KR100973990B1 - 대장암 진단용 마커 ｐｒｒ7과 이에 의해 코드되는 단백질 및 이를 이용한 대장암 진단 키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 C9orf100, PRR7, SQLE 및 TMEM9 유전자의 신규한 용도를 제공한다. 본 발명에 따른 C9orf100, PRR7, SQLE 및 TMEM9 유전자는 대장암과 높은 관련성을 가지므로, 상기 유전자의 발현량을 확인함으로써 대장암의 진단, 약물스크리닝 등이 가능하고, 본 발명에 따른 유전자를 대장암 치료타겟으로 사용가능하다.

C9orf100, PRR7, SQLE, TMEM9, 대장암, 진단, 조성, 치료

Description

대장암 진단용 마커 ＰＲＲ7과 이에 의해 코드되는 단백질 및 이를 이용한 대장암 진단 키트{A colorectal cancer marker PRR7 gene, protein translated from the gene and a diagnostic kit using the same}

본 발명은 대장암 진단용 마커에 관한 것으로서, 좀더 구체적으로는 및 그를 이용한 진단키트, 대장암 치료용 조성물, 대장암 치료제 스크리닝용 조성물 및 스크리닝 방법에 관한 것이다.

대장암은 식생활의 서구화 등 환경적 요인의 변화와 함께 최근 우리나라에서 급속히 증가하는 경향을 보이고 발견되는 연령도 점점 낮아지고 있어, 대장 내시경 등 조기 진단을 위한 검사의 필요성이 증가하고 있다. 대장암의 발생률을 높이는 인자로는 고지방, 저섬유 식이와 가족성 용종 등 몇몇 유전성 질환, 궤양성 대장염 같은 염증성 장 질환 등이 있다. 대장암은 상부 소화기관과 달리 증세가 늦게 나타나며, 증세가 나타나더라도 단순 변비나 치질로 오인하여 적절한 치료시기를 놓치는 경우가 많다. 우리나라에서 대장암은 전체 암 중 12.3%로 위암, 간암, 폐암에 이어 제4위를 차지하며 지속적인 증가 추세를 보이고 있어 2010년경에는 우리나라에서의 대장암 발생빈도가 서양의 수준에 도달할 것으로 예측되고 있다.

일반적인 경우 대장암 환자들은 ① 배변 습관의 변화, ② 혈변이나 점액변(변에 점액이 섞임), ③ 굵기가 가늘어진 변, ④ 체중 감소, ⑤ 복부 불편감(복통·복부팽만), ⑥ 피로, ⑦ 식욕부진·구토·오심, ⑧ 빈혈 등의 증상을 보인다. 그러나 대장암은 초기에는 대부분의 경우 아무런 증상이 없으며, 대장암으로 인해 어떤 증상이 나타나는 경우에는 이미 대장암이 상당히 진행된 경우가 많다. 이는 대장암의 초기에는 암의 크기가 작아서 별다른 증상을 나타내지 않지만, 암이 자라서 커지는 경우 대장 내에서 변이 지나가는 것을 막게 되고, 이와 아울러 자라난 대장암에서 출혈이 일어나고, 대장암 표면에서 분비물이 배설되기 때문이다. 현재 대장암에 사용되고 있는 선별 검사로는 ① 대변 잠혈 검사, ② 종양표지자 검사 ③ 대장조영술, ④ 대장내시경검사, ⑤ 전산화 단층촬영, ⑥ 복부 초음파 검사, ⑦ 경직장 초음파, ⑧ 에스결장경 검사가 있으나 이러한 검사법은 조기진단에 여러 가지 한계가 있다. 대장암 환자의 생존율을 높이기 위해서는 좀 더 정확하게 조기에 진단할 수 있는 방법이 개발되어야 할 것이다. 이를 위해서 정확도를 높일 수 있는 진단시스템이 필요하며, 이는 대장암 관련 마커 유전자의 발굴이 필요한 이유이다.

대장암의 발생과정에는 여러 종류의 암 유전자, 종양 억제유전자 등 다양한 유전자 변화가 관여하는 것으로 알려져 있다. 실제 대장암은 발암과정에서 일어나는 유전적 변화가 가장 많이 밝혀진 암이다. 대장암은 한 개의 암 유전자 또는 종양억제 유전자의 변화가 단독으로 암을 유발시킬 수 있는 것이 아니고 정상 대장 점막세포가 선종의 단계를 거쳐 대장암으로 진행되기 위해서는 수년에 걸친 긴 세월을 통해 여러 개의 암 관련 유전자의 변화가 축적되어야 하는데 이를 대장암 발 생에 있어서 유전자의 다단계적 변화라고 한다. 여기에서 중요한 것은 각 단계에서의 유전자 변화 순서가 아니라 궁극적으로 누적되는 유전자들의 변화의 총합이다. 대장암 발생과정에 관여하는 유전적 변화로는 K-ras, APC, MCC 유전자, 18번 염색체의 DCC유전자, 17번 염색체의 p53 유전자, 그리고 DNA 메틸화의 이상 등이 있으며, hMSH2, hMSH1, hPMS1, hPMS2 등의 돌연변이도 관계된다.

이와 같이, 암의 형성은 다양한 유전자들과 이들 유전자들의 발현 및 조절 기작이 복합적으로 연관되어 진행되므로 최근 들어 다량의 유전자가 탑재된 올리고 칩을 이용하여 암 관련 유전자들의 발현율을 비교함으로써 암의 새로운 진단이나 치료 마커를 발굴하기 위한 연구들이 이루어지고 있다. 암세포에서 발현이 증가하거나 감소하는 유전자들은 세포분열, 세포신호전달, 세포 골격, 세포 운동, 세포 방어, 유전자 및 단백질의 발현 그리고 세포 내 물질 대사 등 여러 부분에 관여하는 것으로 환자 조직에 따라 동일한 발현변화를 보이는 유전자가 있는 반면 다른 발현 변화를 보이는 유전자들이 많다. 이것은 각각 환자들의 특이성 때문일 가능성이 크므로 연구하는 대상의 환자 조직들의 정확한 병리학적 소견과 분류에 따라야 하며 정확한 유전자를 이용한 진단에는 좀더 많은 새로운 유전자들의 검색과 확인이 필요하다.

따라서, 본 발명은 대조군과 비교하여 대장암에 특이적인 신규 마커 유전자를 제공하는 것을 목적으로 한다.

보다 구체적으로, 본 발명은 대장암 특이적 신규 마커 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하는 대장암 진단용 또는 대장암 치료제 스크리닝용 조성물, 상기 유전자의 억제제 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질의 억제제 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 대장암 치료용 조성물 및 대장암 진단용 키트를 제공하고자 한다.

상기 목표를 달성하기 위하여 본 발명자들은 대장암 세포와 대조군 세포를 비교하여 발현량에 현저한 차이가 있는 단백질들을 탐지하여 본 발명에 이르게 되었다.

C9orf100 단백질에 대한 기능은 현재까지 전혀 보고된바 없으며, PRR7 단백질은 식물에 있어서 빛과 관련하여 24시간 주기리듬을 조절할 뿐만 아니라, phyA와 phyB 신호전달경로에 관여하는 것으로 보고되고 있다[Akinori 등, JSBA, 2007 ; Eva 등, Current Biology, 2005]. SQLE 단백질은 콜레스테롤을 합성하는 과정에 관여를 하는 것으로 알려져 있으며, 특히 스쿠알렌의 산화환원효소로 보고되어 있다[Koen 등, JBC, 2007]. TMEM9 단백질은 막전이(trans-membrane) 단백질로서, LAMP1과 함께 세포 내 이동에 관계하는 것으로 보고되고 있다[Marit 등, BBRC, 2002]. 본 발명자들은 상기 유전자들이 대장암과의 관련성이 있음을 최초로 발견하고 본 발명을 완성하였다.

C9orf100, PRR7, SQLE 및 TMEM9 유전자는 대장암과 높은 관련성을 가지므로, 상기 유전자의 발현량을 확인함으로써 대장암의 진단, 대장암 치료용 약물 스크리닝 등이 가능하고, 본 발명의 유전자를 대장암 치료타겟으로 할 수 있다.

본 발명은 C9orf100, PRR7, SQLE 및 TMEM9 로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자를 포함하는 대장암 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 ‘C9orf100’, ‘PRR7’, ‘SQLE’ 및 'TMEM9'의 '유전자'라 함은 이들 유전자의 DNA 또는 mRNA를 말하며, DNA 또는 mRNA의 전부 또는 일부를 모두 포함하는 개념이다.

본 발명의 대장암 진단용 조성물은 상기 유전자 외에도 핵산의 구조를 안정하게 유지시키는 증류수 또는 완충액을 포함할 수 있다.

상기 C9orf100, PRR7, SQLE 및 TMEM9 유전자는 대장암 세포에서 특이적으로 발현이 증가한다. 따라서 상기 유전자의 발현 정도를 조사하면 대장암을 진단할 수 있다.

상기 C9orf100, PRR7, SQLE 및 TMEM9 유전자의 서열정보는 표 1에 나타낸 바와 같다.

서열번호	유전자	길이(염기수)	CDS(단백질 영역)	위치	GeneBank accession No.
1	C9orf100	1..3763	113..1120	9q13.3	NM_032818.2
3	PRR7	1..1507	493..1317	5q35.3	NM_030567.3
5	SQLE	1..2989	927..2651	8q24.1	NM_003129.3
7	TMEM9	1..1592	120..671	1q41	NM_016456.2

본 발명은 또한 상기 유전자들의 대장암 진단 용도 및 상기 조성물과 대장암 의심 환자로부터 얻은 시료 간의 반응을 확인하여 대장암을 진단하는 방법을 제공한다.

