CN116024211A - tRNA衍生物tRF-His-008在诊断、治疗肾癌中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种tRNA片段tRF‑His‑008在诊断、治疗肾癌中的应用，通过荧光定量PCR法发现tRF‑His‑008在肾癌组织中表达显著低表达，且tRF‑His‑008在肾癌细胞中的表达水平显著低于人肾皮质近曲小管上皮细胞系HK2，且tRF‑His‑008在肾癌患者血液外泌体中检测到其表达水平与肾癌组织表达水平正相关；tRF‑His‑008过表达后能够显著抑制肾癌增殖、迁移、侵袭；采用tRF‑His‑008抑制物靶向抑制tRF‑His‑008会显著促进肾癌细胞的增殖、迁移、侵袭。tRF‑His‑008在肾癌诊断及治疗方面具有重要的作用，可以作为肾癌诊断生物标志物及治疗制剂。

Description

tRNA衍生物tRF-His-008在诊断、治疗肾癌中的应用

技术领域

本发明属于肿瘤诊断及生物医药工程领域，涉及一种内源性tRNA衍生物的新用途，具体涉及tRNA衍生物tRF-His-008在诊断和治疗肾癌中的应用。

背景技术

肾细胞癌(Renal cell carcinoma,RCC)是肾癌最常见类型，起源于肾皮质内，约占原发性肾癌的85％，在所有成人恶性肿瘤中占比超4％，是常见的泌尿系统恶性肿瘤。美国癌症协会预估2022年全美肾癌新发病例将达79000例，肾癌死亡病例将达到13920例。RCC最常见的病理类型是透明细胞性肾细胞癌(ccRCC)，占所有RCC的75-80％。早期ccRCC患者行部分肾切除术或根治性切除术可获得良好的预后，5年生存率达90％以上。但是ccRCC由于早期缺乏典型临床症状，四分之一的患者在初次诊断时便被发现有远处转移。而转移性ccRCC对化疗及放疗均不敏感，其5年总生存率仅为12％。目前晚期ccRCC主要依赖于靶向药物治疗和免疫治疗，但患者在接受6到15个月的靶向治疗后会出现耐药。因此转移性ccRCC的机制是目前肿瘤研究中的热点问题，深入研究ccRCC转移机制可为晚期转移性ccRCC的诊治提供新的思路，对改善其预后具有重要意义。

转运RNA(transfer RNA，tRNA)衍生片段(tRNA-derived fragment，tRF) 是近年来小非编码RNA(sncRNA)一个研究热点，它可以影响多种癌细胞的生物学行为。并且，一些研究发现，有些tRF可能是潜在的癌症诊断指标和治疗靶点。

外泌体是由脂质双层膜包围的纳米级(30-150nm)细胞外囊泡。外泌体是由内泌体途径产生的，可以被大多数类型的细胞释放到体液中。外泌体携带大量特异性的蛋白质以及功能性的DNA、mRNA、miRNA和环状RNA等，在体内参与细胞通讯、细胞迁移、促血管新生等生理过程，与包括肿瘤在内多种疾病的发生与进程密切相关。外泌体分布在外周血、尿液、唾液、乳汁、腹水、羊水等体液中，外泌体的各个组分既可以成为疾病诊断的标志物，又可作为疾病治疗的特异性靶点。

本发明通过4对配对肾癌及癌旁组织进行tRF高通量测序并在21对配对的肾癌及癌旁组织进行验证，发现tRNA衍生片段(tRF-His-008)在肾癌组织显著低表达，首次发现tRF-His-008与肾癌的关系及其在肾癌转移中的作用。本发明通过功能实验，证实了过表达tRF-His-008抑制肾癌增殖和转移，抑制tRF-His-008 表达可以促进肾癌增殖和转移。而且tRF-His-008存在于肾癌细胞培养液及肾癌患者血液外泌体中。本发明提供了一种肾癌的诊断标记物和治疗物，具有重要的临床应用价值。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种tRF-His-008在肾癌诊治中的应用，确定了 tRF-His-008是肾癌患者癌组织及血液外泌体中表达下调的tRF，并将tRF-His-008 应用到肾癌的诊断和治疗中。

