KR20190005727A - 난소과립막세포암 또는 자궁내막암의 진단 및 치료를 위한 마이크로rna-1236의 용도 - Google Patents

난소과립막세포암 또는 자궁내막암의 진단 및 치료를 위한 마이크로rna-1236의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 난소과립막세포암 또는 자궁내막암의 진단 및 치료를 위한 마이크로RNA-1236의 용도 등에 관한 것으로, 구체적으로, 난소과립막세포암 또는 자궁내막암 세포에서 마이크로RNA-1236의 변형된 FOXL2 mRNA에 선택적 분해함을 확인함에 따라, 본 발명에 따른 안티-마이크로RNA-1236을 포함하는 조성물은 난소과립막세포암 및/또는 자궁내막암을 예방 또는 치료할 수 있으며, 마이크로RNA-1236의 발현 수준을 확인함으로써 난소과립막세포암 및/또는 자궁내막암의 진단에 유용하게 이용할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

난소과립막세포암 또는 자궁내막암의 진단 및 치료를 위한 마이크로RNA-1236의 용도{Use of microRNA-1236 as a diagnostic marker and therapeutic agent of granulosa cell tumor or Endometrial cancer}
본 발명은 난소과립막세포암 또는 자궁내막암의 진단 및 치료를 위한 마이크로RNA-1236의 용도 등에 관한 것이다.
FOXL2는 winged-helix/forkhead (FH) 도메인 전사인자로서 알려져 있으며, 현재 FOXL2에 대한 다양한 연구가 이루어지고 있다. 즉, 2010년 유럽 분자생물 연구소에서 주도한 연구결과, 저명한 학술지인 Cell에 발표한 연구 논문에서는 성별이 오로지 XY 염색체에 의해 결정된다는 과학적 사실을 뒤엎은 연구 결과를 보고하였다. 연구진은 female mouse의 FOXL2 유전자를 Knock-out한 마우스의 female의 난소가 고환과 같은 구조를 가진 조직으로 변하며 남성 호르몬인 테스토스테론을 분비하는 결과를 확인하였고, 이러한 과정에서 특히 난소에서 존재하는 난소과립세포가 서서히 정자의 성숙에 관여하는 세토리 세포(setori cell)로 변화하는 것을 확인하였다.
또한, FOXL2가 난소의 어느 세포에 발현하는지와 함께 그 발현의 단계별 추이를 살펴본 결과, FOXL2 mRNA는 발생단계부터 미성숙한 생쥐와 성숙한 생쥐의 난소에서 모두 발현하며, 특히 작거나 중간 크기의 난포에 존재하는 미분화된 과립세포(granulosa cell)에 한정적으로 발현하는 것을 확인함으로써, FOXL2가 난포의 성장을 조절하는 인자임을 보고하였다.
한편, 20대에 잘 발생하는 질환으로, 난소과립세포 종양(granulosa cell tumor; GCT)과 난포막 세포 종양(Follicular cell tumor)이 있으며, 이 중 난소과립세포 종양은 에스트로겐을 생산해서 초경 전 질 출혈, 월경 불순, 폐경 후 질 출혈 등의 증상이 있다. 과립막 세포 종양의 3/4가 병기에 속하며 종양의 성장 속도가 느리고 재발도 매우 늦어서 무병기간이 10년 이상이다. 치료에 있어서는 자궁절제술 또는 양측 난관 난소 적출술이 있다. 이러한 난소과립종양세포는 전체 난소암의 5% 이하이나 20대 전에 진단 및 치료 시 90% 이상의 환자가 조기 치료의 가능성이 있기 때문에, 난소과립종양세포를 조기에 진단하는 것은 매우 중요하다.
이와 관련하여, 2009년도 6월 New England Journal of Medicine 지에 발표된 연구 결과에 의하면, whole transcriptome paired-end RNA sequencing을 통하여 97%의 adult-type GCT 환자에게서 FOXL2라는 유전자에 point mutation(402C->G)이 있음이 보고되었다. 이를 통해, FOXL2의 단일, 재발성 체세포 돌연변이 (402C->G)가 성인형 GCT의 발병기전에서 잠재적 조정자로 판단될 수 있다는 것만 알려져 있을 뿐(미국공개특허US2011/0195070 참조), 난소과립 종양세포 발달에 대한 구체적인 메커니즘 및 이를 이용하여 난소과립종양세포를 진단하는 조성물 또는 키트에 대해서는 알려진 바가 없다.
한편, MicroRNA (miRNA)는 mRNA의 안정성 또는 번역 효율을 억제하는 약 22nt의 내인성 non-coding RNA로써, 표적 유전자의 3' untranslated region(UTR)에 염기쌍을 형성하여 전사 후 repressor로 작용하는 것으로 알려져 있다. 최근 high-throughput sequencing과 proteomic analysis를 통해 miRNA가 mRNA의 코딩 서열(coding sequences, CDS)에 결합할 수 있으며 CDS 부위를 타겟으로하는 여러 miRNA의 세포내의 효과가 밝혀졌다. 그러나, miRNA가 mRNA의 CDS에 결합하여도 그 발현에 효과적이지 못한 이유에서, miRNA의 CDS 결합과 관련된 생리학적 관련성 및 병리학적 결과는 여전히 불분명하다. 이는 CDS 영역에서 리보솜이 번역함에 따라 RISC(RNA-induced silencing complex)의 활동을 방해하기 때문으로 생각된다. 따라서 miRNA가 삽입된 RISC (miRNA-loaded RISC, miRISC)가 CDS 영역에 결합하는 것은 mRNA 번역을 억제하는 것에 효율적인 메커니즘으로 생각되지 않았으며, 또한 질병 관련 유전자 좌위의 CDS에 miRNA가 결합하여 나타나는 명확한 병태·생리학적 결과를 입증하는 결정적인 증거가 부족한 문제가 있다.
본 발명자들은, miRNA-1236이 난소과립막세포암 및/또는 자궁내막암의 발달에 기여함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명의 목적은 안티-마이크로RNA-1236 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 항암 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 마이크로RNA-1236를 이용한 난소과립막세포암 또는 자궁내막암 진단용 바이오 마커, 진단 조성물, 진단용 키트를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 마이크로RNA-1236를 이용한 난소과립막세포암 또는 자궁내막암의 발병가능성 예측 또는 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법 및 난소과립막세포암 또는 자궁내막암의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 난소과립막세포암 또는 자궁내막암 진단용 바이오 마커 조성물로서, 상기 바이오 마커는 마이크로RNA-1236 올리고뉴클레오티드이며, 상기 바이오 마커는 난소과립막세포암 또는 자궁내막암 환자에서 특이적으로 발현이 증가되는 것을 특징으로 하는, 난소과립막세포암 또는 자궁내막암 진단용 바이오 마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 마이크로RNA-1236 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 난소과립막세포암 또는 자궁내막암 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 제제는 상기 마이크로RNA-1236에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 세트, 프로브, 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 마이크로RNA-1236 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 난소과립막세포암 또는 자궁내막암 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 제제는 상기 마이크로RNA-1236에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 세트, 프로브, 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 키트는 RT-PCR 키트 또는 DNA 칩인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 (가) 환자의 생물학적 시료로부터 마이크로RNA-1236의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (나) 상기 마이크로RNA-1236의 발현 수준을 정상 대조군 시료의 마이크로RNA-1236의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 난소과립막세포암 또는 자궁내막암의 발병가능성 예측 또는 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 (가) 단계의 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction) 또는 실시간 중합효소 연쇄반응(real time polymerase chain reaction)으로 수행되는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 (가) 마이크로RNA-1236이 발현되는 세포에 후보 물질을 처리하는 단계; (나) 상기 세포 내에서 마이크로RNA-1236의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (다) 상기 (나) 단계의 측정 결과, 마이크로RNA-1236의 발현량이 후보 물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소되는 경우 상기 후보 물질을 난소과립막세포암 또는 자궁내막암의 예방 또는 치료용 물질로 판정하는 단계를 포함하는, 난소과립막세포암 또는 자궁내막암의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 (나) 단계의 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction) 또는 실시간 중합효소 연쇄반응(real time polymerase chain reaction)으로 수행되는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 안티-마이크로RNA-1236 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 항암 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 암은 난소과립막세포암 또는 자궁내막암인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 조성물은 상기 안티-마이크로RNA-1236 또는 이와 상보적인 서열을 포함하는 벡터; 또는 상기 벡터가 형질도입된 세포; 를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 마이크로RNA-1236의 활성을 저해하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 환자의 생물학적 시료로부터 마이크로RNA-1236의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 난소과립막세포암 또는 자궁내막암의 진단방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 안티-마이크로RNA-1236 올리고뉴클레오티드를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 난소과립막세포암 또는 자궁내막암의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 안티-마이크로RNA-1236 올리고뉴클레오티드의 난소과립막세포암 또는 자궁내막암의 예방 또는 치료를 위한 약제 제조용도를 제공한다.
마이크로RNA-1236이 변형된 FOXL2 mRNA 및 LRIG2 mRNA을 선택적으로 분해함을 확인함에 따라, 본 발명에 따른 안티-마이크로RNA-1236을 포함하는 조성물은 난소과립막세포암 및/또는 자궁내막암을 예방 또는 치료할 수 있으며, 마이크로RNA-1236을 그 발현 수준을 확인함으로써 난소과립막세포암 및/또는 자궁내막암의 진단에 유용하게 이용할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 AGCT 환자의 생물학적 시료로부터 변형된 402C>G FOXL2 mRNA의 상대적인 발현 수준을 확인한 도면이다.
도 2a는 AGCT 환자와 JGCT 환자의 생물학적 시료로부터 miR-1236, 변형된 FOXL2 mRNA, 및 WT FOXL2 mRNA의 상대적인 발현 수준 및 상관계수(correlation coefficient)를 확인한 도면이다.
