KR100986465B1

KR100986465B1 - Ｏｉｐ５ 유전자의 신규한 용도

Info

Publication number: KR100986465B1
Application number: KR1020070126815A
Authority: KR
Inventors: 원미선; 정경숙; 김영주; 최신정; 김동명; 임남희; 안지원; 허철구; 송경빈; 김문희; 정경은; 이형주; 염영일; 이희구; 송은영
Original assignee: 주식회사 삼천리제약; 한국생명공학연구원
Priority date: 2006-12-08
Filing date: 2007-12-07
Publication date: 2010-10-11
Also published as: KR20080053222A; KR100992239B1; KR20080053223A

Abstract

본 발명은 OIP5 유전자 또는 OIP5 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하는 항암제 스크리닝용 조성물, 상기 유전자의 억제제 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질의 억제제 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암 치료용 조성물, 및 OIP5 유전자 또는 OIP5 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 OIP5 유전자는 암 세포에 다량 발현되고 정상세포의 증식 속도를 증가시키므로, 이들 유전자의 발현을 저해시키면 암세포의 성장을 억제시키는 작용 효과를 가져온다. 따라서 OIP5 유전자는 각종 항암제 스크리닝 또는 치료제의 표적 유전자로 활용될 수 있다.

OIP5 유전자, 단백질, 암

Description

ＯＩＰ５ 유전자의 신규한 용도{Novel use of OIP5 gene}

본 발명은 MIG12 유전자 또는 MIG12 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하는 암 진단용 또는 항암제 스크리닝용 조성물, OIP5 유전자 또는 OIP5 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하는 암 진단용 또는 항암제 스크리닝용 조성물, 상기 유전자의 억제제 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질의 억제제 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암 치료용 조성물, 및 MIG12 유전자, OIP5 유전자 또는 이들로부터 발현된 단백질 중 하나 이상을 포함하는 암 진단용 키트에 관한 것이다.

인간 유전체 프로젝트 연구 결과, 인체의 질환을 분자 수준에서 이해하고 새로운 질환 관련 표적을 발굴하고 이를 이용한 신약을 개발하고자 하는 신개념의 바이오 생명공학 기술의 시대가 열리고 있다. 이에 따라, 유전적 환경이 다른 환자 개개인에 맞추어 각종 다양한 질병을 진단, 치료, 예측하는 맞춤의학 시대가 현실로 다가오고 있다. 맞춤의학에는 유전체 진단용 바이오마커의 발굴, 표적화 치료기술, 질병 특이적 약물작용점의 발굴, 표적 치료용 신약, 정확한 임상 정보, 환자의 유전체 정보, 유전체적 역학결과, 그리고 이들을 분석 통합할 수 있는 바이오인포 매틱스 등이 상호보완적으로 구성된 약물 유전체기술 개발이 수반되어야 한다. 특히, 맞춤의학에서 경쟁력을 갖추기 위해서는 질환과 개인에 대한 약물 예측 시스템, 진단 바이오마커 발굴, 새로운 표적유전자 및 단백질을 발굴하는 기초연구 및 이를 이용한 치료제의 개발이 중요하다.

최근, 전 세계적으로 난치병인 암의 생성 및 치료와 관련된 유전자의 기능 연구를 통해 치료용 표적을 발굴하고 이들을 진단 및 치료제 개발에 이용하기 위한 치열한 경쟁이 불붙고 있다. 게놈 연구의 활성화와 함께 인간 유전자 DNA 칩 또는 프로테옴 분석 연구가 활발하게 이루어지고 암과 관련된 유전자가 대량 발굴됨에 따라 많은 유전자들의 목록과 관련 데이터베이스는 구축되어 있으나 대부분 이들 유전자들에 대한 세포 내에서의 구체적 생물학적 기능 및 암 관련성은 아직 연구되지 않았거나 불확실하여 실제 암 관련성 또는 진단 및 표적 유전자로 활용하기에 상당한 어려움이 있다.

한편, 수많은 인간 유전자들의 기능에 대한 연구의 필요성이 부각됨에 따라 단순한 기능 및 형태 연구가 가능한 모델 생물체에 대한 활용도 및 관심은 더욱 높아지고 있다. 이에, 세포 내에서 일어나는 기본적이고 진화적으로 잘 보존되어 있는 기작을 이해하기 위하여 오랫동안 여러 분야에서 사용되어 왔던 모델 생물체 (model organism)를 암 진단 또는 치료용 타겟 발굴에 이용하는 연구가 진행되고 있다.

이들 모델 생물체 중 하나로 이용되고 있는 분열 효모 S. pombe 는 유전자가 4,824개로 가장 적지만 43%의 유전자가 인트론(intron)을 함유하고 있다 (Wood V. et al., Nature . 45:871-880, 2002). S. pombe에는 세포 주기 조절, 단백질 분해(proteolysis), 단백질 인산화(protein phosphorylation), RNA 스플라이싱(RNA splicing) 등 진핵 세포내에서 중요한 관련 유전자들이 매우 잘 보존되어 있다. S. pombe를 포함하는 효모류는 진핵 세포 중 가장 간단한 모델 세포로써 저렴한 비용으로 배양이 가능하며 유전학적인 연구 및 조작이 용이하고 생화학적, 생리적 기능 분석 시스템의 확립이 잘 이루어져 있어 인간의 질병을 유발하는 유전자의 기능 연구 및 약물 개발을 위한 모델 세포로 이용되고 있다 (Lum, P.K. et al ., Cell., 116:121-137, 2004). 특히, 분열효모는 세포 주기 및 신호 전달과 관련된 유전자가 결손되거나 세포 내에 대량 발현되면 신호전달 체계 조절에 이상이 초래됨에 따라 세포주기 조절 이상 또는 대사 이상에 의한 세포의 생장 속도 저해 및 형태학적 변화가 초래된다. 따라서 이러한 표현형의 변화를 탐색하여 해당 유전자의 기능을 유추할 수 있다.

한편, 암세포에서 대량 발현된 유전자에 대해 RNAi (RNA interference) 실험 기법을 이용하면 치료용 암 타겟으로의 사용 가능성을 확실히 확인할 수 있다. RNAi는 다양한 형태의 올리고 이중 리보핵산 (miRNA, expressed dsRNA, synthetic siRNA)을 이용하여 세포 내에서 특이적으로 해당 염기서열의 mRNA의 분해를 유도하여 유전자의 기능이 나타나지 못하도록 하는 기법이다. 이렇게 유전자의 발현이 저해된 세포의 표현 현상을 관찰함으로써 해당 유전자의 기능 연구 및 신호전달 경로 (pathway) 분석이 가능하여 암 표적으로서의 검증 (target validation) 등을 통한 신약 개발 연구가 수행되고 있다.

RNAi 기법에 사용 가능한 올리고 이중 리보핵산 중 최근 각광을 받고 있는 siRNA (small interfering RNA)를 이용한 기법은 2002년 Science Journal에서 "breakthrough of the year"라고 선정할 정도로 획기적인 방법이다. siRNA는 짧은 19-30개의 이중 리보핵산쇄(double strand RNA duplex)로 세포내 도입하면 비특이적 저해(non-specific inhibition) 없이 특정 유전자의 발현만을 억제하는 효과를 나타낸다. siRNA의 작용기작은 세포 내에서 RISC (RNA-induced silencing complex)와 결합하여 mRNA에 해당하는 유전자의 sense strand가 잘려나가고 sense strand에 상보적인 antisense stand는 RISC와 복합체로 있다가 상보적인 염기서열을 가진 mRNA 즉 표적 유전자의 mRNA와 결합하여 이를 분해함으로써 유전자의 발현을 저해하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 암의 생성을 촉진, 세포사멸을 억제하는 유전자에 대한 siRNA는 세포 내에서 해당 유전자 작용을 억제시켜 암세포를 죽이는 효과를 나타내며 이를 이용하여 치료용 표적유전자를 검증할 수 있다. 따라서 최근 질병에 대한 표적 유전자 발굴, 표적 유전자 검증, 치료제 개발을 위한 siRNA 연구가 매우 활발하다.

siRNA는 transient transfection과 적당한 delivery 시스템에 의해 유전자 발현 저해를 유도하며 일시적인 효과를 나타내는 반면, 비교적 장기간 RNAi 효과를 나타내도록 하는 shRNA (short hairpin RNA)가 있다. shRNA는 타겟유전자 siRNA 염기서열의 sense와 상보적인 nonsense 사이에 3-10개의 염기 linker를 연결하는 올리고 DNA를 합성한 후 프라스미드 벡터에 클로닝하거나 또는 shRNA를 레트로바이러스인 렌티바이러스 (lentivirus) 및 아데노바이러스 (adenovirus)에 삽입하여 발현 시키면 loop가 있는 헤어핀 구조의 shRNA (short hairpin RNA)가 만들어지고 세포 내의 Dicer에 의해 siRNA로 전환되어 RNAi 효과를 나타낸다. shRNA는 비교적 장기간 RNAi 효과를 나타내도록 하는 장점이 있어 in vivo 실험에 널리 활용되고 있으며 신약으로의 임상적용을 위해 연구되고 있다.

한편, MIG12 (GenBank 등록번호: NM_021242)는 Opitz G/BBB syndrome과 관련 있는 유전자로 미세소관(microtubule)과 결합되어 있는 MID1과 상호작용하는 유전자로 발굴되었다(BMC Cell Biol. 2004; 5: 9). MIG12는 MID1와 함께 미세소관의 안정화에 관계하며, 세포분열, 이동(migration) 등의 미세소관의 안정화를 필요로 하는 세포 내 과정과 관련되어 있는 것으로 추정한다. MID1과 MIG12를 동시에 세포 내 도입시키면 MIG12가 튜불린(tubulin)으로 구성된 필라멘트(filament)를 recruit하여 이러한 아세틸화된 튜불린(acetylated tubulin)으로 구성된 미세소관 다발(microtubule bundle)은 해중합제(depolymerizing agent)에 대해 저항성을 나타낸다. 지금까지 MIG12의 암 관련성에 관해서는 보고된 바가 없다.

OIP5 (GenBank 등록번호: NM_007280)는 임균(Neisseria gonorrhoeae)의 불투명도와 관련 있으며 인체세포의 침입과 연관된 막단백질인 OpaP와 상호작용하는 단백질로 처음 발굴되었다 (John M. Gi-ChungLiZhu & Richard F. Molecular Microbiology 27171- January 1998). OIP는 Raf 키나아제 아형(Raf kinase isoform)과 상호작용하는 단백질 (Genomics Volume 81, 112-125)로, 또 포스파티딜리노시톨 4-포스페이트(phosphatidylinositol 4-phosphate)와 결합하는 PH 도메인(pleckstrin homology domain)을 가진 FAPP1과 상호작용하는 단백질로 발굴 된 바 있으나 (S. Dowler et al. ,Biochem. J. 351 (2000), pp. 19-31), OIP의 구체적인 생리학적 기능에 대해서는 아직까지 보고된 바 없다.

본 발명은 MIG12 유전자 및 OIP5 유전자의 신규한 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.

보다 구체적으로, 본 발명은 MIG12 유전자 또는 MIG12 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하는 암 진단용 또는 항암제 스크리닝용 조성물, OIP5 유전자 또는 OIP5 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하는 암 진단용 또는 항암제 스크리닝용 조성물, 상기 유전자의 억제제 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질의 억제제 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암 치료용 조성물, 및 MIG12 유전자, OIP5 유전자 또는 이들로부터 발현된 단백질 중 하나 이상을 포함하는 암 진단용 키트를 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 MIG12 유전자 또는 MIG12 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하는 암 진단 또는 항암제 스크리닝용 조성물의 용도 및 진단 또는 스크리닝방법, OIP5 유전자 또는 OIP5 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하는 암 진단용 또는 항암제 스크리닝용 조성물의 용도 및 진단 또는 스크리닝방법, 상기 유전자의 억제제 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질의 억제제 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암 치료용 조성물의 용도 및 치료방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 MIG12 유전자를 포함하는 암 진단용 조성물 및 OIP5(오피에이 상호작용 단백질 5; Opa interacting protein 5) 유전자를 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 'MIG12 유전자' 또는 'OIP5 유전자'는 이들 유전자의 DNA 또는 mRNA를 말하며, DNA 또는 mRNA의 전부 또는 일부를 모두 포함하는 개념이다.

본 발명의 조성물은 상기 유전자 외에도 핵산의 구조를 안정하게 유지시키는 증류수 또는 완충액을 포함할 수 있다.

하기 실시예 2 내지 3으로부터 확인할 수 있는 바와 같이, MIG12 또는 OIP5 유전자는 암세포주 및 암세포에서 특이적으로 발현이 증가되어 있다. 따라서 본 발명의 유전자를 이용하여 MIG12 또는 OIP5 유전자의 과발현 여부를 조사하면 암을 진단할 수 있다.

그러므로 본 발명은 또한 상기 유전자들의 암 진단 용도 및 상기 조성물과 대상체로부터 얻은 시료 간의 반응을 확인하여 암을 진단하는 방법을 제공한다.

