KR102006999B1 - 대장암 전이 진단 또는 예후 예측용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

대장암 전이 진단 또는 예후 예측용 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명에서는 스쿠알렌 에폭시다제(squalene epoxidase) 및/또는 p53 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 전이 진단용 조성물을 이용하여, 대장암 전이를 진단 및/또는 대장암의 예후를 예측할 수 있다.

Description

대장암 전이 진단 또는 예후 예측용 조성물 및 이의 용도 {A composition for diagnosing colon cancer metastasis or predicting the same, and use thereof}
본 발명은 스쿠알렌 에폭시다제(squalene epoxidase) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 대장암 전이 진단 또는 예후 예측용 조성물, 키트 및 대장암 전이 진단 또는 예후 예측을 위한 정보제공방법에 관한 것이다.
대장은 맹장과, 결장 (상행 결장, 횡행 결장, 하행 결장, S상 결장), 직장으로 분류되며, 수분과 비타민의 일부, 쓸개즙염, 빌리루빈 등을 흡수하고, 찌꺼기를 대변으로 몸 밖으로 배출하는 동시에 여러 종류의 많은 세균이 서식하는 곳이기도 하다. 대장암(colorectal cancer)은 대장에 생긴 암세포로 이루어진 종양을 의미한다. 구체적으로, 대장에서 폴립이 선종으로부터 성장된 것으로 대부분의 경우에는 양성종양으로 성장하나, 일부는 악성종양으로 발전하는 것으로 알려져 있다.
또한, 대장암은 고지방식품과 육식, 가공 식품과 인스턴트 식품의 섭취가 주요원인이 된다. 이들 식품을 많이 먹으면 콜레스테롤과 발암물질인 담즙산이 많이 분비되고, 콜레스테롤은 대사과정에서 발암물질을 만들며 담즙산은 대장 세포를 암세포로 변하게 하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
대장암은 이른 시기에 발견되면 완치를 기대해 볼 수 있으나, 발견시기가 늦어질수록 폐, 간, 림프절이나 복막 등 절제하기 어려운 곳으로의 전이가 일어난다. 대장암의 평균 재발 시기는 12 내지 24개월 후로 재발의 약 70%가 24개월 이내에 발생한다고 알려져 있으며, 수술 후 3 내지 5년에 90%가 재발되는 것으로 알려져 있다.
상기 질환의 주요 증상으로 초기에는 아무런 증상도 나타나지 않으며, 증상이 없는 경우에도 눈에 띄지 않는 장 출혈로 인한 빈혈, 식욕부진과 체중감소가 나타난다. 대장암은 진행 정도에 따라 1기에서 4기로 분류하며, 구체적으로 1기 및 2기는 암세포가 점막하증 또는 근육층까지만 침윤된 것을 의미하며, 3기 이상인 경우에 림프절 전이가 일어난 것을 의미한다.
대장암은 초기에는 대부분 아무런 증상이 없으며, 증상이 나타난 경우에는 이미 상당히 진행된 경우가 많다. 따라서, 이를 조기 진단하는 것이 중요하나, 특별한 이상 징후가 없는 경우가 많기 때문에, 대장암 전이의 진단에 어려움이 있다.
또한, 국내등록특허 제10-1007573호, 제10-0969692호에서는 대장암 과발현 유전자를 이용하여 대장암을 진단하는 방법을 개발하였으나, 이는 대장암 발병여부를 확인하는 것일 뿐이므로, 대장암 발병을 전제로 한 대장암 전이 여부 및 예후를 진단하는 방법을 개발하여야 할 필요성은 여전히 요구되는 실정이었다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 보다 효과적으로 대장암 전이 및 예후를 진단할 수 있는 방법을 개발하기 위해 예의 연구 노력한 결과, 스쿠알렌 에폭시다제의 발현 수준을 측정하여, 대장암 전이 및 예후를 보다 효과적으로 진단할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 스쿠알렌 에폭시다제(squalene epoxidase) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 대장암 전이 진단 또는 예후 예측용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는, 대장암 전이 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (a) 대장암이 발생한 개체로부터 분리된 시료에서 스쿠알렌 에폭시다제(squalene epoxidase) 유전자의 mRNA 수준 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 측정된 mRNA 수준 또는 이의 단백질 수준을 1기 또는 2기의 대장암이 발병한 대조군 시료의 mRNA 수준 또는 이의 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 대장암 전이의 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (a) 대장암이 발생한 개체로부터 분리된 시료에서 스쿠알렌 에폭시다제(squalene epoxidase) 유전자의 mRNA 수준 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 측정된 mRNA 수준 또는 이의 단백질 수준을 대장암으로 인해 사망한 대조군 시료의 mRNA 수준 또는 이의 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 대장암의 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 스쿠알렌 에폭시다제(squalene epoxidase) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 대장암 전이 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어, "스쿠알렌 에폭시다제 (squalene epoxidase, SqE)"는 산소와 NADPH를 사용하여 스쿠알렌 (squalene)을 2,3-옥시도스쿠알렌 (2,3-oxidosqualene)으로 산화시키는 효소이다. 상기 효소는 스테롤(sterol) 생합성에서 속도를 제한하는 효소 중 하나로서 스테롤(sterol) 생합성 경로에서 산소화 하는 단계를 촉매하는 것으로 알려져 있다. 또한, 스쿠알렌 에폭시다제는 SQLE 유전자에 의해 암호화된다.
스쿠알렌 에폭시다제는 다른 이름으로 스쿠알렌 모노옥시게나제(squalene monooxygenase, SqMO), SQLE 등으로 불리워지고 있다. 또한, 본 발명에서는 상기 스쿠알렌 에폭시다제는 SqE와 혼용될 수 있다. 이의 유전적 정보는 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있으며, 그 예로 미국 국립생물정보센터 (National Center for Biotechnology Information; NCBI)의 GenBank 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로 스쿠알렌 에폭시다제는 NCBI GenBank Accession No. NM_003129.3일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이와 같은 본 발명의 스쿠알렌 에폭시다제는 서열번호 1로 기재한 아미노산 서열뿐만 아니라 상기 서열과 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 특히 구체적으로는 97% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이러한 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 상기 각 단백질과 동일하거나 상응하는 효능을 나타내는 단백질을 나타내는 아미노산 서열이라면 제한없이 포함한다. 또한, 이러한 상동성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
아울러, 본 발명의 상기 각 단백질을 코딩하는 유전자는 상기 각 서열번호로 기재한 아미노산을 코딩하는 염기서열뿐만 아니라, 상기 서열과 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 98% 이상, 가장 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 염기 서열로서 실질적으로 상기 각 단백질과 동일하거나 상응하는 효능을 나타내는 단백질을 코딩하는 유전자 서열이라면 제한없이 포함한다. 또한 이러한 상동성을 갖는 염기서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 염기서열도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
본 발명에서 용어, "상동성"은 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드 모이티 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 하나의 모이티로부터 다른 하나의 모이티까지의 서열 간 상동성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 상동성은 서열정보를 정렬하고 용이하게 입수 가능한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 두 개의 폴리뉴클레오티드 분자 또는 두 개의 폴리펩티드 분자 간의 서열 정보를 직접 정렬하여 결정될 수 있다. 상기 컴퓨터 프로그램은 BLAST(NCBI), CLC Main Workbench(CLC bio), MegAlignTM(DNASTAR Inc) 등일 수 있으나, 상동성을 결정할 수 있는 프로그램이라면 제한 없이 이용할 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드 간 상동성은 상동 영역 간의 안정된 이중가닥을 이루는 조건하에서 폴리뉴클레오티드를 혼성화한 후, 단일-가닥-특이적 뉴클레아제로 분해시켜 분해된 단편의 크기를 결정함으로써 결정할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 스쿠알렌 에폭시다제는 대장암 전이시 발현이 감소하였으며, 또한 발현 감소에 따른 환자의 생존이 감소하는 것을 확인하였는바, 대장암 전이 진단 및 예후 예측에 유용하게 사용될 수 있음을 본 발명자들이 처음으로 규명하였다.
본 발명의 스쿠알렌 에폭시다제 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자는 스쿠알렌을 2,3-옥시도 스쿠알렌으로 산화시키는 활성 기능을 갖고 있는 한 인간을 포함한 다양한 포유류 유래의 스쿠알렌 에폭시다제 단백질, 이를 코딩하는 유전자 또는 이와 기능적으로 동등한 상동 단백질을 포함하는 개념이다.
본 발명의 스쿠알렌 에폭시다제 단백질은 이의 천연형 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 이의 상동단백질 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 상기 스쿠알렌 에폭시다제 단백질 또는 이의 상동단백질은 천연에서 추출하거나 합성될 수 있고, DNA 서열을 기본으로 하는 유전자 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다. 또한, 본 발명에서 스쿠알렌 에폭시다제 단백질을 코딩하는 유전자는 자연에서 분리되거나 인위적으로 합성 변형된 것일 수 있다.
본 발명의 용어 "단백질의 수준을 측정하는 제제"란, 시료에 포함된 표적 단백질의 수준을 측정하는 방법에 사용되는 제제를 의미한다.
상기 단백질의 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체, 또는 앱타머를 포함할 수 있다. 구체적으로 상기 제제는 웨스턴 블럿(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트 면역전기영동(rocket immunoelectrophoresis), 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining), 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 면역형광법(immunofluorescence), 면역크로마토그래피법(immunochromatography), FACS(fluorescenceactivated cell sorter analysis) 및 단백질 칩 분석법(protein chip technology assay) 등의 방법에 사용되는 항체를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 "항체"는 단백질 또는 펩티드 분자의 항원성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질성 분자를 의미한다. 이러한 항체는, 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함될 수 있다. 뿐만 아니라, 인간화 항체 등의 특수 항체를 포함할 수도 있다. 아울러, 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 될 수 있다.
상기 "앱타머"는 단일 가닥 올리고 뉴클레오티드를 의미하는 것으로, 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 말한다. 상기 앱타머는 그 염기 서열에 따라 다양한 3차원 구조를 가질 수 있으며, 항원-항체 반응과 같이 특정 물질에 대하여 높은 친화력을 가질 수 있다. 앱타머는 소정의 표적 분자에 결합함으로써 소정의 표적 분자의 활성을 저해할 수 있다.
본 발명의 앱타머는 RNA, DNA, 변형된(modified) 핵산 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 그 형태가 직쇄상 또는 환상(環狀)일 수 있으나 이들에 한정되지 아니한다. 본 발명의 앱타머는 스쿠알렌 에폭시다제에 대하여 사용될 수 있다. 상기 스쿠알렌 에폭시다제에 결합 활성을 갖는 앱타머는 각각의 염기 서열을 참조하여 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 공지의 방법에 따라 쉽게 제작할 수 있다.