本发明的另一个目的在于提供一种用于诊断肾癌疾病的试剂盒。

本发明的第三个目的在于提供一种治疗肾癌的药物。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

tRF-His-008作为诊断标志物在制备用于诊断肾癌试剂中的应用，所述 tRF-His-008的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

可通过检测tRF-His-008在受试人血液外泌体中的表达水平以诊断肾癌。

一种用于诊断肾癌的试剂盒，含有特异性扩增tRF-His-008的引物。所述试剂盒可采用荧光定量PCR试剂盒；进一步的，所述特异性扩增tRF-His-008的引物为：RT引物序列为SEQ ID No.2，PCR上游引物序列为SEQ ID No.3，下游引物序列为SEQ ID No.4。

tRF-His-008作为治疗药物在制备用于治疗肾癌药物中的应用。

一种肾癌的治疗药物，所述药物含有具有如SEQ ID No.1所示序列的核酸、生物活性功能片段或变体。进一步的，所述药物包括药学上可接受的载体或辅料，包括壳聚糖、胆固醇、脂质体和纳米颗粒等。

有益效果：

本发明首次发现tRF-His-008在肾癌诊断以及治疗方面具有重要的作用，可以作为肾癌诊断生物标志物及治疗靶点。

本发明通过荧光定量PCR法发现tRF-His-008在肾癌组织中表达显著降低。并且tRF-His-008在肾癌患者血液外泌体中检测到其表达水平与肾癌组织表达水平正相关。因此通过检测受试者血液外泌体中tRF-His-008表达水平可以实现肾癌无创、快速诊断。

本发明发现tRF-His-008在肾癌细胞中的表达水平显著低于癌旁正常组织， tRF-His-008过表达后能够显著抑制肾癌的增殖、迁移、侵袭；反之，抑制 tRF-His-008会显著促进肾癌细胞的增殖、迁移、侵袭。上述发现表明tRF-His-008 对肿瘤生长和转移的重要性，并提示转入tRF-His-008模拟物进行肾癌治疗的可行性。

附图说明

附图1为tRF-His-008在21对肾癌组织和癌旁组织中的表达量比较；

附图2为比较10例肾癌组织与对应的肾癌患者血液外泌体中tRF-His-008表达的相关性；

附图3为tRF-His-008在人肾皮质近曲小管上皮细胞系与肾癌细胞系中的相对表达量；

附图4为肾癌细胞中转染tRF-His-008模拟物及抑制剂后tRF-His-008表达量；

附图5为干扰和过表达tRF-His-008对肾癌细胞增殖能力的影响结果图；

附图6为干扰和过表达tRF-His-008对肾癌细胞迁移、侵袭能力的影响结果图；

具体实施方式

本发明通过设计能扩增tRF-His-008的特异性茎环引物，采用荧光定量PCR 的方法检测tRF-His-008基因在肾癌组织及配对的正常组织中的表达差异，结果显示tRF-His-008在肾癌组织中表达水平明显低于癌旁组织。而且tRF-His-008 在肾癌患者血液外泌体中的丰度与肾癌组织中的丰度正相关。故可制作检测 tRF-His-008表达变化的试剂盒，通过检测患者血液外泌体中tRF-His-008表达水平进行肾癌诊断。

接着，对tRF-His-008进行体内外功能学的研究，通过将tRF-His-008模拟物与抑制剂转染肾癌细胞系，成功调整肾癌细胞中tRF-His-008的表达水平。功能实验研究结果显示过表达tRF-His-008后细胞的增殖、迁移、侵袭受到显著抑制，反之，抑制tRF-His-008可显著促进肾癌细胞的增殖、迁移、侵袭。因此， tRF-His-008可以作为治疗药物在制备或筛选治疗肾癌药物中应用。

