖 されて ヽる動物やィヌゃネコなどのペット動物などが対象として挙げられる。非ヒト動 物においては標的抗原の人為的免疫に対する倫理的問題が少ないので、免疫ライ ブラリーの利用がより有効である。
[0108] (3)ポリクローナル抗体の作製
本発明のポリクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じる方法に従って 製造することができる。例えば、免疫抗原 (蛋白質もしくはペプチド抗原）自体、ある Vヽはそれとキャリアー蛋白質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造 法と同様に温血動物に免疫を行い、該免疫動物力 LTBP-1L蛋白質に対する抗体 含有物を採取して、抗体の分離精製を行うことにより製造することができる。
[0109] 温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体に 関し、キャリアー蛋白質の種類およびキャリアー蛋白質とハプテンとの混合比は、キヤ リア一蛋白質に架橋させて免疫したノヽプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの ようなものをどのような比率で架橋させてもよいが、例えば、ゥシ血清アルブミンゃゥシ サイログロブリン、へモシァニン等を重量比でハプテン 1に対し、約 0.1〜約 20、好まし くは約 1〜約 5の割合でカプルさせる方法が用いられる。
[0110] また、ハプテンとキャリアー蛋白質の力プリングには、種々の縮合剤を用いることが できるが、ダルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基 、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担 体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイ ントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約 1 〜約 6週毎に 1回ずつ、計約 2〜約 10回程度行われる。
[0111] ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水など、好ま しくは血液力 採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同 様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体 の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行うことができる。
[0112] 目的の核酸の標的領域と相補的な塩基配列を含む核酸、即ち、 目的の核酸とハイ ブリダィズすることができる核酸は、該目的核酸に対して「アンチセンス」であるという ことができる。
ヒト LTBP-1L蛋白質をコードする核酸 (例、 DNA (以下、アンチセンス核酸の説明 においては、ヒト LTBP-1Lをコードする DNAを本発明の DNAと略記する場合がある) )の塩基配列に、相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有す るアンチセンス核酸としては、ヒト LTBP-1Lをコードする核酸（例、 DNA)の塩基配列 に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有し、該核酸の発 現を抑制し得る作用を有するものであれば、 、ずれのアンチセンス核酸であってもよ い。
[0113] 本発明の DNAに実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、本発明の DNAに相 補的な塩基配列 (すなわち、本発明の DNAの相補鎖)の塩基配列と、オーバーラッ プする領域に関して、約 80%以上、好ましくは約 90%以上、より好ましくは約 95%以 上の相同性を有する塩基配列である。ここで「相同性」とは、前記した本発明の DNA の場合と同義である。特に、本発明の DNAの相補鎖の全塩基配列のうち、（a)翻訳 阻害を指向したアンチセンス核酸の場合は、 LTBP-1L蛋白質の Ν末端部位をコード する部分の塩基配列 (例えば、開始コドン付近の塩基配列など)の相補鎖と約 80% 以上、好ましくは約 90%以上、より好ましくは約 95%以上の相同性を有するアンチセ ンス核酸が、（b) RNaseHによる RNA分解を指向するアンチセンス核酸の場合は、ィ ントロンを含む本発明の DNAの全塩基配列の相補鎖と約 80%以上、好ましくは約 90 %以上、より好ましくは約 95%以上の相同性を有するアンチセンス核酸がそれぞれ 好適である。
[0114] 具体的には、配列番号 : 2で表わされる塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的 な塩基配列、またはその一部を含むアンチセンス核酸、好ましくは、例えば、配列番 号： 2で表わされる塩基配列に相補的な塩基配列またはその一部を含むアンチセン ス核酸などが挙げられる。
[0115] 本発明の DNAの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはそ の一部を有するアンチセンス核酸 (以下、本発明のアンチセンス核酸ともいう）は、ク ローンィ匕した、あるいは決定された LTBP-1Lをコードする DNAの塩基配列情報に基 づき設計し、合成しうる。力かるアンチセンス核酸は、 LTBP-1L遺伝子の複製または 発現を阻害することができる。即ち、本発明のアンチセンス核酸は、 LTBP-1L遺伝子 カゝら転写される RNA (mRNAまたは初期転写産物）とハイブリダィズすることができ、 mRNAの合成 (プロセッシング)または機能（蛋白質への翻訳）を阻害することができ る。
[0116] 本発明のアンチセンス核酸の標的領域は、アンチセンス核酸がハイブリダィズする ことにより、結果として LTBP-1L蛋白質への翻訳が阻害されるものであればその長さ に特に制限はなぐ該蛋白質をコードする mRNAの全配列であっても部分配列であ つてもよく、短いもので約 10塩基程度、長いもので mRNAまたは初期転写産物の全 配列が挙げられる。合成の容易さや抗原性の問題を考慮すれば、約 10〜約 40塩基、 特に約 15〜約 30塩基力 なるオリゴヌクレオチドが好ましいが、それに限定されない 。具体的には、 LTBP-1L遺伝子の 5，端ヘアピンループ、 5，端 6-ベースペア'リピート 、 5'端非翻訳領域、翻訳開始コドン、蛋白質コード領域、 ORF翻訳終止コドン、 3'端 非翻訳領域、 3'端パリンドローム領域または 3'端ヘアピンループなどが、アンチセン ス核酸の好まし 、標的領域として選択しうる力 LTBP-1L遺伝子内の如何なる領域も 対象として選択しうる。例えば、該遺伝子のイントロン部分を標的領域とすることもでき る。
