TWI816712B

TWI816712B - 癌促進因子表現抑制劑的有效成分之篩選用試藥及其篩選方法、癌之預防或治療劑的有效成分之篩選用試藥及其篩選方法、癌促進因子表現抑制劑及癌之預防或治療劑

Info

Publication number: TWI816712B
Application number: TW107139918A
Authority: TW
Inventors: 浅原弘嗣; 千葉朋希; 阿部健太郎
Original assignee: 國立大學法人東京醫科齒科大學; 日商日本臟器製藥股份有限公司
Priority date: 2017-11-09
Filing date: 2018-11-09
Publication date: 2023-10-01
Also published as: JPWO2019093502A1; EP3719124A1; IL274456A; US20200355672A1; KR20200080309A; EP3719124A4; SG11202004097RA; WO2019093502A1; JP7376873B2; CN111315882A; CA3082006A1; IL274456B1; AU2018364001A1; TW202018090A

Abstract

本發明之課題為發現影響癌促進因子之表現量的新穎因子，並提供基於該因子之癌促進因子表現抑制劑及其開發工具，以及提供癌之診斷藥及診斷方法。

本發明之解決手段為提出一種癌促進因子表現抑制劑，其含有選自RBMS表現抑制劑及RBMS功能抑制劑所構成之群組中的至少1種；以RBMS之表現或功能作為指標的篩選方法；及對該方法有用之表現匣；及含有RBMS基因表現產物檢測劑之癌診斷藥；以及以RBMS基因表現量作為指標之癌檢測方法。

Description

癌促進因子表現抑制劑的有效成分之篩選用試藥及其篩選方法、癌之預防或治療劑的有效成分之篩選用試藥及其篩選方法、癌促進因子表現抑制劑及癌之預防或治療劑

本發明係關於癌促進因子表現抑制劑、其有效成分的篩選方法、對於該方法有用的表現匣、及癌的診斷藥及診斷方法等。

近年，癌之發病及進行中，明顯地浸潤於癌細胞本身或微小環境之免疫細胞所產生的炎症性細胞因子擔任重要角色。已知腫瘤浸潤巨噬細胞、纖維母細胞、及T細胞等淋巴球所產生的TNFα或IL-6等炎症性細胞因子作用於腫瘤細胞，經由活性氧類(ROS)之產生或環氧合酶(cyclooxygenase)之表現亢進所造成的前列腺素產生，而作用於旁分泌(paracrine)，促使因DNA損傷所造成之癌進行或增殖(Nat Rev Cancer,2013,13(11),759-771.)。另一方面，已知癌細胞本身所產生的炎症性細胞因子(IL-6或TNFα等)、趨化因子(IL-8或CXCL1等)或增殖因子(HBEGF或PDGF等)，藉由作用於自迴分泌(autocrine)，將STAT通路、PI3K-Akt通路、NF-κ B通路活化，支持癌細胞之生存或增殖，有助於浸潤能力之獲得(Cancer Res,2013,73(11),3470-3480.、Oncogene,2014,33(29),3784-3793.、及Cancer Res,2007,67(2),585-592.)。已知IL-6在乳癌、肺癌、及肝癌中，藉由調控S100A8/9等游走因子，Bcl2、Myc等細胞凋亡抵抗性基因及為Notch配體之Jagged-1，而促使癌細胞之增殖或轉移(Cancer Cell,2008,13(1),7-9.、J Clin Invest,2007,117(12),3988-4002.、J Clin Invest,2007,117(12),3846-3856.、Cell,2013,155(2),384-396.、Neoplasia,2013,15(7),848-862.、Oncogene,2006,25(31),4300-4309.、及Genes Dev,2015,29(15),1631-1648.)。

RNA-結合基序，單股-交互作用蛋白質2(RNA-binding motif,single-stranded-interacting protein 2(RBMS2))，雖被稱為N末端側具有2個RNA結合域之蛋白質，然而實際上尚無解析其功能之報告，其功能迄今仍未明朗。

本發明之課題為發現影響癌促進因子之表現量的新穎因子，及提供基於該發現之癌促進因子表現抑制劑或其開發工具，以及提供癌之診斷藥及診斷方法。

編碼包含IL-6之多種炎症性細胞因子的mRNA，非常不安定，在轉錄後迅速被分解。另一方面，於轉錄後之階段此等mRNA之安定化，被認為將引起表現量之增大及表現時間延長，而與炎症之慢性化、及進一步癌之發病有關。在此方面，嘗試鑑定出於轉錄後階段調控IL-6的新穎因子。

本發明人等專心研究之結果，發現RBMS進行IL-6等癌促進因子mRNA的轉錄後調節。再者，發現RBMS與細胞增殖、細胞游走、細胞浸潤、細胞轉移有關。基於此等認識，發現藉由RBMS之表現或功能之抑制，可抑制癌促進因子，進一步可進行癌之預防或治療，以及藉由以RBMS之表現量作為指標，可診斷癌。基於以上進行進一步研究，結果完成本發明。

亦即，本發明包含下述之態樣。

第1項一種癌促進因子表現抑制劑之有效成分之篩選用試藥，其含有選自表現匣、包含該表現匣之載體、及包含該載體之細胞所構成之群組中的至少1種，其中該表現匣包含RBMS基因表現調控區域，及被配置成可藉由該區域調控表現的基因。

第2項如第1項記載之篩選用試藥，其中該表現匣係選自包含RBMS1基因表現調控區域之表現匣、包含RBMS2基因表現調控區域之表現匣、及包含RBMS3基因表現調控區域之表現匣所構成之群組中的至少1種。

第3項一種癌促進因子表現抑制劑之有效成分之篩選方法，其係於受檢物質存在下，以選自下述(i)~(iii)所構成之群組中的至少1種作為指標，(i)藉由RBMS基因表現調控區域調控表現之基因表現量；(ii)RBMS與包含AU-富集單元(AU-rich element)之RNA之結合量；及(iii)在RBMS過剩表現細胞中，於3’-UTR包含AU-富集單元之mRNA量或源自該mRNA之蛋白質量。

第4項如第3項記載之篩選方法，其中該指標(i)中之該基因表現量，係選自藉由RBMS1基因表現調控區域調控表現之基因表現量、藉由RBMS2基因表現調控區域調控表現之基因表現量、及藉由RBMS3基因表現調控區域調控表現之基因表現量所構成之群組中的至少1種，且該指標(ii)及(iii)中之該RBMS係選自RBMS1、RBMS2、及RBMS3所構成之群組中的至少1種。

第5項如第3或4項記載之篩選方法，其包含在受檢物質存在下該指標之值，比受檢物質不存在下的該指標之值低的情況，選擇該受檢物質作為癌促進因子表現抑制劑之有效成分。

第6項如第3至5項中任一項記載之篩選方法，其中該AU-富集單元為源自選自CSF2、IL-6、ADAM10、ADM、CTGF、HBEGF、HILPDA、IL-24、THBS1、MYC、TGFB2、ADAM10、ITGA6、F3、PTP4A1、HBEGF、HSPA5、THBS1、PLAU、CYR61、ITGA6、EDIL3、CSF1、ITGB1、及MMP1所構成之群組中之至少1種mRNA的AU-富集單元。

第7項如第3至6項中任一項記載之篩選方法，其包含下述步驟(a1)~(c1)：(a1)使含有表現匣的表現系統與受檢物質接觸的步驟，其中該表現匣包含RBMS基因表現調控區域及被配置成可藉由該區域調控表現的基因；(b1)測定接觸受檢物質之表現系統中該基因之表現量作為受檢表現量，以未接觸受檢物質之表現系統中該基因之表現量作為對照表現量，將該受檢表現量與對照表現量做比較的步驟；及(c1)在受檢表現量比對照表現量低之情況，選擇該受檢物質作為癌促進因子表現抑制劑之有效成分的步驟。

第8項如第7項記載之篩選方法，其中該表現匣係選自包含RBMS1基因表現調控區域之表現匣、包含RBMS2基因表現調控區域之表現匣、及包含RBMS3基因表現調控區域之表現匣所構成之群組中的至少1種。

第9項如第7或8項記載之篩選方法，其中該表現系統為細胞。

第10項如第7至9項中任一項記載之篩選方法，其中該基因為報導子基因(reporter gene)。

第11項如第3至6項中任一項記載之篩選方法，包含下述步驟(a2)~(c2)：(a2)使含AU-富集單元之RNA與RBMS在受檢物質存在下接觸之步驟； (b2)測定在受檢物質存在下接觸之情況該RNA與該RBMS的結合量作為受檢結合量，以在受檢物質不存在下接觸之情況該RNA與該RBMS之結合量作為對照結合量，將該受檢結合量與對照結合量做比較的步驟；及(c2)在受檢結合量比對照結合量低之情況，選擇該受檢物質作為癌促進因子表現抑制劑之有效成分的步驟。

第12項如第11項記載之篩選方法，其中該RBMS為選自RBMS1、RBMS2、及RBMS3所構成之群組中的至少1種。

第13項如項3至6中任一項記載之篩選方法，其包含下述步驟(a3)~(c3)：(a3)將含有於3’-UTR包含AU-富集單元之mRNA且RBMS過剩表現的細胞與受檢物質接觸的步驟；(b3)測定與受檢物質接觸之細胞中的該mRNA量或源自該mRNA之蛋白質量，作為受檢量，以不與受檢物質接觸之細胞中的該mRNA量或源自該mRNA之蛋白質量作為對照量，比較該受檢量與該對照量的步驟；及(c3)在受檢量比對照量低之情況，選擇該受檢物質作為癌促進因子表現抑制劑之有效成分的步驟。

第14項如第13項記載之篩選方法，其中該RBMS係選自RBMS1、RBMS2、及RBMS3所構成之群組中的至少1種。

第15項如第13或14項記載之篩選方法，其中該mRNA包含報導子蛋白質之ORF。

第16項一種癌促進因子表現抑制劑，其含有選自RBMS表現抑制劑及RBMS功能抑制劑所構成之群組中的至少1種。

第17項如第16項記載之癌促進因子表現抑制劑，其中該RBMS表現抑制劑為選自RBMS1表現抑制劑、RBMS2表現抑制劑、及RBMS3表現抑制劑所構成之群組中的至少1種，且該RBMS功能抑制劑為選自RBMS1功能抑制劑、RBMS2功能抑制劑、及RBMS3功能抑制劑所構成之群組中的至少1種。

第18項如第16或17項記載之癌促進因子表現抑制劑，其中該RBMS表現抑制劑含有選自RBMS特異性siRNA、RBMS特異性miRNA、RBMS特異性反義核酸、此等之表現載體、及IL-10所構成之群組中的至少1種RBMS表現抑制劑。

第19項如第16至18項中任一項記載之癌促進因子表現抑制劑，其中為表現抑制對象之該癌促進因子係選自CSF2、IL-6、ADAM10、ADM、CTGF、HBEGF、HILPDA、IL-24、THBS1、MYC、TGFB2、ADAM10、ITGA6、F3、PTP4A1、HBEGF、HSPA5、THBS1、PLAU、CYR61、ITGA6、EDIL3、CSF1、ITGB1、及MMP1所構成之群組中的至少1種。

第20項如第16至19項中任一項記載之癌促進因子表現抑制劑，其係使用作為癌之預防或治療劑。

第21項如第20項記載之癌促進因子表現抑制劑，其中為預防或治療對象之該癌，係選自下述之(X)~(Z)所構成之群組中的至少1種： (X)選自胰臟癌、大腸癌、肺癌、膽管癌、及乳癌所構成之群組中的至少1種；(Y)該癌為RAS基因變異類型之癌；及(Z)該癌為高惡性度之癌。

第22項如第21項記載之癌促進因子表現抑制劑，其中RAS基因變異為KRAS基因變異。

第23項一種癌診斷藥，其含有RBMS基因表現產物檢測劑。

第24項如第23項記載之癌診斷藥，其中該RBMS基因表現產物檢測劑為選自RBMS1基因表現產物檢測劑、RBMS2基因表現產物檢測劑、及RBMS3基因表現產物檢測劑所構成之群組中的至少1種。

第25項如第23或24項記載之診斷藥，其中癌促進因子為選自CSF2、IL-6、ADAM10、ADM、CTGF、HBEGF、HILPDA、IL-24、THBS1、MYC、TGFB2、ADAM10、ITGA6、F3、PTP4A1、HBEGF、HSPA5、THBS1、PLAU、CYR61、ITGA6、EDIL3、CSF1、ITGB1、及MMP1所構成之群組中的至少1種。

第26項如第23至25項中任一項記載之癌診斷藥，其中為診斷對象之該癌，係選自下述之(X)~(Z)所構成之群組中的至少1種：(X)選自胰臟癌、大腸癌、肺癌、膽管癌、及乳癌所構成之群組中的至少1種，(Y)該癌為RAS基因變異類型之癌，及(Z)該癌為高惡性度之癌。

第27項如第26項記載之診斷藥，其中RAS基因變異為KRAS基因變異。

第28項一種癌之檢測方法，其具有：(a1)測定從受檢體所採取之試料中RBMS基因表現產物之受檢表現量的步驟；及(b1)將上述步驟(a1)中所測定之受檢表現量，與從未罹患癌之對照受檢體所採取之試料中RBMS基因表現產物之對照表現量做對比的步驟；以及(c1)以與對照表現量相比受檢表現量較高此一情形作為受檢體罹患癌之判斷指標。

第29項一種癌之進行度之判定方法，其具有：(a2)測定從罹患癌之受檢體所採取之試料中RBMS基因表現產物之受檢表現量的步驟；及(b2)將在上述步驟(a2)所測定之受檢表現量，與從罹患癌之對照受檢體所採取之試料中RBMS基因表現產物之對照表現量做對比的步驟；(c2)以與對照表現量相比受檢表現量較高此一情形作為受檢體比對照受檢體之癌進行度高的判斷指標。

第30項如第28或29項記載之方法，其中該RBMS基因表現產物為選自RBMS1基因表現產物、RBMS2基因表現產物、及RBMS3基因表現產物所構成之群組中的至少1種。

第31項如第28至30項中任一項記載之方法，其中該癌為會因為選自CSF2、IL-6、ADAM10、ADM、CTGF、HBEGF、HILPDA、 IL-24、THBS1、MYC、TGFB2、ADAM10、ITGA6、F3、PTP4A1、HBEGF、HSPA5、THBS1、PLAU、CYR61、ITGA6、EDIL3、CSF1、ITGB1、及MMP1所構成之群組中的至少1種而發病或惡化者。

若依照本發明，可提供利用影響癌促進因子表現量之新穎標的因子的新型癌促進因子表現抑制劑，或癌之新型預防或治療劑，進一步提供此等開發工具(例如有效成分之篩選方法、對該方法有用的表現匣等)。又，若依照本發明，可提供基於新穎機制的癌之診斷藥及診斷方法。

第1A圖展示實施例1A之篩選概要。

第1B圖展示實施例1B之結果。在圖左側中，上方之模式圖展示所用之對照報導子載體(無IL-6之3’UTR)的部分構造，下方之模式圖展示所用之報導子載體(有IL-6之3’UTR)的部分構造。白色長條表示導入空白載體(pcDNA3.1)之情況，黑色長條表示導入RBMS2表現載體(pcDNA3.1 FLAG-RBMS2)之情況。橫軸表示所測定的螢光素酶活性之相對值。

第2圖展示實施例2之結果。在圖形左側之模式圖，表示所用的變異型3’UTR報導子載體之部分構造。橫軸表示螢光素酶活性之相對值。白色長條表示導入空白載體之情況，黑色長條表示導入RBMS2表現載體之情況。*表示t-test之結果，p值表示0.05以下。

第3A圖展示實施例5A之結果。縱軸表示反映生存細胞量之螢光素酶活性。橫軸中，siNega表示導入對照siRNA之情況，siRBMS2表示導入針對RBMS2之siRNA的情況。

第3B圖展示實施例5B之結果。縱軸表示反映細胞數之吸光度，橫軸表示siRNA導入後之經過時間。siNega表示導入對照siRNA之情況，siRBMS2表示導入針對RBMS2之siRNA的情況。

第3C圖展示實施例5C之結果。在照片上方中，siNega表示導入對照siRNA之情況，siRBMS2表示導入針對RBMS2之siRNA的情況，各數字表示藉由IL-1β開始刺激後之經過時間。在照片左側，表示西方轉漬法(Western blotting)之檢測對象。

第4圖展示實施例6之結果。siNega表示導入對照siRNA之情況，siRBMS2表示導入針對RBMS2之siRNA的情況。

第5圖展示實施例7之結果。siNega表示導入對照siRNA之情況，siRBMS2表示導入針對RBMS2之siRNA的情況。

第6圖展示實施例8A之結果。橫軸表示螢光素酶活性之相對值(在導入RBMS2表現載體之情況的活性/在導入空白載體之情況的活性)。縱軸表示配置於報導子載體中之螢光素酶基因下游的3’UTR之來源基因。縱軸中，Empty表示於報導子載體中之螢光素酶基因下游未配置來自其他基因之3’UTR的情況。

第7圖展示實施例8B之結果。縱軸表示在以免疫沉降前之細胞溶解液中之螢光素酶mRNA量當作100%的情況，免疫沉降物中之螢光素酶mRNA量之相對值。橫軸中，AUUUA表示在螢光素酶基因之下游導入連結有F3基因野生型3’UTR之報導子載體(實施例8A)的情況，AGGGA表示在螢光素酶基因之下游，導入連結有F3基因變異型3’UTR(AU-富集單元之變異型)之報導子載體的情況。黑色長條表示藉由抗FLAG抗體之免疫沉降的情況，白色長條表示藉由非特異性IgG之免疫沉降的情況。

