JPWO2008153072A1 - 骨・関節疾患感受性遺伝子およびその用途 - Google Patents

骨・関節疾患感受性遺伝子およびその用途 Download PDF

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Abstract

本発明は、配列番号: 2で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質の発現もしくは活性を抑制する物質を含有してなる、関節における炎症性サイトカイン発現および／または関節破壊（例、関節軟骨破壊）および／または骨・関節疾患における疼痛の抑制剤、該蛋白質またはその部分ペプチドを用いることを特徴とする、関節における炎症性サイトカイン発現および／または関節破壊（例、関節軟骨破壊）および／または骨・関節疾患における疼痛を調節する物質のスクリーニング方法、ならびに配列番号: 3で表されるヒトEDG2遺伝子の部分塩基配列において、塩基番号24007で示される塩基における多型を検出することを含む、骨・関節疾患に対する遺伝的感受性の診断方法を提供する。

Description

本発明は、変形性関節症などの骨・関節疾患(bone and joint diseases) に関連する遺伝子および該疾患と相関する該遺伝子内の多型の同定、並びにそれらに基づく骨・関節疾患の予防・治療、該疾患に対する遺伝的感受性の診断などに関する。
（発明の背景）
骨・関節の生活習慣病は、直接命に影響を及ぼすことは少ないが、痛みや歩行障害などのために日常生活動作 (ADL) に支障をきたすことから、高齢者のQOLを損なう最大の原因となっている。また、これらの疾患は加齢とともに発症頻度が急増し且つ慢性に経過することから、国民医療経済にも重大な負担を課すこととなり、高齢化社会においては社会全体で克服すべき重要な課題である。世界保健機関 (WHO) も21世紀の最初の10年を “骨と関節の10年 (the Bone and Joint Decade; BJD)” と位置付けて骨・関節疾患の制圧に乗り出している。
変形性関節症 (osteoarthritis；以下、「OA」ともいう) は慢性の関節炎を伴う骨・関節疾患で、軟骨の退行変性により軟骨の破壊と骨や軟骨の増殖性変化をきたす病気である。その患者数は日本だけでも500万〜700万人にのぼり、60歳以上では、80%以上が膝・肘・股関節や脊椎に変形性関節症の症状を呈すると言われている、代表的なcommon diseaseである。現在のところ、OAの根本的な治療手段はなく、非ステロイド性消炎鎮痛剤やヒアルロン酸、ステロイド剤の投与など、痛みを抑制する対症療法が中心となっている。進行した場合、関節鏡視下手術・骨切り術・人工関節置換などの手術適応となるが、人工関節には寿命があるため55歳位まではこの手術を避けることが望ましいと考えられている。従って、関節の退行性変化を抑制する治療方法の開発が望まれている。
OAは環境要因と遺伝的要因が関与する多因子疾患である。遺伝的要因の解明は、創薬ターゲットの提示につながる。本発明者らは、これまでに、カルモジュリンをコードする遺伝子の１つであるCALM1遺伝子や、OA軟骨での高発現が報告されている細胞外基質蛋白質の１つであるアスポリンの遺伝子における多型がOAと相関することを見出し、これらの遺伝子における異常がOAの発症および／または進行に関連していることを報告している (特許文献１および非特許文献１、２)。
既存の医薬品の約半数は細胞膜上の受容体を介して作用を発現しており、中でもG蛋白質共役型受容体 (GPCR) は特に大きな割合を占めていることから、GPCRは最も有望な創薬ターゲットである。しかしながら、OAの発症や進行に関連するGPCRは未だ報告されていない。
リゾホスファチジン酸 (LPA) は多様な生物学的プロセスを制御する生理活性脂質であり、その受容体としてこれまでに5種のGPCR (LPA1-LPA5) が報告されている。このうちLPA1はEDG2やVZG-1とも呼ばれる (非特許文献３、４)(以下、本明細書では「EDG2」と表記する)。LPAに発痛作用があり (非特許文献５、６)、LPA受容体レベルでの早期介入が神経因性疼痛 (NP) の進展抑制・重症度の軽減に有効であることが示唆されることから (非特許文献７）、EDG2のアンタゴニストは神経因性疼痛 (NP) の治療薬候補として期待されている (非特許文献８)。しかしながら、EDG2とOAをはじめとする骨・関節疾患との関係についての報告は、これまでに皆無である。
国際公開第2006/014013号パンフレット 本谷 (Mototani) ら著, 「ヒューマン・モレキュラー・ジェネティクス (Hum. Mol. Genet.)」, (英国), 2005年, 第14巻, p. 1009-1017 木澤 (Kizawa) ら著, 「ネイチャー・ジェネティックス (Nat Genet.)」, (米国), 2005年, 第37巻 (第2号), p. 138-44 ヘヒト (Hecht, J.H.) ら著, 「ザ・ジャーナル・オヴ・セル・バイオロジー (J. Cell Biol.)」, (米国), 1996年, 第135巻 (第4号), p. 1071-1083 アン (An, S.) ら著, 「バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ (Biochem. Biophys. Res. Commun.)」, (米国), 1997年, 第231巻, p. 619-622 レンベック (Renback, K.)ら著, 「モレキュラー・ブレイン・リサーチ (Mol. Brain Res.)」, (蘭国), 2000年, 第75巻, p. 350-354 井上 (Inoue, M.) ら著, 「ネイチャー・メディシン (Nat. Med.)」, (米国), 2004年, 第10巻 (第7号), p. 712-718 レンベック (Renback, K.)ら著, 「ニューロサイエンス・レターズ (NeuroSci. Lett.)」, (アイルランド), 1999年, 第270巻, p. 59-61 ガーデル (Gardell, S.E.) ら著, 「トレンズ・イン・モレキュラー・メディシン (Trends Mol. Med.)」, (英国), 2006年, 第12巻 (第2号), p. 65-75
本発明の目的は、OAをはじめとする骨・関節疾患の発症および／または進行に関与する遺伝子、特にGPCR遺伝子を同定し、その機能を解明することにより、当該疾患の新規且つ根本的な予防・治療手段を提供することである。また、本発明の別の目的は、骨・関節疾患に対する遺伝的感受性の簡便且つ高確度な診断方法を提供することである。
本発明者らは、上記の目的を達成すべく、創薬ターゲットとして有望なGPCR遺伝子ファミリーに候補遺伝子を絞り込み、既に報告されている多型 (マーカーSNP) を用いて、変形性膝関節症 (Knee OA; KOA) 群と対照群間で相関解析を行った。その結果、EDG2遺伝子上の多型が、独立した2つの集団 (一般集団およびコホート集団) で高い相関を示すことを見出した。さらに、連鎖不平衡 (LD) マッピングにより、KOAと相関するSNPを複数同定した。そのうちの１つ (i-EDG2-09) はEDG2遺伝子のプロモータ領域に存在し、ゲルシフト解析の結果、疾患感受性アレルにより強固に結合する核内因子の存在が明らかになった。また、レポーターアッセイの結果、疾患感受性アレルではEDG2の転写活性が上昇していることが判明した。
主要臓器・組織での発現解析の結果、EDG2は滑膜および脊髄で高発現していることが明らかになった。そこで、滑膜細胞におけるEDG2の役割を解析するため、OA滑膜細胞をLPAで刺激すると、一過的に炎症性サイトカインの発現が上昇し、そのピークから1〜2時間後にMMP-1、3、13の発現が上昇していた。一方、EDG2は脊髄でも高発現し、また、LPAに発痛作用があるとされることから、コホート集団において、自覚症状として痛みを訴える集団について相関解析を行ったところ、i-EDG2-09に有意な相関が認められた。
これらの結果は、EDG2遺伝子のプロモータ領域の多型がEDG2発現量を変化させ、KOAの発症・進展に関与することを示すとともに、EDG2アンタゴニストが、炎症性サイトカインの誘導を抑制して軟骨破壊を抑制し、またKOAに伴う関節痛を抑えることを強く示唆する。
本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
［１］配列番号: 2で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質の発現もしくは活性を抑制する物質を含有してなる、関節における炎症性サイトカイン発現および／または関節破壊（例、関節軟骨破壊）および／または骨・関節疾患における疼痛の抑制剤；
［２］前記物質が、下記(a)〜(d)のいずれかである上記［１］記載の剤：
(a)配列番号: 2で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質をコードする塩基配列に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸；
(b)配列番号: 2で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質に対する中和抗体；
(c)配列番号: 2で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質に対するアンタゴニスト；または
(d)配列番号: 2で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質のドミナントネガティブ体；
［３］骨・関節疾患の予防・治療用である、上記［１］記載の剤；
［４］骨・関節疾患が、変形性関節症、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症、スポーツによる関節障害、先天性骨系統疾患、骨軟骨腫、骨腫瘍および軟骨腫瘍からなる群より選択される、上記［３］記載の剤；
［５］下記(a)または(b)のいずれかを含有してなる骨・関節疾患の診断剤：
(a)配列番号: 2で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質に対する抗体；または
(b)配列番号: 2で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質をコードする塩基配列またはその一部を含む核酸；
［６］骨・関節疾患が、変形性関節症、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症、スポーツによる関節障害、先天性骨系統疾患、骨軟骨腫、骨腫瘍および軟骨腫瘍からなる群より選択される、上記［５］記載の診断剤；
［７］配列番号: 2で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質またはその部分ペプチドを用いることを特徴とする、関節における炎症性サイトカイン発現および／または関節破壊（例、関節軟骨破壊）および／または骨・関節疾患における疼痛を調節する物質のスクリーニング方法；
［８］リゾホスファチジン酸をさらに用いることを特徴とする、上記［７］記載の方法；
［９］配列番号: 2で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質またはその部分ペプチドが、それを産生する細胞の形態で提供される、上記［７］記載の方法；
［１０］配列番号: 2で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質に対する抗体、または該蛋白質をコードする塩基配列もしくはその一部を含む核酸を、さらに用いることを特徴とする、上記［９］記載の方法；
［１１］骨・関節疾患の予防・治療物質のスクリーニング用である、上記［７］記載の方法；
［１２］骨・関節疾患が、変形性関節症、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症、スポーツによる関節障害、先天性骨系統疾患、骨軟骨腫、骨腫瘍および軟骨腫瘍からなる群より選択される、上記［１１］記載の方法；
［１３］配列番号: 3で表される塩基配列中塩基番号8463〜8464で示される塩基（但し、該２つの塩基の間にチミンが挿入されている）を含む該塩基配列の部分配列であって、約１５塩基以上の連続した塩基配列を含む核酸；
［１４］配列番号: 3で表されるヒトEDG2遺伝子の部分塩基配列において、塩基番号8463〜8464、24007、24999および34573で示される塩基もしくは塩基配列からなる群より選択される１以上の塩基もしくは塩基配列における多型を検出することを含む、骨・関節疾患に対する遺伝的感受性の診断方法；
［１５］骨・関節疾患が、変形性関節症、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症、スポーツによる関節障害、先天性骨系統疾患、骨軟骨腫、骨腫瘍および軟骨腫瘍からなる群より選択される上記［１４］記載の方法；
［１６］配列番号: 3で表される塩基配列中塩基番号24007で示される塩基（但し、該塩基はアデニンである）およびそれに隣接する塩基もしくは塩基配列からなる塩基配列を含む核酸を含有してなる、関節における炎症性サイトカイン発現および／または関節破壊（例、関節軟骨破壊）および／または骨・関節疾患における疼痛の抑制剤；
［１７］骨・関節疾患の予防・治療用である、上記［１６］記載の剤；
［１８］骨・関節疾患が、変形性関節症、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症、スポーツによる関節障害、先天性骨系統疾患、骨軟骨腫、骨腫瘍および軟骨腫瘍からなる群より選択される、上記［１７］記載の剤；
［１９］配列番号: 3で表されるヒトEDG2遺伝子の部分塩基配列において、塩基番号24007で示される塩基がチミンであるアレルを有するヒトに投与するための、関節における炎症性サイトカイン発現および／または関節破壊（例、関節軟骨破壊）および／または骨・関節疾患における疼痛を調節する物質のスクリーニング方法であって、配列番号: 3で表される塩基配列中塩基番号24007で示される塩基（但し、該塩基はアデニンである）およびそれに隣接する塩基もしくは塩基配列からなる塩基配列を含む核酸と、該塩基配列に選択的に結合する転写調節因子とを用いることを特徴とする方法；
［２０］骨・関節疾患の予防・治療物質のスクリーニング用である、上記［１９］記載の方法；
［２１］骨・関節疾患が、変形性関節症、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症、スポーツによる関節障害、先天性骨系統疾患、骨軟骨腫、骨腫瘍および軟骨腫瘍からなる群より選択される上記［２０］記載の方法；
［２２］配列番号: 3で表されるヒトEDG2遺伝子の部分塩基配列において、塩基番号8463と8464とで示される塩基間にチミンが挿入されたアレル、塩基番号24007で示される塩基がアデニンであるアレル、塩基番号24999で示される塩基がチミンであるアレルおよび塩基番号34573で示される塩基がチミンであるアレルからなる群より選択される１以上のアレルを有する（但し、２以上のアレルが同一ハプロタイプ上に存在してもよい）ヒトに投与することを特徴とする、配列番号: 2で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質の発現もしくは活性を抑制する物質を含有してなる、関節における炎症性サイトカイン発現および／または関節破壊（例、関節軟骨破壊）および／または骨・関節疾患における疼痛の抑制剤；
［２３］リゾホスファチジン酸の産生もしくは活性を抑制する物質を含有してなる、関節における炎症性サイトカイン発現および／または関節破壊（例、関節軟骨破壊）および／または骨・関節疾患における疼痛の抑制剤；
［２４］前記物質がリゾホスファチジン酸産生酵素阻害物質である、上記［２２］記載の剤；
［２５］骨・関節疾患の予防・治療用である、上記［２３］記載の剤；
［２６］骨・関節疾患が、変形性関節症、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症、スポーツによる関節障害、先天性骨系統疾患、骨軟骨腫、骨腫瘍および軟骨腫瘍からなる群より選択される、上記［２５］記載の剤；
［２７］関節における炎症性サイトカイン発現および／または関節破壊（例、関節軟骨破壊）および／または骨・関節疾患における疼痛の抑制剤を投与された被験体における、配列番号: 2で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質またはそれをコードする遺伝子の発現を調べることを特徴とする、該抑制剤の薬効評価方法；
などを提供する。
EDG2は滑膜細胞において炎症性サイトカインを誘導し、軟骨基質分解酵素の発現を上昇させるので、EDG2遺伝子の発現亢進は軟骨破壊につながる。したがって、EDG2もしくはそのリガンドであるLPAの発現および／または活性を阻害することにより、炎症性サイトカインの誘導および／または軟骨破壊を抑制することができる。また、LPA-EDG2シグナルは痛みにも関与するので、EDG2もしくはLPAの発現および／または活性を阻害することにより、骨・関節疾患における痛みを抑制することができる。さらに、EDG2遺伝子における多型が骨・関節疾患と相関することから、該多型は骨・関節疾患に対する遺伝的感受性の簡便な判定に利用することができる。
rs3739708 LD領域とその周辺のゲノム構造を示す図である。a) rs3739708 LD領域を網掛けで示す。b) rs3739708 LD領域の多型について示す。c) rs3739708 LD領域の多型を含めたペアワイズのD’およびΔについて示す。 LPA受容体遺伝子のヒト主要臓器における発現量を示す図である。 LPA受容体遺伝子のヒトOA膝関節軟骨およびOA滑膜組織における発現量を示す図である。 E11細胞のPMAに対する反応性を示す図である。a) PMA刺激時のAP-1の活性化をルシフェラーゼアッセイで評価した結果を示す。b) PMA刺激によってEDG2遺伝子が経時的に発現上昇することを示す。 ルシフェラーゼアッセイによるi-EDG2-09各アレル転写活性比較を示す図である。 ゲルシフトアッセイの結果を示す図である。a) E11細胞をPMAで刺激すると、i-EDG2-09周辺領域に結合性の核内因子が経時的に核内移行することを示す。b) i-EDG2-09に対する核内因子の結合親和性がアレル間で異なることを示す。またこの核内因子がAP-1であることを示す。 ヒト関節軟骨細胞におけるLPAによる炎症性サイトカイン遺伝子誘導反応を示す図である。a) TNFA遺伝子, b)IL1B遺伝子について示す。 ヒトOA滑膜細胞におけるLPAによる炎症性サイトカイン遺伝子およびMMP遺伝子誘導反応を示す図である。a) - c) 炎症性サイトカイン遺伝子の経時変化について示す。 d) - f) MMP遺伝子の経時変化について示す。g) - i) 炎症性サイトカイン遺伝子のLPA用量依存性について示す。 ウサギ滑膜細胞株におけるLPAによる炎症性サイトカイン遺伝子およびMMP遺伝子誘導反応を示す図である。a) および b) 炎症性サイトカイン遺伝子の経時変化について示す。 c) - e) MMP遺伝子の経時変化について示す。f) および g) 炎症性サイトカイン遺伝子のLPA用量依存性について示す。 i-EDG2-09の疾患感受性ジェノタイプ頻度が日本人一般集団膝関節OAの重症度と相関していることを示す図である。 ヒトOA滑膜細胞におけるLPA誘導性炎症性サイトカイン上昇反応におけるEDG2の関与を示す図である。a) EDG2に対するsiRNAによるEDG2発現抑制、b) EDG2に対するsiRNAによるIL6発現抑制およびc) LPA受容体阻害薬によるIL6発現抑制を示す。
（発明の詳細な説明）
本発明で用いられる配列番号: 2で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質 (以下、包括的に単に「EDG2」という場合がある) は、ヒトもしくは他の温血動物 (例えば、サル, ウシ, ウマ, ブタ, ヒツジ, ヤギ, ウサギ, マウス, ラット, モルモット, ハムスター, ニワトリなど) の細胞 [例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞 (例: マクロファージ, T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球)、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞など] またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織もしくは器官 [例えば、脳、脳の各部位 (例: 嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳)、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆嚢、骨髄、副腎、皮膚、筋肉（例：骨格筋）、肺、消化管 (例: 大腸、小腸)、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、脂肪組織 (例: 褐色脂肪組織、白色脂肪組織)など]、好ましくは滑膜、脳、脊髄などに由来する天然のEDG2蛋白質であってもよく、また、後述のように、化学的に、もしくは無細胞蛋白質合成系を用いて生化学的に合成された蛋白質であってもよい。あるいは、上記アミノ酸配列をコードする塩基配列を含む核酸を導入された形質転換体から産生される組換え蛋白質であってもよい。
配列番号: 2で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とは、配列番号: 2で表されるアミノ酸配列と約50%以上、好ましくは約60%以上、さらに好ましくは約70%以上、より好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有するアミノ酸配列をいう。ここで「相同性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて2つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント (好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである) における、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸および類似アミノ酸残基の割合 (%) を意味する。「類似アミノ酸」とは物理化学的性質において類似したアミノ酸を意味し、例えば、芳香族アミノ酸 (Phe, Trp, Tyr)、脂肪族アミノ酸 (Ala, Leu, Ile, Val)、極性アミノ酸 (Gln, Asn)、塩基性アミノ酸(Lys, Arg, His)、酸性アミノ酸 (Glu, Asp)、水酸基を含むアミノ酸 (Ser, Thr)、側鎖の小さいアミノ酸 (Gly, Ala, Ser, Thr, Met) などの同じグループに分類されるアミノ酸が挙げられる。このような類似アミノ酸による置換は蛋白質の表現型に変化をもたらさない (即ち、保存的アミノ酸置換である) ことが予測される。保存的アミノ酸置換の具体例は当該技術分野で周知であり、種々の文献に記載されている (例えば、Bowie et al., Science, 247: 1306-1310 (1990) を参照)。
本明細書におけるアミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値=10；ギャップを許す；マトリクス=BLOSUM62；フィルタリング=OFF）にて計算することができる。アミノ酸配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、例えば、Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877 (1993) に記載のアルゴリズム [該アルゴリズムはNBLASTおよびXBLASTプログラム (version 2.0) に組み込まれている (Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402 (1997))]、Needleman et al., J. Mol. Biol., 48:444-453 (1970) に記載のアルゴリズム [該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラムに組み込まれている]、Myers and Miller, CABIOS, 4: 11-17 (1988) に記載のアルゴリズム [該アルゴリズムはCGC配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム (version 2.0) に組み込まれている]、Pearson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-2448 (1988) に記載のアルゴリズム [該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のFASTAプログラムに組み込まれている] 等が挙げられ、それらも同様に好ましく用いられ得る。
配列番号: 2で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質とは、上記した「配列番号: 2で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列」を含み、且つ配列番号: 2で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質と実質的に同質の活性を有するような蛋白質をいう。実質的に同質の活性としては、例えば、LPA結合活性、LPAシグナルの伝達活性[例えば、GTP結合活性、アデニル酸シクラーゼ (AC) 阻害活性、ホスホリパーゼC (PLC) β活性増強活性、炎症性サイトカイン (例: TNFα、IL-1b、IL-6等) 誘導活性、それに続く軟骨基質分解酵素 (例: MMP-1、MMP-3、MMP-13等) 誘導活性、発痛作用等] などが挙げられる。「実質的に同質」とは、それらの性質が定性的に (例: 生理学的に、または薬理学的に) 同一であることを意味する。したがって、上記の活性の程度といった量的要素については、同等であることが好ましいが、異なっていてもよい (例えば、約0.01〜約100倍、好ましくは約0.1〜約10倍、より好ましくは約0.5〜約2倍)。
EDG2の活性の測定は、自体公知の方法に準じて行うことができる。例えば、LPA結合活性は3Hで標識したLPAを、GTP結合活性は35Sで標識したGTPアナログ (例: GTPγS等) をそれぞれ用いて、RI活性を指標に測定することができる。また、AC活性の測定は、cAMP量を抗cAMP抗体を用いて測定するか、cAMP応答エレメント (CRE) 制御下にあるレポーター遺伝子の発現を指標として行うことができる。また、PLCβ活性は、蛍光プローブ (例: fura-2、indo-1、fluor-3、Calcium-Green I等) やCa感受性発光蛋白質 (例: エクオリン等) を用いて細胞内Ca2+量を測定するか、3H標識したホスファチジルイノシトール-4,5-二リン酸を用いて生成するイノシトール-1,4,5-三リン酸を測定することにより、あるいはTPA応答エレメント (TRE) 制御下にあるレポーター遺伝子の発現を指標として行うことができる。発痛作用は、von Freyテスト等の公知の疼痛試験により評価することができる。
また、本発明で用いられるEDG2としては、例えば、(1) 配列番号: 2で表されるアミノ酸配列中の1または2個以上 [好ましくは、1〜30個程度、より好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは1〜数 (例: 5、4、3、2) 個] のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、(2) 配列番号: 2で表されるアミノ酸配列に1または2個以上 [好ましくは、1〜30個程度、より好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは1〜数 (例: 5、4、3、2) 個] のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、(3) 配列番号: 2で表されるアミノ酸配列に1または2個以上 [好ましくは、1〜30個程度、より好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは1〜数 (例: 5、4、3、2) 個] のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、(4) 配列番号: 2で表されるアミノ酸配列中の1または2個以上 [好ましくは、1〜30個程度、より好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは1〜数 (例: 5、4、3、2) 個] のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または(5) それらを組み合わせたアミノ酸配列を含む蛋白質であって、配列番号: 2で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質も含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置は、当該蛋白質の活性を損なわない限り、特に限定されない。
一方、配列番号: 2で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むが、配列番号: 2で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質と実質的に同質の活性を有しない蛋白質、例えば、共役するG蛋白質αサブユニット (例: Gi/o) の活性化に関わる領域 (G蛋白質活性化ドメイン; GAD) (例えば、細胞内第3ループのN末側のArg残基および／またはC末側のRRNR配列など) 内に変異 (例えば、欠失、挿入、置換、修飾等) が導入された蛋白質等 (即ち、ドミナントネガティブ変異体; DNM) は、LPAと結合することにより、EDG2を介したLPAからのシグナル伝達作用を遮断することができるので、該シグナル伝達作用を抑制する目的において有用であり得る。
本明細書においてアミノ酸配列により特定される蛋白質は、ペプチド標記の慣例に従って、左端がN末端 (アミノ末端)、右端がC末端 (カルボキシル末端) である。配列番号: 2で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質をはじめとする、本発明で用いられるEDG2は、C末端がカルボキシル基 (-COOH)、カルボキシレート (-COO-)、アミド (-CONH2) またはエステル (-COOR) の何れであってもよい。
ここでエステルにおけるRとしては、例えば、メチル, エチル, n-プロピル, イソプロピル, n-ブチルなどのC1-6アルキル基、例えば、シクロペンチル, シクロヘキシルなどのC3-8シクロアルキル基、例えば、フェニル, α-ナフチルなどのC6-12アリール基、例えば、ベンジル, フェネチルなどのフェニル-C1-2アルキル基もしくはα-ナフチルメチルなどのα-ナフチル-C1-2アルキル基などのC7-14アラルキル基、ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
本発明で用いられる蛋白質がC末端以外にカルボキシル基 (またはカルボキシレート) を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明で用いられる蛋白質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したC末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明で用いられる蛋白質には、N末端のアミノ酸残基 (例: メチオニン残基) のアミノ基が保護基 (例えば、ホルミル基, アセチル基などのC1-6アルカノイルなどのC1-6アシル基など) で保護されているもの、生体内で切断されて生成するN末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基 (例えば、-OH, -SH, アミノ基, イミダゾール基, インドール基, グアニジノ基など) が適当な保護基 (例えば、ホルミル基, アセチル基などのC1-6アルカノイル基などのC1-6アシル基など) で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質 (例えば、配列番号: 2で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号27および35で示されるAsn残基は可能性のあるN結合グリコシル化部位である) などの複合蛋白質なども含まれる。
本発明で用いられる蛋白質の具体例としては、例えば、配列番号: 2で表されるアミノ酸配列からなるヒトEDG2 (GenBank accession No.: NP_001392、NP_476500等)、あるいは他の哺乳動物におけるそのオルソログ (ortholog) 等が挙げられる。例えば、マウスEDG2は、NCBIデータベースにGenBank accession No.: NP_034466として登録されており、ヒトEDG2とは約96％のアミノ酸同一性を示す。また、ラットEDG2は、NCBIデータベースにGenBank accession No.: NP_446388として登録されており、ヒトEDG2とは約97％のアミノ酸同一性を示す。
本発明で用いられるEDG2の部分ペプチドは、配列番号: 2で表されるアミノ酸配列の部分アミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含むペプチドであって、前記した本発明で用いられるEDG2と実質的に同質の活性を有するものであればいずれのものでもよい。ここで「実質的に同質の活性」とは上記と同義である。また、「実質的に同質の活性」の測定は、上記と同様にして行うことができる。本明細書においては、当該部分ペプチドを、以下「本発明の活性ペプチド」と称することとする。
