KR102311390B1 - 교모세포종 예후예측용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 스플라이싱되지 않은 XBP-1의 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 교모세포종 예후예측용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 교모세포종 예후예측용 키트 및 스플라이싱되지 않은 XBP-1의 수준을 이용한 교모세포종 예후예측을 위한 정보의 제공방법에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 스플라이싱되지 않은 XBP-1을 이용하면, 교모세포종의 치료후, 자가포식이 억제되는지의 여부를 확인하여, 교모세포종의 치료후 예후를 예측할 수 있으므로, 보다 효과적인 교모세포종의 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

교모세포종 예후예측용 조성물{Composition for prognosing glioblastoma}

본 발명은 교모세포종 예후예측용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 스플라이싱되지 않은 XBP-1의 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 교모세포종 예후예측용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 교모세포종 예후예측용 키트 및 스플라이싱되지 않은 XBP-1의 수준을 이용한 교모세포종 예후예측을 위한 정보의 제공방법에 관한 것이다.

암은 전세계적으로 가장 보편적인 사망원인 중의 하나이다. 약 천만 건의 새로운 케이스가 매년 발생하며, 전체 사망원인의 약 12%를 차지하여 세 번째로 많은 사망의 원인이 되고 있다. 여러 가지 종류의 암 중에서 특히 뇌암은 연령에 관계없이 발생 되며, 소아에 발생 빈도가 다른 암에 비하여 높은 특징이 있다. 뇌암은 뇌조직과 뇌를 싸고 있는 뇌막에서 발생되는 일차성 뇌종양과 두개골이나 신체의 다른 부위에서 발생된 암으로부터 전이된 이차성 뇌종양으로 구별되는데, 증세로는 운동 마비, 지각마비, 언어 장애, 시력 장애, 평형 장애 등과 같은 국소 증상과 두개내압항진 증상을 들 수 있다. 상기 뇌암은 조직특이적으로 1 내지 2종의 암이 발병되는 다른 조직에서 발병되는 암과는 달리 다형성아교모세포종, 악성신경교종, 임파선종, 배아세포종, 전이성 종양 등의 다양한 종류의 암을 포함하는데, 이 중에서도 신경교종 (glioma), 특히 교모세포종(glioblastoma)은 가장 악성이고 공격적이어서 예후가 매우 좋지 않으며, 진단 후 평균 생존 기간이 약 1년을 넘지 못하는 매우 치명적인 질환이다. 상기 교모세포종이 발병된 환자에서는 뇌세포와 종양세포 간의 경계가 분명하지 않기 때문에, 암조직을 외과적으로 완전히 제거하는 것은 거의 불가능한 것으로 알려져 있다. 이에, 상기 교모세포종을 치료하는 방법을 개발하기 위하여, 다양한 연구가 수행되었고, 그 결과로서 테모졸로마이드(temozolomide, TMZ)가 개발되었다.