본 발명의 진단 방법에서 상기 유전자를 포함하는 조성물과 시료 간의 반응의 확인은 DNA-DNA, DNA-RNA, DNA-단백질 간의 반응 여부를 확인하는데 사용되는 통상적인 방법들, 예컨대 DNA 칩, 단백질 칩, 중합효소 연쇄반응(PCR), 노던 블롯팅, 서던 블롯팅, ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent assay), 효모 이중 혼성법(yeast two-hybrid), 2-D 겔 분석 및 시험관 내 결합 에세이(in vitro binding assay) 등을 이용할 수 있다. 예컨대 상기 유전자의 전부 또는 일부를 프로브로 사용하여 대상자의 체액으로부터 분리한 핵산과 혼성화(hybridization)한 후 본 발명이 속하는 기술분야에 공지된 다양한 방법, 예컨대 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcription polymerases chain reaction), 서던 블롯팅, 노던 블롯팅 등으로 이를 검출함으로써 대장암 의심 환자에서 상기 유전자가 고발현된 상태인지를 조사하면 대장암의 발생 여부를 판단할 수 있다. 상기 프로브를 방사선 동위원소 또는 효소 등으로 표지하면 용이하게 유전자의 존재를 확인할 수 있다. 상기 프로브의 염기서열은 상기 유전자의 염기서열과 70% 이상의 유사성이 있으면 족하다. 상기 프로브는 본 발명의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용한 유전자 증폭법에 의해 제조할 수 있다.

또한, 본 발명은 C9orf100, PRR7, SQLE 및 TMEM9로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 센스 및 안티센스 프라이머쌍을 포함하는 대장암 진단용 조성물을 제공한다.

상기 센스 및 안티센스 프라이머쌍은 상기 유전자에 대한 상보적인 염기서열을 갖는 서열번호 9~16의 프라이머쌍일 수 있다. 상기 프라이머쌍은 다음의 표 2에 정리하였다. 본 발명에서 '상보적'이란 프라이머의 염기서열에서 완전히 상보적인 것과 80% 이상의 상동성이 있는 것을 포함하는 개념이다.

서열번호	유전자	방향	Primer sequence
9	C9orf100	sense	5'- ctggtggccacgtacttttt -3'
10	C9orf100	antisense	5'- gctgttgggacctgtgtttt -3'
11	PRR7	sense	5'- tgtccaaaccaccgtgttac -3'
12	PRR7	antisense	5'- gctgtagtcctcccgaacaa -3'
13	SQLE	sense	5'- gcttccttcctccttcatca -3'
14	SQLE	antisense	5'- acacattcgccaccaagttt -3'
15	TMEM9	sense	5'- tgggcacatttacaaccaga -3'
16	TMEM9	antisense	5'- cgagcatcctcattctcctc -3'

상기 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머를 이용하여 공지의 방법, 예컨대 RT-PCR 방법 등으로 상기 4종 유전자의 발현량을 측정할 수 있다.

본 발명은 또한 C9orf100, PRR7, SQLE 및 TMEM9 로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하는 대장암 진단용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 상기 단백질 외에도 단백질의 구조를 안정하게 유지시키는 증류수 또는 완충액을 포함할 수 있다. 앞서 언급한 바와 같이, 상기 C9orf100, PRR7, SQLE 및 TMEM9 유전자는 대장암 세포에서 특이적으로 발현이 증가하므로 상기 유전자들로부터 발현된 단백질을 이용하여 상기 유전자 또는 단백질의 과발현 여부를 조사하면 대장암을 진단할 수 있다.

본 발명은 또한 상기 단백질의 대장암 진단 용도 및 상기 조성물과 대상체로부터 얻은 시료 간의 반응을 확인하여 대장암을 진단하는 방법을 제공한다.

본 발명의 진단 방법에서 상기 단백질을 포함하는 조성물과 시료 간의 반응의 확인은 DNA-단백질, RNA-단백질, 단백질-단백질 간의 반응 여부를 확인하는데 사용되는 통상적인 방법들, 예컨대 DNA 칩, 단백질 칩, 중합효소 연쇄반응 (PCR), 노던 블롯팅, 서던 블롯팅, 웨스턴 블롯팅, ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent assay), 특이적 면역염색(histoimmunostaining), 효모 이중 혼성법(yeast two-hybrid), 2-D 겔 분석 및 시험관 내 결합 어세이(in vitro binding assay) 등을 이용할 수 있다. 예컨대 상기 유전자들로부터 발현된 단백질의 전부 또는 일부를 프로브로 사용하여 대상자의 체액으로부터 분리한 핵산 또는 단백질과 혼성화한 후 본 발명이 속하는 기술분야에 공지된 다양한 방법, 예컨대 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcription polymerases chain reaction), 웨스턴 블롯팅(western blotting) 등으로 이를 검출함으로써 대상체에서 상기 유전자가 고발현된 상태인지 조사하면 대장암의 발생 여부를 판단할 수 있다. 상기 프로브를 방사선 동위원소 또는 효소 등으로 표지하면 용이하게 유전자의 존재를 확인할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 상기 단백질 대신 상기 단백질에 대한 특이적 항체를 포함할 수 있다. C9orf100, PRR7, SQLE 및 TMEM9 유전자는 대장암세포에서 특이적으로 발현이 증가하여 상기 유전자로부터 발현된 단백질의 양 또한 증가하게 된다. 따라서 상기 유전자로부터 발현된 단백질에 대한 항체를 이용하는 경우, 항원-항체 반응을 통해 상기 단백질을 검출해 내어 대장암을 진단할 수 있다.

상기 단백질에 대한 모노클론 항체는 당업계에 통상적인 모노클론 항체 제작 방법을 통해 제작되어 사용될 수도 있고, 시판되는 것을 사용할 수 있다. 상기 단백질에 대한 모노클론 항체는 일반적으로 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase, AP) 또는 호스래디쉬 퍼옥시다제(horseradish peroxidase, HRP) 등의 효소가 결합된 2차 항체 및 이들의 기질을 사용하여 발색 반응시킴으로써 정량 분석할 수도 있고, 아니면 직접 상기 단백질에 대한 모노클론 항체에 AP 또는 HRP 효소 등이 결합된 것을 사용하여 정량분석할 수도 있다. 또한, 모노클론 항체 대신에 상기 단백질을 인식하는 폴리클론 항체를 사용할 수도 있고 이는 당업계에 통상적인 항혈청 제작 방법을 통해 제작되어 사용될 수도 있으며, 항원결합성을 갖는 것이면 모노클론 항체 또는 폴리클론 항체의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고, 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수항체도 포함된다.

상기 항체는 본 발명의 4종의 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 유전자에 의해 코딩된 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 4종 단백질의 부분 펩타이드도 포함하며, 본 발명의 부분 펩타이드로는 최소한 7개 이상, 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다.

또한 본 발명은 C9orf100, PRR7, SQLE 및 TMEM9 로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자, 상기 유전자의 센스 및 안티센스 프라이머쌍, 상기 유전자로부터 발현된 단백질, 또는 상기 단백질에 대한 항체를 포함하는 대장암 진단용 키트를 제공한다.

상기 대장암 진단용 키트는 지지체, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질액, 또는 1,6-N-아세틸글루코사민 당쇄가지 변화를 측정하기 위한 L4-PHA, 폴리(A) RNA 분리시약 등을 더 포함할 수 있다.

상기 지지체는 니트로셀룰로오즈막, 폴리비닐수지로 합성된 96웰플레이트(96 well plate), 폴리스티렌수지로 합성된 96웰플레이트, 또는 유리로 된 슬라이드글라스 등일 수 있고, 상기 발색 효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 또는 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase) 등일 수 있으며, 상기 형광물질은 FITC, 또는 RITC 등일 수 있고, 상기 발색 기질액은 ABTS(2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzenzothiazoline-6-sulfonic acid)), OPD(o-Phenylenediamine), 또는 TMB(Tetramethyl Benzidine) 등일 수 있다.

본 발명은 또한 C9orf100, PRR7, SQLE 및 TMEM9 로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자를 포함하는 대장암 치료제 스크리닝용 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 상기 조성물의 대장암 치료제 스크리닝용 용도 및 상기 조성물을 표적물질로 이용하여 시험대상물질을 접촉시키고, 표적물질과 시험대상물질 간의 반응을 확인하여, 시험대상물질이 상기 유전자의 발현을 증진시키는 활성 또는 억제하는 활성을 나타내는지를 결정하는 단계를 포함하는 대장암치료제 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 스크리닝 방법에서 상기 유전자를 포함하는 조성물과 시험대상 물질 간의 반응 확인은, DNA-DNA, DNA-RNA, DNA-단백질, DNA-화합물 간의 반응 여부를 확인하는데 사용되는 통상적인 방법들을 사용할 수 있다. 예를 들면, 생체 외부에서(in vitro) 상기 유전자와 시험대상 물질 사이의 결합 여부를 확인하기 위한 혼성화 시험, 포유류 세포와 시험대상물질을 반응시킨 후 노던 분석, 정량적 PCR, 정량적 실시간 PCR 등을 통한 상기 유전자의 발현율 측정 방법, 또는 상기 유전자에 리포터 유전자를 연결시켜 세포 내로 도입한 후 시험대상물질과 반응시키고 리포터 단백질의 발현율을 측정하는 방법 등을 사용할 수 있다. 이러한 경우 본 발명의 조성물은 상기 유전자 외에도, 핵산의 구조를 안정하게 유지시키는 증류수 또는 완충액을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 C9orf100, PRR7, SQLE 및 TMEM9 로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하는 대장암 치료제 스크리닝용 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 상기 조성물의 대장암 치료제 스크리닝용 용도 및 상기 조성물을 표적물질로 이용하여 시험대상물질을 접촉시키고, 표적물질과 시험대상물질 간의 반응을 확인하여, 시험대상물질이 상기 단백질의 기능을 증진시키는 활성 또는 억제하는 활성을 나타내는지를 결정하는 단계를 포함하는 대장암치료제 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 스크리닝 방법에서 상기 단백질을 포함하는 조성물과 시험대상물질 간의 반응 확인은, 단백질-단백질, 단백질-화합물 간의 반응 여부를 확인하는데 사용되는 통상적인 방법들을 사용할 수 있다. 예를 들면, 상기 단백질과 시험대상물질을 반응시킨 후 활성을 측정하는 방법, 효모 이중 혼성법(yeast two-hybrid), 상기 단백질에 결합하는 파지 디스플레이 펩티드 클론(phage-displayed peptide clone)의 검색, 천연물 및 화학물질 라이브러리(chemical library) 등을 이용한 HTS(high throughput screening), 드럭 히트 HTS(drug hit high throughput screening), 세포 기반 스크리닝(cell-based screening), 또는 DNA 어레이(DNA array)를 이용하는 스크리닝법 등을 사용할 수 있다. 이러한 경우 본 발명의 조성물은 상기 단백질 외에도, 단백질의 구조 또는 생리 활성을 안정하게 유지시키는 완충액 또는 반응액을 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은 생체 내(in vivo) 실험을 위해, 상기 단백질을 발현하는 세포, 또는 전사율을 조절할 수 있는 프로모터 하에 상기 단백질을 발현하는 플라스미드를 함유하는 세포 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법에서, 시험대상물질은 통상적인 선정방식에 따라 대장암 억제제로서의 가능성을 지닌 것으로 추정되거나 또는 무작위적으로 선정된 개별적인 핵산, 단백질, 기타 추출물 또는 천연물, 화합물 등이 될 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법을 통해 얻은, 대장암 고발현 유전자의 발현을 증진시키거나 단백질의 기능을 증진시키는 활성을 나타내는 시험대상물질 및 반대로 대장암 고발현 유전자의 발현을 억제시키거나 단백질의 기능을 억제시키는 활성을 나타내는 시험대상물질은, 전자의 경우, 시험대상물질에 대한 억제제를 개발함으로써 대장암치료제 후보물질이 될 수 있고, 후자의 경우는 대장암치료제 후보물질이 될 수 있다. 이와 같은 대장암치료제 후보물질은 이후의 대장암치료제 개발과정에서 선도물질(leading compound)로서 작용하게 되며, 선도물질이 상기 유전자 또는 그로부터 발현되는 단백질의 기능 억제효과를 나타낼 수 있도록 그 구조를 변형시키고 최적화함으로써, 새로운 대장암치료제를 개발할 수 있다.