도 2b는 EM 환자와 정상 그룹의 생물학적 시료로부터 miR-1236 및 LRIG2 mRNA의 상대적인 발현 수준 및 상관계수(correlation coefficient)를 확인한 도면이다.
도 3은 루시퍼라아제 리포터의 구조물(pGL3-FOXL2 벡터)을 도식화한 도면이다.
도 4a는 miR-1236을 트렌스펙션한 KGN 세포에서 리포터인 루시퍼라아제의 활성을 나타낸 도면이다.
도 4b는 miR-1236-G를 트렌스펙션한 KGN 세포에서 리포터인 루시퍼라아제의 활성을 나타낸 도면이다.
도 4c는 miR-1236-U를 트렌스펙션한 KGN 세포에서 리포터인 루시퍼라아제의 활성을 나타낸 도면이다.
도 5a는 in vitro에서 miR-1236과 WT 또는 변형된 FOXL2 mRNA의 결합 정도를 비교 확인한 도면이다.
도 5b는 in vivo에서 RISC와 변형된 FOXL2 mRNA의 특이적 결합을 확인한 도면이다.
도 6a는 anti-miRNA-1236을 트렌스펙션한 KGN 세포에서 변형된 FOXL2 mRNA와 WT FOXL2 mRNA의 발현 수준을 양적 RT-PCR로 확인한 도면이다.
도 6b는 anti-miRNA-1236을 트렌스펙션한 KGN 세포에서 변형된 FOXL2와 WT FOXL2 단백질의 발현 수준을 웨스턴 블롯(western blot)으로 확인한 도면이다.
도 7a는 control miRNA 또는 miR-1236을 트렌스펙션한 KGN 세포에서 FOXL2 mRNA의 발현 수준을 확인한 도면이다.
도 7b는 control miRNA 또는 miR-1236을 트렌스펙션한 KGN 세포 및 COV434 세포에서 FOXL2 단백질 수준을 확인한 도면이다.
도 8a는 KGN 세포에 트렌스펙션된 miR-1236 또는 anti-miR-1236이 세포사멸에 미치는 영향을 확인한 도면이다.
도 8b는 KGN 세포에 트렌스펙션된 miR-1236 또는 anti-miR-1236이 세포주기에 미치는 영향을 확인한 도면이다.
도 8c는 FOXL2-silenced KGN 세포에 트렌스펙션된 miR-1236 또는 anti-miR-1236이 세포 생존력에 미치는 영향을 확인한 도면이다.
도 8d는 FOXL2-silenced KGN 세포에 트렌스펙션된 miR-1236 또는 anti-miR-1236이 세포 이동에 미치는 영향을 확인한 도면이다.
도 8e는 COV434 세포에 트렌스펙션된 miR-1236 또는 anti-miR-1236이 세포 생존력, 세포 이동, 및 FOXL2 단백질 발현에 영향을 미치지 않음을 확인한 도면이다.
도 9은 E2를 처리한 Hec1A 세포에서 miR-1236 및 LRIG2 mRNA의 발현 수준이 변함을 확인한 도면이다.
도 10은 MPA를 처리한 Hec1A 세포에서 miR-1236 및 LRIG2 mRNA의 발현 수준이 변함을 확인한 도면이다.
도 11는 Hec1A 세포에 트렌스펙션된 miR-1236 또는 anti-miR-1236이 세포 생존력에 미치는 영향을 확인한 도면이다.
도 12a는 miR-1236 또는 anti-miR-1236을 트렌스펙션한 Hec1A 세포에서 LRIG2 mRNA의 발현 정도를 확인한 도면이다.
도 12b는 루시퍼라아제 리포터의 구조물(pGL3-LRIG2 벡터)을 도식화한 도면이다.
도 12c는 miRNA NC, miR-1236 mimic, anti-miR-NC, 또는 anti-miR-1236을 트렌스펙션한 Hec1A 세포에서 WT- 또는 Mut- LRIG2의 발현정도를 루시퍼라아제 활성을 통해 확인한 도면이다.
도 13a는 control 또는 miR-1236-/- KGN 세포를 주입한 마우스에서 장내 결절 생성 수를 확인한 도면이다.
도 13b는 control 또는 miR-1236-/- KGN 세포를 주입한 마우스의 결절에서 miR-1236의 발현 수준을 확인한 도면이다.
도 13c는 control 또는 miR-1236-/- KGN 세포를 주입한 마우스의 결절에서 WT- 및 Mut-(402C>G) FOXL2 mRNA의 발현 수준을 확인한 도면이다.
도 13d는 control, miR-1236-/+, 또는 miR-1236-/- KGN 세포의 세포이동을 비교 확인한 도면이다.
마이크로RNA(microRNA, miRNA, miR)는 식물 및 동물의 게놈 내에서 인코딩되어 특정 mRNA에 결합함으로써 유전자 발현을 조절하는 작은 조절 분자로써, 본 발명자들은, miR-1236의 발암효과 및 anti-miR-1236의 항암효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명자들은 난소과립막세포암 또는 자궁내막암 환자에서 특이적으로 마이크로RNA-1236의 발현이 증가되어 있음을 확인하였는바, 본 발명은 난소과립막세포암 또는 자궁내막암 진단용 바이오 마커로서 마이크로RNA-1236 올리고뉴클레오티드의 용도를 제공할 수 있다. 따라서, 본 발명은 난소과립막세포암 또는 자궁내막암 진단용 바이오 마커 조성물로서, 상기 바이오 마커는 마이크로RNA-1236 올리고뉴클레오티드이며, 난소과립막세포암 또는 자궁내막암 환자에서 특이적으로 발현이 증가되는 것을 특징으로 하는, 난소과립막세포암 또는 자궁내막암 진단용 바이오 마커 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 '마이크로RNA-1236 올리고뉴클레이티드'는 마이크로RNA의 일종인 마이크로RNA-1236를 구성하고 있는 단일가닥 또는 이중 가닥 형태의 핵산 분자를 의미한다. 본원에서 '마이크로RNA-1236', 'mir-1236', 'miRNA-1236', 및 'microRNA-1236'은 혼용될 수 있다.
마이크로RNA는 대부분 염색체상의 인트론 등에 끼어 들어가 있으며 이는 전사가 일어난 후 드로사(Drosha) 등에 의해 프로세싱되어 전구체 형태 (precursor-miRNA, precursor form)로 바뀐 후 엑스포틴(exportin)에 의해서 핵을 빠져 나와 다이서(Dicer)에 의해 약 22bp 정도 길이의 성숙된 형태로 바뀌게 되고 이는 RISC (RNA interference silencing complex)와 결합하여 기능을 나타내게 된다.
본 발명에서 이용할 수 있는 마이크로RNA-1236은 인간을 포함한 동물, 예를 들어 원숭이(monkeys), 돼지(pigs), 말(horses), 소(cows), 양(sheeps), 개(dogs), 고양이(cats), 생쥐(mice), 토끼(rabbits) 등으로부터 유래할 수 있으며, 바람직하게는 인간 유래의 마이크로RNA-1236, 마이크로RNA-1236-G 또는 마이크로RNA-1236-U이지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 사용되는 마이크로RNA-1236은 이를 구성하는 올리고뉴클레오티드의 작용성 등가물, 예를 들어, 마이크로RNA-1236 올리고뉴클레오티드의 일부 염기서열이 결실(deletion), 치환(substitution) 또는 삽입(insertion)에 의해 변형되었지만, 마이크로RNA-1236 핵산분자와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체(variants) 및 모방체(mimic)를 포함하는 개념이다.
또한, 본 발명의 마이크로RNA-1236 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태로 존재할 수 있다. 성숙한 마이크로RNA 분자는 주로 단일 가닥으로 존재하지만, 전구체 마이크로RNA 분자는 주로 이중가닥 부분을 형성할 수 있는 적어도 부분적으로 자가-상보적인(예를 들어 스템- 및 루프-구조)이다. 또한, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 RNA, DNA, PNA(peptide nucleic acids), 또는 LNA(locked nucleic acid) 같은 형태로 구성될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 '진단'은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 난소과립막세포암 또는 자궁내막암의 발병 가능성 또는 발병 여부를 확인하는 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 '진단용 바이오 마커, 진단하기 위한 마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)'는 암세포를 정상세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 세포에 비하여 난소과립막세포암 또는 자궁내막암을 가진 세포에서 그 기능 또는 발현이 억제 또는 촉진 양상을 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다.
마이크로RNA-1236은 난소과립막세포암 및 자궁내막암 세포에서 과발현되어 변형된 FOXL2 mRNA 및 LRIG2 mRNA를 선택적으로 분해함으로써, 상기 세포에서 변형된 FOXL2 mRNA 및 LRIG2 mRNA 발현 수준은 마이크로RNA-1236과 반비례 관계에 있으므로, 난소과립막세포암 또는 자궁내막암 진단 마커로 이용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 마이크로RNA-1236의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 난소과립막세포암 또는 자궁내막암 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 '마이크로RNA-1236의 발현 수준을 측정하는 제제'란 세포 내의 마이크로RNA-1236의 발현 수준을 확인함으로써 마커의 검출에 사용될 수 있는 분자를 의미한다. 본 발명에서 마이크로RNA-1236 발현 수준 측정 제제로서 마이크로RNA-1236에 특이적으로 결합하는 안테센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머, 프로브, 또는 항체를 사용할 수 있으며, 유전자 발현 정도를 측정하는데 이용되는 공지의 방법, 예를 들면 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하거나, 프로브를 이용한 혼성화 반응을 통하여 실시하여 마이크로RNA-1236 발현 수준을 측정할 수 있다. 또한, 상기 마커 조성물을 포함하는 키트에는 상기 측정 제제 이외에도 검출을 용이하게 하는 당업계에 공지된 여러 도구, 시약, 예를 들어 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함될 수 있다.
