KR20190114298A - 위암 예후 또는 약물 반응성 예측용 바이오마커 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 위암(Gastric cancer, GC)의 예후 예측용 바이오마커, 상기 유전자 바이오마커의 mRNA 또는 이의 단백질 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 위암 예후 예측용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 위암 예후 예측용 키트, 상기 키트를 이용하여 위암의 예후를 예측하기 위한 정보제공방법, 상기 유전자 바이오마커를 이용하여 위암의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝하는 시스템 및 상기 유전자 바이오마커를 타겟으로 하는 위암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 위암 예후 예측용 바이오마커를 이용하여 위암 환자의 예후를 예측하고, 예측된 예후에 따라 적절한 치료방향을 결정할 수 있어 환자 맞춤별 치료방법의 제공이 가능하고, 불량한 예후의 위암 환자의 위암 재발 및 사망률을 감소시켜 위암 환자를 더욱 효과적으로 치료할 수 있다.

Description

위암 예후 또는 약물 반응성 예측용 바이오마커{Biomarkers for Predicting gastric cancer prognostication or drug reactivity}
본 발명은 위암의 예후 또는 약물 반응성을 예측하기 위한 유전자 바이오마커에 관한 것이다.
위암(Gastric cancer)은 전세계적으로 암으로 인한 사망 원인 중 2위를 차지하고 있을 뿐만 아니라, 한국, 일본 등의 아시아 국가에서도 주요 사망의 원인 중 하나로 잘 알려져 있다(CA.Cancer. J.Clin.(2011) 61:69-90). 위 암의 근본적인 치료 방법은 수술을 통한 위암 조직의 제거이지만, 조기 위암 환자를 제외하고는 절제 시술을 받 은50% 이상의 환자에게서 재발될 정도로 재발 위험성이 매우 높기 때문에, 2기 위암의 경우는 5년 생존율이 30 내지 70%, 3기 위암의 경우는 5 내지 30%에 불과하다. 따라서 위암을 조기에 진단할 수 있는 방법의 개발은 위암으로 인한 생존율을 높이는데 매우 중요하다. 또한, 위암의 병기(stage)를 예측할 수 있다면 환자의 치료 방법을 결정하거나, 치료 전/후의 경과를 예측하는데 매우 유용하게 사용될 수 있습니다. 따라서 한국, 일본 등과 같은 위암 발병률이 높은 국가에서는 X-선 촬영, 내시경을 통한 위암 진단을 보편적으로 실시하고 있다. 그러나 X-선 촬영, 내시경 등을 통한 진단은 일반적으로 환자들이 이상 증상을 느끼고 검사를 받는 경우가 대부분이며, 위암의 초기에는 증상이 없는 경우가 대부분이기 때문에 환자들이 이상 증상을 느끼고 검사를 받을 때면 이미 암 의 단계는 많이 진행되어 있는 것이 보편적인 실정이다. 따라서 혈액 내의 바이오 마커를 이용하여 위암을 진단 할 수 있다면, 자주 용이하게 검사를 시행할 수 있기 때문에 위암 환자들을 조기에 발견하여 치료하는데 매우 유용할 것이다.
이에 따라 위암 진단용 바이오 마커에 대한 다수의 연구가 진행되고 있으며, 지노믹스(genomics), 프로테오믹스 (proteomics) 등의 최신 기술을 이용하여 CEA, AFP 등과 같은 다양한 위암 진단용 바이오 마커들이 활발히 개발 되고 있다. 그러나 아직까지도 조기 위암을 진단할 수 있을 정도로 진단 정확성이 높은 바이오 마커의 개발은 부족한 실정이며, 환자의 치료 방법을 결정하거나, 치료 전/후의 경과를 예측하는데 매우 중요한 위암의 병기를 예측할 수 있는 바이오 마커의 개발은 매우 부족한 실정이다. 이와 같이, 조기 위암을 진단할 수 있을 뿐만 아니라 위암의 병기(stage)를 예측할 수 있는 진단 정확성이 향상 되어 상업적으로 이용 가능한 위암 진단 또는 위암의 병기 진단용 바이오 마커의 개발이 요구되고 있는 실정이다.
이에 본 발명자들은 다양한 표현형을 가지는 위암과 연관된 시그널링 네트워크 하에서, datasets으로부터 예후가 좋지 않은 확산형 위암 환자에서 공통적으로 과다발현된 64개의 유전자를 선별하였고, 이러한 유전자에 특이적인 siRNA를 처리하였을 때 세포 생존율이 감소하고 바이오마커의 mRNA 발현율이 감소하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
상술한 문제점을 해결하기 위한 본 발명의 목적은 위암(Gastric cancer, GC)의 예후 예측용 바이오마커, 상기 유전자 바이오마커의 mRNA 또는 이의 단백질 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 위암 예후 예측용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 위암 예후 예측용 키트, 상기 키트를 이용하여 위암의 예후를 예측하기 위한 정보제공방법, 상기 유전자 바이오마커를 이용하여 위암의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝하는 시스템 및 상기 유전자 바이오마커를 타겟으로 하는 위암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.
상술한 과제를 하결하기 위하여 본 발명은 PRNP, CACNA1C, CACNA2D3, CHRM, CCR5, CXCR4, CXCL12, F2R, FCGR, FGF1, PGFR1, FLT3, FN1, FYN, LCK IL1R1, MMP2, PDGFR, JAK2, PRKCQ, TGFB1, ITGB3, PPP3R2, NGF, STAT5B, EPHA3, NRXN1, CAMK2A 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 포함하는 위암(Gastric cancer, GC)의 예후 예측용 바이오마커를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 바이오마커의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 위암 예후 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 위암예후 예측용 조성물을 포함하는 위암 예후 예측용 키트를 제공한다.