さらに、本発明のアンチセンス核酸は、 LTBP-1Lの mRNAもしくは初期転写産物と ハイブリダィズして蛋白質への翻訳を阻害するだけでなぐ二本鎖 DNAである LTBP -1L遺伝子と結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、 RNAの転写を阻害し得るも のであってもよい。あるいは DNA:RNAノヽイブリツドを形成して RNaseHによる分解を 誘導するものであってもよ 、。
[0117] ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンス核酸を構 成する各ヌクレオチドのリン酸残基 (ホスフェート）は、例えば、ホスホロチォエート、メ チルホスホネート、ホスホロジチォネートなどの化学修飾リン酸残基に置換されて ヽ てもよい。また、各ヌクレオチドの糖 (デォキシリボース）は、 2，一O—メチルイ匕などの 化学修飾糖構造に置換されていてもよいし、塩基部分 (ピリミジン、プリン)も化学修 飾を受けたものであってもよぐ配列番号： 2で表わされる塩基配列を有する DNAに ハイブリダィズするものであれば 、ずれのものでもよ 、。
[0118] アンチセンス核酸は、 2 デォキシ D リボースを含有しているポリヌクレオチド、 D リボースを含有しているポリヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基の N グリコ シドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、非ヌクレオチド骨格を有するその他の ポリマー（例えば、市販の蛋白質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー）または 特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーは DNAや RNA中に見出 されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含 有する）などが挙げられる。それらは、 2本鎖 DNA、 1本鎖 DNA、 2本鎖 RNA、 1本 鎖 RNA、 DNA:RNAノヽイブリツドであってもよぐさらに非修飾ポリヌクレオチド（また は非修飾オリゴヌクレオチド）、公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知 られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチルイ匕されたもの、 1個以上の天然 のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例え ば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、 力ルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合 (例、ホスホロ チォエート、ホスホロジチォエートなど）を持つもの、例えば蛋白質 (例、ヌクレアーゼ 、ヌクレアーゼ 'インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ L—リジンなど )や糖 (例、モノサッカライドなど)などの側鎖基を有しているもの、インターカレントイ匕 合物（例、アタリジン、ソラレンなど）を持つもの、キレートイ匕合物（例えば、金属、放射 活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有 するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、 αァノマー型の核酸など）であっても よい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリンおよびピリミジン 塩基を含有するのみでなぐ修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含 んでいて良い。このような修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、ァシル化 されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。修 飾されたヌクレオシドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよ ぐ例えば、 1個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されていたり、ま たはエーテル、ァミンなどの官能基に変換されて！ヽてよ!/、。
本発明のアンチセンス核酸は、 RNA、 DNAまたは修飾された核酸 (RNA、 DNA) である。修飾された核酸の具体例としては、核酸の硫黄誘導体、チォホスフェート誘 導体、ポリヌクレオシドアミドゃオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものなどが 挙げられる。本発明のアンチセンス核酸は、例えば、以下のように設計されうる。すな わち、細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにする、アンチセンス核酸の細 胞透過性をより高める、 目標とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、 また、もし毒性があるような場合はアンチセンス核酸の毒性をより小さなものにする。こ のような修飾は、例えば Pharm Tech Japan, 8卷， 247頁または 395頁， 1992年、 Antise nse Research and Applications, CRC Press, 1993年などで数多く報告されている。
[0120] 本発明のアンチセンス核酸は、変化せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合を 含有していて良ぐリボゾーム、ミクロスフエアのような特殊な形態で供与されたり、遺 伝子治療により適用されたり、付加された形態で与えられることができうる。こうして付 加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジ ンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せ しめるような脂質 (例、ホスホリピド、コレステロールなど）などの疎水性のものが挙げら れる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体 (例、コレステリ ルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の 3'端または 5 '端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させるこ とができうる。その他の基としては、核酸の 3'端または 5'端に特異的に配置されたキ ヤップ用の基で、ェキソヌクレアーゼ、 RNaseなどのヌクレアーゼによる分解を阻止す るためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、 テトラエチレンダリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基 の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
