CN107460237B - Hes6作为分子靶标在治疗慢性粒细胞白血病的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种慢性粒细胞白血病（chronic myeloid leukemia，CML）治疗的新分子靶标—HES6。相应，本发明提供一种基于HES6的用于慢性粒细胞白血病早期诊断试剂盒，进一步提供通过过表达HES6以促进K562细胞分化的方法。
Description
技术领域
本发明属于生物医学与临床医学技术领域，涉及一个与慢性粒细胞白血病治疗相关的新治剂及其应用方法。
背景技术
HES6，位于人类染色体2q37.3，是HES转录家族中的一员，HES6作为一个转录调节因子，在许多组织中都有表达，而且它参与调控神经元发生、肌细胞生成和肠组织发育等生物学过程。成熟的HES6蛋白含224个氨基酸，其序列为：MAPPAAPGRDRVGREDEDGWETRGDRKARKPLVEKKRRARINESLQELRLLLAGAEVQAKLENAEVLELTVRRVQGVLRGRAREREQLQAEASERFAAGYIQCMHEVHTFVSTCQAIDATVAAELLNHLLESMPLREGSSFQDLLGDALAGPPRAPGRSGWPAGGAPGSPIPSPPGPGDDLCSDLEEAPEAELSQAPAEGPDLVRAALGA VTTAQIARSVWRPW。
HES6与前列腺癌、乳腺癌、转移性结肠癌、恶性胶质瘤等癌症有关，目前研究报道HES6能辅佐一些疾病如去势性前列腺癌、乳腺癌等疾病的诊断。
HES6在慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)和红系分化中的功能国内外尚未见报道。本发明人首次研究发现，敲低HES6后能够延迟红系分化进程。在CML临床病人样本中，相较于正常人，HES6在CML初诊患者中的表达显著下降。当前临床上诱导白血病细胞定向分化是治疗白血病的一种手段。在CML经典细胞系K562细胞中，过表达HES6促进K562细胞向红系分化。基于以上研究成果，表明HES6与慢性粒细胞白血病的诊断和治疗密切相关，HES6是一个可用于治疗慢性粒细胞白血病新的分子靶标，开发针对该靶标的治剂将推动CML的治疗。
发明内容
本发明是针对诱导慢性粒细胞白血病定向进行红系分化，提供一种新的治疗慢性粒细胞白血病的分子靶标HES6及其应用方法，该分子的发现将推动慢性粒细胞白血病的治疗。
作为一个调控分子，HES6在不同的肿瘤中的表达和功能均具有异质性。本发明人课题组长期研究血液肿瘤，在慢性粒细胞白血病上有一定的研究基础，本发明人率先研究了HES6与慢粒的关系；通过检测大量的慢粒初诊病人样本及对照样本，发现了HES6在这两种样本中的表达差异；在这个基础上，深入探究了HES6在K562细胞中的功能。
一种治疗慢性粒细胞白血病的新治剂及其应用方法，该治剂针对的分子标志物为HES6，位于人类染色体2q37.3。
本发明提供一种用于慢性粒细胞白血病早期诊断试剂盒，其包括基于HES6的检测引物，其特征在于所述引物的序列如下：
HES6正向引物：CTGCCGGCTACATCCAGTG
HES6负向引物：CCCAGCAGATCCTGGAAGC。
所述的用于慢性粒细胞白血病早期诊断试剂盒，采用real time PCR，检测CML初诊患者HES6基因表达，并相对于正常人而言，HES6在CML患者中的表达明显下降。这是基于本发明人研究发现相较于正常人，HES6在CML初诊患者中的表达显著下降。
进一步采用GAPDH作为内对照，其中采用下述引物：
GAPDH正向引物：CATGAGAAGTATGACAACAGCCT
GAPDH负向引物：AGTCCTTCCACGATACCAAAGT。
所述real time PCR反应体系如下：
所述real time PCR条件如下：
本发明还提供一种促进K562细胞分化的方法：在所述细胞系细胞中，过表达HES6。所述的促进K562细胞分化的方法，进一步联合hemin处理所述细胞，其能有效地促进K562细胞定向地向红系分化。这是基于本发明人研究发现，在hemin诱导K562的条件下，过表达HES6促进K562细胞向红系分化。
本发明的主要优点和有益效果：通过本发明人的研究，首次发现了敲低HES6延迟红系分化进程，表明HES6与红系分化密切相关；HES6在慢性粒细胞白血病中表达明显下降，表明HES6与慢性粒细胞白血病的发生发展密切相关；在K562细胞中，过表达HES6促进K562细胞分化；以上结果表明HES6是一种治疗慢性粒细胞白血病新的分子靶标。本发明开发了针对该靶标的治剂，对研究CML的治疗具有重大意义。
附图说明
图1、检测HES6-shRNA慢病毒感染效果图A qRT-PCR结果，图B Western blot结果。
图2、慢病毒感染CD34+造血干细胞后在D7通过流式检测GPA，Band3,α4-integrin的表达；其中，图A流式检测CD235a(GPA)的阳性率，图B流式检测Band3,α4-integrin的表达。
图3、采用real time PCR检测HES6在正常样本及CML病人样本中的表达。
图4、瞬时转染HES6-OV质粒检测转染效果，其中，图A：qRT-PCR结果，图B：Westernblot结果。