본 발명의 용어 "mRNA 수준을 측정하는 제제"란, 시료에 포함된 표적 유전자의 발현여부를 확인하기 위하여, 상기 표적 유전자로부터 전사된 mRNA의 수준을 측정하는 방법에 사용되는 제제를 의미한다. 구체적으로 상기 제제는 RT-PCR, 정량 실시간 PCR(quantified real time PCR), 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(real time quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블럿팅(Northern blotting), DNA 칩 분석법 등의 방법에 사용되는 표적 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
상기 "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시될 수 있다.
한편, 상기 "프로브"는 스쿠알렌 에폭시다제 유전자와 상보적으로 결합할 수 있는 프로브가 될 수 있고, 상기 각 유전자와 상보적으로 결합할 수 있는 한, 상기 프로브의 뉴클레오티드 서열은 제한되지 않는다.
한편, 본 발명에서 상기 조성물은 p53 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 "mRNA 수준을 측정하는 제제" 및 "단백질 수준을 측정하는 제제"는 전술한 바와 같다.
본 발명의 용어 "p53"은 종양 억제 유전자로서 DNA 손상, 저산소증 및 종양 유전자의 비정상적 발현과 같은 여러 스트레스에 의해 일어나는 세포 주기 변화, 세포 사멸, DNA 손상복구 및 세포노화 등과 같은 반응을 조절하는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Vousden, Cell, 103:691-694, 2000; Vogelstein et al., Nature, 408:307-310, 2000). 또한, DNA 손상 후 일어나는 p53의 활성화는 p21, Bax, PUMA 및 MDM2와 같은 세포 주기 정체, DNA 손상복구, 세포 사멸에 관련된 유전자의 발현을 조절한다고 알려져 있다(Juven et al., Oncogene, 8:3411-3416, 1993; Barak et al., EMBO J, 12:461-468, 1993).
본 발명에서 p53은 대장암 전이시 발현이 감소하는바, 스쿠알렌 에폭시다제와 함께 대장암 전이를 더욱 정확하게 진단하는 데에 사용될 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 콜레스테롤을 처리한 대장암 세포에서 SqE와 p53의 단백질 발현량이 유의하게 감소됨을 확인하였다(도 4). 또한, 일 실시예에서는 SqE 발현 저하에 의한 p53 발현 감소를 확인하기 위하여, 웨스턴 블롯을 수행한 결과 siSqE 처리에 의한 p53 분해 유도자인 hdm2의 발현 증가 유도에 의한 p53의 단백질 발현량의 감소를 확인할 수 있었다(도 10).
이를 통해, 스쿠알렌 에폭시다제의 발현 억제에 의한 p53의 발현 감소가 대장암 전이의 진단 키트 제작을 위한 타겟이 될 수 있음을 알 수 있었다.
본 발명의 용어 "대장암 전이"란, 대장암의 종양세포가 이동하여 다른 장소에 정착하여 증식하는 것을 의미한다. 구체적으로, 대장암 세포는 정상세포와 달리 주위조직을 침범하면서 성장하기 때문에 혈관이나 림프관 등 튜브 형태의 구조물을 만나면 혈액이나 림프액 등을 타고 다른 곳으로 이동할 수 있다. 이렇게 이동하던 대장암 세포가 다른 장기나 조직에 자리를 잡으면 또다시 세포분열을 하면서 성장하게 되는데 이것을 대장암의 전이라고 한다.
본 발명의 용어 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 대장암의 전이 여부 또는 전이 가능성 여부를 확인하는 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 스쿠알렌 에폭시다제의 발현 저하에 의해 대장암 세포의 생존이 증가함을 확인하였고(도 7), p53의 발현이 억제되고, 대장암 세포의 전이능이 증가됨이 확인되었다 (도 10 및 도 11). 이에 본 발명자들은 스쿠알렌 에폭시다제의 발현 저하가 대장암 전이를 진단할 수 있는 타겟이 될 수 있을 것으로 판단하여 본 발명을 개발하게 되었다. 이는 종래 스쿠알렌 에폭시다제의 과발현을 통해 대장암을 진단하는 대장암 관련 분야에서 알려진 바와 반대되는 메커니즘에 해당한다. 또한, 본 발명에서의 SqE 및 p53의 발현 수준이 기존 임상에서 사용되고 있는 CAF, CA19-9보다 우수한 바이오마커임을 확인하기 위해 ROC 곡선 분석, 최적 컷-오프 값 (cut-off value)분석, 및 최대 유덴 인덱스 (maximum Youden index)에 의해 예측된 최적 컷-오프 값 분석을 수행한 결과, SqE는 임상에 사용되고 있는 CEA와 CA19-9보다 유의한 대장암 전이 진단 효율을 나타냄을 확인하였다. 이는 SqE가 대장암 전이 진단에 있어 높은 효율을 나타내는 바이오마커 임을 의미한다(도 20).
본 발명의 다른 하나의 양태는, 대장암 전이 진단용 조성물을 포함하는, 대장암 전이 진단용 키트를 제공한다. 구체적으로, 상기 키트는 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 본 발명의 스쿠알렌 에폭시다제 또는 p53 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는, 스쿠알렌 에폭시다제 또는 p53 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조구로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 DNA 칩 분석법을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. DNA 칩 분석용 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한, 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.
아울러, 본 발명의 키트는 스쿠알렌 에폭시다제 유전자로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하기 위한 단백질 칩 분석용 키트가 될 수 있는데, 상기 키트는 특별히 이에 제한되지 않으나, 항체의 면역학적 검출을 위하여 기재, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기 기재는 특별히 이에 제한되지 않으나 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 특별히 이에 제한되지 않으나 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(Alkaline Phosphatase)가 사용될 수 있으며, 형광물질은 특별히 이에 제한되지 않으나 FITC, RITC 등이 될 수 있고, 발색 기질액은 특별히 이에 제한되지 않으나 ABTS(2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 될 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는, (a) 대장암이 발생한 개체로부터 분리된 시료에서 스쿠알렌 에폭시다제(squalene epoxidase) 유전자의 mRNA 수준 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 측정된 mRNA 수준 또는 이의 단백질 수준을 1기 또는 2기의 대장암이 발병한 대조군 시료의 mRNA 수준 또는 이의 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 대장암 전이의 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.
또한, 상기 정보제공방법은 (a) 대장암이 발생한 개체로부터 분리된 시료에서 p53 유전자의 mRNA 수준 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 "스쿠알렌 에폭시다제", "p53" 및 "대장암 전이"는 전술한 바와 같다.
본 발명의 용어 "개체"란, 대장암이 발병되었음을 전제로 대장암이 전이되었거나 전이될 가능성이 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미할 수 있다. 상기 동물은 인간뿐만 아니라 이와 유사한 증상의 치료를 필요로 하는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 고양이 등의 포유동물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 스쿠알렌 에폭시다제(squalene epoxidase) 유전자의 mRNA 수준은 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(real time quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩 분석법(DNA chip technology assay)에 의하여 측정될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 스쿠알렌 에폭시다제, p53의 단백질 수준은 웨스턴 블랏(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radial immunodiffusion), 오우크테로니 면역 확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동(rocket immunoelectrophoresis), 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complement Fixation Assay), 면역형광법(immunofluorescence), 면역크로마토그래피법(immunochromatography), FACS 분석법(fluorescenceactivated cell sorter analysis) 및 단백질 칩 분석법(protein chip technology assay)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 이용하여 측정될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어 "대조군"이란, 대장암이 발병된 개체를 의미하는 것으로, 구체적으로는 대장암 세포가 다른 장기나 조직, 예를 들어 림프절 전이 또는 혈액 등으로 전이 되지 않은 대장암이 발병된 개체, 더욱 구체적으로는 1기 또는 2기의 대장암이 발병한 개체일 수 있다. 대장암은 애슬러-콜러 분류법(Astler-Coller staging system)이나 TNM 분류법을 바탕으로 병기를 1기에서 4기까지로 나눌 수 있다. 구체적으로 TNM법 분류법에 따라, 암세포가 점막하층 또는 근?층까지만 국한된 경우를 대장암 1기로 분류하고, 암세포가 장막하층을 뚫거나 림프절 전이없이 인접한 주위 장기까지 침윤한 경우를 대장암 2기로 분류할 수 있다 (국가암정보센터 http://www.cancer.go.kr).
본 발명의 용어 "시료"란, 대장암이 발병된 환자로부터 분리되어 스쿠알렌 에폭시다제 유전자의 발현수준을 측정하는 직접적인 대상을 의미하며, 구체적으로 상기 시료는 대장암 세포 또는 대장암 조직일 수 있다.
상기 정보제공방법은 상기 시료에서 측정한 스쿠알렌 에폭시다제, p53 단백질의 발현 수준이 정상 대조군 시료의 해당 단백질 발현 수준보다 낮은 경우, 대장암 전이로 판단하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는, (a) 대장암이 발생한 개체로부터 분리된 시료에서 스쿠알렌 에폭시다제(squalene epoxidase) 유전자의 mRNA 수준 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 측정된 mRNA 수준 또는 이의 단백질 수준을 대장암으로 인해 사망한 대조군 시료의 mRNA 수준 또는 이의 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 대장암의 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.
또한, 상기 정보제공방법은 (a) 대장암이 발생한 개체로부터 분리된 시료에서 p53 유전자의 mRNA 수준 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 "스쿠알렌 에폭시다제", "p53" 및 "대장암 전이"는 전술한 바와 같다.
본 발명의 용어 "대조군"이란, 대장암이 발병되어 사망한 개체를 의미하는 것으로, 구체적으로는 대장암 세포가 다른 장기나 조직, 예를 들어 림프절 전이 또는 혈액 등으로 전이되어 사망한 개체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 용어 "시료"란, 대장암이 발병되어 사망한 환자로부터 분리되어 스쿠알렌 에폭시다제 유전자의 발현수준을 측정하는 직접적인 대상을 의미하며, 구체적으로 상기 시료는 대장암 세포 또는 대장암 조직일 수 있다.
본 발명의 용어 "예후"란, 질환의 경과 및 사망 또는 생존의 결과를 미리 예측하는 행위를 의미한다. 보다 구체적으로, 예후 또는 예후 예측이란 질환의 경과는 환자의 생리적 또는 환경적 상태에 따라 달라질 수 있으며, 이러한 환자의 상태를 종합적으로 고려하여 치료 전/후 병의 경과를 예측하는 모든 행위를 의미하는 것으로 해석될 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 예후는 대장암의 치료 전/후, 질환의 경과 및 완치여부를 미리 예상하여 대장암 환자의 무병생존율 또는 생존율을 예측하는 행위로 해석될 수 있다. 예를 들어, "예후가 좋다"라고 예측하는 것은 치료여부에 관계없이 대장암 환자의 무병생존율 또는 생존율이 높은 수준을 나타내어, 대장암 환자가 치료될 가능성이 높다는 것을 의미하고, "예후가 나쁘다"라고 예측하는 것은 대장암 치료 후 환자의 무병생존율 또는 생존율이 낮은 수준을 나타내어, 대장암 환자로부터 암이 재발하거나 또는 대장암으로 인하여 사망할 가능성이 높다는 것을 의미한다. 일 예로, 기준점에서 스쿠알렌 에폭시다아제의 대장암 환자의 사망예후 진단률을 검증한 결과 64.43%로 확인되었으며, 이는 기존에 임상에서 사용되고 있는 CEA보다 높은 사망예후 진단률을 가짐을 확인하였다.