본 발명의 진단 방법에서 상기 유전자를 포함하는 조성물과 시료 간의 반응의 확인은 DNA-DNA, DNA-RNA, DNA-단백질 간의 반응 여부를 확인하는데 사용되는 통상적인 방법들, 예컨대 DNA 칩, 단백질 칩, 중합효소 연쇄반응 (PCR), 노던 블롯팅, 서던 블롯팅, ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent assay), 효모 이중 혼성법(yeast two-hybrid), 2-D 겔 분석 및 시험관 내 결합 에세이 (in vitro binding assay) 등을 이용할 수 있다. 예컨대 상기 유전자의 전부 또는 일부를 프로브로 사용하여 대상자의 체액으로부터 분리한 핵산과 하이브리드화한 후 당분야에 공지된 다양한 방법, 예컨대 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcription polymerases chain reaction), 써던블로팅(southern blotting), 노던 블롯 팅(Northern blooting) 등으로 이를 검출함으로써 대상자에서 상기 유전자가 고발현된 상태인지 조사하면 암의 발생 여부를 판단할 수 있다. 상기 프로브를 방사선 동위원소 또는 효소 등으로 표지하면 용이하게 유전자의 존재를 확인할 수 있다.

본 발명은 또한 MIG12 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하는 암 진단용 조성물 및 OIP 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 상기 단백질 외에도 단백질의 구조를 안정하게 유지시키는 증류수 또는 완충액을 포함할 수 있다.

앞서 언급한 바와 같이, MIG12 또는 OIP5 유전자는 암세포에서 특이적으로 발현이 증가하므로 상기 유전자들로부터 발현된 단백질을 이용하여 MIG12 또는 OIP5 유전자 또는 단백질의 과발현 여부를 조사하면 암을 진단할 수 있다.

따라서 본 발명은 또한 상기 단백질들의 암 진단 용도 및 상기 조성물과 대상체로부터 얻은 시료 간의 반응을 확인하여 암을 진단하는 방법을 제공한다.

본 발명의 진단 방법에서 상기 단백질을 포함하는 조성물과 시료 간의 반응의 확인은 DNA-단백질, RNA-단백질, 단백질-단백질 간의 반응 여부를 확인하는데 사용되는 통상적인 방법들, 예컨대 DNA 칩, 단백질 칩, 중합효소 연쇄반응 (PCR), 노던 블롯팅, 서던 블롯팅, 웨스턴 블롯팅, ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent assay), 특이적 면역염색(histoimmunostaining), 효모 이중 혼성법(yeast two-hybrid), 2-D 겔 분석 및 시험관 내 결합 에세이 (in vitro binding assay) 등을 이용할 수 있다. 예컨대 상기 유전자들로부터 발현된 단백질의 전부 또는 일부를 프로브로 사용하여 대상자의 체액으로부터 분리한 핵산 또는 단백질과 하이브리드화한 후 당분야에 공지된 다양한 방법, 예컨대 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcription polymerases chain reaction), 웨스턴 블로팅(western blotting) 등으로 이를 검출함으로써 대상자에서 상기 유전자가 고발현된 상태인지 조사하면 암의 발생 여부를 판단할 수 있다. 상기 프로브를 방사선 동위원소 또는 효소 등으로 표지하면 용이하게 유전자의 존재를 확인할 수 있다.

다르게는 본 발명의 조성물은 상기 단백질 대신 상기 단백질에 대한 특이적 항체를 포함할 수 있다. 암 세포에서는 MIG12 또는 OIP5 유전자가 과발현되어 상기 유전자로부터 발현된 단백질의 양 또한 증가하게 된다. 따라서 실시예 1에서와 같이 상기 유전자로부터 발현된 단백질에 대한 항체를 이용하는 경우, 항원-항체 반응을 통해 상기 단백질을 검출해 내어 암을 진단할 수 있다.

상기 단백질에 대한 모노클로날 항체는 당업계에 통상적인 모노클로날 항체 제작 방법을 통해 제작되어 사용될 수도 있고, 시판되는 것을 사용할 수 있다. 상기 단백질에 대한 모노클로날 항체는 일반적으로 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase, AP) 또는 호올스래디쉬 퍼록시다제(horseradish peroxidase, HRP) 등의 효소가 컨쥬게이션된 2차 항체 및 이들의 기질을 사용하여 발색반응시킴으로써 정량분석할 수도 있고, 아니면 직접 상기 단백질에 대한 모노클로날 항체에 AP 또는 HRP 효소 등이 컨쥬게이션된 것을 사용하여 정량분석할 수도 있다. 또한, 모노클로날 항체 대신에 상기 단백질을 인식하는 폴리클로날 항체를 사용할 수도 있고 이는 당업계에 통상적인 항혈청 제작 방법을 통해 제작되어 사용될 수도 있다.

본 발명은 또한 MIG12 유전자를 포함하는 항암제 스크리닝용 조성물 및 OIP5 유전자를 포함하는 항암제 스크리닝용 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 상기 조성물의 항암제 스크리닝용 용도 및 상기 조성물을 표적물질로 이용하여 시험대상물질을 접촉시키고, 표적물질과 시험대상물질 간의 반응을 확인하여, 시험대상물질이 상기 유전자의 발현을 증진시키는 활성 또는 억제하는 활성을 나타내는지를 결정하는 단계를 포함하는 항암제 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 스크리닝 방법에서 상기 유전자를 포함하는 조성물과 시험대상물질 간의 반응 확인은, DNA-DNA, DNA-RNA, DNA-단백질, DNA-화합물 간의 반응 여부를 확인하는데 사용되는 통상적인 방법들을 사용할 수 있다. 예를 들면, 생체 외부에서(in vitro) 상기 유전자와 시험대상물질 사이의 결합 여부를 확인하기 위한 혼성화 시험, 포유류세포와 시험대상물질을 반응시킨 후 노던 분석, 정량적 PCR, 정량적 실시간 PCR 등을 통한 상기 유전자의 발현율 측정 방법, 또는 상기 유전자에 리포터 유전자를 연결시켜 세포 내로 도입한 후 시험대상물질과 반응시키고 리포터 단백질의 발현율을 측정하는 방법 등을 사용할 수 있다. 이러한 경우 본 발명의 조성물은 상기 유전자 외에도, 핵산의 구조를 안정하게 유지시키는 증류수 또는 완충액을 포함할 수 있다.

또한 본 발명은 상기 조성물을 표적물질로 이용하여 모델세포 또는 동물세포의 표현형 변화를 유도하여 상기 유전자의 발현을 증진시키는 활성 또는 억제하는 활성을 나타내는지를 결정하는 단계를 포함하는 항암제 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 항암제 스크리닝 방법에서 상기 유전자를 과발현시킨 모델생명체 및 동물세포를 이용한 세포성장속도 변화 (growth rate), 형태적 변화 (morphological changes) 및 온도 민감성 변화 (temperature sensitivity) 등의 phenotype 조사를 통한 cell-based 분석을 수행하여 상기 유전자의 발현 및 단백질의 작용을 직접 억제하는 물질 스크리닝을 수행할 수 있다.

또한, 본 발명은 MIG12 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하는 항암제 스크리닝용 조성물 및 OIP5 유전자로부터 발현된 단백질을 포함하는 항암제 스크리닝용 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 상기 조성물의 항암제 스크리닝용 용도 및 상기 조성물을 표적물질로 이용하여 시험대상물질을 접촉시키고, 표적물질과 시험대상물질 간의 반응을 확인하여, 시험대상물질이 상기 단백질의 기능을 증진시키는 활성 또는 억제하는 활성을 나타내는지를 결정하는 단계를 포함하는 항암제 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 스크리닝 방법에서 상기 단백질을 포함하는 조성물과 시험대상물질 간의 반응 확인은, 단백질-단백질, 단백질-화합물 간의 반응 여부를 확인하는데 사용되는 통상적인 방법들을 사용할 수 있다. 예를 들면, 상기 단백질과 시험대상물질을 반응시킨 후 활성을 측정하는 방법, 효모 이중 혼성법(yeast two-hybrid), 상기 단백질에 결합하는 파지 디스플레이 펩티드 클론(phage-displayed peptide clone)의 검색, 천연물 및 화학물질 라이브러리(chemical library) 등을 이용한 HTS(high throughput screening), 드럭 히트 HTS(drug hit HTS), 세포 기반 스크리닝(cell-based screening), 또는 DNA 어레이(DNA array)를 이용하는 스크리닝법 등을 사용할 수 있다. 이러한 경우 본 발명의 조성물은 상기 단백질 외에도, 단백질 의 구조 또는 생리 활성을 안정하게 유지시키는 완충액 또는 반응액을 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은 생체 내(in vivo) 실험을 위해, 상기 단백질을 발현하는 세포, 또는 전사율을 조절할 수 있는 프로모터 하에 상기 단백질을 발현하는 플라스미드를 함유하는 세포 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법에서, 시험대상물질은 통상적인 선정방식에 따라 암전이 억제제로서의 가능성을 지닌 것으로 추정되거나 또는 무작위적으로 선정된 개별적인 핵산, 단백질, 기타 추출물 또는 천연물, 화합물 등이 될 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법을 통해 얻은, 유전자 발현을 증진시키거나 단백질의 기능을 증진시키는 활성을 나타내는 시험대상물질 및 반대로 유전자 발현을 억제시키거나 단백질의 기능을 억제시키는 활성을 나타내는 시험대상물질은, 전자의 경우, 시험대상물질에 대한 억제제를 개발함으로써 항암제 후보물질이 될 수 있고, 후자의 경우는 항암제 후보물질이 될 수 있다. 이와 같은 항암제 후보물질은 이후의 항암제 개발과정에서 선도물질(leading compound)로서 작용하게 되며, 선도물질이 상기 유전자 또는 그로부터 발현되는 단백질의 기능 억제효과를 나타낼 수 있도록 그 구조를 변형시키고 최적화함으로써, 새로운 항암제를 개발할 수 있다.

본 발명은 또한 MIG12 유전자의 siRNA 또는 OIP5 유전자의 siRNA를 제공한다.

siRNA는 유전자의 정방향 서열(sense strand)과 세포 내에서 실제 유전자 억제효과를 나타내는 역방향 서열(anti-sense strand)을 함께 합성한 후 이중리보핵산쇄로 결합시켜 세포내로 도입된다.

본 발명의 siRNA 서열은 별도로 언급이 없는 한, 편의상 유전자의 정방향 서열(sense strand)을 의미한다.

상기 MIG12 유전자(NM_021242)의 후보 siRNA 염기서열 부위는 서열번호 14, 15, 16, 17, 또는 18의 염기서열에 속하는 연속된 19-30개의 염기서열일 수 있으며, 상기 14, 15, 16, 17, 또는 18의 염기서열은 서열번호 1의 MIG12 유전자(NM_021242)의 부분서열로, 각각 845 내지 950번째 염기서열, 970 내지 1030번째 염기서열, 1080 내지 1160번째 염기서열, 1220 내지 1290번째 염기서열, 1320 내지 1400번째 염기서열에 해당하며, 염기수 61-106개로 구성된 서열이다. 즉, 상기 염기서열에 상보적인 염기서열이 효율적으로 RNAi를 유도하는 서열일 수 있다.

상기 MIG12 유전자의 siRNA는 서열번호 14, 15, 16, 17 및 18 중에서 선택된 하나 이상의 서열에서, 연속된 19~30개의 염기서열로부터 유래된 mRNA서열에 해당하는 염기서열을 포함할 수 있다.

상기 MIG12 유전자의 siRNA의 염기서열은 서열번호 3 또는 4일 수 있다. 상기 서열번호 3은 서열번호 1의 MIG12 유전자의 1331 내지 1349번째 염기서열로부터 유래된 mRNA서열에 해당하는 19개의 염기서열에 단쇄의 2염기(TT)가 매달린 서열이고, 상기 서열번호 4는 서열번호 1의 MIG12 유전자의 1123 내지 1141번째 염기서열로부터 유래된 mRNA서열에 해당하는 19개의 염기서열에 단쇄의 2염기(TT)가 매달린 서열로, 상기 서열에 상보적인 역방향 서열(anti-sense strand)의 유전자 억제효과(RNAi 효과)가 뛰어날 수 있다.

상기 OIP5 유전자(NM_007280)의 후보 siRNA 염기서열 부위는 서열번호 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 또는 26의 염기서열에 속하는 연속된 19-30개의 염기서열일 수 있으며, 상기 서열번호 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 또는 26의 염기서열은 서열번호 2의 OIP5 유전자(NM_007280)의 부분서열로, 각각 1 내지 60번째 염기서열, 120 내지 180번째 염기서열, 380 내지 460번째 염기서열, 518 내지 580번째 염기서열, 720 내지 780번째 염기서열, 850 내지 890번째 염기서열, 920 내지 980번째 염기서열, 또는 1040 내지 1100번째 염기서열에 해당하며, 염기수 41-81개로 구성된 서열이다. 즉, 상기 염기서열에 상보적인 염기서열이 효율적으로 RNAi를 유도하는 서열일 수 있다.

상기 OIP5 유전자의 siRNA는 서열번호 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 및 26 중에서 선택된 하나 이상의 서열에서, 연속된 19~30개의 염기서열로부터 유래된 mRNA서열에 해당하는 염기서열을 포함할 수 있다.

상기 OIP5 유전자의 siRNA의 염기서열은 서열번호 5 또는 6일 수 있다. 상기 서열번호 5는 서열번호 2의 OIP5 유전자의 426 내지 444번째 염기서열로부터 유래된 mRNA서열에 해당하는 19개의 염기서열에 단쇄의 2염기(TT)가 매달린 서열이고, 상기 서열번호 6은 서열번호 2의 OIP5 유전자의 417 내지 435번째 염기서열로부터 유래된 mRNA서열에 해당하는 19개의 염기서열에 단쇄의 2염기(TT)가 매달린 서열로, 상기 서열에 상보적인 역방향 서열(anti-sense strand)의 유전자 억제효과(RNAi 효과)가 뛰어날 수 있다.