第8圖展示實施例9之結果。胺基酸標示法為一文字標示法。胺基酸序列之上方及右側之數字，表示從N末端側數起之胺基酸編號。

第9圖展示實施例10之結果。縱軸表示相對於HPRT基因之表現量之各RBMS基因之表現量的相對值。橫軸表示細胞株之名稱。

第10圖展示實施例11之結果。縱軸表示螢光素酶活性。橫軸表示配置於報導子載體中之螢光素酶基因下游的3’UTR之來源基因。

第11圖展示實施例12之結果。縱軸表示反映細胞數之吸光度，橫軸表示siRNA導入後之經過時間。siNega表示導入對照siRNA之情況，siRBMS1表示導入針對RBMS1之siRNA的情況，siRBMS2表示導入針對RBMS2之siRNA的情況。

第12圖展示實施例13之結果。

第13圖展示實施例14之結果。縱軸表示相對於HPRT mRNA表現量之RBMS2 mRNA表現量的相對值。橫軸表示IL-10蛋白質或TGFβ蛋白質添加後之經過時間。白色長條表示添加IL-10蛋白質之情況，黑色長條表示添加TGFβ蛋白質之情況。

第14圖表示實施例15之PAR-CLIP之概要。

第15圖表示實施例15之結果。各線條表示上部所示之基因(從左側起5’→3’)，線條中，黑盒區(black box)表示外顯子。黑盒區之中，細部分表示UTR(非編碼區域)，粗部分表示CDS(編碼區域)。線條下方之點，表示AU-富集單元之位置。線條上方之圖，為縱軸表示RBMS2結合量(=序列引導(sequence lead)數)之圖。

第16A圖展示實施例16之結果(RBMS2之表現數據)。縱軸表示表現量，橫軸表示細胞種類。

第16B圖展示實施例16之結果(RBMS1之表現數據)。縱軸表示表現量，橫軸表示細胞種類。

第17A圖展示實施例17之結果(定量PCR1)。縱軸表示以HPRT之表現量修正的RBMS2表現量，橫軸表示細胞種類。

第17B圖展示實施例17之結果(西方轉漬法)。照片上方表示細胞種類。siRBMS2表示導入針對RBMS2之siRNA的情況。

第17C圖展示實施例17之結果(定量PCR2)。上方之照片，為MCF-7細胞(對照(Control))及在該細胞導入KRAS G13D變異體所得到之細胞(KRAS^G13D)的觀察像。下方之圖，表示以HPRT之表現量修正的RBMS2或IL-6表現量。各圖之橫軸表示所使用之細胞種類(MCF-7細胞(對照)、在該細胞導入KRAS G13D變異體所得到的細胞(KRAS^G13D))。

第17D圖展示實施例17之結果(定量PCR3)。各圖中，縱軸表示圖上方之基因以HPRT之表現量修正後的表現量。圖之橫軸中，siNega表示導入陰性對照siRNA之情況，siKRAS表示導入針對KRAS之siRNA的情況。

第17E圖展示從實施例17之結果所暗示的RBMS2之表現調控及癌促進因子之表現調控的機構。

第18圖展示實施例18之結果。各圖中，縱軸表示生存率，橫軸表示時間(單位為年)。

第19圖展示實施例19之結果。各圖中，縱軸表示以HPRT之表現量修正的RBMS2表現量，橫軸表示細胞種類。

第20A圖展示實施例20之結果(RBMS2)。縱軸表示以HPRT之表現量修正的RBMS2表現量。橫軸中，empty表示導入空白載體之情況，KRAS表示導入野生型KRAS(WT)或各種變異型KRAS(G12D、G12S、G12V、G13D)之表現載體的情況。白色長條表示以含100ng/ml去氧羥四環黴素(doxycycline)之培養基培養的情況，黑色長條表示以含1000ng/ml去氧羥四環黴素之培養基培養的情況。

第20B圖展示實施例20之結果(RBMS1)。縱軸表示以HPRT之表現量修正的RBMS1表現量。其他與第20A圖相同。

第20C圖展示實施例20之結果(IL-6)。縱軸表示以HPRT之表現量修正的IL-6表現量。其他與第20A圖相同。

第20D圖展示實施例20之結果(IL-8)。縱軸表示以HPRT之表現量修正的IL-8表現量。其他與第20A圖相同。

第21A圖展示實施例21之結果(使用MCF-7細胞及MDA-MB-231細胞之情況)。縱軸表示以未添加放線菌素D之樣本中的表現量當作100%時之殘存RNA量，橫軸表示放線菌素D添加後之經過時間。

第21B圖展示實施例21之結果(使用HepG2細胞、LoVo細胞及HPAF-II細胞之情況)。其他與第21A圖相同。

第21C圖展示實施例21之結果(導入針對KRAS之siRNA的情況)。其他與第21A圖相同。

第21D圖展示實施例21之結果(導入針對RBMS2之siRNA的情況)。其他與第21A圖相同。

第22圖展示實施例22之結果。在圖旁邊，表示所使用之啟動子的模式圖。盒(box)表示RBMS2之外顯子(從左起第1外顯子、第2外顯子)。圖形之橫軸表示螢光素酶活性之修正值。

1.定義

在本說明書中，關於「含有」及「包含」之表現方式，包含所謂「含有」、「包含」、「實質上由…所構成」及「只由其構成」之概念。

胺基酸序列之「相同性」意指2個以上之可對比的胺基酸序列，彼此之間胺基酸序列之一致程度。因此，某2個胺基酸序列之一致性越高，該等序列之相同性或類似性越高。胺基酸序列之相同性之程度，例如，可使用為序列分析用工具之FASTA，以預設參數來決定。或者，可使用藉由Karlin及Altschul之演算法BLAST(Karlin S,Altschul SF.“Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoringschemes”Proc Natl Acad Sci USA.87：2264-2268(1990)、KarlinS,Altschul SF.“Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences.”Proc Natl Acad Sci USA.90：5873-7(1993)來決定。根據此種BLAST之演算法而被稱為BLASTX的程式正開發中。此等解析方法之具體手法為周知，只要參照National Center of Biotechnology Information(NCBI)之網站(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)即可。又，鹼基序列之『相同性』亦以上述為基準加以定義。

在本說明書中，「保守性置換」意指胺基酸殘基被置換成具有類似側鏈之胺基酸殘基。例如，「離胺酸、精胺酸、組胺酸」之具有鹼性側鏈的胺基酸殘基的彼此置換，相當於保守性置換。其他，「天冬胺酸、麩胺酸」之具有酸性側鏈的胺基酸殘基；「甘胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸」之具有非帶電性極性側鏈的胺基酸殘基；「丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸」之具有非極性側鏈的胺基酸殘基；「蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸」之具有β-分枝側鏈的胺基酸殘基；「酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸」之具有芳香族側鏈的胺基酸殘基間彼此之置換，同樣亦相當於保守性置換。

在本說明書中，「RBMS」為RBMS家族，具體而言，包含選自RBMS1、RBMS2、及RBMS3所構成之群組的至少1種。此等之中，較佳可列舉RBMS1、RBMS2，更佳可列舉RBMS2。RBMS可為單獨1種，亦可為2種以上之組合。就較佳之組合而言，可列舉RBMS2與RBMS1及/或RBMS3之組合。

在本說明書中，單獨以「RBMS」、「RBMS1」、「RBMS2」、「RBMS3」表示之情況，意指其蛋白質。

在本說明書中，「核苷酸」、「寡核苷酸」及「多核苷酸」與核酸同義，為包含DNA及RNA二者。又，此等可為雙股，亦可為單股，在具有某序列之「核苷酸」(或「寡核苷酸」、「多核苷酸」)的情況，若非特別述及，亦概括地意指具有互補之序列的「核苷酸」(或「寡核苷酸」及「多核苷酸」)。再者，在「核苷酸」(或「寡核苷酸」及「多核苷酸」)為RNA之情況，序列表所示之鹼基記號「T」改讀為「U」者。

在本說明書中，「癌」包含各種癌。就癌而言，例如，可列舉胰臟癌、腎臟癌、白血病、食道癌、胃癌、大腸癌、肝臟癌、肺癌、膽管癌、前列腺癌、皮膚癌、乳癌、子宮頸癌等。

癌較佳為選自以下之(X)~(Z)所構成之群組中的至少1種：(X)選自胰臟癌、大腸癌、肺癌、膽管癌、及乳癌所構成之群組中的至少1種，(Y)該癌為RAS基因變異類型之癌，及(Z)該癌為高惡性度之癌。

即使胰臟癌、大腸癌、肺癌、膽管癌、及乳癌之中，以RAS基因變異類型之癌、高惡性度之癌等為較佳。

RAS包含各種RAS，只要能藉由變異成為癌之原因的RAS及/或能使癌進行之RAS即可，無特別限制。就RAS而言，可列舉例如KRAS、NRAS、HRAS等，較佳可列舉KRAS。

就RAS基因變異而言，只要能成為癌之原因的變異及/或能使癌進行之變異，無特別限制。就該變異而言，例如若為人類之KRAS的情況，可列舉例如從N末端算起第12號之胺基酸(G)及從N末端算起第13 號之胺基酸(G)的變異，更具體而言，可列舉例如G12S、G12C、G12R、G12D、G12V、G12A、G13S、G13C、G13R、G13D、G13V、G13A等。關於人類KRAS以外之RAS之情況，藉由比較胺基酸序列、域配置等，可容易地鑑定人類KRAS之上述變異所對應的變異。

高惡性度之癌(亦包含癌幹細胞)，只要為增殖能力、浸潤能力、轉移能力、未分化度等為高度之癌，無特別限制。癌之惡性度能以例如惡性度標記(亦包含癌幹細胞標記)作為指標而決定。例如，在具有上述RAS基因變異之情況，可判定為高惡性度之癌。除此以外，在急性骨髓性白血病之情況的CD34⁺CD38^-，在乳癌之情況的CD44⁺CD24^-/low，在腦腫瘤之情況的CD133⁺，在前列腺癌之情況的CD133⁺或Sca-1⁺，在大腸癌之情況的CD133⁺，在頭頸部扁平上皮癌之情況的CD44⁺，在胰臟癌之情況的CD133⁺CXCR4⁺，在卵巢癌之情況為CD44⁺CD24⁺ESA(epithelial specific antigen)⁺的情況，可判定為高惡性度之癌。又，例如若為乳癌之情況，可將雌激素受體陰性、黃體激素受體陰性、HER2陰性等當作高惡性度之指標。再者，除上述以外，亦能以增殖能力、浸潤能力、轉移能力等相關的各種周知之標記作為高惡性度之指標。惡性度可藉由單獨1種標記判定，亦可藉由2種以上標記之組合判定。

2.篩選用試藥

本發明係關於一種癌促進因子表現抑制劑之有效成分之篩選用試藥(在本說明書中，稱為「本發明之篩選用試藥」)，其含有選自表現匣(在本說明書中，稱為「本發明之表現匣」)、包含該表現匣之載體、及包含該載體之細胞所構成之群組中的至少1種，其中該表現匣包含 RBMS基因表現調控區域及被配置成可藉由該區域來調控表現的基因。以下，針對該等加以說明。

在本案中，「表現匣」意指在細胞(例如真核細胞，較佳為動物細胞，更佳為哺乳動物細胞)內，具有使該表現匣所含之基因表現之功能的多核苷酸。

在本案中「RBMS基因表現調控區域」只要為在細胞內可調控內在性RBMS基因之表現的DNA區域，或具有與其同等之表現調控能力的DNA區域，將無特別限制。就該區域而言，例如，可列舉啟動子，其包含RBMS基因之轉錄開始點、其上游(5’側)之序列、及視需要其下游(3’側)之序列。就該啟動子之具體例而言，在RBMS基因之轉錄開始點之鹼基為+1，其下游(3’側)為正之值，其上游為0或負之值得情況，可列舉如-10000~+2000，較佳-5000~+1000，更佳-2000~+500，進一步更佳-1000~+200，再進一步更佳-500~+100，特佳-200~+50之DNA區域。再者，關於RBMS2，包含在第2外顯子之上游約4kb至2.5kb之間以及第1外顯子與第2外顯子之間，對轉錄活性重要的區域。因此，以包含該2個區域之至少1個區域的啟動子為較佳。該啟動子，只要與在細胞內調控內在性RBMS基因之表現的啟動子具有同等程度之表現調控能力，可具有變異。在此情況，具有變異之啟動子的鹼基序列，與細胞內調控內在性RBMS基因之表現的啟動子的鹼基序列，具有例如70%以上，較佳80%以上，更佳90%以上，進一步更佳為95%以上，再進一步更佳為97%以上，特佳為99%以上之相同性。變異之部位，以例如周知之表現調控元件(例如基本轉錄因子結合區域、各種活化劑結合區域等)以外之部位為較佳。再者，表現調控單元之共通序列已為周知，可在各種數據庫上容易地探索。

在本申請案中「RBMS基因」無特別限制，可列舉源自動物，例如人類、猴、小鼠、大鼠、狗、貓、兔、豬、馬、牛、綿羊、山羊、鹿等各種哺乳類者。

源自各種動物之RBMS基因為周知。為其表現產物之RBMS mRNA及RBMS蛋白質可例示如下。

(RBMS2)

具體言之，例如就人類RBMS2 mRNA而言，可列舉由序列編號1所示之鹼基序列所構成的mRNA(NCBI Reference Sequence：NM_002898.3)，就小鼠RBMS2 mRNA而言，可列舉由序列編號2所示之鹼基序列所構成的mRNA(NCBI Reference Sequence：NM_019711.2)。就人類RBMS2蛋白質而言，可列舉由序列編號3所示之胺基酸序列所構成的蛋白質(NCBI Reference Sequence：NP_002889.1)，就小鼠RBMS2蛋白質而言，可列舉由序列編號4所示之胺基酸序列所構成的蛋白質(NCBI Reference Sequence：NP_062685.2)。又，RBMS2蛋白質亦包含N末端缺損之類型者，就此種類型者而言，若在例如小鼠之情況，可列舉序列編號5所示之胺基酸序列所構成的蛋白質(NCBI Reference Sequence：NP_001034169.1)(mRNA為由序列編號6所示之鹼基序列所構成(NCBI Reference Sequence：NM_001039080.1))。

(RBMS1)

具體言之，例如就人類RBMS1 mRNA而言，可列舉序列編號7所示之鹼基序列所構成的mRNA(NCBI Reference Sequence：NM_016836.3)，就小鼠RBMS1 mRNA而言，可列舉序列編號8所示之鹼基序列所構成的mRNA(NCBI Reference Sequence：NM_001141932.1)。就人類RBMS1蛋白質而言，可列舉序列編號9所示之胺基酸序列所構成的蛋白質(NCBI Reference Sequence：NP_058520.1)，就小鼠RBMS1蛋白質而言，可列舉序列編號10所示之胺基酸序列所構成的蛋白質(NCBI Reference Sequence：NP_001135404.1)。又，RBMS1蛋白質亦包含N末端缺損之類型者。

(RBMS3)

具體言之，例如就人類RBMS3 mRNA而言，可列舉序列編號11所示之鹼基序列所構成的mRNA(NCBI Reference Sequence：NM_001003793.2)，就小鼠RBMS3 mRNA而言，可列舉序列編號12所示之鹼基序列、所構成的mRNA(NCBI Reference Sequence：NM_001172121.1)。就人類RBMS3蛋白質而言，可列舉序列編號13所示之胺基酸序列所構成的蛋白質(NCBI Reference Sequence：NP_001003793.1)，就小鼠RBMS3蛋白質而言，可列舉序列編號14所示之胺基酸序列所構成的蛋白質(NCBI Reference Sequence：NP_001165592.1)。又，RBMS3蛋白質亦包含N末端缺損之類型者。

為RBMS基因之表現產物的RBMS蛋白質，只要為具有源自癌促進因子mRNA(例如，CSF2、IL-6、ADAM10、ADM、CTGF、HBEGF、HILPDA、IL-24、THBS1、MYC、TGFB2、ADAM10、ITGA6、F3、PTP4A1、 HBEGF、HSPA5、THBS1、PLAU、CYR61、ITGA6、EDIL3、CSF1、ITGB1、MMP1等)之3’UTR的mRNA或具有促進從該mRNA轉譯之蛋白質之表現的活性(以下稱為「癌促進因子表現促進活性」)，亦可具有置換、刪除、加成、插入等胺基酸變異。就變異而言，從「癌促進因子表現促進活性較不易損傷」之觀點而言，較佳為置換，更佳為保守性置換。

又，為RBMS基因之表現產物的RBMS mRNA，只要從該mRNA轉譯之蛋白質具有癌促進因子表現促進活性，亦可具有置換、刪除、附加、插入等鹼基變異。就變異而言，以從該mRNA轉譯之蛋白質中不產生胺基酸置換的變異或產生胺基酸之保守性置換的變異為較佳。

癌促進因子表現促進活性之有無，可依照周知之方法或以其為基準而判定。例如，可依照實施例記載之方法或以其為基準而判定。就具體例而言，在實施例1B中，使用受檢蛋白質之表現載體作為表現載體的情況，若與使用空白載體之情況相比，螢光素酶活性更高，則可判定該受檢蛋白質具有癌促進因子表現促進活性。

就為RBMS基因之表現產物的RBMS蛋白質之較佳具體例而言，可列舉選自下述(a)記載之蛋白質及下述(b)記載之蛋白質所構成之群組中的至少1種，(a)由序列編號3~5、9~10、及13~14所示之胺基酸序列所構成的蛋白質、及(b)由與序列編號3~5、9~10、及13~14所示之胺基酸序列具有85%以上之相同性的胺基酸序列所構成，且具有癌促進因子表現促進活性之蛋白質。

