KR20140072014A - 생물지표 조성물 및 방법 - Google Patents

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KR20140072014A
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커크 브라운
트레이시 파우로우스키
데이비드 스페츨러
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카리스 라이프 사이언스 룩셈부르크 홀딩스, 에스.에이.알.엘.
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Abstract

표현형, 가령, 상태 또는 질환, 또는 질환의 단계 또는 진전을 확인하고, 질환, 상태, 질병 단계 및 상태의 단계에 대한 후보 처치 섭생을 선택하고, 그리고 치료 효과를 결정하기 위하여 진단, 요법-관련된 또는 예후 방법을 위하여 생물지표들을 평가할 수 있다. 체액으로부터 순환하는 생물지표들을 이용하여 생리학적 상태의 프로파일링 또는 표현형을 결정할 수 있다. 여기에는 핵산, 단백질, 그리고 순환하는 구조 가령, 소낭 및 핵산-단백질 복합체를 포함한다.

Description

생물지표 조성물 및 방법{BIOMARKER COMPOSITIONS AND METHODS}
교차 참조
본 출원은 2011년 6월 16일자로 제출된 미국 가특허 출원 61/497,895; 2011년 6월 20일자로 제출된 61/499,138; 2011년 6월 27일자로 제출된 61/501,680; 2011년 7월 8일자로 제출된 61/506,019; 2011년 7월 11일자로 제출된 61/506,606; 2011년 7월 11일자로 제출된 61/506,598; 2011년 7월 14일자로 제출된 61/507,989; 2011년 7월 25일자로 제출된 61/511,455; 2011년 8월 15일자로 제출된 61/523,763 그리고 2011년 8월 23일자로 제출된 61/526,623을 우선권으로 주장하며, 이들 모두는 전문이 여기에 참고자료로 편입된다.
본 출원은 2012년 6월 7일자로 제출된 국제 특허 출원 PCT/US2012/041387의 연속 출원이며, 이 출원은 2011년 6월 7일자로 제출된 미국 가특허 출원 61/494,196; 2011년 6월 7일자로 제출된 61/494,355; 그리고 2011년 7월 14일자로 제출된 61/507,989를 우선권으로 주장하며; 이들 모두는 전문이 여기에 참고자료로 편입된다.
본 출원은 2012년 2월 17일자로 제출된 국제 특허 출원 PCT/US2012/025741의 연속 출원이며, 이 출원은 2011년 2월 24일자로 제출된 U.S. 가특허출원 번호 61/446,313; 2011년 6월 27일자로 제출된 61/501,680; 2011년 4월 4일자로 제출된 61/471,417; 2011년 8월 15일자로 제출된 61/523,763; 그리고 2011년 2월 22일자로 제출된 61/445,273을 우선권으로 주장하며; 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 편입된다.
본 출원은 2011년 8월 18일자로 제출된 국제 특허 출원 PCT/US2011/048327의 연속 출원이며, 이 출원은 2010년 8월 18일자로 제출된 U.S. 가특허출원 번호. 61/374,951; 2010년 9월 2일자로 제출된 61/379,670; 2010년 9월 9일자로 제출된 61/381,305; 2010년 9월 15일자로 제출된 61/383,305; 2010년 10월 8일자로 제출된 61/391,504; 2010년 10월 15일자로 제출된 61/393,823; 2010년 11월 9일자로 제출된 61/411,890; 2010년 11월 17일자로 제출된 61/414,870; 2010년 11월 23일자로 제출된 61/416,560; 2010년 12월 10일자로 제출된 61/421,851; 2010년 12월 15일자로 제출된 61/423,557; 2010년 12월 29일자로 제출된 61/428,196를 우선권으로 주장하며; 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 편입된다.
본 출원은 또한 2011년 3월 1일자로 제출된 국제 특허 출원 PCT/US2011/026750의 연속 출원이며, 이 출원은 2009년 11월 12일자로 제출된 미국 특허 출원 일련 번호 12/591,226의 연속 출원이며, 이 출원은 2008년 11월 12일자로 제출된 미국 가출원 번호 61/114,045; 2008년 11월 13일자로 제출된 61/114,065; 2009년 2월 9일자로 제출된 61/151,183; 2009년 10월 2일자로 제출된 61/278,049; 2009년 10월 9일자로 제출된 61/250,454; 그리고 2009년 10월 19일자로 제출된 61/253,027을 우선권으로 주장하고; 그리고 이 출원은 또한 2010년 3월 1일자로 제출된 미국 가출원 번호 61/274,124; 2010년 6월 22일자로 제출된 61/357,517; 2010년 7월 15일자로 제출된 61/364,785을 우선권으로 주장하며; 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 편입된다.
본 출원은 또한 2011년 4월 6일자로 제출된 국제 특허 출원 PCT/US2011/031479의 연속 출원이며, 이 출원은 2010년 4월 6일자로 제출된 U.S. 가특허출원 번호 61/321,392; 2010년 4월 6일자로 제출된 61/321,407; 2010년 5월 6일자로 제출된 61/332,174; 2010년 5월 25일자로 제출된 61/348,214; 2010년 5월 26일자로 제출된 61/348,685; 2010년 6월 11일자로 제출된 61/354,125; 2010년 6월 16일자로 제출된 61/355,387; 2010년 6월 21일자로 제출된 61/356,974; 2010년 6월 22일자로 제출된 61/357,517; 2010년 7월 8일자로 제출된 61/362,674; 2010년 11월 12일자로 제출된 61/413,377; 2010년 4월 9일자로 제출된 61/322,690; 2010년 5월 13일자로 제출된 61/334,547; 2010년 7월 15일자로 제출된 61/364,785; 2010년 8월 2일자로 제출된 61/370,088; 2010년 9월 2일자로 제출된 61/379,670; 2010년 9월 9일자로 제출된 61/381,305; 2010년 9월 15일자로 제출된 61/383,305; 2010년 10월 8일자로 제출된 61/391,504; 2010년 10월 15일자로 제출된 61/393,823; 2010년 11월 9일자로 제출된 61/411,890; 그리고 2010년 11월 3일자로 제출된 61/416,560을 우선권으로 주장하며; 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 편입된다.
암과 같은 상태 및 질환들에 대한 생물지표들은 생물학적 분자들 가령, 단백질들, 펩티드들, 지질들, RNA, DNA 그리고 이의 변이 및 수정과 같은 것을 포함한다.
특이적 생물지표들, 가령 DNA, RNA 및 단백질들의 확인은 이상 또는 질환들의 진단, 예후, 또는 처치진단(처치진단)에 이용되는 생체특징(생체특징들)을 제공할 수 있다. 생물지표들은 순환하는 DNA, RNA, 단백질들, 및 소낭을 포함하는 체액에서 탐지할 수 있다. 순환하는 생물지표들은 단백질들, 가령 PSA 및 CA125, 그리고 핵산 가령 SEPT9 DNA 및 PCA3 메신져 RNA (mRNA)를 포함한다. 순환하는 생물지표들은 순환하는 소낭과 연합될 수 있다. 소낭(소낭)은 세포로부터 방출되며 그리고 혈액, 혈장, 혈청, 모유, 복수, 기관지폐포 세척액 그리고 소변을 포함하는 다수의 체액에서 발견되는 막에 싸인 구조들이다. 소낭은 단백질들, RNA, DNAs, 바이러스들, 그리고 프리온들의 운반 비이클로 세포간의 소통에 참여할 수 있다. MicroRNA는 메신져 RNA들의 전사 및 분해를 조절하는 짧은 RNA이다. MicroRNA는 체액에서 발견되며, 그리고 종양 세포들로부터 방출되는 소낭 안의 성분으로 관찰되었다. 소낭 및/또는 microRNA을 포함하는 질환과 연관된 순환하는 생물지표들의 분석은 질환 또는 이의 심각성의 탐지, 질환에 대한 경향, 뿐만 아니라 처치 결정을 하는데 도움이 될 것이다.
생물학적 시료 안에 존재하는 소낭은 생물지표들의 원천을 제공하는데, 가령, 이 지표들은 소낭 (소낭 페이로드)내에 존재하거나 또는 소낭의 표면에 존재한다. 소낭의 특징 (가령, 크기, 표면 항원들, 기원 세포의 결정, 페이로드)은 진단, 예후 또는 처치진단 정보(정보)를 또한 제공할 수 있다. 질환을 탐지하고 처치하는데 이용될 수 있는 생물지표들을 확인할 필요는 여전히 남아있다. 소낭과 연관된 microRNA, 단백질 및 다른 생물지표들과 소낭의 특징들은 진단, 예후, 또는 처치진단을 제공할 수 있다.
본 발명은 질환 또는 질환 진행을 나타내는 생물지표들을 탐지하여 표현형을 특징화시키는 방법들 및 시스템들을 제공한다. 생물지표들은 소낭 지표, 단백질, 핵산, mRNA 및/또는 microRNA을 포함하나 이에 한정되지 않는 순환하는 생물지표들일 수 있다. 생물지표들은 핵산-단백질 복합체일 수 있다.
요약
생물학적 시료안에 존재하는 소낭, microRNA 또는 단백질과 같은 순환하는 생물학적 지료들을 분석함으로써 표현형을 특징화하는 방법들 및 조성물들을 여기에서 제공한다. 피험자 또는 개체의 표현형의 특징화는 질환 또는 상태의 진단, 질환 또는 상태의 예후, 질환의 단계 또는 상태의 단계 결정, 약물 효과, 생리학적 상태, 장기 고통 또는 장기 거부, 질환 또는 상태 진전, 질환 또는 상태에 대한 처치법-관련성, 또는 특이적 생리학적 또는 생물학적 상태를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
한 측면에서, 본 발명은 다음을 포함하는 생물특징(biosignature)을 확인하는 방법을 제공한다: (a) 생물학적 시료 안에 하나 또는 그 이상의 생물지표(bio지표)의 존재 또는 수준을 결정하고, 이때 하나 또는 그 이상의 생물지표는 표 5로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 생물지표를 포함하고; 그리고 (b) 하나 또는 그 이상의 생물지표의 존재 또는 수준을 포함하는 생물특징을 확인한다. 이들 방법은 이 생물특징을 참조 생물특징과 비교하는 것을 더 포함할 수 있고, 이때 이러한 비교를 이용하여 암을 특징화한다. 참조 생물특징은 암이 없는 대상의 것일 수 있다. 참조 생물특징은 이 대상의 것일 수 있다. 예를 들면, 참조 생물특징은 대상의 비-악성 시료 이를 테면, 정상적인 인접 조직, 또는 시간을 두고 대상으로부터 취한 상이한 시료일 수 있다. 특징화는 대상에서 암의 존재 또는 위험을 확인하고, 또는 대상에서 암이 전이성 또는 공격성을 확인하는 것을 포함할 수 있다. 비교 단계는 이 생물특징이 참조 생물특징과 비교하여 변경되었는지를 결정하고, 이로 인하여 암에 대한 예후, 진단 또는 치료진단을 제공하는 것을 포함할 수 있다.
일부 구체예들에서, 하나 또는 그 이상의 생물지표는 miR-22, let7a, miR-141, miR-182, miR-663, miR-155, mirR-125a-5p, miR-548a-5p, miR-628-5p, miR-517*, miR-450a, miR-920, hsa-miR-619, miR-1913, miR-224*, miR-502-5p, miR-888, miR-376a, miR-542-5p, miR-30b*, miR-1179, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 생물지표는 miR-22, let7a, miR-141, miR-920, miR-450a, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 이 생물특징은 전립선암을 특징화하는데 이용될 수 있다.
다른 구체예들에서, 하나 또는 그 이상의 생물지표는 표 20-24, 및 이의 조합중 임의의 것에 있는 유전자들로 구성된 군으로부터 선택된 메신져 RNA(mRNA)를 포함한다. 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 생물지표는 A2ML1, BAX, C10orf47, C1orf162, CSDA, EIFC3, ETFB, GABARAPL2, GUK1, GZMH, HIST1H3B, HLA-A, HSP90AA1, NRGN, PRDX5, PTMA, RABAC1, RABAGAP1L, RPL22, SAP18, SEPW1, SOX1, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 mRNA를 포함할 수 있다. 하나 또는 그 이상의 생물지표는 A2ML1, GABARAPL2, PTMA, RABAC1, SOX1, EFTB, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수도 있다. 이 생물특징은 전립선암을 특징화하는데 이용될 수 있다.
하나 또는 그 이상의 생물지표는 CA-125, CA 19-9, c-반응성 단백질, CD95, FAP-1, EGFR, EGFRvIII, 아포리포단백질 AI, 아포리포단백질 CIII, 미오글로빈, 테나신 C, MSH6, 클라우딘-3, 클라우딘-4, 카베올린-1, 응고인자 III, CD9, CD36, CD37, CD53, CD63, CD81, CD136, CD147, Hsp70, Hsp90, Rab13, Desmocollin-1, EMP-2, CK7, CK20, GCDF15, CD82, Rab-5b, Annexin V, MFG-E8, HLA-DR, miR200 microRNA, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 생물지표는 CA-125, CA 19-9, c-반응성 단백질, CD95, FAP-1, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 이 생물특징은 난소암을 특징화하는데 이용될 수 있다.
일부 구체예들에서, 하나 또는 그 이상의 생물지표는 hsa-miR-574-3p, hsa-miR-141, hsa-miR-432, hsa-miR-326, hsa-miR-2110, hsa-miR-181a-2*, hsa-miR-107, hsa-miR-301a, hsa-miR-484, hsa-miR-625*, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 이 생물특징은 전립선암을 특징화하는데 이용될 수 있는데, 이를 테면, 전립선암의 존재를 탐지하는데 이용될 수 있다. 하나 또는 그 이상의 생물지표는 hsa-miR-582-3p, hsa-miR-20a*, hsa-miR-375, hsa-miR-200b, hsa-miR-379, hsa-miR-572, hsa-miR-513a-5p, hsa-miR-577, hsa-miR-23a*, hsa-miR-1236, hsa-miR-609, hsa-miR-17*, hsa-miR-130b, hsa-miR-619, hsa-miR-624*, hsa-miR-198, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 이 생물특징은 전립선암을 특징화하는데 이용될 수 있는데, 이를 테면, 전이성 및 비-전이성 전립선암을 구별하는데 이용될 수 있다.
또다른 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 생물지표는 miR-497, 및 이의 조합을 포함한다. 이 생물특징은 폐암을 특징화하는데 이용될 수 있다.
하나 또는 그 이상의 생물지표는 AQP2, BMP5, C16orf86, CXCL13, DST, ERCC1, GNAO1, KLHL5, MAP4K1, NELL2, PENK, PGF, POU3F1, PRSS21, SCML1, SEMG1, SMARCD3, SNAI2, TAF1C, TNNT3, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 메신져 RNA (mRNA)일 수 있다. 이 생물특징은 전립선암을 특징화하는데 이용될 수 있는데, 이를 테면, 암이 아닌 시료로부터 전립선암을 구별하는데 이용될 수 있다.
구체예들에서, 하나 또는 그 이상의 생물지표는 ADRB2, ARG2, C22orf32, CYorf14, EIF1AY, FEV, KLK2, KLK4, LRRC26, MAOA, NLGN4Y, PNPLA7, PVRL3, SIM2, SLC30A4, SLC45A3, STX19, TRIM36, TRPM8, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 메신져 RNA (mRNA)를 포함한다. 이 생물특징은 전립선암을 특징화하는데 이용될 수 있는데, 이를 테면, 비-전립선암 시료 이를 테면, 유방암 시료로부터 전립선암을 구별하는데 이용될 수 있다.
다른 구체예들에서, 하나 또는 그 이상의 생물지표는 ADRB2, BAIAP2L2, C19orf33, CDX1, CEACAM6, EEF1A2, ERN2, FAM110B, FOXA2, KLK2, KLK4, LOC389816, LRRC26, MIPOL1, SLC45A3, SPDEF, TRIM31, TRIM36, ZNF613, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 메신져 RNA (mRNA)를 포함한다. 이 생물특징은 전립선암을 특징화하는데 이용될 수 있는데, 이를 테면, 비-전립선암 시료 이를 테면, 결장직장암 시료로부터 전립선암을 구별하는데 이용될 수 있다.
여전히 다른 구체예들에서, 하나 또는 그 이상의 생물지표는 ASTN2, CAB39L, CRIP1, FAM110B, FEV, GSTP1, KLK2, KLK4, LOC389816, LRRC26, MUC1, PNPLA7, SIM2, SLC45A3, SPDEF, TRIM36, TRPV6, ZNF613, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 메신져 RNA (mRNA)를 포함한다. 이 생물특징은 전립선암을 특징화하는데 이용될 수 있는데, 이를 테면, 비-전립선암 시료 이를 테면, 폐암 시료로부터 전립선암을 구별하는데 이용될 수 있다.
상기 mRNA중 하나를 인지하는 microRNA가 하나 또는 그 이상의 생물지표일 수 있다. 예를 들면, microRNA는 miR-26a+b, miR-15, miR-16, miR-195, miR-497, miR-424, miR-206, miR-342-5p, miR-186, miR-1271, miR-600, miR-216b, miR-519 패밀리, miR-203, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
또다른 측면에서, 본 발명은 다음을 포함하는 방법을 제공하는데: (a) 생물학적 시료로부터 하나 또는 그 이상의 핵산-단백질 복합체를 단리하고; (b) 하나 또는 그 이상의 핵산-단백질 복합체와 함께 하나 또는 그 이상의 핵산 생물지표의 존재 또는 수준을 결정하고; 그리고 (c) 생물특징 comprising the 하나 또는 그 이상의 핵산 생물지표의 존재 또는 수준을 포함하는 생물특징을 확인한다. 이들 방법은 이 생물특징을 참조 생물특징에 비교하는 것을 더 포함할 수 있고, 이때 이러한 비교를 이용하여 암을 특징화한다. 참조 생물특징은 암이 없는 대상의 것일 수 있다. 참조 생물특징은 이 대상의 것일 수 있다. 예를 들면, 참조 생물특징은 대상의 비-악성 시료 이를 테면, 정상적인 인접 조직, 또는 시간을 두고 대상으로부터 취한 상이한 시료일 수 있다. 특징화는 대상에서 암의 존재 또는 위험을 확인하고, 또는 대상에서 암이 전이성 또는 공격성을 확인하는 것을 포함할 수 있다. 비교 단계는 이 생물특징이 참조 생물특징과 비교하여 변경되었는지를 결정하고, 이로 인하여 암에 대한 예후, 진단 또는 치료진단을 제공하는 것을 포함할 수 있다. 특징화는 대상에서 암의 존재 또는 위험을 확인하고, 또는 대상에서 암이 전이성 또는 공격성을 확인하는 것을 포함할 수 있다. 비교 단계는 이 생물특징이 참조 생물특징과 비교하여 변경되었는지를 결정하고, 이로 인하여 암에 대한 예후, 진단 또는 치료진단을 제공하는 것을 포함할 수 있다.
핵산-단백질 복합체는 하나 또는 그 이상의 Argonaute 패밀리 구성요소, Ago1, Ago2, Ago3, Ago4, GW182 (TNRC6A), TNRC6B, TNRC6C, HNRNPA2B1, HNRPAB, ILF2, NCL (Nucleolin), NPM1 (Nucleophosmin), RPL10A, RPL5, RPLP1, RPS12, RPS19, SNRPG, TROVE2, 아포리포단백질, 아포리포단백질 A, apo A-I, apo A-II, apo A-IV, apo A-V, 아포리포단백질 B, apo B48, apo B100, 아포리포단백질 C, apo C-I, apo C-II, apo C-III, apo C-IV, 아포리포단백질 D (ApoD), 아포리포단백질 E (ApoE), 아포리포단백질 H (ApoH), 아포리포단백질 L, APOL1, APOL2, APOL3, APOL4, APOL5, APOL6, APOLD1, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 단백질은 하나 또는 그 이상의 Argonaute 패밀리 구성요소, Ago1, Ago2, Ago3, Ago4, GW182 (TNRC6A), 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 하나 또는 그 이상의 단백질은 Ago2, 아포리포단백질 I, GW182 (TNRC6A), 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수도 있다.
핵산-단백질 복합체는 하나 또는 그 이상의 microRNA를 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 microRNA는 표 5의 하나 또는 그 이상의 microRNA일 수 있다. 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 microRNA는 miR-22, miR-16, miR-148a, miR-92a, miR-451, let7a, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 한 구체예에서, 핵산-단백질 복합체는 Ago2, 아포리포단백질 I, GW182 (TNRC6A), 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 단백질을 포함하고; 그리고 하나 또는 그 이상의 microRNA는 miR-16 그리고 miR-92a, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 microRNA를 포함한다. 이 생물특징은 전립선암을 특징화하는데 이용될 수 있는데, 이를 테면, 암이 아닌 시료로부터 전립선암을 구별하는데 이용될 수 있다.
또다른 측면에서, 본 발명은 다음을 포함하는 방법을 제공한다: (a) 생물학적 시료의 미세소낭(micro소낭) 집단 안에 하나 또는 그 이상의 단백질 생물지표를 탐지하고; (b) 탐지된 미세소낭 집단과 연합된 하나 또는 그 이상의 하나 또는 그 이상의 핵산 생물지표의 존재 또는 수준을 측정하고; 그리고 (c) 하나 또는 그 이상의 핵산의 존재 또는 수준을 포함하는 생물특징을 확인한다. 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 하나 또는 그 이상의 핵산 생물지표의 수준은 하나 또는 그 이상의 단백질 생물지표의 수준에 대해 표준화될 수 있다. 이들 방법은 이 생물특징을 참조 생물특징에 비교하는 것을 더 포함할 수 있고, 이때 이러한 비교를 이용하여 암을 특징화한다. 참조 생물특징은 암이 없는 대상의 것일 수 있다. 참조 생물특징은 이 대상의 것일 수 있다. 예를 들면, 참조 생물특징은 대상의 비-악성 시료 이를 테면, 정상적인 인접 조직, 또는 시간을 두고 대상으로부터 취한 상이한 시료일 수 있다. 특징화는 대상에서 암의 존재 또는 위험을 확인하고, 또는 대상에서 암이 전이성 또는 공격성을 확인하는 것을 포함할 수 있다. 비교 단계는 이 생물특징이 참조 생물특징과 비교하여 변경되었는지를 결정하고, 이로 인하여 암에 대한 예후, 진단 또는 치료진단을 제공하는 것을 포함할 수 있다.
한 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 단백질 생물지표는 PCSA, Ago2, CD9 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 단백질을 포함한다. 하나 또는 그 이상의 핵산 생물지표는 miR-22, miR-16, miR-148a, miR-92a, miR-451, let7a, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 microRNA일 수 있다. 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 단백질 생물지표는 PCSA 그리고 Ago2를 포함할 수 있고; 그리고 하나 또는 그 이상의 핵산 생물지표는 miR-22를 포함할 수 있다. 또다른 실시예로써, 하나 또는 그 이상의 단백질 생물지표는 PCSA 및/또는 CD9를 포함할 수 있고; 그리고 하나 또는 그 이상의 핵산 생물지표 miR-22를 포함할 수 있다. 또다른 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 단백질 생물지표는 PCSA를 포함하고; 그리고 하나 또는 그 이상의 핵산 생물지표는 표 22-24중 임의의 것으로부터 선택된 메신져 RNA (mRNA)를 포함한다. 이 생물특징은 전립선암을 특징화하는데 이용될 수 있는데, 이를 테면, 암이 아닌 시료로부터 전립선암을 구별하는데 이용될 수 있다.
이 생물특징은 하나 또는 그 이상의 단백질 생물지표 그리고 하나 또는 그 이상의 핵산 생물지표의 수준의 비율로부터 산출된 득점을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 단백질 생물지표는 PCSA 및 PSMA를 포함하고, 하나 또는 그 이상의 핵산 생물지표는 miR-22 및 let7a를 포함한다. 이 경우에서, 득점의 산물은 (a) 미세소낭 하위집단과 연합된 PCSA 단백질의 수준으로 나눈 미세소낭 하위집단 안의 miR-22 페이로드(payload)의 수준의 제 1 배수(multiple); (b) 미세소낭 하위집단과 연합된 PCSA 단백질의 수준에 의해 나눈 미세소낭 하위집단 안에 let7a 페이로드 수준의 제 2 배수; 그리고 (c) 미세소낭 하위집단과 연합된 PSMA 단백질 수준의 제 3 배수의 합을 취하는 것을 포함할 수 있다. 제 1, 제 2 그리고 제 3 배수는 이 생물특징 결정을 최적화하는데 선택될 수 있다. 한 구체예에서, 제 1 배수 및 제 2 배수는 둘다 10이다. 제 3배수는 1일 수 있다.
본 시스템의 이 방법들의 구체예에서, 생물학적 시료는 체내 유체를 포함할 수 있다. 적절한 체내 유체는 임의의 적합한 체액, 가령, 말초 혈액, 혈청, 혈장, 복수, 소변, 뇌척수액 (CSF), 객담, 타액, 골수, 활액, 수양액(aqueous humor), 양수, 귀지, 모유, 기관지폐포 세척액, 정액, 전립선액, 쿠퍼(cowper) 또는 사정전 유체(pre-ejaculatory), 여성 사정액, 땀, 대변 찌꺼기, 모(hair), 눈물, 낭종 유체, 늑막 및 복막 유체, 심장주변 유체, 림프, 미즙(chyme), 유미(chyle), 담즙, 간질성(interstitial) 유체, 월경, 고름, 피지, 구토물, 질 분비물, 점막 분비물, 대변 물, 췌액, 비강의 세척액, 기관지 폐 흡출액, 배낭강(blastocyl) 유체, 또는 탯줄 혈액을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 예를 들면, 생물학적 시료는 가령, 뇨, 혈액 또는 혈액 유도체를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 시스템의 이 방법들의 일부 구체예에서, 생물학적 시료는 조직 시료, 조직 시료의 세포들, 또는 이러한 세포들로부터 방출되는 순환하는 생물지표들을 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 이들 방법들은 조직 시료에 대한 생물특징을 확인하기 위하여 실행될 수 있다. 생물학적 시료는 세포 배양 시료를 포함할 수 있고, 가령, 이 시료는 배양된 세포들 및/또는 이러한 배양된 세포들로부터 방출된 순환하는 생물지표들을 포함하는 배양 배지를 포함할 수 있다. 조직 시료 또는 배양 시료는 암 시료이거나 종양 시료 또는 종양 세포들을 포함할 수 있다.
본 발명의 방법에서, 이 생물학적 시료는 하나 이상의 미세소낭을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 생물지표는 하나 이상의 미세소낭과 연합한다. 하나 이상의 미세소낭은 10 ㎚ 내지 2000 ㎚의 직경 가령, 20 ㎚ 내지 1500 ㎚, 20 ㎚ 내지 1000 ㎚, 20 ㎚ 내지 500 ㎚ 또는 20nm 내지 200nm의 직경을 가질 수 있다,
하나 이상의 미세소낭은 본 명세서에서 기술된 또는 당업계에 공지되어 있는 방법을 이용하여 시료로부터 단리될 수 있다. 구체예들에서, 하나 또는 그 이상의 미세소낭은 크기 압출 크로마토그래피, 밀도 그라디언트 원심분리, 차등 원심분리, 나노막 한외여과, 면역흡착 캡쳐, 친화력 정제, 친화력 캡쳐, 친화력 선택, 면역분석, ELISA, 마이크로유체(microfludic) 분리, 유동 세포분석 또는 이의 조합을 거치게 된다.
하나 이상의 미세소낭은 하나 이상의 결합제와 접촉될 수 있다. 일부 구체예들에서, 이 하나 이상의 결합제는 핵산, DNA 분자, RNA 분자, 항체, 항체 단편, 압타머(압타머), 펩토이드, zDNA, 펩티드 핵산 (PNA), 잠김(잠긴) 핵산 (LNA), 렉틴, 펩티드, 덴드라이머(덴드라이머), 막 단백질 라벨링 물질, 또는 화학적 화합물 또는 이의 또는 이의 조합을 포함한다. 예를 들면, 이 하나 이상의 결합제는 항체 또는 압타머일 수 있다. 하나 이상의 결합제는 하나 이상의 미세소낭을 캡쳐 및/또는 탐지하는데 이용할 수 있다. 한 구체예에서, 이 하나 이상의 결합제는 하나 이상의 미세소낭에 있는 하나 이상의 표면 항원에 결합한다. 이 하나 이상의 표면 항원은 하나 또는 그 이상 단백질을 포함할 수 있다.
하나 또는 그 이상 단백질은 본 명세서에서 기술된 관심 소낭 상에 있는 임의의 유용한 생물지표일 수 있다. 한 구체예에서, 하나 또는 그 이상 단백질은 하나 또는 그 이상 세포 특이적 또는 암 특이적 소낭 지표, 이를 테면, 표 4와 5에서 CD9, CD63, CD81, PSMA, PCSA, B7H3, EpCam, 또는 단백질을 포함한다. 이 하나 이상의 단백질은 일반적인 소낭 지표, 가령, 하나 이상의 테트라스패닌(테트라스파닌), CD9, CD63, CD81, CD63, CD9, CD81, CD82, CD37, CD53, Rab-5b, Annexin V, MFG-E8, 또는 표 3의 단백질을 포함할 수 있다. 구체예들에서, 하나 또는 그 이상 단백질은 표 3-5중 임의의 것에서 하나 또는 그 이상 단백질을 포함할 수 있다.
하나 또는 그 이상 결합제는 하나 또는 그 이상 미세소낭을 캡쳐하는데 이용될 수 있다. 캡쳐된 미세소낭들은 추가 평가에 이용될 수 있다. 예를 들면, 미세소낭 안에 페이로드(payload)가 평가될 수 있다. 미세소낭 페이로드는 하나 이상의 핵산, 펩티드, 단백질, 지질, 항원, 탄수화물, 및/또는 프로테오글리칸을 포함할 수 있다. 이 핵산은 하나 이상의 DNA, mRNA, microRNA, snoRNA, snRNA, rRNA, tRNA, siRNA, hnRNA, 또는 shRNA를 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 하나 또는 그 이상 생물지표는 하나 또는 그 이상 캡쳐된 미세소낭 안에 페이로드를 포함한다. 예를 들면, 하나 또는 그 이상 생물지표는 mRNA 페이로드를 포함할 수 있다. 하나 또는 그 이상 생물지표는 microRNA 페이로드를 또한 포함할 수 있다. 하나 또는 그 이상 생물지표는 단백질 페이로드, 가령, 내부 막 단백질 또는 가용성 단백질을 또한 포함할 수 있다.
본 발명의 이 방법은 시험관내, 가령, 시험관내 생물학적 시료 또는 세포 배양 시료를 이용하여 실시될 수 있다.
추가 구체예에서, 분석중인 암은 비-소(small) 세포 폐암 및 소세포 폐암 (소세포 암종 (귀리 세포 암), 혼합형 소세포/거대 세포 암종, 및 복합형 소세포 암종을 포함)을 포함하는 폐암, 결장암, 유방암, 전립선 암, 간암, 췌장암, 뇌 암, 신장암, 난소암, 위암, 피부암, 골암, 위(gastric)암, 유방암, 췌장(pancreatic) 암, 신경교종, 교아종, 간세포 암종, 유두상 신장 암종, 두경부 편형상피세포 암종, 백혈병, 임파종, 골수종, 또는 충실성 종양일 수 있다.
구체예들에서, 당해 방법에 의해 특징화되는 암은 comprises an 급성 임파아구성 백혈병; 급성 골수성 백혈병; 부신피질 암종; AIDS-관련된 암들; AIDS-관련된 임파종; 항문암; 맹장 암; 성상세포종; 비정형 기형/횡문근양 종양; 기저 세포 암종; 방광 암; 뇌 간(stem) 신경교종 ; 뇌 종양 (뇌 간(stem) 신경교종 , 중추 신경계 비정형 기형/횡문근양 종양, 중추 신경계 배아 종양, 성상세포종, 두개인두종, 상의모세포종, 상의종, 수아종, 수질상피종, 중간 분화의 송과체 실질 종양, 천막상 원시 신경외배엽 종양 및 송과모세포종을 포함); 유방암; 기관지 종양; Bur키트t 임파종; 원발부위불명의 암; 카르시노이드 종양; 원발부위불명의 암종; 중추 신경계 비정형 기형/횡문근양 종양; 중추 신경계 배아 종양; 경부 암; 어린이 암들; 척색종; 만성 림프구성 백혈병; 만성 골수생성 백혈병; 만성 척수증식성 장애들; 결장암; 결장직장 암; 두개인두종; 피부의 T-세포 임파종; 내분비 췌장 섬 세포 종양; 자궁내막 암; 상의모세포종; 상의종; 식도 암; 감각신경모세포종; Ewing 육종; 두개외 세균 세포 종양; 생식선밖 세균 세포 종양; 간밖의 담관 암; 담낭 암; 위의 (위) 암; 위장 카르시노이드 종양; 위장 기질 세포 종양; 위장 기질 종양 (GIST); 임신성 융모성 종양; 신경교종 ; 모(hairy) 세포 백혈병; 두경부 암; 심장 암; Hodgkin 임파종; 하인두 암; 안구내 흑색종; 섬 세포 종양; Kaposi 육종; 신장암; Langerhans 세포 조직구증; 후두 암; 입술 암; 간암; 악성 섬유성 조직구종 골암; 수아종; 수질상피종; 흑색종; Merkel 세포 암종; Merkel 세포 피부암종; 중피종; 잠복 원발성 전이성 편평 목암; 입 암; 다발성 내분비 신성종 증후군; 다발성 골수종; 다발성 골수종/혈장 세포 신생물; 균상 식육종; 골수형성이상 증후군; 척수증식성 신생물; 비강 암; 비인두 암; 신경아종; 비-Hodgkin 임파종; 비흑색종 피부암; 비-소 세포 폐암; 구강 암; 구강 공동 암; 구강인후 암; 골육종; 기타 뇌 및 척추 종양; 난소암; 난소 상피 암; 난소 세균 세포 종양; 난소 낮은 악성 가능성 종양; 췌장 암; 유두종증; 부비동 암; 갑상선 암; 골반 암; 페니스 암; 인두 암; 중간 분화의 송과체 실질 종양; 송과모세포종; 뇌하수체 종양; 혈장 세포 신생물/다발성 골수종; 흉막폐아세포종; 1차 중추 신경계 (CNS) 임파종; 1차 간세포 간암; 전립선 암; 직장 암; 신장 암; 신장 세포 (kidney) 암; 신장 세포 암; 호흡기관 암; 망막아세포종; 횡문근육종; 타액선 암; Szary 증후군; 소세포 폐암; 소장 암; 연조직 육종; 편평성 세포 암종; 편평성 목 암; 위 (위의) 암; 천막상 원시 신경외배엽 종양; T-세포 임파종; 고환 암; 목 암; 흉선 암종; 흉선종; 갑상선 암; 전이성 세포 암; 신장 신우 및 요관의 전이성 세포암; 영양막 종양; 요관 암; 요도 암; 자궁 암; 자궁 육종; 질 암; 외음부 암; Waldenstrm 매크로글로블린혈증; 또는 Wilm 종양일 수 있다. 예를 들면, 암은 전립선암, 폐암, 유방암, 결장직장암 또는 난소암일 수 있다.
