KR20200122183A

KR20200122183A - 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물

Info

Publication number: KR20200122183A
Application number: KR1020190045124A
Authority: KR
Inventors: 이기호; 박은란; 김미연; 송유선; 주현유; 이은주; 함용호
Original assignee: 한국원자력의학원
Priority date: 2019-04-17
Filing date: 2019-04-17
Publication date: 2020-10-27
Also published as: KR102328654B1

Abstract

본 발명은 암의 예방 또는 치료에 이용될 수 있는 신규 표적으로서 YME1L1 유전자 및 YME1L1 단백질의 신규 용도에 관한 것이다.

Description

암의 예방 또는 치료용 약학 조성물{A composition for preventing or treating cancer}

본 발명은 암을 예방하거나 치료하기 위한 약학 조성물에 관한 것이다.

현대 사회에 이르러 암의 발병률은 점차 높아지고 있으며, 암을 예방하거나 치료하기 위한 다양한 방향의 접근이 이루어져 사망률을 낮추고자 하는 시도가 계속되고 있으나, 여전히 한국인의 사망 원인 중에서 암으로 인한 사망자 수는 수십년 동안 1위를 차지할 정도로 높은 통계를 보이고 있다. 암을 치료하기 위한 방법으로는 외과수술, 방사선 요법, 화학적 요법, 생물학적 요법 등이 있는데, 특히 암을 예방하거나 치료하는 데 탁월한 효과를 가지는 약제를 개발하기 위한 국내외 제약 회사의 투자와 연구가 계속되고 있어, 암 치료제의 시장 규모는 전세계적으로 약 10만 달러에 이르며 높은 성장률을 기록하여 2025년에는 17만 달러를 넘어설 것으로 전망되고 있다.

암은 세포의 분열, 생장, 세포사멸 등과 관련된 조절이 정상적으로 이루어지지 않게 됨에 따라 무한히 증식하며 종양을 형성하는 것이 특징 중 하나인 질환으로, 암 세포에서 발현되는 다양한 종류의 유전자나 단백질에 의해 복합적인 영향을 받는다. 따라서 계속적인 암 세포의 분열을 촉진하거나, 암 세포의 사멸을 저해하는 역할을 하는 유전자의 발현 또는 단백질의 활성을 억제하는 경우 암의 발생이나 진행을 저해함으로써 암을 예방하거나 치료하기 위한 방안으로 이용될 수 있다.

한편, YME1L1은 미토콘드리아의 내막에 존재하는 ATP 의존적 단백질 분해효소로, 지질의 전이와 관련된 단백질을 분해하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 또한, 핵의 미토콘드리아 DNA(mtDNA) 전이를 억제하는 활성이 있으며 결직장 선암종 세포에서 YME1L1의 유전자가 높은 빈도로 돌연변이되어 핵 게놈에서의 mtDNA 전달을 증가시킨다는 점을 확인한 보고는 있었지만, 암 세포에서 YME1L1의 발현량이 증가된다거나, 상기 YME1L1의 발현을 억제함으로써 암 세포의 사멸을 유도할 수 있다는 점에 대해서는 연구되거나 보고된 바가 없다.

일반적으로 정상적인 조절을 받는 정상 세포가 암 세포로 전환되는 과정에서, 유전체의 불안정성(genomic instability)이 증가하게 되고 대부분의 세포의 경우 전환 과정에서 사멸되어 암 세포로 발전하지 못하게 된다. 그러나, 일부의 세포에서는 상기와 같은 유전체의 불안정성을 감소시키는 활성을 갖는 단백질의 발현을 증가시킴으로써 세포의 사멸을 방지하여 생존하게 되고, 이로 인하여 암 세포가 형성될 수 있다. 그러므로, 유전체 불안정성을 감소시킬 수 있는 단백질의 활성을 억제하거나 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 억제시키는 경우, 암 세포의 사멸을 유도함으로써 생존율을 낮춰 암을 예방하거나 치료하는 효능을 기대할 수 있다. 따라서 암 세포에서 특이적으로 다량 발현되며 암의 발생과 진행을 돕는 역할을 하는 신규한 유전자 또는 단백질을 발견하고, 이를 타겟으로 하는 새로운 암의 예방 또는 치료 방안을 연구하고 개발해야 할 필요성이 있다.

본 발명은 간암, 섬유육종, 자궁경부암 등과 같은 암의 세포 성장을 저해하거나 사멸을 유도함으로써 암을 예방하거나 치료하는 용도로 이용할 수 있는 제제를 포함하는 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기와 같은 암의 예방 또는 치료 용도로 이용할 수 있는 상기 제제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기와 같은 암의 예방 또는 치료 용도로 이용할 수 있는 상기 폴리뉴클레오티드가 형질도입된 세포를 포함하는 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 피검체로부터 분리된 시료를 분석하여, 암의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 피검 물질을 분석하여, 암의 치료제로 이용될 수 있는 후보 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 YME1L1 유전자의 발현 억제제 또는 YME1L1 단백질의 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 측면은 YME1L1 유전자의 발현 억제제 또는 YME1L1 단백질의 활성 억제제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 측면은 YME1L1 유전자의 발현 억제제 또는 YME1L1 단백질의 활성 억제제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 형질도입된 세포를 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 측면은 피검체로부터 분리된 시료에서 YME1L1 유전자의 발현량 또는 YME1L1 단백질의 활성 수준을 측정하는 단계;를 포함하는, 암의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 측면은 YME1L1 단백질 발현 세포주에 피검 물질을 처리하는 단계;를 포함하는, 암의 치료제 후보 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에서 제공하는 약학 조성물은 YME1L1 유전자의 발현을 억제하거나 YME1L1 단백질의 활성을 억제함으로써, 간암, 신경교종, 자궁경부암, 폐암, 대장암, 유방암, 신경교종 등 다양한 조직으로부터 유래하는 여러 종류의 암 세포에서 DNA에 손상을 유발하는 효과가 있다. 따라서 본 발명의 약학 조성물은 암 세포의 성장을 억제하거나 암 세포의 사멸을 유도하여, 암의 발생 또는 진행을 저해하는 효과가 있으므로, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.

또한, 다양한 암 세포주에서 높게 나타나는 YME1L1 유전자 발현량이나 YME1L1 단백질 활성 수준을 측정함으로써, 암의 발생 위험을 진단하기 위한 정보를 제공하는 데 사용할 수 있으며, 새로운 치료제의 발굴이나 개발에 유용하게 사용할 수 있다.

다만, 본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.