본 발명은 또한 C9orf100, PRR7, SQLE 및 TMEM9 로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 siRNA를 제공한다.

상기 siRNA의 염기서열은 상기 C9orf100, PRR7, SQLE 및 TMEM9로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자(mRNA)의 염기서열 중 각각의 서열에서 연속된 19~23개의 염기서열일 수 있다.

상기 siRNA의 서열은 편의상 정방향 서열(sense strand)을 나타낸 것으로, 실제 유전자 억제효과를 나타내는 역방향 서열(antisense strand)과 함께 이중리보핵산쇄를 구성하게 된다.

본 발명의 siRNA는 짧은 19-23개의 이중 리보핵산쇄로서 세포 내에 도입하면 비특이적 저해(non-specific inhibition) 없이 C9orf100, PRR7, SQLE 및 TMEM9 로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 발현만을 억제하는 효과를 나타내므로, 대장암 관련 유전자 기능연구에 이용할 수 있다. 또한, 상기 C9orf100, PRR7, SQLE 및 TMEM9 로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자 발현을 억제하여 대장암 세포를 사멸시키는 효과도 나타낼 수 있다.

본 발명은 또한 C9orf100, PRR7 및 TMEM9 로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자에 대한 억제제를 포함하는 대장암 치료용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 C9orf100, PRR7 및 TMEM9 로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자는 대장암 세포에서 다량 발현되므로, 상기 유전자의 억제제를 투여하여 상기 유전자의 발현을 저해시키면 대장암을 억제할 수 있다.

삭제

본 발명에 있어서, C9orf100, PRR7 및 TMEM9로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자에 대한 억제제는 상기 유전자의 mRNA에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드일 수 있다.

안티센스 올리고뉴클레오타이드는 생체 내뿐만 아니라 생체 외에서도 유전자-특이적 억제를 달성하기 위해 성공적으로 사용되어 왔다. 안티센스 뉴클레오타이드는 특정 DNA 또는 RNA 타겟에 대해 안티센스(또는 상보)인 짧은 길이의 DNA 합성 가닥(또는 DNA 아날로그)이다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 타겟에 결합하고 전사, 번역 또는 스플라이싱의 단계에서 발현을 멈추게 함으로써 DNA 또는 RNA 타겟에 의해 인코드된 단백질의 발현을 막기 위해 제안되었다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 세포 배양 및 질병의 동물 모델에서도 성공적으로 이용되어 왔다(Hogrefe, 1999). 올리고뉴클레오타이드가 분해되지 않도록 더욱 안정하고 저항적이 되게 하기 위한 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 또 다른 변형이 당업자에게 알려져 있고 이해된다. 여기서 사용된 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 이중나선 또는 단일나선 DNA, 이중나선 또는 단일나선 RNA, DNA/RNA 하이브리드, DNA 및 RNA 아날로그 및 염기, 당 또는 백본(backbone) 변형을 지닌 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 올리고뉴클레오타이드는 안정성을 증가시키고 뉴클레아제 분해에 대한 저항성을 증가시키기 위해 본 발명이 속하는 기술분야에 알려진 방법에 의해 변형된다. 이들 변형은 본 발명 분야에 알려져 있는 올리고뉴클레오타이드 백본의 변형, 당 부분의 변형 또는 염기의 변형을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.

또한, C9orf100, PRR7 및 TMEM9로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자에 대한 억제제는 상기 유전자의 siRNA(Small Interfering RNA)일 수 있다.

즉, 상기 siRNA의 염기서열은 상기 C9orf100, PRR7 및 TMEM9 로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자(mRNA)의 염기서열 중 각각의 서열에서 연속된 19~23개의 연속된 염기서열일 수 있다.

상기 siRNA의 서열은 편의상 정방향 서열(sense strand)을 나타낸 것으로, 실제 유전자 억제효과를 나타내는 역방향 서열(antisense strand)과 함께 이중리보핵산쇄를 구성하게 된다.

siRNA는 세포 배양 및 생체 내에서 오래 지속되는 효과, 생체 내에서 세포를 트랜스펙션시키는 능력 및 혈청 내 분해에 대한 저항력의 측면에서 생체 내에서 특정한 유전자의 발현의 저해에 대해 매우 강한 약물이 되는 잠재력을 지닌다(Bertrand et al., 2002). siRNA의 전달 및 siRNA를 포함한 발현 컨스트럭트/벡터는 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, 미국 출원 제2004/106567 및 2004/0086884는 바이러스성 벡터, 비바이러스성 벡터, 리포솜 전달 운반체, 플라스미드 주입 시스템, 인공 바이러스 엔벨로프 및 폴리라이신 컨쥬게이트를 포함한 전달 메커니즘뿐만 아니라 많은 발현 컨스트럭트/벡터를 제공하고 있다.

siRNA는 상대적으로 낮은 농도로도 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의해 얻을 수 있는 효과와 동등하거나 높은 효과를 얻을 수 있기 때문에 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 대안으로 제시되고 있다(Thompson, 2002). siRNA의 이용은 질병의 동물 모델에 있어서 유전자 발현을 저해하는 데 대중성을 나타내고 있다. 당업자는 당해 기술 분야에 공지된 방법을 이용하여 원하는 방식대로 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 siRNA를 합성하고 변형시킬 수 있다(Andreas Henschel, Frank Buchholz1 and Bianca Habermann (2004) DEQOR: a web-based tool for the design and quality control of siRNAs. Nucleic Acids Research 32(Web Server Issue):W113-W120 참조). 또한 당업자는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 siRNA를 지닌 발현 컨스트럭트/벡터에 유용한 조절 서열(예컨대, 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 조직-특이적 프로모터 또는 그의 결합)을 잘 이해하고 있다.

대장암 치료를 위해 사용되는 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 siRNA는 약제학적으로 허용되는 담체를 추가적으로 포함한 조성물의 형태로 투여될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 예를 들어 하나 이상의 물, 식염수, 인산 완충 식염수, 덱스트린, 글리세롤, 에탄올뿐만 아니라 이들의 조합을 포함한다. 이러한 조성물은 투여 후 활성 성분의 빠른 방출, 또는 지속적이거나 지연된 방출을 제공하도록 제제화될 수 있다.

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본 발명은 또한 C9orf100, PRR7 및 TMEM9로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유전자로부터 단백질 발현을 억제하는 방법 또는 발현된 단백질을 억제하는 방법을 포함하는 대장암 치료방법을 제공한다. 본 발명의 유전자를 억제하거나, 단백질의 발현을 억제하면 대장암이 억제되는 것이므로, 상기 유전자의 발현을 저해하거나 또는 단백질을 억제하면 대장암을 치료할 수 있다.

본 발명에 있어서 대장암 치료는 대장암의 예방 및 억제를 포함한다.

상기 단백질에 대한 억제제는 본 발명의 유전자로부터 발현된 단백질에 대한 항체일 수 있다. 상기 단백질에 대한 모노클론 항체는 당업계에 통상적인 모노클론 항체 제작 방법을 통해 제작되어 사용될 수도 있고, 시판되는 것을 사용할 수 있다. 또한, 모노클론 항체 대신에 상기 단백질을 인식하는 폴리클론 항체를 사용할 수도 있고 이는 당업계에 통상적인 항혈청 제작 방법을 통해 제작되어 사용될 수도 있다.

본 발명의 대장암 치료용 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용되는 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 단백질에 대한 억제제가 항체일 경우 약제학적으로 허용되는 담체는 결합 단백질의 저장 수명 또는 유효성을 증가시키는 습윤제 또는 유화제, 방부제 또는 완충액과 같은 최소량의 보조 물질로 구성될 수 있다.