在上述(b)中，相同性方面，以90%以上為更佳，以95%以上為進一步更佳，以98%以上為再進一步更佳。

就上述(b)記載之蛋白質之一例而言，例如(b’)可列舉由相對於序列編號3~5、9~10、及13~14所示之胺基酸序列，1個或複數個胺基酸經置換、刪除、加成、或插入之胺基酸序列所構成，且具有癌促進因子表現促進活性之蛋白質。

在上述(b’)中，複數個意指例如2~30個，較佳為2~10個，更佳為2~5個，再進一步更佳為2或3個。

就為RBMS基因之表現產物的RBMS mRNA之較佳具體例而言，可列舉選自下述(c)記載之mRNA及下述(d)記載之mRNA所構成之群組中之至少一種，(c)由序列編號1~2、6~8、及11~12所示之鹼基序列所構成的mRNA；及(d)由與序列編號1~2、6~8、及11~12所示之鹼基序列具有85%以上之相同性的鹼基序列所構成，且編碼具有癌促進因子表現促進活性之蛋白質的mRNA。

在上述(d)中，相同性更佳為90%以上，進一步更佳為95%以上，再進一步更佳為98%以上。

就上述(d)記載之蛋白質之一例而言，可列舉如(d’)由相對於序列編號1~2、6~8、及11~12所示之鹼基序列，1個或複數個鹼基經置換、刪除、加成、或插入的鹼基序列所構成，且具有癌促進因子表現促進活性之蛋白質。

在上述(d’)中，複數個意指例如2~500個，較佳為2~100個，更佳為2~50個，進一步更佳為2~10個。

在本案中，被配置成可藉由RBMS基因表現調控區域來調控表現之「基因」，只要為能檢測其表現產物之基因，將無特別限制。再者，其中「基因」意指包含該基因之表現產物即蛋白質之編碼序列者，其雖可包含該基因之其他序列(例如內含子序列等)，然而未包含啟動子之概念。就該基因而言，例如，可列舉報導子基因、藥劑耐性基因、酵素基因、構造基因、輸送基因、貯藏基因、收縮基因、防禦基因、調節基因等、此等基因之改變基因等。就改變基因之例而言，可列舉以可使為其表現產物之蛋白質之一部分中發生置換、刪除、加成、插入等胺基酸變異之方式使鹼基產生變異的上述基因，或能表現由複數種上述基因之表現產物融合成之蛋白質的基因等。此等之中，較佳可列舉報導子基因、藥劑耐性基因等，更佳為報導子基因。

在本案中「報導子基因」，意指例如只要為編碼與特定基質反應而能發光(顯色)的蛋白質或編號藉由激發光而發出螢光的蛋白質的基因，將無特別限定。就發光(顯色)蛋白質而言，可列舉例如螢光素酶、β半乳糖苷酶、氯黴素乙醯轉移酶、β葡萄醣醛酸酶等，就螢光蛋白質而言，可列舉例如GFP、Azami-Green、ZsGreen、GFP2、HyPer、Sirius、BFP、CFP、Turquoise、Cyan、TFP1、YFP、Venus、ZsYellow、Banana、KusabiraOrange、RFP、DsRed、AsRed、Strawberry、Jred、KillerRed、Cherry、HcRed、mPlum等。

在本申請案中「藥劑耐性基因」，只要為可賦予表現其之細胞對於抗菌藥等藥劑之耐性的基因，將無特別限定。具體而言，例如，可列舉氯黴素耐性基因、四環素耐性基因、新黴素耐性基因、紅黴素耐性基因、大觀黴素耐性基因、卡納黴素耐性基因、潮黴素耐性基因、嘌呤黴素耐性基因等。

關於上述「基因」「被配置成表現可被調控」，意指以可使該基因所編碼之蛋白質表現之方式配置該基因。具體而言，例如可列舉從5’側以該基因表現調控區域、該基因之順序配置的態樣。

本發明之表現匣視需要可包含其他單元(例如，多選殖位點(MCS))。例如，若從5’側，依RBMS基因表現調控區域、上述「基因」之順序配置的情況，可列舉在RBMS基因表現調控區域之5’側(較佳為鄰接)、在RBMS基因表現調控區域與上述「基因」之間(較佳為於任一者或兩者鄰接)、在上述「基因」之3’側(較佳為鄰接)，配置MCS之態樣。MCS只要為包含複數(例如2~50，較佳為2~20，更佳為2~10)個限制酵素位點者，將無特別限制。

本發明之表現匣，可為單獨1種，或合併2種以上、3種以上或其以上之組合。

本發明之表現匣，可由其本身單獨，或與其他序列共同構成載體。此種載體(以下稱為「本發明之載體」)亦包含於本發明中。就其他序列而言，無特別限制，可採用表現載體所能包含的各種周知之序列。就此種序列之一例而言，可列舉例如複製起點、藥劑耐性基因等。又，關於藥劑耐性基因之種類，可例示上述者。載體之種類無特別限制，可列舉例如動物細胞表現質體等質體載體；逆轉錄病毒、慢病毒、腺病毒、腺病毒相關病毒、皰疹病毒、仙台病毒等病毒載體等。

本發明之載體，亦可包含於細胞內。此種細胞(以下稱為「本發明之細胞」)亦包含於本發明。在本發明之細胞中，本發明之載體可存在於基因組外，亦能以組入基因組內之狀態存在。就細胞來源之生物種類而言，無特別限制，例如可列舉人類、猴、小鼠、大鼠、狗、貓、兔、豬、馬、牛、綿羊、山羊、鹿等各種哺乳類。又，就該細胞之種類而言，亦無特別限制，可列舉來自各種組織或各種性質之細胞，例如血液細胞、造血幹細胞‧前驅細胞、配子(精子、卵子)、纖維母細胞、上皮細胞、血管內皮細胞、神經細胞、肝細胞、角蛋白生成細胞、肌細胞、表皮細胞、內分泌細胞、ES細胞、iPS細胞、組織幹細胞、癌細胞等。

選自本發明之表現匣、本發明之載體、及本發明之細胞所構成之群組中的至少1種，適合用於後述之本發明之篩選方法。從此觀點，在本發明中，選自本發明之表現匣、本發明之載體、及本發明之細胞所構成之群組中的至少1種，可利用作為癌促進因子表現抑制劑之有效成分之篩選用試藥。

本發明之篩選用試藥，若為含有選自本發明之表現匣、本發明之載體、及本發明之細胞所構成之群組中的至少1種者，將無特別限定，此外，亦可包含例如來自本發明之表現匣的表現產物之檢測所必須者。就此種物之具體例而言，可列舉雜交用之試藥、探針之標識、標識體之檢測劑、緩衝液、器具等。本發明之試藥亦可為包含此等之篩選用套組的形式。

3.篩選方法

本發明係關於一種癌促進因子表現抑制劑之有效成分之篩選方法，其中以受檢物質存在下的選自下述(i)~(iii)所構成之群組中的至少1種作為指標：(i)藉由RBMS基因表現調控區域調控表現的基因表現量、(ii)RBMS與含AU-富集單元之RNA的結合量、及(iii)RBMS過剩表現細胞中於3’-UTR含AU-富集單元的mRNA量或來自該mRNA之蛋白質量(在本說明書中，稱為「本發明之篩選方法」)。

以下，針對其加以說明。

就本案中之「受檢物質」而言，不管為天然存在之化合物或人工製作之化合物，均可廣泛地使用。又，不限於精製之化合物，亦可使用將多種化合物混合而成之組成物，或動植物之萃取液。化合物方面，不限於低分子化合物，亦包含蛋白質、核酸、多糖類等高分子化合物。

本發明之篩選方法，更具體而言，在受檢物質存在下的該指標之值，比受檢物質不存在下的該指標之值低的情況，可選擇該受檢物質作為癌促進因子表現抑制劑之有效成分或其候選物質。

以下，除分別利用指標(i)~(iii)之態樣外，關於具體之篩選方法加以說明。

3-1.利用指標(i)之篩選方法

利用指標(i)之篩選方法，包含下述步驟(a1)~(c1)：(a1)使含有表現匣的表現系統與受檢物質接觸之步驟，其中該表現匣包含RBMS基因表現調控區域及被配置成可藉由該區域來調控表現的基因； (b1)測定接觸受檢物質之表現系統中該基因之表現量作為受檢表現量，以不接觸受檢物質之表現系統中該基因之表現量作為對照表現量，將該受檢表現量與對照表現量做比較的步驟；及(c1)在受檢表現量比對照表現量低之情況，選擇該受檢物質作為癌促進因子表現抑制劑之有效成分的步驟。

在步驟(a1)中，關於「包含RBMS基因表現調控區域及被配置成藉由該區域調控表現之基因的表現匣」，與上述「2.篩選用試藥」同樣。然而，步驟(a1)中之該表現匣，就包含：含有細胞之基因組內之內在性RBMS基因表現調控區域及其下游之RBMS基因的表現匣之點而言，與上述「2.篩選用試藥」中之表現匣相異。

在步驟(a1)中，「表現系統」只要包含可使來自上述表現匣的基因表現之必要成分的系統，將無特別限制。就該表現系統而言，可列舉如無細胞蛋白質表現系統、細胞。無細胞蛋白質表現系統通常由包含轉錄及轉譯所必要之因子(RNA聚合酶、核糖體、各種核糖核苷酸等)的溶液(細胞萃取液等)構成，可使用各種市售者。細胞只要為可使來自上述表現匣的基因表現之細胞，無特別限制，可列舉源自各種組織或各種性質之細胞，例如血液細胞、造血幹細胞‧前驅細胞、配子(精子、卵子)、纖維母細胞、上皮細胞、血管內皮細胞、神經細胞、肝細胞、角蛋白生成細胞、肌肉細胞、表皮細胞、內分泌細胞、ES細胞、iPS細胞、組織幹細胞、癌細胞等。表現系統從「能更簡便地進行篩選」之觀點而言，以細胞為較佳。

在步驟(a1)中，包含上述表現匣之表現系統，在例如表現系統為無細胞蛋白質表現系統之情況，只要其系統之溶液內包含上述表現匣之狀態即可。又，表現系統為細胞之情況，可列舉上述表現匣組入細胞之基因組內的態樣、或存在於基因組外(例如質體之狀態)之態樣等。

在步驟(a1)中，接觸受檢物質之態樣無特別限定。在表現系統為無細胞蛋白質表現系統之情況，例如只在該系統之溶液中添加受檢物質即可。又，在表現系統為細胞之情況，例如只在細胞培養基中添加受檢物質即可。

在步驟(a1)中，受檢物質之接觸時間無特別限制，可依據受檢物質之種類、表現系統之種類等而適宜設定。該時間為例如5分鐘~72小時。

在步驟(b1)中，受檢表現量及對照表現量之測定可依照周知之方法或以其為基準而進行。較佳而言，可使用上述之本發明之診斷藥而進行。若在測定對象為核酸(RBMS mRNA或源自其之核酸(cDNA等))之情況，例如，可使用作為探針或引子，藉由北方轉漬法、RT-PCR法、DNA晶片解析法、原位雜交解析法等測定。若在測定對象為蛋白質之情況，例如，可使用特異性抗體，藉由西方轉漬法、ELISA法等測定。在測定對象為報導子蛋白質之情況，可藉由能檢測該報導子信號(螢光、顯色、發光等)之方法(螢光顯微鏡觀察、螢光素酶檢定等)而測定。在測定對象為藥劑耐性蛋白質之情況，可藉由測定藥劑存在下生存之細胞數，間接地測定。

在利用北方轉漬法之情況，具體而言，可例示將探針以放射性同位素(32P、33P等：RI)或螢光物質等標識，將其依照常法與經轉移至尼龍膜等之源自上述表現系統的mRNA雜交後，所形成之診斷藥與來自受檢者之試料之mRNA的雙股，藉由將來自探針之標識物(RI或螢光物質等標識物質)的信號以放射線檢測器BAS-1800II(富士薄膜公司製)或螢光檢測器等檢測而測定的方法。又，亦可使用AlkPhos Direct Labelling and Detection System(Amersham Pharmacia Biotech公司製)，依照該規程(protocol)將探針標識，與源自上述表現系統之mRNA雜交後，將來自探針標識物之信號藉由多元生物成像器(Multi-BioImager)STORM860(Amersham Pharmacia Biotech公司製)檢測而測定的方法。

在利用RT-PCR法之情況，具體而言，可例示從源自上述表現系統之RNA依照常法調製cDNA，以該cDNA作為模板，以能使標的區域擴增的方式，令一對引子(與上述cDNA(單鏈)結合之正向鏈、與+鏈結合之逆向鏈)與其雜交，依照常法進行PCR法，檢測所得到之擴增雙股DNA的方法。再者，所擴增之雙股DNA之檢測，可使用下述方法：使用預先以RI或螢光物質標識之引子進行PCR，檢測藉由其所產生之標識雙股DNA的方法；使所產生之雙股DNA依照常法轉移至尼龍膜等，使用標識探針與其雜交並檢測的方法等。再者，所生成之標識雙股DNA產物可藉由Agilent 2100 Bioanalyzer(橫河Analytical Systems公司製)等測定。又，亦可藉由SYBR Green RT-PCR Reagents(Applied Biosystems公司製)，依照其規程，調製RT-PCR反應液，在ABI PRISM 7700序列檢測系統(ABI PRISM 7700 Sequence Detection System(Applied Biosystems公司製))中使其反應，並檢測其反應物。

在利用DNA晶片解析之情況，可列舉準備貼附有DNA探針(單股或雙股)之DNA晶片，使其與藉由常法從源自上述表現系統之 RNA所調製的cRNA雜交，然後使DNA與cRNA所形成之雙股與標識探針結合並檢測的方法。

西方轉漬法可例示使用一次抗體後，使用為二次抗體之經125I等放射性同位素、螢光物質、辣根過氧化酶(HRP)等酵素等標識的標識抗體(可與一次抗體結合之抗體)，將所得到之來自標識化合物之放射性同位元素、螢光物質等標識物質之信號藉由放射線測定器BAS-1800II(富士薄膜公司製等)、螢光檢測器等檢測以測定的方法。又，亦可使用一次抗體後，使用ECL Plus Western Blotting Detection System(Amersham Pharmacia Biotech公司製)，依照其規程檢測，並藉由多元生物成像器STORM860(Amersham Pharmacia Biotech公司製)測定。

在步驟(c1)中，例如在受檢表現量比對照表現量低之情況，例如，受檢表現量為對照表現量之1/2、1/5、1/10、1/20、1/50、或1/100之情況，可選擇受檢物質作為癌促進因子表現抑制劑之有效成分或其候選物質。

3-2.利用指標(ii)之篩選方法

利用指標(ii)之篩選方法，包含下述步驟(a2)~(c2)：(a2)使包含AU-富集單元之RNA及RBMS於受檢物質存在下接觸之步驟；(b2)測定在受檢物質存在下接觸之情況該RNA與該RBMS之結合量作為受檢結合量，以受檢物質不存在下接觸之情況RNA與該RBMS之結合量作為對照結合量，將該受檢結合量與對照結合量做比較的步驟；及 (c2)在受檢結合量比對照結合量低之情況，選擇該受檢物質作為癌促進因子表現抑制劑之有效成分的步驟。

在步驟(a2)中，AU-富集單元係以AUUUA等為代表的通式：(U)_nW¹(U)_mW²(U)_o[式中：U表示尿嘧啶；W¹及W²相同或相異，表示腺嘌呤或尿嘧啶(但是，排除W¹及W²兩者均為尿嘧啶之情況)；n表示0~3之整數；o表示0~3之整數；m表示3~5之整數(較佳為3)]所表示之鹼基序列作為共通序列的單元。該AU-富集單元較佳為源自癌促進因子之mRNA(例如，選自CSF2、IL-6、ADAM10、ADM、CTGF、HBEGF、HILPDA、IL-24、THBS1、MYC、TGFB2、ADAM10、ITGA6、F3、PTP4A1、HBEGF、HSPA5、THBS1、PLAU、CYR61、ITGA6、EDIL3、CSF1、ITGB1、及MMP1所構成之群組中的至少1種mRNA)的AU-富集單元。其中，「源自~之AU-富集單元」，換言之，意指此等mRNA所包含的AU-富集單元。

在步驟(a2)中，包含AU-富集單元之RNA，只要為包含該AU-富集單元之RNA，將無特別限制。該RNA中之AU-富集單元之數目，為例如1~20個，較佳為2~15個，更佳為3~12個，進一步更佳為4~10個，再進一步更佳為6~9個。在該RNA中之AU-富集單元數目為複數的情況，AU-富集單元以存在於比較狹窄範圍內(例如，為20~400bp，較佳為40~200bp，更佳為60~150bp，進一步更佳為80~120bp)為較佳。又，此範圍以富含U(U-rich)為較佳。就富含U之程度而言，相對於該範圍全鹼基數，U之數目之比率，例如為20%以上，較佳為30%以上，更佳為50%以上。此比率之上限無特別限制，然而可例示90%、80%、70%等。

在步驟(a2)中，關於RBMS，與上述「2.篩選用試藥」中的RBMS蛋白質相同。

在步驟(a2)中，接觸受檢物質之態樣，只要可使含AU-富集單元之RNA、RBMS、及受檢物質之3成分接觸的態樣，無特別限定。例如，可列舉將此等3成分於適當溶劑中混合之態樣，或將此等3成分於細胞內共存之態樣等。

在步驟(a2)中，受檢物質之接觸時間無特別限制，可依據受檢物質之種類、接觸係在試驗管內進行或在細胞內進行等而適宜設定。該時間為例如5分鐘~72小時。

在步驟(b2)中，受檢結合量及對照結合量之測定可依照周知之方法，或以其為基準進行。例如，可藉由免疫沉降法或凝膠移位法等測定。

免疫沉降法典型地可依照以下方式進行。調製含有包含AU-富集單元之RNA及RBMS(與受檢物質接觸，或不接觸)之細胞的細胞溶解液，在將標籤加成於針對RBMS之抗體或該RBMS之情況，藉由針對該標籤之抗體使該細胞溶解液進行免疫沉降，再藉由PCR測定沉降物中所含的「包含AU-富集單元之RNA」之量。若該測定量越多，表示受檢結合量或對照結合量越多。