具体的には、該部分ペプチドとしては、本発明で用いられるEDG2の構成アミノ酸配列のうち少なくとも50個以上、好ましくは70個以上、より好ましくは100個以上のアミノ酸配列からなるペプチドなどが用いられる。また、本発明で用いられるEDG2の部分ペプチドは、(1) そのアミノ酸配列中の1または2個以上 [好ましくは、1〜30個程度、より好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは1〜数 (例: 5、4、3、2) 個] のアミノ酸が欠失し、または、(2) そのアミノ酸配列に1または2個以上 [好ましくは、1〜30個程度、より好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは1〜数 (例: 5、4、3、2) 個] のアミノ酸が付加し、または、(3) そのアミノ酸配列に1または2個以上 [好ましくは、1〜30個程度、より好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは1〜数 (例: 5、4、3、2) 個] のアミノ酸が挿入され、または、(4) そのアミノ酸配列中の1または2個以上 [好ましくは1〜10個程度、より好ましくは1〜数 (例: 5、4、3、2) 個] のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよく、あるいは(5) それらが組み合わされていてもよい。
一方、EDG2の部分アミノ酸配列を含むがEDG2と実質的に同質の活性を有しないペプチド、例えば、配列番号: 2で表されるアミノ酸配列のうち、LPAとの結合に関わる領域 (リガンド結合ドメイン; LBD) を含むが、G蛋白質活性化ドメイン (GAD) を含まない部分アミノ酸配列を有するものなどは、「本発明の活性ペプチド」には含まれない。しかしながら、かかるペプチドは、上記EDG2のドミナントネガティブ変異体 (DNM) と同様、LPAと結合することにより、EDG2を介したLPAからのシグナル伝達作用を遮断することができるので、該シグナル伝達作用を抑制する目的において有用であり得る。本明細書においては、当該部分ペプチドを以下「本発明の阻害ペプチド」と称することとする。
本発明で用いられるEDG2の部分ペプチド (本発明の活性ペプチドおよび本発明の阻害ペプチドの両者を包含する; 以下、このような場合には「本発明の部分ペプチド」と称することがある) は、C末端がカルボキシル基 (-COOH)、カルボキシレート (-COO-)、アミド (-CONH2) またはエステル (-COOR) の何れであってもよい。ここでエステルにおけるRとしては、EDG2について上記したと同様のものが挙げられる。また、該部分ペプチドがC末端以外にカルボキシル基 (またはカルボキシレート) を有している場合、該カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明で用いられるEDG2の部分ペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては、C末端のエステルと同様のものが例示される。さらに、該部分ペプチドには、EDG2の場合と同様に、N末端のアミノ酸残基 (例: メチオニン残基) のアミノ基が保護基で保護されているもの、N末端側が生体内で切断され生成したグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
本発明で用いられるEDG2またはその部分ペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸 (例: 無機酸, 有機酸) や塩基 (例: アルカリ金属) などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸 (例えば、塩酸, リン酸, 臭化水素酸, 硫酸) との塩、あるいは有機酸 (例えば、酢酸, ギ酸, プロピオン酸, フマル酸, マレイン酸, コハク酸, 酒石酸, クエン酸, リンゴ酸, 蓚酸, 安息香酸, メタンスルホン酸, ベンゼンスルホン酸) との塩などが用いられる。
本発明で用いられるEDG2またはその塩は、前述したヒトや他の温血動物の細胞または組織から自体公知の蛋白質の精製方法によって調製することができる。具体的には、該動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行い、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
本発明で用いられるEDG2もしくはその部分ペプチドまたはその塩 (以下、「EDG2s」と包括的に略記する場合がある) は、公知のペプチド合成法に従って製造することもできる。
ペプチド合成法は、例えば、固相合成法, 液相合成法のいずれであってもよい。本発明の蛋白質を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合し、生成物が保護基を含む場合は保護基を脱離することにより、目的とする蛋白質を製造することができる。ここで、縮合や保護基の脱離は、自体公知の方法、例えば、以下の (1) および (2) に記載された方法に従って行われる。
(1) M. Bodanszky and M.A. Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York(1966)
(2) Schroeder and Luebke, The Peptide, Academic Press, NewYork (1965)
本発明のEDG2sの合成には、通常市販の蛋白質合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂, ヒドロキシメチル樹脂, ベンズヒドリルアミン樹脂, アミノメチル樹脂, 4-ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂, 4-メチルベンズヒドリルアミン樹脂, PAM樹脂, 4-ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂, ポリアクリルアミド樹脂, 4-(2’,4’-ジメトキシフェニル-ヒドロキシメチル)フェノキシ樹脂, 4-(2’,4’-ジメトキシフェニル-Fmocアミノエチル)フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、α-アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とする蛋白質等の配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂から蛋白質または部分ペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的の蛋白質もしくは部分ペプチドまたはそれらのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、蛋白質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、DCC, N,N’-ジイソプロピルカルボジイミド, N-エチル-N’-(3-ジメチルアミノプロリル)カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤 (例えば、HOBt, HOOBt) とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するか、あるいは、対称酸無水物またはHOBtエステルもしくはHOOBtエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行った後に、樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、蛋白質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、N,N-ジメチルホルムアミド, N,N-ジメチルアセトアミド, N-メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン, クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン, ジオキサン, テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル, プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル, 酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度は蛋白質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常、約-20℃〜50℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は、通常、1.5〜4倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には、保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより、十分な縮合を行うことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することによって、後の反応に影響を与えないようにすることができる。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護および保護基、並びにその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは、公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Z, Boc, t-ペンチルオキシカルボニル, イソボルニルオキシカルボニル, 4-メトキシベンジルオキシカルボニル, Cl-Z, Br-Z, アダマンチルオキシカルボニル, トリフルオロアセチル, フタロイル, ホルミル, 2-ニトロフェニルスルフェニル, ジフェニルホスフィノチオイル, Fmocなどが用いられる。
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化(例えば、メチル, エチル, プロピル, ブチル, t-ブチル, シクロペンチル, シクロヘキシル, シクロヘプチル, シクロオクチル, 2-アダマンチルなどの直鎖状、 分枝状もしくは環状アルキルエステル化)、アラルキルエステル化 (例えば、ベンジルエステル, 4-ニトロベンジルエステル, 4-メトキシベンジルエステル, 4-クロロベンジルエステル, ベンズヒドリルエステル化)、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、t-ブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級 (C1-6) アルカノイル基, ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基, エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基, テトラヒドロピラニル基, t-ブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Bzl, Cl2-Bzl, 2-ニトロベンジル, Br-Z, t-ブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Tos, 4-メトキシ-2,3,6-トリメチルベンゼンスルホニル, DNP, ベンジルオキシメチル, Bum, Boc, Trt, Fmocなどが用いられる。
保護基の除去 (脱離) 方法としては、例えば、Pd-黒あるいはPd-炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素, メタンスルホン酸, トリフルオロメタンスルホン酸, トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン, トリエチルアミン, ピペリジン, ピペラジンなどによる塩基処理、また、液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約-20℃〜40℃の温度で行われるが、酸処理においては、例えば、アニソール, フェノール, チオアニソール, メタクレゾール, パラクレゾール, ジメチルスルフィド, 1,4-ブタンジチオール, 1,2-エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる2,4-ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の1,2-エタンジチオール, 1,4-ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液, 希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物, アジド, 活性エステル [アルコール (例えば、ペンタクロロフェノール, 2,4,5-トリクロロフェノール, 2,4-ジニトロフェノール, シアノメチルアルコール, パラニトロフェノール, HONB, N-ヒドロキシスクシミド, N-ヒドロキシフタルイミド, HOBt) とのエステル] などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
蛋白質または部分ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシル末端アミノ酸のα-カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド (蛋白質) 鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のN末端のα-アミノ基の保護基のみを除いた蛋白質または部分ペプチドとC末端のカルボキシル基の保護基のみを除去した蛋白質または部分ペプチドとを製造し、これらの蛋白質またはペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護蛋白質またはペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗蛋白質またはペプチドを得ることができる。この粗蛋白質またはペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望の蛋白質またはペプチドのアミド体を得ることができる。
蛋白質またはペプチドのエステル体を得るには、例えば、カルボキシル末端アミノ酸のα-カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合してアミノ酸エステルとした後、蛋白質またはペプチドのアミド体と同様にして、所望の蛋白質またはペプチドのエステル体を得ることができる。
本発明で用いられるEDG2の部分ペプチドまたはその塩は、上述もしくは後述のいずれかの方法により得られるEDG2またはその塩を、適当なペプチダーゼで切断することによっても製造することができる。
このようにして得られた本発明のEDG2sは、公知の精製法により精製単離することができる。ここで、精製法としては、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶、これらの組み合わせなどが挙げられる。
上記方法で得られる蛋白質または部分ペプチドが遊離体である場合には、該遊離体を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に蛋白質が塩として得られた場合には、該塩を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
本発明のEDG2sは、EDG2またはその部分ペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターを導入した形質転換体を培養してEDG2sを生成せしめ、得られる培養物からEDG2sを分離・精製することによって製造することもできる。
EDG2またはその部分ペプチドをコードする核酸としては、前述した本発明で用いられるEDG2のアミノ酸配列もしくはその部分アミノ酸配列をコードする塩基配列を含むものであればいかなるものでもよい。該核酸は、DNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA/RNAキメラであってもよいが、好ましくはDNAが挙げられる。また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖DNA、二本鎖RNAまたはDNA:RNAのハイブリッドでもよい。
EDG2またはその部分ペプチドをコードするDNAは、ゲノムDNA、ヒトもしくは他の温血動物 (例えば、サル, ウシ, ウマ, ブタ, ヒツジ, ヤギ, ウサギ, マウス, ラット, モルモット, ハムスター, ニワトリなど) の細胞 [例えば、肝細胞, 脾細胞, 神経細胞, グリア細胞, 膵β細胞, 骨髄細胞, メサンギウム細胞, ランゲルハンス細胞, 表皮細胞, 上皮細胞, 杯細胞, 内皮細胞, 平滑筋細胞, 線維芽細胞, 線維細胞, 筋細胞, 脂肪細胞, 免疫細胞 (例: マクロファージ, T細胞, B細胞, ナチュラルキラー細胞, 肥満細胞, 好中球, 好塩基球, 好酸球, 単球) , 巨核球, 滑膜細胞, 軟骨細胞, 骨細胞, 骨芽細胞, 破骨細胞, 乳腺細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞など] またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織もしくは器官 [例えば、脳, 脳の各部位 (例: 嗅球, 扁桃核, 大脳基底球, 海馬, 視床, 視床下部, 大脳皮質, 延髄, 小脳), 脊髄, 下垂体, 胃, 膵臓, 腎臓, 肝臓, 生殖腺, 甲状腺, 胆嚢, 骨髄, 副腎, 皮膚, 筋肉（例：骨格筋）, 肺, 消化管 (例: 大腸, 小腸), 血管, 心臓, 胸腺, 脾臓, 顎下腺, 末梢血, 前立腺, 睾丸, 卵巣, 胎盤, 子宮, 骨, 関節, 脂肪組織 (例: 褐色脂肪組織, 白色脂肪組織)など]、好ましくは滑膜、脳、脊髄などに由来するcDNA、あるいは合成DNAなどが挙げられる。EDG2またはその部分ペプチドをコードするゲノムDNAおよびcDNAは、上記した細胞・組織より調製したゲノムDNA画分および全RNAもしくはmRNA画分をそれぞれ鋳型として用い、Polymerase Chain Reaction (以下、「PCR法」と略称する) およびReverse Transcriptase-PCR (以下、「RT-PCR法」と略称する) によって直接増幅することもできる。あるいは、EDG2またはその部分ペプチドをコードするゲノムDNAおよびcDNAは、上記した細胞・組織より調製したゲノムDNAおよび全RNAもしくはmRNAの断片を適当なベクター中に挿入して調製されるゲノムDNAライブラリーおよびcDNAライブラリーから、コロニーもしくはプラークハイブリダイゼーション法またはPCR法などにより、それぞれクローニングすることもできる。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ, プラスミド, コスミド, ファージミドなどいずれであってもよい。
EDG2をコードするDNAとしては、例えば、配列番号: 1で表される塩基配列を含むDNA、あるいは配列番号: 1で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、前記した配列番号: 2に示されるアミノ酸配列を含む蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質もしくはペプチドをコードするDNAなどが挙げられる。
配列番号: 1で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるDNAとしては、例えば、配列番号: 1で表される塩基配列と約60%以上、好ましくは約70%以上、さらに好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90%以上の相同性を有する塩基配列を含むDNAなどが用いられる。
本明細書における塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool) を用い、以下の条件 (期待値=10; ギャップを許す; フィルタリング=ON; マッチスコア=1; ミスマッチスコア=-3) にて計算することができる。塩基配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、上記したアミノ酸配列の相同性計算アルゴリズムが同様に好ましく例示される。
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、Molecular Cloning, 第2版 (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。ハイブリダイゼーションは、好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行うことができる。
ハイストリンジェントな条件としては、例えば、ナトリウム塩濃度が約19〜約40 mM、好ましくは約19〜約20 mMで、温度が約50〜約70℃、好ましくは約60〜約65℃の条件 (特に、ナトリウム塩濃度が約19 mMで温度が約65℃の場合が好ましい)、あるいは、6×SSC (sodium chloride/sodium citrate) 中45℃でのハイブリダイゼーション反応の後、0.2×SSC／0.1％ SDS中65℃での一回以上の洗浄などが挙げられる。当業者は、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、ハイブリダゼーション反応の温度、プローブ濃度、プローブの長さ、ミスマッチの数、ハイブリダイゼーション反応の時間、洗浄液の塩濃度、洗浄の温度等を適宜変更することにより、所望のストリンジェンシーに容易に調節することができる。
EDG2をコードするDNAは、好ましくは配列番号: 1で表される塩基配列を含むヒトEDG2 cDNA (GenBank accession No.: NM_001401) もしくはそのアレル変異体または他の温血動物 (例えば、マウス, ラット, モルモット, ハムスター, ウサギ, ヒツジ, ヤギ, ブタ, ウシ, ウマ, トリ, ネコ, イヌ, サル, チンパンジーなど) におけるそのオルソログ (ortholog) 等である。例えば、マウスEDG2は、NCBIデータベースにGenBank accession No.: NM_010336として登録されている。また、ラットEDG2は、NCBIデータベースにGenBank accession No.: NM_053936として登録されている。
EDG2の部分ペプチドをコードするDNAは、配列番号: 2で表されるアミノ酸配列の一部と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムDNA、上記した細胞・組織由来のcDNA、合成DNAのいずれでもよい。
具体的には、該部分ペプチドをコードするDNAとしては、例えば、
(1) 配列番号: 1で表される塩基配列を含むDNAの部分塩基配列、または
(2) 配列番号: 1で表される塩基配列を含むDNAとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、且つ該DNAにコードされるアミノ酸配列を含む蛋白質と実質的に同質の活性を有するペプチドをコードするDNAなどが用いられる。
配列番号: 1で表される塩基配列を含むDNAとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるDNAとしては、例えば、該塩基配列中の対応する部分と約60%以上、好ましくは約70%以上、より好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90%以上の相同性を有する塩基配列を含むDNAなどが用いられる。
EDG2またはその部分ペプチドをコードするDNAは、該蛋白質またはペプチドをコードする塩基配列の一部分を含む合成DNAプライマーを用いてPCR法によって増幅するか、または適当な発現ベクターに組み込んだDNAを、EDG2の一部あるいは全領域をコードするDNA断片もしくは合成DNAを標識したものとハイブリダイゼーションさせることによってクローニングすることができる。ハイブリダイゼーションは、例えば、Molecular Cloning, 第2版 (前述) に記載の方法などに従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、該ライブラリーに添付された使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
DNAの塩基配列は、公知のキット、例えば、MutanTM-super Express Km (宝酒造 (株)), MutanTM-K (宝酒造 (株)) 等を用いて、ODA-LAPCR法、Gapped duplex法、Kunkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って変換することができる。
クローン化されたDNAは、目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化するか、リンカーを付加した後に、使用することができる。該DNAはその5’末端側に翻訳開始コドンとしてのATGを有し、また3’末端側には翻訳終止コドンとしてのTAA, TGAまたはTAGを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成DNAアダプターを用いて付加することができる。
上記のEDG2またはその部分ペプチドをコードするDNAを含む発現ベクターで宿主を形質転換し、得られる形質転換体を培養することによって、該蛋白質またはペプチドを製造することができる。
EDG2またはその部分ペプチドをコードするDNAを含む発現ベクターは、例えば、EDG2をコードするDNAから目的とするDNA断片を切り出し、該DNA断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド(例: pBR322, pBR325, pUC12, pUC13)、枯草菌由来のプラスミド (例: pUB110, pTP5, pC194)、酵母由来プラスミド (例: pSH19, pSH15)、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス, ワクシニアウイルス, バキュロウイルスなどの動物ウイルス、pA1-11, pXT1, pRc/CMV, pRc/RSV, pcDNAI/Neoなどが用いられる。
プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。
例えば、宿主が動物細胞である場合、SRαプロモーター, SV40プロモーター, LTRプロモーター, CMV (サイトメガロウイルス) プロモーター, HSV-tkプロモーターなどが用いられる。なかでも、CMVプロモーター, SRαプロモーターなどが好ましい。
宿主がエシェリヒア属菌である場合、trpプロモーター, lacプロモーター, recAプロモーター, λPLプロモーター, lppプロモーター, T7プロモーターなどが好ましい。
宿主がバチルス属菌である場合、SPO1プロモーター, SPO2プロモーター, penPプロモーターなどが好ましい。
宿主が酵母である場合、PHO5プロモーター, PGKプロモーター, PGKプロモーター, ADHプロモーターなどが好ましい。
宿主が昆虫細胞である場合、ポリヘドリンプロモーター, P10プロモーターなどが好ましい。
発現ベクターとしては、上記の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、選択マーカー、SV40複製オリジン (以下、SV40oriと略称する場合がある) などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素 (以下、dhfrと略称する場合がある) 遺伝子 [メソトレキセート (MTX) 耐性]、アンピシリン耐性遺伝子 (以下、Amprと略称する場合がある)、ネオマイシン耐性遺伝子 (以下、Neorと略称する場合がある、G418耐性) 等が挙げられる。特に、dhfr遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用い、dhfr遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によって選択することもできる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列をコードする塩基配列 (シグナルコドン) を、EDG2またはその部分ペプチドをコードするDNAの5’末端側に付加してもよい。宿主がエシェリヒア属菌である場合、PhoA・シグナル配列, OmpA・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合、α-アミラーゼ・シグナル配列, サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合、MFα・シグナル配列, SUC2・シグナル配列などが、宿主が動物細胞である場合、インシュリン・シグナル配列, α-インターフェロン・シグナル配列, 抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ用いられる。
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌, バチルス属菌, 酵母, 昆虫細胞, 昆虫, 動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌としては、例えば、Escherichia coli K12・DH1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60: 160 (1968)], JM103 [Nucleic Acids Res., 9: 309 (1981), JA221 [J. Mol. Biol., 120: 517 (1978)], HB101 [J. Mol. Biol., 41: 459 (1969)], C600 [Genetics, 39: 440 (1954)] などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、Bacillus subtilis MI114 [Gene, 24: 255 (1983)], 207-21 [J. Biochem., 95: 87 (1984)] などが用いられる。
酵母としては、例えば、Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R-, NA87-11A, DKD-5D, 20B-12; Schizosaccharomyces pombe NCYC1913, NCYC2036; Pichia pastoris KM71などが用いられる。
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがAcNPVの場合、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞 (Spodoptera frugiperda cell; Sf細胞), Trichoplusia niの中腸由来のMG1細胞, Trichoplusia niの卵由来のHigh FiveTM細胞, Mamestra brassicae由来の細胞, Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイルスがBmNPVの場合、昆虫細胞としては、蚕由来株化細胞 (Bombyx mori N 細胞; BmN細胞) などが用いられる。該Sf細胞としては、例えば、Sf9細胞 (ATCC CRL1711), Sf21細胞 (以上、Vaughn, J.L. et al., In Vivo, 13: 213-217 (1977)) などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる [Maeda et al., Nature, 315: 592 (1985)]。
動物細胞としては、例えば、サル由来のCOS-7, Vero細胞、チャイニーズハムスター由来のCHO, dhfr遺伝子欠損CHO (CHO (dhfr-)) 細胞、マウス由来のL,AtT-20, ミエローマ細胞、ラット由来のGH3細胞、ヒト由来のFL, HEK293, HepG2, HeLa細胞などが用いられる。
形質転換は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。
エシェリヒア属菌は、例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69: 2110 (1972) や Gene, 17: 107 (1982) などに記載の方法に従って形質転換することができる。
バチルス属菌は、例えば、Mol. Gen. Genet., 168: 111 (1979) などに記載の方法に従って形質転換することができる。
酵母は、例えば、Meth. Enzymol., 194: 182-187 (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 1929 (1978) などに記載の方法に従って形質転換することができる。
昆虫細胞および昆虫は、例えば、Biotechnology (N.Y.), 6: 47-55 (1988) などに記載の方法に従って形質転換することができる。
動物細胞は、例えば、細胞工学別冊8 新細胞工学実験プロトコール, 263-267 (1995)(秀潤社発行), Virology, 52: 456 (1973) に記載の方法に従って形質転換することができる。
形質転換体の培養は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。
例えば、宿主がエシェリヒア属菌またはバチルス属菌である形質転換体を培養する場合、培養に使用される培地としては液体培地が好ましい。また、培地は、形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物などを含有することが好ましい。ここで、炭素源としては、例えば、グルコース, デキストリン, 可溶性澱粉, ショ糖などが、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類, 硝酸塩類, コーンスチープ・リカー, ペプトン, カゼイン, 肉エキス, 大豆粕, バレイショ抽出液などの無機または有機物質が、無機物としては、例えば、塩化カルシウム, リン酸二水素ナトリウム, 塩化マグネシウムなどがそれぞれ挙げられる。また、培地には、酵母エキス, ビタミン類, 生長促進因子などを添加してもよい。培地のpHは、好ましくは約5〜8である。