도 1은 정상 세포주로 사용된 BM-MSC, Adipo-MSC, Retina, WI38, BJ, 간암 세포주로 사용된 Huh7, HepG, Hep3B, SNU387, SNU398, SNU449, 뇌 종양 관련 세포주로 사용된 LN428, U87, 폐암 세포주로 사용된 Calu1, A549, H460, H1299, 골육종 세포주로 사용된 SAOS2, 대장암 세포주로 사용된 HT29, HCT116, 유방암 세포주로 사용된 MDAMB231, MCF7, 섬유육종 세포주로 사용된 HT1080를 대상으로, Real-Time RT-PCR을 통해 상대적인 YME1L1 유전자의 mRNA 양을 측정하여 비교한 그래프이다.
도 2는 Huh7 간암 세포주(A), HT1080 섬유육종 세포주(B) 및 HeLa 자궁경부암 세포주(C)를 대상으로, YME1L1의 발현을 억제하는 3가지 종류의 siRNA인 si-YME1L1#1, si-YME1L1#2, si-YME1L1#3와 대조군-siRNA(si-Con)를 각각 처리하고, 세포를 크리스탈 바이올렛(crystal violet)으로 염색하여 콜로니의 형성을 확인하고(왼쪽 그림) 형성된 콜로니의 수를 카운팅하여 비교한 그래프(가운데 그림)와, 상대적인 YME1L1의 mRNA 양을 측정하여 비교한 그래프(오른쪽 그림)이다.
도 3은 Huh7 간암 세포주(A) 및 HeLa 자궁경부암 세포주(B)를 대상으로, YME1L1의 발현을 억제하는 추가적인 4가지 종류의 siRNA인 si-YME1L1#4, si-YME1L1#5, si-YME1L1#6, si-YME1L1#7과 대조군-siRNA(si-Con)를 각각 처리하고, 세포를 크리스탈 바이올렛(crystal violet)으로 염색하여 콜로니의 형성을 확인하고 형성된 콜로니의 수를 카운팅하여 비교한 그래프(왼쪽 그림)와, 상대적인 YME1L1의 mRNA 양을 측정하여 비교한 그래프(오른쪽 그림)이다.
도 4는 HT1080 섬유육종 세포주, SNU475 간암 세포주, MDAMB231 유방암 세포주, LN428 신경교종 세포주, SW480 대장암 세포주 및 H460 폐암 세포주를 대상으로, YME1L1의 발현을 억제하는 2가지 종류의 siRNA인 si-YME1L1#3, si-YME1L1#7과 대조군-siRNA(si-Con)를 각각 처리하고, 세포를 크리스탈 바이올렛(crystal violet)으로 염색하여 콜로니의 형성을 확인하고(왼쪽 그림) 형성된 콜로니의 수를 카운팅하여 비교한 그래프(오른쪽 그림)와, YME1L1의 단백질 양을 확인한 웨스턴 블랏팅 결과(가운데 그림)이다.
도 5는 HeLa 자궁경부암 세포주를 대상으로, YME1L1의 발현을 억제하는 2가지 종류의 siRNA인 si-YME1L1#3, si-YME1L1#7과 대조군-siRNA(si-Con)를 각각 처리하고, 세포사멸(apoptosis) 정도를 측정할 수 있는 Annexin V-FITC로 염색하여(A) 유세포분석기로 염색된 세포의 비율을 확인한 FACS 히스토그램(B)이다.
도 6은 HeLa 세포주를 대상으로, YME1L1의 발현을 억제하는 siRNA인 si-YME1L1#1, si-YME1L1#3와 대조군-siRNA(si-Control)를 각각 처리하고, 항-γ-H2AX 항체를 이용하여 DNA 손상 마커인 γ-H2AX를 염색하여 현광 현미경으로 관찰한 것이다.

먼저, 본 발명에서 이용된 용어를 정의한다.

본 발명에서 "암"은 세포의 생장 또는 사멸의 조절에 이상이 발생한 질병으로서, 정상적인 세포의 생장 또는 사멸의 균형이 깨지는 경우, 세포가 과다 증식하게 됨으로써 생기는 질병을 의미한다. 이러한 비정상적 과다 증식 세포들은, 경우에 따라 주위 조직 및 장기에 침입하여 종괴를 형성하고, 체내의 정상적인 구조를 파괴하거나 변형시킨다. 종양(tumor)은 신체 조직의 자율적인 과잉 성장에 의해 비정상적으로 자란 세포 덩어리를 의미하며, 양성 종양(benign tumor)과 악성 종양(malignant tumor)으로 구분할 수 있다. 악성 종양은 양성 종양에 비해 성장속도가 매우 빠르고, 주변 조직에 침윤하면서 전이(metastasis)가 일어나 생명을 위협하며, 상기와 같은 악성 종양을 통상적으로 암(cancer)이라 한다.

본 발명에서 "예방"은 질환 또는 장애에 걸릴 위험을 감소시키는 것을 의미하며, 질환에 노출되거나 질환에 걸리기는 쉽지만 아직 질환에 걸리거나 질환의 증후를 나타내지 않는 대상에서 질병의 1종 이상의 임상적 증후가 진행되지 않도록 하여 질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 "치료"는 질환 또는 장애를 경감시키는 것을 의미하며, 질환 또는 이의 1종 이상의 임상적 증후의 진행을 저지 또는 감소시켜 질환의 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 “진단”은 하나 이상의 지표, 이를 테면 질환, 장애, 또는 상태의 징후 또는 증상의 존재에 기초하여 질환, 장애, 또는 상태를 갖는 대상을 확인하기 위한 관찰, 테스트 또는 환경들에 기초한 대상의 상태의 임상적 또는 여타 평가를 의미한다.

본 발명에서 “시료”는 대상으로부터 분리된 유사한 유동체들, 세포들, 또는 조직들의 수집물을 의미한다. “시료”라는 용어는 신체의 유동체(예컨대, 소변, 혈청, 혈액 유동체들, 림프, 담낭 유동체, 복수(ascetic) 유동체, 안구 유동체들, 그리고 기관지 세척 및/또는 복막 헹굼에 의하여 수집된 유동체들), 복수들(ascites), 조직 시료들 또는 대상으로부터의 세포를 포함한다. 또한, 눈물 방울들, 혈청, 뇌척수 유동체, 분변들, 객담, 그리고 세포 추출물들을 포함한다.

본 발명에서 “피검 물질”은 세포 내에서 유의하게 일어나는 유전자 발현량 또는 단백질 활성 수준의 변화를 간접적 또는 직접적으로 유도할 수 있을 것으로 예상되는 모든 물질을 의미한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

1. 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물

본 발명의 일 측면은 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 YME1L1 유전자의 발현 억제제 또는 YME1L1 단백질의 활성 억제제를 유효성분으로 포함한다.

상기 YME1L1 유전자는 ATP-의존적 금속단백질분해효소(ATP-dependent metalloprotease)인 YME1L1 단백질을 암호화하는 유전자이다. 상기 YME1L1 유전자로부터 발현된 YME1L1 단백질은 AAA 패밀리, ATP/GTP 결합 모티프 및 HEXXH 모티프를 포함하는 것일 수 있으며, 상기 YME1L1 단백질은 미토콘드리아의 내막에서 지질 전달 단백질 등의 단백질을 분해하는 활성이 있고 미토콘드리아의 형태 유지, 세포사멸 저항, 세포 분열 등에 관여할 수 있다. 상기 YME1L1 유전자의 염기서열 및 상기 YME1L1 단백질의 아미노산 서열은 NCBI의 GenBank 등의 공개된 데이터베이스나 문헌에서 얻을 수 있다.

상기 YME1L1 유전자의 발현 억제제는, YME1L1 유전자로부터 전사되는 mRNA의 합성 및 mRNA로부터 번역되는 YME1L1 단백질의 합성에 이르기까지의 유전적 흐름 과정을 억제하는 역할을 할 수 있는 모든 제제를 포함한다. 상기 YME1L1 유전자의 발현 억제제는 YME1L1 유전자의 전사를 억제하거나, 전사된 mRNA의 분해를 촉진하거나, mRNA로부터 단백질이 합성되는 과정을 억제하거나, 합성된 단백질의 분해를 촉진하는 제제일 수 있다. 상기 YME1L1 유전자의 전사를 억제는 DNA 상의 프로모터나 조절부위에 RNA 중합효소, 전사조절인자 등이 결합하는 것을 방해하는 것을 포함하고, 상기 단백질이 합성되는 과정을 억제하는 것은 mRNA에 리보솜이 결합하는 것을 방해하는 것을 포함한다. 상기 단백질의 분해를 촉진하는 제제는 YME1L1 단백질의 유비퀴틴화를 유도하는 것을 포함한다.