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述地实施例是本发明一部分实施例，而不是全部地实施例。基于本发明中地实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得地所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1tRF-His-008在肾癌组织和配对正常组织中的表达水平分析

一、材料

所有组织标本来自2019年1月至中2022年5月经病理确诊为肾癌患者。选取 21对肾癌组织及配对正常组织进行分组编号。

二、方法

1)RNA的提取：组织样品取30mg放入500μLRNA裂解缓冲液(奕杉生物) 中，加入净信碾磨珠，放入匀浆器中匀浆，然后按照奕杉组织RNA快速提取试剂盒操作提取RNA，再用NanoDrop ND-1000核酸定量仪定量所提取的RNA的纯度和浓度，琼脂糖质检确保提取RNA的完整性。

2)RNA预处理：采用Arraystar RNA预处理试剂盒(rtStar tRF&tiRNAPretreatment kit)对提取的总RNA进行去甲基化修饰处理，以便更好的进行cDNA合成。

3)cDNA合成：采用诺唯赞miRNA第一链cDNA合成试剂盒miRNA 1^st strand cDNASynthesis Kit(by stem-loop)对预处理后的总RNA反转录合成cDNA。

4)实时定量PCR：根据tRF-His-008和U6的核酸序列设计特异性引物，采用康为世纪UltraSYBR Mixture进行PCR反应，tRF-His-008的上游引物和下游引物分别为SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4，U6的上游引物和下游引物分别为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6。反应体系如下表：

表1 PCR反应体系

将上述组分混合均匀后按一下程序：95℃10min预变性，40个循环：95℃15s，60℃30s。根据溶解曲线判断反应的特异性，由公式

计算tRF-His-008的相对表达量，结果见图1。由图1可知，在21对肾癌临床组织标本中检测tRF-His-008 的表达，结果显示tRF-His-008在癌组织显著下调。

实施例2肾癌患者血液外泌体中检测tRF-His-008表达水平

1)肾癌患者血液外泌体提取：肾癌患者行肾癌根治术收集血液，3000g离心10 分钟后得到上清。取50ml血液上清经超速离心机100000g离心70分钟。离心得到的沉淀用PBS缓冲液重悬，并用0.22μM滤器过滤。

2)外泌体中tRF-His-008表达水平检测：过滤产物再用实施例1中所述的RNA 提取、cDNA合成以及实时定量PCR法操作获得外泌体中tRF-His-008的相对表达量。

3)通过Graphpad Prism8.0.2软件计算尿液外泌体与肾癌组织中tRF-His-008表达相关性，结果见图2。如图2所示，肾癌血液外泌体中tRF-His-008表达水平与肾癌组织中tRF-His-008表达水平正相关，相关系数达0.86，数据具有显著性差异。

实施例3检测肾癌细胞和人肾皮质近曲小管上皮细胞系中tRF-His-008表达

一、材料

肾癌细胞株7860,A498,OSRC2和人肾皮质近曲小管上皮细胞系HK2均购自中科院上海细胞库。

二、方法

按照实施例1中所述的RNA提取、cDNA合成以及实时定量PCR法操作获得各个细胞中tRF-His-008的相对表达量，结果见图3。与人肾皮质近曲小管上皮细胞系HK2相比，3株肾癌细胞中的tRF-His-008显著下调。

实施例4构建tRF-His-008敲低及过表达稳转细胞株

1)采用GV281-NC和GV281-tRF-His-008-mimic慢病毒分别感染786-O和 OS-RC-2细胞系，并加入5μg/mL嘌呤霉素筛选，建立稳定的tRF-His-008高表达和空白对照组肾透明细胞癌细胞系。采用GV281-NC/inhibitor和 GV281-tRF-His-008-inhibitor慢病毒分别感染7860和OSRC2细胞系，同样用 5μg/mL的嘌呤霉素筛选以建立稳定tRF-His-008敲低和空白对照组肾透明细胞癌细胞系。

