CN113564260A - Cpne3在检测和治疗胶质母细胞瘤中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了检测CPNE3表达水平的试剂在制备检测胶质母细胞瘤产品中的应用。本发明通过下调CPNE3可抑制GBM细胞的增殖，促进GBM细胞凋亡，同时发现CPNE3可激活PI3K/AKT通路的主要蛋白标记物磷酸化，相应的途径抑制剂LY294002可对抗CPNE3过表达诱导的细胞增殖增强作用。上述研究为指导其临床早期干预及靶向治疗提供了重要理论依据，有助于开发新的治疗策略来对抗GBM。

Description

CPNE3在检测和治疗胶质母细胞瘤中的用途
技术领域
本发明涉及生物技术和医学检测技术领域，具体涉及CPNE3在检测和治疗胶质母细胞瘤中的用途。
背景技术
胶质母细胞瘤(glioblastoma，GBM)是中枢神经系统最常见的恶性原发肿瘤，主要表现为颅内压增高、神经认知功能障碍和癫痫发作，致使中枢神经受损，危及患者生命。在过去的几十年里，通过手术切除联合化疗和放疗的标准治疗，预后得到了一定的改善。然而，由于肿瘤生长迅速，GBM患者的复发率仍然很高，预后仍然较差。因此，研究肿瘤的增殖和凋亡机制，以及新的GBM治疗策略是必要的。
CPNE3在多种癌变中发挥重要作用。例如，CPNE3在非小细胞肺癌(Non-small celllung cancer,NSCLC)中被认为是一个致癌基因，通过激活FAK信号通路促进NSCLC转移。此外，CPNE3在急性髓系白血病中过表达可能是一个不良预后的生物标志物。然而，CPNE3在GBM中的作用鲜有报道。
即使经过数十年的深入研究，胶质母细胞瘤(GBM)进展的信号调节网络仍不清楚，需要更深入地了解GBM通路的分子串扰，以确定新的早期诊断标志和潜在治疗靶点。
发明内容
基于此，针对上述技术问题，本发明的目的在于提供CPNE3在制备检测和/或治疗胶质母细胞瘤产品中的应用；所述CPNE3在GBM患者样本中表达显著高于正常对照；敲低CPNE3明显抑制GBM细胞的增殖，促进GBM细胞的凋亡。
为实现上述目的，本发明具体技术方案如下：
本发明第一方面提供了检测CPNE3表达水平的试剂在制备检测胶质母细胞瘤产品中的应用。
进一步的，所述检测，包括：
a)鉴定受试者的样本中的标志物CPNE3；以及
b)将所述标志物与参照进行比较，其中与参照相比的所述标志物的表达差异用于检测胶质母细胞瘤。
进一步的，所述样本包括组织、血液或细胞。
进一步的，所述产品包括芯片、制剂或试剂盒。
进一步的，比正常对照相比，所述CPNE3在胶质母细胞瘤患者的样本中表达上调。
本发明第二方面提供了一种检测胶质母细胞瘤的试剂盒，其包括检测样本中CPNE3基因或其蛋白表达水平的试剂。
进一步的，所述试剂选自：
特异性识别CPNE3基因的探针；或
特异性扩增CPNE3基因的引物；或
特异性结合CPNE3编码的蛋白的抗体或配体。
进一步的，所述特异性扩增CPNE3基因的引物序列如SEQID NO.1-2所示。
本发明第三方面提供了CPNE3抑制剂在制备治疗胶质母细胞瘤的药物组合物中的应用。
进一步的，所述抑制剂是以CPNE3基因为靶序列、且能够抑制CPNE3基因的干扰分子，包括：shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。
进一步的，所述抑制剂的靶向基因序列包括如SEQ ID NO.3-5所示。
发明人利用siRNA或shRNA敲低GBM细胞中CPNE3表达后，明显抑制细胞增殖，促进细胞凋亡。
因此，寻找到了预防或治疗胶质母细胞瘤的新途径—抑制CPNE3基因或蛋白的过表达。
本发明第四方面提供了一种治疗胶质母细胞瘤的药物组合物，所述药物组合物包括CPNE3抑制剂和/或PI3K抑制剂。
进一步的，所述CPNE3抑制剂通过抑制PI3K/AKT通路，进而抑制胶质母细胞瘤细胞增殖，促进细胞凋亡。
通常，可将这些抑制剂配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。
在本发明中，是本领域已知的各种载体，如市售的载体、包括质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。表达载体向宿主细胞中的导入可以使用电穿孔法、磷酸钙法、脂质体法、DEAE葡聚糖法、显微注射、病毒感染、脂质体转染、与细胞膜透过性肽的结合等周知的方法。
