JPWO2005097204A1 - 癌の予防・治療剤 - Google Patents

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Abstract

本発明は癌の予防・治療剤などを提供する。具体的には、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質に対する抗体、上記タンパク質の発現または上記タンパク質遺伝子の発現を阻害する化合物などは、癌などの予防・治療剤、癌細胞のアポトーシス促進剤、癌細胞の増殖阻害剤などとして有用である。

Description

本発明は、癌の予防・治療剤または診断薬、癌細胞のアポトーシス促進剤、癌細胞の増殖阻害剤、癌細胞の細胞周期変化の誘発剤、これらのスクリーニングなどに関する。
癌において、遺伝子のマイクロアレイプロファイリングデータでその病態が評価しうることが予見され、実際、白血病においては遺伝子発現プロファイルによる白血病の分類が可能であることが報告されている。また個々の癌組織の遺伝子発現プロファイルを明らかにし、その分類を積み重ねることによって、特定の癌治療法に対する反応性を予測したり特定の癌に対する新たな創薬標的タンパク質を発見したりすることが可能となると考えられる。具体的には、ある種の癌である種のタンパク質の発現亢進が認められる場合には、新たに抗原陽性と診断された患者に対して（ｉ）その発現量を低下させる、（ｉｉ）機能を抑制する、（ｉｉｉ）該タンパク質に対する宿主免疫応答を顕在化させる等の方法によって抗腫瘍活性を導くことが可能となる。これと同時に、抗原陰性と診断された患者に対しては別の治療法への切替が迅速に行えるなど、患者に無用な負担をかける懸念がなくなると予想される。以上のように発現プロファイル解析は、癌の分子診断と分子標的治療薬の開発に多大な貢献をなしうるものと期待されている。
Ｎｅｃｔｉｎ−２α遺伝子（ＲｅｆＳｅｑ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００２８５６）およびＮｅｃｔｉｎ−２δ遺伝子（ＥＭＢＬ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｘ８００３８）は、ヒト白血病細胞株ＴＦ−１由来のｃＤＮＡからクローニングされた遺伝子であり、それぞれ４７９アミノ酸および５３８アミノ酸からなるタンパク質をコードしている（ＲｅｆＳｅｑ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００２８４７およびＥＭＢＬ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＣＡＡ５６３４２）。Ｎｅｃｔｉｎ−２δ遺伝子は、Ｎｅｃｔｉｎ−２α遺伝子のスプライシングバリアントであり、Ｎｅｃｔｉｎ−２δ遺伝子によってコードされるタンパク質は、Ｎｅｃｔｉｎ−２α遺伝子によってコードされるタンパク質の１番目から３５０番目までのアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有しているが、３５１番目よりＣ末端側のアミノ酸配列が異なっている。さらに、Ｎｅｃｔｉｎ−２α遺伝子、およびＮｅｃｔｉｎ−２δ遺伝子に相同性を示すマウス遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＢＣ００９０８８およびＲｅｆＳｅｑ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００８９９０）がマウスＥＳ細胞由来のライブラリーからクローニングされており、それぞれ４６７アミノ酸および５３０アミノ酸からなるタンパク質をコードしている（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＨ０９０８８およびＲｅｆＳｅｑ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿０３３０１６）。これらのマウス遺伝子はＮｅｃｔｉｎ−２α遺伝子およびＮｅｃｔｉｎ−２δ遺伝子に対して塩基配列でそれぞれ約７２％および約７２％、アミノ酸配列でそれぞれ約６９％および約７３％の相同性を有している。Ｎｅｃｔｉｎ−２α遺伝子およびＮｅｃｔｉｎ−２δ遺伝子（以下、Ｎｅｃｔｉｎ−２と総称することもある）はＰＶＲＬ２、ＰＲＲ２、ＰＶＲＲ２、ＨＶＥＢ、ＣＤ１１２などの異名を持つ遺伝子であり、Ｎｅｃｔｉｎファミリーに属している。ＮｅｃｔｉｎファミリーはＮｅｃｔｉｎ−１、Ｎｅｃｔｉｎ−２、Ｎｅｃｔｉｎ−３、およびＮｅｃｔｉｎ−４の４つのサブファミリーから構成されている（以下、これらをＮｅｃｔｉｎと総称することもある）。Ｎｅｃｔｉｎは免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、細胞外領域に３つの免疫グロブリン様ループを有する一回膜貫通型分子である。Ｎｅｃｔｉｎは細胞膜上でシス二量体を形成し、隣接する細胞の細胞膜上のシス二量体同士がトランス結合することにより、細胞間接着を制御していると考えられている。Ｎｅｃｔｉｎのトランス結合は、同一の分子とホモフィリックに形成されるが、Ｎｅｃｔｉｎ−１はＮｅｃｔｉｎ−３およびＮｅｃｔｉｎ−４と、Ｎｅｃｔｉｎ−２はＮｅｃｔｉｎ−３とヘテロフィリックにも形成されることが知られている。また、Ｎｅｃｔｉｎは細胞内領域であるＣ末端を介しアクチン結合タンパク質アファディンと結合することが知られている〔Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｅｉ．（２００３），１１６（１），１７−２７〕。また、Ｎｅｃｔｉｎはヘルペスウイルス上に発現しているｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｄに対する受容体として働き、ヘルペスウイルスが細胞に侵入する際の足場として機能していると考えられている〔Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．（２００３），１１６（１），１７−２７〕。更にＮｅｃｔｉｎ−２はＮＫ細胞上に発現するＤＮＡＭ−１（ＣＤ２２６）のリガンドの１つとしても作用し、ＤＮＡＭ−１を発現するＮＫ細胞は標的細胞上に発現するＮｅｃｔｉｎ−２を足場として細胞傷害活性を発揮すると考えられている〔Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（２００３），１９８（４），５５７−５６７〕。一方、Ｎｅｃｔｉｎ−２は癌抑制遺伝子ｐ５３経路に関与する遺伝子の１つとして報告されている（ＷＯ０２／９９０４０号公報）。さらに、Ｎｅｃｔｉｎ−２は、血管新生疾患、癌、ウイルス感染の治療に有用なタンパク質Ｎｅｃｔｉｎ−３に結合するタンパク質である（ＷＯ０２／２８９０２号公報）、ウイルス感染に関与する受容体である（ＷＯ９９／６３０６３号公報）、乳癌や卵巣癌の診断と治療に有用な遺伝子のうちの１つである（ＷＯ０２／００６７７号公報）、種々の癌で発現亢進し抗腫瘍性抗体医薬の標的として有望な１６種類の遺伝子の中の１つである（ＷＯ０３／０８８８０８号公報）、癌組織で発現亢進し癌の診断、予防に有望な遺伝子の１つである（ＷＯ０４／０３０６１５号公報）と報告されている。
ＰＳＥＣ０１１０ ｆｉｓ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＫ０７５４１９）は、ヒト胎盤由来のｃＤＮＡからクローニングされた遺伝子であり、３４４アミノ酸からなるタンパク質をコードしている（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＢＡＣ１１６０９、ＷＯ００／０５３６７号公報、ＷＯ００／１１０１５号公報、ＷＯ０１／７７２８８号公報、ＥＰ−Ａ−１０６７１８２号公報等）。
ＰＨＧＤＨＬ１遺伝子（ＲｅｆＳｅｑ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿１７７９６７；ＥＰ−Ａ−１０６７１８２号公報）は、３０７アミノ酸からなるタンパク質をコードしており（ＲｅｆＳｅｑ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿８０８８８２）、このタンパク質はＰＳＥＣ０１１０ｆｉｓ遺伝子によってコードされるタンパク質の１３１番目から３４４番目までのアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有しているが、１番目から１３０番目までののアミノ酸は置換されている。このＰＨＧＤＨＬ１遺伝子はＰＳＥＣ０１１０ ｆｉｓ遺伝子に対して塩基配列で約８３％、アミノ酸配列で約７４％の相同性を有している。さらに、ＰＳＥＣ０１１０ ｆｉｓ遺伝子に相同性を示すマウス遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＫ０４９１０９）がマウスＥＳ細胞由来のｃＤＮＡからクローニングされており、３４５アミノ酸からなるタンパク質をコードしている（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＢＡＣ３３５４６）。このマウス遺伝子はＰＳＥＣ０１１０ ｆｉｓ遺伝子に対して塩基配列で約８５％、アミノ酸配列で約８８％の相同性を有している。
ＫＩＡＡ０１５２遺伝子（ＲｅｆＳｅｑ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿０１４７３０）は、ヒト組織由来のｃＤＮＡからクローニングされた遺伝子であり、２９２アミノ酸からなるタンパク質をコードしている（ＲｅｆＳｅｑ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿０５５５４５）。さらに、ＫＩＡＡ０１５２遺伝子に相同性を示すマウス遺伝子（ＲｅｆＳｅｑ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿１７５４０３）がマウス組織由来のｃＤＮＡからクローニングされており、２９１アミノ酸からなるタンパク質をコードしている（ＲｅｆＳｅｑ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿７８０６１２）。このマウス遺伝子は、ＫＩＡＡ０１５２遺伝子に対して塩基配列で約８７％、アミノ酸配列で約９２％の相同性を有している。ＫＩＡＡ０１５２遺伝子は、肝臓癌の診断や治療に有用な遺伝子である（ＷＯ０２／２９１０３号公報）、抗癌剤のスクリーニングに有用な遺伝子のひとつである（ＷＯ０１／９４６２９号公報）と報告されている。また、ＤＮＡ配列で９４％、アミノ酸配列で８８％の相同性を示すヒト遺伝子のクローニングも報告されている（ＷＯ０１／７５０６７号公報）。
ＤＫＦＺＰ５８６Ｌ０７２４遺伝子（ＲｅｆＳｅｑ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿０１５４６２）は、ヒト組織由来のｃＤＮＡから配列決定された遺伝子であり、７１９アミノ酸からなるタンパク質をコードしている（ＲｅｆＳｅｑ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿０５６２７７）。さらに、ＤＫＦＺＰ５８６Ｌ０７２４遺伝子に相同性を示すマウス遺伝子（ＲｅｆＳｅｑ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿１３３７０２）がマウス組織由来のｃＤＮＡからクローニングされており、７２３アミノ酸からなるタンパク質をコードしている（ＲｅｆＳｅｑ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿５９８４６３）。このマウス遺伝子はＤＫＦＺＰ５８６Ｌ０７２４遺伝子に対して塩基配列で約７６％、アミノ酸配列で約７４％の相同性を有している。ＤＫＦＺＰ５８６Ｌ０７２４遺伝子は、網膜疾患などの眼病に関係する（ＣＮ １３４５８２６号公報）、代謝疾患に関係する（ＣＮ １３４５７５０号公報）と報告されている。
ＤＣＢＬＤ１Ｌ遺伝子は、ヒトＴ細胞由来のｃＤＮＡからクローニングされた遺伝子であり、７１５アミノ酸からなるタンパク質をコードしている（ＷＯ０１／２９０８８号公報、ＵＳ２００３０２２２７９号公報、ＷＯ０２／５３７３９号公報等）。ＤＣＢＬＤ１遺伝子（ＲｅｆＳｅｑ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿１７３６７４）は、５３９アミノ酸からなるタンパク質をコードしている（ＲｅｆＳｅｑ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿７７５９４５）。ＤＣＢＬＤ１Ｌタンパク質は、ＤＣＢＬＤ１Ｌ遺伝子によってコードされるタンパク質の１番目から５３８番目までのアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有しているが、５３９番目のアミノ酸はグリシンに置換されている。さらに、ＤＣＢＬＤ１Ｌ遺伝子に相同性を示すマウス遺伝子（ＲｅｆＳｅｑ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿０２５７０５）は、５０３アミノ酸からなるタンパク質をコードしている（ＲｅｆＳｅｑ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿０７９９８１）。このマウス遺伝子は、ＤＣＢＬＤ１Ｌ遺伝子に対して塩基配列で約５３％、アミノ酸配列で約７６％の相同性を有している。ＤＣＢＬＤ１Ｌ遺伝子は卵巣癌の診断と治療に有用な遺伝子の一つとして報告されている（ＷＯ０１／７０９７９号公報）。
癌細胞に特異的に発現する分子を標的とし、癌細胞の増殖阻害を誘導する安全な薬剤が切望されている。
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、癌組織で発現が顕著に増加する遺伝子を見出し、この遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチドが癌細胞のアポトーシスを促進することも見出した。この知見に基づいて、さらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
（１） 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる癌の予防・治療剤、
（２） 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる癌細胞のアポトーシス促進剤、
（３） 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる癌細胞の増殖阻害剤、
（４） 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる癌の診断薬、
（５） （ｉ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチドまたは（ｉｉ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするＲＮＡの一部を含有する二重鎖ＲＮＡを含有してなる癌の予防・治療剤、
（６） （ｉ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチドまたは（ｉｉ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするＲＮＡの一部を含有する二重鎖ＲＮＡを含有してなる癌細胞のアポトーシス促進剤、
（７） （ｉ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチドまたは（ｉｉ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするＲＮＡの一部を含有する二重鎖ＲＮＡを含有してなる癌細胞の増殖阻害剤、
（８） （ｉ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、（ｉｉ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチドまたは（ｉｉｉ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするＲＮＡの一部を含有する二重鎖ＲＮＡを含有してなる癌細胞の細胞周期変化の誘発剤、
（９） 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなる癌の予防・治療剤、
（１０） 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩を含有してなる癌の予防・治療剤、
（１１） 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質の発現を阻害する化合物またはその塩を含有してなる癌の予防・治療剤、
（１２） 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなる癌細胞のアポトーシス促進剤、
（１３） 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩を含有してなる癌細胞のアポトーシス促進剤、
（１４） 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質の発現を阻害する化合物またはその塩を含有してなる癌細胞のアポトーシス促進剤、
（１５） 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなる癌細胞の増殖阻害剤、
（１６） 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩を含有してなる癌細胞の増殖阻害剤、
（１７） 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質の発現を阻害する化合物またはその塩を含有してなる癌細胞の増殖阻害剤、
（１８） 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有してなる癌の診断薬、
（１９） 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、癌の予防・治療剤のスクリーニング方法、
（２０） 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、癌の予防・治療剤のスクリーニング方法、
（２１） 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、癌細胞のアポトーシス促進剤のスクリーニング方法、
（２２） 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、癌細胞のアポトーシス促進剤のスクリーニング方法、
（２３） 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、癌細胞の増殖阻害剤のスクリーニング方法、
（２４） 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、癌細胞の増殖阻害剤のスクリーニング方法、
（２５） 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴とする、癌の予防・治療剤のスクリーニング用キット、
（２６） 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有することを特徴とする、癌の予防・治療剤のスクリーニング用キット、
（２７） 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴とする、癌細胞のアポトーシス促進剤のスクリーニング用キット、
（２８） 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有することを特徴とする、癌細胞のアポトーシス促進剤のスクリーニング用キット、
（２９） 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴とする、癌細胞の増殖阻害剤のスクリーニング用キット、
（３０） 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有することを特徴とする、癌細胞の増殖阻害剤のスクリーニング用キット、
（３１） 哺乳動物に対して、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体の有効量を投与することを特徴とする癌の予防・治療方法、
（３２） 哺乳動物に対して、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体の有効量を投与することを特徴とする癌細胞のアポトーシス促進方法、
（３３） 哺乳動物に対して、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体の有効量を投与することを特徴とする癌細胞の増殖阻害方法、
（３４） 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害することを特徴とする癌の予防・治療方法、
（３５） 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害することを特徴とする癌細胞のアポトーシス促進方法、
（３６） 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害することを特徴とする癌細胞の増殖阻害方法、
（３７） 癌の予防・治療剤を製造するための配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体の使用、
（３８） 癌細胞のアポトーシス促進剤を製造するための配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体の使用、
（３９） 癌細胞の増殖阻害剤を製造するための配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体の使用、
（４０） 癌の予防・治療剤を製造するための配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩の使用、
（４１） 癌細胞のアポトーシス促進剤を製造するための配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩の使用、
（４２） 癌細胞の増殖阻害剤を製造するための配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩の使用などを提供する。
配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８（以下、本発明のタンパク質または本発明で用いられるタンパク質と称することもある）は、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の細胞（例、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞など）もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋などに由来するタンパク質であってもよく、合成タンパク質であってもよい。
配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、好ましくは約７０％以上、好ましくは約８０％以上、好ましくは約９０％以上、好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
アミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；フィルタリング＝ＯＦＦ）にて計算することができる。
実質的に同質とは、それらの性質が性質的に（例、生理学的に、または薬理学的に）同質であることを示す。したがって、本発明のタンパク質の活性が同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．１〜１０倍、より好ましくは０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度、タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
また、本発明で用いられるタンパク質としては、例えば、（ｉ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（ｉｖ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（ｖ）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのいわゆるムテインも含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置としては、とくに限定されない。
本明細書におけるタンパク質は、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をはじめとする、本発明で用いられるタンパク質は、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基、ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
本発明で用いられるタンパク質がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明で用いられるタンパク質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明で用いられるタンパク質には、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイルなどのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。
本発明で用いられるタンパク質の具体例としては、例えば、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：１７で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：２５で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：３８で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：４８で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質などがあげられる。
本発明で用いられるタンパク質の部分ペプチドとしては、前記した本発明で用いられるタンパク質の部分ペプチドであって、好ましくは、前記した本発明で用いられるタンパク質と同様の性質を有するものであればいずれのものでもよい。
例えば、本発明で用いられるタンパク質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、さらに好ましくは７０個以上、より好ましくは１００個以上、最も好ましくは２００個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが用いられる。
また、本発明で用いられる部分ペプチドは、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入され、または、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、より好ましくは数個、さらに好ましくは１〜５個程度）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
また、本発明で用いられる部分ペプチドはＣ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
さらに、本発明で用いられる部分ペプチドには、前記した本発明で用いられるタンパク質と同様に、Ｃ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有しているもの、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
具体的には、
（１）配列番号：６５で表されるアミノ酸配列（配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列の８８番目から１０１番目までのアミノ酸配列のＮ末端に、Ｃｙｓを付加した配列）を有するペプチド、
（２）配列番号：６６で表されるアミノ酸配列（配列番号：１で表されるアミノ酸配列の３４７番目から３６０番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、Ｃｙｓを付加した配列）を有するペプチド、
（３）配列番号：６７で表されるアミノ酸配列（配列番号：３で表されるアミノ酸配列の４２６番目から４３９番目までのアミノ酸配列のＮ末端に、Ｃｙｓを付加した配列）を有するペプチド、
（４）配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質の細胞外領域全体、または当該領域中に含まれる免疫原性ペプチド（エピトープ）などが用いられる。
かかる免疫原性ペプチドの長さは免疫原性を有するような長さである限り特に限定されないが、例えば８個、好ましくは１０個、より好ましくは１２個の連続するアミノ酸残基を有するものが挙げられる。
本発明で用いられる部分ペプチドは抗体作成のための抗原としても用いることができる。
本発明で用いられるタンパク質または部分ペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
本発明で用いられるタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩は、前述したヒトや温血動物の細胞または組織から自体公知のタンパク質の精製方法によって製造することもできるし、タンパク質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、後述のペプチド合成法に準じて製造することもできる。
ヒトや哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行ない、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩、またはそのアミド体の合成には、通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするタンパク質の配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からタンパク質または部分ペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはそれらのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、タンパク質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ，ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、タンパク質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はタンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１．５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行なうことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することによって、後の反応に影響を与えないようにすることができる。
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ｔ−ペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ｔ−ブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級（Ｃ１−６）アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ２−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ｔ−ブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル〕などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
タンパク質または部分ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド（タンパク質）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたタンパク質または部分ペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したタンパク質または部分ペプチドとを製造し、これらのタンパク質またはペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護タンパク質またはペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗タンパク質またはペプチドを得ることができる。この粗タンパク質またはペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のタンパク質またはペプチドのアミド体を得ることができる。
