CN105463117A - 检测人riok2基因表达量和相对表达量的引物对 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了检测人RIOK2基因表达量和相对表达量的引物对。本发明公开的检测人RIOK2基因表达量和相对表达量的引物对,为名称为RIOK2-P的由序列表中序列1所示的单链DNA和序列2所示的单链DNA组成的引物对。实验证明,本发明的引物对能够检测RIOK2在宫颈癌组织中的表达含量,操作相对简单,结果准确。

Description

检测人RIOK2基因表达量和相对表达量的引物对
技术领域
本发明涉及生物技术领域中检测人RIOK2基因表达量和相对表达量的引物对。
背景技术
宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤。原位癌高发年龄为30~35岁,浸润癌为45~55岁,近年来其发病有年轻化的趋势。临床上的诊断方法一般为细胞刮片检测、阴道镜检测、组织活检等。但是,子宫肌瘤、子宫内膜异位、宫颈息肉、溃疡等原因会对诊断结果的确定性造成严重干扰。因此,寻找新的宫颈癌诊断标志物至关重要。
RIOK2(RIOkinase2)基因是一种磷酸激酶。有研究表明该基因与AKT信号通路有关,可以调控细胞迁移、细胞周期、细胞凋亡等行为。在宫颈癌当中,与癌旁组织相比,RIOK2的表达明显升高。因此,RIOK2有希望成为潜在的宫颈癌诊断标志物。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何检测人RIOK2基因表达量或相对表达量。
为解决上述技术问题,本发明首先提供了检测或辅助检测人RIOK2基因表达量或相对表达量的引物对。
本发明所提供的检测或辅助检测人RIOK2基因表达量或相对表达量的引物对,为名称为RIOK2-P的由序列表中序列1所示的单链DNA和序列2所示的单链DNA组成的引物对。
为解决上述技术问题,本发明还提供了检测或辅助检测人类RIOK2基因表达量或相对表达量的成套试剂。
本发明所提供的检测或辅助检测人类RIOK2基因表达量或相对表达量的成套试剂,由所述RIOK2-P与名称为GAPDH-P的与人的GAPDH基因特异结合的引物对组成。
上述成套试剂中,所述GAPDH-P由序列表中序列3所示的单链DNA和序列4所示的单链DNA组成。
为解决上述技术问题,本发明还提供了检测或辅助检测人RIOK2基因表达量或相对表达量的试剂或试剂盒。
本发明所提供的检测或辅助检测人RIOK2基因表达量或相对表达量的试剂或试剂盒,由所述RIOK2-P或所述成套试剂与X1组成,所述X1为进行定量PCR扩增所需试剂。
上述试剂或试剂盒中,所述进行定量PCR扩增所需试剂可为qPCRMIX。qPCRMIX可为北京全式金生物技术(TransGenBiotech)有限公司产品。
上述试剂或试剂盒中,所述定量PCR扩增可为实时荧光定量PCR扩增。
为解决上述技术问题,本发明还提供了检测或辅助检测人RIOK2基因表达量或相对表达量的系统。
本发明所提供的检测或辅助检测人RIOK2基因表达量或相对表达量的系统,由所述RIOK2-P、所述成套试剂或所述试剂或试剂盒与Y1组成,所述Y1为进行RNA提取所需的试剂、进行反转录所需的试剂和/或进行定量PCR扩增所需仪器。
上述系统中,所述进行RNA提取所需的试剂可为TRIzol、氯仿、异丙醇和/或乙醇。TRIzol可为上海捷瑞生物工程有限公司产品。
所述进行反转录所需的试剂可为ReverTranscriptqPCRRTKit中的试剂。ReverTranscriptqPCRRTKit为Takara公司产品。
