CN106929596A - Cpne3基因作为预测诊疗急性心肌梗死标记物的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种CPNE3基因作为预测诊疗急性心肌梗死标记物的医用用途,提供了以CPNE3基因和或基因的表达产物一种新的急性心肌梗死风险预测和诊断治疗靶点,利用CPNE3基因及其表达产物制备急性心肌梗死风险预测标记物和诊断制剂,具有重要的临床应用意义和开发价值。
Description
发明领域:
本发明公开一种CPNE3基因作为预测诊疗急性心肌梗死标记物的用途,涉及外周血急性心肌梗死标志物检测及其应用,属于疾病风险预测评估,基因诊断和生物医药领域。
发明背景:
心肌梗死是一种以高发病率和高死亡率为特点的全球性疾病。全球每年超过300万人新患ST段抬高型心肌梗死,超过400万人新患非ST段抬高型心肌梗死。心肌梗死在发达国家中的发病率较高,在中国等发展国家中的发病率正呈快速上升趋势。流行病学、基础科学相关研究表明,生活方式因素和遗传因素共同促进了冠脉粥样硬化发展和心肌梗死发生。大多数MI是由已知致冠脉粥样硬化危险因素(吸烟、血脂异常、高血压、腹型肥胖、糖尿病等)和易感基因相互作用及其之间相互作用引起。冠心病是一个复杂遗传疾病,现代基因技术已从大量的基因研究中识别出冠心病进展中重要诱发基因或易感基因。
文献表明外周血中基因表达水平可能反应了复杂心血管疾病的变化,是极具意义的检验心血管疾病的生物标志物。发明人前期进行的外周血急性心肌梗死差异基因表达谱分析结果显示:在急性心肌梗死患者和稳定型冠心病患者的外周血白细胞中存在着大量差异表达的基因。其中,CPNE3基因在急性心肌梗死病人外周血中呈现显著低表达,并且在现有研究中未见对CPNE3基因与心肌梗死的相关报道。发明人在前期研究成果的基础之上,通过扩大样本量,来进一步验证CPNE3基因在急性心肌梗死发病过程中的差异表达,并分析CPNE3基因促进稳定型冠心病发展为急性心肌梗死的可能机制。本发明提供了一种新的急性心肌梗死风险预测和诊断治疗靶点,具有重要的临床应用意义和开发价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种CPNE3基因作为预测诊疗急性心肌梗死标记物的用途,用于急性心肌梗死风险预测和诊断,所述急性心肌梗死风险预测和诊断制剂检测CPNE3基因和或基因的表达产物。进一步的,所述的CPNE3基因和或基因的表达产物在急性心肌梗死外周血中低表达。进一步的,所述的CPNE3基因和或基因的表达产物的表达水平荧光定量检测方法。
本发明的目的在于所述急性心肌梗死风险预测和诊断制剂检测CPNE3基因和或基因的表达产物进一步的,采用荧光定量试剂盒、基因芯片、酶联免疫、抗体杂交方法外周血中基因的表达检测方法和相关的生物制剂。
本发明的目的在于所述急性心肌梗死风险预测和诊断制剂检测CPNE3基因和或基因的表达产物进一步的,包含本CPNE3基因和或表达产物用于急性心肌梗死风险预测和诊断的生物制剂。
本发明中荧光定量PCR检测中使用的引物对,其序列如下:
上游引物序列:5’TGTAGGGAGAAGGACCGTGA 3’;
下游引物序列:5’ATGGCTGAAGGTGAAACAGG 3’。
本发明中荧光定量PCR检测体系及反应条件:
荧光定量PCR反应体系:20ul反应体系,每个反应包括:10ul SYBR Premix Ex Taq TM,上、下游引物各0.5ul(浓度为10umol/L),无核酸酶的双蒸水8ul,cDNA模板1ul。权利要求3中所述的荧光定量PCR反应条件:应用实时荧光定量PCR系统扩增。反应条件为95℃预变性10分钟;40个循环:95℃变性15秒, 60℃退火20秒, 72℃ 20延伸秒;溶解曲线和扩增曲线95℃ 1 分钟,55℃ 30秒, 95℃ 30秒。以GAPDH基因为内参基因,所有样本至少重复测量三次,结果取均值;根据CPNE3基因在外周血中mRNA表达水平的高低来预测稳定型冠心病患者发生急性心肌梗死风险的大小。