タンパク質またはペプチドのエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、タンパク質またはペプチドのアミド体と同様にして、所望のタンパク質またはペプチドのエステル体を得ることができる。
本発明で用いられる部分ペプチドまたはそれらの塩は、自体公知のペプチドの合成法に従って、あるいは本発明で用いられるタンパク質を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明で用いられる部分ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の（ｉ）〜（ｖ）に記載された方法が挙げられる。
（ｉ） Ｍ．ＢｏｄａｎｓｚｋｙおよびＭ．Ａ．Ｏｎｄｅｔｔｉ、ペプチド・シンセシス（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９６６年）
（ｉｉ）ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＬｕｅｂｋｅ、ザ・ペプチド（Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９６５年）
（ｉｉｉ）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）（１９７５年）
（ｉｖ）矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ、２０５、（１９７７年）
（ｖ）矢島治明監修、続医薬品の開発、第１４巻、ペプチド合成、広川書店
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明で用いられる部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
本発明で用いられるタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、前述した本発明で用いられるタンパク質をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。好ましくはＤＮＡである。ＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織よりｔｏｔａｌ ＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
本発明で用いられるタンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：１８、配列番号：２６、配列番号：３９もしくは配列番号：４９で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：２、配列番号：４、配列番号：１８、配列番号：２６、配列番号：３９もしくは配列番号：４９で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８もしくは配列番号：４８で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡであれば何れのものでもよい。
配列番号：２、配列番号：４、配列番号：１８、配列番号：２６、配列番号：３９または配列番号：４９で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：１８、配列番号：２６、配列番号：３９または配列番号：４９で表される塩基配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、好ましくは約７０％以上、好ましくは約８０％以上、好ましくは約９０％以上、好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
より具体的には、（ｉ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２で表される塩基配列を含有するＤＮＡまたは配列番号：３で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが、（ｉｉ）配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：４で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが、（ｉｉｉ）配列番号：１７で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：１８で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが、（ｉｖ）配列番号：２５で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２６で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが、（ｖ）配列番号：３８で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：３９で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが、（ｖｉ）配列番号：４８で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：４９で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
本発明で用いられる部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）としては、前述した本発明で用いられる部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
本発明で用いられる部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：１８、配列番号：２６、配列番号：３９または配列番号：４９で表される塩基配列を含有するＤＮＡの一部分を有するＤＮＡ、または配列番号：２、配列番号：４、配列番号：１８、配列番号：２６、配列番号：３９または配列番号：４９で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、本発明のタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの一部分を含有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：２、配列番号：４、配列番号：１８、配列番号：２６、配列番号：３９または配列番号：４９で表される塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡは、前記と同意義を示す。
ハイブリダイゼーションの方法およびハイストリンジェントな条件は前記と同様のものが用いられる。
本発明で用いられるタンパク質、部分ペプチド（以下、これらをコードするＤＮＡのクローニングおよび発現の説明においては、これらを単に本発明のタンパク質と略記する場合がある）を完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明のタンパク質をコードする塩基配列の一部分を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のタンパク質の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
ＤＮＡの塩基配列の変換は、ＰＣＲ、公知のキット、例えば、ＭｕｔａｎＴＭ−ｓｕｐｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｋｍ（宝酒造（株））、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｋ（宝酒造（株））等を用いて、ＯＤＡ−ＬＡ ＰＣＲ法、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法、Ｋｕｎｋｅｌ法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。
クローン化されたタンパク質をコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
本発明のタンパク質の発現ベクターは、例えば、（イ）本発明のタンパク質をコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターなどが挙げられる。
これらのうち、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明のタンパク質のＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌の具体例としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ１２・ＤＨ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｅａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６０巻，１６０（１９６８）〕，ＪＭ１０３〔Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９巻，３０９（１９８１）〕，ＪＡ２２１〔Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２０巻，５１７（１９７８）〕，ＨＢ１０１〔Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４１巻，４５９（１９６９）〕，Ｃ６００〔Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９巻，４４０（１９５４）〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４〔Ｇｅｎｅ，２４巻，２５５（１９８３）〕，２０７−２１〔Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９５巻，８７（１９８４）〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＫＭ７１などが用いられる。
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ ｃｅｌｌ；Ｓｆ細胞）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの中腸由来のＭＧ１細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵由来のＨｉｇｈ ＦｉｖｅＴＭ細胞、Ｍａｍｅｓｔｒａ ｂｒａｓｓｉｃａｅ由来の細胞またはＥｓｔｉｇｍｅｎａ ａｃｒｅａ由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ Ｎ細胞；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１７１１）、Ｓｆ２１細胞（以上、Ｖａｕｇｈｎ，Ｊ．Ｌ．ら、イン・ヴィボ（Ｉｎ Ｖｉｖｏ），１３，２１３−２１７，（１９７７））などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３１５巻，５９２（１９８５）〕。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，マウスＡＴＤＣ５細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９巻，２１１０（１９７２）やＧｅｎｅ，１７巻，１０７（１９８２）などに記載の方法に従って行なうことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８巻，１１１（１９７９）などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５巻，１９２９（１９７８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７−５５（１９８８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８ 新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２巻，４５６（１９７３）に記載の方法に従って行なうことができる。
このようにして、タンパク質をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母エキス、ビタミン類、成長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，４３１−４３３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）最小培地〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７巻，４５０５（１９８０）〕や０．５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１巻，５３３０（１９８４）〕が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Ｇｒａｃｅ’ｓ Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２））に非働化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎仔牛血清を含むＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２巻，５０１（１９５２）〕，ＤＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８巻，３９６（１９５９）〕，ＲＰＭＩ １６４０培地〔Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９巻，５１９（１９６７〕，１９９培地〔Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３巻，１（１９５０）〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外に本発明のタンパク質を生成せしめることができる。
上記培養物から本発明のタンパク質を分離精製するには、例えば、下記の方法により行なうことができる。
本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりタンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどのタンパク質変性剤や、トリトンＸ−１００ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にタンパク質が分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれるタンパタ質の精製は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
かくして得られるタンパク質が遊離体で得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生するタンパク質を、精製前または精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。タンパク質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
かくして生成する本発明のタンパク質の存在は、特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイやウェスタンブロッティングなどにより測定することができる。
本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩に対する抗体（以下、本発明の抗体と略記することがある）は、本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。
本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩（以下、抗体の説明においては、これらを単に本発明のタンパク質と略記する場合がある）に対する抗体は、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
以下に、本発明の抗体の抗原調製法、および該抗体の製造法について説明する。
（１）抗原の調製
本発明の抗体を調製するために使用される抗原としては、例えば、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と同一の抗原決定基を１種あるいは２種以上有する（合成）ペプチドなど何れのものも使用することができる（以下、これらを単に本発明の抗原と称することもある）。
本発明の抗原の具体例としては、
（１）配列番号：６５で表されるアミノ酸配列（配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列の８８番目から１０１番目までのアミノ酸配列のＮ末端に、Ｃｙｓを付加した配列）を有するペプチド、
（２）配列番号：６６で表されるアミノ酸配列（配列番号：１で表されるアミノ酸配列の３４７番目から３６０番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、Ｃｙｓを付加した配列）を有するペプチド、
（３）配列番号：６７で表されるアミノ酸配列（配列番号：３で表されるアミノ酸配列の４２６番目から４３９番目までのアミノ酸配列のＮ末端に、Ｃｙｓを付加した配列）を有するペプチド、
（４）配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質の細胞外領域全体、または当該領域中に含まれる免疫原性ペプチド（エピトープ）などが挙げられる。
かかる免疫原性ペプチドの長さは免疫原性を有するような長さである限り特に限定されないが、例えば８個、好ましくは１０個、より好ましくは１２個の連続するアミノ酸残基を有するものが挙げられる。
上記タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩は、公知の方法に準じて製造でき、さらに、（ａ）例えばヒト、サル、ラット、マウスなどの哺乳動物の組織または細胞から公知の方法あるいはそれに準ずる方法を用いて調製、（ｂ）ペプチド・シンセサイザー等を使用する公知のペプチド合成方法で化学的に合成、（ｃ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造される。
（ａ）該哺乳動物の組織または細胞から本発明の抗原を調製する場合、その組織または細胞をホモジナイズした後、粗分画物（例、膜画分、可溶性画分）をそのまま抗原として用いることもできる。あるいは酸、界面活性剤またはアルコールなどで抽出を行い、該抽出液を、塩析、透析、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することもできる。
（ｂ）化学的に本発明の抗原を調製する場合、該合成ペプチドとしては、例えば上述の（ａ）の方法を用いて天然材料より精製した本発明の抗原と同一の構造を有するもの、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列において３個以上、好ましくは６個以上のアミノ酸からなる任意の箇所のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を１種あるいは２種以上含有するペプチドなどが用いられる。
（ｃ）ＤＮＡを含有する形質転換体を用いて配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩を製造する場合、該ＤＮＡは、公知のクローニング方法〔例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（２ｎｄ ｅｄ．；Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法など〕に従って作製することができる。該クローニング方法とは、（１）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８、または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩のアミノ酸配列に基づきデザインしたＤＮＡプローブまたはＤＮＡプライマーを用い、ｃＤＮＡライブラリーからハイブリダイゼーション法により配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８、または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を得る方法、または（２）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８、または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩のアミノ酸配列に基づきデザインしたＤＮＡプライマーを用い、ＰＣＲ法により配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８、または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を得る方法などが挙げられる。
本発明のタンパク質を発現する哺乳動物細胞自体を、本発明の抗原として直接用いることもできる。哺乳動物細胞としては、上記（ａ）項で述べたような天然の細胞、上記（ｃ）項で述べたような方法で形質転換した細胞などを用いることができる。形質転換に用いる宿主としては、ヒト、サル、ラット、マウス、ハムスターなどから採取した細胞であれば何れのものでも良く、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ７、ＣＨＯ−Ｋ１、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｂａｌｂ３Ｔ３、ＦＭ３Ａ、Ｌ９２９、ＳＰ２／０、Ｐ３Ｕ１、Ｂ１６、またはＰ３８８などが好ましく用いられる。本発明のタンパク質を発現する天然の哺乳動物細胞または形質転換した哺乳動物細胞は、組織培養に用いられる培地（例、ＲＰＭＩ１６４０）または緩衝液（例、Ｈａｎｋｓ’ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に懸濁された状態で免疫動物に注射することができる。免疫方法としては、抗体産生を促すことのできる方法であれば何れの方法でも良く、静脈内注射、腹腔内注射、筋肉内注射または皮下注射などが好ましく用いられる。
本発明の抗原としてのペプチドは、（１）公知のペプチドの合成法に従って、または（２）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することもできる。
該ペプチドの合成法としては、例えば固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、該ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としてはたとえば、以下に記載された方法等が挙げられる。
（ｉ）Ｍ．ＢｏｄａｎｓｚｋｙおよびＭ．Ａ．Ｏｎｄｅｔｔｉ、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９６６年）
（ｉｉ）ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＬｕｅｂｋｅ、Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９６５年）
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶などを組み合わせて該ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られるペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
ペプチドのアミド体は、アミド形成に適した市販のペプチド合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするペプチドの配列通りに、公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、目的のペプチドを取得する。あるいはクロロトリチル樹脂、オキシム樹脂、４−ヒドロキシ安息香酸系樹脂等を用い、部分的に保護したペプチドを取り出し、更に常套手段で保護基を除去し目的のペプチドを得ることもできる。
上記した保護されたアミノ酸の縮合に関しては、ペプチド合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としてはＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが挙げられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ、ＨＯＯＢｔなど）とともに保護されたアミノ酸を直接樹脂に添加するか、または、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護されたアミノ酸の活性化を行ったのちに樹脂に添加することができる。保護されたアミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、ペプチド縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。たとえばＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジンなどの三級アミン類、ジオキサン、テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はペプチド結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜約５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常約１．５ないし約４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行うことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化して、後の反応に影響を及ぼさないようにすることができる。
原料アミノ酸のアミノ基の保護基としては、たとえば、Ｚ、Ｂｏｃ、ターシャリーペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが挙げられる。カルボキシル基の保護基としては、たとえばＣ１−６アルキル基、Ｃ３−８シクロアルキル基、Ｃ７−１４アラルキル基、２−アダマンチル、４−ニトロベンジル、４−メトキシベンジル、４−クロロベンジル、フェナシルおよびベンジルオキシカルボニルヒドラジド、ターシャリーブトキシカルボニルヒドラジド、トリチルヒドラジドなどが挙げられる。
セリンおよびスレオニンの水酸基は、たとえばエステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては例えばアセチル基などの低級（Ｃ１−６）アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが挙げられる。また、エーテル化に適する基としては、たとえばベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、たとえばＢｚｌ、Ｃｌ−Ｂｚｌ，２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ｔ−ブチルなどが挙げられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、Ｂｏｍ、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが挙げられる。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、たとえば対応する酸無水物、アジド、活性エステル［アルコール（たとえば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル］などが挙げられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、たとえば対応するリン酸アミドが挙げられる。
保護基の除去（脱離）方法としては、たとえばＰｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども挙げられる。上記酸処理による脱離反応は一般に−２０℃〜４０℃の温度で行われるが、酸処理においてはアニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護および保護基、ならびにその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基あるいは公知の手段から適宜選択しうる。
ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、まず、カルボキシル末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化した後、アミノ基側にペプチド鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除いたペプチド（またはアミノ酸）とを製造し、この両ペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護ペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗ペプチドを得ることができる。この粗ペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のペプチドのアミド体を得ることができる。
ペプチドのエステル体を得るにはカルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、ペプチドのアミド体と同様にして所望のペプチドのエステル体を得ることができる。
本発明の抗原は、不溶化したものを直接免疫することもできる。また、本発明の抗原を適当な担体に結合または吸着させた複合体を免疫してもよい。該担体（キャリアー）と本発明の抗原（ハプテン）との混合比は、担体に結合あるいは吸着させた本発明の抗原に対して抗体が効率よくできれば、どのようなものをどのような比率で結合あるいは吸着させてもよく、通常ハプテン抗原に対する抗体の作製にあたり常用されている天然もしくは合成の高分子担体を重量比でハプテン１に対し０．１〜１００の割合で結合あるいは吸着させたものを使用することができる。天然の高分子担体としては、例えばウシ、ウサギ、ヒトなどの哺乳動物の血清アルブミンや例えばウシ、ウサギなどの哺乳動物のチログロブリン、例えばウシ、ウサギ、ヒト、ヒツジなどの哺乳動物のヘモグロビン、キーホールリンペットヘモシアニンなどが用いられる。合成の高分子担体としては、例えばポリアミノ酸類、ポリスチレン類、ポリアクリル類、ポリビニル類、ポリプロピレン類などの重合物または供重合物などの各種ラテックスなどを用いることができる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができる。例えば、チロシン、ヒスチジン、トリプトファンを架橋するビスジアゾ化ベンジジンなどのジアゾニウム化合物、アミノ基同志を架橋するグルタルアルデビトなどのジアルデヒド化合物、トルエン−２，４−ジイソシアネートなどのジイソシアネート化合物、チオール基同志を架橋するＮ，Ｎ’−ｏ−フェニレンジマレイミドなどのジマレイミド化合物、アミノ基とチオール基を架橋するマレイミド活性エステル化合物、アミノ基とカルボキシル基とを架橋するカルボジイミド化合物などが好都合に用いられる。また、アミノ基同志を架橋する際にも、一方のアミノ基にジチオピリジル基を有する活性エステル試薬（例えば、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル（ＳＰＤＰ）など）を反応させた後還元することによりチオール基を導入し、他方のアミノ基にマレイミド活性エステル試薬によりマレイミド基を導入後、両者を反応させることもできる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
（ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明の抗原は、温血動物に対して投与される。投与部位は、抗体産生が可能な部位であればよく、抗原自体、または担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、フロインド完全アジュバントやフロインド不完全アジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。また、本発明のモノクローナル抗体の作製に際しては、ＤＮＡ免疫法を利用してもよい（例えば、Ｎａｔｕｒｅ、３５６巻、１５２項−１５４項参照）。用いられる温血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリが挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原で免疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化タンパク質と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２５６、４９５（１９７５）〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などの温血動物の骨髄腫細胞が挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、タンパク質抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したタンパク質を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎仔血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎仔血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