상기 YME1L1 유전자의 발현 억제제는 YME1L1 유전자의 DNA 또는 mRNA에 상보적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드는 YME1L1 유전자의 DNA 또는 mRNA의 일부 또는 전부 서열에 상보적으로 결합함으로써 유전자의 발현을 억제하는 어떠한 것이든 가능하다.

상기 올리고뉴클레오티드는 YME1L1 유전자의 DNA 또는 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA, siRNA), 마이크로 RNA(micro RNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA) 또는 앱타머일 수도 있고, DNA의 프로모터에 결합하여 전사를 억제하거나, 전사된 mRNA를 분해하거나, 또는 mRNA에 리보솜이 결합하는 것을 방해하는 등 통상의 기술자에게 알려진 유전자의 발현을 억제하는 어떠한 제제이든 가능하다.

상기 안티센스 뉴클레오티드는 왓슨-크릭 염기쌍에 정의된 바에 따라, YME1L1 유전자의 DNA, 미성숙-mRNA 또는 성숙된 mRNA에 대해 상보적 염기서열을 가지고 있어, 상기 서열들에 상보적으로 결합(혼성화)하여 DNA로부터 단백질에 이르는 유전정보의 흐름을 방해하는 뉴클레오티드일 수 있다.

상기 작은 간섭 RNA는 상기 YME1L1 유전자의 mRNA 중 일부 연속된 뉴클레오티드 표적 서열과 상동인 독립적인 센스 RNA, 그리고 센스 RNA에 상보적인 안티센스 RNA가 이중가닥 RNA 분자를 형성하는 것일 수 있다. 상기 이중가닥 부위는 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수도 있다. 전체 길이는 10 내지 80 염기, 예컨대 15 내지 60 염기 또는 20 내지 40 염기일 수 있다. 상기 센스 RNA 및/또는 안티센스 RNA 가닥은 이의 당 부분, 염기 부분 또는 인터뉴클레오티드 구조 내에 최소한 1개의 화학적 변형을 포함하는 것이 가능하다. 이러한 변형은 생체 내에서 뉴클레아제에 의해 작은 간섭 RNA의 파괴를 저해하도록 할 수 있다. 또한, 상기 작은 간섭 RNA는 '분리된 것'이며, 이는 자연 상태에 있지 않은 것을 의미하지만 인간의 개입과 관련된 모든 수단에 의해 얻어질 수 있는 것을 의미하고, 특히 화학적 합성, PCR에 의한 요구되는 뉴클레오티드 서열의 증폭 또는 재조합 합성에 의해 이미 존재하는 작은 간섭 RNA를 정제함으로써 얻어질 수 있다.

상기 마이크로 RNA는 17 내지 27 염기 길이의 단일 가닥 RNA 분자로, 유전자를 암호화하지 않는 RNA이며, 특정한 mRNA에 상보적으로 작용/결합하여 mRNA로부터 단백질 번역을 억제시키거나 또는 mRNA를 분해하여, 성장, 분화, 증식 및 사멸과 같은 생체 내의 여러 조절과정에서 중요한 역할을 한다. 마이크로 RNA는 RNAse III 효소인 Dicer에 의해 프리-miRNA라고 불리는 긴 (약 70-80 염기) 헤어핀 유사 전구체로부터 가공되어 만들어진다. 마이크로 RNA가 리보뉴클레오단백질 복합체와 함께 형성된 구조체를 miRNP라고 명명하며, 상기 마이크로 RNA는 표적 부위를 안티센스 상보성에 의해 인식함으로써 표적 유전자의 하향적인 발현 조절을 매개한다. 마이크로 RNA와 mRNA 상 표적 부위 사이의 상보성이 높을 경우, 예를 들면 100% 또는 그에 가까운 경우, 표적 mRNA가 절단되지만, 마이크로 RNA와 표적 부위의 상보성이 낮으면 표적 유전자의 번역(단백질로의 발현)을 억제할 수 있다. 현재까지 수천 종의 마이크로 RNA가 밝혀졌으며, 이와 관련된 정보는 University of Manchester에서 운영 관리하는 miRBase Sequence Database를 통해 확인할 수 있다.

상기 짧은 헤어핀 RNA는 상기 YME1L1 유전자 mRNA 중 일부 연속된 뉴클레오티드 표적 서열과 상동인 독립적인 센스 RNA, 그리고 센스 RNA에 상보적인 안티센스 RNA가 루프에 의해 연결된 스템-루프 구조를 이루는 헤어핀 구조의 단일 RNA 가닥일 수 있다. 상기 스템 부위는 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수도 있다. 전체 길이는 10 내지 80 염기, 예컨대 15 내지 60 염기 또는 20 내지 40 염기일 수 있다. 또한, 상기 루프 영역은 서열에 특별한 의미가 없으며, 단지 센스 RNA 서열과 안티센스 RNA 서열을 적당한 간격으로 연결하기 위하여 3 내지 10 염기의 길이를 가지고 있으면 족하다.

상기 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA, siRNA), 마이크로 RNA(micro RNA) 또는 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA)는 LNP(lipid nanoparticle)에 둘러싸인 형태로 포함될 수 있으며, 올리고뉴클레오티드 형태의 제제를 전달하기 위해 사용되는 어떠한 형태로든 포함될 수 있다.

상기 YME1L1 유전자의 발현 억제제는 YME1L1 단백질에 결합하거나 또는 YME1L1의 결합단백질에 결합하는, 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머 또는 항체일 수도 있고, YME1L1 단백질 또는 이의 결합단백질에 결합함으로써 상기 YME1L1 단백질과 다른 단백질 사이의 상호작용을 방해하여 피드백 메커니즘으로 YME1L1 유전자의 발현을 억제하는 등 통상의 기술자에게 알려진 유전자의 발현을 억제하는 어떠한 제제이든 가능하다.

상기 YME1L1 단백질의 활성 억제제는 YME1L1 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머 및 항체일 수 있고, YME1L1 단백질이 기질에 결합하지 못하게 하거나, 조효소에 결합하지 못하게 하거나, YME1L1 단백질의 분해를 유도하는 등 통상의 기술자에게 알려진 단백질의 활성을 억제하는 어떠한 제제이든 가능하다.

상기 YME1L1 단백질에 결합하는 펩티드 미메틱스(peptide mimetics)는 YME1L1 단백질이 기질과 결합하거나 반응을 촉매하는 도메인 부위를 억제하는 펩티드 또는 비펩티드일 수 있다.

상기 YME1L1 단백질에 결합하는 앱타머(aptamer)는 상기 단백질을 표적으로 하여 특이적인 결합을 형성할 수 있는 특징을 가지며 안정적인 3차 입체구조를 이루고 있는 단일가닥 핵산 분자를 의미하며, DNA, RNA 또는 변형핵산일 수 있다. SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment) 기술 등을 이용하여 상기 단백질에 높은 특이성 및 친화성을 가지는 앱타머를 합성할 수 있다.

상기 YME1L1 단백질에 결합하는 항체는 면역학적으로 상기 단백질의 에피토프(epitope)와 특이적 결합하여 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 의미하며, 동물에 YME1L1 단백질의 주입을 통해 제조된 것 또는 시판되어 구입하는 것을 모두 사용할 수 있다. 또한, 상기 항체는 연속 세포주의 배양을 통해 항체 분자를 생성할 수 있는 어떠한 기술을 사용하여 제조될 수 있으며, 하이브리도마 기술을 사용하여 제조되는 것일 수 있다. 상기 항체는 단일클론항체, 다클론항체, 전체 길이의 사슬 구조를 가진 항체, 적어도 항원 결합 기능을 갖는 기능적인 단편의 항체 및 재조합 항체를 모두 포함할 수 있고, 세척이나 복합체의 분리 등 이후의 단계를 용이하게 하기 위하여 고형 기질(solid substrate)에 결합되어 사용될 수 있다. 상기 고형 기질은 합성수지, 니트로셀룰로오스, 유리기판, 금속기판, 유리섬유, 미세구체 또는 미세비드일 수 있으며, 상기 합성수지는 폴리에스터, 폴리염화비닐, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, PVDF 또는 나일론일 수 있다.