本发明进行的外周血急性心肌梗死差异基因表达谱分析结果显示:在急性心肌梗死病人的外周血白细胞中存在着大量差异表达的基因。其中,CPNE3基因在急性心肌梗死病人外周血中呈现显著低表达。发明人在前期研究成果的基础之上,通过扩大样本量,来进一步验证CPNE3基因在急性心肌梗死发病过程中的差异表达,并分析CPNE3基因促进急性心肌梗死发病的可能机制。
本发明的积极效果在于:
提供了以CPNE3基因和或基因的表达产物一种新的急性心肌梗死风险预测和诊断治疗靶点,利用CPNE3基因及其表达产物制备急性心肌梗死风险预测标记物和诊断制剂,具有重要的临床应用意义和开发价值。
附图说明
图1为本发明CPNE3基因荧光定量PCR的扩增曲线;
图2为本发明CPNE3基因荧光定量PCR特异性引物的溶解曲线;
图3为本发明CPNE3基因mRNA表达水平在急性心梗组和稳定冠心病组的比较;
图4为本发明CPNE3在蛋白水平上的表达水平比较。AMI组,样本编号为1、2、3;SCAD组,样本编号为4、5、6;
图5为本发明CPNE3在蛋白水平灰度分析在急性心肌梗死组和稳定型冠心病组的比较;
图6为本发明实施例3中CPNE3基因相对表达量的ROC曲线。
具体实施方式
结合实例具体实例,进一步阐述本发明,仅用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解,在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型。
实施例1
一、病例的收集
选取2014年11月-2016年11月于吉林大学中日联谊医院心血管内科住院治疗并行冠脉造影术的患者,依据2012年公布的心肌梗死全球统一定义明确诊断为急性心肌梗死的病人91 例为AMI组,2013年ESC指南公布的稳定型冠心病定义诊断为稳定型冠心病的病人87例为SCAD组。并根据冠状动脉造影结果,按照Gensini评分系统对研究对象的冠状动脉血管病变严重程度进行评分,分值越高病变越严重。
二、本发明排除标准:
1.和经皮冠状动脉介入治疗( PCI)或冠状动脉旁路移植术( CABG)相关的心肌梗死;
2.MI type II。继发于供血失衡相关的心梗:如儿茶酚胺水平升高或冠脉痉挛导致的心梗;
3.伴有心脏手术或非心脏手术的心梗;
4.合并多因素或不确定疾病的心肌损伤:严重心力衰竭、应激性心肌病、严重肺栓塞或肺动脉高压、败血症和危重病人、肾功能衰竭、严重的急性神经系统疾病,如卒中、蛛网膜下腔出血等;
5.患有免疫系统疾病和(或)正在服用激素;
6.(活动性或潜伏性)结核感染史或证据;
7.正在患有的、慢性的或复发性的传染性疾病史;
8.合并有严重感染性疾病、恶性肿瘤。怀疑或证实处于免疫缺陷状态的患者;
9.临床资料或者冠脉造影资料不全者。详细记录临床资料,包括:血脂水平、空腹血糖水平、静息血压、体质指数( BMI)、冠心病家族史、吸烟史、冠状动脉造影资料,以及合并其它临床疾病情况(如高血压、糖尿病)等。
三、急性心肌梗死患者组及对照组外周血中CPNE3基因表达情况
1.1 外周血采集、总RNA提取及cDNA合成
留取各研究对象晨起空腹外周静脉血4ml,利用血液总RNA提取试剂盒(RNAsimpleTotal RNA Kit,天根生化科技有限公司,北京),依据试剂盒说明书对已获取的外周血进行总RNA提取,并利用1.5%琼脂糖电泳及紫外分光光度计(Nanodrop 2000)对RNA的质量及浓度进行检测。合格的RNA样本A260/A280值在1.9和2.1之间,且A260/A230值大于2。琼脂糖凝胶电泳可见明亮的28S和18S rRNA条带,且28S rRNA条带亮度约为18S rRNA的两倍。采用反转录试剂盒(TOYOBO Rever Tra Ace qPRC RT kit,上海),取总量为1ug合格的总RNA进行反转录,得到cDNA样品保存于-20℃以便下一步进行实时荧光定量PCR。