상기 테모졸로마이드는 교모세포종 세포의 DNA를 손상시켜서 항암효과를 나타내는 알킬화제의 일종으로서, 최근에는 교모세포종을 치료하기 위하여, 외과적인 수술과 테모졸로마이드 처리를 병용하는 방법이 사용되고 있다. 그러나, 교모세포종은 다양한 유전적 돌연변이를 포함하기 때문에, 상기 병용치료방법이 사용되고 있는 현재에도 교모세포종 환자의 평균 생존율이 현저히 낮아, 새로운 치료제의 개발이 요구되고 있다. 이러한 필요성에 따라 새로운 교모세포종 치료제를 개발하려는 연구가 활발히 진행되고 있다. 예를 들어, 국제특허공개 제2012-061120호에는 정제된 교모세포종 GBM6-AD 줄기 세포를 이용하여 교모세포종을 치료하는 방법이 개시되어 있고, 국제특허공개 제2012-104822호에는 마시텐탄을 투여하여 교모세포종을 치료하는 방법이 개시되어 있다. 그러나, 이같은 방법으로 교모세포종을 치료하더라도, 뇌세포를 대상으로 하는 교모세포종의 특성상 상기 치료가 성공적으로 수행되었는지의 여부를 파악하기는 매우 어렵다는 문제점이 있다. 현재로서는 교모세포종을 치료한 후, 환자의 예후를 확인하기 위하여는 장시간이 소요되고 있는데, 교모세포종이 성공적으로 치료된 경우에는 문제가 없으나, 교모세포종이 효과적으로 치료되지 않은 경우에는, 교모세포종이 악화됨은 물론 전이의 유발빈도가 높다는 교모세포종의 특성상 전이로 인하여 심각한 상황이 발생할 수도 있다. 이러한 문제점을 해결하는 방안으로는 교모세포종을 치료한 후, 이의 예후를 예측할 수 있는 마커를 개발하여야 하지만, 이와 관련된 마커는 아직 개발되지 못하고 있는 실정이다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 교모세포종의 치료후 이의 예후를 효과적으로 예측할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 스플라이싱되지 않은 XBP-1(unspliced XBP-1, uXBP-1)의 수준을 측정하여, 교모세포종의 악화여부를 예측할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 스플라이싱되지 않은 XBP-1의 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 교모세포종 예후예측용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 교모세포종 예후예측용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 스플라이싱되지 않은 XBP-1의 수준을 이용한 교모세포종 예후예측을 위한 정보의 제공방법을 제공하는 것이다.

상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시양태는 스플라이싱되지 않은 XBP-1(unspliced XBP-1, uXBP-1)의 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 교모세포종 예후예측용 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어 "XBP-1(X-box binding protein 1)"이란, bZIP 도메인을 포함하고, 면역계와 세포 스트레스 반응의 적절한 기능에 중요한 유전자의 발현을 조절하는 전사 인자 단백질을 의미한다. 상기 XBP-1은 c-fos와 같은 다른 bZIP 전사인자와 함께 헤테로다이머를 형성할 수 있고, 세포증식을 촉진하는 IL-6의 발현을 조절한다고 알려져 있다. 상기 XBP-1을 코딩하는 유전자는 22번 염색체상에 존재하는 것으로 알려져 있다. 상기 XBP-1 유전자의 구체적인 염기서열 또는 단백질의 아미노산 서열 정보는 NCBI와 같은 database에 보고되어 있다. 예를 들면, GenBank Accession Nos: NM_005080, NM_001079539, NM_001271730, NM_013842, NP_001073007, NP_005071, NP_001258659, NP_038870 등으로 보고되어 있다.

본 발명의 용어 "XBP-1의 수준을 측정할 수 있는 제제"란, XBP-1 유전자 또는 단백질의 발현수준을 확인 또는 측정하기 위하여, 상기 유전자를 증폭 또는 검출하거나, 상기 단백질에 특이적으로 결합하여 검출하는데 사용되는 수단을 의미한다. 상기 제제는 스플라이싱되지 않은 XBP-1의 수준을 측정할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, uXBP-1의 유전자와 결합할 수 있는 프라이머, 프로브, 앱타머 등이 될 수 있고, 다른 예로서, uXBP-1의 단백질과 결합할 수 있는 항체, 펩타이드, 상기 항체의 단편, 저분자 화합물 등이 될 수 있다.

본 발명의 용어 "프라이머"란, 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 프라이머는 상기 XBP-1 유전자를 PCR 방법으로 증폭시킬 수 있는 한 그의 염기서열이 특별히 제한되지 않는다.

본 발명의 용어 "프로브"란, 유전자 또는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하는데, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고, 보다 용이하게 검출하기 위하여 라벨링될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 프로브는 상술한 프라이머와 마찬가지로 상기 XBP-1 유전자의 전체 또는 부분서열과 상보적으로 결합하여 상기 XBP-1 유전자를 검출할 수 있는 한 그의 염기서열이 특별히 제한되지 않는다.