또한, 본 발명의 siRNA는 생체내 핵산 분해효소에 의한 빠른 분해를 막기 위해 화학적으로 변형된 형태일 수 있다. siRNA는 이중나선 구조를 가지므로, 단일나 선 구조의 리보핵산이나 안티센스 올리고핵산(antisense oligonucleotide)보다는 상대적으로 안정한 구조이지만 생체내 핵산 분해효소에 의해 빠르게 분해되기 때문에 화학적 변형을 통해 분해 속도를 감소시킬 수 있다. siRNA가 쉽게 분해되지 않도록 안정하고 저항적이도록 하기 위한 siRNA의 화학적 변형 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. siRNA의 화학적 변형에 가장 많이 사용되는 방식은 보라노포스페이트(boranophosphate) 또는 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 수식 방법(modification)이다. 이들 물질은 siRNA의 뉴클레오사이드(nucleoside) 간의 연결을 안정하게 형성하어, 결과적으로 핵산 분해에 대한 저항성을 부여한다. 보라노포스페이트로 수식된 리보핵산은 핵산 분해가 잘 되지 않는 특징이 있지만, 화학 반응에 의하여 만들어 지지 않고 in vitro 전사 반응에 의해 보라노포스페이트가 리보핵산에 들어가는 방식으로만 합성이 된다. 보라노포스페이트 수식방법은 비교적 손쉬운 방법에 속하지만, 특정 위치에 수식하기 어려운 단점이 있다. 반면 포스포로티오에이트 수식 방법은 원하는 부분에 황(sulfur) 원소를 도입할 수 있는 장점이 있으나, 정도가 심한 포스포티오에이션(phosphothioation)은 효능 감소, 독성, 비특이적 RISC(RNA-induced silencing complex) 형성 등의 문제가 나타날 수 있다. 따라서 최근에는 위의 두 가지 방법 외에 리보핵산의 종결 위치(3'말단 초과부위)에만 화학적 변형을 하여 핵산 분해효소에 저항성을 부여하는 방법이 보다 선호되고 있다. 또한 리보스 환(ribose ring)을 화학적으로 수식하여도 핵산 분해효소에 대한 저항성이 강해지는 것으로 알려져 있는데 특히 본래 세포내 존재하는 리보오스 2'-위치의 변이는 siRNA를 안정화시킨다. 그러나 이 위치에 정확히 메틸기 가 들어가야 안정성이 증가되며 너무 많은 메틸기는 반대로 리보핵산 매개 간섭현상이 상실되는 등의 문제도 있다. 이러한 화학적 변형의 이유는 생체 내에서의 약물동력학적(pharmacokinetic)인 체류시간의 증대 및 유효성을 높이기 위한 목적도 있다 (Mark et. al., Molecular Therapy, 13:644-670, 2006).

화학적 수식방법 외에, siRNA의 세포 내 전달 효율을 높이기 위해서는 안전하고 효율적인 전달 시스템이 요구되어진다. 이를 위해, 본 발명의 siRNA는 핵산 전달체(nucleic acid delivery system)와의 복합체 형태로 암 치료용 의약 조성물 내에 포함될 수 있다.

세포 내로 핵산 물질을 전달하기 위한 핵산 전달체는 크게 바이러스성 벡터와 비바이러스성 벡터로 구분할 수 있다. 가장 널리 이용되는 것은 바이러스 벡터 (viral vector)로 전달 효율이 높고 지속 시간이 길기 때문이다. 여러 가지의 바이러스벡터 중 레트로바이러스 벡터(retroviral vector), 아데노바이러스 벡터(adenoviral vector), 아데노 부속 바이러스 벡터(adeno-associated viral vector) 등이 주요하게 사용되고 있다. 이러한 바이러스 벡터는 리보핵산의 세포내 전달 면에서는 효율적이지만, 생체 내에서의 활성을 가진 바이러스로의 재조합, 면역 반응 유발, 숙주 염색체로의 무작위 삽입 등 안전성(safety) 측면에서 여러 문제점을 가지고 있다. 이에 비해 비바이러스 벡터(nonviral vector)는 바이러스 벡터에 비해 장점을 가지고 있는데, 독성과 면역 반응이 작고, 반복적으로 투여가 가능하며, 리보핵산과의 복합체 형성이 간편하고, 대량 생산이 용이하다. 또한, 질환 세포나 조직부위에 특이적 리간드를 비바이러스성 벡터에 접합하여, 장기·세포 선 택적 핵산 전달을 가능하게 한다. 비바이러스성 벡터로서는 리포좀, 양이온성 고분자를 비롯하여, 미셀, 에멀젼, 나노입자 등의 다양한 제형이 사용될 수 있다. 핵산 전달체는 동물 세포 내에 목적하는 핵산의 수송 효율을 현저히 증강시킬 수 있으며 전달하고자 하는 핵산의 사용 목적에 따라 어떤 동물 세포로도 핵산 전달이 가능하다.

본 발명의 siRNA는 짧은 19-30개의 이중 리보핵산쇄로 세포내 도입하면 비특이적 저해(non-specific inhibition) 없이 MIG12 유전자 또는 OIP5 유전자의 발현을 억제하는 효과를 나타내어, 구체적으로 암세포를 죽이는 항암활성이 있으며, 관련 유전자들의 기능연구에도 이용할 수 있다.

본 발명은 또한 MIG12 유전자의 shRNA 또는 OIP5 유전자의 shRNA를 제공한다.

상기 shRNA(small hairpin RNA)는 타겟유전자 siRNA 염기서열의 sense와 상보적인 nonsense 사이에 3-10개의 염기 linker를 연결하는 올리고 DNA를 합성한 후 프라스미드 벡터에 클로닝하거나 또는 shRNA를 레트로바이러스인 렌티바이러스 (lentivirus) 및 아데노바이러스 (adenovirus)에 삽입하여 발현시키면 loop가 있는 헤어핀 구조의 shRNA (short hairpin RNA)가 만들어지고 세포 내의 Dicer에 의해 siRNA로 전환되어 RNAi 효과를 나타낸다. 상기 shRNA는 siRNA에 비해 비교적 장기간 RNAi 효과를 나타낸다.

상기 MIG12 유전자의 shRNA도 MIG12 유전자의 siRNA와 동일하게 상기 MIG12 유전자의 서열번호 14, 15, 16, 17 및 18 중에서 선택된 하나 이상의 서열에서, 연 속된 19~30개의 염기서열로부터 유래된 mRNA서열에 해당하는 염기서열을 포함할 수 있다.

상기 MIG12 유전자의 shRNA는 서열번호 4의 RNA 염기서열과 이와 3-10염기의 루프(loop)영역으로 연결된 서열번호 4에 역상보적인 RNA 염기서열을 포함할 수 있다. 상기 서열번호 4의 RNA 염기서열은 서열번호 1의 MIG12 유전자의 1123 내지 1141번째 염기서열로부터 유래된 mRNA서열에 해당하는 19개의 염기서열로, 상기 서열에 역상보적인 서열(anti-sense strand)의 유전자 억제효과(RNAi 효과)가 뛰어날 수 있다.

상기 'RNA 염기서열'은 서열번호 4의 염기서열에서 단쇄의 2염기(TT)를 제외한 RNA염기서열 부분을 의미한다.

상기 MIG12유전자의 shRNA를 발현시키기 위한 발현벡터제조용 상층서열(top strand)는 서열번호 27일 수 있다.

상기 OIP5 유전자의 shRNA도 OIP5 유전자의 siRNA와 동일하게 서열번호 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 및 26 중에서 선택된 하나 이상의 서열에서, 연속된 19~30개의 염기서열로부터 유래된 mRNA서열에 해당하는 염기서열을 포함할 수 있다.

상기 OIP5 유전자의 shRNA는 서열번호 5의 RNA 염기서열과 이와 3-10염기의 루프(loop)영역으로 연결된 서열번호 5에 역상보적인 RNA 염기서열을 포함할 수 있다. 상기 서열번호 5의 RNA 염기서열은 서열번호 2의 OIP5 유전자의 426 내지 444번째 염기서열로부터 유래된 mRNA서열에 해당하는 19개의 염기서열로, 상기 서열에 역상보적인 서열(anti-sense strand)의 유전자 억제효과(RNAi 효과)가 뛰어날 수 있다.

상기 'RNA 염기서열'은 서열번호 5의 염기서열에서 단쇄의 2염기(TT)를 제외한 RNA염기서열 부분을 의미한다.

상기 OIP5유전자의 shRNA를 발현시키기 위한 발현벡터제조용 상층서열(top strand)은 서열번호 28일 수 있다.

siRNA의 세포내 지속효과 및 트랜스펙션 효과를 증가시키기 위해 siRNA 염기서열을 포함하는 헤어핀구조의 shRNA (small hairpin RNA)를 포함한 발현 컨스트럭트/벡터는 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, 미국 출원 제2004/106567 및 2004/0086884는 shRNA를 포함하는 바이러스성 벡터, 비바이러스성 벡터 외에 리포솜 전달 운반체, 플라스미드 주입 시스템, 인공 바이러스 엔벨로프 및 폴리라이신 컨쥬게이트를 포함한 전달 메커니즘뿐만 아니라 많은 발현 컨스트럭트/벡터 관련 정보를 제공하고 있다.

본 발명은 또한 MIG12 유전자에 대한 억제제를 포함하는 암 치료용 조성물 및 OIP5 유전자에 대한 억제제를 포함하는 암 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 '유전자에 대한 억제제'는 유전자의 발현 억제제의 개념을 포함한다.

상기 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다.

하기 실시예에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 유전자는 암 세포에서 다량 발현되고, 상기 유전자의 억제제를 투여하여 상기 유전자의 발현을 저해시 키면 암을 억제할 수 있다.

따라서 본 발명은 또한 상기 유전자의 억제제의 암 치료 용도 및 유효량의 상기 유전자의 억제제를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 암 치료방법을 제공한다. 본 발명에 있어서 암 치료는 암의 예방 및 억제를 포함한다.

본 발명에 있어서, 상기 유전자에 대한 억제제는 상기 유전자의 mRNA에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드일 수 있다.

안티센스 올리고뉴클레오타이드는 생체 내 뿐만 아니라 생체 외에서도 유전자-특이적 억제를 달성하기 위해 성공적으로 사용되어 왔다. 안티센스 뉴클레오타이드는 특정 DNA 또는 RNA 타겟에 대해 안티센스(또는 상보)인 짧은 길이의 DNA 합성 가닥(또는 DNA 아날로그)이다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 타겟에 결합하고 전사, 번역 또는 스플라이싱의 단계에서 발현을 멈추게 함으로써 DNA 또는 RNA 타겟에 의해 인코드된 단백질의 발현을 막기 위해 제안되었다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 세포 배양 및 질병의 동물 모델에서도 성공적으로 이용되어 왔다(Hogrefe, 1999). 올리고뉴클레오타이드가 분해되지 않도록 더욱 안정하고 저항적이 되게 하기 위한 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 또다른 변형이 당업자에게 알려져 있고 이해된다. 여기서 사용된 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 이중나선 또는 단일나선 DNA, 이중나선 또는 단일나선 RNA, DNA/RNA 하이브리드, DNA 및 RNA 아날로그 및 염기, 당 또는 백본 변형을 지닌 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 올리고뉴클레오타이드는 안정성을 증가시키고, 뉴클레아제 분해에 대한 저항성을 증가시키기 위해 당분야에 알려진 방법에 의해 변형된다. 이들 변형은 당분야에 알 려져 있고 올리고뉴클레오타이드 백본의 변형, 당 모이어티의 변형 또는 염기의 변형을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.

또한, 상기 유전자에 대한 억제제는 상기 유전자의 siRNA(Small Interfering RNA)일 수 있다.

상기 MIG12 유전자의 siRNA의 염기서열은 서열번호 3 또는 4일 수 있다. 상 기 서열번호 3은 서열번호 1의 MIG12 유전자의 1331 내지 1349번째 염기서열로부터 유래된 mRNA서열에 해당하는 19개의 염기서열에 단쇄의 2염기(TT)가 매달린 서열이고, 상기 서열번호 4는 서열번호 1의 MIG12 유전자의 1123 내지 1141번째 염기서열로부터 유래된 mRNA서열에 해당하는 19개의 염기서열에 단쇄의 2염기(TT)가 매달린 서열로, 상기 서열에 상보적인 역방향 서열(anti-sense strand)의 유전자 억제효과(RNAi 효과)가 뛰어날 수 있다.

상기 OIP5 유전자의 siRNA의 염기서열은 서열번호 5 또는 6일 수 있다. 상기 서열번호 5는 서열번호 2의 OIP5 유전자의 426 내지 444번째 염기서열로부터 유래 된 mRNA서열에 해당하는 19개의 염기서열에 단쇄의 2염기(TT)가 매달린 서열이고, 상기 서열번호 6은 서열번호 2의 OIP5 유전자의 417 내지 435번째 염기서열로부터 유래된 mRNA서열에 해당하는 19개의 염기서열에 단쇄의 2염기(TT)가 매달린 서열로, 상기 서열에 상보적인 역방향 서열(anti-sense strand)의 유전자 억제효과(RNAi 효과)가 뛰어날 수 있다.