（ｂ）モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、自体公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、それ自体公知あるいはそれに準じる方法に従って製造することができる。例えば、免疫抗原（タンパク質抗原）自体、あるいはそれとキャリアータンパク質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、該免疫動物から本発明のタンパク質に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造することができる。
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアータンパク質との複合体に関し、キャリアータンパク質の種類およびキャリアータンパク質とハプテンとの混合比は、キャリアータンパク質に架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どのようなものをどのような比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。
また、ハプテンとキャリアータンパク質のカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、フロインド完全アジュバントやフロインド不完全フアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なわれる。また、本発明のポリクローナル抗体の作製に際しては、ＤＮＡ免疫法を利用してもよい（例えば、Ｎａｔｕｒｅ、３５６巻、１５２項−１５４項参照）。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
本発明で用いられるタンパク質または部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ（以下、アンチセンスポリヌクレオチドの説明においては、これらのＤＮＡを本発明のＤＮＡと略記する場合がある））の塩基配列に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するアンチセンスポリヌクレオチドとしては、本発明のポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）の塩基配列に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有し、該ＤＮＡの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのアンチセンスポリヌクレオチドであってもよく、アンチセンスＤＮＡが好ましい。
本発明のＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、本発明のＤＮＡに相補的な塩基配列（すなわち、本発明のＤＮＡの相補鎖）の全塩基配列あるいは部分塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列などが挙げられる。特に、本発明のＤＮＡの相補鎖の全塩基配列うち、（イ）翻訳阻害を指向したアンチセンスポリヌクレオチドの場合は、本発明のタンパク質のＮ末端部位をコードする部分の塩基配列（例えば、開始コドン付近の塩基配列など）の相補鎖と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアンチセンスポリヌクレオチドが、（ロ）ＲＮａｓｅＨによるＲＮＡ分解を指向するアンチセンスポリヌクレオチドの場合は、イントロンを含む本発明のＤＮＡの全塩基配列の相補鎖と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアンチセンスポリヌクレオチドがそれぞれ好適である。
具体的には、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：１８、配列番号：２６、配列番号：３９または配列番号：４９で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡの塩基配列に相補的な、もしくは実質的に相補的な塩基配列、またはその一部分を有するアンチセンスポリヌクレオチド、好ましくは例えば、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：１８、配列番号：２６、配列番号：３９または配列番号：４９で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡの塩基配列に相補な塩基配列、またはその一部分を有するアンチセンスポリヌクレオチドなどが挙げられる。
アンチセンスポリヌクレオチドは通常、１０〜４０個程度、好ましくは１５〜３０個程度の塩基から構成される。
ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンスＤＮＡを構成する各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）は、例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオネートなどの化学修飾リン酸残基に置換されていてもよい。また、各ヌクレオチドの糖（デオキシリボース）は、２’−Ｏ−メチル化などの化学修飾糖構造に置換されていてもよいし、塩基部分（ピリミジン、プリン）も化学修飾を受けたものであってもよく、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：１８、配列番号：２６、配列番号：３９または配列番号：４９で表わされる塩基配列を有するＤＮＡにハイブリダイズするものであればいずれのものでもよい。これらのアンチセンスポリヌクレオチドは、公知のＤＮＡ合成装置などを用いて製造することができる。
本発明に従えば、本発明のタンパク質遺伝子の複製または発現を阻害することのできる該遺伝子に対応するアンチセンスポリヌクレオチド（核酸）を、クローン化した、あるいは決定されたタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列情報に基づき設計し、合成しうる。かかるアンチセンスポリヌクレオチドは、本発明のタンパク質遺伝子のＲＮＡとハイブリダイズすることができ、該ＲＮＡの合成または機能を阻害することができるか、あるいは本発明のタンパク質関連ＲＮＡとの相互作用を介して本発明のタンパク質遺伝子の発現を調節・制御することができる。本発明のタンパク質関連ＲＮＡの選択された配列に相補的なポリヌクレオチド、および本発明のタンパク質関連ＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、生体内および生体外で本発明のタンパク質遺伝子の発現を調節・制御するのに有用であり、また病気などの治療または診断に有用である。用語「対応する」とは、遺伝子を含めたヌクレオチド、塩基配列または核酸の特定の配列に相同性を有するあるいは相補的であることを意味する。ヌクレオチド、塩基配列または核酸とタンパク質との間で「対応する」とは、ヌクレオチド（核酸）の配列またはその相補体から誘導される（指令にある）タンパク質のアミノ酸を通常指している。タンパク質遺伝子の５’端ヘアピンループ、５’端６−ベースペア・リピート、５’端非翻訳領域、ポリペプチド翻訳開始コドン、タンパク質コード領域、ＯＲＦ翻訳終止コドン、３’端非翻訳領域、３’端パリンドローム領域または３’端ヘアピンループなどは、好ましい対象領域として選択しうるが、タンパク質遺伝子内の如何なる領域も対象として選択しうる。
目的核酸と、対象領域の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチドとの関係については、目的核酸が対象領域とハイブリダイズすることができる場合は、その目的核酸は、当該対象領域のポリヌクレオチドに対して「アンチセンス」であるということができる。アンチセンスポリヌクレオチドは、２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有しているポリヌクレオチド、Ｄ−リボースを含有しているポリヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例えば、市販のタンパク質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー）または特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などが挙げられる。それらは、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＲＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであってもよく、さらに非修飾ポリヌクレオチド（または非修飾オリゴヌクレオチド）、公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合（例、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えばタンパク質（例、ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）や糖（例、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレート化合物（例、アクリジン、ソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。このような修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、例えば、１個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されていたり、またはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡまたは修飾された核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）である。修飾された核酸の具体例としては、核酸の硫黄誘導体、チオホスフェート誘導体、ポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものなどが挙げられる。本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、例えば、以下のように設計されうる。すなわち、細胞内でのアンチセンスポリヌクレオチドをより安定なものにする、アンチセンスポリヌクレオチドの細胞透過性をより高める、目標とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、また、もし毒性があるような場合はアンチセンスポリヌクレオチドの毒性をより小さなものにする。このような修飾は、例えばＰｈａｒｍ Ｔｅｃｈ Ｊａｐａｎ，８巻，２４７頁または３９５頁，１９９２年、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３年などで数多く報告されている。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、変化せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合を含有していて良く、リポゾーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療により適用されたり、付加された形態で与えられることができうる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例、ホスホリピド、コレステロールなど）などの疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の３’端または５’端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の３’端または５’端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
アンチセンスポリヌクレオチドの阻害活性は、本発明の形質転換体、本発明の生体内や生体外の遺伝子発現系、または本発明のタンパク質の生体内や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。
以下に、本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩（以下、本発明のタンパク質と略記する場合がある）、本発明のタンパク質または部分ペプチドをコードするＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略記する場合がある）、本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩に対する抗体（以下、本発明の抗体と略記する場合がある）、および本発明のＤＮＡのアンチセンスポリヌクレオチド（以下、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドと略記する場合がある）の用途を説明する。
本発明のタンパク質は、癌組織で発現が増加するので、疾患マーカーとして利用することが出来る。すなわち、癌組織における早期診断、症状の重症度の判定、疾患進行の予測のためのマーカーとして有用である。よって、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドのアンチセンスポリヌクレオチド、本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物もしくはその塩、本発明のタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物もしくはその塩、または本発明のタンパク質に対する抗体を含有する医薬は、例えば、癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防・治療剤（好ましくは、乳癌、肺癌、大腸癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌などの予防・治療剤）、癌細胞のアポトーシス促進剤、癌細胞の増殖阻害剤、癌細胞の細胞周期変化の誘発剤などとして使用することができる。
（１）本発明の抗体を含有する医薬
本発明の抗体、特に（ｉ）配列番号：６５で表されるアミノ酸配列（配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列の８８番目から１０１番目までのアミノ酸配列のＮ末端に、Ｃｖｓを付加した配列）を有するペプチド、（ｉｉ）配列番号：６６で表されるアミノ酸配列（配列番号：１で表されるアミノ酸配列の３４７番目から３６０番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、Ｃｙｓを付加した配列）を有するペプチド、（ｉｉｉ）配列番号：６７で表されるアミノ酸配列（配列番号：３で表されるアミノ酸配列の４２６番目から４３９番目までのアミノ酸配列のＮ末端に、Ｃｙｓを付加した配列）を有するペプチド、または（ｉｖ）配列番号：１または配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質の細胞外領域全体、または当該領域中に含まれる免疫原性ペプチド（エピトープ）などを認識する抗体は、癌細胞のアポトーシス誘導・促進活性、癌細胞の増殖阻害活性などを有するため、例えば癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防・治療剤（好ましくは、乳癌、肺癌、大腸癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌などの予防・治療剤）、癌細胞のアポトーシス促進剤、癌細胞の増殖阻害剤、癌細胞の細胞周期変化の誘発剤等として使用することができる。
本発明の抗体を含有する上記疾患の予防・治療剤、アポトーシス促進剤、増殖阻害剤、癌細胞の細胞周期変化の誘発剤は低毒性であり、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的（例、血管内投与、皮下投与など）に投与することができる。
本発明の抗体は、それ自体を投与しても良いし、または適当な医薬組成物として投与しても良い。投与に用いられる医薬組成物としては、本発明の抗体およびその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものであっても良い。このような医薬組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。このような注射剤は、公知の方法に従って調製できる。注射剤の調製方法としては、例えば、上記本発明の抗体またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性液、または油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製できる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（５０ｍｏｌ）ａｄｄｕｃｔ ｏｆ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ ｃａｓｔｏｒ ｏｉｌ）〕等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。直腸投与に用いられる坐剤は、上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製されても良い。
経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。このような組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。錠剤用の担体、賦形剤としては、例えば、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムが用いられる。
上記の非経口用または経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。このような投薬単位の剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤が挙げられる。抗体の含有量としては、投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ、とりわけ注射剤では５〜１００ｍｇ、その他の剤形では１０〜２５０ｍｇの上記抗体が含有されていることが好ましい。
本発明の抗体を含有する上記予防・治療剤、調節剤の投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、成人の乳癌の治療・予防のために使用する場合には、本発明の抗体を１回量として、通常０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１日１〜５回程度、好ましくは１日１〜３回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
本発明の抗体は、それ自体または適当な医薬組成物として投与することができる。上記投与に用いられる医薬組成物は、上記抗体またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。かかる組成物は、経口または非経口投与（例、血管内注射、皮下注射など）に適する剤形として提供される。
なお前記した各組成物は、上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
さらに、本発明の抗体は、他の薬剤、例えばアルキル化剤（例、サイクロフォスファミド、イフォスファミド等）、代謝拮抗剤（例、メソトレキセート、５−フルオロウラシル等）、抗癌性抗生物質（例、マイトマイシン、アドリアマイシン等）、植物由来抗癌剤（例、ビンクリスチン、ビンデシン、タキソール等）、シスプラチン、カルボプラチン、エトポキシド、イリノテカンなどと併用してもよい。本発明の抗体および上記薬剤は、同時または異なった時間に、患者に投与すればよい。
（２）アンチセンスポリヌクレオチドを含有する医薬
本発明のＤＮＡに相補的に結合し、該ＤＮＡの発現を抑制することができる本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは低毒性であり、生体内における本発明のタンパク質または本発明のＤＮＡの機能や作用を抑制し、癌細胞のアポトーシスを誘導し、または、癌細胞の増殖を阻害することができるので、例えば癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防・治療剤（好ましくは、乳癌、肺癌、大腸癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌などの予防・治療剤）、癌細胞のアポトーシス促進剤、癌細胞の増殖阻害剤、癌細胞の細胞周期変化の誘発剤などとして使用することもできる。
上記アンチセンスポリヌクレオチドを上記の予防・治療剤、アポトーシス促進剤、増殖阻害剤、癌細胞の細胞周期変化の誘発剤などして使用する場合、自体公知の方法に従って製剤化し、投与することができる。
また、例えば、前記のアンチセンスポリヌクレオチドを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って、ヒトまたは哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的に投与することができる。該アンチセンスポリヌクレオチドは、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。あるいは、エアロゾル化して吸入剤として気管内に局所投与することもできる。
さらに、体内動態の改良、半減期の長期化、細胞内取り込み効率の改善を目的に、前記のアンチセンスポリヌクレオチドを単独またはリポゾームなどの担体とともに製剤（注射剤）化し、静脈、皮下等に投与してもよい。
該アンチセンスポリヌクレオチドの投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、乳癌の治療の目的で本発明のアンチセンスポリヌクレオチドを投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇ）においては、一日につき該アンチセンスポリヌクレオチドを約０．１〜１００ｍｇ投与する。
さらに、該アンチセンスポリヌクレオチドは、組織や細胞における本発明のＤＮＡの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用することもできる。
上記アンチセンスポリヌクレオチドと同様に、本発明のタンパク質をコードするＲＮＡの一部を含有する二重鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、本発明のタンパク質をコードするＲＮＡの一部を含有するリボザイムなども、本発明の遺伝子の発現を抑制することができ、生体内における本発明で用いられるタンパク質または本発明で用いられるＤＮＡの機能を抑制することができるので、例えば、癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防・治療剤（好ましくは、乳癌、肺癌、大腸癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌などの予防・治療剤）、癌細胞のアポトーシス促進剤、癌細胞の増殖阻害剤、癌細胞の細胞周期変化の誘発剤などとして使用することができる。
二重鎖ＲＮＡは、公知の方法（例、Ｎａｔｕｒｅ，４１１巻，４９４頁，２００１年）に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。
本発明の二重鎖ＲＮＡとしては、後述の実施例１１で製造した、
（ｉ）配列番号：５５で表される塩基配列を有するＲＮＡと配列番号：５６で表される塩基配列を有するＲＮＡとをハイブリダイズしたｓｉＲＮＡ−１、
（ｉｉ）配列番号：５７で表される塩基配列を有するＲＮＡと配列番号：５８で表される塩基配列を有するＲＮＡとをハイブリダイズしたｓｉＲＮＡ−２、
（ｉｉｉ）配列番号：５９で表される塩基配列を有するＲＮＡと配列番号：６０で表される塩基配列を有するＲＮＡとをハイブリダイズしたｓｉＲＮＡ−３、
（ｉｖ）配列番号：６１で表される塩基配列を有するＲＮＡと配列番号：６２で表される塩基配列を有するＲＮＡとをハイブリダイズしたｓｉＲＮＡ−４、
（ｖ）配列番号：６３で表される塩基配列を有するＲＮＡと配列番号：６４で表される塩基配列を有するＲＮＡとをハイブリダイズしたｓｉＲＮＡ−５などが用いられる。
リボザイムは、公知の方法（例、ＴＲＥＮＤＳ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７巻，２２１頁，２００１年）に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。例えば、本発明のタンパク質をコードするＲＮＡの一部に公知のリボザイムを連結することによって製造することができる。本発明のタンパク質をコードするＲＮＡの一部としては、公知のリボザイムによって切断され得る本発明のＲＮＡ上の切断部位に近接した部分（ＲＮＡ断片）が挙げられる。
上記の二重鎖ＲＮＡまたはリボザイムを上記予防・治療剤として使用する場合、アンチセンスポリヌクレオチドと同様にして製剤化し、投与することができる。
（３）疾病に対する医薬候補化合物のスクリーニング
本発明のタンパク質は癌組織で発現が亢進しており、さらに、本発明のタンパク質の活性を阻害すると癌細胞がアポトーシスを起こし、癌細胞の増殖が阻害される。従って、本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩は、例えば癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防・治療剤（好ましくは、乳癌、肺癌、大腸癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌などの予防・治療剤）、癌細胞のアポトーシス促進剤、癌細胞の増殖阻害剤、癌細胞の細胞周期変化の誘発剤などとして使用することができる。
したがって、本発明のタンパク質は、本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬として有用である。
すなわち、本発明は、本発明のタンパク質を用いることを特徴とする本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
具体的には、例えば、（ｉ）本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞の活性と、（ｉｉ）本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞と試験化合物の混合物の活性とを比較することを特徴する本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法が用いられる。
本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、例えば、前述した本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターで形質転換された宿主（形質転換体）が用いられる。宿主としては、例えば、ＣＯＳ７細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞などの動物細胞が好ましく用いられる。該スクリーニングには、例えば、前述の方法で培養することによって、本発明のタンパク質を細胞膜上に発現させた形質転換体が好ましく用いられる。本発明のタンパク質を発現し得る細胞の培養方法は、前記した本発明の形質変換体の培養法と同様である。
試験化合物としては、例えばペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などがあげられる。
例えば、上記（ｉｉ）の場合における本発明のタンパク質の活性を、上記（ｉ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上阻害させる試験化合物を、本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物として選択することができる。
本発明のタンパク質の活性を阻害する活性を有する化合物は、本発明のタンパク質の生理活性を抑制するための安全で低毒性な医薬として有用である。
さらに、本発明のタンパク質の遺伝子も、癌組織において発現が増加するので、本発明のタンパク質の遺伝子発現を阻害する化合物またはその塩も、例えば、癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防・治療剤（好ましくは、乳癌、肺癌、大腸癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌などの予防・治療剤）、癌細胞のアポトーシス促進剤、癌細胞の増殖阻害剤、癌細胞の細胞周期変化の誘発剤などとして使用することができる。
したがって、本発明のポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）は、本発明のタンパク質の遺伝子発現を阻害する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬として有用である。
スクリーニング方法としては、（ｉｉｉ）本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞を培養した場合と、（ｉｖ）試験化合物の存在下、本発明で用いられるタンパク質を産生する能力を有する細胞を培養した場合との比較を行うことを特徴とするスクリーニング方法が挙げられる。
上記方法において、（ｉｉｉ）と（ｉｖ）の場合における、前記遺伝子の発現量（具体的には、本発明のタンパク質量または前記タンパク質をコードするｍＲＮＡ量）を測定して、比較する。
試験化合物および本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、上記と同様のものが挙げられる。
タンパク質量の測定は、公知の方法、例えば、本発明のタンパク質を認識する抗体を用いて、細胞抽出液中などに存在する前記タンパク質を、ウェスタン解析、ＥＬＩＳＡ法などの方法またはそれに準じる方法に従い測定することができる。
ｍＲＮＡ量の測定は、公知の方法、例えば、プローブとして配列番号：２、配列番号：４、配列番号：１８、配列番号：２６、配列番号：３９または配列番号：４９で表される塩基配列またはその一部を含有する核酸を用いるノーザンハイブリダイゼーション、あるいはプライマーとして配列番号：２、配列番号：４、配列番号：１８、配列番号：２６、配列番号：３９または配列番号：４９で表される塩基配列またはその一部を含有する核酸を用いるＰＣＲ法またはそれに準じる方法に従い測定することができる。
例えば、上記（ｉｖ）の場合における遺伝子の発現を、上記（ｉｉｉ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上阻害させる試験化合物を、本発明のタンパク質の遺伝子発現を阻害する化合物として選択することができる。
本発明のスクリーニング用キットは、本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩、または本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドを産生する能力を有する細胞を含有するものである。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などから選ばれた化合物またはその塩であり、本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩、本発明のタンパク質の遺伝子発現を阻害する化合物またはその塩である。
該化合物の塩としては、前記した本発明のタンパク質の塩と同様のものが用いられる。
本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩、および本発明のタンパク質の遺伝子発現を阻害する化合物またはその塩はそれぞれ、例えば癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の治療・予防剤（好ましくは、乳癌、肺癌、大腸癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌などの予防・治療剤）、癌細胞のアポトーシス促進剤、癌細胞の増殖阻害剤、癌細胞の細胞周期変化の誘発剤などとして低毒性で安全な医薬として有用である。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩を上述の予防・治療剤として使用する場合、常套手段に従って製剤化することができる。