본 발명은 또한, a) 위암 환자에서 분리된 생물학적 시료로부터 제1항의 바이오마커의 mRNA 또는 이의 단백질 발현수준, 또는 발현패턴을 얻는 단계; 및 b) 상기 a) 단계에서 얻은 발현수준 또는 발현패턴을 예후가 알려진 위암 환자의 해당 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 발현수준, 또는 발현패턴과 비교하는 단계를 포함하는 위암의 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명은 또한, a) 위암 환자에서 분리된 시료에 후보물질을 처리하는 단계; b) 후보물질이 처리된 위암 환자의 시료에서 제1항에 따른 바이오마커의 mRNA 또는 이의 단백질 발현수준을 측정하는 단계; 및 c) 상기 b) 단계의 mRNA 또는 이의 단백질 발현수준이 후보물질의 처리 전보다 낮은 경우, 후보물질을 위암의 예방 또는 치료용 물질로 판단하는 단계; 를 포함하는 위암 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 바이오마커에 의해 코딩되는 단백질 발현 또는 활성을 억제하는 물질; 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 위암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 위암 예후 예측용 바이오마커를 이용하여 위암 환자의 예후를 예측하고, 예측된 예후에 따라 적절한 치료방향을 결정할 수 있어 환자 맞춤별 치료방법의 제공이 가능하고, 불량한 예후의 위암 환자의 위암 재발 및 사망률을 감소시켜 위암 환자를 더욱 효과적으로 치료할 수 있다.
도 1은 TCGA와 GEO GC 데이터세트로부터 PK/PD 바이오마커 후보 유전자를 선별하는 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 64개의 위암 마커 후보 유전자의 약역학 및 약물동태학을 나타낸 것이다.
도 3은 Kaplan-Meier 생존 분석에 사용한 226명 환자의 임상정보를 나타낸 것이다.
도 4는 Kaplan-Meier 생존 분석에 사용한 226명 환자의 자료를 이용하여 조직학적 아형과 병리학적 단계를 토대로 만든 그룹을 나타낸 것이다.
도 5는 Kaplan-Meier 방법에 따라 생존 분석을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도6은 면역조직화학분석 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 세포에 바이오마커 후보 유전자의 siRNA를 처리한 후 세포 생존율을 분석한 결과로, 도 7a는 AGS 세포, 도 7b는 MKN-1 세포, 도 7c는 SNU-16세포, 도 7d는 SNU-668 세포, 도 7e는 SNU-216 세포, 도 7f는 SNU-601 세포, 도 7g는 SNU-620세포에 대한 결과이다.
도 8은 세포에 바이오마커 후보 유전자의 siRNA를 처리한 후 마커 유전자의 mRNA 발현율을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 세포에 바이오마커 후보 유전자의 siRNA를 처리한 후 마커 유전자의 mRNA 발현율을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명에서는 위암의 불량한 예후에 관여하는 선별된 유전자, 즉, PRNP, CACNA1C, CACNA2D3, CHRM, CCR5, CXCR4, CXCL12, F2R, FCGR, FGF1, PGFR1, FLT3, FN1, FYN, LCK IL1R1, MMP2, PDGFR, JAK2, PRKCQ, TGFB1, ITGB3, PPP3R2, NGF, STAT5B, EPHA3, NRXN1 및 CAMK2A 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 포함하는 위암의 예후 예측용 바이오마커를 제공한다. 본 발명의 바이오마커를 이용하면 위암 환자의 예후를 예측하고, 예측된 예후에 따라 적절한 치료방향을 결정할 수 있어 환자 맞춤별 치료방법의 제공이 가능하고, 불량한 예후의 위암 환자의 위암 재발 및 사망률을 감소시켜 위암 환자를 더욱 효과적으로 치료할 수 있다.
본 발명에서 위암의 불량한 예후에 관여하는 유전자의 선별과정은 다음과 같다. 먼저, PATHOME을 사용하여 172 개의 후보 유전자를 생성하였으며, 172 개의 유전자를 상류의 신호 유전자뿐만 아니라 하류의 신호로 확장 시키면, 666 개의 유전자가 잠재적인 PK / PD 마커 후보로 확인되었다. 666개의 유전자 중 TCGA 임상 정보와 유전자 발현을 이용하여 차별 발현 검사와 생존 분석을 통해 64개의 유전자를 도출하였다.
본 발명의 용어 "바이오마커"는 생물학적 현상의 존재와 정량적 또는 정성적으로 연관된 분자를 의미하며, 본 발명의 마커는 위암 발병 이후 예후가 양호하거나 불량한 환자를 예측해내는 기준이 되는 유전자를 지칭한다. 마커는 게놈 뉴클레오티드 서열로부터 또는 발현된 뉴클레오티드 서열로부터(예를 들어, RNA, nRNA, mRNA, cDNA 등으로부터), 또는 코딩된 폴리펩티드로부터 유래될 수 있다. 이 용어는 마커 서열에 상보적이거나 이에 플랭킹된 핵산 서열, 예컨대 마커 서열을 증폭시킬 수 있는 프로브 또는 프라이머 쌍으로 사용된 핵산을 포함한다.