상기 YME1L1 유전자의 발현 억제제 또는 YME1L1 단백질의 활성 억제제는 암 세포에서 DNA의 손상을 유도하여 암 세포의 성장을 억제하고 세포사멸을 촉진하는 효과가 있으므로, 상기 YME1L1 유전자의 발현 억제제 또는 YME1L1 단백질의 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 조성물은 암을 예방하거나 치료하는 용도로 이용할 수 있다.

상기 암은 간암, 섬유육종, 자궁경부암, 폐암, 골육종, 대장암, 유방암, 신경교종, 뇌종양, 신장암, 위암, 전립선암, 자궁암, 결장암, 방광암, 췌장암, 척수종양, 두경부암, 흉선종, 중피종, 식도암, 취암, 담도암, 고환암, 생식세포종, 난소암, 자궁내막암, 림프종, 급성 백혈병, 만성 백혈병, 다발성 골수종, 육종, 악성 흑색종 또는 피부암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 세포의 생장 또는 사멸이 정상적으로 조절되지 않아 종양을 형성하는 질환이면 어느 종류의 암이든 포함될 수 있다.

본 발명의 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물은, 상기 YME1L1 유전자의 발현 억제제 또는 YME1L1 단백질의 활성 억제제 그 자체를 그대로 포함할 수 있으며, 상기 YME1L1 유전자의 발현 억제제 또는 YME1L1 단백질의 활성 억제제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수도 있다.

상기 YME1L1 유전자의 발현 억제제 또는 YME1L1 단백질의 활성 억제제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 벡터에 삽입된 형태인 것일 수 있다.

상기 벡터는 선형 DNA, 플라스미드 벡터, 재조합 비바이러스성 발현벡터 또는 재조합 바이러스성 발현벡터일 수 있다.

상기 YME1L1 유전자의 발현 억제제 또는 YME1L1 단백질의 활성 억제제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 벡터에 삽입된 형태로 본 발명의 상기 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물 내에 포함되는 경우, 상기 벡터는 YME1L1 유전자의 발현 억제제 또는 YME1L1 단백질의 활성 억제제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 이의 전사 또는 해독을 위한 조절 서열을 더 포함할 수 있다. 상기 조절 서열 중 특히 중요한 조절 서열은 프로모터, 인핸서와 같이 전사 개시를 조절하는 것이다. 또한, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 코작(Kozak), 인핸서, 막 표적화 및 분비를 위한 신호서열, IRES(Internal Ribosome Entry Site) 등으로 이루어진 조절 서열을 포함할 수 있다. 이러한 조절 서열과 YME1L1 유전자의 발현 억제제 또는 YME1L1 단백질의 활성 억제제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 작동가능하게 연결될 수 있다. 상기'작동 가능하게 연결된'이란 프로모터 서열의 다운스트림에 유전자가 연결될 때, 해당 유전자의 발현이 가능한 형태로 연결되는 것을 나타낸다.

재조합 바이러스의 특정 목적을 위해 도입되는 프로모터에는, 지속적인 유전자 발현을 유도하는 바이러스 유래의 CMV 프로모터, RSV 프로모터, SV 프로모터 등이 있으며, 특정 환경에서만 유전자의 발현을 유도할 수 있는 프로모터, 호르몬에 의해 작동이 유도되는 ERE를 포함하고 있는 프로모터, 곤충 호르몬인 엑다이손에 의해 작동되는 프로모터, 항생제 테트라사이클린에 의해 유도되는 프로모터 등이 포함된다. 이들 프로모터는 목적 유전 물질의 목적에 적합하게 바이러스 게놈에 삽입하여 사용할 수 있다.

상기 재조합 바이러스성 발현벡터는 재조합 베큘로 바이러스 벡터, 재조합 배니시아 바이러스 벡터, 재조합 레트로바이러스 벡터, 재조합 아데노 바이러스 벡터, 재조합 아데노 관련 바이러스 벡터, 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터 또는 재조합 렌티바이러스(lentivirus) 벡터일 수 있다.

본 발명의 다른 측면은 YME1L1 유전자의 발현 억제제 또는 YME1L1 단백질의 활성 억제제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 형질도입된 세포를 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

벡터는 본 기술 분야의 통상의 기술자에게 널리 알려진 방법으로 숙주 세포에 도입될 수 있다. 도입 방법으로는 일렉트로포레이션(electroporation) 및 리포펙션(lipofection) 등이 있으나 이에 한정된 것이 아니며, 본 기술 분야에 공지된 방법을 선택할 수 있다.

상기 형질도입은 안정적이거나 일시적일 수 있다. 일시적 형질도입의 한 가지 예는 벡터가 숙주 세포 게놈 내에 통합되지 않는, 특정 세포 내에서의 벡터 발현을 포함한다. 또 다른 한편, 안정적 형질도입은 벡터가 숙주 세포 게놈 내에 통합되는, 특정 세포 내에서의 벡터 발현을 포함할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 쥐, 마우스, 가축, 사람 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 상기 '투여'는 약학 조성물 또는 약제를 대상의 시스템 내로 또는 대상 내 또는 위의 특정한 영역에 전달하는 방법을 포함한다. 투여는 예를 들면, 장내로, 비경구적으로, 정맥 내로, 근육 내로, 피하로, 피내로, 비강 내로, 경구로, 경피적으로, 자궁내 경막, 뇌혈관내(intracerebroventricular) 또는 점막으로 투여될 수 있다. 또한, 국소적으로 또는 전신적으로 투여될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상과 함께 투여될 수 있다. 투여를 위해서는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 추가로 약학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함할 수 있다. 상기 '약학적으로 허용 가능한'의 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다. 상기 '담체'는 세포 또는 조직 내로의 화합물의 부가를 용이하게 하는 화합물로 정의된다.

본 발명의 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

또한, 상기 약학 조성물이 포함하는 상기 유효성분은 콜로이드 현탁액, 분말, 식염수, 지질, 리포좀, 미소구체(microspheres), 또는 나노 구형입자와 같은 약학적으로 허용될 수 있는 담체에 운반될 수 있다. 이들은 운반 수단과 복합체를 형성하거나 관련될 수 있고, 지질, 리포좀, 미세입자, 금, 나노입자, 폴리머, 축합 반응제, 다당류, 폴리아미노산, 덴드리머, 사포닌, 흡착 증진 물질 또는 지방산과 같은 당업계에 공지된 운반 시스템을 사용하여 생체 내 운반될 수 있다.