所述进行定量PCR扩增所需仪器可为实时荧光定量pcr仪(如ABI7300或ABI7500(美国AppliedBiosystems公司))。
为解决上述技术问题,本发明还提供了鉴定或辅助鉴定肿瘤组织和/或细胞的系统。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定肿瘤组织和/或细胞的系统,包括所述RIOK2-P、所述成套试剂、所述试剂或试剂盒或所述检测或辅助检测人RIOK2基因表达量或相对表达量的系统与基因定量数据处理系统;所述基因定量数据处理系统用于计算将来自待鉴定组织和/或细胞的RIOK2基因的表达量或相对表达量,根据所述待鉴定组织和/或细胞的RIOK2基因的表达量或相对表达量确定待鉴定组织和/或细胞是否为肿瘤组织和/或细胞。
为解决上述技术问题,本发明还提供了检测RIOK2基因的表达量或相对表达量的方法。
本发明所提供的检测RIOK2基因的表达量或相对表达量的方法,包括以离体的待鉴定组织和/或细胞的cDNA或RNA为模板,用所述RIOK2-P进行PCR扩增,所述PCR扩增中的退火条件可为58℃35sec。反应条件具体可为:95℃预变性1min;95℃15s,58℃35sec,40个循环。
所述PCR扩增时的反应体系可为25μL反应体系,具体如下:2μLcDNA溶液,12.5μLqPCRMix(2×),RIOK2-F(RIOK2-F在该反应体系中的浓度为0.2μM),RIOK2-R(RIOK2-R在该反应体系中的浓度为0.2μM),用无菌蒸馏水补至25μL。
为解决上述技术问题,本发明还提供了鉴定或辅助鉴定肿瘤组织和/或细胞的方法。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定肿瘤组织和/或细胞的方法,包括:检测来自待鉴定组织和/或细胞的RIOK2基因的表达量或相对表达量;如果所述待鉴定组织和/或细胞的RIOK2基因的表达量或相对表达量越高,所述待鉴定组织和/或细胞为或候选为肿瘤组织和/或细胞的风险越大,如果所述待鉴定组织和/或细胞的RIOK2基因的表达量或相对表达量越低,所述待鉴定组织和/或细胞为或候选为肿瘤组织和/或细胞的风险越小。
上述方法中,所述待鉴定组织和/或细胞可为宫颈组织和/或宫颈细胞。
为解决上述技术问题,本发明还提供了所述RIOK2-P、所述成套试剂、所述试剂或试剂盒或所述系统在下述1)-5)中任一种中的应用:
1)检测或辅助检测人RIOK2基因表达量或相对表达量;
2)制备检测或辅助检测人RIOK2基因表达量或相对表达量产品;
3)鉴定或辅助鉴定肿瘤组织和/或细胞;
4)制备鉴定或辅助鉴定肿瘤组织和/或细胞产品。
上述应用中,所述肿瘤组织和/或细胞可为宫颈癌组织和/或细胞。
实验证明,本发明的引物对能够检测RIOK2在宫颈癌组织中的表达含量,操作相对简单,结果准确。
本发明鉴于现有技术中检测宫颈癌样品标志物的不足,本发明设计了检测内参/目的基因用引物,用荧光定量PCR技术检测人融合基因相对表达量。通过调整两个基因的引物探针浓度及比例,优化PCR的反应体系和反应条件,开发了一种用于检测RIOK2基因相对表达量的试剂盒。
使用本发明的试剂盒,将实时荧光PCR技术对RIOK2基因的表达水平进行检测,检测精度高,而且操作简单,可降低检测成本,节约检测时间。采用双标准曲线法,通过构建RIOK2和内参基因GAPDH的标准定量曲线,精确定量样本的内参基因拷贝数和RIOK2拷贝数,相比于以往的免疫组化方法,该试剂盒具有精度高,结果便于判读等优点。加之该试剂盒将反应体系所需的引物、探针进行合理配比和优化,使实验条件达到最佳,从而省去了繁琐的条件摸索环节,大大提升了实验效率。该试剂盒经测试特异性好,灵敏度高,操作简便。有助于临床样品的辅助性检测。
附图说明
图1为RIOK2熔解曲线。