본 발명의 용어 "무병생존율"이란, 치료여부에 관계없이 환자가 암의 재발없이 생존할 수 있는 가능성을 의미한다.
본 발명의 용어 "생존율"이란, 치료여부에 관계없이 암이 재발하든 안하든 환자가 생존할 수 있는 가능성을 의미한다.
상기 정보제공방법은 상기 시료에서 측정한 스쿠알렌 에폭시다제 단백질의 발현 수준이 생존 대장암 환자 대조군 시료의 해당 단백질 발현 수준보다 낮은 경우, 대장암 예후가 나쁘다고 판단하는 것일 수 있다. 구체적으로 스쿠알렌 에폭시다제 단백질의 발현 수준이 생존 대장암 환자 대조군 시료의 해당 단백질 발현 수준보다 낮은 경우 대장암 환자 (예: 대장암이 발병된 환자, 대장암이 전이된 환자 또는 대장암 치료 후 재발한 환자 등)가 사망할 가능성을 예측할 수 있다. 일 예로, 스쿠알렌 에폭시다아제의 발현 정도가 0.01438±0.0071(최적 컷-오프 값 (cut-off value))인 대장암 환자의 생존가능성은 -0.002650±0.0062의 범위에 속하는 대장암 환자의 생존가능성에 비해 높음을 의미하나, 이에 제한되지 않는다. 반대로, 스쿠알렌 에폭시다아제의 발현 정도가 -0.002650±0.0062에 속하는 대장암 환자의 사망 가능성은 0.001438±0.0071에 속하는 대장암 환자의 사망가능성에 비해 유의하게 높음을 의미하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서는 대장암 환자의 예후 마커로서의 SqE와 p53의 활용성을 조사하기 위해, SqE, p53 및 이들의 조합의 ROC 곡선 분석, 최적 컷-오프 값 (cut-off value)분석, 및 최대 유덴 인덱스 (maximum Youden index)에 의해 예측된 최적 컷-오프 값 분석을 수행한 결과, SqE, p53 또는 SqE 및 p53의 조합에 의해 대장암 환자의 예후를 예측할 수 있음을 알 수 있었다.
본 발명은 스쿠알렌 에폭시다제(squalene epoxidase) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 조성물을 제공하여, 대장암 전이 또는 예후를 진단할 수 있다.
도 1은 농도별 콜레스테롤 처리에 의한 세포내부의 콜레스테롤 축적을 확인한 것이다.
도 2는 콜레스테롤 처리에 의한 대장암 세포의 이동능을 확인한 것이다.
도 3은 콜레스테롤 처리에 의한 대장암 세포의 상피-중간엽 이행유도 및 대장암 세포의 생존 증가를 확인한 것이다.
도 4는 콜레스테롤 처리에 의한 SqE 및 p53 발현 감소를 확인한 것이다.
도 5는 콜레스테롤에 의한 SqE 단백질의 분해 촉진을 확인한 것이다.
도 6은 siSqE 처리에 의한 대장암 세포 이동을 확인한 것이다.
도 7은 SqE 발현 저하에 의한 대장암 세포에서 상피-중간엽 이행 유도를 확인한 것이다.
도 8은 부착저해 세포배양 접시를 이용한 콜레스테롤 처리에 의한 대장암 세포의 생존 증가를 확인한 것이다.
도 9는 부착저해 세포배양 접시를 이용한 콜레스테롤 처리에 의한 대장암 세포의 생존 증가를 통계적으로 처리한 것이다.
도 10은 siSqE 처리에 의한 p53 발현 감소를 확인한 것이다.
도 11은 SqE 발현 감소에 의한 대장암 세포의 전이능 증가를 확인한 것이다.
도 12, 13, 14는 in vivo 루시퍼라제법을 이용한 shSqE 대장암 세포의 전이 정도를 확인한 것이다.
도 15는 마우스 모델에서 고콜레스테롤 섭취 및 SqE 발현 감소에 의한 대장암 전이 촉진을 확인한 것이다.
도 16은 마우스 모델에서 고콜레스테롤 섭취 및 SqE 발현 감소에 의한 암의 악성화를 확인한 것이다.
도 17는 인간 대장암 조직에서 대장암 진행에 따른 SqE, p53 및 GSK3β (serine9) 발현 변화를 확인한 것이다.
도 18은 ROC (Receiver Operating Characteristic)곡선을 이용한 SqE 및 p53의 대장암 진단 민감도 및 특이도 분석 결과이다.
도 19는 ROC (Receiver Operating Characteristic)곡선을 이용한 SqE의 대장암 환자 예후 민감도 및 특이도 분석 결과이다.
도 20은 ROC curve에 기반한 각 바이오마커의 대장암 전이진단 효율 비교 분석 결과이다.
도 21는 ROC curve에 기반한 각 바이오마커의 대장암 환자 예후진단 효율 비교 분석 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 콜레스테롤 처리에 의한 대장암 세포내 콜레스테롤 축적
1-1. 세포의 배양
콜레스테롤에 의한 SqE(squalene epoxidase) 및 관련 단백질들의 특이적 발현을 확인하고 상기 유전자의 기능을 확인하기 위하여 대장암 세포주인 HCT116 및 HT29을 배양하였다. HCT116은 DMEM-고 글루코스(Corning, USA)에 HT29은 RPMI-고 글루코스(Corning, USA)에서 배양하였으며, 상기 세포주들은 10% 우태아 혈청, 100mg/ml 스트렙토마이신, 그리고 100 IU/ml 엠피실린이 포함된 배지에서 배양하였다.
1-2. 세포내 콜레스테롤의 측정
세포내 콜레스테롤의 측정은 콜레스테롤과 결합하는 필린(filin) (Cayman, UK)을 사용하여 다음의 방법을 통해 조사하였다. 농도별로 콜레스테롤을 대장암 세포에 처리하고 3일 동안 배양한 후, 메탄올로 고정후 필린(filin) (filip III)을 반응 시켰다. 60분 동안 37℃에서 배양 후 초정밀 공초점 현미경을 이용하여 이미지를 얻은 후 프로그램 (Zen lite, Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 양적 계산을 수행하였다.
그 결과, 농도별 콜레스테롤 처리에 의한 세포내부의 콜레스테롤 축적을 확인하였다(도 1).
실시예 2: 콜레스테롤 처리에 의한 대장암 세포의 이동능 / 침윤능 증가
콜레스테롤 처리에 의한 대장암 세포 이동을 관찰하기 위하여 트랜스웰 (transwell)을 이용한 세포 이동실험을 수행하였다. 먼저 기공 크기 8μm의 트랜스웰 (Corning Incorporated Costar, USA)의 아래면을 2% 젤라틴 (Sigma-Aldrich, USA)으로 코팅한 다음 트랜스웰 삽입의 내부에 무혈청배지의 세포 부유액을 각각 첨가하였다. 이때 외부용기에는 20μM 콜레스테롤과 20% 혈청을 포함한 배지를 넣어주었다. 세포 부유액을 72 시간동안 배양하였고, 배양이 끝나면 삽입(insert)의 내면을 면봉으로 닦아 이동하지 않은 내피세포를 제거하였다. 아래쪽으로 이동한 세포의 수는 크리스탈 바이올렛 용액으로 염색한 후 200배 현미경 시야에서 계수한 후 도식화하여 비교하였다(도 2).
그 결과, 20μM 콜레스테롤 처리에 의한 유의한 대장암 세포의 침윤능, 이동능을 확인할 수 있었다.
실시예 3: 콜레스테롤 처리에 의한 대장암 세포의 상피- 중간엽 이행유도 및 대장암 세포의 생존 증가 확인
대장암 세포의 상피-중간엽 이행 및 SqE 단백질 분해를 확인하기 위해, 다음의 방법으로 수행하였다. 세포를 6 웰 플레이트에 심은 후 20μM 콜레스테롤을 매일 3일 동안 처리한 후 RIPA 버퍼 (Invitrogen, USA)을 이용하여 세포내 단백질을 모은 후 상피-중간엽 이행 표시자인 E-cahderin, N-cadherin, Viment과 GAPDH에 대한 항체를 이용하여 웨스턴 블롯 (western blot)을 수행하였다. 사용된 항체는 표 1과 같다.
항체 Catalog No. 회사
E-cadherin sc-21791 Santa Cruz
N-cadherin 4061s Cell Signaling Technology
Vimentin 5741s Cell Signaling Technology
GAPDH LF PA-0212 AbFrontier
그 결과, 20μM 콜레스테롤 처리에 의한 대장암세포의 상피-중간엽 이행 (E-cadherin의 발현 감소 및 N-cadherin, Vimenting의 발현 증가) 및 SqE 단백질의 분해를 확인할 수 있었다(도 3).
실시예 4: 콜레스테롤에 의한 SqE 및 p53의 발현 감소
4-1 콜레스테롤 처리에 의한 SqE 및 p53 발현 감소확인
콜레스테롤 처리에 의한 SqE 및 p53 발현 감소확인을 위해 6 웰 플레이트에 세포를 동일한 양으로 심은 후 10 (HCT116) 및 20 (HT29)μM 콜레스테롤을 시간별로 (0, 4, 12, 24, 48 시간) 처리 후 RIPA 버퍼 (Invitrogen, USA)을 이용하여 세포내 단백질을 모은 후 각각에 대한 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 시행하였다. 사용된 항체는 표 2와 같다.
항체 Catalog No. 회사
SQE sc-21791 Santa Cruz
E-cadherin sc-21791 Santa Cruz
GSK3 sc-377213 Santa Cruz
GAPDH LF PA-0212 AbFrontier
b-catein sc-7963 Santa Cruz
pGSK3b 9336s Cell Signaling Technology
pGSK3b sc-135653 Santa Cruz
hdM2 OP-46 Calbiochem
p53 sc-56180 Santa Cruz
p-p53 (S315) 2528s Cell Signaling Technology
p-p53 (S376) ab60021 Abcam
그 결과, 10, 20μM 콜레스테롤에 의한 대장암세포에서 유의한 SqE와 p53의 단백질 발현량의 감소를 확인할 수 있었으며, 또한, 상피-중간엽 이행의 표시자인 E-cadherin 또한 상위조절자인 GSK3β의 비활성화 및 β-catenin의 활성화를 통해 유의하게 발현이 감소됨을 관찰함으로써 콜레스테롤에 의한 대장암 세포의 상피-중간엽 이행 유도를 확인하였다(도 4).