본 발명에서 '마이크로RNA-1236 발현수준 측정'은 난소과립막세포암 또는 자궁내막암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 난소과립막세포암 및/또는 자궁내막암 마커 유전자의 마이크로RNA-1236 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 마이크로RNA-1236의 양을 측정한다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블롯팅(Northern blotting), DNA칩 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명에 따른 상기 마이크로RNA-1236의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 난소과립막세포암 또는 자궁내막암 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 제제는 상기 마이크로RNA-1236에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 세트, 프로브, 또는 항체일 수 있다.
또한, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 키트는 RT-PCR 키트 또는 DNA 칩 키트이다.
또한, 상기 난소과립막세포암 또는 자궁내막암 진단용 키트는 분석방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다.
예컨대, 상기 진단 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 키트일 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 각 마커 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오티드로써, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp 의 길이이다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
또한, 상기 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로써, 본 발명은 (가) 환자의 생물학적 시료로부터 마이크로RNA-1236의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (나) 상기 마이크로RNA-1236의 발현 수준을 정상 대조군 시료의 마이크로RNA-1236의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 난소과립막세포암 또는 자궁내막암의 발병가능성 예측 또는 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
상기 마이크로RNA-1236의 발현 수준은 난소과립막세포암 또는 자궁내막암 의심 환자의 생물학적 시료로부터 측정할 수 있다. 상기 생물학적 시료에서 마이크로RNA-1236을 분리하는 과정은 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있으며 마이크로RNA-1236 수준은 다양한 방법으로 측정할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 '생물학적 시료'는 난소과립막세포암 또는 자궁내막암 발병에 의해 난소과립막세포암 또는 자궁내막암 바이오 마커인 마이크로RNA-1236 발현 수준이 차이나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액, 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
상기 검출 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 마이크로RNA-1236 발현량과 난소과립막세포암 또는 자궁내막암 의심환자에서의 마이크로RNA-1236 발현량을 비교할 수 있고, 난소과립막세포암 또는 자궁내막암 마커 유전자에서 마이크로RNA-1236으로의 유의한 발현량의 증가 여부를 판단하여 난소과립막세포암 및/또는 자궁내막암 의심 환자의 실제 난소과립막세포암 및/또는 자궁내막암 발병 여부의 진단 및 발병 가능성을 예측할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 마이크로RNA-1236의 발현 수준의 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction) 또는 실시간 중합효소 연쇄반응(real time polymerase chain reaction)으로 수행될 수 있다.
상기의 역전사효소 중합효소반응은 반응 후 전기영동하여 밴드의 패턴과 두께를 확인함으로써 난소과립막세포암 또는 자궁내막암 진단 마커로 사용되는 유전자의 마이크로RNA-1236 발현 여부와 정도를 확인 가능하고 이를 대조군과 비교함으로써, 난소과립막세포암 또는 자궁내막암의 발병 가능성의 예측 및/또는 발생 여부를 간편하게 진단할 수 있다. 한편, DNA 칩은 상기 난소과립막세포암 또는 자궁내막암 마커 유전자 또는 그 단편에 해당하는 핵산이 유리 같은 기판에 고밀도로 부착되어 있는 DNA 칩을 이용하는 것으로서, 시료에서 마이크로RNA-1236를 분리하고, 그 말단 또는 내부를 형광 물질로 표지된 cDNA 프로브를 조제하여, DNA 칩에 혼성화시킨 다음 난소과립막세포암 또는 자궁내막암의 발병 가능성 및 발병 여부를 판독할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 (가) 마이크로RNA-1236이 발현되는 세포에 후보 물질을 처리하는 단계; (나) 상기 세포 내에서 마이크로RNA-1236의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (다) 상기 (나) 단계의 측정 결과, 마이크로RNA-1236의 발현량이 후보 물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소되는 경우 상기 후보 물질을 난소과립막세포암 또는 자궁내막암의 예방 또는 치료용 물질로 판정하는 단계를 포함하는, 난소과립막세포암 또는 자궁내막암의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명의 스크리닝 방법은 후보 물질을 난소과립막세포암 또는 자궁내막암 세포에 처리한 후, 마이크로RNA-1236의 발현 수준을 측정하고, 마이크로RNA-1236의 발현량을 감소시키는 화합물을 선별함으로써, 마이크로RNA-1236 매개성 암, 구체적으로, 난소과립막세포암 및/또는 자궁내막암을 치료할 수 있는 물질을 간편하게 스크리닝할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 마이크로RNA-1236의 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction) 또는 실시간 중합효소 연쇄반응(real time polymerase chain reaction)으로 수행될 수 있다.
본 발명의 방법은 상술한 바이오 마커를 이용하여 치료제의 효과를 판정하므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
또한, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 안티-마이크로RNA-1236 올리고뉴클레오티드를 포함하는 항암 조성물을 제공한다.
본 발명의 큰 특징은 본 발명의 조성물이 안티-마이크로RNA-1236을 이용하여 난소과립막세포암 또는 자궁내막암 세포의 세포사멸(apoptosis)를 활성화하거나, 세포주기를 조절하거나, 세포의 이동을 감소시킴으로써 항암 효과를 갖는 것이다.
또한, 본 발명의 항암 조성물은 안티-마이크로RNA-1236 올리고뉴클레오티드 자체뿐만 아니라, 세포 내에서 안티-마이크로RNA-1236의 발현율을 증가시킬 수 있는 여타의 물질, 예를 들어 화합물, 천연물, 신규 단백질 등을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 '항암'은 암세포의 증식을 억제하거나 사멸하는 작용 및 암세포의 전이를 억제하거나 차단하는 작용을 의미하는 것으로, 암의 예방 및 치료 모두를 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 '예방'은 조성물의 투여로 암 형성을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미하는 것이며, '치료'란 조성물의 투여로 상기 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하는 것이다.
본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 상기 암은 난소과립막세포암 또는 자궁내막암일 수 있다.
한편, 본 발명의 항암 조성물 내 안티-마이크로RNA-1236 올리고뉴클레오티드는 세포 내 발현을 위한 벡터에 포함되어 제공될 수 있다.
본 발명의 안티-마이크로RNA-1236은 난소과립막세포암 및/또는 자궁내막암을 발전시키는 마이크로RNA-1236의 활성을 저해함으로써 상기 항암 효과를 갖는다.
본 발명의 안티-마이크로RNA-1236 올리고뉴클레오티드는 DNA 및 DEAE-덱스트란의 복합체, DNA 및 핵 단백질의 복합체, DNA 및 지질의 복합체 등의 다양한 형질전환 기술을 이용하여 세포 내로 도입시킬 수 있는데, 이를 위해 상기 안티-마이크로RNA-1236 올리고뉴클레오티드는 세포 내로의 효율적인 도입을 가능하게 하는 전달체 내에 포함된 형태일 수 있다. 상기 전달체는 바람직하게는 벡터이며, 바이러스 벡터 및 비-바이러스 벡터 모두 사용 가능하다. 바이러스 벡터(viral vector)로서, 예를 들면, 렌티바이러스(lentivirus), 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 허피스바이러스(herpes virus) 및 아비폭스바이러스(avipox virus) 벡터 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 렌티바이러스 벡터이지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 렌티바이러스는 레트로바이러스의 일종으로 핵공(nucleopore)이나 완전한 핵막으로의 능동 도입을 가능하게 하는 사전-통합 복합체(바이러스"쉘(shell)")의 친핵성으로 인해 분열 세포뿐만 아니라 미분열 세포도 감염시킬 수 있는 특징이 있다.
본 발명의 상기 올리고뉴클레오티드는 표준 분자 생물학 기술, 예를 들어 화학적 합성 방법 또는 재조합 방법을 이용하여 분리 또는 제조하거나, 시판되는 것을 사용할 수 있다.
한편, 본 발명의 항암 조성물 내 안티-마이크로RNA-1236 올리고뉴클레오티드는 세포에 도입된 형태로 제공될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 '도입'은 형질감염(트렌스펙션; transfection) 또는 형질도입(트렌스덕션; transduction)에 의해 외래 DNA를 세포로 유입시키는 것을 의미한다. 형질감염은 칼슘 포스페이트-DNA 공침전법, DEAE-덱스트란-매개 형질감염법, 폴리브렌-매개 형질감염법, 전기충격법, 미세주사법, 리포좀 융합법, 리포펙타민 및 원형질체 융합법 등의 해당분야에 공지된 여러 방법에 의해 수행될 수 있다. 또한, 형질도입은 감염(infection)을 수단으로 하여 바이러스 또는 바이러스 벡터 입자를 사용하여 세포 내로 유전자를 전달시키는 것을 의미한다. 본 명세서에서 형질감염 및 형질도입은 외래 유전자를 세포로 유입시키는 의미로서 혼용될 수 있다.
이러한 방법을 통해 안티-마이크로RNA-1236 올리고뉴클레오티드가 도입된 세포는 안티-마이크로RNA-1236을 높은 수준으로 발현할 수 있게 되며, 이러한 세포를 암조직에 이식함으로써 암세포의 세포사멸을 유도하고 암의 침윤 및 전이를 억제시킬 수 있다. 그러므로, 안티-마이크로RNA-1236 올리고뉴클레오티드가 도입된 세포를 포함하는 본 발명의 조성물은 암 치료를 위한 세포치료제로 이용될 수 있다.
한편, 본 발명의 안티-마이크로RNA-1236 올리고뉴클레오티드를 포함하는 항암 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 담체와 함께 제제화될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 '약학적으로 허용가능한 담체'란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
본 발명의 안티-마이크로RNA-1236(anti-microRNA-1236) 올리고뉴클레오티드 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 항암 조성물은 이를 유효성분으로 포함하는 어떠한 제형으로도 적용가능하며, 경구용 또는 비경구용 제형으로 제조할 수 있다. 본 발명의 약학적 제형은 구강(oral), 직장(rectal), 비강(nasal), 국소(topical; 볼 및 혀 밑을 포함), 피하, 질(vaginal) 또는 비경구(parenteral; 근육내, 피하 및 정맥내를 포함) 투여에 적당한 것 또는 흡입(inhalation) 또는 주입(insufflation)에 의한 투여에 적당한 형태를 포함한다.