宿主がエシェリヒア属菌である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、グルコース, カザミノ酸を含むM9培地[Miller, J. Exp. Mol. Genet., 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972] が好ましい。必要により、プロモーターを効率よく働かせるために、例えば、3β-インドリルアクリル酸のような薬剤を培地に添加してもよい。
宿主がエシェリヒア属菌である形質転換体の培養は、通常約15〜43℃で、約3〜24時間行われる。必要により、通気や撹拌を行ってもよい。
宿主がバチルス属菌である形質転換体の培養は、通常約30〜40℃で、約6〜24時間行われる。必要により、通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が酵母である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、Burkholder最小培地 [Bostian, K.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4505 (1980)] や0.5%カザミノ酸を含有するSD培地 [Bitter, G.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 5330 (1984)] などが挙げられる。培地のpHは、好ましくは約5〜8である。培養は、通常約20℃〜35℃で、約24〜72時間行われる。必要に応じて、通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えばGrace's Insect Medium [Grace, T.C.C., Nature, 195: 788 (1962)] に非働化した10%ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のpHは、好ましくは約6.2〜6.4である。培養は、通常約27℃で、約3〜5日間行われる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、約5〜20%の胎仔ウシ血清を含むMEM培地 [Science, 122: 501 (1952)], DMEM培地[Virology, 8: 396 (1959)], RPMI1640培地 [J. Am. Med. Assoc., 199: 519 (1967)], 199培地 [Proc. Soc. Biol. Med., 73: 1 (1950)] などが用いられる。培地のpHは、好ましくは約6〜8である。培養は、通常約30℃〜40℃で、約15〜60時間行われる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
以上のようにして、形質転換体の細胞内または細胞外にEDG2sを生成させることができる。
前記形質転換体を培養して得られる培養物から、EDG2sを自体公知の方法に従って分離精製することができる。
例えば、EDG2sを培養菌体あるいは細胞から抽出する場合、培養物から公知の方法で集めた菌体あるいは細胞を適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび/または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊した後、遠心分離やろ過により可溶性蛋白質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。該緩衝液は、尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトンX-100TMなどの界面活性剤を含んでいてもよい。
このようにして得られた可溶性画分中に含まれるEDG2sの単離精製は、自体公知の方法に従って行うことができる。このような方法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法, 限外ろ過法, ゲルろ過法, およびＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。これらの方法は、適宜組み合わせることもできる。
かくして得られるEDG2またはその部分ペプチドが遊離体である場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって該遊離体を塩に変換することができ、該蛋白質またはペプチドが塩として得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により該塩を遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、形質転換体が産生するEDG2sを、精製前または精製後に適当な蛋白質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。該蛋白質修飾酵素としては、例えば、トリプシン, キモトリプシン, アルギニルエンドペプチダーゼ, プロテインキナーゼ, グリコシダーゼなどが用いられる。
かくして得られるEDG2sの存在は、特異的な抗体を用いたエンザイムイムノアッセイやウエスタンブロッティングなどにより確認することができる。
さらに、EDG2またはその部分ペプチドは、それをコードするDNAに対応するRNAを鋳型として、ウサギ網状赤血球ライセート, コムギ胚芽ライセート, 大腸菌ライセートなどからなる無細胞蛋白質翻訳系を用いてインビトロ翻訳することによっても合成することができる。あるいは、さらにRNAポリメラーゼを含む無細胞転写/翻訳系を用いて、EDG2またはその部分ペプチドをコードするDNAを鋳型としても合成することができる。無細胞蛋白質 (転写/) 翻訳系は市販のものを用いることもできるし、それ自体既知の方法、具体的には、大腸菌抽出液はPratt J.M. et al., “Transcription and Translation”, Hames B.D. and Higgins S.J. eds., IRL Press, Oxford179-209 (1984) に記載の方法等に準じて調製することもできる。市販の細胞ライセートとしては、大腸菌由来のものはE.coli S30 extract system (Promega社製) やRTS 500 Rapid Translation System (Roche社製) 等が挙げられ、ウサギ網状赤血球由来のものはRabbit Reticulocyte Lysate System (Promega社製) 等、さらにコムギ胚芽由来のものはPROTEIOSTM(TOYOBO社製) 等が挙げられる。このうちコムギ胚芽ライセートを用いたものが好適である。コムギ胚芽ライセートの作製法としては、例えばJohnston F.B. et al., Nature, 179: 160-161 (1957) あるいはErickson A.H. et al., Meth. Enzymol., 96: 38-50 (1996) 等に記載の方法を用いることができる。
蛋白質合成のためのシステムまたは装置としては、バッチ法 [Pratt, J.M. et al. (1984) 前述] や、アミノ酸、エネルギー源等を連続的に反応系に供給する連続式無細胞蛋白質合成システム [Spirin A.S. et al., Science, 242: 1162-1164 (1988)]、透析法 (Kigawa et al., 第21回日本分子生物学会, WID6)、あるいは重層法 (PROTEIOSTM Wheat germ cell-free protein synthesis core kit取扱説明書: TOYOBO社製) 等が挙げられる。さらには、合成反応系に、鋳型のRNA、アミノ酸、エネルギー源等を必要時に供給し、合成物や分解物を必要時に排出する方法 (特開2000-333673) 等を用いることができる。
「配列番号: 2で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質をコードする塩基配列またはその一部」、あるいは「該塩基配列と相補的な塩基配列またはその一部」を含む核酸とは、前述のEDG2またはその部分ペプチドをコードする核酸だけではなく、コドンの読み枠の合わない部分塩基配列をも含む意味で用いられる。該核酸はDNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA/RNAキメラであってもよい。好ましくはDNAが挙げられる。また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖DNA、二本鎖RNAまたはDNA:RNAのハイブリッドでもよい。
目的核酸の標的領域と相補的な塩基配列を含む核酸、即ち、目的核酸とハイブリダイズすることができる核酸は、該目的核酸に対して「アンチセンス」であるということができる。一方、目的核酸の標的領域と相同性を有する塩基配列を含む核酸は、該目的核酸に対して「センス」であるということができる。ここで「相同性を有する」または「相補的である」とは、塩基配列間で約70%以上、好ましくは約80%以上、より好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の同一性または相補性を有することをいう。
EDG2をコードする塩基配列と相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸 (以下、「アンチセンスEDG2」ともいう) は、クローン化した、あるいは決定されたEDG2をコードする核酸の塩基配列情報に基づき設計し、合成しうる。そうした核酸は、EDG2をコードする遺伝子の複製または発現を阻害することができる。即ち、アンチセンスEDG2は、EDG2をコードする遺伝子から転写されるRNAとハイブリダイズすることができ、mRNAの合成 (プロセッシング) または機能 (蛋白質への翻訳) を阻害することができる。
アンチセンスEDG2の標的領域は、アンチセンス核酸がハイブリダイズすることにより、結果としてEDG2蛋白質への翻訳が阻害されるものであればその長さに特に制限はなく、該蛋白質をコードするmRNAの全配列であっても部分配列であってもよく、短いもので約15塩基程度、長いものでmRNAまたは初期転写産物の全配列が挙げられる。合成の容易さや抗原性の問題を考慮すれば、約15〜約30塩基からなるオリゴヌクレオチドが好ましいがそれに限定されない。具体的には、例えば、EDG2をコードする核酸の5’端ヘアピンループ, 5’端6-ベースペア・リピート, 5’端非翻訳領域, 翻訳開始コドン, 蛋白質コード領域, 翻訳終止コドン, 3’端非翻訳領域, 3’端パリンドローム領域および3’端ヘアピンループが標的領域として選択しうるが、EDG2をコードする遺伝子内の如何なる領域も標的として選択しうる。例えば、該遺伝子のイントロン部分を標的領域とすることもまた好ましい。
さらに、アンチセンスEDG2は、EDG2をコードするmRNAもしくは初期転写産物とハイブリダイズして蛋白質への翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖DNAであるEDG2をコードする遺伝子と結合して三重鎖 (トリプレックス) を形成し、RNAの転写を阻害し得るものであってもよい。
アンチセンス核酸は、2-デオキシ-D-リボースを含有しているデオキシリボヌクレオチド、D-リボースを含有しているリボヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のN-グリコシドであるその他のタイプのヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨格を含むその他のポリマー (例えば、市販の蛋白質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー) または特殊な結合を含むその他のポリマー (但し、該ポリマーはDNAやRNA中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含む) などが挙げられる。それらは、2本鎖DNA, 1本鎖DNA, 2本鎖RNA, 1本鎖RNA, さらにDNA:RNAハイブリッドであることができ、さらに非修飾ポリヌクレオチド (または非修飾オリゴヌクレオチド)、さらには公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、1個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合 (例えば、メチルホスホネート, ホスホトリエステル, ホスホルアミデート, カルバメートなど) を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合 (例えば、ホスホロチオエート, ホスホロジチオエートなど) を持つもの、例えば蛋白質 (ヌクレアーゼ, ヌクレアーゼ・インヒビター, トキシン, 抗体, シグナルペプチド, ポリ-L-リジンなど) や糖 (例えば、モノサッカライドなど) などの側鎖基を有しているもの、インターカレント化合物 (例えば、アクリジン, プソラレンなど) を持つもの、キレート化合物 (例えば、金属, 放射活性をもつ金属, ホウ素, 酸化性の金属など) を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの (例えば、αアノマー型の核酸など) であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリンおよびピリミジン塩基を含むのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいてもよい。こうした修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌクレオシドおよび修飾されたヌクレオチドはまた、糖部分が修飾されていてよく、例えば、1個以上の水酸基がハロゲン、脂肪族基などで置換されていたり、あるいはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。
好ましくは、アンチセンス核酸は、修飾されていてもよいRNAまたはDNAである。修飾された核酸(RNA, DNA) の具体例としては、核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、そしてポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、それに限定されるものではない。アンチセンスEDG2は次のような方針で好ましく設計されうる。すなわち、細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにする、アンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、標的とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、そして、もし毒性があるなら、アンチセンス核酸の毒性をより小さなものにする。こうした修飾は当該分野で数多く知られており、例えば、J. Kawakami et al., Pharm Tech Japan, Vol. 8, 247 (1992), 同 Vol. 8, 395 (1992); S.T. Crooke et al. ed., Antisense Research and Applications, CRC Press (1993) などに開示されている。
アンチセンス核酸は、変化せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合を含有していてもよく、リポソーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療において適用されたり、付加された形態で与えられることができうる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質 (例えば、ホスホリピド, コレステロールなど) といった疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体 (例えば、コレステリルクロロホルメート, コール酸など) が挙げられる。こうしたものは、核酸の3’端あるいは5’端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の3’端あるいは5’端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、RNaseなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
EDG2をコードするmRNAもしくは初期転写産物を、コード領域の内部 (初期転写産物の場合はイントロン部分を含む) で特異的に切断し得るリボザイムもまた、アンチセンスEDG2に包含され得る。「リボザイム」とは核酸を切断する酵素活性を有するRNAをいうが、最近では当該酵素活性部位の塩基配列を含むオリゴDNAも、同様に核酸切断活性を有することが明らかになっているので、本明細書では、配列特異的な核酸切断活性を有する限り、DNAをも包含する概念として用いるものとする。リボザイムとして最も汎用性の高いものとしては、ウイロイドやウイルソイド等の感染性RNAに見られるセルフスプライシングRNAがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型等が知られている。ハンマーヘッド型は約40塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーヘッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ(合わせて約10塩基程度) をmRNAの所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、標的mRNAのみを特異的に切断することが可能である。このタイプのリボザイムは、RNAのみを基質とするので、ゲノムDNAを攻撃することがないというさらなる利点を有する。EDG2mRNAが自身で二本鎖構造をとる場合には、RNAヘリカーゼと特異的に結合し得るウイルス核酸由来のRNAモチーフを連結したハイブリッドリボザイムを用いることにより、標的配列を一本鎖にすることができる [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98(10): 5572-5577 (2001)]。さらに、リボザイムを、それをコードするDNAを含む発現ベクターの形態で使用する場合には、転写産物の細胞質への移行を促進するために、tRNAを改変した配列をさらに連結したハイブリッドリボザイムとすることもできる[Nucleic Acids Res., 29(13): 2780-2788 (2001)]。
EDG2をコードするmRNAもしくは初期転写産物のコード領域内の部分配列 (初期転写産物の場合はイントロン部分を含む) に相補的な塩基配列を含む二本鎖オリゴRNA (siRNA) もまた、アンチセンスEDG2に包含され得る。短い二本鎖RNAを細胞内に導入するとそのRNAの一方の鎖に相補的なmRNAが分解される、いわゆるRNA干渉(RNAi) と呼ばれる現象は、以前から線虫、昆虫、植物等で知られていたが、この現象が哺乳動物細胞でも起こることが確認されて以来 [Nature, 411(6836): 494-498 (2001)]、リボザイムの代替技術として広く利用されている。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムは、EDG2をコードするcDNA配列もしくはゲノムDNA配列情報に基づいてmRNAもしくは初期転写産物の標的領域を決定し、市販のDNA/RNA自動合成機 (アプライド・バイオシステムズ社, ベックマン社等) を用いて、これに相補的な配列を合成することにより調製することができる。RNAi活性を有するsiRNAは、センス鎖及びアンチセンス鎖をDNA/RNA自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中、約90〜約95℃で約1分程度変性させた後、約30〜約70℃で約1〜約8時間アニーリングさせることにより調製することができる。また、相補的なオリゴヌクレオチド鎖を交互にオーバーラップするように合成して、これらをアニーリングさせた後リガーゼでライゲーションすることにより、より長い二本鎖ポリヌクレオチドを調製することもできる。あるいは、siRNAは、センス鎖およびアンチセンス鎖を適当な長さ (例えば、約3〜約10塩基) のリンカーを介して連結したRNA (shRNA) として合成し、導入する動物細胞内の酵素ダイサー (dicer) などによってプロセシングされるように設計することもできる。さらには、センス鎖およびアンチセンス鎖をコードするDNAがそれぞれ別個のU6やH1などのPol III系プロモーターの制御下におかれた発現ベクター、あるいは上記センス鎖とアンチセンス鎖とをリンカーを介して連結したRNA鎖をコードするDNAがPol III系プロモーターの制御下におかれた発現ベクターとして調製し、動物細胞内で発現させ、siRNAを形成させてもよい。
アンチセンスEDG2の遺伝子発現阻害活性は、EDG2をコードする核酸を含む形質転換体、生体内や生体外のEDG2をコードする遺伝子発現系またはEDG2の生体内や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。
本発明はまた、EDG2もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体 (以下、「抗EDG2抗体」と略記する場合がある) を提供する。抗EDG2抗体は、EDG2もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対して特異的親和性を有するものであれば、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。該抗体は、EDG2もしくはその部分ペプチドまたはその塩を抗原として用い、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
[モノクローナル抗体の作製]
(a) モノクローナル抗体産生細胞の作製
EDG2もしくはその部分ペプチドまたはその塩 (EDG2s) を、哺乳動物に対して、投与により抗体産生が可能な部位に、それ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与する。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常2〜6週毎に1回ずつ、計2〜10回程度行われる。用いられる哺乳動物としては、例えば、サル, ウサギ, イヌ, モルモット, マウス, ラット, ヒツジ, ヤギ等が挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
例えば、抗原で免疫された哺乳動物、例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し、最終免疫の2〜5日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化EDG2と抗血清とを反応させた後、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行うことができる。融合操作は、既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法 ［Nature, 256: 495 (1975)］ に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール (PEG) やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはPEGが用いられる。
骨髄腫細胞としては、例えば、NS-1, P3U1, SP2/0, AP-1などの哺乳動物の骨髄腫細胞が挙げられるが、P3U1が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞 (脾細胞) 数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は、1:1〜20:1程度であり、PEG (好ましくはPEG1000〜PEG6000) が10〜80%程度の濃度で添加され、20〜40℃、好ましくは30〜37℃で1〜10分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、例えば、抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相 (例: マイクロプレート) にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体 (細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる) またはプロテインAを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインAを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したEDG2を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などにより、スクリーニングすることができる。
モノクローナル抗体の選別は、自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行うことができる。モノクローナル抗体の選別は、通常HAT (ヒポキサンチン, アミノプテリン, チミジン) を添加した動物細胞用培地で行うことができる。モノクローナル抗体の選別および育種用培地は、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いてもよい。このような培地としては、例えば、1〜20%、好ましくは10〜20%の胎仔ウシ血清を含むRPMI1640培地、1〜10%の胎仔ウシ血清を含むGIT培地 (和光純薬工業(株)) あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地 (SFM-101, 日水製薬(株)) などを用いることができる。培養温度は、通常20〜40℃、好ましくは約37℃である。培養時間は、通常5日〜3週間、好ましくは1週間〜2週間である。培養は、通常5%炭酸ガス下で行うことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
このようにして得られたモノクローナル抗体は、自体公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法 [例: 塩析法, アルコール沈殿法, 等電点沈殿法, 電気泳動法, イオン交換体 (例: DEAE) による吸脱着法, 超遠心法, ゲルろ過法, 抗原結合固相あるいはプロテインAあるいはプロテインGなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法] に従って分離精製することができる。
本発明の抗体をEDG2の活性阻害に利用する場合、該抗体はEDG2の活性阻害活性（即ち、中和活性）を持つものでなければならないので、得られたモノクローナル抗体の中和活性の程度について調べる必要がある。中和活性は、抗体の存在下および非存在下において、後述の本発明のスクリーニング方法を実施し、EDG2を介する細胞刺激活性を比較すること等により測定することができる。
好ましい一実施態様において、本発明の抗体はヒトを投与対象とする医薬品として使用されることから、本発明の抗体（好ましくはモノクローナル抗体）はヒトに投与した場合に抗原性を示す危険性が低減された抗体、具体的には、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、マウス−ヒトキメラ抗体などであり、特に好ましくは完全ヒト抗体である。ヒト化抗体およびキメラ抗体は、後述する方法に従って遺伝子工学的に作製することができる。また、完全ヒト抗体は、ヒト−ヒト（もしくはマウス）ハイブリドーマより製造することも可能ではあるが、大量の抗体を安定に且つ低コストで提供するためには、後述するヒト抗体産生動物（例：マウス）またはファージディスプレイ法を用いて製造することが望ましい。
（ｉ）キメラ抗体の作製
本明細書において「キメラ抗体」とは、Ｈ鎖およびＬ鎖の可変領域（VHおよびVL）の配列がある哺乳動物種に由来し、定常領域（CHおよびCL）の配列が他の哺乳動物種に由来する抗体を意味する。可変領域の配列は、例えばマウス等の容易にハイブリドーマを作製することができる動物種由来であることが好ましく、定常領域の配列は投与対象となる哺乳動物種由来であることが好ましい。
キメラ抗体の作製法としては、例えば米国特許第6,331,415号に記載される方法あるいはそれを一部改変した方法などが挙げられる。具体的には、まず、上述のようにして得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ（例えば、マウス−マウスハイブリドーマ）から、常法に従ってmRNAもしくは全RNAを調製し、cDNAを合成する。該cDNAを鋳型として、適当なプライマー（例えば、センスプライマーとしてVHおよびVLの各Ｎ末端配列をコードする塩基配列を含むオリゴＤＮＡ、アンチセンスプライマーとしてCHおよびCLのＮ末端配列をコードする塩基配列とハイブリダイズするオリゴＤＮＡ（例えばBio/Technology, 9: 88-89, 1991参照））を用い、常法に従ってPCRでVHおよびVLをコードするDNAを増幅・精製する。同様の方法により、他の哺乳動物（例：ヒト）のリンパ球等より調製したRNAからRT-PCRによりCHおよびCLをコードするDNAを増幅・精製する。常法を用いてVHとCH、VLとCLをそれぞれ連結し、得られたキメラＨ鎖DNAおよびキメラＬ鎖DNAを、それぞれ適当な発現ベクター（例えば、CHO細胞、COS細胞、マウス骨髄腫細胞等で転写活性を有するプロモーター（例：CMVプロモーター、SV40プロモーター等）を含むベクターなど）に挿入する。両鎖をコードするDNAは別個のベクターに挿入してもよいし、1個のベクターにタンデムに挿入してもよい。得られたキメラＨ鎖およびキメラＬ鎖発現ベクターで宿主細胞を形質転換する。宿主細胞としては、動物細胞、例えば上記したマウス骨髄腫細胞の他、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、サル由来のCOS-7細胞、Vero細胞、ラット由来のGHS細胞などが挙げられる。形質転換は動物細胞に適用可能ないかなる方法を用いてもよいが、好ましくはエレクトロポレーション法などが挙げられる。宿主細胞に適した培地中で一定期間培養後、培養上清を回収して上記と同様の方法で精製することにより、キメラモノクローナル抗体を単離することができる。あるいは、宿主細胞としてウシ、ヤギ、ニワトリ等のトランスジェニック技術が確立し、且つ家畜（家禽）として大量繁殖のノウハウが蓄積されている動物の生殖系列細胞を用い、常法によってトランスジェニック動物を作製することにより、得られる動物の乳汁もしくは卵から容易に且つ大量にキメラモノクローナル抗体を得ることもできる。さらに、トウモロコシ、イネ、コムギ、ダイズ、タバコなどのトランスジェニック技術が確立し、且つ主要作物として大量に栽培されている植物細胞を宿主細胞として、プロトプラストへのマイクロインジェクションやエレクトロポレーション、無傷細胞へのパーティクルガン法やTiベクター法などを用いてトランスジェニック植物を作製し、得られる種子や葉などから大量にキメラモノクローナル抗体を得ることも可能である。
得られたキメラモノクローナル抗体をパパインで分解すればFabが、ペプシンで分解すればF(ab’)2がそれぞれ得られる。
また、マウスVHおよびVLをコードするDNAを適当なリンカー、例えば1〜40アミノ酸、好ましくは3〜30アミノ酸、より好ましくは5〜20アミノ酸からなるペプチド（例：[Ser-(Gly)m]nもしくは[(Gly)m-Ser]n（mは0〜10の整数、nは1〜5の整数）等）をコードするDNAを介して連結することによりscFvとすることができ、さらにCH3をコードするDNAを適当なリンカーを介して連結することによりminidodyモノマーとしたり、CH全長をコードするDNAを適当なリンカーを介して連結することによりscFv-Fcとすることもできる。このような遺伝子工学的に修飾（共役）された抗体分子をコードするDNAは、適当なプロモーターの制御下におくことにより大腸菌や酵母などの微生物で発現させることができ、大量に抗体分子を生産することができる。
マウスVHおよびVLをコードするDNAを1つのプロモーターの下流にタンデムに挿入して大腸菌に導入すると、モノシストロニックな遺伝子発現によりFvと呼ばれる二量体を形成する。また、分子モデリングを用いてVHおよびVLのフレームワーク領域（FR）中の適当なアミノ酸をCysに置換すると、両鎖の分子間ジスルフィド結合によりdsFvと呼ばれる二量体が形成される。
（ii）ヒト化抗体
本明細書において「ヒト化抗体」とは、可変領域に存在する相補性決定領域（CDR）以外のすべての領域（即ち、定常領域および可変領域中のFR）の配列がヒト由来であり、CDRの配列のみが他の哺乳動物種由来である抗体を意味する。他の哺乳動物種としては、例えばマウス等の容易にハイブリドーマを作製することができる動物種が好ましい。
ヒト化抗体の作製法としては、例えば米国特許第5,225,539号、第5,585,089号、第5,693,761号および第5,693,762号に記載される方法あるいはそれらを一部改変した方法などが挙げられる。具体的には、上記キメラ抗体の場合と同様にして、ヒト以外の哺乳動物種（例：マウス）由来のVHおよびVLをコードするDNAを単離した後、常法により自動DNAシークエンサー（例：Applied Biosystems社製等）を用いてシークエンスを行い、得られる塩基配列もしくはそこから推定されるアミノ酸配列を公知の抗体配列データベース［例えば、Kabat database (Kabatら,「Sequences of Proteins of Immunological Interest」，US Department of Health and Human Services, Public Health Service, NIH編, 第5版, 1991参照) 等］を用いて解析し、両鎖のCDRおよびFRを決定する。決定されたFR配列に類似したFR配列を有するヒト抗体のＬ鎖およびＨ鎖をコードする塩基配列［例：ヒトκ型Ｌ鎖サブグループIおよびヒトＨ鎖サブグループIIもしくはIII（Kabatら，1991（上述）を参照）］のCDRコード領域を、決定された異種CDRをコードする塩基配列で置換した塩基配列を設計し、該塩基配列を20〜40塩基程度のフラグメントに区分し、さらに該塩基配列に相補的な配列を、前記フラグメントと交互にオーバーラップするように20〜40塩基程度のフラグメントに区分する。各フラグメントをDNAシンセサイザーを用いて合成し、常法に従ってこれらをハイブリダイズおよびライゲートさせることにより、ヒト由来のFRと他の哺乳動物種由来のCDRを有するVHおよびVLをコードするDNAを構築することができる。より迅速かつ効率的に他の哺乳動物種由来CDRをヒト由来VHおよびVLに移植するには、PCRによる部位特異的変異誘発を用いることが好ましい。そのような方法としては、例えば特開平5-227970号公報に記載の逐次CDR移植法等が挙げられる。このようにして得られるVHおよびVLをコードするDNAを、上記キメラ抗体の場合と同様の方法でヒト由来のCHおよびCLをコードするDNAとそれぞれ連結して適当な宿主細胞に導入することにより、ヒト化抗体を産生する細胞あるいはトランスジェニック動植物を得ることができる。