본 발명의 이들 방법은 가령, 시험관 생물학적 시료 또는 세포 배양 시료를 이용하여 시험관내에서 실행될 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 임의의 방법을 실행하는 시약을 제공한다. 관련된 측면에서, 본 발명은 본 발명의 임의의 방법을 실행하기 위한 시약을 포함하는 키트를 제공한다. 시약은 하나 또는 그 이상 생물지표에 대해 항체 또는 압타머를 포함하나 이에 한정되지 않는 결합제일 수 있다. 예를 들면, 시약은 표 3-5, 9-11, 16- 27, 29 또는 31-32중 임의의 것에 있는 최소한 하나의 생물지표에 결합할 수 있는 결합물질일 수 있다. 일부 구체예들에서, 이 결합제는 직접적으로 라벨되거나 또는 간접적으로 라벨된 구성일 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 이들 방법중 임의의 것을 실시하기 위한 시약을 제공한다. 관련된 측면에서, 본 발명은 본 발명의 이들 방법중 임의의 것을 실행하기 위한 시약을 포함하는 키트를 제공한다. 시약은 하나 또는 그 이상의 생물지표에 대한 항체 또는 압타머를 포함하나 이에 한정되지 않는, 결합물질일 수 있다. 예를 들면, 시약은 표 3-5, 9-11, 16- 27, 29 또는 31-32중 임의의 것에 있는 최소한 하나의 생물지표에 결합할 수 있는 결합물질일 수 있다. 일부 구체예들에서, 결합물질은 직접적으로 라벨되거나 또는 간접적으로 라벨되도록 구성된다.
또다른 측면에서, 본 발명은 단리된 PCSA+ 소낭(vesicle)을 제공한다. 소낭은 miR-22, let7a, miR-141, miR-182, miR-663, miR-155, mirR-125a-5p, miR-548a-5p, miR-628-5p, miR-517*, miR-450a, miR-920, hsa-miR-619, miR-1913, miR-224*, miR-502-5p, miR-888, miR-376a, miR-542-5p, miR-30b*, miR-1179, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 microRNA을 포함하는 페이로드를 함유할 수 있다. 소낭은 표 20-24중 임의의 것으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 microRNA을 포함하는 페이로드를 함유할 수 있다.
또다른 측면에서, 본 발명은 (a) 기질에 연결된(tethered) 제 1 부분을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 관심대상의 microRNA 서열에 최소한 75% 상보적인 제 2 부분, 그리고 라벨을 포함하는 제 3 부분을 포함하고, 이때 제 2 부분은 제 1 부분과 제 3부분 사이에 위치되며; 그리고 (b) microRNA을 포함하는 조성물을 제공한다. 기질은 본 명세서에서 기술된 기질, 가령, 평면 기질, 컬럼(column), 또는 비드일 수 있다. 일부 구체예들에서, 올리고뉴클레오티드의 제 2 부분은 관심 microRNA 서열에 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 상보적이다. 올리고뉴클레오티드의 제 2 부분은 (b)의 microRNA에 최소한 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 상보적일 수 있다.
구체예들에서, 올리고뉴클레오티드의 제 3 부분은 직접적으로 라벨된다. 다른 구체예들에서, 올리고뉴클레오티드의 제 3 부분은 간접적으로 라벨된다. 올리고뉴클레오티드의 제 3 부분은 가령, 스트렙타아비딘 이를 테면, 스트렙타아비딘-피코에리틴 (PE) (SAPE)을 포함하는 라벨의 결합을 용이하게 하기 위하여 바이오티닐화될 수 있다. 임의의 유용한 라벨이 이용될 수 있다. 예를 들면, 올리고뉴클레오티드의 제 3 부분은 형광 라벨, 방사능라벨 또는 효소 라벨을 포함할 수 있다.
한 구체예에서, (b)의 microRNA는 단백질과 복합체일 수 있다. 단백질은 can be 선택된 from the 집단 consisting of an Argonaute 패밀리 구성요소, Ago1, Ago2, Ago3, Ago4, GW182 (TNRC6A), TNRC6B, TNRC6C, HNRNPA2B1, HNRPAB, ILF2, NCL (Nucleolin), NPM1 (Nucleophosmin), RPL10A, RPL5, RPLP1, RPS12, RPS19, SNRPG, TROVE2, 아포리포단백질, 아포리포단백질 A, apo A-I, apo A-II, apo A-IV, apo A-V, 아포리포단백질 B, apo B48, apo B100, 아포리포단백질 C, apo C-I, apo C-II, apo C-III, apo C-IV, 아포리포단백질 D (ApoD), 아포리포단백질 E (ApoE), 아포리포단백질 H (ApoH), 아포리포단백질 L, APOL1, APOL2, APOL3, APOL4, APOL5, APOL6, 그리고 APOLD1로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 예를 들면, microRNA는 하나 또는 그 이상의 Ago1, Ago2, Ago3 및 Ago4에 의해 결합될 수 있다. 단백질은 핵분해 활성을 나타낼 수 있다. 단백질은 재조합 단백질을 포함할 수 있다. 비-제한적 실시예로써, 단백질은 재조합 Ago2 (rAgo2)를 포함할 수 있다.
구체예들에서, 조성물은 생물학적 시료를 포함한다. microRNA는 생물학적 시료로부터 단리될 수도 있다. 단리된 microRNA는 이를 테면, Ago1, Ago2, Ago3 및 Ago4를 포함하는 상기 것들과 같은 단백질과 리보핵단백질 복합체 안에 존재할 수 있다. 생물학적 시료는 체내 유체를 포함할 수 있다. 적절한 체내 유체는 임의의 적합한 체액, 가령, 말초 혈액, 혈청, 혈장, 복수, 소변, 뇌척수액 (CSF), 객담, 타액, 골수, 활액, 수양액, 양수, 귀지, 모유, 기관지폐포 세척액, 정액, 전립선액, 쿠퍼 유체 또는 사정전 유체, 여성 사정액, 땀, 대변 찌꺼기, 모(hair), 눈물, 낭종 유체, 늑막 및 복막 유체, 심장주변 유체, 림프, 미즙, 유미, 담즙, 간질성 유체, 월경, 고름, 피지, 구토물, 질 분비물, 점막 분비물, 대변 물, 췌액, 비강의 세척액, 기관지 폐 흡출액, 배낭강 유체, 또는 탯줄 혈액을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 예를 들면, 생물학적 시료는 가령, 뇨, 혈액 또는 혈액 유도체를 포함한다.
관련된 측면에서, 본 발명은 다음을 포함하는 방법을 제공한다: (i) 상기에서 교시된 바와 같은 조성물을 제공하고; (ii) microRNA가 올리고뉴클레오티드에 결합을 허용하는 조건하에 이 조성물을 항온처리하고; 그리고 (iii) 기질로부터 절단된 라벨의 양을 탐지한다. 한 구체예에서, 기질로부터 절단된 라벨의 양을 탐지하는 것은 단계(ii)에 앞서 그리고 단계(ii) 이후에 기질과 접촉된 라벨의 양의 탐지를 포함한다. 또다른 구체예에서, 기질로부터 절단된 라벨의 양은 microRNA와 복합된 복합체 안에 단백질의 존재를 나타낸다. 단백질은 이를 테면, Ago1, Ago2, Ago3 및 Ago4를 포함하는 상기 단백질일 수 있다. 기질로부터 절단된 라벨의 양은 절단 반응 전과 후에 관찰될 수 있다. 대안으로, 기질로부터 절단된 라벨의 양은 실시관으로 관찰될 수 있다.
참고자료
본 명세서에서 언급된 모든 공개물, 특허, 특허 출원들은 각 개별 공개, 특허 또는 특허 출원이 특이적으로 그리고 개별적으로 참고문헌에 통합된 것과 동일한 수준으로 참고자료에 통합된다.
도 1A는 표현형을 특징화하기 위하여 핵산을 포함하는 생체특징을 확인하는 방법을 설명한다. 도 1B는 표현형을 특징화하기 위하여 소낭 또는 소낭 집단을 포함하는 생체특징을 확인하는 방법을 설명한다.
도 2는 소낭 생체특징을 평가함으로써 표현형을 특징화하는 방법들을 설명한다. 도 2A는 단백질을 발현시키는 소낭을 캡쳐하는 캡쳐 항체로 피복된 평면 기질의 개략도이다. 이 캡쳐 항체는 질환에 걸린 세포들로부터 유도한 소장 ("질환 소낭")에 특이적인 또는 특이적이지 않은 소낭 단백질에 대한 항체다. 탐지 항체는 캡쳐된 소낭에 결합하고, 형광 신호를 제공한다. 이 탐지 항체는 소낭에 일반적으로 연합된, 또는 기원 세포 또는 질환, 가령, 암과 연합된 항원을 탐지할 수 있다. 도 2B는 단백질을 발현시키는 소장을 캡쳐하는 캡쳐 항체로 피복된 비드의 개요도이다. 이 캡쳐 항체는 질환에 걸린 세포들로부터 유도한 소장 ("질환 소낭")에 특이적인 또는 특이적이지 않은 소낭 단백질에 대한 항체다. 이 탐지 항체는 캡쳐된 소낭에 결합하고, 형광 신호를 제공한다. 이 탐지 항체는 소낭에 일반적으로 연합된, 또는 기원 세포 또는 질환, 가령, 암과 연합된 항원을 탐지할 수 있다. 도 2C는 도 2B에서 나타낸 것과 같은 비드를 이용하여 다중적으로 실행될 수 있는 스크리닝 계획의 예가 된다. 도 2D는 표현형을 특징화하기 위하여 소낭을 캡쳐하고 탐지하기 위한 예시적인 계획을 제시한다. 도 2E는 표현형을 특징화하기 위하여 소낭 페이로드를 평가하기 위한 예시적인 계획을 제시한다.
도 3은 본 발명의 일부 예시적인 구체예들에서 이용할 수 있는 컴퓨터 시스템을 설명한다.
도 4는 피험자로부터 소낭을 탐지하는 비드 기반 방법을 이용한 결과를 나타내는 방법을 설명한다. 주어진 강도에서 캡쳐된 비드의 수는 얼마나 빈번하게 소낭이 이 강도에서 탐지 단백질을 발현시키는지를 나타낸다. 주어진 비드에서 좀더 강력한 신호는 탐지 단백질의 발현이 더 크다는 것을 말한다. 도면은 정상 환자를 한 곡선에 그리고 암 환자를 다른 곡선에 복합시키고, 이 곡선들을 구별하기 위하여 생물-통계학적 분석을 이용하여 수득한 표준화된 그래프다. 각 개체의 데이터는 탐지 기계에 의한 비드 판독 수의 변화를 설명하도록 표준화시키고, 각 집단에서 상이한 수의 시료를 설명하기 위하여 다시 표준화시킨다.
도 5는 TMPRSS2-ERG 발현을 평가함으로써 혈장으로부터 전립선암 세포들-유도된 소낭을 EpCam으로 캡쳐하는 것을 설명한다. VCaP 정제된 소낭은 정상 혈장에 고정되었고, 그 다음 EpCam 또는 이소타입 대조군 항체로 피복된 Dynal 자성 비드와 함께 항온처리하였다. RNA는 Dynal 비드로부터 직접적으로 단리하였다. 각 시료로부터 동량의 RNA를 RT-PCR 및 후속 Taqman 분석에 이용하였다.
도 6은 CD9 비드 캡쳐와 함께 miR-21 또는 miR-141 발현의 막대 그래프를 나타낸다. 전립선암 환자의 혈장 1㎖ 250 ng/㎖의 LNCaP, 또는 정제된 정상 소낭은 CD9 피복된 Dynal 비드와 함께 항온처리하였다. RNA는 비드 및 비드 상청액로부터 단리하였다. 한 가지 시료 (#6)는 또한 비교용으로 캡쳐되지 않았다. microRNA 발현은 qRT-PCR으로 측정하였고, 각 시료의 평균 CT 값을 비교하였다. CD9 캡쳐는 전립선암 시료에서 miR-21 및 miR-141의 탐지를 개선시킨다.
도 7은 MoFlo XDP를 이용하여 소낭을 분리 및 확인하는 것을 설명한다.
도 8은 시료 안에 소낭을 탐지하는 도식을 나타내는데, 여기에서 원하는 소낭의 존재 또는 수준은 미소구체 플랫포옴을 이용하여 평가한다. 도 8A는 컬럼 기반 필터링 방법을 이용하여 혈장으로부터 소낭을 단리하는 도식을 나타내는데, 여기에서 단리된 소낭들은 미소구체 플랫포옴을 이용하여 후속적으로 평가한다. 도 8B는 고속 원심분리, 가령 한외원심분리로 인하여 소낭의 막을 압착하는 도식을 나타낸다. 도 8C는 레이져 탐지를 이용하여 미소구체에 결합된 소낭을 탐지하는 도식을 나타낸다.
도 9A는 정상 전립선과 PCa 시료들을 구별하기 위하여 소낭 생체특징의 능력을 설명한다. 암 지표들은 EpCam 및 B7H3을 포함한다. 일반적인 소낭 지표들은 CD9, CD81 및 CD63을 포함하였다. 전립선 특이적 지표들은 PCSA을 포함하였다. PSMA 뿐만 아니라 PCSA도 이용될 수 있다. 테스트는 정상 시료들과 비교하여 PCa에 대해 98% 감응성이며 95% 특이성인 것으로 밝혀졌다. 도 9B는 정상인 및 전립선 암 환자들에서 도 9A의 소낭 표식에 대해 Y 축상에 평균 형광 강도(MFI)를 설명한다.
도 8은 시료 안에 소낭을 탐지하는 도식을 나타내는데, 여기에서 원하는 소낭의 존재 또는 수준은 미소구체 플랫포옴을 이용하여 평가한다. 도 8A는 컬럼 기반 필터링 방법을 이용하여 혈장으로부터 소낭을 단리하는 도식을 나타내는데, 여기에서 단리된 소낭들은 미소구체 플랫포옴을 이용하여 후속적으로 평가한다. 도 8B는 고속 원심분리, 가령 한외원심분리로 인하여 소낭의 막을 압착하는 도식을 나타낸다. 도 8C는 레이져 탐지를 이용하여 미소구체에 결합된 소낭을 탐지하는 도식을 나타낸다.
도 9A는 정상 전립선과 PCa 시료들을 구별하기 위하여 소낭 생체특징의 능력을 설명한다. 암 지표들은 EpCam 및 B7H3을 포함한다. 일반적인 소낭 지표들은 CD9, CD81 및 CD63을 포함하였다. 전립선 특이적 지표들은 PCSA을 포함하였다. PSMA 뿐만 아니라 PCSA도 이용될 수 있다. 테스트는 정상 시료들과 비교하여 PCa에 대해 98% 감응성이며 95% 특이성인 것으로 밝혀졌다. 도 9B는 정상인 및 전립선 암 환자들에서 도 9A의 소낭 표식에 대해 Y 축상에 평균 형광 강도(MFI)를 설명한다.
도 10은 시료가 전립선암에 양성인지를 판단하기 위한 소낭 전립선암 분석용의사결정수상도(decision tree)의 개요다.
도 11은 상승된 PSA 수준을 이용한 탐지 대 의사결정수상도에 따라 전립선 암에 대한 소낭 탐지 분석 결과를 나타낸다.
도 12는 대조군 그리고 PCa 시료로부터 단리된 소낭 안에 miR-14의 수준을 설명한다.
도 13A-13B는 전립선 암을 위한 소낭-기반 진단 분석으로부터 거짓 음성을 확인하는데 microRNA의 사용을 설명한다. 도 13A는 거짓 음성을 참 양성으로 전환시키고, 이로 인하여 감응성을 개선시키는데 miR 분석을 이용하는 과정을 설명한다. 도 13B는 거짓 양성을 참 음성으로 전환시키고, 이로 인하여 특이성을 개선시키는데 miR 분석을 이용하는 과정을 설명한다. 소낭 진단 분석에 의한 참 양성(TP), 소낭 진단 분석에 의한 참 음성(TN), 소낭 진단 분석에 의한 거짓 양성(FP), 그리고 소낭 진단 분석에 의한 거짓 음성(FN)에 대해 miR-107 (도 13C) 및 miR-141 (도 13D)의 표준화된 수준을 나타낸다. miR-107 및 miR-141은 도 13A 및 도 13B에서 나타낸 도식에서 이용될 수 있다.
도14는 결장직장암 (CRC) 세포 계통 및 환자 시료에서 KRAS 서열화를 설명한다. 시료는 이 세포 계통에서 얻은 게놈 DNA (도14B) 또는 환자의 조직 시료로부터 얻은 게놈 DNA(도14D), 또는 이 세포 계통에서 방출된 소낭 (도14A) 또는 환자의 혈장 시료으로부터 방출된 소낭(도14C) 안에 RNA 페이로드에서 획득된 cDNA를 포함한다.
도15는 인간 혈장으로부터 microRNA의 면역침전을 설명한다. 도 15A는 다양한 인간 혈장의 분획물에서 탐지된 miR-16의 평균 양을 나타낸다. "비드"은 Argonaute2 (Ago2), 아포리포단백질 A1 (ApoA1), GW182, 그리고 IgG 대조군에 대한 항체를 이용하여 공동-면역침전된 miR-16의 양이다. "Dyna"은 Dynabead 단백질 G를 이용한 면역침전을 말하고, "Magna"은 Magnabind 단백질 G 비드를 지칭한다. "Supernt"은 면역침전 반응의 상층액에서 탐지된 miR-16의 양이다. 상세한 내용은 실시예 참고. 도 15B 는 miR-92a가 탐지된 것을 제외하고 도 15A와 동일하다.
도 16은 PE 라벨된 항-PCSA 항체 및 FITC 라벨된 항-Ago2 항체로 착색된 복합체들의 유동 소팅(flow sorting)를 설명한다.
도 17은 인간 혈장 시료 안에 PCSA/Ago2 양성 복합체들에서 microRNA의 탐지를 설명한다. 혈장 시료는 전립선암 (PrC)을 가진 대상 또는 정상적인 대조군 (정상)의 것이다. 도 17A는 인간 혈장의 전체 순환하는 미세소낭 집단에서 miR-22 카피 수를 나타낸다. 도 17B에서는 혈장-유도된 복합체들은 PCSA 및 Argonaute 2 (Ago2)에 대항하는 항체를 이용하여 분류되었음을 나타낸다. RNA가 단리되었고 miR-22의 카피수는 PCSA/Ago2 이중 양성 사건의 집단에서 측정되었다. 도 17C는 유동세포분석법에 의해 각 혈장 시료에 카운트된 PCSA/Ago2 이중 양성 사건의 수를 나타낸다. 도 17D는 각 혈장 시료에 대해 PCSA/Ago2 양성의 전체 수로 나눈 miR-22의 카피 수를 나타낸다. 이로써 PCSA/Ago2 이중 양성 복합체 당 miR-22의 카피수를 얻는다.
도 18은 항-CD9 및/또는 항-PCSA으로 착색된 순환하는 미세소낭 (cMV)의 유동세포분석법을 설명한다. 도 18A는 CD9 및 PCSA에 대한 라벨된 항체를 이용하여 혈장 유도된 cMV의 분석을 설명한다. 도 18B는 항-CD9 및 항-PCSA로 이중 면역침전 이후 이중 양성 CD9/PCSA cMV의 농축을 설명한다. 도 18A와 도 18B 사이에 영역 R7에 있는 이중 양성 집단을 비교한다. 도 18C는 PCSA에 대한 라벨된 항체를 이용하여 혈장 유도된 cMV의 분석을 설명한다. 도 18D는 PCSA에 대한 항체를 이용한 단일 면역침전 이후 PCSA 양성 사건의 농축을 설명한다. 도 18C와 도 18D 사이에 영역 R4 안에 집단을 비교한다.
도 19는 다양한 혈장 분획물에서 miR-22의 수준을 설명한다. 도 19A는 ABI Taqman 탐지 키트 (Assay ID# 000398)에 의해 측정하였을 때, 변형안된 혈장 안에 miR-22 카피 수를 설명한다. 도 19B는 ABI Taqman 탐지 키트에 의해 측정하였을 때 환자 혈장으로부터 농축된 체 순환하는 미세소낭 집단 안에 miR-22 카피 수를 설명한다. 도 19C는 항-CD9 컬럼으로부터 방출된 출발 물질을 이용하여 항-PSCA 컬럼에 유지된 miR-22 카피 수를 설명한다. 도 19D는 비드 기반된 분석을 이용하여 측정하였을 때 시료-정합된 PCSA MFI에 비교되는 miR-22의 카피 수를 설명한다. 이중 면역침전에 이용된 암 및 정상 투입물 혈장에 대한 평균 PCSA MFI 신호는 각각 161.67 및 729.17이었다. 도 19E는 투입물 혈장 안에 miR-22의 카피 수를 설명한다. 도 19F는 도 19E의 투입물 혈장으로부터 항-PCSA 컬럼에 유지된 cMV로부터 miR-22 카피 수를 설명한다. 도 19G는 비드 기반된 분석을 이용하여 측정하였을 때 시료-정합된 PCSA MFI와 비교되는 miR-22 카피 수를 설명한다. 단일 IP에 이용된 암 및 정상 혈장에 있어서 평균 PCSA MFI 신호는 각각 69.17 및 526.5이었다.
도 20A-C는 혈장으로부터 단리된 cMV와 연합된 PCSA 및 PSMA 단백질 그리고 miR-22 및 let7a microRNA의 수준으로부터 유도된 득점을 이용하여 PCa와 정상(PCa 아님) 시료를 구별하는 것을 설명한다. 도 20A는 정상적인 시료와 암 시료에 대해 산출된 득점 플롯을 나타낸다. 도 20B는 도20A의 데이터를 나타내는데, 이때 정상은 정상(전립선 질환 없음), 이형성(이형성), 염증 및 높은 등급의 전립선 상피내 종양 (높은 등급 PIN, 또는 HGPIN)의 집단으로 분류되었고, 그리고 암은 주의관찰 (WW) 또는 암으로 확인된 집단으로 구별한다. 도 20C는 데이터로 생성된 ROC 곡선을 나타낸다. AUC는 0.77이었다.
도 21은 상이한 시료 집단에서 miR-920 (도 21A) 및 miR-450a (도 21B)의 차등 발현에 대한 설명적 플롯을 나타낸다. 시료는 혈장으로부터 단리된 cMV를 발현시키는 PCSA 안에 microRNA를 포함한다. miR-920은 전립선암 ("암") 및 정상 ("정상")과 비교하였을 때, 혼동되는(confounding) 질환들 (가령, 높은 등급 PIN ("hgpin") 및 염증성 질환 ("염증"))에서 과다발현된다. miR-450a는 다른 것들과 비교하였을 때 암에서는 하향조절된다.
도22는 마이크로어래이 프로파일링 of 소낭 mRNA 페이로드 수준의 마이크로어래이 프로파일링으로부터 선택된 mRNA들의 가공안된 배경 추출된 형광 값의 도트 플롯을 설명한다. 각 플롯에서, Y 축은 가공안된 배경 추출된 형광 값 (Raw BG하위 Florescence)을 나타낸다. X은 4명의 정상적인 대조군 혈장과 전립선암 환자 4명의 혈장에 대한 도트 플롯을 나타낸다. 나타낸 mRNA는 A2ML1 (도22A), GABARAPL2 (도22B), PTMA (도22C), RABAC1 (도22D), SOX1 (도22E), 및 ETFB (도22F)이다.
도 23A-23B는 X 축에 나타낸 것과 같이, 비재발성 전립선암 및 전이성 전립선암 시료로부터 단리된 소낭 안에 miR-141 (도 23A) 및 miR-375 (도 23B)의 수준을 나타낸다, 소낭으로부터 단리된 miR는 Taqman 분석을 이용하여 탐지되었다. P 값는 플롯 아래 나타낸다. Y 축은 탐지된 miR의 카피 수를 나타낸다.
도 24A 및 24B는 환자 혈액 시료를 이용하여 폐암 및 정상(비-폐암) 간을 구별하기 위한 microRNA miR-497을 설명한다. Y-축은 0.1 ml의 시료 안에 miR-497의 카피 수를 나타낸다. 도 24A에서, 수평선은 1154개 카피 수를 나타낸다. 도 24B에서 수평선은 1356개의 카피 수를 나타낸다. 도 24C는 순환하는 미세소낭 (cMV) 안에서 miR-497의 수준을 검사함으로써 비-소(small) 세포 폐암 및 정상 혈장 시료를 구별하기 위한 수용자 조작 특징(receiver operating characteristic: ROC)이다. 데이터는 도 24B에 대응한다.
도 25A는 유리 슬라이드에 결합된 Vcap-유도된 미세소낭의 전자 현미경 사진이고, 도 25B는 Vcap-유도된 미세소낭의 주사 전자 현미경 사진이며, 그리고 도 25C는 폴리-L-리신으로 피복된 폴리스티렌에 결합된 Vcap 미세소낭의 주사 전자 현미경 사진이다. 도 25D는 료 수집 수집 프로토콜에서 명시된 것과 같이 혈장으로의 혈액 프로세싱을 설명한다.
도 26은 microRNA 기능 분석을 설명한다. 도 26A는 라벨된 합성 RNA 분자 261-266 및 관심 표적 microRNA 267을 포함하는 리보핵단백질 복합체를 나타낸다. 도 26B는 리보핵단백질 복합체 267에 의해 인지될 때 표적 인지 부위 263에서 합성 RNA 분자의 절단과, 이로 인하여 을 설명한다. 도 26C-E는 다양한 원천으로부터 투입물 리보핵단백질 복합체를 설명한다.
생물학적 시료, 가령, 세포 배양물, 유기체, 또는 피험자의 시료의 표현형을 특징화하는 방법들 및 시스템을 설명한다. 이 표현형은 하나 이상의 생물지표들을 평가함으로써 특징화될 수 있다. 이 생물지표들은 소낭 또는 제시된 소낭 표면 항원들 또는 소낭 페이로드이 소낭 집단과 연합될 수 있다. 여기에서 이용된 것과 같이, 소낭 페이로드는 소낭안에 에워싸인 엔터티(entities)를 포함한다. 소낭 연관된 생물지표들은 막 결합된 그리고 가용성 생물지표들을 모두 포함할 수 있다. 이 생물학적지표들은 핵산(가령, microRNA) 또는 체액내에서 평가되는 단백질/폴리펩티드 또는 이의 기능적 단편들과 같은 순환하는 생물지표들일 수도 있다. 다른 명시가 없는 한, 소낭 또는 생물지표 성분들에 대해 여기에서 이용된 것과 같이 용어들 "정제된" 또는 "단리된"은 세포 또는 유기체로부터 이러한 성분들의 부분적 또는 완전한 정제 또는 분리를 의미한다. 더욱이, 다른 명시가 없는 한, 결합물질을 이용한 소낭 분리는 소낭에 결합물질을 결합시키고, 이러한 결합이 출발 물질에서 다른 생물학적 엔터티로부터 이 소낭을 완전하게 분리하는 지를 포함한다.
순환하는 생물지표, 가령, 핵산 생물지표를 분석함으로써 표현형을 특징화하는 방법은 비-제한적인 예로써 도 1A의 계획 6100A에서 설명한다. 제 1 단계 6101에서, 생물학적 시료는 가령, 체액, 조직 시료 또는 세포 배양물로부터 수득한다. 핵산은 시료 6103로부터 단리된다. 이 핵산은 DNA 또는 RNA, 가령, microRNA일 수 있다. 이러한 핵산의 평가는 표현형에 대한 생체특징을 제시할 수 있다. 표적 표현형 (가령, 질환이 있음 대 건강함, 치료전과 치료후)과 연관된 핵산을 샘플링함으로써, 표현형의 지표인 하나 이상의 핵산 지표들을 결정할 수 있다. 본 발명의 다양한 측면들은 시료 6105에 존재하는 하나 이상의 핵산 분자들(가령, microRNA)를 평가함으로써 결정된 생체특징에 관한 것이며, 이때 이 생체특징은 예정된 표현형 6107에 상응한다. 도 1B는 이 핵산 분자들을 분리하기 위하여 소낭을 이용하는 계획 6100B를 설명한다. 한 실시예에서, 생물학적 시료를 얻고(6102), 하나 이상의 소낭, 가령, 특정 기원 세포의 소낭 및/또는 특정 질환 상태와 관련된 소낭은 시료로부터 단리한다(6104). 이 소낭은 이 소낭과 연관된 표면 항원들을 특징화시킴으로써 및/또는 이 소낭내에 존재하는 성분들 ("페이로드")의 존재 또는 수준을 결정함으로써 분석한다(6106). 다른 언급이 없는 한, 용어 "항원"은 여기에서 이용된 것과 같이 결합물질에 의해 결합될 수 있는 생물지표를 일반적으로 지칭하며, 이때 결합물질은 항체, 압타머, 렉틴이거나, 또는 이 생물학적지표의 다른 결합 물질일 수 있으며 그리고 이러한 생물지표가 숙주에서 면역 반응을 유도하는지에는 무관하다. 소낭 페이로드는 펩티드들 및 폴리펩티드들을 포함하는 단백질, 및/또는 DNA 및 RNA와 같은 핵산일 수 있다. RNA 페이로드는 메신져 RNA (mRNA) 및 microRNA (여기에서 miRNA 또는 miR으로 지칭될 수도 있다)를 포함한다. 표현형은 이 소낭의 생체특징에 근거하여 특징화된다(6108). 본 발명의 또다른 예시적인 방법에 있어서, 계획 6100A 및 6100B는 표현형을 특징화하기 위하여 함께 실행된다. 이러한 계획에서, 소낭 및 핵산, 가령, microRNA을 평가하고, 이에 의해 표현형을 특징화한다.
표현형
막 소낭과 같은 소낭을 분석함으로써 개체의 표현형을 특징화하는 산물 및 과정을 여기에서 설명한다. 표현형은 질환 또는 상태, 질환 단계 또는 상태의 단계, 질환 또는 상태에 민감성, 질환 단계 또는 상태의 예후, 생리학적 상태, 또는 치료에 대한 반응과 같은 피험자에서 임의의 관찰가능한 특징들 또는 특색이 될 수 있다. 표현형은 피험자의 유전자 발현 뿐만 아니라 환경적 인자들의 영향과 이들 둘 사이의 상호작용으로 야기되는, 뿐만 아니라 핵산 서열들에 대한 후생적 수정으로 초래될 수 있다.
피험자에서 표현형은 피험자로부터 생물학적 시료를 수득하고, 그리고 시료로부터 하나 이상의 소낭을 분석함으로써 특징화될 수 있다. 예를 들면, 피험자 또는 개체에 대한 표현형의 특징화는 질환 또는 상태 (전조 단계 이전의 초기 단계 탐지를 포함)를 탐지하고, 질환 또는 상태의 예후, 진단, 또는 치료진단을 결정하고, 또는 질환 또는 상태의 단계 또는 진전을 결정하는 것을 포함할 수 있다. 표현형의 특징화는 또한 특이적 질환, 상태, 질환 단계 및 상태의 단계에 대한 적합한 치료 또는 치료 효과를 확인하고, 질환 진전, 특히 질환 재발생, 전이성 전개 또는 질환 재발의 예측 및 가능성 분석을 포함한다. 표현형은 상태 또는 질환, 가령 암 또는 종양의 임상적으로 뚜렷한 유형 또는 준유형이 될 수도 있다. 표현형 결정은 생리학적 상태의 결정, 또는 장기 고통 또는 이식후 장기 거부와 같은 평가가 될 수도 있다. 여기에서 설명된 산물 및 과정들은 개별적으로 피험자를 평가할 수 있게 하고, 치료에서 좀더 효과적이고 경제적인 이익이 되는 판단을 제시할 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 질환 또는 장애의 치료에 반응할 가능성이 있는지를 예측하기 위한 생체특징을 제공하기 위하여 생물학적 시료를 분석하는 것이다. 표현형의 특징화는 피험자의 반응자/비-반응자 상태를 예측하는 것을 포함하며, 여기에서 반응자는 질환의 치료에 반응하는 것이며, 비-반응자는 이 치료에 반응하지 않는다. 이 피험자에서 소낭을 분석하고, 그리고 해당 치료에 반응하거나 반응하지 않은 공지의 기존 피험자의 소낭 분석과 비교할 수 있다. 피험자의 소낭 생체특징이 치료에 반응하는 것으로 알려진 기존 피험자의 것과 좀더 밀접하게 배열된다면, 이 피험자는 치료에 대해 반응자로 특징화되거나 또는 예측될 수 있다. 유사하게, 피험자의 소낭 생체특징이 치료에 반응하지 않는 것으로 알려진 기존 피험자의 것과 좀더 밀접하게 배열된다면, 이 피험자는 치료에 대해 비-반응자로 특징화되거나 또는 예측될 수 있다. 이 치료는 임의의 적합한 질환, 장애 또는 다른 상태를 위한 것이다. 이 방법은 반응자/비-반응자 상태와 관련된 소낭 생체특징이 공지된 임의의 질환 환경에서 이용될 수 있다.
여기에서 이용된 것과 같이, 용어 "표현형"은 본 발명의 방법들을 이용하여 확인될 수 있는 소낭 생체특징에 기여하는 임의의 특생 또는 특징을 의미할 수 있다. 예를 들면, 표현형은 치료에 반응할 것 같은 피험자의 확인이 될 수 있으며, 또는 좀더 광범위하게는, 표현형은 피험자로부터 수득한 시료에 대한 특징화된 생체특징을 근거하여 진단, 예후 또는 치료진단 결정이 될 수도 있다.
일부 구체예들에서, 표현형은 표 1에 열거된 것과 같은 질환 또는 상태를 포함한다. 예를 들면, 표현형은 종양, 신생물, 또는 암의 존재 또는 가능성을 포함할 수 있다. 여기에서 설명된 산물 또는 과정에 의해 탐지되거나 또는 평가되는 암은 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다: 유방암, 난소암, 폐암, 결장암, 과형성 폴립, 선종, 직장결장암, 고도이형성, 저도이형성, 전립선 이형성, 전립선암, 흑색종, 췌장암, 뇌암 (교아종과 같은), 혈액 악성, 간세포 암종, 경부암, 자궁내막암, 두경부암, 식도암, 위장기질 종양 (GIST), 신장 세포 암종 (RCC) 또는 위암. 직장결장암은 CRC Dukes B 또는 Dukes C-D일 수 있다. 혈액 악성은 B-세포 만성 임파성 백혈병, B-세포 임파종-DLBCL, B-세포 임파종-DLBCL-배 중심-유사, B-세포 임파종-DLBCL-활성화된 B-세포-유사, 및 Burkitt의 임파종일 수 있다.
표현형은 전암 상태, 예를 들면, 악틴성 각화증, 위축성 위염, 백반증, 홍색비후증, 육아종성 림프종증, 전(pre)백혈병, 섬유증, 경부 형성이상, 자궁 경부 형성이상, 색소성 피부건조증, Barrett의 식도, 결장직장 폴립, 또는 악성 종양으로 발달할 가능성이 있는 다른 비정상적인 조직 성장 또는 병소일 수 있다. 변형성 바이러스 감염, 가령 HIV 및 HPV는 또한 본 발명에 따라 평가될 수 있는 표현형을 제시한다.
