JP4530631B2 - 新規タンパク質および癌の予防・治療剤 - Google Patents
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一方、FLJ20539遺伝子(非特許文献1 GenBank Accession No. AK000546)は、ヒト胃癌細胞株KATOIII由来のライブラリーからクローニングされた遺伝子であり、774アミノ酸からなるタンパク質をコードしている(GenBank Accession No. BAA91245)。FLJ13515遺伝子(非特許文献2 GenBank Accession No. AK023577)は、ヒト胎盤由来のライブラリーからクローニングされた遺伝子であり、639アミノ酸からなるタンパク質をコードしている(GenBank Accession No. BAB14613)。このタンパク質はFLJ20539遺伝子によってコードされるタンパク質の136番目から774番目までのアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有しているが、440番目のアミノ酸はグルタミン酸からリジンに置換されている。さらに、これら2種類のヒト遺伝子に相同性を示すマウス遺伝子(GenBank Accession No. BC006896)がマウス乳癌組織由来のライブラリーからクローニングされており、1018アミノ酸からなるタンパク質をコードしている(GenBank Accession No. AAH06896)。このマウス遺伝子はFLJ13515遺伝子に対して塩基配列で約83%、アミノ酸配列で約86%の相同性を有している。
GenBank Accession No. AK000546 GenBank Accession No. AK023577
すなわち、本発明は、
(1) 配列番号:4、配列番号:7、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:20、配列番号:22、配列番号:25または配列番号:27で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩、
(2) 配列番号:15、配列番号:17、配列番号:20、配列番号:22、配列番号:25または配列番号:27で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩、
(3) 上記(1)記載のタンパク質の部分ペプチドまたはその塩、
(4) 上記(1)記載のタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
(5) DNAである上記(4)記載のポリヌクレオチド、
(6) 配列番号:5、配列番号:8、配列番号:16、配列番号:18、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:26または配列番号:28で表される塩基配列を含有する上記(5)記載のポリヌクレオチド、
(7) 配列番号:16、配列番号:18、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:26または配列番号:28で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(8) 上記(4)記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、
(9) 上記(8)記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体、
(10) 上記(9)記載の形質転換体を培養し、上記(1)記載のタンパク質またはその部分ペプチドを生成・蓄積せしめることを特徴とする上記(1)記載のタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の製造法、
(11) 上記(1)記載のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有してなる医薬、
(12) 上記(4)記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬、
(13) 上記(4)記載のポリヌクレオチドを含有してなる診断薬、
(14) 上記(1)記載のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
(14a) 癌の予防・治療作用を有する上記(14)記載の抗体、
(14b) アポトーシス促進活性を有する上記(14)記載の抗体、
(14c) 癌細胞のアポトーシス促進活性を有する上記(14)記載の抗体、
(15) 上記(14)記載の抗体を含有してなる医薬、
(16) 上記(14)記載の抗体を含有してなる診断薬、
(17) 上記(4)記載のポリヌクレオチドに相補的または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチド、
(18) 上記(17)記載のアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる医薬、
(19) 上記(14)記載の抗体を用いることを特徴とする上記(1)記載のタンパク質の定量方法、
(20) 上記(19)記載の定量方法を用いることを特徴とする上記(1)記載のタンパク質の機能が関連する疾患の診断方法、
(21) 上記(1)記載のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、上記(1)記載のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
(22) 上記(1)記載のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有してなる、上記(1)記載のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
(23) 上記(21)記載のスクリーニング方法または上記(22)記載のスクリーニング用キットを用いて得られる、上記(1)記載のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩、
(24) 上記(4)記載のポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、上記(1)記載のタンパク質遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
(25) 上記(4)記載のポリヌクレオチドを含有してなる、上記(1)記載のタンパク質遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
(26) 上記(24)記載のスクリーニング方法または上記(25)記載のスクリーニング用キットを用いて得られる、上記(1)記載のタンパク質遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩、
(27) 上記(23)または上記(26)記載の化合物またはその塩を含有してなる医薬、
(28) 配列番号:1または配列番号:10で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチド、
(29) 上記(28)記載のアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる医薬、
(30) 上記(28)記載のアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる診断薬、
(31) 配列番号:1または配列番号:10で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、
(32) 上記(31)記載の抗体を含有してなる医薬、
(33) 上記(31)記載の抗体を含有してなる診断薬、
(34) 配列番号:1または配列番号:10で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有してなる診断薬、
(35) 癌の予防・治療剤である上記(11)、(12)、(15)、(18)、(27)、(29)または(32)記載の医薬、
(35a) 癌が、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍または血液腫瘍である上記(35)記載の医薬、
(35b) 乳癌または肺癌の予防・治療剤である上記(32)記載の医薬、
(36) 癌の診断薬である上記(13)、(16)、(30)、(33)または(34)記載の診断薬、
(36a) 癌が、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍または血液腫瘍である上記(36)記載の診断薬、
(37) 配列番号:1、配列番号:4、配列番号:7、配列番号:10、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:20、配列番号:22、配列番号:25または配列番号:27で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなる癌の予防・治療剤、
(38) 配列番号:1、配列番号:4、配列番号:7、配列番号:10、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:20、配列番号:22、配列番号:25または配列番号:27で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩を含有してなる癌の予防・治療剤、
(39) 配列番号:1、配列番号:4、配列番号:7、配列番号:10、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:20、配列番号:22、配列番号:25または配列番号:27で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする癌の予防・治療剤のスクリーニング方法、
(40) 配列番号:1、配列番号:4、配列番号:7、配列番号:10、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:20、配列番号:22、配列番号:25または配列番号:27で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴とする癌の予防・治療剤のスクリーニング用キット、
(41) 上記(39)記載のスクリーニング方法または上記(40)記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる癌の予防・治療剤、
(42) 配列番号:1、配列番号:4、配列番号:7、配列番号:10、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:20、配列番号:22、配列番号:25または配列番号:27で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いることを特徴とする癌の予防・治療剤のスクリーニング方法、
(43) 配列番号:1、配列番号:4、配列番号:7、配列番号:10、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:20、配列番号:22、配列番号:25または配列番号:27で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有することを特徴とする癌の予防・治療剤のスクリーニング用キット、
(44) 上記(42)記載のスクリーニング方法または上記(43)記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる癌の予防・治療剤、
(45) アポトーシス促進剤である上記(11)、(12)、(15)、(18)、(27)、(29)または(32)記載の医薬、
(45a) 癌細胞のアポトーシス促進剤である上記(11)、(12)、(15)、(18)、(27)、(29)または(32)記載の医薬、
(46) 配列番号:1、配列番号:4、配列番号:7、配列番号:10、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:20、配列番号:22、配列番号:25または配列番号:27で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とするアポトーシス促進剤のスクリーニング方法、
(47) 配列番号:1、配列番号:4、配列番号:7、配列番号:10、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:20、配列番号:22、配列番号:25または配列番号:27で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いることを特徴とするアポトーシス促進剤のスクリーニング方法、
(48) 哺乳動物に対して、(i)上記(14)もしくは上記(31)記載の抗体、(ii)配列番号:1、配列番号:4、配列番号:7、配列番号:10、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:20、配列番号:22、配列番号:25または配列番号:27で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩、または(iii)該タンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする癌の予防・治療方法、
(49) 配列番号:1、配列番号:4、配列番号:7、配列番号:10、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:20、配列番号:22、配列番号:25または配列番号:27で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する、または該タンパク質の遺伝子の発現を阻害することを特徴とする癌の予防・治療方法、
(50) 癌の予防・治療剤を製造するための、(i)上記(14)もしくは上記(31)記載の抗体、(ii)配列番号:1、配列番号:4、配列番号:7、配列番号:10、配列番号:15、配列番号:17、配列番号:20、配列番号:22、配列番号:25または配列番号:27で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩、または(iii)該タンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩の使用などを提供する。
また、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドや抗体は、本発明で用いられるタンパク質の発現や活性を阻害することができ、例えば大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍または血液腫瘍などの癌の予防・治療剤、好ましくは、乳癌、肺癌などの予防・治療剤として、あるいは癌細胞のアポトーシス促進剤として安全に使用することができる。
配列番号:1で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番号:1で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号:1で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
配列番号:4で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号:4で表されるアミノ酸配列と約70%以上、好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。例えば、配列番号:4で表されるアミノ酸配列の47番目から296番目のアミノ酸配列に対して約70%以上、好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有するアミノ酸配列なども挙げられる。
配列番号:4で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番号:4で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号:4で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
配列番号:7で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号:7で表されるアミノ酸配列と約70%以上、好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。例えば、配列番号:7で表されるアミノ酸配列の577番目から594番目のアミノ酸配列に対して約70%以上、好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有するアミノ酸配列なども挙げられる。
配列番号:7で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番号:7で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号:7で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
配列番号:10で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号:10で表されるアミノ酸配列と約70%以上、好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号:10で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番号:10で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号:10で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
配列番号:15で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号:15で表されるアミノ酸配列と約70%以上、好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。例えば、配列番号:15で表されるアミノ酸配列の47番目から296番目のアミノ酸配列に対して約70%以上、好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有するアミノ酸配列なども挙げられる。
配列番号:15で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番号:15で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号:15で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
配列番号:17で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号:17で表されるアミノ酸配列と約70%以上、好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。例えば、配列番号:17で表されるアミノ酸配列の43番目から292番目のアミノ酸配列に対して約70%以上、好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有するアミノ酸配列なども挙げられる。
配列番号:17で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番号:17で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号:17で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
配列番号:20で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号:20で表されるアミノ酸配列と約70%以上、好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。例えば、配列番号:20で表されるアミノ酸配列の47番目から296番目のアミノ酸配列に対して約70%以上、好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有するアミノ酸配列なども挙げられる。
配列番号:20で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番号:20で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号:20で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
配列番号:22で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号:22で表されるアミノ酸配列と約70%以上、好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。例えば、配列番号:22で表されるアミノ酸配列の43番目から292番目のアミノ酸配列に対して約70%以上、好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有するアミノ酸配列なども挙げられる。
配列番号:22で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番号:22で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号:22で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
配列番号:25で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号:25で表されるアミノ酸配列と約70%以上、好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。例えば、配列番号:25で表されるアミノ酸配列の47番目から296番目のアミノ酸配列に対して約70%以上、好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有するアミノ酸配列なども挙げられる。
配列番号:25で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番号:25で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号:25で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
配列番号:27で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号:27で表されるアミノ酸配列と約70%以上、好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。例えば、配列番号:27で表されるアミノ酸配列の43番目から292番目のアミノ酸配列に対して約70%以上、好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有するアミノ酸配列なども挙げられる。
配列番号:27で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番号:27で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号:27で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
アミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)を用い、以下の条件(期待値=10;ギャップを許す;マトリクス=BLOSUM62;フィルタリング=OFF)にて計算することができる。
クロロパーオキシダーゼ活性の測定は、公知の方法に準じて行えばよく、例えば、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー (J. Biol. Chem.) 241巻、1763〜1768頁(1966年)などに記載の方法またはそれに準じる方法に従って測定することができる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置としては、とくに限定されない。
ここでエステルにおけるRとしては、例えば、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチルなどのC1-6アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのC3-8シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのC6-12アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−C1-2アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−C1-2アルキル基などのC7-14アラルキル基、ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
本発明で用いられるタンパク質がC末端以外にカルボキシル基(またはカルボキシレート)を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明で用いられるタンパク質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したC末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明で用いられるタンパク質には、N末端のアミノ酸残基(例、メチオニン残基)のアミノ基が保護基(例えば、ホルミル基、アセチル基などのC1-6アルカノイルなどのC1-6アシル基など)で保護されているもの、生体内で切断されて生成するN末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基(例えば−OH、−SH、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など)が適当な保護基(例えば、ホルミル基、アセチル基などのC1-6アルカノイル基などのC1-6アシル基など)で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。