[0121] LTBP-1Lをコードする mRNAもしくは初期転写産物を、コード領域の内部（初期転 写産物の場合はイントロン部分を含む)で特異的に切断し得るリボザィムもまた、本発 明のアンチセンス核酸に包含され得る。「リボザィム」とは核酸を切断する酵素活性を 有する RNAを 、うが、最近では当該酵素活性部位の塩基配列を有するオリゴ DNA も同様に核酸切断活性を有することが明らかになっているので、本明細書では配列 特異的な核酸切断活性を有する限り DNAをも包含する概念として用いるものとする 。リボザィムとして最も汎用性の高いものとしては、ウイロイドやウィルソイド等の感染 性 RNAに見られるセルフスプライシング RNAがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型 等が知られている。ハンマーヘッド型は約 40塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマ 一ヘッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ (合わせて約 10塩基程度)を mRNAの所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、標的 mRNAのみを特 異的に切断することが可能である。このタイプのリボザィムは、 RNAのみを基質とす るので、ゲノム DNAを攻撃することがないというさらなる利点を有する。 LTBP-1L mR NAが自身で二本鎖構造をとる場合には、 RNAヘリカーゼと特異的に結合し得るゥ ィルス核酸由来の RNAモチーフを連結したノ、イブリツドリボザィムを用いることにより 、標的配列を一本鎖にすることができる [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98(10): 5572-5 577 (2001)]。さら〖こ、リボザィムを、それをコードする DNAを含む発現ベクターの形 態で使用する場合には、転写産物の細胞質への移行を促進するために、 tRNAを 改変した配列をさらに連結したハイブリッドリボザィムとすることもできる [Nucleic Acids Res., 29(13): 2780-2788 (2001)]。
[0122] 本明細書においては、 LTBP-1Lの mRNAもしくは初期転写産物のコード領域内の 部分配列 (初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）に相補的なオリゴ RNAとそ の相補鎖とからなる二本鎖 RNA、いわゆる siRNAもまた、本発明のアンチセンス核 酸に包含されるものとして定義される。短い二本鎖 RNAを細胞内に導入するとその RNAに相補的な mRNAが分解される、いわゆる RNA干渉 (RNAi)と呼ばれる現象 は、以前から線虫、昆虫、植物等で知られていた力 この現象が動物細胞でも広く起 こることが確認されて以来 [Nature, 411(6836): 494-498 (2001)]、リボザィムの代替技 術として汎用されて 、る。 siRNAは標的となる mRNAの塩基配列情報に基づ 、て、 市販のソフトウェア（例： RNAi Designer; Invitrogen)を用いて適宜設計することができ る。
[0123] 本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド及びリボザィムは、 LTBP-1Lの cDNA配 列もしくはゲノミック DNA配列に基づ 、て mRNAもしくは初期転写産物の標的配列 を決定し、市販の DNAZRNA自動合成機（アプライド 'バイオシステムズ社、ベック マン社等)を用いて、これに相補的な配列を合成することにより調製することができる 。 siRNAは、センス鎖及びアンチセンス鎖を DNAZRNA自動合成機でそれぞれ合 成し、適当なアニーリング緩衝液中、約 90〜約 95°Cで約 1分程度変性させた後、約 30 〜約 70°Cで約 1〜約 8時間アニーリングさせることにより調製することができる。また、 相補的なオリゴヌクレオチド鎖を交互にオーバーラップするように合成して、これらを アニーリングさせた後リガーゼでライゲーシヨンすることにより、より長い二本鎖ポリヌク レオチドを調製することもできる。あるいは、 siRNAは、センス鎖およびアンチセンス 鎖を適当な長さ（例えば約 3〜約 10塩基）のリンカ一を介して連結した RNA(shRNA )として合成し、導入する動物細胞内の酵素ダイサー（dicer)などによってプロセシン グされるように設計することもできる。さらには、センス鎖およびアンチセンス鎖をコー ドする DNAがそれぞれ別個の U6や HIなどの Pol III系プロモーターの制御下にお かれた発現ベクター、ある 、は上記センス鎖とアンチセンス鎖とをリンカ一を介して連 結した RNA鎖をコードする DNA力 Pol III系プロモーターの制御下におかれた発現 ベクターとして調製し、動物細胞内で発現させ、 siRNAを形成させてもよい。
[0124] 本発明のアンチセンス核酸の阻害活性は、 LTBP-1L遺伝子を導入した形質転換 体、生体内や生体外の LTBP-1L遺伝子発現系、または生体内や生体外の LTBP-1L 蛋白質翻訳系を用いて調べることができる。
[0125] 以下に、上述の本発明の抗体、および本発明のアンチセンス核酸の用途を説明す る。
(1)本発明の抗体を含有する医薬
LTBP-1L蛋白質は予後不良の癌患者組織で発現が増加しており、特にステージの 進んだ癌における直接的もしくは間接的な増悪因子であると考えられる。本発明の 抗体は、 LTBP-1L蛋白質の活性を中和することができるため、癌 (好ましくは、卵巣 癌、子宮頸癌、子宮体癌、胃癌、大腸癌、肺癌、その他の固形癌 (例えば、肝臓癌、 脾臓癌、胆嚢癌、腎臓癌等)、より好ましくは卵巣癌、子宮頸癌、子宮体癌、胃癌、大 腸癌および肺癌、特に好ましくは卵巣癌、子宮体癌および肺癌)の治療剤として使用 することができる。
本発明の抗体を含有する癌治療剤は低毒性であり、そのまま液剤として、または適 当な剤型の医薬組成物として、ヒトに対して経口的または非経口的 (例、血管内投与 、皮下投与など）に投与することができる。