이 외에도, 약학적으로 허용되는 담체는 제제시 통상적으로 이용되는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아, 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세 결정성 셀룰로스, 폴리비닐 피로리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 실제 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 생약 추출물 또는 생약 발효물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 상기 산제는 본 발명의 유효 성분과 유당, 전분, 미결정셀룰로오스 등 약제학적으로 허용가능한 적당한 담체를 단순 혼합함으로써 제조될 수 있다. 과립제는 본 발명의 상기 유효성분, 약학적으로 허용 가능한 적당한 담체 및 폴리비닐피롤리돈, 히드록시프로필셀룰로오스 등의 약학적으로 허용 가능한 적당한 결합제를 혼합한 후, 물, 에탄올, 이소프로판올 등의 용매를 이용한 습식과립법 또는 압축력을 이용한 건식과립법을 이용하여 제조될 수 있다. 또한 정제는 상기 과립제를 마그네슘스테아레이트 등의 약학적으로 허용 가능한 적당한 활택제와 혼합한 후, 타정기를 이용하여 타정함으로써 제조될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 상기 유효 성분은 치료해야 할 질환 및 개체의 상태에 따라 경구제, 주사제(예를 들어, 근육주사, 복강주사, 정맥주사, 주입(infusion), 피하주사, 임플란트), 흡입제, 비강투여제, 질제, 직장투여제, 설하제, 트랜스더말제, 토피칼제 등으로 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 투여 경로에 따라 통상적으로 사용되고 비독성인, 약학적으로 허용 가능한 운반체, 첨가제, 비히클을 포함하는 적당한 투여 유닛 제형으로 제제화될 수 있다.

상기 투여시 유효성분인 YME1L1 유전자의 발현 억제제 또는 YME1L1 단백질의 활성 억제제, YME1L1 유전자의 발현 억제제 또는 YME1L1 단백질의 활성 억제제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 YME1L1 유전자의 발현 억제제 또는 YME1L1 단백질의 활성 억제제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 형질도입된 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 한 성분의 양은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여 방법, 배설율, 목적 부위 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.

본 발명의 약학 조성물 내의 상기 유효성분은 30μM 이상, 구체적으로는 35μM 이상, 보다 구체적으로는 40μM 이상의 농도로 포함될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물에 유효성분으로서, YME1L1 유전자의 발현 억제제 또는 YME1L1 단백질의 활성 억제제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 포함될 경우, 0.05 내지 500 ㎎가 함유되는 것이 바람직하고, 0.1 내지 300 ㎎가 함유되는 것이 더욱 바람직하며, YME1L1 유전자의 발현 억제제 또는 YME1L1 단백질의 활성 억제제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 바이러스의 경우, 10³~10¹² IU (10 내지 10¹⁰ PFU)가 함유되는 것이 바람직하고, 10⁵ 내지 10¹⁰ IU를 함유되는 것이 더욱 바람직하다.

또한, 본 발명의 YME1L1 유전자의 발현 억제제 또는 YME1L1 단백질의 활성 억제제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 유효성분으로 함유하는 조성물의 유효 용량은 체중 1 ㎏당 벡터의 경우에는 0.05 내지 12.5 ㎎/㎏, 재조합 바이러스의 경우에는 10⁷ 내지 10¹¹ 바이러스 입자(10⁵ 내지 10⁹ IU)/㎏이고, 바람직하게는 벡터의 경우에는 0.1 내지 10 ㎎/㎏, 재조합 바이러스의 경우에는 10⁸ 내지 10¹⁰ 입자(10⁶ 내지 10⁸ IU)/㎏이며, 하루 2 내지 3회 투여될 수 있다. 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 질환의 발병 정도에 따라 변할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 '약학적으로 유효한 양'은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 다른 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나, 다른 오염물질에 의해 유발되는 질환의 치료제 또는 피부 노화 개선을 위한 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로 본 발명의 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율, 배설 속도, 질병 종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라 증감될 수 있으며, 치료하고 있는 상태의 심각성 등에 따라 다양할 수 있다. 필요에 따라 편리성을 위하여 1일 총 투여량을 하루 동안 여러 번 나누어 투여될 수 있다. 일례로 일일 투여량은 매일 약 0.0001 mg/kg 내지 약 10 g/kg으로, 바람직하게는 약 0.001 mg/kg 내지 약 1 g/kg의 양을 1일 1회 투여할 수 있다. 아울러, 투여 기간은 1일 내지 2개월일 수 있으나, 질환의 예방 또는 치료 효과가 나타날 때까지 제한 없이 투여될 수 있다. 또한, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간 간격으로 1일 수회, 예컨대 하루 2회 내지 3회 분할 투여될 수 있다.

2. 암의 진단 방법

본 발명의 다른 측면은 암의 진단 방법, 구체적으로는 암의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명의 상기 암의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법은, 피검체로부터 분리된 시료에서 YME1L1 유전자의 발현량 또는 YME1L1 단백질의 활성 수준을 측정하는 단계;를 포함한다.

상기 피검체로부터 분리된 시료는 세포, 조직, 혈액, 혈청, 타액 또는 소변일 수 있다.

상기 YME1L1 유전자의 발현량을 측정하는 단계는 상기 YME1L1 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하여 인식할 수 있도록 하거나 양을 증폭시킬 수 있는 제제를 이용하여 측정하는 단계일 수 있다.

구체적인 예로, 상기 mRNA 또는 mRNA를 역전사시켜 만든 cDNA의 염기서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍, 프로브를 이용하여 측정하는 것일 수 있으며, 중합효소 연쇄반응(PCR), RT-PCR(Reverse transcription-PCR), 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), 노던 블롯(Northern blot), 마이크로 어레이(Microarray), RNase 보호 분석법(RNase protection assay), 염기서열 분석(sequencing) 등의 방법으로 측정할 수 있으나, 이에 한정하지 않고 통상의 기술자에게 알려진 어떠한 방법을 이용하여 측정하는 것이든 가능하다.

또한, 상기 YME1L1 유전자의 발현량을 측정하는 단계는 상기 YME1L1 유전자로부터 발현된 YME1L1 단백질에 특이적으로 결합하여 인식할 수 있는 제제를 이용하여 측정하는 단계일 수 있다.

구체적인 예로, 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 이용하여 측정하는 것일 수 있으며, 웨스턴블랏(Western blotting), 효소-면역화학 검출법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining, IHC), 면역침강(immunoprecipitation) 및 면역형광법(immunofluorescence) 등의 방법으로 측정될 수 있으나, 이에 한정하지 않고 통상의 기술자에게 알려진 어떠한 방법을 이용하여 측정하는 것이든 가능하다.

상기 YME1L1 단백질의 활성 수준을 측정하는 단계는 SDS-PAGE, 면역형광법, 효소면역분석법(ELISA), 질량분석 및 단백질 칩 등의 방법으로 측정할 수 있고, 단백질의 활성 수준을 측정할 수 있는 방법이면 본 발명에 제한 없이 적용할 수 있다.

한편, 본 발명의 상기 암의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법은, 상기 측정하는 단계에서 측정된 YME1L1 유전자의 발현량 또는 YME1L1 단백질의 활성 수준을 정상 개체 유래 시료의 YME1L1 유전자의 발현량 또는 YME1L1 단백질의 활성 수준과 비교하는 단계; 및 비교하는 단계의 비교 결과 피검체 유래 시료의 YME1L1 유전자의 발현량 또는 YME1L1 단백질의 활성 수준이 정상 개체 유래 시료에 비해 높은 경우 상기 피검체를 암의 발생 위험이 높은 것으로 판정하는 단계;를 더 포함할 수 있다.

상기 피검체로부터 분리된 시료에서 YME1L1 유전자의 발현량을 정상 개체의 YME1L1 유전자의 발현량과 비교하였을 때, YME1L1 유전자로부터 발현된 mRNA 또는 단백질의 양이 정상 개체의 mRNA 양 또는 단백질의 양보다 더 높게 나타날 경우 장차 암이 발생할 가능성이 높거나 현재 암이 진행되고 있을 가능성이 높은 것으로 판정하는 정보를 피검체에게 제공할 수 있다. 아울러, 피검체 유래 시료 내에 존재하는 YME1L1 단백질의 활성 수준이 정상 개체의 YME1L1 단백질의 활성 수준보다 더 높은 활성을 보이는 것으로 나타날 경우에도 장차 암이 발생할 가능성이 높거나 현재 암이 진행되고 있을 가능성이 높은 것으로 판정하는 정보를 피검체에게 제공할 수 있다.