本発明で用いられるタンパク質の具体例としては、例えば、配列番号:1で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号:4で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号:7で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号:10で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号:15で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号:17で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号:20で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号:22で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号:25で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号:27で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質などがあげられる。
例えば、本発明で用いられるタンパク質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも20個以上、好ましくは50個以上、さらに好ましくは70個以上、より好ましくは100個以上、最も好ましくは200個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが用いられる。
また、本発明で用いられる部分ペプチドは、そのアミノ酸配列中の1または2個以上(好ましくは、1〜10個程度、さらに好ましくは数(1〜5)個)のアミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に1または2個以上(好ましくは1〜20個程度、より好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数(1〜5)個)のアミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列に1または2個以上(好ましくは1〜20個程度、より好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数(1〜5)個)のアミノ酸が挿入され、または、そのアミノ酸配列中の1または2個以上(好ましくは1〜10個程度、より好ましくは数個、さらに好ましくは1〜5個程度)のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
さらに、本発明で用いられる部分ペプチドには、前記した本発明で用いられるタンパク質と同様に、C末端以外にカルボキシル基(またはカルボキシレート)を有しているもの、N末端のアミノ酸残基(例、メチオニン残基)のアミノ基が保護基で保護されているもの、N端側が生体内で切断され生成したグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
本発明で用いられる部分ペプチドは抗体作成のための抗原としても用いることができる。
本発明で用いられるタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩は、前述したヒトや温血動物の細胞または組織から自体公知のタンパク質の精製方法によって製造することもできるし、タンパク質をコードするDNAを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、後述のペプチド合成法に準じて製造することもできる。
ヒトや哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行ない、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、タンパク質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、DCC、N,N’−ジイソプロピルカルボジイミド、N−エチル−N’−(3−ジメチルアミノプロリル)カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤(例えば、HOBt,HOOBt)とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物またはHOBtエステルあるいはHOOBtエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化(例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、t−ブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、2−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化)、アラルキルエステル化(例えば、ベンジルエステル、4−ニトロベンジルエステル、4−メトキシベンジルエステル、4−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化)、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、t−ブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級(C1−6)アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、t−ブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Bzl、Cl2−Bzl、2−ニトロベンジル、Br−Z、t−ブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Tos、4−メトキシ−2,3,6−トリメチルベンゼンスルホニル、DNP、ベンジルオキシメチル、Bum、Boc、Trt、Fmocなどが用いられる。
保護基の除去(脱離)方法としては、例えば、Pd−黒あるいはPd−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−20℃〜40℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、1,4−ブタンジチオール、1,2−エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる2,4−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の1,2−エタンジチオール、1,4−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
タンパク質または部分ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド(タンパク質)鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のN末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたタンパク質または部分ペプチドとC末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したタンパク質または部分ペプチドとを製造し、これらのタンパク質またはペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護タンパク質またはペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗タンパク質またはペプチドを得ることができる。この粗タンパク質またはペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のタンパク質またはペプチドのアミド体を得ることができる。
タンパク質またはペプチドのエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、タンパク質またはペプチドのアミド体と同様にして、所望のタンパク質またはペプチドのエステル体を得ることができる。
(i)M. Bodanszky および M.A. Ondetti、ペプチド・シンセシス(Peptide Synthesis), Interscience Publishers, New York (1966年)
(ii)SchroederおよびLuebke、ザ・ペプチド(The Peptide), Academic Press, New York (1965年)
(iii)泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株) (1975年)
(iv)矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タンパク質の化学IV、205、(1977年)
(v)矢島治明監修、続医薬品の開発、第14巻、ペプチド合成、広川書店
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明で用いられる部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織よりtotalRNAまたはmRNA画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction(以下、RT−PCR法と略称する)によって増幅することもできる。
本発明で用いられるタンパク質をコードするDNAとしては、例えば、
(i)配列番号:2で表される塩基配列を含有するDNA、または配列番号:2で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号:1で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするDNA、
(ii)配列番号:5で表される塩基配列を含有するDNA、または配列番号:5で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号:4で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするDNA、
(iii)配列番号:8で表される塩基配列を含有するDNA、または配列番号:8で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号:7で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするDNA、
(iv)配列番号:11で表される塩基配列を含有するDNA、または配列番号:11で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号:10で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするDNA、
(v)配列番号:16で表される塩基配列を含有するDNA、または配列番号:16で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号:15で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするDNA、
(vi)配列番号:18で表される塩基配列を含有するDNA、または配列番号:18で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号:17で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするDNA、
(vii)配列番号:21で表される塩基配列を含有するDNA、または配列番号:21で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号:20で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするDNA、
(viii)配列番号:23で表される塩基配列を含有するDNA、または配列番号:23で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号:22で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするDNA、
(ix)配列番号:26で表される塩基配列を含有するDNA、または配列番号:26で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号:25で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするDNA、
(x)配列番号:28で表される塩基配列を含有するDNA、または配列番号:28で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号:27で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするDNAであれば何れのものでもよい。
配列番号:5で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるDNAとしては、例えば、配列番号:5で表される塩基配列と約70%以上、好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有する塩基配列を含有するDNAなどが用いられる。例えば、配列番号:5で表される塩基配列の139番目から888番目の塩基配列に対して約70%以上、好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有する塩基配列を含有するDNAなども用いられる。
配列番号:8で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるDNAとしては、例えば、配列番号:8で表される塩基配列と約70%以上、好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有する塩基配列を含有するDNAなどが用いられる。例えば、配列番号:8で表される塩基配列の1728番目から1782番目の塩基配列に対して約70%以上、好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有する塩基配列を含有するDNAなども用いられる。
配列番号:11で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるDNAとしては、例えば、配列番号:11で表される塩基配列と約70%以上、好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有する塩基配列を含有するDNAなどが用いられる。
配列番号:16で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるDNAとしては、例えば、配列番号:16で表される塩基配列と約70%以上、好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有する塩基配列を含有するDNAなどが用いられる。
配列番号:18で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるDNAとしては、例えば、配列番号:18で表される塩基配列と約70%以上、好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有する塩基配列を含有するDNAなどが用いられる。
配列番号:21で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるDNAとしては、例えば、配列番号:21で表される塩基配列と約70%以上、好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有する塩基配列を含有するDNAなどが用いられる。
配列番号:23で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるDNAとしては、例えば、配列番号:23で表される塩基配列と約70%以上、好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有する塩基配列を含有するDNAなどが用いられる。
配列番号:26で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるDNAとしては、例えば、配列番号:26で表される塩基配列と約70%以上、好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有する塩基配列を含有するDNAなどが用いられる。
配列番号:28で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるDNAとしては、例えば、配列番号:28で表される塩基配列と約70%以上、好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有する塩基配列を含有するDNAなどが用いられる。
塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)を用い、以下の条件(期待値=10;ギャップを許す;フィルタリング=ON;マッチスコア=1;ミスマッチスコア=-3)にて計算することができる。
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング(Molecular Cloning)2nd(J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989)に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約19〜40mM、好ましくは約19〜20mMで、温度が約50〜70℃、好ましくは約60〜65℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約19mMで温度が約65℃の場合が最も好ましい。
より具体的には、(i)配列番号:1で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするDNAとしては、配列番号:2で表される塩基配列を含有するDNAまたは配列番号:3で表される塩基配列を含有するDNAなどが、
(ii)配列番号:4で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするDNAとしては、配列番号:5で表される塩基配列を含有するDNAまたは配列番号:6で表される塩基配列を含有するDNAなどが、
(iii)配列番号:7で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするDNAとしては、配列番号:8で表される塩基配列を含有するDNAまたは配列番号:9で表される塩基配列を含有するDNAなどが、
(iv)配列番号:10で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするDNAとしては、配列番号:11で表される塩基配列を含有するDNAまたは配列番号:12で表される塩基配列を含有するDNAなどが、
(v)配列番号:15で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするDNAとしては、配列番号:16で表される塩基配列を含有するDNAまたは配列番号:19で表される塩基配列を含有するDNAなどが、
(vi)配列番号:17で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするDNAとしては、配列番号:18で表される塩基配列を含有するDNAまたは配列番号:19で表される塩基配列を含有するDNAなどが、
(vii)配列番号:20で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするDNAとしては、配列番号:21で表される塩基配列を含有するDNAまたは配列番号:24で表される塩基配列を含有するDNAなどが、
(viii)配列番号:22で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするDNAとしては、配列番号:23で表される塩基配列を含有するDNAまたは配列番号:24で表される塩基配列を含有するDNAなどが、
(ix)配列番号:25で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするDNAとしては、配列番号:26で表される塩基配列を含有するDNAまたは配列番号:29で表される塩基配列を含有するDNAなどが、
(x)配列番号:27で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするDNAとしては、配列番号:28で表される塩基配列を含有するDNAまたは配列番号:29で表される塩基配列を含有するDNAなどが用いられる。
本発明で用いられる部分ペプチドをコードするDNAとしては、例えば、配列番号:2、配列番号:5、配列番号:8、配列番号:11、配列番号:16、配列番号:18、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:26または配列番号:28で表される塩基配列を含有するDNAの一部分を有するDNA、または配列番号:2、配列番号:5、配列番号:8、配列番号:11、配列番号:16、配列番号:18、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:26または配列番号:28で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、本発明のタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードするDNAの一部分を含有するDNAなどが用いられる。
配列番号:2、配列番号:5、配列番号:8、配列番号:11、配列番号:16、配列番号:18、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:26または配列番号:28で表される塩基配列とハイブリダイズできるDNAは、前記と同意義を示す。
ハイブリダイゼーションの方法およびハイストリンジェントな条件は前記と同様のものが用いられる。
DNAの塩基配列の変換は、PCR、公知のキット、例えば、MutanTM-super Express Km(宝酒造(株))、MutanTM-K(宝酒造(株))等を用いて、ODA-LA PCR法、Gapped duplex法、Kunkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。
クローン化されたタンパク質をコードするDNAは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該DNAはその5’末端側に翻訳開始コドンとしてのATGを有し、また3’末端側には翻訳終止コドンとしてのTAA、TGAまたはTAGを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成DNAアダプターを用いて付加することもできる。
本発明のタンパク質の発現ベクターは、例えば、(イ)本発明のタンパク質をコードするDNAから目的とするDNA断片を切り出し、(ロ)該DNA断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMVプロモーター、HSV-TKプロモーターなどが挙げられる。
これらのうち、CMV(サイトメガロウイルス)プロモーター、SRαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、trpプロモーター、lacプロモーター、recAプロモーター、λPLプロモーター、lppプロモーター、T7プロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、SPO1プロモーター、SPO2プロモーター、penPプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、P10プロモーターなどが好ましい。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明のタンパク質のN端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、PhoA・シグナル配列、OmpA・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、MFα・シグナル配列、SUC2・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明のタンパク質をコードするDNAを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
エシェリヒア属菌の具体例としては、例えば、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)K12・DH1〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA,60巻,160(1968)〕,JM103〔Nucleic Acids Research,9巻,309(1981)〕,JA221〔Journal of Molecular Biology,120巻,517(1978)〕,HB101〔Journal of Molecular Biology,41巻,459(1969)〕,C600〔Genetics,39巻,440(1954)〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス(Bacillus subtilis)MI114〔Gene,24巻,255(1983)〕,207−21〔Journal of Biochemistry,95巻,87(1984)〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)AH22,AH22R−,NA87−11A,DKD−5D,20B−12、シゾサッカロマイセス ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)NCYC1913,NCYC2036、ピキア パストリス(Pichia pastoris)KM71などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、Nature,315巻,592(1985)〕。