본 발명의 방법들에 의해 특징화되는 암은 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다: 암종, 육종, 임파종 또는 백혈병, 생식 세포 종양, 세포종(blastoma), 또는 다른 암. 암종(carcinoma)은 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다: 상피 신생물, 편평 세포 신생물 편평 세포 암종, 기저 세포 신생물 기저 세포 암종, 과도기성 세포 유두종 및 암종, 선종 및 선암종 (선(glands)), 선종, 선암종, 증식성 위벽염 인슐린종(linitis plastica 인슐린oma), 글루카곤종, 가스트린종, 장펩티드종(vipoma), 담관암, 간세포 암종, 아데노이드 포낭 암종, 맹장의 유암종 종양, 프로락티노마(prolactinoma), 호산성세포종(oncocytoma), 허틀(hurthle) 세포 선종, 신장 세포 암종, 그라비츠(grawitz) 종양, 다중 내분비 선종, 자궁내막양 선종, 부속기 및 피부 부속기 신생물, 점액표피양 신생물, 포낭, 뮤신 그리고 장액성신생물, 담관낭선종, 복막 가성점액종(pseudomyxoma peritonei), 도관, 소엽 그리고 수질부 신생물, 선방(acinar) 세포 신생물, 복합 상피 신생물, warthin의 종양, 가슴샘종, 분화된 성샘 신생물, 성삭(sex cord) 기질 종양, 난포막종, 과립층 세포 종양, 남아와세포종, Sertoli-Leydig 세포 종양, 사구 종양, 부신경교종, 크롬친화세포종, 사구 종양, nevi 및 흑색종, 멜라닌세포 모반, 악성 흑색종, 흑색종, 결절성 흑색종, 이형성 모반, 악성 흑자 흑색종, 표재 확장성 흑색종, 그리고 악성 선단 흑자성 흑색종. 육종은 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다: 피부의 종양, 보트로이드(botryodies), 연골육종, Ewing의 육종, 악성 혈관 내피종, 악성 슈반세포종, 골육종, 다음을 포함하는 연조직 육종: 폐포 유연부 육종, 혈관육종, 담낭육종 가엽, 피부섬유육종, 섬유의 종양, 복부결합조직형 작은 원형 세포 종양, 상피와 같은 육종, 골격외 연골육종, 골격외 골육종, 섬유육종, 혈관외피세포종, 혈관육종, Kaposi의 육종, 평활육종근, 지방육종, 림프관육종, 임파육종, 악성 섬유성 조직구종, 신경섬유육종, 횡문근육종, 그리고 활액육종. 임파종 및 백혈병은 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다: 만성림프구성 백혈병/작은 임파구성 임파종, B-세포 사전림프구성 백혈병, 임파혈질세포 임파종 (가령, Waldenstrm 매크로글로블린혈증), 비장 연변부 임파종, 혈장 세포 골수종, 형질세포종, 단클론 면역글로블린 침착 질환, 중쇄 질환, 결절외변연부 B 세포 임파종-malt 임파종이라고도 불림, 림프절 변연부 B 세포 임파종 (nmzl), 여포 임파종, 맨틀(mantle) 세포 임파종, 미만성 거대 B 세포 임파종, 종격동 (흉선) 거대 B 세포 임파종, 혈관내 거대 B 세포 임파종, 원발성 삼출성 임파종, Burkitt 임파종/백혈병, T 세포 사전림프구성 백혈병, T 세포 거대 과립성 림프구성 백혈병, 공격적인 NK 세포 백혈병, 성인T 세포 백혈병/임파종, 결절외 NK/T 세포 임파종, 코의 유형, 장질환-유형 T 세포 임파종, 간비장 T 세포 임파종, 모구성 NK 세포 임파종, 균상 식육종/세자리(sezary) 증후군, 원발성 피부의 CD30-양성 T 세포 임파증식성 장애, 원발성 피부의 역행성 거대 세포 임파종, 림프종양 구진증, 맥관면역모구성 T 세포 임파종, 말초 T 세포 임파종, 상세불명, 역행성 거대 세포 임파종, 고전적 Hodgkin 임파종(결절성 경화, 혼합형 세포성, 림프구-풍부, 림프구 감손된 또는 감손되지 않은), 그리고 결절성 림프구-우세 Hodgkin 임파종. 생식 세포 종양은 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다: 배아세포종, 이상종자배아세포종, 고환종, 비-배아세포종성 생식 세포 종양, 배아 암종, 내배엽 만곡 종양, 융모막암종, 기형종, 다배아종, 그리고 생식아세포종. 세포종은 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다: 신아세포종, 수아종, 및 망막아종. 다른 암들은 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다: 음순(labial) 암종, 후두 암종, 하인두 암종, 혀 암종, 타액선 암종, 위암종, 선암종, 갑상선암 (수질부 및 유두 갑상선암종), 신장 암종, 신장 유조직 암종, 경부암종, 자궁 체부 암종, 자궁 내막 암종, 융모막 암종, 고환 암종, 비뇨기 암종, 흑색종, 뇌종양 가령, 교아종, 성상세포종, 수막종, 수아종 그리고 말초 신경외배엽 종양, 쓸개암종, 기관지 암종, 다중 골수종, 기저세포암, 기형종, 망막아종, 맥락막 흑색종, 고환종, 횡문근육종, 두개인두종, 골육종, 연골육종, 골육종, 지방육종, 섬유육종, Ewing 육종, 및 형질세포종.
추가 구체예에서, 분석하게 되는 암은 비-소 세포 폐암 및 소 세포 폐암 (소 세포 암종 (귀리 세포 암)을 포함하는 폐암, 혼합형 소 세포/거대 세포 암종, 및 복합형 소 세포 암종을 포함), 결장암, 유방암, 전립선암, 간암, 췌장 암, 뇌암, 신장 암, 난소암, 위암, 피부 암, 골 암, 위암, 유방암, 췌장암, 신경교종, 교아종, 간세포 암종, 유두 신장 암종, 두경부 편평 세포 암종, 백혈병, 임파종, 골수종, 또는 충실성 종양을 포함할 수 있다.
구체예들에서, 암은 급성 림프구성 백혈병; 급성 골수성 백혈병; 부신피질 암종; AIDS-관련된 암; AIDS-관련된 임파종; 항문암; 맹장암; 성상세포종; 비정형 유기형/간상 종양; 기저 세포 암종; 방광암; 뇌줄기 교종; 뇌종양 (뇌줄기 교종, 중추 신경계 비정형 유기형/간상 종양, 중추 신경계 배아 종양, 성상세포종, 두개인두종, 뇌실막모세포종, 상의세포종, 수아종, 수질상피종, 중간 분화의 송과체종 종양, 천막상부 원시성 외배엽 종양 및 송과체모세포종을 포함); 유방암; 기관지 종양; Burkitt 임파종; 원발부위 불명 암; 유암종 종양; 원발부위 불명 암의 암종; 중추 신경계 비정형 유기형/간상 종양; 중추 신경계 배아 종양; 경부암; 소아 암; 척색종; 만성림프구성 백혈병; 만성골수성 백혈병; 만성골증식성 장애; 결장암; 직장결장암; 두개인두종; 피부의 T-세포 임파종; 내분비 췌장 섬 세포 종양; 자궁내막암; 뇌실막모세포종; 상의세포종; 식도암; 감각신경모세포종; Ewing 육종; 두개밖 생식 세포 종양; 고환외 생식 세포 종양; 간밖의 담즙 관 암; 쓸개암; 위 암; 위장유암종 종양; 위장기질 세포 종양; 위장기질 종양 (GIST); 임신성 영양막 종양; 신경교종; 모(hair) 세포 백혈병; 두경부암; 심장 암; Hodgkin 임파종; 하인두 암; 안구내 흑색종; 섬 세포 종양; Kaposi 육종; 신장 암; Langerhans 세포 조직구증; 후두 암; 입술 암; 간암; 악성 섬유성 조직구종 골암; 수아종; 수질상피종; 흑색종; Merkel 세포 암종; Merkel 세포 피부 암종; 중피종; 잠복 원발성을 가진 전이성 편평세포 경부암; 구강암; 다중 내분비 신조직형성 증후군; 다중 골수종; 다중 골수종/혈장 세포 신생물; 균상 식육종; 골이형성 증후군; 골증식성 신생물; 비강 암; 비인두 암; 신경아종; 비-Hodgkin 임파종; 비-흑색종 피부 암; 비-소 세포 폐암; 구강 암; 구강 공동 암; 구강인후 암; 골육종; 다른 뇌 및 척수 종양; 난소암; 난소 상피 암; 난소 생식 세포 종양; 난소 악성 가능성이 낮은 종양; 췌장암; 유두종증; 부비동 암; 부갑상선암; 골반 암; 페니스 암; 인두 암; 중간 분화의 송과체종 종양; 송과체모세포종; 뇌하수체 종양; 혈장 세포 신생물/다중 골수종; 폐모세포종; 원발성 중추 신경계 (CNS) 임파종; 원발성 간세포 간암; 전립선암; 직장 암; 신장 암; 신장 세포 (신장) 암; 신장 세포 암; 기도 암; 망막아종; 횡문근육종; 타액선 암; Szary 증후군; 소 세포 폐암; 소장 암; 연조직 육종; 편평 세포 암종; 편평 목 암; 위암; 천막상부 원시성 외배엽 종양; T-세포 임파종; 고환 암; 목 암; 흉선 암종; 가슴샘종; 갑상선암; 과도기성 세포 암; 신장 신우 및 수뇨관의 과도기성 세포암; 영양막 종양; 수뇨관 암; 요도 암; 자궁 암; 자궁 육종; 질 암; 외음부 암; Waldenstrm 매크로글로블린혈증; 또는 Wilm의 종양을 포함한다. 본 발명의 방법들은 이들 암과 다른 암들을 특징화하는데 이용할 수 있다. 따라서, 표현형의 특징화는 여기에서 설명된 한 가지 암의 진단, 예후 또는 치료진단을 제시할 수 있다.
표현형은 염증 질환, 면역 질환, 또는 자가면역 질환일 수도 있다. 예를 들면, 이 질환은 염증성 장 질환 (IBD), Crohn 질환 (CD), 궤양성 결장염 (UC), 골반 염증, 맥관염, 건선, 당뇨병, 자가면역 간염, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 유형 I 당뇨병, 류마티스 관절염, 건선, 전신 홍반성 낭창 (SLE), Hashimoto의 갑상선염, Grave의 질환, 강직성 척추염, Sjogrens 질환, CREST 증후군, 경피증, 류마티스 질환, 장기 거부, 원발성 경화성 담관염, 또는 폐혈증일 수 있다.
이 표현형은 또한 심혈관 질환, 가령 아테롬성경화, 울혈성 심부전, 취약성 죽상경화반, 발작, 또는 허혈을 포함할 수 있다. 심혈관 질환 또는 상태는 고혈압, 협착증, 혈관 폐색 또는 혈전증일 수 있다.
표현형은 또한 신경 질환, 가령, 다발성 경화증 (MS), Parkinson 질환 (PD), Alzheimer 질환 (AD), 정신불열증, 양극성장애, 우울, 자폐증, Prion 질환, Pick 질환, 치매, Huntington 질환 (HD), Down 증후군, 뇌혈관 질환, Rasmussen의 뇌염, 바이러스성 수막염, 신경정신성 전신 홍반성 낭창 (NPSLE), 근위축성 측삭 경화, Creutzfeldt-Jacob 질환, Gerstmann-Straussler-Scheinker 질환,전염성 해마상뇌증, 허혈성 재관류 손상 (가령 발작), 뇌외상, 미생물 감염, 또는 만성피로 증후군을 포함할 수 있다. 이 표현형은 섬유근육통, 만성 신경병 통증, 또는 말초 신경병 통증과 같은 상태일 수도 있다.
이 표현형은 감염질환, 가령, 박테리아성, 바이러스성 또는 효모 감염을 또한 포함할 수 있다. 예를 들면, 이 질환 또는 상태는 Whipple 질환, Prion 질환, 간경변, 메티실린-저항성 스타필로코커스 아우레우스, HIV, 간염, 매독, 수막염, 말라리아, 결핵, 또는 인플루엔자일 수 있다. 바이러스성 단백질들, 가령 HIV 또는 HCV-유사 입자들은 바이러스성 상태를 특징화하기 위하여 소낭에서 평가할 수 있다.
이 표현형은 또한 주산기(주산기) 또는 임신 관련된 상태 (가령 자간전증 또는 조산), 대사 질환 또는 상태, 가령, 철 대사와 연관된 대사 질환 또는 상태를 포함할 수 있다. 예를 들면, 헵시딘은 철 결핍을 특징화하기 위하여 소낭에서 분석될 수 있다. 대사 질환 또는 상태는 당뇨병, 염증, 또는 주산기 상태일 수 있다.
본 발명의 방법들을 이용하여 하나 또는 다수의 생물지표들을 포함하는 후부 생물특징을 통하여 평가될 수 있는 이들 질환 및 장애 그리고 다른 질환 및 장애를 특징화할 수 있다. 따라서, 표현형의 특징화는 여기에서 설명된 장애 및 질환중 하나의 진단, 예후 또는 치료진단을 제시할 수 있다.
본 발명의 다양한 구체예들에서, 본 명세서에서 기술된 임의의 상태 또는 질환에 대한 생물특징은 몇 가지 상이한 생물지표중 하나에 속한 하나 또는 그 이상의 생물지표들을 포함할 수 있는데, 이때 이 범주는 다음중 하나 또는 그 이상을 포함한다: 1) 질환 특이적 생물지표들; 2) 세포- 또는 조직-특이적 생물지표들; 3) 소낭-특이적 지표들 (가령, 일반적인 소낭 생물지표들); 4) 혈관생성-특이적 생물지표들; 그리고 5) 면역조정 생물지표들. 이러한 모든 지표들의 예는 본 명세서에서 기술되고, 당업계에 평균적 지식을 가진 자들에게 공지되어 있다. 더욱이, 특정 질환 또는 상태에서 역할을 하는 것으로 특징화된 당업계에 공지되어 있는 생물지표는 본 발명의 조성물 및 방법에서 표적으로 이용되도록 개조될 수 있다. 추가 구체예들에서, 이러한 생물지표들은 모든 소낭 표면 지표들, 또는 소낭 표면 지표들과 소낭 페이로드 지표들의 조합(가령, 소낭에 의해 에워싸인 분자들)일 수 있다. 또한, 본 명세서에서 기술된 것과 같이, 평가된 생물학적 시료는 임의의 생물학적 유체이거나, 또는 이러한 생물학적 유체 안에 존재하는 개별 성분들 (가령, 소낭, 핵산, 단백질, 또는 이의 복합체들)을 포함할 수 있다.
피험자(Subjects)
피험자의 하나 이상의 표현형은 하나 이상의 소낭, 가령, 피험자로부터 수득한 생물학적 시료내 소낭을 분석함으로써 결정할 수 있다. 피험자 또는 환자는 소, 조류, 갯과동물, 말, 고양잇과 동물, 양, 돼지와 같은 포유류, 또는 영장류 (인간 및 비-인간 영장류를 포함)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 피험자는 절멸위기에 처하여 중요한 포유류, 가령 시베리아 호랑이; 또는 인간의 소비를 위하여 농장에서 사육되는 동물과 같은 경제적 중요성, 또는 인간에게 사회적으로 중요한 동물, 가령, 애완동물 또는 동물원 동물을 포함할 수 있다. 이러한 동물의 예는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다: 개 및 고양이와 같은 육식동물; 어린 돼지, 수퇘지, 멧돼지를 포함한 돼지; 소, 황소, 양, 기린, 사슴, 염소, 아메리카들소, 낙타 또는 말과 같은 반추동물 또는 유제동물(발굽). 멸종위기의 또는 동물원에 있는 조류, 뿐만 아니라 가금류, 더 구체적으로, 가축화된 가금류, 가령 사육 조류, 가령, 칠면조, 닭, 오리, 거위, 뿔닭을 또한 포함한다. 또한 길들여진 돼지 및 말(경주용 말 포함)을 포함한다. 추가로, 농업 및 수족관 및 다른 활동과 연관된 동물과 같은 상업적 활동과 연관된 임의의 동물 종이 포함되는데, 이때 질환 모니터링, 진단 및 치료법 선택은 경제적 생산성 및/또는 먹이 사슬의 안전성에 대해 농축산 분야에서 일반적인 관행이다.
피험자는 암과 같이 이미-존재하는 질환 또는 상태를 보유할 수 있다. 대안으로, 이 피험자는 임의의 공지의 기존 상태를 보유하지 않을 수 있다. 피험자는 암 치료와 같은 현존 또는 과거 치료에 또한 비-반응성일 수 있다.
시료들(Samples)
피험자로부터 수득한 생물학적 시료는 임의의 체액 또는 생물학적 유체일 수 있다. 예를 들면, 이 생물학적 시료는 말초 혈액, 혈청, 혈장, 복수, 소변, 뇌척수액 (CSF), 객담, 타액, 골수, 활액, 수양액, 양수, 귀지, 모유, 기관지폐포 세척액, 정액 (전립선액을 포함), Cowper 유체 또는 사정전 유체, 여성 사정액, 땀, 대변 찌꺼기, 모(hair), 눈물, 낭종 유체, 늑막 및 복막 유체, 심장주변 유체, 림프, 미즙, 유미, 담즙, 간질성 유체, 월경, 고름, 피지, 구토물, 질 분비물, 점막 분비물, 대변 물, 췌액, 비강의 세척액, 기관지 폐 흡출액 또는 다른 세척 유체를 포함하는 임의의 생물학적 유체가 될 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 생물학적 시료는 또한 배낭강, 탯줄 혈액, 또는 태아 또는 모체 기원일 수 있는 모계 순환을 포함할 수 있다. 이 생물학적 시료는 소낭 및 다른 순환하는 생물지표들을 수득할 수 있는 조직 시료 또는 생검일 수도 있다. 예를 들면, 시료의 세포들은 배양되거나 또는 배양물로부터 단리된 소낭일 수 있다. (예를 들면, 실시예 1 참고). 다양한 구체예들에서, 여기에서 설명된 생물지표들 및/또는 생체특징은 다양한 방법들, 예를 들면, 혈액, 혈장, 혈청 또는 전술한 임의의 생물학적 시료들로부터 핵산 분자들의 추출, 폴리펩티드 (또는 기능적 단편) 생물지표(들)의 확인을 위하여 단백질 또는 항체 어레이의 이용, 뿐만 아니라 다른 어래이, 핵산 및 폴리펩티드 분자들의 확인 및 평가를 위하여 당업계에 공지되어 있는 서열화, PCR, 및 프로테오믹(proteomic) 기술을 이용하여 이러한 생물학적 시료로부터 직접적으로 평가할 수 있다(가령, 핵산 또는 폴리펩티드 생물지표들 또는 이의 기능적 단편의 존재 또눈 수준의 확인). 또한, 이러한 시료 안에 존재하는 하나 또는 그 이상의 성분들은 우선 단리되거나 또는 농축되며, 그리고 추가 처리되어, 선택된 생물지표들의 존재 또는 수준을 평가하거나, 가령, 주어진 생물특징을 평가한다. 예를 들면, 미세소낭은 단백질 및/또는 핵산 생물지표들에 대해 미세소낭을 프로파일링하기에 앞서 시료로부터 단리될 수 있다.
표 1은 질환, 상태, 또는 생물학적 상태와 소낭이 분석될 생물학적 시료의 해당 목록의 예시적인 설명을 열거한다.
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Figure pct00002

본 발명의 방법은 혈액 시료 또는 혈액 유도체를 이용하여 표현형을 특징화하는데 이용할 수 있다. 혈액 유도체들은 혈장 및 혈청을 포함한다. 혈액 혈장은 전혈의 액체 성분이며, 총 혈액 용적의 대략 55% 용적을 차지한다. 혈장은 용액안에 소량의 미네랄, 염, 이온, 영양소 및 단백질과 주로 물로 구성된다. 전혈에서, 적혈구 세포, 백혈구세포, 및 혈소판은 혈장 안에 현탁된다. 혈액 혈청은 피브리노겐 또는 다른 응고 인자들(가령, 전혈에서 상기 두 세포들과 응고 인자를 뺀)이 없는 혈액 혈장을 말한다.
이 생물학적 시료는 이 생물학적지표들의 분석을 생물학적 시료의 직접적인 평가 또는 이 생물학적 시료로부터 수득된 하나 이상의 소낭을 프로파일링함으로써 생물지표들의 분석을 실행하지 않은 제 3 자를 통하여 수득할 수 있다. 예를 들면, 이 시료는 시료를 얻는 피험자의 임상의, 의사 또는 다른 건강관리인을 통하여 얻을 수 있다. 대안으로, 이 생물학적 시료는 이 소낭을 분석하는 동일한 단체로부터 수득할 수 있다. 추가로, 분석될 생물학적 시료들은 보관되거나(가령, 냉동됨) 또는 그렇지 않으면 보존 상태하에서 보관된다.
생물지표 분석에 이용되는 생물학적 시료들의 용적은 0.1-20mL 범위, 약 20mL 미만, 15mL 미만, 10mL 미만, 9mL 미만, 8mL 미만, 7mL 미만, 6mL 미만, 5mL 미만, 4mL 미만, 3mL 미만, 2mL 미만, 1 mL 미만 또는 0.1mL 미만일 수 있다.
체액 시료는 표현형을 특징화하기 위한 시료로 이용할 수 있다. 예를 들면, 시료안의 생물지표들은 질환의 진단, 예후 및/또는 치료진단을 제공하기 위하여 평가된다. 이 생물학적지표들은 순환하는 단백질들 또는 핵산과 같은 순환하는 생물지표들일 수 있다. 이 생물학적지표들은 소낭 또는 소낭 집단과 또한 연관될 수 있다. 본 발명의 방법들은 피험자내 생물학적 시료 안에 존재할 수 있는 하나 이상의 소낭, 뿐만 아니라 하나 이상의 상이한 소낭 집단을 평가하는데 적용할 수 있다. 생물학적 시료 안의 하나 이상의 생물지표들의 분석을 이용하여 분석을 위하여 추가적인 생물학적 시료를 얻어야 하는지를 판단할 수 있다. 예를 들면, 체액 시료 안에 하나 이상의 소낭 분석은 조직 생검을 얻어야하는지를 판단하는데 도움을 준다.
환자로부터 시료는 순환하는 생물지표들 및 후속 분석을 위하여 여기에 포함된 다른 엔터티들을 보존하는 조건들 하에서 수거할 수 있다. 한 구체예에서, 시료들은 하나 이상의 CellSave Preservative 튜브s (Veridex, North Raritan, NJ),PAXGENE 혈액 DNA 튜브s (QI나이N GmbH, Germ임의의), 및 RNAlater (QI나이N GmbH, Germ임의의)을 이용하여 처리한다.
CellSave Preservative 튜브s (CellSave 튜브)는 가스를 빼낸(evacuated) 멸균된 혈액 수거 튜브다. 각 튜브는 Na2EDTA 및 세포 보존제를 함유하는 용액을 담고있다. EDTA는 칼슘 이온을 흡수하고, 이는 혈액 응고를 줄이거나 또는 없앨 수 있다. 보존제는 상피 및 기타 세포들의 형태 및 세포 표면 항원 발현을 보존한다. 수거 및 프로세싱은 제조업자가 제공하는 프로토콜에서 설명한 것과 같이 실행할 수 있다. 각 튜브는 당업계 숙련자들에게 공지된 것과 같이, 표준 정맥절개술 과정에 따라 정맥 전혈을 빼내기 위하여 각 튜브로부터 내용물을 빼낸다. CellSave 튜브들은 미국 특허 제5,466,574호; 제5,512,332호; 제5,597,531호; 제5,698,271호; 제5,985,153호; 제5,993,665호; 제6,120,856호; 제6,136,182호; 제6,365,362호; 제6,551,843호; 제6,620,627호; 제6,623,982호; 제6,645,731호; 제6,660,159호; 제6,790,366호; 제6,861,259호; 제6,890,426호; 제7,011,794호; 제7,282,350호; 제7,332,288호; 제5,849,517호 및 제5,459,073호에서 설명하며, 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 통합된다.
PAXGENE 혈액 DNA 튜브 (PAXGENE 튜브)는 핵산 분리용으로 전혈 수거를 위한 플라스틱으로 된, 가스를 빼낸 튜브다. 이 튜브는 전혈 견본의 운반 및 저장 그리고 여기에 함유된 핵산, 가령, DNA 또는 RNA의 단리에 이용할 수 있다. 표준 정맥절개술 프로토콜하에서 첨가제를 담고 있는, 가스를 빼낸 튜브 안으로 혈액을 수집한다. 수거 및 프로세싱은 제조업자가 제공하는 프로토콜에 설명된 것과 같이 실행할 수 있다. PAXGENE 튜브는 미국 특허 제5,906,744호; 제4,741,446호; 제4,991,104호에서 설명하고 있으며, 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 통합된다.
RNAlater RNA Stabilization Re나이nt (RNAlater)는 조직 안에서 RNA의 즉각적인 안정화에 이용된다. RNA는 수거된 시료 안에서 불안정할 수 있다. 수성 RNAlater 시약은 조직 및 기타 생물학적 시료들을 침투하고, 이에 의해 여기에 함유된 RNA를 안정화시키고, 보호한다. 이러한 보호는 하류 분석이 조직 또는 기타 시료에서 RNA의 발현 프로파일을 반영하도록 지원한다. 시료들은 수거 직후 적절한 용적의 RNAlater 시약에 침수시킨다. 수거 및 프로세싱은 제조업자가 제공하는 프로토콜에서 설명된 것과 같이 실행할 수 있다. 제조업자에 따라, 시약은 37℃에서 최대 1일간, 18-25C에서 7일간, 또는 2-8C에서 4주간 RNA를 보존하여, 액화 질소 또는 드라이아이스 없이 시료의 프로세싱, 운반, 저장, 및 선적이 가능하다. 이 시료들은 또한 창고 저장을 위하여 -20℃ 또는 -80℃에 보관할 수 있다. 보존된 시료들을 이용하여 tRNA, mRNA, 및 microRNA을 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 유형의 RNA를 분석할 수 있다. RNAlater는 DNA, RNA 및 단백질 분석을 위하여 시료를 수거하는데 또한 유용할 것이다. RNAlater는 미국 특허 제5,346,994호에서 설명하고 있으며, 이의 전문이 여기에 참고자료로 통합된다.
소낭
본 발명의 방법들은 소낭 집단의 평가를 포함한 하나 이상의 소낭의 평가를 포함할 수 있다. 여기에서 이용된 것과 같이, 소낭은 세포들로부터 발산되는 막 소낭이다. 소낭 또는 막 소낭은 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다: 순환하는 마이크로소낭 (cMVs), 마이크로소낭(미세소낭), 엑소좀(exosome), 나노소낭(nano소낭), 덱소좀(dexosome), 물집(bleb), 물집모양의(blebbby), 프로스타좀(prostasome), 극미립자, 내강내 소낭, 막 단편, 내강내 엔도좀 소낭, 엔도좀-유사 소낭, 엑소사이토시스 비이클(exocytosis vehicle), 엔도좀(endosome) 소낭, 엔도좀 소낭, 아팝토시스성 체(apoptotic body), 다중소낭체(multivesicular body), 분비성 소낭, 인지질 소낭, 리포좀 소낭, 아르고좀(argosome), 텍사좀(texasome), 쎄크레좀(secresome), 토레로좀(tolerosome), 멜라노좀(melanosome), 온코좀(oncosome), 또는 배출된(exocytosed) 비이클 비이클. 더욱이, 비록 소낭은 상이한 세포 과정에 의해 만들어질 수 있지만, 본 발명의 방법들은 이러한 소낭이 생물학적 시료 안에 존재하고, 여기에서 설명된 방법들에 의해 특징화될 수 있다면, 임의의 한 기전에 한정되거나 의존하지 않는다. 다른 명시가 없는 한, 소낭의 한 종을 이용하는 방법들은 다른 유형의 소낭에도 적용할 수 있다. 소낭은 가용성 성분들, 일부의 경우 페이로드라고 불리는 것을 포함할 수 있는 안쪽 격실을 에워싸는 세포막과 유사한 지질 이중층을 가진 구형 구조를 포함한다. 일부 구체예들에서, 본 발명의 방법들은 약 40-100 ㎚의 직경을 가진 작은 배출된 소낭인, 엑소좀을 이용한다. 유형 및 특징을 포함한 막 소낭에 관해서는 Thery et al., Nat Rev Immunol. 2009 Aug;9(8):581-93을 참고한다. 상이한 유형의 소낭의 일부 성질들은 표 2에 포함되어 있다.
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소낭은 혈장 막 또는 내부 막으로부터 유도된 발산된 막 결합된 미립자, 또는 "극미립자"을 포함한다. 소낭은 세포들의 세포외부 환경으로 방출될 수 있다. 소낭 방출 세포들은 외배엽, 내배엽, 또는 중배엽으로부터 기인된 또는 이로부터 유도된 세포들을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이 세포들은 유전적, 환경적, 및/또는 임의의 다른 변이 또는 변경을 겪을 수 있다. 예를 들면, 세포는 종양 세포들일 수 있다. 소낭은 원천 세포 내 임의의 변화를 반영할 수 있고, 그리고 이에 의해 원천 세포들의 변화, 가령, 다양한 유전적 돌연변이들을 보유하는 세포들을 반영할 수 있다. 한 기전에서, 소낭은 세포 막의 한 분절이 자발적으로 끼워넣고, 궁극적으로 배출될 때 세포내에서 만들어진다(예를 들면, Keller et al., Immunol. Lett. 107 (2): 102-8 (2006)). 소낭은 헤르니아화된 생리팽출(헤르니화된 팽출) (물집형성) 분리 및 혈장막의 일부분의 봉인 모두로부터 생성된 지질 이중층 막 또는 종양-유도된 microRNA 또는 세포내 단백질들을 포함하나 이에 한정되지 않는 이 소낭 내강 안에 포함된 분자들과 함께 종양-유도된 단백질에 선택적으로 결합하는 숙주 순환계로부터 유도된 표면-결합된 분자들을 포함하는 종양 기원의 다양한 막-연관된 단백질들을 담고 있는 임의의 세포내 막-결합된 소낭 구조의 방출로부터 생성된 지질 이중층 막에 의해 결합된 세포-유도된 구조들을 또한 포함한다. 물집 및 물집형성은 Charras et al., Nature Reviews 분자 and Cell Biology, Vol. 9, No. 11, p. 730-736 (2008)에서 추가 설명된다. 순환계 또는 종양 세포들의 체액으로 발산되는 소낭은 "순환하는 종양-유도된 소낭"이라고 지칭할 수 있다. 이러한 소낭이 엑소좀인 경우, 순환하는-종양 유도된 엑소좀 (CTE)이라고 할 수 있다. 일부 경우들에서, 소낭은 특이적 세포 기원으로부터 유도될 수 있다. 기원 세포 특이적 소낭으로써 CTE는 전형적으로 가령, 체액으로부터 그리고 가끔 특이적 방식으로 CTE 또는 기원 세포 특이적 소낭의 분리를 허용하는 하나 이상의 독특한 생물지표들을 보유한다. 예를 들면, 세포 또는 조직 특이적 지표들을 이용하여 기원 세포를 확인한다. 이러한 세포 또는 조직 특이적 지표들의 실시예는 여기에서 설명하고 있으며, 그리고 조직-특이적 유전자 발현 및 조절 (TiGER) 데이터베이스에서 추가 평가된다, bioinfo.wilmer.jhu.edu/tiger/; Liu et al. (2008) TiGER: a 데이터베이스 for tissue-specific gene 발현 and regulation. BMC Bioinformatics. 9:271; Tissue Distribution DBs, genome.dkfz-heidelberg.de/menu/tissue_db/index.html.
소낭은 약 10 ㎚, 20 ㎚, 또는 30 ㎚ 이상의 직경을 가질 수 있다. 소낭은 40 ㎚, 50 ㎚, 100 ㎚, 200 ㎚, 500 ㎚, 1000 ㎚, 1500nm 이상의 직경 또는 10,000 ㎚ 이상의 직경을 가질 수 있다. 소낭은 약 20-2000nm, 약 20-1500nm, 약 30-1000 ㎚, 약 30-800 ㎚, 약 30-200 ㎚, 또는 약 30-100 ㎚의 직경을 보유할 수 있다. 일부 구체예들에서, 이 소낭은 10,000 ㎚ 미만, 2000nm 미만, 1500nm 미만, 1000 ㎚ 미만, 800 ㎚ 미만, 500 ㎚ 미만, 200 ㎚ 미만, 100 ㎚ 미만, 50 ㎚ 미만, 40 ㎚ 미만, 30 ㎚ 미만, 20 ㎚ 미만 또는 10 ㎚ 미만의 직경을 가질 수 있다. 여기에서 이용된 것과 같이 용어 수치적 값 앞에 "약"은 수치의 상위 또는 하위 10% 변이는 명시된 값의 범위내에 속한다는 것을 의미한다. 다양한 유형의 소낭에 대한 전형적인 크기는 표 2에 제공한다. 소낭을 평가하여 단일 소낭 또는 임의의 수의 소낭의 직경을 측정할 수 있다. 예를 들면, 소낭 집단의 직경 범위 또는 소낭 집단의 평균 직경의 범위를 결정할 수 있다. 소낭 직경은 당업계에 공지되어 있는 방법들, 가령, 전자 현미경과 같은 영상 기술을 이용하여 평가할 수 있다. 한 구체예에서, 하나 이상의 소낭의 직경은 광학적 미립자 탐지를 이용하여 측정한다. 가령, 미국 특허 제7,751,053호, "Optical Detection and Anaylsis of Particles"(July 6, 2010); 그리고 미국 특허 제7,399,600호, "Optical Detection and Anaylsis of Particles"(July 15, 2010).
일부 구체예들에서, 소낭은 생물학적 시료의 사전 분리, 정제, 또는 농축없이 생물학적 시료료부터 직접적으로 분석한다. 예를 들면, 시료 내 소낭의 양 자체가 진단, 예후 또는 치료진단 결정을 제시하는 생체특징을 제시할 수 있다. 대안으로, 시료 내 소낭은 분석 전에 시료로부터 단리된, 캡쳐된, 정제된, 또는 농축된 소낭일 수 있다. 여기에서 이용된 것과 같이, 분리, 캡쳐 또는 정제는 시료 내 다른 성분으로부터 부분적 분리, 부분적 캡쳐 또는 부분적 정제를 포함한다. 소낭 분리는 여기에서 설명된 다양한 기술들 가령, 크로마토그래피, 여과, 원심분리, 유동 세포분석법, 친화력 캡쳐 (가령, 평면 표면 또는 비드에), 및/또는 마이크로유체를 이용하여 실행할 수 있다.
엑소좀과 같은 소낭을 평가함으로써 기준에 대해 소낭 특징들을 비교함으로써, 표현형 특징을 제공할 수 있다. 일부 구체예들에서, 소낭 상의 표면 항원들을 평가한다. 표면 항원들은 해부학적 기원 및/또는 세포의 소낭 및 다른 표현형 정보, 가령, 종양 상태의 암시를 제공한다. 예를 들면, 여기에서 환자 시료, 가령, 혈액, 혈청 또는 혈장과 같은 체액에서 볼 수 있는 소낭은 결장직장 기원 및 암의 존재를 나타내는 표면 항원들에 대해 평가한다. 이 표면 항원들은 표면 단백질들, 지질들, 탄수화물, 그리고 다른 막 성분들을 포함하나 이에 한정되지 않는 소낭 막 표면에서 탐지할 수 있는 임의의 유익한 생물학적 집단을 포함할 수 있다. 예를 들면, 종양 항원을 발현시키는 결장 유도된 소낭의 양성 탐지는 이 환자가 직장결장암을 가지고 있음을 나타낼 수 있다. 이렇게, 본 발명의 방법들을 이용하여 피험자로부터 수득한 하나 이상의 소낭의 예를 들면, 질환-특이적 그리고 세포-특이적 생물지표들을 평가함으로써, 해부학적 또는 세포 기원과 연관된 임의의 질환 도는 상태를 특징화할 수 있다.