본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 경구 투여용 제형으로는, 예를 들어 정제, 트로키제, 로렌지, 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제로 제제화할 수 있다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제, 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제, 스테아르산 마스네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유를 포함할 수 있으며, 캡슐제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 더 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 비경구 투여용 제형으로는, 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사 등의 주사용 형태, 좌제 주입방식 또는 호흡기를 통하여 흡입이 가능하도록 하는 에어로졸제 등 스프레이용으로 제제화할 수 있다. 주사용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다. 좌제로 주입하기 위해서는, 코코아버터 또는 다른 글리세라이드 등 통상의 좌약 베이스를 포함하는 좌약 또는 체료 관장제와 같은 직장투여용 조성물로 제제화할 수 있다. 에어로졸제 등의 스프레이용으로 제형화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합될 수 있다.
본 발명의 안티-마이크로RNA-1236 올리고뉴클레오티드를 암세포에 처리하는 방법으로는 대개 마이크로RNA-1236 올리고뉴클레오티드를 세포에 도입시킬 수 있는 바이러스성 또는 비-바이러스성 운반 기술을 이용할 수 있다. 바이러스 운반 메카니즘은 렌티바이러스(lentivirus), 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 허피스바이러스(herpes virus) 및 아비폭스바이러스(avipox virus) 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 비-바이러스성 운반 메카니즘은 지질 매개 트랜스펙션, 리포좀, 면역리포좀, 리포펙틴, 양이온성 표면 양친매물질 및 이의 조합물을 포함할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예, 실험방법 및 실험재료를 제시한다. 그러나 하기의 실시예, 실험방법 및 실험재료는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예, 실험방법 및 실험재료에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실험방법 및 재료]
1. 세포 배양 및 시약
Dulbecco's Modified Eagle Medium-Ham's F12 (DMEM/F12) 배지 및 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) (Caisson, North Logan, UT, USA)에서 인간 성인형 GCT 유래의 KGN 세포 (Riken, Tsukuba, Japan) 및 유년형 GCT 유래의 COV434 세포 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) (Caisson)를 각각 배양하였다. 상기 배지에 10 % fetal bovine serum (FBS) 및 1 % 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin) (Caisson)을 첨가하여, 상기 세포를 5 % CO2에서 37℃ 조건하에서 배양하였다. 다른 시약은 달리 명시하지 않는 한 Sigma-Aldrich에서 구입하였다.
2. 피시험자 및 GCT 조직
서울 아산병원 및 분당 CHA 여성병원의 성인형 과립막세포암(AGCT, adult-type granulosa cell tumors) 환자 46명 및 유년형 과립막세포암(JGCT, juvenile-type granulosa cell tumors) 환자 4명을 대상으로 모든 피험자의 정보제공 동의를 받아 AGCT 및 JGCT 조직을 채취하여 FFPE(formalin-fixed paraffin-embedded) 블록을 분석하였다.
3. 유전체 DNA 및 RNA의 추출
FFPE의 총 RNA는 PureLinkTM FFPE Total RNA Isolation 키트 (Invitrogen)를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 추출하였다. TRIzol Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여, 제조사의 지침에 따라, 배양된 세포의 총 RNA를 분리하고, Intron G-DEXTM genomic DNA extraction 키트 (Intron, 성남, 한국)를 사용하여 탈 파라핀화된 조직 및 세포로부터 유전체 DNA를 추출하였다.
4. 파이로시퀀싱 (Pyrosequencing)
AGCT 환자의 cDNA 50 ng을 PyroMark PCR Kit (Qiagen, Hilden, Germany)을 이용하여 25-μL PCR에 사용하였다. 이때, 프라이머 세트는 순방향 프라이머 (Pyro-FOXL2-F [서열번호 1]: 5'-AGAAGGGCTGGCAAAATAGCATC-3') 및 역방향 바이오티닐화 프라이머 (Reverse Biotinylated Primer) (Pyro-FOXL2-R [서열번호 2]: 5'-CCGGAAGGGCCTCTTCAT-3'); 또는 역방향 프라이머 (Pyro-FOXL2-R2 [서열번호 3]: 5'-TAGTTGCCCTTCTCGAACATGTC-3') 및 순방향 바이오티닐화 프라이머 (Pyro-FOXL2-F2 [서열번호 4]: 5'-CATCGCGAAGTTCCCGTTCTA-3')을 사용하였고, PCR은 95 ℃를 15분 동안 유지한 후 [94 ℃에서 30 초, 60 ℃에서 30 초, 72 ℃에서 30 초]를 45회 반복 후 7분 동안 72 ℃를 유지하는 조건으로 수행하였다. Pyromark Q48 vacuum workstation guide (Qiagen)에 기술된 바와 같이, 바이오틸닐화 PCR 산물과 서열분석 프라이머 (FOXL2-seqF [서열번호 5]: 5'-CGCAAGGGCAACTACT-3' 또는 FOXL2-seqR2 [서열번호 6]: 5'-CCTTCTCGAACATGTCT-3')를 혼성화(hybridization) 시킨 후 sptretavidin Sepharose HP beads (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) 를 이용하여 PCR 산물을 정제하였다. 상기에 따라 획득한 pyrogram 데이터는 pyromark Q48 소프트웨어 (Qiagen)를 사용하여 분석하였다.
5. 대립유전자 특이적 PCR 분석 (Allele-specific PCR analysis)
이형 접합체 FOXL2 대립 형질의 증폭을 위해 402에서 변이 뉴클레오타이드의 위치에서 대립유전자 특이적 프라이머를 3' 미스매치로 설계하였다. FOXL2의 증폭에 사용된 PCR 프라이머는 FOXL2-279F (서열번호 7: 5'-GAATAAGAAGGGCTGGCAAAAT-3'), WT 특이적인 역방향 프라이머 (서열번호 8: 5'-CCTTCTCGAACATGTCTTCG-3'), 및 402C>G에 특이적인 역방향 프라이머 (서열번호 9: 5'-CCTTCTCGAACATGTCTTCC-3')를 포함한다. GAPDH의 증폭을 위해, GAPDH-F (서열번호 10: 5'-AGGGGCCATCCACAGTCTT-3') 및 GAPDH-R (서열번호 11: 5'-AGCCAAAAGGGTCATCATCTCT-3')을 사용 하였다. PCR 산물을 전기 영동으로 1.5 % 아가로스겔에서 분리하고 자외선 하에서 시각화하였다.
6. 실시간 양적 역전사 중합연쇄반응 (Reverse transcription and quantitative real-time PCR : RT-qPCR)
Nanodrop 2000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA)을 사용하여 추출된 total RNA의 품질과 양을 확인한 후 iScript cDNA 합성 키트 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. RT-qPCR은 CFX-96 Thermal Cycler and Detection System (Bio-Rad Laboratories)에서 수행되었다.
FOXL2 및 GAPDH 증폭을 위하여 대립유전자 특이적 PCR 분석에서 이용된 프라이머와 동일한 프라이머를 RT-qPCR 분석에 사용하였다. RT-qPCR 분석에 사용된 다른 PCR 프라이머의 구체적 정보는 하기와 같다. ZEB2-F (서열번호 12: 5'-CAAGAGGCGCAAACAAGC-3'), ZEB2-R (서열번호 13: 5'-GGTTGGCAATACCGTCAT-3'), Bcl-2-F (서열번호 14: 5'-GTGGAGGAGCTCTTCAGGGA- 3'), Bcl-2-R (서열번호 15: 5'-AGGTGCCGGTTCAGGTACTC-3'), p21-F (서열번호 16: 5'-TGTCCGTCAGAACCCATGC-3'), p21-R (서열번호 17: 5'-AAAGTCGAAGTTCCATCGCT-3'), FIS-1-F (서열번호 18: 5′-ACCTGGCCGTGGGGAACTACC-3′), FIS-1-R (서열번호 19: 5'-AGTTCCTTGGCCTGGTTGTTCTGG-3'), AFP-F (서열번호 20: 5'-CACGGATCCAACTTGAGGCTGTCATTGC-3') 및 AFP-R (서열번호 21: 5'-CGGAATTCGATAAGGAAATCTCACATAAAAGTC-3').
LRIG2 증폭을 위해 사용된 PCR 프라이머의 정보는 하기와 같다. LRIG2-F[서열번호 22]: 5’-AAATGCAGCGGAATGGAATT-3’; LRIG2-R[서열번호 23]: 5’-CCCCTTGTTTACTCGTGTAA-3’. qRT-PCR은 Biosystems SYBR green PCR master mix (Bio-Rad Laboratories)을 사용하여 10 μl의 최종 샘플을 기준으로 수행되었다.
유전자 발현 수준은 ΔΔCt 방법을 사용하여 정량화하였으며, 모든 프라이머는 Cosmogenetech (Seoul, Korea)에서 구입하였다. miRNA 분석을 위해 TaqMan MicroRNA Reverse Transcription kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)와 TaqMan MicroRNA Assay kit (Applied Biosystems, hsa-miR-1)의 역전사 프라이머를 사용하여 약 10 ng의 total RNA를 역전사 시켰다. 1236 [분석 ID: 002761]; RNU6B [분석 ID: 001093]). RT-qPCR은 TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) 및 TaqMan MicroRNA Assay kit의 TaqMan 프로브를 사용하여 CFX-96 Thermal Cycler and Detection System에서 제조사의 지침에 따라 수행하였으며, miRNA 발현 수준은 내인성(endogenous) RNU6B에 대해 정상화하였다.
7. mRNA 붕괴율
mRNA 붕괴율(decay rate)을 평가하기 위해 세포 배양 배지에 5 μg/mL actinomycin D를 첨가하여 RNA 합성을 종료시켰다. actinomycin D를 첨가한 후 각각 0, 0.5, 1, 2, 4, 및 8 시간이 경과한 때에 세포를 수확하고 TRIzol 시약을 사용하여 총 RNA를 분리하였다. mRNA 수준은 상기 기재된 바와 같이 실시간 PCR에 의해 결정하였다.
