CN110684840A - Gbgt1基因在急性心肌梗死风险预测标记物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了GBGT1基因在急性心肌梗死风险预测标记物中的用途，以GBGT1基因和或基因的表达产物作为一种新的急性心肌梗死风险预测和诊断治疗靶点,利用基因及其表达产物制备急性心肌梗死风险预测标记物和诊断制剂,具有重要的临床应用意义和开发价值。

Description

GBGT1基因在急性心肌梗死风险预测标记物中的用途

技术领域

本发明公开一种提供了GBGT1基因在急性心肌梗死风险预测标记物中的用途，为明确冠心病患者患心肌梗死疾病的风险预测评估，涉及基因诊断和生物医药领域，具体涉及一种外周血心肌梗死标志物检测及其应用，更具体是指基因表达产物和生物制剂在制备心肌梗死预测和诊疗药物中的应用，属于基因诊断和生物制药技术领域。

背景技术：

冠心病在美国和许多发达国家排在死亡原因的第一位。预计在接下来的几十年，它也是全球主要的死因尤其是，在冠心病的进程中潜在致命的急性心肌梗死风险。然而，美国从20世纪60年代开始，出现冠心病死亡率下降趋势。得益于美国所进行的降低冠心病危险因素的努力，主要是控制危险因素和改进心肌梗死的治疗方法。冠状动脉是唯一供给心脏血液的血管，其形态似冠状，故称为冠状动脉。这条血管也随年龄环境及自身遗传基因的改变同全身血管一样的硬化，呈粥样改变，造成供养心脏血液循环障碍，引起心肌缺血、缺氧，即为冠心病。

大量的流行病学研究证实了吸烟，糖尿病，高脂血症，高血压，肥胖作为冠心病的独立危险因素。此外，针对以上这些风险因素的治疗措施已经证实可以有效地降低未来冠状动脉硬化性心脏病事件的风险。由于其在冠心病发病中的作用，这5个危险因素常常被称为“传统的”危险因素。虽然这些冠心病发展中的传统危险因素的重要性是公认的，但通常认为，存在50%左右的冠心病患者并没有这些传统危险因素参与。这就说明，其他的非传统危险因素、遗传因素、环境因素在冠心病中同样发挥了重要作用。而冠心病和其他慢性病同样是复杂的多基因共同作用的多基因疾病，正因为导致冠心病的病因繁多，所以直到如今，尚不能精准地预测和预防心肌梗死的发生，而需要更为有效的检测手段。

发明内容

本发明一种提供了GBGT1基因在急性心肌梗死风险预测标记物中的用途，目的在于为已经明确诊断为冠心病患者供一种心肌梗死风险预测，所述急性心肌梗死风险预测和诊断制剂检测GBGT1基因和或基因的表达产物。进一步的，所述的GBGT1基因和或基因的表达产物在急性心肌梗死外周血中高表达。更进一步的，所述的GBGT1基因和或基因的表达产物的表达水平荧光定量检测方法。

本发明的目的在于所述急性心肌梗死风险预测和诊断制剂检中GBGT1基因和或基因的表达产物的表达量高低，采用基因芯片、外周血中基因的表达检测方法、荧光定量方法、相关的生物制剂。

本发明中GBGT1基因首先设计荧光定量PCR检测中使用的引物对，其序列如下：

上游引物序列：5’GGACTACCTCTTCTGCTTGAT 3’；

下游引物序列：5’CCTTCGCTGTCTGCCACAA 3’。

GBGT1基因引物需要在特定条件及体系下发挥作用，本发明中GBGT1基因荧光定量PCR检测体系及反应条件：

GBGT1荧光定量PCR反应体系：

20ul的反应体系，每个反应包括：10ul的SYBRPremix Ex Taq TM，上、下游引物各0.5ul（浓度为10umol/L），无核酸酶的双蒸水8ul，cDNA模板1ul；荧光定量PCR反应条件：应用实时荧光定量PCR系统扩增；反应条件为95℃预变性5分钟；35个循环：95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸20秒；溶解曲线和扩增曲线95℃1分钟，55℃30秒，95℃30秒；以GAPDH基因（一个在体内恒定表达的基因，和GBGT1基因作为对照）为内参基因，所有样本至少重复测量三次，结果取均值。