ヒト化抗体もキメラ抗体と同様に遺伝子工学的手法を用いてscFv、scFv-Fc、minibody、dsFv、Fvなどに改変することができ、適当なプロモーターを用いることで大腸菌や酵母などの微生物でも生産させることができる。
ヒト化抗体作製技術は、例えばハイブリドーマの作製技術が確立していない他の動物種に好ましく投与し得るモノクローナル抗体を作製するのにも応用することができる。例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリなどの家畜（家禽）として広く繁殖されている動物やイヌやネコなどのペット動物などが対象として挙げられる。
（iii）ヒト抗体産生動物を用いた完全ヒト抗体の作製
内因性免疫グロブリン（Ig）遺伝子をノックアウト（KO）した非ヒト温血動物に機能的なヒトIg遺伝子を導入し、これを抗原で免疫すれば、該動物由来の抗体の代わりにヒト抗体が産生される。従って、マウス等のようにハイブリドーマ作製技術が確立している動物を用いれば、従来のマウスモノクローナル抗体の作製と同様の方法によって完全ヒトモノクローナル抗体を取得することが可能となる。まず、ヒトIgのＨ鎖およびＬ鎖のミニ遺伝子を通常のトランスジェニック（Tg）技術を用いて導入したマウスと、内因性マウスIg遺伝子を通常のKO技術を用いて不活性化したマウスとを交配して得られたヒト抗体産生マウス（Immunol. Today, 17: 391-397, 1996を参照）を用いて作製されたヒトモノクローナル抗体のいくつかは既に臨床段階にあり、現在までのところ抗ヒトIgヒト抗体（HAHA）の産生は報告されていない。
その後、Abgenix社［商品名：XenoMouose（Nat. Genet., 15: 146-156, 1997; 米国特許第5,939,598号等を参照）］やMedarex社［商品名：Hu-Mab Mouse（Nat. Biotechnol., 14: 845-851, 1996; 米国特許第5,545,806号等を参照）］が酵母人工染色体（YAC）ベクターを用いてより大きなヒトIg遺伝子を導入したTgマウスを作製し、よりレパートリーに富んだヒト抗体を産生し得るようになった。しかしながら、ヒトIg遺伝子は、例えばＨ鎖の場合、約80種のＶ断片、約30種のＤ断片および6種のＪ断片が様々に組み合わされたVDJエクソンが抗原結合部位をコードすることによりその多様性を実現しているため、その全長はＨ鎖が約1.5Mb（14番染色体）、κＬ鎖が約2Mb（2番染色体）、λＬ鎖が約1Mb（22番染色体）に達する。ヒトにおけるのと同様の多様な抗体レパートリーを他の動物種で再現するためには、各Ig遺伝子の全長を導入することが望ましいが、従来の遺伝子導入ベクター（プラスミド、コスミド、BAC、YAC等）に挿入可能なDNAは通常数kb〜数百kbであり、クローニングしたDNAを受精卵に注入する従来のトランスジェニック動物作製技術では全長の導入は困難であった。
Tomizukaら（Nat. Genet., 16: 133-143, 1997）は、Ig遺伝子を担持するヒト染色体の自然断片（hCF）をマウスに導入して（染色体導入（TC）マウス）、完全長ヒトIg遺伝子を有するマウスを作製した。即ち、まず、Ｈ鎖遺伝子を含む14番染色体およびκＬ鎖遺伝子を含む2番染色体を例えば薬剤耐性マーカー等で標識したヒト染色体を有するヒト−マウスハイブリッド細胞を48時間程度紡錘糸形成阻害剤（例：コルセミド）で処理して、１〜数本の染色体もしくはその断片が核膜に被包されたミクロセルを調製し、微小核融合法によりマウスES細胞に染色体を導入する。薬剤を含む培地を用いてヒトIg遺伝子を有する染色体もしくはその断片を保持するハイブリッドES細胞を選択し、通常のKOマウス作製の場合と同様の方法によりマウス胚へ顕微注入する。得られるキメラマウスからコートカラーを指標にする等して生殖系列キメラを選択し、ヒト14番染色体断片を伝達するTCマウス系統（TC(hCF14)）およびヒト2番染色体断片を伝達するTCマウス系統（TC(hCF2)）を樹立する。常法により内因性Ｈ鎖遺伝子およびκＬ鎖遺伝子をKOされたマウス（KO(IgH)およびKO(Igκ)）を作製し、これら4系統の交配を繰り返すことにより、４種の遺伝子改変をすべて有するマウス系統（ダブルTC/KO）を樹立することができる。
上記のようにして作製されるダブルTC/KOマウスに、通常のマウスモノクローナル抗体を作製する場合と同様の方法を適用すれば、抗原特異的ヒトモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作製することができる。しかしながら、κＬ鎖遺伝子を含むhCF2がマウス細胞内で不安定なため、ハイブリドーマ取得効率は通常のマウスの場合に比べて低いという欠点がある。
一方、前記Hu-Mab MouseはκＬ鎖遺伝子の約50%を含むが、可変領域クラスターが倍加した構造を有するため完全長を含む場合と同等のκ鎖の多様性を示し（他方、Ｈ鎖遺伝子は約10%しか含まないのでＨ鎖の多様性は低く、抗原に対する応答性が不十分である）、且つYACベクター（Igκ-YAC）によりマウス染色体中に挿入されているので、マウス細胞内で安定に保持される。この利点を生かし、TC(hCF14)マウスとHu-Mab Mouseとを交配してhCF14とIgκ-YACとを安定に保持するマウス（商品名：KMマウス）を作製することにより、通常のマウスと同等のハイブリドーマ取得効率および抗体の抗原親和性を得ることができる。
さらに、より完全にヒトにおける多様な抗体レパートリーを再現するために、λＬ鎖遺伝子をさらに導入したヒト抗体産生動物を作製することもできる。かかる動物は、上記と同様の方法でλＬ鎖遺伝子を担持するヒト22番染色体もしくはその断片を導入したTCマウス（TC(hCF22)）を作製し、これと上記ダブルTC/KOマウスやKMマウスとを交配することにより得ることもできるし、あるいは、例えばＨ鎖遺伝子座とλＬ鎖遺伝子座とを含むヒト人工染色体（HAC）を構築してマウス細胞に導入することにより得ることもできる（Nat. Biotechnol., 18: 1086-1090, 2000）。
本発明の抗体を医薬品として利用する場合はモノクローナル抗体であることが望ましいが、ポリクローナル抗体であってもよい。本発明の抗体がポリクローナル抗体である場合には、ハイブリドーマの利用を要しないので、ハイブリドーマ作製技術は確立されていないがトランスジェニック技術は確立されている動物種、好ましくはウシ等の有蹄動物を用いて、上記と同様の方法によりヒト抗体産生動物を作製すれば、より大量のヒト抗体を安価に製造することも可能である（例えば、Nat. Biotechnol., 20: 889-894, 2002参照）。得られるヒトポリクローナル抗体は、ヒト抗体産生動物の血液、腹水、乳汁、卵など、好ましくは乳汁、卵を採取し、上記と同様の精製技術を組み合わせることによって精製することができる。
（iv）ファージディスプレイヒト抗体ライブラリーを用いた完全ヒト抗体の作製
完全ヒト抗体を作製するもう１つのアプローチはファージディスプレイを用いる方法である。この方法はPCRによる変異がCDR以外に導入される場合があり、そのため臨床段階で少数のHAHA産生の報告例があるが、その一方で宿主動物に由来する異種間ウイルス感染の危険性がない点や抗体の特異性が無限である（禁止クローンや糖鎖などに対する抗体も容易に作製可能）等の利点を有している。
ファージディスプレイヒト抗体ライブラリーの作製方法としては、例えば、以下のものが挙げられるが、これに限定されない。
用いられるファージは特に限定されないが、通常繊維状ファージ（Ffバクテリオファージ）が好ましく用いられる。ファージ表面に外来タンパク質を提示する方法としては、g3p、g6p〜g9pのコートタンパク質のいずれかとの融合タンパク質として該コートタンパク質上で発現・提示させる方法が挙げられるが、よく用いられるのはg3pもしくはg8pのＮ末端側に融合させる方法である。ファージディスプレイベクターとしては、1)ファージゲノムのコートタンパク質遺伝子に外来遺伝子を融合した形で導入して、ファージ表面上に提示されるコートタンパク質をすべて外来タンパク質との融合タンパク質として提示させるものの他、2)融合タンパク質をコードする遺伝子を野生型コートタンパク質遺伝子とは別に挿入して、融合タンパク質と野生型コートタンパク質とを同時に発現させるものや、3)融合タンパク質をコードする遺伝子を有するファージミドベクターを持つ大腸菌に野生型コートタンパク質遺伝子を有するヘルパーファージを感染させて融合タンパク質と野生型コートタンパク質とを同時に発現するファージ粒子を産生させるものなどが挙げられるが、1)の場合は大きな外来タンパク質を融合させると感染能力が失われるため、抗体ライブラリーの作製のためには2)または3)のタイプが用いられる。
具体的なベクターとしては、Holtら（Curr. Opin. Biotechnol., 11: 445-449, 2000）に記載されるものが例示される。例えば、pCES1（J. Biol. Chem., 274: 18218-18230, 1999参照）は、1つのラクトースプロモーターの制御下にg3pのシグナルペプチドの下流にκＬ鎖定常領域をコードするDNAとg3pシグナルペプチドの下流にCH3をコードするDNA、His-tag、c-myc tag、アンバー終止コドン(TAG)を介してg3pコード配列とが配置されたFab発現型ファージミドベクターである。アンバー変異を有する大腸菌に導入するとg3pコートタンパク質上にFabを提示するが、アンバー変異を持たないHB2151株などで発現させると可溶性Fab抗体を産生する。また、scFv発現型ファージミドベクターとしては、例えばpHEN1（J. Mol. Biol., 222:581-597, 1991）等が用いられる。
一方、ヘルパーファージとしては、例えばM13-KO7、VCSM13等が挙げられる。
また、別のファージディスプレイベクターとして、抗体遺伝子の３’末端とコートタンパク質遺伝子の５’末端にそれぞれシステインをコードするコドンを含む配列を連結し、両遺伝子を同時に別個に（融合タンパク質としてではなく）発現させて、導入されたシステイン残基同士によるS-S結合を介してファージ表面のコートタンパク質上に抗体を提示し得るようにデザインされたもの（Morphosys社のCysDisplayTM技術）等も挙げられる。
ヒト抗体ライブラリーの種類としては、ナイーブ／非免疫ライブラリー、合成ライブラリー、免疫ライブラリー等が挙げられる。
ナイーブ／非免疫（non-immunized）ライブラリーは、正常なヒトが保有するVHおよびVL遺伝子をRT-PCRにより取得し、それらをランダムに上記のファージディスプレイベクターにクローニングして得られるライブラリーである。通常、正常人の末梢血、骨髄、扁桃腺などのリンパ球由来のmRNA等が鋳型として用いられる。疾病履歴などのＶ遺伝子のバイアスをなくすため、抗原感作によるクラススイッチが起こっていないIgM由来のmRNAのみを増幅したものを特にナイーブライブラリーと呼んでいる。代表的なものとしては、CAT社のライブラリー（J. Mol. Biol., 222: 581-597, 1991; Nat. Biotechnol., 14: 309-314, 1996参照）、MRC社のライブラリー（Annu. Rev. Immunol., 12: 433-455, 1994参照）、Dyax社のライブラリー（J. Biol. Chem., 1999 (上述); Proc. Natl. Acad. Sci. USA，14: 7969-7974, 2000参照）等が挙げられる。
合成ライブラリーは、ヒトＢ細胞内の機能的な特定の抗体遺伝子を選び、Ｖ遺伝子断片の、例えばCDR3等の抗原結合領域の部分を適当な長さのランダムなアミノ酸配列をコードするDNAで置換し、ライブラリー化したものである。最初から機能的なscFvやFabを産生するVHおよびVL遺伝子の組み合わせでライブライリーを構築できるので、抗体の発現効率や安定性に優れているとされる。代表的なものとしては、Morphosys社のHuCALライブラリー（J．Mol. Biol., 296: 57-86, 2000参照）、BioInvent社のライブラリー（Nat. Biotechnol., 18: 852, 2000参照）、Crucell社のライブラリー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 3938, 1995; J. Immunol. Methods, 272: 219-233, 2003参照）等が挙げられる。
免疫（immunized）ライブラリーは、癌、自己免疫疾患、感染症等の患者やワクチン接種を受けた者など、標的抗原に対する血中抗体価が上昇したヒトから採取したリンパ球、あるいは上記体外免疫法により標的抗原を人為的に免疫したヒトリンパ球等から、上記ナイーブ／非免疫ライブラリーの場合と同様にしてmRNAを調製し、RT-PCR法によってVHおよびVL遺伝子を増幅し、ライブラリー化したものである。最初から目的の抗体遺伝子がライブラリー中に含まれるので、比較的小さなサイズのライブラリーからでも目的の抗体を得ることができる。
ライブラリーの多様性は大きいほどよいが、現実的には、以下のパンニング操作で取り扱えるファージ数（1011〜1013ファージ）と通常のパンニングでクローンの単離および増幅に必要なファージ数（100〜1,000ファージ／クローン）を考慮すれば、108〜1011クローン程度が適当であり、約108クローンのライブラリーで通常10-9オーダーのKd値を有する抗体をスクリーニングすることができる。
標的抗原に対する抗体をファージディスプレイ法で選別する工程をパンニングという。具体的には、例えば、抗原を固定化した担体とファージライブラリーとを接触させ、非結合ファージを洗浄除去した後、結合したファージを担体から溶出させ、大腸菌に感染させて該ファージを増殖させる、という一連の操作を3〜5回程度繰り返すことにより抗原特異的な抗体を提示するファージを濃縮する。抗原を固定化する担体としては、通常の抗原抗体反応やアフィニティークロマトグラフィーで用いられる各種担体、例えばアガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス、金属などからなるマイクロプレート、チューブ、メンブレン、カラム、ビーズなど、さらには表面プラズモン共鳴（SPR）のセンサーチップなどが挙げられる。抗原の固定化には物理的吸着を用いてもよく、また、通常タンパク質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。例えばビオチン−（ストレプト）アビジン系等が好ましく用いられる。標的抗原である内因性リガンドがペプチドなどの小分子である場合には、抗原決定基として用いた部分が担体との結合により被覆されないように特に注意する必要がある。非結合ファージの洗浄には、BSA溶液などのブロッキング液（1-2回）、Tween等の界面活性剤を含むPBS（3-5回）などを順次用いることができる。クエン酸緩衝液（pH5）などの使用が好ましいとの報告もある。特異的ファージの溶出には、通常酸（例：0.1M塩酸など）が用いられるが、特異的プロテアーゼによる切断（例えば、抗体遺伝子とコートタンパク質遺伝子との連結部にトリプシン切断部位をコードする遺伝子配列を導入することができる。この場合、溶出するファージ表面には野生型コートタンパク質が提示されるので、コートタンパク質のすべてが融合タンパク質として発現しても大腸菌への感染・増殖が可能となる）や可溶性抗原による競合的溶出、あるいはS-S結合の還元（例えば、前記したCysDisplayTMでは、パンニングの後、適当な還元剤を用いて抗体とコートタンパク質とを解離させることにより抗原特異的ファージを回収することができる）による溶出も可能である。酸で溶出した場合は、トリスなどで中和した後で溶出ファージを大腸菌に感染させ、培養後、常法によりファージを回収する。
パンニングにより抗原特異的抗体を提示するファージが濃縮されると、これらを大腸菌に感染させた後プレート上に播種してクローニングを行う。再度ファージを回収し、上述の抗体価測定法（例：ELISA、RIA、FIA等）やFACSあるいはSPRを利用した測定により抗原結合活性を確認する。
選択された抗原特異的抗体を提示するファージクローンからの抗体の単離・精製は、例えば、ファージディスプレイベクターとして抗体遺伝子とコートタンパク質遺伝子の連結部にアンバー終止コドンが導入されたベクターを用いる場合には、該ファージをアンバー変異を持たない大腸菌（例：HB2151株）に感染させると、可溶性抗体分子が産生されペリプラズムもしくは培地中に分泌されるので、細胞壁をリゾチームなどで溶解して細胞外画分を回収し、上記と同様の精製技術を用いて行うことができる。His-tagやc-myc tagを導入しておけば、IMACや抗c-myc抗体カラムなどを用いて容易に精製することができる。また、パンニングの際に特異的プロテアーゼによる切断を利用する場合には、該プロテアーゼを作用させると抗体分子がファージ表面から分離されるので、同様の精製操作を実施することにより目的の抗体を精製することができる。
ヒト抗体産生動物およびファージディスプレイヒト抗体ライブラリーを用いた完全ヒト抗体作製技術は、他の動物種のモノクローナル抗体を作製するのにも応用することができる。例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリなどの家畜（家禽）として広く繁殖されている動物やイヌやネコなどのペット動物などが対象として挙げられる。非ヒト動物においては標的抗原の人為的免疫に対する倫理的問題が少ないので、免疫ライブラリーの利用がより有効である。
[ポリクローナル抗体の作製]
EDG2もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対するポリクローナル抗体は、自体公知の方法に従って製造することができる。例えば、免疫抗原 (EDG2s) 自体、あるいはそれとキャリアー蛋白質との複合体を作製し、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様にして温血動物に免疫を行い、該免疫動物から抗EDG2抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行うことにより製造することができる。
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリアー蛋白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率よくできれば、どのようなものをどのような比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン1に対し、約0.1〜20、好ましくは約1〜5の割合でカプリングさせる方法が用いられる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤、例えばグルタルアルデヒドやカルボジイミド, マレイミド活性エステル, チオール基, ジチオビリジル基を含む活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約2〜6週毎に1回ずつ、計約3〜10回程度行われる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、腹水、母乳など、鳥類の場合は血液、卵などから採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行うことができる。
EDG2の部分ペプチドまたはその塩を抗原として用いる場合、そのEDG2上の位置は特に限定されないが、例えば、各種温血動物間でよく保存された領域の部分アミノ酸配列を含むポリペプチドもしくはオリゴペプチドまたはその塩が用いられる。
上記した(i) EDG2s、(ii) EDG2またはその部分ペプチドをコードする核酸 (好ましくは、DNA)、(iii) 抗EDG2抗体、(iv) アンチセンスEDG2、(v) EDG2 DNMまたは本発明の阻害ペプチド、更には(vi) EDG2アンタゴニストは、例えば以下の用途を有する。
後記実施例において示される通り、EDG2遺伝子は、関節組織、特に滑膜で高発現しており、OA滑膜において発現が上昇する。また、OA滑膜では、LPA刺激により一過的に炎症性サイトカインの発現が上昇し、それに引き続いて軟骨基質分解酵素群の発現が上昇するが、EDG2に対するsiRNAの添加によりそれらの発現上昇が抑制される。これらの事実は、EDG2の発現もしくは活性を抑制し得る物質が、関節における炎症性サイトカイン発現および／または関節破壊（例、関節軟骨破壊）を抑制し、骨・関節疾患、特に軟骨基質の変性・産生異常や、軟骨前駆細胞から軟骨細胞への分化異常が関連する疾患の予防・治療に有効であることを示すものである。ここで「関連する疾患」とは、それに起因するか、あるいは結果としてそのような状態を生じる疾患をいう。
さらに、EDG2遺伝子は脊髄でも高発現しており、ドミナントなLPA受容体である。後述するEDG2遺伝子におけるOA感受性多型i-EDG2-09は、感受性アレルでEDG2プロモーターの転写活性が上昇しているが、該多型は膝疼痛を訴える症候性OAと有意に相関する。これらの事実は、EDG2の発現もしくは活性を抑制し得る物質が、関節破壊（例、関節軟骨破壊）を抑制するだけでなく、OA患者の主訴である痛みを軽減する作用を有し、疼痛を伴う骨・関節疾患の予防・治療に有効であることを示すものである。
〔1〕 関節における炎症性サイトカイン発現・関節破壊（例、関節軟骨破壊）・骨・関節疾患における疼痛の抑制剤
上記のように、EDG2は、滑膜細胞での炎症性サイトカインの発現上昇を惹起することにより、軟骨基質分解酵素の発現を増加させて関節軟骨の破壊を促進するとともに、LPAからのシグナルを伝達することにより、骨・関節疾患における疼痛を誘導すると考えられるので、生体内においてEDG2またはそれをコードする核酸 (例: 遺伝子, mRNA等) に異常がある (高活性変異体の出現) 場合、あるいはその発現量が異常に増加している場合、さらには他の何らかの要因で関節における炎症性サイトカインの発現上昇が起こり、また軟骨基質の分解が異常亢進している場合、あるいは骨・関節疾患において疼痛の症状が現れている場合に、a) (i) アンチセンスEDG2を患者に投与して標的細胞内に導入し (および発現させ) たり、あるいは(ii) 単離した標的細胞にアンチセンスEDG2を導入し発現させた後に、該細胞を該患者に移植したり、b) 抗EDG2抗体を患者に投与してEDG2を不活性化 (中和) したり、c) EDG2アンタゴニストを患者に投与してEDG2の作用を遮断したり、d) EDG2 DNMもしくは本発明の阻害ペプチドを患者に投与してEDG2の作用を遮断したり、e) EDG2 DNMもしくは本発明の阻害ペプチドをコードする核酸を上記アンチセンスEDG2と同様にin vivoもしくはex vivoに患者に導入・発現させることなどによって、患者の体内におけるEDG2の量および／または活性を低減させ、炎症性サイトカインの発現および/または関節破壊（例、関節軟骨破壊）を抑制し、疼痛を軽減して、軟骨基質の異常などを基盤とする疾患、疼痛を伴う骨・関節疾患などを予防・治療することができる。
したがって、a)アンチセンスEDG2 、b) 抗EDG2抗体、c) EDG2アンタゴニスト、d) EDG2 DNMもしくは本発明の阻害ペプチド、またはe) EDG2 DNMもしくは本発明の阻害ペプチドをコードする核酸を、上記のような疾患、例えば、変形性関節症、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症、スポーツによる関節障害、先天性骨系統疾患 (例: 軟骨無形成症, 多発性骨端異形成症, 脊椎骨端異形成症, 骨幹端異形成症, Stickler症候群, 偽性軟骨無形成症, 多発性外骨腫, 片側肥大, オリエール病, マフッチ症候群等)、骨軟骨腫、骨腫瘍、軟骨腫瘍などの疾患、好ましくは変形関節症 [例: 股関節OA (HOA), 膝関節OA (KOA)]、より好ましくはKOAの予防・治療剤として使用することができる。
ここでEDG2アンタゴニストとは、EDG2のLBDに拮抗的に結合するが、EDG2の活性型と不活性型の平衡状態にほとんど又は全く影響を及ぼさない物質 (ニュートラルアンタゴニスト) と、EDG2の任意の部位に結合して、EDG2の活性型と不活性型の平衡状態をより不活性側にシフトさせる物質 (インバースアゴニスト) の両方を包含する意味で用いられる。EDG2アンタゴニストとしては、例えば、EP 1258484 A1に記載されるイソキサゾール誘導体 (好ましくは、Ki16425 (Mol. Pharmacol., 2003, 64(4): 994-1005参照) 等)、ジオクチルグリセロールピロホスフェート、ジオクチルホスファチジン酸 (Mol. Pharmacol., 2001, 60(4): 776-784)、Avanti Polar Lipids, Inc.から市販されるVPC32183、VPC32179、VPC12249などの公知のアンタゴニストの他、後述の本発明のスクリーニング法によって選択される物質も包含され得る。
抗EDG2抗体、EDG2アンタゴニスト、またはEDG2 DNMもしくは本発明の阻害ペプチドを上記予防・治療剤として使用する場合は、常套手段に従って製剤化することができる。一方、アンチセンスEDG2またはEDG2 DNMもしくは本発明の阻害ペプチドをコードする核酸を上記予防・治療剤として使用する場合は、該核酸を単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って製剤化することができる。該核酸は、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与することができる。
例えば、アンチセンスEDG2、抗EDG2抗体、EDG2アンタゴニスト、EDG2もしくは本発明の阻害ペプチドまたはEDG2 DNMもしくは本発明の阻害ペプチドをコードする核酸 (以下、包括的に「EDG2抑制薬」という場合がある)は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、EDG2抑制薬を、生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに、一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン, コーンスターチ, トラガント, アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ, ゼラチン, アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖, 乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント, アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油, 椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水, ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液 (例えば、D-ソルビトール, D-マンニトール, 塩化ナトリウムなど) などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール (例: エタノール), ポリアルコール (例: プロピレングリコール, ポリエチレングリコール), 非イオン性界面活性剤 (例: ポリソルベート80TM, HCO-50) などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油, 大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル, ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
また、上記予防・治療剤は、例えば、緩衝剤 (例えば、リン酸塩緩衝液, 酢酸ナトリウム緩衝液)、無痛化剤(例えば、塩化ベンザルコニウム, 塩酸プロカインなど), 安定剤 (例えば、ヒト血清アルブミン, ポリエチレングリコールなど)、保存剤(例えば、ベンジルアルコール, フェノールなど)、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや他の温血動物 (例えば、ラット, マウス, ハムスター, ウサギ, ヒツジ, ヤギ, ブタ, ウシ, ウマ, ネコ, イヌ, サル, チンパンジー, トリなど) に対して投与することができる。
EDG2抑制薬の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に、例えばOA患者 (60 kgとして) においては、一日につき約0.1〜100 mg、好ましくは約1.0〜50mg、より好ましくは約1.0〜20 mgである。非経口的に投与する場合は、その投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば注射剤の形では、通常、例えばOA患者 (60 kgとして) においては、一日につき約0.01〜30 mg程度、好ましくは約0.1〜20 mg程度、より好ましくは約0.1〜10 mg程度を投与するのが好都合である。他の動物の場合も、ヒト60 kg当たりに換算した量を投与することができる。
〔2〕 骨・関節疾患の予防・治療物質のスクリーニング
上記のように、EDG2の活性を抑制し得る物質は、関節における炎症性サイトカイン発現、関節破壊（例、関節軟骨破壊）を抑制し、疼痛を軽減するので、軟骨基質の異常などを基盤とする疾患、疼痛を伴う骨・関節疾患の予防・治療に有効である。従って、本発明は、EDG2sを用いてその活性の変動を測定することによる、骨・関節疾患の予防・治療物質のスクリーニング方法を提供する。具体的には、EDG2sを用いるか、または組換えEDG2の発現系を構築し、該発現系を用いたアフィニティーアッセイ系を用いることによって、EDG2とリガンドの結合性を低減させる物質を効率よくスクリーニングすることができる。
このような化合物には、(a) EDG2を介した細胞刺激活性 (例えば、共役GαにおけるGTP-GDP交換反応促進、細胞内cAMP産生阻害、イノシトールリン酸 (IP3) 産生促進、細胞内Ca2+取り込み促進、炎症性サイトカイン発現誘導、軟骨基質分解酵素発現誘導、発痛作用など) を遮断もしくは抑制する化合物 (アンタゴニスト)、(b) EDG2とリガンドとの結合力を減少させる化合物などが含まれる。
すなわち、本発明は、(i) EDG2とLPAとを接触させた場合と、(ii) EDG2と、LPAおよび試験化合物とを接触させた場合との比較を行なうことを特徴とする、EDG2とLPAとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
上記スクリーニング方法においては、(i) と (ii) の場合におけるEDG2に対するLPAの結合量、細胞刺激活性などを測定して、比較することを特徴とする。
より具体的には、本発明は、
(1) 標識したLPAをEDG2sに接触させた場合と、標識したLPAおよび試験化合物をEDG2sに接触させた場合における、標識したLPAのEDG2sに対する結合量を測定し、比較することを特徴とするEDG2とLPAとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
(2) 標識したLPAを、EDG2sを産生する細胞またはその膜画分に接触させた場合と、標識したLPAおよび試験化合物をEDG2sを産生する細胞またはその膜画分に接触させた場合における、標識したLPAの該細胞または膜画分に対する結合量を測定し、比較することを特徴とするEDG2とLPAとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
(3) 標識したLPAを、EDG2または本発明の活性ペプチドをコードするDNAを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したEDG2sに接触させた場合と、標識したLPAおよび試験化合物を、EDG2または本発明の活性ペプチドをコードするDNAを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したEDG2sに接触させた場合における、標識したLPAのEDG2sに対する結合量を測定し、比較することを特徴とするEDG2とLPAとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
(4) LPAを、EDG2sを細胞膜上に発現する細胞に接触させた場合と、LPAおよび試験化合物を、EDG2sを細胞膜上に発現する細胞に接触させた場合における、EDG2sを介した細胞刺激活性 (例えば、共役GαにおけるGTP-GDP交換反応促進、細胞内cAMP産生阻害、IP3産生促進、細胞内Ca2+取り込み促進、炎症性サイトカイン発現誘導、軟骨基質分解酵素発現誘導、発痛作用など) を測定し、比較することを特徴とするEDG2とLPAとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、および
(5) LPAを、EDG2または本発明の活性ペプチドをコードするDNAを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したEDG2sに接触させた場合と、LPAおよび試験化合物を、EDG2または本発明の活性ペプチドをコードするDNAを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したEDG2sに接触させた場合における、EDG2sを介した細胞刺激活性 (例えば、共役GαにおけるGTP-GDP交換反応促進、細胞内cAMP産生阻害、IP3産生促進、細胞内Ca2+取り込み促進、炎症性サイトカイン発現誘導、軟骨基質分解酵素発現誘導、発痛作用など) を測定し、比較することを特徴とするEDG2とLPAとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
尚、上記(1)〜(5)の方法において、LPAの代わりにEDG2アゴニスト (例えば、Avanti Polar Lipids, Inc.から市販されるVPC31143、VPC31144等) を用いることもできる。
以下に本発明のスクリーニング方法を具体的に説明する。