凝膠移位法典型地可依照以下方式進行。將含有包含AU-富集單元之RNA及RBMS(可進一步含有受檢物質，或不含)的溶液，使用適當凝膠(丙烯醯胺凝膠等)等進行電泳，測定顯示包含AU-富集單元之 RNA與RBMS結合之複合體的區帶信號。該測定量越多，表示受檢結合量或對照結合量越多。

在步驟(c2)中，例如在受檢結合量比對照結合量低之情況，例如，受檢結合量為對照結合量之1/2、1/5、1/10、1/20、1/50、或1/100之情況，可選擇受檢物質作為癌促進因子表現抑制劑之有效成分或其候選物質。

3-3.利用指標(iii)之篩選方法

利用指標(iii)之篩選方法，包含下述步驟(a3)~(c3)：(a3)使含有於3’-UTR包含AU-富集單元之mRNA且RBMS過剩表現之細胞，與受檢物質接觸的步驟，(b3)測定與受檢物質接觸之細胞中該mRNA量或源自該mRNA之蛋白質量作為受檢量，以不與受檢物質接觸之細胞中的該mRNA量或源自該mRNA之蛋白質量作為對照量，比較該受檢量與該對照量之步驟，及(c3)在受檢量比對照量低之情況，選擇該受檢物質作為癌促進因子表現抑制劑之有效成分的步驟。

在步驟(a3)中，關於AU-富集單元，係與「3-2.利用指標(ii)之篩選方法」中的AU-富集單元相同。

在步驟(a3)中，於3’-UTR包含AU-富集單元之mRNA，只要在3’-UTR中包含該AU-富集單元之mRNA，將無特別限制。該mRNA之3’-UTR中的AU-富集單元之數目，例如為1~20個，較佳為2~15，更佳為3~12，進一步更佳為4~10，再進一步更佳為6~9。在該mRNA中之AU-富集單元之數目為複數的情況，以AU-富集單元存在於較狹窄範圍內 (例如，20~400bp，較佳為40~200bp，更佳為60~150bp，進一步更佳為80~120bp)為較佳。

在步驟(a3)中，於3’-UTR包含AU-富集單元之mRNA，較佳為癌促進因子之mRNA，更佳可列舉CSF2、IL-6、ADAM10、ADM、CTGF、HBEGF、HILPDA、IL-24、THBS1、MYC、TGFB2、ADAM10、ITGA6、F3、PTP4A1、HBEGF、HSPA5、THBS1、PLAU、CYR61、ITGA6、EDIL3、CSF1、ITGB1、MMP1等之mRNA等，或此等mRNA之變異型。就該變異型而言，較佳可列舉在AU-富集單元以外之序列、或一部分AU-富集單元中，有1或複數個(例如，2~50個，較佳為2~20個，更佳為2~10個，進一步更佳為2~5個，再進一步更佳為2或3個)鹼基經置換、刪除、加成、或插入的mRNA。

在步驟(a3)中，關於RBMS，與上述「2.篩選用試藥」中的RBMS蛋白質相同。

在步驟(a3)中，關於細胞，與上述「3-1.利用指標(i)之篩選方法」中的細胞相同。

在步驟(a3)中，對於接觸受檢物質之態樣無特別限定。例如可列舉在細胞培養基中添加受檢物質之態樣。

在步驟(a3)中，受檢物質之接觸時間無特別限制，可依據受檢物質之種類等而適宜設定。該時間為例如5分鐘~72小時。

在步驟(b3)中，關於受檢量及對照量之測定，與上述「3-1.利用指標(i)之篩選方法」中的受檢表現量及對照表現量之測定相同。

在步驟(c3)中，例如在受檢量比對照量低之情況，例如，受檢量為對照量之1/2、1/5、1/10、1/20、1/50、或1/100的情況，可選擇受檢物質作為癌促進因子表現抑制劑之有效成分或其候選物質。

4.癌促進因子表現抑制劑

本發明係關於一種癌促進因子表現抑制劑(在本說明書中，稱為「本發明之劑」)，其含有選自RBMS表現抑制劑及RBMS功能抑制劑所構成之群組中的至少1種。以下，針對其加以說明。

關於為表現抑制對象及功能抑制對象之RBMS，與上述「2.篩選用試藥」中的RBMS蛋白質相同。

就RBMS表現抑制劑而言，只要能抑制RBMS蛋白質之表現量者，無特別限制，例如可列舉RBMS特異性小型干擾RNA(small interfering RNA(siRNA))、RBMS特異性微RNA(miRNA)、RBMS特異性反義核酸、此等之表現載體等。又，此等之外，IL-10蛋白質亦有可作為RBMS表現抑制劑之功能。

RBMS特異性siRNA只要為特異地抑制編碼RBMS之基因之表現的雙股RNA分子，將無特別限制。在一實施態樣中，siRNA以例如18鹼基以上、19鹼基以上、20鹼基以上、或21鹼基以上之長度為較佳。又，siRNA以例如25鹼基以下、24鹼基以下、23鹼基以下、或22鹼基以下之長度為較佳。推想在此處記載之siRNA之長度的上限值及下限值可為任意組合。例如，推想可為下列組合：下限為18鹼基，上限為25鹼基、24鹼基、23鹼基、或22鹼基之長度；下限為19鹼基，上限為25鹼基、24鹼基、23鹼基、或22鹼基之長度；下限為20鹼基，上限為25鹼基、24 鹼基、23鹼基、或22鹼基之長度；下限為21鹼基，上限為25鹼基、24鹼基、23鹼基、或22鹼基之長度。

siRNA亦可為shRNA(small hairpin RNA)。shRNA可設計成其一部分形成莖環(stem-loop)構造之方式。例如，shRNA可設計成：若將某區域之序列當作序列a，將相對於序列a之互補鏈當作序列b，則以如序列a、間隔(spacer)、序列b之順序，使此等序列存在於單股RNA鏈中，且全體成為45~60鹼基之長度。序列a係編碼為標的之RBMS的鹼基序列之一部分區域的序列，標的區域無特別限定，任何區域均可作為候選。於是，序列a之長度為19~25鹼基，較佳19~21鹼基。

RBMS特異性siRNA可在5’或3’末端，具有加成之鹼基。該加成之鹼基的長度，通常為約2~4鹼基。該加成之鹼基，可為DNA亦可為RNA，然而若使用DNA，則有可使核酸之安定性提高的情況。就此種加成之鹼基之序列而言，可列舉如ug-3’、uu-3’、tg-3’、tt-3’、ggg-3’、guuu-3’、gttt-3’、ttttt-3’、uuuuu-3’等序列，然而不限定於此等者。

siRNA亦可在3'末端具有突出部序列(懸垂(overhang))，具體而言，可列舉加成dTdT(dT表示去氧胸苷)者。又，亦可為末端無加成之平滑末端(blunt end)。siRNA亦可為正義股與反義股相異之鹼基數，例如，可列舉反義股在3'末端及5'末端具有突出部序列(懸垂)之「不對稱干擾RNA(asymmetrical interfering RNA(aiRNA))」。典型之aiRNA，反義股係由21鹼基構成，正義股係由15鹼基構成，反義股之兩端各形成3鹼基之懸垂構造。

RBMS特異性siRNA之標的序列的位置，理應無特別限制，然而在一實施態樣中，以從下列區域選擇標的序列為較佳：5’-UTR、從開始密碼子至約50鹼基、及3’-UTR以外之區域。對於所選擇之標的序列之候選群，以使用BLAST(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)等同源性檢索軟體調查標的以外之mRNA中是否有連續16-17個鹼基構成之序列與其為同源性，來確認所選擇之標的序列之特異性為較佳。關於特異性經確認之標的序列，亦可設計成由在AA(或NA)以下之19-21鹼基中具有TT或UU之3’末端懸垂的正義股，及具有與該19-21鹼基互補之序列及TT或UU之3’末端懸垂的反義股所構成的雙股RNA，作為siRNA。又，為siRNA之前驅體的shRNA，可藉由適當選擇能形成環構造之任何連接子序列(例如，約5-25鹼基)，將上述正義股與反義股經由該連接子序列連結起來而設計。

siRNA及/或shRNA之序列可使用各種網站上所免費提供的檢索軟體進行檢索。就此種網站而言，例如，可列舉以下各項。

Ambion提供之siRNA Target Finder(http：//www.ambion.com/jp/techlib/misc/siRNA_finder.html)、pSilencer(註冊商標)表現載體(Expression Vector)用插入設計工具(http：//www.ambion.com/jp/techlib/misc/psilencer_converter.html)，RNAi Codex提供之GeneSeer(http：//codex.cshl.edu/scripts/newsearchhairpin.cgi)。

siRNA可藉由將mRNA上之標的序列的正義股及反義股分別以DNA/RNA自動合成機合成，於適當黏合(annealing)緩衝液中，使其在約90至約95℃進行約1分鐘改質後，於約30至約70℃進行約1至約8 小時黏合而調製。又，亦可藉由合成為siRNA之前驅體的shRNA，將其使用RNA切斷蛋白質切丁酶(dicer)切斷而調製。

RBMS特異性miRNA只要能抑制編碼RBMS之基因之轉譯，可為任意者。例如，miRNA，可非如siRNA將標的mRNA切斷，而是與標的之3’非轉譯區域(UTR)對合，抑制其轉譯。miRNA可為pri-miRNA(primary miRNA)、pre-miRNA(precursor miRNA)、及成熟miRNA之任一種。miRNA之長度無特別限制，pri-miRNA之長度通常為數百至數千鹼基，pre-miRNA之長度通常為50至80鹼基，成熟miRNA之長度通常為18至30鹼基。在一實施態樣中，RBMS特異性miRNA，較佳為pre-miRNA或成熟miRNA，更佳為成熟miRNA。此種RBMS特異性miRNA，可依照周知之手法合成，亦可從提供合成RNA之公司購入。

RBMS特異性反義核酸，係包含與編碼RBMS之基因的mRNA之鹼基序列互補或實質上互補的鹼基序列或其一部分的核酸，且其係藉由與該mRNA形成特異性且安定之雙股而結合，具有抑制RBMS蛋白質合成之功能的核酸。反義核酸亦可為DNA、RNA、DNA/RNA嵌合體之任一種。在反義核酸為DNA之情況，藉由標的RNA與反義DNA形成之RNA：DNA雜合體被內在性核糖核酸酶H(RNase H)識別，可引起標的RNA之選擇性分解。因此，在指向被RNase H分解之反義DNA的情況，標的序列不僅可為mRNA中之序列，亦可為RBMS基因之初期轉譯產物的內含子區域之序列。內含子序列，可藉由使用BLAST、FASTA等同源性檢索程式比較基因組序列與RBMS基因之cDNA鹼基序列而決定。

RBMS特異性反義核酸之標的區域，只要為藉由該反義核酸雜交，結果能抑制RBMS蛋白質之轉譯者，其長度無限制。RBMS特異性反義核酸可為編碼RBMS之mRNA之全序列，亦可為部分序列。若考慮合成之容易度或抗原性、細胞內移行性之問題等，以約10至約40鹼基，尤其約15至約30鹼基所構成之寡核苷酸為較佳，然而不以此等為限。更具體而言，可選擇RBMS基因之5’端髮夾(hairpin)環、5’端非轉譯區域、轉譯開始密碼子、蛋白質編碼區域、ORF轉譯終止密碼子、3’端非轉譯區域、3’端廻文(palindrome)區域或3’端髮夾環等作為反義核酸之較佳標的區域，然而不限定於此等者。

RBMS特異性反義核酸不僅抑制與RBMS基因之mRNA或初期轉錄產物雜交，而抑制轉譯成蛋白質，亦可為與為雙股DNA之此等基因結合，形成三股(triplex)，抑制轉錄成RNA者(反基因(antigene))。

構成上述之RBMS特異性siRNA、RBMS特異性miRNA、及RBMS特異性反義核酸之核苷酸分子，為使安定性(化學上及/或對酵素)或比活性(與RNA之親和性)提高，可包含各種化學修飾。例如，為防止藉由核酸酶等水解酵素分解，可將構成反義核酸之各核苷酸的磷酸殘基(phosphate)置換為例如硫代磷酸酯(phosphorothioate；PS)、甲基膦酸酯(methylphosphonate)、二硫代磷酸酯(phosphorodithioate)等化學修飾磷酸殘基。又，亦可將各核苷酸之糖(核糖)之2’位的羥基，置換為-OR(R=CH₃(2’-O-Me)、CH₂CH₂OCH₃(2’-O-MOE)、CH₂CH₂NHC(NH)NH₂、CH₂CONHCH₃、或CH₂CH₂CN等)。再者，亦可對鹼基部分(嘧啶、嘌呤)施行化學修飾，例如，對嘧啶鹼基之5位施行甲基或陽離子性官能基之導入，或對2位之羰基施行置換為硫羰基等。又，構成siRNA或miRNA之核苷酸分子的一部分，亦可置換為天然型之DNA。

RBMS特異性siRNA、RBMS特異性miRNA、及RBMS特異性反義核酸等，可藉由基於RBMS基因之cDNA序列或基因組之DNA序列，決定mRNA或初期轉錄產物之標的序列，並使用市售之DNA/RNA自動合成機，合成與其互補之序列而調製。又，包含上述之各種修飾的反義核酸，亦可依照任何周知之手法，進行化學上的合成。

關於RBMS特異性siRNA、RBMS特異性miRNA、或RBMS特異性反義核酸之表現載體，只要以能表現RBMS特異性siRNA、RBMS特異性miRNA、或RBMS特異性反義核酸之狀態組入，無特別限定。典型而言，該表現載體包含：啟動子序列、以及包含RBMS特異性siRNA、RBMS特異性miRNA、或RBMS特異性反義核酸之編碼序列(視需要進一步可包含轉錄終結信號序列)的多核苷酸，視需要可包含其他序列。啟動子無特別限制，可列舉如CMV啟動子、EF1啟動子、SV40啟動子、MSCV啟動子、hTERT啟動子、β肌動蛋白啟動子、CAG啟動子等RNA聚合酶II(polII)系啟動子；小鼠及人類之U6-snRNA啟動子、人類H1-RNase P RNA啟動子、人類纈胺酸-tRNA啟動子等RNA聚合酶III(polIII)系啟動子等，此等之中，從可正確地進行短RNA之轉錄的觀點而言，以polIII系啟動子為較佳。就其他序列而言，無特別限制，可採用各種能含有表現載體的周知之序列。就此種序列之一例而言，可列舉如複製起點、藥劑耐性基因等。又，藥劑耐性基因之種類及載體之種類可例示上述者。

就RBMS表現抑制劑之其他例而言，可列舉RBMS特異性核糖酵素(ribozyme)等。「核糖酵素」狹義上意指具有切斷核酸之酵素活性的RNA，然而在本案中，只要具有序列特異性之核酸切斷活性，亦可包含DNA。作為核糖酵素核酸之泛用性最高者，為在類病毒(viroid)或擬病毒(virusoid)等感染性RNA中所見到的自我剪接(self-splicing)RNA，已知有槌頭(hammer-head)型或髮夾型等。槌頭型以約40鹼基發揮酵素活性，採取槌頭構造之部分的兩端所鄰接之數個鹼基(合計約10鹼基)，藉由成為與mRNA之期望切斷部位互補的序列，可只特異性地切斷標的mRNA。此類型之核糖酵素核酸，由於只以RNA作為基質，具有「不攻擊基因組DNA」之優點。在RBMS基因之mRNA本身採取雙股構造的情況，藉由使用雜交體核糖酵素，可使標的序列形成單股，其中該雜交種核糖酵素連結有源自病毒核酸，可與RNA解旋酶(helicase)特異性結合的RNA基序[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,98(10)：5572-5577(2001)]。再者，在將核糖酵素以包含編碼其之DNA之表現載體的態樣使用之情況，為了促進轉錄產物向細胞質移行，亦可製作進一步連結有改變tRNA而得之序列的雜交體核糖酵素[Nucleic Acids Res.,29(13)：2780-2788(2001)]。

RBMS功能抑制劑只要為能抑制RBMS蛋白質之功能者，無特別限制。其中，抑制RBMS蛋白質之功能，意指例如使(x)RBMS與含AU-富集單元之RNA的結合量減少，及/或使(y)RBMS過剩表現細胞中的3’-UTR中含AU-富集單元之mRNA量或源自該mRNA之蛋白質量減少。是否抑制RBMS蛋白質之功能，例如，可依照上述「3-2.利用指標(ii)之篩選方法」或「3-3.利用指標(iii)之篩選方法」記載之方法而判定。

為本發明之劑之表現抑制對象的癌促進因子，只要為有助於提高細胞增殖抑制能力、細胞游走抑制能力、細胞浸潤抑制能力、癌細胞轉移抑能力等的因子，無特別限制。就該因子而言，可列舉如CSF2、IL-6、ADAM10、ADM、CTGF、HBEGF、HILPDA、IL-24、THBS1、MYC、TGFB2、ADAM10、ITGA6、F3、PTP4A1、HBEGF、HSPA5、THBS1、PLAU、CYR61、ITGA6、EDIL3、CSF1、ITGB1、MMP1等。