本発明の抗体は、それ自体を投与しても良いし、または適当な医薬組成物として投 与しても良い。投与に用いられる医薬組成物としては、本発明の抗体およびその塩と 薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものであっても良 、。 このような医薬組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
[0126] 非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射 剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を 包含しても良い。このような注射剤は、公知の方法に従って調製できる。注射剤の調 製方法としては、例えば、上記本発明の抗体またはその塩を通常注射剤に用いられ る無菌の水性液、または油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製できる 。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含 む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール (例、エタノール)、 ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活 性剤〔例、ポリソルベート 80、 HCO - 50 (polyoxyethylene (50mol) adduct of hydroge nated castor oil)〕等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が 用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用しても よい。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。直腸投与 に用いられる坐剤は、上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することに よって調製されても良い。
[0127] 経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤 (糖 衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカブ セル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。このような組成物は公知 の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦 形剤を含有していても良い。錠剤用の担体、賦形剤としては、例えば、乳糖、でんぷ ん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムが用いられる。
[0128] 上記の非経口用または経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような 投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。このような投薬単位の剤形として は、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤が挙げられる。抗体 の含有量としては、投薬単位剤形当たり通常 5〜500mg、とりわけ注射剤では 5〜100 mg、その他の剤形では 10〜250mgの上記抗体が含有されて!、ることが好まし!/、。
[0129] 本発明の抗体を含有する上記製剤の投与量は、投与対象、対象とする癌種、症状 、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、成人の卵巣癌の治療のために使用す る場合には、本発明の抗体を 1回量として、通常 0.01〜20mg/kg体重程度、好ましく は 0.1〜10mg/kg体重程度、さらに好ましくは 0.1〜5mg/kg体重程度を、 1日 1〜5回程 度、好ましくは 1日 1〜3回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非 経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が 特に重 、場合には、その症状に応じて増量してもよ 、。
[0130] 本発明の抗体は、それ自体または適当な医薬組成物として投与することができる。
上記投与に用いられる医薬組成物は、上記抗体またはその塩と薬理学的に許容さ れ得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。カゝかる組成物は、経口また は非経口投与 (例、血管内注射、皮下注射など）に適する剤形として提供される。 なお前記した各組成物は、上記抗体との配合により好ましくな 、相互作用を生じな い限り他の活性成分を含有してもよ 、。
さらに、本発明の抗体は、他の薬剤、例えばアルキル化剤（例、サイクロフォスフアミ ド、ィフォスフアミド等）、代謝拮抗剤 (例、メソトレキセート、 5—フルォロウラシル等）、 抗癌性抗生物質 (例、マイトマイシン、アドリアマイシン等）、植物由来抗癌剤 (例、ビ ンクリスチン、ビンデシン、タキソール等）、シスプラチン、カルボプラチン、エトポキシ ド、イリノテカンなどと併用してもよい。本発明の抗体および上記薬剤は、同時または 異なった時間に、患者に投与すればよい。
[0131] (2)アンチセンス核酸を含有する医薬
LTBP-1L遺伝子の転写産物に相補的に結合し、該遺伝子の発現を抑制することが できる本発明のアンチセンス核酸は、低毒性であり、生体内における LTBP-1L蛋白 質または LTBP-1L遺伝子の機能や作用を抑制することができるので、癌 (卵巣癌、子 宫頸癌、子宮体癌、胃癌、大腸癌、肺癌、その他の固形癌 (例えば、肝臓癌、脾臓癌 、胆嚢癌、腎臓癌等)、より好ましくは卵巣癌、子宮頸癌、子宮体癌、胃癌、大腸癌お よび肺癌、特に好ましくは卵巣癌、子宮体癌および肺癌)の治療剤として使用するこ とがでさる。
[0132] 本発明のアンチセンス核酸を癌治療剤として使用する場合、自体公知の方法に従 つて製剤化し、投与することができる。
また、例えば、前記のアンチセンス核酸を単独あるいはレトロウイルスベクター、ァ デノウィルスベクター、アデノウイルスァソシエーテッドウィルスベクターなどの適当な ベクターに挿入した後、常套手段に従って、ヒトまたは哺乳動物 (例、ラット、ゥサギ、 ヒッジ、ブタ、ゥシ、ネコ、ィヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的に投与する ことができる。該アンチセンス核酸は、そのままで、あるいは摂取促進のために補助 剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイド口ゲルカテ 一テルのようなカテーテルによって投与できる。あるいは、エアロゾルィ匕して吸入剤と して気管内に局所投与することもできる。