본 발명에 있어서, 용어 "예후"는 의학적 귀추(예컨대, 장기 생존 가능성, 무병생존율 등)에 대한 예상을 의미하며, 양성적 예후(긍정적 예후) 또는 음성적 예후(부정적 예후)를 포함하며, 상기 음성적 예후는 재발, 종양 성장, 전이, 약 저항성 등의 병의 진행 또는 치명성(mortality)을 포함하고, 양성적 예후는 질병이 없는 상태 등의 질병의 차도, 종양 퇴행 등의 질병의 개선 또는 안정화(stabilization)를 포함한다.
본 발명에 있어서, 용어 "예측"은 의학적 귀추에 대하여 미리 헤아려 짐작하는 것을 의미하며, 본 발명의 목적상 위암으로 진단받은 환자의 병의 경과(병의 진행, 개선, 위암의 재발, 종양 성장, 약 저항성)를 미리 짐작하는 것을 의미한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 바이오마커의 mRNA 또는 이의 단백질 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 위암 예후 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어, "바이오마커의 mRNA 또는 이의 단백질 발현수준을 측정하는 제제" 란 본 발명의 바이오마커 유전자 또는 이들 유전자에 의해 코딩된 단백질의 발현수준을 확인하기 위하여 사용될 수 있는 분자를 의미하며, 바람직하게는 상기 바이오마커에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드이거나, 또는 상기 바이오마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 특이적인 항체일 수 있다.
본 발명에서 용어, "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 마커에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 이러한 항체는 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개의 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다. 이러한 본 발명의 바이오마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 대한 항체는 당업계의 공지된 방법으로 제조될 수 있는 모든 항체가 될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 암 진단 마커의 검출에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태 뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 상기 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv 등이 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에서 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3` hydroxyl group)을 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형의 복사를 위한 시작지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 본 발명에서는 본 발명 마커 폴리뉴클레오티드의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 위암의 예후를 예측할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명에서 용어, "프로브(probe)" 란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며, 표지(labeling)되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오티드 프로브, 단일 사슬 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중 사슬 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 본 발명의 마커 폴리뉴클레오티드와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 위암의 예후를 예측할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
본 발명은 또한, 전술한 위암 예후 예측용 조성물을 포함하는 위암 예후 예측용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 상기 위암 예후 예측용 바이오마커 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 이들 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현수준을 확인함으로써 위암의 예후를 예측하는데 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 바이오마커 유전자들의 mRNA 발현수준을 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-중합효소 및 역전사효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-물(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 위암의 예후 예측용 바이오마커를 검출하기 위한 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판을 포함하고 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 본 발명에서 상기 바이오마커 유전자들에 의해 코딩된 단백질의 발현수준을 측정하기 위한 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체 및 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스틸렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드 글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase)가 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있으며, 발색기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘) 등이 사용될 수 있다.
본 발명은 또한, a) 위암 환자에서 분리된 생물학적 시료로부터 상기 바이오마커의 mRNA 또는 이의 단백질 발현수준, 또는 발현패턴을 얻는 단계; 및 b) 상기 a) 단계에서 얻은 발현수준 또는 발현패턴을 예후가 알려진 위암 환자의 해당 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 발현수준, 또는 발현패턴과 비교하는 단계를 포함하는 위암의 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 용어, "mRNA 발현수준 측정"이란 위암의 예후를 예측하기 위하여 생물학적 시료에서 바이오마커 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정함으로써 알 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(northern blotting) 또는 DNA 칩(DNA chip technology) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 용어, "단백질 발현수준 측정"이란 위암의 예후를 예측하기 위하여 생물학적 시료에서의 마커 유전자에서 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 유전자에서 발현된 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbentassay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radial immunodiffusion), 오우크테로니면역 확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동(rocket immunoelectrophoresis), 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complement Fixation Assay), 면역형광법(immunofluorescence), 면역크로마토그래피법(immunochromatography), FACS 분석법(fluorescenceactivated cell sorter analysis) 또는 단백질 칩 방법(protein chip technology) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, "위암 환자에서 분리된 생물학적 시료"란 이에 제한되는 것은 아니나, 위암 환자의 유방 유래의 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨일 수 있으며, 바람직하게는 유방 종양 조직일 수 있다.
본 발명에서 용어, "예후가 알려진 위암 환자"는 위암으로 진단받은 환자 중에서 병의 진행 경과가 밝혀진 환자를 의미하며, 예컨대 위암으로 인한 외과 수술을 받은 후 36개월 안에 재발하여 불량한 예후를 가진 것으로 확정된 환자 또는 위암으로 인한 외과 수술을 받은 후 36개월 이후 재발하지 않고 생존하거나 완치되어 양호한 예후를 가진 것으로 확정된 환자 등이며, 이들 환자로부터 채취한 시료와 예후를 알고자 하는 환자로부터 채취한 시료에서 유전자 발현수준 또는 발현패턴을 수득하고, 비교함으로써 예후를 알고자 하는 환자의 예후를 정확하게 예측할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 다수의 위암 환자로부터 마커 유전자의 발현수준 또는 발현패턴을 측정하고, 측정된 값을 이들 환자의 예후와 함께 데이터베이스화한 후, 예후를 알고자하는 환자의 발현수준 또는 발현패턴을상기 데이터베이스에 입력하여 예후를 예측할 수 있다. 이 경우, 발현수준 또는 발현패턴을 비교하기 위한 공지의 알고리즘, 통계분석 프로그램 등을 사용할 수 있다. 또한, 상기 데이터베이스는 위암 환자를 병리학적 병기, 치료받은 치료법 등으로 더욱 세분화될 수 있다.