본 발명의 용어 "앱타머"란, 특정의 3차원 입체형태를 채택하는 능력에 의해 표적 mRNA와 결합하여 이에 대해 길항 효과를 갖는 핵산 리간드 분자를 의미한다. 전형적으로 앱타머는 규정된 이차 및 삼차 구조, 예컨대 스템-루프구조로 접혀지는 15-50 염기 길이의 작은 핵산일 수 있다. 앱타머는 10^-6, 10^-8, 10^-10, 또는 10^-12 보다 적은 kd로 표적 분자와 결합하는 것이 바람직하다. 앱타머는 매우 고도의 특이성을 가지는 표적 분자와 결합할 수 있다. 또한, 앱타머는 다수의 리보뉴클레오티드 단위, 데옥시리보뉴클레오티드 단위, 또는 두 가지 유형의 뉴클레오티드 잔기의 혼합물로 구성될 수 있다. 앱타머는 하나 이상의 변형된 염기, 당 또는 포스페이트 주쇄 단위를 추가로 포함할 수 있다. 앱타머는 올리고 핵산 (예컨대, RNA) 또는 펩타이드 물질이며, 이에 대한 상세한 내용은 Bock LC et al., Nature 355 (6360):5646 (1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R. "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24):142727 (1998)에 기재되어 있다.

본 발명의 용어 "항체"란, 생체의 면역계에서 혈액이나 림프를 순환하면서 외부 물질인 항원이 침입한 경우 이에 반응하는 물질을 말하며, 림프조직에서 형성되는 글로불린계 단백질로 면역글로불린이라고도 불린다. 항체는 B 세포가 생산해서 체액으로 흘려보내는 단백질로 항원과 특이적으로 결합하며, 하나의 항체 분자에는 두 개의 중사슬 (heavy chain)과 두 개의 경사슬 (light chain)이 있으며, 각각의 중사슬과 경사슬은 그의 N-터미널 말단에 가변영역을 갖고 있다. 각각의 가변영역은 3 개의 상보성 결정부위 (Complementarity determining region: CDR)와 4 개의 구조 형성부위 (framework regions: FRs)로 구성되는데, 상보성 결정 부위들은 항체의 항원 결합 특이성을 결정하고, 가변영역의 구조형성 부위들로 유지되는 비교적 짧은 펩티드 서열로 존재한다.

본 발명에 있어서, 상기 항체는 uXBP-1에 특이적으로 결합하여 활성을 억제하는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다. uXBP-1에 대한 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 XBP-1 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.

XBP-1에 특이적으로 결합하는 펩타이드는 당업계에 공지된 통상의 방법, 예를 들어 파아지 디스플레이 방식으로 얻을 수 있다(Smith GP, "Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface". Science 228 (4705):1315?1317(1985); Smith GP, Petrenko VA, "Phage display". Chem. Rev. 97(2):391-410(1997)).

본 발명의 용어 "교모세포종(glioblastoma)"이란, 원발성 뇌암의 일종인 신경교종(glioma)에 속하는 성상세포종으로 분류되는 악성종양의 일종으로서, 성상세포종 중에서 가장 악성이며 조직학적으로는 역형성 성상세포종에 괴사소견이 추가된 형태의 악성종양을 의미한다. 상기 교모세포종은 신경교종의 1/2, 소아 신경교종의 15%를 차지하며 소뇌에 발생하는 경우는 흔치 않은 것으로 보고되고 있는데, 신경교종 중에서 가장 악성이고 공격적인 증상을 나타내어 예후가 매우 좋지 않으며, 진단 후 평균 생존 기간이 약 1년을 넘지 못하는 것으로 알려져 있다. 실제로, 상기 교모세포종이 발병된 환자에서는 뇌세포와 종양세포 간의 경계가 분명하지 않기 때문에, 암조직을 외과적으로 완전히 제거하는 것은 거의 불가능한 것으로 알려져 있다.

본 발명의 용어 "예후"란, 의학적 귀추(예컨대, 장기 생존 가능성, 무병생존율 등)에 대하여 예상하는 일체의 행위를 의미하며, "예후예측"과 동일한 의미로 사용된다. 대체로, 상기 예후는 양성적 예후(긍정적 예후) 또는 음성적 예후(부정적 예후)를 포함하며, 상기 음성적 예후는 재발, 종양 성장, 전이, 약 저항성 등의 병의 진행 또는 치명성(mortality)을 포함하고, 양성적 예후는 질병이 없는 상태 등의 질병의 차도, 종양 퇴행 등의 질병의 개선 또는 안정화(stabilization)를 포함한다.