또한, 본 발명의 siRNA는 생체내 핵산 분해효소에 의한 빠른 분해를 막기 위해 화학적으로 변형된 형태일 수 있다. siRNA는 이중나선 구조를 가지므로, 단일나선 구조의 리보핵산이나 안티센스 올리고핵산(antisense oligonucleotide)보다는 상대적으로 안정한 구조이지만 생체내 핵산 분해효소에 의해 빠르게 분해되기 때문에 화학적 변형을 통해 분해 속도를 감소시킬 수 있다. siRNA가 쉽게 분해되지 않도록 안정하고 저항적이도록 하기 위한 siRNA의 화학적 변형 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. siRNA의 화학적 변형에 가장 많이 사용되는 방식은 보라노포스페이트(boranophosphate) 또는 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 수식 방법(modification)이다. 이들 물질은 siRNA의 뉴클레오사이드(nucleoside) 간의 연결을 안정하게 형성하어, 결과적으로 핵산 분해에 대한 저항성을 부여한다. 보라노포스페이트로 수식된 리보핵산은 핵산 분해가 잘 되지 않는 특징이 있지만, 화학 반응에 의하여 만들어 지지 않고 in vitro 전사 반응에 의해 보라노포스페이트가 리보핵산에 들어가는 방식으로만 합성이 된다. 보라노포스페이트 수식방법은 비교적 손쉬운 방법에 속하지만, 특정 위치에 수식하기 어려운 단점이 있다. 반면 포스포로티오에이트 수식 방법은 원하는 부분에 황(sulfur) 원소를 도입할 수 있는 장 점이 있으나, 정도가 심한 포스포티오에이션(phosphothioation)은 효능 감소, 독성, 비특이적 RISC(RNA-induced silencing complex) 형성 등의 문제가 나타날 수 있다. 따라서 최근에는 위의 두 가지 방법 외에 리보핵산의 종결 위치(3'말단 초과부위)에만 화학적 변형을 하여 핵산 분해효소에 저항성을 부여하는 방법이 보다 선호되고 있다. 또한 리보스 환(ribose ring)을 화학적으로 수식하여도 핵산 분해효소에 대한 저항성이 강해지는 것으로 알려져 있는데 특히 본래 세포내 존재하는 리보오스 2'-위치의 변이는 siRNA를 안정화 시킨다. 그러나 이 위치에 정확히 메틸기가 들어가야 안정성이 증가되며 너무 많은 메틸기는 반대로 리보핵산 매개 간섭현상이 상실되는 등의 문제도 있다. 이러한 화학적 변형의 이유는 생체 내에서의 약물동력학적(pharmacokinetic)인 체류시간의 증대 및 유효성을 높이기 위한 목적도 있다 (Mark et. al., Molecular Therapy, 13:644-670, 2006).

세포 내로 핵산 물질을 전달하기 위한 핵산 전달체는 크게 바이러스성 벡터와 비바이러스성 벡터로 구분할 수 있다. 가장 널리 이용되는 것은 바이러스 벡터 (viral vector)로 전달 효율이 높고 지속 시간이 길기 때문이다. 여러 가지의 바이러스벡터 중 레트로바이러스 벡터(retroviral vector), 아데노바이러스 벡터(adenoviral vector), 아데노 부속 바이러스 벡터(adeno-associated viral vector) 등이 주요하게 사용되고 있다. 이러한 바이러스 벡터는 리보핵산의 세포내 전달 면에서는 효율적이지만, 생체 내에서의 활성을 가진 바이러스로의 재조합, 면역 반응 유발, 숙주 염색체로의 무작위 삽입 등 안전성(safety) 측면에서 여러 문제점을 가지고 있다. 이에 비해 비바이러스 벡터(nonviral vector)는 바이러스 벡터에 비해 장점을 가지고 있는데, 독성과 면역 반응이 작고, 반복적으로 투여가 가능하며, 리보핵산과의 복합체 형성이 간편하고, 대량 생산이 용이하다. 또한, 질환 세포나 조직부위에 특이적 리간드를 비바이러스성 벡터에 접합하여, 장기·세포 선택적 핵산 전달을 가능하게 한다. 비바이러스성 벡터로서는 리포좀, 양이온성 고분자를 비롯하여, 미셀, 에멀젼, 나노입자 등의 다양한 제형이 사용될 수 있다. 핵산 전달체는 동물 세포 내에 목적하는 핵산의 수송 효율을 현저히 증강시킬 수 있으며 전달하고자 하는 핵산의 사용 목적에 따라 어떤 동물 세포로도 핵산 전달이 가능하다.

또한 상기 유전자에 대한 억제제는 MIG12 유전자의 shRNA 또는 OIP5 유전자의 shRNA일 수 있다.

상기 MIG12 유전자의 shRNA도 MIG12 유전자의 siRNA와 동일하게 상기 MIG12 유전자의 서열번호 14, 15, 16, 17 및 18 중에서 선택된 하나 이상의 서열에서, 연속된 19~30개의 염기서열로부터 유래된 mRNA서열에 해당하는 염기서열을 포함할 수 있다.

siRNA는 세포 배양 및 생체 내에서 오래 지속되는 효과, 생체 내에서 세포를 트랜스펙션시키는 능력 및 혈청 내 분해에 대한 저항력의 측면에서 생체 내에서 특정한 유전자의 발현의 저해에 대해 매우 강한 약물이 되는 잠재력을 지닌다(Bertrand et al., 2002).

siRNA는 상대적으로 낮은 농도로도 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의해 얻을 수 있는 효과와 동등하거나 높은 효과를 얻을 수 있기 때문에 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 대안으로 제시되고 있다(Thompson, 2002). siRNAs의 이용은 질병의 동물 모델에 있어서 유전자 발현을 저해하는 데 대중성을 나타내고 있다. 당업자는 당해 기술 분야에 공지된 방법을 이용하여 원하는 방식대로 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 siRNA를 합성하고 변형시킬 수 있다(예를 들어, Andreas Henschel, Frank Buchholz1 and Bianca Habermann (2004) DEQOR: a web-based tool for the design and quality control of siRNAs. Nucleic Acids Research 32(Web Server Issue):W113-W120. 참조). 또한 당업자는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, 또는 shRNA 발현 컨스트럭트/벡터에 유용한 조절 서열(예컨대, 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 조직-특이적 프로모터 또는 그의 결합)을 잘 이해하고 있다.

암 치료를 위해 사용되는 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, 또는 shRNA는 약제학적으로 허용되는 담체를 추가적으로 포함한 조성물의 형태로 투여될 수 있다. 적당한 약제학적으로 허용되는 담체는 예를 들어 하나 이상의 물, 식염수, 인산 완충 식염수, 덱스트린, 글리세롤, 에탄올뿐만 아니라 이들의 조 합을 포함한다. 이러한 조성물은 투여 후 활성 성분의 빠른 방출, 또는 지속적이거나 지연된 방출을 제공하도록 제제화될 수 있다.

상기 유전자의 저해제는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, 또는 shRNA 외에도 상기 유전자의 발현을 저해하는 저분자화합물, 천연물, 생체유용단백질, 생체 내 단백질 또는 신규단백질, 합성 및 천연화합물질 등 어떤 것이든 가능하다. 따라서 종래 당해 기술 분야에서 상기 유전자의 저해제로 알려진 화합물 및 상기 유전자를 이용한 스크리닝을 통해 발굴한 물질도 이용가능하다.

본 발명은 또한 MIG12 유전자로부터 발현된 단백질에 대한 억제제를 포함하는 암 치료용 조성물 및 OIP5 유전자로부터 발현된 단백질에 대한 억제제를 포함하는 암 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 유전자를 억제하면 그에 따른 단백질의 발현이 억제되어 암이 억제되는 것이므로, 상기 유전자의 단백질을 저해하면 암을 억제할 수 있다.

따라서 본 발명은 상기 단백질에 대한 억제제의 암 치료 용도 및 유효량의 상기 단백질의 억제제를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 암 치료방법을 제공한다. 본 발명에 있어서 암 치료는 암의 예방 및 억제를 포함한다.

상기 단백질에 대한 억제제는 본 발명의 유전자로부터 발현된 단백질에 대한 항체일 수 있다. 상기 단백질에 대한 모노클로날 항체는 당업계에 통상적인 모노클로날 항체 제작 방법을 통해 제작되어 사용될 수도 있고, 시판되는 것을 사용할 수 있다. 또한, 모노클로날 항체 대신에 상기 단백질을 인식하는 폴리클로날 항체를 사용할 수도 있고 이는 당업계에 통상적인 항혈청 제작 방법을 통해 제작되어 사용 될 수도 있다.

본 발명의 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용되는 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 단백질에 대한 억제제가 항체일 경우 약제학적으로 허용되는 담체는 결합 단백질의 저장 수명 또는 유효성을 증가시키는 습윤제 또는 유화제, 방부제 또는 완충액과 같은 최소량의 보조 물질로 구성될 수 있다.

또한 본 발명의 암 치료용 조성물은 하나 또는 그 이상의 항암제와 함께 사용될 수 있다. 본 발명의 암 치료용 조성물은 예를 들어 당업자에게 잘 알려진 화학요법약제(chemotherapeutic agent), 예컨대, 사이클로포스파마이드, 아지리딘, 알킬알콘설포네이트, 나이트로소우레아, 다카르바진, 카르보플라틴, 시스플라틴 등과 같은 알킬화제(alkylating agent), 마이토마이신 C, 안트라사이클린, 독소루비신(아드리아마이신) 등과 같은 항생제, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라신, 시타라빈 등과 같은 항대사제(antimetabolitic agent), 빈카 알칼로이드와 같은 식물유래 약제 및 호르몬 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 암 치료용 조성물은 상기 유효 성분 외에도 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 포함할 수 있으며, 이러한 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 가용화제 등이 있다.

또한 본 발명의 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용되는 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 조성물의 약제 제제 형태는 과립제, 산제, 피복정, 정제, 캡슐제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있다.

본 발명의 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.

본 발명의 치료 방법에 있어서, "유효량"은 암을 억제하는 효과를 이루는데 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 본 발명의 유효 성분의 "유효량"은 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 성인의 경우, 상기 유전자 또는 단백질의 억제제를 1일 1회 내지 수회 투여시, siRNA일 경우 0.01ng/kg~10㎎/kg, shRNA일 경우 0.01ng/kg~10㎎/kg, 상기 유전자의 mRNA에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드인 경우 0.01ng/kg~10㎎/kg, 화합물일 경우 0.1ng/kg~10㎎/kg, 상기 단백질에 대한 모노클로날 항체일 경우 0.1ng/kg~10㎎/kg, 저분자화합물일 경우 0.1ng/kg~10㎎/kg, 천연물일 경우 0.1ng/kg~10㎎/kg, 생체유용단백질일 경우 0.1ng/kg~10㎎/kg의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.

추가로, 본 발명은 MIG12 유전자, OIP5 유전자 또는 이들로부터 발현된 단백질 중 하나 이상을 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.

상기 암 진단용 키트는 본 발명의 진단용 조성물 외에도 상기 조성물과 시료 간의 반응을 파악하는데 사용되는 예컨대 DNA 칩, 단백질 칩 등의 적용을 위한 재료를 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 MIG12 유전자는 서열번호 1의 염기서열 또는 상기 염기서열 중 하나 이상의 염기가 결실, 치환 또는 삽입된 염기서열을 가질 수 있다.

또한 본 발명에 있어서, 상기 OIP5 유전자는 서열번호 2의 염기서열 또는 상기 염기서열 중 하나 이상의 염기가 결실, 치환 또는 삽입된 염기서열을 가질 수 있다.

상기한 MIG12 유전자, OIP5 유전자, 이들에 대한 siRNA 또는 shRNA의 서열은 예시일 뿐 이에 한정되는 것은 아님은 당업자에게 자명하다. 상기 서열들에 대해 실질적인 서열 동일성 또는 실질적인 서열 상동성을 지닌 서열 또한 본 발명의 범주에 포함된다. 여기서 사용된 "실질적인 서열 동일성" 또는 "실질적인 서열 상동성"이라는 용어는 서열이 또 다른 서열과의 실질적인 구조적 또는 기능적 동일성을 나타냄을 표현하기 위해 사용된다. 이러한 차이는 예를 들어 다른 종 간의 코돈 용법의 고유의 변이에 기인한다. 2 이상의 다른 서열 사이의 유의적인 양의 서열 중복 또는 유사성이 있는 경우 이들 서열의 길이 또는 구조가 다르더라도 유사한 물리적 특성을 지니는 경우 구조적 차이는 무시할만한 정도가 된다.