本發明之劑可使用作為癌之預防或治療劑。又，本發明之劑亦可使用作為細胞增殖抑制劑、細胞游走抑制劑、細胞浸潤抑制劑、癌細胞轉移抑制劑等。

本發明之劑只要含有選自RBMS表現抑制劑及RBMS功能抑制劑所構成之群組中的至少1種(在本說明書中，僅稱為「有效成分」)，將無特別限制，然而視需要亦可進一步包含其他成分。就其他成分而言，若為藥學上可容許之成分，即無特別限定，可列舉如基劑、載劑、溶劑、分散劑、乳化劑、緩衝劑、安定劑、賦形劑、黏合劑、崩散劑、潤滑劑、增黏劑、保濕劑、著色料、香料、螯合劑等。

本發明之劑之使用態樣，無特別限制，可依據其種類而採用適當之使用態樣。本發明之劑可於例如試管中使用(例如，添加於培養細胞之培養基中)，亦可使用於活體中(例如，對動物投與)。

本發明之劑之適用對象無特別限定，例如，可列舉人類、猴、小鼠、大鼠、狗、貓、兔、豬、馬、牛、綿羊、山羊、鹿等各種哺乳類動物，動物細胞等。細胞之種類亦無特別限制，可列舉如血液細胞、造血幹細胞‧前驅細胞、配子(精子、卵子)、纖維母細胞、上皮細胞、血管內皮細胞、神經細胞、肝細胞、角蛋白生成細胞、肌肉細胞、表皮細胞、內分泌細胞、ES細胞、iPS細胞、組織幹細胞、癌細胞等。

本發明之劑之劑型無特別限制，可依照其使用態樣而採用適當之劑型。例如，若為對動物投與之情況，可列舉如錠劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、細粒劑、糖漿劑、腸溶劑、緩釋性膠囊劑、咀嚼錠、滴劑、丸劑、內用液劑、糖果錠劑、緩釋劑、緩釋性顆粒劑等經口劑；點鼻劑、吸入劑、肛門栓劑、插入劑、浣腸劑、果凍劑等外用劑等。又，本發明之劑可為固體製劑、半固體製劑、液劑之任一種。

本發明之劑中的有效成分之含量係依隨使用態樣、適用對象、適用對象之狀態等者而定，雖無限定，然而可為例如0.0001~100重量%，較佳為0.001~50重量%。

在將本發明之劑投與至動物之情況的投與量，若為能表現藥效之有效量，將無特別限定，通常就有效成分之重量而言，一般在經口投與之情況，每一日為0.1~1000mg/kg體重，較佳為每一日0.5~500mg/kg體重，在非經口投與之情況，為每一日0.01~100mg/kg體重，較佳為0.05~50mg/kg體重。上述投與量以1日1次或分為2至3次投與為較佳，亦可依據年齡、病態、症狀而適宜增減。

5.診斷藥

本發明係關於含有RBMS基因表現產物檢測劑之癌診斷藥(在本說明書中，亦以「本發明之診斷藥」表示)。以下，針對其加以說明。

為RBMS基因表現產物檢測劑之檢測對象的RBMS基因表現產物，若為在診斷對象生物之活體內表現的RBMS基因表現產物，將無特別限定，可列舉如RBMS mRNA或源自其之核酸(cDNA等)、RBMS蛋白質等。

為診斷對象之動物，若為能將RBMS基因於活體內表現之動物，將無特別限制，可列舉如人類、猴、小鼠、大鼠、狗、貓、兔等各種哺乳類。

關於為檢測對象之RBMS基因表現產物，與上述「2.篩選用試藥」中的RBMS蛋白質、RBMS mRNA相同。

RBMS基因表現產物檢測劑，若為能成為上述RBMS基因表現產物之檢測及定量者，將無特別限定。就RBMS基因表現產物檢測劑而言，在RBMS基因表現產物為核酸(例如，RBMS mRNA、或源自其之核酸(cDNA等)等)之情況，可列舉如引子、探針等，在RBMS基因表現產物為蛋白質之情況，可列舉如抗體等。

引子或探針等若能選擇性地(特異性地)識別RBMS mRNA或源自其之核酸等，將無特別限定。其中，「選擇性地(特異性地)識別」，意指例如在北方轉漬法中，能特異性地檢測RBMS mRNA，或在RT-PCR法中，特異性地擴增RBMS mRNA或其來源核酸(cDNA等)，然而不限定於此等，本技術領域人士只要能判斷上述檢測物或擴增物為源自RBMS mRNA者即可。

就引子或探針之具體例而言，可列舉選自下述(e)記載之多核苷酸及下述(f)記載之多核苷酸所構成之群組中的至少1種：(e)具有RBMS mRNA之鹼基序列中連續至少15個鹼基之多核苷酸及/或與該多核苷酸互補的多核苷酸；及 (f)於嚴苛條件下可雜交於RBMS mRNA之鹼基序列或與其互補之鹼基序列上，且具有至少15個鹼基之多核苷酸。

互補之多核苷酸或互補之鹼基序列(互補股、逆股)，意指相對於RBMS mRNA之鹼基序列所構成之多核苷酸的全長序列，或在該鹼基序列中具有至少連續15鹼基長的鹼基序列的部分序列(其中為方便計，亦將此等稱為「正股」)，基於「A：T及G：C」之鹼基對關係，有鹼基互補之關係的多核苷酸或鹼基序列者。但是，該互補股不限於與為對象之正股之鹼基序列形成完全互補序列的情況，只要具有於嚴苛條件下能與為對象之正股雜交之程度的互補關係者即可。再者，其中嚴苛條件，如Berger and Kimmel(1987,Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology,Vol.152,Academic Press,San Diego CA)所教導，可根據與複合體或探針結合之核酸的熔解溫度(Tm)而決定。例如就雜交後之洗淨條件而言，通常可列舉「1×SSC，0.1%SDS、37℃」程度之條件。互補股以即使於該條件下洗淨仍可與為對象之正股維持雜交狀態者為較佳。雖無特別限制，然而就更嚴苛雜交條件而言，可列舉「0.5×SSC，0.1%SDS，42℃」程度，就進一步更嚴苛雜交條件而言，可列舉「0.1×SSC，0.1%SDS，65℃」程度之洗淨條件。具體而言，就此種互補股而言，可例示與對象之正股之鹼基序列具有完全互補關係之鹼基序列所構成的股，及由與該股具有至少90%，較佳為95%，更佳為98%以上，進一步更佳為99%以上之相同性之鹼基序列所構成的股。

引子或探針等可根據例如RBMS mRNA之鹼基序列，利用例如載體NTI(Infomax公司製)來設計。具體而言，可使用前述RBMS mRNA之鹼基序列付諸於載體NTI之軟體所得到的引子或探針之候選序列、或至少一部分包含該序列的序列，作為引子或探針。

引子或探針等之鹼基長，若為如上述具有連續至少15鹼基之長度者，將無特別限制，可依據用途而適宜設定。就鹼基長度而言，例如若在用作引子之情況，可例示如15鹼基至100鹼基，較佳為15鹼基至50鹼基，更佳為15鹼基至35鹼基，例如若在用作探針之情況，可例示如15鹼基至全序列之鹼基數，較佳為15鹼基至1000鹼基，更佳為100鹼基至1000鹼基。

引子或探針等，只要未顯著損及其功能，亦可施行修飾。就修飾而言，例如，可加成標識物，可列舉如螢光色素、酵素、蛋白質、放射性同位素、化學發光物質、生物素等。

就本發明中所用之螢光色素而言，較佳可使用一般用於標識核苷酸，以檢測或定量核酸者，例如，可列舉HEX(4,7,2’,4’,5’,7’-六氯-6-羧基螢光素，綠色螢光色素)、螢光素(fluorescein)、NED(商品名，應用生物系統公司製，黃色螢光色素)、或6-FAM(商品名，應用生物系統公司製，黃綠色螢光色素)、羅丹明(rhodamin)或其衍生物[例如，四甲基羅丹明(TMR)]，然而不以此等為限。以螢光色素標識核苷酸之方法，可使用周知之標識法中的適當者[參照Nature Biotechnology,14,303-308(1996)]。又，亦可使用市售之螢光標識套組(例如，Amersham Pharmacia公司製，多核苷酸ECL 3’-Oligo Labelling System等)。

引子亦可固定化在任何固相來使用。因此，本發明之診斷藥可以探針(寡或多核苷酸)被固定化之探針形式(例如固定有探針之DNA晶片、cDNA微陣列、寡DNA陣列、膜過濾器等；以下總稱為「DNA晶片等」)來提供。

固定化所使用之固相，若為可固定化寡核苷酸或多核苷酸者，將無特別限制，可列舉如玻璃板、尼龍膜、微珠粒、矽晶片、毛細管或其他基板等。寡或多核苷酸於固相之固定，可為使預先合成之寡或多核苷酸承載於固相上的方法，亦可為將為目的之寡或多核苷酸於固相上合成的方法。固定方法若為例如DNA微陣列，可利用市售之Spotter(Amersham公司製等)等，依據固定化探針之種類，為該技術領域中所周知[例如，藉由光微影技術(Affymetrix公司)、噴墨技術(Rosetta Inpharmatics公司)之寡核苷酸的原位合成等]。

抗體等若為能選擇性地(特異性地)識別RBMS蛋白質者，將無特別限定。其中，「選擇性地(特異性地)識別」，意指例如在西方轉漬法或ELISA法中，能特異性地檢測RBMS蛋白質，然而不以此為限，只要本技術領域人士若能判斷上述檢測物為來自RBMS蛋白質者即可。

抗體方面，包含多株抗體、單株抗體、嵌合體抗體、單鏈抗體、或如Fab片段或藉由Fab表現庫所生成之片段等具有抗原結合性之上述抗體的一部分。對於RBMS蛋白質之胺基酸序列中至少連續通常8胺基酸，較佳15胺基酸，更佳20胺基酸所構成之多肽具有抗原結合性的抗體，亦包含於本發明之抗體中。

此等抗體之製造方法為已周知，本發明之抗體亦可依照此等之常法而製造(Current protocols in Molecular Biology,Chapter 11.12~11.13(2000))。具體而言，在本發明之抗體為多株抗體之情況，使用依照常法於大腸菌等中表現而精製之RBMS蛋白質，或依照常法合成的具有該RBMS蛋白質之部分胺基酸序列的寡肽，將家兔等非人類動物免疫，依照常法從該免疫動物之血清得到。另一方面，在為單株抗體之情況，將依照常法於大腸菌等表現而精製之RBMS蛋白質、或具有RBMS蛋白質之部分胺基酸序列的寡肽，使小鼠等非人類動物免疫，令所得到之脾臟細胞與骨髓瘤細胞進行細胞融合，從所製備得的融合瘤細胞中可得到單株抗體(Current protocols in Molecular Biology edit.Ausubel et al.(1987)Publish.John Wiley and Sons.Section 11.4~11.11)。

抗體之製作中使用作為免疫抗原的RBMS蛋白質，可根據周知之基因序列資料，藉由DNA選殖、各質體之構築、對宿主之轉染、轉形體之培養及從培養物回收蛋白質之操作而得到。此等操作可依據本技術領域人士已知之方法、或文獻記載之方法(Molecular Cloning,T.Maniatis et al.,CSH Laboratory(1983),DNA Cloning,DM.Glover,IRL PRESS(1985))等而進行。

具體而言，藉由製作可使編碼RBMS之基因於期望之宿主細胞中表現的重組DNA(表現載體)，將其導入宿主細胞並轉形，培養該轉形體，從所得到之培養物，回收目的蛋白質，可得到作為製造本發明抗體用之免疫抗原的蛋白質。又，RBMS蛋白質之部分肽，亦可依據周知之基因序列資料，藉由一般化學合成法(肽合成)而製造。

又，本發明之抗體亦可使用具有RBMS蛋白質之部分胺基酸序列的寡肽來製備。使用於該抗體之製造的寡(多)肽，雖不需要具有功能上之生物活性，然而期望具有與RBMS蛋白質同樣免疫原特性者。較佳可例示具有該免疫原特性，且RBMS蛋白質之胺基酸序列中至少連續8胺基酸，較佳15胺基酸，更佳20胺基酸所構成之寡(多)肽。

針對該寡(多)肽之抗體的製造，可藉由依據宿主使用各種佐劑，提高免疫學之反應而進行。雖未限定，然而此種佐劑包含弗氏(Freund)佐劑；如氫氧化鋁之礦物凝膠；以及如溶血卵磷酯、普盧蘭尼克多元醇、多聚陰離子、肽、油乳劑、鑰孔帽貝血藍素(keyhole limpet hemocyanin)及二硝基酚之表面活性物質；BCG(卡爾梅特-嬌蘭桿菌)或短小棒狀桿菌(Corunebacterium parvum)等人類佐劑。

本發明之診斷藥若為含有上述RBMS基因表現產物檢測劑者，將無特別限定，可為僅由該檢測劑構成者，該檢測劑之外，亦可含有檢測例如RBMS基因表現產物所必要者。就此種物之具體例而言，可列舉雜交用之試藥、探針之標識、標識體之檢測劑、緩衝液、器具等。本發明之診斷藥亦可為含此等之診斷藥套組之態樣。

本發明之診斷藥，如後述在「6.疾病之檢測方法」及「7.疾病之進行度之判定方法」中之記載，可使用於癌之有無(亦即，受檢體是否罹患癌)的診斷、及上述診斷對象疾病之進行度的診斷。

6.疾病之檢測方法

本發明係關於以RBMS基因表現產物之表現量作為指標的癌之檢測方法(在本說明書中，亦以「本發明之疾病檢測方法」表示)。以下，針對其加以說明。

就本發明之疾病檢測方法之具體態樣而言，可列舉例如以下之態樣：一種癌之檢測方法，其包含：(a1)測定從受檢體所採取之試料中RBMS基因表現產物之受檢表現量的步驟，及(b1)將上述步驟(a1)所測定之受檢表現量，與從未罹患癌之對照受檢體所採取之試料中的RBMS基因表現產物之對照表現量做對比的步驟，以及(c1)將與對照表現量相比受檢表現量較高此一情形，作為受檢體罹患癌之判斷指標。

受檢體為本發明之疾病檢測方法之對象，其生物種類無特別限定。例如，可列舉人類、猴、小鼠、大鼠、狗、貓、兔等各種哺乳類。

試料若為包含RBMS基因表現產物之試料，將無特別限制，可依據檢測對象疾病之種類等而適宜選擇。就試料而言，可列舉如血液試料、尿試料、其他各種組織片等。就試料而言，雖可將從活體採取者以原樣使用，然而以將檢測對象之RBMS基因表現產物依照常法精製‧濃縮者為較佳。又，在檢測對象之RBMS基因表現產物為核酸之情況，亦可從RBMS mRNA製備反映該mRNA之序列資料的核酸(例如cDNA等)，並使用其作為試料。

RBMS基因表現產物之受檢表現量及對照表現量的測定，可依照周知之方法或以其為基準而進行。較佳而言，可使用上述本發明之診斷藥進行。若RBMS基因表現產物為核酸(RBMS mRNA或源自其之核酸(cDNA等))之情況，例如，可使用本發明之診斷藥作為探針或引子，藉由北方轉漬法、RT-PCR法、DNA晶片解析法、原位雜交解析法等而測定。若RBMS基因表現產物為蛋白質之情況，例如，可使用本發明之診斷藥作為一次抗體，藉由西方轉漬法、ELISA法等而測定。關於此等之具體方法，如上述「3-1.利用指標(i)之篩選方法」記載。

為與受檢表現量之對比對象的對照表現量，雖可為1個受檢體之對照表現量，然而以複數個受檢體之對照表現量的平均值或中位值等為較佳。

受檢體是否有癌之判斷，係以受檢表現量比對照表現量高作為基準而判斷。具體而言，例如可以與對照表現量相比，受檢表現量上升50%以上，較佳為上升100%以上，更佳為上升200%以上，作為指標而進行。

7.疾病之進行度之判定方法

本發明係關於以RBMS基因表現產物之表現量作為指標的癌之進行度之判定方法(在本說明書中，亦以「本發明之進行度判定方法」表示)。以下，對於其加以說明。

就本發明之進行度判定方法的具體態樣而言，可列舉例如以下之態樣。

一種癌之進行度判定方法，其包含(a2)測定從罹患癌之受檢體所採取之試料中RBMS基因表現產物之受檢表現量的步驟，及(b2)將上述步驟(a2)所測定之受檢表現量，與從未罹患癌之對照受檢體所採取之試料中的RBMS基因表現產物之對照表現量做對比的步驟，以及 (c2)以與對照表現量相比受檢表現量較高此一情形，作為受檢體比對照受檢體癌之進行度高之判斷指標。

關於受檢體、試料、受檢表現量及對照表現量之測定、為與受檢表現量之對比對象的對照表現量等，如上述「6疾病之檢測方法」記載。

疾病之進行度，可定義為例如與CSF2、IL-6、ADAM10、ADM、CTGF、HBEGF、HILPDA、IL-24、THBS1、MYC、TGFB2、ADAM10、ITGA6、F3、PTP4A1、HBEGF、HSPA5、THBS1、PLAU、CYR61、ITGA6、EDIL3、CSF1、ITGB1、MMP1等癌促進因子之表現相關症狀之嚴重度。

受檢體是否比對照受檢體之癌之進行度高的判斷，係以受檢表現量比對照表現量高，作為基準進行判斷。具體而言，例如以與對照表現量相比，受檢表現量上升50%以上，較佳上升100%以上，更佳上升200%以上，作為指標而進行。

[實施例]