3. 암의 치료제 후보물질의 스크리닝 방법

본 발명의 다른 측면은 암의 치료제 후보 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 암의 치료제 후보 물질의 스크리닝 방법은 YME1L1 발현 세포주에 피검 물질을 처리하는 단계;를 포한한다.

한편, 본 발명의 암의 치료제 후보 물질의 스크리닝 방법은, 상기 피검 물질을 처리하는 단계의 피검 물질이 처리된 세포주에서 YME1L1 유전자의 발현량 또는 YME1L1 단백질의 활성 수준을 측정하는 단계; 및 상기 측정하는 단계의 YME1L1 유전자의 발현량 또는 YME1L1 단백질의 활성 수준이 피검 물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소된 피검 물질을 선별하는 단계;를 더 포함 할 수 있다.

상기 피검 물질은 천연 화합물, 합성 화합물, RNA, DNA, 폴리펩티드, 효소, 단백질, 리간드, 항체, 항원, 박테리아의 대사산물, 진균의 대사산물 또는 생활성 분자일 수 있다.

상기 YME1L1 유전자의 발현량을 측정하는 방법 및 YME1L1 단백질의 활성 수준을 측정하는 방법은 상기 YME1L1 유전자의 발현량 측정을 통한 암의 진단 방법에서 설명한 YME1L1 유전자의 발현량을 측정하는 방법 및 YME1L1 단백질의 활성 수준 측정하는 방법과 동일하다.

상기 YME1L1 발현 세포주에 피검 물질을 처리한 결과 피검 물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 YME1L1 유전자로부터 발현된 mRNA의 양 또는 단백질의 양이 더 감소한 것으로 나타나거나, YME1L1 단백질의 활성 수준이 더 낮게 나타날 경우, 처리한 피검 물질은 YME1L1 단백질이 암을 진행시키거나 악화시키는 것을 저해하는 암의 치료제의 후보물질일 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되지 아니한다.

[실시예 1] 다양한 종류의 암 세포주에서 YME1L1의 발현량 확인

세포의 배양

YME1L1의 발현과 암 사이의 관련성에 대해 확인하기 위하여, 다양한 종류의 암 세포주 및 정상 세포주를 배양하여 실험에 이용하였다.

정상 세포주로는 BM-MSC, Adipo-MSC, Retina, WI38, BJ, 간암 세포주로는 Huh7, HepG, Hep3B, SNU387, SNU398, SNU449, 뇌 종양 관련 세포주로는 LN428, U87, 폐암 세포주로는 Calu1, A549, H460, H1299, 골육종 세포주로는 SAOS2, 대장암 세포주로는 HT29, HCT116, 유방암 세포주로는 MDAMB231, MCF7, 섬유육종 세포주로는 HT1080를 사용하였다.

먼저, Huh7, SNU387, SNU398, SNU449, A549, H460, HCT116, H1299 및 MDAMB231 세포는 10%의 FBS(fetal bovine serum)가 포함된 RPMI 배지에서 배양하였다. Hep3B, HepG2, WI38, BJ, MCF7, U87, HeLa 및 HT1080 세포는 10% FBS가 들어있는 MEM 배지에서, LN428 세포는 10% FBS가 들어있는 DMEM 배지에서 Calu1, SAOS2 및 HT29 세포는 10% FBS가 들어있는 McCoy'5A 배지에서 배양하였다. Lonza에서 구입한 BM-MSC(Human Mesenchymal Stem Cells)는 MS-CGM human Mesenchymal Stem Cell Growth BulletKit?? 배지에서 배양하였고, Adipo-MSC(adipose tissue-drived MSC) 세포는 세포바이오에서 구입한 전용 배지에서 배양하였다. Retina 세포는 10%가 들어있는 DMEM/F12 배지에서 배양하였다.

RNA의 분리 및 Real-Time RT-RCR

상기와 같은 방법으로 배양된 각 세포주로부터 YME1L1 유전자의 발현량을 확인하기 위하여, RNA를 분리하고 cDNA를 합성한 다음 Real-Time RT-PCR을 통해 양을 확인하였다. RNA는 Qiagen RNeasy Mini Kit를 이용하여 추출하였고, 추출한 RNA 농도는 ND-1000 분광광도계(spectrophotometer, NanoDrop Technologies, Inc. Wilmington, DE, USA)를 이용하여 측정하였다. cDNA(complementary DNA)를 합성하기 위하여, 0.5 μg의 RNA를 iScript?? cDNA Synthesis Kit(Biorad)를 이용하였고, Real-Time PCR은 SYBR Green을 이용하여 Hipi Real-time PCR 2X Master Mix (엘피스바이오)로 수행하였다. Real-Time RT-PCR에 이용한 프라이머는 하기 표 1의 서열을 갖는 것으로 이용하였다.

서열번호	서열 이름	염기서열
1	YME1L1 forward	5'- TATAGCGCCATCATTCGTGA -3'
2	YME1L1 reverse	5'- TTCGCCTTAGGGAATCATTG -3'

YME1L1의 발현량 확인

상기와 같이 배양된 세포주들 중에서 5종의 정상 세포주(WI38 fibroblast, BJ fibroblast, Retinal epithelial cells, BM-MSC(bone marrow-derived stem cells), Adipo-MSC(adipocyte-derived stem cells))로부터 상기와 같은 방법으로 RNA를 분리하고 Real-Time RT-PCR을 통해 YME1L1의 발현량을 측정하였다. 정상 세포주로부터 측정한 YME1L1 발현량의 평균값을 기준으로 하여, 동일한 방법으로 측정한 각 암 세포주의 YME1L1 발현량을 비교하였다.

그 결과, 정상 세포주와 비교할 때 Huh7, HepG2, Hep3B 및 SNU398과 같은 간암 세포주, Calu1, A549, H460 및 H1299과 같은 폐암 세포주, SAOS2와 같은 골육종 세포주, HCT116 및 HT29과 같은 대장암 세포주, MDAMB231 및 MCF7과 같은 유방암 세포주, HT1299과 같은 섬유육종 세포주 등의 암 세포주에서 YME1L1의 mRNA가 현저하게 증가되어 있음을 확인하였다(도 1). 다양한 종류의 암 세포주에서 YME1L1이 다량 발현되어 있음을 확인하여, YME1L1의 발현이 암의 성장, 진행 등과 관련성이 있는 것임을 확인할 수 있었다.

[실시예 2] YME1L1의 발현 억제를 통한 암 세포주의 성장 억제 효과 확인

간암, 섬유육종 및 자궁경부암 세포주에 대한 효과 확인

상기 실시예 1을 통해 확인한 바와 같이 YME1L1의 발현이 암의 성장과 관련 있으므로, YME1L1의 발현을 억제시키는 경우 암 세포의 성장이 저해되는지 여부를 확인하기 위하여, siRNA를 이용하여 YME1L1의 발현을 억제하였다. YME1L1 발현의 억제에는 3가지 서로 다른 YME1L1-siRNA(각각 si-YME1L1#1, #2, #3)를 사용하였다. 상기 si-YME1L1#1, si-YME1L1#2, si-YME1L1#3은 Mbiotech(IDT) 社에서 제작하여 사용하였고, 대조군-siRNA(si-control)는 Mbiotech 社에서 구입하여 사용하였다.