实时荧光定量PCR检测
利用SYBR荧光定量试剂盒(SYBR Premix Ex Taq TM ,TaKaRa, 大连)进行PCR扩增。采用20ul反应体系,每个反应包括:10ul SYBR Premix Ex Taq TM,上、下游引物各0.5ul(浓度为10umol/L),无核酸酶的双蒸水8ul,cDNA模板1ul。应用Mx3005P实时荧光定量PCR系统(Strata Gene)扩增。反应条件为95℃10分钟;40个循环:95℃ 15秒, 60℃ 20秒, 72℃ 20秒;95℃ 1 分钟,55℃ 30秒, 95℃ 30秒。以GAPDH基因为内参基因,所有样本至少重复测量三次,结果取均值。每个样本所得循环阈值(Ct)以相对表达量2-△Ct表示(△Ct=目的基因Ct-内参基因Ct),并进行比较。急性心肌梗死组对于对照组的相对表达量以2-△△Ct法进行统计分析,△△Ct=急性心肌跟死组△Ct-对照组△Ct。所用PCR引物根据NCBI数据库提供的CPNE3基因序列进行设计,并由上海生工生物技术有限公司合成,引物序列见表1
表 1. RT-PCR 引物序列
Genes | Genes Primer sequence(5’-3’) | |
CPNE3 | Fa | GTCAGACCCTTTATGTGTGTTGT |
Rb | TGGAAAATTGGGGATTCAAGCAA | |
GAPDH | Fa | ACGGATTTGGTCGTATTGGGCG |
Rb | CTCCTGGAAGATGGTGATGG |
Fa, 上游引物;Rb,下游引物。
四、 CPNE3基因相对表达量与急性心肌梗死患者血脂,血糖等性状的相关性分析
1.1方法统计学分析
数据使用SPSS 26.0软件进行统计学分析,计量资料服从正态分布使用X±S进行统计描述,组间差异比较使用独立T检验分析,不服从正态分布的使用中位数和四分位数间距进行统计分析描述,组间差异使用秩和检验;计数资料采用频数进行统计分析描述,组间差异使用x²检验分析;AMI相关危险因素采用二元logistic回归分析。CPNE3基因相对表达量与心肌肌钙蛋白I 和 Gensini 评分的相关性采用双变量相关分析;统计结果以双侧p<0.05认为有统计学意义。
临床资料分析
研究对象的临床资料分析结果表明:在年龄、性别、 BMI、高血压病史、冠心病家族史、收缩压、舒张压及血清甘油三酯水平( TG)、血清总胆固醇水平( TC)、和低密度脂蛋白胆固醇水平( LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)等方面,两组未见明显统计学差异。AMI组患者年龄明显高于SCAD组,差异均有统计学意义,详见表2。
基因实时荧光定量 PCR 扩增产物鉴定
外周血 RNA 实时荧光定量 PCR 检测结果显示:CPNE3基因扩增曲线为显著平滑的“S型”,见图1。溶解曲线呈现单一的溶解峰,扩增产物特异性较高,见图2。
2.3.1 CPNE3 基因 mRNA水平相对表达量在AMI组和SCAD组间比较分析
T-PCR 所得每个样本的ΔCt 值均为单个样本重复3次测量所得均值。结果显示,AMI组2-△Ct为 0.020(0.016-0.032),SCAD组2-△Ct为0.029(0.021-0.067),两组差别有显著统计学差异( Z =-4.231, P=0.000)。AMI患者外周血中CPNE3基因mRNA相对表达量明显低于SCAD患者,且其相对表达量为SCAD组的0.69倍。详见图3。