8. miRNAs 및 antisense miRNAs
Mature miR-1236 (서열번호 24: 5'-CCUCUUCCCCUUGUCUCUCCAG-3'), miR-1236-G (서열번호 25: 5'-CCUCUUCGCCUUGUCUCUCCAG-3'), miR-1236-U (서열번호 26: 5'-CCUCUUCUCCUUGUCUCUCCAG-3')의 센스 가닥 서열, 및 Non-specific control RNA (서열번호 27: 5'-CCUCGUGCCGUUCCAUCAGGUAGUU-3')는 Genolution Pharmaceuticals, Inc. (Seoul, Korea)에서 구입하였다. anti-miR-1236 (서열번호 28: 5'-CTGGAGAGACAAGGGGAAGAGG-3'), anti-miR-145 (서열번호 29: 5'-AGGGATTCCTGGGAAAACTGGAC-3'), anti-miR-204 (서열번호 30: 5'-AGGCATAGGATGACAAAGGGAA-3'), anti-miR-423-3p (서열번호 31: 5′-ACTGAGGGGCCTCAGACCGAGCT-3'), anti-miR-484 (서열번호 32: 5'-ATCGGGAGGGGACTGAGCCTGA-3'), 및 음성 대조군 (서열번호 33: 5'-GTGTAACACGTCTATACGCCCA-3'의 랜덤 서열을 갖는 22-mer 스크램블된 프로브)은 Cosmogenetech에서 구입하였다.
9. RNA interference
FOXL2 (siFOXL2)에 대한 siRNA 표적 서열[서열번호 34]은 5'-GGCAUCUACCAGUACAUCAdTdT-3'이며, control siRNA의 서열[서열번호 35]은 5'-CCUACGCCACCAAUUUCGU-3'으로 하였다. 모든 siRNA는 Bioneer에서 구입하였으며, 센스 및 안티센스 올리고뉴클레오티드를 어닐링 완충액 (Bioneer)의 존재하에 어닐링시켰다.
10. 면역블롯팅 분석 (Immunoblot analysis)
Lipofectamine 2000 (Invitrogen)을 사용하여 특정 플라스미드 또는 올리고뉴클레오티드를 KGN 세포 (1×106) 및 COV434 세포 (0.3×106)에 트렌스펙션(transfection)시켰다. 세포 용해물(lysate)을 제조하고 각각의 항체로 면역블롯팅하기 위해 SDS-PAGE를 수행하였다. 막 상에있는 단백질 신호는 ChemiDoc XRS + System Imager (Bio-Rad Laboratories)를 사용하여 검출하였고, 각 구간의 강도는 Quantity One software (Bio-Rad Laboratories)를 사용하여 정량화하였다. 본 발명의 명세서 전체에 걸쳐 제시된 모든 면역 블롯 이미지에 대해, 목적 단백질의 추정 분자량에 따라 막을 절단하고 항체로 표시된 프로빙 하였다. 모든 절단된 도트는 동일한 실험 조건 하에서 수행되었다. 본 실험에서 사용된 항체는 토끼의 항체로서, anti-FOXL2 및 anti-GAPDH (sc-25778; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)을 사용하였다.
11. 발광효소분석 (Luciferase assays)
11-1. pGL3-FOXL2 벡터
miRNA의 인식부위로 추정되는 부위 및 402 뉴클레오티드 잔기를 포함하는 FOXL2의 231-bp 코딩 영역을 KGN 세포의 유전체 DNA로부터 증폭시켰다. 증폭된 단편을 CDS 또는 루시퍼라아제(luciferase) 유전자의 CDS 및 3'-UTR의 NcoI 또는 XbaI 부위의 pGL3-control 벡터 (Promega, Madison, WI, USA)에 삽입하여 pGL3-CDS-FOXL2s 및 pGL3-UTR-FOXL2s을 제조하였다. Lipofectamine 2000 (Invitrogen)을 사용하여 KGN 세포 (4×105)에 pCMV-β-galactosidase (Clontech, Mountain View, CA, USA) 및 miRNA를 트렌스펙션 하였다. 이어서, 상기 트렌스펙션된 세포를 DMEM/F12 배지를 포함하는 12-웰 플레이트에서 48 시간 동안 배양하였다. 루시퍼라아제 활성은 Luciferase Assay System 키트 (Promega)를 사용하여 측정하였다. 발광은 FlexStation3 Microplate Reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 측정하였다. 결과는 β-gal 발현에 대한 정상화 후에 배율 변화의 상대적인 루시퍼라아제 활성으로 표현하였다. 모든 데이터는 독립적인 실험을 3회 수행하고 그 평균 ± SEM으로 표현하였다.
11-2. pGL3-LRIG2 벡터
miR-1236과 결합부위로 추정되는 영역을 포함하는 야생형(WT) 3'-UTR을 PCR을 통해 증폭하고, pGL3-control 벡터에 삽입하여 Wt-pGL3-LRIG2-3′-UTR vector (WT 벡터)을 제조하였다. 그리고 miR-1236과 결합부위로 추정되는 영역을 포함하는 돌연변이(Mut) LRIG2의 3'-UTR은 돌연변이를 제조하기 위한 프라이머를 사용하여 LRIG2 3'-UTR에서 miR-1236 표적 부위의 특이적 돌연변이 LRIG2의 3'-UTR을 제조하여 증폭하였고, 증폭 산물을 pGL3-control 벡터에 삽입하여 Mut-pGL3-LRIG2-3'-UTR vector (Mut 벡터)를 제조하였다. WT 증폭을 위하여 Forward [서열번호 36]: 5'-gctctagaagctcatcaaaaatgtgcagc-3', Reverse [서열번호 37]: 5'-gctctagattcccagaaggctccaaagtt-3' 프라이머를 사용하였고, Mut 증폭을 위하여 Forward [서열번호 38]: 5'-gtcccttctcgtcacattgctgcttaacatg-3', Reverse [서열번호 39]: 5'- gttaagcagcaatgtgacgagaagggacaagcagatgcac-3' 프라이머를 사용하였다.
이어서, 96-well plate에서 80% confluency로 배양한 Hec1A 세포에 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)을 사용하여, WT 벡터 또는 Mut 벡터와 함께 20 nM miRNA NC, miR-1236 mimic, anti-miR-NC, 또는 anti-miR-1236로 공동-트렌스펙션(co-transfection)을 수행하고, 48시간 동안 배양하였다. 루시퍼라아제 활성은 Dual Luciferase Reporter Assay 시스템 (Promega Corporation)을 이용하여 측정하였다.
12. 세포 생존력 측정 (Cell viability assay)
KGN 세포 (1×104) 및 COV434 세포 (0.3×104)를 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)을 사용하여 트렌스펙션 후, CellTiter-Glo assay (Promega)로 세포 생존력을 측정하였다. 데이터는 3 번의 독립적인 실험의 평균 ± SEM으로 나타내었다.
13. 세포사멸 분석 (Apoptosis analysis)
트렌스펙션하고 48 시간 후 FITC Apoptosis Detection Kit II (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 사용하여 KGN 세포 (1×106)를 FITC-conjugated Annexin-V로 염색하였다. 이어서, 상기 세포를 FACSCalibur flow cytometer (BD Biosciences)를 사용하여 유동 세포 계측법으로 분석하였다. 데이터는 propidium iodide (PI) 양성이거나 음성인 annexin V 양성 세포의 절대 백분율로 표시하였다. 데이터는 3 번의 독립적인 실험의 평균 ± SEM으로 나타내었다.
14. 세포주기 분석 (Cell cycle analysis)
KGN 세포 (1×106)를 획득하고 차가운 PBS로 2 회 세척하고 4 ℃에서 최소 1 시간 동안 70 % 에탄올로 고정시켰다. 고정 세포를 세척하고, 100 ㎍/mL RNase A를 함유하는 PBS에 현탁시키고, 37 ℃에서 30 분 동안 배양하였다. 그리고, 상기 세포를 50 ㎍/mL PI로 염색하여 FACSCalibur flow cytometer 로 분석하였다. 데이터는 3 번의 독립적인 실험값의 평균 ± SEM으로 나타내었다.
15. 세포 이동 분석 (Cell migration assay)
주화성 이동 분석(chemotaxis migration assay)은 Transwell Permeable Supports (8 ㎛ pore size, 6.5 mm Insert, Corning-Costar, Lowell, MA, USA)를 사용하여 수행되었다. KGN 세포 (1×106) 및 COV434 세포 (0.3×106)에 상기 플라스미드 (pcDNA3 및 pcDNA3-Flag-FOXL2) 또는 올리고뉴클레오티드로 트렌스펙션한 후, 24 시간 동안 배양하고, 상기 세포를 DMEM/F12 또는 DMEM 및 1 % FBS를 함유하는 상부 챔버에 2×105 세포/웰의 밀도로 플레이팅하였다. 하부 챔버는 화학 유인 물질로서 DMEM/F12 또는 DMEM 및 10 % FBS를 함유하였다. 6 시간 배양 후, 세포 및 배지를 상부 챔버로부터 제거하고, 이동된 세포를 5 % 글루타르알데히드(glutaraldehyde)로 20 분 동안 고정시키고 20 분 동안 3 % 크리스탈 바이올렛(crystal violet)으로 염색시켰다. 이동된 세포의 이미지는 명시야 현미경 하에서 ×100 배율로 촬영하였으며, 정량은 챔버 당 5 개의 무작위 필드에서 이동된 세포 수를 계수하여 ×200 배율의 광학 현미경으로 촬영하여, 이동된 세포를 영상화하였다 (배율 100 배). 정량화된 결과는 3번의 독립적인 실험값의 평균 ± SEM으로 나타내었다.