4-2. 웨스턴 블럿을 이용한 콜레스테롤에 의한 SqE 단백질의 분해 촉진확인
대장암 세포에서 콜레스테롤에 의한 SqE 단백질의 분해 정도를 웨스턴 블럿을 기반을 두어 다음의 방법을 통해 확인하였다. 대장암 세포주을 6웰 플레이트에 접종하고 24 시간 후에 DMEM-고 글루코스 배지 조건에서 실시예 5-1에서 확립된 200nM siRNAs (siCont, siSqE)를 처리한 세포그룹과 함께 5% 지단백질 결핍 혈청 (lipoprotein deficient serum)과 20μg/ml 시클로덱스트린 (LPDS/CD) 배지 조건에서 20μM의 콜레스테롤을 세포에 시간별로 처리한 후, 세포를 RIPA 버퍼 (invitrogen, 미국)로 터트린 후 단백질을 모아서 SqE와 GAPDH에 대한 항체를 이용하여 웨스턴 블럿을 수행하였다.
4-3. 총 RNA 분리 및 역전사 반응물 (cDNA) 생성
상업적으로 판매되는 시스템인 RNeasy Total RNA 키트 (Nanohelix co., 한국)을 사용하여 대장암 세포에서 총 RNA를 추출하였다. 페놀-클로로포름법에 의하여 총 RNA만을 정제하였다. 이후, 1mg RNA를 주형으로 하고 올리고 dT를 프라이머로 하여 역전사 반응을 수행하였다 (Nanohelix, South Korea).
4-4. 반정량적 역전사 중합효소 연쇄반응 ( Semiquantative RT- PCR )
실시예 4-3에서 수행한 역전사 반응물 (cDNA) 및 표 3에 제시된 프라이머를 가지고 수행한 반정량적 역전사 중합효소 연쇄반응 (Semiquantative RT-PCR)의 조성 (10μl)은 다음과 같다: 2X premix PCR mixture (Nanohelix, 한국) 5μl, 프라이머 각 0.5μM, 주형 cDNA 1μl. 반정량적 역전사 중합효소 연쇄반응의 조건은 95℃에서 2분 30초간 초기변성 시행 후, 95℃ 20초, 58℃ 45초, 72℃ 30초간 증폭반응을 하였고, 72℃에서 5분간 증폭산물을 안정화시켰다. 도출된 PCR 결과물은 1% 아가로스 겔을 이용하여 확인하였다.
명칭 Accession 프라이머 염기서열 서열번호
E-cadherin XM_011525788 정방향 5’-CAACGACCCAACCCAAGAAT-3’ 4
역방향 5’-TCCGCCTCCTTCTTCATCAT-3’ 5
N-cadherin NM_004360 정방향 5’-ACAGTGGCAGCTGGACTTGA-3’ 6
역방향 5’-TCCCTTGGCTAATGGCACTT-3’ 7
Vimentin XM_011519649 정방향 5’-CCTTGAACGCAAAGTGGAAT-3’ 8
역방향 5’-GCTTCAACGGCAAAGTTCTC-3’ 9
TP53 NM_001276698.1 정방향 5’-CCTCACCATCATCACACTGC-3’ 10
역방향 5’-CCTCATTCAGCTCTCGGAAC-3’ 11
Squalene epoxidase NM_003129 정방향 5’-GCTTCCTTCCTCCTTCATCA-3’ 12
역방향 5’-ACACATTCGCCACCAAGTTT-3’ 13
GAPDH NM_001289746 정방향 5’-ACCATCTTCCAGGAGCGAGA-3’ 14
역방향 5’-AGTGATGGCATGGACTGTGG-3’ 15
그 결과, 20 μM 콜레스테롤 처리에 의한 시간별 유의한 SqE 단백질의 분해 및 소폭의 mRNA 발현 저하를 확인할 수 있었다(도 5).
실시예 5: SqE 발현 저하에 의한 대장암 세포의 이동능 / 침윤능 증가
5-1. SqE siRNA 제조
SqE 유전자의 발현 억제에 의한 세포 내 기능을 조사하기 위하여, SqE의 염기서열 (서열번호 1) 중에서 20개의 뉴클레오티드로 이루어진 siRNAs (서열번호 2 및 서열번호 3)을 제작하였다. SqE의 아미노산 서열은 서열번호 16으로 표시하였다.
5-2. SqE 발현 저하에 의한 대장암 세포 이동 실험
siSqE 처리에 의한 대장암 세포 이동을 관찰하기 위하여 트랜스웰 (transwell)을 이용한 세포 이동실험을 실시하였다. 먼저 기공 크기 8μm의 트랜스웰 (Corning Incorporated Costar, USA)의 아래면을 2% 젤라틴 (Sigma-Aldrich, USA)으로 코팅한 다음 트랜스웰 삽입의 내부에 무혈청 배지의 조건으로 200 nM siCont 또는 siSqE가 이틀 동안 처리된 세포 부유액을 각각 첨가하였다. 이때 외부용기에는 20% 혈청을 포함한 배지를 넣어주었다. 세포 부유액을 48시간 동안 배양하였고, 배양이 끝나면 삽입(insert)의 내면을 면봉으로 닦아 이동하지 않은 내피세포를 제거하였다. 아래쪽으로 이동한 세포의 수는 크리스탈 바이올렛 용액으로 염색한 후 200배 현미경 시야에서 계수한 후 도식화하여 비교하였다(도 6).
그 결과, siSqE 처리에 의한 유의한 대장암 세포의 침윤능, 이동능을 확인할 수 있었다.
실시예 6: SqE 발현 저하에 의한 대장암 세포의 상피- 중간엽 이행유도 및 대장암 세포 생존 증가 확인
6-1. 웨스턴 블럿법과 반정량적 역전사 중합효소 연쇄반응을 이용한 SqE 발현 저하에 의한 대장암 세포에서 상피- 중간엽 이행 유도 확인
대장암 세포의 상피-중간엽 이행을 확인하기 위해, 세포를 6 웰 플레이트에 심은 후 200 nM siSqE을 3일 동안 처리한 후 RIPA 버퍼 (Invitrogen, USA)을 이용하여 세포내 단백질을 모은 후 상피-중간엽 이행 표시자인 E-cahderin, N-cadherin, Viment과 GAPDH에 대한 항체를 이용하여 웨스턴 블럿과 실시예 4 (4-2)에 서술한 방법에 기초하여 반정량적 역전사 중합효소 연쇄반응을 수행하였다.
그 결과, SqE 발현 저해에 의한 대장암세포의 상피-중간엽 이행 (E-cadherin의 단백질, mRNA 발현 감소 및 N-cadherin, Viment의 단백질 및 mRNA의 발현 증가)를 확인할 수 있었다(도 7).
6-2 부착저해 세포배양 접시를 이용한 콜레스테롤 처리에 의한 대장암 세포의 생존 증가 확인
아노이키스(anoikis)는 세포사멸의 한 종류로 세포가 세포기질과의 부착이 되지 않거나 본래의 위치가 아닌 곳에 부착되어 있을 경우에 발생하는 세포 죽음으로 이러한 아노이키스가 잘 이루어지지 않게 되면 부유 상태에서의 세포가 생존하거나 본래의 기관이 아닌 곳에서의 생장이 가능하게 된다. 결과적으로, 암의 전이가 유도가 된다.
따라서, 콜레스테롤 처리에 의한 부유상태에서 대장암 세포의 생존 증가능을 확인하기 위해 대장암 세포를 부착저해 세포 배양 접시 (ultra low attachment plates, Corning, USA)에 배양 하며 동시에 20 μM 콜레스테롤을 매일 3일 동안 처리한 후 현미경으로 촬영하여 세포 생존을 확인하였다. 동시에 비교군으로 대장암 세포에 실시예 5 (5-1)에서 확립한 200 nM siRNAs를 처리한 후 동일한 조건에서 배양하며 세포 생존을 확인하였다(도 8).
6-3 부착저해 세포배양 접시를 이용한 콜레스테롤 처리에 의한 대장암 세포의 생존 증가의 통계적 확인
앞선 6-2에서 확인된 콜레스테롤 및 SqE에 대한 siRNA에 의한 대장암 세포의 생존증가를 통계적으로 확인하기 위해 MTT법을 기반으로 다음의 방법으로 수행하였다. 비부착성 플레이트에서 20 μM 콜레스테롤 또는 실시예 5 (5-1)에서 확립한 200 nM의 SqE에 대한 siRNA를 3일 동안 처리한 후 세포를 모아서 96 웰 플레이트로 옮긴 후 2mg/ml MTT를 처리한 후 2시간 동안 37에서 반응 시킨 후 DMSO로 반응을 중단시켰다. Microplate reader (570nm)로 흡광도를 읽은 후 퍼센트로 환산하여 세포의 사멸/생존을 확인하였다. 또한, 대조군으로 SqE의 활성저해제인 50 μM 터비나핀(Terbinafine)을 처리하여 동일한 방법으로 대장암 세포의 사멸/생존을 확인하였다(도 9).
그 결과, 거의 모든 세포가 사멸된 대조군에 비해 20 μM 콜레스테롤 (도 9A) 또는 200 nM siSqE (도 9B) 처리에 의한 대장암세포의 유의한 생존 증가를 확인할 수 있었다. 하지만, SqE 활성 저해 (도 9C)에 의한 대장암 세포의 유의한 생존은 확인할 수 없었다.
실시예 7: SqE 발현 저해에 의한 p53의 발현 감소
SqE 발현 저하에 의한 p53 발현 감소확인을 위해 6 웰 플레이트에 세포를 동일한 양으로 심은 후 200 nM siCont 및/또는 siSqE를 3일 동안 처리한 후 RIPA 버퍼 (Invitrogen, USA)을 이용하여 세포내 단백질을 모은 후 각각에 대한 항체를 이용하여 웨스턴 블롯법을 시행하였다.
그 결과, 200 nM siSqE 처리에 의한 p53 분해 유도자인 hdm2의 발현 증가 유도에 의한 p53의 단백질 발현량의 감소를 확인할 수 있었으며 또한, 상피-중간엽 이행의 표시자인 E-cadherin 또한 상위조절자인 GSK3β의 비활성화 (phospho-ser9 GSK3β 증가)및 β-catenin의 활성화를 통해 유의하게 발현이 감소됨을 관찰함으로써 콜레스테롤에 의한 대장암 세포의 상피-중간엽 이행 유도를 확인할 수 있었다(도 10).