图5、在Hemin-K562中过表达HES6后检测对细胞分化的影响，其中，图A是过表达HES6后联苯胺染色结果，图B是联苯胺染色阳性率统计图。
图6、在K562中过表达HES6后real time PCR检测HBB、HBG、HBE、GPA的表达情况。
图7、HES6与GATA-1的免疫共沉淀实验图。
图8、Western blot敲低HES6检测GATA-1及其下游分子4.1R，p21的表达，慢病毒感染造血干细胞后收取D9天细胞提取蛋白，Western blot结果表明敲低HES6后GATA-1及其下游分子4.1R，p21的蛋白水平明显下调，GAPDH为内参。
图9、real time PCR检测敲低HES6后GATA-1的mRNA水平，慢病毒感染细胞后收取D9天细胞，qRT-PCR结果表明敲低HES6后GATA-1的mRNA水平未发生明显改变，GAPDH为内参。
图10、在敲低HES6同时过表达GATA-1并检测对细胞分化的影响。
具体实施方式
下面通过相关的实施方式、实施例或实验等进一步阐述本发明，便于进一步理解本发明。其中，所述实验方法如果没有特别说明，则采用的是本领域的常规方法。
实施例一：包装的敲低病毒在造血干细胞中敲低HES6
1、293T细胞中包装HES6过表达/敲低病毒颗粒，首先进行细胞转染，按照以下体系(表一)进行：
表一、质粒转染体系参照表
转染6h后换新鲜的完全培基并计时；分别收取24h及48h的病毒原液，超速离心浓缩，测定病毒滴度后-80℃保存。
2、将包装的HES6敲低病毒和对照病毒感染到K562细胞中，按照MOI＝50、polybrene终浓度为8ug/mL的条件进行感染。
3、收集细胞提取总蛋白，Western blot检测HES6的表达情况。具体做法是：使用RIPA蛋白裂解液(P0013B，碧云天)提取蛋白质，用BCA试剂盒测定蛋白浓度。使用Westernblot方法进行免疫印记。其中，HES6抗体(sc-133196，Santa Cruz)稀释比为1：500，GAPDH抗体稀释比为1：3000；以检测实验组和对照样本之间的蛋白表达差异。Western blot结果显示相较于对照组，敲低组HES6下调0.8和0.5倍，表明包装的HES6敲低病毒能够成功地发挥功能(参见图1)。
4、流式细胞术检测造血干细胞表面分子标志物GPA、Band3，α4-integrin的表达：将上述的细胞收集后计数，然后每个样取2.5×105细胞，按照1:100的比例将流式抗体孵育细胞，室温避光孵育20min，用流式细胞仪检测敲低HES6对红系分化的影响。结果显示：D7对照组中GPA阳性率约为34％，HES6敲低组GPA阳性率约为19.5％和22.5％，表明敲低HES6显著降低GPA的表达(参见图2A)。在Band3，α4-integrin的染色中，敲低HES6后在D7、D9时阳性细胞群与对照组相比明显滞后，在红系分化的D11，D13时，实验组和对照组的分化程度基本达成一致(参见图2B)。
可见，敲低HES6能够延迟红系分化进程。
实施例二：HES6在CML初诊患者中的表达
1.收集正常人及CML初诊患者外周血样本中的单个核细胞，采用淋巴细胞分离液分离CML初诊患者和作为对照的正常人外周血样本中的单个核细胞，提取细胞总RNA用于后续实验。
2.采用real time PCR方法检测HES6的表达情况，以GAPDH作为内对照：根据Invitrogen公司提供的TRIzol试剂处理步骤1样本中所得的单个核细胞，提取总RNA，逆转录获成cDNA，根据合成的HES6和GAPDH引物序列(见表二)，并按照相应的反应体系(见表三)和反应条件(见表四)进行real time PCR，检测CML初诊患者和正常人对照样本HES6基因表达情况。
表二、HES6和GAPDH引物序列表
表三、real time PCR反应体系
表四、real time PCR反应条件
如图3所示，结果发现相较于正常人，HES6在CML初诊患者中的表达显著下降，达50％。由此也可以得出HES6的表达量可以作为CML的早期诊断标志物。
实施例三：包装的过表达病毒在K562细胞中过表达HES6
1、293T细胞中包装HES6过表达/敲低病毒颗粒，首先进行细胞转染，按照上述表一体系进行。
转染6h后换新鲜的完全培基并计时；分别收取24h及48h的病毒原液，超速离心浓缩，测定病毒滴度后-80℃保存。
2、将包装的HES6过表达/敲低病毒和对照病毒感染到K562细胞中，按照MOI＝50、polybrene终浓度为8ug/mL的条件进行感染。
3、收集细胞提取总蛋白，Western blot检测HES6的表达情况。具体做法是：使用RIPA蛋白裂解液(P0013B，碧云天)提取蛋白质，用BCA试剂盒测定蛋白浓度。使用Westernblot方法进行免疫印记。其中，HES6抗体(sc-133196，Santa Cruz)稀释比为1：500，GAPDH抗体稀释比为1：3000；以检测实验组和对照样本之间的蛋白表达差异。Western blot结果显示相较于对照组，过表达组HES6上调2.5倍，表明包装的HES6过表达病毒能够成功地发挥功能(参见图4)。