또다른 구체예에서, 하나 이상의 소낭 페이로드를 평가하여 표현형 특징을 제공한다. 소낭의 페이로드는 이 소낭 안에 둘러싸인 것으로 탐지되는, 단백질들 및 핵산, 가령, 게놈 또는 cDNA, mRNA, 또는 이의 기능적 단편들, 뿐만 아니라 microRNA (miR)을 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 유용한 생물학적 집단을 포함한다. 추가로, 본 발명의 방법들은 표현형 특징을 제공하기 위한 소낭 표면 항원들 (추가로 또는 소낭 페이로드로 한정)을 탐지에 관한 것이다. 예를 들면, 소낭은 소낭 표면 항원들에 특이적인 결합물질 (가령, 항체들 또는 압타머들)을 이용하여 특징화될 수 있으며, 그리고 결합된 소낭은 여기에서 설명된 하나 이상의 페이로드 성분들을 확인하기 위하여 추가 평가할 수 있다. 여기에서 설명된 것과 같이, 관심 표면 항원들을 가진 또는 관심 페이로드를 가진 소낭의 수준은 기준과 비교할 수 있고, 표현형을 특징화한다. 예를 들면, 기준과 비교하여 시료내 암-관련된 표면 항원들 또는 소낭 페이로드, 가령, 종양 연관된 mRNA 또는 microRNA의 과다발현은 시료 안에 암의 존재를 나타낼 수 있다. 평가되는 생물지표들은 바람직한 표적 시료의 선택 및 바람직한 기준 시료에 표적 시료의 비교에 근거하여 존재하거나 존재하지 않거나, 또는 증가되거나 또는 감소될 수 있다. 표적 시료들의 비-제한적인 예는 다음을 포함한다: 질환; 치료된/치료되지 않은; 장기적인 연구와 같이 상이한 시점; 그리고 기준 시료의 비-제한적인 실시예들: 비-질환; 정상; 상이한 시점; 그리고 후보 치료(들)에 대한 감응성 또는 저항성.
MicroRNA
다양한 생물지표 분자들은 생물학적 시료들 또는 이러한 생물학적 시료들로부터 수득한 소낭에서 평가할 수 있다. MicroRNA는 본 발명의 방법들을 통하여 평가되는 한 부류의 생물지표들을 포함한다. MicroRNA, - 또한 miRNA 또는 miR으로도 불리기도 함-는 길이가 대략 21-23개 뉴클레오티드인 짧은 RNA 스트랜드이다. MiRNA는 DNA로부터 전사되지만 단백질로 해독되지 않고, 따라서 넌-코딩 RNA를 포함하는 유전자에 의해 인코드된다. miR는 공지의 원발성 전사체 pri-miRNA로부터 pre-miRNA라고 불리는 짧은 스템-루프(stem-loop) 구조로 프로세스되고, 최종적으로 생성된 단일 스트랜드 miRNA로 프로세스된다. pre-miRNA는 전형적으로 자가-상보 영역내에서 자체적으로 안으로 접히는 구조를 형성한다. 이들 구조는 그 다음 동물에서는 뉴클레아제 또는 식물에서는 DCL1에 의해 프로세스된다. 성숙 miRNA 분자들은 하나 이상의 메신져 RNA (mRNA) 분자들에 부분적으로 상보적이며, 그리고 단백질들의 전사를 조절하는 기능을 할 수 있다. miRNA의 확인된 서열들은 공개된 이용가능한 데이터베이스 가령, www.microRNA.org, www.mirbase.org, 또는 www.mirz.unibas.ch/cgi/miRNA.cgi.에서 평가할 수 있다.
miRNA는 " mir-[숫자]"과 같은 작명 협정에 따라 일반적으로 번호를 할당받는다. miRNA의 숫자는 이미 확인된 miRNA 종에 대해 발견된 순서에 따라 할당된다. 예를 들면, 만약 가장 최근에 공개된 miRNA가 mir-121이라면, 그 다음 발견되는 miRNA는 mir-122로 명명될 것이다. miRNA가 상이한 유기체의 공지의 miRNA에 유사한 것으로 발견되었다면, 이름은 [유기체 확인자]- mir-[숫자]의 형태로, 선택적 유기체 확인자 이름이 제공된다. 확인자는 호모 사피엔스의 경우 hsa 그리고 Mus Musculus의 경우 mmu를 포함한다. 예를 들면, mir-121에 인간 상동체는 hsa-mir-121로 명명될 것이며, 마우스 상동체는 mmu-mir-121로 명명되며, 쥐 상동체는 rno-mir-121 등으로 명명될 것이다.
성숙한 microRNA는 보통 접두사 "miR"이 붙고, 유전자 또는 전구물질 miRNA는 접두사 "mir"이 붙는다. 예를 들면, mir-121은 miR-121의 전구물질이다. 상이한 miRNA 유전자 또는 전구물질들이 동일한 성숙한 miRNA로 프로세스될 때, 이 유전자/전구물질은 숫자로 된 접미사로 나타낼 수 있다. 예를 들면, mir-121-1 및 mir-121-2는 miR-121로 프로세스되는 별개의 유전자 또는 전구물질을 지칭할 수 있다. 문자로 된 접미사들을 이용하여 밀접하게 관련된 성숙 서열들을 나타낸다. 예를 들면, mir-121a 및 mir-121b는 각각 밀접하게 관련된 miRNA miR-121a 및 miR-121b으로 프로세스될 수 있다. 본 발명의 내용에서, 접두사 mir-* 또는 miR-*를 가진 임의의 microRNA (miRNA 또는 miR)는 명시적으로 다른 언급이 없는 한, 전구물질 및/또는 성숙 종을 모두 포함하는 것으로 이해해야 한다.
일부의 경우, 두 가지 성숙 miRNA 서열들은 동일한 전구물질로부터 기원됨이 관찰된다. 서열들중 하나는 다른 것에 비하여 더 많을 경우, "*" 접미사를 이용하여 일반성이 적은 변이체를 나타낸다. 예를 들면, miR-121는 우세한 산물이며, 반면 miR-121*는 전구물질의 반대 측에서 볼 수 있는 일반성이 적은 변이체를 나타낸다. 우세 변이체가 확인되지 않는다면, miR는 전구물질의 5'가지로부터의 변이체에 대해 접미사 "5p"을 붙이고, 3'가지로부터의 변이체에 대해 접미사 "3p"을 붙여서 구별할 수 있다. 예를 들면, miR-121-5p는 전구물질의 5'가지로부터 기원되었고, 반면 miR-121-3p는 3'가지로부터 기원되었다. 흔하지는 않지만, 5p 및 3p 변이체들을 센스("s")과 안티센스 ("as")으 지칭할 수 있다. 예를 들면, miR-121-5p는 miR-121-s로 지칭할 수 있고, 반면 miR-121-3p는 miR-121-as으로 지칭할 수 있다.
상기 명명 협정은 세월이 경과함에따라 발전하여왔고, 절대적인 규칙보다는 일반적인 지침이다. 예를 들면, miRNA의 let- 및 lin- 패밀리는 일반명으로 지속적으로 지칭되고 있다. 전구물질/성숙 형에 대한 mir/miR은 또한 지침으로, 어떤 형태로 부를지를 결정하기 위해 내용을 고려해야만 한다. miR 명명에 대한 상세한 내용은 www.mirbase.org 또는 Ambros et al., A uniform 시스템 for microRNA annotation, RNA 9:277-279 (2003)을 참고한다.
식물 miRNA는 Meyers et al., Plant Cell. 2008 20(12):3186-3190에서 설명된 것과 같이 상이한 명명 협정을 따른다.
다수의 miRNA는 유전자 조절에 관여하고, 그리고 miRNA는 유전자 조절의 주요 단계로 현재 인지되는 넌-코딩 RNA의 성장하는 부류의 일부다. 일부 경우에서, miRNA는 이들의 표적 mRNA의 3-UTRs에 박혀있는 조절 부위에 결합하여 해독의 억제를 유도함으로써 해독을 방해할 수 있다. 표적 인지는 표적 부위와 miRNA의 씨드 영역 (miRNA's 5 단부에서 위치 2-8)의 상보적 염기 접합(pairing)이 관계하는데, 씨드 상보성의 정확한 수준은 정확하게 결정되지 않았고, 그리고 3 접합에 의해 수정될 수 있다. 접합. 다른 경우들에서, miRNA는 작은 간섭 RNA (siRNA)와 유사하게 기능을 하여, 그리고 완벽하게 상보적인 mRNA 서열들에 결합하여 표적 전사체를 파괴한다.
다수의 miRNA의 특징은 이들이 초기 발생, 세포 증식 그리고 세포 사멸, 아팝토시스(자가사멸) 그리고 지방 대사를 포함하는 다양한 프로세스에 영향을 준다는 것을 나타낸다. 예를 들면, 일부 miRNA, 가령 lin-4, let-7, mir-14, mir-23, 그리고 반탐(bantam)은 세포 분화 및 조직 발달에 주요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 다른 것들도 이들의 차등적 공간적 그리고 일시적 발현 패턴으로 인하여 유사한 중요한 역할을 가지는 것으로 본다.
miRBase (www.mirbase.org)에서 이용가능한 miRNA 데이터베이스는 공개된 miRNA 서열들 및 주석의 검색가능한 데이터베이스를 포함한다. 더우기 정보 약 miRBase에 대한 정보는 다음의 문헌들에서 찾아볼 수 있고, 이들 각각은 전문이 참고자료로 첨부된다: Griffiths-Jones et al., miRBase: tools for microRNA 게놈ss. NAR 2008 36(데이터베이스 Issue):D154-D158; Griffiths-Jones et al., miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. NAR 2006 34(데이터베이스 Issue):D140-D144; and Griffiths-Jones, S. microRNA Registry. NAR 2004 32(데이터베이스 Issue):D109-D111. 대표적 miRNA는 miRBase의 Release 16(September 2010)을 포함된다.
여기에서 설명된 것과 같이, microRNA는 암 및 기타 질환들에 관련된 것으로 알려져 있고, 그리고 시료 안에서 표현형을 특징화하기 위하여 평가할 수 있다. 가령, Ferracin et al., Micro지표s: miRNA in Cancer disgnosis and prostehics, Exp Rev Mol Diag, Apr 2010, Vol. 10, No. 3, P나이s 297-308; Fabbri, miRNA as 분자 bio지표s of Cancer, Exp Rev Mol Diag, May 2010, Vol. 10, No. 4, P나이s 435-444. 소낭들 및 miR를 단리하고 그리고 특징화하는 기술은 당업계의 숙련자들에게 공지되어 있다. 소낭 및 miR를 분리하고 특징화시키는 기술들은 당업계에 공지되어 있다. 여기에서 제시한 방법에 추가로, 추가 방법들은 미국 특허 제7,888,035호, "방법 FOR ASSESSING RNA PATTERN" (February 15, 2011); 그리고 국제 특허 출원 PCT/US2010/058461, "METHOD AND SYSTEM FOR ISOLATING, STORING, AND ANALYZING VESICLES"(November 30, 2010); 그리고 PCT/US2011/021160, "DETECTION OF GASTROINTESTINAL DISORDERS" (January 13, 2011); 이들 각 출원은 전문이 여기에 참고자료로 통합된다.
순환하는 생물지표들
순환하는 생물지표들은 혈액, 혈장, 혈청과 같은 체액에서 탐지가능한 생물지표들을 포함한다. 순환하는 암 생물지표들의 예로는 심장 트로포닌 T (cTnT), 전립선암에 대한 전립선 특이적 항원(PSA)과 난소암에 대한 CA125를 포함한다. 본 발명에 따른 순환하는 생물지표들은 체액에서 탐지될 수 있는 단백질, 핵산, 가령, DNA, mRNA 및 microRNA, 지질들, 탄수화물 및 대사산물들을 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 적합한 생물지표들을 포함한다. 순환하는 생물지표들은 막 연합된, 막 단편에 묻힌, 생물학적 복합체의 일부분, 또는 용액에서 자유로운 생물지표들과 같은 세포와 연합되지 않은 생물지표들을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 순환하는 생물지표들은 피험자의 생물학적 유체 안에 존재하는 하나 이상의 소낭과 연합된 생물지표들이다.
순환하는 생물지표들은 다양한 표현형의 특징화의 용도로 확인되었다. 가령, Ahmed N, et al., Proteomics-based Identification of haptoglobin-1 전구물질 as a 신규한 circulating biomaker of ovarian cancer. Br. J. Cancer 2004; Mathelin et al., circulating proteinic biomakers and Breast cancer, Gynecol Obstet Fertil. 2006 Jul-Aug;34(7-8):638-46. Epub 2006 Jul 28; Ye et al., Recent technical strategies to identify 진단적 biomakers for ovarian Cancer. Expert Rev Protemicss. 2007 Feb;4(1):121-31; Carney, circulating oncoproteins HER2/neu, EGFR and CAIX (MN) as 신규한 cancer biomakers for ovarian cancer. Expert Rev Mol Diagn. 2007 May;7(3):309-19; Gagnon, 발견 and Application of protein biomakers for ovarian cancer, Curr Opin Obstet Gynecol. 2008 Feb;20(1):9-13; Pasterkamp et al., immuno 조절물질y cells: circulating biomakers 인자ies in Cardi맥관 diseases. Clin Sci (Lond). 2008 Aug;115(4):129-31; Fabbri, miRNA as 분자 bio지표s of cancer, Exp Rev Mol Diag, May 2010, Vol. 10, No. 4, P나이s 435-444; PCT 특허 공개 WO/2007/088537; 미국 특허 제 7,745,150호 및 제7,655,479호; 미국 특허 공개 20110008808, 20100330683, 20100248290, 20100222230, 20100203566, 20100173788, 20090291932, 20090239246, 20090226937, 20090111121, 20090004687, 20080261258, 20080213907, 20060003465, 20050124071, 및 20040096915, 이들 각 출원은 전문이 여기에 참고자료로 통합된다.
소낭 농축(Enrichment)
소낭 또는 소낭들의 집단은 분석 전/또는 분석하는 동안 단리되거나, 정제되거나, 농축되거나 또는 다른 수단으로 풍부하게 될 수 있다. 다른 언급이 없는 한, 소낭들 또는 생물지표 구성요소들과 관련하여 여기에서 사용된 용어 "정제된", "단리된" 또는 이와 유사한 것은 세포 또는 유기체로부터 이러한 구성요소들의 부분적 또는 완벽한 정제 또는 단리를 포함한다는 의미다. 소낭의 분석은 생물학적 시료의 하나 이상의 소낭 집단의 양을 정량화하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들면, 이종(이질성) 집단의 소낭이 정량화되거나 또는 동종(균질성) 집단의 소낭, 가령 특정 생물지표 프로파일을 가진, 특정 생체특징을 가진, 또는 특정 세포 유형으로부터 유도된 소낭 집단은 이종 집단의 소낭으로부터 단리되고, 정량화될 수 있다. 소낭의 분석은 또한 하나 이상의 특정 생물지표 프로파일 또는 소낭의 생체특징을 여기에서 설명된 것과 같이, 정성적으로 또는 정량적으로 탐지하는 것을 포함할 수 있다.
소낭은 생물-유체 은행과 같은 곳에 보관하거나 저장할 수 있고, 필요시 분석을 위하여 꺼낼 수 있다. 소낭은 살아있는 또는 죽은 피험자로부터 이미 수거되고 보관된 생물학적 시료로부터 또한 단리할 수 있다. 추가로, 소낭은 King et al., Breast Cancer Res 7(5): 198-204 (2005)에서 설명된 것과 같이 수거된 생물학적 시료로부터 단리할 수 있다. 소낭은 보관된 또는 저장된 시료로부터 단리할 수 있다. 대안으로, 소낭은 시료의 보관 또는 저장없이 생물학적 시료로부터 단리되고 분석될 수 있다. 더욱이, 제 3 집단은 생물학적 시료를 수득하거나 보관할 수 있고, 또는 분석을 위하여 소낭을 구하거나 또는 보관할 수 있다.
소낭의 농축된 집단은 생물학적 시료로부터 수득할 수 있다. 예를 들면, 소낭은 크기 압출 크로마토그래피, 밀도 그라디언트 원심분리, 차등 원심분리, 나노막 한외여과, 면역흡착 캡쳐, 친화력정제, 마이크로유체 분리, 또는 이의 조합들을 이용하여 생물학적 시료로부터 농축하거나 또는 단리할 수 있다.
크기 압출 크로마토그래피, 가령 겔 침투 컬럼, 원심분리 또는 밀도 그라디언트 원심분리, 그리고 여과 방법들을 이용할 수 있다. 예를 들면, 소낭은 차등 원심분리, 음이온 교환 및/또는 겔 침투 크로마토그래피 (예를 들면, 미국 특허 제6,899,863호 및 제6,812,023호에서 설명된 것과 같이), 슈크로즈 밀도 그라디언트, 세포기관 전기영동 (예를 들면, 미국 특허 제7,198,923호에서 설명된 것과 같은), 자석 활성화된 세포 분류 (MACS), 또는 나노막 한외여과 농축기에 의해 단리될 수 있다. 다양한 조합의 분리 또는 농축 방법들을 이용할 수 있다.
매우 풍부한 단백질들, 가령 알부민 및 면역글로블린은 생물학적 시료로부터 소낭의 분리를 방해할 수 있다. 예를 들면, 소낭은 생물학적 시료, 가령 혈액에서 발견되는 가장 풍부한 단백질들에 특이적인 다중 항체들을 이용하는 시스템에 의해 생물학적 시료로부터 단리시킬 수 있다. 이러한 시스템은 한번에 몇 가지 단백질들을 제거할 수 있고, 따라서 기원 세포 특이적 소낭과 같은 풍부성이 덜한 종들을 밝힐 수 있다.
이러한 유형의 시스템은 혈액, 뇌척수액 또는 소변과 같은 생물학적 시료로부터 소낭을 분리하는데 이용할 수 있다. 생물학적 시료로부터 소낭의 분리는 또한 Chromy et al. J Proteome Res 2004; 3:1120-1127에서 설명된 고도로 풍부한 단백질 제거 방법들에 의해 강화될 수 있다. 또다른 구체예에서, 생물학적 시료로부터 소낭의 분리는 Zhang et al, Mol Cell Protemics 2005;4:144-155에서 설명된 것과 같이 당펩티드 캡쳐를 이용하여 혈청 단백질을 제거함으로써 강화될 수 있다. 추가로, 생물학적 시료, 가령 소변으로부터 소낭의 단리는 차등 원심분리후 세포질 또는 항-세포질 에피토프에 대한 항체로 접촉시켜 실시할 수 있다(Pisitkun et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 2004;101:13368-13373).
생물학적 시료로부터 소낭의 분리 또는 농축(enrichment)은 초음파파쇄 (예를 들면, 초음파를 제공함으로써), 세제, 다른 막-활성화 물질, 또는 이의 임의의 조합을 이용하여 강화할 수 있다. 예를 들면, 초음파 에너지를 잠재적 종양 부위로 적용할 수 있고, 이론에 결부되지 않고, 조직으로부터 소낭의 방출을 증가시킬 수 있어, 이로써 여기에서 설명된 하나 이상의 방법들을 이용하여 생물학적 시료로부터 분석 또는 평가할 소낭 집단의 농축이 가능하다.
시료 취급(Sample Handling)
여기에서 설명된 것과 같이, 순환하는 생물지표들을 탐지하는 방법들, 가령, 항체 친화력 분리와 함께, 다양한 농축 또는 분리 과정을 이용하여 결과의 일관성을 최적화할 수 있다. 이러한 단계들은 쉐이킹 또는 볼텍싱과 같은 교반, 폴리머 기반의 분리, 가령, PEG와 함께 상이한 분리 기술들, 그리고 여과 또는 다른 단계들 동안 상이한 수준으로 농축시키는 것을 포함할 수 있다. 시료를 암유하는 소낭을 테스트하는 다양한 단계에 적용할 수 있다는 것은 당업자들이 인지할 것이다. 한 구체예에서, 시료 자체, 가령, 혈장 또는 혈청과 같은 체액을 볼텍스한다. 일부 구체예들에서, 하나 이상의 시료 처리 단계, 가령, 소낭 분리가 일어난 후, 시료를 볼텍스한다. 교반(Agitation)은 필요에 따라 일부 또는 모든 적절한 시료 처리 단계에서 일어날 수 있다. 첨가제는 가령, 관심대상의 생물지표들의 응집 또는 분해를 조절하는, 프로세스를 개선시키기 위하여, 다양한 단계에 도입시킬 수 있다.
결과는 이 시료를 다양한 물질들로 처리함으로써 바람직한 수준으로 또한 최적화시킬 수 있다. 이러한 물질들은 응집을 조절하기 위한 첨가제 및/또는 pH 또는 이온 강도를 조정하기 위한 첨가제를 포함한다. 응집을 조절하는 첨가제는 소 혈청 알부민 (BSA) 및 우유, 무질서유발(chaotropic) 물질들 가령, 구아니듐 하이드로클로라이드, 그리고 세척제 또는 계면활성제와 같은 차단 물질들을 포함한다. 유용한 이온성 세척제는 쇼듐 도데실 술페이트 (SDS, 쇼듐 라우릴 술페이트 (SLS)), 쇼듐 라우레 술페이트 (SLS, 쇼듐 라우릴 에테르 술페이트 (SLES)), 암모늄 라우릴 술페이트 (ALS), 센트리모니움 브롬화물, 센트리모니움 염화물, 센트리모니움 스테아레이트, 및 이와 유사한 것들을 포함한다. 유용한 비-이온성 (zwitterionic) 세척제는 폴리옥시에틸렌 글리콜, 폴리소르베이트 20 (Tween 20으로도 알려짐), 기타 폴리소르베이트 (가령, 40, 60, 65, 80, 등), Triton-X (가령, X100, X114), 3-[(3-콜라아미드프로필)디메틸암모니오]-1-프로판술포네이트(CHAPS), CHAPSO, 데옥시콜산, 쇼듐 데하이드로콜레이트, NP-40, 글리코시드, 옥틸-티오-글루코시드, 말토시드, 및 이와 유사한 것들을 포함한다. 일부 구체예들에서, 혈소판 응집을 감소시키는 것을 보여준 계면활성제, Pluronic F-68을 이용하여 분리 및/또는 탐지하는 동안 소낭을 함유하는 시료를 처리한다. F68은 0.1% 내지 10% 농도, 가령, 1%, 2.5% 또는 5% 농도로 이용할 수 있다. 용액의 pH 및/또는 이온 강도는 다양한 산, 또는 완충액, 또는 염으로 조정할 수 있는데, 예를 들면, 염화나트륨(NaCl), 인산염-완충된 염수 (PBS), 트리스-완충된 염수 (TBS), 인산나트륨염, 염화칼륨염, 인산칼륨염, 구연산나트륨염 그리고 염수-구연산나트륨염 (SSC) 완충액을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일부 구체예들에서, NaCl은 0.1% 내지 10%의 농도, 가령, 1%, 2.5% 또는 5%의 최종 농도로 추가한다. 일부 구체예들에서, Tween 20은 0.005 내지 2% 농도, 가령, 0.05%, 0.25% 또는 0.5 %의 최종 농도로 추가한다. 본 발명에 사용하는 차단 물질은 비활성 단백질, 가령, 우유 단백질, 비-지방 건유 단백질, 알부민, BSA, 카제인, 또는 혈청 가령, 신생 송아지 혈청 (NBCS), 염소 혈청, 토끼혈청 또는 연어 혈청을 포함한다. 단백질은 0.1% 내지 10% 농도, 가령, 1%, 2%, 3%, 3.5%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 또는 10% 농도에서 추가할 수 있다. 일부 구체예들에서, BSA는 0.1% 내지 10% 농도, 가령, 1%, 2%, 3%, 3.5%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 또는 10% 농도에서 추가한다. 한 구체예에서, 시료는 미국 특허 출원 11/632946, (July 13, 2005 제출)에서 제시한 방법에 따라 처리하며, 이 출원은 여기에 참고자료로 통합된다. 시판되는 차단제들, 가령, SuperBlock, StartingBlock, Protein-Free, Pierce (division of Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL)를 이용할 수 있다. 일부 구체예들에서, SSC/세척제 (가령, 0.5%의 Tween 20 또는 0.1%의 Triton-X 100과 함께 20X SSC)는 0.1% 내지 10% 농도, 가령, 1.0% 또는 5.0% 농도로 추가한다.
소낭들 및 기타 순환하는 생물지표들을 탐지하는 방법들은 여기에서 설명된 것과 같이, 프로토콜 및 처리를 다양하게 조합하여 원하는 데로 최적화시킬 수 있다. 탐지 프로토콜은 교반, 분리 방법들, 및 첨가제들의 다양한 조합에 의해 최적화할 수 있다. 일부 구체예들에서, 환자 시료는 분리 단계 전 그리고 단계 후에 볼텍스하고, 그리고 시료는 BSA 및/또는 F68을 포함하는 차단 물질로 처리한다. 이러한 처리는 큰 응집물 또는 단백질 또는 기타 생물학적 찌꺼기의 형성을 감소시킬 수 있고, 따라서 좀더 일관성있는 탐지 판독을 제공할 수 있다.
여과 및 한외여과(ultra여과)
소낭은 여과 모듈을 통하여 피험자로부터 생물학적 시료를 여과하고, 소낭을 포함하는 여과되지 못한 물질(retentate)을 수거하고, 이로써 생물학적 시료로부터 소낭을 단리시킬 수 있다. 이 방법은 필터를 포함하는 여과 모듈을 통하여 피험자로부터 생물학적 시료를 여과시키고, 그리고 소낭을 포함하는 여과되지 못한 물질(retentate)을 수거하고, 이로써 생물학적 시료로부터 소낭을 단리시키는 것을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 이 필터는 약 100 kilo Daltons 이상의 분자들을 유지시킨다.
이 방법은 소낭의 생체특징을 결정하는 것을 더 포함할 수 있다. 이 방법은 여과되지 못한 물질을 다중 기질에 제공하는 것을 더 포함할 수 있는데, 여기에서 각 기질은 하나 이상의 캡쳐 물질에 연결되어 있으며, 그리고 다중 기질의 부분 집합은 다중 기질의 또다른 부분집합과는 상이한 켭쳐 물질 또는 캡쳐 물질 조합을 포함한다.
시료 안에 소낭의 생체특징을 결정하는 방법을 또한 제시하는데, 이 방법은 다음을 포함한다: 여과 모듈을 통하여 장애를 가진 피험자의 생물학적 시료를 여과하고, 이 여과 모듈로부터 하나 이상의 소낭을 포함하는 여과되지 못한 물질을 수거하고, 그리고 하나 이상의 소낭의 생체특징을 결정한다. 한 구체예에서, 이여과 모듈은 약 100 또는 150 kilo Daltons 이상의 분자들을 유지시키는 필터를 포함한다.
여기에서 설명된 방법은 여과 모듈을 통하여 피험자의 생물학적 시료를 여과하고; 이 여과 모듈로부터 하나 이상의 소낭을 포함하는 여과되지 못한 물질을 수거하고; 그리고 하나 이상의 소낭의 생체특징을 탐지하고; 이 생체특징에 근거하여 피험자의 표현형을 특징화함으로써 피험자의 표현형을 특징화하는 것을 더 포함할 수 있는데, 이때 특징화는 최소한 70% 감응성을 가진다. 일부 구체예들에서, 특징화는 이 생체특징을 가진 하나 이상의 소낭의 양을 결정하는 것을 포함한다. 더욱이, 특징화는 약 80% 내지 100% 감응성을 가질 수 있다.
다수의 소낭의 다중 분석을 위한 방법을 또한 여기에서 제시한다. 일부 구체예들에서, 이 방법은 여과 모듈을 통하여 피험자의 생물학적 시료를 여과하고; 이 여과 모듈로부터 다수의 소낭을 포함하는 여과되지 못한 물질을 수거하고; 다수의 소낭을 다수의 캡쳐 물질에 제공하고, 여기에서 다수의 캡쳐 물질은 다수의 기질에 연결되며, 그리고 다수의 기질의 각 부분집합은 다수의 기질의 또다른 부분집합과 상이하게 라벨되며; 다수의 소낭의 최소한 하나의 부분집합을 캡쳐하고; 그리고 캡쳐된 소낭의 최소한 하나의 부분집합에 대한 생체특징을 결정하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 각 기질은 하나 이상의 캡쳐 물질에 연결되며, 그리고 다수의 기질의 각 부분집합은 다수의 기질의 다른 부분집합과 비교하여 상이한 캡쳐 물질 또는 캡쳐 물질 조합을 포함한다. 일부 구체예들에서, 다수의 기질의 최소한 한 부분집합은 하나 이상의 라벨을 포함하여 본질적으로 라벨된다. 이 기질은 미립자 또는 비드, 또는 이의 임의의 조합일 수 있다. 일부 구체예들에서, 여과는 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 또는 500 kiloDaltons 이상으로 더 큰 분자를 유지시킨다. 한 구체예에서, 여과 모듈은 약 100 또는 150 kilo Daltons 이상의 분자들을 유지시키는 필터를 포함한다. 한 구체예에서, 여과 모듈은 약 9, 20, 100 또는 150 kiloDaltons 이상의 분자를 유지시키는 필터를 포함한다.
일부 구체예들에서, 다수의 소낭의 다중 분석을 위한 방법은 여과 모듈을 통하여 피험자의 생물학적 시료를 여과시키고, 여기에서 여과 모듈은 약 100 또는 150 kilo Daltons 이상의 분자들을 유지시키는 필터를 포함하고; 여과 모듈로부터 다수의 소낭을 포함하는 여과되지 못한 물질을 수거하고; 다수의 소낭을 다수의 캡쳐 물질에 제공하고, 여기에서 다수의 캡쳐 물질은 마이크로어래이에 연결되며; 마이크로어래이 상에서 다수의 소낭의 최소한 하나의 부분집합을 캡쳐하고; 그리고 캡쳐된 소낭의 최소한 하나의 부분집합의 생체특징을 결정하는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 필터는 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 또는 500 kiloDaltons 이상의 분자를 유지시킨다. 한 구체예에서, 여과 모듈은 약 100 또는 150 kilo Daltons 이상의 분자들을 유지시키는 필터를 포함한다. 한 구체예에서, 여과 모듈은 약 9, 20, 100 또는 150 kiloDaltons 이상의 분자를 유지시키는 필터를 포함한다.
이 생물학적 시료는 여과에 의한 분리전에 정화(clarification)할 수 있다. 정화는 세포 찌꺼지 및 기타 바람직하지 않은 물질의 선택적 제거를 포함한다. 예를 들면, 순환하는 생물지쵸들의 탐지를 방해할 수 있는 세포찌꺼지 및 기타 성분들은 제거될 수 있다. 정화는 저속 원심분리, 가령, 약 5,000x g, 4,000x g, 3,000x g, 2,000x g, 1,000x g, 또는 이 미만에서 저속 원심분리에 의해 실시할 수 있다. 소낭을 담고 있는 상층액, 또는 정화된 생물학적 시료는 그 다음 수거하고, 여과하여 정화된 생물학적 시료로부터 소낭을 단리시킬 수 있다. 일부 구체예들에서, 이 생물학적 시료는 여과에 의한 소낭 분리전, 정화되지 않는다.
일부 구체예들에서, 시료로부터 소낭의 분리시에 고속 원심분리, 가령 한외원심분리를 이용하지 않는다. 예를 들면, 분리는 원심분리 속도, 가령 약 100,000x g 또는 그 이상의 이용을 요구하지 않을 수 있다. 일부 구체예들에서, 시료로부터 소낭의 분리시에 50,000x g, 40,000x g, 30,000x g, 20,000x g, 15,000x g, 12,000x g, 또는 10,000x g 미만의 속도를 이용한다.
임의의 수의 이용가능한 필터 형태를 이용하여 관심 시료를 여과할 수 있다. 생물학적 시료로부터 소낭을 단리시키는데 이용되는 여과 모듈은 섬유-기반 여과 카트릿지일 수 있다. 예를 들면, 이 섬유는 속이 빈 폴리머 섬유, 가령, 폴리프로필렌 속이 빈 섬유일 수 있다. 생물학적 시료는 시료 유체, 가령, 여기에서 설명된 생물학적 유체를 펌프 장치, 가령, 연동 펌프를 이용하여 모듈로 펌핑하여 여과모듈로 도입시킬 수 있다. 펌프 유속은 가령, 분당 약 0.25mL, 0.5mL, 1mL, 1.5mL, 2mL, 2.5mL, 3mL, 3.5mL, 4mL, 4.5mL, 5mL, 6mL, 7mL, 8mL, 9mL, 또는 10 mL/minute에서 다양할 수 있다. 유속은 주어진 행태, 가령, 여과 모듈의 크기 및 처리량에 대해 조정될 수 있다.
여과 모듈은 막 여과 모듈일 수 있다. 예를 들면, 막 여과 모듈은 교반된 세포 장치(가령, 자석 교반기를 포함하는) 내에 내장된 필터 디스크 막, 가령, 친수성 폴리비닐리덴 디플로라이드 (PVDF) 필터 디스크 막을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 시료는 필터 막의 어느 측면에 생긴 압력 차로 인하여 필터를 통하여 이동한다.
필터는 낮은 소수성 흡수성 및/또는 높은 친수성 성질을 보유한 재질을 포함할 수 있다. 예를 들면, 필터는 소낭은 유지시키고 대부분의 단백질들은 침투시키는 평균 포어 크기를 보유하고 뿐만 아니라 친수성인 표면을 보유하여, 이로 인하여 단백질 흡착을 제한시킬 수 있다. 예를 들면, 필터는 폴리프로필렌, PVDF, 폴리에틸렌, 폴리플로오르에틸렌, 셀룰로오즈, 2차 셀룰로오즈 아세테이트, 폴리비닐알코올, 그리고 에틸렌비닐 알코올로 구성된 군으로부터 선택된 재료를 포함할 수 있다(EVAL®, Kuraray Co., Okayama, Japan). 필터에 이용될 수 있는 추가 재료는 폴리술폰 및 폴리에테르술폰을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
여과 모듈은 약 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 400, 또는 500 kilo Daltons (kDa)이상의 분자들을 유지시키는 필터, 가령, 약 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 400, 또는 500의 MWCO (분자량 컷오프)을 가진 필터를 보유할 수 있다. MWCO 9 kDa, 20 kDa 및/또는 150 kDa 범위의 한외여과막이 이용될 수 있다. 일부 구체예들에서, 여과 모듈내 필터는 약 0.01 ㎛ 내지 약 0.15 ㎛의 평균 포어 직경을 보유하며, 일부 구체예들에서 약 0.05 ㎛ 내지 약 0.12 ㎛의 평균 포어 직경을 보유한다. 일부 구체예들에서, 필터는 약 0.06 ㎛, 0.07. ㎛, 0.08 ㎛, 0.09 ㎛, 0.1 ㎛, 0.11 ㎛ 또는 0.12 ㎛의 평균 포어 직경을 보유한다.
여과 모듈는 상업적으로 이용가능한 컬럼, 가령, 단백질들을 농축 또는 단백질을 분리(가령, 한외여과)하는데 전형적으로 이용되는 컬럼일 수 있다. 실시예는 Millpore (Billerica, MA)의 컬럼, 가령, Amicon® 원심분리 여과, 또는 Pierce® (Rockford, IL)의 컬럼, 가령, Pierce 농축 필터 장치를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 유용한 컬럼들(Pierce company)은 9 kDa, 20 kDa 및/또는 150 kDa의 MWCO를 가진 일회용 한외여과 원심분리 장치들을 포함한다. 이들 농축장치들은 원뿔형 장치에 용접된 고성능 재생 셀룰로오즈 막으로 구성된다. 필터들은 미국 특허 제6,269,957호 또는 제6,357,601호에서 설명하는 것일 수 있고, 이둘 모두 전문이 여기에 참고자료로 통합된다.