在本发明中，“宿主细胞”可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如酵母；CHO、COS、或293细胞的动物细胞等。
优选的，所述药物组合物包括药学上可接受的载体和/或辅料。
本发明的药物组合物还可以与其他治疗胶质母细胞瘤的药物联用，其他治疗性药物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性药物。
本发明有益效果：
本发明发现CPNE3在TCGA数据集GBM组织中的表达水平相较于癌旁正常组织显著升高，并通过临床样本和细胞实验进一步验证。为了阐明CPNE3在GBM病理中的潜在功能，发明人在GBM细胞系中敲除和过表达CPNE3，并在离体和在体动物模型中，研究CPNE3对细胞增殖和凋亡的生物学功能，通过下调CPNE3可抑制GBM细胞的增殖，促进GBM细胞凋亡，同时发现CPNE3可激活PI3K/AKT通路的主要蛋白标记物磷酸化，相应的通路抑制剂LY294002可对抗CPNE3过表达诱导的细胞增殖增强作用。上述发现为指导其临床早期干预及靶向治疗提供了重要理论依据，有助于开发新的治疗策略来对抗GBM。
附图说明
图1CPNE3在GBM组织中上调。(A)与TCGA数据库中的相邻正常组织(Normal n＝5)相比，GBM组织(GBM n＝168)中CPNE3的mRNA表达水平显著升高。(B)与GEPIA数据库中的相邻正常组织(Normal n＝207)相比，GBM组织(GBM n＝163)中CPNE3的mRNA表达水平显著升高。(C)CPNE3 mRNA在临床GBM样本(肿瘤n＝16)和配对的相邻正常组织(相邻n＝16)中的相对表达水平。(D)临床GBM样本(左)和相邻正常组织(右)的代表性免疫印迹图像。对临床样本中CPNE3标准化蛋白水平的柱状图。所有数据均展示为平均值±SD。*代表指定组之间p值<0.05。
图2CPNE3在GBM细胞系中的表达调控。(A)与正常人神经胶质细胞系HEB相比，GBM细胞系(包括A172、T98G、U251、U87)中CPNE3 mRNA的相对表达水平。*代表相应组别与HEB组相比p值<0.05。(B)A172、T98G、U251、U87和HEB细胞系中CPNE3蛋白表达水平的代表性免疫印迹图像和柱状图。*代表指定组别与HEB组相比，p值<0.05。(C)与空白对照组(U251)以及阴性对照组(siNC)相比，CPNE3敲低组(siCPNE3-1、siCPNE3-2、siCPNE3-3)中CPNE3的mRNA表达下调。*代表与对照组相比，p值<0.05。(D)与空白对照组(T98G)以及阴性对照组(Vector)相比，CPN3E过表达组(oeCPNE3)中CPNE3的mRNA表达上调，*代表指定组别与对照组相比，p值<0.05。CPNE3敲低的U251细胞(E)和CPNE3过表达的T98G细胞(F)中CPNE3表达的代表性免疫印迹图像和柱状图。*代表指定组别与对照组相比，p值<0.05。
图3CPNE3过表达可以在GBM细胞系中促进细胞增殖。(A)CCK-8分析表明，转染CPNE3的siRNA可以抑制U251细胞的增殖，*代表指定组别与siNC组相比，p值<0.05。(B)CCK-8分析表明CPNE3的过表达促进了T98G细胞的增殖。转染siCPNE3的U251细胞(C)和CPNE3过表达的T98G细胞(D)中PCNA和Ki67的代表性免疫印迹图像，*代表指定组别与Vector组相比，p值<0.05。柱状图显示了CPNE3敲降的U251细胞和CPNE3过表达T98G细胞中PCNA(E)和Ki67(F)的表达。*代表在指定组之间p值<0.05。
图4CPNE3可以促进GBM细胞凋亡。(A)&(B)转染siCPNE3(siCPNE3-1和siCPNE3-2)的U251细胞和转染过表达CPNE3(oeCPNE3)的T98G细胞通过流式细胞术分析细胞凋亡。凋亡细胞的百分比表示为平均值±SD。(C)当细胞中CPNE3的表达被敲低或过表达，凋亡相关蛋白XIAP和Bim的代表性免疫印迹图像。(D)XIAP的表达被siCPNE3抑制并被CPNE3过表达增强。(E)显示Bim的表达被siCPNE3增强并被CPNE3过表达抑制。*表示在指定组之间p值<0.05。