外周血中基因表达水平的高低可能反应了心血管疾病的变化和发展，是极具意义并且方便、性价比高的检验心血管疾病的生物标志物的手段。外周血心肌梗死患者差异基因表达谱分析结果显示：在心肌梗死患者和健康对照患者的外周血白细胞中存在着大量差异表达的基因。

本发明进行的外周血急性心肌梗死差异基因表达谱分析结果显示在急性心肌梗死病人的外周血白细胞中存在着大量差异表达的基因。其中,GBGT1基因在急性心肌梗死病人外周血中呈现显著高表达。利用基因转染增加人肝细胞中GBGT1的表达水平，并进一步分析GBGT1基因促进急性心肌梗死发病的机制。

本发明积极效果在于：

提供了GBGT1基因在急性心肌梗死风险预测标记物中的用途，可以作为一种新的心肌梗死风险预测和诊断治疗靶点，利用GBGT1基因及其表达产物制备急性心肌梗死风险预测标记物和诊断制剂，具有重要的临床应用意义和开发价值。

附图说明：

图1为本发明GBGT1基因mRNA表达水平在急性心梗组和健康对照组的比较曲线；

图2为本发明GBGT1基因相对表达量的ROC曲线。

图3为人肝细胞基因转染后GBGT1基因相比表达量，A是人肝细胞过表达GBGT1基因mRNA相比表达量，其中****代表P＜0.0001；B是人肝细胞过表达GBGT1蛋白表达水平WesternBlot检测结果，其中编号1位阴性对照组，2为GBGT1过表达组。

图4A为人肝细胞GBGT1过表达后实验组和对照组中甘油三酯浓度的对比结果；B为人肝细胞GBGT1过表达后实验组和对照组中胆固醇浓度的对比结果，其中**代表P＜0.01。

具体实施方式

结合实例具体实例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解，在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型。

本发明主要采用GBGT1基因荧光定量PCR筛选出稳定型冠心病患者发生急性心肌梗死的相关基因表达量，结合分子生物学实验和临床病例关联分析，证实了是急性心肌梗死诊治标志物。

试验例1

通过以下试验表明本发明医疗效果

一、病例的收集

研究对象由2016年5月至2016年10月就诊于吉林大学中日联谊医院（长春市，中国）的89名AMI患者和89名非冠心病对照组患者构成。89名AMI患者的诊断符合2012年ESC[14]公布的心肌梗死的一般定义，即心肌缺血的临床症状；新的或可能的新的重要ST段T波变化或新的左束支传导阻滞；心电图病理Q波的发展；新的活心肌丧失或新的局部壁运动异常的影像学证据；冠状动脉造影术发现冠状动脉内血栓。出现类似胸痛的症状，然而冠脉造影示血管无狭窄的89名患者组成对照组。

二、排除标准：

1.经皮冠状动脉介入（PCI）或冠状动脉旁路移植术（CABG）所致急性心肌梗死。

2.心肌能量的供需失衡，包括冠状动脉痉挛、快/慢心律失常、严重贫血、主动脉夹层、梗阻性肥厚性心肌病、主动脉瓣膜病、主动脉瘤。

3.非缺血性心肌损伤，包括开胸手术、心脏电除颤及射频消融、急性心肌炎、使用心脏毒性药物。

4.由非心脏疾病导致的心肌损伤，包括严重的肺动脉高压或肺动脉栓塞症、严重的感染性疾病膜下腔出血等。

5.肌炎或皮肌炎、带状疱症、结核性胸椎炎、胸部或胸壁肿瘤、气胸、先天性心血管病。

6.（活动性或潜伏性）结核感染史或证据。

7.正在患有的、慢性的或复发性的传染性疾病史。

8.合并有严重感染性疾病、恶性肿瘤。怀疑或证实处于免疫缺陷状态的患者。

9.临床资料或者冠脉造影资料不全者。详细记录临床资料，包括：血脂水平、空腹血糖水平、静息血压、冠心病家族史、吸烟史、冠状动脉造影资料，以及合并其它临床疾病情况（如高血压、糖尿病）等。