단리된 소낭을 포함하는 여과되지 못한 물질은 여과 모듈로부터 수거할 수 있다. 여과되지 못한 물질은 필터로부터 여과되지 못한 물질을 흘러내리게 함으로써 수거할 수 있다. 이론에 결부되지 않고, 여과되지 못한 물질의 더 용이한 수거와 가혹한 사용을 감소시키고, 또는 시간-소모적 수거 기술을 최소화하기 위하여 친수성 표면 성질들을 보유하고, 이로 인하여 단백질 흡착을 제한시키는 필터 조성물을 선택할 수 있다.
수거된 여과되지 못한 물질은 그 다음 여기에서 설명되는 것과 같이, 후속 분석, 가령, 여과되지 못한 물질 안의 하나 이상의 소낭의 생체특징을 평가하는 후속 분석에 이용할 수 있다. 이 분석은 수거된 여과되지 못한 물질에서 직접 실행할 수 있다. 대안으로, 수거된 여과되지 못한 물질은 하나 이상의 소낭을 분석하기 전 추가 농축 또는 정제할 수 있다. 예를 들면, 여과되지 못한 물질은 여기에서 설명된 것과 같이 더 농축시키거나 또는 크기 압출 크로마토그래피, 밀도 그라디언트 원심분리, 차등 원심분리, 면역흡착 캡쳐, 친화력정제, 마이크로유체 분리, 또는 이의 조합들을 이용하여 여과되지 못한 물질로부터 소낭을 단리시킬 수 있다. 일부 구체예들에서, 여과되지 못한 물질은 또다른 여과 단곌를 거칠 수 있다. 대안으로, 필터를 이용하여 소낭을 분리하기 전, 이 소낭은 크기 압출 크로마토그래피, 밀도 그라디언트 원심분리, 차등 원심분리, 면역흡착 캡쳐, 친화력정제, 마이크로유체 분리, 또는 이의 조합들을 이용하여 농축 또는 단리된다.
생물지표들의 농축 및 단리에 필터의 조합이 이용될 수 있다. 예를 들면, 생물학적 시료는 약 0.01 μm 내지 약 2 μm, 약 0.05 μm 내지 약 1.5 μm 사이의 다공성 또는 구멍 크기를 가진 필터를 통하여 우선 여과될 수 있고, 그리고 그 다음 이 시료가 여과된다. 예를 들면, 약 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 400, 또는 500 kilo Daltons (kDa)이상의 분자들을 유지시키는 필터, 가령, 약 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 400, 또는 500의 MWCO(분자량 컷오프)를 보유한 필터를 가진 여과 모듈을 통하여 생물학적 시료를 여과하기 전, 이 생물학적 시료는 약 0.01 ㎛ 내지 약 2 ㎛, 약 0.05 ㎛ 내지 약 1.5 ㎛의 포터 크기 또는 다공성을 보유한 필터를 통하여 우선 여과될 수 있으며, 일부 구체예들에서, 필터는 약 0.5㎛, 0.6㎛, 0.7㎛, 0.8㎛, 0.9㎛, 1.0㎛, 1.1㎛, 1.2㎛, 1.3㎛, 1.4㎛, 1.5㎛, 1.6㎛, 1.7㎛, 1.8㎛, 1.9㎛ 또는 2.0 ㎛의 포어 크기를 보유한다. 필터는 주사기 필터일 수 있다. 따라서, 한 구체예에서, 이 방법은 약 100 또는 150 kilo Daltons 이상의 분자들을 유지시키는 필터를 포함하는 여과 모듈을 통하여 시료를 여과시키기 전, 필터, 가령, 주사기 필터를 통하여 생물학적 시료를 여과시키는 것을 포함하는데, 여기에서 주사기 필터는 약 1 ㎛ 이상의 다공성을 보유한다. 한 구체예에서, 이 필터는 1.2 ㎛ 필터이며, 그리고 여과는 150 kDa 컷오프를 가진 7㎖ 또는 20㎖ 농축기 컬럼을 통하여 시료를 통과시킴으로 진행된다.
여과 모듈은 마이크로유체 장치의 성분일 수 있다. "lab-on-a-chip" 시스템, 생물의학적 마이크로-전자-기계 시스템 (bioMEMs), 또는 다성분 집적 시스템으로도 불리는 마이크로유체 장치를 이용하여 소낭을 단리하고, 그리고 분석할 수 있다. 이러한 시스템들은 소낭의 결합, 생물지표들의 탐지, 그리고 여기에서 추가 설명된 다른 프로세스들을 가능하게 하는 프로세스를 소형화하고 그리고 구획화한다.
마이크로유체 장치는 여과 모듈을 포함함으로써 소낭 분리에 이용할 수도 있다. 예를 들면, 마이크로유체 장치는 생물학적 시료의 크기에 근거하여 생물학적 시료로부터 소낭을 단리시키기 위하여 하나 이상의 채널을 이용할 수 있다. 생물학적 시료는 하나 이상의 마이크로유체 채널로 도입될 수 있고, 이 채널은 소낭의 통과를 선택적으로 허용한다. 마이크로유체 장치는 결합물질을 더 포함하거나, 또는 소낭의 성질, 예를 들면, 크기, 모양, 기형성(deformability), 생물지표 프로파일, 또는 생체특징에 근거하여 소낭을 선별하는 하나 이상의 여과 모듈을 더 포함할 수 있다.
결합물질(Binding 나이nts)
결합제(결합 시약으로도 또한 지칭됨)는 표적 생물지표에 결합할 수 있는 물질들을 포함한다. 결합제는 표적 생물지표에 특이적일 수 있고, 표적 생물지표에 결합할 수 있는 물질을 의미한다. 표적은 본 명세서에서 기술된 임의의 유용한 생물지표, 가령, 소낭 표면에 있는 생물지표와 같은 것일 수 있다. 일부 구체예들에서, 이 표적은 단일 분자, 이를 테면 단일 단백질인데, 결합제는 단일 단백질에 특이적이다. 다른 구체예들에서, 이 표적은 분자들의 집단, 이를 테면 유사한 에피토프 또는 모이어티를 보유하는 패밀리 또는 단백질이며, 이 결합제는 단백질의 패밀리 또는 집단에 특이적이다. 분자 집단은 분자의 분류, 이를 테면 단백질, DNA 또는 RNA일 수 있다. 이 결합제는 소낭의 성분 또는 생물지료에 결합함으로써 소낭을 캡쳐하는데 이용되는 캡쳐 물질일 수 있다. 일부 구체예들에서, 캡쳐 물질은 소낭상에 있는 항원에 결합하는 항체 또는 이의 단편, 또는 압타머일 수 있다. 캡쳐 물질은 임의선택적으로 기질에 결합될 수 있고, 소낭을 단리하는데 사용될 수 있는데, 하기에서 더 상세하게 설명된다.
결합물질은 순환하는 생물지표, 가령, 소낭 또는 소낭의 성분에 결합하는 물질이다. 결합물질은 캡쳐 물질 및/또는 탐지 물질로 이용할 수 있다. 캡쳐 물질은 가령, 소낭의 성분 또는 생물지표에 결합함으로써, 순환하는 생물지표에 결합하고, 이를 캡쳐할 수 있다. 예를 들면, 캡쳐 물질은 소낭에 있는 항원에 결합하는 캡쳐 항체 또는 캡쳐 항원일 수 있다. 탐지 물질은 순환하는 생물지표에 결합할 수 있고, 이로 인하여 이 생물학적지표의 탐지를 실행한다. 예를 들면, 기질에 차단된 항체 또는 압타머를 포함하는 캡쳐 물질은 시료 안의 소낭을 캡쳐하는데 이용할 수 있고, 그리고 라벨을 운반하는 항체 또는 압타머를 포함하는 탐지 물질은 탐지 물질의 라벨의 탐지를 통하여 캡쳐된 소낭을 탐지하는데 이용할 수 있다. 일부 구체예들에서, 소낭은 동일한 소낭 생물지표들을 인지하는 캡쳐 및 탐지 물질을 이용하여 평가한다. 예를 들면, 소낭 집단은 테트라스파닌을 이용하여 가령, 기질에 결합된 항-CD9 항체를 이용함으로써 캡쳐되고, 그리고 캡쳐된 소낭은 캡쳐된 소낭에 라벨을 붙이는 형광으로 라벨된 항-CD9 항체를 이용하여 탐지할 수 있다. 다른 구체예들에서, 소낭은 상이한 소낭 생물지표들을 인지하는 캡쳐 및 탐지 물질을 이용하여 평가한다. 예를 들면, 소낭 집단은 세포-특이적 지표 가령, 기질에 결합된 항-PCSA 항체를 이용하여 캡쳐될 수 있고, 그리고 캡쳐된 소낭은 캡쳐된 소낭에 라벨을 붙이는 형광으로 라벨된 항-CD9 항체를 이용하여 탐지할 수 있다. 유사하게, 이 소낭 집단은 일반적 소낭 지표 가령, 기질에 결합된 항-CD9 항체를 이용하여 캡쳐될 수 있고, 그리고 캡쳐된 소낭은 캡쳐된 소낭에 라벨을 붙이는 세포-특이적 또는 질환 특이적 지표에 특이적인 형광으로 라벨된 항-CD9 항체를 이용하여 탐지할 수 있다.
이 결합제에 의해 인지되는 생물지표들은 때로 항원으로 지칭되기도 한다. 다른 언급이 없는 한, 여기에서 이용된 항원은 결합제의 유형 및 생물지료의 면역원성과는 무관하게 결합제에 의해 결합될 수 있는 임의의 엔터리를 포괄한다. 항원은 이의 기능성 단편을 더 포괄한다. 예를 들면, 항원은 결합제에 의해 결합될 수 있는 단백질 및 이의 단편을 포함하는 생물지표를 포괄할 수 있다.
한 구체예에서, 소낭은 소낭의 생물지표에 결합하는 캡쳐 물질을 이용하여 캡쳐된다. 캡쳐 물질은 기질에 연결되고, 소낭을 단리시키는데 이용할 수 있으며, 이에 대해서 더 설명한다. 한 구체예에서, 캡쳐 물질은 물질 또는 시료에 존재하는 소낭의 친화적 캡쳐 또는 분리에 이용한다.
결합물질은 생물학적 시료로부터 소낭을 농축 또는 단리한 후에 이용할 수 있다. 예를 들면, 소낭은 생물학적 시료로부터 우선 단리시키고, 그 다음 특이적 생체특징을 가진 소낭을 단리 또는 탐지한다. 특이적 생체특징을 가진 소낭은 이 생물학적지표에 대한 결합물질을 이용하여 단리 또는 탐지할 수 있다. 특이적 생물지표를 가진 소낭은 이종 집단의 소낭으로부터 단리 또는 탐지할 수 있다. 대안으로, 사전 분리 또는 농축 단계 없이 소낭을 포함하는 생물학적 시료에 결합 물질을 이용할 수 있다. 예를 들면, 결합물질을 이용하여 생물학적 시료로부터 직접적으로 특이적 생체특징을 가진 소낭을 단리 또는 탐지한다.
결합물질은 소낭의 성분에 결합할 수 있는 핵산, 단백질, 또는 다른 분자 일 수 있다. 결합물질은 DNA, RNA, 단클론 항체들, 다클론 항체들, Fabs, Fab', 단일 쇄 항체들, 합성 항체들, 압타머들 (DNA/RNA), 펩토이드, zDNA, 펩티드 핵산 (PNAs), 잠김 핵산 (LNAs), 렉틴, 합성 또는 자연 생성 화학적 화합물(약물, 라벨링 시약을 포함하나 이에 한정되지 않는), 덴드라이머, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들면, 결합물질은 캡쳐 항체일 수 있다. 본 발명의 구체예들에서 , 결합물질은 막 단백질 라벨링 물질을 포함한다. 가령, 막 단백질 라벨링 물질은 Alroy et al., 미국 특허 공개 US 2005/0158708에서 설명한다. 한 구체예에서, 소낭은 여기에서 설명된 것과 같이 단리 또는 캡쳐되고, 하나 이상의 막 단백질 라벨링 물질을 이용하여 이 소낭을 탐지한다.
일부 경우들에서, 단일 결합물질은 소낭을 단리 또는 탐지하는데 이용할 수 있다. 다른 경우들에서, 상이한 결합물질의 조합을 이용하여 소낭을 단리 또는 탐지할 수 있다. 예를 들면, 최소한 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 25개, 50개, 75개 또는 100개 상이한 결합물질을 이용하여 생물학적 시료로부터 소낭을 단리 또는 탐지할 수 있다. 더욱이, 하기에서 더 설명되는 것과 같이, 소낭에 대한 하나 이상의 상이한 결합물질은 소낭의 생체특징을 형성할 수 있다.
상이한 결합물질을 다중화(multiplexing)에 또한 이용할 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 소낭 집단의 분리 또는 탐지는 상이한 결합물질을 가진 각 소낭 집단을 분리 또는 탐지함으로써 실행할 수 있다. 상이한 결합물질은 상이한 미립자에 결합할 수 있으며, 여기에서 상이한 미립자는 라벨된다. 또다른 구체예에서, 상이한 결합물질을 포함하는 어래이는 다중 분석에 이용할 수 있고, 여기에서 상이한 결합물질은 차등적으로 라벨되거나 또는 어래이 상에 결합 물질 위치에 근거하여 확인할 수 있다. 다중화는 하기에서 설명된 것과 같이 라벨 또는 탐지 방법의 분해 능력에 따라 성취될 수 있다. 결합물질을 이용하여 가령, 세포 기원 특이적 소낭을 탐지하기 위하여 소낭을 탐지할 수 있다. 결합물질 또는 다중 결합물질들 자체가 결합물질 프로파일을 형성하여 소낭에 대한 생체특징을 제공할 수 있다. 하나 이상의 결합물질은 2011년 4월 6일자로 제출된 국제 특허 출원 Serial No. PCT/US2011/031479(이 출원은 전문이 여기에 참고자료로 편입된다), "Circulating Biomakers for Disease"의 도 2로부터 선택할 수 있다. 예를 들면, 이종 집단의 소낭으로부터 소낭의 차등 탐지 또는 분리에서 2, 3, 4가지 이상의 결합 물질을 이용하여 소낭 집단이 탐지되거나 단리된다면, 소낭 집단에 대한 특정 결합물질 프로파일은 특정 소낭 집단에 대한 생체특징을 제공한다. 소낭은 다중 방식으로 임의의 수의 결합물질을 이용하여 탐지할 수 있다. 따라서, 결합물질을 또한 이용하여 소낭에 대한 생체특징을 형성할 수 있다. 이 생체특징을 이용하여 표현형을 특징화할 수 있다.
결합물질은 렉틴일 수 있다. 렉틴은 식물과 동물에 광범위하게 분포된 폴리사카라이드와 당단백질들에 선택적으로 결합하는 단백질들이다. 예를 들면, 렉틴 가령, 갈란투스 니발리스 어글루티닌(Galanthus nivalis agglutinin)("GNA")의 형태로 갈란투스 니발리스(Galanthus nivalis)로부터 유도된, 나르시수스 슈도나르시수스(Narcissus pseudonarcissus) 어글루티닌 ("NPA")의 형태로 나르시수스 슈도나르시수스(Narcissus pseudonarcissus)로부터 유도된 그리고 "시아노비린(시안ovirin)"으로 불리된 청녹조류 나스톡 엘립소스포룸(Nostoc ellipsosporum) (Boyd et al. Antimicrob 나이nt Chemother 41(7): 1521 1530, 1997; Hammar et al. Ann N Y Acad Sci 724: 166 169, 1994; Kaku et al. Arch Biochem Biophys 279(2): 298 304, 1990) 렉틴들을 소낭을 단리하는데 이용할 수 있다. 이들 렉틴은 만노즈 함량이 높은 당단백질들에 결합할 수 있다(Chervenak et al. Biochemistry 34(16): 5685 5695, 1995). 만노즈 함량이 높은 당단백질은 α-13 또는 α-16 만노즈-만노즈 링키지 형태의 만노즈-만노즈 링키지를 보유하는 당단백질을 말한다.
결합물질은 하나 이상의 렉틴에 결합하는 물질일 수 있다. 렉틴 캡쳐는 생물학적지표 카펩신 D의 분리에 적용시킬 수 있는데, 그 이유는 렉틴 갈란투스 니발리스 어글루티닌(GNA)과 콘카나발린 A (ConA)에 결합할 수 있는 당화된(당sylated) 단백질이기 때문이다.
소낭을 캡쳐하는데 렉틴을 이용하는 방법 및 장치들은 국제 특허 출원 PCT/US2010/058461, "METHOD AND 시스템 FOR ISOLATING, STORING, AND ANALYZING 소낭" (November 30, 2010); PCT/US2009/066626, "친화력 CAPTURE OF CIRCULATING BIOMAKERS" (December 3, 2009); PCT/US2010/037467, "METHOD AND MATERIALS FOR ISOLATING 엑소좀"(June 4, 2010); 그리고 PCT/US2007/006101, "EXTRACORPOREAL REMOVAL OF MICROVESICULAR PARTICLES"(March 9, 2007), 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 통합된다.
결합물질은 항체일 수 있다. 예를 들면, 이 소낭에 존재하는 하나 이상의 항원에 특이적인 하나 이상의 항체를 이용하여 소낭을 단리할 수 있다. 예를 들면, 소낭은 이의 표면에 CD63을 보유할 수 있고, 그리고 CD63에 대한 항체, 또는 캡쳐 항체를 이용하여 이 소낭을 단리할 수 있다. 대안으로, 종양 세포로부터 유도된 소낭은 EpCam을 발현시킬 수 있고, EpCam 및 CD63에 대한 항체를 이용하여 소낭을 단리할 수 있다. 소낭을 단리시키기 위한 다른 항체들은 CD9, PSCA, TNFR, CD63, B7H3, MFG-E8, EpCam, Rab, CD81, STEAP, PCSA, PSMA, 또는 5T4에 대한 항체, 또는 캡쳐 항체를 포함할 수 있다. 소낭을 단리시키기 위한 다른 항체들은 DR3, STEAP, epha2, TMEM211, MFG-E8, 조직 인자 (TF), unc93A, A33, CD24, NGAL, EpCam, MUC17, TROP2, 또는 TETS에 대한 항체, 또는 캡쳐 항체를 포함할 수 있다..
일부 구체예들에서, 캡쳐 물질는 CD9, CD63, CD81, PSMA, PCSA, B7H3, EpCam, PSCA, ICAM, STEAP, 또는 EGFR에 대한 항체다. 캡쳐 물질은 소낭의 생물지표들를 확인하는데 또한 이용할 수 있다. 예를 들면, 캡쳐 물질 가령, CD9에 대한 항체는 소낭의 생물지표로 CD9를 확인할 수 있다. 일부 구체예들에서, 다수의 캡쳐 물질은 가령, 다중 분석에 이용할 수 있다. 다수의 캡쳐 물질은 CD9, CD63, CD81, PSMA, PCSA, B7H3, EpCam, PSCA, ICAM, STEAP, 및 EGFR중 하나 이상의에 대한 결합 물질을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 다수의 캡쳐 물질은 CD9, CD63, CD81, PSMA, PCSA, B7H3, MFG-E8, 및/또는 EpCam에 대한 결합 물질을 포함할 수 있다. 추가 다른 구체예들에서, 다수의 캡쳐 물질은 CD9, CD63, CD81, PSMA, PCSA, B7H3, EpCam, PSCA, ICAM, STEAP, 및/또는 EGFR에 대한 결합 물질을 포함할 수 있다. 다수의 캡쳐 물질은 TMEM211, MFG-E8, 조직 인자 (TF), 및/또는 CD24에 대한 결합 물질을 포함할 수 있다.
여기에서 언급된 항체들은 면역글로블린 분자들 또는 면역글로블린 분자들의 면역학적으로 활성 부분들, 가령, 항원 및 합성 항체들에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 가진 분자들일 수 있다. 면역글로블린 분자들은 면역글로블린 분자의 임의의 류(가령, IgG, IgE, IgM, IgD 또는 IgA) 또는 아류(하위분류)일 수 있다. 항체들은 다클론, 단클론, 이중특이적, 합성, 인간화된 그리고 키메라 항체들, 단일 쇄 항체들, Fab 단편 및 F(ab')2 단편들, Fv 또는 Fv' 부분들, Fab 발현 라이브러리의 발현에 의해 생성된 단편들, 항-이디오타입 (항-Id) 항체들, 또는 상기 임의의 에피토프-결합단편들을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 항원 (또는 다른 분자)에 "특이적으로 결합하는" 항체 또는 일반적인 임의의 분자는 항원에 대해 선호적으로 결합한다면, 항체는 또다른 분자와는 가령, 약 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만 또는 1% 미만의 교차 활성을 보유한다.
결합물질은 또한 폴리펩티드 또는 펩티드일 수 있다. 폴리펩티드는 광범위한 의미로 이용되며, 아단위(하위단위) 아미노산, 아미노산 유사체들, 또는 펩티드모방체들의 서열을 포함할 수 있다. 아단위들은 펩티드 결합에 의해 연결될 수 있다. 폴리펩티드들은 자연 생성되거나, 자연 생성 폴리펩티드들의 프로세스된 형태(가령, 효소 절단에 의해), 화학적으로 합성되거나 또는 재조합에 의해 발현될 수 있다. 본 발명의 방법에 이용가능한 폴리펩티드들은 표준 기술을 이용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 폴리펩티드들은 D-아미노산 (L-아미노산-특이적 프로테아제에 저항성인), D- 및 L-아미노산의 조합, β 아미노산, 또는 특정한 성질을 전하기 위하여 다양하게 기획된 또는 비-자연 생성 아미노산 (가령, β-메틸 아미노산, Cα-메틸 아미노산, 및 Nα-메틸 아미노산, 등.)을 포함할 수 있다. 합성 아미노산은 리신용 오르니틴, 그리고 류신 또는 이소류신용 노르류신을 포함할 수 있다. 추가로, 폴리펩티드들은 펩티드모방성 결합들, 가령, 에스테르 결합들을 보유하여, 새로운 성질을 가진 폴리펩티드들을 만들 수 있다. 예를 들면, 폴리펩티드는 환원된 펩티드 결합, 가령, R1-CH2-NH-R2,의 통합에 의해 만들어 질 수 있고, 여기서 R1 및 R2는 아미노산 잔기들 또는 서열들이다. 환원된 펩티드 결합은 디펩티드 아단위로 도입될 수 있다. 이러한 폴리펩티드는 프로테아제 활성에 저항성을 가질 수 있으며, 그리고 생체내에서 연장된 반감기를 보유할 수 있다. 폴리펩티드들은 또한 펩토이드(N-치환된 글리신)를 포함할 수 있는데, 이때 측쇄들은 아미노산에서 α-탄소에 붙어있는 것과는 달리, 분자의 골격을 따라 질소 원자들에게 붙어있다. 폴리펩티드들 및 펩티드들은 본 출원을 통하여 상호호환적으로 이용될 수 있으며, 가령 용어 펩티드가 이용될 때, 이 용어는 폴리펩티드들을 또한 포함할 수 있으며, 용어 폴리펩티드들이 이용될 때, 이는 또한 펩티드들을 포함할 수 있다. 용어 "단백질"은 다른 언급이 없는 한, 본 명세서를 통하여 용어 "폴리펩티드" 및 "펩티드"과 호환되어 사용된다.
소낭은 결합물질을 이용하여 단리, 캡쳐 또는 탐지할 수 있다. 결합물질은 소낭 "하우스킵핑 단백질," 또는 일반적 소낭 생물지표에 결합하는 물질일 수 있다. 이 생물지표는 CD63, CD9, CD81, CD82, CD37, CD53, 또는 Rab-5b, Annexin V 또는 MFG-E8일 수 있다. 4가지 막통과 도메인을 가진 막 단백질의 패밀리인 테트라스파닌을 일반적 소낭 지표들로 이용할 수 있다. 테트라스파닌은 CD151, CD53, CD37, CD82, CD81, CD9 및 CD63을 포함한다. 포유동물에서 확인된 다음을 포함하는 30가지 이상의 테트라스파닌이 있다: TSPAN1 (TSP-1), TSPAN2 (TSP-2), TSPAN3 (TSP-3), TSPAN4 (TSP-4, NAG-2), TSPAN5 (TSP-5), TSPAN6 (TSP-6), TSPAN7 (CD231, TALLA-1, A15), TSPAN8 (CO-029), TSPAN9 (NET-5), TSPAN10 (Oculospanin), TSPAN11 (CD151-유사), TSPAN12 (NET-2), TSPAN13 (NET-6), TSPAN14, TSPAN15 (NET-7), TSPAN16 (TM4-B), TSPAN17, TSPAN18, TSPAN19, TSPAN20 (UP1b, UPK1B), TSPAN21 (UP1a, UPK1A), TSPAN22 (RDS, PRPH2), TSPAN23 (ROM1), TSPAN24 (CD151), TSPAN25 (CD53), TSPAN26 (CD37), TSPAN27 (CD82), TSPAN28 (CD81), TSPAN29 (CD9), TSPAN30 (CD63), TSPAN31 (SAS), TSPAN32 (TSSC6), TSPAN33, 및 TSPAN34. 다른 흔히 관찰되는 소낭 지표들은 표 3에 열거된 것들을 포함한다. 이들중 임의의 것을 소낭 지표들로 이용할 수 있다. 더욱이, 본 명세서에서 기술된 또는 표 3의 임의의 지표들은 질환 또는 상태에 대한 후보 생물특징을 확인하는데 선택될 수 있고, 이때 하나 또는 그 이상의 선택된 생물지표들은 질환 또는 상태와 관련된 기전에서 직접적 또는 간접적 역할 또는 기능을 가진다.
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결합물질은 특이적 세포 유형, 가령, 종양 세포 또는 특이적 기원 세포로부터 유도된 소낭에 결합하는 물질(가령 조직 인자, EpCam, B7H3, R나이 또는 CD24에 대한 결합 물질) 일 수 있다. 소낭을 단리하거나 또는 탐지하는데 이용되는 결합물질은 2011년 4월 6일자로 제출된 국제 특허 출원 번호. PCT/US2011/031479(이 출원은 전문이 여기에 참고자료로 편입된다), "Circulating Biomakers for Disease"의 도 1로부터 선택된 항원에 대한 결합물질일 수 있다. 소낭에 대한 결합물질은 또한 특허 출원 번호. PCT/US2011/031479의 도 2에서 열거한 것들로부터 선택할 수 있다. 결합물질은 항원 가령, 테트라스파닌, MFG-E8, 어넥신 V, 5T4, B7H3, 카베올린, CD63, CD9, E-캐드헤린, 조직 인자, MFG-E8, TMEM211, CD24, PSCA, PCSA, PSMA, Rab-5B, STEAP, TNFR1, CD81, EpCam, CD59, CD81, ICAM, EGFR, 또는 CD66에 대한 것일 수 있다. 혈소판용 결합제는 당단백질 가령, GpIa-IIa, GpIIb-IIIa, GpIIIb, GpIb, 또는 GpIX일 수 있다. 결합제는 하나 또는 그 이상의 CD9, Erb2, Erb4, CD81, Erb3, MUC16, CD63, DLL4, HLA-Drpe, B7H3, IFNAR, 5T4, PCSA, MICB, PSMA, MFG-E8, Muc1, PSA, Muc2, Unc93a, VEGFR2, EpCAM, VEGF A, TMPRSS2, R나이, PSCA, CD40, Muc17, IL-17-RA, 그리고 CD80을 포함하는 항원에 대한 것일 수 있다. 예를 들면, 이 결합제는 하나 또는 그 이상의 CD9, CD63, CD81, B7H3, PCSA, MFG-E8, MUC2, EpCam, R나이 그리고 Muc17일 수 있다. 하나 이상의 결합물질, 가령, 2개 이상의 항원에 대한 하나 이상의 결합물질을 이용하여 소낭을 단리 또는 탐지할 수 있다. 이용된 결합물질은 특정 세포 유형으로부터 유도된 또는 기원 세포 특이적 소낭의 단리 또는 탐지하고자 하는 희망에 근거하여 선택할 수 있다.
결합물질은 또한 직접적 또는 간접적으로 고형 표면 또는 기질에 연결할 수 있다. 고형 표면 또는 기질은 마이크로어래이 및 웰에 의해 제공되는 표면들, 미립자 가령, 비드, 컬럼, 광학 섬유들, 와이프(wipes), 유리 및 변형된 또는 기능화된 유리, 석영, 운모, 디아조화된 막 (종이 또는 나일론), 폴리포름알데히드, 셀룰로오즈, 셀룰로오즈 아세테이트, 종이, 세라믹, 금속, 메탈로이드, 반도체 물질, 양자점들(quantum dots), 피복된 비드 또는 미립자, 다른 크로마토그래피 재료들, 자석 미립자; 플라스틱(아크릴, 폴리스티렌, 스티렌 또는 다른 재료들의 코폴리머, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리부틸렌, 폴리우레탄, 폴리테트라플루오루에틸렌(PTFE, TEFLON™, 등을 포함), 폴리사카라이드, 나일론 또는 니트로셀룰로오즈, 수지, 실리콘 및 변형 실리콘을 포함하는 실리카 또는 실리카-기반 재료들, 탄소, 금속, 무기 유리, 플라스틱, 세라믹, 전도성 폴리머(가령, 폴리피롤 및 폴리인돌과 같은 폴리머 포함); 마이크로 또는 나노구조화된 표면 가령, 핵산 틸링(tiling) 어래이, 나노튜브, 나노와이어 또는 나노미립자 장식된 표면; 또는 다공성 표면 또는 겔, 가령, 메타그릴레이트, 아크릴아미드, 슈가 폴리머들, 셀룰로오즈, 실리케이트, 또는 다른 섬유성 또는 스트랜드화된 폴리머들을 포함하나 이에 한정되지 않는 결합물질이 직접적 또는 간접적으로 부착되는 임의의 물리적 고형 물질일 수 있다. 추가로, 당업계에 공지되어 있는 것과 같이, 기질은 폴리머들, 가령, 덱스트란, 아크릴아미드, 젤라틴 또는 아가로즈를 포함하는 임의의 다수의 재료들로 수동적 또는 화학적으로 유도화된 코딩제를 이용하여 피복시킬 수 있다. 이러한 코팅은 생물학적 시료에 어래이의 사용을 용이하게 할 수 있도록 한다.
예를 들면, 소낭을 단리시키는데 이용되는 항체는 고형 기질 가령, 웰, 가령, 시판되는 이용가능한 플레이트(가령 Nunc, Milan Italy)에 결합될 수 있다. 각 웰은 항체로 피복될 수 있다. 일부 구체예들에서, 소낭을 단리시키는데 이용되는 항체는 고형 기질 가령, 어래이에 결합된다. 어래이는 분자 상호작용의 예정된 공간적 배열, 결합 섬, 생물분자들, 구역, 도메인 또는 별도의 경계 내에 배치된 결합 섬 또는 결합물질의 공간적 배열을 보유할 수 있다. 더우기, 용어 어래이는 표면에 배열된 다중 어래이를 지칭하는데 이용될 수 있는데, 가령, 표면이 어래이의 다중 복사체로 뚫여있는 표면인 경우가 될 것이다. 다중 어래이를 보유한 이러한 표면은 다중 어래이 또는 반복 어래이라고도 부를 수 있다.
어래이는 전형적으로 엔터티, 가령, 결합 사건을 통하여 시료 안에 있는 소낭의 존재를 탐지할 수 있는 접근가능한 모이어티를 포함한다. 어래이는 마이크로어래이라고 칭할 수 있다. 어래이 또는 마이크로어래이는 DNA 마이크로어래이, 이를 테면 cDNA 마이크로어래이, 올리고뉴클레오티드 마이크로어래이 그리고 SNP 마이크로어래이, microRNA 어래이, 단백질 마이크로어래이, 항체 마이크로어래이, 조직 마이크로어래이, 세포의 마이크로어래이 (형질감염 마이크로어래이라고도 함), 화학적 화합물 마이크로어래이, 그리고 탄수화물 어래이 (당어래이)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. DNA 어래이는 전형적으로 시료 안에 존재하는 서열들에 결합할 수 있는 접근가능한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. MicroRNA 어래이, 가령, University of Louisville 또는 Agilent의 시판 시스템에서 구한 MMChips 어래이는 microRNA을 탐지하는데 이용될 수 있다. 단백질 마이크로어래이는 단백질 키나아제, 전사 인자 단백질-활성화의 기질들을 식별을 포함하는 단백질-단백질 상호작용을 식별, 또는 생물학적으로 활성의 작은 분자들의 표적을 식별하는데 이용될 수 있다. 단백질 어래이는 상이한 단백질 분자들, 일반적으로 항체들, 또는 관심 단백질에 결합되는 뉴클레오티드 서열의 어래이를 포함할 수 있다. 비-제한적 실시예에서, 단백질 어래이는 소낭의 표면에 특정 단백질을 보유하는 소낭을 탐지하는데 이용될 수 있다. 항체 어래이는 시료, 가령, 세포 또는 조직 용해물 용액으로부터 단백질 또는 다른 생물학적 물질을 탐지하기 위한 캡쳐 분자로 이용되는 단백질 칩상에 표지된 항체들을 포함한다. 예를 들면, 항체 어래이는 체내 유체, 가령, 혈청 또는 뇨로부터 소낭-연합된 생물지표들을 탐지하는데 이용될 수 있다. 조직 마이크로어래이는 다중 조직학적 분석이 허용되도록 어래이 방식에서 어샘블된 별도의 조직 코어를 포함한다. 형질감염 마이크로어래이라고도 불리는 세포성 마이크로어래이는 다양한 캡쳐 물질, 이를 테면 접근가능한 위치에서 켭쳐가 촉진되도록 세포들과 상호작용할 수 있는 항체들, 단백질, 또는 지질을 포함한다. 세포성 어래이는 소낭 그리고 세포의 막 사이에 유사성으로 인하여 소낭을 캡쳐하는데 또한 이용될 수 있다. 화학적 화합물 마이크로어래이는 화학적 화합물들의 어래이를 포함하고, 이 화합물에 결합되는 단백질 또는 다른 생물학적 물질을 탐지하는데 이용될 수 있다. 탄수화물 어래이 (당어래이)는 탄수화물의 어래이를 포함하고, 가령, 당 모이어티에 결합하는 단백질을 탐지할 수 있다. 당업자는 본 발명의 방법에 따른 유사한 기술 또는 개선된 기술이 이용될 수 있음을 인지할 것이다.
결합물질은 미립자 가령, 비드 또는 미소구체에 또한 결합될 수 있다. 예를 들면, 소낭의 성분에 특이적인 항체는 미립자에 결합할 수 있고, 그리고 항체-결합된 미립자를 이용하여 생물학적 시료로부터 소낭을 단리한다. 일부 구체예들에서, 미소구체는 자석 또는 형광으로 라벨된다. 추가로, 소낭 분리용 결합 물질은 고형 기질 자체일 수도 있다. 예를 들면, 라텍스 비드, 가령, 알데히드/설페이트 비드 (Interfacial Dynamics, Portland, OR)를 이용할 수 있다.