外周血CPNE3基因蛋白水平表达结果分析
本研究中以β -actin 为内参基因,对患者外周血进行蛋白水平的检测。Western Blot结果显示:AMI组与SCAD组在β -actin 基因蛋白水平表达上无明显差异,而在CPNE3基因蛋白水平表达上差异显著,与SCAD患者相比,AMI患者在外周血中PRMRT5 蛋白水平为低表达,AMI组CPNE3蛋白表达为SCAD组的 0.356倍,详见图4。
基因相对表达量与年龄、血清血脂、血糖等的相关性分析
本组资料表明,CPNE3基因的mRNA水平表达量、患者年龄在AMI和SCAD两组比较均存在差异性。进一步分析CPNE3基因mRNA表达量与患者年龄、空腹血糖、血清血脂水平是否有关。将所有纳入的研究对象依据血脂水平分层标准分为:TC 正常组(<5.18mmol/L)和 TC 升高组(≧5.18mmol/L)、TG正常组(<1.76mmol/L)、TG升高组(≧1.76)、LDL-C 正常组(<3.37mmol/L)和 LDL-C 升高组(≧3.37mmol/L)、HDL-C正常组(≧0.907)、HDL-C降低组(<0.907)。依据空腹血糖标准水平将所有研究对象分为:血糖正常组(≤6.0)、血糖升高组(>6)。依据所有研究对象以年龄做AMI的ROC曲线的cut off值将所有纳入的研究对象分为:高龄组(>66.5)和 低龄组(≤66.5)、每个研究对象CPNE3基因mRNA水平的相对表达量以2-△Ct表示,分别比较各组间 与CPNE3基因表达量的相关性。结果显示:CPNE3基因mRNA表达量在高龄组与低龄组之间有差异(P=0.008);CPNE3基因mRNA表达量与血清血脂、血糖均无关。结果详见表3。
采用 Logistic 回归分析 CPNE3基因mRNA水平表达量及患者年龄与急性心肌梗死的关系
按CPNE3 基因的相对表达量cut off值将所有研究对象分为高表达组(2-△Ct>0.013)和低表达组(2-△Ct≤0.013),进一步采用逐步二元 Logistic 回归分析CPNE3基因mRNA水平表达量、患者年龄与AMI的相关性。结果表明:CPNE3基因低表达、患者高龄是AMI的独立危险因素,与CPNE3高表达相比,CPNE3基因低表达组AMI的风险增加3.845倍,高龄使AMI风险增加了2.605倍。详见表4。
基因相对表达量在急性心肌梗死诊断中的ROC曲线和cut off值
根据急性心肌梗死组和对照组各样本实时荧光定量 PCR 所得CPNE3相对表达量 2-△CT值绘制 ROC 曲线,见图5。从图5可知 CPNE3基因的相对表达量对急性心肌梗死的诊断具有一定的参考价值,曲线下面积( AUC)为0.684±0.040。,以约登指数最大值确定的 CPNE3基因相对表达量cut off值0.024 ,诊断AMI的敏感度为0.690 ,特异性为0.648,阳性预测值68.6%,阴性预测值65.2%。
基因相对表达量与冠状动脉病变严重程度的相关性分析
根据冠状动脉造影结果,按照 Gensini 评分系统对所有研究对象冠状动脉病变严重程度进行评分。分值越高代表冠状动脉狭窄越重。所有研究对象Gensini 评分结果为 25
(9.5-52),对CPNE3基因和 Gensini 分值进行双变量相关分析,结果显示:CPNE3基因mRNA表达量与 Gensini 分值呈显著负相关( rs=-0.200, P=0.018),即 CPNE3基因mRNA的相对表达量越低, Gensini 分值越高,冠状动脉病变则越重。
基因的相对表达量与心肌肌钙蛋白 I( TnI)的相关性