まず、本発明のスクリーニング方法に用いるEDG2としては、上記したEDG2sを含有するものであれば何れのものであってもよいが、EDG2を産生する哺乳動物の臓器の細胞膜画分が好適である。しかし、特にヒト由来の臓器は入手が困難なことから、スクリーニングに用いられるものとしては、組換え体を用いて大量発現させたヒト由来のEDG2sなどが適している。
EDG2sを製造するには、前述の方法が用いられるが、EDG2または本発明の活性ペプチドをコードするDNAを哺乳動物細胞や昆虫細胞で発現させることにより行なうことが好ましい。目的とする蛋白質部分をコードするDNA断片にはcDNAが用いられるが、必ずしもこれに制約されるものではない。例えば、遺伝子断片や合成DNAを用いてもよい。EDG2または本発明の活性ペプチドをコードするDNA断片を宿主動物 (昆虫) 細胞に導入し、それらを効率よく発現させるためには、該DNA断片を、SV40由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒトヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、SRαプロモーター、昆虫を宿主とするバキュロウイルスに属する核多角体病ウイルス(nuclear polyhedrosis virus; NPV) のポリヘドリンプロモーターなどの下流に組み込むのが好ましい。
したがって、本発明のスクリーニング方法において用いられるEDG2sは、それ自体公知の方法に従って精製したEDG2であってもよいし、EDG2sを産生する細胞またはその細胞膜画分として用いてもよい。
上記スクリーニング方法において、EDG2sを産生する細胞を用いる場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化してもよい。固定化方法はそれ自体公知の方法に従って行なうことができる。
EDG2sを産生する細胞とは、EDG2sを発現した宿主細胞をいうが、該宿主細胞としては、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが用いられる。
前記細胞膜画分としては、細胞を破砕した後、それ自体公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Potter−Elvehjem型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Kinematica社製）による破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（500rpm〜3000rpm）で短時間（通常、約1〜10分）遠心し、上清をさらに高速（15000rpm〜30000rpm）で通常30分〜2時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現したEDG2sと細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。
EDG2sを産生する細胞やその膜画分中のEDG2sの量は、１細胞あたり103〜108分子であるのが好ましく、105〜107分子であるのがより好適である。なお、発現量が多いほど膜画分当たりのLPA結合活性（比活性）が高くなり、高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、同一ロットで大量の試料を測定できるようになる。
EDG2とLPAとの結合性を変化させる化合物をスクリーニングする上記の(1)〜(3)を実施するためには、例えば、適当なEDG2s含有膜画分と標識したLPAが必要である。
EDG2s含有膜画分としては、天然型のEDG2含有膜画分か、またはそれと同等の活性を有する組換えEDG2s含有膜画分などが望ましい。ここで、同等の活性とは、同等のLPA結合活性、シグナル伝達作用などをいう。
標識したLPAとしては、常法に従って、例えば [3H]、[32P]、[125I]、[14C] などで標識されたものが用いられる。
具体的には、EDG2とLPAとの結合性を変化させる化合物のスクリーニングを行なうには、まずEDG2sを産生する細胞またはその膜画分を、スクリーニングに適したバッファーに懸濁することによりEDG2s標品を調製する。バッファーは、pH4〜10（望ましくはpH6〜8）のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどのEDG2sとLPAとの結合を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。また、非特異的結合を低減させる目的で、CHAPS、Tween-80TM（花王−アトラス社）、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性剤をバッファーに加えることもできる。さらに、プロテアーゼによるEDG2sの分解を抑える目的でPMSF、ロイペプチン、E-64（ペプチド研究所製）、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。0.01〜10mlのEDG2s懸濁液に、一定量（5,000cpm〜500,000cpm）の標識したLPAを添加し、同時に10-4M〜10-10Mの試験化合物を共存させる。非特異的結合量（NSB）を知るために大過剰の未標識のリガンドを加えた反応チューブも用意する。反応は約0〜約50℃、望ましくは約4〜約37℃で、約20分〜約24時間、望ましくは約30分〜約3時間行う。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンターまたはγ-カウンターで計測する。拮抗する物質がない場合のカウント (B0) から非特異的結合量（NSB）を引いたカウント（B0-NSB）を100％とした時、特異的結合量（B-NSB）が、例えば、50％以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
EDG2とLPAとの結合性を変化させる化合物をスクリーニングする上記の(4)〜(5)の方法を実施するためには、例えば、EDG2sを介する細胞刺激活性 (例えば、共役GαにおけるGTP-GDP交換反応促進、細胞内cAMP産生阻害、IP3産生促進、細胞内Ca2+取り込み促進、炎症性サイトカイン発現誘導、軟骨基質分解酵素発現誘導、発痛作用など) を公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定することができる。
具体的には、まず、EDG2sを産生する細胞をマルチウェルプレート等に培養する。スクリーニングを行なうにあたっては、前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、試験化合物などを添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質の生成が、細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアッセイを行なってもよい。また、cAMP産生抑制などの活性については、フォルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することができる。
細胞刺激活性を測定してスクリーニングを行なうには、EDG2sを膜上に発現した適当な細胞が必要である。EDG2sを発現した細胞としては、天然型のEDG2を産生する細胞株、前述の組換えEDG2sを発現した細胞株などが望ましい。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが用いられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
EDG2とLPAの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キットは、EDG2s、EDG2sを産生する細胞またはその膜画分などを含有するものである。
本発明のスクリーニング用キットの例としては、次のものが挙げられる。
１．スクリーニング用試薬
(1) 測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution（ギブコ社製）に、0.05％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたもの。
孔径0.45μmのフィルターで濾過滅菌し、4℃で保存するか、あるいは用時調製しても良い。
(2) EDG2s標品
EDG2sを発現させたCHO細胞を、12穴プレートに5×105個／穴で継代し、37℃、5％CO2、95％airで2日間培養したもの。
(3) 標識LPA
市販の [3H]、[32P]、[125I]、[14C] などで標識したLPA (アナログを含む)
水溶液の状態のものを4℃あるいは-20℃にて保存し、用時に測定用緩衝液にて1μMに希釈する。
(4) LPA標準液
LPA (アナログを含む) を0.1％ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を含むPBSで1mMとなるように溶解し、-20℃で保存する。
２．測定法
(1) 12穴組織培養用プレートにて培養したEDG2s発現CHO細胞を、測定用緩衝液1mlで2回洗浄した後、490μlの測定用緩衝液を各穴に加える。
(2) 10-3〜10-10Mの試験化合物溶液を5μl加えた後、標識LPAを5μl加え、室温にて1時間反応させる。非特異的結合量を知るためには試験化合物の代わりに10-3MのLPA標準液を5μl加えておく。
(3) 反応液を除去し、1mlの洗浄用緩衝液で3回洗浄する。細胞（またはプレート）に結合した標識LPAを0.2N NaOH-1％ SDSで溶解し、4mlの液体シンチレーターA（和光純薬製）と混合する。
(4) 液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）を用いて放射活性を測定し、Percent Maximum Binding（PMB）を次の式〔数１〕で求める。
〔数１〕
PMB=[(B-NSB)/(B0-NSB)]×100
PMB：Percent Maximum Binding
B ：検体を加えた時の値
NSB：Non-specific Binding（非特異的結合量）
B0 ：最大結合量
別の好ましい一実施態様においては、EDG2sを細胞膜上に発現する細胞はさらに共役するGαを発現する。EDG2とそれぞれ共役するGαのファミリーは、リガンドであるLPAを作用させた場合に、EDG2のシグナル伝達作用が活性化されるか否かを検定することにより、同定することができる。EDG2の共役Gαとしては、Gi/o、Gq/11等が知られている。好ましくは、EDG2sおよびその共役Gαを発現する細胞としては、EDG2または本発明の活性ペプチドをコードするDNAおよび該共役GαをコードするDNAをコトランスフェクトされた形質転換細胞が挙げられる。
LPAがEDG2sに結合すると、該受容体のGα活性化ドメイン (GAD) と共役Gαの受容体結合領域とが相互作用してGαのコンフォメーション変化を生じ、GTP/GDP結合領域からGDPが解離して速やかにGTPを結合する。Gα-GTPはエフェクターに作用してその活性を促進または抑制する。一方、アンタゴニストが結合すると、受容体のコンフォメーション変化が起こらずGα活性化ドメインは不活性化状態にあるので、活性化型のGα-GTPレベルが減少し、エフェクターへの作用が阻害される。ここで、GTPの代わりに、例えば、35S標識したGTPγS等のGαのGTPase活性によって加水分解を受けないGTPアナログを系に添加しておけば、試験化合物の存在下と非存在下での膜に結合した放射活性を測定・比較することにより、GαにおけるGDP-GTP交換反応に及ぼす試験化合物の効果を評価することができ、EDG2のアゴニスト／アンタゴニスト活性を有する物質をスクリーニングすることができる。即ち、試験化合物の存在下で放射活性が減少すれば、該試験化合物はEDG2に対するアンタゴニスト活性を有する。
別の好ましい一実施態様においては、EDG2sと共役Gαとの共発現系において、該Gαと相互作用するエフェクターの活性を、試験化合物の存在下及び非存在下で比較することを特徴とするスクリーニング方法が提供される。したがって、EDG2sおよびその共役Gαを発現する細胞はまた、該Gαからのシグナルを受容するエフェクターをさらに発現する。Gi/oファミリーに属するGαは、アデニル酸シクラーゼ (AC) をエフェクターとし、その活性を抑制する。Gq/11ファミリーに属するGαは、ホスホリパーゼＣ (PLC) βをエフェクターとし、その活性を促進する。
エフェクターとしてACを含むスクリーニング系においては、Gαのエフェクターへの作用は、AC活性を直接測定することにより評価することができる。AC活性の測定には公知のいかなる手法を用いてもよく、例えば、ACを含む膜画分にATPを添加し、生成するcAMP量を、抗cAMP抗体を用いてRI（例えば、125Ｉ）、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ等）、蛍光物質（例えば、FITC、ローダミン等）等で標識したcAMPとの競合イムノアッセイにより測定する方法や、ACを含む膜画分に［α-32P］ATPを添加し、生成する［32P］cAMPをアルミナカラム等で分離後、その放射活性を測定する方法等が挙げられるが、これに限定されない。共役GαがGi/oの場合は、試験化合物存在下でAC活性が増加すれば該試験化合物はEDG2に対するアンタゴニスト活性を有し、反対にAC活性が減少すれば、該試験化合物はEDG2に対するアゴニスト活性を有する。
スクリーニング系として無傷真核細胞を用いる場合は、GαのACへの作用は、細胞内のcAMP量を測定するか、あるいは細胞を［3H］アデニンで標識し、生成した［3H］cAMPの放射活性を測定することによっても評価することができる。細胞内cAMP量は、試験化合物の存在下及び非存在下で細胞を適当な時間インキュベートした後、細胞を破砕して得られる抽出液について、上記の競合イムノアッセイを実施することにより測定することができるが、公知の他のいかなる方法も使用することができる。
別の態様として、cAMP量をcAMP応答エレメント（CRE）の制御下にあるリポーター遺伝子の発現量を測定することにより評価する方法もある。即ち、CREを含むプロモーターの下流にリポーター蛋白質（例えば、ルシフェラーゼ、GFP、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等）をコードするDNAを連結した発現カセットを含むベクターを導入された真核細胞を、試験化合物の存在下及び非存在下で適当な時間培養し、細胞を破砕して得られた抽出液におけるリポーター遺伝子の発現を公知の手法を用いて測定・比較することにより、細胞内cAMP量を評価するというものである。
従って、共役GαがGi/oの場合、試験化合物の存在下で細胞内cAMP量（もしくはCRE制御下にあるリポーター遺伝子の発現量）が増加すれば、該試験化合物はEDG2に対するアンタゴニスト活性を有し、反対にcAMP量（もしくはリポーター遺伝子の発現量）が減少すれば、該試験化合物はEDG2に対するアゴニスト活性を有する。
一方、エフェクターとしてPLCβを含むスクリーニング系（即ち、共役GαポリペプチドがGq/11の場合）においては、Gαのエフェクターへの作用は、PLCβ活性を直接測定することにより評価することができる。PLCβ活性は、例えば、［3H］標識したホスファチジルイノシトール-4,5-二リン酸 (PIP) をPLCβ含有膜画分に添加し、生成するイノシトールリン酸 (IP3) 量を、公知の手法を用いて測定することにより評価することができる。試験化合物の存在下及び非存在下でPLCβ活性を測定・比較し、試験化合物存在下でPLCβ活性が増加すれば、該試験化合物はEDG2に対するアゴニスト活性を有し、反対にPLCβ活性が減少すれば、該試験化合物はEDG2に対するアンタゴニスト活性を有する。
スクリーニング系として無傷真核細胞を用いる場合は、GαのPLCβへの作用は、細胞に［3H］標識イノシトールを添加し、生成した［3H］標識IP3の放射活性を測定したり、細胞内のCa2+量を測定することによっても評価することができる。細胞内Ca2+量は、試験化合物の存在下及び非存在下で細胞を適当な時間インキュベートした後、蛍光プローブ（fura-2、indo-1、fluor-3、Calcium-Green I等）を用いて分光学的に測定するか、カルシウム感受性発光蛋白質であるエクオリン等を用いて測定することができるが、公知の他のいかなる方法を使用してもよい。蛍光プローブを用いた分光学的測定に適した装置として、FLIPR（Molecular Devices社）システムが挙げられる。
別の態様として、Ca2+によりアップレギュレートされるTPA（12-O-テトラデカノイルホルボール-13-アセテート）応答エレメント（TRE）の制御下にあるリポーター遺伝子の発現量を測定することによりCa2+量を評価する方法もある。即ち、TREを含むプロモーターの下流にリポーター蛋白質（例えば、ルシフェラーゼ、GFP、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等）をコードするDNAを連結した発現カセットを含むベクターを導入された真核細胞を、試験化合物の存在下及び非存在下で適当な時間培養し、細胞を破砕して得られた抽出液におけるリポーター遺伝子の発現を公知の手法を用いて測定・比較することにより、細胞内Ca2+量を評価するというものである。
従って、試験化合物の存在下で細胞内Ca2+量（もしくはTRE制御下にあるリポーター遺伝子の発現量）が増加すれば、該試験化合物はEDG2に対するアゴニスト活性を有し、反対に細胞内Ca2+量（もしくはリポーター遺伝子の発現量）が減少すれば、該試験化合物はEDG2に対するアンタゴニスト活性を有する。
Gi/oポリペプチドのACと相互作用する領域（C末端の約5アミノ酸程度）をGq/11の配列に置換したキメラGαを真核細胞で発現させることにより、EDG2の共役Gαにかかわらず、エフェクターとしてPLCβを用いて、EDG2のアゴニスト／アンタゴニストをスクリーニングすることができる。
別の好ましい一実施態様においては、例えば、WO 03/055507に記載されるようにして、EDG2のC末端側に共役Gαを連結した融合蛋白質を、哺乳動物細胞や昆虫細胞などの宿主真核細胞で発現させることにより、EDG2を恒常的に活性化することができる。この場合、LPAなどのリガンドを用いることなく、アゴニスト、インバースアゴニストをスクリーニングすることが可能である。
また、別の好ましい一実施態様においては、宿主細胞として酵母（例えば、パン酵母など）が用いられる。酵母は唯一のGPCRとして接合フェロモンα因子の受容体であるSTE2を有する。リガンドの刺激を受けると、STE2は共役GαであるGPA1を活性化してGβ/Gγと解離する。解離したGβ/GγからのキナーゼカスケードシグナルによりFUS1の発現が誘導され、接合が起こる。ここでSTE2を破壊して、代わりにEDG2を酵母で発現させ、さらにGPA1プロモーターの制御下にEDG2の共役Gαを共発現させれば、LPAの刺激によりEDG2があたかもSTE2と同様に細胞内シグナル伝達を媒介する。ここでGPA1プロモーターの制御下にEDG2と共役するGαを共発現させ、さらにFUS1に栄養要求性変異を相補する遺伝子やレポーター遺伝子（例えば、LacZ）などを融合させれば、容易にシグナルの活性化を検出することができる。この方法の詳細については、例えば、Yeast, 16: 11-22 (2000)等に記載されている。
上記スクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、EDG2とLPAとの結合性を変化させる作用を有する化合物であり、具体的には、（a）LPA−EDG2相互作用を介して細胞刺激活性 (例えば、共役GαにおけるGTP-GDP交換反応促進、細胞内cAMP産生阻害、IP3産生促進、細胞内Ca2+取り込み促進、炎症性サイトカイン発現誘導、軟骨基質分解酵素発現誘導、発痛作用など) を有する化合物（アゴニスト）、（b）該細胞刺激活性を有しない化合物（アンタゴニスト）、（c）EDG2とLPAとの結合力を増強する化合物、あるいは（d）EDG2とLPAとの結合力を減少させる化合物である。
EDG2に対するアンタゴニストは、EDG2に対するLPAが有する生理活性を抑制することができるので、LPA活性を抑制する安全で低毒性な医薬として有用である。また、EDG2とLPAとの結合力を減少させる化合物は、EDG2に対するLPAが有する生理活性を減少させるための安全で低毒性な医薬として有用である。したがって、これらの化合物は、関節における炎症性サイトカインの発現、それにより惹起され得る関節破壊（例、関節軟骨破壊）、あるいは骨・関節疾患における疼痛の抑制薬として用いることができ、軟骨基質異常を生じる骨・関節疾患、疼痛を伴う症候性の骨・関節疾患、例えば、変形性関節症、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症、スポーツによる関節障害、先天性骨系統疾患 (例: 軟骨無形成症, 多発性骨端異形成症, 脊椎骨端異形成症, 骨幹端異形成症, Stickler症候群, 偽性軟骨無形成症, 多発性外骨腫, 片側肥大, オリエール病, マフッチ症候群等)、骨軟骨腫、骨腫瘍、軟骨腫瘍などの疾患、好ましくは変形関節症 [例: 股関節OA (HOA), 膝関節OA (KOA)]、より好ましくはKOAの予防・治療薬として有用である。
一方、EDG2に対するアゴニストは、EDG2に対するLPAが有する生理活性と同様の作用を有しているので、LPA活性を増強する安全で低毒性な医薬として有用である。また、EDG2とLPAとの結合力を増強する化合物は、EDG2に対するLPAが有する生理活性を増強するための安全で低毒性な医薬として有用である。これらの化合物は、例えば、統合失調症 (精神分裂病)、肥満症等の予防・治療薬として有用である。
また、上記スクリーニング方法における細胞刺激活性の測定は、スクリーニングの目的に応じて、より直接的なEDG2の活性を評価することによっても行うことができる。
例えば、上述の通り、EDG2はLPA刺激を受けて、滑膜細胞において炎症性サイトカイン (例えば、TNFα、IL-1b、IL-6等) や軟骨基質分解酵素 (例えば、MMP-1、MMP-3、MMP-13などのコラゲナーゼ等)の発現を誘導する。したがって、EDG2を強制発現させた滑膜細胞をLPA存在下で培養した場合と、LPAおよび試験化合物の存在下で培養した場合とで、上記いずれかの遺伝子発現を比較することにより、EDG2の炎症性サイトカイン発現誘導および／または関節破壊（例、関節軟骨破壊）作用を抑制する物質をスクリーニングすることができる。
試験化合物の存在下で該遺伝子 (群) の発現が低下した場合には、該試験化合物をEDG2の該活性を抑制する物質として、それぞれ選択することができる。
また、上述の通り、EDG2は骨・関節疾患における疼痛 (例えば、OAにおける関節痛、特にKOAにおける膝疼痛) に関与する。したがって、例えば、EDG2を過剰発現させた実験動物 (例えば、EDG2トランスジェニックマウス、ラット等) に対して、試験化合物投与群と非投与群とでそれぞれvon Frey test等の疼痛試験を実施し、試験化合物投与群において有意な鎮痛効果が認められた場合に、該化合物を骨・関節疾患における疼痛を抑制する物質として選択することができる。
上記のようにして得られたEDG2の活性を抑制する物質 (EDG2活性抑制薬) を上記骨・関節疾患予防・治療剤として使用する場合は、EDG2アンタゴニスト等について前記したと同様の方法により製剤化することができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや他の温血動物 (例えば、ラット, マウス, ハムスター, ウサギ, ヒツジ, ヤギ, ブタ, ウシ, ウマ, ネコ, イヌ, サル, チンパンジー, トリなど) に対して投与することができる。
EDG2活性抑制薬の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に、例えばOA患者 (60 kgとして) においては、一日につき約0.1〜100 mg、好ましくは約1.0〜50 mg、より好ましくは約1.0〜20 mgである。非経口的に投与する場合は、その1回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば注射剤の形では、通常、例えばOA患者 (60 kgとして) においては、一日につき約0.01〜30 mg程度、好ましくは約0.1〜20 mg程度、より好ましくは約0.1〜10 mg程度を投与するのが好都合である。他の動物の場合も、ヒト60 kg当たりに換算した量を投与することができる。
上述のように、EDG2の発現を抑制する物質もまた、関節における炎症性サイトカイン発現、関節破壊（例、関節軟骨破壊）、骨・関節疾患における疼痛を抑制し、軟骨基質異常を生じる骨・関節疾患、あるいは疼痛を伴う症候性の骨・関節疾患の予防・治療に有効である。従って、本発明は、EDG2sを産生する能力を有する細胞におけるEDG2sの発現を、試験化合物の存在下と非存在下で比較することを特徴とする、関節における炎症性サイトカイン発現および／または関節破壊（例、関節軟骨破壊）および／または骨・関節疾患における疼痛を抑制する物質のスクリーニング方法を提供する。
EDG2sの発現量は、EDG2をコードする核酸とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る核酸 (即ち、前記したEDG2をコードする塩基配列またはその一部を含む核酸 (以下、「センスEDG2」ともいう) またはEDG2をコードする塩基配列に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸 (アンチセンスEDG2））を用いてそのmRNAを検出することにより、転写レベルで測定することもできる。あるいは、該発現量は、前記した抗EDG2抗体を用いて蛋白質 (ペプチド) を検出することにより、翻訳レベルで測定することもできる。
従って、より具体的には、本発明は、
(a) EDG2sを産生する能力を有する細胞を試験化合物の存在下および非存在下に培養し、両条件下におけるEDG2sをコードするmRNAの量を、センスもしくはアンチセンスEDG2を用いて測定、比較することを特徴とする、関節における炎症性サイトカイン発現および／または関節破壊（例、関節軟骨破壊）および／または骨・関節疾患における疼痛を抑制する物質のスクリーニング方法、および
(b) EDG2sを産生する能力を有する細胞を試験化合物の存在下および非存在下に培養し、両条件下におけるEDG2sの蛋白質 (ペプチド) 量を、抗EDG2抗体を用いて測定、比較することを特徴とする、関節における炎症性サイトカイン発現および／または関節破壊（例、関節軟骨破壊）および／または骨・関節疾患における疼痛を抑制する物質のスクリーニング方法を提供する。
上記 (a) および (b) のスクリーニング方法において、EDG2sを産生する能力を有する細胞としては、上記したEDG2活性抑制薬のスクリーニング方法において用いられるのと同様のものが好ましく用いられる。
例えば、EDG2sのmRNA量または蛋白質 (ペプチド) 量の測定は、具体的には以下のようにして行うことができる。
(i) 正常あるいは疾患モデル非ヒト温血動物 (例えば、マウス, ラット, ウサギ, ヒツジ, ブタ, ウシ, ネコ, イヌ, サル, トリなど) に対して、薬剤あるいは物理的刺激などを与える一定時間前 (30分前〜24時間前、好ましくは30分前〜12時間前、より好ましくは1時間前〜6時間前) もしくは一定時間後 (30分後〜3日後、好ましくは1時間後〜2日後、より好ましくは1時間後〜24時間後)、または薬剤あるいは物理的刺激と同時に被験物質を投与し、投与から一定時間が経過した後、関節液、関節軟骨などを採取する。得られた生体試料に含まれる細胞において発現したEDG2のmRNAは、例えば、通常の方法により細胞等からmRNAを抽出し、例えば、RT-PCRなどの手法を用いることにより定量することができ、あるいは自体公知のノーザンブロット解析により定量することもできる。一方、EDG2蛋白質量は、ウェスタンブロット解析や以下に詳述する各種イムノアッセイ法を用いて定量することができる。
(ii) EDG2またはその部分ペプチドをコードする核酸を導入した形質転換体を上記の方法に従って作製し、該形質転換体を常法に従って培養する際に被験物質を培地中に添加し、一定時間培養後、該形質転換体に含まれるEDG2sのmRNA量または蛋白質 (ペプチド) 量を定量、解析することにより行うことができる。
被験物質としては、ペプチド, 蛋白質, 非ペプチド性化合物, 合成化合物, 発酵生産物などが挙げられ、これら物質は新規な物質であってもよいし、公知の物質であってもよい。
上記 (b) のスクリーニング方法におけるEDG2sの量の測定は、具体的には、例えば、
(i) 抗EDG2抗体と、試料液および標識化されたEDG2sとを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化されたEDG2sを検出することにより試料液中のEDG2sを定量する方法や、
(ii) 試料液と、担体上に不溶化した抗EDG2抗体および標識化された別の抗EDG2抗体とを、同時あるいは連続的に反応させた後、不溶化担体上の標識剤の量 (活性) を測定することにより、試料液中のEDG2sを定量する方法等が挙げられる。
上記 (ii) の定量法においては、2種の抗体はEDG2sの異なる部分を認識するものであることが望ましい。例えば、一方の抗体がEDG2sのN端部を認識する抗体であれば、他方の抗体としてEDG2sのC端部と反応するものを用いることができる。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素, 酵素, 蛍光物質, 発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、[125I], [131I], [3H], [14C]などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β-ガラクトシダーゼ, β-グルコシダーゼ, アルカリフォスファターゼ, パーオキシダーゼ, リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン, フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール, ルミノール誘導体, ルシフェリン, ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン-(ストレプト)アビジン系を用いることもできる。
試料液としては、細胞を破砕した後、それ自体公知の方法で得られる細胞膜含有画分が用いられる。細胞の破砕方法としては、Potter−Elvehjem型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Kinematica社製）のよる破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などが挙げられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（500rpm〜3000rpm）で短時間（通常、約1〜10分）遠心し、上清をさらに高速（15000rpm〜30000rpm）で通常30分〜2時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。
また、標識剤の検出が可能である限り、無傷細胞を試料として用いてもよい。
抗EDG2抗体を用いるEDG2sの定量法は、特に制限されるべきものではなく、試料液中の抗原量に対応した、抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられる。感度、特異性の点で、例えば、後述するサンドイッチ法を用いるのが好ましい。
抗原あるいは抗体の不溶化にあたっては、物理吸着を用いてもよく、また通常蛋白質あるいは酵素等を不溶化・固定化するのに用いられる化学結合を用いてもよい。担体としては、アガロース, デキストラン, セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン, ポリアクリルアミド, シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等があげられる。
サンドイッチ法においては不溶化した抗EDG2抗体に試料液を反応させ (1次反応)、さらに標識化した別の抗EDG2抗体を反応させた (2次反応) 後、不溶化担体上の標識剤の量もしくは活性を測定することにより、試料液中のEDG2sを定量することができる。1次反応と2次反応は、逆の順序で行っても、また、同時に行ってもよいし、時間をずらして行ってもよい。標識化剤および不溶化の方法は、前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相化抗体あるいは標識化抗体に用いられる抗体は、必ずしも1種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で2種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
抗EDG2抗体は、サンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどにも用いることができる。
競合法では、試料液中のEDG2sと標識したEDG2sとを抗体に対して競合的に反応させた後、未反応の標識抗原 (F) と、抗体と結合した標識抗原 (B) とを分離し (B/F分離)、B, Fいずれかの標識量を測定することにより、試料液中のEDG2sを定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、ポリエチレングリコールや前記抗体 (1次抗体) に対する2次抗体などを用いてB/F分離を行う液相法、および、1次抗体として固相化抗体を用いるか (直接法)、あるいは1次抗体は可溶性のものを用い、2次抗体として固相化抗体を用いる固相化法 (間接法) とが用いられる。
イムノメトリック法では、試料液中のEDG2sと固相化したEDG2sとを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後、固相と液相を分離するか、あるいは試料液中のEDG2sと過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化したEDG2sを加えて未反応の標識化抗体を固相に結合させた後、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し、試料液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。試料液中のEDG2sの量がわずかであり、少量の沈降物しか得られない場合にも、レーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に、当業者の通常の技術的配慮を加えて、EDG2sの測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