動物細胞としては、例えば、サル細胞COS−7,Vero,チャイニーズハムスター細胞CHO(以下、CHO細胞と略記),dhfr遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞CHO(以下、CHO(dhfr−)細胞と略記),マウスL細胞,マウスAtT−20,マウスミエローマ細胞,マウスATDC5細胞,ラットGH3,ヒトFL細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA,69巻,2110(1972)やGene,17巻,107(1982)などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、Methods in Enzymology,194巻,182-187(1991)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA,75巻,1929(1978)などに記載の方法に従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、Bio/Technology,6,47-55(1988)などに記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊8 新細胞工学実験プロトコール.263-267(1995)(秀潤社発行)、Virology,52巻,456(1973)に記載の方法に従って行なうことができる。
このようにして、タンパク質をコードするDNAを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のpHは約5〜8が望ましい。
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約15〜43℃で約3〜24時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約30〜40℃で約6〜24時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー(Burkholder)最小培地〔Bostian, K. L. ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77巻,4505(1980)〕や0.5%カザミノ酸を含有するSD培地〔Bitter, G. A. ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA,81巻,5330(1984)〕が挙げられる。培地のpHは約5〜8に調整するのが好ましい。培養は通常約20℃〜35℃で約24〜72時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Grace's Insect Medium(Grace, T.C.C., Nature,195,788(1962))に非動化した10%ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のpHは約6.2〜6.4に調整するのが好ましい。培養は通常約27℃で約3〜5日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約5〜20%の胎児牛血清を含むMEM培地〔Science,122巻,501(1952)〕,DMEM培地〔Virology,8巻,396(1959)〕,RPMI 1640培地〔The Journal of the American Medical Association 199巻,519(1967)〕,199培地〔Proceeding of the Society for the Biological Medicine,73巻,1(1950)〕などが用いられる。pHは約6〜8であるのが好ましい。培養は通常約30℃〜40℃で約15〜60時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外に本発明のタンパク質を生成せしめることができる。
本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび/または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりタンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどのタンパク質変性剤や、トリトンX−100TMなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にタンパク質が分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれるタンパク質の精製は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
なお、組換え体が産生するタンパク質を、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
かくして生成する本発明のタンパク質の存在は、特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイやウェスタンブロッティングなどにより測定することができる。
本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩(以下、抗体の説明においては、これらを単に本発明のタンパク質と略記する場合がある)に対する抗体は、本発明のタンパク質を抗原として用い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
(a)モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明のタンパク質は、温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常2〜6週毎に1回ずつ、計2〜10回程度行われる。用いられる温血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリが挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原で免疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の2〜5日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化タンパク質と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔Nature、256、495 (1975)〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはPEGが用いられる。
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、タンパク質抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相(例、マイクロプレート)にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体(細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる)またはプロテインAを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインAを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したタンパク質を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。通常HAT(ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン)を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、1〜20%、好ましくは10〜20%の牛胎児血清を含むRPMI1640培地、1〜10%の牛胎児血清を含むGIT培地(和光純薬工業(株))あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地(SFM−101、日水製薬(株))などを用いることができる。培養温度は、通常20〜40℃、好ましくは約37℃である。培養時間は、通常5日〜3週間、好ましくは1週間〜2週間である。培養は、通常5%炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
モノクローナル抗体の分離精製は、自体公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体(例、DEAE)による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインAあるいはプロテインGなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じる方法に従って製造することができる。例えば、免疫抗原(タンパク質抗原)自体、あるいはそれとキャリアータンパク質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、該免疫動物から本発明のタンパク質に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造することができる。
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアータンパク質との複合体に関し、キャリアータンパク質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン1に対し、約0.1〜20、好ましくは約1〜5の割合でカプルさせる方法が用いられる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約2〜6週毎に1回ずつ、計約3〜10回程度行なわれる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
本発明のDNAに実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、本発明のDNAに相補的な塩基配列(すなわち、本発明のDNAの相補鎖)の全塩基配列あるいは部分塩基配列と約70%以上、好ましくは約80%以上、より好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有する塩基配列などが挙げられる。特に、本発明のDNAの相補鎖の全塩基配列うち、(イ)翻訳阻害を指向したアンチセンスポリヌクレオチドの場合は、本発明のタンパク質のN末端部位をコードする部分の塩基配列(例えば、開始コドン付近の塩基配列など)の相補鎖と約70%以上、好ましくは約80%以上、より好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有するアンチセンスポリヌクレオチドが、(ロ)RNaseHによるRNA分解を指向するアンチセンスポリヌクレオチドの場合は、イントロンを含む本発明のDNAの全塩基配列の相補鎖と約70%以上、好ましくは約80%以上、より好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有するアンチセンスポリヌクレオチドがそれぞれ好適である。
具体的には、配列番号:2、配列番号:5、配列番号:8、配列番号:11、配列番号:16、配列番号:18、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:26または配列番号:28で表される塩基配列を含有するDNAの塩基配列に相補的な、もしくは実質的に相補的な塩基配列、またはその一部分を有するアンチセンスポリヌクレオチド、好ましくは例えば、配列番号:2、配列番号:5、配列番号:8、配列番号:11、配列番号:16、配列番号:18、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:26または配列番号:28で表される塩基配列を含有するDNAの塩基配列に相補な塩基配列、またはその一部分を有するアンチセンスポリヌクレオチドなどが挙げられる。
アンチセンスポリヌクレオチドは通常、10〜40個程度、好ましくは15〜30個程度の塩基から構成される。
ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンスDNAを構成する各ヌクレオチドのりん酸残基(ホスフェート)は、例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオネートなどの化学修飾りん酸残基に置換されていてもよい。また、各ヌクレオチドの糖(デオキシリボース)は、2’−O−メチル化などの化学修飾糖構造に置換されていてもよいし、塩基部分(ピリミジン、プリン)も化学修飾を受けたものであってもよく、配列番号:2で表される塩基配列を有するDNAにハイブリダイズするものであればいずれのものでもよい。これらのアンチセンスポリヌクレオチドは、公知のDNA合成装置などを用いて製造することができる。
目的核酸と、対象領域の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチドとの関係は、対象物とハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドとの関係は、「アンチセンス」であるということができる。アンチセンスポリヌクレオチドは、2−デオキシ−D−リボースを含有しているポリヌクレオチド、D−リボースを含有しているポリヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のN−グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー(例えば、市販のタンパク質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー)または特殊な結合を含有するその他のポリマー(但し、該ポリマーはDNAやRNA中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する)などが挙げられる。それらは、2本鎖DNA、1本鎖DNA、2本鎖RNA、1本鎖RNA、さらにDNA:RNAハイブリッドであることができ、さらに非修飾ポリヌクレオチド(または非修飾オリゴヌクレオチド)、さらには公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、1個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合(例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど)を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合(例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど)を持つもの、例えばタンパク質(ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−L−リジンなど)や糖(例えば、モノサッカライドなど)などの側鎖基を有しているもの、インターカレント化合物(例えば、アクリジン、ソラレンなど)を持つもの、キレート化合物(例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など)を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの(例えば、αアノマー型の核酸など)であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。こうした修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、例えば、1個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されていたり、あるいはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチド(核酸)は、RNA、DNA、あるいは修飾された核酸(RNA、DNA)である。修飾された核酸の具体例としては核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、そしてポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、それに限定されるものではない。本発明のアンチセンス核酸は次のような方針で好ましく設計されうる。すなわち、細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにする、アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、目標とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、そしてもし毒性があるならアンチセンス核酸の毒性をより小さなものにする。
こうして修飾は当該分野で数多く知られており、例えば J. Kawakami et al., Pharm Tech Japan, Vol. 8, pp.247, 1992; Vol. 8, pp.395, 1992; S. T. Crookeet al. ed., Antisense Research and Applications, CRC Press, 1993 などに開示がある。
本発明のアンチセンス核酸は、変化せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合を含有していて良く、リポゾーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療により適用されたり、付加された形態で与えられることができうる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質(例えば、ホスホリピド、コレステロールなど)といった疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体(例えば、コレステリルクロロホルメート、コール酸など)が挙げられる。こうしたものは、核酸の3’端あるいは5’端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の3’端あるいは5’端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、RNaseなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
アンチセンス核酸の阻害活性は、本発明の形質転換体、本発明の生体内や生体外の遺伝子発現系、あるいは本発明のタンパク質の生体内や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。該核酸それ自体公知の各種の方法で細胞に適用できる。
本発明のタンパク質は癌組織で発現が亢進してしており、さらに、本発明のタンパク質の活性(例、クロロパーオキシダーゼ活性)を阻害すると癌細胞がアポトーシスを起こす。従って、本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩は、例えば大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍または血液腫瘍などの癌の予防・治療剤として使用することができる。好ましくは、乳癌、肺癌などの予防・治療剤である。また、本発明のタンパク質の活性(例、クロロパーオキシダーゼ活性)を阻害する化合物またはその塩は、例えば、癌細胞のアポトーシス促進剤として使用することもできる。
したがって、本発明のタンパク質は、本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬として有用である。
すなわち、本発明は、本発明のタンパク質を用いることを特徴とする本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
具体的には、例えば、(i)本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞のクロロパーオキシダーゼ活性と、(ii)本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞と試験化合物の混合物のクロロパーオキシダーゼ活性とを比較することを特徴する本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法が用いられる。
上記スクリーニング方法においては、例えば、(i)と(ii)の場合において、クロロパーオキシダーゼ活性を測定し、monochlorodimedoneに塩素を付加してdichlorodimedoneを生成する活性を指標として比較する。
クロロパーオキシダーゼ活性は、公知の方法、例えば、ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー (J. Biol. Chem.) 241巻、1763頁〜1768頁(1966年)記載の方法に従って測定する。
本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、例えば、前述した本発明のタンパク質をコードするDNAを含有するベクターで形質転換された宿主(形質転換体)が用いられる。宿主としては、例えば、COS7細胞、CHO細胞、HEK293細胞などの動物細胞が好ましく用いられる。該スクリーニングには、例えば、前述の方法で培養することによって、本発明のタンパク質を細胞膜上に発現させた形質転換体が好ましく用いられる。本発明のタンパク質を発現し得る細胞の培養方法は、前記した本発明の形質変換体の培養法と同様である。
試験化合物としては、例えばペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などがあげられる。
例えば、上記(ii)の場合における本発明のタンパク質のクロロパーオキシダーゼ活性を、上記(i)の場合に比べて、約20%以上、好ましくは30%以上、より好ましくは約50%以上阻害させる試験化合物を、本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物として選択することができる。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などから選ばれた化合物である。該化合物の塩としては、前記した本発明のペプチドの塩と同様のものが用いられる。
したがって、本発明のポリヌクレオチド(例、DNA)は、本発明のタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬として有用である。
スクリーニング方法としては、(iii)本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞を培養した場合と、(iv)試験化合物の存在下、本発明で用いられるタンパク質を産生する能力を有する細胞を培養した場合との比較を行うことを特徴とするスクリーニング方法が挙げられる。
上記方法において、(iii)と(iv)の場合における、前記遺伝子の発現量(具体的には、本発明のタンパク質量または前記タンパク質をコードするmRNA量)を測定して、比較する。
試験化合物および本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、上記と同様のものが挙げられる。
タンパク質量の測定は、公知の方法、例えば、本発明のタンパク質を認識する抗体を用いて、細胞抽出液中などに存在する前記タンパク質を、ウェスタン解析、ELISA法などの方法またはそれに準じる方法に従い測定することができる。
mRNA量の測定は、公知の方法、例えば、プローブとして配列番号:2、配列番号:5、配列番号:8、配列番号:11、配列番号:16、配列番号:18、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:26または配列番号:28で表される塩基配列またはその一部を含有する核酸を用いるノーザンハイブリダイゼーション、あるいはプライマーとして配列番号:2、配列番号:5、配列番号:8、配列番号:11、配列番号:16、配列番号:18、配列番号:21、配列番号:23、配列番号:26または配列番号:28で表される塩基配列またはその一部を含有する核酸を用いるPCR法またはそれに準じる方法に従い測定することができる。
例えば、上記(iv)の場合における遺伝子の発現を、上記(iii)の場合に比べて、約20%以上、好ましくは30%以上、より好ましくは約50%以上阻害させる試験化合物を、本発明のタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物として選択することができる。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などから選ばれた化合物またはその塩であり、本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩、本発明のタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩である。
該化合物の塩としては、前記した本発明のタンパク質の塩と同様のものが用いられる。
本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩、および本発明のタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩はそれぞれ、例えば大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍または血液腫瘍などの癌の治療・予防剤(好ましくは、乳癌、肺癌などの予防・治療剤)として、または癌細胞のアポトーシス促進剤として有用である。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩を上述の予防・治療剤として使用する場合、常套手段に従って製剤化することができる。