본 발명의 위암의 예후 예측을 위한 정보제공방법에 있어서, 상기 바이오마커 유전자의 발현수준을 mRNA 수준 또는 단백질 수준에서 측정할 수 있고, 생물학적 시료에서 mRNA 또는 단백질의 분리는 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있다. mRNA 수준을 측정하기 위한 분석 방법 및 단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법은 상기에서 설명한 바와 같다.
상기 분석방법들을 통하여, 예후가 알려진 위암 환자의 시료로부터 측정한 위암 바이오마커 유전자의 발현량과 예후를 알고자 하는 환자의 시료로부터 측정한 위암 바이오마커 유전자의 발현량을 비교할 수 있고, 발현량의 증감 여부를 판단하여 위암의 예후를 예측할 수 있다. 즉, 발현량을 비교한 결과, 예후를 알고자 하는 환자의 샘플이 예후가 알려진 환자의 샘플과 비슷한 발현량 또는 발현패턴을 나타내었다면, 이는 양호한 예후를 가질 것이라고 판단할 수 있고, 반대로 불량한 예후로 알려진 환자의 샘플과 비슷한 발현량 또는 발현패턴을 나타내었다면, 이는 불량한 예후를 가질 것이라고 판단할 수 있다.
따라서, 본 발명에 의하면 위암의 예후를 정확하게 예측할 수 있고, 예측된 예후에 따라 적절한 치료계획을 세울 수 있는 이점을 얻을 수 있다. 예컨대, 양호한 예후를 가질 것이라고 판단된 환자에 대해서는 표준 치료 또는 덜 침범적인 치료(invasive treatment) 옵션을 추구하도록 결정할 수 있고, 불량한 예후를 가질 것이라고 판단된 환자에 대해서는 상위 단계의 병기 위암 환자에게 사용하는 치료방법 또는 매우 공격적이거나 실험적인 치료를 추구하도록 결정할 수 있다.
본 발명은 또한, a) 위암 환자에서 분리된 생물학적 시료에 후보물질을 처리하는 단계; b) 후보물질이 처리된 위암 환자의 시료에서 제1항에 따른 바이오마커의 mRNA 또는 이의 단백질 발현수준을 측정하는 단계; 및 c) 상기 b) 단계의 mRNA 또는 이의 단백질 발현수준이 후보물질의 처리 전보다 낮은 경우, 후보물질을 위암의 예방 또는 치료용 물질로 판단하는 단계; 를 포함하는 위암 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝하는 시스템을 제공한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 바이오마커에 의해 코딩되는 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 물질; 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 위암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에서는, 본 발명에서 선별된 바이오마커 유전자의 siRNA를 이용하여 위암 환자의 치료 가능성을 확인하기 위해 위암 세포주에 siRNA를 처리하여 유전자를 넉다운(knock-down)시킨 후, 세포 생존율 및 mRNA 발현율을 측정하였다. 그 결과, SNU 620, SNU-668, SNU-216, SNU-601, MKN-1 세포에서 대부분의 유전자의 siRNA에 의한 우수한 세포사멸 효과가 관찰되었으며, AGS, SNU-16 세포 에서도 일부 유전자의 siRNA에 의한 세포사멸 효과가 관찰되었다(도 7). 이를 통해, 본 발명에서 선별된 예후 관련 바이오마커 유전자를 타겟으로 한 치료가 실제 위암 환자에서 효과를 나타낸다는 것을 확인할 수 있으며, 본 발명의 선별된 바이오마커 유전자가 위암 환자를 치료하는데 유용하다는 것을 확인할 수 있다.
상기 바이오마커에 의해 코딩되는 단백질의 발현을 억제하는 물질은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 바이오마커 유전자에 대한 안티센스 올리고 뉴클레오티드(antisense oligonucleotide), 앱타머(aptamer), siRNA 또는 shRNA 등이 될 수 있다.
본 발명의 용어 "siRNA(small interfering RNA)"란, RNA 간섭 또는 유전자 사일런싱(silencing)을 매개할 수 있는 약 20 뉴클레오티드 크기의 작은 핵산 분자를 의미하며, siRNA가 세포 내에 도입되면, 다이서(dicer) 단백질에 의해 인지되어 상기 바이오마커 유전자를 분해하여, 결국 유전자의 발현을 저해하게 된다. 이러한 siRNA는 공지된 siRNA를 직접 화학적으로 합성하는 방법(Sui G 등, (2002) Proc Natl Acad Sci USA 99:5515-5520), 실험실적 환경에서 전사를 이용한 siRNA의 합성법(Brummelkamp TR 등, (2002) Science 296:550-553) 등에 의해 제조될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 용어 "shRNA(short hairpin RNA)"란, siRNA 타겟 서열의 센스 및 안티센스 서열이 5-9개의 염기로 구성된 루프(loop)를 사이에 두고 위치한 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA)를 의미한다. 상기 shRNA는 siRNA의 고가의 생합성 비용, 낮은 세포 형질감염 효율로 인한 RNA 간섭 효과의 단시간 유지 등의 단점을 극복하기 위한 것으로 RNA 중합효소 Ⅲ의 프로모터로부터 아데노 바이러스, 렌티 바이러스 및 플라스미드 발현 벡터 시스템을 이용하여 이를 세포 내로 도입하여 발현시킬 수 있으며, 이러한 shRNA는 세포 내에 존재하는 siRNA 프로세싱 효소(Dicer or Rnase Ⅲ)에 의해 정확한 구조를 갖는 siRNA로 전환되어 목적 유전자의 사일런싱을 유도 하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 용어 "앱타머(aptamer)"란, 작은 RNA 조각을 의미하며, 20 내지 60 nt 정도의 크기를 가지는 올리고머 분자를 의미하는데, 서열에 따라 다양한 3차원 구조를 가질 수 있으며, 특정 물질과 높은 친화력을 가질 수 있어 목적하는 타겟 서열과 반응하여 효과적으로 억제가 가능하다.