4、联苯胺染色：联苯胺能够在过氧化氢的作用下与细胞中的血红蛋白结合生成蓝色沉淀，检测细胞中联苯胺染色阳性率可以判断细胞的分化程度。在K562细胞中过表达HES6，并用用30μM的hemin诱导其向红系分化，48h收集细胞。联苯胺染色结果显示(参见图5)，与对照组相比，过表达HES6后联苯胺染色阳性率升高1.35倍，表明过表达HES6能够促进细胞分化。
5、real time PCR检测：在K562细胞中过表达HES6，并用用30μM的hemin诱导其向红系分化，48h收集细胞。与对照组相比，过表达HES6后，血红蛋白HBB、HBG、HBE，以及血型糖蛋白GPA的mRNA表达水平分别上调1.5倍，1.7倍，1.75倍，1.2倍(图6)，表明过表达HES6后能够促进K562细胞向红系分化。
实施例四：HES6调控终末红系分化的机制研究
1、HES6与GATA-1存在直接的相互作用
本发明中，敲低HES6能够抑制红系细胞增殖和延迟红系终末分化进程。正常的红系发育进程受到核心转录因子GATA-1的严格调控；GATA-1表达及活性的异常均会导致红系发育紊乱。根据已有的文献报道本发明人推测HES6与GATA-1可能存在直接的相互作用，为了明确HES6与GATA-1结合的这种可能性，我们通过免疫共沉淀实验(Co-IP)实验来验证。免疫共沉淀的实验结果表明HES6抗体能够将GATA-1沉淀下来，同样的GATA-1抗体能够将HES6沉淀下来(参见图7),证明HES6与GATA-1存在直接的相互作用。
2、敲低HES6后GATA-1蛋白水平下调
前面的实验已经证实了HES6与GATA-1的相互作用，为进一步探究HES6影响红系分化的具体机制，敲低HES6后在D9检测GATA-1以及其下游靶基因的蛋白水平的变化。实验结果显示(图8)，敲低HES6后，GATA-1的蛋白水平明显降低，其下游靶分子4.1R、p21的蛋白水平也呈降低趋势，而GATA-1的mRNA水平并未有明显的变化(图9)。
3、过表达GATA-1能够挽救HES6敲低后红系分化的延迟
在检测了GATA-1表达变化后，为了明确HES6在红系分化中的作用是否通过调控GATA-1而实现，在CD34+造血干细胞培养D2，用HES6-shRNA慢病毒感染CD34+造血干细胞，D4天加嘌呤霉素，D6用HMD-GATA-1慢病毒感染CD34+造血干细胞，D7天换液继续培养。然后用流式细胞术检测对红系分化的影响。流式实验结果表明，敲低HES6后细胞的分化程度降低，而过表达GATA-1后细胞的分化得到一定程度的挽救(图10)；由此可以证明，HES6通过调控GATA-1蛋白水平进而在红系分化中发挥生物学功能。
Claims (7)
1.一种用于慢性粒细胞白血病早期诊断试剂盒，其包括基于HES6的检测引物，其特征在于所述引物的序列如下：
HES6正向引物：CTGCCGGCTACATCCAGTG
HES6负向引物：CCCAGCAGATCCTGGAAGC。
2.如权利要求1所述的用于慢性粒细胞白血病早期诊断试剂盒，其特征在于包括以GAPDH作为内参对照的引物为：
GAPDH正向引物：CATGAGAAGTATGACAACAGCCT
GAPDH负向引物：AGTCCTTCCACGATACCAAAGT。
3.如权利要求2所述的用于慢性粒细胞白血病早期诊断试剂盒，其特征在于采用realtime PCR检测CML初诊患者HES6基因表达，并相对于正常人而言，HES6在CML患者中的表达明显下降。
4. 如权利要求3所述的用于慢性粒细胞白血病早期诊断试剂盒，其特征在于所述realtime PCR反应体系如下：
以10μl反应体系计，其包括5μl的2×master mix，1μl的浓度为0.3-1μM引物混合物，终浓度不超过10ng/μl的1μl模板DNA，余量为高温灭菌的ddH2O。
5.如权利要求3所述的用于慢性粒细胞白血病早期诊断试剂盒，其特征在于所述realtime PCR条件如下：
95℃起始变性10 min，然后以95℃变性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸20 s，进行35次循环。
6.基于HES6的检测引物在制备慢性粒细胞白血病早期诊断试剂中的用途，其特征在于所述引物的序列如下：
HES6正向引物：CTGCCGGCTACATCCAGTG
HES6负向引物：CCCAGCAGATCCTGGAAGC。
7.如权利要求6所述的基于HES6的检测引物在制备慢性粒细胞白血病早期诊断试剂中的用途，其特征在于，还包括检测作为内参对照的GAPDH的引物：
GAPDH正向引物：CATGAGAAGTATGACAACAGCCT
GAPDH负向引物：AGTCCTTCCACGATACCAAAGT。
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Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1890382A (zh) * | 2003-09-24 | 2007-01-03 | 肿瘤疗法科学股份有限公司 | 检测、诊断和治疗肝细胞癌(hcc)的方法 |
| CN101100692A (zh) * | 2007-07-23 | 2008-01-09 | 中南大学 | 慢性髓系白血病耐IFN-α标志物基因的诊断用途 |
| CN101422617A (zh) * | 2007-10-30 | 2009-05-06 | 武汉大学 | 一种znf268基因剪接异构体在抗白血病中的应用 |