例えば、経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などがあげられる。かかる組成物は自体公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなどが用いられる。
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤、関節内注射剤などの剤形を包含する。かかる注射剤は、自体公知の方法に従って、例えば、上記化合物またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（５０ｍｏｌ）ａｄｄｕｃｔ ｏｆ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ ｃａｓｔｏｒ ｏｉｌ）〕などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、上記化合物またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。かかる投薬単位の剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤などが例示され、それぞれの投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ、とりわけ注射剤では５〜１００ｍｇ、その他の剤形では１０〜２５０ｍｇの上記化合物が含有されていることが好ましい。
なお前記した各組成物は、上記化合物との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して経口的にまたは非経口的に投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、乳癌の治療の目的で本発明のタンパク質の遺伝子発現を阻害する化合物またはその塩を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該化合物またはその塩を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物またはその塩の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、乳癌の治療の目的で本発明のタンパク質の遺伝子発現を阻害する化合物またはその塩を注射剤の形で通常成人（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該化合物またはその塩を約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを癌病変部に注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
（４）本発明のタンパク質の定量
本発明の抗体は、本発明のタンパク質を特異的に認識することができるので、被検液中の本発明のタンパク質の定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使用することができる。
すなわち、本発明は、
（ｉ）本発明の抗体と、被検液および標識化された本発明のタンパク質とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化された本発明のタンパク質の割合を測定することを特徴とする被検液中の本発明のタンパク質の定量法、および
（ｉｉ）被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の別の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の本発明のタンパク質の定量法を提供する。
上記（ｉｉ）の定量法においては、一方の抗体が本発明のタンパク質のＮ端部を認識する抗体で、他方の抗体が本発明のタンパク質のＣ端部に反応する抗体であることが望ましい。
また、本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体（以下、本発明のモノクローナル抗体と称する場合がある）を用いて本発明のタンパク質の定量を行なえるほか、組織染色等による検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。
本発明の抗体を用いる本発明のタンパク質の定量法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、タンパク質量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔１２５Ｉ〕、〔１３１Ｉ〕、〔３Ｈ〕、〔１４Ｃ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、シアニン蛍光色素（例、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＣＹ５．５、Ｃｙ７（アマシャムバイオサイエンス社製）など）、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等が挙げられる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した別の本発明のモノクローナル抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の本発明のタンパク質量を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドイッチ法による本発明のタンパク質の測定法においては、１次反応と２次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、本発明のタンパク質の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。すなわち、１次反応および２次反応に用いられる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、本発明のタンパク質のＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。
競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原（Ｆ）と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、および、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のタンパク質の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
例えば、入江 寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ」Ｖｏｌ．７０（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ａ））、同書Ｖｏｌ．７３（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ｂ））、同書Ｖｏｌ．７４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ｃ））、同書Ｖｏｌ．８４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ｄ：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ））、同書Ｖｏｌ．９２（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ｅ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ））、同書Ｖｏｌ．１２１（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ Ｉ：Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ））（以上、アカデミックプレス社発行）などを参照することができる。
以上のようにして、本発明の抗体を用いることによって、本発明のタンパク質を感度良く定量することができる。
さらには、本発明の抗体を用いて本発明のタンパク質の濃度を定量することによって、本発明のタンパク質の濃度の増加が検出された場合、例えば癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、本発明の抗体は、体液や組織などの被検体中に存在する本発明のタンパク質を検出するために使用することができる。また、本発明のタンパク質を精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中の本発明のタンパク質の検出、被検細胞内における本発明のタンパク質の挙動分析などのために使用することができる。
（５）遺伝子診断薬
本発明のＤＮＡは、例えば、プローブとして使用することにより、ヒトまたは温血動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）における本発明のタンパク質またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断薬として有用である。
本発明のＤＮＡを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、自体公知のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，第８６巻，２７６６〜２７７０頁（１９８９年））などにより実施することができる。
例えば、ノーザンハイブリダイゼーションにより発現過多が検出された場合やＰＣＲ−ＳＳＣＰ法によりＤＮＡの突然変異などが検出された場合は、例えば癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）である可能性が高いと診断することができる。
（６）本発明のタンパク質を含有する医薬
本発明のタンパク質は癌で過剰に発現していることから、癌患者の免疫系を活性化するために本発明のタンパク質を癌ワクチンとして用いることもできる。
例えば、強力な抗原提示細胞（例、樹状細胞）を本発明のタンパク質存在下に培養し、該タンパク質を貪食させた後に、再び患者の体内に戻す、所謂養子免疫療法などを好ましく適用し得る。体内に戻された樹状細胞は癌抗原特異的な細胞障害性Ｔ細胞を誘導、活性化することにより癌細胞を死滅させることが可能である。
また、本発明のタンパク質は、例えば癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防または治療のためのワクチン製剤として、安全に、哺乳動物（例、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ブタ）に投与することもできる。
該ワクチン製剤は、通常、本発明のタンパク質および生理学的に許容されうる担体を含有する。担体としては例えば、水、食塩水（生理食塩水を含む）、緩衝液（例、リン酸緩衝液）、アルコール（例、エタノール）などの液体の担体があげられる。
ワクチン製剤は、通常のワクチン製剤の製造方法に従って調製することができる。
通常、本発明のタンパク質は、生理学的に許容されうる担体に溶解または懸濁される。また、本発明のタンパク質と生理学的に許容されうる担体とを別々に調製し、用時それらを混合して用いてもよい。
ワクチン製剤には、本発明のタンパク質および生理学的に許容されうる担体に加え、アジュバント（例、水酸化アルミニウムゲル、血清アルブミンなど）、防腐剤（例、チメロサールなど）、無痛化剤（例、ブドウ糖、ベンジルアルコールなど）などを配合させてもよい。また、本発明のタンパク質に対する抗体産生を促進させるために、例えばサイトカイン（例、インターロイキン−２などのインターロイキン類、インターフェロン−γなどのインターフェロン類など）をさらに配合させてもよい。
ワクチン製剤として用いる際、本発明のタンパク質は活性体として用いてもよいが、抗原性を高めるために本発明のタンパク質を変性させてもよい。本発明のタンパク質の変性は、通常、加熱処理、タンパク質変性剤（例、ホルマリン、塩酸グアニジン、尿素）による処理により行われる。
得られたワクチン製剤は低毒性であり、通常注射剤として、例えば皮下、皮内、筋肉内に投与してもよく、また癌細胞塊またはその近傍に局所的に投与してもよい。
本発明のタンパク質の投与量は、例えば対象疾患、投与対象、投与ルートなどによって異なるが、例えば本発明のタンパク質を癌に罹患した成人（体重６０ｋｇ）に皮下的に注射剤として投与する場合、１回当たり通常０．１〜３００ｍｇ程度、好ましくは１００〜３００ｍｇ程度である。ワクチン製剤の投与回数は１回でもよいが、抗体産生量を高めるために、約２週間〜約６ヶ月の間隔をあけて、該ワクチン製剤を２〜４回投与することもできる。
（７）ＤＮＡ転移動物
本発明は、外来性の本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ（以下、本発明の外来性ＤＮＡと略記する）またはその変異ＤＮＡ（本発明の外来性変異ＤＮＡと略記する場合がある）を有する非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
（１）本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物、
（２）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（１）記載の動物、
（３）ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第（２）記載の動物、および
（４）本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを含有し、哺乳動物において発現しうる組換えベクターを提供するものである。
本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物（以下、本発明のＤＮＡ転移動物と略記する）は、未受精卵、受精卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生における胚発生の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に８細胞期以前）に、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などにより目的とするＤＮＡを転移することによって作出することができる。また、該ＤＮＡ転移方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞などに目的とする本発明の外来性ＤＮＡを転移し、細胞培養、組織培養などに利用することもでき、さらに、これら細胞を上述の胚芽細胞と自体公知の細胞融合法により融合させることにより本発明のＤＮＡ転移動物を作出することもできる。
非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどが用いられる。なかでも、病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、また、繁殖が容易なゲッ歯動物、とりわけマウス（例えば、純系として、Ｃ５７ＢＬ／６系統，ＤＢＡ２系統など、交雑系として、Ｂ６Ｃ３Ｆ１系統，ＢＤＦ１系統，Ｂ６Ｄ２Ｆ１系統，ＢＡＬＢ／ｃ系統，ＩＣＲ系統など）またはラット（例えば、Ｗｉｓｔａｒ，ＳＤなど）などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける「哺乳動物」としては、上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどがあげられる。
本発明の外来性ＤＮＡとは、非ヒト哺乳動物が本来有している本発明のＤＮＡではなく、いったん哺乳動物から単離・抽出された本発明のＤＮＡをいう。
本発明の変異ＤＮＡとしては、元の本発明のＤＮＡの塩基配列に変異（例えば、突然変異など）が生じたもの、具体的には、塩基の付加、欠損、他の塩基への置換などが生じたＤＮＡなどが用いられ、また、異常ＤＮＡも含まれる。
該異常ＤＮＡとしては、異常な本発明のタンパク質を発現させるＤＮＡを意味し、例えば、正常な本発明のタンパク質の機能を抑制するタンパク質を発現させるＤＮＡなどが用いられる。
本発明の外来性ＤＮＡは、対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳動物由来のものであってもよい。本発明のＤＮＡを対象動物に転移させるにあたっては、該ＤＮＡを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合したＤＮＡコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。例えば、本発明のヒトＤＮＡを転移させる場合、これと相同性が高い本発明のＤＮＡを有する各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のＤＮＡを発現させうる各種プロモーターの下流に、本発明のヒトＤＮＡを結合したＤＮＡコンストラクト（例、ベクターなど）を対象哺乳動物の受精卵、例えば、マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明のＤＮＡを高発現するＤＮＡ転移哺乳動物を作出することができる。
本発明のタンパク質の発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウィルスなどのレトロウィルス、ワクシニアウィルスまたはバキュロウィルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。なかでも、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好ましく用いられる。
上記のＤＮＡ発現調節を行なうプロモーターとしては、例えば、（ｉ）ウイルス（例、シミアンウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、ＪＣウイルス、乳癌ウイルス、ポリオウイルスなど）に由来するＤＮＡのプロモーター、（ｉｉ）各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のプロモーター、例えば、アルブミン、インスリンＩＩ、ウロプラキンＩＩ、エラスターゼ、エリスロポエチン、エンドセリン、筋クレアチンキナーゼ、グリア線維性酸性タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、血小板由来成長因子β、ケラチンＫ１，Ｋ１０およびＫ１４、コラーゲンＩ型およびＩＩ型、サイクリックＡＭＰ依存タンパク質キナーゼβＩサブユニット、ジストロフィン、酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、心房ナトリウム利尿性因子、内皮レセプターチロシンキナーゼ（一般にＴｉｅ２と略される）、ナトリウムカリウムアデノシン３リン酸化酵素（Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ）、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインＩおよびＩＩＡ、メタロプロティナーゼ１組織インヒビター、ＭＨＣクラスＩ抗原（Ｈ−２Ｌ）、Ｈ−ｒａｓ、レニン、ドーパミンβ−水酸化酵素、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、ペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２、ミエリン基礎タンパク質、チログロブリン、Ｔｈｙ−１、免疫グロブリン、Ｈ鎖可変部（ＶＮＰ）、血清アミロイドＰコンポーネント、ミオグロビン、トロポニンＣ、平滑筋αアクチン、プレプロエンケファリンＡ、バソプレシンなどのプロモーターなどが用いられる。なかでも、全身で高発現することが可能なサイトメガロウイルスプロモーター、ヒトペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）のプロモーター、ヒトおよびニワトリβアクチンプロモーターなどが好適である。
上記ベクターは、ＤＮＡ転移哺乳動物において目的とするメッセンジャーＲＮＡの転写を終結する配列（一般にターミネターと呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウイルス由来および各種哺乳動物由来の各ＤＮＡの配列を用いることができ、好ましくは、シミアンウイルスのＳＶ４０ターミネターなどが用いられる。
その他、目的とする外来性ＤＮＡをさらに高発現させる目的で各ＤＮＡのスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核ＤＮＡのイントロンの一部などをプロモーター領域の５’上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３’下流に連結することも目的により可能である。
正常な本発明のタンパク質の翻訳領域は、ヒトまたは各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来の肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＤＮＡおよび市販の各種ゲノムＤＮＡライブラリーよりゲノムＤＮＡの全てあるいは一部として、または肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＲＮＡより公知の方法により調製された相補ＤＮＡを原料として取得することが出来る。また、外来性の異常ＤＮＡは、上記の細胞または組織より得られた正常なタンパク質の翻訳領域を点突然変異誘発法により変異した翻訳領域を作製することができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうるＤＮＡコンストラクトとして、前記のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常のＤＮＡ工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において、本発明の外来性ＤＮＡが存在することは、作出動物の後代がすべて、その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを保持することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを有する。
本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の外来性ＤＮＡが過剰に存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有する。
導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを過剰に有するように繁殖継代することができる。
本発明の正常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の正常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を促進することにより最終的に本発明のタンパク質の機能亢進症を発症することがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の正常ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタンパク質の機能亢進症や、本発明のタンパク質が関連する疾患の病態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、遊離した本発明のタンパク質の増加症状を有することから、本発明のタンパク質に関連する疾患に対する予防・治療剤、例えば癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防・治療剤のスクリーニング試験にも利用可能である。
一方、本発明の外来性異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。さらに、目的とする外来ＤＮＡを前述のプラスミドに組み込んで原料として用いることができる。プロモーターとのＤＮＡコンストラクトは、通常のＤＮＡ工学的手法によって作製することができる。受精卵細胞段階における本発明の異常ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の異常ＤＮＡが存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫は、その胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有する。導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを有するように繁殖継代することができる。
本発明の異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の異常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を阻害することにより最終的に本発明のタンパク質の機能不活性型不応症となることがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の異常ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患を治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、具体的な利用可能性としては、本発明の異常ＤＮＡ高発現動物は、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症における本発明の異常タンパク質による正常タンパク質の機能阻害（ｄｏｍｉｎａｎｔ ｎｅｇａｔｉｖｅ作用）を解明するモデルとなる。
また、本発明の外来異常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、遊離した本発明のタンパク質の増加症状を有することから、本発明のタンパク質または機能不活性型不応症に対する予防・治療剤、例えば癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防・治療剤のスクリーニング試験にも利用可能である。
また、上記２種類の本発明のＤＮＡ転移動物のその他の利用可能性として、例えば、
（ｉ）組織培養のための細胞源としての使用、
（ｉｉ）本発明のＤＮＡ転移動物の組織中ＤＮＡもしくはＲＮＡを直接分析するか、またはＤＮＡにより発現されたペプチド組織を分析することによる、本発明のタンパク質により特異的に発現あるいは活性化するペプチドとの関連性についての解析、
（ｉｉｉ）ＤＮＡを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、これらを使用して、一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
（ｉｖ）上記（ｉｉｉ）記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のスクリーニング、および
（ｖ）本発明の変異タンパク質を単離精製およびその抗体作製などが考えられる。
さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症などを含む、本発明のタンパク質に関連する疾患の臨床症状を調べることができ、また、本発明のタンパク質に関連する疾患モデルの各臓器におけるより詳細な病理学的所見が得られ、新しい治療方法の開発、さらには、該疾患による二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
また、本発明のＤＮＡ転移動物から各臓器を取り出し、細切後、トリプシンなどのタンパク質分解酵素により、遊離したＤＮＡ転移細胞の取得、その培養またはその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。さらに、本発明のタンパク質産生細胞の特定化、アポトーシス、分化あるいは増殖との関連性、またはそれらにおけるシグナル伝達機構を調べ、それらの異常を調べることなどができ、本発明のタンパク質およびその作用解明のための有効な研究材料となる。
さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症を含む、本発明のタンパク質に関連する疾患の治療薬の開発を行なうために、上述の検査法および定量法などを用いて、有効で迅速な該疾患治療薬のスクリーニング法を提供することが可能となる。また、本発明のＤＮＡ転移動物または本発明の外来性ＤＮＡ発現ベクターを用いて、本発明のタンパク質が関連する疾患のＤＮＡ治療法を検討、開発することが可能である。
（８）ノックアウト動物
本発明は、本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
（１）本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
（２）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化された第（１）項記載の胚幹細胞、
（３）ネオマイシン耐性である第（１）項記載の胚幹細胞、
（４）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（１）項記載の胚幹細胞、
（５）ゲッ歯動物がマウスである第（４）項記載の胚幹細胞、
（６）本発明のＤＮＡが不活性化された該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、
（７）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうる第（６）項記載の非ヒト哺乳動物、
（８）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（６）項記載の非ヒト哺乳動物、
（９）ゲッ歯動物がマウスである第（８）項記載の非ヒト哺乳動物、および
（１０）第（７）項記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、該非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡに人為的に変異を加えることにより、ＤＮＡの発現能を抑制するか、もしくは該ＤＮＡがコードしている本発明のタンパク質の活性を実質的に喪失させることにより、ＤＮＡが実質的に本発明のタンパク質の発現能を有さない（以下、本発明のノックアウトＤＮＡと称することがある）非ヒト哺乳動物の胚幹細胞（以下、ＥＳ細胞と略記する）をいう。
非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のＤＮＡに人為的に変異を加える方法としては、例えば、遺伝子工学的手法により該ＤＮＡ配列の一部又は全部の削除、他ＤＮＡを挿入または置換させることによって行なうことができる。これらの変異により、例えば、コドンの読み取り枠をずらしたり、プロモーターあるいはエキソンの機能を破壊することにより本発明のノックアウトＤＮＡを作製すればよい。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞（以下、本発明のＤＮＡ不活性化ＥＳ細胞または本発明のノックアウトＥＳ細胞と略記する）の具体例としては、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡを単離し、そのエキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいはｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を代表とするレポーター遺伝子等を挿入することによりエキソンの機能を破壊するか、あるいはエキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、ｐｏｌｙＡ付加シグナルなど）を挿入し、完全なメッセンジャーＲＮＡを合成できなくすることによって、結果的に遺伝子を破壊するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（以下、ターゲッティングベクターと略記する）を、例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、得られたＥＳ細胞について本発明のＤＮＡ上あるいはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析あるいはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列とターゲッティングベクター作製に使用した本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマーとしたＰＣＲ法により解析し、本発明のノックアウトＥＳ細胞を選別することにより得ることができる。