본 발명에서 유전공학적 기술과 관련된 사항은 샘브룩 등의 문헌(Sambrook, et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001)) 및 프레드릭 등의 문헌 (Frederick M. Ausubel et al., Current protocols in molecular biology volume 1, 2, 3, John Wiley & Sons, Inc. (1994))에 개시되어 있는 내용에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 MIG12 및 OIP5 유전자는 모델세포에 과발현한 결과 세포주기 조절 및 성장인자와 관련 있고, 암 세포주에서 다량 발현되며, 세포의 증식 속도를 증가시키므로, 이들 유전자의 발현을 저해시키면 암세포의 성장을 억제시키는 작용 효과를 가져온다. 따라서 MIG12와 OIP5 유전자는 각종 암의 진단 또는 치료제의 표적 유전자로 활용될 수 있다. 그러므로, 본 발명은 암 표적 유전자에 특이적인 치료제와 같이 부작용이 적은 맞춤형 항암제인 siRNA/shRNA 신약, 항체신약, 단백질신약 등의 바이오 신약 및 MIG12와 OIP5 단백질을 표적으로 하는 저분자 합성신약, 천연물 신약 등의 표적 항암제 등 신약개발에 활용될 것이다. 또한 새로운 암 관련 기전 경로 연구의 기반을 닦는 원천 기술 개발에 기여할 것이다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

<실시예 1> MIG12 또는 OIP5 유전자 발현과 그 효과 확인

분열효모는 세포 주기 및 신호 전달과 관련된 유전자가 결손되거나 세포 내에 과량 발현되면 신호전달 체계 조절에 이상이 초래되어 세포주기 조절 이상 또는 대사 이상에 의한 세포의 생장 속도 저해 및 형태학적 변화를 나타내므로, 인간 유전자 MIG12 또는 OIP5를 분열효모 내에서 과량 발현시켜 세포의 생장 속도 저해 및 형태학적 변화 등 유전자과발현에 따른 암관련 효과를 확인하였다.

1-1. MIG12 또는 OIP5 유전자 발현 효모 제조

MIG12 또는 OIP5 유전자를 분열효모에서 다량으로 쉽게 발현시키기 위해 Gateway^TM 시스템(Invitrogen, USA)을 이용하고, 티아민의 존재 유무에 따라 유전자의 발현을 조절하는 nmt1 프로모터가 있는 유전자 발현 벡터를 사용하였다. 또한, 인간 유전자 각각을 S. pombe 발현벡터 시스템에 맞게 클로닝해야 하는 번거로움을 줄이기 위해 전환 카세트가 삽입된 p173DES 벡터(기탁번호:KCTC 10757BP)를 사용하였다. 인간 유전자 MIG12 또는 OIP5가 클론된 엔트리 벡터(entry vector)(프런티어 인간유전체기능사업단 제공, 대한민국)를 p173DES 벡터와 in vitro 상에서 융합 반응시킨 후 인간 유전자들이 발현되는 분열효모 유전자 발현 벡터를 제조하였다 (도 1).

p173DES 벡터에 클론된 유전자들의 과발현시 나타나는 세포 형질 변화와 표현형의 변화를 관찰하기 위하여 인간 유전자 MIG12와 OIP5가 각각 클로닝된 플라스미드를 S. pombe의 정상 반수체(haploid) 균주인 ED665(h-)(Fanters, University of Glasgow, UK)에 리튬 아세테이트(lithium acetate) 형질전환 방법으로 형질 전환하였다.

형질전환체들의 선택 배지는 분열 효모 플라스미드인 pDES173의 마커(marker)인 우라실(uracil)과 균주의 영양 요구성을 고려하여 EMM 배지 (Edinburgh Minimal Media)에 아데닌(adenine)과 류신(leucine)을 첨가시켜 준 배지 (이후 EMM+AL로 표기함)를 사용하였다.

1-2. 세포성장 저해 효과

암 관련 인간 유전자들을 ED665 균주에서 발현시키기 위해 프로모터의 리프레서(repressor)역할을 하는 티아민(thiamine, 이하 Thia로도 표기)을 2μM 첨가해준 EMM+AL+Thia와 첨가해주지 않은 EMM+AL을 각각 사용하였다. 대조군으로 인간 유전자가 들어있지 않은 pDES173를 함께 발현시켰다. 30℃에서 3일간 배양한 후, EMM+AL 고체 배지와 EMM+AL+Thia 고체 배지에 자란 콜로니를 비교하여 세포 성장의 저해 여부를 관찰하였다. 그 결과, EMM+AL고체 배지에서 배양된 MIG12 또는 OIP5 유전자가 도입된 균주의 콜로니 형성이 억제됨으로써 MIG12 또는 OIP5가 과량 발현되면 세포의 성장 저해 현상이 나타남을 확인하였다(도2A, 3A).

1-3. 세포형질 변화 효과

또한 세포 형질 변화를 확인하기 위해 EMM+AL+Thia 고체배지에서 배양한 세포를 멸균한 증류수로 3번 세척해 티아민을 완전히 제거시킨 후, EMM+AL 액체 배지와 EMM+AL+Thia (2μM) 액체 배지 각각 10ml 에 다시 O.D₆₀₀ 값이 0.3 되도록 접종 하였다. 6-8시간 동안 30℃에서 배양 후 다시 각각 동일한 배지에 O.D₆₀₀ 값을 0.1로 되도록 희석하여 16시간 배양하였다. 이렇게 얻어진 세포들을 광학 현미경으로 관찰하여 인간 유전자가 과발현 되었을 때 나타나는 세포 형질 변화를 정상 세포의 형질과 비교 분석하여, 인간 유전자가 S. pombe에 과발현 되었을 때 격막이 여러개 있는 긴 세포로 형태 변화가 일어난 것을 확인하였다 (도2B, 3B).

1-4. 세포주기 이상 효과

또한, 상기 실시예 1-3의 세포에 PI(propidium iodide)를 처리하여 염색체 DNA를 염색한 후 DNA 함량을 분석하는 FACScan ^TM (Becton, Dickinson and company)을 이용하여 인간 유전자가 과발현되어 세포 주기에 이상이 생기는 것을 확인하였다.(도 2C, 3C).

1-5. 인간유전자 발현

인간 유전자가 제대로 발현되었는지는 발현 단백질의 N-말단 부위에 있는 HA tag를 인식하는 모노클로날 항체(Cell signaling, U.S.A)를 이용하여 웨스턴 블랏으로 확인하였다(도 2D, 3D).

상기 1-2 내지 1-4의 결과로 부터 본 발명에 따른 MIG12 또는 OIP5 유전자의 과발현에 의해 암의 특징인 세포성장, 세포형질변화, 세포주기 이상이 나타나는 것을 확인할 수 있다. 따라서, MIG12 또는 OIP5 유전자의 과발현 여부를 측정함으로써 암의 진단, 약물 스크리닝이 가능하다. 일 예로, 1-5의 결과에 나타난 바와 같이 MIG12 또는 OIP5 유전자가 발현한 단백질에 대한 항체를 이용하여, MIG12 또는 OIP5 유전자의 발현 여부를 측정함으로써 암의 진단, 약물 스크리닝이 가능하다.

<실시예 2> 암세포주에서 MIG12 또는 OIP5 유전자 발현

유전자의 암 관련성을 추정하는 간단한 방법은 암조직 또는 암세포주에서의 해당 유전자의 발현양의 변화를 비교하는 것이다. 정상 세포에 비해 암세포주에서 다량 발현되어 있는지 또는 감소되어 있는지 비교하여 암 생성 및 진행에 따른 발현량과의 관계를 조사한다. 이를 위해서 암세포주에서 실제 해당 유전자의 발현이 어떻게 나타나고 있는지 암 세포주에서 총 RNA를 추출한 후 해당 유전자의 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 RT-PCR을 수행하여 각 유전자의 양을 정상 세포주와 비교하여 유전자의 세포 내 발현양을 확인한다.

MIG12 또는 OIP5 유전자의 발현 정도를 인간 위암 세포주, 간암 세포주 및 정상 세포에서 RT-PCR을 실시하여 분석하였다. 위암 세포주로서 Sun620, Sun216, Sun484, Sun601 및 Sun638(서울대학교 세포주 은행), 간암세포주로서 Huh7, SH-J1, 및 Ck-1a(전남대학교 김대곤 박사에게서 분양), Chang(ATCC #CCL-62), Snu790 및 Snu354(서울대학교 세포주 은행)를 이용하였다. 그리고, 정상세포주로 IMR90 (human fetal lung fibroblasts, ATCC #CCL-186)을 이용하였다. 본 실험의 RT-PCR은 one-step RT-PCR PreMix kit (iNtRON Biotechnology, INC) 을 이용해 실시하였다. 이 키트는 cDNA의 합성 및 증폭이 한번에 이루어질 수 있도록 제작된 것으로, PreMix (OptiScriptTM RT, i-StarTaqTMDNA polymerase) 8㎕에 각 암세포의 RNA 주형 1㎍/reaction, 특이적 프라이머(specific primer), 3차 증류수를 넣어 total 20㎕로 volume을 맞춰 RT-PCR을 수행하였다. 상기 RT-PCR에서 사용한 특이적 프라이머는 다음과 같다(표 1).

	N-말단	C-말단
MIG12	서열번호 10 5'-ATGATGCAAATCTGCGACACC-3'	서열번호 11 5'-TCAGTGGCCCCAATTGCCGAA-3'
OIP5	서열번호 12 5'-GGCTGGGGGCTGAGGAGCCA-3'	서열번호 13 5'-CACTTCACTCAGAATCTTCA-3'

RT-PCR을 수행한 결과, MIG12와 OIP5는 정상 세포주와 비교하여 대부분의 인간 위암 및 간암 세포주에서 그 RNA 레벨이 확실히 증가됨을 확인할 수 있었다 (도 4).

따라서, MIG12 또는 OIP5의 mRNA레벨을 RT-PCR 등을 이용하여 측정함으로써, MIG12 또는 OIP5와 관련한 암의 진단, 약물 스크리닝 등이 가능하다는 것을 알 수 있다.

<실시예 3> 대장암 세포주에서 OIP5 유전자의 발현

3-1. 대장암환자의 암조직과 정상조직에서 OIP5의 발현

삼성의료원(서울, 대한민국)으로부터 66명의 대장암 환자의 대장암 조직과 정상 조직을 각각 입수하였다. 각각의 조직은 환자로부터 외과적으로 제거된 후, 분석때까지 이를 액체질소에 보관하였다.

총 RNA는 QIAGEN키트(RNeasy Maxi kit: cat #75162)를 사용하여 분리하였고 Experion RNA StdSens(Bio-Rad사) 칩을 이용하여 정량하였다. 우선 대장암 임상조직과 정상조직을 적절한 크기로 자른 후 150ul의 베타 멀캅토 에탄올을 첨가한 15ml의 키트 내 분해 완충액에 용해시켰다. 여기에 15ml의 70% 에탄올을 넣어 잘 섞은 후, 3000g에서 5분간 원심분리하여 총 RNA를 막에 부착시켰다. 두 차례의 세척을 한 후 1.2ml의 RNase가 없는 물을 첨가하여 총 RNA를 분리하였다. 부착된 세포주의 경우는 트립신, EDTA를 이용하여 회수한 후 키트 내 분해 완충액 1ml에 용해시켰다.

상기 추출된 총 RNA를 Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit (Ambion사)을 이용하여 하이브리드화 하였다. T7 Oligo(dT) primer를 이용하여 cDNA를 합성하고, biotin-UTP를 이용하여 in vitro transcription을 실시하여 biotin-labeled cRNA를 제조하였다. 제조된 cRNA는 NanoDrop을 이용하여 정량하였다. 정상 대장 상피세포 및 대장암 세포에서 제조된 cRNA를 Human-6 V2 (Illumina사) 칩에 하이브리드화 하였다. 하이브리드화 후 비특이적 하이브리드화를 제거하기 위하여 Illumina Gene Expression System 세척액 (Illumina사)을 이용하여 DNA 칩을 세척하였고 세척된 DNA 칩은 streptavidin-Cy3(Amersham사) 형광 염색약으로 표지하였다. 형광 표지된 DNA 칩은 공촛점(confocal) 레이저 스캐너 (Illumina사)를 이용하여 스캐닝하여 각 스팟에 존재하는 형광의 데이터를 얻어서 TIFF 형태의 이미지 파일로 저장하였다. TIFF 이미지 파일을 BeadStudio version 3(Illumina사)으로 정량하여 각 스팟의 형광값을 정량하였다. 정량된 결과는 Avadis Prophetic version 3.3(Strand Genomics사) 프로그램으로 'quantile' 기능을 이용하여 보정하였다.

그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5는 대장암 환자의 암조직과 정상조직에서 추출된 mRNA 추출후 측정된 OIP5유전자 발현 프로파일로, 고발현되는 경우(정상조직에 대한 암조직에서의 mRNA양이 상대적으로 증가하는 경우) 붉은색으로, 저발현되는 경우(정상조직에 대한 암조직에서의 mRNA양이 상대적으로 감소되는 경우) 녹색으로 나타내었다. 도 5에서 GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) 와 ACTB(Homo sapiens actin, beta)는 유전자 발현의 차이를 판단하기 위한 표준유전자를 의미한다.

그 결과, 총 66명의 대장암 환자 중 58명의 환자에서 OIP5 유전자의 발현량이 2배 이상 증가되었음을 확인할 수 있었으며(도 5), OIP5 유전자가 대장암세포 내 발현이 평균 3.7배 증가되었음을 확인하였다. 도 5에서 DF는 수술 치료 후 재발하지 않은 환자, RC는 수술치료후에도 재발한 환자군에서 OIP5의 발현정도를 비교한 것인데 환자 두 군에서 뚜렷한 OIP5 발현량의 차이는 없는 것으로 보인다.