图5PI3K/AKT信号通路参与CPNE3诱导的GBM细胞增殖和凋亡调控。(A)GSEA分析表明CPNE3通过激活PI3K/AKT信号通路实现了调节作用。(B)CPNE3下调的U251细胞(siCPNE3-1和siCPNE3-2)和CPNE3过表达的T98G细胞(oeCPNE3)中PI3K/AKT通路关键蛋白的代表性免疫印迹图像。(C)柱状图显示CPNE3的表达与PI3K/AKT磷酸化呈正相关(p-PI3K和p-AKT)，而与PI3K/AKT的总表达量无显着关联(PI3K和AKT)。(D)与阴性对照组(Veh+Vec，带线的圆圈)相比，CPNE3的过表达促进T98G细胞中GBM细胞增殖(Veh+OE，带线的方块)；由CPNE3过表达诱导的这种增强作用被PI3K抑制剂LY294002(LY+OE，带线的向下三角)抑制。(E)&(F)CPNE3过表达(oeCPNE3)在T98G细胞中可以抑制细胞凋亡，而PI3K抑制剂LY294002(LY294002，黑色)逆转了CPNE3过表达(oeCPNE3)和CPNE3的细胞凋亡抑制作用-野生型细胞。通过流式细胞术分析细胞凋亡。凋亡细胞的百分比表示为平均值±SD。*代表在指定组之间p值<0.05。
图6CPNE3在裸鼠异种移植瘤模型中促进GBM肿瘤生长。(A)shCPNE3和shNC干预的裸鼠异种移植肿瘤的图像。(B)从植入后第12天到第33天，每隔3天测量肿瘤大小；并计算肿瘤体积。*代表与shNC组相比，指定组别p值<0.05。(C)植入后33天对大鼠实施安乐死，收集异种移植肿瘤并称重。(D)和(E)蛋白质免疫印迹分析表明，CPNE3的敲低可以抑制PI3K/AKT通路激活，而总PI3K/AKT表达没有显着变化。*代表指定组之间p值<0.05。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
下述实施例所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所有的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例中所用的材料：
PCNA抗体(1:1000；Cell Signaling Technology,#13110)，ki67抗体(1:500,Abcam,Ab16667),XIAP抗体(1:1000,Abcam,Ab28151)，Bim抗体(1:1000,Abcam,Ab7888),p-P13K抗体(1:1000,Abcam,Ab182651)，P13K抗体(1:1000,Abcam,Ab133595)，AKT抗体(1:1000，Cell Signaling Technology，#9272)，p-AKT抗体(1：2000，Cell SignalingTechnology，#4060)，抗GAPDH抗体(1：2000，Cell Signaling Technology，#5174)；AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒(Beyotime，C1062M)；
实施例中所用的细胞系及细胞培养：人GBM细胞株(A172、T98G、U251、U87)、人星形细胞细胞株HEB和人HEK293T细胞株均取自美国ATCC(American Type CultureCollection,USA)。A172、T98G、U251、U87、HEB、HEK293T细胞在添加10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM(Hyclone,USA)中培养。细胞在37℃、5％CO2湿化培养箱中培养。根据细胞需要，定期更新培养液。
本发明的统计分析：
数据表示为一式三份的平均值±标准偏差(SD)。通过重复测量方差分析，然后是Bonferroni检验和t检验建立组之间的差异。p值<0.05具有显著性(*)。
实施例1 CPNE3在GBM中过表达
为了研究CPNE3在GBM中的功能，发明人首先比较了TCGA/GEPIA数据集中CPNE3在GBM肿瘤组织和癌旁正常组织中的表达。结果发现，与癌旁组织相比，CPNE3的mRNA表达在GBM组织中显著上调(图1A,B)。
进一步，发明人收集GBM临床样本使用Real-time PCR和Western Blot分别检测CPNE3的mRNA和蛋白的表达情况。
具体方法如下，
GBM样本收集：自2019年6月至2020年12月收集于北京天坛医院手术患者16例的GBM肿瘤组织及相应的癌旁组织，肿瘤切除后立即冷冻于液氮中。患者知情同意经首都医科大学附属北京天坛医院伦理委员会批准(KY 2018-052-01)。