图2为GAPDH熔解曲线。
图3为RIOK2和GAPDH的扩增曲线。其中。左侧为GAPDH扩增曲线,右侧为RIOK2扩增曲线。
图4为6位临床宫颈癌患者RIOK2的相对表达量。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述,给出的实施例仅为了阐明本发明,而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1
本发明的用于检测RIOK2基因相对表达量的试剂盒,包括:
TRIzol(上海捷瑞生物工程有限公司);
氯仿;
无水乙醇;
ReverTranscriptqPCRRTKit(Takara公司);
检测体系PCR反应液:qPCRMix(2×)(北京全式金生物技术(TransGenBiotech)有限公司)、RIOK2-F/RIOK2-R各0.2μM
其中,引物序列为:
RIOK2-F:CGTTACATGAGCCGAGATGA(序列1)
RIOK2-R:ACAGCCACCATGTTTAAGGC(序列2)
GAPDH-F:CATGAGAAGTATGACAACAGCCT(序列3)
GAPDH-R:AGTCCTTCCACGATACCAAAGT(序列4)
实施例2
本发明试剂盒的使用方法:
(1)抽提的组织RNA:取适量的新鲜组织,加入1mLtrizol在匀浆其中研磨均匀,加入0.2ml氯仿,震荡均匀;14000rpm4℃离心10min,吸取上清层转移至另一新的离心管中;加入等体积的异丙醇,上下充分混匀,室温静置10min;14000rpm4℃离心10min,弃上清,加入75%乙醇1ml,轻轻上下颠倒洗涤管壁;14000rpm4℃离心5min,弃乙醇;室温干燥10-15min,加入20ulRNase-free水溶解沉淀。
(2)参考Takara公司的ReverTranscriptqPCRRTKit试剂盒说明书,将RNA反转为cDNA,得到cDNA溶液,cDNA溶液中cDNA的浓度为50μL/μL。
(3)试剂配置:每个反应体系均为25μL反应体系,具体如下:2μLcDNA溶液,12.5μLqPCRMix(2×),RIOK2-F或GAPDH-F(RIOK2-F或GAPDH-F在该反应体系中的浓度为0.2μM),RIOK2-R或GAPDH-R(RIOK2-R或GAPDH-R在该反应体系中的浓度为0.2μM),用无菌蒸馏水补至25μL。用生理盐水作为空白对照。
(4)检测:检测在实时荧光PCR仪上进行,可用仪器包括ABI7300,ABI7500(美国AppliedBiosystems公司)等。反应条件:95℃预变性1min;95℃15s,58℃35sec,40个循环,荧光信号于58℃35sec时采集。
(5)结果判断:将阈值线调整至背景信号及阴性扩增线以上,系统根据标准曲线和CT值自动计算出拷贝数。
使用该试剂盒检测得到的溶解度曲线及扩增曲线见图1,图2和图3。
实施例3
采用本发明核酸检测试剂盒检测临床标本
检测对象:临床宫颈癌患者6位,(所有样品为宫颈癌I期组织)。每个患者的宫颈癌组织和宫颈癌旁组织成对检测一共6对,按实施例2试剂盒的使用方法检测待测样本。每个样本3次重复,1份空白对照。检测时间仅需100分钟。
6位临床宫颈癌患者样本检测结果如下表所示:
6位临床宫颈癌患者样本检测结果总结见图4。
图4结果显示,使用该引物对能够检测RIOK2在宫颈癌组织中的表达含量,操作相对简单,结果准确。
本发明鉴于现有技术中检测宫颈癌样品标志物的不足,本发明设计了检测内参/目的基因用引物,用荧光定量PCR技术检测人融合基因相对表达量。通过调整两个基因的引物探针浓度及比例,优化PCR的反应体系和反应条件,开发了一种用于检测RIOK2基因相对表达量的试剂盒。