실시예 8: SqE 발현 감소에 의한 대장암 전이 촉진 확인
SqE 발현 감소에 의한 대장암 세포의 전이능 증가 확인을 위해 안정적으로 SqE의 발현이 저해되는 대장암 세포 (shSqE)를 다음의 방법에 따라 구축하였다. SqE의 안정적 발현 저해를 위해, HCT11, HT29 대장암 세포를 SqE Mission shRNA Lentiviral Transduction Particles (Sigma: TRCN0000046155)와 Mission pLKO.1-puro Non-Target shRNA Control Transduction Particles (Sigma: SHC016V)에 감염시켰다. 이후, 인간 대장암 세포의 생체내 이동을 관찰하기 위해 루시퍼라제 백터(Luciferase vector)인 4 μg PGL4.17를 리포펙타민(lipofectamine) 3000 (invitrogen, USA)을 이용하여 세포에 처리하였다. 이후, 10 μg/ml 퓨로마이신(puromycin)과 0.3 mg/ml G418로 세포를 약 3주간 콜로니를 선택 및 세포를 증식시켰다. 일차적으로, 트랜스웰법을 이용하여 SqE 발현 저해에 의한 대장암 세포의 이동 및 침윤을 확인하였으며, 이차적으로 반정량적 역전사 중합효소 연쇄반응(semi-quantative RT-PCR)법을 이용하여 대장암 세포의 SqE의 발현 저해 정도를 확인하였다. 마지막으로 정량적 역전사 중합효소 연쇄반응 (quantative RT-PCR)법을 이용하여 대장암 세포내 삽입된 PGL4.17의 발현 정도와 루시퍼라제 활성 정도를 확인하였다(도 11).
그 결과, SqE의 안정적인 발현 저해 및 그에 따른 유의한 대장암 세포의 이동능 및 침윤능 증가를 HCT116(도 11A), HT29(도 11B) 세포 모두에서 확인하였으며, 또한, 두 세포 모두 유사한 정도의 PGL4.17의 발현 및 루시퍼라제 활성을 나타냄을 확인하였다.
실시예 9: 동물모델에서의 SqE 발현 감소에 의한 대장암 전이 촉진 확인
9-1. in vivo 루시퍼라제법을 이용한 shSqE 대장암 세포의 전이 정도 확인
앞선 실시예 8에서 확립된 HCT116기반 shCont/shSqE 세포를 실험동물의 등 (Subcutaneou)과 대장 (Orthotopic)에 주입한 후 100일 동안 대조군 세포 (shCont)와 비교해 shSqE 대장암 세포의 전이 정도를 in vivo 루시퍼라제법을 이용하여 모니터링 하였다 (IVIS Lumina II, Caliper Life Science). 또한, 100일 후, 폐, 간을 적출하여 암의 진행정도를 Hematoxylin/eosin 염색법을 이용하여 확인하였다. 그 외에, 암세포의 in vivo 아노이키스 저항능을 확인하기 위해 폐조직을 이용하여 caspase-3 (세포사 마커) 및 MCM-7 (암세포의 세포증식 마커)에 대한 항체를 이용하여 면역형광염색법 및 초정밀 공초점 형광현미경을 이용하여 확인하였다(도 12, 도 13, 도 14).
그 결과, SqE의 발현이 안정적으로 저해된 대장암 세포 (shSqE)의 전이가 대조군 대장암 세포 (shCont)의 전이에 비해 유의하게 증가됨을 확인할 수 있었으며 또한, shSqE가 주입된 실험동물의 간과 폐에서 유의한 암세포의 증가를 확인하였다. 이외에도, shSqE 세포가 주입된 실험동물의 폐 조직을 염색한 결과, 유의한 암세포의 증가 및 세포사의 감소를 확인함으로써, SqE 발현 저해에 의한 대장암 세포의 유의한 in vivo 세포 생존 증가를 확인할 수 있었다.
9-2: HT29 세포를 이용하여 구축된 마우스 모델에서 고콜레스테롤 섭취 및 SqE 발현 감소에 의한 대장암 전이 촉진 확인
마우스를 고콜레스테롤 사료 및 대조 사료로 한달 동안 섭취시킨 후 마우스 모델 구축 직전에 혈중 콜레스테롤을 측정한 결과 고콜레스테롤 섭취 쥐의 혈중 콜레스테롤 양이 유의하게 증가하였음을 확인하였다 (200mg/dl, 도 15가). 또한, 실시예 8에서 확립된 HT29기반 shCont/shSqE cells을 마우스의 대장 (Orthotopic)에 주입하고 고콜레스테롤 사료 및 대조 사료를 120일 동안 섭취하게 한 후, 대조군 세포 (shCont)와 비교해 shSqE 대장암 세포의 전이 정도를 in vivo luciferase 법을 이용하여 모니터링하였다 (IVIS Lumina II, Caliper Life Science). 그 결과, 암세포의 유의한 전이를 확인하였다 (도 15나-라).
또한, 120일 후, 폐, 간을 적출하여 암의 진행 정도를 Hematoxylin/eosin 염색법을 이용하여 조사하였다 (도 15마). 그 결과, 암의 형성을 확인하였다.
또한, 각 그룹의 생존을 확인한 결과 대조사료 섭취 및 shCont이 주입된 쥐에 대비해서 나머지 그룹들의 생존률이 유의하게 감소함을 확인하였다 (도 15바). 이는 고콜레스테롤 섭취에 의한 SqE 발현 감소가 대장암의 전이를 촉진시킴을 의미한다 (도 15).
9-3: HT29 세포를 이용하여 구축된 마우스 모델에서 고콜레스테롤 섭취 및 SqE 발현 감소에 의한 암의 악성화 및 혈중 암세포 증가 확인
실시예 9-2에서 확립된 쥐의 폐 조직을 적출하여 암의 진행 정도를 Hematoxylin/eosin 염색법을 이용하여 확인 한 결과, shCont/대조군 사료 섭취군에 비해 고콜레스테롤 섭취 또는 SqE 발현감소 그룹에서 유의한 암 생성이 확인되었다(도 16가). 또한 암세포의 침윤을 나타내는 Vimentin의 유의한 증가가 확인되었다 (도 16나). 그 외에도 고콜레스테롤 섭취 또는 SqE 발현감소 그룹에서 암세포 표시자인 Minichromosome maintenance complex component 7 (MCM7)의 증가 및 Histone H2A.X와 세포사멸 표시자인 caspase-3 (C3)의 감소에 의한 암세포의 생존 증가 및 세포 사멸 저해가 확인되었다 (도 16다-라). 또한, 유의한 대장암 세포 표시자인 CUB domain-containing protein 1 (CDCP1)의 존재를 고콜레스테롤 섭취 그룹과 SqE 발현 감소 그룹에서 확인하였다 (도 16마).
이는 고콜레스테롤 섭취에 의한 SqE 발현 감소에 의한 혈중 암세포의 증가에 의한 암의 악성화가 촉진됨을 의미한다 (도 16).
실시예 10: 대장암 진행에 따른 SqE와 p53의 유의한 발현 저해 확인
대장암 진행에 따른 SqE와 p53 발현 변화를 확인하기 위해, 인간 대장암 마이크어레이 슬라이드 (CO702, CO803, US Biomax, USA)를 구입하여 면역형광염색법 및 초정밀 공초점 현미경을 이용하여 조직 촬영을 수행한 후 분석 프로그램 (Zen lite, Germany)을 이용하여 환자들의 대장암 진행정도에 따라 SqE 및 p53의 발현 변화 및 동시 위치성 (co-localization)에 대해 조사하였다(표 4 및 표 5).
Figure 112017111433634-pat00001
Figure 112017111433634-pat00002
Figure 112017111433634-pat00003
종양의 경계부는 대장암의 독립적인 예후 인자로 인정받지 못하고 있으나, 침윤성 성장을 보이는 종양의 침습면에서 5개 미만의 암세포군들 (tumor budding)이 중배율 (x250배) 시야에서 10개 이상 관찰될 때는 유의하게 예후가 나쁘다고 보고되고 있다.
형광면역염색법과 초정밀 공초점 형광현미경을 이용하여 각 조직에서 SqE, p53의 발현 정도를 분석한 결과, low tumor budding에 비해 high tumor budding, 즉, 대장암의 진행정도가 악성으로 갈수록 유의하게 SqE (도 17A) 및 p53 (도 17B) 발현이 감소됨을 확인할 수 있었다. 또한, SqE와 p53의 해리도가 높아질수록 GSK3β의 Ser9 인산화 (pSer9-GSK3β) 정도가 높아짐을 알 수 있었다 (도 17C 및 도 17D).
이를 통해, 대장암의 악성으로의 진행 정도 즉, 대장암 전이 정도에 따라 유의하게 SqE와 p53의 발현이 감소됨을 확인할 수 있었다.
실시예 11: 조직 마이크로 어레이 (Tissue microarray ; TMA ) 이미지분석에 의한 SqE 및 p53의 발현 분석
대장암 조직, 대장암 기원 전이 조직, 및 정상 조직으로 이루어진 TMA 슬라이드를 US Biomax로부터 구매하고 SqE와 p53의 항체를 이용하여 형광 면역염색화학적 기법을 통해 염색한 후 촛점형광현미경 관찰 (x200)을 수행하여 SqE와 p53의 발현패턴을 분석하였다. 각 단백질의 양적 발현 분석은 Carl Zeiss에서 제공하는 ZEN (blue edition)을 이용하여 수행하였다. 이후 획득한 값은 Global equalization을 통해 변환 후 GraphPad Prism을 이용하여 이후 통계분석을 수행하였다 (Idikio et al., International Journal of Clinical Experimental Pathology 2011; 4:505-512) (표 6).
Figure 112017111433634-pat00004
Figure 112017111433634-pat00005
Figure 112017111433634-pat00006
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Figure 112017111433634-pat00011
실시예 12: SqE 및 p53의 대장암 전이 진단 민감도 및 특이도 분석
12-1: ROC (Receiver Operating Characteristic)곡선을 이용한 SqE 및 p53의 대장암 전이 진단 민감도 및 특이도 분석
대장암 환자의 전이 진단 마커로서의 SqE와 p53의 활용성을 조사하기 위해, GraphPad Prism을 이용하여 실시예 11의 표 6 데이터 (원발암 vs 전이암)로부터 ROC 곡선 분석을 수행하였다.
그 결과 SqE의 AUC(Area Under the Curve) 값은 0.7101 (95% CI: 0.6174-0.8029)로 p53의 0.5827 (95% CI: 0.4619-0.7035) 보다 더 높게 나타났다. 또한 2종 단백질의 조합 (SqE+p53) AUC값은 0.6530 (95% CI: 0.5783-0.7276)로 확인되었다. 이는 SqE 단독 또는 SqE 및 p53의 조합, p53 단독에 의해 대장암의 전이 여부를 진단할 수 있음을 의미한다 (도 18).