Real-time PCR检测：使用RNAiso Plus试剂盒(invitrogen)分离组织中的总RNA。使用OneScript Plus逆转录酶试剂盒(Fermentas)将mRNA转录成cDNA。Real-time PCR使用SYBR Green PCR MasterMix试剂盒(Thermo)在ABI仪上进行检测。以GAPDH作为内参比较不同组中CPNE3基因的表达水平。
所述Real-time PCR的扩增引物：
Homo sapiens copine 3(CPNE3),mRNA
NM_003909.5
Primer F 5'-CATTGTAGAGGCGTATCG-3'，SEQ ID No.1；
Primer R 5'-CCATCACCATCCAGAAAC-3'，SEQ ID No.2；
Pos:1286-1567
产物大小:282bps。
Western Blot检测：将组织块或细胞在含有1mM苯甲磺酰氟(PMSF)的RIPA裂解缓冲液中裂解提取总蛋白。总蛋白裂解物(25μg)经10％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转移至PVDF膜，室温下用5％脱脂奶粉封闭1h，然后与CPNE3抗体(1:500,Abcam,Ab236606)4℃孵育过夜，TBST洗涤3次。在室温下应用HRP偶联的二抗(1:1000，Beyotime)孵育1h，TBST洗涤3次。ECL超敏化学发光液显影，经Tanon-5200成像系统成像。以GAPDH蛋白作为内参比较不同组中CPNE3蛋白的表达水平。
结果发现，CPNE3的mRNA和蛋白质表达均高于配对的相邻正常组织(图1C、D)。生物信息分析以及临床样本中的验证表明CPNE3可能在GBM病理学中起致瘤基因的作用。
实施例2 CPNE3在GBM细胞中的表达与调控
为了选择合适的细胞模型，发明人分析了CPNE3 mRNA和蛋白在人胶质瘤细胞系A172、T98G、U251、U87和人正常胶质细胞系HEB中的表达情况。选取CPNE3 mRNA(图2A)和蛋白(图2B)表达明显高于HEB细胞株的所有胶质瘤细胞株，并进一步选取CPNE3表达最高的(U251)和最低的(T98G)胶质瘤细胞株进行CPNE3下调和过表达研究。
发明人设计3种不同siCPNE3分别为siCPNE3-1、siCPNE3-2、siCPNE3-3及siNC对照组，用于CPNE-3的敲降，并在pLKO.1-puro(Addgen公司)中克隆。具体为，利用RNA干扰技术，以CPNE3基因为靶基因，选取3个RNAi靶点，命名为siCPNE3-1(GGTGGAGTGTTATGATTAT，SEQID No.3)、shCPNE3-2(GCAGACAGCTTCTCAATAT，SEQ ID No.4)、shCPNE3-3(CCAGACAAGCTATAGTTAA，SEQ ID No.5)，设计CPNE3基因特异性的小干扰RNA(siRNA)，构建其短发夹RNA(shCPNE3-1、shCPNE3-2、shCPNE3-3)，连接到经EcoR I和AgelI双酶切线性化的pLKO.1-puro慢病毒载体上，转化DH5a大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性克隆，将pLKO.1-shCPNE3、psPAX2和pMD2G质粒共转染包装细胞293T，包装生产慢病毒并测定滴度。用shCPNE3慢病毒感染U251细胞，用于敲低细胞中CPNE3基因表达。
所述shCPNE3-1核苷酸序列为，
正义链：
5’-CCGGTGGTGGAGTGTTATGATTATCTCGAGATAATCATAACACTCCACCTTTTTG-3’，SEQ IDNo.6；
反义链：
5’-AATTCAAAAAGGTGGAGTGTTATGATTATCTCGAGATAATCATAACACTCCACCA-3’，SEQ IDNo.7；
所述shCPNE3-2核苷酸序列为，
正义链：
5’-CCGGTGCAGACAGCTTCTCAATATCTCGAGATATTGAGAAGCTGTCTGCTTTTTG-3’，SEQ IDNo.8；
反义链：
5’-AATTCAAAAAGCAGACAGCTTCTCAATATCTCGAGATATTGAGAAGCTGTCTGCA-3’，SEQ IDNo.9；
所述shCPNE3-3核苷酸序列为，