また、相同組換え法等により本発明のＤＮＡを不活化させる元のＥＳ細胞としては、例えば、前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知ＥｖａｎｓとＫａｕｆｍａの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスのＥＳ細胞の場合、現在、一般的には１２９系のＥＳ細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得するなどの目的で例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善したＢＤＦ１マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２とのＦ１）を用いて樹立したものなども良好に用いうる。ＢＤＦ１マウスは、採卵数が多く、かつ、卵が丈夫であるという利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを背景に持つので、これを用いて得られたＥＳ細胞は病態モデルマウスを作出したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとバッククロスすることでその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。
また、ＥＳ細胞を樹立する場合、一般には受精後３．５日目の胚盤胞を使用するが、これ以外に８細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率よく多数の初期胚を取得することができる。
また、雌雄いずれのＥＳ細胞を用いてもよいが、通常雄のＥＳ細胞の方が生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
ＥＳ細胞の雌雄の判定方法としては、例えば、ＰＣＲ法によりＹ染色体上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その１例としてあげることができる。この方法を使用すれば、従来、核型分析をするのに約１０６個の細胞数を要していたのに対して、１コロニー程度のＥＳ細胞数（約５０個）で済むので、培養初期におけるＥＳ細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。
また、第二次セレクションとしては、例えば、Ｇ−バンディング法による染色体数の確認等により行うことができる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常数の１００％が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、ＥＳ細胞の遺伝子をノックアウトした後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が２ｎ＝４０である細胞）に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いやすいので、注意深く継代培養することが必要である。例えば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上でＬＩＦ（１〜１００００Ｕ／ｍｌ）存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、５％炭酸ガス、９５％空気または５％酸素、５％炭酸ガス、９０％空気）で約３７℃で培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（通常０．００１〜０．５％トリプシン／０．１〜５ｍＭ ＥＤＴＡ、好ましくは約０．１％トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ）処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などがとられる。このような継代は、通常１〜３日毎に行なうが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔Ｍ．Ｊ．Ｅｖａｎｓ及びＭ．Ｈ．Ｋａｕｆｍａｎ，Ｎａｔｕｒｅ、第２９２巻、１５４頁、１９８１年；Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｔｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．第７８巻、７６３４頁、１９８１年；Ｔ．Ｃ．Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら、ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォロジー、第８７巻、２７頁、１９８５年〕、本発明のＥＳ細胞を分化させて得られる本発明のＤＮＡ発現不全細胞は、インビトロにおける本発明のタンパク質の細胞生物学的検討において有用である。
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、該動物のｍＲＮＡ量を公知方法を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、正常動物と区別することが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、例えば、前述のようにして作製したターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、導入によりターゲッティングベクターの本発明のＤＮＡが不活性化されたＤＮＡ配列が遺伝子相同組換えにより、マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の本発明のＤＮＡと入れ換わる相同組換えをさせることにより、本発明のＤＮＡをノックアウトさせることができる。
本発明のＤＮＡがノックアウトされた細胞は、本発明のＤＮＡ上またはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析またはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列と、ターゲッティングベクターに使用したマウス由来の本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列とをプライマーとしたＰＣＲ法による解析で判定することができる。非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、本発明のＤＮＡが不活性化された細胞株をクローニングし、その細胞を適当な時期、例えば、８細胞期の非ヒト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。作出された動物は正常な本発明のＤＮＡ座をもつ細胞と人為的に変異した本発明のＤＮＡ座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。
該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明のＤＮＡ座をもつ場合、このようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、全ての組織が人為的に変異を加えた本発明のＤＮＡ座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コートカラーの判定等により選別することにより得られる。このようにして得られた個体は、通常、本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体であり、本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体同志を交配し、それらの産仔から本発明のタンパク質のホモ発現不全個体を得ることができる。
卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマイクロインジェクション法でＤＮＡ溶液を注入することによりターゲッティングベクターを染色体内に導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物に比べて、遺伝子相同組換えにより本発明のＤＮＡ座に変異のあるものを選択することにより得られる。
このようにして本発明のＤＮＡがノックアウトされている個体は、交配により得られた動物個体も該ＤＮＡがノックアウトされていることを確認して通常の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。すなわち、該不活化ＤＮＡの保有する雌雄の動物を交配することにより、該不活化ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得しうる。得られたホモザイゴート動物は、母親動物に対して、正常個体１，ホモザイゴート複数になるような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。ヘテロザイゴート動物の雌雄を交配することにより、該不活化ＤＮＡを有するホモザイゴートおよびヘテロザイゴート動物を繁殖継代する。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、非常に有用である。
また、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のタンパク質により誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、本発明のタンパク質の生物活性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、これらの疾病の原因究明及び治療法の検討に有用である。
（８ａ）本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニング方法
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニングに用いることができる。
すなわち、本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、該動物の変化を観察・測定することを特徴とする、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病、例えば癌などに対して治療・予防効果を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられる本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものがあげられる。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などがあげられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
具体的には、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を、試験化合物で処理し、無処理の対照動物と比較し、該動物の各器官、組織、疾病の症状などの変化を指標として試験化合物の治療・予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、例えば、経口投与、静脈注射などが用いられ、試験動物の症状、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。また、試験化合物の投与量は、投与方法、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。
例えば癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）に対して治療・予防効果を有する化合物をスクリーニングする場合、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、試験化合物非投与群と癌の発症度合いの違いや癌の治癒度合いの違いを上記組織で経時的に観察する。
該スクリーニング方法において、試験動物に試験化合物を投与した場合、該試験動物の上記疾患症状が約１０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましくは約５０％以上改善した場合、該試験化合物を上記の疾患に対して治療・予防効果を有する化合物として選択することができる。
該スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のタンパク質の欠損や損傷などによって引き起こされる疾患に対して治療・予防効果を有するので、該疾患に対する安全で低毒性な予防・治療剤などの医薬として使用することができる。さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸など）や塩基（例、アルカリ金属など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のタンパク質を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、該化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）の乳癌患者においては、一日につき該化合物を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、該化合物を注射剤の形で通常成人（体重６０ｋｇとして）の乳癌患者に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
（８ｂ）本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法
本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
上記スクリーニング方法において、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記した本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、本発明のＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが用いられる。
試験化合物としては、前記と同様のものがあげられる。
レポーター遺伝子としては、前記と同様のものが用いられ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）、可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子などが好適である。
本発明のＤＮＡをレポーター遺伝子で置換された本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物では、レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの支配下に存在するので、レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレースすることにより、プロモーターの活性を検出することができる。
例えば、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ領域の一部を大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）で置換している場合、本来、本発明のタンパク質の発現する組織で、本発明のタンパク質の代わりにβ−ガラクトシダーゼが発現する。従って、例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）のようなβ−ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用いて染色することにより、簡便に本発明のタンパク質の動物生体内における発現状態を観察することができる。具体的には、本発明のタンパク質欠損マウスまたはその組織切片をグルタルアルデヒドなどで固定し、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄後、Ｘ−ｇａｌを含む染色液で、室温または３７℃付近で、約３０分ないし１時間反応させた後、組織標本を１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄することによって、β−ガラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色を観察すればよい、また、常法に従い、ｌａｃＺをコードするｍＲＮＡを検出してもよい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物である。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、アルカリ金属など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその塩は、本発明のタンパク質の発現の阻害、該タンパク質の機能を阻害することができるので、例えば癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防・治療剤として有用である。
さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のタンパク質またはその塩を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）の乳癌患者においては、一日につき該化合物を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物を注射剤の形で通常成人（体重６０ｋｇとして）の乳癌患者に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
このように、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニングする上で極めて有用であり、本発明のＤＮＡ発現不全に起因する各種疾患の原因究明または予防・治療剤の開発に大きく貢献することができる。
また、本発明のタンパク質のプロモーター領域を含有するＤＮＡを使って、その下流に種々のタンパク質をコードする遺伝子を連結し、これを動物の卵細胞に注入していわゆるトランスジェニック動物（遺伝子移入動物）を作成すれば、特異的にそのタンパク質を合成させ、その生体での作用を検討することも可能となる。さらに上記プロモーター部分に適当なレポーター遺伝子を結合させ、これが発現するような細胞株を樹立すれば、本発明のタンパク質そのものの体内での産生能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物の探索系として使用できる。
本明細書において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ ：アデニン
Ｔ ：チミン
Ｇ ：グアニン
Ｃ ：シトシン
ＲＮＡ ：リボ核酸
ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム
Ｇｌｙ ：グリシン
Ａｌａ ：アラニン
Ｖａｌ ：バリン
Ｌｅｕ ：ロイシン
Ｉｌｅ ：イソロイシン
Ｓｅｒ ：セリン
Ｔｈｒ ：スレオニン
Ｃｙｓ ：システイン
Ｍｅｔ ：メチオニン
Ｇｌｕ ：グルタミン酸
Ａｓｐ ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ ：リジン
Ａｒｇ ：アルギニン
Ｈｉｓ ：ヒスチジン
Ｐｈｅ ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ ：チロシン
Ｔｒｐ ：トリプトファン
Ｐｒｏ ：プロリン
Ａｓｎ ：アスパラギン
Ｇｌｎ ：グルタミン
ｐＧｌｕ ：ピログルタミン酸
Ｓｏｃ ：セレノシステイン（ｓｅｌｅｎｏｃｙｓｔｅｉｎｅ）
また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記する。
Ｍｅ ：メチル基
Ｅｔ ：エチル基
Ｂｕ ：ブチル基
Ｐｈ ：フェニル基
ＴＣ ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基
Ｔｏｓ ：ｐ−トルエンスルフォニル
ＣＨＯ ：ホルミル
Ｂｚｌ ：ベンジル
Ｃｌ２−Ｂｚｌ ：２，６−ジクロロベンジル
Ｂｏｍ ：ベンジルオキシメチル
Ｚ ：ベンジルオキシカルボニル
Ｃｌ−Ｚ ：２−クロロベンジルオキシカルボニル
Ｂｒ−Ｚ ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル
Ｂｏｃ ：ｔ−ブトキシカルボニル
ＤＮＰ ：ジニトロフェニル
Ｔｒｔ ：トリチル
Ｂｕｍ ：ｔ−ブトキシメチル
Ｆｍｏｃ ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＯＢｔ ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール
ＨＯＯＢｔ ：３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン
ＨＯＮＢ ：１−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド
ＤＣＣ ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕
Ｎｅｃｔｉｎ−２αのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２〕
配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するＮｅｃｔｉｎ−２αをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３〕
Ｎｅｃｔｉｎ−２δのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４〕
配列番号：３で表されるアミノ酸配列を有するＮｅｃｔｉｎ−２δをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：５〕
実施例１および２で用いられたアンチセンスオリゴヌクレオチド１の塩基配列を示す。
〔配列番号：６〕
実施例１および２で用いられたコントロールオリゴヌクレオチド１の塩基配列を示す
〔配列番号：７〕
実施例２で用いられたプライマー１の塩基配列を示す。
〔配列番号：８〕
実施例２で用いられたプライマー２の塩基配列を示す。
〔配列番号：９〕
実施例２で用いられたＴａｑＭａｎプローブ１の塩基配列を示す。
〔配列番号：１０〕
実施例２で用いられたプライマー３の塩基配列を示す。
〔配列番号：１１〕
実施例２で用いられたプライマー４の塩基配列を示す。
〔配列番号：１２〕
実施例２で用いられたＴａｑＭａｎプローブ２の塩基配列を示す。
〔配列番号：１３〕
参考例１および２で用いられたプライマー５の塩基配列を示す。
〔配列番号：１４〕
参考例１で用いられたプライマー６の塩基配列を示す。
〔配列番号：１５〕
参考例２で用いられたプライマー７の塩基配列を示す。
〔配列番号：１６〕
参考例２で用いられたプライマー８の塩基配列を示す。
〔配列番号：１７〕
ＰＳＥＣ０１１０ ｆｉｓのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１８〕
配列番号：１７で表されるアミノ酸配列を有するＰＳＥＣ０１１０ ｆｉｓをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１９〕
実施例３および４で用いられたアンチセンスオリゴヌクレオチド２の塩基配列を示す。
〔配列番号：２０〕
実施例３および４で用いられたコントロールオリゴヌクレオチド２の塩基配列を示す。
〔配列番号：２１〕
実施例４で用いられたプライマー９の塩基配列を示す。
〔配列番号：２２〕
実施例４で用いられたプライマー１０の塩基配列を示す。
〔配列番号：２３〕
参考例３で用いられたプライマー１１の塩基配列を示す。
〔配列番号：２４〕
参考例３で用いられたプライマー１２の塩基配列を示す。
〔配列番号：２５〕
ＫＩＡＡ０１５２のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２６〕
配列番号：２５で表されるアミノ酸配列を有するＫＩＡＡ０１５２をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：２７〕
実施例５および６で用いられたアンチセンスオリゴヌクレオチド３の塩基配列を示す。
〔配列番号：２８〕
実施例５および６で用いられたコントロールオリゴヌクレオチド３の塩基配列を示す。
〔配列番号：２９〕
実施例６で用いられたプライマー１３の塩基配列を示す。
〔配列番号：３０〕
実施例６で用いられたプライマー１４の塩基配列を示す。
〔配列番号：３１〕
参考例６で用いられたプライマー３０の塩基配列を示す。
〔配列番号：３２〕
参考例６で用いられたプライマー３１の塩基配列を示す。
〔配列番号：３３〕
参考例６で用いられたプライマー３２の塩基配列を示す。
〔配列番号：３４〕
参考例４で用いられたプライマー１７の塩基配列を示す。
〔配列番号：３５〕
参考例４で用いられたプライマー１８の塩基配列を示す。
〔配列番号：３６〕
参考例４で用いられたプライマー１９の塩基配列を示す。
〔配列番号：３７〕
参考例４で用いられたプライマー２０の塩基配列を示す。
〔配列番号：３８〕
ＤＫＦＺＰ５８６Ｌ０７２４のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：３９〕
配列番号：３８で表されるアミノ酸配列を有するＤＫＦＺＰ５８６Ｌ０７２４をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：４０〕
実施例７および８で用いられたアンチセンスオリゴヌクレオチド４の塩基配列を示す。
〔配列番号：４１〕
実施例７および８で用いられたコントロールオリゴヌクレオチド４の塩基配列を示す。
〔配列番号：４２〕
実施例８で用いられたプライマー２１の塩基配列を示す。
〔配列番号：４３〕
実施例８で用いられたプライマー２２の塩基配列を示す。
〔配列番号：４４〕
参考例５で用いられたプライマー２３の塩基配列を示す。
〔配列番号：４５〕
参考例５で用いられたプライマー２４の塩基配列を示す。
〔配列番号：４６〕
参考例５で用いられたプライマー２５の塩基配列を示す。
〔配列番号：４７〕
参考例５で用いられたプライマー２６の塩基配列を示す。
〔配列番号：４８〕
ＤＣＢＬＤ１Ｌのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４９〕
配列番号：４８で表されるアミノ酸配列を有するＤＣＢＬＤ１をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：５０〕
実施例９および１０で用いられたアンチセンスオリゴヌクレオチド５の塩基配列を示す。
〔配列番号：５１〕
実施例９および１０で用いられたコントロールオリゴヌクレオチド５の塩基配列を示す。
〔配列番号：５２〕
実施例１０で用いられたプライマー２７の塩基配列を示す。
〔配列番号：５３〕
実施例１０で用いられたプライマー２８の塩基配列を示す。
〔配列番号：５４〕
参考例６で用いられたプライマー２９の塩基配列を示す。
〔配列番号：５５〕
実施例１１、実施例１２および実施例１３で用いたｓｉＲＮＡ−１の塩基配列を示す。
〔配列番号：５６〕
実施例１１、実施例１２および実施例１３で用いたｓｉＲＮＡ−１の塩基配列を示す。
〔配列番号：５７〕
実施例１１、実施例１２および実施例１３で用いたｓｉＲＮＡ−２の塩基配列を示す。
〔配列番号：５８〕
実施例１１、実施例１２および実施例１３で用いたｓｉＲＮＡ−２の塩基配列を示す。
〔配列番号：５９〕
実施例１１、実施例１２および実施例１３で用いたｓｉＲＮＡ−３の塩基配列を示す。
〔配列番号：６０〕
実施例１１、実施例１２および実施例１３で用いたｓｉＲＮＡ−３の塩基配列を示す。
〔配列番号：６１〕
実施例１１、実施例１２および実施例１３で用いたｓｉＲＮＡ−４の塩基配列を示す。
〔配列番号：６２〕
実施例１１、実施例１２および実施例１３で用いたｓｉＲＮＡ−４の塩基配列を示す。
〔配列番号：６３〕
実施例１１、実施例１２および実施例１３で用いたｓｉＲＮＡ−５の塩基配列を
〔配列番号：６４〕
実施例１１、実施例１２および実施例１３で用いたｓｉＲＮＡ−５の塩基配列を
〔配列番号：６５〕
実施例１６で用いられたペプチド１のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：６６〕
実施例１６で用いられたペプチド２のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：６７〕
実施例１６で用いられたペプチド３のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：６８〕
参考例７で用いられたプライマー３３の塩基配列を示す。
〔配列番号：６９〕
参考例７で用いられたプライマー３４の塩基配列を示す。
〔配列番号：７０〕
Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−ＦＬＡＧタンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：７１〕
配列番号：７０で表されるＮｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−ＦＬＡＧタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
以下において、実施例および参考例により本発明をより具体的にするが、この発明はこれらに限定されるものではない。
Ｎｅｃｔｉｎ−２α、およびＮｅｃｔｉｎ−２δ遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチド投与によるヒト大腸がん細胞株のアポトーシス誘発
アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）より購入したヒト大腸がん細胞株ＨＴ−２９を、１０％牛胎仔血清（ＪＲＨ社）を含むＭｃＣｏｙ’ ｓ ５Ａ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）〔以下、Ｍ５培地と略することもある〕で懸濁し、１ウェル当たり１万個の細胞密度で９６穴平底組織培養プレート（ＢＤファルコン社）に播種した。５％炭酸ガス気流中、３７℃で一晩培養した後、オリゴヌクレオチドをトランスフェクションした。
具体的には、Ｎｅｃｔｉｎ−２α遺伝子の翻訳領域もしくはＮｅｃｔｉｎ−２δ遺伝子のイントロン領域にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチド配列（配列番号：５）を設計後、ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ化オリゴヌクレオチドを合成し、ＨＰＬＣ精製して用いた（以下、アンチセンスオリゴヌクレオチド１と略する）。コントロールとしては、配列番号：５で示される塩基配列のリバース配列を有するオリゴヌクレオチド（配列番号：６）を同様にｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ化し、ＨＰＬＣ精製して用いた（以下、コントロールオリゴヌクレオチド１と略する）。２００ｎｇのアンチセンスオリゴヌクレオチド１、または２００ｎｇのコントロールオリゴヌクレオチド１をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）０．５μＬと共にＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）５０μＬと混合し、室温で２０分間放置した。予めＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ ５０μＬに培地交換しておいたＨＴ−２９細胞培養液に上記混合液を全量添加し、更に３時間培養を継続した後、Ｍ５培地に培地交換した。更に２日間培養を継続した後、Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ ３／７アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて添付プロトコールに従い、上記オリゴヌクレオチドのアポトーシス誘導活性を測定した。その結果、Ｎｅｃｔｉｎ−２α遺伝子、およびＮｅｃｔｉｎ−２δ遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチド１（配列番号：５）はコントロールオリゴヌクレオチド１（配列番号：６）に比べて約１．９倍のアポトーシス誘導活性を示し、統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を示した。
Ｎｅｃｔｉｎ−２α遺伝子、およびＮｅｃｔｉｎ−２δ遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチド投与によるＮｅｃｔｉｎ−２α遺伝子、およびＮｅｃｔｉｎ−２δ遺伝子のｍＲＮＡ発現量低下