例えば、Meth. Enzymol., Vol. 70: (Immunochemical Techniques (Part A)), 同書 Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B)), 同書 Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C)), 同書 Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Part D: Selected Immunoassays)), 同書 Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods)), 同書 Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies)) (以上、Academic Press発行) などを参照することができる。
以上のようにして、抗EDG2抗体を用いることによって、細胞におけるEDG2sの生産量を感度よく定量することができる。
上記 (a) および (b) のスクリーニング法において、EDG2sの発現量 (mRNA量または蛋白質 (ペプチド) 量) を増加させた物質をEDG2発現促進薬、発現量を減少させた物質をEDG2発現抑制薬としてそれぞれ選択することができる。EDG2発現抑制薬は、関節における炎症性サイトカインの発現、それにより惹起され得る関節破壊（例、関節軟骨破壊）、あるいは骨・関節疾患における疼痛の抑制薬として用いることができ、軟骨基質異常を生じる骨・関節疾患、疼痛を伴う症候性の骨・関節疾患、例えば、変形性関節症、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症、スポーツによる関節障害、先天性骨系統疾患 (例: 軟骨無形成症, 多発性骨端異形成症, 脊椎骨端異形成症, 骨幹端異形成症, Stickler症候群, 偽性軟骨無形成症, 多発性外骨腫, 片側肥大, オリエール病, マフッチ症候群等)、骨軟骨腫、骨腫瘍、軟骨腫瘍などの疾患、好ましくは変形関節症 [例: 股関節OA (HOA), 膝関節OA (KOA)]、より好ましくはKOAの予防・治療薬として有用である。
一方、EDG2発現促進薬は、例えば、統合失調症 (精神分裂病)、肥満症等の予防・治療薬として有用である。
EDG2発現抑制薬を上記予防・治療剤として使用する場合は、前記したEDG2アンタゴニスト等の場合と同様にして製剤化することができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや他の温血動物 (例えば、ラット, マウス, ハムスター, ウサギ, ヒツジ, ヤギ, ブタ, ウシ, ウマ, ネコ, イヌ, サル, チンパンジー, トリなど) に対して投与することができる。
EDG2発現抑制薬の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に、例えばOA患者 (60 kgとして) においては、一日につき約0.1〜100 mg、好ましくは約1.0〜50 mg、より好ましくは約1.0〜20 mgである。非経口的に投与する場合は、その1回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば注射剤の形では、通常、例えばOA患者 (60 kgとして) においては、一日につき約0.01〜30 mg程度、好ましくは約0.1〜20 mg程度、より好ましくは約0.1〜10 mg程度を投与するのが好都合である。他の動物の場合も、ヒト60 kg当たりに換算した量を投与することができる。
上記のEDG2発現抑制薬のスクリーニング方法はまた、既存の関節における炎症性サイトカイン発現抑制剤、関節破壊（例、関節軟骨破壊）抑制剤、骨・関節疾患における疼痛抑制剤等の投与対象に対する薬効を評価するのに用いることもできる。即ち、上記いずれかの薬剤を投与された被験体から、例えば関節液、関節軟骨などの生体試料を採取し、該試料中のEDG2 mRNA量またはEDG2蛋白質量を上記の方法を用いて測定する。例えば、薬剤投与前と比較してEDG2の発現量が有意に減少した場合に、該薬剤は、該被験体（薬剤投与対象）に対して予防・治療効果があると判定することができる。
(4) 遺伝子診断剤
EDG2をコードする塩基配列またはその一部を含む核酸 (センスEDG2)、あるいは該塩基配列と相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸 (アンチセンスEDG2) は、プローブ等として使用することにより、ヒトまたは他の温血動物 (例えば、ラット, マウス, ハムスター, ウサギ, ヒツジ, ヤギ, ブタ, ウシ, ウマ, ネコ, イヌ, サル, チンパンジー, トリなど) におけるEDG2をコードするDNAまたはmRNAの異常 (遺伝子異常) を検出することができるので、例えば、該DNAの損傷もしくは突然変異やmRNAのスプライシング異常あるいは発現低下、あるいは該DNAの増幅やmRNAの発現上昇などの遺伝子診断剤として有用である。EDG2をコードする塩基配列の一部を含む核酸は、プローブとして必要な長さ (例えば、約15塩基以上) を有する限り特に制限されず、また、EDG2の部分ペプチドをコードしている必要もない。
センスもしくはアンチセンスEDG2を用いる上記の遺伝子診断は、例えば、自体公知のノーザンハイブリダイゼーション、 定量的RT-PCR、PCR-SSCP法、アレル特異的PCR、PCR-SSOP法、DGGE法、RNaseプロテクション法、PCR-RFLP法などにより実施することができる。
上記のように、EDG2は炎症性サイトカインの発現を上昇させ、関節破壊（例、関節軟骨破壊）を誘導し、あるいは骨・関節疾患において疼痛を惹起する。そのため、軟骨基質異常を生じる骨・関節疾患や疼痛を伴う症候性の骨・関節疾患に罹患しているか、あるいは将来罹患するリスクが高い状態にあれば、EDG2遺伝子の発現が正常な状態に比して上昇していると考えられる。従って、例えば、被験温血動物の細胞から抽出したRNA画分についてのノーザンハイブリダイゼーションや定量的RT-PCRの結果、EDG2遺伝子の発現上昇が検出された場合は、軟骨基質異常を生じる骨・関節疾患、疼痛を伴う症候性の骨・関節疾患、例えば、変形性関節症、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症、スポーツによる関節障害、先天性骨系統疾患 (例: 軟骨無形成症, 多発性骨端異形成症, 脊椎骨端異形成症, 骨幹端異形成症, Stickler症候群, 偽性軟骨無形成症, 多発性外骨腫, 片側肥大, オリエール病, マフッチ症候群等)、骨軟骨腫、骨腫瘍、軟骨腫瘍などの疾患に罹患しているか、あるいは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
前記した抗EDG2抗体は、ヒトまたは他の温血動物 (例えば、ラット, マウス, ハムスター, ウサギ, ヒツジ, ヤギ, ブタ, ウシ, ウマ, ネコ, イヌ, サル, チンパンジー, トリなど) におけるEDG2またはその塩の量を測定することができるので、例えば、該蛋白質の発現低下または発現上昇などの遺伝子診断剤として有用である。
抗EDG2抗体を用いる上記の遺伝子診断は、前記した抗EDG2抗体を用いるEDG2発現抑制薬のスクリーニング方法 ((b) のスクリーニング方法) において、EDG2sを産生する能力を有する細胞として、被験温血動物から採取した生体試料 (例: 関節液, 生検など) を用いてイムノアッセイを実施することにより行うことができる。
イムノアッセイの結果、該試料中のEDG2またはその塩の増加が検出された場合は、軟骨基質異常を生じる骨・関節疾患、疼痛を伴う症候性の骨・関節疾患、例えば、変形性関節症、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症、スポーツによる関節障害、先天性骨系統疾患 (例: 軟骨無形成症, 多発性骨端異形成症, 脊椎骨端異形成症, 骨幹端異形成症, Stickler症候群, 偽性軟骨無形成症, 多発性外骨腫, 片側肥大, オリエール病, マフッチ症候群等)、骨軟骨腫、骨腫瘍、軟骨腫瘍などの疾患に罹患しているか、あるいは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
本発明はまた、OAをはじめとする骨・関節疾患に対する遺伝的感受性の判定（診断）方法（以下、単に「本発明の診断方法」という場合がある）を提供する。本発明の診断方法は、被験者のEDG2遺伝子における多型を検出することを特徴とする。
本明細書において「（遺伝子）多型」とは、ゲノムDNA上の１または複数の塩基の変化（置換、欠失、挿入、転位、逆位等）であって、その変化が集団内に１％以上の頻度で存在するものをいい、例えば、１個の塩基が他の塩基に置換されたもの（SNP）、1〜数十塩基が欠失もしくは挿入されたもの（DIP）、2〜数十塩基を１単位とする配列が繰り返し存在する部位においてその繰り返し回数が異なるもの（繰り返し単位が2〜4塩基のものをマイクロサテライト多型、数〜数十塩基のものをvariable number of tandem repeat (VNTR)という）等が挙げられる。本発明の診断方法に利用することができる多型は、下記の条件を満たす限りいずれのタイプのものであってもよい。
本発明の診断方法において利用することができる多型は、EDG2遺伝子内に存在する多型であって、その一方のアレル頻度が、任意の骨・関節疾患非罹患者集団におけるよりも任意の骨・関節疾患患者集団において有意に高いものであれば特に制限されないが、好ましくは、配列番号: 3で表される塩基配列中塩基番号24007で示される塩基 [転写開始点 (配列番号: 3で表される塩基配列中塩基番号26827で示される「A」) の上流側2820番目 (-2820) の塩基に相当する。以下、EDG2遺伝子における多型の位置は転写開始点からの距離で表記する。] におけるSNP [-2820 G>A (以下、本明細書における多型は「“多型位置”“メジャーアレルの塩基”>“マイナーアレルの塩基”」で表記する。“-”は塩基が存在しないことを意味し、“N/ins”は塩基Nが挿入されていることを意味する。); 後記実施例においてEDG2遺伝子の5’フランキング領域、第1エクソンおよび第1イントロンからなる領域内に見出された27の多型のうち、5’上流側から第9番目の多型であるので、該多型を「i-EDG2-09」と称する。他の多型も同様にして命名される。] および該SNPと連鎖不平衡係数D’が0.9以上の連鎖不平衡状態にある多型である。ここで「連鎖不平衡係数D’」は、２つのSNPについて第一のSNPの各アレルを（A, a）、第二のSNPの各アレルを（B, b）とし、４つのハプロタイプ（AB, Ab, aB, ab）の各頻度をPAB, PAb, PaB, Pabとすると、下記式により得られる。
D’＝(PABPab−PAbPaB)／Min [(PAB＋PaB)(PaB＋Pab), (PAB＋PAb)(PAb＋Pab)]
［式中、Min [(PAB＋PaB)(PaB＋Pab), (PAB＋PAb)(PAb＋Pab)]は、(PAB＋PaB)(PaB＋Pab)と(PAB＋PAb)(PAb＋Pab)とのうち、値の小さい方をとることを意味する。］
i-EDG2-09はNCBI SNPデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/）にRefSNP ID: rs10980705として登録される、EDG2遺伝子の転写開始点から上流2820番目の塩基におけるSNPであり、メジャーアレルの塩基が「G」、マイナーアレルの塩基が「A」である。このうちAアレルは、OA患者群で頻度の高いOA感受性アレルである。
EDG2遺伝子の5’フランキング領域、第1エクソンおよび第1イントロンからなる領域内に存在するi-EDG2-09以外の多型としては、NCBI SNPデータベースに登録された17個の公知多型 [RefSNP ID: rs3030215 (-23718〜-23719 ->ACAGGAG/ins; i-EDG2-02), rs4576485 (-14799 T>C; i-EDG2-05), rs10980706 (-3262 A>C; i-EDG2-08), rs9919025 (-2254 C>T; i-EDG2-10), rs4978978 (-2068 C>G; i-EDG2-11), rs10980704 (-1828 A>T; i-EDG2-12), rs10980702 (-1340 G>T; i-EDG2-13), rs10980701 (-1076 G>C; i-EDG2-14), rs12344515 (-866 A>G; i-EDG2-15), rs7858454 (-77 A>G; i-EDG2-17), rs12236414 (1039 G>T; i-EDG2-18), rs7041855 (1637 A>C; i-EDG2-19), rs1861157 (3389 C>T; i-EDG2-21), rs3739706 (7369 C>T; i-EDG2-23), rs3739707 (7660 T>G; i-EDG2-24), rs3739708 (7747 A>T; i-EDG2-25) およびrs2287005 (9053 A>G; i-EDG2-27)]、並びに本発明において見出された9個の新規多型 [-26825〜-26826 ->A/ins (i-EDG2-01), -18363〜-18364 ->T/ins (i-EDG2-03), -14946 G>A (i-EDG2-04), -13850 A>T (i-EDG2-06), -3289 C>T (i-EDG2-07), -425 T>C (i-EDG2-17), 1728 A>G (i-EDG2-20), 3624 G>A (i-EDG2-22) および8510 A>G (i-EDG2-26)] が挙げられる。これらのうち、i-EDG2-24を除くすべての多型は、互いにD’>0.9の関係にある。
上記多型のうち、一方のアレル頻度が任意の骨・関節疾患非罹患者集団におけるよりも任意の骨・関節疾患患者集団において有意に高いものが、本発明の診断方法に利用することができる。本明細書においては、以下、かかる多型を骨・関節疾患マーカー多型という場合もある。
骨・関節疾患患者集団および骨・関節疾患非罹患者集団は、それぞれ統計学上信頼し得る結果を与えるに十分な数からなる集団であれば、その大きさ（サンプル数）、各サンプルの背景（例えば、出身地、年齢、性別、疾患等）などに特に制限はない。骨・関節疾患としては、例えば、変形性関節症、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症、スポーツによる関節障害、骨軟骨腫、骨腫瘍、軟骨腫瘍、先天性骨系統疾患等が挙げられるが、好ましくは変形性関節症、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症、スポーツによる関節障害、軟骨基質異常を生じる先天性骨系統疾患等であり、より好ましくは変形性関節症（OA）、いっそう好ましくは変形性股関節症（HOA）もしくは変形性膝関節症（KOA）、就中KOAである。また、倫理上、試料提供者のインフォームド・コンセントを必要とすることから、骨・関節疾患非罹患者集団としては、通常、ある医療機関における骨・関節疾患以外の患者群、あるいはある地域における集団検診において骨・関節疾患に罹患していないと診断された被験者群などが好ましく用いられる。
i-EDG2-09以外の上記26多型のうち、日本人一般集団におけるケース・コントロール相関解析において、一方のアレル頻度が非OA患者集団におけるよりもOA患者集団において有意に高かった多型として、i-EDG2-03、i-EDG2-12およびi-EDG2-25が挙げられる。いずれもマイナーアレル (i-EDG2-03ではT/insアレル、i-EDG2-12ではTアレル、i-EDG2-25ではTアレル) がOA感受性アレルである。これらの多型は互いにほぼ完全連鎖の関係にある。
従って、好ましい実施態様においては、本発明の診断方法はi-EDG2-03、i-EDG2-09、i-EDG2-12およびi-EDG2-25のうちの1以上の多型を検出することを含む。より好ましくは、本発明の診断方法において利用される多型は、i-EDG2-09またはi-EDG2-12であり、特に好ましくはi-EDG2-09である。i-EDG2-09の多型はEDG2遺伝子の転写活性に影響を及ぼし、Aアレル (-2820A) では、転写因子AP-1が活性化される条件下で転写活性が上昇する。従って、上記したEDG2の機能 (即ち、関節における炎症性サイトカイン発現の誘導、関節破壊（例、関節軟骨破壊）の惹起、骨・関節疾患における疼痛の惹起等) を考慮すると、Aアレルは変形性関節症だけでなく、軟骨基質異常を生じる骨・関節疾患および疼痛を伴う症候性の骨・関節疾患、例えば、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症、スポーツによる関節障害、先天性骨系統疾患 (例: 軟骨無形成症, 多発性骨端異形成症, 脊椎骨端異形成症, 骨幹端異形成症, Stickler症候群, 偽性軟骨無形成症, 多発性外骨腫, 片側肥大, オリエール病, マフッチ症候群等)、骨軟骨腫、骨腫瘍、軟骨腫瘍などの疾患に対しても感受性を示すことが示唆される。
また、i-EDG2-03、i-EDG2-12およびi-EDG2-25の多型、特にi-EDG2-12の多型は、i-EDG2-09とほぼ完全連鎖の状態にあるので、これらの多型のいずれかを検出することにより、上記骨・関節疾患に対して感受性のハプロタイプを保有しているか否かを高確度に判定することが可能である。
本発明の診断方法において、多型の検出は公知のSNP検出方法のいずれも使用することができる。古典的な検出方法としては、例えば、被験者の細胞等から抽出したゲノムDNAを試料とし、EDG2遺伝子の部分塩基配列 [例えば、配列番号: 3で表される塩基配列を参照することができる。該塩基配列は、GenBank accession No. AC007157 (VERSION: AC007157.6, GI: 4646258, 1999年4月27日更新; 本明細書においては、単に「AC007157.6」と略記する場合もある) として登録されている塩基配列 (相補鎖配列) 中塩基番号112795〜76917で示される塩基配列に相当する。] であって、上記したいずれかの多型部位（好ましくは、i-EDG2-03、i-EDG2-09、i-EDG2-12またはi-EDG2-25、より好ましくはi-EDG2-09またはi-EDG2-12、特に好ましくはi-EDG2-09）の塩基を含む、約15〜約500塩基の連続した塩基配列を含有してなる核酸をプローブとして用い、例えばWallaceら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 278-282 (1983)）の方法に従って、ストリンジェンシーを正確にコントロールしながらハイブリダイゼーションを行い、プローブと完全相補的な配列のみを検出する方法や、上記核酸と上記核酸において多型部位の塩基が他の塩基に置換された核酸のいずれか一方を標識し、他方を未標識としたミックスプローブを用い、変性温度から徐々に反応温度を低下させながらハイブリダイゼーションを行い、一方のプローブと完全相補的な配列を先にハイブリダイズさせ、ミスマッチを有するプローブとの交差反応を防ぐ方法などが挙げられる。ここで標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔125Ｉ〕、〔131Ｉ〕、〔3Ｈ〕、〔14Ｃ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。
好ましくは、多型の検出は、例えば、WO 03/023063に記載された種々の方法、例えば、RFLP法、PCR-SSCP法、ASOハイブリダイゼーション、ダイレクトシークエンス法、ARMS法、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法、RNaseA切断法、化学切断法、DOL法、TaqMan PCR法、インベーダー法、MALDI-TOF/MS法、TDI法、モレキュラー・ビーコン法、ダイナミック・アレルスペシフィック・ハイブリダイゼーション法、パドロック・プローブ法、UCAN法、DNAチップまたはDNAマイクロアレイを用いた核酸ハイブリダイゼーション法、、およびECA法などにより実施することができる（WO 03/023063，第17頁第5行〜第28頁第20行を参照）。以下、代表的な方法として、後記実施例で使用されるTaqMan PCR法とインベーダー法について、より詳細に説明する。
（１）TaqMan PCR法
TaqMan PCR法は、蛍光標識したアレル特異的オリゴヌクレオチド（TaqManプローブ）とTaq DNAポリメラーゼによるPCRとを利用した方法である。TaqManプローブとしては、EDG2遺伝子の部分塩基配列 (例えば、配列番号: 3で表される塩基配列を参照) であって、上記したいずれかの多型部位（好ましくは、i-EDG2-03、i-EDG2-09、i-EDG2-12またはi-EDG2-25、より好ましくはi-EDG2-09またはi-EDG2-12、特に好ましくはi-EDG2-09）の塩基を含む、約15〜約30塩基の連続した塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが用いられる。例えば、i-EDG2-03は、配列番号: 3で表される塩基配列中塩基番号8463〜8464で示される塩基配列、i-EDG2-09は、配列番号: 3で表される塩基配列中塩基番号24007で示される塩基、i-EDG2-12は、配列番号: 3で表される塩基配列中塩基番号24999で示される塩基、i-EDG2-25は、配列番号: 3で表される塩基配列中塩基番号34573で示される塩基における多型であるので、各多型の検出用プローブとしては、それらの塩基 (もしくは塩基配列) を含む、約15〜約30塩基の連続した部分塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが用いられる。
該プローブは、その5’末端がFAMやVICなどの蛍光色素で、3’末端がTAMRAなどのクエンチャー（消光物質）でそれぞれ標識されており、そのままの状態ではクエンチャーが蛍光エネルギーを吸収するため蛍光は検出されない。プローブは双方のアレルについて調製し、一括検出のために互いに蛍光波長の異なる蛍光色素（例えば、一方のアレルをFAM、他方をVIC）で標識することが好ましい。また、TaqManプローブからのPCR伸長反応が起こらないように3’末端はリン酸化されている。TaqManプローブとハイブリダイズする領域を含むゲノムDNAの部分配列を増幅するように設計されたプライマーおよびTaq DNAポリメラーゼとともにPCRを行うと、TaqManプローブが鋳型DNAとハイブリダイズし、同時にPCRプライマーからの伸長反応が起こるが、伸長反応が進むとTaq DNAポリメラーゼの5’ヌクレア−ゼ活性によりハイブリダイズしたTaqManプローブが切断され、蛍光色素が遊離してクエンチャーの影響を受けなくなり、蛍光が検出される。鋳型の増幅により蛍光強度は指数関数的に増大する。
例えば、i-EDG2-09多型の検出において、当該多型部位の塩基を含むアレル特異的オリゴヌクレオチド（約15〜約30塩基長；AアレルはFAMで、GアレルはVICでそれぞれ5’末端標識し、3’末端はいずれもTAMRAで標識）をTaqManプローブとして用いた場合、被験者のジェノタイプがAA、あるいはGGであれば、それぞれFAMあるいはVICの強い蛍光強度を認め、他方の蛍光はほとんど認められない。一方、被験者のジェノタイプがAGであれば、FAMおよびVIC両方の蛍光が検出される。
（２）インベーダー法
インベーダー法では、TaqMan PCR法と異なり、アレル特異的オリゴヌクレオチド（アレルプローブ）自体は標識されず、多型部位の塩基の5’側に鋳型DNAと相補性のない配列（フラップ）を有し、3’側には鋳型に特異的な相補配列を有する。インベーダー法では、さらに鋳型の多型部位の3’側に特異的な相補配列を有するオリゴヌクレオチド（インベーダープローブ；該プローブの5’末端である多型部位に相当する塩基は任意である）と、5’側がヘアピン構造をとり得る配列を有し、ヘアピン構造を形成した際に5’末端の塩基と対をなす塩基から3’側に連続する配列がアレルプローブのフラップと相補的な配列であることを特徴とするFRET（fluorescence resonance energy transfer）プローブとが用いられる。FRETプローブの5’末端は蛍光標識（例えば、FAMやVICなど）され、その近傍にはクエンチャー（例えば、TAMRAなど）が結合しており、そのままの状態（ヘアピン構造）では蛍光は検出されない。
鋳型であるゲノムDNAにアレルプローブおよびインベーダープローブを反応させると、三者が相補結合した際に多型部位にインベーダープローブの3’末端が侵入する。この多型部位の構造を認識する酵素（cleavase）を用いてアレルプローブの一本鎖部分（即ち、多型部位の塩基から5’側のフラップ部分）を切り出すと、フラップはFRETプローブと相補的に結合し、フラップの多型部位がFRETプローブのヘアピン構造に侵入する。この構造をcleavaseが認識して切断することにより、FRETプローブの末端標識された蛍光色素が遊離してクエンチャーの影響を受けなくなって蛍光が検出される。多型部位の塩基が鋳型とマッチしないアレルプローブはcleavaseによって切断されないが、切断されないアレルプローブもFRETプローブとハイブリダイズすることができるので、同様に蛍光が検出される。但し、反応効率が異なるため、多型部位の塩基がマッチするアレルプローブでは、マッチしないアレルプローブに比べて蛍光強度が顕著に強い。
通常、３種のプローブおよびcleavaseと反応させる前に、鋳型DNAはアレルプローブおよびインベーダープローブがハイブリダイズする部分を含む領域を増幅し得るプライマーを用いてPCRにより増幅しておくことが好ましい。
上記のようにして多型を調べた結果、骨・関節疾患に感受性のアレルを保有していると判定された場合、特に該アレルについてホモ接合体であると判定された場合には、被験者は当該骨・関節疾患に対する遺伝的感受性が高いと診断することができる。例えば、
(1) i-EDG2-03についてT/insアレルを保有する場合、
(2) i-EDG2-09についてAアレルを保有する場合、
(3) i-EDG2-12についてTアレルを保有する場合、または
(4) i-EDG2-25についてTアレルを保有する場合、
被験者は、軟骨基質異常を生じる骨・関節疾患および疼痛を伴う症候性の骨・関節疾患、例えば、変形性関節症、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症、スポーツによる関節障害、先天性骨系統疾患 (例: 軟骨無形成症, 多発性骨端異形成症, 脊椎骨端異形成症, 骨幹端異形成症, Stickler症候群, 偽性軟骨無形成症, 多発性外骨腫, 片側肥大, オリエール病, マフッチ症候群等)、骨軟骨腫、骨腫瘍、軟骨腫瘍などの疾患、好ましくはOA（例えば、HOAもしくはKOA）、より好ましくはKOAに罹患しやすい（感受性である）と判定（診断）することができる。
尚、２以上の多型を調べた際に、１以上の結果が他の結果と相反する場合には、i-EDG2-09および／またはi-EDG2-12多型の結果が優先され、これらの塩基の中で結果が相反する場合には、i-EDG2-09多型の結果が優先される。
上述のように、i-EDG2-03多型は、本発明において初めて見出された新規多型であり、且つ骨・関節疾患に対する遺伝的感受性の診断に利用できるマーカー多型である。より詳細には、i-EDG2-03の位置における公知の塩基配列は、配列番号: 3で表される塩基配列中塩基番号8463〜8464で示される通り「TA」であるが、本発明者らは該2塩基間に「チミン（T）」が挿入されている新規多型（DIP）を同定した。T/insアレルの頻度は、非OA患者集団に比べてOA患者集団において有意に高いことから、該アレルは、軟骨基質異常を生じる骨・関節疾患および疼痛を伴う症候性の骨・関節疾患、例えば、変形性関節症、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症、スポーツによる関節障害、先天性骨系統疾患 (例: 軟骨無形成症, 多発性骨端異形成症, 脊椎骨端異形成症, 骨幹端異形成症, Stickler症候群, 偽性軟骨無形成症, 多発性外骨腫, 片側肥大, オリエール病, マフッチ症候群等)、骨軟骨腫、骨腫瘍、軟骨腫瘍などの疾患、好ましくはOA（例えば、HOAもしくはKOA）、より好ましくはKOAに対する感受性アレルである。
従って、本発明はまた、EDG2遺伝子の部分塩基配列であって、配列番号: 3で表される塩基配列中塩基番号8463〜8464で示される塩基（但し、該2つの塩基の間に「T」が挿入されている）を含む、約15〜約500塩基（好ましくは約15〜約200塩基、より好ましくは約15〜約50塩基）の連続した塩基配列を含有してなる核酸を提供する。かかる多型部位を含む新規核酸は、上記した本発明の診断方法において、i-EDG2-03多型を検出するのに好ましく用いることができる。そのような核酸は、配列番号: 3で表される塩基配列情報に基づいて、DNA/RNA自動合成機を用いて合成することができる。
本発明はまた、上記本発明の診断方法に用いるためのキットを提供する。即ち、本発明の診断用キットは、EDG2遺伝子内に存在する多型であって、一方のアレル頻度が、任意の骨・関節疾患非罹患者集団におけるよりも任意の骨・関節疾患患者集団において高い多型からなる群より選択される１以上の多型、好ましくはi-EDG2-09もしくは該多型と連鎖不平衡係数D’が0.9以上の連鎖不平衡状態にある（好ましくは、完全連鎖状態にある）、EDG2遺伝子内に存在する多型の各々を検出し得る、１組以上の核酸プローブおよび／またはプライマーを含むことを特徴とする。
具体的には、本発明の診断用キットに用いられる核酸プローブは、上記本発明の診断方法において検出すべき多型部位の塩基を含む領域でゲノムDNAとハイブリダイズする核酸であり、標的部位に対して特異的であり且つ多型性を容易に検出し得る限りその長さ（ゲノムDNAとハイブリダイズする部分の塩基長）に特に制限はなく、例えば約15塩基以上、好ましくは約15〜約500塩基、より好ましくは約15〜約200塩基、いっそう好ましくは約15〜約50塩基である。
該プローブは、多型性の検出に適した付加的配列（ゲノムDNAと相補的でない配列）を含んでいてもよい。例えば、上記インベーダー法に用いられるアレルプローブは、多型部位の塩基の5’末端にフラップと呼ばれる付加的配列を有する。
また、該プローブは、適当な標識剤、例えば、放射性同位元素（例：125Ｉ、131Ｉ、3Ｈ、14Ｃ等）、酵素（例：β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等）、蛍光物質（例：フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネート等）、発光物質（例：ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニン等）などで標識されていてもよい。あるいは、蛍光物質（例：FAM、VIC等）の近傍に該蛍光物質の発する蛍光エネルギーを吸収するクエンチャー（消光物質）がさらに結合されていてもよい。かかる実施態様においては、検出反応の際に蛍光物質とクエンチャーとが分離して蛍光が検出される。
好ましくは、本発明の診断用キットに用いられる核酸プローブは、配列番号: 3で表される塩基配列中、塩基番号8463〜8464で示される多型部位（i-EDG2-03）、塩基番号24007で示される多型部位（i-EDG2-09）、塩基番号24999で示される多型部位（i-EDG2-12）および塩基番号34573で示される多型部位（i-EDG2-25）からなる群より選択される多型部位、より好ましくはi-EDG2-09および／またはi-EDG2-12の多型部位、特に好ましくはi-EDG2-09の多型部位の塩基を含む、約15〜約500塩基、好ましくは約15〜約200塩基、より好ましくは約15〜約50塩基の連続した塩基配列を含有してなる核酸である。ここで、
(1) 塩基番号8463〜8464で示される塩基はTAまたはT(T/ins)A、
(2) 塩基番号24007で示される塩基はGまたはA、
(3) 塩基番号24999で示される塩基はAまたはT、
(4) 塩基番号34573で示される塩基はAまたはT、
であり、使用する多型検出法に応じて、各多型部位についていずれか一方の塩基を有する核酸を用いることもできるし、各アレルに対応する塩基を有する２種類の核酸を用いることもできる。尚、上記インベーダー法に使用されるインベーダープローブについては、多型部位の塩基（即ち、3’末端の塩基）は任意の塩基でよい。
本発明の診断用キットに用いられる核酸プライマーは、上記本発明の診断方法において検出すべき多型部位の塩基を含むゲノムDNAの領域を特異的に増幅し得るように設計されたものであればいかなるものであってもよい。例えば、配列番号: 3で表される塩基配列の部分塩基配列であって、検出すべき多型部位の塩基より5’側の相補鎖配列の一部にハイブリダイズする、約15〜約50塩基、好ましくは約15〜約30塩基の塩基配列を含む核酸と、該多型部位の塩基より3’側の配列の一部にハイブリダイズする、約15〜約50塩基、好ましくは約15〜約30塩基の塩基配列を含む核酸との組み合わせであり、それらによって増幅される核酸の断片長が約50〜約1,000塩基、好ましくは約50〜約500塩基、より好ましくは約50〜約200塩基である、一対の核酸が挙げられる。
該プライマーは、多型性の検出に適した付加的配列（ゲノムDNAと相補的でない配列）、例えばリンカー配列を含んでいてもよい。
また、該プライマーは、適当な標識剤、例えば、例えば、放射性同位元素（例：125Ｉ、131Ｉ、3Ｈ、14Ｃ等）、酵素（例：β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等）、蛍光物質（例：フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネート等）、発光物質（例：ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニン等）などで標識されていてもよい。
好ましくは、本発明の診断用キットに用いられる核酸プライマーは、配列番号: 3で表される塩基配列中、塩基番号8463〜8464で示される多型部位（i-EDG2-03）、塩基番号24007で示される多型部位（i-EDG2-09）、塩基番号24999で示される多型部位（i-EDG2-12）および塩基番号34573で示される多型部位（i-EDG2-25）からなる群より選択される多型部位、より好ましくはi-EDG2-09および／またはi-EDG2-12の多型部位、特に好ましくはi-EDG2-09の多型部位の塩基を含む、約50〜約1,000塩基、好ましくは約50〜約500塩基、より好ましくは約50〜約200塩基の連続した塩基配列を増幅し得る一対の核酸である。