三、急性心肌梗死患者组及对照组外周血中GBGT1基因表达情况方法

1.外周血采集、总RNA提取及cDNA合成

留取各研究对象晨起空腹外周静脉血4ml，利用血液总RNA提取试剂盒（Blood TotalRNA Kit,新景生物试剂开发有限公司，杭州），依据试剂盒说明书对已获取的外周血进行总RNA提取，并利用1.0%琼脂糖电泳及酶标仪（Biotek Epoch）对RNA的质量及浓度进行检测。合格的RNA样本A260/A280值在1.8和2.0之间，且A260/A230值大于2。琼脂糖凝胶电泳可见明亮的28S和18SrRNA条带，且28SrRNA条带亮度约为18SrRNA的两倍。采用反转录试剂盒（fastking一步法除基因组cDNA第一链合成预混剂，天根生化科技有限公司，北京），取总量为1ug合格的总RNA进行反转录，得到cDNA样品保存于-20℃以便下一步进行实时荧光定量PCR。

2.GBGT1基因实时荧光定量PCR检测

利用生工荧光定量试剂盒(Taq qpcr合成预混剂)进行PCR扩增。SOCS3荧光定量PCR反应体系：20ul反应体系，每个反应包括:10ul FastqPCR MasterMix，上、下游引物各0.5ul(浓度为10umol/L)，无核酸酶的双蒸水8ul，cDNA模板1ul。GBGT1荧光定量PCR反应条件：应用实时荧光定量PCR系统扩增。反应条件为95℃预变性5分钟；35个循环：95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸20秒；溶解曲线和扩增曲线95℃1分钟，55℃30秒，95℃30秒；以GAPDH基因（一个在体内恒定表达的基因，和GBGT1基因作对照）为内参基因，所有样本至少重复测量三次，结果取均值。每个样本所得循环阈值（Ct）以相对表达量2-△Ct表示（△Ct=目的基因Ct-内参基因Ct），并进行比较。急性心肌梗死组对于对照组的相对表达量以2-△△Ct法进行统计分析，△△Ct=急性心肌梗死组△Ct-对照组△Ct。所用PCR引物根据NCBI数据库提供的GBGT1基因序列进行设计，并由上海生工生物技术有限公司合成，引物序列如下所示：

GBGT1

上游引物：5’CCTTCGCTGTCTGCCACAA 3’

下游引物：5’CCTTCGCTGTCTGCCACAA 3’

GAPDH

上游引物：5’GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT 3’

下游引物：5’GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG3’；

四、GBGT1基因相对表达量与急性心肌梗死患者血脂，血糖等性状的相关性分析

1.统计学分析

本实验所有实验数据均使用SPSS24.0软件进行统计学分析，计量资料服从正态分布的采用X±S进行统计描述，组间差异比较采用独立样本T检验分析。不服从正态分布的计量数据采用四分位数间距进行统计分析，组间差异采用秩和检验。计数资料采用频数进行统计描述，组间差异比较采用卡方检验分析。AMI的相关危险因素采用多因素logistic回归分析。所有检验结果以双侧P<0.05认为有统计学差异。

五、GBGT1过表达载体的构建及转染

1.GBGT1过表达载体的构建

根据NCBI网站公布的GBGT1基因序列设计特异性表达载体。使用质粒PEX-4（pGCMV/MCS/T2A/EGFP/Neo）来携带目的基因介导胞内转染。含有目的基因的载体为pGPU6/GFP/Neo-GBGT1-Homo-1044，其靶序列为GCGTGTTTCCACTGCCTTTGT。以绿色荧光蛋白（GFP）标记的空载体pGPU6/GFP/Neo-shNC作为阴性对照。它们均购自上海吉玛制药技术有限公司。

2.人肝细胞培养及细胞转染

本实验使用人肝细胞L-02细胞株。将L-02细胞置于37℃恒温培养箱中培养，使用的培养基为DMEM，培养基中按比例加入10%的FBS及青-链霉素抗生素100U/ml。于转染前一天，将L-02细胞传代于6孔培养板中，每孔细胞数约2×〖10〗^5/ml。在37℃条件下，于不含抗生素的培养基中使用FuGENE®HD Transfection Reagent(Promega Corporation,Madison,USA)介导胞内转染，同时将样本分为实验组(pGPU6/GFP/Neo-GBGT1-Homo-1044)和对照组(pGPU6/GFP/Neo-shNC)。每组各转染2个孔，一个孔用来提取总RNA，另一个孔用来提取总蛋白，测甘油三酯，胆固醇浓度。