急性心肌梗死组心肌肌钙蛋白检测结果为 0.790(0.138-8.760)ng/ml。血清肌钙蛋白I( TnI)浓度的高低反应了急性心肌梗死的范围的大小。血清 TnI 和CPNE3基因相对表达量的双变量相关分析结果显示:外周血中CPNE3基因表达量与血清TnI 浓度无关(rs=-0.144,P=0.364)。即CPNE3基因mRNA水平表达量与心肌梗死的范围无关。
基因相对表达量与急性心梗患者发病距采血的时间的相关性
以急性心肌梗死患者过去一周内初发的长时间(≥20min)静息痛作为发病时间点,急性心肌梗死组患者发病距采血的时间即为发病时间,结果为24(11-72)h。CPNE3基因相对表达量和急性心肌梗死发病时间相关分析结果显示:外周血中CPNE3基因表达量与急性心肌梗死发病时间长短无关(rs=-0.098,P=0.533)。
SEQUENCE LISTING
<110> 吉林大学
<120>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 104
<212> mRNA
<213> 人(Homo)
<400> 1
gtcagaccct ttatgtgtgt tgtttttgaa tacaagtggt caacagtggt atgaggttga 60
gcgcacagaa aggattaaga attgcttgaa tccccaattt tcca 104
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gtcagaccct ttatgtgtgt tgt 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tggaaaattg gggattcaag caa 23
Claims (5)
1.CPNE3基因及其表达产物在制备急性心肌梗死风险预测标记物和诊断制剂中的用途。
2.由CPNE3基因及其表达产物制备的急性心肌梗死风险预测标记物和诊断制剂,其特征在于:
所述急性心肌梗死风险预测标记物和诊断制剂采用常规PCR相对定量,荧光定量试剂盒、酶联免疫方法、蛋白杂交、基因芯片检测受试者或急性心肌梗死患者外周血中基因的表达水平。
3.一种利用CPNE3基因及其表达产物对急性心肌梗死诊断和风险预测的检测方法,其特征在于:
以受试者或急性心肌梗死患者外周血提取基因组DNA为模板,荧光定量检测CPNE3基因mRNA表达水平使用的特异性检测基因的引物对序列,其序列如下所示:
上游引物序列:GTCAGACCCTTTATGTGTGTTGT
下游引物序列:TGGAAAATTGGGGATTCAAGCAA。
4.根据权利要求3所述的利用CPNE3基因及其表达产物对急性心肌梗死诊断和风险预测的检测方法,其特征在于:
权利要求3中所述的荧光定量PCR反应体系:20ul反应体系,每个反应包括:10ul SYBRPremix Ex Taq TM,上、下游引物各0.5ul(浓度为10umol/L),无核酸酶的双蒸水8ul,cDNA模板1ul;
所述的荧光定量PCR反应条件:应用实时荧光定量PCR系统扩增;反应条件为95℃预变性10分钟;40个循环:95℃变性15秒, 60℃退火20秒, 72℃ 20延伸秒;溶解曲线和扩增曲线 95℃ 1 分钟,55℃ 30秒, 95℃ 30秒;以GAPDH基因为内参基因,所有样本至少重复测量三次,结果取均值;根据CPNE3基因在外周血中mRNA表达水平的高低来预测稳定型冠心病患者发生急性心肌梗死风险的大小。
5. CPNE3基因及其表达产物制备的急性心肌梗死风险预测标记物和诊断制剂医用用途,包括:荧光定量试剂盒、基因芯片、酶联免疫、抗体杂交方法外周血中基因的表达检测方法和相关的生物制剂。
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