자석 비드에 결합된 결합물질을 또한 이용하여 소낭을 단리시킬 수 있다. 예를 들면, 생물학적 시료 가령, 환자의 혈청을 결장암 스크리닝을 위해 수거할 수 있다. 시료는 자석 마이크로비드에 연결된 항-CCSA-3 (결장암-특이적 항원)과 함께 항온처리할 수 있다. 저 밀도 마이크로컬럼은 MACS 분리기의 자장내에 배치하고, 그리고 이 컬럼은 완충 용액 가령, Tris-완충된 염수로 씻어낸다. 자석 면역 복합체를 컬럼에 제공하고, 결합안된, 비-특이적 물질은 버린다. CCSA-3 선택된 소낭은 분리기로부터 컬럼을 제거하고, 이를 수거 튜브에 놓아둠으로써 회수할 수 있다. 완충액을 컬럼에 추가할 수 있고, 자석으로 라벨된 소낭은 컬럼에 공급된 플런져(plunger)를 제공함으로써 방출시킬 수 있다. 단리된 소낭은 IgG 용리 완충액에서 희석시킬 수 있고, 그리고 그 다음 복합체는 원심분리되어, 소낭으로부터 마이크로비드를 분리시킬 수 있다. 펠렛화된 단리된 기원 세포 특이적 소낭은 완충액 가령, 인산염-완충된 염수에 재현탁시키고, 정량화시킬 수 있다. 대안으로, 항체 캡쳐된 기원 세포 특이적 소낭과 자석 마이크로비드 사이의 강력한 점착력으로 인하여, 단백질분해성 효소 가령, 트립신을 이용하여 원심분리 필요없이 캡쳐된 소낭을 방출시킬 수 있다. 단백질분해성 효소는 이 소낭을 방출시키는데 충분한 시간동안 항체 캡쳐된 기원 세포 특이적 소낭과 함께 항온처리할 수 있다.
소낭을 분리하기 위한 결합물질, 가령, 항체는 이 소낭의 성분에 결합물질이 결합하도록 최소한 충분한 시간동안 관심 소낭을 포함하는 생물학적 시료와 바람직하게 접촉한다. 예를 들면, 항체는 약 10 분, 30 분, 1 시간, 3 시간, 5 시간, 7 시간, 10 시간, 15 시간, 1 일, 3 일, 7 일 또는 10 일을 포함하나 이에 한정되지 않는 추가 날짜 범위의 다양한 간격으로 생물학적 시료와 접촉시킬 수 있다.
결합물질, 가령, 2011년 4월 6일자 제출된 국제 특허 출원 번호 PCT/US2011/031479, "Circulating Bio지표s for Disease"(이 출원은 전문이 여기에 참고자료로 편입된다)의 도 1에 열거한 항원에 특이적인 항체, 또는 PCT/US2011/031479의 도 2에 열거한 결합물질은 탐지를 촉진시키도록 라벨될 수 있다. 적절한 라벨은 자석 라벨, 형광 모이어티, 효소, 화학적발광 프로브, 금속 미립자, 비-금속 콜로이드성 미립자, 폴리머 염료 미립자, 안료 분자, 안료 미립자, 전기화학적으로 활성 종들, 반도체 나노결정 또는 양자점들 또는 골드 미립자, 형광단, 양자 도트, 또는 방사능활성 라벨을 포함하는 다른 나노미립자를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 단백질 라벨은 하기에서 설명된 것과 같이 녹색 형광 단백질 (GFP) 그리고 이의 변이체 (가령, 시안 형광 단백질 그리고 황색 형광 단백질); 그리고 발광 단백질 이를 테면 루시퍼라제를 포함한다. 방사능활성의 라벨 방사능동위원소 (방사능핵종), 이를 테면 3H, 11C, 14C, 18F, 32P, 35S, 64Cu, 68Ga, 86Y, 99Tc, 111In, 123I, 124I, 125I, 131I, 133Xe, 177Lu, 211At, 또는 213Bi을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 형광 라벨은 희토류 킬레이트 (가령, 유로품 킬레이트), 로다민, 플로우레신, 가령, FITC, 5-카르복시플로우레신, 6-카르복시 플로우레신을 포함하나 이에 한정되지 않는 유형; TAMRA; 단실; Lissamine; 시아닌; 피코에리틴; Texas Red; Cy3, Cy5, 다폭실, NBD, Cascade Yellow, 단실, PyMPO, 피렌, 7-디에틸아미노쿠마린-3-카르복실산 그리고 기타 쿠마린 유도체들, Marina Blue™, Pacific Blue™, Cascade Blue™, 2-안트라센술포닐, PyMPO, 3,4,9,10-페릴렌-테트라카르복실산, 2,7-디플로오르플루오레신 (Oregon Green™ 488-X), 5-카르복시플루오레신, Texas Red™-X, Alexa Fluor 430, 5-카르복시테트라메틸로다민 (5-TAMRA), 6-카르복시테트라메틸로다민 (6-TAMRA), BODIPY FL, 비마네, 그리고 Alexa Fluor 350, 405, 488, 500, 514, 532, 546, 555, 568, 594, 610, 633, 647, 660, 680, 700, 그리고 750, 그리고 이의 유도체들을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 가령, "The Handbook--A Guide to Fluorescent Probe and Labeling Technologies," Tenth Edition, available on the internet at probe (dot) invitrogen (dot) com/handbook. 형광 라벨은 하나 이상의 FAM, dRHO, 5-FAM, 6FAM, dR6G, JOE, HEX, VIC, TET, dTAMRA, TAMRA, NED, dROX, PET, BHQ, Gold540 및 LIZ일 수 있다.
결합물질은 직접적 또는 간접적으로 라벨될 수 있는데, 가령, 라벨은 바이오틴-스트렙타아비딘을 통하여 항체에 부착된다. 대안으로, 항체는 라벨되지 않지만, 제 1 항체가 관심 항원된 결합된 후 라벨된 제 1 항체와 나중에 접촉한다.
예를 들면, 다양한 효소-기질 라벨들은 이용가능하며 또는 설명되고 있다 (예를 들면, 미국 특허 제4,275,149호). 효소는 다양한 기술을 이용하여 측정할 수 있는 색소생산성 기질의 화학적 변경을 일반적으로 촉매한다. 예를 들면, 효소는 기질 안에 색의 변화를 촉매할 수 있고, 이러한 변화는 분광광도적으로 측정할 수 있다. 대안으로, 효소는 기질의 형광 또는 화학적발광을 변경시킬 수 있다. 효소 라벨들의 예는 루시퍼라제 (가령, 반딧불이 루시퍼라제 및 박테리아성 루시퍼라제; 미국 특허 제4,737,456호), 루시페린, 2,3-디하이드로프탈라진디온, 말레이트 데하이드로게나제, 우레아제, 퍼옥시다제 가령, 냉고추냉이 퍼옥시다제 (HRP), 알칼리 포스파타제 (AP), β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 라이소자임, 사카라이드 옥시다제 (가령, 포도당 옥시다제, 갈락토즈 옥시다제, 그리고 포도당-6-인산염 데하이드로게나제), 헤테로사이클 옥시다제 (가령, 유리카제 및 산틴 옥시다제), 락토퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제, 및 이와 유사한 것들을 포함한다. 효소-기질 조합의 예는 냉고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)와 기질로 수소 퍼옥시다제, 여기에서 수소 퍼옥시다제는염료 전구물질 (가령, 오르소페닐렌 디아민 (OPD) 또는3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 하이드로클로라이드 (TMB))를 산화시키고; 알칼리 포스파타제 (AP)와 색소생산성 기질로서 파라-니트로페닐 염산염; 그리고 β-D-갈락토시다제 (β-D-Gal)와 색소생산성 기질 (가령, p-니트로페닐-β-D-갈락토시다제) 또는 플로오로게닉 기질 4-메틸움베리페릴-β-D-갈락토시다제를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
이용되는 분리 또는 탐지 방법에 따라, 결합물질은 고형 표면 또는 기질, 가령, 어래이, 미립자, 웰 및 상기에서 설명한 다른 기질에 연결될 수 있다. 세포 표면에 항체들의 화학적 연결을 위한 방법들은 당업계에 공지되어 있으며, 그리고 예를 들면, 글루타알데히드 또는 말레이미드 활성화된 항체들을 이용한 커플링을 포함할 수 있다. 다중 단계 과정을 이용한 화학적 커플링 방법들은 바이오티닐화, 예를 들면 이들 화합물의 숙시니미드 에스테르를 이용한 트리니트로페놀 (TNP) 또는 디곡시게닌의 커플링을 포함한다. 바이오티닐화(바이오티닐화)는 예를 들면, D-바이오티닐-N-하이드록시숙시니미드를 이용하여 실행할 수 있다. 숙시니미드 군들은 pH 7 이상의 값, 그리고 약 pH 8.0 내지 약 pH 8.5에서에서 선호적으로 아미노 기와 효과적으로 반응한다. 바이오티닐화는 예를 들면, 세포들을 디티오트레톨로 처리하고, 이어서 바이오틴 말레이미드를 추가하여 실행할 수 있다.
유동 세포분석법
미립자 가령, 비드 또는 미소구체를 이용하여 소낭의 분리 또는 탐지는 유동 세포분석법을 이용하여 또한 실행할 수 있다. 유동 세포분석법은 유체의 흐름에 현탁된 미시적 미립자를 분류하는데 이용할 수 있다. 미립자가 통과할 때, 미립자들은 선택적으로 하전되고, 출구는 별도 경로의 흐름으로 편향될 수 있다. 따라서, 원래 혼합물, 가령, 생물학적 시료로부터 고도의 정확성과 속도로 집단들을 분리하는 것이 가능하다. 유동 세포분석법은 광학적/전자 탐지 장치를 통하여 단일 세포 흐름의 물리적 및/또는 화학적 특징의 동시 다중매개변수적 분석을 가능하게 한다. 단일 주파수(색)의 광선, 보통 레이져 광선은 유체의 유체역학적 기류로 향하도록 한다. 다수의 검출자들은 기류가 광선을 통과하는 지점을 겨냥하고 있고; 하나는 광선과 일렬로 (Forward 분산 또는 FSC) 그리고 몇 가지는 광선에 수직으로(Side 분산 또는 SSC) 그리고 하나 이상의 형광 검출자.
광선을 통과하는 각 현탁된 미립자는 어떤 방식으로던 빛을 산란시키고, 미립자내 형광 화합물은 광원보다 더 낮은 주파수에서 여기되어 빛을 방출할 수 있다. 이러한 분산된 그리고 형광 광의 조합이 검출자에 의해 수집되고, 그리고 각 검출자(각 형광 방출 피크에 대해 하나의 검출자)에서 파동을 광으로 분석함으로써 각 개별 미립자의 물리적 그리고 화학적 구조에 대한 다양한 실체를 유추하는 것이 가능하다. FSC는 세포 크기와 관계있고, SSC는 미립자의 내부 복합성, 가령, 핵의 모양, 세포질 미립자의 양 및 유형 또는 막 거침성에 따라 달라진다. 일부 유동 세포분석법은 형광의 필요성을 제거하여, 측정을 위해 오직 광 분산만을 이용한다.
유동 세포분석법은 "실시간"에서 매 순간 수천만 미립자를 분석할 수 있고, 그리고 특화된 성질을 보유하는 미립자를 활발하게 분리 및 단리시킬 수 있다. 유동 세포분석법은 각 분석 세션 동안에 다수의 단일 세포들에 대한 고처리량 자동화된 정량분석과 분리를 제공한다. 유동 세포분석기(Flow cytomers)는 다중 레이져 및 형광 검출자들을 보유하여, 다중 라벨들의 표현형에 의해 표적 집단을 좀더 정확하게 특징짓는데 이용할 수 있도록 한다. 따라서, 유동 세포분석기, 가령, 다색(multicolor) 유동 세포분석기를 이용하여 다중 형광 라벨들 또는 색깔을 가진 하나 이상의 소낭을 탐지할 수 있다. 일부 구체예들에서, 유동 세포분석기는 또한 가령, 크기 또는 상이한 지표들에 의해 상이한 소낭 집단을 분류 또는 분리할 수 있다.
유동 세포분석기는 하나 이상의 레이져, 가령, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의 레이져를 보유할 수 있다. 일부 구체예들에서, 유동 세포분석기는 하나 이상의 색 또는 형광 라벨, 가령, 최소한 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 또는 20개의 상이한 색 또는 형광 라벨을 탐지할 수 있다. 예를 들면, 유동 세포분석기는 최소한 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 또는 20개의 형광 검출자를 보유할 수 있다.
하나 이상의 소낭을 탐지 또는 분석하고, 상이한 집단의 소낭을 분류 또는 분리시키는데 이용할 수 있는 상업적으로 이용가능한 유동 세포분석기의 예는 MoFlo™ XDP Cell Sorter (Beckman Coulter, Brea, CA), MoFlo™ Legacy Cell Sorter (Beckman Coulter, Brea, CA), BD FACSAria™ Cell Sorter (BD Biosciences, San Jose, CA), BD™ LSRII (BD Biosciences, San Jose, CA), and BD FACSCalibur™ (BD Biosciences, San Jose, CA)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 다색 또는 다중-형광 세포측정기의 용도는 하기에서 더 설명하는 바와 같이 소낭의 다중 분석에 이용할 수 있다. 일부 구체예들에서, 유동 세포분석기는 하나 이상의 특징들에 근거하여 하나 이상의 소낭 집단을 분류하고, 이로 인하여 하나 이상의 소낭집단을 수거 또는 분류할 수 있다. 예를 들면, 2개 집단의 소낭은 크기가 상이하여, 각 집단내 소낭은 유사한 크기 범위를 가지며, 따라서 차등적으로 탐지되거나 또는 분류될 수 있다. 또다른 구체예에서, 2개 집단의 소낭은 차등적으로 라벨된다.
유동 세포측정기로부터 생성된 데이터는 1차원적으로 막대그래프를 생성하기 위하여, 또는 도트 플롯으로 2차원적으로 보기위하여 또는 새로운 소프트웨어를 가진 3차원적으로 플롯할 수 있다. 플롯상의 영역은 게이트(gates)로 명명된 일련의 부분집합 추출에 의해 순차적으로 구별될 수 있다. 혈액학과 특히 연관하여 진단 및 임상 목적의 특이적 게이팅(gating) 프로토콜이 존재한다. 플롯들은 흔히 로그자에서 만들어진다. 상이한 형광 염료의 방출 스펙트럼은 중첩되기 때문에 검출자의 신호는 전자적으로 뿐만 아니라 계산적으로 보정되어야만 한다. 라벨링 생물지표들에 대한 형광단은 Ormerod, 유동 세포분석 2nd ed., Springer-Verlag, New York (1999), 그리고 Nida et al., Gynecologic Oncology 2005;4 889-894에 설명된 것들을 포함할 수 있고, 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 통합된다.
다중화(Multiplexing)
다중 실험은 단일 분석에서 다중 분석물질을 동시에 측정할 수 있는 실험들을 포함한다. 소낭 및 연관된 생물지표들은 다중 방식으로 평가할 수 있다. 다중화 상이한 순환 생물지표, 가령, microRNA, 단백질 또는 소낭 집단의 다중화에 상이한 결합 물질을 이용할 수 있다. 상이한 생물지표, 가령, 상이한 소낭 집단은 상이한 결합물질을 이용하여 단리 또는 탐지할 수 있다. 생물학적 시료내 각 집단은 상이한 신호생성 라벨, 상기에서 설명된 것과 같은 가령, 형광단, 양자점, 또는 방사능활성 라벨로 라벨할 수 있다. 라벨은 결합물질에 직접적으로 콘쥬게이트되거나 또는 간접적으로 이용하여 소낭에 결합하는 결합 물질을 탐지할 수 있다. 두 개 이상의 친화력 요소들에 결합하는 2개 이상의 차등적으로 라벨된 소낭 집단은 합쳐진 신호를 생산할 수 있기 때문에, 다중화 분석에서 탐지되는 다수의 집단은 라벨들의 해리 능력 및 신호의 총합에 따라 달라진다
최소한 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 25개, 50개, 75개 또는 100개의 상이한 순환 생물지표들의 다중화를 실행할 수 있다. 예를 들면, 한 가지 기원 세포에 특이적인 하나의 소낭 집단은 상이한 기원 세포에 특이적인 제 2 소낭 집단과 함께 분석할 수 있으며, 이때 각 집단은 상이한 라벨로 라벨시킨다. 대안으로, 특정 생물지표 또는 생체특징을 가진 소낭 집단은 상이한 생물지표 또는 생체특징을 가진 제 2의 소낭 집단과 함께 분석할 수 있다. 일부 경우들에서, 수백 또는 수천개의 소낭이 단일 분석으로 평가될 수 있다.
한 구체예에서, 다중 분석은 다수의 기질, 가령, 비드에 하나 이상의 소낭 집단을 포함하는 다수의 소낭을 제공하여 실행한다. 각 비드는 하나 이상의 캡쳐 물질에 연결된다. 다수의 비드는 부분집합으로 나뉘는데, 동일한 캡쳐 물질을 가진 비드 또는 캡쳐 물질의 조합은 비드의 부분집합을 형성하고, 비드의 각 부분집합은 상이한 캡쳐 물질을 보유하거나 또는 비드의 또다른 부분집합과는 다른 캡쳐 물질을 보유한다. 비드는 캡쳐 물질에 결합하는 성분을 포함하는 소낭을 캡쳐하는데 이용할 수 있다. 상이한 부분집합을 이용하여 상이한 소낭 집단을 캡쳐할 수 있다. 캡쳐된 소낭은 하나 이상의 생물지표들을 탐지함으로써 분석할 수 있다.
유동 세포분석법은 미립자-기반 또는 비드 기반 분석과 결합하여 이용할 수 있다. 높은 감응성 자동제어(automation)와 일치하는 특이적 활성을 가진 동족(cognate) 리간드 및 리포터 분자들과 함께 비드 코딩을 이용한 다중매개변수적 면역분석 또는 다른 고처리량 탐지 분석을 이용할 수 있다. 예를 들면, 각 부분집합 안의 비드는 또다른 부분 집단과는 차등적으로 라벨될 수 있다. 미립자 기반 분석 시스템에서 소장의 결합물질 또는 캡쳐 물질 가령, 캡쳐 항체는 접근가능한 비드 또는 미소구체 상에 고정시킬 수 있다. 각 개별 결합분석 (가령, 결합물질이 항체인 경우 면역 분석)에서 각 결합 물질은 별개의 유형의 미소구체 (가령, 마이크로비드)에 연결될 수 있고 그리고 결합분석 반응은 미소구체의 표면에서 일어난다. 미소구체는 상이한 라벨들에 의해 구별될 수 있는데, 예를 들면, 특이적 캡쳐 물질을 가진 미소구체는 상이한 캡쳐 물질을 가진 또다른 미소구체와 비교하여 상이한 신호생성 라벨을 보유할 것이다. 예를 들면, 미소구체는 별개의 형광 강도로 착색될 수 있고, 특이적 결합물질을 가진 미소구체의 형광 강도는 상이한 결합물질을 가진 또다른 미소구체의 강도와는 상이하다. 상이한 캡쳐 물질에 의해 결합된 생물지표들은 상이한 라벨을 이용하여 차등적으로 탐지될 수 있다.
미소구체는 최소한 2가지 상이한 라벨들 또는 염료로 라벨 또는 착색될 수 있다. 일부 구체예들에서, 미소구체는 최소한 3가지, 4가지, 5가지, 6가지, 7가지, 8가지, 9가지, 또는 10가지의 상이한 라벨들로 라벨된다. 다수의 미소구체 안에 상이한 미소구체는 하나 이상의 라벨 또는 염료를 보유할 수 있고, 여기에서 미소구체의 다양한 부분집합은 상이한 결합물질을 가진 상이한 미소구체의 탐지를 허용하도록 다양한 라벨 또는 염료의 비율 및 조합을 가진다. 예를 들면, 라벨들 및 염료의 다양한 비율 및 조합은 상이한 형광 강도를 허용할 수 있다. 대안으로, 다양한 비율 및 조합을 결합물질을 확인하기 위한 상이한 탐지 패턴을 만드는데 이용할 수도 있다. 미소구체는 외부적으로 라벨 또는 착색될 수 있거나, 또는 내부 형광 또는 신호생성 라벨들을 보유할 수 있다. 비드는 이들의 적합한 결합물질과 함께 별도로 적하될 수 있고, 따라서, 상이한 소낭 집단들은 상이한 결합물질이 연결되는 차등적으로 라벨된 미소구체에 기초한 상이한 결합 물질에 근거하여 단리될 수 있다.
또다른 구체예에서, 다중 분석은 평면 기질을 이용하여 실행할 수 있는데, 여기에서 이 기질은 다수의 캡쳐 물질을 포함한다. 다수의 캡쳐 물질은 하나 이상의 소낭 집단을 캡쳐할 수 있고, 그리고 캡쳐된 소낭의 하나 이상의 생물지표들을 탐지할 수 있다. 평면 기질은 여기에서 추가로 설명되는 마이크로어래이 또는 다른 기질일 수 있다.
신규한 결합물질(신규한 Binding 나이nts)
소낭은 소낭의 신규한 성분에 대한 결합물질, 가령, 관심 소낭에 특이적인 신규한 항원에 대한 항체를 이용하여 단리 또는 탐지할 수 있다. 관심 소낭에 특이적인 신규한 항원들은 공간의 작은 부분만을 이용하여 다량의 화학적/구조적 공간을 적절하게 표본화를 허용하는 기질, 가령, 어래이 또는 다수의 미립자에 결합된 공지의 조성물의 상이한 테스트 화합물을 이용하여 단리하거나 또는 확인할 수 있다. 확인된 신규한 항원은 소낭의 생물지표로 또한 작용할 수 있다. 예를 들면, 기원 세포 특이적 소낭에 대해 확인된 신규한 항원은 유용한 생물지표일 것이다.
시료 접촉에 대해 이용된 용어 "물질" 또는 "시약"은 표적 폴리펩티드, 펩티드, 핵산 분자들, 렙틴, 지질, 또는 본 명세서에서 기술된 것과 같이 또는 당업계에 공지되어 것과 같이 탐지될 수 있는 임의의 기타 생물학적 엔터티를 포함하는 표적 분자에 결합하고, 혼성화되고, 연합되거나 또는 표적 분자의 탐지 또는 탐지를 촉진시키도록 기획된 임의의 엔터티를 의미할 수 있다. 이러한 물질/시약의 예들은 당업계에 공지되어 있고, 범용의 또는 특이적 핵산 프라이머, 핵산 프로브, 항체들, 압타머, 펩토이드, 펩티드 핵산, 잠긴 핵산, 렉틴, 덴드라이머, 화학적 화합물, 또는 본 명세서에서 기술된 또는 당업계에 공지되어 있는 기타 엔터티를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
결합물질은 테스트 화합물들에 대항하는 동종 또는 이종 소낭 집단을 스크리닝함으로써 확인할 수 있다. 기질 표면의 각 테스트 화합물의 조성물은 공지이기 때문에, 이것은 친화력 요소들에 대해 스크린을 구성한다. 예를 들면, 테스트 화합물 어래이는 기질 접근가능한 위치들 상에 존재하는 특정 위치에 있는 테스트 화합물들을 포함하고, 그리고 소낭에 대한 하나 이상의 결합물질을 확인하는데 이용할 수 있다. 테스트 화합물들은 모두 관련없거나 또는 핵심 서열 또는 구조의 작은 변이에 근거하여 관련될 수 있다. 상이한 테스트 화합물들은 주어진 테스트 화합물의 변이체 (가령, 폴리펩티드 이소폼), 구조적으로 또는 조성적으로 무관한 테스트 화합물들, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다.
테스트 화합물은 펩토이드, 폴리사카라이드, 유기 화합물, 무기화합물, 폴리머, 지질들, 핵산, 폴리펩티드, 항체, 단백질, 폴리사카라이드, 또는 다른 화합물일 수 있다. 테스트 화합물은 천연 또는 합성된 것일 수 있다. 테스트 화합물은 다수의 링키지 또는 링키지의 조합 (가령, 아미드, 에스테르, 에테르, 티올, 라디칼 추가, 금속 배위, 등.), 수지상(수지상) 구조, 원형 구조, 공동 구조 또는 특이적 추가가 일어날 때 기본골격으로 작용하는 부착 부위 부근 다중의 다른 구조에 근거한 선형 또는 가지형 이형폴리머 화합물들을 포함하거나 또는 구성할 수 있다. 테스트 화합물은 당업계에 공지되어 있는 표준 방법들을 이용하여 기질상에 배치되거나 또는 그 자리에서(in situ) 합성될 수 있다. 추가로, 테스트 화합물은 유용한 상호작용, 가령, 협조적 결합을 탐지하기 위하여 함께 배치되거나 또는 그 자리에서(in situ) 합성될 수 있다
테스트 화합물은 공지의 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드일 수 있고, 따라서, 소낭과 결합하는 테스트 화합물의 탐지는 결합물질로 이용할 수 있는 공지의 아미노 서열의 폴리펩티드의 확인으로 이어질 수 있다. 예를 들면, 동질성 소낭 집단을 다양한 길이의 아미노산을 보유하는 몇 개 내지 1,000,000개 테스트 폴리펩티드를 보유하는 슬라이드 상의 스팟티드(spotted) 어래이에 제공할 수 있다. 폴리펩티드들은 C-말단을 통하여 표면에 부착할 수 있다. 폴리펩티드들의 서열은 시스테인을 제외한 19개 아미노산으로부터 무작위로 생성될 수 있다. 결합 반응은 비-특이적 경쟁자, 가령, 또다른 염료로 라벨된 과량의 박테리아성 단백질들을 포함할 수 있고, 각 폴리펩티드 결합표적에 대한 특이적 비율을 결정할 수 있다. 최고 특이성 및 결합을 가진 폴리펩티드를 선택할 수 있다. 각 스팟 상의 폴리펩티드의 정체는 공지이며, 따라서 바로 확인할 수 있다. 동종 소낭 집단, 가령, 기원 세포 특이적 소낭에 대해 특이적인 신규한 항원이 확인되었다면, 이러한 기원 세포 특이적 소낭은 이하에서 설명하는 방법들에서 이러한 항원을 이용하여 후속적으로 단리시킬 수 있다.
어래이를 또한 이용하여 소낭에 대한 결합물질로 작용하는 항체를 확인할 수 있다. 테스트 항체들은 어래이에 부착할 수 있고, 그리고 소낭을 단리 또는 확인하는데 이용할 수 있는 항체들을 확인하기 위하여 이종 소낭 집단에 대해 스크리닝할 수 있다. 소낭의 동종 집단 가령, 기원 세포 특이적 소낭은 또한 항체 어래이로 스크리닝할 수 있다. 동종 집단의 소낭을 단리 또는 탐지하기 위하여 항체들을 확인하는 것을 제외하고, 상동성 집단에 특이적인 하나 이상의 단백질 생물지표들을 확인할 수 있다. 테스트 항체들 사전-선택된 테스트 항체들을 가진 상업적으로 이용가능한 플랫포옴 또는 어래이에 부착된 테스트 항체들의 맞춤 선별을 이용할 수 있다. 예를 들면, Full Moon Bio시스템의 항체 어래이는 결합 물질로써 Bcl-XL, ERCC1, 케라틴 15, CD81/TAPA-1, CD9, 상피 특이적 항원 (ESA), 및 Mast Cell Chymase에 대한 항체를 확인하는 전립선암 세포 유도된 소낭을 이용하여 스크리닝할 수 있고, 그리고 확인된 단백질들은 이 소낭에 대한 생물지표들로 이용할 수 있다. 생물지표는 존재하거나 또는 없거나, 과소발현 또는 과다발현되고, 상태를 특징화하는데 이용될 수 있다.
결합물질로 이용할 수 있는 항체 또는 합성 항체는 또한 펩티드 어래이를 통하여 확인할 수 있다. 또다른 방법은 항체 파아지 디스플레이를 통하여 합성 항체 생성을 이용하는 것이다. 항체들의 M13 박테리오 파아지 라이브러리 (가령 Fabs)는 피복 단백질에 융합물질로써 파아지 미립자의 표면에 디스플레이된다. 각 파아지 미립자는 독특한 항체는 나타내고, 또한 인코딩 DNA를 함유하는 벡터를 포집한다. 고도로 다양한 라이브러리를 구축할 수 있고, 파아지 풀(pool)로 제공되어, 고정된 항원에 결합을 위한 항체 선별에 이용할 수 있다. 항원-결합 파아지는 고정된 항원에 의해 유지되고, 비-결합 파아지는 세척에 의해 제거된다. 유지된 파아지 풀은 대장균(Escherichia coli) 숙주의 감염에 의해 증폭될 수 있고, 증폭된 풀(pool)은 항원-결합 클론에 의해 우세한 집단을 궁극적으로 수득하기 위한 추가 선별 라운드에 이용한다. 이 단계에서, 개별 상(파아지) 클론은 단리하고, DNA 서열화를 거쳐 디스플레이된 항체들의 서열을 해독할 수 있다. 파아지 디스플레이 및 당업계에 공지되어 있는 다른 방법들을 이용하여 소낭에 대한 높은 친화력있는 설계 항체들을 만들 수 있다.
비드-기반 분석을 또한 이용하여 소낭을 단리 또는 탐지하기 위한 신규한 결합물질을 확인할 수 있다. 테스트 항체 또는 펩티드는 미립자에 콘쥬게이트할 수 있다. 예를 들면, 비드는 항체 또는 펩티드에 콘쥬게이트할 수 있고 그리고 특이적 조직 또는 종양 유형으로부터 소낭을 표적으로 할 수 있는 신규한 항체들에 대한 발견 또는 특히 선택하기 위하여 소낭 집단의 표면에서 발현되는 단백질들을 탐지하고 정량화하는데 이용할 수 있다. 유기 기원의 임의의 분자는 제조업자의 지시에 따라 시판되는 키트를 사용하여 폴리스티렌 비드에 성공적으로 콘쥬게이트할 수 있다. 각 비드 세트는 특정 탐지가능한 파장으로 채색될 수 있고, 그리고 이들 각각은 어떤 비드가 기존의 콘쥬게이트된 항체들 또는 펩티드들의 에피토프에 일치하는 엑소좀 단백질들에 연결되어 있는지를 특별히 측정하는데 이용할 수 있는 공지의 항체 또는 펩티드에 연결할 수 있다. 상이한 강도를 가진 각 비드가 상기에서 설명한 상이한 결합물질을 가지므로 비드는 별개의 형광 강도로 채색될 수 있다.
예를 들면, 정제된 소낭 준비물은 실험적으로 결정된 분석 역학 범위에 따라 분석 완충액 내에서 적합한 농도로 희석시킬 수 있다. 충분한 용적의 연결된 비드를 준비할 수 있고, 대략 1 ㎕의 항체-연결된 비드는 웰에 한 방울씩 넣고, 최종 용적을 대략 50 ㎕으 조정할 수 있다. 항체-콘쥬게이트된 비드는 진공에 적합한 플레이트에 추가되었을 때, 비드를 세척하여 적절한 결합 상태를 유지시킬 수 있다. 소낭 준비물의 적합한 용적을 테스트할 각 웰에 추가할 수 있고, 그 다음 혼합물은 가령, 15-18 시간 동안 항온처리한다. 탐지 항체 희석 용액을 이용하여 충분한 용적의 탐지 항체를 분지할 수 있고, 1시간 동안 또는 필요한 시간 만큼 혼합물과 항온처리할 수 있다. 그 다음 비드를 세척하고 스트렙타아비딘 피코에리틴으로 구성된 탐지 항체(바이오틴 발현시키는) 혼합물을 추가한다. 그 다음 비드를 세척하고, 기구에서 제공하는 소프트웨어를 이용한 현탁 어래이 시스템 상에서 분석하기 전에 몇 차례 진공으로 흡출시킬 수 있다. 이 소낭을 선택적으로 추출하는데 이용할 수 있는 항원의 정체성은 분석으로부터 밝혀질 수 있을 것이다.
영상화 시스템을 이용한 분석을 이용하여 특이적 조직, 세포 또는 종양 유형으로부터 소낭을 발견하고, 이를 특별히 선택하고, 농축시키기 위하여 소낭의 표면에 발현되는 단백질을 탐지하고 정량화할 수 있다. 다중 웰 다중화 탄소 피복된 플레이트에 콘쥬게이트된 항체, 펩티드 또는 세포들을 이용할 수 있다. 웰 안의 많은 분석 물질의 동시 측정은 패턴화된 탄소 작업 표면에 어래이 된 캡쳐 항체의 이용을 통하여 이루어질 수 있다. 그 다음 분석물질은 강화된 전기-화학적 발광 플레이트를 가진 전극 웰에서 시약으로 라벨될 항체로 탐지할 수 있을 것이다. 유기 기원의 임의의 분자는 탄소 피복된 플레이트에 성공적으로 콘쥬게이트시킬 수 있다. 소낭의 표면에 발현되는 단백질들을 이 분석으로부터 확인할 수 있고, 그리고 특이적 조직 또는 종양 유형으로부터 소낭을 특별히 선별하고 이를 농축시키기 위한 표적으로 이용할 수 있다.
결합물질은 또한 압타머일 수 있는데, 이는 이들의 상보 서열이외의 분자들에 결합할 수 있는 핵산을 지칭한다. 압타머는 전형적으로 30-80개 핵산을 보유하며, 특정 표적 분자에 대해 높은 친화력을 보유할 수 있다(보고된 Kd는 10-11~ 10- 6mole/l). 표적을 위한 압타머는 기하급수적 농축에 의해 리간드의 조직적 발달을 이용하여 확인할 수 있다(SELEX) (Tuerk & Gold, Science 249:505-510, 1990; Ellington & Szostak, Nature 346:818-822, 1990), 가령, 미국 특허 제5,270,163호, 제6,482,594호, 제6,291,184호, 제6,376,190호 그리고 제6,458,539호에서 설명됨. 핵산의 라이브러리에 표적 소낭을 접촉시킬 수 있고, 표적에 특이적으로 결합된 이들 핵산은 표적에 특이적으로 결합하지 않은 라이브러리안의 나머지 핵산들로부터 분할된다. 분할된 핵산은 증폭되어 리간드-농축된 풀(pool)을 만든다. 결합, 분할 및 증폭(가령, 선별)의 다수 순환으로 바람직한 활성을 가진 하나 이상의 압타머들을 확인한다. 소낭을 분리하기 위하여 압타머를 확인하는 또다른 방법은 미국 특허 제6,376,190호에서 설명하고 있으며, 여기에서는 화학적으로 합성된 펩티드에 결합으로 라이브러리 안에 핵산의 빈도의 증가 또는 감소를 설명한다. 변형된 방법들, 가령, 레이져 SELEX 또는 deSELEX(미국 특허 공개 20090264508에서 설명된)을 또한 이용할 수 있다.
결합제에 대해 본 명세서에서 이용된 것과 같이, 용어 "특이적"은 기타 표적보다 이 표적에 더 큰 친화력을 가진다는 의미인데, 전형적으로 이 결합제가 이의 표적에 절대적으로 특이적임을 요구하지는 않지만, 훨씬 더 큰 친화력을 가진다.
마이크로유체(Microfluidics)
소낭을 확인하고 단리시키는 방법들은 마이크로유체 장치와 조합하여 이용할 수 있다. 여기에서 설명된 소낭을 단리 또는 탐지하는 방법들은 가령, 마이크로유체 장치를 이용하여 실시할 수 있다. "lab-on-a-chip" 시스템, 생물의학적 마이크로-전기-시스템 (bioMEMs), 또는 다중성분 집적된 시스템으로도 불리는 마이크로유체 장체는 소낭을 단리하고 분석하는데 이용할 수 있다. 이러한 시스템들은 소낭의 결합, 생체특징의 탐지, 그리고 다른 프로세스를 허용하는 프로세스를 소형화하고, 구별시킨다.
마이크로유체 장치를 이용하여 크기 차등 또는 친화력 선별을 통하여 소낭을 분리하는데 또한 이용할 수 있다. 예를 들면, 마이크로유체 장치는 크기에 근거하여 생물학적 시료로부터 소낭을 단리시키는 하나 이상의 채널을 이용하거나 또는 생물학적 시료로부터 소낭을 단리하기 위한 하나 이상의 결합물질을 이용한다. 생물학적 시료는 소낭의 통과를 선택적으로 허용하는 하나 이상의 마이크로유체 채널로 도입될 수 있다. 선별은 소낭의 성질, 가령, 소낭의 크기, 모양, 기형성, 또는 생체특징에 근거할 수 있다.