六、GBGT1表达水平及细胞培养基TG和CHOL含量的检测与分析

1.人肝细胞总蛋白的提取以及甘油三酯、胆固醇的测定

利用蛋白裂解液M-PER(MammalianProtein Extraction Reagent Prod#78501,Thermo,Taiwan,China)提取两组总蛋白。按照说明书分别利用组织总胆固醇测定试剂盒和组织甘油三酯测定试剂盒提取裂解液中的甘油三酯和胆固醇。并且，按照试剂盒的要求设置标准品孔，空白对照孔和待测样品孔，每个样品均设置至少3个重复。采用酶标仪（上海精密仪器仪表有限公司）分别检测每孔的光密度值（OD值），根据标准孔绘制标准曲线，读取待测样本所检测指标的浓度。

2.Western blot分析

将提取的总蛋白（16ul）和蛋白Marker（5ul）置入由10ml分离胶（10%Gel SDS-PAGE）和2ml浓缩胶（5%Acrylamide SDS-PAGE）组成的胶板中进行为时85分钟的电泳，使用的电泳缓冲液为1×Tris-Glycine Buffer。随后，利用半干转膜仪（Bio-Rad laboratories,lnc.,Hercules,CA,USA）将蛋白印迹转移至PVDF膜上。于室温条件下，PVDF膜在5%BAS缓冲液中封闭1小时。将封闭的PVDF膜放入TBST中4℃过夜，其中加入了一抗（GBGT1 monoclonalantibodies,1:1000,rabbit.no.ab154837;GAPDH polyclonal antibodies,1:1000,rabbit.no.ab181602;Abcam,Cambridge,MA,USA）。洗剂后，将膜置于4℃与二抗(goatanti-rabbi)结合2小时。将ECL化学发光试剂盒（Thermo Fisher Scientific,lnc.）中A液和B液按1:1混合后滴在PVDF膜上，利用全自动化学发光图像分析仪对膜进行显色曝光。

实验结果

1.研究对象临床资料分析

急性心肌梗死组和对照组的临床基线资料如表1所示，和健康人对照组相比，AMI组患者的年龄、空腹血糖（FBG）、甘油三脂（TG）明显升高。同时，高密度脂蛋白（HDL-C）减低。

表1AMI组和对照组的临床基线资料

2.外周血白细胞中GBGT1基因相对表达量分析

外周血RNA的荧光定量PCR检测结果显示，GBGT1基因溶解曲线呈现单一的溶解峰，扩增曲线为显著的“S型”，表明PCR扩增反应成功，产物特异性较好。利用RT-PCR的方法，同时每个样本的实验均重复三次，其均值用来表达GBGT1的mRNA的表达量。心梗组的2^(-△CT)值为3.180×10-3(2.613×10-3,4.613×10-3)，而健康人对照组的2^(-△CT)为2.794×10-3(1.708×10-3,4.771×10-3)，两者之间的差别具有统计学意义（P=0.027），如图1所示。

3. logistic回归分析GBGT1基因mRNA表达量与AMI的相关性

临床基线资料表明，与健康对照组相比，AMI患者的GBGT1相比表达量增加、TG升高、年龄增加、FBG升高，HDL-C减低。为了进一步评估它们与AMI的关系，进行了多因素logistic回归分析（表2）。按照欧洲心脏病学会[16]和美国糖尿病协会（ADA）的建议对FBG、TG、HDL-C及年龄进行分组。依照上述标准，研究对象被分为：FBG升高组（FBG≥7.0mmol/L），FBG正常组（FBG＜7.0mmol/L），TG升高组（TG≥1.7mmol/L），TG正常组（TG＜1.7mmol/L），年老组（Age≥65），年轻组（Age＜65），HDL-C正常组（HDL-C≤1.0mmol/L），HDL-C升高组（HDL-C＞1.0mmol/L）。同时基于GBGT1相比表达量的cutoff值将患者分为高GBGT1表达组（2-△Ct＞1.904×10-3）和低GBGT1表达组（2-△Ct≤1.904×10-3）。在调整了所有其他可能的风险因素之后，例如年龄、空腹血糖、HDL-C等，GBGT1 mRNA 在外周血中高表达（2-△Ct＞1.904×10-3）是AMI的独立危险因素，同时经调整的OR值为6.367（95%CI：2.013-20.137，P＜0.05）。