以下，根據實施例，詳細說明本發明，然而本發明不被此等實施例所限定。

實施例1：為IL-6轉錄後調節因子之RBMS2之鑑定

實施例1A

為了找出IL-6轉錄後調節因子，進行篩選。將概要示於第1A圖。具體而言，如以下方式進行。首先，製作在SV40啟動子之下游，從5’側配置螢光素酶之ORF、IL-6之3’UTR(序列編號15)的報導子載體。將該報導子載體、及各種基因之表現載體，在384孔盤上，使用轉染試藥(Fugene HD，Promega公司製)導入HEK293T細胞中。從導入經過48小時後，測定各孔中的螢光素酶活性。將所得到之測定值與對照(導入空白載體作為表現載體之樣本)之測定值比較，篩選相對於對照有變化之表現載體(1次篩選)。從所選擇之表現載體，萃取與RNA相關之約100基因之表現載體，與上述同樣方式進行篩選(2次篩選)。

2次篩選之結果，鑑定出作為IL-6轉錄後調節因子之RBMS2(NP_002889.1，序列編號3)。

實施例1B

將實施例1A所製作之報導子載體、或從該報導子載體排除人類IL-6之3’UTR所形成的對照報導子載體，與RBMS2表現載體或空白載體一起導入HEK293T細胞中。從導入經過8小時後，測定螢光素酶活性。將結果示於第1B圖。

如第1B圖所示，RBMS2以依存於IL-6之3’UTR之方式，使螢光素酶活性上升。

實施例2：藉著RBMS2並經由ARE的IL-6 mRNA安定化

製作在啟動子之下游，從5’側配置螢光素酶之ORF、IL-6之變異型3’UTR(97-267(鹼基序列：序列編號16)、122-193(鹼基序列：序列編號17)、△ARE1(鹼基序列：序列編號18)、△ARE2(鹼基序列：序列編號19)、或ARE突變體(mutant)(鹼基序列：序列編號20))所形成的變異型3’UTR報導子載體。將該變異型3’UTR報導子載體，與RBMS2表現載體或空白載體一起導入HEK293T細胞中。從導入經過48小時後，測定螢光素酶活性。將結果示於第2圖中。

在IL-6 mRNA之3’UTR中，存在與mRNA之安定化相關的莖環構造，及富含AU之AU-富集單元(ARE)。莖環構造係藉由為RNase之Regnase-1(ZC3H12A)識別及隨後分解的重要單元。又，報導ARID5a藉由拮抗Regnase-1之功能，有助於IL-6 mRNA之安定化。然而，如第2圖所示，RBMS2使3’UTR中該莖環構造缺損之報導子(97-267及122-193)之活性上升。

IL-6 mRNA中2個相鄰之ARE以2處近接的方式存在。已知經由該區域，TTP等ARE結合蛋白質與mRNA之分解有關。如第2圖所示，若缺損一方之ARE區域，則未見到藉由RBMS2的報導子活性上升(△ARE1及△ARE2)。又，即便使ARE之序列變異(將U置換為G)，亦未見到藉由RBMS2的報導子活性上升(ARE mutant)。由此，暗示RBMS2經由ARE區域，與mRNA之安定化有關。

實施例3：藉由RBMS2調控之因子的詳盡解析

將針對RBMS2之siRNA(Thermo Fisher Scientific公司，Silencer(R)Select s11867)或對照siRNA(Thermo Fisher Scientific公司，Silencer^TM Select Negative Control No.1)，使用Lipofectamine RNAiMax，導入為乳癌細胞株之MDA-MB-231細胞中。48小時後，從細胞調製RNA，藉由次世代定序儀(Illumina公司，Next-seq)進行定序。藉由RBMS2減弱(knockdown)，鑑定基因表現改變為2倍以上或一半以下之基因的427基因。萃取為此等基因之3’UTR內具有ARE序列者的243基因。

實施例4：基因功能分類(Gene Ontology)解析

關於藉由RBMS2減弱，基因表現改變為2倍以上或一半以下，且在3’UTR具有ARE之基因群，使用DAVID(https：//david.ncifcrf.gov/tools.jsp)進行基因功能分類解析。其結果，就p值顯示為5%以下且FDR值顯示為10%以下的生物程序(biological process)而言，抽取出「細胞增殖」及「細胞移動」。由此，暗示「細胞增殖」及「細胞移動」係藉由RBMS2調控。再者，就RBMS2之標的基因而言，鑑定出促進細胞增殖之基因有11種(CSF2、IL6、ADAM10、ADM、CTGF、HBEGF、HILPDA、IL24、THBS1、MYC、及TGFB2)、促進細胞移動之基因有9種(ADAM10、ITGA6、F3、PTP4A1、HBEGF、HSPA5、THBS1、PLAU、及CYR61)。此等基因全部為藉由RBMS2減弱使基因表現下降至一半以下之基因。

實施例5：RBMS2影響細胞增殖之解析

實施例5A：生存細胞之解析

使用Lipofectamine RNAiMax，將針對RBMS2之siRNA(Thermo Fisher Scientific公司，Silencer(R)Select s11867)或對照siRNA(Thermo Fisher Scientific公司，Silencer^TM Select Negative Control No.1)導入MDA-MB-231細胞中。48小時後，使用RealTime-Glo^TM MT Cell Viability Assay(Promega公司)測定生存細胞量。將結果示於第3A圖。

如第3A圖所示，藉由RBMS2減弱抑制細胞增殖。

實施例5B：細胞數之解析

將MDA-MB-231細胞播種於96孔盤，培養一晚(16小時)後，使用Lipofectamine RNAiMax，將針對RBMS2之siRNA(Thermo Fisher Scientific公司，Silencer(R)Select s11867)或對照siRNA(Thermo Fisher Scientific公司，Silencer^TM Select Negative Control No.1)導入細胞中。將剛導入siRNA後當作0小時，以後每24小時計測細胞數。細胞數之計測，係使用CellTiter 96(R)AQueous One Solution Cell Proliferation Assay(Promega公司)。將結果示於第3B圖。

如第3B圖所示，藉由RBMS2減弱可抑制細胞增殖。

實施例5C：Akt通路及STAT3通路之解析

使用Lipofectamine RNAiMax，將針對RBMS2之siRNA(Thermo Fisher Scientific公司，Silencer(R)Select s11867)或對照siRNA(Thermo Fisher Scientific公司，Silencer^TM Select Negative Control No.1)導入MDA-MB-231細胞中。48小時後，藉由IL-1β(20ng/ml)刺激30分鐘或60分鐘。用PBS洗淨後，將細胞懸浮於溶解液(20mM Tris-HCl,pH7.5,150mM NaCl,1% NP40,0.5%脫氧膽酸鈉)。將所萃取之蛋白質10μg藉由SDS-PAGE分離後，轉錄於PVDF膜，進行西方轉漬法。就一次抗體而言，將anti-Phospho-Akt(Ser473)(Cell Signaling Technology公司，#4060)、anti-Akt(total)(Cell Signaling Technology公司，#4691)、anti-Phospho-Stat3(Tyr705)(Cell Signaling Technology公司，#9145)、anti-STAT3(total)(Santa Cruz公司，sc-482)、anti-Tubulin(Cell Signaling Technology公司，#2148)分別稀釋1,000倍來使用。就二次抗體而言，將Anti-Rabbit IgG、HRP-Linked F(ab’)2 Fragment Donkey(GE Healthcare公司，NA9340)稀釋10,000倍來使用。藉由ECL試藥(Thermo Fisher Scientific公司， Pierce^TM ECL Western Blotting Substrate)發光，並藉由ImageQuant LAS4000mini(GE Healthcare公司)攝影。將結果示於第3C圖。

如第3C圖所示，藉由RBMS2減弱，抑制細胞增殖相關之信號傳達通路。

實施例6：RBMS2之影響細胞游走能力之解析

使用Lipofectamine RNAiMax，將針對RBMS2之siRNA(Thermo Fisher Scientific公司，Silencer(R)Select s11867)或對照siRNA(Thermo Fisher Scientific公司，Silencer^TM Select Negative Control No.1)導入MDA-MB-231細胞中。48小時後，藉由胰蛋白酶處理，調製細胞懸浮液。以不添加血清之培養基(無血清DMEM培養基)將細胞洗淨2次。在24孔盤中添加800μl之含10%血清的DMEM，在其中設置Transwell插入器(Corning公司，#353097)。將懸浮於無血清DMEM培養基之細胞播種於Transwell插入器。16小時後，將細胞藉由水晶紫(Crystal violet)染色。檢測出染色細胞越多，表示細胞游走能力越高。將結果示於第4圖。

如第4圖所示，藉由RBMS2減弱，抑制細胞游走能力。

實施例7：RBMS2之影響細胞浸潤能力之解析

使用Lipofectamine RNAiMax，將針對RBMS2之siRNA(Thermo Fisher Scientific公司，Silencer(R)Select s11867)或對照siRNA(Thermo Fisher Scientific公司，Silencer^TM Select Negative Control No.1)導入MDA-MB-231細胞中。48小時後，藉由胰蛋白酶處理，調製細胞懸浮液。以未添加血清之培養基(無血清DMEM培養基)洗淨2次。在24孔盤中添加800μl之含10%血清的DMEM，於其中設置基底膜基質(Matrigel)侵入室(invasion chamber)(Corning公司，#354480)。將懸浮於無血清DMEM培養基之細胞播種於基底膜基質侵入室。16小時後，將細胞藉由水晶紫染色。檢測出的染色細胞越多，表示細胞浸潤能力越高。將結果示於第5圖中。

如第5圖所示，藉由RBMS2減弱，抑制細胞浸潤能力。

實施例8：RBMS2之轉移相關因子調控能力的解析

實施例8A

在HEK293T細胞中導入下述報導子載體、Renilla螢光素酶表現載體及RBMS2表現載體或對照空白載體，48小時後，使用Dual-Glo Luciferase Assay System(Promega公司)進行螢光素酶檢定。將結果示於第6圖中。

報導子載體：在SV40啟動子之調控下可表現的螢火蟲(Firefly)螢光素酶基因之下游，配置當RBMS2減弱時表現量降低之基因中，顯示所謂規定「細胞移動(Cell motion)」之基因功能分類(gene ontology)的基因(轉移相關因子)之3’UTR(F3：refseqID NM_001178096.1 939~2233(序列編號21)、PLAU：refseqID NM_001145031.2 1731~2625(序列編號22)、HBEGF：refseqID NM_001945.2 903~2358(序列編號23)、THBS1：refseqID NM_003246.3 3693~7237(序列編號24)、CYR61：refseqID NM_001554.4 1371~2288(序列編號25)、ITGA6：refseqID NM_000210.3 3457~5842(序列編號26)、HSPA5：refseqID NM_005347.4 2227~3970(序列編號27))、(EDIL3：refseqID NM_005711.4 1937~4772(序列編號28)、(CSF1：refseqID NM_000757.5 2079~4250(序列編號29)、(ITGB1： refseqID NM_002211.3 2619~3880(序列編號30)、或(MMP1：refseqID NM_002421.3 1554~2082(序列編號31)所形成的載體。

如第6圖所示，藉由RBMS2過剩表現，具有轉移相關因子之3’UTR的報導子載體之表現量增加。由此，暗示RBMS2，經由3’UTR而將轉移相關因子之mRNA安定化。

實施例8B

在HEK293T細胞中，導入具有F3基因之3’UTR的報導子載體(實施例8A)或使該載體之3’UTR中全部(6個)AU-富集單元(AUUUA)變異為AGGGA所形成的報導子載體，以及附FLAG標籤之RBMS2表現載體。48小時後，回收細胞，溶解於1ml之RIP裂解緩衝液(20mM Tris-HCl(pH 7.5)、100mM KCl、5mM MgCl2、0.5% NP-40、40U/μl RNase抑制劑(東洋紡公司)、Complete迷你蛋白酶抑制劑混合錠(Roche)、1μM PMSF)。在冰上靜置15分鐘後，以20,000xg離心5分鐘，回收上清液。保存50μl之上清液，作為輸入液(input)。剩餘上清液分為2瓶，各450μl，在其中，添加2μg之正常小鼠IgG或anti-FLAG抗體(SIGMA公司，F1804)。繼而，添加50μl之Protein G Dynabeads(Thermo Fisher Scientific公司)，並於4℃反應2小時。反應後，藉由RIP裂解緩衝液將珠粒洗淨3次。將輸入液(input)、及免疫沉降之RNA藉由ReliaPrepTM RNA Cell Miniprep System(Promega公司)精製，使用隨機引子進行逆轉錄。濃縮效率係藉由定量PCR，以相對於輸入液(input)之相對值來決定。將結果示於第7圖。

如第7圖所示，可知RBMS2與F3基因之3’UTR結合，其結合量藉由AU-富集單元之變異而降低。由此，暗示RBMS2係於F3基因之3’UTR，經由AU-富集單元而結合。

實施例9：RBMS家族之同源性解析

將人類RBMS1(RefseqID；NP_058520.1)、人類RBMS2(RefseqID；NP_002889.1)、人類RBMS3(RefseqID；NP_001003793.1)，使用CLC sequence viewer進行同源性解析。將解析結果示於第8圖。

如第8圖所示，RBMS2中，高度保存對標的RNA之結合為重要的RRM1域(從N末端1~128號之區域)及RRM1域內之芳香族胺基酸(*苯丙胺酸、RBMS1；F107及F110、RBMS2；F101及F104、RBMS3；F106及F109)。

實施例10：RBMS家族之表現解析

藉由HEK293T細胞(人類胎兒性腎細胞)、MCF7細胞(乳癌)、MDA-MB-231細胞(乳癌)、A549細胞(肺癌)、HeLa細胞(子宮頸癌)、HepG2細胞(肝癌)、U87細胞(腦腫瘤)、THP1細胞(單球性白血病)、U937細部(單球性白血病)、Ramos細胞(Burkitt淋巴瘤、B細胞瘤)、Jurkat細胞(急性T細胞性白血病)、RAW264.7細胞(巨噬細胞)、HH4-13細胞(T細胞)、A20細胞(B細胞)、B16細胞(黑色素瘤)、3T3細胞(纖維母細胞)、3T3L1細胞(纖維母細胞)、及10T1/2細胞(類間葉系幹細胞)調製RNA，以oligo dT作為引子，進行逆轉錄。藉由使用THUNDERBIRD(註冊商標)SYBR qPCR Mix(東洋紡)之定量PCR，測定人類或小鼠RBMS1、2、3之表現量。將結果示於第9圖。第9圖中，各基因之表現量以相對於HPRT基因之表現量來表示。

PCR所用之引子之序列，如以下所示。

人類HPRT(5’-CCTGGCGTCGTGATTAGTGA-3’(序列編號32)及5’-CGAGCAAGACGTTCAGTCCT-3’(序列編號33))

人類RBMS1(5’-CACCACCAGGAGTTTCTGCC-3’(序列編號34)及5’-CAGCAAGTCTCACCTCTCCTT-3’(序列編號35))

人類RBMS2(5’-CATCTCTCCCTCAGCAGCAC-3’(序列編號36)及5’-GCTGCTCTCCTCGACTGAAA-3’(序列編號37))

人類RBMS3(5’-TCTCCAAACCAAGCAGTCCT-3’(序列編號38)及5’-GGAGGCCTCGAATGTACAGG-3’(序列編號39))

小鼠HPRT(5’-CTTCCTCCTCAGACCGCTTT-3’(序列編號40)及5’-CATCATCGCTAATCACGACGC-3’(序列編號41))

小鼠RBMS1(5’-GAGATGATCTTCCCCAGCGG-3’(序列編號42)及5’-GGACCAGAGACTGCTGCTTG-3’(序列編號43))

小鼠RBMS2(5’-TGGCCTAGGAGGGGTTAGAC-3’(序列編號44)及5’-GCTGGATGCCACTTCTCAGT-3’(序列編號45))

小鼠RBMS3(5’-TGGACCACCCCATGTCAATG-3’(序列編號46)及5’-TGAATCGTTCCTGCTGTCCC-3’(序列編號47))。

實施例11：藉由RBMS家族之轉錄後調控

在HEK293T細胞中，導入下述報導子載體、Renilla螢光素酶表現載體及RBMS1、RBMS2、RBMS3表現載體或對照空白載體，於48小時後使用Dual-Glo Luciferase Assay System(Promega公司)進行螢光素酶檢定。將結果示於第10圖中。

報導子載體：在SV40啟動子之調控下表現的螢火蟲螢光素酶基因之下游，配置人類IL-6之3’UTR(RefseqID：NM_000600.4、755鹼基-1023鹼基)(序列編號48)或人類IL-8之3’UTR(RefseqID；NM_000584.3、936鹼基-1293鹼基(序列編號49))所形成的載體。

如第10圖所示，藉由RBMS過剩表現，具有IL-6或IL-8之3’UTR的報導子載體之表現量增加。此暗示不僅RBMS2，RBMS1及RBMS3亦可使mRNA經由3’UTR而安定化。

實施例12：藉由RBMS家族之癌增殖抑制

將MDA-MB-231細胞播種於96孔盤中，培養一晚(16小時)後，使用Lipofectamine RNAiMax，將針對RBMS1之siRNA(Thermo Fisher Scientific公司，Silencer(R)Select s11864)、針對RBMS2之siRNA(Thermo Fisher Scientific公司，Silencer(R)Select s11867)或對照siRNA(Thermo Fisher Scientific公司，Silencer^TM Select Negative Control No.1)導入細胞中。以剛導入siRNA後當作0小時，以後每24小時計測細胞數。細胞數之計測係使用CellTiter 96(R)AQueous One Solution Cell Proliferation Assay(Promega公司)。將結果示於第11圖。

如第11圖所示，藉由RBMS減弱，抑制癌細胞之增殖。

實施例13：藉由RBMS家族之癌之轉移抑制

小鼠黑色素瘤細胞株B16細胞中，使用反轉錄病毒使對照或針對RBMS2之短髮夾RNA(short hairpin RNA(shRNA))表現，建立減弱細胞。將為對數增殖期之細胞藉由胰蛋白酶/EDTA剝離，用PBS洗淨2次後，以成為1x10⁶/ml之狀況懸浮於無血清DMEM培養基中。從C57BL/6J小鼠(8週，雌性)之尾靜脈投與2x10⁵個(200μl)之細胞懸浮液，於3週後摘出肺，評價轉移。

shRNA序列如以下所示。

對照shRNA：5’-GCTACACAAATCAGCGATTT-3’(序列編號50)RBMS2 shRNA：5’-GGAAACCACCTTCAACCAACT-3’(序列編號51)。