16. In vitro 에서의 전사(transcription)
WT 및 402C>G FOXL2 mRNA의 402 뉴클레오티드 잔기를 포함하는 230 bp CDS 서열의 시험관내 전사는 MegashortScriptTM T7 키트 (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)를 사용하여 수행되었다. T7-FOXL2 DNA 주형을 생성하기 위하여, pCMV-FOXL2-WT 및 pCMV-FOXL2-C134W을 주형으로 사용하였으며, T7 프로모터 서열 T7-FOXL2-F (서열번호 40: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGGGCTGGCAAAATAGCA- 3') 및 T7-FOXL2-R (서열번호 41: 5'-GGCGCCTCCGGCCCCGA-3')을 포함하는 프라이머 세트를 이용하여 PCR로 증폭하였다. RNA를 T7 RNA 중합 효소를 사용하여 시험관 내에서 전사시켰다.
17. In vitro 에서 miR-1236 과 FOXL2 mRNA간의 어닐링(annealing) 분석
5'말단에 32P (PerkinElmer, Boston, MA, USA)로 표지된 miR-1236 (0.5nM)을 WT 또는 402C>G FOXL2의 mRNA의 농도를 각각 0, 2.5, 12.5, 25, 및 50 mM로 증가시켜 배양하였다. 65 ℃에서 5 분 동안 하이브리드화 버퍼(100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7.4 및 10 mM MgCl2)에 용해시킨 다음 천천히 실온으로 냉각시켰다. 상기 용액의 분취액을 1 부피 (v)의 정지 완충액 (pH 7.4, 10mM EDTA, 2 % (v/v) SDS, 8M urea, 0.025 % (v/v) bromophenol blue)의 20mM Tris- 6 % 천연 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분석하였다. FOXL2의 밴드 강도는 형성된 miRNA 복합체를 phosphorimager와 OptiQuant 소프트웨어 (Packard, Meriden, CT, USA)를 사용하여 검출하고 정량화하였다.
18. In vivo 에서 FOXL2 mRNAs와 RISC의 결합 확인
대조군 miRNA 또는 miR-1236-G (10 nM)로 형질 감염된 KGN 세포 (2×107)를 pH 7.4의 버퍼(150 mM KCl, 0.5 % NP-40, 2 mM EDTA, 1 mM의 25 mM Tris-HCl NaN, 0.5 mM DTT, RNase 저해제, 0.05 % Tween20 및 protease 저해제 (GeneDEPOT, Barker, TX, USA))에서 용해하고, 4,500 x g에서 4 분간 원심 분리하였다. 이후, Dynabeads 단백질 G (Invitrogen)를 실온에서 rotator로 2 시간 동안 rat-anti-human AGO2 항체 (11A9; Helmholtz Zentrum Mㆌnchen, Germany) 또는 anti-IgG (sc-2026; Santa Cruz Biotechnology)와 미리 배양하였다. 이어서 항체가 코팅된 비드(beads)를 KGN 용해물과 함께 4 ℃에서 2 시간 동안 배양하였다. 배양 후, 비드를 완충액 (300 mM KCl, 50 mM Tris-HCl pH 7.4, 1 mM MgCl2, 0.1 % NP-40, 0.05 % Tween20)으로 3 회 세척하였다. 상기에 따라 RNA 침전물을 페놀 : 클로로포름 (5 : 1, pH 4.3)을 사용하여 추출하고, aqueous phase상에서 클로로포름으로 재 추출한 다음, 10 % 3M NaOAc (pH 5.2)의 존재 하에 이소프로판올로 침전시키고, 70 % 에탄올로 2회 세척하였다. 정제된 RNA는 역전사 효소 및 402C>G 부위의 하류 영역에 결합하는 FOXL2-430-R 프라이머 (서열번호 42: 5'-GGTAGTTGCCCTTCTCGAAC-3')를 이용하여 역전사 시켰다. 이어서, cDNA 생성물을 FOXL2-279F 프라이머를 사용하여 FOXL2 대립유전자 특이적 PCR 분석에 사용하였다.
20. miR-1236 knockout 세포주 제작
miR-1236 KO(knockout) 세포주는 Ran et al의 프로토콜에 따라 제작하였다. 구체적으로, 먼저 Cas9 (D10A) nickases을 코딩하는 벡터를 제조하기 위하여, PCR을 통해 pSpCas9n(BB)-2A-GFP (Addgene, Cambridge, MA, USA)에 돌연변이를 유도하였다. 상기 돌연변이를 위해 사용된 프라이머 정보는 하기와 같다: D10A-F (서열번호 43: 5′-TAGAGGTACCCGTTACATAAC-3′), D10A-R (서열번호 44: 5′-CTGAAGATCTCTTGCAGATAG-3′), Mut-D10A-F (서열번호 45: 5′-TACAGCATCGGCCTGGCCATCGGC-3′), 및 Mut-D10A-R (서열번호 46: 5′-GGTGCCGATGGCCAGGCCGATGCT-3′).
CRISPR DESIGN (http://crispr.mit.edu/)을 이용하여 miR-1236* 영역 (sgRNA-miR-1236-1 및 -2) 또는 miR-1236 영역 (sgRNA-miR-1236-3 및 -4)에 인접한 motif(PAM) 서열을 표적으로 하는 4개의 가이드 RNA (guide RNA)를 설계하였다,
miR-1236* 또는 miR-1236을 표적으로 하는 플라스미드 벡터를 제조하기 위하여, pX458(D10A)-miR-1236-5p 또는 pX458(D10A)-miR-1236-3p 이중 가이드 올리고뉴클레오티드 프라이머를 각각 vector pX458(D10A)에 삽입하였다. 이어서, 100 mm 접시에서 배양한 KGN 또는 COV434 세포 (1 × 106)를 5 μg의 CRISPR 플라스미드 벡터로 트렌스펙션 하였다. 트렌스펙션된 세포를 24시간 동안 배양하여 수확하고, PBS(phosphate buffered saline: Ca2 +/Mg2 +-free, 1 mM EDTA, 25 mM HEPES pH 7.0, 및 heat-inactivated 1% FBS을 포함)로 현탁시킨 후, BD FACSAria II cell sorter (BD Bioscience, San Jose, CA, USA)을 이용하여 GFP 신호를 기반으로 하는 유동세포 계측법으로 분류하였다. 분류된 세포는 96-well plates의 각 웰 단위로 재배양 하였다.
21. 동물실험 모델
상기 실험방법 11에 의해 제작된 miR-1236-/- KGN 세포주를 마우스에 이식(xenotransplantation)하여 FOXL2 발현 정도와 종양생성 정도를 확인하고자 하였다. 보다 구체적으로, miR-1236이 knockout된 KGN 세포(5×106)와 control 세포를 수확하고, 100 μl의 PBS 및 materigel (1:1)에 재현탁시킨 후 각 마우스(seven-week-old female BALB/c nude mice- control; n=8, miR-1236-/-; n=8)의 양 옆구리에 접종한 후 2개월간 사육하였다. 이어서, 각 마우스를 희생시킨 후 종양 생성 여부를 확인하고, 장에 형성된 결절의 수를 계측하였다.
22. 통계 분석
Student-Newman-Keuls 테스트를 사용하여 값의 다중 비교 분석을 수행하고, SAS 버전 9.2 (SAS Institute, Cary, NC, USA) 및 SigmaPlot (Systat Software, San Jose, CA, USA). 상기 데이터들은 평균 ± SEM으로 표시하고, p <0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
[실시예]
실시예 1. KGN 세포에서 miR-1236의 변형된 FOXL2 mRNA 분해능 확인
변형된 FOXL2 mRNA의 CDS에서 402C>G 유전자좌를 표적으로하는 miR-1236의 능력을 확인하기 위해, 루시퍼라아제 리포터 구조물을 개발하였다. 구체적으로, 도 3에 나타낸 바와 같이, 변형된 FOXL2 또는 WT FOXL2의 상응하는 단편의 402C>G 유전자좌를 함유한 231-bp DNA 단편을 루시퍼라아제 유전자의 CDS에 인-프레임(in-frame)으로 삽입하여 대립유전자 특이적인(allele-specific) 성질을 갖는 리포터를 제조하였다.
그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이, miR-1236의 트렌스펙션은 WT FOXL2 서열을 포함하는 루시퍼라아제 리포터의 활성에 영향을 주지 않으면서 402C>G FOXL2 변이체 서열을 보유하는 루시퍼라아제 리포터의 활성을 70 % 감소시키는 것을 발견하였다.
동일한 231bp의 FOXL2 단편이 루시퍼라아제 유전자의 3'UTR 위치에 삽입되었을 때 (실험방법 11 참조), 상기 결과와 유사하게 리포터의 대립유전자 특이적 억제 성질이 확인되었다. FOXL2 mRNA에서 miR-1236과 변형 궤적 간 상호작용의 특이성을 miR-1236의 두 가지 돌연변이를 사용하여 추가로 시험하였다.
그 결과, 도 4b에 나타낸 바와 같이, miR-1236-G는 402C>G FOXL2 mRNA에서 7-mer seed match를 WT FOXL2 mRNA로 이동시켰지만, 도 4c에 나타낸 바와 같이, miR-1236-U의 seed sequence는 402C>G 또는 WT FOXL2 mRNA 와 일치하지 않았다. 구체적으로, WT 리포터에 영향을 주지 않으면서 돌연변이 402C>G FOXL2 리포터를 억제하는 miR-1236의 선택적 효과는 402C>G 돌연변이 리포터에 영향을 주지 않으면서 WT 리포터를 억제하는 miR-1236-G 돌연변이체에 의해 완전히 역전되었다. 대조적으로, miR-1236-U 돌연변이체는 402C>G 돌연변이체 또는 WT FOXL2 리포터 상에 어떠한 억제 효과도 발휘하지 않았다. 따라서, 상기 결과는 402C>G 유전자좌가 FOXL2 대립유전자의 발현에 대한 miR-1236의 효과를 구별하는 데 중요하다는 것을 나타낸다.