使用本发明的试剂盒,将实时荧光PCR技术对RIOK2基因的表达水平进行检测,检测精度高,而且操作简单,可降低检测成本,节约检测时间。采用双标准曲线法,通过构建RIOK2和内参基因GAPDH的标准定量曲线,精确定量样本的内参基因拷贝数和RIOK2拷贝数,相比于以往的免疫组化方法,该试剂盒具有精度高,结果便于判读等优点。加之该试剂盒将反应体系所需的引物、探针进行合理配比和优化,使实验条件达到最佳,从而省去了繁琐的条件摸索环节,大大提升了实验效率。该试剂盒经测试特异性好,灵敏度高,操作简便。有助于临床样品的辅助性检测。

Claims (10)

1.检测或辅助检测人RIOK2基因表达量或相对表达量的引物对,为名称为RIOK2-P的由序列表中序列1所示的单链DNA和序列2所示的单链DNA组成的引物对。
2.检测或辅助检测人类RIOK2基因表达量或相对表达量的成套试剂,由权利要求1所述RIOK2-P与名称为GAPDH-P的与人的GAPDH基因特异结合的引物对组成。
3.根据权利要求2所述的成套试剂,其特征在于:所述GAPDH-P由序列表中序列3所示的单链DNA和序列4所示的单链DNA组成。
4.检测或辅助检测人RIOK2基因表达量或相对表达量的试剂或试剂盒,由权利要求1所述引物对或权利要求2或3所述成套试剂与X1组成,所述X1为进行定量PCR扩增所需试剂。
5.根据权利要求4所述的试剂或试剂盒,其特征在于:所述进行定量PCR扩增所需试剂为qPCRMIX。
6.检测或辅助检测人RIOK2基因表达量或相对表达量的系统,由权利要求1所述引物对、权利要求2或3所述成套试剂或权利要求4或5所述试剂或试剂盒与Y1组成,所述Y1为进行RNA提取所需的试剂、进行反转录所需的试剂和/或进行定量PCR扩增所需仪器。
7.鉴定或辅助鉴定肿瘤组织和/或细胞的系统,包括权利要求1所述引物对、权利要求2或3所述成套试剂、权利要求4或5所述试剂或试剂盒或权利要求6所述的系统与基因定量数据处理系统;所述基因定量数据处理系统用于计算将来自待鉴定组织和/或细胞的RIOK2基因的表达量或相对表达量,根据所述待鉴定组织和/或细胞的RIOK2基因的表达量或相对表达量确定待鉴定组织和/或细胞是否为肿瘤组织和/或细胞。
8.下述1)或2)的方法:
1)检测RIOK2基因的表达量或相对表达量的方法,包括以离体的待鉴定组织和/或细胞的cDNA或RNA为模板,用权利要求1所述引物对进行PCR扩增,所述PCR扩增中的退火条件为58℃35sec。
2)鉴定或辅助鉴定肿瘤组织和/或细胞的方法,包括:检测来自待鉴定组织和/或细胞的RIOK2基因的表达量或相对表达量;如果所述待鉴定组织和/或细胞的RIOK2基因的表达量或相对表达量越高,所述待鉴定组织和/或细胞为或候选为肿瘤组织和/或细胞的风险越大,如果所述待鉴定组织和/或细胞的RIOK2基因的表达量或相对表达量越低,所述待鉴定组织和/或细胞为或候选为肿瘤组织和/或细胞的风险越小。
9.权利要求1所述引物对、权利要求2或3所述成套试剂、权利要求4或5所述试剂或试剂盒或权利要求6或7所述系统在下述1)-5)中任一种中的应用:
1)检测或辅助检测人RIOK2基因表达量或相对表达量;
2)制备检测或辅助检测人RIOK2基因表达量或相对表达量产品;
3)鉴定或辅助鉴定肿瘤组织和/或细胞;
4)制备鉴定或辅助鉴定肿瘤组织和/或细胞产品。
10.根据权利要求7所述系统、权利要求8所述方法或权利要求9所述应用,其特征在于:权利要求7或8中所述待鉴定组织和/或细胞为宫颈宫颈组织和/或宫颈宫颈细胞;权利要求9中所述肿瘤组织和/或细胞为宫颈癌组织和/或细胞。
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