表2：AMI独立危险因素多因素logistic回归分析结果

	回归系数	标准误	Ward	P	OR	95%CI
							年龄≥65	0.150	0.215	0.483	0.487	1.161	0.762-1.771
FBG≥7.0	0.311	0.235	1.758	0.187	1.365	0.862-2.163
							TG≥1.7	0.163	0.216	0.573	0.449	1.178	0.771-1.798
HDL-C≤1.0	0.315	0.224	1.982	0.159	1.370	0.884-2.124
							高GBGT1表达	1.851	0.588	9.926	0.002	6.367	2.013-20.137

4.GBGT1基因相对表达量诊断AMI的价值

根据GBGT1 mRNA的相对表达量绘制ROC曲线（如图2）。得知GBGT1基因的相对表达量可以作为诊断AMI的参考标准之一。同时根据约登指数的最大值0.303可以判断cutoff值为1.904×10-3。高GBGT1表达提示AMI，其诊断AMI的敏感性为0.966，特异性为0.337。阳性预测值和阴性预测值分别为0.593、0.909。GBGT1的相对表达量在针对AMI时的敏感性高，特异性不强。因而，低GBGT1表达（2-△Ct≤1.904×10-3）时AMI的可能性小，可以作为AMI的排除诊断标准。

5.人肝细胞中GBGT1的表达结果

对健康人肝细胞中的GBGT1的mRNA表达水平进行检测，发现过表达组的GBGT1的mRNA表达量明显高于对照组，约为对照组的240076倍(图3A)。同时对肝细胞中的GBGT1蛋白表达水平进行检测，与对照组相比，过表达组的GBGT1蛋白表达量增加约11倍（图3B）。

6.甘油三酯、胆固醇浓度分析

在转染结束24小时后，使用RIPA裂解液对两组细胞进行裂解，离心后取上清进行甘油三酯、胆固醇浓度的测定。每组实验均至少进行3次且计算的是相对于蛋白质浓度的相对浓度。结果显示：GBGT1组和对照组的甘油三酯浓度分别为2.54×10-3±0.04×10-3umol/g，2.04×10-3±0.02×10-3 umol/g。过表达组的甘油三脂浓度较对照组升高，P<0.0001，具有统计学意义，如图4A所示。两组的胆固醇浓度分别为598.36±20.05umol/g，545.06±18.95umol/g，P值为0.0724，不具有统计学意义。如图4B所示。

总结：AMI患者外周血白细胞中GBGT1高表达，且高GBGT1表达是AMI的独立危险因素。GBGT1表达量在诊断AMI时的敏感性高，特异性不足，可以作为AMI的排除诊断标准。GBGT1促进甘油三酯合成可能是其促进AMI的机制之一。

Claims (4)

1. GBGT1基因及其表达产物在制备急性心肌梗死风险预测标记物和诊断制剂中的用途；

以受试者或急性心肌梗死患者外周血提取基因组DNA为模板,荧光定量检测GBGT1基因mRNA表达水平使用的特异性检测基因的引物对P序列,其序列如下所示：

上游引物序列：5’GGACTACCTCTTCTGCTTGAT 3’；

下游引物序列：5’CCTTCGCTGTCTGCCACAA 3’。

2.由GBGT1基因及其表达产物制备的急性心肌梗死风险预测标记物和诊断制剂,其特征在于：

所述急性心肌梗死风险预测标记物和诊断制剂采用常规PCR相对定量,荧光定量试剂盒、酶联免疫方法、蛋白杂交、基因芯片检测受试者或急性心肌梗死患者外周血中基因的表达水平。

3.一种基于GBGT1基因及其表达产物对急性心肌梗死风险预测和诊断的检测方法,其特征在于：

权利要求1中所述的荧光定量PCR反应体系：20ul反应体系，每个反应包括：10ul的SYBRPremix Ex Taq TM，上、下游引物各0.5ul（浓度为10umol/L），无核酸酶的双蒸水8ul，cDNA模板1ul；权利要求3中所述的荧光定量PCR反应条件：应用实时荧光定量PCR系统扩增；反应条件为95℃预变性5分钟；35个循环：95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸20秒；溶解曲线和扩增曲线95℃1分钟，55℃30秒，95℃30秒；以GAPDH基因为内参基因，所有样本至少重复测量三次，结果取均值。

4.权利要求1所述的GBGT1基因及其表达产物制备的急性心肌梗死风险预测标记物和诊断制剂医用用途,包括荧光定量试剂盒、基因芯片、酶联免疫、抗体杂交方法外周血中基因的表达检测方法和相关的生物制剂。

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