3-2. 대장암환자의 암조직에서 OIP5의 mRNA 발현 비교

암세포주 대신 상기 3-1의 66명의 대장암 환자의 암조직 중 무작위로 선발한 10명의 대장암 환자의 암조직을 사용한 것을 제외하고는 실시예 2와 동일하게 RT-PCR을 수행하였다.

그 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6은 대장암환자 10명의 암조직에서 RT-PCR을 이용하여 OIP5의 RNA레벨을 측정한 결과로, T는 암조직을 의미하며, NT는 대조군으로 사용한 정상조직을 의미한다. 그 결과 10명의 환자 대장암조직중 8명의 환자 대장암조직에서 OIP5 유전자가 높게 발현되는 것을 확인할 수 있었다.

상기 3-1과 3-2의 결과는 실제 대장암환자로부터 얻은 세포주와 OIP5유전자 간의 높은 상관성을 나타내는 것으로, OIP5 유전자를 진단, 약물스크리닝, 및 치료타겟으로 사용할 수 있음을 나타내는 것이다.

<실시예 4> MIG12 또는 OIP5 유전자 발현시 세포증식 속도 증가 효과

해당 유전자가 암 생성과 관련되어 있을 경우 세포 증식속도에 영향을 미친다는 점을 이용하여, 비형질전환된 포유류 세포주인 NIH3T3에서 CMV 프로모터를 이용하여 유전자를 과발현시켜 72시간 동안 세포 수를 측정하여, 세포 증식 속도를 대조군과 비교하여 해당 유전자가 세포 증식에 미치는 영향을 조사함으로써, MIG12 또는 OIP5 유전자의 암관련성을 확인하였다.

먼저 MIG12 또는 OIP5를 포함하는 벡터 DNA를 large scale로 컬럼을 통해 정제하였으며, 6-웰 세포 배양 플레이트에서 형질전환을 실시하였다. 형질전환을 위한 NIH3T3 (mouse embryonicfibroblast cell line) 세포주(ATCC CRL-1658)는 10% 송아지 혈청(10% calf serum)이 첨가된 DMEM 배지에서 60~70% 컨플루언시(confluency)로 배양하였다.

DNA (1㎍/㎕) 10㎕와 Lipofectamine in reagent (GIBCO/BRL) 10㎕, 무혈청 DMEM 배지(Dulbelcco's Modified Eagle's Medium) 500㎕를 혼합하여 실온에서 45분간 반응시킨 후, NIH3T3이 배양된 웰에 넣어 48시간 동안 37℃에서 배양하였다. DNA 혼합액 첨가 4~6시간 후 새로운 배지로 교체하였고, 세포 수를 측정하여 세포 생장 속도를 조사하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7은 암 관련성 예측을 위한 실험으로 MIG12 또는 OIP5 유전자를 동물세포(NIH3T3)에 발현시킨 후 세포의 증식 속도의 변화를 분석(proliferation assay)한 결과를 나타내는 그래프로, 흰색은 대조군으로 과발현 되지 않은 세포주에 대한 결과이며, 검은색은 유전자가 과발현된 세포주에 대한 결과이다. 그 결과, 유전자 MIG12 또는 OIP5를 생쥐의 정상 세포주인 NIH3T3 세포주에 발현시켰을 때 세포생장속도가 증가함을 확인할 수 있었다 (도 7).

이와 같은 결과는 MIG12 또는 OIP5 유전자가 발현되어 세포의 성장속도를 증가시키는 역할을 함으로써 암 관련성을 뒷받침하고, MIG12 또는 OIP5의 발현정도를 측정함으로써, MIG12 또는 OIP5 유전자와 관련한 암의 진단, 약물 스크리닝 등이 가능하다는 것을 알 수 있다.

<실시예 5> siRNA의 디자인 및 합성

암세포 조직 또는 암세포주에서 다량 발현되는 유전자의 경우 siRNA 기법을 통해 유전자 발현을 억제하여 세포의 증식 속도에 변화가 있는지를 관찰할 수 있으므로, MIG12 및 OIP5에 대한 각각의 siRNA를 디자인하여 다양한 암세포주에 도입한 후 mRNA 발현 저하에 따른 암세포주의 성장 속도의 변화를 관찰하였다.

MIG12 유전자, OIP5 유전자의 siRNA는 19개 올리고뉴클레오타이드의 이중 리보핵산쇄에 단쇄의 3'-에 2 염기(TT)가 매달린 구조로 디자인하였다.

MIG12 및 OIP5 유전자의 siRNA를 디자인 하기 위하여 설계된 siRNA와 타깃 mRNA와의 열역학적 결합에너지를 계산하여 세포내 RISC (RNA-induced silencing complex) 단백질이 결합하는데 가장 적합한 에너지 분포를 가지는 염기서열을 선택하고자 하였다. 이를 위해 mRNA의 에너지 프로화일 분석을 하여 유전자의 가장 효율이 높은 타깃 영역을 찾아(도 8), 선별된 siRNA의 순위를 결정하여 siRNA를 디자인하였다.

MIG12 유전자(NM_ 021242) mRNA의 에너지 프로화일 분석을 통해 siRNA 염기서열로 디자인 될 수 있는 부위는 서열번호 14, 15, 16, 17, 또는 18의 염기서열에 속하는 연속된 19-30개의 염기서열과 상보적인 염기서열이다. 상기 서열번호 14, 15, 16, 17, 또는 18의 염기서열은 서열번호 1의 MIG12 유전자(NM_021242)의 부분서열로, 각각 845 내지 950번째 염기서열, 970 내지 1030번째 염기서열, 1080 내지 1160번째 염기서열, 1220 내지 1290번째 염기서열, 1320 내지 1400번째 염기서열과 상보적인 염기서열에 해당한다. 즉 디자인될 수 있는 siRNA의 염기서열은 상기 서열번호 14, 15, 16, 17, 또는 18의 염기서열 중 각각의 서열의 일부로 19~30개의 연속된 염기서열로부터 유래된 mRNA서열에 해당하는 염기서열이다.

OIP5 유전자 (NM_ 021242) mRNA의 에너지 프로화일 분석을 통해 siRNA 염기서열로 디자인 될 수 있는 부위는 서열번호 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 또는 26의 염기서열에 속하는 연속된 19-30개의 염기서열이다. 상기 서열번호 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 또는 26의 염기서열은 서열번호 2의 OIP5 유전자의 부분서열로, 각각 1 내지 60번째 염기서열, 120 내지 180번째 염기서열, 380 내지 460번째 염기서열, 518 내지 580번째 염기서열, 720 내지 780번째 염기서열, 850 내지 890번째 염기서열, 920 내지 980번째 염기서열, 1040 내지 1100번째 염기서열에 해당한다. 즉 디자인될 수 있는 siRNA의 염기서열은 상기 서열번호 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 또는 26의 염기서열 중 각각의 서열의 일부로 19~30개의 연속된 염기서열로부터 유래된 mRNA서열에 해당하는 염기서열이다.

상기 에너지 프로파일 분석 결과를 이용하여, siMIG12는 서열번호 3 또는 4의 염기서열을 갖도록 디자인 하였고, siOIP5는 서열번호 5 또는 6의 염기서열을 갖도록 디자인 하였다. 상기 서열번호 3의 염기서열은 서열번호 1의 1331~1349번째 염기서열로부터 유래된 mRNA서열에 해당하는 염기서열에 단쇄의 2염기(TT)가 매달린 구조이며, 서열번호 4의 염기서열은 1123~1141 번째 염기서열로부터 유래된 mRNA서열에 해당하는 염기서열에 단쇄의 2염기(TT)가 매달린 구조이다. 또한, 상기 서열번호 5는 서열번호 2의 OIP5 유전자의 426 내지 444 번째 염기서열로부터 유래된 mRNA서열에 해당하는 염기서열에 단쇄의 2염기(TT)가 매달린 구조이며, 상기 서열번호 6은 서열번호 2의 OIP5유전자의 417 내지 435번째 염기서열로부터 유래된 mRNA서열에 해당하는 염기서열에 단쇄의 2염기(TT)가 매달린 구조이다.

또한, 암 관련 성질을 나타내는 유전자로 RABGTTA(Rab geranylgeranyl transferase alpha-subunit 유전자)를 사용하였고, RABGTTA의 siRNA는 서열번호 7또는 서열번호 8의 염기서열을 갖도록 디자인 하였다.

그리고, 세포에 아무 영향을 미치지 않는 GFP (Green Flourescence Protein)를 siRNA실험의 네거티브 컨트롤(negative control)로 사용하였으며, siGFP는 서열번호 9의 염기서열을 갖도록 디자인 하였다.

모든 유전자의 siRNA는 유전자의 정방향 서열 (sense strand)과 세포 내에서 실제 유전자 억제효과를 나타내는 역방향 서열 (anti-sense strand)을 함께 디자인하여 합성한 후 이중리보핵산쇄로 결합시켜 세포내로 도입하였다.

상기 디자인된 siRNA는 삼천리제약(대한민국)에서 합성하였다.

<실시예 6> MIG12 또는 OIP5 유전자 siRNA의 효과에 의한 암세포주의 성장저해 효과

암세포조직 또는 암세포주에서 다량 발현되는 유전자의 경우 siRNA기법을 통해 유전자 발현을 억제하여 세포의 증식 속도에 변화가 있는지를 관찰할 수 있으므로, 실시예 5에서 제조된 siRNA를 다양한 암세포주에 도입하여 성장저해, 세포사멸 효과 등을 확인하였다.

6-1. 암세포주의 성장저해 효과

위암 세포주 Snu638(서울대학교 세포주 은행), 간암세포주 HCC(서울대학교 세포주 은행), Huh7(전남대학교 김대곤 박사에게서 분양), Snu387(서울대학교 세포주 은행), CK-1a(전남대학교 김대곤 박사에게서 분양), 폐암세포주 A549(서울대학교 세포주 은행), 대장암세포주 colo205(서울대학교 세포주 은행), sw620(서울대학교 세포주 은행), DLD-1(서울대학교 세포주 은행), KM120(서울대학교 세포주 은행)를 사용하였다. 30% 컨플루언시로 배양 후 올리고펙타민 방법(Invitrogen Co.)으로 siMIG12(서열번호 3 및 서열번호 4), siOIP5(서열번호 5 및 서열번호 6), siRABGGTA (서열번호 7 및 서열번호 8), siGFP(서열번호 9)를 세포내에 도입하여 형질전환한 후 5시간 후 PBS로 세포를 세척하고 새로운 배지로 교체 후 72시간 동안 배양하였다.

SRB (Sulfur rhodamine, Sigma Co.)로 염색하고 siRNA에 의한 암세포의 성장저해를 현미경 및 SRB로 염색된 세포수에 의한 변화를 통해 조사하였다 (도9, 도10). 도 9는 MIG12와 OIP5 유전자의 암 타겟 유전자 가능성을 확인하기 위한 siRNA 실험 결과로 다양한 위암, 간암, 폐암 및 대장암 세포주에서의 세포성장 저해 정도를 보여주는 그래프이며, 도 10은 MIG12와 OIP5 유전자의 암 타겟 유전자 가능성을 확인하기 위한 siRNA 실험 결과로 다양한 위암, 간암, 폐암 및 대장암 세포주에서의 세포성장 저해를 나타내는 세포사진이다. 그 결과 콘트롤인 GFP siRNA를 기준(1.0)으로 다양한 암세포주에서의 각 유전자의 RNAi 효과에 의한 성장저해 정도를 나타내었는데 0.8 정도의 효과가 있는 것으로 추정하였다. 따라서, 본 발명에 따른 siMIG12와 siOIP5는 세포주마다 저해 정도가 다르게 나타나 세포주 특이성을 보이고 있으며, 위암세포주, 폐암세포주, 간암세포주 및 대장암세포주 등의 세포성장 억제 효과가 있어 항암효과가 있음을 알 수 있다(도 9).

또한, HCC, Hur7, Snu638, Snu387 및 CK-K1 세포주 실험에서 콘트롤인 GFP siRNA를 처리한 세포주에서는 큰 변화가 없는 반면, MIG12 또는 OIP5의 siRNA를 처리한 위암 세포주 Snu638, 간암세포주 HCC, Huh7, 및 Snu387에서 세포의 성장 억제를 보여주고 있다 (도 10).

6-2. 세포사멸 효과

Snu638 세포주에 RNAi 실험 후 해당 유전자의 발현억제에 의한 세포사멸 정도를 측정하기 위해 FACS (Fluorescence Activated Cell Sorter) 분석을 수행하였다 (도 11). RABGTTA의 siRNA를 처리한 경우에는 세포주의 성장 억제 효과를 관찰하지 못하였다. CK-1a 세포주에서는 3종의 유전자의 발현을 억제시켜도 세포주의 성장 억제 효과를 관찰하지 못하였다. siOIP를 도입한 Snu638세포주의 FACS 분석을 통해 세포사멸이 유도되는 것을 관찰하였다 (도 11). 콘트롤인 siGFP를 넣은 암세포주에서는 72시간 후 세포사멸의 주현상인 DNA 단편이 약간 보이나 siMIG12 또는 siOIP5를 처리시 상대적으로 DNA 단편들이 다량 존재함을 확인하였다.