또한 본 발명의 대장암 치료용 조성물은 하나 또는 그 이상의 대장암 치료제와 함께 사용될 수 있다. 본 발명의 대장암 치료용 조성물은 예를 들어 당업자에게 잘 알려진 화학요법약제(chemotherapeutic agent), 예컨대, 사이클로포스파마이드, 아지리딘, 알킬알콘설포네이트, 나이트로소우레아, 다카르바진, 카르보플라틴, 시스플라틴 등과 같은 알킬화제(alkylating agent), 마이토마이신 C, 안트라사이클린, 독소루비신(아드리아마이신) 등과 같은 항생제, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라신, 시타라빈 등과 같은 항대사제(antimetabolitic agent), 빈카 알칼로이드와 같은 식물유래 약제 및 호르몬 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 대장암 치료용 조성물은 상기 유효 성분 외에도 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 포함할 수 있으며, 이러한 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 가용화제 등이 있다.

또한 본 발명의 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용되는 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 대장암 치료용 조성물의 약제 제제 형태는 과립제, 산제, 피복정, 정제, 캡슐제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있다.

본 발명의 대장암 치료용 조성물은 정맥 내, 동맥 내, 복강 내, 근육 내, 동맥 내, 복강 내, 흉골 내, 경피, 비측 내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구 내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.

본 발명의 치료 방법에 있어서, "유효량"은 대장암을 억제하는 효과를 이루는데 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 본 발명의 유효 성분의 "유효량"은 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 성인의 경우, 상기 유전자 또는 단백질의 억제제를 1일 1회 내지 수회 투여시, siRNA일 경우 0.01ng/㎏~10㎎/㎏, 상기 유전자의 mRNA에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드인 경우 0.01ng/㎏~10㎎/㎏, 화합물일 경우 0.1ng/㎏~10㎎/㎏, 상기 단백질에 대한 모노클로날 항체일 경우 0.1ng/kg~10㎎/㎏의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 상기 C9orf100, PRR7, SQLE 및 TMEM9 유전자는 표 1의 염기서열 또는 상기 염기서열 중 하나 이상의 염기가 결실, 치환 또는 삽입된 염기서열일 수 있다.

상기 C9orf100, PRR7, SQLE 및 TMEM9 유전자, 상기 유전자의 센스 및 안티센스 프라이머쌍, 및 상기 유전자의 siRNA 서열은 예시일 뿐 이에 한정되는 것이 아님은 당업자에게 자명하다. 상기 서열들에 대해 실질적인 서열 동일성 또는 실질적인 서열 상동성을 지닌 서열 또한 본 발명의 범주에 포함된다. 여기서 사용된 "실질적인 서열 동일성" 또는 "실질적인 서열 상동성"이라는 용어는 서열이 또 다른 서열과의 실질적인 구조적 또는 기능적 동일성을 나타냄을 표현하기 위해 사용된다. 이러한 차이는 예를 들어 다른 종 간의 코돈 용법의 고유의 변이에 기인한다. 2 이상의 다른 서열 사이의 유의적인 양의 서열 중복 또는 유사성이 있는 경우 이들 서열의 길이 또는 구조가 다르더라도 유사한 물리적 특성을 지니는 경우 구조적 차이는 무시할만한 정도가 된다.

본 발명에서 유전공학적 기술과 관련된 사항은 샘브룩 등의 문헌(Sambrook, et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001)) 및 프레드릭 등의 문헌 (Frederick M. Ausubel et al., Current protocols in molecular biology volume 1, 2, 3, John Wiley & Sons, Inc. (1994))에 개시되어 있는 내용에 의해 좀더 명확해진다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

< 실시예 1> 제브라피쉬 모델동물에서 인간 전장유전자의 발현 기능분석

1-1. 시험관 내 전사( In vitro transcription ) 법에 의한 mRNA 의 제조

(1) 플라스미드의 분리 및 선형 DNA 제조

인간 전장유전자 클론을 96웰 딥 플레이트에서 0.1% 암피실린이 (100㎎/㎖) 함유된 LB 배지에서 37℃ 16시간 배양한 후, MWG 96웰 플라스미드 프렙 시스템(plasmid prep system)으로 플라스미드 DNA를 분리하였다. 시험관 내 전사법에 의한 mRNA의 주형을 제조하기 위해 유전자의 3'말단에 있는 제한효소인 NotI(500u, Takara사) 또는 XhoI(5000u, Takara사)를 37℃, 12시간 처리하여 선형 DNA 플라스미드를 제조, 정제하였다. 최종적으로 1.5~5㎍의 정제된 선형 DNA를 시험관 내 전사에 이용했다.

(2) mRNA 제조

상기 절단된 DNA를 주형으로 SP6 및 T7 RNA 폴리머라제(mMESSAGE mMACHINE^TM Ambion사)를 이용하여 37℃에서 2시간 반응시킨 후 DNase I을 37℃에서 15분간 반응시켜 잔류 DNA를 분해시켰다. 여기에 뉴클레아제-제거된 물(Nuclease-free water) 125㎕, 5M 암모늄 아세테이트 15㎕, PCI 혼합물(페놀: 클로로포름:아이소아밀알콜 = 25:24:1) 150㎕를 섞은 후 1분간 와류혼합하고 5분 동안 원심분리하였다. 상등액을 취하여 클로로포름을 동일한 양만큼 넣고 5분간 원심분리하였다. 또다시 상등액을 취하여 아이소프로판올을 동일한 양만큼 넣고 4℃에서 15분 동안 원심분리하고 상등액을 제거한 후 70% 에탄올을 넣어 씻어주고 제거한 후 뉴클레아제가 제거된 물 10㎕에 녹였으며, UV 흡광기(spectrophotometer)를 이용하여 정량하였다. 나머지는 1㎕씩 나누어 -70℃에 보관하였다.

1-2. 제브라피쉬 모델동물에 인간 전장유전자의 과발현

(1) 제브라피쉬에 마이크로인젝션( microinjection )

제브라피쉬의 산란과 수정은 빛에 의해 유도되므로 낮 14시간, 밤 10시간의 명암을 유지하였다. 암, 수 한 쌍씩을 전용 짝짓기 케이지(mating cage)에 함께 넣어준 후 수집된 수정란을 1.5% 아가로즈로 만든 마이크로인젝션용 지금 100mm의 페트리디쉬에 옮기고 정렬한 후 마이크로인젝터(World Precision Instruments)를 이용하여 발생 1-4세포기 발생배에 mRNA를 0.2% 페놀레드와 혼합하여 100-200pg씩 마이크로인젝션하였다.

(2) 제브라피쉬의 표현형을 지표로 한 유전자 기능분석

RNA를 제브라피쉬 발생배에 마이크로인젝션을 통해 과발현을 수행한 후 발생과정 동안의 변화를 실체현미경(S6E, LEICA사)을 통해 관찰하였다. 그 결과, C9orf100 유전자 과발현시 제브라피쉬의 눈이 작아진(small eye) 현상이 관찰되었고, PRR7의 경우 제브라피쉬 몸 축의 길이가 짧아졌으며(shortened body axis), 신체 형성 결손(body patterning defect)이 확인되었다. 또한, SQLE의 경우에도 신체 형성 결손(body patterning defect)이 확인되었으며, TMEM9 과발현시 수포(edema) 형성 및 세포 사멸(dell death) 현상이 관찰되었다. 상기 4종의 유전자는 과발현시 제브라피쉬 개체 수준에서 표현형의 변화를 유도하므로 세포, 개체 수준에서 유의한 활성을 가지는 유전자임이 확인되었다(도 1).

< 실시예 2> 올리고 칩을 이용한 대장암 임상시료에서 4종 유전자의 발현량 확인

2-1. 대장암 임상조직과 정상조직에서 총 RNA 분리

(1) 대장암 임상조직의 준비

66쌍의 환자의 대장암 조직과 정상 조직은 삼성의료원으로부터 공급받았다. 임상조직은 환자로부터 외과적 방법으로 제거된 후, 분석 때까지 이를 액체 질소에 보관하였다.

(2) 총 RNA 분리

총 RNA는 QIAGEN 키트(RNeasy Maxi kit: cat #75162)를 사용하여 분리하였고, Experion RNA StdSens(Bio-Rad사) 칩을 이용하여 정량하였다. 우선 상기 대장암 임상조직과 정상조직을 적절한 크기로 자른 후 150㎕의 베타 머캅토에탄올을 첨가한 15㎖의 키트 내 분해 완충액에 용해시켰다. 여기에 15㎖의 70% 에탄올을 넣어 잘 섞은 후, 3000×g에서 5분간 원심분리하여 총 RNA를 막에 부착시켰다. 두 차례 세척한 후 1.2㎖의 RNase가 없는 물을 첨가하여 총 RNA를 분리하였다. 부착된 세포주의 경우는 트립신, EDTA를 이용하여 회수한 후 키트 내 분해 완충액 RLN(50mM TrisCl, pH 8.0, 140mM NaCl, 1.5mM MgCl2, 0.5% NP-40) 1㎖에 베타 머캅토에탄올 10㎕를 첨가하여 용해시켰다. 여기에 1㎖의 70% 에탄올을 넣어 잘 섞은 후, 3000×g에서 5분간 원심분리하여 총 RNA를 막에 부착시켰다. 두 차례의 세척을 한 후 100㎕의 RNase가 없는 물을 첨가하여 총 RNA를 분리하였다.