実施例１で用いたヒト大腸がん細胞株ＨＴ−２９をＭ５培地に懸濁し、１ウェル当たり６万個の細胞密度で２４穴平底組織培養プレート（ＢＤファルコン社）に播種した。５％炭酸ガス気流中、３７℃で一晩培養した後、実施例１の方法に準じてオリゴヌクレオチドをトランスフェクションした。但し、全ての添加物の重量あるいは液量を６倍にスケールアップした。トランスフェクションの後、２４時間培養を継続した後にＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてトータルＲＮＡを抽出した。約４００ｎｇのトータルＲＮＡを鋳型として、ＴａｑＭａｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて添付プロトコールに従い逆転写反応した。Ｎｅｃｔｉｎ−２α遺伝子の発現量の測定はトータルＲＮＡにして５ｎｇに相当するｃＤＮＡを鋳型とし、ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）７．５μＬ、プライマー１（配列番号：７）およびプライマー２（配列番号：８）を各５００ｎＭ、ＦＡＭ標識したＴａｑＭａｎプローブ１（配列番号：９）を１００ｎＭとなるように加え反応液量１５μＬとし、定量的ＰＣＲ法を用いて測定した。Ｎｅｃｔｉｎ−２δ遺伝子の発現量の測定はトータルＲＮＡにして５ｎｇに相当するｃＤＮＡを鋳型とし、ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）７．５μＬ、プライマー３（配列番号：１０）およびプライマー４（配列番号：１１）を各５００ｎＭ、ＦＡＭ標識したＴａｑＭａｎプローブ２（配列番号：１２）を１００ｎＭとなるように加え反応液量１５μＬとし、定量的ＰＣＲ法を用いて測定した。ＰＣＲ反応は、５０℃・２分、９５℃・１０分の後、９５℃・１５秒、６０℃・１分のサイクルを４０回繰り返した。一方、同量の鋳型ｃＤＮＡ中に含まれるβ−アクチン遺伝子発現量をＴａｑＭａｎ β−ａｃｔｉｎ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて測定し内部標準とした。
オリゴヌクレオチドをトランスフェクションしない場合には、Ｎｅｃｔｉｎ−２α遺伝子、およびＮｅｃｔｉｎ−２δ遺伝子の発現量はそれぞれβ−アクチン遺伝子発現量の０．１５％、０．７６％であった。アンチセンスオリゴヌクレオチド１（配列番号：５）投与群ではＮｅｃｔｉｎ−２α遺伝子、およびＮｅｃｔｉｎ−２δ遺伝子の発現量はそれぞれβ−アクチン遺伝子発現量の０．０９５％、０．４５％であり、オリゴヌクレオチドをトランスフェクションしない場合と比べて統計学的に有意（Ｐ＜０．０１）な発現量低下が認められた。一方、陰性対照として用いたコントロールオリゴヌクレオチド１（配列番号：６）投与群ではＮｅｃｔｉｎ−２α遺伝子、およびＮｅｃｔｉｎ−２δ遺伝子の発現量はそれぞれβ−アクチン遺伝子発現量の０．１８％、０．７６％であり、オリゴヌクレオチドをトランスフェクションしない場合と比べて統計学的に有意な発現量低下は認められなかった。
これらの結果より、Ｎｅｃｔｉｎ−２α遺伝子、およびＮｅｃｔｉｎ−２δ遺伝子の発現量の低下によりヒト大腸がん細胞株ＨＴ−２９のアポトーシスが誘発されたことが示された。
参考例１
ヒト肺がん細胞株由来タンパク質Ｎｅｃｔｉｎ−２αをコードするｃＤＮＡのクローニングと塩基配列の決定
ヒト肺がん細胞株Ａ５４９のＭａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を鋳型とし、制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列を付加したプライマー５（配列番号：１３）、および制限酵素ＥｃｏＲＶの認識配列を付加したプライマー６（配列番号：１４）を用いてＰＣＲ反応を行った。該反応における反応液の組成は上記ｃＤＮＡ １μＬを鋳型として使用し、ＰｆｕＴｕｒｂｏ Ｈｏｔｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）１Ｕ、プライマー５（配列番号：１３）、およびプライマー６（配列番号：１４）を各１μＭ、ｄＮＴＰｓを２００μＭ、および２ｘＧＣ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ社）を１０μＬ加え、２０μＬの液量とした。ＰＣＲ反応は、９４℃・１分の後、９４℃・５秒、７２℃・４分のサイクルを５回、９４℃・５秒、７０℃・４分のサイクルを５回、９４℃・５秒、６８℃・４分のサイクルを３５回繰り返した。次にＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）にて該ＰＣＲ反応産物を精製した後、制限酵素ＥｃｏＲＩ、およびＥｃｏＲＶにて処理した。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）も制限酵素ＥｃｏＲＩ、およびＥｃｏＲＶにて処理した。これらをＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）にて精製した。それぞれのＤＮＡ断片をＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ社）を用いてライゲーション反応を行った後、大腸菌ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に導入し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地中で選択した。個々のクローンの配列を解析した結果、Ｎｅｃｔｉｎ−２αタンパク質（配列番号：１）をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：２）を有する動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２αを得た。
参考例２
ヒト肺がん細胞株由来タンパク質Ｎｅｃｔｉｎ−２δをコードするｃＤＮＡのクローニングと塩基配列の決定
ヒト肺がん細胞株Ａ５４９のＭａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を鋳型とし、制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列を付加したプライマー５（配列番号：１３）、および制限酵素ＥｃｏＲＶの認識配列を付加したプライマー７（配列番号：１５）を用いてＰＣＲ反応を行った。該反応における反応液の組成は上記ｃＤＮＡ １μＬを鋳型として使用し、ＰｆｕＴｕｒｂｏ Ｈｏｔｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）１Ｕ、プライマー５（配列番号：１３）およびプライマー７（配列番号：１５）を各１μＭ、ｄＮＴＰｓを２００μＭ、および２ｘＧＣ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ社）を１０μＬ加え、２０μＬの液量とした。ＰＣＲ反応は、９４℃・１分の後、９４℃・５秒、７２℃・４分のサイクルを５回、９４℃・５秒、７０℃・４分のサイクルを５回、９４℃・５秒、６８℃・４分のサイクルを３５回繰り返した。次にＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）にて該ＰＣＲ反応産物を５０μＬの水にて溶出し、これを鋳型としてＰＣＲ反応を行った。該反応における反応液の組成は上記ＰＣＲ反応産物１μＬを鋳型として使用し、ＰｆｕＴｕｒｂｏ Ｈｏｔｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）１Ｕ、プライマー５（配列番号：１３）、および制限酵素ＥｃｏＲＶの認識配列を付加したプライマー８（配列番号：１６）を各１μＭ、ｄＮＴＰｓを２００μＭ、および２ｘＧＣ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ社）を１０μＬ加え、２０μＬの液量とした。ＰＣＲ反応は、９４℃・１分の後、９４℃・２０秒、６０℃・１５秒、７２℃・２分のサイクルを２５回繰り返した。次にＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）にて該ＰＣＲ反応産物を精製し、制限酵素ＥｃｏＲＩ、およびＥｃｏＲＶにて処理した。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）も制限酵素ＥｃｏＲＩ、およびＥｃｏＲＶにて処理した。これらをＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）にて精製し、それぞれのＤＮＡ断片をＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ社）を用いてライゲーション反応を行った後、大腸菌ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に導入し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地中で選択した。個々のクローンの配列を解析した結果、Ｎｅｃｔｉｎ−２δタンパク質（配列番号：３）をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：４）を有する動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２δを得た。
ＰＳＥＣ０１１０ ｆｉｓ遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチド投与によるヒト大腸がん細胞株のアポトーシス誘発
実施例１で用いたヒト大腸がん細胞株ＨＴ−２９をＭ５培地で懸濁し、１ウェル当たり１万個の細胞密度で９６穴平底組織培養プレート（ＢＤファルコン社）に播種した。５％炭酸ガス気流中、３７℃で一晩培養した後、オリゴヌクレオチドをトランスフェクションした。
具体的には、ＰＳＥＣ０１１０ ｆｉｓの３’−非翻訳領域配列にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチド配列（配列番号：１９）を設計後、ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ化オリゴヌクレオチドを合成し、ＨＰＬＣ精製して用いた（以下、アンチセンスオリゴヌクレオチド２と略する）。コントロールとしては、配列番号：１９で示される塩基配列のリバース配列を有するオリゴヌクレオチド（配列番号：２０）を同様にｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ化し、ＨＰＬＣ精製して用いた（以下、コントロールオリゴヌクレオチド２と略する）。２００ｎｇのアンチセンスオリゴヌクレオチド２、あるいは２００ｎｇのコントロールオリゴヌクレオチド２をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）０．５μＬと共にＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）５０μＬと混合し、室温で２０分間放置した。予めＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ ５０μＬに培地交換しておいたＨＴ−２９細胞培養液に上記混合液を全量添加し、更に３時間培養を継続した後、Ｍ５培地に培地交換した。更に２日間培養を継続した後、Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ ３／７アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて添付プロトコールに従い、上記オリゴヌクレオチドのアポトーシス誘導活性を測定した。その結果、ＰＳＥＣ０１１０ ｆｉｓ遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチド２（配列番号：１９）はコントロールオリゴヌクレオチド２（配列番号：２０）に比べて約２．９倍のアポトーシス誘導活性を示し、統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を示した。
ＰＳＥＣ０１１０ ｆｉｓ遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチド投与によるＰＳＥＣ０１１０ ｆｉｓ遺伝子のｍＲＮＡ発現量低下
実施例１で用いたヒト大腸がん細胞株ＨＴ−２９をＭ５培地に懸濁し、１ウェル当たり６万個の細胞密度で２４穴平底組織培養プレート（ＢＤファルコン社）に播種した。５％炭酸ガス気流中、３７℃で一晩培養した後、実施例３の方法に準じてオリゴヌクレオチドをトランスフェクションした。但し、全ての添加物の重量あるいは液量を６倍にスケールアップした。トランスフェクション後、２４時間培養を継続した後にＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてトータルＲＮＡを抽出した。約４００ｎｇのトータルＲＮＡを鋳型として、ＴａｑＭａｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて添付プロトコールに従い逆転写反応した。ＰＳＥＣ０１１０ ｆｉｓ遺伝子の発現量の測定はトータルＲＮＡにして５ｎｇに相当するｃＤＮＡを鋳型とし、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）７．５μＬ、プライマー９（配列番号：２１）およびプライマー１０（配列番号：２２）を各５００ｎＭとなるように加え反応液量１５μＬとし、定量的ＰＣＲ法を用いて測定した。ＰＣＲ反応は、５０℃・２分、９５℃・１０分の後、９５℃・１５秒、６０℃・１分のサイクルを４０回繰り返した。一方、同量の鋳型ｃＤＮＡ中に含まれるβ−アクチン遺伝子発現量をＴａｑＭａｎ β−ａｃｔｉｎ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて測定し内部標準とした。
オリゴヌクレオチドをトランスフェクションしない場合には、ＰＳＥＣ０１１０ ｆｉｓ遺伝子の発現量はβ−アクチン遺伝子発現量の０．２６％であったのに対し、アンチセンスオリゴヌクレオチド２（配列番号：１９）投与群では０．１７％であり統計学的に有意（Ｐ＜０．０１）な発現量低下が認められた。一方、陰性対照として用いたコントロールオリゴヌクレオチド２（配列番号：２０）投与群では０．２３％であり非トランスフェクション群と比べて統計学的に有意な発現量低下は認められなかった。
これらの結果より、ＰＳＥＣ０１１０ ｆｉｓ遺伝子の発現量の低下によりヒト大腸がん細胞株ＨＴ−２９のアポトーシスが誘発されたことが示された。
参考例３
ヒト肺がん細胞株由来タンパク質ＰＳＥＣ０１１０ ｆｉｓをコードするｃＤＮＡのクローニングと塩基配列の決定
ヒト肺がん細胞株Ａ５４９のＭａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を鋳型とし、制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列を付加したプライマー１１（配列番号：２３）および制限酵素ＸｈｏＩの認識配列を付加したプライマー１２（配列番号：２４）を用いてＰＣＲ反応を行った。該反応における反応液の組成は上記ｃＤＮＡ １μＬを鋳型として使用し、ＰｆｕＴｕｒｂｏ Ｈｏｔｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）１Ｕ、プライマー１１（配列番号：２３）およびプライマー１２（配列番号：２４）を各１μＭ、ｄＮＴＰｓを２００μＭ、および２ｘＧＣ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ社）を１０μＬ加え、２０μＬの液量とした。ＰＣＲ反応は、９５℃・１分の後、９５℃・２０秒、６０℃・１５秒、７２℃・３分のサイクルを３５回繰り返し、続いて７２℃・１０分の反応を行った。アガロースゲル電気泳動で分離後、約１ｋｂに相当するＤＮＡ断片を回収し、Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。これをＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ ＰＣＲクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の処方に従いプラスミドベクターｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）へサブクローニングした。これを大腸菌ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に導入し、カナマイシンを含むＬＢ寒天培地中で選択した。個々のクローンの配列を解析した結果、ＰＳＥＣ０１１０ ｆｉｓタンパク質（配列番号：１７）をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：１８）を有するプラスミド、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ−ＰＳＥＣ０１１０ ｆｉｓを得た。
次にｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ−ＰＳＥＣ０１１０ ｆｉｓを制限酵素ＥｃｏＲＩ、およびＸｈｏＩにて処理した。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）も制限酵素ＥｃｏＲＩ、およびＸｈｏＩにて処理した。これらをＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｅａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）にて精製した。それぞれのＤＮＡ断片をＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ社）を用いてライゲーション反応を行った後、大腸菌ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に導入し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地中で選択した。個々のクローンの配列を解析した結果、ＰＳＥＣ０１１０ ｆｉｓタンパク質（配列番号：１７）をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：１８）を有する動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＰＳＥＣ０１１０ ｆｉｓを得た。
ＫＩＡＡ０１５２遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチド投与による肺がん細胞株のアポトーシス誘発
ＡＴＣＣより購入したヒト非小細胞肺がん細胞株Ａ５４９を、１０％牛胎仔血清（ＪＲＨ社）を含むＦ１２ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｋａｉｇｈｎ’ｓ改変培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）〔以下、Ｆ−１２Ｋ培地と略することもある〕で懸濁し、１ウェル当たり１万個の細胞密度で９６穴平底組織培養プレート（ＢＤファルコン社）に播種した。５％炭酸ガス気流中、３７℃で一晩培養した後、オリゴヌクレオチドをトランスフェクションした。
具体的には、ＫＩＡＡ０１５２遺伝子の３’非翻訳領域にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチド配列（配列番号：２７）を設計後、ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ化オリゴヌクレオチドを合成し、ＨＰＬＣ精製して用いた（以下、アンチセンスオリゴヌクレオチド３と略する）。コントロールとしては、配列番号：２７で示される塩基配列のリバース配列を有するオリゴヌクレオチド（配列番号：２８）を同様にｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ化し、ＨＰＬＣ精製して用いた（以下、コントロールオリゴヌクレオチド３と略する）。５０ｎｇのアンチセンスオリゴヌクレオチド３、または５０ｎｇのコントロールオリゴヌクレオチド３をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）０．８μｌと共に、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）５０μｌと混合し、室温で２０分間放置した。予めＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）５０μｌに培地交換しておいたＡ５４９細胞培養液に上記混合液を全量添加し、更に３時間培養を継続した後、Ｆ−１２Ｋ培地１００μｌに培地交換した。３日間培養を継続した後、Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＥＬＩＳＡＰｌｕｓキット（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を用いて、添付プロトコールに従い上記オリゴヌクレオチドのアポトーシス誘導活性を測定した。その結果、ＫＩＡＡ０１５２遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチド３（配列番号：２７）は陰性対照として用いたコントロールオリゴヌクレオチド３（配列番号：２８）に比べ、約１．５倍のアポトーシス誘導活性を示し、統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０５）を示した。
ＫＩＡＡ０１５２遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチド投与によるＫＩＡＡ０１５２遺伝子のｍＲＮＡ発現量低下
実施例５で用いたヒト肺がん細胞株Ａ５４９を、Ｆ−１２Ｋ培地に懸濁し、１ウェル当たり６万個の細胞密度で２４穴平底組織培養プレート（ＢＤファルコン社）に播種した。５％炭酸ガス気流中、３７℃で一晩培養した後、実施例５の方法に準じてオリゴヌクレオチドをトランスフェクションした。但し、全ての添加物の重量あるいは液量を６倍にスケールアップした。トランスフェクションの後、２４時間培養を継続した後にＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてトータルＲＮＡを抽出した。約４００ｎｇのトータルＲＮＡを鋳型として、ＴａｑＭａｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて添付プロトコールに従い逆転写反応した。ＫＩＡＡ０１５２遺伝子の発現量の測定はトータルＲＮＡにして５ｎｇに相当するｃＤＮＡを鋳型とし、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）７．５μＬ、プライマー１３（配列番号：２９）およびプライマー１４（配列番号：３０）を各５００ｎＭとなるように加え反応液量１５μＬとし、定量的ＰＣＲ法を用いて測定した。ＰＣＲ反応は、５０℃・２分、９５℃・１０分の後、９５℃・１５秒、６０℃・１分のサイクルを４０回繰り返した。一方、同量の鋳型ｃＤＮＡ中に含まれるβ−アクチン遺伝子発現量を測定し内部標準とした。
オリゴヌクレオチドをトランスフェクションしない場合には、ＫＩＡＡ０１５２遺伝子の発現量はβ−アクチン遺伝子発現量の１．７％であったのに対し、アンチセンスオリゴヌクレオチド３（配列番号：２７）投与群では１．１％であり統計学的に有意（Ｐ＜０．０１）な発現量低下が認められた。一方、陰性対照として用いたコントロールオリゴヌクレオチド３（配列番号：２８）投与群では１．８％であり非トランスフェクション群と比べて統計学的に有意な発現量低下は認められなかった。
この結果より、ＫＩＡＡ０１５２遺伝子の発現量の低下によりヒト肺がん細胞株Ａ５４９のアポトーシスが誘発されたことが示された。
参考例４
ヒト肺がん細胞株由来タンパク質ＫＩＡＡ０１５２をコードするｃＤＮＡのクローニングと塩基配列の決定
ヒト肺がん細胞株Ａ５４９のＭａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を鋳型とし、制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列を付加したプライマー１７（配列番号：３４）および制限酵素ＸｂａＩの認識配列を付加したプライマー１８（配列番号：３５）を用いてＰＣＲ反応を行った。該反応における反応液の組成は上記ｃＤＮＡ １μＬを鋳型として使用し、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｐｆｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）１．２５Ｕ、プライマー１７（配列番号：３４）およびプライマー１８（配列番号：３５）を各５００ｎＭ、ｄＮＴＰｓを３００μＭ、ＭｇＳＯ４を１ｍＭ、１０Ｘ ＰＣＲｘ Ｅｎｈａｎｃｅｒ Ｓｙｓｔｅｍを４μＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、および１０Ｘ Ｐｆｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を４μＬ加え、２０μＬの液量とした。ＰＣＲ反応は、９４℃・５分の後、９４℃・１５秒、５８℃・３０秒、６８℃・３分のサイクルを３５回繰り返した。続いて該ＰＣＲ反応産物にＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ社）を０．５Ｕ添加し、７２℃・１０分の反応を行った。該反応液をＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）にて精製し、これをＴＯＰＯ ＴＡ ＰＣＲクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の処方に従いプラスミドベクターｐＣＲ４−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）へサブクローニングした。これを大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に導入し、カナマイシンを含むＬＢ寒天培地中で選択した。個々のクローンの配列を解析した結果、ＫＩＡＡ０１５２タンパク質（配列番号：２５）をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：２６）を有するプラスミド、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯ−ＫＩＡＡ０１５２を得た。
次にｐＣＲ４−ＴＯＰＯ−ＫＩＡＡ０１５２を鋳型とし、制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列を付加したプライマー１９（配列番号：３６）および制限酵素ＸｈｏＩの認識配列を付加したプライマー２０（配列番号：３７）を用いてＰＣＲ反応を行った。該反応における反応液の組成はｐＣＲ４−ＴＯＰＯ−ＫＩＡＡ０１５２ １０ｎｇを鋳型として使用し、ＰｆｕＴｕｒｂｏ Ｈｏｔｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）１Ｕ、プライマー１９（配列番号：３６）およびプライマー２０（配列番号：３７）を各１μＭ、ｄＮＴＰｓを２００μＭ、および２ｘＧＣ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ社）を１０μＬ加え、２０μＬの液量とした。ＰＣＲ反応は、９５℃・１分の後、９５℃・２０秒、６０℃・１５秒、７２℃・２分のサイクルを３０回繰り返した。次にＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）にて該ＰＣＲ反応産物を精製した後、制限酵素ＥｃｏＲＩ、およびＸｈｏＩにて処理した。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）も制限酵素ＥｃｏＲＩ、およびＸｈｏＩにて処理した。これらをＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）にて精製し、それぞれのＤＮＡ断片をＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ社）を用いてライゲーション反応を行った後、大腸菌ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に導入し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地中で選択した。個々のクローンの配列を解析した結果、ＫＩＡＡ０１５２タンパク質（配列番号：２５）をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：２６）を有する動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＫＩＡＡ０１５２を得た。
ＤＫＦＺＰ５８６Ｌ０７２４遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチド投与による肺がん細胞株のアポトーシス誘発
実施例５で用いた肺がん細胞株Ａ５４９をＦ−１２Ｋ培地で懸濁し、１ウェル当たり１万個の細胞密度で９６穴平底組織培養プレート（ＢＤファルコン社）に播種した。５％炭酸ガス気流中、３７℃で一晩培養した後、オリゴヌクレオチドをトランスフェクションした。
具体的には、ＤＫＦＺＰ５８６Ｌ０７２４遺伝子の翻訳領域にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチド配列（配列番号：４０）を設計後、ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ化オリゴヌクレオチドを合成し、ＨＰＬＣ精製して導入実験に用いた（以下、アンチセンスオリゴヌクレオチド４と略する）。コントロールとしては、配列番号：４０で示される塩基配列のリバース配列を有するオリゴヌクレオチド（配列番号：４１）を同様にｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ化し、ＨＰＬＣ精製して用いた（以下、コントロールオリゴヌクレオチド４と略する）。５０ｎｇのアンチセンスオリゴヌクレオチド４、あるいは５０ｎｇのコントロールオリゴヌクレオチド４をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）０．８μｌと共に、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）５０μｌと混合し、室温で２０分間放置した。予めＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）５０μｌに培地交換しておいたＡ５４９細胞培養液に上記混合液を全量添加し、更に３時間培養を継続した後、Ｆ−１２Ｋ培地１００μｌに培地交換した。３日間培養を継続した後、Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ ３／７アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて、添付プロトコールに従い上記オリゴヌクレオチドのアポトーシス誘導活性を測定した。その結果、ＤＫＦＺＰ５８６Ｌ０７２４遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチド４（配列番号：４０）は陰性対照として用いたコントロールオリゴヌクレオチド４（配列番号：４１）に比べ、約１．５倍のアポトーシス誘導活性を示し、統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０１）を示した。
ＤＫＦＺＰ５８６Ｌ０７２４遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチド投与によるＤＫＦＺＰ５８６Ｌ０７２４遺伝子のｍＲＮＡ発現量低下
実施例５で用いたヒト肺がん細胞株Ａ５４９をＦ−１２Ｋ培地に懸濁し、１ウェル当たり６万個の細胞密度で２４穴平底組織培養プレート（ＢＤファルコン社）に播種した。５％炭酸ガス気流中、３７℃で一晩培養した後、実施例７記載の方法に準じてアンチセンスオリゴヌクレオチド４（配列番号：４０）あるいはコントロールオリゴヌクレオチド４（配列番号：４１）をトランスフェクションした。但し、全ての添加物の重量あるいは液量を６倍にスケールアップした。トランスフェクションの後、２０時間培養を継続した後にＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてトータルＲＮＡを抽出した。次にトータルＲＮＡ溶液５μＬを鋳型として、ＴａｑＭａｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて添付プロトコールに従い逆転写反応を行った。このようにして得られたｃＤＮＡ溶液２μＬを鋳型とし、プライマー２１（配列番号：４２）、プライマー２２（配列番号：４３）各４００ｎＭおよびＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）１０μＬを加えて反応液量２０μＬとし、定量的ＰＣＲ法を用いてＤＫＦＺＰ５８６Ｌ０７２４遺伝子の発現コピー数を測定した。ＰＣＲ反応は、５０℃・２分、９５℃・１０分の後、９５℃・１５秒、６０℃・１分のサイクルを４０回繰り返した。一方、同量の鋳型ｃＤＮＡ中に含まれるβ−アクチン遺伝子発現量をＴａｑＭａｎ β−ａｃｔｉｎ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて測定し内部標準とした。
オリゴヌクレオチドをトランスフェクションしない場合には、ＤＫＦＺＰ５８６Ｌ０７２４遺伝子の発現量はβ−アクチン遺伝子の発現量の３．２％であったのに対し、アンチセンスオリゴヌクレオチド４（配列番号：４０）投与群では０．６％、一方、コントロールオリゴヌクレオチド４（配列番号：４１）投与群では１．４％であった。また、コントロールオリゴヌクレオチド４投与群と比べた場合に、アンチセンスオリゴ４投与群で統計学的に有意（Ｐ＜０．０５）な発現量低下が認められた。この結果より、ヒト肺がん細胞株Ａ５４９のアポトーシスがＤＫＦＺＰ５８６Ｌ０７２４遺伝子の発現量低下により誘発されたことが示された。
参考例５
ヒト肺がん細胞株由来タンパク質ＤＫＦＺＰ５８６Ｌ０７２４をコードするｃＤＮＡのクローニングと塩基配列の決定