2)干扰和过表达效率验证：

收集上述经嘌呤霉素筛选后的细胞系，采用实施例1中所述RNA提取、cDNA 合成及实时定量PCR检测tRF-His-008相对表达量。由结果图4可见，感染 tRF-His-008-inhibitor病毒可以显著降低细胞中tRF-His-008表达，而感染 tRF-His-008-mimic慢病毒可以显著提高tRF-His-008表达水平。

实施例5：敲低或过表达tRF-His-008后肾癌细胞增殖能力测定

1)将实施例4中获得的tRF-His-008敲低和过表达稳转细胞株(7860、OSRC2) 提前一天消化成单细胞悬液，计数，调整细胞浓度为20000个/ml，接种至96孔板，每孔100μL，即每孔细胞为2000个。

2)待细胞贴壁厚分别在不同的时间点(1，2，3，4，5天)加入CCK8试剂，比例为1：10，即100μL培养液加入10μL检测液。

3)37℃孵育2h后，酶标仪检测450nm吸光度。

4)图5为在肾癌细胞中敲低和过表达tRF-His-008后细胞生长曲线示意图，由图 5可知，敲低tRF-His-008表达肾癌细胞株增殖加快；而过表达tRF-His-008肾癌细胞株增殖受抑制。

实施例6：敲低或过表达tRF-His-008对肾癌细胞迁移、侵袭能力的影响

将肾癌细胞接种到transwell小室中，每孔100μL(不含FBS)，在transwell 下室加入0.6ml含10％FBS的完全培养基刺激细胞迁移，在细胞培养箱中培养 24小时后，弃去空中培养液，用组织固定液常温固定15分钟，0.1％结晶紫染色 10分钟，清水漂净，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，显微镜下观察并选择四个视野拍照计数。细胞侵袭实验需在transwell小室上室添加50ul Matrigel胶，其余与上述步骤基本相同。实验独立重复3次，细胞迁移、侵袭数通过ImageJ 软件统计，并进行统计t检验，**P<0.01为有显著性统计学差异，***P<0.001 为有极显著性统计学差异。结果发现敲低tRF-His-008后，肾癌细胞的迁移和侵袭能力明显增强，而过表达tRF-His-008抑制肾癌细胞的迁移和侵袭(图6)。

本发明中涉及的序列具体如下：

SEQUENCE LISTING

SEQ ID NO.1

>tRF-His-008

GCCGTGATCGTATAGTGGTTAGTACTCTGCG

SEQ ID NO.2

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC

SEQ ID NO.3

GCCGTGATCGTATAGTGGTTAGTAC

SEQ ID NO.4

AGTGCAGGGTCCGAGGTATT

SEQ ID NO.5

GCGCGTCGTGAAGCGTTC

SEQ ID NO.6

GTGCAGGGTCCGAGGT 。

Claims (8)

1.tRF-His-008作为诊断标志物在制备用于诊断肾癌试剂中的应用，所述tRF-His-008的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过检测tRF-His-008在肾组织或血液外泌体中的表达水平以诊断肾癌。

3.用于诊断肾癌的试剂盒，其特征在于，含有特异性扩增tRF-His-008的引物。

4.根据权利要求3所述的用于诊断肾癌的试剂盒，其特征在于，含有：特异性扩增tRF-His-008的逆转录引物SEQ ID No.2，实时定量PCR上游引物序列SEQ ID No.3，下游引物序列SEQ ID No.4。

5.根据权利要求3所述的用于诊断肾癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中检测样本为患者血液外泌体。

6.tRF-His-008在制备用于治疗肾癌药物中的应用。

7.一种肾癌的治疗药物，其特征在于，所述药物含有具有如SEQ ID No.1所示序列的核酸、生物活性功能片段或变体。

8.根据权利要求7所述的药物，其特征在于，所述药物包括药学上可接受的载体或辅料。

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