12-2: SqE 및 p53의 최적 컷- 오프 값 (cut-off value)에 기초한 대장암 전이 진단
실시예 11의 표 6 데이터 (원발암 vs 전이암)로부터 SqE 및 p53의 최적 컷-오프 값 (cut-off value)을 계산하여 SqE 및 p53의 최적 컷-오프 값 (cut-off value)에 기초한 대장암 전이 진단 효율을 확인하였다.
그 결과, 하기 표 7에 도시한 바와 같이, 대장 전이암에서 SqE의 높은 민감도를 확인하였다 (86.96%). 이와는 달리 p53에서는 높은 특이도를 확인하였으며 (94.38%), SqE+p53의 경우 72.1%의 높은 민감도가 확인되었다. 이러한 결과는 SqE 또는 p53 단독이 각각 민감도와 특이도에서 대장암 전이 예후 (prognotics marker)에 더욱 특이적임을 의미한다.
대장 전이암 SqE SqE/p53 p53
민감도 (sensitivity, %) 86.96
(0.7668-0.9386)		 72.07
(0.6276-0.8017)		 7.143
(0.01498-0.1948)
특이도
(specificity, %)		 12.36
(0.0634-0.2104)		 28.09
(0.2162-0.3530)		 94.38
(0.8737-0.9815)
12-3: 최대 유덴 인덱스 (maximum Youden index)를 이용한 SqE 및 p53의 대장암 전이 진단 민감도 및 특이도 분석
SqE, p53 및 SqE+p53의 대장암 전이 진단 지표로서의 정확도를 평가하기 위하여, 실시예 11의 표 6 데이터 (원발암 vs 전이암)로부터 최대 유덴 인덱스 (maximum Youden index)에 의해 예측된 최적 컷-오프 값에 따른 SqE, p53 및 SqE+p53의 대장암 전이 진단의 민감도 및 특이도 (%)를 확인하였다.
그 결과, 하기 표 8에 나타낸 바와 같이, SqE의 민감도는 59.4%, 특이도는 91%로 나타났고, 이와는 달리 p53의 민감도는 64.3%, 특이도는 71.9%로 나타났다. 그리고 SqE와 p53을 조합하였을 때에는 민감도 64%, 특이도 79.2%로 나타났다. 이는 SqE 또는 SqE+p53 조합이 p53 단독에 비하여 대장암 전이 진단 특이성이 높은 것을 의미한다.
대장 전이암 SqE SqE/p53 p53
Y-index 0.5043 0.4374 0.3732
민감도 (sensitivity, %) 59.42
(0.4837-0.7240)		 63.96
(0.5430-0.7286)		 64.29
(0.4803-0.7845)
특이도
(specificity, %)		 91.01
(0.8305-0.9604)		 79.21
(0.7251-0.8492)		 71.91
(0.6138-0.8093)
실시예 13: SqE의 대장암 환자 예후 민감도 및 특이도 분석
13-1: ROC (Receiver Operating Characteristic)곡선을 이용한 SqE의 대장암 환자 예후 민감도 및 특이도 분석
대장암 환자의 예후 마커로서의 SqE와 p53의 활용성을 조사하기 위해, 실시예 11의 표 6 데이터 (대장암 환자 중 생존환자 vs 사망환자)로부터 GraphPad Prism을 이용하여 ROC 곡선 분석을 수행하였다.
그 결과 SqE의 AUC 값은 0.6443 (95% CI (confidence interval): 0.5030-0.7856)로 p53의 AUC 값인 0.6131 (95% CI: 0.4291-0.7971) 보다 높게 나타났다. 또한 2종 단백질의 조합 (SqE+p53) AUC값은 0.6261 (95% CI: 0.5178-0.7344)로 확인되었다. 이는 SqE 단독 또는 SqE 및 p53의 조합에 의해 대장암 환자의 예후를 예측할 수 있음을 확인하였다 (도 19).
13-2: SqE 및 p53의 최적 컷- 오프 값 (cut-off value)에 기초한 대장암 환자 예후 진단
실시예 11의 표 6 데이터 (대장암 환자 중 생존환자 vs 사망환자)로부터 SqE 및 p53의 최적 컷-오프 값 (cut-off value)을 계산하여 SqE 및 p53의 최적 컷-오프 값 (cut-off value)에 기초한 대장암 환자 예후 민감도와 특이도를 조사하였다.
그 결과, 하기 표 9에 기재한 바와 같이, 대장암 환자 예후 진단에서 SqE의 높은 민감도를 확인하였다 (64.3 %). 이와는 달리 p53의 예후 진단 특이도는 100 %였으며, SqE+p53의 경우 예후진단 특이도는 96.88 %로 확인되었다. 이러한 결과는 SqE 또는 p53 단독이 각각 민감도와 특이도에서 대장암 환자 예후 (prognotics marker)에 더욱 특이적임을 의미한다.
대장암 예후 SqE SqE/p53 p53
민감도
(95% CI, %)		 64.29
(0.4803-0.7845)		 3.571
(0.007427-0.1008)		 2.381
(0.0006026-0.1257)
특이도
(95% CI, %)		 31.25
(0.1102-0.5866)		 96.88
(0.8378-0.9992)		 100.0
(0.7941-1.000)
13-3: 최대 유덴 인덱스 (maximum Youden index)를 이용한 SqE 및 p53의 대장암 환자 예후 민감도 및 특이도 분석
SqE, p53 및 SqE+p53의 대장암 환자 예후 지표로서의 정확도를 평가하기 위하여, 실시예 11의 표 6 데이터 (대장암 환자 중 생존환자 vs 사망환자)로부터 최대 유덴 인덱스 (maximum Youden index)에 의해 예측된 최적 컷-오프 값에 따른 SqE, p53 및 SqE+p53의 대장암 환자 예후 민감도 및 특이도 (%)를 조사하였다.
그 결과, 하기 표 10에 나타낸 바와 같이, SqE의 민감도는 52.4%, 특이도는 93.8%로 나타났고, 이와는 달리 p53의 민감도는 97.6%, 특이도는 43.8%로 나타났다. 그리고 SqE와 p53을 조합하였을 때에는 민감도 45.2%, 특이도 81.3%로 나타났다. 이는 SqE 단독 또는 SqE+p53 조합이 대장암 환자 예후 특이성을, p53 단독이 민감성을 가지는 것을 의미한다.
대장암 예후 SqE SqE/p53 p53
Y-index 0.461 0.265 0.414
민감도
(95% CI, %) 		52.38
(0.3642-0.6800)		 45.24
(0.3434-0.5648)		 97.62
(0.8743-0.9994)
특이도
(95% CI, %)		 93.75
(0.6977-0.9984)		 81.25
(0.6356-0.9279)		 43.75
(0.1975-0.7012)
실시예 14: 조직 마이크로 어레이 (Tissue microarray ; TMA ) 이미지분석에 의한 임상에서 사용되고 있는 CAF , CA19-9와 SqE , p53의 발현 패턴 분석
US Biomax로부터 여러 종류의 대장암, 전이암, 정상조직으로 이루어진 TMA 슬라이드 (CO953)를 구매한 후, 실시예 11에서 제시된 방법을 이용하여 carcinoembryonic antigen (CEA), carbohydrate antigen (CA19-9), SqE, p53의 항체를 이용하여 동일한 조건하에 반응하고 발현 패턴을 분석하였다. 이후 획득한 값은 Global equalization을 통해 변환 후 GraphPad Prism을 이용하여 이후 통계분석을 수행하였다 (표 11).
Figure 112017111433634-pat00012
Figure 112017111433634-pat00013
실시예 15: CEA , CA-19-9 및 SqE , p53의 대장암 전이 진단 민감도 및 특이도 비교분석
15-1: ROC (Receiver Operating Characteristic)곡선을 이용한 CEA , CA-19-9 및 SqE , p53의 대장암 전이 진단 민감도 및 특이도 비교분석
대장암 전이 진단 마커로서의 SqE와 p53의 활용성을 조사하기 위해, 실시예 14의 표 11 데이터 (원발암 vs 전이암)를 사용하여 ROC 곡선 분석을 수행하고 임상에서 사용되고 있는 CEA 및 CA19-9와의 전이 진단효율을 비교하였다.
그 결과, CEA의 AUC 값은 0.8867 (95% CI (confidence intervals): 0.8144-0.9590), CA19-9의 AUC값은 0.8075 (95% CI: 0.7140-0.9010)이었으며, SqE의 AUC 값은 0.9983 (95% CI (confidence intervals): 0.9938-1.003), p53의 AUC 값은 0.5208 (95% CI: 0.3734-0.6682)로 나타났다. 즉, SqE는 임상에 사용되고 있는 CEA와 CA19-9보다 유의한 대장암 전이 진단 효율을 나타냈다. 이는 SqE가 대장암 전이 진단에 있어 높은 효율을 나타내는 바이오마커 임을 의미한다 (도 20).
15-2: CEA , CA19-9 및 SqE , p53의 최적 컷- 오프 값 (cut-off value)에 기초한 대장암 전이 진단 효율 비교
실시예 14의 표 11 데이터 (원발암 vs 전이암)로부터 CEA, CA19-9, SqE, p53의 최적 컷-오프 값 (cut-off value)을 계산하여 CEA, CA19-9, SqE, p53의 최적 컷-오프 값 (cut-off value)에 기초한 대장암 전이 진단 효율을 확인하였다.
그 결과, 하기 표 12에 기재한 바와 같이, 임상에서 사용되고 있는 CEA, CA19-9와 SqE에서 높은 민감도 (80%, 70%, 100%) 및 높은 특이도 (83.3%, 80%, 88.3%)를 확인하였으며, 이와 비교하여 p53에서는 낮은 민감도 (40%)와 높은 특이도 (68.3%)를 확인하였다. 즉, SqE는 임상에서 사용되고 있는 바이오마커보다 유의하게 높은 민감도와 특이도를 나타냈다. 이는 SqE가 대장암 전이진단에 있어 높은 진단 효율을 나타내는 바이오마커 임을 의미한다 (표 12).
대장 전이암
CEA 민감도 (95% CI, %) 80.0 (0.5634-0.9427)
특이도 (95% CI, %) 83.33 (0.7148-0.9171)
CA19-9 민감도 (95% CI, %) 70.0 (0.4572-0.8811)
특이도 (95% CI, %) 80.0 (0.6767-0.8922)
SqE 민감도 (95% CI, %) 100 (0.8316-1.000)
특이도 (95% CI, %) 88.33 (0.7743-0.9518)
p53 민감도 (95% CI, %) 40.0(0.1912-0.6395)
특이도 (95% CI, %) 68.33(0.5504-0.7974)
15-3: 최대 유덴 인덱스 (maximum Youden index)를 이용한 CEA , CA19-9 및 SqE, p53의의 대장암 전이진단 민감도 및 특이도 분석
CEA, CA19-9, SqE, p53의 대장암 전이 진단 지표로서의 정확도를 평가하기 위하여, 실시예 14의 표 11 데이터 (원발암 vs 전이암)로부터 최대 유덴 인덱스 (maximum Youden index)에 의해 예측된 최적 컷-오프 값에 따른 CEA, CA19-9 및 SqE, p53의 대장암 전이 진단의 민감도 및 특이도 (%)를 확인하였다.