2-2. 총 RNA 를 이용한 마이크로어레이 실시

혼성화를 위해 실시예 2-1에서 추출된 총 RNA를 Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit(Ambion사)을 이용하였다. T7 Oligo(dT) 프라이머를 이용하여 cDNA를 합성하고, 바이오틴-UTP를 이용하여 시험관 내 전사를 실시하여 바이오틴 표지된 cRNA를 제조하였다. 제조된 cRNA는 NanoDrop(Nanodrop사, ND-1000)을 이용하여 정량하였다. 정상 대장 상피세포 및 대장암 세포에서 제조된 cRNA를 Human-6 V2(Illumina사) 칩에 혼성화하였다. 혼성화 후 비특이적 혼성화를 배제하기 위하여 Illumina Gene Expression System 세척액(Illumina사)을 이용하여 Illumina Human-6 V2칩을 세척하였고, 세척된 Illumina Human-6 V2칩은 스트렙타비딘-Cy3(Amersham사) 형광 염색약으로 표지하였다. 형광 표지된 DNA 칩은 공촛점(confocal) 레이저 스캐너(Illumina사)를 이용하여 스캐닝하여 각 스팟에 존재하는 형광의 데이터를 얻어서 TIFF 형태의 이미지 파일로 저장하였다. TIFF 이미지 파일을 BeadStudio version 3(Illumina사)를 이용하여 각 스팟의 형광값을 정량하였다. 정량된 결과는 Avadis Prophetic version 3.3(Strand Genomics사) 프로그램으로 ‘quantile’ 기능을 이용하여 보정하였다.

2-3. 발굴한 4종 유전자의 대장암 조직에서의 발현량 확인

상기 과정을 통하여 정상 대장 상피세포와 대장암 세포의 유전자 발현양상을 비교 분석한 결과, 제브라피쉬에서 고발현시 표현형의 변화를 나타낸 4종의 유전자(C9orf100, PRR7, SQLE 및 TMEM9)는 대장암 조직에서 고발현되는 유전자로 확인되었다(도 2).

또한, 상기 각각의 유전자에 대해 마이크로어레이 상의 구체적인 변화율과 유의성(P값), 그리고 유전자의 정의 및 알려진 기능을 표 3에 나타내었다. 표 3에 나타난 바와 같이 유전자들이 정상 대장 상피세포와 비교하여 발현차이를 크게 나타내므로, 대장암 진단, 약물 스크리닝, 또는 치료 타겟 등으로 사용할 수 있음을 알 수 있다.

프로브 ID	유전자	변화율(log2)	p값	유전자의 정의 및 기능
4920494	C9orf100	1.3929	2.93E-13	chromosome 9 open reading frame 100 (C9orf100), mRNA
1740521	PRR7	1.7479	4.82E-16	proline rich 7 (synaptic) (PRR7), mRNA
1710093	SQLE	1.7156	9.12E-09	squalene epoxidase (SQLE), mRNA
290762	TMEM9	0.6926	0.0079	transmembrane protein 9 (TMEM9), mRNA

< 실시예 3> RT - PCR 을 이용한 대장암 임상시료에서의 발굴한 4종 유전자의 발현량 확인

66쌍의 임상환자 샘플(실시예 2의 66쌍의 대장암 환자로부터 채취한 대장암조직(T1~T66)과 정상조직(N1~N66) 중 임상 2기에 해당하는 환자조직 20쌍(T1~T20, N1~N20)을 이용하였으며, 실시예 2에서 확인된 4종의 대장암 고발현 유전자의 발현량을 정량적 RT-PCR 방법과 실시간 RT-PCR을 통하여 분석하였다.

3-1. 역전사 효소 반응에 의한 cDNA 합성

임상 2기에 해당하는 환자조직 20쌍(T1~T20, N1~N20)의 RNA를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 시료 각각의 총 RNA 5㎍, 프라이머인 50uM Olgo(dT)20 1㎕와 10mM dNTP 2.5㎕,를 넣고 RNase 저해제인 DEPC(DiethylenePyrocarbonate)가 들어 있는 멸균수로 전체가 25㎕가 되도록 하여 RNA/프라이머 혼합용액을 만들었다. 65℃에서 5분간 반응시킨 후 55℃로 옮겨 보관하였다. 다음 10X RT 완충액 5㎕, 25mM MgCl₂ 10㎕, 0.1M DTT 5㎕, RNase inhibitor 1㎕, SuperScriptIII RT 효소를 1㎕ 넣고 전체가 25㎕가 되도록 한 후 55℃에서 보관 중인 RNA/프라이머 혼합용액과 섞어준 후, 55℃에서 50분간 반응시켰다. 그 후 85℃에서 5분간 반응시켜 RT 효소를 불활성화한 후 얼음에 넣어 반응을 종결시켰다. PCR을 하기 전에 cDNA 시료에 RNase 1㎕를 처리하여 37℃에서 20분간 반응시켜 RNA를 제거한 후 PCR 반응을 하였다.

3-2. PCR 을 통한 cDNA 증폭과 발현량 확인

(1) 주형의 농도 보정

마커 유전자를 정량하기 위한 표준 유전자로서 B2M을 사용하였다. 표준 유전자의 프라이머를 이용하여 PCR 반응을 수행하고 표준 유전자 B2M의 발현량이 동일해지도록 cDNA의 농도를 보정하였다.

우선 각각의 cDNA를 50배 희석한 후 희석된 샘플 2㎕를 이용하여 PCR 반응을 수행하였다. PCR은 5X PCR premix(제노텍사) 4㎕, 1㎕의 B2M 5' 프라이머(10pmole), 1㎕의 3' 프라이머(10pmole), 4㎕의 증류수를 넣어 사용하였고 20 사이클, 23 사이클, 25 사이클 수행하였다. 이때 PCR 반응 조건은 94℃ 30초, 50℃ 30초, 72℃ 1분으로 수행하였으며, 산물의 크기는 357bp이다.

PCR 산물을 1.5% 아가로스 젤에 로딩하여 전기영동한 후 젤 사진을 찍고, 이미지를 TotalLab v1.0 프로그램[Nonlinear Dynamix사]으로 정량한 후, 다시 보정하여 PCR을 수행하여 정량하는 방식으로 각 시료의 농도를 동일하게 보정하였다.

(2) PCR 에 의한 대장암 마커 유전자 증폭

1) 정량적 RT - PCR

상기 (1)에서 보정된 시료를 50배 희석한 cDNA를 각 유전자의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR하였다. PCR 반응은 94℃ 1분, 55℃ 30초, 72℃ 30초로 하였으며, 사이클 수는 각 유전자의 샘플 내의 농도에 따라 보정하면서 실시하였다. 적게는 28 사이클을 수행하였으며 많게는 35 사이클을 수행하였다. PCR 반응용액 조성은 표 4와 같고, 사용된 프라이머는 표 2와 같다. 표준 유전자 B2M의 프라이머 서열은 표 5에 나타내었다. 대장암 관련 5종의 고발현 유전자인 C9orf100, PRR7, SQLE 및 TMEM9 프라이머는 단백질 코딩 내부에서 디자인하였으며 각 프라이머의 길이는 20mer이고 Tm값은 55℃ 내외이다.

cDNA	2㎕
5X pre-mix (제노텍사)	2㎕
정방향 프라이머 (10pmole/㎕)	1㎕
역방향 프라이머 (10pmole/㎕)	1㎕
증류수	4㎕
총부피	10㎕

서열번호	유전자	방향	프라이머 서열
17	B2M	sense	5'- caaatgccgcatcttcaa -3'
18	B2M	antisense	5'- ctcgctccgtggccttag -3'

2) 실시간 RT - PCR

상기 (1)에서 보정된 시료를 500배 희석한 cDNA를 각 유전자의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR하였다. 반응액의 조성은 표 6과 같고, 사용된 프라이머는 표 2 및 표 5와 같았다. 실시간 PCR의 조건은 95℃에서 2분간 초기변성 시행 후, 95℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 30초간 증폭반응을 하였고, 70℃에서 62℃까지 한 사이클당 0.2℃만큼 내려가도록 설정하여(step size: 0.2℃/사이클) 10초 동안 결합반응을 시행한 다음, 72℃에서 10초 동안 연장반응을 거쳐 40℃에서 30초 동안 증폭 산물을 안정화시켰다. 증폭반응은 LightCycler 2.0(Roche, Penzberg, 독일)을 이용하여 시행하였으며, 증폭신호의 검출을 위해서 측정파장 530㎚, 분석파장 530/705㎚로 설정하여 결합반응에서 형광신호를 단발적으로 측정하였다(single fluorescence measurement). 대장암 관련 유전자의 프라이머는 단백질 코딩 내부에서 디자인하였으며 각 프라이머의 길이는 20mer이고 Tm 값은 55℃ 내외이다.

cDNA	2㎕
2X SYBR pre-mix EX taq (Takara사)	5㎕
정방향 프라이머 (10pmole/㎕)	0.3㎕
역방향 프라이머 (10pmole/㎕)	0.3㎕
증류수	2.4㎕
총부피	10㎕

(3) 발현량 확인

1) 정량적 RT - PCR

PCR 산물을 확인하기 위하여 1.5% 아가로스 젤을 이용하여 전기영동하고 이미지 장비를 이용하여 분석하였다.

그 결과를 도 3a 및 도 3b에 나타내었으며, 도 3a는 임상조직에서 대장암 고발현 유전자의 발현량을 나타낸 RT-PCR 결과사진이고, 도 3b는 C9orf100, PRR7의 발현량을 정량화하여 나타낸 그래프이다. 사진에서 N은 정상 조직(비암 조직)을 의미하며, T는 그에 해당하는 대장암 조직을 의미한다. 모든 유전자의 이미지 사진을 TotalLab v1.0 프로그램[Nonlinear Dynamix사]으로 정량한 후 B2M으로 보정하고 그래프로 다시 나타내었다. 상기 그래프의 X축은 임상시료를 나타낸 것이며 Y축은 발현비(대장암조직/정상조직)를 나타낸다. 상기 발현비는 대장암 조직에서 발현되는 양(각각의 마커 유전자의 발현량을 표준유전자인 B2M의 발현량으로 보정하여 준 값)을 각각의 셋트의 정상 대장 조직에서 발현되는 발현량으로 나누어 준 값이다.