한 구체예에서, 이종 집단의 소낭을 마이크로유체 장치로 도입시킬 수 있으며, 그리고 하나 이상의 상이한 동종 집단의 소낭을 얻을 수 있다. 예를 들면, 상이한 채널는 상이한 소낭 집단을 선별하도록 상이한 크기 선별 또는 결합물질을 보유할 수 있다. 따라서, 마이크로유체 장치는 다수의 소낭을 단리시킬 수 있으며, 여기에서 다수의 소낭의 최소한 일부분 집합은 다수의 소낭의 또다른 부분 집합과는 상이한 생체특징을 포함한다. 예를 들면, 마이크로유체 장치는 최소한 2가지, 3가지, 4가지, 5가지, 6가지, 7가지, 8가지, 9가지, 10가지, 15가지, 20가지, 25가지, 30가지, 40가지, 50가지, 60가지, 70가지, 80가지, 90가지, 또는 100가지의 상이한 부분집합을 분리할 수 있고, 여기에서 소낭의 각 부분집합은 상이한 생체특징을 포함한다.
일부 구체예들에서, 마이크로유체 장치는 소낭의 추가 농축 또는 선별을 허용하는 하나 이상의 채널을 포함할 수 있다. 제 1 채널을 통과한 후 농축된 소낭 집단은 제 2 채널로 도입되어, 제 2 채널 안에 존재하는 하나 이상의 결합물질을 통하여 추가 농축될 바람직한 소낭 또는 소낭 집단의 통과를 허용한다.
어래이-기반 분석 및 비드-기반 분석은 마이크로유체 장치로 이용할 수 있다. 예를 들면, 결합물질은 비드에 연결될 수 있으며, 비드와 소낭 사이에 결합 반응은 마이크로유체 장치 내에서 실시할 수 있다. 다중화(multiplexing) 또한 마이크로유체 장치를 이용하여 실행할 수 있다. 상이한 격실은 상이한 집단의 소낭에 대한 상이한 결합물질을 포함할 수 있으며, 여기에서 각 집단은 상이한 기원 세포 특이적 소낭 집단에 대한 것이다. 한 구체예에서, 각 집단은 상이한 생체특징을 보유한다. 미소구체와 소낭 사이에 혼성화 반응은 마이크로유체 장치 안에서 실행할 수 있으며, 그리고 반응 혼합물은 탐지 장치로 운반될 수 있다. 탐지 장치, 가령, 이중 또는 다중 레이져 탐지 시스템은 마이크로유체 시스템의 일부분일 수 있으며 그리고 이의 색-코딩에 의해 각 비드 또는 미소구체를 확인하기 위하여 레이져를 이용할 수 있고, 그리고 또다른 레이져는 각 비드에 관련된 혼성화 신호를 탐지할 수 있다.
본 발명의 방법들에는 임의의 적절한 마이크로유체 장치가 이용될 수 있다. 소낭에 사용하는 또는 소낭에 사용하도록 개작된 마이크로유체 장치의 예는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다: 미국 특허 7,591,936, 7,581,429, 7,579,136, 7,575,722, 7,568,399, 7,552,741, 7,544,506, 7,541,578, 7,518,726, 7,488,596, 7,485,214, 7,467,928, 7,452,713, 7,452,509, 7,449,096, 7,431,887, 7,422,725, 7,422,669, 7,419,822, 7,419,639, 7,413,709, 7,411,184, 7,402,229, 7,390,463, 7,381,471, 7,357,864, 7,351,592, 7,351,380, 7,338,637, 7,329,391, 7,323,140, 7,261,824, 7,258,837, 7,253,003, 7,238,324, 7,238,255, 7,233,865, 7,229,538, 7,201,881, 7,195,986, 7,189,581, 7,189,580, 7,189,368, 7,141,978, 7,138,062, 7,135,147, 7,125,711, 7,118,910, 7,118,661, 7,640,947, 7,666,361, 7,704,735; 그리고 국제 특허 공개 WO 2010/072410; 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 통합된다. 여기에서 설명된 방법들을 이용할 수 있는 또다른 예는 Chen et al., "Microfluidic Separation and transcriptome analysis of 혈청 vescile," Lab on a Chip, Dec. 8, 2009 DOI: 10.1039/b916199f.에서 설명된다.
본 발명에 이용하기 위한 기타 마이크로유체 장치는 U.S. 특허 5,376,252, 6,408,878, 6,645,432, 6,719,868, 6,793,753, 6,899,137, 6,929,030, 7,040,338, 7,118,910, 7,144,616, 7,216,671, 7,250,128, 7,494,555, 7,501,245, 7,601,270, 7,691,333, 7,754,010, 7,837,946; U.S. 특허 출원 2003/0061687, 2005/0084421, 2005/0112882, 2005/0129581, 2005/0145496, 2005/0201901, 2005/0214173, 2005/0252773, 2006/0006067; 그리고 EP 특허 0527905 그리고 1065378을 포함하나 이에 한정되지 않는, 탄성중합체 층들, 벨브 그리고 펌프를 포함하는 장치를 포함하한다: 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 편입된다. 일부 경우들에서, 대부분 장치 또는 모든 장치는 탄성중합체 재료를 포함한다. 특정 장치는 장치를 통하여 용액의 흐름을 조절하도록 하나 또는 그 이상 탄성중합체 벨브가 포함된 장치와 열 순환 반응(가령, PCR)을 실행하도록 기획된다. 이 장치는 반응 부위 어래이를 포함할 수 있고, 따라서 이에 의해 다수의 반응이 실행된다. 따라서, 이 장치는 다중 방식으로 소낭으로부터 단리된 microRNA를 포함하는 순환하는 microRNA들을 평가하는데 이용될 수 있다. 한 구체예에서, 마이크로유체 장치는 (a) 탄성중합체 기질에 형성된 제 1 다중 유동 채널; (b) 반응 부위 어래이의 경계를 정하기 위하여 제 1 다중 유동 채널과 교차되는, 탄성중합체 기질 내에 형성된 제 2 다중 유동 채널, 각 반응 부위는 제 1 및 제 2 다중 유동 채널의 교차점에 위치한다; (c) 제 1 및 제 2 다중 유동 채널을 따라 배치된 그리고 다른 반응 부위에서 용액으로부터 각 반응 부위안에 용액을 단리시키도록 작용되는 반응 부위 사이에 위치한 다중 격리 벨브, 이때 격리 벨브는 하나 또는 그 이상의 유동 채널을 덮고, 교차되는 하나 또는 그 이상의 조절 채널을 포함하고; 그리고 (d) 서로에 대해 반응 부위들을 격리시키기 위하여 벨브를 동시에 작동시키는 수단을 포함한다. 본 발명의 범위내에서 이 장치의 기본 구조에 다양한 변형이 계획된다. PCR 방법을 이용하여 각 반응 부위에서 MicroRNA가 탐지될 수 있다. 예를 들면, 이 방법은 다음의 단계들을 포함할 수 있다: (i) 마이크로유체 장치를 제공하는 단계, 이 마이크로유체 장치는 다음을 포함한다: 채널을 통하여 서로 유체 소통되는 제 1 단부와 제 2 단부를 가진 제 1 유동 채널; 다중 유동 채널, 각 유동 채널은 말단 벽에서 끝나고; 이때 각 유동 채널은 제 1 유동 채널로부터 분기되고 제 1 유동 채널과 유체 소통되며, 이때 제 1 유동 채널로부터 유동 채널을 하나로 진입되는 수성 유체는 제 1 유동 채널 만을 통하여 유동 채널 밖으로 흘러나갈 수 있고; 그리고, 제 1 유동 채널과 유체 소통되는 주입구, 이 주입구는 시료 유체를 도입시키기 위한 주입구; 이때 각 유동 채널은 벨브와 연합되어, 닫힌 경우, 제 1 유동 채널로부터 유동 채널의 한 단부를 격리시키고, 이로 인하여 벨브와 말단 벽 사이에 격리된 반응 부위가 형성되고; 조절 채널; 이때 각 벨브는 작동력이 조절 채널에 가해지면 벨브에 연합된 유동 채널 안으로 휘고, 이에 의해 벨브가 닫히게 되는 편향가능한 막이고; 그리고 이때 작동력이 조절 채널에 가해질 때, 각 유동 채널의 벨브는 닫히고, 각 유동 채널에서 격리된 반응 부위가 만들어진다; (ii) 시료 유체를 주입구로 도입시키는 단계, 이 시료 유체는 유동 채널을 채우게 되고; (iii) 벨브를 작동시켜 시료 유체는 유동 채널 안에 별도 부분으로 분리되고; (iv) 시료 유체 안에 핵산을 증폭시키는 단계; (v) 시료 유체의 일부분을 분석하는 단계, 증폭이 반응을 만드는 지를 판단한다. 시료 유체는 증폭가능한 핵산 표적, 가령, microRNA를 포함할 수 있고, 그리고 조건은 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 조건일 수 있고, 반응은 PCR 산물의 형성을 초래한다.
한 구체예에서, microRNA을 탐지하는데 이용되는 PCR은 디지털 PCR이며, 이는 Brown, et al., U.S. Pat. No. 6,143,496, "Method of sampling, amplifying and quantifying segment of nucleic acid, 중합효소 쇄 reaction assembly having nanoliter-sized chambers and 방법 of filling chambers", 그리고 by Vogelstein, et al, U.S. Pat. No. 6,446,706, "Digital PCR"에서 설명되며, 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 편입된다. 디지털 PCR에서, 시료는 분할되어, 시료 안 개별 핵산 분자들이 이를 테면, 상기에서 설명된 마이크로유체 장치의 반응 부위와 같은 많은 별개 영역에 위치되고, 농축된다. 시료의 분할은 Poisson에 따라 평가함으로써 분자들의 카운트를 허용한다. 그 결과, 각 부분은 "0" 또는 "1" 분자들, 또는 음성 또는 양성 반응을 각각 포함할 것이다. PCR 증폭 후, 핵산은 PCR 단부-산물, 양성 반응을 포함하는 영역들을 카운트함으로써 정량화될 수 있다. 통상적인 PCR에서, 출발 복사 수는 PCR 증폭 주기의 수에 비례한다. 그러나, 디지털 PCR은 초기 시료 양을 결정하기 위하여 증폭 주기 수에 의존하지 않고, 불확실한 지수적 데이터에 의존성을 제거하고, 절대적인 정량화를 제공한다. 따라서, 이 방법은 시료 안에 microRNA를 탐지하는 감각적인 방법을 제공할 수 있다.
한 구체예에서, 소낭을 단리 또는 탐지하기 위한 마이크로유체 장치는 폭이 약 1㎜ 미만, 2㎜ 미만, 3㎜ 미만, 4㎜ 미만, 5㎜ 미만, 6㎜ 미만, 7㎜ 미만, 8㎜ 미만, 9㎜ 미만, 10㎜ 미만, 11㎜ 미만, 12㎜ 미만, 13㎜ 미만, 14㎜ 미만, 15㎜ 미만, 16㎜ 미만, 17㎜ 미만, 18㎜ 미만, 19㎜ 미만, 20㎜ 미만, 21㎜ 미만, 22㎜ 미만, 23㎜ 미만, 24㎜ 미만, 25㎜ 미만, 26㎜ 미만, 27㎜ 미만, 28㎜ 미만, 29㎜ 미만, 30㎜ 미만, 35㎜ 미만, 40㎜ 미만, 45㎜ 미만, 50㎜ 미만, 55㎜ 미만, 60 ㎜ 미만 또는 약 2-60㎜, 3-50㎜, 3-40㎜, 3-30㎜, 3-20㎜, 또는 4-20 mm 사이인 채널을 포함한다. 마이크로채널은 약 10㎛ 미만, 11㎛ 미만, 12㎛ 미만, 13㎛ 미만, 14㎛ 미만, 15㎛ 미만, 16㎛ 미만, 17㎛ 미만, 18㎛ 미만, 19㎛ 미만, 20㎛ 미만, 21㎛ 미만, 22㎛ 미만, 23㎛ 미만, 24㎛ 미만, 25㎛ 미만, 26㎛ 미만, 27㎛ 미만, 28㎛ 미만, 29㎛ 미만, 30㎛ 미만, 31㎛ 미만, 32㎛ 미만, 33㎛ 미만, 34㎛ 미만, 35㎛ 미만, 36㎛ 미만, 37㎛ 미만, 38㎛ 미만, 39㎛ 미만, 40㎛ 미만, 45㎛ 미만, 50㎛ 미만, 55㎛ 미만, 60㎛ 미만, 65㎛ 미만 또는 70 ㎛ 미만의 폭, 또는 약 10-70 ㎛, 10-40 ㎛, 15-35 ㎛, 또는 20-30 ㎛의 폭을 보유할 수 있다. 더욱이, 마이크로채널은 약 1㎝ 미만, 2㎝ 미만, 3㎝ 미만, 3.5㎝ 미만, 4㎝ 미만, 4.5㎝ 미만, 5㎝ 미만, 5.5㎝ 미만, 6㎝ 미만, 6.5㎝ 미만, 7㎝ 미만, 7.5㎝ 미만, 8㎝ 미만, 8.5㎝ 미만, 9㎝ 미만, 9.5㎝ 미만 또는 10 ㎝ 미만의 길이를 보유할 수 있다. 마이크로유체 장치는 약 40㎛, 41㎛, 42㎛, 43㎛, 44㎛, 45㎛, 46㎛, 47㎛, 48㎛, 49㎛, 50㎛, 51㎛, 52㎛, 53㎛, 54㎛, 55㎛, 56㎛, 57㎛, 58㎛, 59㎛, 60㎛, 65㎛, 70㎛, 75㎛, 또는 80 ㎛ 폭 미만의, 또는 약 40-80㎛, 40-70㎛, 40-60㎛ 또는 45-55 ㎛ 폭을 가지는 홈을 천장에 보유할 수 있다. 홈은 약 1㎛, 2㎛, 3㎛, 4㎛, 5㎛, 6㎛, 7㎛, 8㎛, 9㎛, 10㎛, 11㎛, 12㎛, 13㎛, 14㎛, 15㎛, 16㎛, 17㎛, 18㎛, 19㎛, 20㎛, 25㎛, 30㎛, 35㎛, 40㎛, 45㎛, 또는 50 ㎛ 미만의 깊이, 가령, 약 1-50㎛, 5-40㎛, 5-30㎛, 3-20㎛ 또는 5-15 ㎛의 깊이를 보유할 수 있다.
마이크로유체 장치는 채널의 표면에 부착된 또는 채널에 존재하는 하나 이상의 결합 물질을 보유할 수 있다. 예를 들면, 마이크로채널은 하나 이상의 캡쳐 물질, 가령, EpCam, CD9, PCSA, CD63, CD81, PSMA, B7H3, PSCA, ICAM, STEAP, 및 EGFR에 대한 캡쳐 물질을 보유한다. 한 구체예에서, 마이크로채널 표면은 아비딘 및 캡쳐 물질, 가령, 바이오티닐화 된 항체로 처리되는데, 아비딘에 결합하기 위하여 채널안으로 주입될 수 있다. 다른 구체예들에서, 캡쳐 물질들은 마이크로유체 장치의 쳄버 또는 기타 성분들 안에 존재한다. 캡쳐 물질들은 마이크로유체 채널들을 통하여 이동되도록 조정될 수 있는 비드에 또한 부착될 수 있다. 한 구체예에서, 캡쳐 물질들은 자석 비드에 부착된다. 비드는 자석을 이용하여 조정될 수 있다.
생물학적 시료는 마이크로유체 장치, 또는 마이크로채널안으로 가령, 분당 최소한 약 1㎕, 2㎕, 3㎕, 4㎕, 5㎕, 6㎕, 7㎕, 8㎕, 9㎕, 10㎕, 11㎕, 12㎕, 13㎕, 14㎕, 15㎕, 16㎕, 17㎕, 18㎕, 19㎕, 20㎕, 25㎕, 30㎕, 35㎕, 40㎕, 45㎕, 또는 50 ㎕의 속도로, 가령, 분당 약 1-50㎕, 5-40㎕, 5-30㎕, 3-20㎕ 또는 5-15 ㎕의 속도로 흘러보낼 수 있다. 하나 이상의 소낭은 캡쳐될 수 있고, 마이크로유체 장체에서 직접적으로 탐지될 수 있다. 대안으로, 캡쳐된 소낭은 방출되고, 분석 전 마이크로유체 장치를 나온다. 또다른 구체예에서, 하나 이상의 캡쳐된 소낭은 마이크로채널 안에서 용해되고, 가령, 소낭 안에 패이로드를 검사하기 위하여 이 용해물을 분석할 수 있다. 용해 완충액은 채널을 통하여 흘러들어가서 캡쳐된 소낭을 용해시킬 수 있다. 예를 들면, 용해 완충액은 이 장치 또는 마이크로채널로 가령, 분당 최소한 약 1㎕, 2㎕, 3㎕, 4㎕, 5㎕, 6㎕, 7㎕, 8㎕, 9㎕, 10㎕, 11㎕, 12㎕, 13㎕, 14㎕, 15㎕, 16㎕, 17㎕, 18㎕, 19㎕, 20㎕, 25㎕, 30㎕, 35㎕, 40㎕, 45㎕, 또는 50 ㎕의 속도로, 가령, 분당 약 1-50㎕, 5-40㎕, 5-30㎕, 3-20㎕ 또는 5-15 ㎕의 속도로 흘러들어갈 수 있다. 용해물은 수거하고, 그리고 소낭의 하나 이상의 생물지표들을 탐지하기 위하여 분석할 수 있다.
본 명세서에서 기술된 다양한 격리 및 탐지 시스템은 진단, 예후, 질환 계층화, 치료진단(theranosis), 반응자/비-반응자 상태의 예측, 질환 관찰, 처치 관찰 그리고 이러한 질환 및 장애들에 관련된 유사한 것들에 대한 정보를 제공하는 순환하는 생물지표들 이를 테면 소낭을 단리 또는 탐지하는데 이용될 수 있다. 격리 기술의 조합도 본 발명의 범위 내에 있다. 비-제한적 실시예에서, 시료는 이를 테면 전기이동적 운동성의 크기와 같은 성질에 근거하여 소낭을 단리하기 위하여 크로마토그래피 컬럼을 통하여 이동될 수 있고, 그리고 그 다음 이 소낭은 마이크로유체 장치를 통하여 통과될 수 있다. 결합제는 이 단계들 전, 후 또는 이 단계 동안에 이용될 수 있다.
세포 및 질환-특이적 소낭
여기에서 설명된 결합 물질을 이용하여 소낭, 가령, 기원 세포 소낭 또는 특이적 생체특징을 가진 소낭을 단리 또는 탐지할 수 있다. 결합 물질을 이용하여 소낭으로부터 이종 집단의 소낭을 탐지 또는 단리할 수 있고, 또는 이종 집단의 소낭으로부터 특이적 생체특징을 가진 소낭, 가령, 기원 세포 특이적 소낭의 동종 집단을 단리 또는 탐지할 수 있다.
소낭, 가령, 기원 세포 특이적 소낭의 동종 집단은 분석하고, 그리고 이를 이용하여 피험자의 표현형을 특징화할 수 있다. 기원 세포 특이적 소낭은 특이적 조직의 세포들, 관심 대상의 특이적 종양의 세포들 또는 관심 대상의 질병든 조직, 순환하는 종양 세포들, 또는 모계 또는 태아 기원의 세포들을 포함하나 이에 한정되지 않는 특이적 세포 유형으로부터 유도된 소낭이다. 소낭은 종양 세포들 또는 폐, 췌장, 위, 장, 방광, 신장, 난소, 고환, 피부, 결장직장, 유방, 전립선, 뇌, 식도, 간, 태반, 또는 태아 세포들로부터 유도할 수 있다. 단리된 소낭은 또한 특정 시료 유형, 가령, 비뇨기 소낭으로부터 유도된 것일 수 있다.
생물학적 시료로부터 기원 세포 특이적 소낭은 기원 세포에 특이적인 하나 이상의 결합 물질을 이용하여 단리할 수 있다. 질환 또는 상태의 분석용 소낭은 이 질환 또는 상태의 생물지표들들에 특이적인 하나 이상의 결합 물질을 이용하여 단리할 수 있다.
기원 세포 특이적 소낭을 분리하기 이전 이종 소낭 집단을 만들기 위하여, 여기에서 설명된 것과 같이 가령, 원심분리, 크로마토그래피, 또는 여과를 이용하여 기원 세포 특이적 소낭의 분리 또는 탐지 이전에 소낭을 농축시킬 수 있다. 대안으로, 이 소낭은 농축되지 않거나, 이 생물학적 시료는 기원 세포 소낭을 분리하기 전, 소낭으로 농축되지 않는다.
도 1B는 기원 세포 특이적 소낭을 단리 또는 확인하기 위한 한 가지 방법을 나타내는 순서도(6100B)를 설명한다. 제 1, 생물학적 시료는 단계(6102)에서 피험자로부터 수득한다. 시료는 분석을 실행하는 동일한 집단 또는 제 3 집단으로부터 수득할 수 있다. 그 다음, 기원 세포 특이적 소낭은 단계(6104)에서 생물학적 시료로부터 단리된다. 단리된 기원 세포 특이적 소낭은 그 다음 단계(6106)에서 분석하고, 그리고 특정 표현형에 대한 생물지표 또는 생체특징은 단계(6108)에서 확인한다. 이 방법은 다수의 표현형에 대해 이용할 수도 있다. 일부 구체예들에서, 단계(6104) 이전에, 소낭은 동종 집단의 소낭을 얻기 위하여 생물학적 시료로부터 농축하거나 또는 단리한다. 예를 들면, 특이적 세포 유형으로부터 유도된 소낭을 단리 또는 확인하는데 특이적인 하나 이상의 결합 물질을 사용하기 전, 소낭의 이종 집단은 원심분리, 크로마토그래피, 여과, 또는 여기에서 설명된 것과 같은 다른 방법들을 이용하여 단리할 수 있다.
기원 세포 특이적 소낭은 기원 세포 특이적 소낭에 높은 특이성으로 결합하는 하나 이상의 결합 물질을 이용함으로써 피험자의 생물학적 시료로부터 단리할 수 있다. 일부 경우들에서, 단일 결합물질을 이용하여 기원 세포 특이적 소낭을 단리할 수 있다. 다른 경우들에서, 결합물질의 조합을 이용하여 기원 세포 특이적 소낭을 단리시킬 수 있다. 예를 들면, 최소한 2가지, 3가지, 4가지, 5가지, 6가지, 7가지, 8가지, 9가지, 10가지, 11가지, 12가지, 13가지, 14가지, 15가지, 16가지, 17가지, 18가지, 19가지, 20가지, 25가지, 50가지, 75가지, 또는 100가지의 상이한 결합물질을 이용하여 기원 세포 소낭을 단리할 수 있다. 따라서, 소낭 집단 (가령, 동일한 결합물질 프로파일을 보유한 소낭)은 단일 또는 다수의 결합물질을 이용하여 확인할 수 있다.
하나 이상의 결합물질은 기원 세포, 가령, 종양, 자가면역 질환, 심혈관 질환, 신경 질환, 감염 또는 다른 질환 또는 장애와 관련된 기원 세포에 특이적인 표적 항원(들)에 대한 이들의 특이성에 근거하여 선택한다. 이 기원 세포는 진단, 예후, 질환 특화(stratification), 치료진단, 반응자/비-반응자 상태의 예측, 질환 모니터링, 치료 모니터링 그리고 이러한 질환 및 장애와 관련된 이와 유사한 것들에 대한 정보를 제공하는 세포일 수 있다. 기원 세포는 또한 생물지표들의 용도를 발견하는데 유용한 세포일 수도 있다. 기원 세포 특이적 소낭, 질환 특이적 소낭, 또는 종양 특이적 소낭을 단리하기 위하여 단독으로 또는 조합으로 이용할 수 있는 비-제한적인 항원의 예는 2011년 4월 6일자로 제출된 국제 특허 출원 번호PCT/US2011/031479, "Circulating Biomakers for Disease"(니는 전문이 여기에 참고자료로 편입된다)의 도 1에 나타내고, 또한 여기에서 설명한다. 항원은 결합물질에 접근가능한 막 결합된 항원을 포함할 수 있다. 항원은 표현형을 특징화하는데 관련된 생물지표들일 수 있다.
당업자는 정보를 제공하는 소낭을 단리하는데 이용되는 임의의 이용가능한 항원이 본 발명에 의해 고려된다는 것을 인지할 것이다. 여기에서 제시한 것과 같이, 표면 항원들 및/또는 이의 단편들을 인지하는 결합물질, 가령, 항체들, 압타머들 및 렉틴이 선택될 수 있다. 결합물질은 바람직한 세포 유형 또는 위치에 특이적인 항원을 인지할 수 있고 및/또는 바람직한 세포들과 관련된 생물지표들을 인지할 수 있다. 이 세포들은 가령, 종양 세포들, 다른 질환이 있는 세포들, 가령, 활성화된 면역 세포들과 같은, 질환의 지표로 작용할 수 있는 세포들일 수 있다. 당업자는 관심 대상의 임의의 세포에 대한 결합 물질은 이들 세포와 관련된 소낭을 단리하는데 유용다는 것을 인지할 것이다. 당업자는 또한 여기에서 설명된 결합 물질은 관심 대상의 소낭을 탐지하는데 이용할 수 있다는 것을 추가 인지할 것이다. 비-제한적인 예로서, 소낭 생물지표에 대한 결합 물질은 하나 이상의 동일한 또는 상이한 결합물질에 의해 결합된 소낭을 탐지하기 위하여 직접적 또는 간접적으로 라벨할 수 있다.
암, 자가면역 질환, 심혈관 질환, 신경 질환, 감염 또는 다른 질환 또는 장애와 관련된 소낭에 결합하는데 유용한 결합 물질에 대한 다수의 표적은 표 4에 제시한다. 열거한 장애들중 하나와 관련된 세포로부터 유도된 소낭은 표에 있는 항원중 하나를 이용하여 특징화할 수 있다. 결합물질, 가령, 항체 또는 압타머는 열거된 항원들, 이의 단편들의 에피토프를 인지할 수 있고, 또는 결합물질은 임의의 적합한 조합에 대항하여 이용할 수 있다. 소낭을 특징화하시 위하여 이 질환 또는 장애와 연관된 다른 항원들이 인지될 수도 있다. 당업자는 소낭을 특징화하기 위하여 분리, 캡쳐 또는 탐지용으로 정보를 제공하는 소낭을 평가하는데 이용할 수 있는 임의의 이용가능한 항원이 고려된다는 것을 인식할 것이다.
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010

전술한 표 4, 뿐만 아니라 본 명세서에서 공개된 기타 생물지표들은 설명을 위한 것이며, 출원인은 상이한 질환 상태 또는 조건에 걸쳐 설명된 다양한 생물지표들의 통합도 고려한다. 예를 들면, 본 발명의 방법은 상이한 질환 또는 조건에 걸쳐 다양한 생물지료를 이용할 수 있는데, 이때 생물지표들은 진단, 예후 또는 치료진단 특징을 제공하는데 유용하다. 한 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 또는 당업계에 공지되어 있는 혈관신생, 염증 또는 면역-연합된 항원 (또는 생물지표들)은 생물특징의 식별에서 생물학적 시료를 스크리닝하기 위한 본 발명의 방법들에 이용될 수 있다. 게다가, 미세소낭 집단을 평가하기 위하여 출원인의 다중 방법의 유연성은 상이한 조건 또는 질환에 대한 다양한 지표들(그리고 일부 경우에 중첩되는 지표들)의 평가를 용이하게 하고, 이들의 병인관계는 필수적으로 특정 세포의 그리고 생물학적 기전을 공유할 수 있는데, 가령, 상이한 암들은 신생혈관생성, 또는 면역 반응 조절 또는 조정을 위한 생물지료들과 관련된다. 미세소낭-연합된 생물지표들과 함께, 조직 또는 세포-특이적 생물지표들과 이러한 중첩되는 생물지표들의 조합으로 본 발명의 방법 및 조성물을 실행하는 강력한 일련의 도구를 제공한다.
기원 세포 특이적 소낭은 여기에서 설명된 것과 같이, 신규한 결합 물질과 방법을 이용하여 단리할 수 있다. 더욱이, 기원 세포 특이적 소낭은 이러한 소낭의 세포 결합 짝 또는 결합 물질에 근거한 분리 방법을 이용하여 생물학적 시료로부터 단리시킬 수 있다. 이러한 세포성 결합 짝은 하나 이상의 특이적 생물지표들이 존재하는 이러한 소낭에만 결합하는 펩티드들, 단백질들, RNA, DNA, 압타머들, 세포들 또는 혈청-연관된 단백질들을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 기원 세포 특이적 소낭의 분리 또는 탐지는 단일 결합짝 또는 결합물질, 또는 결합 짝 또는 결합물질의 조합으로 실시할 수 있는데, 이들의 단일 적용 또는 복합 적용으로 기원 세포 특이적 분리 또는 탐지가 이루어진다. 이러한 결합물질의 비-제한적 예는 2011년 4월 6일자로 제출된 국제 특허 출원 번호 PCT/US2011/031479, "Circulating Biomakers for Disease"(이 출원은 전문이 여기에 참고자료로 편입된다)의 도 2에 제공한다. 예를 들면, 특징화 유방암의 소낭은 에스트로겐, 프로게스테론, 트라스투주마브, CCND1, MYC PNA, IGF-1 PNA, MYC PNA, SC4 압타머 (Ku), AII-7 압타머 (ERB2), Galectin-3, 뮤신-유형 O-글리칸, L-PHA, Galectin-9, 또는 이의 임의의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는 하나 이상의 결합 물질로 단리할 수 있다.
결합물질은 또한 다음에 근거하여 기원 세포 특이적 소낭을 단리 또는 탐지하는데 이용할 수 있다: i) 기원 세포 특이적 소낭에 특이적인 항원의 존재; ii) 기원 세포 특이적 소낭에 특이적인 지표들의 부재; 또는 iii) 기원 세포 특이적 소낭에 특이적인 생물지표들의 발현 수준. 이종 소낭 집단은 소낭의 기원 세포 특징들을 배제하거나 또는 확인하기 위하여 기획된 특이적 결합 물질로 피복된 표면에 제공할 수 있다. 다양한 결합물질, 가령, 항체들은 고형 표면 또는 기질 상에 어래이될 수 있고, 이종 소낭 집단은 상호작용이 일어날 수 있도록 충분한 시간 동안 고형 표면 또는 기질과 접촉시킨다. 어래이 표면 또는 기질 상의 주어진 항체 위치에 특이적 결합 또는 비-결합은 주어진 기원 세포에 특이적인 소낭 집단의 항원 특이적 특징들을 확인하는 기능을 할 수 있다. 즉, 결합 사건들은 결합된 항체에 의해 인지되는 항원을 보유하는 소낭의 존재를 알릴 수 있다. 역으로, 결합 사건의 부족은 결합된 항체에 의해 인지되는 항원을 보유하는 소낭의 부재를 알릴 수 있다.
기원 세포 특이적 소낭은 상기에서 설명된 것과 같은 자석 캡쳐 방법, 형광 활성화된 세포 분류 (FACS) 또는 레이져 혈구계산을 이용한 하나 이상의 결합 물질을 이용하여 농축 도는 단리시킬 수 있다. 자석 캡쳐 방법들은 자석으로 활성화된 세포 분류기 (MACS) 마이크로비드 또는 자석 컬럼의 이용을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이용될 수 있는 면역친화력 및 자석 미립자 방법들의 예는 미국 특허 제4,551,435호, 제4,795,698호, 제4,925,788호, 제5,108,933호, 제5,186,827호, 제5,200,084호 또는 제5,158,871호에 설명된다. 기원 세포 특이적 소낭은 또한 미국 특허 제7,399,632호에 설명된 일반적인 방법들에 따라, 소낭에 특이적인 항원 조합을 이용하여 단리할 수 있다.
생물학적 시료에 대해 기원 세포 특이적 소낭을 단리 또는 농축시키는 임의의 다른 적합한 방법들은 본 발명과 조합될 수 있다. 예를 들면, 크기 압출 크로마토그래피 가령, 겔 침투 컬럼, 원심분리 또는 밀도 그라디언트 원심분리, 그리고 여과 방법들은 여기에서 설명된 항원 선별 방법들과 복합하여 이용할 수 있다. 기원 세포 특이적 소낭은 Koga et al., Anticancer Research, 25:3703-3708 (2005), Taylor et al., Gynecologic Oncology, 110:13-21 (2008), Nanjee et al., Clin Chem, 2000;46:207-223 또는 미국 특허 제7,232,653호에 설명된 방법들에 따라 단리할 수 있다.
소낭은 진단, 예후, 질환 계층화, 치료진단, 반응자/비-반응자 상태의 예측, 질환 관찰, 처치 관찰 그리고 이와 유사한 것을 제공하기 위하여 단리되거나 및/또는 탐지될 수 있다. 한 구체예에서, 소낭은 종양, 또는 악성 성장, 자가면역 질환의 부위, 심혈관 질환, 신경 질환, 또는 감염으로부터 유도된 세포로부터 단리될 수 있다. 일부 구체예들에서, 단리된 소낭은 이러한 질환 및 장애와 관련된 세포들, 가령, 이 질환의 병인에서 역할을 하는 면역 세포들로부터 유도되고, 소낭의 분석은 진단, 예후, 질환 특화, 치료진단, 반응자/비-반응자 상태의 예측, 질환 모니터링, 치료 모니터링 그리고 이러한 질환 및 장애와 관련된 이와 유사한 것들에 대해 정보를 제공한다. 이 소낭은 새로운 생물지표들을 발견하는데 추가로 유용하다. 소낭과 연합된 생물지표들을 확인함으로써, 단리된 소낭은 여기에서 설명된 것과 같이, 표현형의 특징화를 위하여 평가할 수 있다.
일부 구체예들에서, 본 발명의 방법은 개체의 생물학적 시료에 존재하는 하나 또는 그 이상 미세소낭 집단을 평가함으로써 개인에서 암의 존재 또는 암발생 가능성을 특징화하는 것에 관한 것이다. 미세소낭은 본 명세서에서 기술된 또는 당업계에 공지되어 있는 하나 또는 그 이상 공정을 이용하여 단리될 수 있다.
이러한 미세소낭 집단은 테스트 시료에 대해 진단, 예후 또는 치료진단 특징을 제공하기 위하여 참조 시료와 미세소낭 집단에 대한 생물지표 프로파일, 또는 생물특징을 비교함으로써, 개인에 대한 질환 표현형 특징을 별도로 또는 집합적으로 제공할 수 있다.
이 소낭 집단(들)은 본 명세서에서 기술된 다양한 생물학적 시료 그리고 체내 유체로부터 평가될 수 있다.