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤、関節内注射剤などの剤形を包含する。かかる注射剤は、自体公知の方法に従って、例えば、上記化合物またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール(例、エタノール)、ポリアルコール(例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール)、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート80、HCO−50(polyoxyethylene(50mol)adduct of hydrogenated castor oil)〕などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、上記化合物またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。
なお前記した各組成物は、上記化合物との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血動物(例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど)に対して経口的にまたは非経口的に投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、乳癌の治療の目的で本発明のタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩を経口投与する場合、一般的に成人(体重60kgとして)においては、一日につき該化合物またはその塩を約0.1〜100mg、好ましくは約1.0〜50mg、より好ましくは約1.0〜20mg投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物またはその塩の1回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、乳癌の治療の目的で本発明のタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩を注射剤の形で通常成人(体重60kgとして)に投与する場合、一日につき該化合物またはその塩を約0.01〜30mg、好ましくは約0.1〜20mg、より好ましくは約0.1〜10mgを癌病変部に注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重60kg当たりに換算した量を投与することができる。
本発明の抗体は、本発明のタンパク質を特異的に認識することができるので、被検液中の本発明のタンパク質の定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使用することができる。
すなわち、本発明は、
(i)本発明の抗体と、被検液および標識化された本発明のタンパク質とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化された本発明のタンパク質の割合を測定することを特徴とする被検液中の本発明のタンパク質の定量法、および
(ii)被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の別の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の本発明のタンパク質の定量法を提供する。
上記(ii)の定量法においては、一方の抗体が本発明のタンパク質のN端部を認識する抗体で、他方の抗体が本発明のタンパク質のC端部に反応する抗体であることが望ましい。
本発明の抗体を用いる本発明のタンパク質の定量法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量(例えば、タンパク質量)に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔125I〕、〔131I〕、〔3H〕、〔14C〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反応させ(1次反応)、さらに標識化した別の本発明のモノクローナル抗体を反応させ(2次反応)たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の本発明のタンパク質量を定量することができる。1次反応と2次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも1種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で2種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドイッチ法による本発明のタンパク質の測定法においては、1次反応と2次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、本発明のタンパク質の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。すなわち、1次反応および2次反応に用いられる抗体は、例えば、2次反応で用いられる抗体が、本発明のタンパク質のC端部を認識する場合、1次反応で用いられる抗体は、好ましくはC端部以外、例えばN端部を認識する抗体が用いられる。
競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原(F)と、抗体と結合した標識抗原(B)とを分離し(B/F分離)、B,Fいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、B/F分離をポリエチレングリコール、前記抗体に対する第2抗体などを用いる液相法、および、第1抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第1抗体は可溶性のものを用い第2抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
例えば、入江 寛編「ラジオイムノアッセイ」(講談社、昭和49年発行)、入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ」(講談社、昭和54年発行)、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」(医学書院、昭和53年発行)、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」(第2版)(医学書院、昭和57年発行)、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」(第3版)(医学書院、昭和62年発行)、「Methods in ENZYMOLOGY」 Vol. 70(Immunochemical Techniques(Part A))、 同書Vol. 73(Immunochemical Techniques(Part B))、 同書 Vol. 74(Immunochemical Techniques(Part C))、 同書 Vol. 84(Immunochemical Techniques(Part D:Selected Immunoassays))、 同書 Vol. 92(Immunochemical Techniques(Part E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、 同書 Vol. 121(Immunochemical Techniques(Part I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))(以上、アカデミックプレス社発行)などを参照することができる。
以上のようにして、本発明の抗体を用いることによって、本発明のタンパク質を感度良く定量することができる。
さらには、本発明の抗体を用いて本発明のタンパク質の濃度を定量することによって、本発明のタンパク質の濃度の増加が検出された場合、例えば大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍または血液腫瘍などの癌である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、本発明の抗体は、体液や組織などの被検体中に存在する本発明のタンパク質を検出するために使用することができる。また、本発明のタンパク質を精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中の本発明のタンパク質の検出、被検細胞内における本発明のタンパク質の挙動の分析などのために使用することができる。
本発明のDNAは、例えば、プローブとして使用することにより、ヒトまたは温血動物(例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど)における本発明のタンパク質またはその部分ペプチドをコードするDNAまたはmRNAの異常(遺伝子異常)を検出することができるので、例えば、該DNAまたはmRNAの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該DNAまたはmRNAの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断薬として有用である。
本発明のDNAを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、自体公知のノーザンハイブリダイゼーションやPCR−SSCP法(ゲノミックス(Genomics),第5巻,874〜879頁(1989年)、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ユーエスエー(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America),第86巻,2766〜2770頁(1989年))などにより実施することができる。
例えば、ノーザンハイブリダイゼーションにより発現過多が検出された場合やPCR−SSCP法によりDNAの突然変異などが検出された場合は、例えば大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍または血液腫瘍などの癌である可能性が高いと診断することができる。
本発明のDNAに相補的に結合し、該DNAの発現を抑制することができる本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは低毒性であり、生体内における本発明のタンパク質または本発明のDNAの機能や作用を抑制することができるので、例えば大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍または血液腫瘍などの癌の予防・治療剤として使用することができる。好ましくは、乳癌、肺癌などの予防・治療剤である。また、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは例えば、癌細胞のアポトーシス促進剤として使用することもできる。
上記アンチセンスポリヌクレオチドを上記の予防・治療剤、促進剤などして使用する場合、自体公知の方法に従って製剤化し、投与することができる。
また、例えば、前記のアンチセンスポリヌクレオチドを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って、ヒトまたは哺乳動物(例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど)に対して経口的または非経口的に投与することができる。該アンチセンスポリヌクレオチドは、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。あるいは、エアロゾル化して吸入剤として気管内に局所投与することもできる。
さらに、体内動態の改良、半減期の長期化、細胞内取り込み効率の改善を目的に、前記のアンチセンスポリヌクレオチドを単独またはリポゾームなどの担体とともに製剤(注射剤)化し、静脈、皮下等に投与してもよい。
該アンチセンスポリヌクレオチドの投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、乳癌の治療の目的で本発明のアンチセンスポリヌクレオチドを投与する場合、一般的に成人(体重60kg)においては、一日につき該アンチセンスポリヌクレオチドを約0.1〜100mg投与する。
さらに、該アンチセンスポリヌクレオチドは、組織や細胞における本発明のDNAの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用することもできる。
上記アンチセンスポリヌクレオチドと同様に、本発明のタンパク質をコードするRNAの一部を含有する二重鎖RNA、本発明のタンパク質をコードするRNAの一部を含有するリボザイムなども、本発明の遺伝子の発現を抑制することができ、生体内における本発明で用いられるタンパク質または本発明で用いられるDNAの機能を抑制することができるので、例えば、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍または血液腫瘍などの癌の予防・治療剤(好ましくは、乳癌、肺癌などの予防・治療剤)、癌細胞のアポトーシス促進剤などとして使用することができる。
二重鎖RNAは、公知の方法(例、Nature, 411巻, 494頁, 2001年)に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。
リボザイムは、公知の方法(例、TRENDS in Molecular Medicine, 7巻, 221頁, 2001年)に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。例えば、本発明のタンパク質をコードするRNAの一部に公知のリボザイムを連結することによって製造することができる。本発明のタンパク質をコードするRNAの一部としては、公知のリボザイムによって切断され得る本発明のRNA上の切断部位に近接した部分(RNA断片)が挙げられる。
上記の二重鎖RNAまたはリボザイムを上記予防・治療剤として使用する場合、アンチセンスポリヌクレオチドと同様にして製剤化し、投与することができる。
本発明の抗体は、癌細胞の増殖阻害作用あるいはアポトーシス促進作用を有し、例えば大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍または血液腫瘍などの癌の予防・治療剤(例、ワクチンなど)として使用することができる。好ましくは、乳癌、肺癌などの予防・治療剤である。また、本発明の抗体は、例えば、癌細胞のアポトーシス促進剤として使用することもできる。
本発明の抗体を含有する上記疾患の予防・治療剤、促進剤は低毒性であり、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは哺乳動物(例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど)に対して経口的または非経口的(例、血管内投与、皮下投与など)に投与することができる。好ましくはワクチンとして定法に従って投与することができる。
本発明の抗体は、それ自体を投与しても良いし、または適当な医薬組成物として投与しても良い。投与に用いられる医薬組成物としては、本発明の抗体およびその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものであっても良い。このような医薬組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤、ワクチン等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。このような注射剤は、公知の方法に従って調整できる。注射剤の調整方法としては、例えば、上記本発明の抗体またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性液、または油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製できる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール(例、エタノール)、ポリアルコール(例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール)、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート80、HCO−50(polyoxyethylene(50mol)adduct of hydrogenated castor oil)〕等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。直腸投与に用いられる坐剤は、上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製されても良い。
経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤(糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む)、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤(ソフトカプセル剤を含む)、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。このような組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。錠剤用の担体、賦形剤としては、例えば、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムが用いられる。
上記の非経口用または経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。このような投薬単位の剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤(アンプル)、坐剤が挙げられる。抗体の含有量としては、投薬単位剤形当たり通常5〜500mg程度、とりわけ注射剤では5〜100mg程度、その他の剤形では10〜250mg程度の上記抗体が含有されていることが好ましい。
本発明の抗体を含有する上記予防・治療剤、調節剤の投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、成人の乳癌の治療・予防のために使用する場合には、本発明の抗体を1回量として、通常0.01〜20mg/kg体重程度、好ましくは0.1〜10mg/kg体重程度、さらに好ましくは0.1〜5mg/kg体重程度を、1日1〜5回程度、好ましくは1日1〜3回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
本発明の抗体は、それ自体または適当な医薬組成物として投与することができる。上記投与に用いられる医薬組成物は、上記抗体またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。かかる組成物は、経口または非経口投与(例、血管内注射、皮下注射など)に適する剤形として提供される。
なお前記した各組成物は、上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
本発明のタンパク質は癌で過剰に発現していることから、癌患者の免疫系を活性化するために本発明のタンパク質を癌ワクチンとして用いることもできる。
例えば、強力な抗原提示細胞(例、樹状細胞)を本発明のタンパク質存在下に培養し、該タンパク質を貪食させた後に、再び患者の体内に戻す、所謂養子免疫療法などを好ましく適用し得る。体内に戻された樹状細胞は癌抗原特異的な細胞障害性T細胞を誘導、活性化することにより癌細胞を死滅させることが可能である。
また、本発明のタンパク質は、例えば大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍または血液腫瘍などの癌の予防または治療のためのワクチン製剤として、安全に、哺乳動物(例、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ブタ)に投与することもできる。
該ワクチン製剤は、通常、本発明のタンパク質および生理学的に許容されうる担体を含有する。担体としては例えば、水、食塩水(生理食塩水を含む)、緩衝液(例、リン酸緩衝液)、アルコール(例、エタノール)などの液体の担体があげられる。
ワクチン製剤は、通常のワクチン製剤の製造方法に従って調製することができる。
通常、本発明のタンパク質は、生理学的に許容されうる担体に溶解または懸濁される。また、本発明のタンパク質と生理学的に許容されうる担体とを別々に調製し、用時それらを混合して用いてもよい。
ワクチン製剤には、本発明のタンパク質および生理学的に許容されうる担体に加え、アジュバント(例、水酸化アルミニウムゲル、血清アルブミンなど)、防腐剤(例、チメロサールなど)、無痛化剤(例、ブドウ糖、ベンジルアルコールなど)などを配合させてもよい。また、本発明のタンパク質に対する抗体産生を促進させるために、例えばサイトカイン(例、インターロイキン−2などのインターロイキン類、インターフェロン−γなどのインターフェロン類など)をさらに配合させてもよい。
ワクチン製剤として用いる際、本発明のタンパク質は活性体として用いてもよいが、抗原性を高めるために本発明のタンパク質を変性させてもよい。本発明のタンパク質の変性は、通常、加熱処理、タンパク変性剤(例、ホルマリン、塩酸グアニジン、尿素)による処理により行われる。
得られたワクチン製剤は低毒性であり、通常注射剤として、例えば皮下、皮内、筋肉内に投与してもよく、また癌細胞塊またはその近傍に局所的に投与してもよい。
本発明のタンパク質の投与量は、例えば対象疾患、投与対象、投与ルートなどによって異なるが、例えば本発明のタンパク質を癌に罹患した成人(体重60kg)に皮下的に注射剤として投与する場合、1回当たり通常0.1mg〜300mg程度、好ましくは100mg〜300mg程度である。ワクチン製剤の投与回数は1回でもよいが、抗体産生量を高めるために、約2週間〜約6ヶ月の間隔をあけて、該ワクチン製剤を2〜4回投与することもできる。
本発明は、外来性の本発明のタンパク質をコードするDNA(以下、本発明の外来性DNAと略記する)またはその変異DNA(本発明の外来性変異DNAと略記する場合がある)を有する非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
(1)本発明の外来性DNAまたはその変異DNAを有する非ヒト哺乳動物、
(2)非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第(1)記載の動物、
(3)ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第(2)記載の動物、および
(4)本発明の外来性DNAまたはその変異DNAを含有し、哺乳動物において発現しうる組換えベクターを提供するものである。
本発明の外来性DNAまたはその変異DNAを有する非ヒト哺乳動物(以下、本発明のDNA転移動物と略記する)は、未受精卵、受精卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生における胚発生の段階(さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に8細胞期以前)に、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、DEAE−デキストラン法などにより目的とするDNAを転移することによって作出することができる。また、該DNA転移方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞などに目的とする本発明の外来性DNAを転移し、細胞培養、組織培養などに利用することもでき、さらに、これら細胞を上述の胚芽細胞と自体公知の細胞融合法により融合させることにより本発明のDNA転移動物を作出することもできる。
非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどが用いられる。なかでも、病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、また、繁殖が容易なゲッ歯動物、とりわけマウス(例えば、純系として、C57BL/6系統,DBA2系統など、交雑系として、B6C3F1系統,BDF1系統,B6D2F1系統,BALB/c系統,ICR系統など)またはラット(例えば、Wistar,SDなど)などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける「哺乳動物」としては、上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどがあげられる。
本発明の変異DNAとしては、元の本発明のDNAの塩基配列に変異(例えば、突然変異など)が生じたもの、具体的には、塩基の付加、欠損、他の塩基への置換などが生じたDNAなどが用いられ、また、異常DNAも含まれる。
該異常DNAとしては、異常な本発明のタンパク質を発現させるDNAを意味し、例えば、正常な本発明のタンパク質の機能を抑制するタンパク質を発現させるDNAなどが用いられる。
本発明の外来性DNAは、対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳動物由来のものであってもよい。本発明のDNAを対象動物に転移させるにあたっては、該DNAを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合したDNAコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。例えば、本発明のヒトDNAを転移させる場合、これと相同性が高い本発明のDNAを有する各種哺乳動物(例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど)由来のDNAを発現させうる各種プロモーターの下流に、本発明のヒトDNAを結合したDNAコンストラクト(例、ベクターなど)を対象哺乳動物の受精卵、例えば、マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明のDNAを高発現するDNA転移哺乳動物を作出することができる。