2) 실시간 RT - PCR

실시간 RT-PCR은 정량적으로 분석 가능한 실험법으로써 2가지 정도의 분석법이 있으며, 본 실험에서는 시료 간의 상대적인 비교가 가능한 상대 역가 방법(Comparative threshold method)[Kenneth등, METHODS 25, 204-208(2001)]을 사용하였다. 이 방법은 각 시료들 간의 PCR CT(cycle threshold) 값을 이용하는 것으로, 각 유전자의 CT값을 B2M의 CT값으로 보정한 후 정상조직과 대장암조직간의 CT값 차이를 구하여 상대 역가 방법(Comparative threshold method)에서 사용되는 공식을 적용하여 유전자의 발현량을 비교하였다. 상기 그래프의 X축은 임상시료를 나타낸 것이며 Y축은 발현비(대장암조직/정상조직)를 나타낸다.

정량적 RT-PCR 혹은 실시간 RT-PCR을 통해 5종의 유전자들은 확연히 대장암 시료에서 고발현됨을 확인하였고, 각각의 유전자별 정상 대장 상피세포와 대장암 세포를 비교하여 2배 이상의 발현량 차이를 보이는 시료의 수는 표 7에 나타내었다. 고발현되는 대장암 마커 유전자 C9orf100, PRR7, SQLE 및 TMEM9는 대장암의 진단, 또는 약물 스크리닝 등을 위한 대장암 마커, 또는 치료 타겟 등으로 사용할 수 있을 것으로 보인다.

유전자	2배 이상 발현량차이를 보인 시료수 /전체 반응 시료수 (%)
C9orf100	13/20(65%)
PRR7	8/20(40%)
SQLE	16/20(80%)
TMEM9	8/20(40%)

도 1a 내지 d는 제브라피쉬 모델동물에서 과발현시 표현형의 변화를 나타낸 사진이다.

(1) C9orf100 : 눈이 작아짐(small eye) 관찰

(2) PRR7 : 몸 축의 길이가 짧아짐(shortened body axis), 신체 형성 결손(body patterning defect) 관찰

(3) SQLE: 신체 형성 결손(body patterning defect) 관찰

(4) TMEM9: 수포(edema) 형성, 세포 사멸(dell death) 관찰

도 2는 대장암 유전자의 마이크로어레이 결과를 나타낸 사진이다.