또한, MIG12 및 OIP5의 siRNA를 이용한 RNAi 실험을 통해 MIG12 또는 OIP5 발현이 감소시 세포의 세포사멸이 일어남을 FACS 분석을 통해 확인하였다. 세포사멸과 관련된 어떠한 유전자들의 발현변화가 있는지 알아보기 위해 RT-PCR을 수행하였다. siRNA 처리 후 72시간 배양한 후 세포(Snu638)를 수집하고 total RNA를 분리하였다. RNA로부터 cDNA를 합성하고 Gene Expression Profiling kit (GeneXp™) (Seegene, Seoul, Korea)를 사용하여 RT-PCR을 수행하여 siRNA를 처리하여 세포사멸을 유도한 세포와 siRNA를 처리하지 않은 정상세포에서 apoptosis 관련된 유전자들의 발현정도를 조사 비교하였다 (도 12). 그 결과, siMIG12의 경우 apoptosis 유도에 직접 관여하는 것으로 알려진 카스파제2, 카스파제7, 카스파제8, 카스파제9, 카스파제10, BAK1 및 granzyme의 발현양이 증가되었다. siOIP5의 경우 apoptosis 유도에 직접 관여하는 것으로 알려진 카스파제2, 카스파제8, 카스파제9, 카스파제10, BAK1 및 granzyme의 발현양이 증가되었다. 또한 apoptosis 유도에 반대작용을 하는 Mcl-1이 감소됨을 나타내었다. 두 유전자 siRNA 처리시 동일하게 Bcl2의 발현이 증가되었고 OIP5 유전자의 발현 감소시 P53도 증가됨을 확인하였으며 이를 통해 MIG12와 OIP5 유전자의 발현감소시 apoptosis가 유도되며, apoptosis가 유도되는 기전은 서로 다름을 나타내고 있다.

결과적으로 본 발명의 siRNA는 암세포주의 세포사멸효과를 유도하여 항암효과를 나타냄을 알 수 있다.

<실시예 7> MIG12 및 OIP5 유전자의 shRNA 디자인 및 합성

암세포 조직 또는 암세포주에서 다량 발현되는 유전자의 경우 shRNA 기법을 통해 유전자 발현을 억제하여 암세포의 증식 속도에 변화가 있는지를 관찰할 수 있으므로, MIG12, 및 OIP5에 대한 각각의 shRNA를 디자인하여 이를 세포내 도입하기 위한 벡터에 클로닝한 후 암세포주에 도입한 후 mRNA 발현 저하에 따른 암세포주의 성장 속도의 변화를 관찰하였다.

먼저 MIG12, OIP5 및 GFP의 shRNA를 디자인하였고, 합성은 바이오니아(대한민국)에서 하였다. GFP (Green Flourescence Protein)는 세포에 아무 영향을 미치지 않는 shRNA 실험의 negative control로 사용되었다. shRNA를 제조하기 위해 siRNA 염기서열에 해당하는 DNA (forward 및 reverse)와 루프 염기서열을 포함하는 67개 뉴클레오타이드 1쌍 (top 및 bottom strand)을 합성하여 U6 프로모터를 가진 pENTR-U6-BHRNX 벡터(뉴로제넥스)에 클로닝하였다. 67개 뉴클에오타이드의 구조는 gatcc- siRNA 정방향 염기서열 - loop -siRNA 역방향 염기서열 - TTTTTTACGCGTg로 되어 있으며 in vivo 상에서 stem-loop 구조를 이루게 된다(도 13A). 서열번호 27은 MIG12 유전자의 shRNA용 염기서열(top strand)로 siMIG12　서열번호 4를 사용하였다. 서열번호 28은 OIP5 유전자의 shRNA용 염기서열(top strand)로 siOIP5 서열번호 5를 사용하였다. 합성한 67mer의 뉴클레오타이드를 pENTR-U6-BHRNX 벡터(뉴로제넥스)에 클로닝한 후 시퀀스를 확인하였다. 서열번호 29의 염기서열을 상층서열(top strand)로 사용한 것을 제외하고는 MIG12 및 OIP5 유전자의 shRNA와 동일하게 GFP shRNA도 디자인하고 합성하였다.

<실시예 8> MIG12 또는 OIP5 유전자의 shRNA에 의한 암세포주의 성장저해 효과

간암세포주 Huh7을 60% 컨플루언시로 배양 후 리포펙타민 방법 (Invitrogen Co.)으로 벡터로부터 실시예 7의 shRNA가 발현되도록 세포 내에 도입하여 형질전환한 후 5시간 후 새로운 배지로 교체하고 72시간 동안 배양하였다. 현미경을 통해 세포의 성장 저해를 관찰하고, SRB (Sulfur rhodamine, Sigma Co.)로 염색하였다. 콘트롤인 GFP shRNA를 처리한 세포주에서는 큰 변화가 없는 반면, MIG12, OIP5의 shRNA를 처리한 간암세포주 Huh7에서 세포의 성장 억제를 보여주고 있다 (도 13B).

<실시예 9> 인간 유전자 MIG12 또는 OIP5 과발현 효과를 이용한 약물 스크리닝

암 관련 인간 유전자들을 실시예 1의 분열효모 ED665 균주에서 발현시키기 위한 유전자 발현벡터의 프로모터는 티아민에 의해 조절 받는다. 즉, MIG12 또는 OIP5 유전자가 도입된 ED665 균주를 티아민(thiamine, 이하 Thia로도 표기)을 15uM 첨가해준 배지 (EMM+AL+Thia)에서 배양시 MIG12 또는 OIP5 유전자가 발현되지 않으나 첨가하지 않은 배지 (EMM+AL)에서 배양시 MIG12 또는 OIP5 유전자가 다량 발현된다. 이와 같은 성질을 이용하여 티아민을 시험대상물질로 하고, MIG12 또는 OIP5유전자를 표적물질로 하여 항암제 스크리닝이 가능함을 확인하였다.

9-1. MIG12 또는 OIP5 과발현에 의한 분열효모의 세포 성장 억제 효과

MIG12 또는 OIP5 유전자발현에 의한 세포 성장 억제를 확인하기 위해 EMM+AL+Thia 고체배지에서 배양한 ED665균주를 멸균한 증류수로 3번 세척해 티아민을 완전히 제거시킨 후, EMM+AL 액체 배지와 EMM+AL+Thia (15uM) 액체 배지 각각 10ml 에 다시 O.D₆₀₀ 값이 0.1이 되도록 접종 하여 세포 성장 정도를 관찰하였다. 대조군(콘트롤)은 유전자 클로닝 없이 발현 벡터만 도입된 균주를 사용하였다. 도 14에 23시간 경과시 세포성장 차이를 도시하였다. 도 14에서 (+)는 티아민을 포함하는 배지에서의 결과를 의미하고, (-)는 티아민을 포함하지 않는 배지에서의 결과를 의미한다. 그 결과 티아민을 제거하고 12시간 후부터 MIG12와 OIP5 단백질 발현이 유도되기 시작하였고, 도 14에 도시한 바와 같이 23시간 경과 후에 단백질 발현 유도에 따른 세포 성장 정도의 차이가 크게 나타났다 (도 14). 즉, MIG12 또는 OIP5의 발현에 의해 세포성장은 감소하며, 티아민에 의해 MIG12 또는 OIP5 유전자 발현을 억제할 경우 세포성장 억제가 일어나지 않음을 확인하였다.

9-2. 96-well 플레이트에서 MIG12 또는 OIP5 과발현 효과의 정량적 측정

p173DES 벡터에 클론된 유전자들의 과발현시 나타나는 세포 성장 정도를 96well 플레이트 상에서 관찰하였다. EMM+AL+Thia 고체배지에서 접종하여 배양한 세포를 멸균한 증류수로 3번 세척해 티아민을 완전히 제거시킨 후, EMM+AL 액체 배지와 EMM+AL+Thia (15uM) 액체 배지 200ul 에 OD값이 0.05가 되도록 접종한 후 96well 플레이트에 분주하고 1/5 비율로 단계적으로 희석시켜 24시간 배양하였다. 대조군(콘트롤)은 유전자 클로닝 없이 발현 벡터만 도입된 균주를 사용하였다. 인간 유전자가 들어있지 않은 대조군에서는 티아민 첨가 유무에 관계없이 세포 성장에 거의 영향이 없었으나, MIG12 또는 OIP5 유전자가 도입된 군에서는 티아민이 첨가되지 않아 MIG12 또는 OIP5 유전자가 과발현 되었을 때에는 세포 성장이 크게 억제됨을 확인하였다 (도 15A). 또한, 96-well 플레이트에 자란 세포를 EMM+AL 고체 배지와 EMM+AL+Thia (15uM) 고체 배지에 각각 4배씩 희석 배양 하였을 때 과발현시키지 않은 EMM+AL+Thia (15uM) 고체 배지에서는 성장 정도에 차이 없이 모두 잘 자랐으나, MIG12 또는 OIP5 유전자의 과발현을 유도한 EMM+AL 고체 배지에서는 세포의 성장 억제가 나타남을 확인하였다 (도 15B).

9-1 내지 9-2의 결과로 부터, 본 발명에 따른 MIG12 및 OIP5유전자(표적물질)가 과발현되어 성장이 억제된 세포에 대하여, 약물(시험대상물질)처리를 통해 세포 성장이 정상으로 회복되는지 여부를 96-well plate 및 고체배지에 배양함으로써 성장 억제 효과를 비교적 정량적으로 쉽게 확인할 수 있어 MIG12 또는 OIP5를 표적으로 하는 항암제를 탐색할 수 있으므로 약물스크리닝 시스템으로 활용될 수 있다.

도 1은 인간 유전자가 삽입되어 있는 플라스미드(Entry clone)로부터 인간 유전자를 S. pombe 목적 벡터(destination vector)에 클로닝하는 모식도이다.

도 2는 인간 유전자 MIG12가 S. pombe에서 과발현 되었을 때 나타나는 표현형의 변화를 보여주는 것으로, 도 2A는 세포성장억제, 도 2B는 세포의 형태학적 변화, 도 2C는 세포 내 DNA 양의 변화를 나타낸다. 또한, 도 2D는 인간유전자 발현을 확인한 결과이다.

도 3은 인간 유전자 OIP5가 S. pombe에서 과발현 되었을 때 나타나는 표현형의 변화를 보여주는 것으로, 도 3A는 세포성장억제, 도 3B는 세포의 형태학적 변화, 도 3C는 세포 내 DNA 양의 변화를 나타낸다. 또한, 도 3D는 인간유전자 발현을 확인한 결과이다.

도 4는 RT-PCR을 사용하여 간암 및 위암 세포주에서의 MIG12 또는 OIP5 유전자의 mRNA 양을 측정한 결과를 나타낸다.

도 5는 대장암환자의 암조직과 정상조직에서 OIP5 유전자의 발현을 비교한 그림이다.

도 6은 대장암환자의 암조직에서 RT-PCR을 이용하여 OIP5의 mRNA발현정도를 비교한 그림이다.

도 7은 암 관련성 예측을 위한 실험으로 MIG12 또는 OIP5 유전자를 동물세포(NIH3T3)에 발현시킨 후 세포의 증식 속도의 변화를 분석(proliferation assay)한 결과를 보여주는 그래프이다.

도 8은 MIG12 또는 OIP5 유전자의 에너지 프로파일을 보여주는 그림이다.

도 9는 MIG12 또는 OIP5 유전자의 암 타겟 유전자의 가능성을 확인하기 위한 siRNA 실험 결과로서, 다양한 위암, 간암, 폐암 및 대장암 세포주에서의 세포 성장 저해 정도를 보여주는 그래프이다.

도 10은 MIG12 또는 OIP5 유전자의 암 타겟 유전자의 가능성을 확인하기 위한 siRNA 실험 결과로서 다양한 위암 및 간암 세포주에서의 세포 성장 저해를 나타내는 세포사진이다.

도 11은 siRNA 실험 후 해당 유전자의 발현억제에 의한 세포사멸 정도를 측정하기 위한 FACS 분석 결과를 나타낸다.

도 12는 siMIG12 또는 siOIP5를 이용한 RNAi 실험을 통해 세포사멸과 관련된 유전자들의 발현변화를 나타낸다.

도 13은 shRNA 디자인(A) 및 실험결과(B)를 나타낸다.

도 14는 MIG12 또는 OIP5 유전자를 모델세포 분열효모 S. pombe에 과발현 시킨 후 세포의 성장속도 저해현상 및 정도를 나타낸 그래프이다.