上記のDNA発現調節を行なうプロモーターとしては、例えば、(i)ウイルス(例、シミアンウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、JCウイルス、乳癌ウイルス、ポリオウイルスなど)に由来するDNAのプロモーター、(ii)各種哺乳動物(ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど)由来のプロモーター、例えば、アルブミン、インスリンII、ウロプラキンII、エラスターゼ、エリスロポエチン、エンドセリン、筋クレアチンキナーゼ、グリア線維性酸性タンパク質、グルタチオンS−トランスフェラーゼ、血小板由来成長因子β、ケラチンK1,K10およびK14、コラーゲンI型およびII型、サイクリックAMP依存タンパク質キナーゼβIサブユニット、ジストロフィン、酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、心房ナトリウム利尿性因子、内皮レセプターチロシンキナーゼ(一般にTie2と略される)、ナトリウムカリウムアデノシン3リン酸化酵素(Na,K−ATPase)、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインIおよびIIA、メタロプロティナーゼ1組織インヒビター、MHCクラスI抗原(H−2L)、H−ras、レニン、ドーパミンβ−水酸化酵素、甲状腺ペルオキシダーゼ(TPO)、ペプチド鎖延長因子1α(EF−1α)、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖1および2、ミエリン基礎タンパク質、チログロブリン、Thy−1、免疫グロブリン、H鎖可変部(VNP)、血清アミロイドPコンポーネント、ミオグロビン、トロポニンC、平滑筋αアクチン、プレプロエンケファリンA、バソプレシンなどのプロモーターなどが用いられる。なかでも、全身で高発現することが可能なサイトメガロウイルスプロモーター、ヒトペプチド鎖延長因子1α(EF−1α)のプロモーター、ヒトおよびニワトリβアクチンプロモーターなどが好適である。
上記ベクターは、DNA転移哺乳動物において目的とするメッセンジャーRNAの転写を終結する配列(一般にターミネターと呼ばれる)を有していることが好ましく、例えば、ウイルス由来および各種哺乳動物由来の各DNAの配列を用いることができ、好ましくは、シミアンウイルスのSV40ターミネターなどが用いられる。
正常な本発明のタンパク質の翻訳領域は、ヒトまたは各種哺乳動物(例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど)由来の肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来DNAおよび市販の各種ゲノムDNAライブラリーよりゲノムDNAの全てあるいは一部として、または肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来RNAより公知の方法により調製された相補DNAを原料として取得することが出来る。また、外来性の異常DNAは、上記の細胞または組織より得られた正常なタンパク質の翻訳領域を点突然変異誘発法により変異した翻訳領域を作製することができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうるDNAコンストラクトとして、前記のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常のDNA工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性DNAの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。DNA転移後の作出動物の胚芽細胞において、本発明の外来性DNAが存在することは、作出動物の後代がすべて、その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性DNAを保持することを意味する。本発明の外来性DNAを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性DNAを有する。
本発明の外来性正常DNAを転移させた非ヒト哺乳動物は、交配により外来性DNAを安定に保持することを確認して、該DNA保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性DNAの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。DNA転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の外来性DNAが過剰に存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性DNAを過剰に有することを意味する。本発明の外来性DNAを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性DNAを過剰に有する。
導入DNAを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該DNAを過剰に有するように繁殖継代することができる。
また、本発明の外来性正常DNAを転移させた哺乳動物は、遊離した本発明のタンパク質の増加症状を有することから、本発明のタンパク質に関連する疾患に対する予防・治療剤、例えば大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍または血液腫瘍などの癌の予防・治療剤のスクリーニング試験にも利用可能である。
一方、本発明の外来性異常DNAを有する非ヒト哺乳動物は、交配により外来性DNAを安定に保持することを確認して該DNA保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。さらに、目的とする外来DNAを前述のプラスミドに組み込んで原料として用いることができる。プロモーターとのDNAコンストラク卜は、通常のDNA工学的手法によって作製することができる。受精卵細胞段階における本発明の異常DNAの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保される。DNA転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の異常DNAが存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常DNAを有することを意味する。本発明の外来性DNAを受け継いだこの種の動物の子孫は、その胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常DNAを有する。導入DNAを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該DNAを有するように繁殖継代することができる。
また、具体的な利用可能性としては、本発明の異常DNA高発現動物は、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症における本発明の異常タンパク質による正常タンパク質の機能阻害(dominant negative作用)を解明するモデルとなる。
また、本発明の外来異常DNAを転移させた哺乳動物は、遊離した本発明のタンパク質の増加症状を有することから、本発明のタンパク質または機能不活性型不応症に対する予防・治療剤、例えば大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍または血液腫瘍などの癌の予防・治療剤のスクリーニング試験にも利用可能である。
また、上記2種類の本発明のDNA転移動物のその他の利用可能性として、例えば、
(i)組織培養のための細胞源としての使用、
(ii)本発明のDNA転移動物の組織中のDNAもしくはRNAを直接分析するか、またはDNAにより発現されたペプチド組織を分析することによる、本発明のタンパク質により特異的に発現あるいは活性化するペプチドとの関連性についての解析、
(iii)DNAを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、これらを使用して、一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
(iv)上記(iii)記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のスクリーニング、および
(v)本発明の変異タンパク質を単離精製およびその抗体作製などが考えられる。
また、本発明のDNA転移動物から各臓器を取り出し、細切後、トリプシンなどのタンパク質分解酵素により、遊離したDNA転移細胞の取得、その培養またはその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。さらに、本発明のタンパク質産生細胞の特定化、アポトーシス、分化あるいは増殖との関連性、またはそれらにおけるシグナル伝達機構を調べ、それらの異常を調べることなどができ、本発明のタンパク質およびその作用解明のための有効な研究材料となる。
さらに、本発明のDNA転移動物を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症を含む、本発明のタンパク質に関連する疾患の治療薬の開発を行なうために、上述の検査法および定量法などを用いて、有効で迅速な該疾患治療薬のスクリーニング法を提供することが可能となる。また、本発明のDNA転移動物または本発明の外来性DNA発現ベクターを用いて、本発明のタンパク質が関連する疾患のDNA治療法を検討、開発することが可能である。
本発明は、本発明のDNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
(1)本発明のDNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
(2)該DNAがレポーター遺伝子(例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子)を導入することにより不活性化された第(1)項記載の胚幹細胞、
(3)ネオマイシン耐性である第(1)項記載の胚幹細胞、
(4)非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第(1)項記載の胚幹細胞、
(5)ゲッ歯動物がマウスである第(4)項記載の胚幹細胞、
(6)本発明のDNAが不活性化された該DNA発現不全非ヒト哺乳動物、
(7)該DNAがレポーター遺伝子(例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子)を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のDNAに対するプロモーターの制御下で発現しうる第(6)項記載の非ヒト哺乳動物、
(8)非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第(6)項記載の非ヒト哺乳動物、
(9)ゲッ歯動物がマウスである第(8)項記載の非ヒト哺乳動物、および
(10)第(7)項記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のDNAに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のDNAに人為的に変異を加える方法としては、例えば、遺伝子工学的手法により該DNA配列の一部又は全部の削除、他DNAを挿入または置換させることによって行なうことができる。これらの変異により、例えば、コドンの読み取り枠をずらしたり、プロモーターあるいはエキソンの機能を破壊することにより本発明のノックアウトDNAを作製すればよい。
また、相同組換え法等により本発明のDNAを不活化させる元のES細胞としては、例えば、前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知 EvansとKaufmaの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスのES細胞の場合、現在、一般的には129系のES細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなES細胞を取得するなどの目的で例えば、C57BL/6マウスやC57BL/6の採卵数の少なさをDBA/2との交雑により改善したBDF1マウス(C57BL/6とDBA/2とのF1)を用いて樹立したものなども良好に用いうる。BDF1マウスは、採卵数が多く、かつ、卵が丈夫であるという利点に加えて、C57BL/6マウスを背景に持つので、これを用いて得られたES細胞は病態モデルマウスを作出したとき、C57BL/6マウスとバッククロスすることでその遺伝的背景をC57BL/6マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。
また、ES細胞を樹立する場合、一般には受精後3.5日目の胚盤胞を使用するが、これ以外に8細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率よく多数の初期胚を取得することができる。
また、雌雄いずれのES細胞を用いてもよいが、通常雄のES細胞の方が生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
また、第二次セレクションとしては、例えば、G−バンディング法による染色体数の確認等により行うことができる。得られるES細胞の染色体数は正常数の100%が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、ES細胞の遺伝子をノックアウトした後、正常細胞(例えば、マウスでは染色体数が2n=40である細胞)に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いやすいので、注意深く継代培養することが必要である。例えば、STO繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上でLIF(1〜10000 U/ml)存在下に炭酸ガス培養器内(好ましくは、5%炭酸ガス、95%空気または5%酸素、5%炭酸ガス、90%空気)で約37℃で培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン/EDTA溶液(通常0.001〜0.5%トリプシン/0.1〜5mM EDTA、好ましくは約0.1%トリプシン/1mM EDTA)処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などがとられる。このような継代は、通常1〜3日毎に行なうが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
ES細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔M. J. Evans及びM. H. Kaufman, Nature 第292巻、154頁、1981年;G. R. Martin Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 第78巻、7634頁、1981年;T. C. Doetschman ら、ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォロジー、第87巻、27頁、1985年〕、本発明のES細胞を分化させて得られる本発明のDNA発現不全細胞は、インビトロにおける本発明のタンパク質の細胞生物学的検討において有用である。
該非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物は、例えば、前述のようにして作製したターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、導入によりターゲッティングベクターの本発明のDNAが不活性化されたDNA配列が遺伝子相同組換えにより、マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の本発明のDNAと入れ換わる相同組換えをさせることにより、本発明のDNAをノックアウトさせることができる。
本発明のDNAがノックアウトされた細胞は、本発明のDNA上またはその近傍のDNA配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析またはターゲッティングベクター上のDNA配列と、ターゲッティングベクターに使用したマウス由来の本発明のDNA以外の近傍領域のDNA配列とをプライマーとしたPCR法による解析で判定することができる。非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、本発明のDNAが不活性化された細胞株をクローニングし、その細胞を適当な時期、例えば、8細胞期の非ヒト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。作出された動物は正常な本発明のDNA座をもつ細胞と人為的に変異した本発明のDNA座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。
該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明のDNA座をもつ場合、このようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、全ての組織が人為的に変異を加えた本発明のDNA座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コートカラーの判定等により選別することにより得られる。このようにして得られた個体は、通常、本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体であり、本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体同志を交配し、それらの産仔から本発明のタンパク質のホモ発現不全個体を得ることができる。
このようにして本発明のDNAがノックアウトされている個体は、交配により得られた動物個体も該DNAがノックアウトされていることを確認して通常の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。すなわち、該不活化DNAの保有する雌雄の動物を交配することにより、該不活化DNAを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得しうる。得られたホモザイゴート動物は、母親動物に対して、正常個体1,ホモザイゴート複数になるような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。ヘテロザイゴート動物の雌雄を交配することにより、該不活化DNAを有するホモザイゴートおよびヘテロザイゴート動物を繁殖継代する。
本発明のDNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、非常に有用である。
また、本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のタンパク質により誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、本発明のタンパク質の生物活性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、これらの疾病の原因究明及び治療法の検討に有用である。
本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のDNAの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニングに用いることができる。
すなわち、本発明は、本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、該動物の変化を観察・測定することを特徴とする、本発明のDNAの欠損や損傷などに起因する疾病、例えば癌などに対して治療・予防効果を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられる本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものがあげられる。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などがあげられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
具体的には、本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物を、試験化合物で処理し、無処理の対照動物と比較し、該動物の各器官、組織、疾病の症状などの変化を指標として試験化合物の治療・予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、例えば、経口投与、静脈注射などが用いられ、試験動物の症状、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択す
ることができる。また、試験化合物の投与量は、投与方法、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。
該スクリーニング方法において、試験動物に試験化合物を投与した場合、該試験動物の上記疾患症状が約10%以上、好ましくは約30%以上、より好ましくは約50%以上改善した場合、該試験化合物を上記の疾患に対して治療・予防効果を有する化合物として選択することができる。
該スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のタンパク質の欠損や損傷などによって引き起こされる疾患に対して治療・予防効果を有するので、該疾患に対する安全で低毒性な予防・治療剤などの医薬として使用することができる。さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸(例、無機酸、有機酸など)や塩基(例、アルカリ金属など)などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸(例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など)との塩、あるいは有機酸(例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など)との塩などが用いられる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のタンパク質を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物(例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど)に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、該化合物を経口投与する場合、一般的に成人(体重60kgとして)の乳癌患者においては、一日につき該化合物を約0.1〜100mg、好ましくは約1.0〜50mg、より好ましくは約1.0〜20mg投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の1回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、該化合物を注射剤の形で通常成人(体重60kgとして)の乳癌患者に投与する場合、一日につき該化合物を約0.01〜30mg、好ましくは約0.1〜20mg、より好ましくは約0.1〜10mgを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重60kg当たりに換算した量を投与することができる。
本発明は、本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のDNAに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
上記スクリーニング方法において、本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記した本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、本発明のDNAがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のDNAに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが用いられる。
試験化合物としては、前記と同様のものがあげられる。
レポーター遺伝子としては、前記と同様のものが用いられ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子(lacZ)、可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子などが好適である。
本発明のDNAをレポーター遺伝子で置換された本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物では、レポーター遺伝子が本発明のDNAに対するプロモーターの支配下に存在するので、レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレースすることにより、プロモーターの活性を検出することができる。