本発明の診断用キットに用いられる核酸プローブまたはプライマーは、DNAであってもRNAであってもよく、また、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。二本鎖の場合は二本鎖DNA、二本鎖RNA、DNA／RNAハイブリッドのいずれであってもよい。従って、本明細書においてある塩基配列を有する核酸について記載する場合、特に断らない限り、該塩基配列を有する一本鎖核酸、該塩基配列と相補的な配列を有する一本鎖核酸、それらのハイブリッドである二本鎖核酸をすべて包含する意味で用いられていると理解されるべきである。
上記核酸プローブまたはプライマーは、例えば、配列番号: 3で表される塩基配列の情報に基づいて、DNA/RNA自動合成機を用いて常法に従って合成することができる。
上記核酸プローブおよび／またはプライマーは、各々別個に（あるいは可能であれば混合した状態で）水もしくは適当な緩衝液（例：TEバッファーなど）中に適当な濃度（例：2×〜20×濃度で1〜50μMなど）となるように溶解し、約-20℃で保存することができる。
本発明の診断用キットは、多型検出法に応じて、当該方法の実施に必要な他の成分を構成としてさらに含んでいてもよい。例えば、該キットがTaqMan PCR法による多型検出用である場合には、該キットは、10×PCR反応緩衝液、10×MgCl2水溶液、10×dNTPs水溶液、Taq DNAポリメラーゼ（5U/μL）等をさらに含むことができる。
後記実施例において示される通り、i-EDG2-09において、Aアレル(-2820A) により選択的に結合する核内因子が存在し、該因子が転写因子として作用していることが示唆される。従って、配列番号: 3で表される塩基配列中塩基番号24007で示される塩基 (但し、該塩基は「アデニン（A）」である) およびそれに隣接する塩基（もしくは塩基配列）からなる塩基配列を含む核酸は、デコイ核酸として機能することにより、EDG2遺伝子の転写調節領域への該核内因子の結合を阻害して、EDG2遺伝子の転写活性を低減させることができ、関節における炎症性サイトカイン発現、関節破壊（例、関節軟骨破壊）、骨・関節疾患における疼痛等の抑制剤として用いることができ、従って、軟骨基質異常を生じる骨・関節疾患および疼痛を伴う症候性の骨・関節疾患、例えば、変形性関節症、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症、スポーツによる関節障害、先天性骨系統疾患 (例: 軟骨無形成症, 多発性骨端異形成症, 脊椎骨端異形成症, 骨幹端異形成症, Stickler症候群, 偽性軟骨無形成症, 多発性外骨腫, 片側肥大, オリエール病, マフッチ症候群等)、骨軟骨腫、骨腫瘍、軟骨腫瘍などの疾患、好ましくはOA（例えば、HOAもしくはKOA）、より好ましくはKOAの予防・治療剤として用いることができる。
ここで「隣接する塩基」は、-2820Aの5’上流側および3’下流側のいずれであってもよく、その両方であってもよい。-2820Aおよびそれに隣接する塩基（もしくは塩基配列）からなる塩基配列は、好ましくは約5〜約30塩基、より詳細には-2820Aとその5’上流側0〜20塩基および16Tの3’下流側0〜20塩基とからなる全長約5〜約30塩基からなる塩基配列である。
上記デコイ核酸を上記予防・治療剤として使用する場合は、前記した抗EDG2アンタゴニスト等の場合と同様にして製剤化することができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや他の温血動物 (例えば、ラット, マウス, ハムスター, ウサギ, ヒツジ, ヤギ, ブタ, ウシ, ウマ, ネコ, イヌ, サル, チンパンジー, トリなど) に対して投与することができる。
上記デコイ核酸の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に、例えばOA患者 (60 kgとして) においては、一日につき約0.1〜100 mg、好ましくは約1.0〜50 mg、より好ましくは約1.0〜20 mgである。非経口的に投与する場合は、その1回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば注射剤の形では、通常、例えばOA患者 (60 kgとして) においては、一日につき約0.01〜30 mg程度、好ましくは約0.1〜20 mg程度、より好ましくは約0.1〜10 mg程度を投与するのが好都合である。他の動物の場合も、ヒト60 kg当たりに換算した量を投与することができる。
上記のように、i-EDG2-09において、Aアレル(-2820A) により選択的に結合する核内因子が存在し、該因子が転写因子として作用していることが示唆されるので、該因子の-2820Aおよびその周辺領域への結合を阻害する物質は、骨・関節疾患、軟骨基質異常を生じる骨・関節疾患および疼痛を伴う症候性の骨・関節疾患、例えば、変形性関節症、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症、スポーツによる関節障害、先天性骨系統疾患 (例: 軟骨無形成症, 多発性骨端異形成症, 脊椎骨端異形成症, 骨幹端異形成症, Stickler症候群, 偽性軟骨無形成症, 多発性外骨腫, 片側肥大, オリエール病, マフッチ症候群等)、骨軟骨腫、骨腫瘍、軟骨腫瘍などの疾患、好ましくはOA（例えば、HOAもしくはKOA）、より好ましくはKOAの予防・治療に有効である。
従って、本発明はまた、配列番号: 3で表される塩基配列中塩基番号24007で示される塩基 (但し、該塩基は「A」である) およびそれに隣接する塩基（もしくは塩基配列）からなる塩基配列を含む核酸と、該塩基配列に選択的に結合する転写因子とを用いることを特徴とする、上記骨・関節疾患の予防・治療物質のスクリーニング方法を提供する。例えば、
1) 試験化合物の存在下における該核酸と該転写因子の結合調節を検出する方法、および
2) 該核酸を含むプロモーターの制御下にある遺伝子を含む動物細胞における、試験化合物の存在下および非存在下での該遺伝子の発現を比較する方法などが挙げられる。
該核酸と該転写因子との結合を指標とする場合、例えば、標識 (例: 32P, ジゴキシゲニン等) した該核酸と該転写因子 (例えば、ヒトまたは他の温血動物細胞由来の核抽出液の状態で提供され得る。あるいは、該核酸を用いて該抽出液からアフィニティー精製して用いることもできる) とを試験化合物の存在下でインキュベートした後、該反応液を非変性ゲル電気泳動に付し、核酸−転写因子複合体に相当するバンドのシグナル強度の増減を検出することにより行うことができる。
試験化合物としては、例えばペプチド, 蛋白質, 非ペプチド性化合物, 合成化合物, 発酵生産物, 細胞抽出液, 植物抽出液, 動物組織抽出液などが挙げられる。
該核酸を含むプロモーターの制御下にある遺伝子の発現を指標とする場合、プロモーターとしては、動物細胞内で機能し得るいかなるプロモーターも使用することができ、例えば、SRαプロモーター, SV40プロモーター, LTRプロモーター, CMV (サイトメガロウイルス) プロモーター, HSV-tkプロモーターなどが用いられる。該核酸は、自体公知の遺伝子工学的手法を用いて該プロモーター内の適当な位置に挿入することができる。あるいは、-2820Aを含むEDG2遺伝子のネイティブなプロモーターを使用してもよい。
該核酸を含むプロモーターの制御下にある遺伝子は、その発現量を容易に測定し得るものであれば特に制限されないが、好ましくはルシフェラーゼ, GFP, アルカリホスファターゼ, ペルオキシダーゼ, β-ガラクトシダーゼなどのレポーター遺伝子が挙げられる。また、-2820Aを含むEDG2遺伝子をそのまま使用することもできる。この場合、該EDG2遺伝子を生来有する動物 (好ましくはヒト) 由来の細胞もしくは組織を、「該核酸を含むプロモーターの制御下にある遺伝子を含む動物細胞」として使用することができる。該核酸を含むプロモーターの制御下にある遺伝子としてレポーター遺伝子を用いる場合は、該核酸を含む上記プロモーターの下流にレポーター遺伝子を自体公知の遺伝子工学的手法を用いて連結したものを、適当な導入ベクター、例えば、大腸菌由来のプラスミド (例: pBR322, pBR325, pUC12, pUC13)、枯草菌由来のプラスミド (例: pUB110, pTP5, pC194)、酵母由来プラスミド (例: pSH19, pSH15)、λファージなどのバクテリオファージ等のベクター中に挿入し、宿主動物細胞に導入することができる。該導入ベクターは、所望により他のエンハンサー、ポリA付加シグナル、選択マーカー、SV40複製オリジン (以下、SV40oriと略称する場合がある) などを含有していてもよい。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子[メソトレキセート (MTX) 耐性]、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子 (G418耐性) 等が挙げられる。
動物細胞は、該転写因子を発現し得る細胞であれば特に制限はなく、例えば、Huh-7細胞などを用いることもできるが、これに限定されない。該動物細胞は、例えば、 細胞工学別冊8 新細胞工学実験プロトコール, 263-267 (1995年) (秀潤社発行)、Virology, 52: 456 (1973) に記載の方法に従って形質転換することができる。
試験化合物としては、例えばペプチド, 蛋白質, 非ペプチド性化合物, 合成化合物, 発酵生産物, 細胞抽出液, 植物抽出液, 動物組織抽出液などが挙げられる。
試験化合物の存在下および非存在下に、適当な培地(例: 最小必須培地, ダルベッコ改変イーグル培地, ハム培地, F12培地, RPMI1640培地, ウイリアムE培地等) 中で一定時間細胞を培養した後、該核酸を含むプロモーターの制御下にある遺伝子の発現を両条件下で比較する。EDG2遺伝子の発現は、上記抗EDG2抗体を用いたELISAなどのイムノアッセイ法や、RT-PCR法により検出・定量することができる。
あるいは、上記の方法に用いられ得る動物細胞を用い、該転写因子の細胞内局在性を、例えば、該動物細胞における該因子の細胞質から核への移行の度合を指標として、試験化合物の存在下および非存在下で比較することによっても、骨・関節疾患の予防・治療物質をスクリーニングすることができる。より具体的には、例えば、該転写因子に対する蛍光標識した抗体で該細胞を免疫染色することにより、該因子の細胞質から核への移行をモニタリングすることができる。あるいは、該転写因子をGFPなどの蛍光蛋白質との融合蛋白質として発現し得る形質転換体を用いることにより、直接的に該因子の細胞質から核への移行をモニタリングすることもできる (例えば、Biochem. Biophys. Res. Commun., 278: 659-664 (2000) を参照)。
上記のスクリーニング法において、該核酸と該転写因子の結合を阻害した試験化合物は、関節における炎症性サイトカイン発現、関節破壊（例、関節軟骨破壊）、骨・関節疾患における疼痛等の抑制剤として用いることができ、従って、軟骨基質異常を生じる骨・関節疾患および疼痛を伴う症候性の骨・関節疾患、例えば、変形性関節症、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症、スポーツによる関節障害、先天性骨系統疾患 (例: 軟骨無形成症, 多発性骨端異形成症, 脊椎骨端異形成症, 骨幹端異形成症, Stickler症候群, 偽性軟骨無形成症, 多発性外骨腫, 片側肥大, オリエール病, マフッチ症候群等)、骨軟骨腫、骨腫瘍、軟骨腫瘍などの疾患、好ましくはOA（例えば、HOAもしくはKOA）、より好ましくはKOAの予防・治療剤として使用することができる。
上記の結合阻害化合物を上記予防・治療剤として使用する場合は、前記したEDG2アンタゴニスト等の場合と同様にして製剤化することができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや他の温血動物 (例えば、ラット, マウス, ハムスター, ウサギ, ヒツジ, ヤギ, ブタ, ウシ, ウマ, ネコ, イヌ, サル, チンパンジー, トリなど) に対して投与することができる。
上記の結合阻害化合物の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に、例えば変形性関節症患者 (60 kgとして) においては、一日につき約0.1〜100 mg、好ましくは約1.0〜50 mg、より好ましくは約1.0〜20 mgである。非経口的に投与する場合は、その1回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば注射剤の形では、通常、例えば変形性関節症患者 (60 kgとして) においては、一日につき約0.01〜30 mg程度、好ましくは約0.1〜20 mg程度、より好ましくは約0.1〜10 mg程度を投与するのが好都合である。他の動物の場合も、ヒト60 kg当たりに換算した量を投与することができる。
上述のように、i-EDG2-03、i-EDG2-09、i-EDG2-12およびi-EDG2-25の各多型において、マイナーアレル（i-EDG2-03ではT/insアレル、i-EDG2-09ではAアレル、i-EDG2-12ではTアレル、i-EDG2-25ではTアレル）はOAをはじめとする骨・関節疾患に対して感受性のアレルである。また、i-EDG2-09について、AアレルではGアレルに比べて、転写因子AP-1が活性化される条件下でEDG2遺伝子の転写活性が上昇する。一方で、EDG2は、関節において炎症性サイトカイン発現を誘導することにより、軟骨基質分解酵素群の発現を上昇させ、関節破壊（例、関節軟骨破壊）を惹起するとともに、骨・関節疾患における疼痛を惹起し得ることが強く示唆される。以上より、上記感受性アレルを有する動物個体では、EDG2の過剰発現に伴って、関節における炎症性サイトカイン発現が上昇し、関節破壊（例、関節軟骨破壊）を引き起こしたり、骨・関節疾患において疼痛の症状を示したりするリスクが、非感受性アレルを有する個体に比較して高いと考えられる。従って、上記感受性アレルを有する個体に対しては、EDG2の発現もしくは活性を抑制する物質（EDG2抑制薬）の投与が、骨・関節疾患、特に軟骨基質異常を生じる骨・関節疾患および疼痛を伴う症候性の骨・関節疾患、例えば、変形性関節症、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症、スポーツによる関節障害、先天性骨系統疾患 (例: 軟骨無形成症, 多発性骨端異形成症, 脊椎骨端異形成症, 骨幹端異形成症, Stickler症候群, 偽性軟骨無形成症, 多発性外骨腫, 片側肥大, オリエール病, マフッチ症候群等)、骨軟骨腫、骨腫瘍、軟骨腫瘍などの疾患、好ましくはOA（例えば、HOAもしくはKOA）、より好ましくはKOAの予防・治療に有効である。
従って、本発明はまた、i-EDG2-03、i-EDG2-09、i-EDG2-12およびi-EDG2-25のいずれかの多型について感受性アレルを有する、好ましくは感受性アレルについてのホモ接合体である動物個体（好ましくは、ヒト）に対して投与することを特徴とする、前記EDG2抑制薬を含有してなる、関節における炎症性サイトカイン発現、関節破壊（例、関節軟骨破壊）、骨・関節疾患における疼痛の抑制剤、軟骨基質異常を生じる骨・関節疾患および疼痛を伴う症候性の骨・関節疾患、例えば、変形性関節症、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症、スポーツによる関節障害、先天性骨系統疾患 (例: 軟骨無形成症, 多発性骨端異形成症, 脊椎骨端異形成症, 骨幹端異形成症, Stickler症候群, 偽性軟骨無形成症, 多発性外骨腫, 片側肥大, オリエール病, マフッチ症候群等)、骨軟骨腫、骨腫瘍、軟骨腫瘍などの疾患、好ましくはOA（例えば、HOAもしくはKOA）、より好ましくはKOAの予防・治療剤を提供する。
この場合も、EDG2抑制薬は上記と同様の手法により製剤化することができ、また、投与量・投与経路についても上記と同様のものが用いられ得る。
EDG2は、そのリガンドであるLPAの刺激を受けて、炎症性サイトカインの発現を誘導し、それにより軟骨基質分解酵素群の発現を誘導して関節軟骨の破壊を惹起するとともに、骨・関節疾患における疼痛を惹起する。従って、LPAによる刺激を遮断することによっても、前記EDG2抑制薬と同様の効果が得られうる。
したがって、本発明はまた、LPAの産生もしくは活性を抑制する物質を含有してなる、関節における炎症性サイトカイン発現、関節破壊（例、関節軟骨破壊）、骨・関節疾患における疼痛の抑制剤、軟骨基質異常を生じる骨・関節疾患および疼痛を伴う症候性の骨・関節疾患、例えば、変形性関節症、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症、スポーツによる関節障害、先天性骨系統疾患 (例: 軟骨無形成症, 多発性骨端異形成症, 脊椎骨端異形成症, 骨幹端異形成症, Stickler症候群, 偽性軟骨無形成症, 多発性外骨腫, 片側肥大, オリエール病, マフッチ症候群等)、骨軟骨腫、骨腫瘍、軟骨腫瘍などの疾患、好ましくはOA（例えば、HOAもしくはKOA）、より好ましくはKOAの予防・治療剤を提供する。
LPAの産生を阻害する物質としては、例えば、LPA産生酵素の発現もしくは活性を阻害する物質等が挙げられるが、それらに限定されない。LPAはホスファチジルコリンからホスホリパーゼD（PLD）および分泌性ホスホリパーゼA2（sPLA2）を介して、またはホスホリパーゼA2（PLA2）、レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ（LCAT）およびオートタキシン/リゾホスホリパーゼD（ATX/lysoPLD）を介して、あるいはモノアシルグリセロール（MAG）からMAGキナーゼを介して産生される。従って、これらの酵素群の1以上の発現もしくは産生を阻害することにより、LPAの産生を阻害することができる。該酵素群の発現を阻害する物質としては、各酵素遺伝子のアンチセンス核酸やsiRNA等が挙げられる。これらの分子は、自体公知の各酵素遺伝子のヌクレオチド配列情報に基づいて、アンチセンスEDG2について上記したと同様の手法により取得することができる。一方、該酵素群の活性を阻害する物質としては、各酵素蛋白質に対する中和抗体や公知の酵素阻害剤などが挙げられる。該中和抗体は、市販されているものをそのまま用いることもできるし、各酵素蛋白質もしくはそのペプチド断片を抗原として、抗EDG2抗体について上記したと同様の手法により取得することができる。また、LPA産生酵素インヒビターとしては、例えば、クロルプロマジン、キナクリン、アラキドニルトリフルオロメチルケトン、パルミチルトリフルオロメチルケトン、抗アネキシン抗体等のPLA2インヒビター、エタノール、１−ブタノール、２，３−ジホスホグリセレート等のPLDインヒビター、DTNB、PCMPS等のLCATインヒビター、環状ホスファチジン酸アナログ等のATXインヒビター等が挙げられる。
LPAの活性を阻害する物質としては、上記EDG2アンタゴニストの他、LPAに対する抗体等が例示されるが、それらに限定されない。抗LPA中和抗体としては、市販のものをそのまま使用することもできるし、LPAをハプテンとして適当なキャリア蛋白質（例えば、KLH、アルブミンなど）とコンジュゲート化し、これを抗原として抗EDG2抗体について上記したと同様の手法により取得することができる。
LPA産生酵素遺伝子のアンチセンス核酸やsiRNAは、アンチセンスEDG2と同様にして製剤化することができる。また、抗LPA産生酵素中和抗体や抗LPA中和抗体は、抗EDG2抗体と同様にして製剤化することができる。さらに、LPA産生酵素インヒビターは、EDG2アンタゴニストと同様にして製剤化することができる。
上記LPAの産生もしくは活性を阻害する物質の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に、例えばOA患者 (60 kgとして) においては、一日につき約0.1〜100 mg、好ましくは約1.0〜50 mg、より好ましくは約1.0〜20 mgである。非経口的に投与する場合は、その1回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば注射剤の形では、通常、例えばOA患者 (60 kgとして) においては、一日につき約0.01〜30 mg程度、好ましくは約0.1〜20 mg程度、より好ましくは約0.1〜10 mg程度を投与するのが好都合である。他の動物の場合も、ヒト60 kg当たりに換算した量を投与することができる。
本明細書において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければL体を示すものとする。
DNA : デオキシリボ核酸
cDNA : 相補的デオキシリボ核酸
A : アデニン
T : チミン
G : グアニン
C : シトシン
RNA : リボ核酸
mRNA : メッセンジャーリボ核酸
dATP : デオキシアデノシン三リン酸
dTTP : デオキシチミジン三リン酸
dGTP : デオキシグアノシン三リン酸
dCTP : デオキシシチジン三リン酸
ATP : アデノシン三リン酸
EDTA : エチレンジアミン四酢酸
SDS : ドデシル硫酸ナトリウム
Gly : グリシン
Ala : アラニン
Val : バリン
Leu : ロイシン
Ile : イソロイシン
Ser : セリン
Thr : スレオニン
Cys : システイン
Met : メチオニン
Glu : グルタミン酸
Asp : アスパラギン酸
Lys : リジン
Arg : アルギニン
His : ヒスチジン
Phe : フェニルアラニン
Tyr : チロシン
Trp : トリプトファン
Pro : プロリン
Asn : アスパラギン
Gln : グルタミン
pGlu : ピログルタミン酸
Sec : セレノシステイン(selenocysteine)
また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記する。
Me : メチル基
Et : エチル基
Bu : ブチル基
Ph : フェニル基
TC : チアゾリジン-4(R)-カルボキサミド基
Tos : p-トルエンスルフォニル
CHO : ホルミル
Bzl : ベンジル
Cl2-Bzl : 2,6-ジクロロベンジル
Bom : ベンジルオキシメチル
Z : ベンジルオキシカルボニル
Cl-Z : 2-クロロベンジルオキシカルボニル
Br-Z : 2-ブロモベンジルオキシカルボニル
Boc : t-ブトキシカルボニル
DNP : ジニトロフェニル
Trt : トリチル
Bum : t-ブトキシメチル
Fmoc : N-9-フルオレニルメトキシカルボニル
HOBt : 1-ヒドロキシベンズトリアゾール
HOOBt : 3,4-ジヒドロ-3-ヒドロキシ-4-オキソ-1,2,3-ベンゾトリアジン
HONB : 1-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド
DCC : N,N’-ジシクロヘキシルカルボジイミド
本願明細書の配列表中の配列番号: 1-3は、以下の配列を示す。
[配列番号: 1]
ヒトEDG2 cDNAのCDSの塩基配列を示す。
[配列番号: 2]
EDG2遺伝子にコードされるヒトEDG2蛋白質のアミノ酸配列を示す。
[配列番号: 3]
ヒトEDG2遺伝子の5’フランキング領域、第1エクソンおよび第1イントロンからなる領域の塩基配列を示す。
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これらは単なる例示であって本発明を何ら限定するものではない。
実施例1 オリゴヌクレオチドマイクロアレイ解析による軟骨に発現しているGPCRの選出
相関解析を用いた変形性関節症 (OA) 感受性遺伝子を同定する手法として、関節軟骨に発現するG タンパク質共役型受容体 (G protein coupled receptor, GPCR) に対する候補遺伝子アプローチを採用した。OA感受性遺伝子の候補遺伝子としてGPCRをターゲットにすることにより、直接的な低分子化合物による創薬ターゲットを同定できる可能性がある。また、OA感受性シグナル伝達経路も同定することができ、そのシグナルに関与する分子をも創薬ターゲットとして検討することができる。しかしながら、すべてのGPCRを候補遺伝子とするのは現実的ではない。そこで、OAの主な病変部位である関節軟骨に発現するGPCRについて相関解析を行うこととした。
GPCRの発現解析は、約６万種類のターゲット配列に対するオリゴヌクレオチドプローブから構成されるマイクロアレイセット（GeneChip U95およびU133, Affymetrix）を用いて行った。ビオチン化cRNAの調製とアレイハイブリダイゼーションなどの一連の操作はAffymetrix GeneChip expression analysis manualに準じて行った。OA関節軟骨および正常関節軟骨のRNAは、武田薬品工業株式会社の社内倫理委員会の承認の下に、Direct Clinical Access社より購入した。まず、Total RNA 5-10μgを鋳型とし、T7-poly T primerとSuperscript II (Invitrogen)を用いてfirst strand cDNAを合成した。次に、E.coli DNA polymerase I (Invitrogen) とligase (Invitrogen) を用いてsecond strand cDNAを合成した。得られた二本鎖cDNAを用いて、ビオチン化UTPとCTP (Enzo Diagnostics)の存在下でin vitro transcription (Ambion) を行った。ビオチン化cRNAを、Tris (pH 8.1), 100 mM 酢酸カリウム, 30 mM 酢酸マグネシウムを含むバッファー中、94℃で30分間インキュベートすることにより断片化し、アレイハイブリダイゼーションを行った。洗浄および染色は専用のFluidics Station (Affymetrix) を用いて行った。シグナルは専用のConfocal Scanner (Molecular Dynamics) を用いて検出した。上記の方法により、膝関節OA患者由来関節軟骨 (n=5)、股関節OA患者由来軟骨 (n=5)、正常膝関節軟骨 (n=3)および正常股関節軟骨 (n=3)より抽出したtotal RNAから作製したビオチン化cRNAプローブを用いてマイクロアレイ解析を行い、いずれかの個人で ”presence”と判定されたGPCRを、「関節軟骨発現GPCR」とした。その結果、軟骨発現GPCRとして64遺伝子を選択した (表1)。
実施例2 ジェノタイピングプローブの選出
相関解析を行うためには、疾患群（ケース）と対照群（コントロール）の各個人について、各遺伝子上に存在する一塩基多型 (Single nucleotide polymorphism, SNP) の遺伝子型（ジェノタイプ）を決定する必要がある。そこで、理化学研究所遺伝子多型研究センター (理研SRC) 保有のインベーダープローブを用いて遺伝子型の決定（ジェノタイピング）を行うこととした。実施例1で選択した64個の軟骨発現GPCR遺伝子に対して、理研SRC保有のインベーダープローブの有無についてデータベースサーチを行った。その結果、47遺伝子について、インベーダープローブが登録されていた。
1遺伝子あたりのプローブ数が1である8遺伝子については、無条件にそのプローブを用いてジェノタイピングを行うこととした。1遺伝子あたりのプローブ数が2以上である残りの39遺伝子については、理研SRCのジェノタイプデータを用いてハプロタイプタギングSNP (htSNP) を選出し、ジェノタイピングプローブとして使用することとした。htSNPの選出手順について記す。まず、39遺伝子に存在する全てのインベーダープローブについて理研SRCのジェノタイピングデータを参照し、ハーディ・ワインベルグ平衡 (Hardy-Weinberg’s equilibrium, HWE) を満たす544個のプローブを選択した (P ≧ 0.01)。この544個のプローブのうち、マイナーアレル頻度 (Minor allele frequency, MAF) が10%以上のプローブのジェノタイプデータから、ガブリエル法を用いてハプロタイプブロックを推定した。推定されたハプロタイプブロックについて、そのブロックにおける頻度1%以上のハプロタイプを全て表現するSNPを、htSNPとして選出した。htSNPの選出を行った39遺伝子のうち、37遺伝子に関しては、1遺伝子あたり1〜11個のhtSNPが存在していた。これらの遺伝子に対するhtSNPの総数は162であった。残りの2遺伝子 (GRM7およびGRM8) については、htSNPの数はそれぞれ45および47であった。これらの2遺伝子は、他の遺伝子に対して多数のhtSNPをタイピングする必要があるため、今回のスクリーニングからは除外した。また、X染色体上のSNPも解析対象から除外した。以上の過程を経て、最終的に44遺伝子に対する167 SNPを、ジェノタイピングの対象SNPとして決定した (表2)。
実施例3 段階的スクリーニングを用いた膝OA感受性多型の選出
相関解析には、2段階の段階的スクリーニングの手法を用いた。スクリーニングで使用するケース集団は、日本の各医療機関に来院した患者群であり、X線画像診断の結果、膝関節にOA変化が認められた集団である (ラジオグラフィックOA患者集団)。1次スクリーニングとして、日本人膝OA集団368人および対照集団323人から抽出したゲノムDNAに対して、Ohnishiら [J Hum Genet. 2001;46(8):471-7.] の方法に従い、インベーダー法によってジェノタイピングを行った。ジェノタイピングを行った167 SNPのうち、4 SNPは多型性がなかった。また、5 SNPは対照集団でHWE (P ≧ 0.01)を満たさず、さらに、6 SNPはプローブがワークせず、ジェノタイピングが出来なかった。これらのSNPを除外した155 SNPについてχ2検定もしくはフィッシャーの正確な検定による相関解析を行ったところ、13 SNPがP < 0.05の相関を示した。これらの13 SNPに対して、1次スクリーニングと重複しない日本人膝OA集団276人についてジェノタイピングを行い、理研SRCのデータベースに登録されている654人対照集団のジェノタイプデータを用いて相関解析を行ったところ、2 SNP (rs3739216およびrs3739708) が P < 0.05の相関を示した。しかしながら、rs3739216は、1次スクリーニングと2次スクリーニングにおけるMAFの傾向が膝OA集団と対照集団で逆転し、両スクリーニングデータを統合した解析ではP > 0.05となったため、棄却した。最終的に、rs3739708が2段階のスクリーニングを通過した (表3)。本スクリーニングにより、rs3739708の存在する連鎖不平衡 (linkage disequilibrium, LD) 領域に膝OA感受性多型が存在することが示唆された。
実施例4 日本人膝OA集団を用いたrs3739708の連鎖不平衡領域の決定
実施例3に示す2段階スクリーニングによって、膝OAと高い相関を示すrs3739708が選出された。Common disease-common variant仮説から、真の膝OA感受性多型はrs3739708と同じLD領域に存在すると考えられる。我々は、rs3739708を含む約800kbの領域に存在する多型について、インベーダープローブもしくはApplied biosystems社で既に設計済みのTaqManプローブ (表4のProbe typeのカラムで、InvaderもしくはTaqManと記載のあるプローブ) を用いて、1次スクリーニングで使用した膝OA患者群のジェノタイピングを行った。それらのうち、MAFが10%以上の多型を用いてrs3739708との連鎖不平衡定数D’を計算した。その結果、rs3739708とD’ > 0.9の関係にある多型はrs7041855およびrs3739707であった (図1a)。一方、rs3739708から約35 kb上流にあるrs11794726および約10 kb下流にあるrs12353088とのD’はそれぞれ、0.69および0.40であることから、rs3739708の存在するLD領域はこれらの2 SNPに挟まれる約45 kb領域内にあることが示唆された (図1a)。この領域をrs3739708 LD領域と呼ぶことにする。
実施例5 rs3739708 LD領域における多型ディスカバリー
真の膝OA感受性多型を同定するため、rs3739708 LD領域に対して、Iidaら[J Hum Genet. 2005;50(1):42-5.] の方法に従い、多型ディスカバリーを行った。方法を簡単に記す。ゲノムDNAは48人から抽出し、3個人ずつ混合した16種類の混合ゲノムを使用した。Genbankデータベースに報告のあるゲノム配列 (AC007157.6) を元に、rs11794726とrs12353088とに挟まれる領域を増幅するプライマーを作成した。これらのプライマーを用いて、混合ゲノムDNA 20 ngに対してPCRを行った。PCRは、GeneAmp PCRシステム（Applied biosystems）を用いて、以下の条件で行った。すなわち、初期変性を94℃で2分間行った後、94℃で30秒間（熱変性）、60℃で30秒間（アニーリング）、72℃で2分間（伸長反応）の3温度を1サイクルとした反応を35サイクル行い、最後に最終伸長反応として72℃で7分間反応させた。配列決定は、蛍光dyeターミネーターを用いたサイクルシークエンス法により、PCR反応産物を鋳型として行った。全ての遺伝子多型はポリフレッドコンピュータープログラムを用いて決定した。その結果、多型ディスカバリーを行った領域には、24個のSNPと3個の挿入/欠失多型があることが明らかになった (図1b、表5)。そのうち、9個の多型はNCBIの公開しているdbSNPへの登録がなく、新規多型であった。
実施例6 rs3739708 LD領域の確認
実施例5で存在が明らかになった多型について、Assays-by-Designサービス（Applied biosystems）によってジェノタイピング用TaqManプローブを作成した。このTaqManプローブを用いて、1次スクリーニングで使用した膝OA患者群の各個人から採取したゲノムDNA (368人) を試料として、384マルチウェルプレート上でジェノタイピング反応を行った。検出は、ABI Prism 7900 (Applied biosystems) を用いて行い、Sequence Detection Software (Applied biosystems) を用いて解析した。また、TaqManプローブが作成できなかった多型については、当該多型領域を増幅するPCRプライマーを作成し、ゲノムDNAを鋳型としてPCRを行い、実施例5に記載した方法にしたがってジェノタイピングを行った。これらのうち、MAFが10%以上の多型および実施例4で使用したrs3739708を含む800 kbの領域に存在する多型のジェノタイプデータを用いて、ペアワイズにD’を計算し、LDマップを作成した (図1c)。その結果、実施例5でrs3739708 LD領域に存在する多型は、互いにD’>0.9の関係にあることが明らかとなった (i-EDG2-24のみD’ > 0.5)。