본 발명의 목적상, 상기 예후는 교모세포종으로 진단받은 환자의 병의 경과(병의 진행, 개선, 교모세포종의 재발, 교모세포종의 성장, 교모세포종의 의약 저항성 등)를 미리 짐작하는 일체의 행위로 해석될 수 있다.

다른 실시양태는 상기 교모세포종의 예후예측용 조성물을 포함하는, 교모세포종의 예후예측용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트는 마이크로어레이 키트의 형태로 실시될 수 있다. 상기 마이크로어레이 키트는 마이크로어레이의 고상표면에 프로브가 고정화된 형태로 제조될 수 있다.

본 발명의 키트에서 이용되는 프로브는 상기 설명한 바와 동일하다.

본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 상기한 프로브는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기체(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기체는 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함한다. 상기한 혼성화 어레이 요소는 상기의 기체 상에 배열되고 고정화 된다. 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 실시된다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기체에 결합될 수 있다.

한편, 본 발명의 구현예에 따른 마이크로어레이에 적용되는 시료 DNA는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화된다. 혼성화 조건은 다양하게 할 수 있다. 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.

프로브의 표지는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 이는 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 적합한 표지는 형광단(예컨대, 플루오리신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 로다민, 리사민(lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5 (Pharmacia)), 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소(P32 및 S35), 매스 표지, 전자밀집입자, 효소(알칼린 포스파타아제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다아제), 조인자, 효소에 대한 기질, 중금속(예컨대, 금) 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션 (nick translat 바이오 방법, 무작위 프라이밍 방법(Mult prime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법 (Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.

분석 대상이 되는 핵산 시료는 다양한 생시료(biosamples)에서 얻은 mRNA를 이용하여 제조할 수 있다. 프로브 대신에 분석 대상이 되는 cDNA를 표지하여 혼성화 반응-기초 분석을 실시할 수도 있다.

프로브를 이용하는 경우, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화시킨다. 본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다. 예를 들어, 상기 엄격조건 중에서 고 엄격조건은 0.5 M NaHPO4, 7% SDS(sodium dodecyl sulfate), 1 mM EDTA에서 65℃ 조건으로 혼성화하고, 0.1 x SSC(standard saline citrate)/0.1% SDS에서 68℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 또는, 고 엄격조건은 6 x SSC/0.05% 소듐 파이로포스페이트에서 48℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 저 엄격조건은 예를 들어, 0.2 x SSC/0.1% SDS에서 42℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다.

혼성화 반응 이후에, 혼성화 반응을 통하여 나오는 혼성화 시그널을 검출한다. 혼성화 시그널은 예컨대, 프로브에 결합된 표지의 종류에 따라 다양한 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 프로브가 효소에 의해 표지된 경우, 이 효소의 기질을 혼성화 반응 결과물과 반응시켜 혼성화 여부를 확인할 수 있다. 이용될 수 있는 효소/기질의 조합은, 퍼옥시다아제(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제)와 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatecN-l), TMB(tetra methyl benzidine), ABTS(2,2-Azino-di-[3-ethylbenzthiazoline sulfate]), o-페닐렌디아민(OPD미노에틸나프톨/파이로닌; 알칼린 포스파타아제와 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphtN-l-AS-B1-pN-spNate)노에틸ECF 기질; 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate) 등이다. 프로브가 금 입자로 표지된 경우에는 실버 나이트레이트를 이용하여 실버 염색 방법으로 검출할 수 있다. 따라서 본 발명의 키트를 혼성화에 기초하여 실시하는 경우에는, 구체적으로 (i) 본 발명의 마커의 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보적인 서열을 가지는 프로브를 핵산 시료에 혼성화시키는 단계; (ii) 상기 혼성화 반응 발생 여부를 검출하는 단계를 포함한다. 혼성화 과정에 의한 혼성화 시그널의 세기를 분석함으로써, 만성 골수성 백혈병 환자에 대한 약물 내성도를 판단할 수 있다. 즉, 시료에서 본 발명의 타겟 마커의 뉴클레오티드 서열에 대한 혼성화 시그널이 정상 시료보다 강하게 나오는 경우에는 만성 골수성 백혈병 약물에 대하여 내성을 나타내는 것으로 판단된다.