例えば、本発明のタンパク質をコードするDNA領域の一部を大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子(lacZ)で置換している場合、本来、本発明のタンパク質の発現する組織で、本発明のタンパク質の代わりにβ−ガラクトシダーゼが発現する。従って、例えば、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−ガラクトピラノシド(X−gal)のようなβ−ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用いて染色することにより、簡便に本発明のタンパク質の動物生体内における発現状態を観察することができる。具体的には、本発明のタンパク質欠損マウスまたはその組織切片をグルタルアルデヒドなどで固定し、リン酸緩衝生理食塩液(PBS)で洗浄後、X−galを含む染色液で、室温または37℃付近で、約30分ないし1時間反応させた後、組織標本を1mM EDTA/PBS溶液で洗浄することによって、β−ガラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色を観察すればよい。また、常法に従い、lacZをコードするmRNAを検出してもよい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のDNAに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物である。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸(例、無機酸など)や塩基(例、アルカリ金属など)などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸(例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など)との塩、あるいは有機酸(例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など)との塩などが用いられる。
さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のタンパク質またはその塩を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物(例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど)に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、本発明のDNAに対するプロモーター活性を阻害する化合物を経口投与する場合、一般的に成人(体重60kgとして)の乳癌患者においては、一日につき該化合物を約0.1〜100mg、好ましくは約1.0〜50mg、より好ましくは約1.0〜20mg投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の1回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、本発明のDNAに対するプロモーター活性を阻害する化合物を注射剤の形で通常成人(体重60kgとして)の乳癌患者に投与する場合、一日につき該化合物を約0.01〜30mg、好ましくは約0.1〜20mg、より好ましくは約0.1〜10mgを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重60kg当たりに換算した量を投与することができる。
このように、本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のDNAに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニングする上で極めて有用であり、本発明のDNA発現不全に起因する各種疾患の原因究明または予防・治療剤の開発に大きく貢献することができる。
また、本発明のタンパク質のプロモーター領域を含有するDNAを使って、その下流に種々のタンパクをコードする遺伝子を連結し、これを動物の卵細胞に注入していわゆるトランスジェニック動物(遺伝子移入動物)を作成すれば、特異的にそのタンパク質を合成させ、その生体での作用を検討することも可能となる。さらに上記プロモーター部分に適当なレポーター遺伝子を結合させ、これが発現するような細胞株を樹立すれば、本発明のタンパク質そのものの体内での産生能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物の探索系として使用できる。
DNA :デオキシリボ核酸
cDNA :相補的デオキシリボ核酸
A :アデニン
T :チミン
G :グアニン
C :シトシン
RNA :リボ核酸
mRNA :メッセンジャーリボ核酸
dATP :デオキシアデノシン三リン酸
dTTP :デオキシチミジン三リン酸
dGTP :デオキシグアノシン三リン酸
dCTP :デオキシシチジン三リン酸
ATP :アデノシン三リン酸
EDTA :エチレンジアミン四酢酸
EGTA :エチレングリコール-ビス-(ベータアミノエチルエーテル)四酢酸
SDS :ドデシル硫酸ナトリウム
Gly :グリシン
Ala :アラニン
Val :バリン
Leu :ロイシン
Ile :イソロイシン
Ser :セリン
Thr :スレオニン
Cys :システイン
Met :メチオニン
Glu :グルタミン酸
Asp :アスパラギン酸
Lys :リジン
Arg :アルギニン
His :ヒスチジン
Phe :フェニルアラニン
Tyr :チロシン
Trp :トリプトファン
Pro :プロリン
Asn :アスパラギン
Gln :グルタミン
pGlu :ピログルタミン酸
Sec :セレノシステイン(selenocysteine)
Me :メチル基
Et :エチル基
Bu :ブチル基
Ph :フェニル基
TC :チアゾリジン−4(R)−カルボキサミド基
Tos :p−トルエンスルフォニル
CHO :ホルミル
Bzl :ベンジル
Cl2-Bzl :2,6−ジクロロベンジル
Bom :ベンジルオキシメチル
Z :ベンジルオキシカルボニル
Cl−Z :2−クロロベンジルオキシカルボニル
Br−Z :2−ブロモベンジルオキシカルボニル
Boc :t−ブトキシカルボニル
DNP :ジニトロフェニル
Trt :トリチル
Bum :t−ブトキシメチル
Fmoc :N−9−フルオレニルメトキシカルボニル
HOBt :1−ヒドロキシベンズトリアゾール
HOOBt :3,4−ジヒドロ−3−ヒドロキシ−4−オキソ−
1,2,3−ベンゾトリアジン
HONB :1-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド
DCC :N,N’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
〔配列番号:1〕
FLJ20539のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号:2〕
配列番号:1で表されるアミノ酸配列を有するFLJ20539をコードするDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号:3〕
FLJ20539をコードする全長遺伝子を含むDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号:4〕
hCP50177のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号:5〕
配列番号:4で表されるアミノ酸配列を有するhCP50177のDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号:6〕
hCP50177の全長遺伝子を含むDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号:7〕
hCP1762319のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号:8〕
配列番号:7で表されるアミノ酸配列を有するhCP1762319のDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号:9〕
hCP1762319の全長遺伝子を含むDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号:10〕
FLJ13515のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号:11〕
配列番号:10で表されるアミノ酸配列を有するFLJ13515をコードするDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号:12〕
FLJ13515をコードする全長遺伝子を含むDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号:13〕
実施例2、実施例19、実施例20および実施例21で用いられたアンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
〔配列番号:14〕
実施例2、実施例19、実施例20および実施例21で用いられたアンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
〔配列番号:15〕
TACT427−Aのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号:16〕
配列番号:15で表されるアミノ酸配列を有するTACT427−AをコードするDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号:17〕
TACT427−A2のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号:18〕
配列番号:17で表されるアミノ酸配列を有するTACT427−A2をコードするDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号:19〕
TACT427−AおよびTACT427−A2をコードする全長遺伝子を含むDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号:20〕
TACT427−Bのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号:21〕
配列番号:20で表されるアミノ酸配列を有するTACT427−BをコードするDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号:22〕
TACT427−B2のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号:23〕
配列番号:22で表されるアミノ酸配列を有するTACT427−B2をコードするDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号:24〕
TACT427−BおよびTACT427−B2をコードする全長遺伝子を含むDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号:25〕
TACT427−Cのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号:26〕
配列番号:25で表されるアミノ酸配列を有するTACT427−CをコードするDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号:27〕
TACT427−C2のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号:28〕
配列番号:27で表されるアミノ酸配列を有するTACT427−C2をコードするDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号:29〕
TACT427−CおよびTACT427−C2をコードする全長遺伝子を含むDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号:30〕
実施例3で用いられたプライマー1の塩基配列を示す。
〔配列番号:31〕
実施例3で用いられたプライマー2の塩基配列を示す。
〔配列番号:32〕
実施例4で用いられたプライマー3の塩基配列を示す。
〔配列番号:33〕
実施例4で用いられたプライマー4の塩基配列を示す。
〔配列番号:34〕
実施例5で用いられたプライマー5の塩基配列を示す。
〔配列番号:35〕
実施例5で用いられたプライマー6の塩基配列を示す。
〔配列番号:36〕
実施例6、実施例7、実施例8、および実施例20で用いられたプライマー7の塩基配列を示す。
〔配列番号:37〕
実施例6、実施例7、実施例8、および実施例20で用いられたプライマー8の塩基配列を示す。
〔配列番号:38〕
実施例6、実施例7、実施例8、および実施例20で用いられたTaqManプローブ1の塩基配列を示す。
〔配列番号:39〕
実施例10で用いられたプライマー9の塩基配列を示す。
〔配列番号:40〕
実施例10で用いられたプライマー10の塩基配列を示す。
〔配列番号:41〕
実施例11で用いられたペプチド1のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号:42〕
実施例11で用いられたペプチド2のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号:43〕
実施例11で用いられたペプチド3のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号:44〕
実施例19、実施例20および実施例21で用いられたセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
後述の実施例4で得られた形質転換体Escherichia coli TOP10/47427A/pCR-BluntII-TOPOは、2002年12月3日から茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6(郵便番号305-8566)の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託番号FERM BP-8253として寄託されている。
後述の実施例4で得られた形質転換体Escherichia coli TOP10/47427B/pCR-BluntII-TOPOは、2002年12月3日から茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6(郵便番号305-8566)の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託番号FERM BP-8254として寄託されている。
後述の実施例5で得られた形質転換体Escherichia coli TOP10/47427C/pCR-BluntII-TOPOは、2002年12月3日から茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6(郵便番号305-8566)の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託番号FERM BP-8255として寄託されている。
乳癌組織および肺癌組織で特異的に発現亢進している遺伝子群を明らかにするため、乳癌組織8例、正常乳房組織4例から抽出されたtotal RNA(表1)、および肺癌組織4例、正常肺組織5例から抽出されたtotal RNA(表3)を材料とし、oligonucleotide microarray (Human Genome U95A, U95B, U95C, U95D, U95E;Affymetrix社) を用いて遺伝子発現解析を行った。
実験方法は、Affymetrix社の実験手引き書 (Expression analysis technical manual) に従った。その結果、乳癌組織(lot.0009-192-00101、lot.0009-192-00120、lot.0009-192-00153、lot.0009-192-00178)および肺癌組織(lot.0009-192-00122、lot.0011-192-01293、lot.0011-192-01297)においてそれぞれ正常乳房組織、正常肺組織に比べ、(1)FLJ20539遺伝子(配列番号:2)、FLJ20539関連遺伝子であるhCP50177遺伝子(配列番号:5)、FLJ20539関連遺伝子であるhCP1762319遺伝子(配列番号:8)ならびにFLJ13515遺伝子(配列番号:11)、および(2)後述の実施例4または実施例5で得られたTACT427-A遺伝子(配列番号:16)、TACT427-A2遺伝子(配列番号:18)、TACT427-B遺伝子(配列番号:21)、TACT427-B2遺伝子(配列番号:23)、TACT427-C遺伝子(配列番号:26)ならびにTACT427-C2遺伝子(配列番号:28)の発現亢進が検出された(表2および表4)。
本発明のタンパク質遺伝子の発現を抑制することにより、ヒト肺癌細胞株のアポトーシスが誘発されるか否かを調べた。
まず、アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)より購入したヒト非小細胞肺癌細胞株NCI-H460を、RPMI-1640培地(25mM HEPES含有)(Invitrogen社)に牛胎仔血清(ATCC)を10%加えた培地で懸濁し、1ウェル当たり4000個の細胞密度で96穴平底組織培養プレート(BDファルコン社)に播種した。5%炭酸ガス気流中、37℃で一晩培養した後、アンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクションした。
具体的には、(1)FLJ20539遺伝子(配列番号:2)、FLJ20539関連遺伝子であるhCP50177遺伝子(配列番号:5)、FLJ20539関連遺伝子であるhCP1762319遺伝子(配列番号:8)ならびにFLJ13515遺伝子(配列番号:11)、および(2)後述の実施例4または実施例5で得られたTACT427-A遺伝子(配列番号:16)、TACT427-A2遺伝子(配列番号:18)、TACT427-B遺伝子(配列番号:21)、TACT427-B2遺伝子(配列番号:23)、TACT427-C遺伝子(配列番号:26)ならびにTACT427-C2遺伝子(配列番号:28)のタンパク質コード領域配列または3’非翻訳領域にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチド配列(配列番号:13)を設計後、phosphorothioate化オリゴヌクレオチドを合成し、HPLC精製して導入実験に用いた(以下、アンチセンスオリゴヌクレオチドと略する)。コントロールとしては、配列番号:13で示される塩基配列のリバース配列(配列番号:14)を同様にphosphorothioate化し、HPLC精製して用いた(以下、コントロールオリゴヌクレオチドと略する)。
アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはコントロールオリゴヌクレオチドを、Opti-MEM(Invitrogen社)で希釈し、さらにFuGENE6試薬(Roche Diagnostics社)を4倍量(4μL/μgオリゴヌクレオチド)の割合で加えた混合液を室温で30分間放置した。このオリゴヌクレオチド溶液を、1ウェル当たり40μLの割合でプレートに添加した。オリゴヌクレオチドの終濃度は140nMとなるよう調整した。上記の条件で更に3日間培養した後、Cell Death Detection ELISAPLUSキット(Roche Diagnostics社)を用いて、添付プロトコールに従い上記オリゴヌクレオチドのアポトーシス誘導活性を測定した。
その結果、アンチセンスオリゴヌクレオチドは陰性対照として用いたコントロールオリゴヌクレオチドに比べ、約2.8倍のアポトーシス誘導活性を示し、統計学的に有意な差(P=0.0005)を示した(表5)。
アンチセンスオリゴヌクレオチド投与により、(1)FLJ20539遺伝子(配列番号:2)、FLJ20539関連遺伝子であるhCP50177遺伝子(配列番号:5)、FLJ20539関連遺伝子であるhCP1762319遺伝子(配列番号:8)ならびにFLJ13515遺伝子(配列番号:11)、および(2)後述の実施例4または実施例5で得られたTACT427-A遺伝子(配列番号:16)、TACT427-A2遺伝子(配列番号:18)、TACT427-B遺伝子(配列番号:21)、TACT427-B2遺伝子(配列番号:23)、TACT427-C遺伝子(配列番号:26)ならびにTACT427-C2遺伝子(配列番号:28)の発現量が低下するか否か調べた。
実施例2で用いたヒト非小細胞肺癌細胞株NCI-H460を実施例2と同じ培地に懸濁し、1ウェル当たり24,000個の細胞密度で24穴平底組織培養プレート(BDファルコン社)に播種した。5%炭酸ガス気流中、37℃で一晩培養した後、アンチセンスオリゴヌクレオチドとコントロールオリゴヌクレオチドをトランスフェクションした。オリゴヌクレオチド溶液の添加量は1ウェル当たり390μLとし、オリゴヌクレオチドの終濃度は200nMとなるよう調整した。トランスフェクション後、5%炭酸ガス気流中、37℃で24時間培養を継続した後にRNeasy Mini Total RNA Kit(QIAGEN社)を用いてトータルRNAを抽出した。約400 ngのトータルRNAを鋳型として、TaqMan Reverse Transcription Reagents(Applied Biosystems社)を用いて添付プロトコールに従い逆転写反応を行った。トータルRNAにして10 ngに相当するcDNAを鋳型とし、2種類のプライマー〔プライマー1(配列番号:30)およびプライマー2(配列番号:31)〕とSYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems社)を用いて、(1)FLJ20539遺伝子(配列番号:2)、FLJ20539関連遺伝子であるhCP50177遺伝子(配列番号:5)、FLJ20539関連遺伝子であるhCP1762319遺伝子(配列番号:8)ならびにFLJ13515遺伝子(配列番号:11)、および(2)後述の実施例4で得られたTACT427-A遺伝子(配列番号:16)、TACT427-A2遺伝子(配列番号:18)、TACT427-B遺伝子(配列番号:21)、TACT427-B2遺伝子(配列番号:23)、TACT427-C遺伝子(配列番号:26)ならびにTACT427-C2遺伝子(配列番号:28)の発現コピー数を測定した。
同量の鋳型cDNA中に含まれるβ-アクチン遺伝子発現量をTaqMan β-actin Control Reagents(Applied Biosystems社)を用いて測定し内部標準とした。アンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクションしない場合には、上記10遺伝子の発現量はβ-アクチン遺伝子の発現量の0.10%であったのに対し、配列番号:13で示されるアンチセンスオリゴヌクレオチド投与群では0.046%であり統計学的に有意(P≦0.05)な発現量低下が認められた。一方、コントロールオリゴヌクレオチド(配列番号:14)投与群では0.088%であり非トランスフェクション群と比べて統計学的に有意な発現量低下は認められなかった。この結果より、上記10遺伝子の発現量の低下によりヒト肺癌細胞株のアポトーシスが誘発されたことが示された。
ヒト脳Marathon-Ready cDNA(CLONTECH社)を鋳型とし、2種のプライマー〔プライマー3(配列番号:32)およびプライマー4(配列番号:33)〕を用いてPCR反応を行った。該反応における反応液の組成は、上記cDNA1μlを鋳型として使用し、PfuTurbo DNA Polymerase(STRATAGENE社)6.25U、プライマー3(配列番号:32)およびプライマー4(配列番号:33)を各1.0μM、dNTPsを200μM、およびPfu Buffer(STRATAGENE社)を5μl加え、50μlの液量とした。PCR反応は、95℃・1分の後、95℃・10秒、55℃・30秒、72℃・6分のサイクルを40回繰り返した。該PCR反応産物をPCR Purification Kit(QIAGEN社)を用いて精製した。これをZero Blunt TOPO PCRクローニングキット(Invitrogen社)の処方に従いプラスミドベクターpCR-BluntII-TOPO(Invitrogen社)へサブクローニングした。これを大腸菌TOP10に導入し、cDNAを持つクローンをカナマイシンを含むLB寒天培地中で選択した。個々のクローンの配列を解析した結果、配列番号:16および配列番号:21で表されるcDNAの塩基配列をそれぞれ得た。
配列番号:3で表されるFLJ20539全長遺伝子塩基配列の1〜160番目および2483〜2755番目の塩基配列を、配列番号:16で表される塩基配列の5’端および3’端にそれぞれ付加した塩基配列を、配列番号:19に示す。
配列番号:3で表されるFLJ20539全長遺伝子塩基配列の1〜160番目および2483〜2755番目の塩基配列を、配列番号:21で表される塩基配列の5’端および3’端にそれぞれ付加した塩基配列を、配列番号:24に示す。
配列番号:16で表される塩基配列を有するDNA断片を有するプラスミドをTACT427-A/pCR-BluntII-TOPOと、配列番号:21で表される塩基配列を有するDNA断片を有するプラスミドをTACT427-B/pCR-BluntII-TOPOと名付けた。
配列番号:16で表される塩基配列がコードするアミノ酸配列(配列番号:15)を含有するタンパク質をTACT427-Aと命名した。
配列番号:21で表される塩基配列がコードするアミノ酸配列(配列番号:20)を含有するタンパク質をTACT427-Bと命名した。
さらに、プラスミドTACT427-A/pCR-BluntII-TOPOが導入された形質転換体をEscherichia coli TOP10/47427A/pCR-BluntII-TOPOと、プラスミドTACT427-B/pCR-BluntII-TOPOが導入された形質転換体をEscherichia coli TOP10/47427B/pCR-BluntII-TOPOとそれぞれ命名した。
TACT427-Bのアミノ酸配列(配列番号:20)では、TACT427-Aのアミノ酸配列(配列番号:15)の278番目のArgがGlnに、825番目のGluがLysに、826番目のAlaがProに、970番目のValがAlaにそれぞれ置換され、340番目のSerが欠失している。
TACT427-BをコードするDNAの塩基配列(配列番号:21)では、TACT427-AをコードするDNAの塩基配列(配列番号:16)の833番目のgがaに、1482番目のgがcに、1590番目のaがgに、2473番目のgがaに、2476番目のgがcに、2909番目のtがcにそれぞれ置換され、1015〜1017番目のagcが欠失している。
TACT427-Aのアミノ酸配列の1〜4番目のアミノ酸配列が欠失している配列を配列番号:17に示す。配列番号:17で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をTACT427-A2と命名する。TACT427-A2をコードするDNAの塩基配列を配列番号:18に示す。