ヒト肺がん細胞株Ａ５４９のＭａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を鋳型とし、プライマー２３（配列番号：４４）およびプライマー２４（配列番号：４５）を用いてＰＣＲ反応を行った。該反応における反応液の組成は上記ｃＤＮＡ １μＬを鋳型として使用し、ＰｆｕＴｕｒｂｏ Ｈｏｔｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）１Ｕ、プライマー２３（配列番号：４４）およびプライマー２４（配列番号：４５）を各１μＭ、ｄＮＴＰｓを２００μＭ、および２ｘＧＣ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ社）を１０μＬ加え、２０μＬの液量とした。ＰＣＲ反応は、９４℃・１分の後、９４℃・５秒、７２℃・４分のサイクルを５回、９４℃・５秒、７０℃・４分のサイクルを５回、９４℃・５秒、６８℃・４分のサイクルを３５回繰り返した。次に該ＰＣＲ反応産物を鋳型とし、制限酵素ＢａｍＨＩの認識配列を付加したプライマー２５（配列番号：４６）および制限酵素ＸｈｏＩの認識配列を付加したプライマー２６（配列番号：４７）を用いてＰＣＲ反応を行った。該反応における反応液の組成は、上記該ＰＣＲ反応産物を水で５０倍に希釈した溶液１μＬを鋳型として使用し、ＰｆｕＴｕｒｂｏ Ｈｏｔｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）１Ｕ、プライマー２５（配列番号：４６）およびプライマー２６（配列番号：４７）を各１μＭ、ｄＮＴＰｓを２００μＭ、および２ｘＧＣ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ社）を１０μＬ加え、２０μＬの液量とした。ＰＣＲ反応は、９４℃・１分の後、９４℃・５秒、７２℃・４分のサイクルを５回、９４℃・５秒、７０℃・４分のサイクルを５回、９４℃・５秒、６８℃・４分のサイクルを３５回繰り返した。アガロースゲル電気泳動で分離後、約２．２ｋｂに相当するＤＮＡ断片を回収し、Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。これをＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ ＰＣＲクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の処方に従いプラスミドベクターｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）へサブクローニングした。これを大腸菌ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に導入し、カナマイシンを含むＬＢ寒天培地中で選択した。個々のクローンの配列を解析した結果、ＤＫＦＺＰ５８６Ｌ０７２４タンパク質（配列番号：３８）をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：３９）を有するプラスミドｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ−ＤＫＦＺＰ５８６Ｌ０７２４を得た。
次にｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ−ＤＫＦＺＰ５８６Ｌ０７２４を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩにて処理した。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）も制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩにて処理した。これらをＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）にて精製した。それぞれのＤＮＡ断片をＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ社）を用いてライゲーション反応を行った後、大腸菌ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に導入し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地中で選択した。個々のクローンの配列を解析した結果、ＤＫＦＺＰ５８６Ｌ０７２４タンパク質（配列番号：３８）をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：３９）を有する動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＤＫＦＺＰ５８６Ｌ０７２４を得た。
ＤＣＢＬＤ１Ｌ遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチド投与による肺がん細胞株のアポトーシス誘発
実施例５で用いた肺がん細胞株Ａ５４９をＦ−１２Ｋ培地で懸濁し、１ウェル当たり１万個の細胞密度で９６穴平底組織培養プレート（ＢＤファルコン社）に播種した。５％炭酸ガス気流中、３７℃で一晩培養した後、オリゴヌクレオチドをトランスフェクションした。
具体的には、ＤＣＢＬＤ１Ｌ遺伝子の３’非翻訳領域にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチド配列（配列番号：５０）を設計後、ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ化オリゴヌクレオチドを合成し、ＨＰＬＣ精製して導入実験に用いた（以下、アンチセンスオリゴヌクレオチド５と略する）。コントロールとしては、配列番号：５０で示される塩基配列のリバース配列を有するオリゴヌクレオチド（配列番号：５１）を同様にｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ化し、ＨＰＬＣ精製して用いた（以下、コントロールオリゴヌクレオチド５と略する）。５０ｎｇのアンチセンスオリゴヌクレオチド５、あるいは５０ｎｇのコントロールオリゴヌクレオチド５をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）０．８μｌと共に、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）５０μｌと混合し、室温で２０分間放置した。予めＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）５０μｌに培地交換しておいたＡ５４９細胞培養液に上記混合液を全量添加し、更に３時間培養を継続した後、Ｆ−１２Ｋ培地１００μｌに培地交換した。３日間培養を継続した後、Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ ３／７アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて、添付プロトコールに従い上記オリゴヌクレオチドのアポトーシス誘導活性を測定した。その結果、ＤＣＢＬＤ１Ｌ遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチド５（配列番号：５０）は陰性対照として用いたコントロールオリゴヌクレオチド５（配列番号：５１）に比べ、約１．３倍のアポトーシス誘導活性を示し、統計学的に有意な差（Ｐ＜０．０１）を示した。
ＤＣＢＬＤ１Ｌ遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチド投与によるＤＣＢＬＤ１Ｌ遺伝子のｍＲＮＡ発現量低下
実施例５で用いたヒト肺がん細胞株Ａ５４９をＦ−１２Ｋ培地に懸濁し、１ウェル当たり６万個の細胞密度で２４穴平底組織培養プレート（ＢＤファルコン社）に播種した。５％炭酸ガス気流中、３７℃で一晩培養した後、実施例９記載の方法に準じてアンチセンスオリゴヌクレオチド５（配列番号：５０）またはコントロールオリゴヌクレオチド５（配列番号：５１）をトランスフェクションした。但し、全ての添加物の重量あるいは液量を６倍にスケールアップした。トランスフェクションの後、２０時間培養を継続した後にＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてトータルＲＮＡを抽出した。次にトータルＲＮＡ溶液５μＬを鋳型として、ＴａｑＭａｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて添付プロトコールに従い逆転写反応を行った。このようにして得られたｃＤＮＡ溶液２μＬを鋳型とし、プライマー２７（配列番号：５２）、プライマー２８（配列番号：５３）各４００ｎＭおよびＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）１０μＬを加えて反応液量２０μＬとし、定量的ＰＣＲ法を用いてＤＣＢＬＤ１Ｌ遺伝子の発現コピー数を測定した。ＰＣＲ反応は、５０℃・２分、９５℃・１０分の後、９５℃・１５秒、６０℃・１分のサイクルを４０回繰り返した。一方、同量の鋳型ｃＤＮＡ中に含まれるβ−アクチン遺伝子発現量をＴａｑＭａｎ β−ａｃｔｉｎ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて測定し内部標準とした。
オリゴヌクレオチドをトランスフェクションしない場合には、ＤＣＢＬＤ１Ｌ遺伝子の発現量はβ−アクチン遺伝子の発現量の２．２％であったのに対し、アンチセンスオリゴヌクレオチド５（配列番号：５０）投与群では０．３％、一方、コントロールオリゴヌクレオチド５（配列番号：５１）投与群では１．５％であった。また、コントロールオリゴヌクレオチド５投与群と比べた場合に、アンチセンスオリゴヌクレオチド５投与群で統計学的に有意（Ｐ＜０．０１）な発現量低下が認められた。この結果より、ヒト肺がん細胞株Ａ５４９のアポトーシスがＤＣＢＬＤ１Ｌ遺伝子の発現量低下により誘発されたことが示された。
参考例６
ヒト肺がん細胞株由来タンパク質ＤＣＢＬＤ１ＬをコードするｃＤＮＡのクローニングと塩基配列の決定
ヒト肺がん細胞株Ａ５４９のＭａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を鋳型とし、プライマー２９（配列番号：５４）およびプライマー３０（配列番号：３１）を用いてＰＣＲ反応を行った。該反応における反応液の組成は上記ｃＤＮＡ １μＬを鋳型として使用し、ＰｆｕＴｕｒｂｏ Ｈｏｔｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）１Ｕ、プライマー２９（配列番号：５４）およびプライマー３０（配列番号：３１）を各１μＭ、ｄＮＴＰｓを２００μＭ、および２ｘＧＣ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ社）を１０μＬ加え、２０μＬの液量とした。ＰＣＲ反応は、９５℃・１分の後、９６℃・２０秒、６３℃・１５秒、７２℃・３分のサイクルを４０回繰り返した。アガロースゲル電気泳動で分離後、約２．３ｋｂに相当するＤＮＡ断片を回収し、Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。これをＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ ＰＣＲクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の処方に従いプラスミドベクターｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）へサブクローニングした。これを大腸菌ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に導入し、カナマイシンを含むＬＢ寒天培地中で選択した。個々のクローンの配列を解析した結果、ＤＣＢＬＤ１Ｌタンパク質（配列番号：４８）をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：４９）を有するプラスミド、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ−ＤＣＢＬＤ１Ｌを得た。
次にｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ−ＤＣＢＬＤ１Ｌを鋳型とし、プライマー３１（配列番号：３２）およびプライマー３２（配列番号：３３）を用いてＰＣＲ反応を行った。該反応における反応液の組成は上記ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ−ＤＣＢＬＤ１Ｌ １０ｎｇを鋳型として使用し、ＰｆｕＴｕｒｂｏ Ｈｏｔｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）１Ｕ、制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列を付加したプライマー３１（配列番号：３２）および制限酵素ＸｈｏＩの認識配列を付加したプライマー３２（配列番号：３３）を各１μＭ、ｄＮＴＰｓを２００μＭ、および２ｘＧＣ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉ（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ社）を１０μＬ加え、２０μＬの液量とした。ＰＣＲ反応は、９４℃・１分の後、９４℃・２０秒、６０℃・１５秒、７２℃・２分のサイクルを２５回繰り返した。ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、該ＰＣＲ反応産物を精製し、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩにて処理した。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）も制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩにて処理した。それぞれのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で分離後、Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。それぞれのＤＮＡ断片をＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ社）を用いてライゲーション反応を行った後、大腸菌ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に導入し、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地中で選択した。個々のクローンの配列を解析した結果、ＤＣＢＬＤ１Ｌタンパク質（配列番号：４８）をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：４９）を有する動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＤＣＢＬＤ１Ｌを得た。
Ｎｅｃｔｉｎ−２遺伝子のｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ投与によるヒト大腸癌細胞株の細胞増殖抑制
Ｎｅｃｔｉｎ−２α遺伝子、もしくはＮｅｃｔｉｎ−２δ遺伝子（以下、これらを総称してＮｅｃｔｉｎ−２遺伝子と称する）のｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡは５種のｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ−１、ｓｉＲＮＡ−２、ｓｉＲＮＡ−３、ｓｉＲＮＡ−４、およびｓｉＲＮＡ−５）を等量ずつ混合することにより作製した（以下、ｓｉＲＮＡ−１、ｓｉＲＮＡ−２、ｓｉＲＮＡ−３、ｓｉＲＮＡ−４、およびｓｉＲＮＡ−５を混合したｓｉＲＮＡをＮｅｃｔｉｎ−２−ｓｉＲＮＡと称する）。Ｎｅｃｔｉｎ−２α遺伝子、もしくはＮｅｃｔｉｎ−２δ遺伝子のｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡであるｓｉＲＮＡ−１、ｓｉＲＮＡ２、ｓｉＲＮＡ−３、ｓｉＲＮＡ−４、およびｓｉＲＮＡ−５は、それぞれ２種のＲＮＡ断片（ｓｉＲＮＡ−１は配列番号：５５で表される塩基配列を有するＲＮＡと配列番号：５６で表される塩基配列を有するＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ−２は配列番号：５７で表される塩基配列を有するＲＮＡと配列番号：５８で表される塩基配列を有するＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ−３は配列番号：５９で表される塩基配列を有するＲＮＡと配列番号：６０で表される塩基配列を有するＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ−４は配列番号：６１で表される塩基配列を有するＲＮＡと配列番号：６２で表される塩基配列を有するＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ−５は配列番号：６３で表される塩基配列を有するＲＮＡと配列番号：６４で表される塩基配列を有するＲＮＡ）をハイブリダイズさせることにより作製した。陰性コントロールとしては、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社より購入したＮｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃｏｎｔｒｏｌ ＩＸ（以下、ｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｄｓＲＮＡと略する）を用いた。
具体的には、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）より購入したヒト大腸癌細胞株ＨＴ−２９を、１０％牛胎仔血清（ＪＲＨ社）を含むＭ５Ａ培地で懸濁し、１枚あたり５０万個の細胞密度で１０ｃｍ組織培養シャーレ（ＢＤファルコン社）に播種した。５％炭酸ガス気流中、３７℃で一晩培養した後、トリプシン・ＥＤＴＡを用いてＨＴ−２９細胞を回収した。回収したＨＴ−２９細胞１００万個をＮｅｃｔｉｎ−２−ｓｉＲＮＡ １５０ｐｍｏｌ、もしくはｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｄｓＲＮＡ １５０ｐｍｏｌを含むＣｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ Ｖ（Ａｍａｘａ社）に付属のｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｖ １００μｌに懸濁し、ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒのプログラムＴ−２０にてトランスフェクションした。５％炭酸ガス気流中、３７℃で２４時間培養を行い、１ウェル当たり３千個の細胞密度で９６穴平底組織培養プレートに播種し、５日間培養を継続した。続いて培地を除去後、プレートを−８０℃で５分間静置し室温で５分間放した。次に各ウェルに１％ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）、および１％ＩＧＥＰＡＬ−ＣＡ６３０（ＩＣＮ社）を含む水溶液１００μＬを添加し、２０分間放置した後、励起波長４８５ｎｍ、発光波長５３５ｎｍにて蛍光強度を計測することにより、細胞内ＤＮＡ含量を測定した。その結果、Ｎｅｃｔｉｎ−２−ｓｉＲＮＡ投与群はｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｄｓＲＮＡ投与群に比べて約３８％蛍光強度が低下し、統計学的に有意な差（Ｐ＜０．００１）を示した。このことから、Ｎｅｃｔｉｎ−２−ｓｉＲＮＡによるＨＴ−２９細胞に対する増殖抑制が明らかとなった。
Ｎｅｃｔｉｎ−２−ｓｉＲＮＡ投与によるＨＴ−２９細胞の細胞周期の変化
実施例１１で用いたヒト大腸癌細胞株ＨＴ−２９をＭ５Ａ培地に懸濁し、１枚あたり５０万個の細胞密度で１０ｃｍ組織培養シャーレに播種した。５％炭酸ガス気流中、３７℃で一晩培養した後、実施例１１の方法に準じてＮｅｃｔｉｎ−２−ｓｉＲＮＡ、もしくは陰性コントロールとしてｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｄｓＲＮＡをトランスフェクションし、２４時間培養を継続した。その後、ＨＴ−２９細胞を回収し１ウェルあたり２０万個の細胞密度で６穴平底組織培養プレート（ＢＤファルコン社）に播種し、５％炭酸ガス気流中、３７℃で培養した。５日間培養した後、細胞をＣｙｃｌｅＴＥＳＴ Ｐｌｕｓ ＤＮＡ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（ベクトン・ディッキンソン社）を用いて、ＦＡＣＳｃａｎ（ベクトン・ディッキンソン社）により細胞周期を解析した。その結果、Ｎｅｃｔｉｎ−２−ｓｉＲＮＡ投与群では、Ｇ０／Ｇ１期にある細胞の比率が、陰性コントロールとして用いたｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｄｓＲＮＡ投与群に比して、約１３％上昇していた。さらにＮｅｃｔｉｎ−２−ｓｉＲＮＡ投与群では、Ｓ期にある細胞の比率が、陰性コントロールとして用いたｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｄｓＲＮＡ投与群に比して、約１１％低下していた。このことから、Ｎｅｃｔｉｎ−２−ｓｉＲＮＡにより、ヒト大腸癌細胞株ＨＴ−２９の細胞周期の変化が誘発されたことが示された。
Ｎｅｃｔｉｎ−２−ｓｉＲＮＡ投与によるＮｅｃｔｉｎ−２遺伝子のｍＲＮＡ発現量低下
実施例１１で用いたヒト大腸癌細胞株ＨＴ−２９をＭ５Ａ培地に懸濁し、１枚あたり５０万個の細胞密度で１０ｃｍ組織培養シャーレに播種した。５％炭酸ガス気流中、３７℃で一晩培養した後、実施例１１の方法に準じてＮｅｃｔｉｎ−２−ｓｉＲＮＡ、もしくは陰性コントロールとしてｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｄｓＲＮＡをトランスフェクションした。トランスフェクション後、２４時間培養を継続した後にＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてトータルＲＮＡを抽出した。約１００ｎｇのトータルＲＮＡを鋳型として、ＴａｑＭａｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて逆転写反応を行った。Ｎｅｃｔｉｎ−２α遺伝子のｍＲＮＡの発現量はトータルＲＮＡにして１０ｎｇに相当するｃＤＮＡを鋳型とし、ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）５μＬ、プライマー１（配列番号：７）およびプライマー２（配列番号：８）を各５００ｎＭ、ＦＡＭ標識したＴａｑＭａｎプローブ１（配列番号：９）を１００ｎＭとなるように加え、反応液量１０μＬとし定量的ＰＣＲ法を用いて測定した。一方、Ｎｅｃｔｉｎ−２δ遺伝子のｍＲＮＡの発現量はトータルＲＮＡにして１０ｎｇに相当するｃＤＮＡを鋳型とし、ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）５μＬ、プライマー３（配列番号：１０）およびプライマー４（配列番号：１１）を各５００ｎＭ、ＦＡＭ標識したＴａｑＭａｎプローブ２（配列番号：１２）を１００ｎＭとなるように加え、反応液量１０μＬとし定量的ＰＣＲ法を用いて測定した。ＰＣＲ反応は、５０℃・２分、９５℃・１０分の後、９５℃・１５秒、６０℃・１分のサイクルを４０回繰り返した。同量の鋳型ｃＤＮＡ中に含まれるβ−アクチン遺伝子のｍＲＮＡ発現量をＴａｑＭａｎ β−ａｃｔｉｎ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて測定し内部標準とした。
Ｎｅｃｔｉｎ−２−ｓｉＲＮＡ投与群では、陰性コントロールとして用いたｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｄｓＲＮＡ投与群に比してＮｅｃｔｉｎ−２αのｍＲＮＡ発現量は６９％、Ｎｅｃｔｉｎ−２δのｍＲＮＡ発現量は７３％低下しており、統計学的に有意な差（Ｐ＜０．００１）を示した。これらの結果より、Ｎｅｃｔｉｎ−２−ｓｉＲＮＡ投与によりＮｅｃｔｉｎ−２α遺伝子、およびＮｅｃｔｉｎ−２δ遺伝子のｍＲＮＡの発現量低下が誘発されたことが示された。
ヒト癌組織におけるＮｅｃｔｉｎ−２遺伝子のｍＲＮＡ発現亢進の検討
Ｎｅｃｔｉｎ−２遺伝子のｍＲＮＡ発現が癌組織において亢進しているか否かを定量的ＰＣＲ法により検討した。発現量測定にはｃＤＮＡ ＣｅＨＡＴ−ＳＤ Ｂｒｅａｓｔ Ｔｕｍｏｒ １（コスモバイオ社）、ｃＤＮＡ ＣｅＨＡＴ−ＳＤ Ｂｒｅａｓｔ Ｔｕｍｏｒ ２（コスモバイオ社）、Ｈｕｍａｎ Ｃｏｌｏｎ Ｍａｔｃｈｅｄ ｃＤＮＡ Ｐａｉｒ Ｐａｎｅｌ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）、Ｈｕｍａｎ Ｌｕｎｇ Ｍａｔｃｈｅｄ ｃＤＮＡ Ｐａｉｒ Ｐａｎｅｌ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）、およびＨｕｍａｎ Ｏｖａｒｙ Ｍａｔｃｈｅｄ ｃＤＮＡ Ｐａｉｒ Ｐａｎｅｌ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用いた。Ｎｅｃｔｉｎ−２α遺伝子のｍＲＮＡ発現量の測定は１μＬのｃＤＮＡを鋳型とし、ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）７．５μＬ、プライマー１（配列番号：７）およびプライマー２（配列番号：８）を各５００ｎＭ、ＦＡＭ標識したＴａｑＭａｎプローブ１（配列番号：９）を１００ｎＭとなるように加え反応液量を１５μＬとした。Ｎｅｃｔｉｎ−２δ遺伝子のｍＲＮＡ発現量の測定は１μＬのｃＤＮＡを鋳型とし、ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）７．５μＬ、プライマー３（配列番号：１０）およびプライマー４（配列番号：１１）を各５００ｎＭ、ＦＡＭ標識したＴａｑＭａｎプローブ２（配列番号：１２）を１００ｎＭとなるように加え反応液量を１５μＬとした。但し、ｃＤＮＡ ＣｅＨＡＴ−ＳＤ Ｂｒｅａｓｔ Ｔｕｍｏｒ １（コスモバイオ社）、およびｃＤＮＡ ＣｅＨＡＴ−ＳＤ Ｂｒｅａｓｔ Ｔｕｍｏｒ ２（コスモバイオ社）については鋳型量を０．２μＬとした。ＰＣＲ反応は、５０℃・２分、９５℃・１０分の後、９５℃・１５秒、６０℃・１分のサイクルを４０回繰り返した。一方、同量の鋳型ｃＤＮＡ中に含まれるβ−アクチン遺伝子のｍＲＮＡ発現量を測定し内部標準とした。その結果、正常組織に対する癌組織でのＮｅｃｔｉｎ−２α遺伝子のｍＲＮＡ発現量に関して、ｃＤＮＡ ＣｅＨＡＴ−ＳＤ Ｂｒｅａｓｔ Ｔｕｍｏｒ １（コスモバイオ社）に含まれる３人のドナーで、各々１．１倍、１０倍、４．３倍の増加が、ｃＤＮＡ ＣｅＨＡＴ−ＳＤ Ｂｒｅａｓｔ Ｔｕｍｏｒ ２（コスモバイオ社）に含まれる３人のドナーで、各々１２倍、３．５倍、２１倍の増加が認められた。同様にして、Ｈｕｍａｎ Ｃｏｌｏｎ Ｍａｔｃｈｅｄ ｃＤＮＡ Ｐａｉｒ Ｐａｎｅｌ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）に含まれる５人のドナーで各々４．８倍、３．２倍、２．６倍、１．９倍、１．８倍の増加が、Ｈｕｍａｎ Ｌｕｎｇ Ｍａｔｃｈｅｄ ｃＤＮＡ Ｐａｉｒ Ｐａｎｅｌ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）に含まれる５人のドナーで各々１１倍、３．７倍、４．１倍、３．２倍、１．３倍の増加が、Ｈｕｍａｎ Ｏｖａｒｙ Ｍａｔｃｈｅｄ ｃＤＮＡ Ｐａｉｒ Ｐａｎｅｌ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）に含まれる５人のドナーのうち４人で各々１．３倍、１．８倍、２．６倍、２．４倍の増加が確認された。Ｎｅｃｔｉｎ−２δ遺伝子のｍＲＮＡ発現量は、ｃＤＮＡ ＣｅＨＡＴ−ＳＤ Ｂｒｅａｓｔ Ｔｕｍｏｒ １（コスモバイオ社）に含まれる３人のドナーのうち２人で、各々１．１倍、５．３倍の増加が、ｃＤＮＡ ＣｅＨＡＴ−ＳＤ Ｂｒｅａｓｔ Ｔｕｍｏｒ ２（コスモバイオ社）に含まれる３人のドナーのうち２人で、各々２．０倍、２．５倍の増加が認められた。同様にして、Ｈｕｍａｎ Ｃｏｌｏｎ Ｍａｔｃｈｅｄ ｃＤＮＡ Ｐａｉｒ Ｐａｎｅｌ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）に含まれる５人のドナーのうち３人で各々１．３倍、１．８倍、１．５倍の増加が、Ｈｕｍａｎ Ｌｕｎｇ Ｍａｔｃｈｅｄ ｃＤＮＡ Ｐａｉｒ Ｐａｎｅｌ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）に含まれる５人のドナーのうち４人で各々４．８倍、３．７倍、１．１倍、１．３倍の増加が、Ｈｕｍａｎ Ｏｖａｒｙ Ｍａｔｃｈｅｄ ｃＤＮＡ Ｐａｉｒ Ｐａｎｅｌ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）に含まれる５人のドナーのうち４人で各々４．２倍、２．１倍、２．４倍、４．２倍の増加が確認された。これらの結果より、癌組織におけるＮｅｃｔｉｎ−２α遺伝子、およびＮｅｃｔｉｎ−２δ遺伝子のｍＲＮＡの発現亢進が確認された。
ヒト癌細胞株におけるＮｅｃｔｉｎ−２遺伝子のｍＲＮＡの定量
骨肉種細胞株Ｓａｏｓ−２、脳腫瘍細胞株ＳＫ−Ｎ−ＭＣ、ＳＫ−Ｎ−ＡＳ、ＳＫ−Ｎ−ＢＥ、ＳＫ−Ｎ−ＤＺ、ＳＫ−Ｎ−ＦＩ、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、Ｄ３４１ Ｍｅｄ、Ｄａｏｙ、ＤＢＴＲＧ−０５ＭＧ、Ｕ−１１８ＭＧ、Ｕ−８７ＭＧ、ＣＣＦ−ＳＴＴＧ１、ＳＷ １０８８、乳癌細胞株ＨＣＣ１９３７、ＺＲ−７５−１、ＡＵ５６５、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＳＫＢＲ−３、ＢＴ４７４、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ、ＭＤＡ−ＭＢ−４３６、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５ＶＩＩ、Ｔ−４７Ｄ大腸癌細胞株Ｃａｃｏ−２、ＣＯＬＯ ２０１、ＣＯＬＯ ２０５、ＣＯＬＯ ３２０ＤＭ、ＤＬＤ−１、ＨＣＴ−１５、ＨＣＴ−８、ＨＴ−２９、ＬｏＶｏ、ＬＳ１８０、ＬＳ１２３、ＬＳ１７４Ｔ、ＮＣＩ−Ｈ５４８、ＮＣＩ−ＳＮＵ−Ｃ１、ＳＫ−ＣＯ−１、ＳＷ ４０３、ＳＷ ４８、ＳＷ ４８０、ＳＷ ６２０、ＳＷ ８３７、ＳＷ ９４８、ＨＣＴ １１６、ＷｉＤｒ、非小細胞肺癌細胞株Ａ５４９、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ３５８、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＮＣＩ−Ｈ５２２、ＮＣＩ−Ｈ６６１、ＮＣＩ−Ｈ８１０、ＮＣＩ−Ｈ１１５５、ＮＣＩ−Ｈ１２９９、ＮＣＩ−Ｈ１３９５、ＮＣＩ−Ｈ１４３５、ＮＣＩ−Ｈ１５８１、ＮＣＩ−Ｈ１６５１、ＮＣＩ−Ｈ１７０３、ＮＣＩ−Ｈ１７９３、ＮＣＩ−Ｈ２０７３、ＮＣＩ−Ｈ２０８５、ＮＣＩ−Ｈ２１０６、ＮＣＩ−Ｈ２２２８、ＮＣＩ−Ｈ２３４２、ＮＣＩ−Ｈ２３４７、ＳＫ−ＬＵ−１、ＮＣＩ−Ｈ２１２２、ＳＫ−ＭＥＳ−１、ＮＣＩ−Ｈ２９２、小細胞肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ１８７、ＮＣＩ−Ｈ３７８、ＮＣＩ−Ｈ５２６、ＮＣＩ−Ｈ８８９、ＮＣＩ−Ｈ１４１７、ＮＣＩ−Ｈ１６７２、ＮＣＩ−Ｈ１８３６、ＮＣＩ−Ｈ１９６３、ＮＣＩ−Ｈ２２２７、ＮＣＩ−Ｎ４１７、ＳＨＰ−７７、卵巣癌細胞株ＥＳ−２、Ｃａｏｖ−３、ＭＤＡＨ２７７４、ＮＩＨ：ＯＶＣＡＲ３、ＯＶ−９０、ＳＫ−ＯＶ−３、ＴＯＶ−１１２Ｄ、ＴＯＶ−２１Ｇ、前立腺癌細胞株ＤＵ １４５、ＬＮＣａＰ、網膜芽腫細胞株ＷＥＲＩ−Ｒｂ−１、Ｙ７９、精巣癌細胞株Ｃａｔｅｓ−１Ｂ（以上ＡＴＣＣより購入）、大腸癌細胞株ＣＯＣＭ１、非小細胞肺癌細胞株ＶＭＲＣ−ＬＣＤおよび前立腺癌細胞株ＰＣ３（以上Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（ＪＣＲＢ）より購入）、それぞれＡＴＣＣあるいはＪＣＲＢが推奨している培養方法に従って培養し、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてトータルＲＮＡを調製した。このトータルＲＮＡを鋳型として逆転写反応を行いｃＤＮＡを調製し、定量的ＰＣＲ反応を行うことにより、Ｎｅｃｔｉｎ−２遺伝子のｍＲＮＡ発現量の定量を行った。Ｎｅｃｔｉｎ−２遺伝子のｍＲＮＡ発現量の定量は上記トータルＲＮＡ ５ｎｇより得られたｃＤＮＡを鋳型とし、実施例２に記載の方法に従って行った。一方、同量の鋳型ｃＤＮＡ中に含まれるβ−アクチン遺伝子のｍＲＮＡ発現量を測定し内部標準とした。
Ｎｅｃｔｉｎ−２α遺伝子、もしくはＮｅｃｔｉｎ−２δ遺伝子のｍＲＮＡ発現量をβ−アクチン遺伝子のｍＲＮＡ発現量で標準化した相対的発現量を〔表１〕に示す。Ｎｅｃｔｉｎ−２α遺伝子のｍＲＮＡは２株の癌細胞株で、Ｎｅｃｔｉｎ−２δ遺伝子のｍＲＮＡは１２株の癌細胞株でβ−アクチンの１％以上の発現を示すことが明らかとなった。
Figure 2005097204
ペプチド抗原を用いたウサギ抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ポリクローナル抗体の作製
Ｎｅｃｔｉｎ−２αタンパク質（配列番号：１）、Ｎｅｃｔｉｎ−２δタンパク質（配列番号：３）のアミノ酸配列に基づき、１５アミノ酸からなる以下の３種のペプチド（ペプチド１〜３）を合成した。
ペプチド１のアミノ酸配列