さらに、体内動態の改良、半減期の長期化、細胞内取り込み効率の改善を目的に 、前記のアンチセンス核酸を単独またはリボゾームなどの担体とともに製剤（注射剤） 化し、静脈、皮下等に投与してもよい。
[0133] 該アンチセンス核酸の投与量は、対象とする癌種、投与対象、投与ルートなどによ り差異はあるが、例えば、卵巣癌の治療の目的で本発明のアンチセンス核酸を投与 する場合、一般的に成人 (体重 60kg)においては、一日にっき該アンチセンス核酸を 約 0.1〜約 1 OOmg投与する。
[0134] 上記- 202Gおよび Zまたは +20A多型を含むヒト LTBP-1L遺伝子の短 、断片（オリゴ DNA)は、 -202Gおよび/または +20Aアレルを有する癌患者において、 LTBP-1Lプロ モーターへの Splの結合を競合的に阻害することができるので、 LTBP-1L遺伝子の 過剰発現を抑制するデコイ核酸として使用することができる。したがって、本発明はま た、ヒト LTBP-1L遺伝子の部分塩基配列であって、配列番号： 1で表される塩基配列 中塩基番号 2014および Zまたは 2235で示される塩基を含む、約 15〜約 500塩基の連 続した塩基配列を含有してなる核酸を含有する、癌 (卵巣癌、子宮頸癌、子宮体癌、 胃癌、大腸癌、肺癌、その他の固形癌 (例えば、肝臓癌、脾臓癌、胆嚢癌、腎臓癌等 )、より好ましくは卵巣癌、子宮頸癌、子宮体癌、胃癌、大腸癌および肺癌、特に好ま しくは卵巣癌、子宮体癌および肺癌)の治療剤を提供する。
該核酸は、上記本発明のアンチセンス核酸と同様に製剤化することができ、癌患者 に投与することができる。
[0135] 本明細書にぉ 、て、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 IUPAC-IUB Com mission on Biochemical Nomenclatureによる略号あるいは当該分野における慣用略 号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る 場合は、特に明示しなければ L体を示すものとする。
DNA ：デォキシリボ核酸 cDNA ：相補的デォキシリボ核酸
A ：ァデニン
T ：チミン
G ：グァニン
C ：シトシン
RNA ：リボ核酸
mRNA ：メッセンジャーリボ核酸 dATP ：デォキシアデノシン三リン酸 dTTP ：デォキシチミジン三リン酸 dGTP ：デォキシグアノシン三リン酸 dCTP ：デォキシシチジン三リン酸
ATP ：アデノシン三リン酸
EDTA ：エチレンジァミン四酢酸
SDS ：ドデシル硫酸ナトリウム
Gly ：グリシン
Ala ：ァラニン
Val ：バリン
し eu ：ロイシン
He ：イソロイシン
Ser ：セリン
Thr ：スレ才ニン
Cys ：システィン
Met ：メチォニン
Glu ：グルタミン酸
Asp ：ァスパラギン酸
Lys ：リジン
Arg ：ァノレギニン
His ：ヒスチジン Phe ：フエ-ルァラニン
Tyr ：チロシン
Trp ：トリブトファン
Pro ：プロリン
Asn ：ァスパラギン
Gin ：グノレタミン
pGlu ：ピログルタミン酸
Figure imgf000063_0001
また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記す る。
Me ：メチル基
Et ：ェチル基
Bu ：ブチル基
Ph ：フエ-ノレ基
TC ：チアゾリジン- 4(R)-カルボキサミド基
Tos ： p-トノレエンスノレフォニノレ
CHO ：ホノレミノレ
Bzl ：ベンジノレ
CI— Bzl : 2,6—ジクロロべンジル
Bom ：ベンジル才キシメチノレ
Z ：ベンジルォキシカルボニル
C1-Z ： 2-クロ口べンジノレォキシカノレボニノレ
Br- Z ： 2-ブロモベンジ /レオキシカルボ二ノレ
Boc ： t-ブトキシカルボニル
DNP ：ジニトロフエニル
Trt ：トリチル
Bum ： t-ブトキシメチル
Fmoc ： N- 9-フルォレニルメトキシカルボニル HOBt ： 1-ヒドロキシベンズトリアゾール
HOOBt : 3,4-ジヒドロ- 3-ヒドロキシ- 4-ォキソ -1,2, 3-ベンゾトリアジン
HONB ： 1-ヒドロキシ- 5-ノルボルネン -2,3-ジカルボキシイミド
DCC ： Ν,Ν' -ジシクロへキシノレカノレボジイミド
[0137] 本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
ほ己列番号: 1〕
ヒト LTBP-1L遺伝子の 5， -調節領域の塩基配列を示す。
ほ己列番号: 2〕
ヒト LTBP- 1L cDNAの塩基配列を示す。
ほ己列番号: 3〕
ヒト LTBP-1L蛋白質のアミノ酸配列を示す。
実施例
[0138] 以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これらは単なる例示で あって本発明を何ら限定するものではない。
[0139] 実施例 1 LTBP-1L遺伝子 5' -調節領域内の新規 SNPsの同定
( 1 )試料および DNA調製
組織標本は、金沢大学医学部附属病院の卵巣癌患者 66人、子宮体癌患者 66人、 胃癌患者 55人、大腸癌患者 81人、肺癌患者 90人の一連のシリーズから外科的に得 て、 DNA分析用に- 80°Cで保存するか、免疫組織化学分析用にホルムアルデヒドで 固定した。本研究における患者組織の使用のために、患者から書面によるインフォ一 ムドコンセントを得た。患者はすべて、新たに診断され、以前に治療 (ィ匕学療法もしく は放射線治療）を受けておらず、組織学的に確認された。健常対照 DNAサンプルは 、書面によるインフォームドコンセントの下に、金沢大学のスタッフおよび学生を含む 日本人 156個体の口腔上皮細胞から得た。口腔上皮細胞は以前報告した口腔洗浄 法（Lancet 1988, 1: 1356— 8 ; Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 1998, 7: 719—24) を改変して集めた。簡単にいえば、歯磨き力も少なくとも 3時間後に、参加者に、口腔 洗浄液モンダミン (登録商標；アース製薬） 10 mLで 10秒間激しく口をゆすいだ後、コ 二カルチューブに吐き出してもらい、それを 3,000 gで 10分間遠心することにより口腔 細胞を集めた。 Wizardゲノム DNA精製キット（プロメガ社)を用いて、全ゲノム DNAを 精製した。
[0140] (2) LTBP- 1Lプロモーターのシーケンシング
- 2164〜+130にわたる LTBP- 1Lプロモーター領域を、ダイレクトシーケンシングによ つて解析した。使用した PCRプライマーの配列は以下の通りである。
F (フォーワード）- 1: 5 ' -CGTCGACTCGATCTCAAAGTGTTGC-3 ' (配列番号： 4 )および
R (リバ -ス） - 1： 5， -GAGGATTGAGGTGAGTCACAAGG-3 ' (配列番号： 5)；