도 3a와 3b는 임상조직에서 대장암 고발현 유전자의 발현량을 나타낸 정량적 RT-PCR 결과 및 발현비를 나타낸 그래프이며, 도 3c는 대장암 고발현 되는 5종의 유전자중 SQLE, TMEM9의 실시간 RT-PCR 반응을 수행한 결과이다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> A colorectal cancer marker genes, proteins translated from the genes and a diagnostic kit using the same <130> NSKIM-0804 <160> 18 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 3763 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (113)..(1117) <400> 1 cttcctgcgc gctgccctcc ccggccccgc ctccgcggct cccgcccgcg agcggttggg 60 atttgaatct gccgcggact gcagccggaa gtgtcgatcc ctcagccagg gc 112 atg gag ctc tcc tgc ccc ggt tcg cgg tgc ccg gtg caa gag cag cgt 160 Met Glu Leu Ser Cys Pro Gly Ser Arg Cys Pro Val Gln Glu Gln Arg 1 5 10 15 gcc cgc tgg gag cgg aaa cgc gcc tgc acc gcc cgg gag ctg cta gag 208 Ala Arg Trp Glu Arg Lys Arg Ala Cys Thr Ala Arg Glu Leu Leu Glu 20 25 30 acc gag cgg cgc tac caa gaa cag ctg ggg ctg gtg gcc acg tac ttt 256 Thr Glu Arg Arg Tyr Gln Glu Gln Leu Gly Leu Val Ala Thr Tyr Phe 35 40 45 ttg ggg atc ctg aaa gcc aag ggg acc ctg cga cca cct gag cgc cag 304 Leu Gly Ile Leu Lys Ala Lys Gly Thr Leu Arg Pro Pro Glu Arg Gln 50 55 60 gcc ctg ttt ggc tcc tgg gag ctc atc tac ggc gcc agc cag gag ctg 352 Ala Leu Phe Gly Ser Trp Glu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Gln Glu Leu 65 70 75 80 ctt ccc tac ctg gaa gga gga tgc tgg ggc caa ggg ctg gag ggc ttc 400 Leu Pro Tyr Leu Glu Gly Gly Cys Trp Gly Gln Gly Leu Glu Gly Phe 85 90 95 tgc cgc cac ttg gag ctc tat aac caa ttt gct gcc aac tca gag agg 448 Cys Arg His Leu Glu Leu Tyr Asn Gln Phe Ala Ala Asn Ser Glu Arg 100 105 110 tcc cag acc acc ctg cag gag cag cta aag aaa aat aaa ggt ttc cgg 496 Ser Gln Thr Thr Leu Gln Glu Gln Leu Lys Lys Asn Lys Gly Phe Arg 115 120 125 agg ttt gta cgg ctt cag gaa ggc cgc cct gag ttt ggg ggc ctt cag 544 Arg Phe Val Arg Leu Gln Glu Gly Arg Pro Glu Phe Gly Gly Leu Gln 130 135 140 ctc cag gac ctg ctc cct ctg cct ctg caa cgg ctc cag cag tat gag 592 Leu Gln Asp Leu Leu Pro Leu Pro Leu Gln Arg Leu Gln Gln Tyr Glu 145 150 155 160 aat ctc gtc gta gct ttg gct gaa aac aca ggt ccc aac agc cct gac 640 Asn Leu Val Val Ala Leu Ala Glu Asn Thr Gly Pro Asn Ser 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His Leu Ser Arg Val 275 280 285 Phe Gly His Ser Gly Gly Pro Cys Gly Gly Leu Leu Ser Leu Ser Phe 290 295 300 Pro His Glu Lys Leu Leu Leu Met Ser Thr Asp Gln Glu Glu Leu Ser 305 310 315 320 Arg Trp Tyr His Ser Leu Thr Trp Ala Ile Ser Ser Gln Lys Asn 325 330 335 <210> 3 <211> 1507 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (493)..(1314) <400> 3 gggcgcgcgc cccgcgcctc cagcccagcg ctcggagccg ctttcgctgc cactgtctgc 60 tcccccgggc cgccgccgcc tccccccgca ggcccggggc tctgtccgct gggcccgcgc 120 tgctcgcccc gggccaggag aacgagctcg aggaggatgc ctgggcccgg tgcaaggttc 180 cccctctcac ccgcagctgt ggagaggagg aagcggaact agagatgccc atctggagtg 240 agtgcaggac caggtcccgc gcggccccgg gtgaggcacg cccgcgcgcc cgccggcgcc 300 atgggaagga gcgggcgccg ctgctgtccc ccgccggcgc gcgcacgact tgagacctgc 360 cacgggcagc ccccggccgc gggtccccga gtgacgctgg cggcacctga gagtgtggcg 420 cgggcccggg gccacgcagc ggagcccagt gtccagtgaa gcgtctgagg acccgccgcc 480 cgtgccgccg cc atg gtg atg tcc cag ggc acc tac acg ttc ctc 525 Met Val Met Ser Gln Gly Thr 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Leu Ala Pro Pro Gln Pro Pro Pro His 65 70 75 80 Arg Ser Arg Leu Glu Ala Pro Ala His Ala His Ser His Pro His Val 85 90 95 His Val His Pro Leu Leu His His Gly Pro Ala Gln Pro His Ala His 100 105 110 Ala His Pro His Pro His His His Ala Leu Pro His Pro Pro Pro Thr 115 120 125 His Leu Ser Val Pro Pro Arg Pro Trp Ser Tyr Pro Arg Gln Ala Glu 130 135 140 Ser Asp Met Ser Lys Pro Pro Cys Tyr Glu Glu Ala Val Leu Met Ala 145 150 155 160 Glu Pro Pro Pro Pro Tyr Ser Glu Val Leu Thr Asp Thr Arg Gly Leu 165 170 175 Tyr Arg Lys Ile Val Thr Pro Phe Leu Ser Arg Arg Asp Ser Ala Glu 180 185 190 Lys Gln Glu Gln Pro Pro Pro Ser Tyr Lys Pro Leu Phe Leu Asp Arg 195 200 205 Gly Tyr Thr Ser Ala Leu His Leu Pro Ser Ala Pro Arg Pro Ala Pro 210 215 220 Pro Cys Pro Ala Leu Cys Leu Gln Ala Asp Arg Gly Arg Arg Val Phe 225 230 235 240 Pro Ser Trp Thr Asp Ser Glu Leu Ser Ser Arg Glu Pro Leu Glu His 245 250 255 Gly Ala Trp Arg Leu Pro Val Ser Ile Pro Leu Phe Gly Arg Thr Thr 260 265 270 Ala Val <210> 5 <211> 2989 <212> 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Asn Lys Glu Gln Leu Glu Ala Arg Arg Arg Arg Lys Gly Thr Asn Ile 90 95 100 tca gaa aca agc tta ata gga aca gct gcc tgt aca tca aca tct tct 1286 Ser Glu Thr Ser Leu Ile Gly Thr Ala Ala Cys Thr Ser Thr Ser Ser 105 110 115 120 cag aat gac cca gaa gtt atc atc gtg gga gct ggc gtg ctt ggc tct 1334 Gln Asn Asp Pro Glu Val Ile Ile Val Gly Ala Gly Val Leu Gly Ser 125 130 135 gct ttg gca gct gtg ctt tcc aga gat gga aga aag gtg aca gtc att 1382 Ala Leu Ala Ala Val Leu Ser Arg Asp Gly Arg Lys Val Thr Val Ile 140 145 150 gag aga gac tta aaa gag cct gac aga ata gtt gga gaa ttc ctg cag 1430 Glu Arg Asp Leu Lys Glu Pro Asp Arg Ile Val Gly Glu Phe Leu Gln 155 160 165 ccg ggt ggt tat cat gtt ctc aaa gac ctt ggt ctt gga gat aca gtg 1478 Pro Gly Gly Tyr His Val Leu Lys Asp Leu Gly Leu Gly Asp Thr Val 170 175 180 gaa ggt ctt gat gcc cag gtt gta aat ggt tac atg att cat gat cag 1526 Glu Gly Leu Asp Ala Gln Val Val Asn Gly Tyr Met Ile His Asp Gln 185 190 195 200 gaa agc aaa tca gag gtt cag att cct tac cct ctg tca gaa aac aat 1574 Glu Ser Lys Ser Glu Val Gln Ile Pro Tyr Pro Leu Ser Glu Asn Asn 205 210 215 caa gtg cag agt gga aga gct ttc cat cac gga aga ttc atc atg agt 1622 Gln Val Gln Ser Gly Arg Ala Phe His His Gly Arg Phe Ile Met Ser 220 225 230 ctc cgg aaa gca gct atg gca gag ccc aat gca aag ttt att gaa ggt 1670 Leu Arg Lys Ala Ala Met Ala Glu Pro Asn Ala Lys Phe Ile Glu Gly 235 240 245 gtt gtg tta cag tta tta gag gaa gat gat gtt gtg atg gga gtt cag 1718 Val Val Leu Gln Leu Leu Glu Glu Asp Asp Val Val Met Gly Val Gln 250 255 260 tac aag gat aaa gag act gga gat atc aag gaa ctc cat gct cca ctg 1766 Tyr Lys Asp Lys Glu Thr Gly Asp Ile Lys Glu Leu His Ala Pro Leu 265 270 275 280 act gtt gtt gca gat ggg ctt ttc tcc aag ttc agg aaa agc ctg gtc 1814 Thr Val Val Ala Asp Gly Leu Phe Ser Lys Phe Arg Lys Ser Leu Val 285 290 295 tcc aat aaa gtt tct gta tca tct cat ttt gtt ggc ttt ctt atg aag 1862 Ser Asn Lys Val Ser Val Ser Ser His Phe Val Gly Phe Leu Met Lys 300 305 310 aat gca cca cag ttt aaa gca aat cat gct gaa ctt att tta gct aac 1910 Asn Ala Pro Gln Phe Lys Ala Asn His Ala Glu Leu Ile Leu Ala Asn 315 320 325 ccg agt cca gtt ctc atc tac cag att tca tcc agt gaa act cga gta 1958 Pro Ser Pro Val Leu Ile Tyr Gln Ile Ser Ser Ser Glu Thr Arg Val 330 335 340 ctt gtt gac att aga gga gaa atg cca agg aat tta aga gaa tac atg 2006 Leu Val Asp Ile Arg Gly Glu Met Pro Arg Asn Leu Arg Glu Tyr Met 345 350 355 360 gtt gaa aaa att tac cca caa ata cct gat cac ctg aaa gaa cca ttc 2054 Val Glu Lys Ile Tyr Pro Gln Ile Pro Asp His Leu Lys Glu Pro Phe 365 370 375 tta gaa gcc act gac aat tct cat ctg agg tcc atg cca gca agc ttc 2102 Leu Glu Ala Thr Asp Asn Ser His Leu Arg Ser Met Pro Ala Ser Phe 380 385 390 ctt cct cct tca tca gtg aag aaa cga ggt gtt ctt ctt ttg gga gac 2150 Leu Pro Pro Ser Ser Val Lys Lys Arg Gly Val Leu Leu Leu Gly Asp 395 400 405 gca tat aat atg agg cat cca ctt act ggt gga gga atg act gtt gct 2198 Ala Tyr Asn Met Arg His Pro Leu Thr Gly Gly Gly Met Thr Val Ala 410 415 420 ttt aaa gat ata aaa cta tgg aga aaa ctg cta aag ggt atc cct gac 2246 Phe Lys Asp Ile Lys Leu Trp Arg Lys Leu Leu Lys Gly Ile Pro Asp 425 430 435 440 ctt tat gat gat gca gct att ttc gag gcc aaa aaa tca ttt tac tgg 2294 Leu Tyr Asp Asp Ala Ala Ile Phe Glu Ala Lys Lys Ser Phe Tyr Trp 445 450 455 gca aga aaa aca tct cat tcc ttt gtc gtg aat atc ctt gct cag gct 2342 Ala Arg Lys Thr Ser His Ser Phe Val Val Asn Ile Leu Ala Gln Ala 460 465 470 ctt tat gaa tta ttt tct gcc aca gat gat tcc ctg cat caa cta aga 2390 Leu Tyr Glu Leu Phe Ser Ala Thr Asp Asp Ser Leu His Gln Leu Arg 475 480 485 aaa gcc tgt ttt ctt tat ttc aaa ctt ggt ggc gaa tgt gtt gcg ggt 2438 Lys Ala Cys Phe Leu Tyr Phe Lys Leu Gly Gly Glu Cys Val Ala Gly 490 495 500 cct gtt ggg ctg ctt tct gta ttg tct cct aac cct cta gtt tta att 2486 Pro Val Gly Leu Leu Ser Val Leu Ser Pro Asn Pro Leu Val Leu Ile 505 510 515 520 gga cac ttc ttt gct gtt gca atc tat gcc gtg tat ttt tgc ttt aag 2534 Gly His Phe Phe Ala Val Ala Ile Tyr Ala Val Tyr Phe Cys Phe Lys 525 530 535 tca gaa cct tgg att aca aaa cct cga gcc ctt ctc agt agt ggt gct 2582 Ser Glu Pro Trp Ile Thr Lys Pro Arg Ala Leu Leu Ser Ser Gly Ala 540 545 550 gta ttg tac aaa gcg tgt tct gta ata ttt cct cta att tac tca gaa 2630 Val Leu Tyr Lys Ala Cys Ser Val Ile Phe Pro Leu Ile Tyr Ser Glu 555 560 565 atg aag tat atg gtt cat ta agcttaaagg ggaaccattt gtgaatgaat 2680 Met Lys Tyr Met Val His 570 atttggaact taccaagtcc taagagactt ttggaagagg atatatatag catagtacca 2740 taccacttat aaagtggaaa ctcttggacc aagatttgga ttaatttgtt tttgaagttt 2800 tttgtatata aatatgtaaa tacatgcttt aatttgcaat ttaaaatgaa ggggttaaat 2860 aagttagaca tttaaaagaa atgattgtta ccataaatta gtgctaatgc tgaggagaac 2920 tacagttttt cttttgaatt tagtatttga gatgagttgt tgggacatgc aaataaaatg 2980 aagaatgaa 2989 <210> 6 <211> 574 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Trp Thr Phe Leu Gly Ile Ala Thr Phe Thr Tyr Phe Tyr Lys Lys 1 5 10 15 Phe Gly Asp Phe Ile Thr Leu Ala Asn Arg Glu Val Leu Leu Cys Val 20 25 30 Leu Val Phe Leu Ser Leu Gly Leu Val Leu Ser Tyr Arg Cys Arg His 35 40 45 Arg Asn Gly Gly Leu Leu Gly Arg Gln Gln Ser Gly Ser Gln Phe Ala 50 55 60 Leu Phe Ser Asp Ile Leu Ser Gly Leu Pro Phe Ile Gly Phe Phe Trp 65 70 75 80 Ala Lys Ser Pro Pro Glu Ser Glu Asn Lys Glu Gln Leu Glu Ala Arg 85 90 95 Arg Arg Arg Lys Gly Thr Asn Ile Ser Glu Thr Ser Leu Ile Gly Thr 100 105 110 Ala Ala Cys Thr Ser Thr Ser Ser Gln Asn Asp Pro Glu Val Ile Ile 115 120 125 Val Gly Ala Gly Val Leu Gly Ser Ala Leu Ala Ala Val Leu Ser Arg 130 135 140 Asp Gly Arg Lys Val Thr Val Ile Glu Arg Asp Leu Lys Glu Pro Asp 145 150 155 160 Arg Ile Val Gly Glu Phe Leu Gln Pro Gly Gly Tyr His Val Leu Lys 165 170 175 Asp Leu Gly Leu Gly Asp Thr Val Glu Gly Leu Asp Ala Gln Val Val 180 185 190 Asn Gly Tyr Met Ile His Asp Gln Glu Ser Lys Ser Glu Val Gln Ile 195 200 205 Pro Tyr Pro Leu Ser Glu Asn Asn Gln Val Gln Ser Gly Arg Ala Phe 210 215 220 His His Gly Arg Phe Ile Met Ser Leu Arg Lys Ala Ala Met Ala Glu 225 230 235 240 Pro Asn Ala Lys Phe Ile Glu Gly Val Val Leu Gln Leu Leu Glu Glu 245 250 255 Asp Asp Val Val Met Gly Val Gln Tyr Lys Asp Lys Glu Thr Gly Asp 260 265 270 Ile Lys Glu Leu His Ala Pro Leu Thr Val Val Ala Asp Gly Leu Phe 275 280 285 Ser Lys Phe Arg Lys Ser Leu Val Ser Asn Lys Val Ser Val Ser Ser 290 295 300 His Phe Val Gly Phe Leu Met Lys Asn Ala Pro Gln Phe Lys Ala Asn 305 310 315 320 His Ala Glu Leu Ile Leu Ala Asn Pro Ser Pro Val Leu Ile Tyr Gln 325 330 335 Ile Ser Ser Ser Glu Thr Arg Val Leu Val Asp Ile Arg Gly Glu Met 340 345 350 Pro Arg Asn Leu Arg Glu Tyr Met Val Glu Lys Ile Tyr Pro Gln Ile 355 360 365 Pro Asp His Leu Lys Glu Pro Phe Leu Glu Ala Thr Asp Asn Ser His 370 375 380 Leu Arg Ser Met Pro Ala Ser Phe Leu Pro Pro Ser Ser Val Lys Lys 385 390 395 400 Arg Gly Val Leu Leu Leu Gly Asp Ala Tyr Asn Met Arg His Pro Leu 405 410 415 Thr Gly Gly Gly Met Thr Val Ala Phe Lys Asp Ile Lys Leu Trp Arg 420 425 430 Lys Leu Leu Lys Gly Ile Pro Asp Leu Tyr Asp Asp Ala Ala Ile Phe 435 440 445 Glu Ala Lys Lys Ser Phe Tyr Trp Ala Arg Lys Thr Ser His Ser Phe 450 455 460 Val Val Asn Ile Leu Ala Gln Ala Leu Tyr Glu Leu Phe Ser Ala Thr 465 470 475 480 Asp Asp Ser Leu His Gln Leu Arg Lys Ala Cys Phe Leu Tyr Phe Lys 485 490 495 Leu Gly Gly Glu Cys Val Ala Gly Pro Val Gly Leu Leu Ser Val Leu 500 505 510 Ser Pro Asn Pro Leu Val Leu Ile Gly His Phe Phe Ala Val Ala Ile 515 520 525 Tyr Ala Val Tyr Phe Cys Phe Lys Ser Glu Pro Trp Ile Thr Lys Pro 530 535 540 Arg Ala Leu Leu Ser Ser Gly Ala Val Leu Tyr Lys Ala Cys Ser Val 545 550 555 560 Ile Phe Pro Leu Ile Tyr Ser Glu Met Lys Tyr Met Val His 565 570 <210> 7 <211> 1592 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (120)..(668) <400> 7 tacggctgcg agaagacgac agaaggggat taagagggag ggcggggaca actgggtctt 60 ttgcggctgc agcgggcttg taggtgtccg gctttgctgg cccagcaagc ctgataagc 119 atg aag ctc tta tct ttg gtg gct gtg gtc ggg tgt ttg ctg gtg ccc 167 Met Lys Leu Leu Ser Leu Val Ala Val Val Gly Cys Leu Leu Val Pro 1 5 10 15 cca gct gaa gcc aac aag agt tct gaa gat atc cgg tgc aaa tgc atc 215 Pro Ala Glu Ala Asn Lys Ser Ser Glu Asp Ile Arg Cys Lys Cys Ile 20 25 30 tgt cca cct tat aga aac atc agt ggg cac att tac aac cag aat gta 263 Cys Pro Pro Tyr Arg Asn Ile Ser Gly His Ile Tyr Asn Gln Asn Val 35 40 45 tcc cag aag gac tgc aac tgc ctg cac gtg gtg gag ccc atg cca gtg 311 Ser Gln Lys Asp Cys Asn Cys Leu His Val Val Glu Pro Met Pro Val 50 55 60 cct ggc cat gac gtg gag gcc tac tgc ctg ctg tgc gag tgc agg tac 359 Pro Gly His Asp Val Glu Ala Tyr Cys Leu Leu Cys Glu Cys Arg Tyr 65 70 75 80 gag gag cgc agc acc acc acc atc aag gtc atc att gtc atc tac ctg 407 Glu Glu Arg Ser Thr Thr Thr Ile Lys Val Ile Ile Val Ile Tyr Leu 85 90 95 tcc gtg gtg ggt gcc ctg ttg ctc tac atg gcc ttc ctg atg ctg gtg 455 Ser Val Val Gly Ala Leu Leu Leu Tyr Met Ala Phe Leu Met Leu Val 100 105 110 gac cct ctg atc cga aag ccg gat gca tat act gag caa ctg cac aat 503 Asp Pro Leu Ile Arg Lys Pro Asp Ala Tyr Thr Glu Gln Leu His Asn 115 120 125 gag gag gag aat gag gat gct cgc tct atg gca gca gct gct gca tcc 551 Glu Glu Glu Asn Glu Asp Ala Arg Ser Met Ala Ala Ala Ala Ala Ser 130 135 140 ctc ggg gga ccc cga gca aac aca gtc ctg gag cgt gtg gaa ggt gcc 599 Leu Gly Gly Pro Arg Ala Asn Thr Val Leu Glu Arg Val Glu Gly Ala 145 150 155 160 cag cag cgg tgg aag ctg cag gtg cag gag cag cgg aag aca gtc ttc 647 Gln Gln Arg Trp Lys Leu Gln Val Gln Glu Gln Arg Lys Thr Val Phe 165 170 175 gat cgg cac aag atg ctc agc ta gatgggctgg tgtggttggg tcaaggcccc 700 Asp Arg His Lys Met Leu Ser 180 aacaccatgg ctgccagctt ccaggctgga caaagcaggg ggctacttct cccttccctc 760 ggttccagtc ttccctttaa aagcctgtgg catttttcct ccttctccct aactttagaa 820 atgttgtact tggctatttt gattagggaa gagggatgtg gtctctgatc tccgttgtct 880 tcttgggtct ttggggttga agggaggggg aaggcaggcc agaagggaat ggagacattc 940 gaggcggcct caggagtgga tgcgatctgt ctctcctggc tccactcttg ccgccttcca 1000 gctctgagtc ttgggaatgt tgttaccctt ggaagataaa gctgggtctt caggaactca 1060 gtgtctggga ggaaagcatg gcccagcatt cagcatgtgt tcctttctgc agtggttctt 1120 tatcaccacc tccctcccag ccccagcgcc tcagccccag ccccagctcc agccctgagg 1180 acagctctga tgggagagct gggccccctg agcccactgg gtcttcaggg tgcactggaa 1240 gctggtgttc gctgtcccct gtgcacttct cgcactgggg catggagtgc ccatgcatac 1300 tctgctgccg gtcccctcac ctgcacttga ggggtctggg cagtccctcc tctccccagt 1360 gtccacagtc actgagccag acggtcggtt ggaacatgag actcgaggct gagcgtggat 1420 ctgaacacca cagcccctgt acttgggttg cctcttgtcc ctgaacttcg ttgtaccagt 1480 gcatggagag aaaattttgt cctcttgtct tagagttgtg tgtaaatcaa ggaagccatc 1540 attaaattgt tttatttctc tcaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 1592 <210> 8 <211> 183 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Lys Leu Leu Ser Leu Val Ala Val Val Gly Cys Leu Leu Val Pro 1 5 10 15 Pro Ala Glu Ala Asn Lys Ser Ser Glu Asp Ile Arg Cys Lys Cys Ile 20 25 30 Cys Pro Pro Tyr Arg Asn Ile Ser Gly His Ile Tyr Asn Gln Asn Val 35 40 45 Ser Gln Lys Asp Cys Asn Cys Leu His Val Val Glu Pro Met Pro Val 50 55 60 Pro Gly His Asp Val Glu Ala Tyr Cys Leu Leu Cys Glu Cys Arg Tyr 65 70 75 80 Glu Glu Arg Ser Thr Thr Thr Ile Lys Val Ile Ile Val Ile Tyr Leu 85 90 95 Ser Val Val Gly Ala Leu Leu Leu Tyr Met Ala Phe Leu Met Leu Val 100 105 110 Asp Pro Leu Ile Arg Lys Pro Asp Ala Tyr Thr Glu Gln Leu His Asn 115 120 125 Glu Glu Glu Asn Glu Asp Ala Arg Ser Met Ala Ala Ala Ala Ala Ser 130 135 140 Leu Gly Gly Pro Arg Ala Asn Thr Val Leu Glu Arg Val Glu Gly Ala 145 150 155 160 Gln Gln Arg Trp Lys Leu Gln Val Gln Glu Gln Arg Lys Thr Val Phe 165 170 175 Asp Arg His Lys Met Leu Ser 180 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer of C9orf100 <400> 9 ctggtggcca cgtacttttt 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer of C9orf100 <400> 10 gctgttggga cctgtgtttt 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer of PRR7 <400> 11 tgtccaaacc accgtgttac 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer of PRR7 <400> 12 gctgtagtcc tcccgaacaa 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer of SQLE <400> 13 gcttccttcc tccttcatca 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer of SQLE <400> 14 acacattcgc caccaagttt 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer of TMEM9 <400> 15 tgggcacatt tacaaccaga 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer of TMEM9 <400> 16 cgagcatcct cattctcctc 20 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer of B2M <400> 17 caaatgccgc atcttcaa 18 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer of B2M <400> 18 ctcgctccgt ggccttag 18