Huh7 간암 세포주, HT1080 섬유육종 세포주 및 HeLa 자궁경부암 세포주를 각각 6 well 플레이트에 시딩(seeding)하고, 다음날 상기 si-YME1L1#1, #2, #3 및 대조군-siRNA를 RNA iMAX 반응용액(Invitrogen)을 이용해 각 암세포주에 트랜스펙션(transfection) 시킨 다음, 24시간 경과 후에 1,000 개의 세포를 계산하여 다시 시딩하였다. 7 내지 10일 경과 후, 암 세포에 의해 형성된 콜로니를 크리스탈 바이올렛(crystal violet)으로 염색하여 각 암세포주의 성장 정도를 측정하였고, Real-Time RT-PCR을 통해 각 암세포주에서의 YME1L1 발현이 siRNA에 의해 제대로 억제되었는지 여부를 확인하였다. YME1L1에 대한 프라이머는 상기 표 1의 서열을 갖는 것으로 이용하였고, 상기 YME1L1-siRNA #1, #2, #3과 Real-Time PCR의 대조군으로 사용된 β-액틴에 대한 프라이머는 하기 표 2의 서열을 갖는 것으로 이용하였다.

서열번호	서열 이름	염기서열
3	si-YME1L1#1	5'- GCUGCUAUUCGGCAUUUAU -3'
4	si-YME1L1#2	5'- GGUCAUGCCAUUAUUGCAU -3'
5	si-YME1L1#3	5'- GGAGGAAGCUAAACAAGAA -3'
6	control-siRNA	5'- CCUCGUGCCGUUCCAUCAGGUAGUU -3'
7	β-actin forward	5'- GCACCACACCTTCTACAATGA -3'
8	β-actin reverse	5'- TAGCACAGCCTGGATAGCAAC -3'

Real-Time PCR 결과, YME1L1-siRNA를 처리하면 YME1L1의 mRNA 양이 감소하여 발현이 억제되었음을 확인할 수 있었고, YME1L1-siRNA #1, #2, #3를 처리한 경우, 대조군-siRNA를 처리한 세포와 비교할 때, Huh7 간암 세포주, HT1080 섬유육종 세포주 및 HeLa 자궁경부암 세포주 모두 콜로니 형성이 크게 억제되는 것을 확인하였다. 콜로니의 수를 카운팅한 결과 역시 YME1L1 유전자의 발현을 억제한 경우에 감소하는 것으로 측정되었다(도 2). 따라서, YME1L1의 발현량을 감소시킴에 따라 간암 세포주의 성장이 억제되는 효과를 유도할 수 있음을 확인할 수 있었다.

YME1L1의 발현을 억제하는 다른 종류의 siRNA를 이용한 경우의 효과 확인 - 총 7종 siRNA의 암세포 성장 억제 효과 확인

상기 YME1L1-siRNA #1, #2, #3을 이용한 실험 결과가 YME1L1의 mRNA 서열 중 일부 특정 지역의 서열을 인지하는 siRNA에 의해서만 발생하는 효과가 아님을 확인하기 위하여, 다른 종류의 siRNA 4종을 이용하여 추가적인 확인 실험을 수행하였다.

하기 표 3에 기재된 것과 같은 YME1L1의 발현을 억제하는 siRNA인, YME1L1-siRNA #4, #5, #6, #7 및 대조군-siRNA를 이용하여, Huh7 간암 세포주 및 HeLa 자궁경부암 세포주를 대상으로 상기 실험과 동일하게 트랜스펙션시킨 후, YME1L1의 mRNA 양을 측정하고, 콜로니의 수를 확인하였다. 상기 si-YME1L1#4, si-YME1L1#5, si-YME1L1#6 및 si-YME1L1#7은 Mbiotech(IDT) 社에서 제작하여 사용하였고, 대조군-siRNA(si-control)는 Mbiotech 社에서 구입하여 사용하였다.

서열번호	서열 이름	염기서열
9	si-YME1L1#4	5'- GGAACCGACCAUAUUACAA -3'
10	si-YME1L1#5	5'- GCGGAUGGUUACCAAAUUU -3'
11	si-YME1L1#6	5'- CCUUCUAAGGGACUCAUAU -3'
12	si-YME1L1#7	5'- GGAUCAGAUGUUGAGAGUU -3'

그 결과, 상기 YME1L1-siRNA #1, #2, #3으로 트랜스펙션시킨 실험의 결과와 마찬가지로 YME1L1-siRNA #4, #5, #6, #7을 이용한 경우에도 Huh7 간암 세포주 및 HeLa 자궁경부암 세포주의 콜로니 형성 수가 감소하는 것으로 측정되었다(도 3).

따라서, 특정한 서열에 대해 결합하는 일부 siRNA에 의해서만 암세포의 성장 억제 효과가 발생하는 것이 아니라, YME1L1 유전자의 발현을 억제하는 경우 siRNA 종류와 무관하게 암세포의 성장을 억제하여 암을 예방하거나 치료할 수 있는 효과가 발생할 수 있음을 확인할 수 있었다.

다양한 종류의 암세포주에 대한 성장 억제 효과 확인

간암 세포주, 자궁경부암 세포주 이외의 암세포를 대상으로 하는 경우에도, YME1L1 유전자를 억제하였을 때 암세포의 성장 억제 효과가 있는지 확인하기 위하여, HT1080 섬유육종 세포주, SNU475 간암 세포주, MDAMB231 유방암 세포주, LN428 신경교종 세포주, SW480 대장암 세포주 및 H460 폐암 세포주를 대상으로 실험을 수행하였다.

YME1L1의 발현을 억제하기 위하여 상기 siRNA 중 YME1L1-siRNA #3 및 #7을 RNA iMAX 반응용액(Invitrogen)으로 트랜스펙션 시켰고, 24시간 후 1,000개의 세포를 시딩하여 다시 7 내지 10일 후 크리스탈 바이올렛 시약으로 염색하여 콜로니의 수를 관찰하였다. 이번에는 발현되어 만들어진 YME1L1의 양을 확인하기 위하여, 각 세포주로부터 단백질을 분리하여 웨스턴 블랏팅을 수행하였다.

수거한 각 세포주에 용해 버퍼(lysis buffer, 120mM NaCl, 40 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.5%(w/v) NP40, 1mM PMSF, protease inhibitor cocktail(100X, GenDEPOT))를 처리하여 30분간 4℃에서 세포를 용해시킨 후, 20분 동안 12,000 rpm으로 원심분리하였다. 상층액만 분리한 다음 Bradford(BIORAD)로 정량하고 12% SDS-PAGE gel에서 전기영동하여 NC membrane(Whatman)에 78V, 2시간 조건으로 트랜스퍼시킨 다음, 항-YME1L1 항체(Protentech) 및 항-β-액틴 항체(Santacruz)를 이용하여 단백질의 양을 측정하였다.

웨스턴 블랏팅 수행 결과, YME1L1에 대한 siRNA를 처리한 세포주에서는 모두 YME1L1 단백질의 양이 감소하여 있는 것으로 측정되었고, 콜로니의 수를 카운팅한 결과, 대조군-siRNA를 처리한 군과 비교할 때 콜로니의 수가 감소하여 성장 억제 효과가 있음을 확인하였다(도 4). 따라서 YME1L1을 억제하는 경우 간암, 자궁경부암 이외에도 다양한 종류의 암종에서도 모두 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

상기와 같은 실시예의 실험 결과를 종합하여 볼 때, YME1L1의 발현을 억제(YME1L1의 mRNA 또는 단백질의 감소)함으로써 암세포의 성장이 저해되고 암을 예방하거나 치료할 수 있는 효과를 달성할 수 있음을 확인할 수 있었다.