將結果示於第12圖中。在投與表現對照shRNA之B16細胞的情況，可確認對肺之轉移巢有2處(一處為第12圖中，箭號所示之黑色部分，另一處存在於第12圖中視野無法確認的背面)。另一方面，在投與RBMS2減弱的B16細胞之情況，未見到對肺之轉移。

實施例14：調控RBMS之表現之因子的探索

在為人類T細胞株之Jurkat細胞之培養基中，添加IL-10蛋白質或TGFβ蛋白質(終濃度：IL-10蛋白質→20ng/mL，TGFβ蛋白質→10ng/mL)。從添加前、添加經過8小時及24小時後之細胞調製cDNA，藉由定量PCR，測定RBMS2 mRNA及HPRT(對照)mRNA之表現量。將結果示於第13圖中。

如第13圖所示，藉由IL-10蛋白質之添加，RBMS2 mRNA之表現量降低。由此，發現IL-10蛋白質具有RBMS2表現抑制作用。

實施例15：RBMS之RNA上之結合部位之解析

藉由PAR-CLIP解析RBMS之RNA上之結合部位。將PAR-CLIP之概要示於第14圖。具體而言，如以下之方式進行。

去氧羥四環黴素誘導性RBMS2表現細胞之建立

將附加有FLAG標籤之人類RBMS2選殖入pCLT-EFS-Pur載體，將其與pCAG-HIVgp載體及pCMV-VSV-G-RSV-Rev載體一起對HEK293T細胞進行基因導入，製作慢病毒(lentivirus)。使所製作之慢病毒感染MDA-MB-231細胞24小時，並於1μg/ml嘌呤黴素存在下培養5日。

免疫沉降

將2×10⁶之細胞播種於6個15cm培養皿中，培養一晚後，添加去氧羥四環黴素(最終濃度10ng/ml)及4-硫代尿苷(最終濃度100μM)，培養16小時後，以150μJ/cm2照射365nm之UV，使RNA與蛋白質交聯。用細胞刮刀回收細胞後，以細胞溶解液懸浮，得到細胞溶解液。添加抗FLAG標籤抗體(SIGMA公司；M2，10μg)及Protein A磁珠粒(Thermo Fisher Scientific公司)，使其於4℃反應2小時，進行免疫沉降。

RNA萃取及連接子附加

在免疫沉降物(RNA‧RBMS2蛋白質複合體)中，使用T4 RNA連接酶(NEB)，於RNA之3’側加成連接子(序列5’-UGGAAUUCUCGGGUGCCAAGG-3’(序列編號52))，然後於RNA之5’側以[γ-32P]ATP進行放射性同位素標識。以SDS-PAGE電泳，轉錄於硝基纖維素膜後，切出RNA/RBMS2蛋白質複合體(55kDa至80kDa附近)，由此將RNA精製。在精製之RNA之5’側，使用T4 RNA連接酶(NEB)加成連接子(序列5’-GUUCAGAGUUCUACAGU CCGACGAUC-3’(序列編號53))，以該RNA作為模板，使用特異性引子(序列 5’-CCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3’(序列編號54))進行逆轉錄，合成cDNA(Thermo Fisher Scientific公司，SuperScript III)。

PCR

以cDNA作為模板，使用以下之引子，進行PCR，進行指標(index)加成。

RNA PCR引子1st

5’-GTTCAGAGTTCTACAGTCCGA-3’(序列編號55)

RNA PCR引子，Index1 1st

5’-CCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3’(序列編號56)

以第1階段PCR產物作為模板，使用以下之引子，進行指標加成，切出200bp附近之PCR產物，並精製。

RNA PCR引子

5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTT CAGAGTTCTACAGTCCGA-3’(序列編號57)

RNA PCR引子，Index1

5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATG TGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3’(序列編號58)。

次世代定序儀

將上述PCR產物調整至10pM後，藉由MiSeq(Illumina公司)進行定序。從藉由次世代定序儀解析所得到之Fastq檔案之序列資料，將轉接子(adaptor)序列使用FaQCs進行修剪後，使用Bowtie，對人類基因組序列(hg38)進行定位(mapping)。已定位之序列資料使用IGV進行可視化。

結果

就代表性之例而言，將IL-6、IL-8(CXCL8)、及CXCL1之基因組區域的結果示於第15圖中。可知各基因之3’UTR(特別AU-富集單元)與RBMS2結合。

實施例16：高惡性度癌之RBMS之表現

藉由GEO(Gene Expression Omnibus)數據庫取得GSE6883-GPL96或GSE6883-GPL97之數據(原始論文為Liu et al.N Engl J Med 2007；356：217-26.)，解析RBMS2(探針ID；205228_at)及RBMS1(探針ID；237860_at)之表現數據。

將RBMS2之表現數據示於第16A圖中，並將RBMS1之表現數據示於第16B圖中。可知在高惡性度之癌(H：CD44+ CD24-癌細胞)中，RBMS為高表現。

實施例17：RBMS表現之調控機制之解析

解析RBMS表現之調控機制。具體而言，如以下之方式進行。

再者，所使用之定量PCR引子如以下所示。再者，以下之實施例，若無特別限定，亦使用此處記載之引子。

KRAS引子

hKRAS-Fw：TGGTGAGGGAGATCCGACAA(序列編號59)

hKRAS-Rv：AGGCATCATCAACACCCAGA(序列編號60)

IL-6引子

hIL6-Fw：CTCCAGGAGCCCAGCTATGA(序列編號61)

hIL6-Rv：GAGGTGAGTGGCTGTCTGTG(序列編號62)

HPRT引子

hHPRT-Fw：GCTGGCGTCGTGATTAGTGA(序列編號63)

hHPRT-Rv：CGAGCAAGACGTTCAGTCCT(序列編號64)

CXCL1引子

hCXCL1-Fw：TCACAGTGTGTGGTCAACAT(序列編號65)

hCXCL1-Rv：AGCCCCTTTGTTCTAAGCCA(序列編號66)

RBMS2引子

hRBMS2-Fw：GTGATAGGCCAGGGGAGTAG(序列編號67)

hRBMS2-Rv：ACTCTGCTCCTATGCTGGTG(序列編號68)。

又，所使用之siRNA如以下所示。再者，以下之實施例，若無特別限定，亦使用此處記載之siRNA。

KRAS減弱試驗用siRNA(Qiagen公司)

siNega：AllStars Negative Control siRNA(SI03650318)序列未公開

siKRAS：Hs_KRAS_2 FlexiTube siRNA(Cat.No.SI03106824)序列未公開

RBMS2減弱試驗用siRNA(Thermo Fisher Scientific公司)

陰性對照(Thermo Fisher Scientific公司(Ambion),Silencer(註冊商標)Select Negative Control No.1 siRNA，製品編號：4390843)序列未公開

Human RBMS2-1(Thermo Fisher Scientific公司(Ambion),Silencer(註冊商標)Select,siRNA ID No.s11867)序列：UUUGCACAAAUUUUCCUUGGT(序列編號69)。

定量PCR1

藉由MCF-7或MDA-MB-231細胞將RNA精製(Promega公司；ReliaPrep Cell mini prep kit)，藉由寡dT引子進行逆轉錄(東洋紡公司；ReverTra Ace)。藉由qPCR(東洋紡公司；THUNDERBIRD(註冊商標)qPCR Mix)解析RBMS2之表現。以HPRT之表現量進行修正。將結果示於第17A圖中。

西方轉漬法

將MCF-7或MDA-MB-231細胞懸浮於裂解緩衝液(20mM Tris-HCl(pH7.5)、150mM NaCl、0.5m MEDTA、1% Triton X-100、0.5%脫氧膽酸鈉、Complete迷你蛋白酶抑制劑混合片(Roche))，在冰上靜置15分鐘後，離心(15,000rpm,4℃,5分)並回收上清液。將20μg之蛋白質樣本藉由10%SDS-PAGE進行電泳後，轉錄於PVDF膜。於室溫進行1小時之封阻(blocking)(Nakarai Tesque公司；Blocking One)後，以稀釋2,000倍之RBMS2抗體(兔多株，自家製作抗體)反應一晚。以TBST(20mM Tris-HCl,pH7.5,150mM NaCl,0,05% Tween-20)進行3次10分鐘之洗淨後，將HRP標識之抗兔IgG抗體於室溫反應1小時。藉由ECL試藥使區帶可視化。將結果示於第17B圖中。

定量PCR2

KRAS(G13D變異體)選殖入pCSII-CMV-MCS-Venus載體中。使用聚乙烯亞胺，將pCSII-CMV-MCS-Venus空白載體或pCSII-CMV-MCS-Venus-KRAS(G13D)載體，與pCAG-HIVgp載體及pCMV-VSV-G-RSV-Rev載體一起，對HEK293T細胞進行基因導入，進行48小時培養，製作慢病毒。使回收之上清液感染MCF-7細胞，進行5日培養後，將RNA精製(Promega公司；ReliaPrep Cell mini prep kit)，並藉由寡dT引子進行逆轉錄(東洋紡公司；ReverTra Ace)。將RBMS2及IL-6之表現藉由qPCR(東洋紡公司；THUNDERBIRD(註冊商標)qPCR Mix)解析。以HPRT之表現量進行修正。將結果示於第17C圖中。

定量PCR3

將10pmol之siRNA陰性對照(siNega)或針對KRAS之siRNA(siKRAS)，使用Lipofectamine RNAiMAX轉染試劑(Thermo Fisher Scientific公司)導入MDA-MB-231細胞中，培養48小時。將RNA精製(Promega公司；ReliaPrep Cell mini prep kit)，並藉由寡dT引子進行逆轉錄(東洋紡公司；ReverTra Ace)。藉由qPCR(東洋紡公司；THUNDERBIRD(註冊商標)qPCR Mix)解析RBMS2、KRAS及IL-6之表現。以HPRT之表現量進行修正。將結果示於第17D圖中。

結果

可知RBMS2在具有KRAS G13D變異之高惡性度癌(MDA-MB-231)中表現量高(第17A圖及第17B圖)。又，若在不具有KRAS G13D變異之細胞(MCF-7)中導入KRAS G13D變異體，則RBMS2之表現量、及藉由RBMS2調控表現之癌促進因子(IL-6)的表現量增加(第17C圖)。再者，可知若調控具有KRAS G13D變異之細胞(MDA-MB-231)的KRAS，則RBMS2之表現量、及藉由RBMS2調控表現之癌促進因子(IL-6)的表現量減少(第17D圖)。從此等結果，暗示所謂「RBMS2之表現被KRAS G13D 變異體促進，藉此，IL-6等癌促進因子之mRNA被安定化，其表現量亢進」的機制(第17E圖)。

實施例18：RBMS表現與預後之關係

藉由人類蛋白質表現圖譜(Human protein atlas)資料庫(http：//www.proteinatlas.org)，解析RBMS2或RBMS1在胰臟癌、大腸癌、肺癌或乳癌中的表現。

將結果示於第18圖中。可知RBMS1、RBMS2之高表現有預後變差的傾向。

實施例19：RBMS表現與KRAS變異之關連1

藉由MCF-7(乳癌、KRAS；WT)、MDA-MB-231(乳癌、KRAS；G13D)、LoVo(大腸癌、KRAS；G13D)或Panc1(胰臟癌、KRAS；G12V)將RNA精製(Promega公司；ReliaPrep Cell mini prep kit)，並藉由寡dT引子進行逆轉錄(東洋紡公司；ReverTra Ace)。將RBMS2之表現，藉由qPCR(東洋紡公司；THUNDERBIRD(註冊商標)qPCR Mix)解析。以HPRT之表現量進行修正。

將結果示於第19圖中。可知在各種KRAS變異細胞中，RBMS表現量亢進。藉此，暗示RBMS2之表現係藉由變異型KRAS來誘導。

實施例20：RBMS表現與KRAS變異之關連2

在此，初始所使用之定量PCR引子如以下所示。再者，以下之實施例，若無特別限定，亦使用此處記載之引子。

IL-8引子

hIL8-Fw：ACCGGAAGGAACCATCTCAC(序列編號70)

hIL8-Rv：GGCAAAACTGCACCTTCACAC(序列編號71)

RBMS1引子

hRBMS1-Fw：CCATGGCATAGAGAAGGAGAGG(序列編號72)

hRBMS1-Rv：TAGCAGCTGTAGTTGGGTCG(序列編號73)。

將KRAS及其變異體(G12D、G12S、G12V、G13D)選殖入pCLT-EFS-Pur載體中。使用聚伸乙亞胺，將pCLT-EFS-Pur空白載體、pCLT-EFS-Pur-KRAS或其變異體載體，與pCAG-HIVgp載體及pCMV-VSV-G-RSV-Rev載體一起對HEK293T細胞進行基因導入，並培養48小時，製作慢病毒。使回收之上清液感染MCF-7細胞，並在1μg/ml嘌呤黴素存在下培養5日。於含100ng/ml或1000ng/ml去氧羥四環黴素之培養基中培養72小時後，將RNA精製(Promega公司；ReliaPrep Cell mini prep kit)，並藉由寡dT引子進行逆轉錄(東洋紡公司；ReverTra Ace)。將RBMS2、RBMS1、IL-8及IL-6之表現，藉由qPCR(東洋紡公司；THUNDERBIRD(註冊商標)qPCR Mix)解析。以HPRT之表現量進行修正。

將RBMS2之結果示於第20A圖中，將RBMS1之結果示於第20B圖中，將IL-6之結果示於第20C圖中，將IL-8之結果示於第20D圖中。顯示RBMS2及RBMS1之表現係藉由各種變異型KRAS誘導。

實施例21：KRAS變異細胞中之mRNA之安定性

解析KRAS變異細胞中之mRNA的安定性。具體而言，如以下之方式進行。

將MCF-7細胞及MDA-MB-231細胞以20ng/ml之人類IL-1β刺激3小時後，添加5μg/ml放線菌素D，將1小時後及2小時後之RNA精製(Promega公司；ReliaPrep Cell mini prep kit)，並藉由寡dT引子進行逆轉錄(東洋紡公司；ReverTra Ace)。將IL-6之表現藉由qPCR(東洋紡公司；THUNDERBIRD(註冊商標)qPCR Mix)解析。以HPRT之表現量進行修正。計算以未添加放線菌素D之樣本的表現量當作100%時之殘存RNA量。將結果示於第21A圖中。

在MCF-7細胞及MDA-MB-231細胞中添加5μg/ml放線菌素D，將1小時後及2小時後之RNA精製(Promega公司；ReliaPrep Cell mini prep kit)，並藉由寡dT引子進行逆轉錄(東洋紡公司；ReverTra Ace)。將IL-8及CXCL1之表現藉由qPCR(東洋紡公司；THUNDERBIRD(註冊商標)qPCR Mix)解析。以HPRT之表現量進行修正。計算以未添加放線菌素D之樣本的表現量當作100%時之殘存RNA量。將結果示於第21A圖中。

在HepG2細胞(肝臟癌、KRAS；WT)、LoVo細胞(大腸癌、KRAS；G13D)或HPAF-II細胞(胰臟癌、KRAS；G13D)中添加5μg/ml放線菌素D，將1小時後及2小時後之RNA精製(Promega公司；ReliaPrep Cell mini prep kit)，並藉由寡dT引子進行逆轉錄(東洋紡公司；ReverTra Ace)。藉由qPCR(東洋紡公司；THUNDERBIRD(註冊商標)qPCR Mix)解析IL-6、IL-8及CXCL1之表現。以HPRT之表現量進行修正。計算以未添加放線菌素D之樣本的表現量當作100%時之殘存RNA量。將結果示於第21B圖中。

使用Lipofectamine RNAiMAX轉染試劑(Thermo Fisher Scientific公司)，將10pmol之siRNA陰性對照(siNega)或針對KRAS之siRNA(siKRAS)導入MDA-MB-231細胞中，並培養48小時。添加5μg/ml放線菌素D，將1小時後及2小時後之RNA精製(Promega公司；ReliaPrep Cell mini prep kit)，並藉由寡dT引子進行逆轉錄(東洋紡公司；ReverTra Ace)。將IL-6、IL-8及CXCL1之表現藉由qPCR(東洋紡公司；THUNDERBIRD(註冊商標)qPCR Mix)解析。以HPRT之表現量進行修正。計算以未添加放線菌素D之樣本的表現量當作100%時之殘存RNA量。將結果示於第21C圖中。

使用Lipofectamine RNAiMAX轉染試劑(Thermo Fisher Scientific公司)，將10pmol之siRNA陰性對照(siNega)或針對RBMS2之siRNA(siRBMS2)導入MDA-MB-231細胞中，培養48小時。添加5μg/ml放線菌素D，將1小時後及2小時後之RNA精製(Promega公司；ReliaPrep Cell mini prep kit)，並藉由寡dT引子進行逆轉錄(東洋紡公司；ReverTra Ace)。將IL-6、IL-8及CXCL1之表現藉由qPCR(東洋紡公司；THUNDERBIRD(註冊商標)qPCR Mix)解析。以HPRT之表現量進行修正。計算以未添加放線菌素D之樣本的表現量當作100%時之殘存RNA量。將結果示於第21D圖中。

可知在KRAS變異細胞中，IL-6、IL-8及CXCL1之mRNA之安定性亢進(第21A圖、第21B圖)。又，可知藉由抑制變異型KRAS或RBMS2，可抑制此亢進狀態(第21C圖、第21D圖)。此等結果，支持所謂「RBMS2 之表現藉由KRAS G13D變異體促進，藉此，IL-6等癌促進因子之mRNA被安定化，其表現量亢進」的機制(實施例17、第17E圖)。

實施例22：RBMS啟動子解析

將人類RBMS2基因之第2外顯子之上游約4kbp(序列編號74)、第1外顯子之上游約3kbp(序列編號75)、第2外顯子之上游約2.5kbp(序列編號76)、第1外顯子之上游約1kbp(序列編號77)選殖入螢光素酶載體(pGL4、Promega公司)。使用聚伸乙二亞胺，將含RBMS1基因之上游區域的載體及Renilla螢光素酶載體(phRL-TK、Promega公司)，對HEK293T細胞進行基因導入，並培養48小時。螢光素酶活性係使用Dual-Glo(註冊商標)螢光素酶檢定系統(Promega公司)計測，藉由Renilla螢光素酶進行修正。

將結果示於第22圖中。可知第2外顯子之上游約4kb至2.5kb之間、及第1外顯子與第2外顯子之間，包含對轉錄活性重要之區域。

<110> 國立大學法人東京醫科齒科大學(NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION TOKYO MEDICAL AND DENTAL UNIVERSITY) 日商日本臟器製藥股份有限公司(NIPPON ZOKI PHARMACEUTICAL.,LTD.)