F- -2: 5， -GTAGAACAAGGAATTGGATCCGT-3， （配列番号： 6)および
R- -2: 5， -TTGATTTGGCAGGCAGGGCCTC- 3 ' (配列番号： 7)；
F- -3: 5， -GTTCTCACAAGCAGCTAGTGCT- 3 ' (配列番号： 8)および
R- -3: 5， -GAAAGTCCACAGTCATAGCAGTC-3 ' (配列番号： 9)；
F- -4: 5， -CAAAGCCTTGGAAACACACCATC-3， （配列番号： 10)および
R- -4: 5， -TTAGGGTAGGACTAGAGTTCA- 3 ' (配列番号：11) ;
F- -5: 5， -GTCGGATTACGGTCCCGTGA- 3 ' (配列番号： 12)および
R- -5: 5， -TTACTGAACGATCCTGTCCTTTC- 3，；（配列番号： 13)並びに
F- -6: 5， -AGTATCACAGCAAACACGGAT-3， （配列番号： 14)および
R- -6: 5， -GGTGCACCACGTAGGTGATCCTCC- 3， （配列番号： 15)
すべての PCR産物を精製した後、両端力もダイレクトにシーケンシングした。すべて のシーケンシング反応は、 ABI 310 DNAアナライザ一中で色素ターミネータ一化学を 用いて実施した。その結果、 -202G/Cおよび +20A/Cの新規 SNPsが同定された（図 1 A)。
[0141] (3)ハプロタイプ解析
-202G/Cおよび +20A/Cのハプロタイプを、 PCRに基づく制限酵素断片長多型 (RF LP)法により解析した。 - 392〜+154にわたる LTBP- 1Lプロモーター領域を、 F- 7: 5，- TTGGCTGCTCAGGTCTGACA- 3，（配列番号： 16)および R- 6プライマーを用いて 増幅した。 PCRは、 94°C、 2分の後、 94°C、 1分； 56°C、 1分および 72°C、 1分を 31サイク ルの条件下で実施し、最後のステップで 72°C、 10分を行って、すべての PCRフラグメ ントを完全に伸長させた。このサイクル数は PCR反応が指数関数的である範囲内であ つた。 546 bpの PCR産物を EcoRIIと Cspl (いずれも東洋紡製）とで二重消化し、得られ る DNAフラグメントを 3%ァガロースゲル上で分離した。ハプロタイプは図 1Bに示され る長さのバンドを検出することにより判定した。
その結果、各種癌患者群、対照群のいずれからも、 4つの可能性のあるハプロタイ プのうち、 2つのハプロタイプ（G-Aおよび C-C)のみが同定された。したがって、 3つ の遺伝子型 G- A/G- A、 G- A/C- C、および C- C/C- Cが検出された。 C- Cハプロタイ プが GenBankに登録されているが（AF171934)、日本人集団においては、被験者全 体、卵巣癌患者群、大腸癌患者群、対照群では C-Cのアレル頻度はマイナーであり 、本発明者らが新たに同定した G-Aアレルが日本人集団におけるメジャーアレルで あった (表 1)。卵巣癌患者群、大腸癌患者群と対照群との間でアレル頻度に有意差 はなぐしたがって、該 SNPsはこれらの癌に対する感受性多型ではないことが示され た。
他方、子宮体癌患者群、胃癌患者群、肺癌患者群では C-Cハプロタイプの頻度が 対照群におけるそれに比べて有意に高力つた (表 1)。
[表 1]
¾ I腿^肺5
W癌癌
各種癌患者と健常者 （対照） における LTBP - 1Lプロモーターのジ ノタイピング 絲 太粉 LTBP- 1Lプロモーターの遺伝子型（個体数 /%) ァレル頻度 p値（ ^ ¾定） 給 1回 1 G-A/G-A G-A/C-C C - C/C- C G- A OC vs. 健常者
156 49(31.4%) 84(53. 9%) 23(14. 7%) 0. 58 0. 42
66 21(31.8%) 31(47. 0%) 14(21. 2%) 0. 55 0. 45 0.56
81 28 (34.6%) 35(43. 2%) 18(22. 2%) 0. 56 0. 44 0.65
90 23 (25.6%) 45(50. 0%) 22 (24. 4%) 0. 51 0. 49 0.09 (p<0. 1)
66 11(16.7%) 41(62. 1%) 14(21. 2%) 0. 48 0. 52 0.04 (p<0.05)
55 7(12.7%) 35(63. 6%) 13(23. 6%) 0. 44 0. 56 0.013(p<0.05) すべてハーディワインベルグ平衡にのっている
実施例 2 LTBP-1Lプロモーター活性に及ぼす SNPsの影響
実施例 1で同定された多型が LTBP-1Lプロモーターの活性に及ぼす影響を、ルシ フェラーゼレポーターアツセィにより調べた。
LTBP-1Lプロモータ^ ルシフェラーゼレポータープラスミドは、ヘルシンキ大学の J orma Keski- Oja博士より供与を受けた (J. Biol. Chem. 1999, 274: 32619-30)。このプ ラスミドは、 LTBP-1L遺伝子 5，-調節領域（-2211〜+54)をルシフェラーゼレポーター ベクター pGL3- Basic (Promega社）中に挿入したものである。変異プラスミドは、 GeneT anor Site-Directed Mutagenesis system (Invitrogen Life Technologies)を用い飞 した。 - 202Gを導入するためのプライマーには 5，- TGCGCGGCCCGCTCCCCTGGC CCCTCCCCGCTCCC- 3，（配列番号： 17)および 5， -AGGGGAGCGGGCCGCGCA AGGTGAGGGTCC-3' (配列番号： 18)を用い、 +20Aを導入するためのプライマーに は 5， -GGCCGGGGGAGGGGGCCGGACAGCGCGCGACC-3 ' (配列番号： 19)およ び 5， - GTCCGGCCCCCTCCCCCGGCCGTGCGGCTCGCCT- 3 ' (配列番号： 20) を用いた（図 2A参照）。プラスミド pM、 pM- Spl (Spl発現ベクター）、 pCMV- DNsp3 (S p3のドミナントネガティブ体発現ベクター）は京都府立医科大学の曽和義広博士より 供与を受けた。
卵巣癌由来の RMUG-S細胞株（JCRBより入手）は 10% FBS含有 Ham F12培地（Sigm a-Aldrich) (100U/mlペニシリンおよび 100 μ g/mlストレプトマイシンを含む）中で維 持した後、トランスフエクシヨン 1日前に 24ゥエルプレートに 5 X 104細胞の密度で播種し た。細胞を各レポータープラスミド 0.4 g単独で、もしくは同量のエフェクタープラスミ ドとともに FuGENE6トランスフエクシヨン試薬（Roche Molecular Biochemicals)を用い てトランスフエタトした。トランスフエクシヨン効率を校正するために、 Renillaルシフェラ ーゼプラスミド phRL-tkをコトランスフエタトした。 48時間後、 DuaHusiferase Reporter Assay System (Promega)を用いて細胞を溶解し、ホタルおよび Renillaルシフェラーゼ 活性を Lumat LB9507 (Berthold Technologies)を用いて測定した。すべての実験は 各レポータープラスミドにっき少なくとも 3回行 、、相対ルシフェラーゼ活性を計算し た。結果は平均士 SD (n=3)で示す（図 2B)。転写活性は G-Aハプロタイプが最も高く 、 C-Cハプロタイプの 3.6倍であった。 G-Cおよび C- Aノヽプロタイプは中間の活性を示 した。