正义链：
5’-CCGGTCCAGACAAGCTATAGTTAACTCGAGTTAACTATAGCTTGTCTGGTTTTTG-3’，SEQ IDNo.10；
反义链：
5’-AATTCAAAAACCAGACAAGCTATAGTTAACTCGAGTTAACTATAGCTTGTCTGGA-3’，SEQ IDNo.11。
然后，构建过表达质粒，通过NCBI查找目的基因的mRNA序列，针对CDS区域以及选用载体设计引物及酶切位点。CPNE3(NM_003909.5)基因CDS区域全长1614bp，根据载体信息选择酶切位点为上游EcoR I、下游BamH I，克隆到pLVX-Puro慢病毒载体(Clontech公司)中。将过表达质粒转染293T细胞。用慢病毒上清液感染T98G细胞，感染72h后。
用q-PCR和Western Blot检测上述制备的T98G细胞和U251细胞中CPNE3基因表达水平。
结果显示，3种不同siCPNE3包装的慢病毒载体转染到U251细胞中，这些慢病毒载体均显著降低了CPNE3的mRNA和蛋白水平(图2C&E)，选择siCPNE3-1和siCPNE3-2进行细胞功能实验。相反，将CPNE3包装的慢病毒转染到T98G细胞中，诱导CPNE3过表达(图2D&F)。
实施例3 CPNE3促进GBM细胞增殖
为了研究CPNE3对细胞增殖的作用，发明人进行了CCK-8(SAB，CP002)实验，实验分组如下，
CPNE3基因干扰胶质瘤U251细胞
1)siNC；
2)siCPNE3-1；
3)siCPNE3-2；
CPNE3基因过表达T98G细胞
1)Vector；
2)oeCPNE3；
将处于对数生长期的各组细胞，在显微镜下计数后制成3×104个细胞/ml的细胞悬液。分别取100μl至96孔培养板，每种细胞每块板接种3个同样的孔作为复孔，3×103个细胞/孔，以100μl培养液做空白对照，37℃5％CO2中培养。0h/24h/48h/72h后，按1:10体积比混合Cell Counting Kit-8(CCK-8)和无血清必需基本培养基，每孔100μL加入待测孔中，在37℃，5％CO2培养箱中孵育1h；用酶标仪测定450nm波长吸光度。记录每块板的数值。
结果显示，CPNE3敲降组的细胞与siNC处理的细胞相比，从24h到72h开始显著抑制U251细胞的增殖(p<0.01，图3A)；CPNE3过表达组的细胞与载体处理的细胞比较，可显著促进T98G细胞增殖(p<0.01，图3B)。
发明人还检测了增殖相关蛋白水平，增殖细胞核抗原(PCNA)和Ki67在CPNE3敲除组中显著下调(图3C)，而在CPNE3过表达组中显著上调(图3D)。提示CPNE3在GBM细胞增殖过程中起重要作用。
实施例4 CPNE3抑制GBM细胞凋亡
采用流式细胞仪检测CPNE3对GBM细胞凋亡的影响。
转染后48小时，收集细胞，并用4℃PBS洗涤两次，然后重悬于结合缓冲液(10mMHEPES/NaOH、140mM NaCl、2mM KCl)中。Annexin V-FITC 4℃避光孵育15min。然后再次洗涤细胞、离心并重悬于结合缓冲液中。在流式细胞术分析之前，将PI添加到每个样品中。凋亡细胞通过cytoFLEX(BECKMAN)系统定量，标记为Annexin V+/PI-的细胞是早期凋亡细胞。
通过Annexin V-FITC染色，结果显示，转染siCPNE3的U251细胞凋亡率显著提高(p<0.05)。CPNE3上调组T98G细胞凋亡百分率显著降低(p<0.05)(图4A&B)。发明人还通过Western Blot技术分析了凋亡抑制蛋白(XIAP)和凋亡调节蛋白Bim的表达(图4C)，结果显示，siCPNE3处理U251细胞后，抑制了XIAP的表达，促进了Bim的表达。而CPNE3在T98G细胞中过表达则显示相反的结果。以上结果表明，CPNE3在一定程度上通过调控细胞凋亡来影响GBM细胞的活力和增殖。
实施例5 cpne3相关通路分析
采用基因集富集分析(GSEA)来评估TCGA GBM样本中CPNE3表达相关的途径。发明人使用在线基因集富集分析(GSEA v2.0，http://www.broad.mit.edu/gsea/)对CPNE3的表达与生物过程/途径、表型之间的关系进行分析。从分子特征数据库MSigDB(http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb)中获得预定义的基因集。来自TCGA数据集的样本以中位数将样本分为CPNE3高表达组和低表达组。当FDR评分<0.25时，基因集被认为显著富集。