또 다른 실시양태는 교모세포종 예후예측을 위한 정보의 제공방법을 제공하다.

구체적으로, 상기 교모세포종 예후예측을 위한 정보의 제공방법은 (a) 교모세포종이 발병된 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 스플라이싱되지 않은 XBP-1(uXBP-1)의 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 측정된 uXBP-1의 수준을 대조군 시료의 것과 비교하는 단계를 포함한다.

상기, 교모세포종, XBP-1 등은 상술한 바와 동일하다.

상기 방법에 있어서, (a) 단계의 uXBP-1의 수준을 측정하는 단계는 상기 교모세포종 예후예측용 조성물 또는 키트를 사용하여 수행될 수 있다.

상기 방법에 있어서, (b) 단계에서 사용되는 대조군은 발병된 후 치료를 수행하지 않은 교모세포종의 세포 또는 조직이 될 수 있다. 상기 (b) 단계를 수행한 결과, 대조군 시료의 것에 비하여 (a) 단계에서 측정된 uXBP-1의 수준이 증가된 경우에는 교모세포종의 자가포식이 억제되어, 교모세포종의 치료후 예후가 좋지 않을 것으로 예측할 수 있다.

본 발명에서 제공하는 스플라이싱되지 않은 XBP-1을 이용하면, 교모세포종의 치료후, 자가포식이 억제되는지의 여부를 확인하여, 교모세포종의 치료후 예후를 예측할 수 있으므로, 보다 효과적인 교모세포종의 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 다양한 비율의 괴사세포에 노출된 교모세포종에서 발현된 uXBP-1 단백질의 수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진 및 그래프이다.
도 2는 다양한 비율의 괴사세포에 노출된 교모세포종에서 발현된 인산화된 IRE1α(p-IRE1α) 단백질의 수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진 및 그래프이다.
도 3은 비접힘단백질반응이 유도된 조건에서 다양한 비율의 괴사세포에 노출된 교모세포종 세포내에 존재하는 스플라이싱된 XBP-1, 스플라이싱되지 않은 XBP-1 및 인산화된 IRE1α(p-IRE1α) 단백질의 수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다.
도 4는 다양한 비율의 괴사세포에 노출된 교모세포종 세포내에서 자가포식 활성마커인 p62와 LC3의 수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진 및 그래프이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 괴사세포에 노출된 교모세포종 세포에서 uXBP-1의 발현수준 분석

먼저, 1% FBS를 포함하는 DMEM(WelGENE Inc. Daegu, Korea) 배지가 담겨진 60mm 배양접시에 접종된 교모세포종 세포를 총 5번의 동결-해동 과정(freezing-thawing cycle)을 통해 괴사세포를 제작하였다.

다음으로, 교모세포종 세포와 상기 제작된 괴사세포를 다양한 비율(1:05, 1:1, 1:3 또는 1:5; 세포수 기준)로 혼합하여 24시간 동안 배양하고, 배양이 종료되면, 각 교모세포종 세포의 파쇄물을 수득하였다. 상기 수득한 세포파쇄물을 대상으로 항-uXBP-1 항체(Abcam, Ab37152)를 사용한 웨스턴블럿 분석을 수행하여, 각각의 교모세포종 세포에서 발현된 uXBP-1 단백질의 수준을 비교하였다(도 1). 이때, 내부대조군으로는 α-tubulin을 사용하였다.

도 1은 다양한 비율의 괴사세포에 노출된 교모세포종에서 발현된 uXBP-1 단백질의 수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진 및 그래프이다.