[0144] LTBP-ILプロモーターは Spl結合モチーフである GCボックスを含み、そのうちの 1つ は- 202位とオーバーラップし、他の 1つは +20位に隣接する（図 2A)。そこで、 Splが L TBP-1Lプロモーターを制御して!/、るか否かを調べた。 G-Aハプロタイプを有するレポ 一タープラスミドと Spl発現ベクターをコトランスフエタトすると、転写活性は顕著に増 大した（図 2C)。対照的に、 Spl機能を阻害することが知られている Sp3ドミナントネガ ティブ体発現ベクターとコトランスフエタトすると、転写活性は顕著に阻害された。 Spl による同様の効果は C-Cハプロタイプにぉ 、ても観察された力 その効率は低力つた 。これらの結果は Splが LTBP-1L遺伝子の転写を活性ィ匕し、特に G-Aノヽプロタイプに ぉ 、てその程度が高 、ことを示唆する。
[0145] 実施例 3 電気泳動移動度シフトアツセィ (EMSA)
EMSAは以前に記載されたようにして行った（Cancer Res. 1999, 59: 551-7)。 -202 Cおよび- 202Gにそれぞれ対応する二本鎖オリゴヌクレオチド 5，- GCGGCCCGCTC CCCTCGCCCCTCCCCGCT- 3 ' (配列番号： 2 および 5， - GCGGCCCGCTCCCC TGGCCCCTCCCCGCT-3 ' (配列番号： 22)を MEGALABEL Kit (TaKaRa)を用いて [ y - 32P]ATPでラベルした。ヒト Spl蛋白質 (Promega) 1 μ gを、 100倍モル過剰の非標 識競合 DNAの存在下および非存在下に、 10% グリセロール、 25mM HEPES (pH7.9) 、 50mM KC1、 0.5mM PMSFおよび ImM DTTを含む反応液 25 1中、 poly(dI— dC)と 氷上で 20分間インキュベートした。スーパーシフトアツセィには、抗 Spl抗体（Santa Cr uz Biotechnologies)を組換え Spl蛋白質と、氷上で 60分間プレインキュペートした。ィ ンキュベーシヨン後、標識したオリゴヌクレオチド（〉30,000cpm)をカ卩え、反応混合物を 室温でさらに 20分間インキュベートした。 5%ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、 D NA-蛋白質複合体を遊離 DNAから分離し、ゲルを乾燥して Fuji BAS-ΙΠバイオィメー ジングアナライザー（富士写真フィルム）を用いたオートラジオグラフィ一に付した。 Sp 1の特異的結合を確認するために、 Spl (5 ' -ATTCGATCGGGGCGGGGCGAGC-3 ' (配列番号： 23) )もしくは AP2 (5 ' -GATCGAACTGACCGCCCGCGGCCCGT-3 ' ( 配列番号： 24) )に対するコンセンサスオリゴヌクレオチドを用いた。
[0146] その結果、 -202Cを有するプローブと Spl蛋白質との結合を示すバンドは検出され ないか、ごくかすかにしか検出されなかったのに対し、 -202Gを有するプローブは Spl 蛋白質と強く結合することが分力つた（図 3)。スーパーシフトアツセィの結果、 -202G を有するプローブと Spl蛋白質との複合体は抗 Spl抗体によりスーパーシフトしたが、 エストロゲン受容体や c-mycに対する抗体によってはシフトしな力つたことから、該プ ローブが Spl蛋白質と結合していることが確認された。これらのバンドは、ホモ口ガスな 未標識競合 DNAおよび Splコンセンサスオリゴヌクレオチドの添カ卩により消失したが、 AP2コンセンサスオリゴヌクレオチドによっては消失しなかった。同様の結果は +20Aを 有するプローブと +20Cを有するプローブとの間でも観察された力 +20Aの Splとの結 合ァフィユティーは- 202Gのそれよりは弱かった。
[0147] 実施例 4 卵巣癌における LTBP-1L発現の免疫組織ィ匕学的解析
LTBP-1L蛋白質発現レベルに及ぼす SNPsの影響を、種々の遺伝子型を有する 36 人の卵巣癌患者から採取した外科標本を用いて免疫組織化学的に解析した。
アツセィは、 VECTASTAIN ABC Elite kit (Vector Laboratories)を用いて、 Am. J. P athol. 2003, 163: 859-67に記載の方法に従って、ホルマリン固定'パラフィン包埋し た卵巣組織上で行った。 1 X抗原回復溶液 (Biogenex)中で 10分間抗原回復を行い 、 3% H 0含有メタノール中で内在パーォキシダーゼをクェンチングした。組織切片
2 2
をマウス抗 LTBP-1Lモノクローナル抗体（R&D Systems) (希釈度 1:1000)もしくは非 免疫マウス全血清と 4°Cで 16時間インキュベートさせた。洗浄後、該切片をピオチン 化二次抗体と反応させ、ストレプトアビジン ピオチン 西洋ヮサビパーォキシダー ゼ複合体、ピオチンィ匕チラミド、ストレプトアビジン標識パーォキシダーゼおよび 3,3，- ジァミノべンジジン (Dako Cytomation)と順次反応させて検出した。切片をへマトキシ リンでカウンター染色した。染色度は、陰性 0 (無染色）、低 1 + (5〜25%の細胞が陽 性もしくは染色強度がきわめて弱い）、中 2+ (25〜75%の細胞が陽性、強く陽性)、高 3+ (75%以上の細胞が陽性、染色強度がきわめて強い)で評価した。 2人の病理学者 が結果を判定し、結果が一致しな力つた場合は解析力 除外した。
[0148] その結果、調べたすべての組織サンプルで癌および間質細胞の両方で LTBP-1L の免疫染色が検出された (表 2)。 G-Aホモ接合型の遺伝子型を有する 13卵巣癌のう ち、 4検体で 3+、 6検体で 2+の発現を示した。ヘテロ接合型の遺伝子型を有する 14癌 サンプルのうち、 4検体で 3+、 2検体で 2+の発現を示した力 8検体で 1+の低発現であ つた。 C-Cホモ接合型の遺伝子型を有する 9検体のうち、 1検体で 3+、 2検体で 2+の発 現を示したが、 5検体で 1+の低発現であり、 1検体では発現が認められな力つた。 3+ および 2+の発現を示した患者を発現が
増大した群として括ると、 G-Aホモ接合型は、ヘテロ接合型および C-Cホモ接合型と 比較して、有意に LTBP-1Lの発現増力！]と相関した (Pく 0.05)。
[0149] [表 2]