본 발명의 용어 "안티센스"란, 안티센스 올리고머라고도 하고, 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어 표적 서열 내에서 mRNA와 RNA:올리고머 헤테로이중체를 형성할 수 있는 뉴클레오티드 염기의 서열 및 서브유닛간 백본을 갖는 올리고머를 의미한다. 상기 안티센스는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있고, mRNA의 번역을 차단 또는 저해하며, mRNA의 스플라이스 변이체를 생산하는 mRNA의 프로세싱 과정을 변화시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 안티센스는 바람직하게는 본 발명의 바이오마커유전자의 폴리뉴클레오티드에 상보적인 안티센스 올리고머가 될 수 있다. 상기 안티센스는 통상적인 방법으로 개체에 투여함으로써 발암 유전자의 발현을 예방 또는 억제시키는 방식으로 사용될 수 있다. 예를 들면, 안티센스 올리고디옥시뉴클레오티드를 폴리-L-라이신 유도체와 정전기적 인력에 의해 혼합시키고, 상기 혼합체를 개체의 정맥에 투여하는 방법(J.S. kim et al., J controlled Release 53, 175-182, 1998)이 사용될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
아울러, 상기 바이오마커에 의해 코딩되는 단백질의 발현을 억제하는 물질로는 단백질의 활성을 억제하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편 등이 될 수 있다. 이때, 상기 항체는 특별히 이에 제한되지 않으나, 본 발명의 바이오마커에 의해 코딩되는 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 모든 항체가 될 수 있고, 바람직하게는 단일클론항체, 카이메릭 항체(chimeric antibody), 인간화 항체(humanized antibody), 인간 항체(human antibody) 등이 될 수 있을 뿐만 아니라, 상기 항체의 기능적인 단편이 될 수도 있다 모두 포함한다. 또한 상기 항체는 본 발명의 바이오마커에 의해 코딩되는 단백질을 특이적으로 인식하는 결합의 특성을 갖는 한, 2개의 중쇄(heavy chain)와 2개의 경쇄(light chain)의 전체 길이를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체의 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.
본 발명에서 제공하는 약학적 조성물은 유효성분으로 사용되는 상기 바이오마커에 의해 코딩되는 단백질 발현 또는 활성을 억제하는 올리고 뉴클레오티드 또는 항체 이외에, 암치료 활성을 나타내는 공지의 치료제를 추가로 포함할 수 있다. 이때, 상기 공지의 치료제는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 방사성 핵종, 약제, 림포카인, 독소, 이중특이적 항체 등이 될 수 있고, 보다 바람직하게는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, 186Re, 에토포시드, 테니포시드, 아드리아마이신, 다우노마이신, 카르미노마이신, 아미노프테린, 닥티노마이신, 미토마이신류, 시스-백금 및 시스-백금 동족체, 블레오마이신류, 에스페라미신류, 5-플루오로우라실, 멜팔란, 질소 머스타드 등이 될 수 있다.
한편, 본 발명의 조성물은 투여 방식에 따라 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로, 식염수 ,멸균수, 링거액, 완충 식염수,덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 상기 성분들 중 어느 하나의 이상의 성분을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 통상적으로 사용되는 다른 첨가제를 추가적으로 포함할 수 있다. 또한 투여 목적에 따라 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있고, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 또는 조직 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 상기와 같은 담체, 부형제 또는 첨가제의 종류는 당업계의 통상적인 제제를 모두 포함하며, 상기 예에 의해 사용가능한 담체, 부형제 또는 첨가제의 종류가 제한 되는 것은 아니다.
상기와 같은 조성물 또는 혼합물은 목적 또는 필요에 따라 당업계에서 사용되는 통상적인 방법, 투여 경로, 투여량에 따라 적절하게 개체에 투여될 수 있다.투여 경로의 예로는 경구, 비 경구, 피하, 복강 내, 폐 내, 및 비강 내로 투여될 수 있고, 국부적 면역억제 치료를 위해, 필요하다면 병변 내 투여를 포함하는 적합한 방법에 의해 투여된다. 비 경구 주입에는 근육 내, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내 또는 피하투여가 포함된다. 또한 당업계에 공지된 방법에 따라 적절한 투여량 및 투여 횟수가 선택될 수 있으며, 실제로 투여되는 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 또는 shRNA를 포함하는 조성물의 양 및 투여 횟수는 예방 또는 치료하고자 하는 증상의 종류, 투여 경로, 성별, 건강 상태, 식이, 개체의 연령 및 체중, 및 질환의 중증도와 같은 다양한 인자에 의해 적절하게 결정될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다
실시예 1. TCGA와 GEO GC 데이터세트로부터 PK/PD 바이오마커 후보 유전자의 선별
위암은 생물학적 및 임상적 특성이 다양하기 때문에 위암 데이터세트에서 다양한 대조군과 환자를 대상으로 위암 관련 유전자를 확보하였으며, 8가지 위암 데이터세트는 하기 표 1에 나타내었다.