도 1에서 보듯이, 교모세포종에 노출된 괴사세포의 비율에 비례하여, 교모세포종 세포에서 발현된 uXBP-1 단백질의 수준이 증가됨을 확인하였다.

실시예 2: 괴사세포에 노출된 교모세포종 세포에서 uIRE-1α 단빽질의 발현수준 분석

상기 실시예 1을 통하여, 교모세포종에 노출된 괴사세포의 비율에 비례하여, 교모세포종 세포에서 발현된 uXBP-1 단백질의 수준이 증가됨을 확인하였으므로, 상기 XBP-1의 스플라이싱에 관여하는 IRE-1alpha 단빽질의 활성이 변화되는지 확인하였다.

대략적으로, 상기 실시예 1에서 수득한 각 교모세포종 세포의 파쇄물을 대상으로 항-p-IRE1α 항체(Thermo Fisher, PAI-16927)를 사용한 웨스턴블럿 분석을 수행하여, 각각의 교모세포종 세포에서 발현된 p-IRE1α 단백질의 수준을 비교하였다(도 2). 이때, 내부대조군으로는 α-tubulin을 사용하였다.

도 2는 다양한 비율의 괴사세포에 노출된 교모세포종에서 발현된 인산화된 IRE1α(p-IRE1α) 단백질의 수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진 및 그래프이다.

도 2에서 보듯이, 교모세포종에 노출된 괴사세포의 비율에 비례하여, 교모세포종 세포에서 측정된 인산화된 IRE1α(p-IRE1α) 단백질의 수준이 감소됨을 확인하였다.

따라서, 교모세포종에 노출된 괴사세포의 비율에 비례하여 교모세포종 세포내 IRE-1alpha 단빽질의 활성이 감소됨을 알 수 있었다.

실시예 3: 비접힘단백질반응(UPR)이 괴사세포에 노출된 교모세포종 세포에 미치는 영향 분석

먼저, 비접힘단백질반응(unfolded protein response, UPR)유도 약물로 알려진 Tg(Thapsigargin)(Sigma-Aldrich, T9033) 250nM와 1% FBS를 포함하는 DMEM 배지에 교모세포종 세포를 접종하고 3시간 동안 배양하였다.

다음으로, 상기 배양된 교모세포종 세포와 실시예 1에서 제작한 괴사세포를 혼합하여 24시간 동안 배양하고, 배양이 종료되면, 각 교모세포종 세포의 파쇄물을 수득하였다. 상기 수득한 세포파쇄물을 대상으로 항-uXBP-1 항체(스플라이싱된 XBP-1 검출), 항-sXBP-1 항체(스플라이싱되지 않은 XBP-1 검출) 및 항-p-IRE1α 항체를 사용한 웨스턴블럿 분석을 수행하여, 각각의 교모세포종 세포 내에 존재하는 uXBP-1, sXBP-1 및 p-IRE1α 단백질의 수준을 비교하였다(도 3). 이때, 내부대조군으로는 α-tubulin을 사용하였다.

또한, 비교군으로서, 상기 실시예 1에서 수득한 각각의 세포파쇄물을 대상으로 동일한 웨스턴블럿 분석을 수행하였다.

도 3은 비접힘단백질반응이 유도된 조건에서 다양한 비율의 괴사세포에 노출된 교모세포종 세포내에 존재하는 스플라이싱된 XBP-1, 스플라이싱되지 않은 XBP-1 및 인산화된 IRE1α(p-IRE1α) 단백질의 수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다.

도 3에서 보듯이, 비접힘단백질반응이 유도되지 않은 조건에서는 괴사세포의 비율이 증가할 수록 교모세포종 세포에서 인산화된 IRE1α(p-IRE1α) 단백질과 스플라이싱된 XBP-1 단백질의 수준이 감소하였고, 스플라이싱되지 않은 XBP-1 단백질의 수준이 증가한 반면, 비접힘단백질반응이 유도된 조건에서는 인산화된 IRE1α(p-IRE1α) 단백질이 대조군 보다도 높은 수준을 나타내었고, 스플라이싱된 XBP-1 단백질은 대조군과 유사한 수준을 나타내었으나, 스플라이싱되지 않은 XBP-1 단백질은 검출되지 않음을 확인하였다.