Claims (17)

1. PRR7 유전자를 포함하는 대장암 진단용 조성물.
2. PRR7 유전자의 센스 및 안티센스 프라이머쌍을 포함하는 대장암 진단용 조성물.
3. 제2항에 있어서, 상기 센스 및 안티센스 프라이머쌍은 서열번호 11, 12로 이루어진 것인 대장암 진단용 조성물.
4. PRR7 유전자로부터 발현된 단백질 또는 이에 대한 항체를 포함하는 대장암 진단용 조성물.
5. 삭제
6. PRR7 유전자, 상기 유전자의 센스 및 안티센스 프라이머쌍, 상기 유전자로부터 발현된 단백질 또는 상기 단백질에 대한 항체를 포함하는 대장암 진단용 키트.
7. PRR7 유전자를 포함하는 대장암 치료제 스크리닝용 조성물.
8. PRR7 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하는 대장암 치료제 스크리닝용 조성물.
9. PRR7 유전자로부터 발현된 단백질에 대한 항체를 포함하는 대장암 치료제 스크리닝용 조성물.
10. 제7항의 조성물을 표적물질로 이용하여 시험대상물질을 접촉시키고, 표적물질과 시험대상물질 간의 반응을 확인하여, 시험대상물질이 상기 유전자의 발현을 증진시키는 활성 또는 억제하는 활성을 나타내는지를 결정하는 단계를 포함하는 대장암 치료제 스크리닝 방법.
11. 제8항의 조성물을 표적물질로 이용하여 시험대상물질을 접촉시키고, 표적물질과 시험대상물질 간의 반응을 확인하여, 시험대상물질이 상기 단백질의 기능을 증진시키는 활성 또는 억제하는 활성을 나타내는지를 결정하는 단계를 포함하는 대장암 치료제 스크리닝 방법.
12. 삭제
13. 삭제
14. PRR7 유전자의 mRNA에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 대장암 치료용 조성물.
15. PRR7 유전자의 siRNA를 포함하는 대장암 치료용 조성물.
16. 삭제
17. PRR7 유전자로부터 발현된 단백질에 대한 항체를 포함하는 대장암 치료용 조성물.

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