데이터세트명 번호
GSE15459 Chia, 2015 # 185
GSE37023 Wu, 2013 # 186
GSE13861 Cho, 2011 # 187
GSE15081 Takeno, 2010 # 188
GSE27342 Cui, 2011 #189
GSE47007 Suzuki, 2015 #190
GSE63089 Zhang, 2015 #191
GSE36968 Kim, 2012 #192
PATHOME을 사용하여 8 가지 데이터 세트의 서브 패스웨이 네트워크를 구축하고 하위 경로 네트워크에서 특정 약물 (PharmGKB {Barbarino, 2017 # 194} 및 Drugbank {Law, 2014 # 193})과 관련된 유전자를 확인하였다. 네트워크 분석에서 약물 관련 유전자 목록은 172 개의 후보 유전자를 생성하였으며, 172 개의 유전자를 상류의 신호 유전자뿐만 아니라 하류의 신호로 확장 시키면, 666 개의 유전자가 잠재적인 PK / PD 마커 후보로 확인되었다. 666 유전자의 중요성을 독립적으로 검증하기 위해 유전자 발현, 생존 정보 및 로렌 조직학 분류를 포함한 TC GC GC 데이터 세트 (TCGA_STAD_exp_HiSeq-2015-02-24 버전 양식, UCSC 암 브라우저)를 사용하였다. 장형 위암보다 예후가 나쁜 미만형 위암 서브타입에서 차등적으로 발현된 유전자에 중점을 두고 후보 유전자를 선택하였으며, 666 유전자의 TCGA 발현의 차별적인 발현 분석을 위해, 통계적으로 중요한 유전자로서 1.3 또는 1 / 1.3 (장에서 확산)과 0.05의 p- 값 컷오프를 사용했다. 그 결과, 180 개의 후보 유전자가 선택되었다.
실시예 2. 선별된 180개 후보 유전자의 임상정보 및 유전자 발현 수준에 따른 생존 분석
Kaplan-Meier 생존 분석을 통해 유전자 발현 수준에 따른 생존 분석을 실시하였다. 상기 TCGA GC 데이터를 이용하여 226 명의 환자 표본 (미만형 63명, 장형 163명)의 임상 정보(조직학적 아형, 생존 정보 및 병리 단계)를 추출 하였다(도 3), 생존율의 유의성에 대한 180 개의 후보 유전자의 발현 데이터를 얻었다. 이어서 226 개의 표본 자료를 이용하여 조직 학적 아형 (미만성, 장, 확산 및 장)과 병리학적 단계 (I ~ II, III ~ IV, I ~ IV)를 토대로 그룹을 만들었다. 조직학 하위 유형의 발현 수준에 따라 생존율의 차이를 결정하기 위해 도 4과 같이 9 개 그룹을 나누었다. 샘플은 각 유전자에 대한 발현 수준의 중간 값을 기준으로 나누었다. 중앙값보다 크면 "높은 표현"이라고 표시된다. 표본 표현이 중앙값보다 작거나 같으면 표본에 "저 표현"이라고 표시된다. Kaplan-Meier 방법에 따라 R 소프트웨어를 사용하여 생존 분석을 수행하였다. 각각의 유전자에 대한 높은 발현 및 낮은 발현 그룹의 생존 곡선의 그래프를 그렸다. 생존율의 차이는 log-rank test를 사용하여 얻었고 p 값이 0.05 미만인 경우 통계적으로 유의하다고 간주되었다(도 5, 표 3 및 표 4). 중앙값 대신에 평균값에 기초한 생존 분석도 같은 방법으로 수행되었다(표 2 및 표 3).
　 Median (cutoff for assigning either high- or low-expressing groups)
Pathologic stage I ~ II III ~IV I ~ IV
Catergories
Gene 		D I D+I D I D+I D I

D+I
ACTN2 　
AKT3 　 0.0403
CACNA1C 　
CACNA2D3 　 0.0147
CAMK2A 0.0455 0.0245 0.0221
CAV1 　 0.0116 0.019 0.0024 0.0084
CCL11 　 0.0237
CCL14 　
CCL22 　 0.0457
CCR4 　 0.046
CHRM2 　 0.0469 0.0416
COL4A2 　 0.0149 0.0188
COL4A6 　
CX3CR1 　
CXCR4 　
DNM3 　 0.0086
DUSP3 　
F2R 　 0.0145
FCGR2A 0.0286
FGF1 　 0.0227
FGF5 　
FGFR1 　 0.0394 0.0141
FLT3LG 　
FN1 　
FYN 　 0.0477
GNAI1 　 0.0371
GNB4 　
GNG11 　 0.043
GNG8 0.0315
HCST 　
HGF 　 0.0301
IGF1 　
IKBKG 　 0.0472 0.0216 0.0143 0.0055
IL1R1 　
IL6ST 　 0.0154 0.038
ILK 　 0.0259 0.0283
ITGB3 　
JAK2 　 0.016
LAMA2 　 0.0468
LAMA4 　 0.0048 0.0127 0.00361 0.0217
LCK 0.0345
MAP3K3 　
MAPK10 　
MAPT 　
NGF 　 0.0191
PAK3 　 0.0389
PDGFD 　 0.0318
PDGFRB 　 0.0085
PIK3CG 　 0.0302
PLA2G2C 　 0.0457
PPP3R2 0.0438
PRKCQ 　
PRNP 　 0.0489 0.0285
PTPN6 　 0.0144 0.0369
RAC2 0.0253 0.0164
RRAS 　 0.0438
SHC4 　 0.0437 0.0286 0.0291