结果显示CPNE3表达与PI3K-AKT-mTOR信号通路呈正相关(图5A)。PI3K/AKT通路在各类癌症细胞增殖中起重要作用，提示CPNE3可能通过影响PI3K/AKT通路调控GBM的增殖和凋亡。因此，发明人采用Western Blot检测PI3K/AKT通路是否参与CPNE3影响下的增殖调节。如图5B&C所示,siRNA-CPNE3处理的U251细胞使PI3K和AKT的磷酸化水平降低，相反的，在CPNE3过表达的T98G细胞中PI3K和AKT的磷酸化水平升高，以上调控均没有影响PI3K和AKT总量的表达。
实施例6 CPNE3通过PI3K/AKT途径调控细胞增殖和凋亡
为了进一步探索CPNE3参与调控作用的机制，发明人应用PI3K抑制剂LY294002来抑制PI3K/AKT通路的激活。将CPNE3基因过表达T98G细胞联合20μM的LY294002处理，实验分为：1)Vehicle Vector；2)Vehicle oeCPNE3；3)LY294002Vector；4)LY294002oeCPNE3，检测各组细胞增殖和凋亡情况。
如图5D所示，CCK8检测显示LY294002抑制了因CPNE3过表达而介导的T98G细胞增殖。Annexin V-FITC染色流式细胞分析显示，LY294002处理后T98G细胞的凋亡率与对照处理组(4.90±0.38％)相比显著升高(18.77±0.57％，p<0.05)。同时，因CPNE3过表达而介导的凋亡抑制作用也得到了缓解(p<0.05)(图5E&F)。提示CPNE3通过激活PI3K/AKT通路促进GBM细胞增殖，抑制细胞凋亡。
实施例7 CPNE3的敲降可抑制U251细胞的在裸鼠体内的增殖
为了研究CPNE3在裸鼠体内对胶质瘤生长的影响，发明人建立了裸鼠异种移植瘤模型，具体的，分别将转染shNC和shCPNE3-1，shCPNE3-2的U251细胞(实施例2中制备)重悬于无血清DMEM培养基中，浓度为5×107细胞/mL。18只雄性裸鼠随机分为3组，分别在右侧腋窝皮下接种0.1mL细胞悬液。肿瘤的长度和宽度每周使用游标卡尺测量，并按照0.5×长度×宽度2计算肿瘤体积。培养5周后将小鼠安乐死，肿瘤被收集并称重，同时计算生长曲线。
结果发现，注射CPNE3下调的U251细胞的小鼠生长速度明显慢于对照组(图6A&B)。此外，注射CPNE3下调的U251细胞的小鼠肿瘤明显小于对照组(图6C)。同时免疫荧光染色检测PCNA、Ki67在异种移植瘤组织中的表达发现，CPNE3敲除组肿瘤组织中PCNA和Ki67的荧光信号明显降低。HE染色发现CPNE3敲除组细胞密度降低，细胞核缩小。此外，与发明人之前在离体细胞模型的研究结果一致，在CPNE3敲低动物中PI3K和AKT的磷酸化水平被显著抑制，而PI3K和AKT的总表达没有显著变化(图6D&E)。
所述免疫荧光方法如下:
将移植瘤组织切成小块，一般为1.5cm×1.5cm×0.3cm，石蜡包埋制备。通常，5μm切片在室温下风干2小时。切片在PBS中洗涤3次，并在室温下在2％BSA、0.1％Tween20的PBS中封闭。然后，将切片在PBS中洗涤3次，并与一抗Ki-67(Abcam，Ab15580)和PCNA(Abcam，Ab18197)一起在4℃下孵育过夜。第二天，切片在PBST(PBS中的0.05％Tween20)中洗涤3次，并使用Alexa Fluor 488二抗(1:500，Byotime，A0423)。每个切片加入DAPI(1:500，Byotime，C1002)并避光孵育1h。所有图像均使用荧光显微镜(NIKON，ECLIPSE Ni)拍摄。
所述HE染色方法如下：
固定异种移植肿瘤组织，然后进行石蜡包埋。具体将5μm切片在室温下风干2小时。组织切片脱蜡、再水化，并用苏木精和伊红(H&E)进行组织学染色，所有图像均使用显微镜(NIKON,ECLIPSE Ni)拍摄。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 北京市神经外科研究所
<120> CPNE3在检测和治疗胶质母细胞瘤中的用途
<130> P210227
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