[실시예 3] YME1L1 발현 억제를 통한 암세포주의 세포사멸 유도 효과 확인

상기 실시예의 실험 결과에서 확인한 바와 같은, YME1L1의 발현 억제에 따른 암세포의 성장 억제 효과가 세포사멸(apoptosis)과 관련있는지 여부를 확인하기 위하여, 상기 실시예에서 이용한 것과 동일한 HeLa 자궁경부암 세포주를 대상으로 세포사멸 마커인 Annexin-V 염색을 수행하였다.

HeLa 세포를 60 mm dish에 시딩하고, 다음날 si-YME1L1#3, #7 및 대조군-siRNA를 처리하였다. 96시간 경과 후에 세포를 모아 Annexin V-FITC를 첨가하여 15분 동안 염색하고 유세포 분석기(Cell QuestPro, BD-SCIENCE)를 이용하여 FACS 분석을 수행하였다.

그 결과, si-YME1L1#3, #7을 처리한 암세포주의 경우, 대조군 siRNA를 처리한 경우와 비교하여, FACS 히스토그램 상 Annexin-V의 염색 강도(staining intensity)가 증가된 것으로 측정되었고(도 5의 A), Annexin-V 염색된 세포 수의 비율이 증가되어 나타났다(도 5의 B).

상기와 같은 결과를 통해, YME1L1의 발현을 억제하는 경우 발생하는 암세포의 성장 억제 효과는, 암세포의 세포사멸에 의한 것임을 알 수 있으며, YME1L1의 발현을 억제시킴으로써 암세포의 세포사멸을 유도하여 암을 예방하거나 치료할 수 있음을 확인할 수 있었다.

[실시예 4] YME1L1 발현 감소에 의한 세포사멸과 DNA 손상의 관련성 확인

YME1L1의 발현 억제에 의한 암 세포의 성장 저해 및 세포사멸 유도 효과가 암 세포의 DNA 손상과 관련되어 진행되는 것인지 여부를 확인하기 위하여, DNA 손상의 마커로 이용되는 γ-H2AX를 염색시켜 염색된 foci를 측정하였다. 커버글라스를 넣은 6 well 플레이트에 상기 실시예에서 이용한 것과 동일한 HeLa 세포주를 시딩한 이후, si-YME1L1#1, si-YME1L1#3 및 대조군-siRNA를 각각 처리하였다. 72시간 경과 후에 커버글라스를 꺼내 고정시킨 다음 항-γ-H2AX 항체(Cell Siganaling Technology)를 이용하여 염색하고, 형광 현미경을 통해 관찰하였다.

그 결과, si-YME1L1#1 및 si-YME1L1#3의 서로 다른 2가지 siRNA를 처리한 세포의 경우에는, 대조군-siRNA를 처리한 세포에 비해 γ-H2AX foci가 현저하게 증가되어 있음을 확인하였다(도 6). 따라서 DNA의 손상 마커인 γ-H2AX의 foci가 증가한다는 상기와 같은 실험 결과를 통해, YME1L1의 발현을 억제하는 경우, DNA 손상이 증가함에 따라 암 세포의 사멸이 유도되고 성장이 저해되는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

이상에서 본 발명은 기재된 실시예에 대해서만 상세히 설명되었지만 본 발명의 기술사상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 청구범위에 속함은 당연한 것이다.

<110> KOREA INSTITUTE OF RADIOLOGICAL & MEDICAL SCIENCES <120> A composition for preventing or treating cancer <130> 2019DPA3252 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YME1L1 forward primer <400> 1 tatagcgcca tcattcgtga 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YME1L1 reverse primer <400> 2 ttcgccttag ggaatcattg 20 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-YME1L1#1 <400> 3 gcugcuauuc ggcauuuau 19 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-YME1L1#2 <400> 4 ggucaugcca uuauugcau 19 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-YME1L1#3 <400> 5 ggaggaagcu aaacaagaa 19 <210> 6 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> control-siRNA <400> 6 ccucgugccg uuccaucagg uaguu 25 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin forward primer <400> 7 gcaccacacc ttctacaatg a 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin reverse primer <400> 8 tagcacagcc tggatagcaa c 21 <210> 9 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-YME1L1#4 <400> 9 ggaaccgacc auauuacaa 19 <210> 10 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-YME1L1#5 <400> 10 gcggaugguu accaaauuu 19 <210> 11 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-YME1L1#6 <400> 11 ccuucuaagg gacucauau 19 <210> 12 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-YME1L1#7 <400> 12 ggaucagaug uugagaguu 19

Claims

YME1L1 유전자의 발현 억제제 또는 YME1L1 단백질의 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 YME1L1 유전자의 발현 억제제는 YME1L1 유전자의 DNA 또는 mRNA에 상보적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotides)인 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
청구항 2에 있어서,
상기 올리고뉴클레오티드는 YME1L1 유전자의 DNA 또는 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA), 마이크로 RNA(micro RNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA) 및 앱타머로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 YME1L1 유전자의 발현 억제제는 YME1L1 단백질에 결합하거나 또는 YME1L1의 결합단백질에 결합하는, 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 YME1L1 단백질의 활성 억제제는 YME1L1 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 암은 간암, 섬유육종, 자궁경부암, 폐암, 골육종, 대장암, 유방암, 신경교종, 뇌종양, 신장암, 위암, 전립선암, 자궁암, 결장암, 방광암, 췌장암, 척수종양, 두경부암, 흉선종, 중피종, 식도암, 취암, 담도암, 고환암, 생식세포종, 난소암, 자궁내막암, 림프종, 급성 백혈병, 만성 백혈병, 다발성 골수종, 육종, 악성 흑색종 및 피부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
피검체로부터 분리된 시료에서 YME1L1 유전자의 발현량 또는 YME1L1 단백질의 활성 수준을 측정하는 단계;를 포함하는, 암의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
청구항 7에 있어서,
상기 YME1L1 유전자의 발현량 또는 YME1L1 단백질의 활성 수준을 측정하는 단계에서 측정된 YME1L1 유전자의 발현량 또는 YME1L1 단백질의 활성 수준을 정상 개체 유래 시료의 YME1L1 유전자의 발현량 또는 YME1L1 단백질의 활성 수준과 비교하는 단계; 및
상기 비교하는 단계의 비교 결과 YME1L1 유전자의 발현량 또는 YME1L1 단백질의 활성 수준이 정상 개체 유래 시료에 비해 높은 경우 상기 피검체를 암의 발생 위험이 높은 것으로 판정하는 단계;를 더 포함하는, 암의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
청구항 7에 있어서,
상기 피검체로부터 분리된 시료는 세포, 조직, 혈액, 혈청, 타액 및 소변으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 암의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
YME1L1 단백질 발현 세포주에 피검 물질을 처리하는 단계;를 포함하는, 암의 치료제 후보 물질의 스크리닝 방법.
청구항 10에 있어서,
상기 피검 물질을 처리하는 단계의 피검 물질이 처리된 세포주에서 YME1L1 유전자의 발현량 또는 YME1L1 단백질의 활성 수준을 측정하는 단계; 및
상기 측정하는 단계에서 측정한 YME1L1 유전자의 발현량 또는 YME1L1 단백질의 활성 수준이 피검 물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소된 피검 물질을 선별하는 단계;를 더 포함하는, 암의 치료제 후보 물질의 스크리닝 방법.
청구항 10 또는 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서,
상기 피검 물질은 천연 화합물, 합성 화합물, RNA, DNA, 폴리펩티드, 효소, 단백질, 리간드, 항체, 항원, 박테리아의 대사산물, 진균의 대사산물 및 생활성 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 암의 치료제 후보 물질의 스크리닝 방법.