상기 결과로부터, 교모세포종 세포가 괴사세포에 노출되면 비접힘단백질반응(UPR)이 억제되는 것으로 분석되었다.

실시예 4: 괴사세포에 노출된 교모세포종 세포에서 자가포식 활성마커 분석

상기 실시예 1에서 수득한 각 교모세포종 세포의 파쇄물을 대상으로, 자가포식(autophagy) 활성마커로 알려진 p62에 대항 항체(Cell Signaling, 88588) 및 LC3에 대한 항체(Cell signaling, 2775)를 사용한 웨스턴블럿 분석을 수행하여, 각각의 교모세포종 세포에서 자가포식 활성마커의 수준을 분석하였다(도 4).

도 4는 다양한 비율의 괴사세포에 노출된 교모세포종 세포내에서 자가포식 활성마커인 p62와 LC3의 수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진 및 그래프이다.

도 4에서 보듯이, 교모세포종에 노출된 괴사세포의 비율에 비례하여, 교모세포종 세포에서 측정된 자가포식 활성마커인 p62와 LC3의 수준이 증가됨을 확인하였다.

상기 결과에서 보듯이, 상기 자가포식 활성마커가 세포내에서 분해되지 않고 잔류한다는 사실은, autophagosome degradation 작용이 정상적으로 수행되지 않아, 자가포식작용이 억제됨을 시사하는 것으로 분석되었다.

따라서, 교모세포종 세포가 괴사세포에 노출될 경우 자가포식이 억제됨을 알 수 있었다.

상기 실시예 1 내지 4의 결과를 종합하면, 교모세포종 세포가 생체 내 암미세환경의 조건에서 괴사세포에 노출되었을 경우, p-IRE1α의 수준이 감소되고, 세포 내 uXBP-1의 축적량이 증가되며, 자가포식이 억제됨을 알 수 있었다.

교모세포종과 같은 암세포의 경우 자가포식이 억제되면 이에 의하여 암세포의 증식이 촉진된다고 알려져 있으므로, 세포 내 uXBP-1의 수준을 측정함으로써 교모세포종의 악화여부를 진단할 수 있을 것이다.

나아가, 교모세포종 세포 내 uXBP-1의 축적량을 감소시켜서, 교모세포종의 자가포식을 활성화시킴으로써, 교모세포종의 치료에 활용될 수 있을 것이다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (7)

1. 스플라이싱되지 않은 XBP-1(unspliced XBP-1, uXBP-1)의 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는, 교모세포종 예후예측용 조성물로서,
   상기 측정된 uXBP-1의 수준이 대조군 시료의 것에 비하여 증가된 경우에 교모세포종의 자가포식이 억제되어 교모세포종의 치료후 예후가 좋지 않을 것으로 예측할 수 있는 것인, 교모세포종 예후예측용 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 제제는 uXBP-1의 mRNA와 결합할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 앱타머인 것인, 조성물.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 제제는 uXBP-1의 단백질과 결합할 수 있는 항체, 펩타이드, 상기 항체의 단편 또는 저분자 화합물인 것인, 조성물.
   
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 교모세포종의 예후예측용 키트.
   
5. 제4항에 있어서,
   상기 키트는 마이크로어레이 키트인 것인, 키트.
   
6. (a) 교모세포종이 발병된 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 스플라이싱되지 않은 XBP-1(unspliced XBP-1, uXBP-1)의 수준을 측정하는 단계; 및
   (b) 상기 측정된 uXBP-1의 수준을 대조군 시료의 것과 비교하는 단계를 포함하며,
   상기 (b) 단계를 수행한 결과, 대조군 시료의 것에 비하여 (a) 단계에서 측정된 uXBP-1의 수준이 증가된 경우에는, 교모세포종의 자가포식이 억제되어 교모세포종의 치료후 예후가 좋지 않을 것으로 예측할 수 있는 것인, 교모세포종 예후예측을 위한 정보의 제공방법.
   
7. 삭제

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