그 결과, 하기 표 13에 나타낸 바와 같이, SqE는 임상에서 사용되고 있는 CEA와 CA19-9보다 유의하게 높은 Y-index, 민감도, 특이도를 나타냈다. 이와는 달리, p53은 다른 바이오마커에 비해 낮은 Y-index 및 민감도와 특이도를 가지는 것으로 확인되었다. 즉, SqE는 임상에서 사용되고 있는 바이오마커보다 유의하게 높은 Y-index, 민감도와 특이도를 나타냈다. 이는 SqE가 임상적으로 높은 대장암 전이진단 효율을 가지는 바이오마커임을 의미한다 (표 13).
대장 전이암
CEA 민감도 (95% CI, %) 95.0 (0.7513-0.9987)
특이도 (95% CI, %) 75 (0.6214-0.8528)
Y-index 70
CA19-9 민감도 (95% CI, %) 90.0(0.6830-0.9877)
특이도 (95% CI, %) 73.33(0.6034-0.8393)
Y-index 63.33
SqE 민감도 (95% CI, %) 100 (0.8316-1.000)
특이도 (95% CI, %) 76.67 (0.6396-0.8662)
Y-index 76.67
p53 민감도 (95% CI, %) 45.0 (0.2306-0.6847)
특이도 (95% CI, %) 58.33 (0.4488-0.7093)
Y-index 3.33
실시예 16: CEA , CA-19-9 및 SqE , p53의 대장암 환자 예후 비교분석
16-1: ROC (Receiver Operating Characteristic)곡선을 이용한 CEA , CA-19-9 및 SqE , p53의 대장암 환자 사망진단 비교분석
대장암 환자 예후 마커로서의 SqE와 p53의 활용성을 조사하기 위해, 실시예 14의 표 11 데이터(생존 vs 사망)를 사용하여 ROC 곡선 분석을 수행하고 임상에서 사용되고 있는 CEA 및 CA19-9와의 예후를 비교하였다.
그 결과, CEA의 AUC 값은 0.6220 (95% CI (confidence intervals): 0.4653-0.7788), CA19-9의 AUC값은 0.5818 (95% CI: 0.4099-0.7538)이었으며, SqE의 AUC 값은 0.6443 (95% CI (confidence intervals): 0.5030-0.7856), p53의 AUC 값인 0.6414 (95% CI: 0.4903-0.7924)로 나타났다. 즉, SqE와 p53는 임상에서 사용되는 CEA와 CA19-9보다 높게 대장암 환자의 예후를 예측할 수 있음을 확인하였다. 이는 SqE와 p53이 대장암 환자의 예후를 예측함에 있어 높은 효율을 나타내는 바이오마커 임을 의미한다 (도 21).
16-2: CEA , CA19-9 및 SqE , p53의 최적 컷- 오프 값 (cut-off value)에 기초한 대장암 환자 예후 진단 비교
실시예 14의 표 11 데이터 (생존 vs 사망)로부터 CEA, CA19-9 및 SqE, p53의 최적 컷-오프 값 (cut-off value)을 계산하여 CEA, CA19-9 및 SqE, p53의 최적 컷-오프 값 (cut-off value)에 기초한 대장암 환자 예후 민감도와 특이도를 조사하였다.
그 결과, 대장암 환자에서 CEA, CA19-9, SqE, p53의 사망진단효율을 확인하였다. 그 결과, 하기 표 14에 기재한 바와 같이, 임상에서 사용되고 있는 CEA, CA19-9와 SqE, p53에서 유의한 민감도 (69%, 64%, 52%, 50%)를 확인하였다. 또한, CEA, CA19-9에 비해 SqE와 p53의 높은 특이도 (88%, 81%)를 확인하였다. 이러한 결과는 SqE가 임상에서 사용되고 있는 바이오마커보다 유의하게 높은 특이도를 가지며, 대장암 환자 예후 예측에 있어 유의한 진단 효율을 가짐을 의미한다 (표 14).
대장암 환자 예후 예측
CEA 민감도 (95% CI, %) 69.05(0.5291-0.8238)
특이도 (95% CI, %) 68.75(0.4134-0.8898)
CA19-9 민감도 (95% CI, %) 64.29 (0.4803-0.7845)
특이도 (95% CI, %) 56.25 (0.2988-0.8025)
SqE 민감도 (95% CI, %) 52.38 (0.3642-0.6800)
특이도 (95% CI, %) 87.50 (0.6165-0.9845)
p53 민감도 (95% CI, %) 50.0(0.3419-0.6581)
특이도 (95% CI, %) 81.25(0.5435-0.9595)
16-3: 최대 유덴 인덱스 (maximum Youden index)를 이용한 CEA , CA19-9 및 SqE, p53의 대장암 환자 예후 민감도 및 특이도 분석
CEA, CA19-9, SqE, p53의 대장암 환자 사망 진단 지표로서의 정확도를 평가하기 위하여, 실시예 14의 표 11 데이터 (생존 vs 사망)로부터 최대 유덴 인덱스 (maximum Youden index)에 의해 예측된 최적 컷-오프 값에 따른 CEA, CA19-9 및 SqE, p53의 대장암 환자 예후 민감도 및 특이도(%)를 조사하였다.
그 결과, 하기 표 15에 나타낸 바와 같이, SqE는 임상에서 사용되고 있는 CEA와 CA19-9와 유사한 Y-index를 나타냈지만, 민감도는 유의하게 높은 것으로 확인되었다. 이와는 달리, p53은 다른 바이오마커에 비해 낮은 Y-index 및 특이도를 나타냈다. 이는 SqE는 대장암 환자 사망 예후 예측에 있어 임상적으로 높은 진단 효율을 가지는 바이오마커임을 의미한다 (표 15).
대장암 환자 예후 예측
CEA 민감도 (95% CI, %) 45.24 (0.2985-0.6133)
특이도 (95% CI, %) 68.75 (0.4134-0.8898)
Y-index 13.99
CA19-9 민감도 (95% CI, %) 45.24(0.2985-0.6133)
특이도 (95% CI, %) 68.75(0.4134-0.8898)
Y-index 13.99
SqE 민감도 (95% CI, %) 61.9 (0.4564-0.7643)
특이도 (95% CI, %) 50.0(0.2465-0.7535)
Y-index 11.9
p53 민감도 (95% CI, %) 57.14 (0.4096-0.7228)
특이도 (95% CI, %) 37.50 (0.1520-0.6457)
Y-index -0.0536
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY <120> A composition for diagnosing colon cancer metastasis or predicting the same, and use thereof <130> KPA161140-KR-P1 <150> KR 10-2016-0148930 <151> 2016-11-09 <160> 16 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1725 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgtggactt ttctgggcat tgccactttc acctattttt ataagaagtt cggggacttc 60 atcactttgg ccaacaggga ggtcctgttg tgcgtgctgg tgttcctctc gctgggcctg 120 gtgctctcct accgctgtcg ccaccgaaac gggggtctcc tcgggcgcca gcagagcggc 180 tcccagttcg ccctcttctc ggatattctc tcaggcctgc ctttcattgg cttcttctgg 240 gccaaatccc cccctgaatc agaaaataag gagcagctcg aggccaggag gcgcagaaaa 300 ggaaccaata tttcagaaac aagcttaata ggaacagctg cctgtacatc aacatcttct 360 cagaatgacc cagaagttat catcgtggga gctggcgtgc ttggctctgc tttggcagct 420 gtgctttcca gagatggaag aaaggtgaca gtcattgaga gagacttaaa agagcctgac 480 agaatagttg gagaattcct gcagccgggt ggttatcatg ttctcaaaga ccttggtctt 540 ggagatacag tggaaggtct tgatgcccag gttgtaaatg gttacatgat tcatgatcag 600 gaaagcaaat cagaggttca gattccttac cctctgtcag aaaacaatca agtgcagagt 660 ggaagagctt tccatcacgg aagattcatc atgagtctcc ggaaagcagc tatggcagag 720 cccaatgcaa agtttattga aggtgttgtg ttacagttat tagaggaaga tgatgttgtg 780 atgggagttc agtacaagga taaagagact ggagatatca aggaactcca tgctccactg 840 actgttgttg cagatgggct tttctccaag ttcaggaaaa gcctggtctc caataaagtt 900 tctgtatcat ctcattttgt tggctttctt atgaagaatg caccacagtt taaagcaaat 960 catgctgaac ttattttagc taacccgagt ccagttctca tctaccagat ttcatccagt 1020 gaaactcgag tacttgttga cattagagga gaaatgccaa ggaatttaag agaatacatg 1080 gttgaaaaaa tttacccaca aatacctgat cacctgaaag aaccattctt agaagccact 1140 gacaattctc atctgaggtc catgccagca agcttccttc ctccttcatc agtgaagaaa 1200 cgaggtgttc ttcttttggg agacgcatat aatatgaggc atccacttac tggtggagga 1260 atgactgttg cttttaaaga tataaaacta tggagaaaac tgctaaaggg tatccctgac 1320 ctttatgatg atgcagctat tttcgaggcc aaaaaatcat tttactgggc aagaaaaaca 1380 tctcattcct ttgtcgtgaa tatccttgct caggctcttt atgaattatt ttctgccaca 1440 gatgattccc tgcatcaact aagaaaagcc tgttttcttt atttcaaact tggtggcgaa 1500 tgtgttgcgg gtcctgttgg gctgctttct gtattgtctc ctaaccctct agttttaatt 1560 ggacacttct ttgctgttgc aatctatgcc gtgtattttt gctttaagtc agaaccttgg 1620 attacaaaac ctcgagccct tctcagtagt ggtgctgtat tgtacaaagc gtgttctgta 1680 atatttcctc taatttactc agaaatgaag tatatggttc attaa 1725 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siCont <400> 2 augaacguga auugcucaat t 21 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siSqE <400> 3 gcagagccca atgcaaagtt tdtdt 25 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for E-cadherin <400> 4 caacgaccca acccaagaat 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for E-cadherin <400> 5 tccgcctcct tcttcatcat 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for N-cadherin <400> 6 acagtggcag ctggacttga 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for N-cadherin <400> 7 tcccttggct aatggcactt 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Vimentin <400> 8 ccttgaacgc aaagtggaat 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Vimentin <400> 9 gcttcaacgg caaagttctc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for TP53 <400> 10 cctcaccatc atcacactgc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for TP53 <400> 11 cctcattcag ctctcggaac 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Squalene epoxidase <400> 12 gcttccttcc tccttcatca 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Squalene epoxidase <400> 13 acacattcgc caccaagttt 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for GAPDH <400> 14 accatcttcc aggagcgaga 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for GAPDH <400> 15 agtgatggca tggactgtgg 20 <210> 16 <211> 574 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Met Trp Thr Phe Leu Gly Ile Ala Thr Phe Thr Tyr Phe Tyr Lys Lys 1 5 10 15 Phe Gly Asp Phe Ile Thr Leu Ala Asn Arg Glu Val Leu Leu Cys Val 20 25 30 Leu Val Phe Leu Ser Leu Gly Leu Val Leu Ser Tyr Arg Cys Arg His 35 40 45 Arg Asn Gly Gly Leu Leu Gly Arg Gln Gln Ser Gly Ser Gln Phe Ala 50 55 60 Leu Phe Ser Asp Ile Leu Ser Gly Leu Pro Phe Ile Gly Phe Phe Trp 65 70 75 80 Ala Lys Ser