<120> 癌促進因子表現抑制劑的有效成分之篩選用試藥及其篩選方法、癌之預防或治療劑的有效成分之篩選用試藥及其篩選方法、癌促進因子表現抑制劑及癌之預防或治療劑

<130> P18-224WO

<140> TW107139918

<141> 2018-11-09

<150> JP2017-216747

<151> 2017-11-09

<160> 77

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 8504

<212> DNA

<213> 智人

<400> 1

<210> 2

<211> 5207

<212> DNA

<213> 小家鼠

<400> 2

<210> 3

<211> 407

<212> PRT

<213> 智人

<400> 3

<210> 4

<211> 383

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 4

<210> 5

<211> 355

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 5

<210> 6

<211> 5390

<212> DNA

<213> 小家鼠

<400> 6

<210> 7

<211> 4305

<212> DNA

<213> 智人

<400> 7

<210> 8

<211> 2543

<212> DNA

<213> 小家鼠

<400> 8

<210> 9

<211> 406

<212> PRT

<213> 智人

<400> 9

<210> 10

<211> 417

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 10

<210> 11

<211> 8234

<212> DNA

<213> 智人

<400> 11

<210> 12

<211> 7409

<212> DNA

<213> 小家鼠

<400> 12

<210> 13

<211> 437

<212> PRT

<213> 智人

<400> 13

<210> 14

<211> 463

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 14

<210> 15

<211> 446

<212> DNA

<213> 智人

<400> 15

<210> 16

<211> 171

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IL-6 3'UTR 97-267

<400> 16

<210> 17

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IL-6 3'UTR 122-193

<400> 17

<210> 18

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IL-6 3'UTR delta ARE1

<400> 18

<210> 19

<211> 101

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IL-6 3'UTR delta ARE2

<400> 19

<210> 20

<211> 71

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IL-6 3'UTR ARE mutant

<400> 20

<210> 21

<211> 1285

<212> DNA

<213> 智人

<400> 21

<210> 22

<211> 894

<212> DNA

<213> 智人

<400> 22

<210> 23

<211> 1455

<212> DNA

<213> 智人

<400> 23

<210> 24

<211> 3544

<212> DNA

<213> 智人

<400> 24

<210> 25

<211> 918

<212> DNA

<213> 智人

<400> 25

<210> 26

<211> 2386

<212> DNA

<213> 智人

<400> 26

<210> 27

<211> 1744

<212> DNA

<213> 智人

<400> 27

<210> 28

<211> 2835

<212> DNA

<213> 智人

<400> 28

<210> 29

<211> 2171

<212> DNA

<213> 智人

<400> 29

<210> 30

<211> 1261

<212> DNA

<213> 智人

<400> 30

<210> 31

<211> 528

<212> DNA

<213> 智人

<400> 31

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hHPRT-f

<400> 32

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hHPRT-r

<400> 33

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hRBMS1-f

<400> 34

<210> 35

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hRBMS1-r

<400> 35

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hRBMS2-f

<400> 36

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hRBMS2-r

<400> 37

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hRBMS3-f

<400> 38

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hRBMS3-r

<400> 39

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mHPRT-f

<400> 40

<210> 41

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mHPRT-r

<400> 41

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mRBMS1-f

<400> 42

<210> 43

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mRBMS1-r

<400> 43

<210> 44

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mRBMS2-f

<400> 44

<210> 45

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mRBMS2-r

<400> 45

<210> 46

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mRBMS3-f

<400> 46

<210> 47

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mRBMS3-r

<400> 47

<210> 48

<211> 268

<212> DNA

<213> 智人

<400> 48

<210> 49

<211> 357

<212> DNA

<213> 智人

<400> 49

<210> 50

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> control shRNA

<400> 50

<210> 51

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RBMS2 shRNA

<400> 51

<210> 52

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Linker 1

<400> 52

<210> 53

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Linker 2

<400> 53

<210> 54

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Primer A

<400> 54

<210> 55

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RNA PCR Primer 1st

<400> 55

<210> 56

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RNA PCR Primer,Index1 1st

<400> 56

<210> 57

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RNA PCR Primer

<400> 57

<210> 58

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RNA PCR Primer,Index1

<400> 58

<210> 59

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hKRAS-Fw

<400> 59

<210> 60

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hKRAS-Rv

<400> 60

<210> 61

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hIL6-Fw

<400> 61

<210> 62

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hIL6-Rv

<400> 62

<210> 63

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hHPRT-Fw

<400> 63

<210> 64

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hHPRT-Rv

<400> 64

<210> 65

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hCXCL1-Fw

<400> 65

<210> 66

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hCXCL1-Rv

<400> 66

<210> 67

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hRBMS2-Fw

<400> 67

<210> 68

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hRBMS2-Rv

<400> 68

<210> 69

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Human RBMS2-1

<400> 69

<210> 70

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hIL8-Fw

<400> 70

<210> 71

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hIL8-Rv

<400> 71

<210> 72

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hRBMS1-Fw

<400> 72

<210> 73

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> hRBMS1-Rv

<400> 73

<210> 74

<211> 4000

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RBMS2_4k

<400> 74

<210> 75

<211> 2953

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RBMS2_3k

<400> 75

<210> 76

<211> 2879

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RBMS2_2.5k

<400> 76

<210> 77

<211> 1009

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> RBMS2_1k

<400> 77

Claims

一種癌促進因子表現抑制劑之有效成分之篩選用試藥，其含有選自表現匣、包含該表現匣之載體、及包含該載體之細胞所構成之群組中的至少1種，其中該表現匣包含RBMS2基因啟動子、及被配置成可藉由該RBMS2基因啟動子調控表現的基因，該RBMS2基因啟動子包含將RBMS2基因之轉錄開始點之鹼基作為+1，其下游(3’側)為正之值，其上游為0或負之值時的-200至+50之DNA區域。
一種癌促進因子表現抑制劑之有效成分之篩選方法，其係於受檢物質存在下，以選自下述(i)~(iii)所構成之群組中的至少1種作為指標，(i)藉由包含將RBMS2基因之轉錄開始點之鹼基作為+1，其下游(3’側)為正之值，其上游為0或負之值時的-200至+50之DNA區域的RBMS2基因啟動子調控表現之基因表現量；(ii)RBMS2與含AU-富集單元之RNA的結合量；及(iii)在RBMS2過剩表現細胞中，於3’-UTR含AU-富集單元之mRNA量或來自該mRNA之蛋白質量。
如申請專利範圍第2項所述之篩選方法，其包含在受檢物質存在下該指標之值比受檢物質不存在下之該指標之值低的情況，選擇該受檢物質作為癌促進因子表現抑制劑的有效成分。
如申請專利範圍第2項所述之篩選方法，其中該AU-富集單元係從選自CSF2、IL-6、ADAM10、ADM、CTGF、HBEGF、HILPDA、IL-24、THBS1、MYC、TGFB2、ITGA6、F3、PTP4A1、HSPA5、PLAU、 CYR61、EDIL3、CSF1、ITGB1、及MMP1所構成之群組中之至少1種mRNA而來的AU-富集單元。
如申請專利範圍第2至4項中任一項所述之篩選方法，其包含下述步驟(a1)~(c1)：(a1)使含有表現匣的表現系統與受檢物質接觸的步驟，其中該表現匣包含RBMS2基因啟動子及被配置成可藉由該RBMS2基因啟動子調控表現的基因，該RBMS2基因啟動子包含將RBMS2基因之轉錄開始點之鹼基作為+1，其下游(3’側)為正之值，其上游為0或負之值時的-200至+50之DNA區域；(b1)測定接觸受檢物質之表現系統中該基因之表現量作為受檢表現量，以未接觸受檢物質之表現系統中該基因之表現量作為對照表現量，將該受檢表現量與對照表現量做比較的步驟；及(c1)在受檢表現量比對照表現量低之情況，選擇該受檢物質作為癌促進因子表現抑制劑之有效成分的步驟。
如申請專利範圍第5項所述之篩選方法，其中該表現系統為細胞。
如申請專利範圍第5項所述之篩選方法，該基因為報導子基因(reporter gene)。
如申請專利範圍第2至4項中任一項所述之篩選方法，其包含下述步驟(a2)~(c2)：(a2)使包含AU-富集單元之RNA與RBMS2在受檢物質存在下接觸的步驟； (b2)測定在受檢物質存在下接觸之情況該RNA與該RBMS2之結合量作為受檢結合量，將受檢物質不存在下接觸之情況該RNA與該RBMS2之結合量作為對照結合量，將該受檢結合量與該對照結合量做比較的步驟；及(c2)在受檢結合量比對照結合量低之情況，選擇該受檢物質作為癌促進因子表現抑制劑之有效成分的步驟。
如申請專利範圍第2至4項中任一項所述之篩選方法，其包含下述步驟(a3)~(c3)：(a3)使含有於3’-UTR含AU-富集單元之mRNA且RBMS2過剩表現之細胞與受檢物質接觸的步驟；(b3)測定與受檢物質接觸之細胞中該mRNA量或源自該mRNA之蛋白質量作為受檢量，以不與受檢物質接觸之細胞中該mRNA量或來自該mRNA之蛋白質量作為對照量，比較該受檢量與該對照量之步驟；及(c3)在受檢量比對照量低之情況，選擇該受檢物質作為癌促進因子表現抑制劑之有效成分的步驟。
如申請專利範圍第9項所述之篩選方法，其中該mRNA包含報導子蛋白質之ORF。
一種癌之預防或治療劑的有效成分之篩選用試藥，其係含有選自表現匣、包含該表現匣之載體、及包含該載體之細胞所構成之群組中的至少1種，其中，該表現匣包含RBMS2基因啟動子、及被配置成藉由該RBMS2基因啟動子調控表現的基因，該RBMS2基因啟動子包含將選自由RBMS1基因及RBMS2基因所構成之群組中的至少1種RBMS基因之轉錄開始點之鹼基作為+1，其下游(3’側)為正之值，其上游為0或負之值時的-200至+50之DNA區域。
一種癌之預防或治療劑的有效成分之篩選方法，其係於受檢物質存在下，以選自下述(i)~(iii)所構成之群組中的至少1種作為指標，(i)藉由包含將選自由RBMS1基因及RBMS2基因所構成之群組中的至少1種RBMS基因之轉錄開始點之鹼基作為+1，其下游(3’側)為正之值，其上游為0或負之值時的-200至+50之DNA區域的RBMS基因啟動子調控表現之基因表現量；(ii)RBMS2與含AU-富集單元之RNA的結合量；及(iii)在RBMS2過剩表現細胞中，於3’-UTR含AU-富集單元之mRNA量或來自該mRNA之蛋白質量。
如申請專利範圍第12項所述之篩選方法，其包含在受檢物質存在下該指標之值比受檢物質不存在下之該指標之值低的情況，選擇該受檢物質作為癌促進因子表現抑制劑的有效成分。
如申請專利範圍第12項所述之篩選方法，其中該AU-富集單元為從選自CSF2、IL-6、ADAM10、ADM、CTGF、HBEGF、HILPDA、IL-24、THBS1、MYC、TGFB2、ITGA6、F3、PTP4A1、HSPA5、PLAU、CYR61、EDIL3、CSF1、ITGB1、及MMP1所構成之群組中之至少1種mRNA而來的AU-富集單元。
如申請專利範圍第12至14項中任一項所述之篩選方法，其包含下述步驟(a1)~(c1)： (a1)使含有表現匣的表現系統與受檢物質接觸的步驟，其中該表現匣包含RBMS2基因啟動子及被配置成可藉由該RBMS2基因啟動子調控表現的基因，該RBMS2基因啟動子包含將選自由RBMS1基因及RBMS2基因所構成之群組中的至少1種RBMS基因之轉錄開始點之鹼基作為+1，其下游(3’側)為正之值，其上游為0或負之值時的-200至+50之DNA區域；(b1)測定接觸受檢物質之表現系統中該基因之表現量作為受檢表現量，以未接觸受檢物質之表現系統中該基因之表現量作為對照表現量，將該受檢表現量與對照表現量做比較的步驟；及(c1)在受檢表現量比對照表現量低之情況，選擇該受檢物質作為癌促進因子表現抑制劑之有效成分的步驟。
如申請專利範圍第15項所述之篩選方法，其中該表現系統為細胞。
如申請專利範圍第15項所述之篩選方法，該基因為報導子基因(reporter gene)。
如申請專利範圍第12至14項中任一項所述之篩選方法，其包含下述步驟(a2)~(c2)：(a2)使包含AU-富集單元之RNA與RBMS2在受檢物質存在下接觸的步驟；(b2)測定在受檢物質存在下接觸之情況該RNA與該RBMS2之結合量作為受檢結合量，將受檢物質不存在下接觸之情況該RNA與該RBMS2之結合量作為對照結合量，將該受檢結合量與該對照結合量做比較的步驟；及 (c2)在受檢結合量比對照結合量低之情況，選擇該受檢物質作為癌促進因子表現抑制劑之有效成分的步驟。
如申請專利範圍第12至14項中任一項所述之篩選方法，其包含下述步驟(a3)~(c3)：(a3)使含有於3’-UTR含AU-富集單元之mRNA且RBMS2過剩表現之細胞與受檢物質接觸的步驟；(b3)測定與受檢物質接觸之細胞中該mRNA量或源自該mRNA之蛋白質量作為受檢量，以不與受檢物質接觸之細胞中該mRNA量或來自該mRNA之蛋白質量作為對照量，比較該受檢量與該對照量之步驟；及(c3)在受檢量比對照量低之情況，選擇該受檢物質作為癌促進因子表現抑制劑之有效成分的步驟。
如申請專利範圍第19項所述之篩選方法，其中該mRNA包含報導子蛋白質之ORF。
一種癌促進因子表現抑制劑，其含有RBMS2表現抑制劑，其中，該RBMS2表現抑制劑含有選自RBMS2特異性siRNA、RBMS2特異性miRNA、RBMS2特異性反義核酸、此等之表現載體、及IL-10所構成之群組中之至少1種的RBMS2表現抑制劑。
如申請專利範圍第21項所述之癌促進因子表現抑制劑，其中為表現抑制對象之該癌促進因子，為選自CSF2、IL-6、ADAM10、ADM、CTGF、HBEGF、HILPDA、IL-24、THBS1、MYC、TGFB2、ITGA6、F3、 PTP4A1、HSPA5、PLAU、CYR61、EDIL3、CSF1、ITGB1、及MMP1所構成之群組中的至少1種。
如申請專利範圍第21或22項所述之癌促進因子表現抑制劑，其係使用作為癌之預防或治療劑，該癌為選自下述之(X)~(Z)所構成之群組中的至少1種：(X)選自胰臟癌、大腸癌、肺癌、及乳癌所構成之群組中的至少1種；(Y)該癌為RAS基因變異類型之癌；及(Z)該癌為高惡性度之癌。
如申請專利範圍第23項所述之癌促進因子表現抑制劑，其中RAS基因變異為KRAS基因變異。
一種癌之預防或治療劑，其含有選自由RBMS1基因及RBMS2基因所構成之群組中的至少1種的RBMS表現抑制劑，其中，該RBMS1表現抑制劑係含有選自由RBMS1特異性siRNA、RBMS1特異性miRNA、RBMS1特異性反義核酸、及此等之表現載體所構成之群組中之至少1種的RBMS1表現抑制劑，該RBMS2表現抑制劑含有選自RBMS2特異性siRNA、RBMS2特異性miRNA、RBMS2特異性反義核酸、及此等之表現載體所構成之群組中之至少1種的RBMS2表現抑制劑。
如申請專利範圍第25項所述之癌之預防或治療劑，其中為表現抑制對象之該癌促進因子，為選自CSF2、IL-6、ADAM10、ADM、CTGF、HBEGF、HILPDA、IL-24、THBS1、MYC、TGFB2、ITGA6、F3、 PTP4A1、HSPA5、PLAU、CYR61、EDIL3、CSF1、ITGB1、及MMP1所構成之群組中的至少1種。
如申請專利範圍第25或26項所述之癌之預防或治療劑，其中，該癌為選自下述之(X)~(Z)所構成之群組中的至少1種：(X)選自胰臟癌、大腸癌、肺癌、及乳癌所構成之群組中的至少1種；(Y)該癌為RAS基因變異類型之癌；及(Z)該癌為高惡性度之癌。
如申請專利範圍第27項所述之癌之預防或治療劑，其中RAS基因變異為KRAS基因變異。