TACT427-Bのアミノ酸配列の1〜4番目のアミノ酸配列が欠失している配列を配列番号:22に示す。配列番号:22で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をTACT427-B2と命名する。TACT427-B2をコードするDNAの塩基配列を配列番号:23に示す。
TACT427-AをコードするDNAの塩基配列(配列番号:16)は、ヒトではFLJ20539をコードするDNAの塩基配列(配列番号:2)に最も高い相同性を示した。配列番号:16で表される塩基配列の1〜138番目および889〜3072番目の塩基配列に対しては、配列番号:2で表される塩基配列の1〜138番目および139〜2322番目の塩基配列が対応し、各部分配列において、99.3%および100%の相同性をそれぞれ示す。FLJ20539をコードするDNAの塩基配列(配列番号:2)は、TACT427-AをコードするDNAの塩基配列(配列番号:16)の139〜888番目に相当する塩基配列を欠いていることより、この配列はTACT427-Aに特異的な配列である。
TACT427-A2、TACT427-BおよびTACT427-B2についても、TACT427-Aと同様に、FLJ20539に最も高い相同性を示し、かつ、同様な塩基置換および塩基配列の欠失を有する。
TACT427-Aのアミノ酸配列(配列番号:15)の735〜792番目までのアミノ酸配列、TACT427-A2のアミノ酸配列(配列番号:17)の731〜788番目までのアミノ酸配列、TACT427-Bのアミノ酸配列(配列番号:20)の734〜791番目までのアミノ酸配列、およびTACT427-B2のアミノ酸配列(配列番号:22)の730〜787番目までのアミノ酸配列は、ともにアミノ酸ドメインモチーフ検索サイトSMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)での検索で、クロロパーオキシダーゼモチーフを有することからクロロパーオキシダーゼ活性を持つと考えられる。
TACT427-Aの疎水性プロット図を〔図1〕に、TACT427-A2の疎水性プロット図を〔図2〕に、TACT427-Bの疎水性プロット図を〔図3〕に、TACT427-B2の疎水性プロット図を〔図4〕にそれぞれ示す。
ヒト非小細胞肺癌細胞株NCI-H522(ATCCより購入)をRPMI-1640培地(Invitrogen社)に牛胎仔血清を10%加えた培地で培養し、RNeasy Mini Total RNA Kit(QIAGEN社)を用いてトータルRNAを抽出した。トータルRNAを鋳型として、TaqMan Reverse Transcription Reagents(Applied Biosystems社)を用いて添付プロトコールに従い逆転写反応しcDNAを得た。ここで得られたcDNAを鋳型とし、2種のプライマー〔プライマー5(配列番号:34)およびプライマー6(配列番号:35)〕を用いてPCR反応を行った。該反応における反応液の組成は上記cDNAを鋳型として使用し、PfuTurbo Hotstart DNA Polymerase(STRATAGENE社)2.5 U、プライマー5(配列番号:34)およびプライマー6(配列番号:35)を各1.0μM、dNTPsを200μM、およびGC BufferI(TaKaRa社)を10μl加え、20μlの液量とした。PCR反応は、95℃・1分の後、95℃・30秒、60℃・20秒、72℃・3分のサイクルを35回繰り返した。該PCR反応産物をアガロースゲルにて電気泳動後、MinElute Gel Extraction Kit(QIAGEN社)を用いて精製した。これをZero Blunt TOPO PCRクローニングキット(Invitrogen社)の処方に従いプラスミドベクターpCR-BluntII-TOPO(Invitrogen社)へサブクローニングした。これを大腸菌TOP10に導入し、cDNAを持つクローンをカナマイシンを含むLB寒天培地中で選択した。個々のクローンの配列を解析した結果、配列番号:26で表されるcDNAの塩基配列を得た。
配列番号:3で表されるFLJ20539全長遺伝子塩基配列の1〜160番目および2483〜2755番目の塩基配列を、配列番号:26で表される塩基配列の5’端および3’端にそれぞれ付加した塩基配列を、配列番号29:に示す。
配列番号:26で表される塩基配列を有するDNA断片を有するプラスミドをTACT427-C/pCR-BluntII-TOPOと名付けた。
配列番号:26で表されるDNAの塩基配列がコードするアミノ酸配列(配列番号:25)を含有するタンパク質をTACT427-Cと命名した。
プラスミドTACT427-C/pCR-BluntII-TOPOが導入された形質転換体を、Escherichia coli TOP10/47427C/pCR-BluntII-TOPOと命名した。
TACT427-Cのアミノ酸配列(配列番号:25)では、TACT427-Aのアミノ酸配列(配列番号:15)の491番目のValがMetに、825番目のGluがLysに、826番目のAlaがProに、970番目のValがAlaにそれぞれ置換され、340番目のSerが欠失している。
TACT427-CをコードするDNAの塩基配列(配列番号:26)では、TACT427-AをコードするDNAの塩基配列(配列番号:16)の504番目のaがcに、939番目のaがgに、1471番目のgがaに、1482番目のgがcに、1590番目のaがgに、2473番目のgがaに、2476番目のgがcに、2909番目のtがcにそれぞれ置換され、1015〜1017番目のagcが欠失している。
TACT427-Cのアミノ酸配列の1〜4番目のアミノ酸配列が欠失している配列を配列番号:27に示す。配列番号:27で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をTACT427-C2と命名する。TACT427-C2をコードするDNAの塩基配列を配列番号:28に示す。
TACT427-CをコードするDNAの塩基配列(配列番号:26)は、ヒトではFLJ20539をコードするDNAの塩基配列(配列番号:2)に最も高い相同性を示した。配列番号:26で表される塩基配列の1〜138番目および886〜3069番目のDNA塩基配列に対しては、配列番号:2で表される塩基配列の1〜138番目および139番目〜2322番目の塩基配列が対応し、各部分配列において、99.3%および99.5%の相同性をそれぞれ示す。FLJ20539コードするDNAの塩基配列(配列番号:2)は、TACT427-C(配列番号:26)で表される139〜885番目に相当するDNA塩基配列を欠いていることより、この配列は、TACT427-Cに特異的な配列である。TACT427-C2についても、TACT427-Cと同様にFLJ20539に最も高い相同性を示し、かつ同様な塩基配列の欠失を有する。
TACT427-Cのアミノ酸配列(配列番号:25)の734〜791番目までの配列およびTACT427-C2のアミノ酸配列(配列番号:27)の730〜787番目までの配列は、ともにアミノ酸ドメインモチーフ検索サイトSMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)での検索でクロロパーオキシダーゼモチーフを有することからクロロパーオキシダーゼ活性を持つと考えられる。
TACT427-Cの疎水性プロット図を〔図5〕に、TACT427-Cの疎水性プロット図を〔図6〕に示す。
TACT427-Aタンパク質(配列番号:15)、TACT427-A2タンパク質(配列番号:17)、TACT427-Bタンパク質(配列番号:20)、TACT427-B2タンパク質(配列番号:22)、TACT427-Cタンパク質(配列番号:25)およびTACT427-C2タンパク質(配列番号:27)をまとめてTACT427タンパク質と略記することもある。
ヒト癌組織における遺伝子発現量の検討(その1)
ヒト癌患者組織(乳癌、肺癌、大腸癌、直腸癌、卵巣癌)由来のMatched Tumor/Normal cDNA Pair(CLONTECH社)を鋳型として、FAM標識したTaqManプローブを用いた定量的PCR反応を行うことにより、癌組織と正常組織でのFLJ20539遺伝子(配列番号:2)、hCP50177遺伝子(配列番号:5)、hCP1762319遺伝子(配列番号:8)ならびにFLJ13515遺伝子(配列番号:11)、および実施例4または実施例5で得られたTACT427遺伝子の発現量を測定した。
該反応における反応液の組成は、上記cDNA 1μlを鋳型として使用し、TaqManTM Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems社)を7.5μl、プライマー7(配列番号:36)およびプライマー8(配列番号:37)を各0.5μM、TaqManプローブ1(配列番号:38)を100nMとなるよう加え、15μlの液量とした。PCR反応は、50℃・2分、95℃・10分の後、95℃・15秒、60℃・1分のサイクルを40回繰り返した。
その結果、上記遺伝子の総量は、ヒト乳癌組織4例中2例で周辺正常組織に比べそれぞれ約7倍、約16倍の、ヒト肺癌組織3例中2例で周辺正常組織に比べそれぞれ約3倍、約2倍の、ヒト大腸癌組織5例中4例で周辺正常組織に比べそれぞれ約2倍、約8倍、約3倍、約4倍の、ヒト直腸癌組織3例中2例で周辺正常組織に比べ約10倍、約5倍の、ヒト卵巣癌組織5例中2例で周辺正常組織に比べそれぞれ約3倍、約20倍の発現量を示した。
これより、上記遺伝子の総量は、癌組織において顕著に発現上昇していることがわかる。
ヒト肺癌組織(Direct Clinical Access社、およびBioClinical Partners社より購入)より調製したcDNAを鋳型として実施例6と同様の方法により、癌組織、および正常組織における実施例6で用いた遺伝子の発現量の比較を行った。
該反応における反応液の組成は上記cDNA 1μlを鋳型として使用し、実施例6と同一条件でPCR反応を行った。並行してTaqManTM Human β-actin Control Reagents(Applied Biosystems社)を用いて上記cDNA 1μlに含まれるβ-アクチン遺伝子のコピー数を算出し内部標準とした。β-アクチン遺伝子発現量で標準化した場合、上記遺伝子の総量は、DirectClinical Access社のサンプルでは、正常肺組織に比べてヒト肺癌組織10例中8例で約144倍、約3倍、約5倍、約4倍、約4倍、約13倍、約3倍、約19倍に増加しており、ヒト肺癌組織における顕著な発現上昇がみられた。
また、BioClinical Partners社のサンプルでは、上記遺伝子の総量がβ-アクチン遺伝子発現量の1%を超えるものが、正常肺組織では7例中1例であったのに対し、ヒト肺癌組織では11例中5例と高頻度に認められた。
これより、上記遺伝子がヒト肺癌組織において顕著に発現上昇していることが示された。
以下で使用される脳腫瘍細胞株SK-N-MC、SK-N-AS、SK-N-BE、SK-N-DZ、SK-N-FI、SK-N-SH、D341Med、Daoy、DBTRG-05MG、U-118 MG、U-87 MG、CCF-STTG1およびSW 1088;ヒト乳癌細胞株HCC1937、ZR-75-1、AU565、MCF-7およびMDA-MB-231;ヒト大腸癌細胞株Caco-2、COLO201、COLO 205、COLO 320DM、HCT-8、HT-29、LoVo、LS123、SNU-C1、SK-CO-1、SW 403、SW 48、SW480、SW 620、SW 837およびSW 948;ヒト胎児腎臓細胞株HEK293;ヒト小細胞肺癌細胞株NCI-H187、NCI-H378、NCI-H526、NCI-H889、NCI-H1672、NCI-H1836、NCI-H2227、NCI-N417およびSHP-77;ヒト非小細胞肺癌細胞株A549、NCI-H23、NCI-H226、NCI-H358、NCI-H460、NCI-H522、NCI-H661、NCI-H810、NCI-H1155、NCI-H1299、NCI-H1395、NCI-H1417、NCI-H1435、NCI-H1581、NCI-H1651、NCI-H1703、NCI-H1793、NCI-H1963、NCI-H2073、NCI-H2085、NCI-H2106、NCI-H2228、NCI-H2342およびNCI-H2347;ヒト卵巣癌細胞株ES-2、Caov-3、MDAH2774、NIH:OVCAR3、OV-90、SK-OV-3、TOV-112DおよびTOV-21G;ヒト膵臓癌細胞株PANC-1、MIA-PaCa-2、AsPC-1、BxPC-3、Capan-1およびCapan-2;ヒト前立腺癌細胞株DU145;ヒト網膜芽腫細胞株WERI-Rb-1およびY79;ヒト精巣癌細胞株Cates-1Bの86株は、ATCCより購入した。ヒト正常気道上皮細胞SAECおよびヒト正常前立腺上皮細胞HPrECは、Clonetics社より購入した。ヒト大腸癌細胞株COCM1、ヒト非小細胞肺癌細胞株VMRC-LCDおよびヒト前立腺癌細胞株PC3は、JCRBより購入した。これら細胞株は実施例9以降の実施例でも用いることがある。
上記記載の細胞株91株よりRNeasy Mini Total RNA Kit(QIAGEN社)を用いてトータルRNAを調製した。このトータルRNAを鋳型としてTaqMan Reverse Transcription Reagents(Applied Biosystems社)の添付プロトコールに従い、ランダムプライマーを用いた逆転写反応でcDNAを調製した。このcDNAを鋳型として定量的PCR反応を行うことにより、遺伝子FLJ20539遺伝子(配列番号:2)、hCP50177遺伝子(配列番号:5)、hCP1762319遺伝子(配列番号:8)ならびにFLJ13515遺伝子(配列番号:11)、およびTACT427遺伝子の発現量の検討を行った。
該反応は上記トータルRNA 5 ngより得られたcDNAを鋳型として使用し、実施例6と同様の方法により行った。並行してTaqManTM Human β-actin Control Reagents(Applied Biosystems社)を用いて上記トータルRNA 1 ngに含まれるβ-アクチン遺伝子のコピー数を算出し内部標準とした。
上記遺伝子全体の発現量を、β-アクチン遺伝子発現量で標準化した相対的発現率を〔表6〕および〔表7〕に示す。
上記遺伝子発現量の総量がβ-アクチン遺伝子発現量の1%を超える癌細胞株が13株見出され、上記遺伝子の癌細胞株における高発現が認められた。
TACT427-Aタンパク質およびTACT427-Bタンパク質のC末端に3xFLAGタグを融合したタンパク質を発現する動物細胞用発現ベクターを構築した。
実施例4で得たTACT427-A/pCR-BluntII-TOPO、TACT427-B/pCR-BluntII-TOPO、およびp3xFLAG-CMV-14(Sigma社)を制限酵素EcoRIおよびXbaIにて処理し、アガロースゲル電気泳動で分離後、TACT427-A、TACT427-Bおよびp3xFLAG-CMV-14に相当するDNA断片を回収し、Gel Extraction Kit(QIAGEN社)を用いて精製した。それぞれのDNA断片をDNA Ligation Kit ver.2(Takara Bio社)を用いてライゲーション反応を行った後、大腸菌TOP10に導入し、アンピシリンを含むLB寒天培地中で選択した。個々のクローンの配列を解析した結果、TACT427-Aタンパク質(配列番号:15)、およびTACT427-Bタンパク質(配列番号:20)をコードするcDNA配列を有する動物細胞用発現ベクターp3xFLAG-TACT427-A、およびp3xFLAG-TACT427-Bを得た。
TACT427-Aタンパク質(配列番号:15)を発現する動物細胞用発現ベクターを構築した。
実施例9で得られたp3xFLAG-TACT427-Aを鋳型とし、プライマー9(配列番号:39)およびプライマー10(配列番号:40)を用いてPCR反応を行った。該反応における反応液の組成はp3xFLAG-TACT427-A200 ngを鋳型として使用し、Pfu Turbo Hotstart DNA Polymerase(STRATAGENE社)を2.5 U、プライマー9(配列番号:39)およびプライマー10(配列番号:40)を各1μM、dNTPsを200μM、およびGC Buffer I(Takara Bio社)を25μl加え、50μlの液量とした。PCR反応は、95℃・1分の後、95℃・15秒、60℃・15秒、72℃・3分のサイクルを25回繰り返し行った。次にPCR Purification Kit(QIAGEN社)にて該PCR反応産物を精製した後、制限酵素XbaIおよびEcoRIにて処理した。pcDNA3.1(+)(Invitrogen社)も制限酵素XbaIおよびEcoRIにて処理した。これらをアガロースゲル電気泳動で分離後、TACT427-Aタンパク質をコードする塩基配列を含むDNA断片とpcDNA3.1(+)に相当するDNA断片をそれぞれ回収し、Gel Extraction Kit(QIAGEN社)を用いて精製した。それぞれのDNA断片をDNA Ligation Kit ver.2(Takara Bio社)を用いてライゲーション反応を行った後、大腸菌TOP10に導入し、アンピシリンを含むLB寒天培地中で選択した。個々のクローンの配列を解析した結果、TACT427-Aタンパク質をコードするcDNA配列を有する動物細胞用発現ベクターpcDNA3.1(+)-TACT427-Aを得た。
TACT427タンパク質のアミノ酸配列に基づき、15アミノ酸からなる以下の3種のペプチド(ペプチド1〜3)をFmoc固相合成法を用いて合成した。
ペプチド1のアミノ酸配列〔Gly-Ser-Gly-Glu-Glu-Asn-Asp-Pro-Gly-Glu-Gln-Ala-Leu-Pro-Cys(配列番号:41)〕は、TACT427-Aタンパク質(配列番号:15)の220番目から233番目までのアミノ酸配列のC末端に、Cysを付加した配列である。
ペプチド2〔Gly-Pro-Ala-Glu-Gly-Pro-Ala-Glu-Pro-Ala-Ala-Glu-Ala-Ser-Cys(配列番号:42)〕のアミノ酸配列は、TACT427-Aタンパク質(配列番号:15)の517番目から530番目までのアミノ酸配列のC末端に、Cysを付加した配列である。
ペプチド3のアミノ酸配列〔Gly-Ser-Val-Gly-Gly-Asn-Thr-Gly-Val-Arg-Gly-Lys-Phe-Glu-Cys(配列番号:43)〕は、TACT427-Aタンパク質(配列番号:15)の800番目から813番目までのアミノ酸配列のC末端に、Cysを付加した配列である。
上記ペプチド1、ペプチド2およびペプチド3のそれぞれのペプチドに、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)をキャリアータンパク質として結合させ抗原とし、以下のように、ウサギポリクローナル抗体を作製した。
免疫動物は雄性ウサギKBL:JW(11週齢、オリエンタル酵母)一羽を用い、初回感作は完全フロインドアジュバンド(Difco社)懸濁液、2回目以降は不完全フロインドアジュバンド(Difco社)懸濁液を用いた。感作は背部皮下注射により行い、1回の感作には各抗原0.5mgを用い、初回感作後14日毎に3回繰り返した。初回感作後52日目に麻酔下頚動脈採血を行い、血清約50mlを得た。このようにして得られた血清を硫酸アンモニウム塩析法により濃縮し、得られた粗IgG画分全量をプロテインAアフィニティーカラム(Amersham-Bioscience社)により精製し、ペプチド1、ペプチド2またはペプチド3を免疫したウサギから、それぞれ約223mg、約495 mgおよび約390 mgの精製IgGを得た。さらにペプチド1に対する精製IgG 111mg、ペプチド2に対する精製IgG 248mgおよびペプチド3に対する精製IgG195mgを材料として、各々の免疫源ペプチドを固定化したカラムに結合するIgG画分を取得した。固定化には各ペプチドのC末端のCysを利用し、ホウ酸緩衝液を用いてセファロースカラム(Amersham-Bioscience社)にカップリングした。カラムからの溶出には8M尿素/リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)を用いた。溶出液をPBSに対して透析して尿素を除いた後、限外濃縮、フィルターろ過滅菌することにより、ペプチド1、ペプチド2およびペプチド3に対するアフィニティー精製抗体AS-2480、AS-2481およびAS-2482を、約3.7mg、約0.69 mgおよび約17 mgずつ取得した。
TACT427-Aタンパク質(配列番号:15)の検出は、実施例11で作製したペプチド抗体を含むウサギ血清を用いて行った。ヒト胎児腎臓由来HEK293細胞1.0×106個を10%牛胎仔血清(JRH社)を含むダルベッコ改変型イーグル最少培地(Invitrogen社)9 mlに懸濁し、直径10cmのぺトリディッシュに播種した。5%炭酸ガス気流下、37℃で一晩培養した後、予めFuGene6トランスフェクション試薬18μl(Roche Diagnostics社)およびOPTI-MEM I(Invitrogen社)と混合し室温で15分間放置しておいたp3xFLAG-TACT427-A 6μgを添加し同条件で培養を継続した。2日後に細胞をPBSで洗浄後、氷冷したRIPA緩衝液〔50mMトリス・塩酸緩衝液、pH 7.5、150 mM 塩化ナトリウム、1%Triton X-100、0.1%SDS、1%デオキシコール酸、CompleteTMタブレット(Roche Diagnostics社)、Phosphatase Inhibitor Cocktail-2(Sigma社)〕800μlを添加し4℃で15分間放置した。このRIPA緩衝液を回収し、15,000rpmで20分間遠心分離した上澄液を無細胞抽出液とし、20μlを7.5%アクリルアミドゲルでのSDS-PAGEに供した。泳動分離したタンパク質は、常法に従いクリアブロットP膜(ATTO社)に転写した後、ブロッキング溶液(トリス緩衝化生理食塩水、0.1%Tween-20、5%スキムミルク)中に1時間室温放置した。次に実施例11で作製したペプチド抗体AS-2480、AS-2481またはAS-2482を含む3種類のウサギ血清を、ブロッキング溶液中で各々100倍に希釈して加え、4℃にて一晩インキュベートし、続いてHRP標識抗ウサギIgG抗体(Amersham-Bioscience社)をブロッキング溶液で10万倍に希釈した2次抗体溶液中で1時間室温放置した。検出はECL plus(Amersham-Bioscience社)の添付プロトコールに従い行った。
ペプチド抗体AS-2480、AS-2481またはAS-2482を含む3種類のウサギ血清のいずれを用いても、分子量150kD近傍の位置にTACT427-Aタンパク質に由来する特異的なバンドが認められた。
実施例11で作製したペプチド抗体を用いて、TACT427-Aタンパク質に対する免疫沈降を非変性状態にて行った。
実施例9で得たp3xFLAG-TACT427-Aを用いて実施例12と同様の操作で調製した無細胞抽出液1mlに、Protein G-Sepharose 4FF(Amersham-Bioscience社)懸濁液(等容量のRIPA緩衝液で懸濁したもの)50μlとウサギ血清3μlとを加え、4℃にて一晩撹拌を行った。ウサギ血清としては、実施例11で作製したペプチド抗体AS-2480、AS-2481またはAS-2482を含む3種類のウサギ血清のいずれかを用いた。ProteinG-Sepharose 4FF共沈殿画分をRIPA緩衝液にて洗浄後、1% 2-メルカプトエタノールを含むSDS-PAGE用サンプルバッファー(Bio Rad社)50μlに懸濁し95℃で5分間加熱した後、20μlを7.5%アクリルアミドゲルでのSDS-PAGEに供した。検出は実施例12に記載の方法に準じた。但し一次抗体としてマウス抗FLAGM2抗体(Sigma社)をブロッキング溶液で10μg/mlとなるよう希釈したもの、二次抗体としてHRP標識抗マウスIgG抗体(Amersham-Bioscience社)をブロッキング溶液で5万倍に希釈したものを用いた。ペプチド抗体AS-2480、AS-2481またはAS-2482を含む3種類のウサギ血清のいずれを用いて免疫沈降を行った場合にも、分子量150kD近傍にTACT427-Aタンパク質に由来する特異的なバンドが認められた。
これより、ペプチド抗体AS-2480、AS-2481およびAS-2482は、未変性のTACT427-Aタンパク質と結合することが明らかとなった。
直径10cmのぺトリディッシュに播種した肺癌細胞株A549、NCI-H226ならびにNCI-H522および乳癌細胞株ZR-75-1をPBSで洗浄後、実施例12に記載の方法に従い無細胞抽出液を作製した。A549、NCI-H226、NCI-H522およびZR-75-1の無細胞抽出液各々1mlに、ProteinG-Sepharose 4FF(Amersham-Bioscience社)懸濁液(等容量のRIPA緩衝液で懸濁したもの)50μlと、実施例11で作製したペプチド抗体AS-2482を3μg加え、4℃にて一晩撹拌を行った。ProteinG-Sepharose 4FF共沈殿画分をRIPA緩衝液にて洗浄後、1% 2-メルカプトエタノールを含むSDS-PAGE用サンプルバッファー(Bio Rad社)50μlに懸濁し95℃で5分間加熱した後、20μlを7.5%アクリルアミドゲルでのSDS-PAGEに供した。ペプチド抗体AS-2482を用いて実施例12に記載の方法に準じて検出を行った。
A549、NCI-H226、NCI-H522およびZR-75-1のいずれにおいても、分子量150kD近傍に、TACT427タンパク質に由来する特異的なバンドが認められた。
これより、上記タンパク質が上記5種類の癌細胞株で発現していることが明らかとなった。
ヒト胎児腎臓由来HEK293細胞1×105個を10%牛胎仔血清(JRH社)を含むダルベッコ改変型イーグル最少培地(Invitrogen社)に懸濁し、2ウェル ポリ-D-リジンコートカルチャースライド(BDファルコン社)に播種した。同様に5×104個のヒト非小細胞肺癌細胞株NCI-H460を10%牛胎仔血清(JRH社)を含むRPMI1640培地(Invitrogen社)に懸濁し2ウェル ポリ-D-リジンコートカルチャースライド(BDファルコン社)に播種した。5%炭酸ガス気流下、37℃で一晩培養した後、予めFuGene6トランスフェクション試薬5.3μl(Roche Diagnostics社)およびOPTI-MEM I(Invitrogen社)と混合し室温で15分間放置しておいたp3xFLAG-TACT427-A 1.33μgを添加し同条件で培養を継続した。2日後に細胞をPBSで洗浄後、10%中性ホルマリン緩衝液を加え室温で30分間固定した。その後PBSで0.1%に希釈したTritonX-100を加え室温で5分放置した後、再びPBSで洗浄し、更に1% BSAを含むPBSを加え4℃で24時間放置し、抗体の非特異的結合サイトをブロックした。次に1% BSAを含むPBSで10μg/mlとなるよう希釈したマウス抗FLAG M2抗体(Sigma社)を加え、室温で45分間反応させてからPBSで洗浄し、続いて1% BSAを含むPBSで10μg/mlとなるよう希釈したAlexa488標識抗マウスIgG抗体(Molecular Probes社)を加えた。再び室温で45分間反応させてからPBSで洗浄した後、蛍光顕微鏡により観察した。