Pro Pro Glu Ser Glu Asn Lys Glu Gln Leu Glu Ala Arg 85 90 95 Arg Arg Arg Lys Gly Thr Asn Ile Ser Glu Thr Ser Leu Ile Gly Thr 100 105 110 Ala Ala Cys Thr Ser Thr Ser Ser Gln Asn Asp Pro Glu Val Ile Ile 115 120 125 Val Gly Ala Gly Val Leu Gly Ser Ala Leu Ala Ala Val Leu Ser Arg 130 135 140 Asp Gly Arg Lys Val Thr Val Ile Glu Arg Asp Leu Lys Glu Pro Asp 145 150 155 160 Arg Ile Val Gly Glu Phe Leu Gln Pro Gly Gly Tyr His Val Leu Lys 165 170 175 Asp Leu Gly Leu Gly Asp Thr Val Glu Gly Leu Asp Ala Gln Val Val 180 185 190 Asn Gly Tyr Met Ile His Asp Gln Glu Ser Lys Ser Glu Val Gln Ile 195 200 205 Pro Tyr Pro Leu Ser Glu Asn Asn Gln Val Gln Ser Gly Arg Ala Phe 210 215 220 His His Gly Arg Phe Ile Met Ser Leu Arg Lys Ala Ala Met Ala Glu 225 230 235 240 Pro Asn Ala Lys Phe Ile Glu Gly Val Val Leu Gln Leu Leu Glu Glu 245 250 255 Asp Asp Val Val Met Gly Val Gln Tyr Lys Asp Lys Glu Thr Gly Asp 260 265 270 Ile Lys Glu Leu His Ala Pro Leu Thr Val Val Ala Asp Gly Leu Phe 275 280 285 Ser Lys Phe Arg Lys Ser Leu Val Ser Asn Lys Val Ser Val Ser Ser 290 295 300 His Phe Val Gly Phe Leu Met Lys Asn Ala Pro Gln Phe Lys Ala Asn 305 310 315 320 His Ala Glu Leu Ile Leu Ala Asn Pro Ser Pro Val Leu Ile Tyr Gln 325 330 335 Ile Ser Ser Ser Glu Thr Arg Val Leu Val Asp Ile Arg Gly Glu Met 340 345 350 Pro Arg Asn Leu Arg Glu Tyr Met Val Glu Lys Ile Tyr Pro Gln Ile 355 360 365 Pro Asp His Leu Lys Glu Pro Phe Leu Glu Ala Thr Asp Asn Ser His 370 375 380 Leu Arg Ser Met Pro Ala Ser Phe Leu Pro Pro Ser Ser Val Lys Lys 385 390 395 400 Arg Gly Val Leu Leu Leu Gly Asp Ala Tyr Asn Met Arg His Pro Leu 405 410 415 Thr Gly Gly Gly Met Thr Val Ala Phe Lys Asp Ile Lys Leu Trp Arg 420 425 430 Lys Leu Leu Lys Gly Ile Pro Asp Leu Tyr Asp Asp Ala Ala Ile Phe 435 440 445 Glu Ala Lys Lys Ser Phe Tyr Trp Ala Arg Lys Thr Ser His Ser Phe 450 455 460 Val Val Asn Ile Leu Ala Gln Ala Leu Tyr Glu Leu Phe Ser Ala Thr 465 470 475 480 Asp Asp Ser Leu His Gln Leu Arg Lys Ala Cys Phe Leu Tyr Phe Lys 485 490 495 Leu Gly Gly Glu Cys Val Ala Gly Pro Val Gly Leu Leu Ser Val Leu 500 505 510 Ser Pro Asn Pro Leu Val Leu Ile Gly His Phe Phe Ala Val Ala Ile 515 520 525 Tyr Ala Val Tyr Phe Cys Phe Lys Ser Glu Pro Trp Ile Thr Lys Pro 530 535 540 Arg Ala Leu Leu Ser Ser Gly Ala Val Leu Tyr Lys Ala Cys Ser Val 545 550 555 560 Ile Phe Pro Leu Ile Tyr Ser Glu Met Lys Tyr Met Val His 565 570

Claims (14)

  1. 스쿠알렌 에폭시다제(squalene epoxidase: squalene monooxygenase) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 대장암 전이 진단 또는 예후 예측용 조성물로서,
    상기 제제는 측정된 스쿠알렌 에폭시다제 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준이 전이되지 않은 대장암 시료의 스쿠알렌 에폭시다제 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준보다 낮은 경우, 대장암 전이로 판단하여 대장암 전이 진단을 위한 정보를 제공하는 것인, 대장암 전이 진단 또는 예후 예측용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 단백질의 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체, 또는 앱타머를 포함하는 것인, 대장암 전이 진단 또는 예후 예측용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 예후는 사망 예후인 것인, 대장암 전이 진단 또는 예후 예측용 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 mRNA의 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브인 것인, 대장암 전이 진단 또는 예후 예측용 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 p53 유전자의 mRNA 수준 또는 이로부터 발현되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 추가적으로 포함하고,
    상기 제제는 측정된 p53 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준이 전이되지 않은 대장암 시료의 p53 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준보다 낮은 경우, 대장암 전이로 판단하여 대장암 전이 진단을 위한 정보를 제공하는 것인, 대장암 전이 진단 또는 예후 예측용 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 대장암 전이 진단 또는 예후 예측용 키트.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 키트는 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트인 것인, 대장암 전이 진단 또는 예후 예측용 키트.
  8. (a) 대장암이 발생한 개체로부터 분리된 시료에서 스쿠알렌 에폭시다제(squalene epoxidase: squalene monooxygenase) 유전자의 mRNA 수준 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 단계;
    (b) 상기 측정된 mRNA 수준 또는 이의 단백질 수준을 1기 또는 2기의 대장암이 발병한 대조군 시료의 mRNA 수준 또는 이의 단백질 수준과 비교하는 단계; 및
    (c) 대장암이 발생한 개체로부터 분리된 시료에서 상기 측정된 mRNA 수준 또는 이의 단백질 수준이 대조군 시료의 mRNA 수준 또는 이의 단백질 수준보다 낮은 경우, 대장암 전이로 판단하는 단계를 포함하는, 대장암 전이의 진단을 위한 정보제공방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 방법은 (a) 단계에서 대장암이 발생한 개체로부터 분리된 시료에서 p53 유전자의 mRNA 수준 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는, 대장암 전이의 진단을 위한 정보제공방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서,
    상기 유전자의 mRNA 수준은 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(real time quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩 분석법(DNA chip technology assay)에 의하여 측정되는 것인, 대장암 전이의 진단을 위한 정보제공방법.
  11. 제8항 또는 제9항에 있어서,
    상기 단백질의 수준은 웨스턴 블랏(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radial immunodiffusion), 오우크테로니 면역 확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동(rocket immunoelectrophoresis), 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complement Fixation Assay), 면역형광법(immunofluorescence), 면역크로마토그래피법(immunochromatography), FACS 분석법(fluorescenceactivated cell sorter analysis) 및 단백질 칩 분석법(protein chip technology assay)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 이용하여 측정되는 것인, 대장암 전이의 진단을 위한 정보제공방법.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 대장암 전이는 콜레스테롤에 의해 유도되는 것인, 대장암 전이 진단 또는 예후 예측용 조성물.
  13. (a) 대장암이 발생한 개체로부터 분리된 시료에서 스쿠알렌 에폭시다제(squalene epoxidase: squalene monooxygenase) 유전자의 mRNA 수준 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 단계;
    (b) 상기 측정된 mRNA 수준 또는 이의 단백질 수준을 생존 대장암 환자 대조군 시료의 mRNA 수준 또는 이의 단백질 수준과 비교하는 단계; 및
    (c) 대장암이 발생한 개체로부터 분리된 시료에서 상기 측정된 mRNA 수준 또는 이의 단백질 수준이 대조군 시료의 mRNA 수준 또는 이의 단백질 수준보다 낮은 경우, 대장암 예후가 나쁘다고 판단하는 단계를 포함하는, 대장암의 예후 예측을 위한 정보제공방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 방법은 (a) 단계에서 대장암이 발생한 개체로부터 분리된 시료에서 p53 유전자의 mRNA 수준 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는, 대장암의 예후 예측을 위한 정보제공방법.

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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210150221A (ko) 2020-06-03 2021-12-10 한국생명공학연구원 암 전이 및 재발 진단용 조성물

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050260177A1 (en) 1998-06-05 2005-11-24 Corixa Corporation Compounds for immunotherapy and diagnosis of colon cancer and methods for their use

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007037421A (ja) * 2005-08-01 2007-02-15 Osaka Univ 大腸癌リンパ節転移の有無を予測するための遺伝子セット
KR100969692B1 (ko) * 2008-01-18 2010-07-14 한국생명공학연구원 대장암 과발현 유전자를 이용한 대장암 진단 마커
KR100973990B1 (ko) * 2008-04-02 2010-08-05 한국생명공학연구원 대장암 진단용 마커 ｐｒｒ7과 이에 의해 코드되는 단백질 및 이를 이용한 대장암 진단 키트
KR101174452B1 (ko) * 2009-05-11 2012-08-16 한국생명공학연구원 대장암 및 전이에 대한 바이오마커, 이를 이용한 대장암 진단 및 치료제 스크리닝
KR101007574B1 (ko) * 2009-07-28 2011-01-14 한국생명공학연구원 대장암 과발현 유전자를 이용한 대장암 진단 마커

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050260177A1 (en) 1998-06-05 2005-11-24 Corixa Corporation Compounds for immunotherapy and diagnosis of colon cancer and methods for their use

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J P Cruse et al, Gut (1982), vol 23, pp 594-599.*
김재오 저, 대한 대장 항문 학회지 (2007), 제23권, 제2호, pp 116-128.
허정욱 저, J Korean Soc Coloproctol (2009), vol 25, no 2, pp 107-112.*

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210150221A (ko) 2020-06-03 2021-12-10 한국생명공학연구원 암 전이 및 재발 진단용 조성물

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