TCF7L1 　 0.0135 0.0132 0.0446
TGFB1 　 0.0329
TLN1 　 0.0069 0.0153
TYROBP 　
VAV1 　 0.0496
VEGFB 　 0.0204
VEGFC 　 　 　 　 0.0405 　 　 0.012 0.0139
　 Mean (cutoff for assigning either high- or low-expressing groups)
Pathologic stage I ~ II III ~IV I ~ IV
Catergories
Gene 		D I D+I D I D+I D I D+I
ACTN2 　 0.0295 　
AKT3 　 0.0398 0.00868 　
CACNA1C 0.0452 　
CACNA2D3 　 0.0376 0.0274 　
CAMK2A 　 　
CAV1 　 0.0428 　
CCL11 　 　
CCL14 　 0.0451 0.0241 　
CCL22 　 　
CCR4 　 　
CHRM2 　 　
COL4A2 　 　
COL4A6 　 0.0252 0.00725 　
CX3CR1 　 0.0167 　
CXCR4 　 0.0184 　
DNM3 　 0.0187 0.0112 　
DUSP3 　 0.0265 　
F2R 　 0.0336 　
FCGR2A 　 　
FGF1 　 　
FGF5 　 0.0252 0.0311 0.0133 　
FGFR1 　 　
FLT3LG 　 0.0313 　
FN1 　 0.0174 0.0104 　
FYN 　 　
GNAI1 　 0.0292 　
GNB4 　 0.0333 　
GNG11 　 　
GNG8 　 　
HCST 0.0118 　
HGF 　 　
IGF1 　 0.0292 　
IKBKG 　 0.0414 0.0158 0.011
IL1R1 　 0.0375 　
IL6ST 　 　
ILK 　 0.0376 　
ITGB3 　 0.00504 0.0131 0.00432 0.0465
JAK2 　 　
LAMA2 　 0.0428 0.0282 　
LAMA4 　 0.0058 0.0041 　
LCK 　 　
MAP3K3 　 0.0335 　
MAPK10 　 0.0409 　
MAPT 　 0.0396 　
NGF 　 　
PAK3 　 0.0102 　
PDGFD 　 　
PDGFRB 　 0.0485
PIK3CG 　 　
PLA2G2C 　 　
PPP3R2 　 　
PRKCQ 　 0.0433 　
PRNP 　 0.0434 0.0147 　
PTPN6 　 0.00782 0.0215 　
RAC2 　 　
RRAS 　 　
SHC4 　 　
TCF7L1 　 0.0234 　
TGFB1 　 0.0329 0.0293
TLN1 　 　
TYROBP 0.0397 　
VAV1 　 　
VEGFB 　 　
VEGFC 　 　 　 　 0.043 　 　 0.00929 　
666 개의 유전자 중 TCGA 임상 정보와 유전자 발현을 이용하여 차별 발현 검사와 임상 관련 연관성 (예 : 생존 분석)을 수행하여 64 개의 위암 예후 관련 바이오마커가 하기와 같이 도출되었다(도 2). 64 개의 유전자 중에서 새로운 GC/PD 마커 후보로 PRNP, CAMK2A 및 CACNA2D3를 선택하여 코호트에서 IHC를 수행했다.
실시예 3. 면역 조직 화학 분석
Immunohistochemistry는 Discovery XT 자동 면역 조직 화학 염색기 (Ventana Medical Systems, Inc., Tuscon, AZ, USA)를 사용하여 자동으로 수행되었다. 정제 된 anti-Prion (인장 카탈로그 # 9620-02, 1:50, BioLegend)을 위한 항체가 사용되었다. Ventana Chromo Map Kit (Ventana Medical Systems)를 사용하여 탐지가 이루어졌으며 간단한 과정이 수행되었습니다. EZ Prep 용액을 사용하여 절편을 탈 파라핀 화하고 CC1 (Tris / Borate / EDTA가 함유 된 pH 8.4 완충액)을 항원 검색을 위해 90 분 동안 (확장 된 프로토콜) 사용 하였다. 억제제 D (3 % H2O2, 내인성 퍼 옥시다아제)를 37 ℃에서 4 분 동안 차단시켰다. 슬라이드를 1 차 항체 37 ℃에서 32 분간, 2 차 항체 omnimap 항 마우스 HRP 37 ℃에서 16 분 동안 배양 하였다. 슬라이드를 37 ℃에서 8 분 동안 DAB + H2O2 기질에서 인큐베이션 한 다음 37 ℃에서 헤 마톡 실린 및 청색 시약 대조 물을 첨가하여 배양 하였다. 반응 용액 (pH 7.6 Tris buffer)을 세척액으로 사용 하였다. 면역 조직 화학 염색은 종양 세포의 10 % 이상이 PRNP의 세포질에서 강한 과립 염색을 보였을 때 양성으로 해석되었다(도 6a, 6b 및 6c).
실시예 4. siRNA 스크리닝
3-1. siRNA 처리 후 세포 생존율 분석
위암 세포주에 선별된 바이오마커 후보 유전자의 siRNA를 처리한 후 AGS, MKN-1, SNU-16, SNU-668, SNU-216, SNU-601 및 SNU-620 세포를 실험군으로 사용하였다. 넉다운(knock-down)시켰을 때 대부분의 세포를 사멸시키는 것으로 공지된 PLK1을 양성대조군, 비-표적 서열(non-targeting sequence)을 음성대조군으로 사용하였다. 본 실시예에서 사용된 siRNA는 Dharmacon 사에서 입수하였다.