〔Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ（配列番号：６５）〕は、Ｎｅｃｔｉｎ−２αタンパク質（配列番号：１）、およびＮｅｃｔｉｎ−２δタンパク質（配列番号：３）の８８番目から１０１番目までのアミノ酸配列のＮ末端に、Ｃｙｓを付加した配列である。
ペプチド２のアミノ酸配列
〔Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ（配列番号：６６）〕は、Ｎｅｃｔｉｎ−２αタンパク質（配列番号：１）の３４７番目から３６０番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、Ｃｙｓを付加した配列である。
ペプチド３のアミノ酸配列
〔Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ（配列番号：６７）〕は、Ｎｅｃｔｉｎ−２δタンパク質（配列番号：３）の４２６番目から４３９番目までのアミノ酸配列のＮ末端に、Ｃｙｓを付加した配列である。
上記ペプチド１、ペプチド２およびペプチド３のそれぞれのペプチドに、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）をキャリアータンパク質として結合させ抗原とした。免疫動物は雄性ウサギＫＢＬ：ＪＷ（１１週齢、オリエンタル酵母）を用い、初回免疫はフロインド完全アジュバンド（Ｄｉｆｃｏ社）懸濁液、２回目以降はフロインド不完全アジュバンド（Ｄｉｆｃｏ社）懸濁液を用いた。免疫は背部皮下注射により行い、１回の免疫には各抗原０．５ｍｇを用い、初回免疫後１４日毎に３回繰り返した。初回免疫後５２日目に麻酔下頚動脈採血を行い、ペプチド１、ペプチド２またはペプチド３を免疫したウサギから各々７０ｍｌ、６６ｍｌ、７２ｍｌの血清を得た。このようにして得られた血清を硫酸アンモニウム塩析法により濃縮し、プロテインＡアフィニティーカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）により精製し、ペプチド１、ペプチド２、およびペプチド３を免疫したウサギから精製ＩｇＧを得た。ここで得られた精製ＩｇＧをペプチドの固定化カラムでの精製に用いた。固定化には各ペプチドのＣｙｓを利用し、ホウ酸緩衝液を用いてセファロースカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）にカップリングした。カラムからの溶出には８Ｍ尿素を含むＰＢＳを用いた。溶出液をＰＢＳに対して透析して尿素を除いた後、限外濃縮、フィルターろ過滅菌することにより、ペプチド１、ペプチド２、およびペプチド３に対する抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ポリクローナル抗体精製標品ＡＳ−２７０４、ＡＳ−２７０５、およびＡＳ−２７０６を取得した。
参考例７ 組換え型Ｎｅｃｔｉｎ−２細胞外領域タンパク質の動物細胞用発現ベクターの構築
参考例２で作製したｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２δを鋳型とし、制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列を付加したプライマー３３（配列番号：６８）、および制限酵素ＸｈｏＩの認識配列を付加したプライマー３４（配列番号：６９）を用いてＰＣＲ反応を行った。該反応における反応液の組成はｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２δ １０ｎｇを鋳型として使用し、ＰｆｕＵｌｔｒａ Ｈｏｔｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）２．５Ｕ、プライマー３３（配列番号：６８）、およびプライマー３４（配列番号：６９）を各０．２μＭ、ｄＮＴＰｓを２００μＭ、および１０ｘ Ｐｆｕ Ｕｌｔｒａ Ｂｕｆｆｅｒ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を５μＬ加え、５０μＬの液量とした。ＰＣＲ反応は、９５℃・２分の後、９５℃・３０秒、６０℃・３０秒、７２℃・１分１５秒のサイクルを３０回繰り返した後に、７２℃・１０分の反応を行った。次にＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）にて該ＰＣＲ反応産物を精製した後、制限酵素ＥｃｏＲＩ、およびＸｈｏＩにて処理した。同様にｐＣＭＶ−Ｔａｇ４（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）も制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩにて処理した。Ｗｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてそれぞれのＤＮＡ断片を精製した後、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いてライゲーション反応を行った。得られたプラスミドを大腸菌ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に導入し、カナマイシンを含むＬＢ寒天培地中で選択した。個々のクローンの配列を解析した結果、Ｎｅｃｔｉｎ−２δタンパク質の細胞外領域（配列番号：３で表されるＮｅｃｔｉｎ−２δのアミノ酸配列の１番目から３６１番目）のＣ末端にＦＬＡＧタグが融合したＮｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−ＦＬＡＧタンパク質（配列番号：７０）をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号：７１）を有する動物細胞用発現ベクターｐＣＭＶ−Ｔａｇ４−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−ＦＬＡＧを得た。
組換え型Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−ＦＬＡＧタンパク質の調製
ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３発現システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い、参考例７にて作製したｐＣＭＶ−Ｔａｇ４−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−ＦＬＡＧによりコードされるＮｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−ＦＬＡＧタンパク質を取得した。具体的には、２９３Ｆ細胞株にｐＣＭＶ−Ｔａｇ４−Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−ＦＬＡＧを２９３フェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてトランスフェクションし、５％炭酸ガス気流下、３７℃で３日間旋回培養した。細胞懸濁液を遠心分離して得た培養上清を０．４５μｍのフィルターを用いろ過した後、ＰＢＳで平衡化した抗ＦＬＡＧ抗体カラム（Ｓｉｇｍａ社）に供した。ＰＢＳでカラムを洗浄した後、ＦＬＡＧペプチドを０．１ｍｇ／ｍＬの濃度で含有するＰＢＳにて溶出した。Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−ＦＬＡＧタンパク質の溶出画分をＶｉｖａ ｓｐｉｎを用いた限外ろ過にて濃縮後、ＰＢＳで平衡化した脱塩ゲルろ過カラムＰＤ−１０（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｅｅｓ社）を用いてＦＬＡＧペプチドを除き、再度濃縮して組換え型Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−ＦＬＡＧタンパク質を取得した。
Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−ＦＬＡＧタンパク質を用いたウサギ抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ポリクローナル抗体の作製
実施例１７で調製した組換え型Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−ＦＬＡＧタンパク質を免疫原としてウサギ抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ポリクローナル抗体を作製した。Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−ＦＬＡＧタンパク質のＰＢＳ溶液とフロインド完全アジュバントとを等量混合して作製したエマルションを用い、家兎（日本白色種、雌、３ｋｇ）３羽の背部皮下、および皮内に１羽あたり０．１ｍｇのＮｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−ＦＬＡＧタンパク質を免疫した。２回目以降の免疫にはフロインド不完全アジュバントを用いたタンパク質エマルションを同様に調製し、２週間毎に７回追加免疫を行った。
免疫前および４回目と６回目の免疫１週間後に耳静脈より採血し、Ｎｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−ＦＬＡＧタンパク質をコートしたイムノプレートを用いたＥＬＩＳＡにより血清抗体価の上昇を確認した。最終免疫の１週間後に３羽のウサギより麻酔下頚動脈採血を行い、それぞれ７８．９ｍｌ、７８．２ｍｌ、７８．８ｍｌの抗血清を取得した。
これらの抗血清をＰＢＳで２倍希釈し、遠心分離した上澄液をＮｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−ＦＬＡＧタンパク質をＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＨＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に固定化し作製した抗原カラムに供した。カラムをＰＢＳで洗浄後、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む０．１Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ３）で溶出し、溶出液を１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）で中和した後、ＰＢＳに対して４℃で終夜透析し、ウサギ抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ポリクローナル抗体を取得した。ここで得られたウサギ抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ポリクローナル抗体精製標品をそれぞれＮ２−Ｎｏ．１、Ｎ２−Ｎｏ．２、およびＮ２−Ｎｏ．３と命名した。
ＤＮＡ免疫法を用いたウサギ抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ポリクローナル抗体の作製
Ｎｅｃｔｉｎ−２タンパク質に対するポリクローナル抗体の作製を、ＤＮＡ免疫法による抗体作製技術を有するＧｅｎｏｖａｃ社に委託して行った。免疫にはＮｅｃｔｉｎ−２δ（配列番号：３）のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを使用し、Ｇｅｎｏｖａｃ社出願の特許文献（ＷＯ００／２９４４２）に記載されている方法に従い、ウサギ２羽に対してＤＮＡ免疫を行い、それぞれ１２７ｍＬ、および１１５ｍＬの抗血清を得た。
これらの抗血清をＰＢＳで２倍希釈し、遠心分離した上澄液をＮｅｃｔｉｎ−２ＥＤ−ＦＬＡＧタンパク質をＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＨＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に固定化し作製した抗原カラムに供した。カラムをＰＢＳで洗浄後、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む０．１Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ３）で溶出し、溶出液を１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）で中和した後、ＰＢＳに対して４℃で終夜透析し、ウサギ抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ポリクローナル抗体精製標品を取得した。ここで得られたウサギ抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ポリクローナル抗体をそれぞれＮ２−Ｒ１、およびＮ２−Ｒ２と命名した。
ヒト癌細胞株におけるＮｅｃｔｉｎ−２タンパク質の検出
癌細胞におけるＮｅｃｔｉｎ−２タンパク質の発現量を検討した。ＡＴＣＣより購入した癌細胞株、ＮＣＩ−Ｈ１７０３、ＨＴ−２９、ＯＶ−９０、ＳＫＢＲ−３、ＳＫ−ＯＶ−３、ＮＣＩ−Ｈ２３４２、ＴＯＶ−１１２Ｄ、ＮＣＩ−Ｈ２１２２、ＮＣＩ−Ｈ２９２、Ｃａｐａｎ−２、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＢｘＰＣ−３、ＨＣＴ−８、ＳＫ−Ｎ−ＤＺ、Ｃａｏｖ−３、ＤＵ １４５、Ａ５４９、Ｃａｃｏ−２、ＷｉＤｒ、ＺＲ−７５−１、ＨＣＴ−１５、ＮＣＩ−Ｈ１２９９、ＮＣＩ−Ｈ２２２８、ＢＴ４７４を培養し、Ｓｔａｉｎ ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）を用いてそれぞれ１００万個／ｍＬとなるように細胞の懸濁液を作製した。細胞懸濁液に最終濃度３μｇ／ｍＬとなるように実施例１９で作製したＮ２−Ｒ１を加え、４℃にて１時間放置した。また、最終濃度３μｇ／ｍＬとなるように非免疫ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ社）を加え、陰性コントロールとした。遠心後、Ｓｔａｉｎ ｂｕｆｆｅｒにて洗浄し、Ａｌｅｘａ４８８標識した抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）を最終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように加え、４℃にて１時間放置した。その後、ＦＡＣＳｃａｎ（ベクトン・ディッキンソン社）により、各細胞に発現しているＮｅｃｔｉｎ−２タンパク質の検出を行った。陰性コントロール群に対するＮ２−Ｒ１添加群の中央値の比を〔表２〕に示した。この結果から、用いた癌細胞株においてＮｅｃｔｉｎ−２タンパク質が検出されることが示された。
Figure 2005097204
組換え型完全長Ｎｅｃｔｉｎ−２δタンパク質の安定発現細胞株の樹立（その１）
Ｎｅｃｔｉｎ−２δタンパク質（配列番号：３）を構成的に発現する細胞株の樹立を行った。Ｎｅｃｔｉｎ−２δ全長遺伝子をグルタミン合成酵素（ＧＳ）発現ベクターｐＥＥ１２．４（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社）に組み込みＮｅｃｔｉｎ−２δ発現プラスミド（ｐＥＥ１２．４−Ｎｅｃｔｉｎ−２δ）を作製した。直線化したｐＥＥ１２．４−Ｎｅｃｔｉｎ−２δをＣＨＯ−Ｋ１細胞（１千万個）にジーンパルサー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いてトランスフェクションした。これを１０％透析血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、およびＧＳ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＪＲＨ社）を含有するＧＳ選択ＤＭＥＭ培地（ＪＲＨ社）に再懸濁させ、９６穴平底組織培養プレート４０枚に１ウェルあたり２５００個／５０μＬとなるよう播種した。５％炭酸ガス気流下、３７℃で２４時間培養した後、３３．３μＭまたは６６．６μＭ ＭＳＸ（ＩＣＮ社）を含む１５０μＬの上記の培地をそれぞれプレート２０枚ずつに加え、５％炭酸ガス気流下、３７℃で３〜４週間培養を継続し、増殖したコロニーを２４穴平底組織培養プレートへ播種した。培養を継続した後、２４穴平底組織培養プレートよりＲＮｅａｓｙ ９６ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてトータルＲＮＡを取得し逆転写反応を行い、該反応産物を鋳型として定量的ＰＣＲを行った。Ｎｅｃｔｉｎ−２δ遺伝子のｍＲＮＡ発現量は内在性のＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量で標準化することにより算出し、Ｎｅｃｔｉｎ−２δ遺伝子のｍＲＮＡ発現量の高い上位６０株を取得した。
これらの６０株のＮｅｃｔｉｎ−２δタンパク質発現量を実施例１６で作製したＡＳ−２７０４を用いたフローサイトメトリーにより測定し、Ｎｅｃｔｉｎ−２δタンパク質を高発現するＣＨＯ細胞株、４３−２を取得した。
組換え型完全長Ｎｅｃｔｉｎ−２δタンパク質の安定発現細胞株の樹立（その２）
Ｎｅｃｔｉｎ−２δタンパク質（配列番号：３）を構成的に発現する細胞株の樹立を行った。ＡＴＣＣより購入したＨＴ−２９細胞を１０％牛胎仔血清（ＪＲＨ社）を含むＭ５Ａ培地にて培養を行い、トリプシン・ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてＨＴ−２９細胞を回収した。回収したＨＴ−２９細胞１００万個を、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−Ｎｅｃｔｉｎ−２δ ２μｇを含むＣｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ Ｖ（Ａｍａｘａ社）に付属のｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｖ １００μｌに懸濁し、ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒのプログラムＴ−２０にてトランスフェクションを行った。２日間培養を継続した後に０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を含む上記培地（Ｇ４１８選択培地）に交換した。Ｇ４１８選択培地で培養を継続し、トリプシン・ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて２回継代培養した後、１ウェルあたり細胞１個となるように９６穴平底組織培養プレートに播種し、Ｇ４１８選択培地で培養を継続した。コロニーを形成したウェルから細胞を回収し、２４穴平底組織培養プレートに播種した。Ｇ４１８選択培地で培養を継続した後、１％の２−メルカプトエタノールを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）２００μＬに細胞を懸濁した。１００℃で３分間加熱処理した後、２０μｌを７．５％アクリルアミドゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。実施例１６で作製したＡＳ−２７０６を用いてウェスタンブロッティングを行い、Ｎｅｃｔｉｎ−２δタンパク質を高発現するＨＴ−２９細胞株２δ−２５を得た。
ウサギ抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ポリクローナル抗体を用いた細胞増殖抑制活性の検討（その１）
実施例２１にて作製したＮｅｃｔｉｎ−２δタンパク質を高発現するＣＨＯ細胞株４３−２を１０％透析血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＧＳ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＪＲＨ社）、および２５μＭ ＭＳＸ（ＩＣＮ社）を含むＧＳ選択ＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に懸濁させて、９６穴平底組織培養プレートに１ウェルあたり２５０個、もしくは５００個となるように播種した。５％炭酸ガス気流下、３７℃で２４時間培養した後、実施例１８、および実施例１９にて得られたウサギ抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ポリクローナル抗体Ｎ２−Ｎｏ．１、Ｎ２−Ｎｏ．２、Ｎ２−Ｎｏ．３、Ｎ２−Ｒ１、もしくはＮ２−Ｒ２を最終濃度３０μｇ／ｍＬとなるように添加した。陰性コントロールとして非免疫ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ社）を同濃度となるように添加し、５％炭酸ガス気流下、３７℃で３日間培養し、ＷＳＴ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ社）を用いて細胞増殖に対するウサギ抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ポリクローナル抗体の効果を観察した。細胞を１ウェルあたり２５０個播種した際には、Ｎ２−Ｎｏ．１、Ｎ２−Ｎｏ．２、Ｎ２−Ｎｏ．３、Ｎ２−Ｒ１、もしくはＮ２−Ｒ２添加群では、陰性コントロール群に比べ各々９０％、９１％、８５％、９０％、９２％の吸光度値の低下が検出された。細胞を１ウェルあたり５００個播種した際には、Ｎ２−Ｎｏ．１、Ｎ２−Ｎｏ．２、Ｎ２−Ｎｏ．３、Ｎ２−Ｒ１、もしくはＮ２−Ｒ２添加群では、陰性コントロール群に比べ各々８１％、７６％、７８％、８０％、８５％の吸光度値の低下が検出された。このことから、抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ポリクローナル抗体がＮｅｃｔｉｎ−２δタンパク質を高発現するＣＨＯ細胞株４３−２に対し細胞増殖抑制活性を有することが示された。
ウサギ抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ポリクローナル抗体を用いた細胞増殖抑制活性の検討（その２）
実施例２２にて作製したＮｅｃｔｉｎ−２δタンパク質を高発現するＨＴ−２９細胞株２δ−２５を１％牛胎仔血清（ＪＲＨ社）を含むＭ５Ａ培地にて懸濁し、９６穴平底組織培養プレートに１ウェルあたり１千個となるように播種した。細胞播種と同時に実施例１９で得られたウサギ抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ポリクローナル抗体Ｎ２−Ｎｏ．１を最終濃度３０μｇ／ｍＬとなるように添加した。陰性コントロールとして非免疫ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ社）を同濃度となるように添加し、５％炭酸ガス気流下、３７℃で６日間培養し、ＷＳＴ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ社）を用いて細胞増殖に対する抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ポリクローナル抗体の効果を観察した。ウサギ抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ポリクローナル抗体Ｎ２−Ｎｏ．１添加群では陰性コントロール群に比べ、３６％の吸光度値の低下が検出された。このことから、抗Ｎｅｃｔｉｎ−２ポリクローナル抗体がＮｅｃｔｉｎ−２δタンパク質を高発現するＨＴ−２９細胞株２δ−２５に対し細胞増殖抑制活性を有することが示された。
配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質（本発明で用いられるタンパク質）やこのタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、癌組織に特異的に発現し、癌の診断マーカーとなる。したがって、上記タンパク質に対する抗体、上記ポリヌクレオチドに対するアンチセンスポリヌクレオチド、上記タンパク質をコードするＲＮＡの一部を含有する二重鎖ＲＮＡ、上記タンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩、上記タンパク質遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩などは、例えば、癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防・治療剤（好ましくは、乳癌、肺癌、大腸癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌などの予防・治療剤）、癌細胞のアポトーシス促進剤、癌細胞の増殖阻害剤、癌細胞の細胞周期変化の誘発剤などとして安全に使用することができる。また、上記タンパク質、上記ポリヌクレオチド、上記抗体などは、癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防・治療剤（好ましくは、乳癌、肺癌、大腸癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌などの予防・治療剤）、癌細胞のアポトーシス促進剤、癌細胞の増殖阻害剤、癌細胞の細胞周期変化の誘発剤などのスクリーニングに有用である。

Claims (41)

  1. 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる癌の予防・治療剤。
  2. 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる癌細胞のアポトーシス促進剤。
  3. 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる癌細胞の増殖阻害剤。
  4. 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を含有してなる癌の診断薬。
  5. （ｉ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチドまたは（ｉｉ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするＲＮＡの一部を含有する二重鎖ＲＮＡを含有してなる癌の予防・治療剤。
  6. （ｉ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチドまたは（ｉｉ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするＲＮＡの一部を含有する二重鎖ＲＮＡを含有してなる癌細胞のアポトーシス促進剤。
  7. （ｉ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチドまたはまたは（ｉｉ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするＲＮＡの一部を含有する二重鎖ＲＮＡを含有してなる癌細胞の増殖阻害剤。
  8. 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなる癌の予防・治療剤。
  9. 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩を含有してなる癌の予防・治療剤。
  10. 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質の発現を阻害する化合物またはその塩を含有してなる癌の予防・治療剤。
  11. 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなる癌細胞のアポトーシス促進剤。
  12. 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩を含有してなる癌細胞のアポトーシス促進剤。
  13. 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質の発現を阻害する化合物またはその塩を含有してなる癌細胞のアポトーシス促進剤。
  14. 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなる癌細胞の増殖阻害剤。
  15. 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩を含有してなる癌細胞の増殖阻害剤。
  16. 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質の発現を阻害する化合物またはその塩を含有してなる癌細胞の増殖阻害剤。
  17. 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有してなる癌の診断薬。
  18. 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、癌の予防・治療剤のスクリーニング方法。
  19. 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、癌の予防・治療剤のスクリーニング方法。
  20. 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、癌細胞のアポトーシス促進剤のスクリーニング方法。
  21. 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、癌細胞のアポトーシス促進剤のスクリーニング方法。
  22. 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、癌細胞の増殖阻害剤のスクリーニング方法。
  23. 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、癌細胞の増殖阻害剤のスクリーニング方法。
  24. 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴とする、癌の予防・治療剤のスクリーニング用キット。
  25. 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有することを特徴とする、癌の予防・治療剤のスクリーニング用キット。
  26. 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴とする、癌細胞のアポトーシス促進剤のスクリーニング用キット。
  27. 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有することを特徴とする、癌細胞のアポトーシス促進剤のスクリーニング用キット。
  28. 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴とする、癌細胞の増殖阻害剤のスクリーニング用キット。
  29. 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有することを特徴とする、癌細胞の増殖阻害剤のスクリーニング用キット。
  30. 哺乳動物に対して、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体の有効量を投与することを特徴とする癌の予防・治療方法。
  31. 哺乳動物に対して、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体の有効量を投与することを特徴とする癌細胞のアポトーシス促進方法。
  32. 哺乳動物に対して、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体の有効量を投与することを特徴とする癌細胞の増殖阻害方法。
  33. 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害することを特徴とする癌の予防・治療方法。
  34. 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害することを特徴とする癌細胞のアポトーシス促進方法。
  35. 配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害することを特徴とする癌細胞の増殖阻害方法。
  36. 癌の予防・治療剤を製造するための配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体の使用。
  37. 癌細胞のアポトーシス促進剤を製造するための配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体の使用。
  38. 癌細胞の増殖阻害剤を製造するための配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体の使用。
  39. 癌の予防・治療剤を製造するための配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩の使用。
  40. 癌細胞のアポトーシス促進剤を製造するための配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩の使用。
  41. 癌細胞の増殖阻害剤を製造するための配列番号：１、配列番号：３、配列番号：１７、配列番号：２５、配列番号：３８または配列番号：４８で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩の使用。
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