| CN102226177A (zh) * | 2011-04-25 | 2011-10-26 | 周蒙滔 | Notch通路关键分子的荧光定量检测试剂盒 |
| CN103074354A (zh) * | 2012-11-22 | 2013-05-01 | 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 | miR-125b在红细胞成熟化中的用途 |
| CN103215363A (zh) * | 2013-04-22 | 2013-07-24 | 中南大学 | 一种淋巴细胞白血病分子标志物的应用方法 |
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Patent Citations (7)
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|---|---|---|---|---|
| CN1890382A (zh) * | 2003-09-24 | 2007-01-03 | 肿瘤疗法科学股份有限公司 | 检测、诊断和治疗肝细胞癌(hcc)的方法 |
| CN101100692A (zh) * | 2007-07-23 | 2008-01-09 | 中南大学 | 慢性髓系白血病耐IFN-α标志物基因的诊断用途 |
| CN101422617A (zh) * | 2007-10-30 | 2009-05-06 | 武汉大学 | 一种znf268基因剪接异构体在抗白血病中的应用 |
| CN102226177A (zh) * | 2011-04-25 | 2011-10-26 | 周蒙滔 | Notch通路关键分子的荧光定量检测试剂盒 |
| CN103074354A (zh) * | 2012-11-22 | 2013-05-01 | 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 | miR-125b在红细胞成熟化中的用途 |
| CN103215363A (zh) * | 2013-04-22 | 2013-07-24 | 中南大学 | 一种淋巴细胞白血病分子标志物的应用方法 |
| CN105463117A (zh) * | 2016-01-15 | 2016-04-06 | 苏州吉诺瑞生物科技有限公司 | 检测人riok2基因表达量和相对表达量的引物对 |
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| ACCESSION NO：BAA96082，HES6 [Homo sapiens];Bae,S. et al.;《Genbank》;20010224;ORIGIN * |
| Hes6 Controls Cell Proliferation via Interaction with cAMP-response Element-binding Protein-binding Protein in the Promyelocytic Leukemia Nuclear Body;Bokkee Eun et al.;《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》;20080229;第283卷(第9期);第5939-5949页 * |
| Notch Signals Inhibit the Development of Erythroid/Megakaryocytic Cells by Suppressing GATA-1 Activity through the Induction of HES1;Eri Ishiko et al.;《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》;20050211;第280卷(第6期);摘要，第4929页左栏第1段至第4938页右栏第2段 * |
| Notch 信号在慢性粒细胞白血病细胞增殖和伊马替尼耐药的调控作用研究;付伟;《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》;20160815(第8期);第1-119页 * |
| Notch-Hes信号通路异常与急性白血病;谷振阳 等;《中国实验血液学杂志》;20170228;第25卷(第1期);第240-243页 * |
| The bHLH gene Hes6, an inhibitor of Hes1, promotes neuronal differentiation;Soo-Kyung Bae et al.;《Development》;20000613;第127卷(第13期);摘要，第2933页左栏1段至第2942页右栏第1段 * |
| 慢性髓性白血病患者骨髓中Notch 信号通路的表达;冯超 等;《郑州大学学报》;20161130;第51卷(第6期);摘要，第736页左栏第1段至第739页左栏第2段 * |
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