실시예 2. KGN 세포에서 miR-1236의 변형된 FOXL2 mRNA 특이적 결합 확인
WT FOXL2 전사체 보다 402C>G FOXL2 전사체에 대한 miR-1236의 특이적 결합은 시험관내 결합 분석에 의해 생화학적으로 확인되었다. 구체적으로, WT 또는 402C>G FOXL2 mRNA의 230nt 염기 서열의 합성 전사체를 방사성 표지된 miR-1236과 함께 배양하고 RNA 이중 가닥의 형성을 모니터링 하였다.
그 결과, 도 5a에서 확인할 수 있는 바와 같이, miR-1236은 402C>G FOXL2 전사체와 이중 가닥을 우선적으로 형성하였다.
이어서, 대립유전자 특이적인(allele-specific) RT-PCR을 이용하여 AGO2-immunoprecipitates로부터 FOXL2 mRNA를 분석함으로써 KGN 세포에서 402C>G FOXL2 mRNA와 RISC의 직접 연관성을 확인하였다.
그 결과, 도 5b에서 확인할 수 있는 바와 같이, 변형된 FOXL2 mRNA의 단편은 쉽게 검출되었지만, WT mRNA의 단편은 검출되지 않았다. 상기 결과는 RISC가 변형된 mRNA와 특이적으로 결합함을 나타낸다. 구체적으로, miR-1236-G의 KGN 세포로의 형질 감염은 WT FOXL2 mRNA의 RISC로의 도입을 유도하여 WT FOXL2 mRNA 및 FOXL2 단백질의 수준을 감소시켰다. 상기 결과에 따라 miR-1236은 전반적으로 402C>G 유전자좌를 표적 부위로 인식함으로써 FOXL2 변이종에 선택적으로 작용하여 FOXL2 발현의 대립유전자 특이적 억제에 기여한다는 사실이 입증된다.
실시예 3. KGN 세포에 anti-miR-1236의 트렌스펙션에 따른 FOXL2 mRNA 발현 수준 상승 확인
miRNA 예측 도구(genie.weizmann.ac.il/pubs/mir07/mir07_prediction.html)를 사용하여 변형된 FOXL2 mRNA 서열을 분석함으로써, 돌연변이된 부위를 둘러싼 서열에 결합할 것으로 예측되었던 miRNA-1236를 얻었다. KGN 세포에 anti-miR-1236을 트렌스펙션하여 FOXL2의 발현 수준을 확인하였다.
그 결과, 도 6a에 나타낸 바와 같이, anti-miR-1236의 트렌스펙션(transfection)은 변형된 FOXL2 mRNA 수준을 대략 3.2 배 상승시키면서도, KGN 세포에서 WT FOXL2의 수준에 영향을 미치지 않음을 확인하였다. 나머지 4 개의 anti-miRNA는 변이체 또는 WT FOXL2의 mRNA 수준에 유의한 영향을 미치지 않았으며, 도 6b에 나타낸 바와 같이, anti-miR-1236의 트렌스펙션은 FOXL2의 단백질 수준을 증가시킴을 확인하였다. 상기 결과는 anti-miR-1236의 트렌스펙션을 통해 FOXL2 단백질 수준을 정상 수준으로 올림으로써, 항암효과를 얻을 수 있음을 시사한다.
한편, 도 7a에 나타낸 바와 같이, miR-1236 RNA mimic의 형질 감염은 WT mRNA의 수준에 영향을 미치지 않고 변이체 FOXL2 mRNA의 수준을 추가로 감소시키고, 결과적으로 도 7b의 왼쪽 패널에 나타낸 바와 같이, FOXL2 단백질의 발현 수준을 감소시켰다. 또한, 도 7b의 오른쪽 패널에 나타낸 바와 같이, KGN 세포에서 관찰된 것과는 달리, miR-1236의 COV434 세포로의 형질 감염은 FOXL2 단백질의 수준에 영향을 미치지 않았다. 이 결과는 변형된 FOXL2 mRNA에서 miR-1236의 특이적인 작용을 뒷받침한다. anti-miRNA 또는 mimic 올리고뉴클레오티드로 각각 트랜스펙션된 세포에서의 miR-1236의 효과적인 고갈 또는 과발현은 TaqMan 마이크로RNA 검정에 의해 확인하였다.
실시예 4. KGN 세포에서 miR-1236의 발암 활성 및 anti-miR-1236의 항암 활성 확인
KGN 세포로의 miR-1236의 형질 감염은 세포 생존력을 현저하게 향상 시켰지만, anti-miR-1236은 생존력을 감소시킴을 확인함에 따라, 본 실시예에서는 miR-1236의 발암 활성을 구체적으로 조사하였다.
그 결과, 도 8a에 나타낸 바와 같이, miR-1236 또는 anti-miR-1236을 트렌스펙션한 후 annexin-V-positive 세포사멸 세포 수가 각각 감소하고 증가하였으며, 도 8b에 나타낸 바와 같이, miR-1236으로 처리하면 S기로의 세포주기 진행이 가속화되는 반면, anti-miR-1236은 세포주기 정지를 유도하였고, 도 8c에 나타낸 바와 같이, FOXL2-silenced 세포에서 miR-1236 또는 anti-miR-1236의 형질 감염은 세포 생존력을 변화시키지 못하였다. 또한, 도 8d에 나타낸 바와 같이, miR-1236로 트렌스펙션은 세포이동을 촉진하였으며, anti-miR-1236로 트렌스펙션은 세포 이동을 억제하고, 상기 올리고뉴클레오티드의 이러한 효과는 FOXL2 고갈시 더 이상 관찰되지 않았다. 또한, 도 8e에 나타낸 바와 같이, COV434 세포에 miR-1236를 트렌스펙션한 경우 세포 생존력 및 세포 이동의 변화는 관찰되지 않았으며, FOXL2 단백질 발현에 영향을 미치지 않음을 확인함으로써, miR-1236의 402C>G 대립유전자 특이적인 발암 효과를 확인하였다. 상기와 같은 결과는, miR-1236은 FOXL2에 의존하여 KGN 세포에 영향을 미치고, FOXL2의 과발현이나 knockdown은 KGN 세포의 이동을 억제하거나 촉진하여 암세포의 전이성 특징에 FOXL2가 방어적인 역할을 반영함을 의미한다.
실시예 5. Hec1A 세포에서 miR-1236의 발암 활성 및 anti-miR-1236의 항암 활성 확인
도 2b에서 확인할 수 있는 바와 같이, 자궁내막암(Endometrial cancer, EM) 환자의 miR-1236의 발현 수준은 정상 그룹과 비교하여 월등히 높은바, miR-1236이 자궁내막암 세포에 미치는 영향 및 역할을 확인하기 위하여, 자궁내막암 세포주인 Hec1A 세포에 E2 (estradiol)를 100 nM을 처리하고 5일 동안 miRNA-1236의 발현 수준을 TaqMan MicroRNA assay를 이용하여 분석하고, miRNA-1236의 타겟 유전자로 추정되는 LRIG2 mRNA의 발현수준을 RT-qPCR로 확인하였다.
그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, E2를 처리한 Hec1A 세포에서 miR-1236의 발현 수준이 대조군과 비교하여 높음을 확인하였고, E2를 처리한 Hec1A 세포에서 LRIG2 mRNA 발현 수준이 감소함을 확인하였다. 상기 결과는, 자궁내막암 세포에서 miR-1236이 LRIG2 mRNA를 선택적으로 분해하여 세포주기 또는 세포사멸을 조절하는 LRIG2 단백질의 수준을 낮추어 발암 활성을 갖음을 암시한다.
보다 구체적으로, 자궁내막암 환자의 치료를 위해 사용되는 호르몬제 중 하나인 MPA (medroxyprogesterone acetate)를 Hec1A 세포에 10 μM 처리한 후 5일 동안 miR-1236의 발현 수준 및 LRIG2 mRNA의 발현 수준을 관찰하였다.
그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, MPA를 처리한 Hec1A 세포에서 miR-1236의 발현 수준이 감소함을 확인하였고, MPA를 처리한 Hec1A 세포에서 LRIG2 mRNA 발현 수준이 증가함을 확인하였다. 상기 결과는, 자궁내막암 세포에서 MPA가 miRNA-1236의 발현 수준을 낮추거나 그 활성을 억제함에 따라 세포주기 또는 세포사멸을 조절하는 LRIG2 단백질의 수준을 높임으로써 항암 효과를 나타냄을 암시한다.
또한, Hec1A 세포 (1×104)에 miR-1236 mimic, anti-miR-1236, 또는 음성 대조군을 트렌스펙션하고 48 시간 후 CellTiter-Glo assay (Promega)로 세포 생존력을 확인하였다.
그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, miR-1236 mimic을 트렌스펙션하여 miR-1236을 과발현시킨 경우 Hec1A 세포의 생존력이 증가하는 반면, anti-miR-1236 트렌스펙션하여 miR-1236을 knockdown한 경우 세포 생존력이 감소함을 확인할 수 있었다.
상기로부터, miR-1236와 anti-miR-1236에 의한 LRIG2의 발현 조절을 검증 하기 위하여, Hec1A 세포 (0.3×106 세포)를 Microporator MP-100 (Invitrogen Life Technologies)을 사용하여 60 mm 플레이트에 접종하고, 20nM의 miRNA NC, miR-1236 mimic, anti-miR-NC, 또는 anti-miR-1236으로 형질감염(transfection)을 수행하였다. 48시간 후 세포를 수확하고 배양된 세포의 총 RNA를 분리하여 RT-qPCR을 수행하여 LRIG2와 GAPDH의 발현수준을 측정하고 GAPDH 기준으로 LRIG2 mRNA의 발현정도를 확인하였다.
그 결과, 도 12a에 나타낸 바와 같이, miRNA-1236의 존재하에서 LRIG2의 발현은 감소하였으며, anti-miR-1236의 존재 하에서는 발현이 월등히 증가함을 확인할 수 있었다.