28개의 유전자를 각각 siRNA로 넉다운(knock-down)시켰을 때, 세포 생존율은 도 7에 나타내었다. 도 7에 나타난 바와 같이 6개의 위암 세포 중 SNU 620, SNU-668, SNU-216, SNU-601, MKN-1 세포는 대부분의 유전자에 대한 siRNA에 의해 세포 생존율이 현저하게 감소하여 가장 우수한 효과를 나타냄을 확인하였으며, AGS, SNU-16 세포 또한 일부 유전자에 대한 siRNA에 의해 세포 생존율이 감소함을 확인하였다. 이를 통해, 본 발명에서 선별된 예후 관련 바이오마커 후보 유전자는 위암 환자를 치료하기 위한 타겟으로 유용함을 확인할 수 있다.
3-2. siRNA 처리 후 mRNA 발현 분석
위암 세포주에 선별된 바이오마커 후보 유전자의 siRNA를 처리한 후 mRNA 발현을 분석하였다. SNU-216, SNU-601 및 SNU-620, SNU-668, AGS 및 MKN-1 세포를 실험군으로 사용하였으며, 5개의 유전자를 각각 siRNA로 넉다운(knock-down) 시켰을 때, mRNA 발현율은 도 8에 나타내었으며, 웨스턴 블롯 결과는 도 9에 나타내었다.
도 8에 나타난 바와 같이 SNU-216, SNU-601 및 SNU-620, SNU-668, AGS 및 MKN-1 세포에서 siRNA에 의해 실험에 사용된 모든 바이오마커의 mRNA 발현율이 감소함을 확인하였다. 이를 통해, 본 발명에서 선별된 예후 관련 바이오마커 후보 유전자는 위암 환자를 치료하기 위한 타겟으로 유용함을 확인할 수 있다.

Claims (14)

  1. PRNP, CACNA1C, CACNA2D3, CHRM, CCR5, CXCR4, CXCL12, F2R, FCGR, FGF1, PGFR1, FLT3, FN1, FYN, LCK IL1R1, MMP2, PDGFR, JAK2, PRKCQ, TGFB1, ITGB3, PPP3R2, NGF, STAT5B, EPHA3, NRXN1, CAMK2A 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자를 포함하는 위암(Gastric cancer, GC)의 예후 예측용 바이오마커.
  2. 제1항에 있어서, 상기 바이오마커는 PRNP, CACN2D3, PDGFR, JAK2 및 CAMK2A 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자인 것을 특징으로 하는 바이오마커.
  3. 제1항의 바이오마커의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 위암 예후 예측용 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 바이오마커에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 포함하고, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 바이오마커 유전자의 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 위암 예후 예측용 조성물.
  5. 제3항 또는 제4항의 조성물을 포함하는 위암 예후 예측용 키트.
  6. 제5항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, 경쟁적 RT-PCR 키트, 실시간 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인 것인 위암 예후 예측용 키트.
  7. a) 위암 환자에서 분리된 생물학적 시료로부터 제1항의 바이오마커의 mRNA 또는 이의 단백질 발현수준, 또는 발현패턴을 얻는 단계; 및
    b) 상기 a) 단계에서 얻은 발현수준 또는 발현패턴을 예후가 알려진 위암 환자의 해당 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 발현수준, 또는 발현패턴과 비교하는 단계를 포함하는 위암의 예후 예측을 위한 정보제공방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 mRNA 수준을 측정하는 방법은 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(real time quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩 방법(DNA chip technology)인 것인 위암의 예후 예측을 위한 정보제공방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 단백질의 수준을 측정하는 방법은 웨스턴 블랏(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbentassay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radial immunodiffusion), 오우크테로니면역 확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동(rocket immunoelectrophoresis), 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complement Fixation Assay), 면역형광법(immunofluorescence), 면역크로마토그래피법(immunochromatography), FACS 분석법(fluorescenceactivated cell sorter analysis) 또는 단백질 칩 방법(protein chip technology)인 것인 위암의 예후 예측을 위한 정보제공방법.
  10. a) 위암 환자에서 분리된 시료에 후보물질을 처리하는 단계;
    b) 후보물질이 처리된 위암 환자의 시료에서 제1항에 따른 바이오마커의 mRNA 또는 이의 단백질 발현수준을 측정하는 단계; 및
    c) 상기 b) 단계의 mRNA 또는 이의 단백질 발현수준이 후보물질의 처리 전보다 낮은 경우, 후보물질을 위암의 예방 또는 치료용 물질로 판단하는 단계; 를 포함하는 위암 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝하는 시스템.
  11. 제1항에 따른 바이오마커에 의해 코딩되는 단백질 발현 또는 활성을 억제하는 물질; 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 위암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 물질은 상기 바이오마커에 대한 안티센스 올리고 뉴클레오티드, 앱타머(aptamer), siRNA 또는 shRNA인 것인 약학적 조성물.
  13. 제11항에 있어서, 상기 물질은 상기 바이오마커의 단백질 활성을 억제하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 것인 약학적 조성물.
  14. 제1항에 있어서, 상기 위암은 확산형 위안인, 바이오마커.
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102253304B1 (ko) * 2019-11-28 2021-05-20 경상국립대학교산학협력단 위암 재발 예측용 바이오 마커
KR20210094938A (ko) * 2020-01-22 2021-07-30 계명대학교 산학협력단 당뇨 조기진단을 위한 바이오마커 및 이의 용도
WO2022145532A1 (ko) * 2020-12-30 2022-07-07 경상대학교병원 위암 예후 예측용 바이오마커 및 이의 용도

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