cattgtagag gcgtatcg 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
ccatcaccat ccagaaac 18
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
ggtggagtgt tatgattat 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
gcagacagct tctcaatat 19
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
ccagacaagc tatagttaa 19
<210> 6
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
ccggtggtgg agtgttatga ttatctcgag ataatcataa cactccacct ttttg 55
<210> 7
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
aattcaaaaa ggtggagtgt tatgattatc tcgagataat cataacactc cacca 55
<210> 8
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
ccggtgcaga cagcttctca atatctcgag atattgagaa gctgtctgct ttttg 55
<210> 9
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
aattcaaaaa gcagacagct tctcaatatc tcgagatatt gagaagctgt ctgca 55
<210> 10
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 10
ccggtccaga caagctatag ttaactcgag ttaactatag cttgtctggt ttttg 55
<210> 11
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 11
aattcaaaaa ccagacaagc tatagttaac tcgagttaac tatagcttgt ctgga 55

Claims (10)

1.检测CPNE3表达水平的试剂在制备检测胶质母细胞瘤产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，比正常对照相比，所述CPNE3在胶质母细胞瘤患者的样本中表达上调。
3.一种检测胶质母细胞瘤的试剂盒，其特征在于，其包括检测样本中CPNE3基因或其蛋白表达水平的试剂。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂选自：
特异性识别CPNE3基因的探针；或
特异性扩增CPNE3基因的引物；或
特异性结合CPNE3编码的蛋白的抗体或配体。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述特异性扩增CPNE3基因的引物序列如SEQ ID NO.1-2所示。
6.CPNE3抑制剂在制备治疗胶质母细胞瘤的药物组合物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抑制剂是以CPNE3基因为靶序列、且能够抑制CPNE3基因的干扰分子，包括：shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抑制剂的靶向基因序列包括如SEQ IDNO.3-5所示。
9.一种治疗胶质母细胞瘤的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括CPNE3抑制剂和/或PI3K抑制剂。
10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述CPNE3抑制剂通过抑制PI3K/AKT通路，促进细胞凋亡，进而抑制胶质母细胞瘤细胞增殖。
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