도 15는 96-well 플레이트를 사용하여 MIG12와 OIP5 유전자를 표적으로 하는 HTS 스크리닝시스텔 개발가능성을 조사한 결과를 나타낸 그림이다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Novel use of OIP5 gene <130> P07-074-KRI <150> KR1020060124438 <151> 2006-12-08 <160> 29 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2454 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> mRNA <222> (1)..(2454) <223> MIG12, Homo sapiens MID1 interacting protein 1 (gastrulation specific G12 homolog (zebrafish)) (MID1IP1), transcript variant 1, mRNA. <400> 1 ggctcactct gcaaccaagg cacgtgcatt ctggtcatcc cacgcgggga gcgcgcgcaa 60 ggcccgccca gcccccacat gccagcccca ccctccagtc ggtccggacg ccgacgcctt 120 tttgaccctc gctgtgcccg gccctcctca tctggcctgc ccagggcttg gtgctggcgg 180 ggtccagctg ctccaatccc tcctcctctg ctctgccctg ccctgccctg gcctgccccg 240 gcgccctccc tcagcccggg tatcaggcga gaggcggagc tggcccggcg cgccccgccc 300 ccgctgtaga aagggccggg cgagtgttac tcgcggtcat cccggcctgg gccttttatc 360 tcggtgctgc cgggggaggc gggaggagga gacaccaggg gtggccctga gcgccggcga 420 cacctttcct ggactataaa ttgagcacct gggatgggta gggggccaac gcagtcaccg 480 ccgtccgcag tcacagtcca gccactgacc gcagcagcgc ccttgcgtag cagccgcttg 540 cagcgagaac actgaattgc caacgagcag gagagtctca aggcgcaaga ggaggccagg 600 gctcgaccca cagagcaccc tcagccatcg cgagtttccg ggcgccaaag ccaggagaag 660 ccgcccatcc cgcagggccg gtctgccagc gagacgagag ttggcgaggg cggaggagtg 720 ccgggaatcc cgccacaccg gctatagcca ggcccccagc gcgggccttg gagagcgcgt 780 gaaggcgggc atccccttga cccggccgac catccccgtg cccctgcgtc cctgcgctcc 840 aacgtccgcg cggccaccat gatgcaaatc tgcgacacct acaaccagaa gcactcgctc 900 tttaacgcca tgaatcgctt cattggcgcc gtgaacaaca tggaccagac ggtgatggtg 960 cccagcttgc tgcgcgacgt gcccctggct gaccccgggt tagacaacga tgttggcgtg 1020 gaggtaggcg gcagtggcgg ctgcctggag gagcgcacgc ccccagtccc cgactcggga 1080 agcgccaatg gcagcttttt cgcgccctct cgggacatgt acagccacta cgtgcttctc 1140 aagtccatcc gcaacgacat cgagtggggg gtcctgcacc agccgcctcc accggctggg 1200 agcgaggagg gcagtgcctg gaagtccaag gacatcctgg tggacctggg ccacttggag 1260 ggtgcggacg ccggcgaaga agacctggaa cagcagttcc actaccacct gcgcgggctg 1320 cacactgtgc tctcgaaact cacgcgcaaa gccaacatcc tcactaacag atacaagcag 1380 gagatcggct tcggcaattg gggccactga ggcgtggcgc ccgtggctgc ccagcacctt 1440 cttcgaccca tctcaccctc tctcattcct caaagctttt tttttttttc ctggctgggg 1500 ggcgggaagg gcagactgca aactgggggg ctgcgtacgt gcaggaggcg cggtggggct 1560 gcgtggagga gggggccacg tgtgagagag aagaaaatgg tggccggaga tgggagggcc 1620 caaggaacct cctgggaggg ggcctgcatt ctatgttggt gggaatggga ctgggctgac 1680 gccctgcatt cagcctgtgc ctttcctggg gtttcttttc tgttcttttc ggaggagagg 1740 gcccgagaag gggccatacc agggcgcggc gctgggttgc cacacttggg aaagcagccc 1800 ggagctgggt gctggggaag gcggggcgcg tagcctcccg ccgccctgcg gttgggccgg 1860 tggaggccca ggcgttgcta ggattgcatc agttttcctg tttgcactat ttctttttgt 1920 aacattggcc ctgtgtgaag tatttcgaat ctcctccttg ctctgaaact tcagcgattc 1980 cattgtgata agcgcacaaa cagcactgtc tgtcggtaat cggtactact ttattaatga 2040 ttttctgtta cactgtatag tagtcctatg gcacccccac cccatccctt tcgtgccact 2100 cccgtcccca cccccacccc agtgtgtata agctggcatt tcgccagctt gtacgtagct 2160 tgccactcag tgaaaataat aacattatta tgagaaagtg gacttaaccg aaatggaacc 2220 aactgacatt ctatcgtgtt gtacatagaa tgatgaaggg ttccactgtt gttgtatgtc 2280 ttaaatttat ttaaaacttt ttttaatcca gatgtagact atattctaaa aaataaaaaa 2340 gcaaatgtgt caactaaatt ggacaagcgt ctggtcctca ttaatctgcc aatgaatggt 2400 ttcgtcatta aataaaaatc aatttaattg atttactagc aaaaaaaaaa aaaa 2454 <210> 2 <211> 1249 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> mRNA <222> (1)..(1249) <223> Homo sapiens Opa interacting protein 5 (OIP5), mRNA. <400> 2 gagctgtgct tggggcgggg cctggcgtgt attcgaaagg aaggcgccgg ctgcgggaag 60 atggcggctc agccgctgcg gcatcgctca cgttgtgcaa cgccgccccg gggggacttt 120 tgtggtggca ctgagagggc gattgaccaa gcttctttta cgacctccat ggagtgggat 180 acgcaggtgg tgaaggggtc ctcgccgctc ggccccgcag ggctgggggc tgaggagcca 240 gccgccggcc cgcagctgcc gtcttggctg cagcctgaga ggtgcgctgt gttccagtgc 300 gcacagtgtc acgcagtgct cgccgactcg gtgcacctcg cctgggacct gtcgcggtcc 360 ctcggggccg tggtcttctc cagagttaca aataacgtcg ttttggaagc gcccttccta 420 gttggcattg aaggttcact caaaggcagt acttacaacc ttttattctg tggttcttgt 480 gggattcccg ttggtttcca tctgtattct acccatgctg ccctggctgc cttgagaggt 540 cacttctgcc tttccagtga caaaatggtg tgctatctct taaaaacaaa agccatagta 600 aatgcatcag agatggatat tcaaaatgtt cctctatcag aaaagattgc agagctgaaa 660 gagaagatag tgctaacgca caatcgctta aaatcactaa tgaagattct gagtgaagtg 720 actcctgacc agtccaagcc agaaaactga tcctgtacca aagcttgagt gtcaggttca 780 ggctttattg ctgtcttcaa caacaggtgc tgcttagtca tttcttgaaa aagattggct 840 tcaagaatgg aggggaaatg cagtttctat ttacctttag gctgattttc caaattattt 900 gtgaagctgt ttttagaaga tgagagacta aggattcttc tcttttatag ctatttgcct 960 taagaactta ctttagattc ttattgaatt cataatactt atctctgaaa atgtctttga 1020 ctgtaaattt aggaattaag atgcagagtc ccatgtgtcc tctgatctaa agttgcatgg 1080 ttggtctgaa aatagagttg ggcttaatgt tgacttctat tactcctgca tggagcagtt 1140 gttatgaata ctaatacatc actttttaac ttctgtaaaa tacagatcat aatattctat 1200 aggtaatgtt taataaattg cctgaataat atacaaaaaa aaaaaaaaa 1249 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA for MIG12 (NM_021242:1331-1349) <220> <223> siRNA <400> 3 ucucgaaacu cacgcgcaat t 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA for MIG12(NM_021242: 1123-1141) <220> <223> siRNA <400> 4 agccacuacg ugcuucucat t 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA for OIP5 (NM_007280: 426-444) <220> <223> siRNA <400> 5 cauugaaggu ucacucaaat t 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA for OIP5 (NM_007280: 417-435) <220> <223> siRNA <400> 6 ccuaguuggc auugaaggut t 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA for RABGGTA (NM_182836: 1110-1128) <220> <223> siRNA <400> 7 acauacauuu cgcgucauut t 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA for RABGGTA (NM_182836:1509-1527) <220> <223> siRNA <400> 8 ggcucacaag gaucugacat t 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA for GFP <220> <223> siRNA <400> 9 guucagcgug uccggcgagt t 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminal primer for PCR of MIG12 <400> 10 atgatgcaaa tctgcgacac c 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminal primer for PCR of MIG12 <400> 11 tcagtggccc caattgccga a 21 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminal primer for PCR of OIP5 <400> 12 ggctgggggc tgaggagcca 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminal primer for PCR of OIP5 <400> 13 cacttcactc agaatcttca 20 <210> 14 <211> 106 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> mRNA <222> (1)..(106) <223> partial sequence of MIG12 (NM_021242: 845-950) <400> 14 tccgcgcggc caccatgatg caaatctgcg acacctacaa ccagaagcac tcgctcttta 60 acgccatgaa tcgcttcatt ggcgccgtga acaacatgga ccagac 106 <210> 15 <211> 61 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> mRNA <222> (1)..(61) <223> partial sequence of MIG12 (NM-021242: 970-1030) <400> 15 ctgcgcgacg tgcccctggc tgaccccggg ttagacaacg atgttggcgt ggaggtaggc 60 g 61 <210> 16 <211> 81 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> mRNA <222> (1)..(81) <223> partial sequence of MIG12(NM_021242: 1080-1160) <400> 16 aagcgccaat ggcagctttt tcgcgccctc tcgggacatg tacagccact acgtgcttct 60 caagtccatc cgcaacgaca t 81 <210> 17 <211> 71 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> mRNA <222> (1)..(71) <223> partial sequence of MIG12(NM_021242: 1220-1290) <400> 17 ggaagtccaa ggacatcctg gtggacctgg gccacttgga gggtgcggac gccggcgaag 60 aagacctgga a 71 <210> 18 <211> 81 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> mRNA <222> (1)..(81) <223> partial sequence of MIG12(NM_021242: 1320-1400) <400> 18 gcacactgtg ctctcgaaac tcacgcgcaa agccaacatc ctcactaaca gatacaagca 60 ggagatcggc ttcggcaatt g 81 <210> 19 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> mRNA <222> (1)..(60) <223> partial sequence of OIP5(NM_007280:1-60) <400> 19 gagctgtgct tggggcgggg cctggcgtgt attcgaaagg aaggcgccgg ctgcgggaag 60 60 <210> 20 <211> 61 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> mRNA <222> (1)..(61) <223> partial sequence of OIP5(NM_007280: 120-180) <400> 20 ttgtggtggc actgagaggg cgattgacca agcttctttt acgacctcca tggagtggga 60 t 61 <210> 21 <211> 81 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> mRNA <222> (1)..(81) <223> partial sequence of OIP5(NM_007280: 380-460) <400> 21 ccagagttac aaataacgtc gttttggaag cgcccttcct agttggcatt gaaggttcac 60 tcaaaggcag tacttacaac c 81 <210> 22 <211> 63 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> mRNA <222> (1)..(63) <223> partial sequence of OIP5(NM_007280:518-580) <400> 22 ctgccctggc tgccttgaga ggtcacttct gcctttccag tgacaaaatg gtgtgctatc 60 tct 63 <210> 23 <211> 61 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> mRNA <222> (1)..(61) <223> partial sequence of OIP5(NM_007280:720-780) <400> 23 gactcctgac cagtccaagc cagaaaactg atcctgtacc aaagcttgag tgtcaggttc 60 a 61 <210> 24 <211> 41 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> mRNA <222> (1)..(41) <223> partial sequence of OIP5(NM_007280: 850-890) <400> 24 gaggggaaat gcagtttcta tttaccttta ggctgatttt c 41 <210> 25 <211> 61 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> mRNA <222> (1)..(61) <223> partial sequence of OIP5(NM_007280: 920-980) <400> 25 atgagagact aaggattctt ctcttttata gctatttgcc ttaagaactt actttagatt 60 c 61 <210> 26 <211> 61 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> mRNA <222> (1)..(61) <223> partial sequence of OIP5(NM_007280: 1040-1100) <400> 26 gatgcagagt cccatgtgtc ctctgatcta aagttgcatg gttggtctga aaatagagtt 60 g 61 <210> 27 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> top strand for shMIG12 <400> 27 gatccgagcc actacgtgct tctcattcaa gagatgagaa gcacgtagtg gctctttttt 60 acgcgtg 67 <210> 28 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> top strand for shOIP5 <400> 28 gatccgcatt gaaggttcac tcaaattcaa gagatttgag tgaaccttca atgctttttt 60 acgcgtg 67 <210> 29 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> top strand for shGFP <400> 29 gatccggttc agcgtgtccg gcgagttcaa gagactcgcc ggacacgctg aacctttttt 60 acgcgtg 67

Claims

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서열번호 5 또는 6의 염기서열을 포함하는 OIP5(오피에이 상호작용 단백질 5) 유전자의 siRNA.
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제6항에 있어서, 상기 siRNA는 화학적으로 변형한 형태인 siRNA.
서열번호 5의 RNA 염기서열과 이와 3~10 염기의 루프(loop)영역으로 연결된 서열번호 5에 역상보적인 RNA 염기서열을 포함하는 OIP5(오피에이 상호작용 단백질 5) 유전자의 shRNA.
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제10항에 있어서, 상기 shRNA를 발현시키기 위한 발현벡터제조용 상층서열(top strand)은 서열번호 28인 shRNA.
OIP5(오피에이 상호작용 단백질 5) 유전자에 대한 억제제로 OIP5(오피에이 상호작용 단백질 5) 유전자의 siRNA 또는 shRNA를 포함하는 암 치료용 조성물로, 상기 siRNA는 서열번호 5 또는 6의 염기서열을 포함하는 siRNA이고, 상기 shRNA는 서열번호 5의 RNA 염기서열과 이와 3~10 염기의 루프(loop)영역으로 연결된 서열번호 5에 역상보적인 RNA 염기서열을 포함하는 shRNA이며, 상기 암은 위암, 간암, 폐암, 또는 대장암 중에서 선택된 하나 이상인 조성물.
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제14항에 있어서, 상기 siRNA는 화학적으로 변형한 형태인 암 치료용 조성물.
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제14항에 있어서, 상기 shRNA를 발현시키기 위한 발현벡터제조용 상층서열(top strand)은 서열번호 28인 암 치료용 조성물.
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