LTBP - 1Lプ uモータ一の遺伝子型と卵巣癌における LTBP - 1発現との間の相関 染色強度
遺伝子型 n 0 1+ 2+ 3+
Figure imgf000071_0001
#P〈0. 05, G-A/G-A vs. G- A/C- C及び C - C/C- C (Fisherの正確確率検定) 2+または 3+を、 0または 1+と比較して発現が増加した群に分類した。
[0150] 実施例 5 各種癌患者の臨床的特徴と結果に及ぼす LTBP-1L SNPsの影響
LTBP-1Lの遺伝子型と卵巣癌、子宮体癌および肺癌の臨床病理学的特徴 (年齢、 組織学的タイプ、腫瘍のグレードおよび FIGO臨床ステージ）との関係を調べた。 LTB P-1L遺伝子型とこれらのパラメータの間には有意な相関は認められな力つた。次に、 累積生存率を遺伝子型ごとに比較した。 Kaplan-Meier法を用いて生存曲線をプロッ トし、 log- rankテストを用いて比較した。結果を図 4〜6に示す。ヘテロ接合型および C -Cホモ接合型の遺伝子型を有する患者に比べて、 G-Aホモ接合型の遺伝子型を有 する患者の累積生存率は低力つた。
産業上の利用可能性
[0151] 本発明によれば、癌、特に卵巣癌、子宮体癌および肺癌などの癌における予後の 良否を判定することができる。また、 LTBP-1Lに対する抗体、 LTBP-1Lのアンチセン ス核酸などは、癌、特に卵巣癌などの癌の治療剤として有用である。 さらに、本発明によれば、子宮体癌、胃癌および肺癌などの癌に対する感受性を予 測することができ、それらの癌の発症リスクの検査に有用である。
本発明を好ましい態様を強調して説明してきたが、好ましい態様が変更され得るこ とは当業者にとって自明であろう。本発明は、本発明が本明細書に詳細に記載され た以外の方法で実施され得ることを意図する。したがって、本発明は添付の「請求の 範囲」の精神および範囲に包含されるすべての変更を含むものである。
本出願は、日本国で出願された特願 2006-019859を基礎としており、そこに開示さ れる内容は本明細書にすべて包含されるものである。また、ここで述べられた特許お よび特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたこ とによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。

Claims

請求の範囲
[1] 癌患者より採取されたゲノム DNA含有試料において、配列番号： 1で表されるヒト LT BP-1L遺伝子 5， -調節領域の塩基配列中塩基番号 2014および Zまたは 2235で示さ れる塩基における多型を検定することを特徴とする、癌の予後診断のための検査方 法。
[2] 癌が、卵巣癌、子宮頸癌、子宮体癌、胃癌、大腸癌および肺癌からなる群より選択 される、請求項 1記載の方法。
[3] 癌が卵巣癌、子宮体癌または肺癌である、請求項 2記載の方法。
[4] ヒト LTBP-1L遺伝子の部分塩基配列であって、配列番号： 1で表される塩基配列中 塩基番号 2014および Zまたは 2235で示される塩基を含む、約 15〜約 500塩基の連続 した塩基配列を含有してなる核酸。
[5] 配列番号： 1で表されるヒト LTBP-1L遺伝子 5 ' -調節領域の塩基配列中塩基番号 20 14および 2235で示される塩基における多型の各々を検出し得る 1組以上の核酸プロ ーブおよび Zまたはプライマーを含んでなる、癌の予後診断のための検査用キット。
[6] 核酸プローブが、配列番号： 1で表されるヒト LTBP-1L遺伝子 5 ' -調節領域の塩基 配列中塩基番号 2014および Zまたは 2235で示される多型部位の塩基を含む、約 15 〜約 500塩基の連続した塩基配列を含有してなる核酸であり、核酸プライマーが、ヒト LTBP-1L遺伝子の部分塩基配列であって、配列番号： 1で表される塩基配列中塩基 番号 2014および/または 2235で示される多型部位の塩基を含む約 50〜約 1,000塩 基の連続した塩基配列を増幅し得る一対の核酸である請求項 5記載のキット。
[7] 癌が、卵巣癌、子宮頸癌、子宮体癌、胃癌、大腸癌および肺癌からなる群より選択 される、請求項 5または 6記載のキット。
[8] 癌が卵巣癌、子宫体癌または肺癌である、請求項 7記載のキット。
[9] 配列番号： 2で表される塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列また はその一部を含む核酸を含有してなる癌治療剤。
[10] 配列番号: 2で表される塩基配列中塩基番号 1〜1038で示される部分塩基配列に 相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸を含有してな る、請求項 9記載の剤。
[11] 配列番号： 3で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を 含む蛋白質またはその部分ペプチドに対する中和抗体を含有してなる癌治療剤。
[12] 中和抗体が、配列番号： 3で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号 1〜346で示される アミノ酸配列の一部を認識するものである、請求項 11記載の剤。
[13] 請求項 4記載の核酸を含有してなる癌治療剤。
[14] 癌が、卵巣癌、子宮頸癌、子宮体癌、胃癌、大腸癌および肺癌からなる群より選択 される、請求項 9〜13のいずれかに記載の剤。
[15] 癌が卵巣癌、子宮体癌または肺癌である、請求項 14記載の剤。
[16] 被験者より採取されたゲノム DNA含有試料において、配列番号： 1で表されるヒト LT BP-1L遺伝子 5， -調節領域の塩基配列中塩基番号 2014および Zまたは 2235で示さ れる塩基における多型を検定することを特徴とする、子宮体癌、胃癌および肺癌から なる群より選択される癌に対する感受性の検査方法。
[17] 配列番号： 1で表されるヒト LTBP-1L遺伝子 5 ' -調節領域の塩基配列中塩基番号 20 14および 2235で示される塩基における多型の各々を検出し得る 1組以上の核酸プロ ーブおよび Zまたはプライマーを含んでなる、子宫体癌、胃癌または肺癌に対する 感受性の検査用キット。
[18] 核酸プローブが、配列番号： 1で表されるヒト LTBP-1L遺伝子 5' -調節領域の塩基 配列中塩基番号 2014および Zまたは 2235で示される多型部位の塩基を含む、約 15 〜約 500塩基の連続した塩基配列を含有してなる核酸であり、核酸プライマーが、ヒト LTBP-1L遺伝子の部分塩基配列であって、配列番号： 1で表される塩基配列中塩基 番号 2014および/または 2235で示される多型部位の塩基を含む約 50〜約 1,000塩 基の連続した塩基配列を増幅し得る一対の核酸である請求項 17記載のキット。
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