実施例7 rs3739708 LD領域内多型の日本人一般集団における相関解析
rs3739708連鎖不平衡領域内に存在する全ての多型について、膝OA患者644人 (1次および2次スクリーニングで使用した集団) および対照集団640人について、実施例4および6に記載の方法に従ってジェノタイピングを行い、相関解析を行った。その結果、rs3739708 (i-EDG2-25) よりも強い相関を示す多型を3つ同定した (表6)。これらの多型は、全てマイナーアレルの劣性モデルで最も強い相関を示した。またこれらの多型は、互いにほぼ完全連鎖の関係にあった (Δ > 0.85)。
実施例8 ハプロタイプ解析
実施例7で取得したジェノタイピングデータを用いて、rs3739708連鎖不平衡領域におけるハプロタイプ解析を行った。ハプロタイプ解析に用いたSNPは、マイナーアレル頻度が10%を超える13個のSNPである。その結果、この領域には、8つのハプロタイプが全集団 (膝OA患者および対照集団) の95%を占めることがわかった (表７)。これらのハプロタイプについて相関解析を行ったところ、実施例7で同定した3つのSNPよりも高い相関を示すハプロタイプは認められなかった (表７)。このことは、rs3739708連鎖不平衡領域における真の疾患感受性多型は、実施例7で高い相関を示した3 SNPの中にあることを強く示唆するものである。
実施例9 日本人一般集団での膝OA高相関多型に対するコホート集団での再現性解析
rs3739708 LD領域内に存在する4つの膝OA高相関多型 (i-EDG2-03, 09, 12および25) について、三重県コホート (宮川村と南勢町) における相関解析を実施した。相関解析は、X線画像上でOAと判定される集団 (238人、OA集団) をケースとし、X線画像上でOA所見が認められず、かつ痛みのない集団(279人、非OA集団) をコントロールとして実施した。その結果、i-EDG2-09, 12および25がマイナーアレルの劣性モデルでP < 0.05の相関を示した (表８)。この結果は、実施例7と合わせて、i-EDG2-09, 12および25の膝OAとの相関が、独立した2つのケース・コントロール集団で再現されたことを意味する。i-EDG2-09の最終的な相関値は、独立した2集団（日本人一般集団とコホート集団） のP値をかけた0.0000015である。これは、1次スクリーニングで用いたSNP数 (155 SNPs) でボンフェローニ補正を行っても有意な値である。
実施例10 EDG2遺伝子のヒト組織における発現解析
相関解析の結果から、EDG2遺伝子が膝OA感受性遺伝子であることが示唆された。EDG2は、リゾホスファチジン酸 (lysophosphatidic acid, LPA) をリガンドとするGPCRである。LPAには、EDG2を含めて4つの受容体が報告されている (EDG2, EDG4, EDG7およびGPR23)。これら4つのLPA受容体の組織分布を解析するため、ヒト各種組織における定量的リアルタイムPCRによる発現定量解析を実施した。ヒト各種組織 (Human Total RNA Master Panel, Clontech) のtotal RNA 500 ngに対して、Multiscribe reverse transcriptase (Applied biosystems) およびrandom hexamerを用いて逆転写を行い、cDNAを得た。LPA受容体遺伝子の定量は、QuantiTect STBR Green PCR (Qiagen) を用いて、ABI PRISM 7700 sequence detection system (Applied biosystems) 上で、添付文書の方法に準じて行った。各遺伝子のコピー数は、検量線を用いて算出した。また、各遺伝子量は、G3PDH遺伝子のコピー数で割り込み、標準化した。遺伝子定量に用いたプライマーを、表9に記す。G3PDH遺伝子に対するプライマーは東洋紡社の製品を使用した。その結果、EDG2遺伝子は脳 (whole brain) および脊髄 (spinal cord) に強く発現していることが明らかになった。これらの臓器では、EDG2遺伝子の発現量が他のLPA受容体遺伝子と比較して20〜100倍程度高く、dominantなLPA受容体である (図2)。また、EDG2遺伝子は副腎、小脳、肺、胎盤、前立腺、精巣、甲状腺、気管、子宮にも中程度に発現していることが明らかになった (図2)。これらの組織では、必ずしもEDG2がdominantなLPA受容体ではなかった。
実施例11 EDG2遺伝子のOA滑膜およびOA関節軟骨における発現解析
実施例10で対象とした4つのLPA受容体の関節組織における発現を解析するため、膝OA患者の関節軟骨および滑膜組織に対して、定量的リアルタイムPCRによる発現定量解析を実施した。方法は実施例10に準じた。各組織 (関節軟骨n=4、滑膜n=3) からtotal RNAをIsogen (ニッポンジーン) を用いて抽出し、total RNA 500 ngに対して、Multiscribe reverse transcriptase (Applied biosystems) およびrandom hexamerを用いて逆転写を行い、cDNAを得た。LPA受容体遺伝子の定量は、QuantiTect STBR Green PCR (Qiagen) を用いて、ABI PRISM 7700 sequence detection system (Applied biosystems) 上で、添付文書の方法に準じて行った。各遺伝子のコピー数は、検量線を用いて算出した。また、各遺伝子量は、G3PDH遺伝子のコピー数で割り込み、標準化した。遺伝子定量に用いたプライマーを、表9に記す。G3PDH遺伝子に対するプライマーは東洋紡社の製品を使用した。その結果、EDG2遺伝子は、膝OA関節軟骨およびOA滑膜に発現していることが明らかになった。EDG2遺伝子の発現量は、滑膜において高く、関節軟骨と比較して約10倍程度であった。また、滑膜組織では、EDG2遺伝子が他のLPA受容体遺伝子に対して、発現量が約25倍程度発現しており、EDG2遺伝子は滑膜においてdominantなLPA受容体であることが示された (図3)。一方、関節軟骨においては、EDG2遺伝子に他にGPR23遺伝子が同程度に発現しており、EDG2がdominantなLPA受容体ではないことが示された (図3)。
実施例12 滑膜細胞株E11細胞のphorbol 12-myristate 13-acetate刺激における転写因子AP-1活性化の検討
EDG2遺伝子はOA滑膜においてdominantなLPA受容体であることから、OA感受性多型の機能解析は滑膜細胞を用いて行うこととした。E11細胞は、慢性リウマチ患者の滑膜由来の繊維芽細胞様細胞をサルSV40ラージT抗原で不死化した細胞株である (Abe et al, J Rheumatol. 1997 Mar;24(3):420-9.)。i-EDG2-09および12の存在するEDG2の5’-flanking領域には、AP-1結合モチーフが存在する。そこで、E11細胞においてAP-1による転写活性化機構が存在するかどうかを検討するため、E11細胞をphorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) で刺激し、AP-1の結合モチーフがルシフェラーゼ遺伝子の前に組み込まれたコンストラクト (PathDirectAP-1cis-Reporting system, Stratagene) のルシフェラーゼ活性を測定した。方法を記す。E11細胞は10% 胎仔ウシ血清(FBS)、抗生物質 (100 U/ml ペニシリン Gと100 μg/ml ストレプトマイシン) およびL-glutamine (200 mM) を含むDulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM, Sigma)で培養した。トランスフェクションの前日、E11細胞を5 x 104 個/ウェルとなるように24マルチウェルプレートに播種した。翌日、Fugene-6 (Roche diagnostics) を用いて、1ウェルあたり、レポーターコンストラクト200 ng、およびトランスフェクション効率を補正する内部標準としてのpRL-TK (Promega) 4 ngをトランスフェクションした。トランスフェクションから24時間後、細胞を0.1, 1および10 ng/mlのPMAを含む培地で培養した。刺激から24時間後に可溶化し、ピッカジーン・デュアル・シーパンジーシステム (東洋インキ) を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。例数はn=2とした。その結果、PMAの用量依存的にルシフェラーゼ活性が上昇することが明らかになった (図4a)。この結果は、E11細胞において、PMA刺激によるAP-1活性化機構が存在することを示す。
実施例13 滑膜細胞株E11細胞のPMA刺激におけるEDG2遺伝子の発現制御の検討
実施例12の結果から、E11細胞ではPMA刺激によってAP-1が活性化する機構が存在することが明らかになった。そこで、E11細胞においてPMAがEDG2遺伝子発現を変化させるかについて経時的に検討した。方法を記す。E11細胞を1 x 105 個/ウェルとなるように24マルチウェルプレートに播種した。細胞をコンフルエント状態になるまで培養した後、PMA (10 ng/ml) で刺激し、0, 2, 4, 9, 12および24時間後のtotal RNAをISOGENを用いて回収した。これらのtotal RNA中のEDG2遺伝子のG3PDHに対する発現量は実施例11に記載の方法に準じて行った。例数はn=4とした。その結果、PMA添加から2時間から12時間後にかけて、EDG2遺伝子の発現量は経時的に上昇した (図4b)。このことは、PMA刺激によって、EDG2遺伝子の発現上昇シグナルが活性化されることを示す。
実施例14 レポーターアッセイによるi-EDG2-09の転写活性に及ぼす影響 (アレル間の比較)
膝OAと高い相関を示した2多型のうち、i-EDG2-09の1〜7 bp上流にはDuncliffeらの報告 [Immunity. 1997 Feb;6(2):175-85.] に記載のAP-1結合モチーフが存在し、11〜16 bpにはGuoらの報告 [J Biol Chem. 2001 Dec 28;276(52):48871-8.] に記載のNFAT結合モチーフが存在する。AP-1とNFATがタンデムに位置する転写因子結合モチーフの存在は、複数の遺伝子で知られている[Macian F, Lopez-Rodriguez C and Rao A., Oncogene. 2001 Apr 30;20(19):2476-89. Review.]。一方、i-EDG2-12を含む周辺配列には、明確な転写因子結合配列は存在しなかった。そこで、i-EDG2-09のEDG2遺伝子転写活性に与える影響を、ルシフェラーゼレポーターアッセイによって解析した。i-EDG2-09を中心とし、AP-1およびNFAT結合モチーフを含む領域 (EDG2の転写開始点から -2809〜-2839の領域) の5’側に制限酵素NheIの接着末端4 bp、3’側にXbaIの接着末端4 bpを付加したオリゴヌクレオチド（センス鎖およびアンチセンス鎖）を、i-EDG2-09の両アレル (GもしくはA) について作成した。これらのオリゴヌクレオチドを各アレルごとに二本鎖DNAとした後、ルシフェラーゼレポーターベクターであるpGL3-promoter vector (Promega) のNheI部位に、5’→3’の方向性を保持したまま各アレルが5回タンデムに組み込まれたレポーターコンストラクトを、GアレルおよびAアレルについて作成した。これらのコンストラクトを、10% 胎仔ウシ血清 (FBS) および抗生物質 (100 U/ml ペニシリン Gと100 μg/ml ストレプトマイシン) を含むDulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM, Sigma)で培養したE11細胞に、トランスフェクションした。トランスフェクションは、以下の手順で行った。トランスフェクションの前日、E11細胞を5 x 104 個/ウェルとなるように24マルチウェルプレートに播種した。翌日、Fugene-6 (Roche Diagnostics) を用いて、1ウェルあたり、レポーターコンストラクト200 ng、およびトランスフェクション効率を補正する内部標準としてのpRL-TK (Promega) 4 ngをトランスフェクションした。トランスフェクションから24時間後、細胞を10 ng/mlのPMAを含む培地で刺激した。刺激から5時間後に可溶化し、ピッカジーン・デュアル・シーパンジーシステム (東洋インキ) を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。その結果、両コンストラクトともに、PMAの添加によってルシフェラーゼ活性が有意に上昇した。また、PMA非添加時では、GアレルとAアレルに転写活性の差は無いが、PMA添加時では、AアレルにおいてGアレルよりも2.4倍高い転写活性が確認された (図5)。この結果から、Aアレルは転写活性を上昇させるアレルであることが明らかになった。Aアレルのホモ接合体の個体数は膝OA患者群で多いことから、EDG2遺伝子の転写活性化が膝OAの発症もしくは進展に関与している可能性が示唆された。
実施例15 ゲルシフトアッセイによるi-EDG2-09に対する核内因子結合親和性の検討 (アレル間の比較)
実施例14において、i-EDG2-09はアレル間で転写活性に差があることが明らかになった。そこで、この転写活性の差が、各アレルに対する核内因子の結合親和性の差に依存するかを検討するため、PMAで刺激をしたE11細胞の核抽出物を用いてゲルシフトアッセイを行った。方法を記す。E11細胞を100 mm dishでコンフルエント状態にした後、PMA (10 ng/ml) を含む培地で0, 1, 2, 4および8時間培養した。各時間経過後、E11細胞の核抽出タンパク質を、Andrewsら [Nucleic Acids Res. 1991 Nov 25;19(22):6263-8.] の方法に従い調整した。オリゴヌクレオチドのアニーリングとDIGラベリングは、DIG ゲルシフトキット (Roche Diagnostics) を用いて行った。使用したオリゴヌクレオチドの配列を表10に記す。DIGラベルしたプローブを、PMA刺激したE11細胞核抽出物と混合して20分間室温でインキュベーションし、DNA-タンパク質複合体を形成した。形成したDNA-タンパク質複合体は、0.5% Tris-ホウ酸-EDTAバッファー中で、6%ポリアクリルアミドゲルによって分離した。DIGラベルしたプローブと非標識プローブの競合実験に際しては、ラベルしたプローブと核抽出物の混合に先立って、ラベルしたプローブの125倍量の非標識プローブを添加した。泳動後、DNA-タンパク質複合体をニトロセルロース膜に転写し、ベーキング (120℃、30分間) によって架橋した後、化学発光検出システム (Roche Diagnostics社) で標識プローブ由来のシグナルを検出した。
まず、AアレルのオリゴヌクレオチドとPMAで経時的に刺激したE11細胞の核抽出物を用いてゲルシフトアッセイを行った。その結果、E11細胞の核抽出物とラベル化オリゴを混合したレーンにおいて特異的なバンドが確認された (図6a, 矢印1および2)。バンド1のシグナル強度はPMA刺激後2時間で飽和に達し、バンド2のシグナルはPMA刺激後8時間まで経時的に上昇した。このことは、Aアレルのオリゴヌクレオチドに結合性の核内因子が経時的に核内移行することを示唆する。次に、バンド2のシグナル強度が最も強くなるPMA刺激8時間後のE11核抽出物と、AアレルもしくはGアレルのヌクレオチドを混合してゲルシフトアッセイを行った。その結果、Gアレルのオリゴヌクレオチドにも、Aアレルのオリゴヌクレオチドと同様に核内因子の結合に由来するバンドを確認することができた (図6b, 矢印1および2)。これらのバンドは各々の非標識オリゴヌクレオチドによって消失することから、非特異的な結合でないことが示されている。バンドの強度をアレル間で比較した場合、バンド1の強度はアレル間で差は無いが、バンド2の強度はAアレルでより強かった。このバンド2は、非標識のAP-1結合モチーフ配列のオリゴヌクレオチドで消失することから、AP-1である可能性が示唆された。以上の結果から、AアレルはAP-1の結合親和性を上昇させる可能性が示唆された。実施例14から、AアレルはPMA添加時のルシフェラーゼ活性の上昇を促進することが示されており、本実験結果から、実施例14のルシフェラーゼ活性上昇は、AP-1の結合モチーフに対する結合親和性の上昇に起因していることが示唆された。
実施例16 ヒト関節軟骨細胞におけるLPAの炎症性サイトカイン遺伝子発現誘導の解析
EDG2のリガンドであるLPAの、ヒト関節軟骨細胞における炎症性サイトカインの発現誘導反応について解析した。方法を記す。正常ヒト膝関節軟骨細胞 (NHAC-kn, Takara) を、アルジネートビーズ中に包埋し、添付の分化培地(CDM) で3週間培養した。Sodium citrate溶液 (55 mM in 0.15M NaCl solution) でインキュベーションした後、アルジネートビーズを溶解し、遠心操作によって細胞を回収した。細胞を155 mM NaCl溶液で2回洗浄した後、1 x 105個/ウェルの割合で24プレートに播種した。LPA (1-Oleoyl-sn-Glycero-3-Phosphate, Sigma) 刺激を行う12時間前に、0.1% fatty acid free bovine serum albumin (Sigma)を含むDMEM/F-12培地に置換した。培地の置換から12時間後、細胞を10 μM LPAで刺激し、0, 2, 4, 8, 12および24時間後におけるtotal RNAの抽出をISOGEN (ニッポンジーン) で行い、実施例10に準じた方法で、炎症性サイトカイン遺伝子であるTNFAおよびIL1Bの発現量を定量した。例数はn=4で行った。その結果、TNFA遺伝子はLPA添加2時間後に、一過的に発現量が2倍程度上昇した (図7a)。IL1Bに関しては、発現上昇反応が見られなかった (図7b)。
実施例17 ヒトOA滑膜細胞におけるLPAの炎症性サイトカイン遺伝子およびマトリックスメタロプロテアーゼ遺伝子の発現誘導の解析
EDG2のリガンドであるLPAの、OA患者由来繊維芽細胞様滑膜細胞における炎症性サイトカインの発現誘導反応について解析した。方法を記す。OA患者由来繊維芽細胞様滑膜細胞 (HFLS-OA) はCell application社から購入した。HFLS-OAは添付のSynoviocyte growth mediumを用いて培養した。継代回数は4および5回のものを使用した。HFLS-OAを1 x 105個/ウェルの割合で24プレートに播種し、コンフルエントになるまで、添付のSynoviocyte growth mediumを用いて培養した。LPA刺激を行う12時間前に、0.1% fatty acid free bovine serum albumin (Sigma)を含むHam’s F-12 (Invitrogen) 培地に置換した。経時変化解析では、培地の置換から12時間後に細胞を10 μM LPAで刺激し、0, 1, 2, 4, 8, 12および24時間後におけるtotal RNAの抽出をISOGEN (ニッポンジーン) で行い、実施例10に準じた方法で炎症性サイトカイン遺伝子であるTNFA, IL1B, IL6遺伝子およびマトリックスメタロプロテイナーゼ(Matrix metalloproteinase, MMP) 遺伝子であるMMP1, MMP3, MMP13遺伝子の発現量を定量した (n=4)。また、用量依存性の試験では、培地の置換から12時間後、細胞を0, 0.1, 0.3, 1, 3および10 μM LPAで刺激し、2時間後におけるtotal RNAの抽出をISOGEN (ニッポンジーン) で行い、経時変化の試験と同様の方法で炎症性サイトカイン遺伝子であるTNFA, IL1B, IL6遺伝子の発現量を定量した (n=3)。使用したプライマーの配列は表9に示す。LPA刺激における炎症性サイトカイン遺伝子の経時変化試験の結果、TNFA, IL1BおよびIL6の発現量はそれぞれ、2, 4および1時間後をピークとして一過的に発現上昇した (図8a, bおよびc)。MMP遺伝子であるMMP1, MMP3, MMP13遺伝子の発現量は、それぞれ8, 8および4時間後をピークとして一過的に発現上昇した (図8d, eおよびf)。滑膜細胞においてMMP遺伝子群は、炎症性サイトカインによって発現上昇することが知られている。本実験において、炎症性サイトカイン遺伝子の発現上昇がMMP遺伝子群の発現上昇に先だっていることから、LPA刺激によるMMP遺伝子群の発現上昇は、炎症性サイトカインを介した2次的な反応である可能性がある。また、用量依存性の試験の結果、LPAは用量依存的に炎症性サイトカイン遺伝子の発現を上昇させることが示された (図8g, hおよびi)。TNFAおよびIL1B遺伝子は1 μMで発現量がほぼプラトーに達したのに対してIL6遺伝子は10 μMまで用量依存的に発現上昇した。以上の結果から、LPAはOA滑膜細胞において炎症性サイトカイン遺伝子の発現を誘導し、パラクライン的にMMP遺伝子群の発現を誘導することが示された。実施例11に示すOA滑膜組織におけるLPA受容体発現解析の結果から、滑膜組織では、EDG2遺伝子が他のLPA受容体遺伝子に比較してdominantであることが示されている。このことから、LPAの炎症性サイトカイン遺伝子群誘導反応は、主にEDG2遺伝子を介した反応である可能性が非常に高いと考えられる。
実施例14において、膝OA感受性多型であるi-EDG2-09のAアレルは、EDG2遺伝子の転写活性を上昇させることから、AAホモ接合対の個体ではEDG2が滑膜細胞に高発現しLPA刺激による炎症性サイトカイン遺伝子発現上昇反応が亢進している可能性がある。誘導された炎症性サイトカインは、関節におけるMMP群を誘導して軟骨破壊を引き起こし、ラジオグラフィックOAへの感受性を上昇させているのかもしれない。また同時に、炎症性サイトカインは、滑膜に存在する1次求心性神経の反応閾値を下げることによって症候性OAへの感受性を上昇させているのかもしれない。
実施例18 ウサギ滑膜細胞株におけるLPAの炎症性サイトカイン遺伝子およびMMP遺伝子の発現誘導の解析
LPAのウサギ滑膜細胞株における炎症性サイトカインの発現誘導反応について解析した。方法を記す。ウサギ滑膜細胞株 (HIG-82) はATCCから購入した。HIG-82は10% 胎仔ウシ血清(FBS) および抗生物質 (100 U/ml ペニシリン Gと100 μg/ml ストレプトマイシン) を含むHam’s F-12培地(Invitrogen)で培養した。HIG-82を1 x 105個/ウェルの割合で24プレートに播種し、コンフルエントになるまで培養した。LPA刺激を行う12時間前に、0.1% fatty acid free bovine serum albumin (Sigma)を含むHam’s F-12培地に置換した。経時変化解析では、培地の置換から12時間後に細胞を10 μM LPAで刺激し、0, 2, 4, 8, 12および24時間後におけるtotal RNAの抽出をISOGEN (ニッポンジーン) で行い、実施例10に準じた方法で炎症性サイトカイン遺伝子であるTNFA, IL1B遺伝子およびMMP遺伝子であるMMP1, MMP3およびMMP13遺伝子の発現量を定量した (n=4)。また、用量依存性の試験では、培地の置換から12時間後、細胞を0, 0.1, 1および10 μM LPAで刺激し、2時間後におけるtotal RNAの抽出をISOGEN (ニッポンジーン) で行い、経時変化の試験と同様の方法で炎症性サイトカイン遺伝子であるTNFA, IL1B遺伝子の発現量を定量した (n=4)。LPA刺激における炎症性サイトカイン遺伝子の経時変化試験の結果、TNFA, IL1B遺伝子の発現量はいずれも2時間後をピークとして一過的に発現上昇した (図9aおよびb)。MMP遺伝子であるMMP1, MMP3およびMMP13遺伝子の発現量は、それぞれ4, 4および8時間後をピークとして一過的に発現上昇した。また用量依存性の試験の結果、LPAは用量依存的に炎症性サイトカイン遺伝子の発現を上昇させることが示された。IL1B遺伝子は1 μMで発現量がほぼプラトーに達したのに対してTNFA遺伝子は10 μMまで用量依存的に発現上昇した。以上の結果は、実施例17に示したHFLS-OAの結果とよく類似したものであり、HIG-82細胞においてもLPA刺激によって炎症性サイトカイン遺伝子群の発現が誘導され、パラクライン的にMMP群の発現を誘導されることが示された。
実施例19 i-EDG2-09の疾患感受性ジェノタイプ頻度と日本人膝関節OAの重症度との相関
i-EDG2-09について、膝関節OAの重症度と疾患感受性ジェノタイプ (Aのホモ接合体)の頻度との関係を日本人一般集団膝関節OAについて調べた。
その結果、該集団では、疾患の重症度が高いほど疾患感受性ジェノタイプ頻度が高い傾向が認められた（図10）。したがって、遺伝子型（genotype）と表現型（phenotype）とが相関することがわかった。
実施例20 ヒトOA滑膜細胞におけるLPA誘導性炎症性サイトカイン上昇反応における、EDG2の関与
実施例17で得られた、ヒトOA滑膜細胞におけるLPA誘導性炎症性サイトカイン上昇反応におけるEDG2の関与を解析するため、siRNAによる検討を行った。方法を記す。EDG2に対するsiRNAの設計はTakara Bio Web site (http://bio.takara.co.jp) のsiRNA設計サポートシステムを利用して行った。また、siRNAの合成はTakara Bioに委託した。配列を表11に記す。コントロールsiRNAには、アスポリンに対するsiRNAの配列をスクランブルしたものを用いた。OA患者由来繊維芽細胞様滑膜細胞 (HFLS-OA) はCell application社から購入した。HFLS-OAは添付のSynoviocyte growth mediumを用いて培養した。継代回数は4および5回のものを使用した。HFLS-OAを1 x 105個/ウェルの割合で24プレートに播種し、添付のSynoviocyte growth mediumを用いて培養した。翌日、EDG2に対するsiRNAを最終濃度が11 nMになるようにTrans-IT-TKO transfection regent (Mirus社) を用いて、添付のプロトコールに従いHFLS-OA内に導入した。Transfectionの翌日、0.1% fatty acid free bovine serum albumin (Sigma)を含むHam’s F-12 (Invitrogen) 培地に置換した。培地置換から12時間後に細胞を10 μM LPAで刺激し、2時間後におけるtotal RNAの抽出をISOGEN (ニッポンジーン) で行い、実施例10に準じた方法でIL6遺伝子の発現量を定量した (n=4)。EDG2に対するsiRNAを導入した細胞では、EDG2の発現量が有意に抑制された (図11a)。同時にLPAに反応して上昇してくるIL6遺伝子の発現量も有意に抑制された (図11b)。この結果から、HFLS-OAにおいて、LPAによって誘導されるIL6遺伝子の発現上昇にはEDG2が関与していることが示された。
さらに、ヒトOA滑膜細胞におけるLPA誘導性炎症性サイトカイン上昇反応におけるEDG2の関与を、EDG2に対するアンタゴニストを用いて解析した。方法を記す。EDG2アンタゴニストとしてKi16425 (Sigma) を使用した。OA患者由来繊維芽細胞様滑膜細胞 (HFLS-OA) はCell application社から購入した。HFLS-OAは添付のSynoviocyte growth mediumを用いて培養した。継代回数は4および5回のものを使用した。HFLS-OAを1 x 105個/ウェルの割合で24プレートに播種し、コンフルエントになるまで、添付のSynoviocyte growth mediumを用いて培養した。LPA刺激を行う12時間前に、0.1% fatty acid free bovine serum albumin (Sigma)を含むHam’s F-12 (Invitrogen) 培地に置換した。培地の置換から12時間後に細胞をKi16425 (0, 0.3, 1, 3, 10および33 μM)で30分間処理した。その後10 μM LPAで刺激し、2時間後におけるtotal RNAの抽出をISOGEN (ニッポンジーン) で行い、実施例10に準じた方法でIL6遺伝子の発現量を定量した (n=4)。その結果、Ki16425は、LPAによるIL6遺伝子の発現上昇を用量依存的に抑制した (図11c)。Ki16425は、EDG2だけでなくEDG7に対してもアンタゴニスト活性を持つが、実施例11に示すとおり、滑膜組織ではEDG2がdominantなLPA受容体であるため、Ki16425は主にEDG2に作用していると考えられる。本結果は、HFLS-OAにおけるLPAの炎症性サイトカインの発現誘導は、EDG2を介していることを強く示唆するものである。
実施例21 EDG2アンタゴニストのスクリーニング系の構築
ヒトEDG2のORF配列を含む強制発現ベクター [hEDG2-pcDNA3.1(+)]を、UMR cDNA Resource Centerから購入した。このプラスミドを、McA-RH7777 (大日本製薬株式会社) に、Lipofectamine LTX (インビトロジェン)を用いて導入し、Geneticin を含む培地で14〜20日間培養し、EDG2安定発現細胞を取得した。
次に、LPAによる刺激が、発現させたEDG2を介して細胞内Ca濃度を上昇させることを、FLIPR tetra (Molecular Devices)を用いて評価した。即ち、本細胞を、384穴プレートに播種し、0.03 〜 10 μＭのLPA (Sigma) を各ウェルに添加して、LPAの用量依存的に、細胞内Ca2+濃度上昇が起こることを確認した。
さらに、このLPA刺激（0.3 μＭ)による細胞内Ca2+濃度の上昇は、EDG2に対して拮抗作用を有するKi16425 (Sigma) の事前添加 (10-8 〜 10-5 M) によって、用量依存的に抑制された。
本発明によれば、骨・関節疾患に対する遺伝的感受性を容易に判定することができる。また、抗EDG2抗体、アンチセンスEDG2、EDG2アンタゴニスト、EDG2のDNM、その他それらの発現もしくは活性を調節し得る物質は、骨・関節疾患の予防・治療剤として使用することができる。
本出願は、日本で出願された特願２００７−１５５７９２を基礎としており、それらの内容は本明細書にすべて包含されるものである。

Claims (15)

  1. 下記(a)または(b)のいずれかを含有してなる骨・関節疾患の診断剤：
    (a)配列番号: 2で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質に対する抗体；または
    (b)配列番号: 2で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質をコードする塩基配列またはその一部を含む核酸。
  2. 骨・関節疾患が、変形性関節症、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症、スポーツによる関節障害、先天性骨系統疾患、骨軟骨腫、骨腫瘍および軟骨腫瘍からなる群より選択される、請求項１記載の診断剤。
  3. 配列番号: 2で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質またはその部分ペプチドを用いることを特徴とする、関節における炎症性サイトカイン発現および／または関節破壊および／または骨・関節疾患における疼痛を調節する物質のスクリーニング方法。
  4. リゾホスファチジン酸をさらに用いることを特徴とする、請求項３記載の方法。
  5. 配列番号: 2で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質またはその部分ペプチドが、それを産生する細胞の形態で提供される、請求項３記載の方法。
  6. 配列番号: 2で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質に対する抗体、または該蛋白質をコードする塩基配列もしくはその一部を含む核酸を、さらに用いることを特徴とする、請求項５記載の方法。
  7. 骨・関節疾患の予防・治療物質のスクリーニング用である、請求項３記載の方法。
  8. 骨・関節疾患が、変形性関節症、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症、スポーツによる関節障害、先天性骨系統疾患、骨軟骨腫、骨腫瘍および軟骨腫瘍からなる群より選択される、請求項７記載の方法。
  9. 配列番号: 3で表される塩基配列中塩基番号8463〜8464で示される塩基（但し、該２つの塩基の間にチミンが挿入されている）を含む該塩基配列の部分配列であって、約15塩基以上の連続した塩基配列を含む核酸。
  10. 配列番号: 3で表されるヒトEDG2遺伝子の部分塩基配列において、塩基番号8463〜8464、24007、24999および34573で示される塩基もしくは塩基配列からなる群より選択される１以上の塩基もしくは塩基配列における多型を検出することを含む、骨・関節疾患に対する遺伝的感受性の診断方法。
  11. 骨・関節疾患が、変形性関節症、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症、スポーツによる関節障害、先天性骨系統疾患、骨軟骨腫、骨腫瘍および軟骨腫瘍からなる群より選択される請求項１０記載の方法。
  12. 配列番号: 3で表されるヒトEDG2遺伝子の部分塩基配列において、塩基番号24007で示される塩基がチミンであるアレルを有するヒトに投与するための、関節における炎症性サイトカイン発現および／または関節破壊および／または骨・関節疾患における疼痛を調節する物質のスクリーニング方法であって、配列番号: 3で表される塩基配列中塩基番号24007で示される塩基（但し、該塩基はアデニンである）およびそれに隣接する塩基もしくは塩基配列からなる塩基配列を含む核酸と、該塩基配列に選択的に結合する転写調節因子とを用いることを特徴とする方法。
  13. 骨・関節疾患の予防・治療物質のスクリーニング用である、請求項１２記載の方法。
  14. 骨・関節疾患が、変形性関節症、骨粗鬆症、慢性関節リウマチ、関節炎、滑膜炎、代謝性関節症、スポーツによる関節障害、先天性骨系統疾患、骨軟骨腫、骨腫瘍および軟骨腫瘍からなる群より選択される請求項１３記載の方法。
  15. 関節における炎症性サイトカイン発現および／または関節破壊および／または骨・関節疾患における疼痛の抑制剤を投与された被験体における、配列番号: 2で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質またはそれをコードする遺伝子の発現を調べることを特徴とする、該抑制剤の薬効評価方法。
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