한편, miR-1236 또는 anti-miR-1236에 따른 LRIG2의 발현 조절 활성을 재확인하기 위하여, 루시퍼라아제 리포터 구조물을 개발하였다. 구체적으로, 도 12b에 나타낸 바와 같이, miR-1236과 결합부위로 추정되는 영역을 포함하는 야생형(WT) 3'-UTR 또는 변형된(Mut) LRIG2 3'-UTR을 pGL3-control 벡터에 삽입하여 Wt-pGL3-LRIG2-3′-UTR vector 및 Mut-pGL3-LRIG2-3'-UTR vector를 제조하고, miRNA NC, miR-1236 mimic, anti-miR-NC, 또는 anti-miR-1236와 함께 공동-트렌스펙션(co-transfection)하여, 루시퍼라아제 리포터 활성을 관찰하였다.
그 결과, 도 12c에 나타낸 바와 같이, miR-1236에 의해 WT-LRIG2의 발현 수준이 감소하고 anti-miR-1236에 의해 증가됨을 확인할 수 있었다. 한편, Mut-LRIG2의 경우 miR-1236과 anti-miR-1236의 영향을 받지 아니함을 확인할 수 있었다. 따라서 miRNA-1236이 LRIG2에 직접 결합하여 mRNA 발현을 조절함을 확인할 수 있었다.
실시예 6. In vivo에서 miR-1236의 발암 활성 확인
miR-1236의 발암활성을 in vivo에서 확인하기 위하여, control과 miR-1236-/- KGN 세포주를 제작하여 7주령의 암컷 BALB/c nude 마이스의 양 옆구리에 주입하고, 2개월 동안 사육하여 종양생성 여부와 장내의 결절(nodules)을 계수하였다.
그 결과, 도 13a에 나타낸 바와 같이, control은 장에 암의 전이가 일어나 종양 결절이 다수 형성된 반면, miR-1236-/- KGN 세포를 이식한 마우스의 장에서는 종양 결절이 적게 형성되어 있는 것을 확인할 수 있었다.
이어서, 마우스의 장에서 발생한 결절과 miR-1236 및 FOXL2의 발현과의 관계를 확인하기 위하여, 대립유전자 특이적 PCR 분석(allele-specific RT-qPCR)을 수행하였으며, 그 결과, 도 13b에 나타낸 바와 같이, 마우스의 종양 결절에서 miR-1236-/- 의 경우 control과 비교하여 현격하게 낮은 miR-1236 발현 수준을 나타냈으며, 도 13c에 나타낸 바와 같이, control과는 달리 miR-1236-/- 의 경우 변형된 FOXL2(402C>G)의 발현이 WT 수준으로 증가되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 miR-1236에 의하여 변형된 FOXL2(402C>G) 특이적으로 조절됨을 xenograft mouse model을 통해 다시 한번 확인할 수 있었다.
상기 결과는, 성인형 난소과립막세포암에서 FOXL2의 402C>G 돌연변이가 miR-1236의 대립유전자 특이적인 성질을 통해 변형된 FOXL2 mRNA의 극적인 불안정화를 유도하여 발암효과를 갖는 것을 보여준다. 또한 자궁내막암에서 miR-1236의 LRIG2 mRNA에 특이적인 분해를 통해 발암효과를 갖는 것을 보여준다. 상기에 따라, miR-1236을 난소과립막세포암 또는 자궁내막암의 진단 타겟으로 이용할 수 있으며, miR-1236의 발현 수준을 낮추거나 그 활성을 억제하는 물질을 확인하여 상기 암의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝할 수 있으며, anti-miR-1236을 이용하여 상기 암의 예방 또는 치료의 접근이 가능함을 알 수 있다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가지는 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> Chung-Ang University Industry-Academy Cooperation Foundation <120> Use of microRNA-1236 as a diagnostic marker and therapeutic agent of granulosa cell tumor or Endometrial cancer <130> MP18-095 <150> KR 1020170085722 <151> 2017-07-06 <160> 46 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pyro-FOXL2-F <400> 1 agaagggctg gcaaaatagc atc 23 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pyro-FOXL2-R <400> 2 ccggaagggc ctcttcat 18 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pyro-FOXL2-R2 <400> 3 tagttgccct tctcgaacat gtc 23 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pyro-FOXL2-F2 <400> 4 catcgcgaag ttcccgttct a 21 <210> 5 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FOXL2-seqF <400> 5 cgcaagggca actact 16 <210> 6 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FOXL2-seqR2 <400> 6 CCTTCTCGAACATGTCT 16 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FOXL2-279F <400> 7 gaataagaag ggctggcaaa at 22 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> wt-FOXL2-279R <400> 8 ccttctcgaa catgtcttcg 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mut-FOXL2-279R <400> 9 ccttctcgaa catgtcttcc 20 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH-F <400> 10 aggggccatc cacagtctt 19 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH-R <400> 11 agccaaaagg gtcatcatct ct 22 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZEB2-F <400> 12 caagaggcgc aaacaagc 18 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZEB2-F <400> 13 ggttggcaat accgtcat 18 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bcl-2-F <400> 14 gtggaggagc tcttcaggga 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bcl-2-R <400> 15 aggtgccggt tcaggtactc 20 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p21-F <400> 16 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25 ccucuucgcc uugucucucc ag 22 <210> 26 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-1236-U <400> 26 ccucuucucc uugucucucc ag 22 <210> 27 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Non-specific control RNA <400> 27 ccucgugccg uuccaucagg uaguu 25 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-miR-1236 <400> 28 ctggagagac aaggggaaga gg 22 <210> 29 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-miR-145 <400> 29 agggattcct gggaaaactg gac 23 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-miR-204 <400> 30 aggcatagga tgacaaaggg aa 22 <210> 31 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-miR-423-3p <400> 31 actgaggggc ctcagaccga gct 23 <210> 32 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-miR-484 <400> 32 atcgggaggg gactgagcct ga 22 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-control <400> 33 gtgtaacacg tctatacgcc ca 22 <210> 34 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siFOXL2 <400> 34 ggcaucuacc aguacaucat t 21 <210> 35 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> control siRNA <400> 35 ccuacgccac caauuucgu 19 <210> 36 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> wt_LRIG2_3prime-UTR_F <400> 36 gctctagaag ctcatcaaaa atgtgcagc 29 <210> 37 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> wt_LRIG2_3prime-UTR_R <400> 37 gctctagatt cccagaaggc tccaaagtt 29 <210> 38 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mut_LRIG2_3prime-UTR_F <400> 38 gtcccttctc gtcacattgc tgcttaacat g 31 <210> 39 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mut_LRIG2_3prime-UTR_R <400> 39 gttaagcagc aatgtgacga gaagggacaa gcagatgcac 40 <210> 40 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T7-FOXL2-F <400> 40 taatacgact cactataggg agggctggca aaatagca 38 <210> 41 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T7-FOXL2-R <400> 41 ggcgcctccg gccccga 17 <210> 42 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Claims (14)

  1. 난소과립막세포암 또는 자궁내막암 진단용 바이오 마커 조성물로서,
    상기 바이오 마커는 마이크로RNA-1236 올리고뉴클레오티드이며, 난소과립막세포암 또는 자궁내막암 환자에서 특이적으로 발현이 증가되는 것을 특징으로 하는, 난소과립막세포암 또는 자궁내막암 진단용 바이오 마커 조성물.
  2. 마이크로RNA-1236 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 난소과립막세포암 또는 자궁내막암 진단용 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 제제는 상기 마이크로RNA-1236에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 세트, 프로브, 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 난소과립막세포암 또는 자궁내막암 진단용 조성물.
  4. 마이크로RNA-1236 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 난소과립막세포암 또는 자궁내막암 진단용 키트.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 제제는 상기 마이크로RNA-1236에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 세트, 프로브, 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 난소과립막세포암 또는 자궁내막암 진단용 키트.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 키트는 RT-PCR 키트 또는 DNA 칩인 것을 특징으로 하는, 난소과립막세포암 또는 자궁내막암 진단용 키트.
  7. (가) 환자의 생물학적 시료로부터 마이크로RNA-1236의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (나) 상기 마이크로RNA-1236의 발현 수준을 정상 대조군 시료의 마이크로RNA-1236의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 난소과립막세포암 또는 자궁내막암의 발병가능성 예측 또는 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 (가) 단계의 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction) 또는 실시간 중합효소 연쇄반응(real time polymerase chain reaction)으로 수행되는 것을 특징으로 하는, 난소과립막세포암 또는 자궁내막암의 발병가능성 예측 또는 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법.
  9. (가) 마이크로RNA-1236이 발현되는 세포에 후보 물질을 처리하는 단계;
    (나) 상기 세포 내에서 마이크로RNA-1236의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (다) 상기 (나) 단계의 측정 결과, 마이크로RNA-1236의 발현량이 후보 물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소되는 경우 상기 후보 물질을 난소과립막세포암 또는 자궁내막암의 예방 또는 치료용 물질로 판정하는 단계를 포함하는, 난소과립막세포암 또는 자궁내막암의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝하는 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 (나) 단계의 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction) 또는 실시간 중합효소 연쇄반응(real time polymerase chain reaction)으로 수행되는 것을 특징으로 하는, 난소과립막세포암 또는 자궁내막암의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝하는 방법.
  11. 안티-마이크로RNA-1236 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 항암 조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 암은 난소과립막세포암 또는 자궁내막암인 것을 특징으로 하는, 항암 조성물.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 조성물은 상기 안티-마이크로RNA-1236 또는 이와 상보적인 서열을 포함하는 벡터; 또는 상기 벡터가 형질도입된 세포를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 항암 조성물.
  14. 제11항에 있어서,
    상기 조성물은 마이크로RNA-1236의 활성을 저해하는 것을 특징으로 하는, 항암 조성물.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20140072014A (ko) * 2011-06-16 2014-06-12 카리스 라이프 사이언스 룩셈부르크 홀딩스, 에스.에이.알.엘. 생물지표 조성물 및 방법

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Wang et al., Oncology reports, Vol.31., pp.1905-1910 (2014) 1부.* *

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