その結果、TACT427-Aタンパク質は、HEK293、NCI-H460のいずれにおいても細胞質膜上に発現していることが明らかとなった。
また同様の方法でHEK293細胞に、pcDNA3.1(+)-TACT427-Aプラスミドを導入し、10μg/mlのAS-2480、AS-2481およびAS-2482を一次抗体として、10μg/mlのAlexa488標識抗ウサギIgG抗体(MolecularProbes社)を二次抗体として用いて、TACT427-Aタンパク質の局在性を調べたところ、同じく細胞質膜上に発現していることが明らかとなった。
実施例12と同様の方法で、HEK293細胞にp3xFLAG-TACT427-Aプラスミドを導入し、48時間後に細胞表層上に露出したタンパク質をCellular Labeling and Immunoprecipitation Kit(Roche Diagnostics社)を用いてビオチン標識を行った。さらに実施例12の方法に従い調製した無細胞抽出液1mlとマウス抗FLAG M2抗体(Sigma社)3μgとを用いて実施例13の方法に従って免疫沈降しSDS-PAGEを行った。HRP標識したストレプトアビジン(Amersham-Bioscience社)を用いて検出したところ、分子量150kD近傍にTACT427-Aタンパク質に由来するバンドが認められ、TACT427-Aタンパク質が細胞質膜上に発現することが明らかとなった。
直径10cmのぺトリディッシュに播種したヒト非小細胞肺癌細胞株A549、NCI-H226およびNCI-H522の細胞表層上に露出しているタンパク質をCellular Labeling and Immunoprecipitation Kit(Roche Diagnostics社)を用いてビオチン標識を行った。さらに実施例12の方法に従い調製した無細胞抽出液1mlとウサギペプチド抗体AS-2482 3μgとを用いて実施例13の方法に従って免疫沈降しSDS-PAGEを行った。HRP標識したストレプトアビジン(Amersham-Bioscience社)を用いて検出したところ、A549、NCI-H226およびNCI-H522のいずれにおいても、分子量150kD近傍にTACT427-Aタンパク質、TACT427-A2タンパク質、TACT427-Bタンパク質、TACT427-B2タンパク質、TACT427-Cタンパク質およびTACT427-C2タンパク質に由来するバンドが認められた。
これより、TACT427タンパク質が細胞質膜上に発現していることが明らかとなった。
直径10cmのペトリディッシュに播種しサブコンフルエントにまで培養したヒト非小細胞肺癌細胞株A549をPBSで洗浄後、3%BSAおよび5mM EDTAを含むPBSを加え室温で15分間放置しA549細胞を分散した。次に緩衝液A〔2%牛胎仔血清(JRH社)および0.1%アジ化ナトリウムを含むHBSS(Hanks’Balanced Salt Solutions、Invitrogen社)〕で1×106個/mlの濃度になるようにA549細胞を懸濁し、終濃度5μg/mlとなるようにAS-2482または非免疫ウサギIgG(Jackson社)を加え、氷上に5時間放置した。続いて緩衝液Aで細胞を洗浄した後、10μg/mlのAlexa488標識抗ウサギIgG抗体(Molecular Probes社)を含む緩衝液Aで懸濁し、氷上にて1.5時間放置した。緩衝液Aで再び洗浄後、FACScan(BDバイオサイエンス社)にて解析した。その結果、ウサギペプチド抗体AS-2482特異的にA549細胞が染色され、TACT427-Aタンパク質、TACT427-A2タンパク質、TACT427-Bタンパク質、TACT427-B2タンパク質、TACT427-Cタンパク質およびTACT427-C2タンパク質が細胞質膜上に発現していることが明らかとなった。
実施例2に記載のNCI-H460以外のヒト非小細胞肺癌細胞株においてもアンチセンスオリゴヌクレオチド導入によりアポトーシスが誘発されるか否かを検討した。
ヒト非小細胞肺癌細胞株A549およびNCI-H226(いずれもATCCより購入)を、それぞれKaighn's改変F-12 Nutrient Mixture(Invitrogen社)および25mM HEPES含有RPMI-1640培地(Invitrogen社)に牛胎仔血清(JRH社)を10%加えた培地で懸濁し、1ウェル当たり1×104個の細胞密度で96穴平底組織培養プレート(BDファルコン社)に播種した。5%炭酸ガス気流中、37℃で一晩培養した後、オリゴヌクレオチドを導入した。
以下に述べる実施例19、20および21で用いたセンスオリゴヌクレオチド(配列番号:44)は、実施例2に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド(配列番号:13)に相補的な配列を有するように設計し、phosphorothioate化した後、HPLC精製して用いた(以下、センスオリゴヌクレオチドと略する)。
具体的には、A549細胞の場合には、実施例2で得られたアンチセンスオリゴヌクレオチド(配列番号:13)、コントロールオリゴヌクレオチド(配列番号:14)、およびセンスオリゴヌクレオチド(配列番号:44)、それぞれ0.05μgをリポフェクトアミン2000(Invitrogen社)0.8μlと共に、OPTI-MEMI(Invitrogen社)50μlと混合し、室温で20分間放置した。予めOPTI-MEM I(Invitrogen社)50μlに培地交換しておいたA549細胞に該混合液中を全量添加し、更に3時間培養を継続した後、10%牛胎仔血清(JRH社)を含むKaighn's改変F-12Nutrient Mixture(Invitrogen社)100μlに培地交換した。
NCI-H226細胞の場合では、アンチセンスオリゴヌクレオチド(配列番号:13)、コントロールオリゴヌクレオチド(配列番号:14)、およびセンスオリゴヌクレオチド(配列番号:44)のそれぞれ0.13μgを、オリゴフェクトアミン(Invitrogen社)0.8μlと共に、OPTI-MEMI(Invitrogen社)50μlと混合し、室温で20分間放置した。予めOPTI-MEM I(Invitrogen社)50μlに培地交換しておいたNCI-H226細胞に該混合液を全量添加し、更に3時間培養を継続した後、30%牛胎仔血清(JRH社)を含む25mM HEPES含有RPMI-1640培地(Invitrogen社)50μlを添加した。
オリゴヌクレオチドを導入して更に2日間培養した後、Cell Death Detection ELISAPLUS(Roche Diagnostics社)の添付プロトコールに従い、上記オリゴヌクレオチドのアポトーシス誘導活性を測定した。
その結果、両細胞株においてアンチセンスオリゴヌクレオチドは陰性対象として用いたコントロールオリゴヌクレオチドおよびセンスオリゴヌクレオチドに比べ、それぞれ1.65倍および3.03倍のアポトーシス誘導活性を示し、統計学的に有意な差(P≦0.01)を示した。
実施例3に記載のNCI-H460以外のヒト非小細胞肺癌細胞株においてもアンチセンスオリゴヌクレオチド投与により、上記遺伝子のmRNA発現量が低下するか否か調べた。
ヒト非小細胞肺癌細胞株A549およびNCI-H226をそれぞれ実施例19と同じ培地に懸濁し、1ウェル当たりA549細胞株では7.5×104個、NCI-H226細胞株では5×104個の細胞密度で24穴平底組織培養プレート(BDファルコン社)に播種した。5%炭酸ガス気流中、37℃で一晩培養した後、オリゴヌクレオチドをトランスフェクションした。
具体的に、A549細胞株では、アンチセンスオリゴヌクレオチド(配列番号:13)、コントロールオリゴヌクレオチド(配列番号:14)、およびセンスオリゴヌクレオチド(配列番号:44)のそれぞれ0.84μgをリポフェクトアミン2000(Invitrogen社)3.2μlと共に、Opti-MEMI(Invitrogen社)200μlと混合し、室温で20分間放置した。予めOPTI-MEM I(Invitrogen社)200μlに培地交換しておいたA549細胞に該混合液を全量添加し、更に3時間培養を継続した後、10%牛胎仔血清(JRH社)を含むKaighn's改変F-12Nutrient Mixture(Invitrogen社)500μlに培地交換した。
NCI-H226細胞の場合では、アンチセンスオリゴヌクレオチド(配列番号:13)、コントロールオリゴヌクレオチド(配列番号:14)、およびセンスオリゴヌクレオチド(配列番号:44)のそれぞれ0.13μgを、オリゴフェクトアミン(Invitrogen社)2μlと共にOpti-MEMI(Invitrogen社)125μlと混合し、室温で20分間放置した。予めOPTI-MEM I(Invitrogen社)125μlに培地交換しておいたNCI-H226細胞に該混合液を全量添加し、更に4時間培養を継続した後、30%牛胎仔血清(JRH社)を含む25mM HEPES含有RPMI-1640培地(Invitrogen社)125μlを加えた。
オリゴヌクレオチドをトランスフェクションし、更に16時間培養を継続した後に、RNeasyMini Total RNA Kit(QIAGEN社)を用いてA549細胞およびNCI-H226細胞からトータルRNAを抽出した。TaqManTM Reverse Transcription Reagents(Applied Biosystems社)の添付プロトコールに従い、ランダムプライマーを用いた逆転写反応によってトータルRNAからcDNAを調製した。トータルRNA5 ngから調製したcDNAを鋳型とし、実施例6と同様の方法によりFLJ20539遺伝子(配列番号:2)、hCP50177遺伝子(配列番号:5)、hCP1762319遺伝子(配列番号:8)ならびにFLJ13515遺伝子(配列番号:11)、およびTACT427遺伝子の発現量を測定した。同量の鋳型cDNA中に含まれるβ-アクチン遺伝子発現量をTaqManTM β-actin Control Reagents(Applied Biosystems社)を用いて測定し内部標準とした。
β-アクチン遺伝子発現量に対する上記遺伝子の相対的発現量比率(%)は、陰性対照として用いたコントロールオリゴヌクレオチド(配列番号:14)またはセンスオリゴヌクレオチド(配列番号:44)を導入した場合に比べて、アンチセンスオリゴヌクレオチド(配列番号:13)を導入した場合に顕著に低下しており、統計学的に有意(P≦0.01)な発現量低下が認められた(表8)。
この結果より、ヒト非小細胞肺癌細胞株A549およびNCI-H226においても、FLJ20539遺伝子(配列番号:2)、hCP50177遺伝子(配列番号:5)、hCP1762319遺伝子(配列番号:8)ならびにFLJ13515遺伝子(配列番号:11)、およびTACT427遺伝子のmRNA発現量低下により、アポトーシスが誘発されたことが示された。
ヒト非小細胞肺癌細胞株A549およびNCI-H226をそれぞれ実施例19と同じ培地に懸濁し、A549細胞株では2.25×106個、NCI-H226細胞株では1.45×106個の細胞を直径10cmのぺトリディッシュ(BDファルコン社)に播種した。5%炭酸ガス気流中、37℃で一晩培養した後、オリゴヌクレオチドをトランスフェクションした。
具体的には、A549細胞株では、アンチセンスオリゴヌクレオチド(配列番号:13)、コントロールオリゴヌクレオチド(配列番号:14)およびセンスオリゴヌクレオチド(配列番号:44)のそれぞれ5.8μgを、リポフェクトアミン2000(Invitrogen社)96μlと共に、Opti-MEM I(Invitrogen社)6 mlと混合し、室温で20分間放置した。予めOPTI-MEM I(Invitrogen社)6 mlに培地交換しておいたA549細胞に該混合液を全量添加し、更に3時間培養を継続した後、10%牛胎仔血清(JRH社)を含むKaighn's改変F-12 Nutrient Mixture(Invitrogen社)15 mlに培地交換した。
NCI-H226細胞株では、アンチセンスオリゴヌクレオチド(配列番号:13)、コントロールオリゴヌクレオチド(配列番号:14)およびセンスオリゴヌクレオチド(配列番号:44)のそれぞれ9.7μgを、オリゴフェクトアミン(Invitrogen社)60μlと共にOpti-MEMI(Invitrogen社)3.75 mlと混合し、室温で20分間放置した。予めOPTI-MEM I(Invitrogen社)3.75 mlに培地交換しておいたNCI-H226細胞に該混合液を全量添加し、更に4時間培養を継続した後、30%牛胎仔血清(JRH社)を含む25mM HEPES含有RPMI-1640培地(Invitrogen社)3.75 mlを加えた。
トランスフェクション後、更に24時間、48時間、72時間培養を継続した後に、実施例12の方法に従い無細胞抽出液を調製した。得られた無細胞抽出液のタンパク質濃度をBCAProtein Assay Kit(Pierce社)にて測定し、各無細胞抽出液中のタンパク質濃度をそろえた。A549細胞株の無細胞抽出液100μg、およびNCI-H226細胞株の無細胞抽出液140μgを、実施例12の方法に準じてSDS-PAGEおよびウェスタンブロッティングをそれぞれ行った。一次抗体として実施例11で作製したAS-2482を3μg/mlの濃度で、二次抗体としてHRP標識抗ウサギIgG抗体(Amersham-Bioscience社)を用いた。検出はSuperSignalTM West Femto Maximum Sensitivity Substrate(Pierce社)を用いて添付のマニュアルに従った。
その結果、両細胞株ともアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入した場合にのみ、TACT427タンパク質がほぼ消失しているのが確認され、かつ、該タンパク質の消失は24時間で認められた。また、同時にサイトケラチン8タンパク質の発現量を抗ヒトサイトケラチン8抗体(Oncogene社)を用いたウエスタンブロッティング法で調べたが、いずれのオリゴヌクレオチド処理でも発現量減少は認められなかった。これより、TACT427タンパク質発現量の特異的低下により、ヒト肺癌細胞株のアポトーシスが誘発されたことが示された。
TACT427-Aタンパク質(配列番号:15)のC末端に3xFLAGタグを融合したタンパク質を構成的に発現する細胞株の樹立をマウス胎仔由来線維芽細胞株Balb3T3-A31(以後、A31細胞と略記する)を用いて行った。A31細胞1.25×105個を10%牛胎仔血清(JRH社)および50μg/mlゲンタマイシン(Invitrogen社)を含むダルベッコ改変型イーグル最少培地(Invitrogen社)2.5 mlに懸濁し、6穴プレートの1ウェルに播種した後、5%炭酸ガス気流下、37℃で一晩培養した。さらに同じ培地2.5mlに培地交換し4時間培養を継続した後、予めFuGENE6トランスフェクション試薬3.8μl(Roche Diagnostics社)およびOPTI-MEM I(Invitrogen社)93.3μlと混合し室温で15分間放置しておいたプラスミドp3xFLAG-TACT427-A1.25μgを添加し培養を継続した。翌日にトリプシン・EDTA(Invitrogen社)を用いて細胞を回収し、0.5 mg/mlのG418(Promega社)を含む上記培地(G418選択培地)10mlに懸濁し、直径10 cmのペトリディッシュに播種した。G418選択培地で培養を継続し2回継代培養した後、1ウェルあたり細胞100個(培地容量0.1 ml)の割合から始まる2倍希釈系列を12系列作成し96穴プレートにそれぞれ播種し、3日ごとにG418選択培地を交換しながら培養を継続した。ウェルあたり0.8個〜3.2個の細胞が増殖しコロニーを形成したウェルから11日後に細胞を回収し、24穴プレートの2ウェルに等しく播種した。G418選択培地でコンフルエントになるまで培養を継続した後、1ウェル分の細胞をスクレイパーで回収し、1% 2-メルカプトエタノールを含むSDS-PAGE用サンプルバッファー(Bio Rad社)40μlに懸濁した。95℃で5分間加熱処理した後、12μlを10%アクリルアミドゲルでのSDS-PAGEに供した。実施例13で記載した方法に準じ、マウス抗FLAGM2抗体(Sigma社、1000倍希釈)を用いてウエスタンブロッティングを行い、TACT427-Aタンパク質(配列番号:15)のC末端に3xFLAGタグが付加したタンパク質を構成的に発現する細胞株TACT-1を得た。
実施例22で得られたTACT-1およびその親株A31細胞を10%牛胎仔血清(JRH社)および50μg/mlゲンタマイシン(Invitrogen社)を含むダルベッコ改変型イーグル最少培地(Invitrogen社)0.1mlに懸濁し1ウェルあたり6×103個になるようそれぞれ組織培養用96穴プレートに播種した。5%炭酸ガス気流下、37℃で一晩培養した後、トポイソメラーゼI阻害剤カンプトテシン(WakoPure Chemical社)あるいはタンパク質合成阻害剤アニソマイシン(Wako Pure Chemical社)を種々の濃度になるよう添加した上記培地に交換し培養を継続した。24時間後にCell Death Detection ELISAPLUS (Roche Diagnostics社)を用いてアポトーシスを検出した。終濃度1μg/mlのカンプトテシン添加によりTACT-1に誘発されたアポトーシスは、同じ条件でA31に認められたアポトーシスの56%にとどまった。また終濃度1μg/mlのアニソマイシン添加によりTACT-1に誘発されたアポトーシスは、同じ条件でA31に認められたアポトーシスの69%にとどまった。以上の結果は、カンプトテシンやアニソマイシンによって誘発されるアポトーシスに対し、TACT-1細胞が耐性になっていることを示しており、TACT427-A強制発現によりアポトーシス耐性能を獲得することが明らかとなった。
実施例23で記載したTACT-1細胞株のアポトーシス耐性現象のメカニズムを調べる一環として、抗アポトーシス作用に関与するMAPキナーゼ、即ちERK1/2タンパク質のリン酸化をA31細胞株と比較した。A31細胞には10%牛胎仔血清(JRH社)および50μg/mlゲンタマイシン(Invitrogen社)を含むダルベッコ改変型イーグル最少培地(Invitrogen社)を用い、TACT-1細胞には同培地に更に0.6 mg/mlG418(Promega社)を添加したものを用いて、直径10 cmのペトリディッシュ(BD ファルコン社)で5%炭酸ガス気流中、37℃で培養した。細胞密度が約80%コンフルエントになった時点で、1μg/mlアニソマイシン(Wako Pure Chemical社)を含む上記培地に交換し、37℃で1時間、4時間および8時間培養を続けた。アニソマイシン処理前の細胞も含めて、これらそれぞれの細胞を氷冷したPBS(Ca、Mg不含)10mlで2回洗浄し、0.5 mlの細胞溶解用緩衝液〔1% Triton X-100、1% デオキシコール酸、0.05% SDS、5.25mM EGTA、EDTA不含CompleteTMタブレット(Roche Diagnostics社)、Phosphatase inhibitor cocktail-2(Sigma社)、150mM 塩化ナトリウムを含む50mMトリス・塩酸緩衝液、pH7.5〕を加えて4℃で20分間放置した。スクレイパーを用いて細胞破砕液を回収し、4℃、15000回転で20分間遠心分離して沈殿物を除去した。この細胞破砕液80μlに10% 2-メルカプトエタノールを含む5倍濃縮SDS-PAGE用サンプルバッファー(Bio Rad社)を20μl加え、95℃で5分間加熱した。なお、5μl細胞破砕液を蒸留水で10倍希釈し、Micro BCA protein assay reagent(Pierce社)の処方に準じてタンパク質濃度を測定し、2% 2-メルカプトエタノールを含むSDS-PAGE用サンプルバッファー(BioRad社)で適宜希釈してタンパク質濃度を揃えた。総タンパク質24μgを7.5% ポリアクリルアミドゲルでのSDS-PAGEに供した後、PVDF膜に転写した。転写した膜は5%スキムミルクを含むTTBS(0.1%Tween 20を含むTBS)で室温、1時間ブロッキングした後、10分間のTTBS洗浄を2回行った。その後、抗ERK1/2抗体(Cell signaling社)または抗リン酸化ERK1/2抗体(Cell signaling社)を5% BSA(Sigma社)を含むTTBSでそれぞれ5000倍または1000倍に希釈した一次抗体液を用いて4℃で一晩反応させた後、10分間のTTBS洗浄を4回行った。次に、5%スキムミルクを含むTTBSで10000倍に希釈したHRP標識抗ウサギIgG抗体(Amersham Bioscience社)を添加し室温で1時間保温した後、10分間のTTBS洗浄を4回行った。ECLplus試薬(Amersham Bioscience社)を用いてERK1/2タンパク質およびリン酸化ERK1/2タンパク質に相当するバンドを検出した結果、TACT-1細胞株ではA31細胞株と比べ、アニソマイシン添加で誘導されるERK1/2タンパク質のリン酸化、即ち活性化が増強されていた。TACT-1細胞におけるERK1/2活性化亢進程度を求めるため、現像したフィルムをルミノイメージアナライザーLAS-1000plus(FUJIFILM社)で画像として読み取り、付属のイメージゲージソフトウェアを用いてリン酸化ERK1とリン酸化ERK2のバンド強度をそれぞれ数値化した。アニソマイシン処理時間(2時間、4時間および8時間)毎に、A31細胞のバンド強度を100%としてTACT-1細胞のリン酸化亢進率を算出したところ、TACT-1細胞におけるERK1のリン酸化亢進率は164%、150%および158%、ERK2のリン酸化亢進率は130%、137%および172%であった。
この結果から、TACT-1細胞株のアポトーシス耐性現象のメカニズムの一つがERK1/2の活性化増強作用であることが明らかとなった。
実施例23で記載したTACT-1細胞株のアポトーシス耐性現象のメカニズムを調べる一環として、p38MAPKのリン酸化をA31細胞株と比較した。
8×105個のA31細胞またはTACT-1細胞を、10%牛胎仔血清(JRH社)および50μg/mlゲンタマイシン(Invitrogen社)を含むダルベッコ改変型イーグル最少培地(Invitrogen社)5 mlに懸濁し、直径6 cmのペトリディッシュ(BD ファルコン社)に播種した。5%炭酸ガス気流中、37℃で一晩培養した後、終濃度1μg/mlとなるようアニソマイシン(Wako Pure Chemical社)を添加し直ちに培養を継続した。アニソマイシン添加前あるいは添加後15分、30分および60分後の細胞を1mMオルトバナジン(V)酸ナトリウム(Wako Pure Chemical社)を含むPBS 5 mlで1回洗浄した後、実施例12に記載のRIPA緩衝液にPhosphatase Inhibitor Cocktail-1を加えた細胞溶解用緩衝液を0.2 ml添加し4℃で15分間放置した。スクレイパーで細胞破砕液を回収し4℃、15000回転で5分間遠心分離して沈殿物を除去した。この細胞破砕液80μlに5% 2-メルカプトエタノールを含む5倍濃縮SDS-PAGE用サンプルバッファー(Bio Rad社)を20μl加え、95℃で5分間加熱した。なお、上記細胞溶解用緩衝液を蒸留水で20倍に希釈した溶液で細胞破砕液15μlを20倍希釈し、Micro BCA protein assay reagent(Pierce社)の処方に準じてタンパク質濃度を測定し、タンパク質濃度がほぼ揃っていることを確認した。総タンパク質約14μgを5%−20%ポリアクリルアミドグラジエントゲルでのSDS-PAGEに供した後、PVDF膜に転写した。転写した膜は5%スキムミルクを含むTTBS(0.1% Tween 20を含むTBS)で室温、1時間ブロッキングした後、5分間のTTBS洗浄を3回行った。その後、抗p38MAPK抗体(Cell signaling社)または抗リン酸化p38MAPK抗体(Cell signaling社)を5% BSA(Sigma社)を含むTTBSで1000倍に希釈した一次抗体液を用いて4℃で一晩反応させた。続いて、5分間のTTBS洗浄を3回行った後に、5%スキムミルクを含むTTBSで5000倍に希釈したHRP標識抗ウサギIgG抗体(Amersham Bioscience社)を添加し室温で1時間保温した。再び、5分間のTTBS洗浄を3回行い、過剰量の抗体を取り去った後に、ECL plus試薬(Amersham Bioscience社)を用いてp38MAPKタンパク質およびリン酸化p38MAPKタンパク質に相当するバンドを検出した。A31細胞ではp38MAPKタンパク質のリン酸化はアニソマイシン添加後30分でようやく微かに認められたのに対し、TACT-1細胞ではアニソマイシン添加後15分で明らかに強く認められ、p38MAPKタンパク質のリン酸化、即ち活性化が速やかに誘導されることが判明した。
この結果から、TACT-1細胞株のアポトーシス耐性現象のメカニズムの一端をp38MAPKの活性化増強作用が担っていることが示唆された。
Claims (13)
- 配列番号:15で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩。
- 配列番号:15で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその塩。
- 請求項1または2記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
- DNAである請求項3記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号:16で表される塩基配列を含有する請求項4記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号:16で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド。
- 請求項3〜6のいずれか1項記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
- 請求項7記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
- 請求項8記載の形質転換体を培養し、請求項1または2記載のタンパク質を生成・蓄積せしめることを特徴とする請求項1または2記載のタンパク質またはその塩の製造法。
- 請求項1または2記載のタンパク質またはその塩に対する抗体。
- 請求項10記載の抗体を含有してなる診断薬。
- 請求項11記載の抗体を用いることを特徴とする請求項1または2記載のタンパク質の定量方法。
- 癌の診断薬である請求項11記載の診断薬。
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