생물지표 평가(Bio지표 Assesment)
본 발명의 한 측면에서, 생물학적 피험자로부터 얻은 시료를 분석하고, 시료 안에 하나 또는 그 이상의 순환하는 생물 지표들의 집단, 가령, 순환하는 소낭, 단백질 또는 핵산의 존재, 수준, 양 또는 농도를 측정함으로써, 피험자에 대해 표현형을 특징화시킬 수 있다. 구체예들에서, 특징화는 이 시료 안에 순환하는 생물지표들이 참고(표준 또는 대조군으로도 칭할 수 있다)와 비교하여 변경되는지를 결정하는 것을 포함한다. 변화는 시료와 참조 사이에 존재 또는 부재, 정량적 수준, 참조와 비교하여 상대적 수준, 가령, 존재하는 모든 소낭의 수준, 하우스키핑(하우스킵핑) 지표의 수준, 및/또는 스파이크-인(spiked-in) 지표의 수준, 상승된 수준, 감소된 수준, 과다발현, 과소발현, 차등 발현, 돌연변이 또는 기타 변경된 서열, 변형 (당화, 인산화, 후성적 변화) 그리고 이와 유사한 것을 포함하는 임의의 측정가능한 차이를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일부 구체예들에서, 순환하는 생물지표들은 이들의 양을 결정하기 앞서 시료로부터 정제 또는 농축된다. 다른 언급이 없는 한, 본 명세서에서 이용된 것과 같이,"정제된" 또는 "단리된"은 부분적 또는 완전한 정제 또는 격리를 지칭한다. 다른 구체예들에서, 순환하는 생물지표들은 사전 정제 또는 농축없이 시료로부터 직접적으로 평가된다. 순환하는 소낭은 세포 기원의 특이적 소낭 또는 특이적 생물특징을 가진 소낭일 수 있다. 생물특징은 특이적 패턴의 생물지표들, 가령, 이를 테면 질환 표현형을 탐지하는데 바람직한 표현형을 나타내는 생물지표 패턴을 포함한다. 이 생물특징은 하나 또는 그 이상의 순환하는 생물지표들을 포함한다. 생물특징은 표현형의 특징화, 가령, 진단, 예후, 치료진단, 또는 반응자/비-반응자 상태의 예측을 특징화할 때 소낭의 양을 이용할 수 있다. 일부 구체예들에서, 생물특징은 생리학적 또는 생물학적 상태, 가령, 임신 또는 임신 단계를 결정하는데 이용한다. 생물특징의 양을 또한 이용하여 치료 효과, 질환 또는 상태의 단계, 또는 질환 또는 상태의 진전을 판단할 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 소낭의 양은 질환 단계 또는 진전에서 증가와 비례 또는 역비례할 수 있다. 탐지된 소낭의 양을 또한 이용하여 질환 또는 상태의 진전을 모니터하거나 또는 치료에 대한 피험자의 반응을 모니터할 수 있다.
순환하는 생물지표들은 기준 수준 또는 값과 순환하는 생물지표들을 비교함으써 평가될 수 있다. 기준 값은 물리적 또는 일시적 종료점에 특징적일 수 있다. 예를 들면, 기준 값은 시료를 평가하는 동일 피험자의 것이거나 또는 기준 값은 시료들의 대표 집단(가령, 질환의 증상을 나타내지 않는 정상 피험자의 시료들)의 것일 수 있다. 따라서, 기준 값은 주어진 시료에서 분석되는 생물특징에 대한 피험자 시료의 정보와 비교되는 임계치를 제공할 수 있다. 이러한 기준 값은 나이 (가령, 신생, 유아, 청년기, 젊은 층, 중년층, 노련청 그리고 다양한 연령대의 성인), 인종/민족 집단, 정상 대 질환이 있는 피험자, 흡연자 대 비-흡연자, 치료를 받은 피험자 대 치료를 받지 않은 피험자, 유사하게 진단을 받은 또는 치료된 피험자 군 또는 개체에서 상이한 치료 시점들 또는 이의 조합들을 포함하나 이에 한정되지 않는 특정 무리에 대응하는 시료군으로부터 모아진 데이터에 따라 설정될 수 있다. 더욱이, 특정 개체의 상이한 시점의 치료에서 생물특징을 판단함으로써, 치료될 개체에 대한 질환 또는 상태의 치료 또는 진전에 대한 개체의 반응을 모니터할 수 있다.
기준 값은 개별화된 추적을 제공하기 위하여 동일한 피험자로부터 평가된 시료에 근거할 수 있다. 일부 구체예에서, 대상의 시료 안에 생물특징의 빈번한 테스트는 이 대상에 대해 기존에 확립된 기준 값에 대한 더 나은 비교를 제공한다. 이러한 시간 일정 측정을 이용하면 의사는 대상에 대해 이미 확립된 기준값에 대해 더 나은 비교를 제공할 수 있으며, 따라서 치료에 대한 더 나은 판단을 제공할 수 있다. 일부 경우에서, 대상의 고유 생물 특징과 비교하였을 때, 시간이 경과함께 따라 생물특징의 가변성의 감소는 이 대상에 특화된 개별화된 임계치, 가령, 진단이 이루어지는 임계치를 허용한다. 설명을 위한 예로써, 전립선 세포로부터 유도된 소낭의 수준은 시간의 경과에 따라 이 대상에서 측정되는 것이 고려된다. 대상의 혈액내 전립선에서 유도된 소낭의 수준의 스파이크는 전립선 암으로 인하여 전립선 세포의 과다증식을 나타낼 수 있다.
영향을 받지 않은 개체에서 관심 생물특징의 양을 측정함으로써 특정 표현형 없는 영향을 받지 않은 개체 (다양한 연령, 인종적 배경 및 성별)에 대해 기준값을 확립할 수 있다. 예를 들면, 기준 집단에 대한 기준 값을 테스트 피험자에서 하나 이상의 순환하는 생물지표의 탐지를 위한 기준선으로 이용할 수 있다. 피험자의 시료가 기준과 유사한 수준 또는 값을 보유한다면, 이 피험자는 이 질환을 보유하지 않거나, 또는 질환의 발달 가능성이 낮은 것으로 확인할 수 있다.
대안으로, 표현형을 가진 개체에서 하나 이상의 소낭 집단의 양을 측정함으로써 특정 표현형을 가진 개체에 대해 기준 값 또는 수준을 확립할 수 있다. 추가로, 특정 표현형에 대한 색인 값이 생성될 수 있다. 예를 들면, 상이한 질환 단계는 가령, 상이한 질환 단계를 가진 개체로부터 수득된 상이한 값을 보유할 수 있다. 피험자의 값은 색인과 비교할 수 있고, 이 질환의 진단 또는 예후, 가령, 이 질환의 단계 또는 진전을 결정할 수 있고, 이때 대상의 수준은 이 색인과 가장 밀접하게 관련된다. 다른 구체예들에서, 색인 값은 치료 효과에 대해 생성된다. 예를 들면, 특정 질환을 가진 개체의 소낭 수준이 생성될 수 있고, 이 개체에 무슨 치료가 효과적인지를 알 수 있다. 소낭의 수준을 이용하여 값을 만들고, 이 값을 피험자의 값과 비교하고, 그리고 가령, 이 수준으로부터 이 피험자가 치료에 대해 반응자 또는 비-반응자인지를 예측함으로써 개체에 대한 치료 또는 치료법을 선택할 수 있다.
일부 구체예들에서, 특정 암에 대한 생물지표를 특이적으로 표적하는 항원을 가진 순환하는 생물지표들을 단리 또는 탐지함으로써, 특정 암을 가지지 않는 개체에 대해 기준 값을 정한다. 비-제한적 예로써, 영향을 받지 않은 개체에 대해 처방된 동일한 기술을 이용하여, 다양한 단계의 직장결장암 및 암이 아닌 용종을 가진 개체들을 조사할 수 있고, 그리고 각 집단에 대한 순환하는 소낭의 수준들을 결정할 수 있다. 일부 구체예들에서, 이 수준은 최소한 이중 또는 삼중으로 실시된 최소한 2가지 별개 실험으로부터 평균 ± 표준 편차로 정의한다. 관찰된 구별되는 생물지표들의 통계학적 유의성을 판단하기 위하여 통계학적 테스트를 이용하여 이들 집단 간을 비교할 수 있다. 일부 구체예들에서, 통계학적 유의성은 매개변수적 통계학적 테스트를 이용하여 측정한다. 매개변수적 통계학적 테스트는 분별적 인자 기획, 가변성 분석(ANOVA), t-테스트, 최소제곱법, Pearson 상관관계, 단순 선형 회귀, 비-선형 회귀, 다중 선형 회귀, 또는 다중 비선형 회귀를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 대안으로, 매개변수적 통계학적 테스트는 일원 변량 분석, 이원 변량 분석, 또는 반복 변형 분석 측정을 포함한다. 다른 구체예들에서, 통계학적 유의성은 비-매개변수적 통계학적 테스트를 이용하여 측정한다. 실시예는 Wilcoxon signed-rank 테스트, Mann-Whitney 테스트, Kruskal-Wallis 테스트, Friedman 테스트, Spearman 순위 상관 계수, Kendall Tau 분석, 그리고 비-매개변수적 회귀 테스트를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일부 구체예들에서, 통계학적 유의성은 0.05, 0.01, 0.005, 0.001, 0.0005, 또는0.0001 미만의 p-값에서 측정한다. p-값은 가령, Bonferroni 보정, 이의 변형, 또는 당업계에 공지되어 있는 다른 기술, 가령, Hochberg 보정, Holm-Bonferroni 보정, idk 보정, Dunnett의 보정 또는 Tukey의 다중 비교를 이용하여 보정할 수 있다. 일부 구체예들에서, ANOVA는 각 집단의 생물지표들의 테스트 후 비교를 위하여 Tukey 보정을 한다.
질환 재발 모니터링 (또는 MS에서 악화 파아지), 치료 반응 모니터링, 또는 반응자/비-반응자 상태의 예측을 위하여 기준 값을 확립할 수 있다.
일부 구체예들에서, 소낭에 대한 기준 값은 합성 소낭이라고도 불리는 인공적인 소낭을 이용하여 측정한다. 인공적인 소낭을 제조하는 방법들은 당업계에 공지되어 있으며, 가령, 리포좀을 이용하여 만들 수 있다. 인공적인 소낭은 US20060222654 및 US4448765에서 공개된 방법을 이용하여 제조할 수 있다(이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 통합된다). 공지의 지표를 가진 인공적인 소낭을 작제하여 캡쳐 및/또는 탐지를 용이하게 할 수 있다. 일부 구체예들에서, 인공적인 소낭은 프로세싱하기 전 체내 시료에 고정시킨다. 초기 시료 대 프로세스된 시료에서 소낭의 양에 대한 기준을 제공하기 위하여, 프로세싱 동안 고유의 합성 소낭의 수준은 여기에서 설명된 여과 또는 다른 분리 방법을 이용하여 추적할 수 있다. 유사하게, 임의의 프로세스 단계 전 또는 후, 인공적인 소낭을 시료에 고정시킬 수 있다. 일부 구체예들에서, 인공적인 소낭을 이용하여 소낭의 분리 및 탐지에 이용되는 장비의 구경을 정한다.
인공적인 소낭을 만들고, 그리고 분석, 가령, 비드-기반 분석의 가능성을 테스트하기 위한 대조군으로 이용할 수 있다. 인공적인 소낭은 비드 및 탐지 항체들 모두에 결합할 수 있다. 따라서, 인공적인 소낭은 이들 각 항체가 결합하는 아미노산 서열/구조를 포함한다. 인공적인 소낭은 정제된 단백질 또는 항체가 결합하는 합성 펩티드 서열을 포함할 수 있다. 인공적인 소낭은 비드, 가령, 생물학적 분자들이 부착할 수 있는 폴리스티렌 비드일 수도 있다. 비드가 이용가능한 카르복실기를 보유한다면, 단백질 또는 펩티드는 가령, 카르보디이미드 커플링과 같은 이용가능한 아민 기를 통하여 비드에 부착할 수 있다.
또다른 구체예에서, 인공적인 소낭은 아비딘으로 피복된 폴리스티렌 비드일 수 있으며, 그리고 바이오틴은 합성 시점에 또는 바이오틴-말레이미드 화학물질을 통하여 선택된 단백질 또는 펩티드상에 위치한다. 비드상에 있는 단백질들/펩티드들은 인공적인 소낭이 이용되는 분야에 특이적인 비율로 함께 혼합할 수 있으며, 그 다음 비드에 콘쥬게이트시킨다. 그 다음 이들 인공적인 소낭은 캡쳐 비드와 탐지 항체들 사이의 링크로 작용하고, 이로 인하여 분석 성분들이 적절히 작용하는지를 보유주기 위한 대조군을 제공한다.
값은 정량적 또는 정성적 값일 수 있다. 이 값은 소낭의 수준(예로, 용적당 질량)의 직접적인 측정이거나 간접적 측정, 가령, 특이적 생물지표의 양일 수도 있다. 이 값은 정량적, 가령, 수치 값일 수 있다. 다른 구체예들에서, 이 값은 정성적, 가령, 소낭이 없음, 낮은 수준의 소낭, 중간 수준의 소낭, 높은 수준의 소낭, 또는 이의 변이일 수 있다.
기준 값은 데이터베이스에 저장할 수 있고, 그리고 특이적 생체특징을 가진 소낭으로부터 순환하는 생물지표들, 가령, 소낭 또는 microRNA의 총량, 또는 특이적 집단의 소낭 또는 microRNA의 양, 가령, 기원 세포 특이적 소낭 또는 microRNA 또는 microRNA의 양 또는 수준에 근거하여 진단, 예후, 치료진단, 질환 특화, 질환 모니터링, 치료 모니터링 또는 질환 또는 상태의 비-반응자/반응자 상태의 예측을 위한 기준으로 이용할 수 있다. 설명을 위한 예로서, 암을 진단하는 방법을 고려한다. 이 암이 있는 그리고 없는 기준 피험자의 소낭 또는 다른 순환하는 생물지표들을 평가하고, 데이터베이스에 보관한다. 기준 피험자들은 이 암 또는 또다른 상태, 가령, 건강한 상태를 나타내는 생체특징을 제공한다. 테스트 피험자의 시료를 그 다음 분석하고, 그리고 데이터베이스에 있는 것과 대조하여 microRN생체특징을 비교한다. 피험자의 생체특징이 암을 나타내는 기준 값에 좀더 근접하다면, 암 진단이 내려질 수 있다. 역으로, 피험자의 생체특징이 건강한 상태를 나타내는 기준 값과 좀더 밀접하다면, 이 피험자는 이 질환이 없는 것으로 판단할 수 있다. 당업자는 이 실시예는 비-한정적이며, 다른 표현형, 가령, 다른 질환, 예후, 치료진단, 질환 특화, 질환 모니터링, 치료 모니터링 또는 비-반응자/반응자 상태의 예측, 및 이와 유사한 것들을 평가하는 것까지 확장시킬 수 있음을 인지할 것이다.
표현형을 특징화하기 위한 생체특징은 표면 항원 또는 페이로드와 같은 소낭과 연합된 생물지표들을 포함하는 순환하는 생물지표들을 탐지함으로써 결정할 수 있다. 소낭 안의 페이로드 가령, 단백질 또는 mRNA 또는 microRNA와 같은 RNA의 종이 평가될 수 있다. 대안으로, 시료 안의 페이로드를 분석하여 이 소낭으로부터 페이로드의 분석없이 표현형을 특징화한다. 소낭을 평가하기 위한 많은 분석학적 기술이 이용가능하다. 일부 구체예들에서, 당업계에 공지되어 있는 과정에 따라 질량 분석, 유동 세포분석법, 면역세포화학적 착색, Western 블랏팅, 전기영동, 크로마토그래피 또는 x-ray 결정학을 이용하여 소낭 수준을 특징화한다. 예를 들면, Clayton et al., Journal of immunological 방법 2001;163-174에서 설명된 것과 같이(이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 통합된다), 유동 세포분석법을 이용하여 소낭을 특징화하고, 그리고 정량적으로 측정할 수 있다. 상기에서 설명된 것과 같이, 결합물질을 이용하여 소낭 수준을 결정할 수 있다. 예를 들면, 소낭에 대한 결합 물질을 라벨하고, 이 라벨을 탐지하고, 그리고 시료 안에 소낭의 양을 결정하는데 이용한다. 결합물질은 상기에서 설명된 것과 같이, 가령, 어래이 또는 미립자에 결합시킬 수 있다.
소낭의 양을 측정하기 위하여 전기영동적 tag 또는 eTag를 이용할 수 있다. eTag는 핵산 또는 항체들에 연결된 작은 형광 분자들이며 그리고 하나의 특이적 핵산 서열 또는 단백질에 결합하도록 기획된다. eTag가 이의 표적에 결합하면, 이 표적으로부터 결합된 eTag를 절단하는데 효소를 이용한다. "리포터"라고 불리는 방출된 eTag로부터 생선된 신호는 시료 안에 있는 표적 핵산 또는 단백질의 양에 비례한다. eTag 리포터는 모세 전기영동으로 확인할 수 있다. 각 eTag 리포터의 독특한 전하-대-질량 비율--즉, 이의 분자량으로 나눈 전하--은 모세 전기영동 정보에서 특이적 피크로 나타난다. 따라서, eTag을 가진 소낭의 특이적 생물지표들을 표적함으로써, 소낭의 양 또는 수준을 측정할 수 있다.
이 소낭 수준은 이종 소낭 집단, 가령, 시료 안의 총 소낭 집단으로부터 측정한다. 대안으로, 이 소낭 수준은 동질성 집단, 또는 실질적으로 동질성 소낭 집단으로부터 측정하는데, 가령, 특이적 기원 세포 소낭, 가령, 전립선암 세포들의 소낭 수준으로부터 측정한다. 추가 다른 구체예들에서, 특정 생물지표 또는 생물지표들의 조합, 가령, 전립선 암에 특이적 생물지표를 가진 소낭에서 이 수준을 측정한다. 소낭의 수준 측정은 소낭의 생물학적지표 또는 생물지표들의 조합을 측정하는 것과 병합하여 실행할 수 있다. 대안으로, 소낭의 양을 측정하는 것은 이 소낭의 생물지표 또는 생물지표들의 조합을 측정하기 전 또는 측정 후에 실행할 수 있다.
소낭의 양을 측정하는 것은 다양한 방식으로 분석할 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 소낭 집단, 가령, 상이한 생물지표들 또는 생물지표들의 조합을 가진 상이한 기원 세포 특이적 소낭의 양은 여기에서 설명된 바와 같이 실행할 수 있다.
진단 또는 관련된 테스트의 성과는 통계학적 측정을 이용하여 전형적으로 평가한다. 특징의 성과는 감응성, 특이성 그리고 관련된 측정을 측정함으로써 평가할 수 있다. 예를 들면, 관심 순환하는 생물지표들의 수준을 분석하여 표현형을 특징화, 가령, 질환의 탐지할 수 있다. 질환을 탐지하기 위한 분석의 감응성 및 특이성을 결정한다.
참(진정한) 양성은 특징적인 피험자, 가령, 특징을 가진 것으로 정확하게 확인된 질환 또는 장애를 가진 피험자이다. 거짓(허위) 양성은 특징으로 가진 것으로 테스트에서 잘못 확인된, 특징을 가지지 않은 피험자이다. 참(진정한) 음성은 특징을 가지지 않은 것으로 정확하게 확인된, 특징이 없는 피험자이다. 거짓(허위) 음성은 특징을 가지지 않은 것으로 잘못 확인된, 특징을 가진 피험자이다. 이들 부류를 구별하는 테스트의 능력이 테스트 성과를 측정하도록 한다.
테스트의 특이성은 참(진정한) 음성 수치를 사실상의 음성 (가령, 참(진정한) 음성과 거짓(허위) 양성의 합) 수치로 나눈 것으로 정의한다. 감응성(감응성)은 얼마나 많은 피험자가 정확하게 음성으로 확인되었는지의 측정이다. 100% 특이성은 테스트가 사실상의 모든 음성을 인지한다는 것을 의미한다 - 예를 들면, 건강한 모든 사람이 건강한 것으로 인지될 수 있다. 낮은 특이성은 더 많은 음성이 양성으로 판단된다는 것을 나타낸다.
테스트의 감응성은 참(진정한) 양성의 수치를 사실상의 양성 (가령, 참(진정한) 양성과 거짓(허위) 음성의 합) 숫자로 나눈 것으로 정의한다. 특이성은 얼마나 많은 피험자가 정확하게 양성으로 확인되는 지의 측정이다. 100% 감응성은 테스트가 사실상의 모든 양성을 인지한다는 것을 말한다 - 예를 들면, 모든 아픈 사람을 아픈 것으로 인지할 것이다. 낮은 감응성은 더 많은 양성이 음성으로 잘못 판단된다는 것을 나타낸다.
테스트의 정확성은 참(진정한) 양성과 참(진정한) 음성의 수치를 모든 참(진정한)과 거짓(허위) 양성 그리고 모든 참(진정한)과 거짓(허위) 음성의 합으로 나눈 것으로 정의한다. 정확성은 감응성과 특이성 측정을 복합한 하나의 수치를 제공한다.
감응성, 특이성 그리고 정확성은 특정 식별 임계치 값에서 결정된다. 예를 들면, 전립선암 (PCa) 탐지를 위한 공통적인 임계치는 혈청에서 4 ng/mL의 전립선 특이적 항원 (PSA)이다. 임계치와 동일한 또는 이보다 높은 PSA 수준은 PCa에 대해 양성으로 간주하고 그리고 이보다 낮은 임의의 수준은 음성으로 간주한다. 임계치는 가변성이기 때문에, 감응성 및 특이성 또한 가변적이다. 예를 들면, 암을 탐지하기 위한 임계치가 증가됨에 따라, 특이성이 증가될 것이고, 이는 피험자를 양성으로 부르기 곤란하기 때문에 거짓(허위) 양성이 더 적어지게 된다. 동시에 감응성은 감소할 것이다. 식별 임계치는 가변적이기 때문에 수신자 판단 특정 곡선 (ROC 곡선)은 이원적 분류 시스템에 대한 참(진정한) 양성비율 (가령, 감응성) 대 거짓(허위) 양성 비율(가령, 1 특이성)의 그래프 플롯이다. ROC 곡선은 임계치가 변화될 때 감응성 및 특이성이 어떻게 변화되는지를 보여준다. ROC 곡선의 곡선 아래 면적(AUC)은 개괄적 값을 제시하는데, 이는 전체 범위의 임계치 이상의 테스트의 성과를 나타낸다. AUC는 분류자가 무작위로 선택한 양성 시료를 무작위로 선택한 음성 시료보다 더 높이 분류할 가능성과 동일하다. AUC가 0.5라는 것은 테스트가 50%의 적합한 순위를 가진다는 것을 말하고, 이는 분별력이 없는 것과 등가이다 (동전 뒤집기 또한 50%의 적합한 순위를 가진다). AUC가 1.0이라는 것은 테스트가 모든 피험자를 적절하게 등급화시킨다(분류)는 것을 의미한다. AUC는 Wilcoxon 순위 매김 테스트와 대등하다.
본 발명에 따른 생체특징을 이용하여 최소한 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 또는 70% 감응성, 가령, 최소한 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 또는 87% 감응성으로 표현형을 특징화시킬 수 있는데, 일부 구체예들에서, 표현형은 최소한 87.1%, 87.2%, 87.3%, 87.4%, 87.5%, 87.6%, 87.7%, 87.8%, 87.9%, 88.0%, 또는 89% 감응성, 가령, 최소한 90% 감응성으로 특징화된다. 표현형은 최소한 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 감응성으로 특징화된다.
본 발명에 따른 생체특징을 이용하여 최소한 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 또는 97% 특이성, 가령, 최소한 97.1%, 97.2%, 97.3%, 97.4%, 97.5%, 97.6%, 97.7%, 97.8%, 97.8%, 97.9%, 98.0%, 98.1%, 98.2%, 98.3%, 98.4%, 98.5%, 98.6%, 98.7%, 98.8%, 98.9%, 99.0%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100% 특이성으로 피험자의 표현형을 특징화할 수 있다.
본 발명에 따른 생체특징을 이용하여 가령, 순환하는 생물지표들의 수준 또는 다른 특징들에 근거하여 최소한 50% 감응성 그리고 최소한 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 특이성으로; 최소한 55% 감응성 및 최소한 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 특이성으로; 최소한 60% 감응성과 최소한 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 특이성으로; 최소한 65% 감응성과 최소한 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 특이성으로; 최소한 70% 감응성과 최소한 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 특이성으로; 최소한 75% 감응성과 최소한 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 특이성으로; 최소한 80% 감응성과 최소한 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 특이성으로; 최소한 85% 감응성과 최소한 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 특이성으로; 최소한 86% 감응성과 최소한 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 특이성으로; 최소한 87% 감응성과 최소한 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 특이성으로; 최소한 88% 감응성과 최소한 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 특이성으로; 최소한 89% 감응성과 최소한 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99, 또는 100% 특이성으로; 최소한 90% 감응성과 최소한 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 특이성으로; 최소한 91% 감응성과 최소한 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 특이성으로; 최소한 92% 감응성과 최소한 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 특이성으로; 최소한 93% 감응성과 최소한 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 특이성으로; 최소한 94% 감응성과 최소한 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 특이성으로; 최소한 95% 감응성과 최소한 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 특이성으로; 최소한 96% 감응성과 최소한 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 특이성으로; 최소한 97% 감응성과 최소한 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 특이성으로; 최소한 98% 감응성과 최소한 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 특이성으로; 최소한 99% 감응성과 최소한 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 특이성으로; 또는 실질적으로 100% 감응성과 최소한 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 특이성으로 피험자의 표현형을 특징화할 수 있다.
본 발명에 따른 생체특징을 이용하여 최소한 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 또는 97% 정확성으로, 가령, 최소한 97.1%, 97.2%, 97.3%, 97.4%, 97.5%, 97.6%, 97.7%, 97.8%, 97.8%, 97.9%, 98.0%, 98.1%, 98.2%, 98.3%, 98.4%, 98.5%, 98.6%, 98.7%, 98.8%, 98.9%, 99.0%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100% 정확성으로 피험자의 표현형을 특징화할 수 있다.
일부 구체예들에서, 본 발명에 따른 생체특징을 이용하여 최소한 0.60, 0.61, 0.62, 0.63, 0.64, 0.65, 0.66, 0.67, 0.68, 0.69, 0.70, 0.71, 0.72, 0.73, 0.74, 0.75, 0.76, 0.77, 0.78, 0.79, 0.80, 0.81, 0.82, 0.83, 0.84, 0.85, 0.86, 0.87, 0.88, 0.89, 0.90, 0.91, 0.92, 0.93, 0.94, 0.95, 0.96, 또는 0.97, 가령, 최소한 0.971, 0.972, 0.973, 0.974, 0.975, 0.976, 0.977, 0.978, 0.978, 0.979, 0.980, 0.981, 0.982, 0.983, 0.984, 0.985, 0.986, 0.987, 0.988, 0.989, 0.99, 0.991, 0.992, 0.993, 0.994, 0.995, 0.996, 0.997, 0.998, 0.999 또는 1.00의 AUC로 피험자의 표현형을 특징화한다.
더욱이, 특이성, 감응성, 정확성 또는AUC를 결정하는 신뢰도 수준은 최소한 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 신뢰도에서 측정할 수 있다.
다른 관련된 성과 측정은 양성 및 음성 가능성 비율 [양성 LR = 감응성/(1-특이성); 음성 LR = (1-감응성)/특이성]을 포함한다. 이러한 측정을 또한 이용하여 본 발명의 방법들에 따른 테스트 성과를 측정할 수 있다.
분류(분류ification)
본 발명에 따른 생체특징을 이용하여 시료를 분류할 수 있다. 식별력있는 분석을 위한 기술은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 주어진 질환 또는 장애에 대해 주어진 치료에 반응자인지 또는 비-반응자인지를 시료를 분류 또는 예측할 수 있다. 많은 통계학적 분류 기술에 당업자에게 공지되어 있다. 감독을 받은 학습 접근법(supervised learning approaches)에서, 두 개 이상의 집단의 시료 군을 통계학적 분류 방법으로 분석한다. 두 개 이상의 집단을 구별하는 분류자를 구축하는데 이용할 수 있는 생물지표들을 발견할 수 있다. 그 다음 새로운 시료를 분석하여 분류자는 새로운 지표를 두 개 이상의 집단중 하나와 연관시킬 수 있다. 통상적으로 이용되는 감독된 분류자는 뉴럴 네트워크(다중 층 퍼셉트론), 서포터 벡터 기계, k-nearest neighbors, Gaussian 혼합물 모델, Gaussian, 경험이 없는 Ba예, 의사결정수상도 및 방사성 기반 기능(RBF) 분류자를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 선형 분류 방법들은 Fisher의 선형 식별, 로직 회귀(logistic regression), 경험이 없는 Ba예 분류자, 퍼셉트론(perceptron), 그리고 서포트 벡터 기계(SVMs)를 포함한다. 본 발명에 이용할 수 있는 다른 분류자는 이차 분류자(quadratic 분류자), k-nearest neighbor, 부스팅(boosting), 의사결정수상도, 랜덤 포레스트(random forests), 뉴럴 네트워크, 패턴 인지, Ba예ian 네트워크 그리고 Hidden Markov 모델을 포함한다. 당업자는 이러한 또는 상기 분류자의 임의의 개선된 분류자를 포함하여, 다른 분류자을 본 발명의 범위내에서 고려할 수 있음을 인지할 것이다.
감독된 방법들을 이용한 분류는 일반적으로 다음 방법으로 실시한다:
감독된 학습(가령 손필적을 인지하는 학습)의 주어진 문제를 해결하기 위하여, 다양한 단계들을 고려해야만 한다:
1. 훈련 세트 모집. 이는 예를 들면, 질환 또는 장애가 있는 또는 없는 피험자, 치료에 반응하는 또는 반응하지 않는 피험자, 질환이 진행된 또는 진행되지 않는 피험자들로부터 시료들을 포함한다. 훈련 시료들은 분류자를 "훈련"시키는데 이용한다.
2. 학습된 기능의 투입물 "특징"을 결정한다. 학습된 기능의 정확성은 투입물 대상이 어떻게 제시되는지에 따라 달라진다. 전형적으로, 투입물 대상은 특징 벡터로 형질전환되고, 이 벡터는 대상을 설명하는 다수의 특징들을 보유한다. 과정의 크기로 인하여 특징들의 수는 너무 크지 않아야 하지만, 결과물을 정확하게 예측할 수 있을 정도로 충분한 크기를 가지야 한다. 특징들은 생물지표들의 모임 가령, 여기에서 설명된 것과 같이, 소낭으로부터 유도된 생물지표들을 포함할 수 있다.
3. 학습된 기능의 구조와 대응하는 학습 알고리즘을 결정한다. 가령, 인공적인 뉴랄 네트워크, 의사결정수상도, Ba예 분류자 또는 서포트 벡터 기계로 학습 알고리즘을 선택한다. 학습 알고리즘을 이용하여 분류자를 구축한다.
4. 분류자의 구축. 모집된 훈련 세트에서 학습 알고리즘을 운용한다. 학습 알고리즘의 매개변수는 부분집합 훈련 세트의 부분 집합(실증 세트로 불림)에서 성화를 최적화하거나 또는 교차-실증(cross-validation)으로 조절할 수 있다. 메게변수 조정 및 학습 후, 알로리즘의 성과는 훈련 세트와는 분리된 고유(경험이 없는) 시료의 테스트 세트에서 측정할 수 있다.
상기에서 설명한 것과 같이 분류자가 결정된 후, 분류자는 본 발명의 방법들에 의해 분석하게될 피험자의 시료를 분류하는데 이용할 수 있다. 한 예로써, 훈련 및 테스트 세트로 질환을 가진 그리고 질환이 없는 기준 피험자에서 관심대상의 순환하는 생물지표들의 수준에 대한 데이터를 이용하여 분류자를 구축할 수 있다. 테스트 피험자의 시료에서 발견된 순환하는 생물지표들의 수준을 평가하고, 그리고 이 분류자를 이용하여 이 피험자를 질환을 가진 또는 질환이 없는 피험자로 분류한다. 또다른 예로써, 훈련 및 테스트 세트로 특정 질환에 반응을 하는 또는 반응을 하지 않는 것으로 확인된 기준 피험자에서 관심대상의 소낭의 생물지표들의 수준에 대한 데이터를 이용하여 분류자를 구축할 수 있다. 테스트 피험자의 시료에서 발견된 소낭의 생물지표들을 평가하고, 그리고 이 분류자를 이용하여 이 피험자를 질환을 가진 또는 질환이 없는 피험자로 분류한다.
감독되지 않은 학습 접근법을 또한 본 발명에 이용할 수 있다. 클러스터링(Clustering)은 감독되지 않은 학습 접근법이며, 여기에서 클러스터링 알고리즘은 라벨들을 이용하지 않는 일련의 시료와 상관있다. 가장 유사한 시료들을 "클러스터(Clustering)"으 분류한다. 새로운 시료를 클러스터로 분류할 수 있고, 이로 인하여 가장 밀접하게 연관된 다른 구성요소들을 가진 것으로 분류할 수 있다. 당업계에 공지되어 있는 많은 클러스터링 알고리즘, 가령, 계층적(hierarchical) 클러스크링을 본 발명에 이용할 수 있다.
생체특징(Biosignatures)
표면 및 페이로드 소낭 연관된 생물지표들, 및/또는 순환하는 microRNA 및 단백질을 포함하는 순환하는 생물지표들을 포함하는 소낭 집단을을 평가함으로써 본 발명에 따른 생체특징을 얻을 수 있다. 피험자로부터 유도된 생체특징을 이용하여 피험자의 표현형을 특징화할 수 있다. 생체특징은 하나 이상의 추가 생물지표들, 가령, 관심 대상의 소낭과 연관된 순환하는 생물지표들 또는 생물지표들의 수준을 포함할 수 있다. 관심대상의 소낭의 생체특징은 소낭에 존재하는 특정 항원 또는 생물지표들을 포함할 수 있다. 생체특징은 microRNA을 포함하는 소낭 내에 페이로드로 운반되는 하나 이상의 항원들 또는 생물지표들을 포함할 수 있다. 생체특징은 이 소낭에서 탐지되는 하나 이상의 생물지표들을 가진 소낭에 존재하는 하나 이상의 항원들 또는 생물지표들의 조합을 포함할 수 있다. 생체특징은 소낭의 생물지표들이외에 소낭에 대한 다른 정보를 더 포함할 수 있다. 이러한 정보는 소낭 크기, 순환 반감기, 대사 반감기, 그리고 생체내 또는 시험관에서 특이적 활성을 포함할 수 있다. 생체특징은 분류자를 구축하는데 이용되는 생물지표들 또는 다른 특징들을 포함할 수 있다.
일부 구체예들에서, microRNA는 생물학적 시료 안에서 직접적으로 탐지한다. 예를 들면, 체액내 RNA는 시판되는 이용가능한 키트 가령, mirVana 키트 (Applied Bio시스템s/ Ambion, Austin, TX), MagMAX™ RNA 분리 키트 (Applied Bio시스템s/ Ambion, Austin, TX), 및 QIAzol 용해 시약과 RNeasy Midi Kit (Qi나이n Inc., Valencia CA)를 이용하여 단리할 수 있다. 상기에서 설명된 것과 같은 어래이 또는 PCR 기술을 이용하여 microRNA의 특정 종들을 측정할 수 있다.
일부 구체예들에서, 소낭의 microRNA 페이로드를 평가하여 표현형을 특징화한다. 이 소낭의 생체특징을 결정하기 전, 소낭을 정제하거나 또는 농축할 수 있다. 예를 들면, 기원 세포 특이적 소낭을 단리하고, 이의 생체특징을 결정할 수 있다. 대안으로, 소낭의 생체특징은 사전 정제 또는 농축없이 시료로부터 직접적으로 분석할 수 있다. 본 발명의 생체특징을 이용하여 여기에서 설명된 질환 또는 상태의 진단, 예후, 또는 치료진단 또는 유사한 측정을 할 수 있다. 생체특징은 또한 치료 효과, 질환 또는 상태의 단계, 또는 질환 또는 상태의 진전, 또는 반응자/비-반응자 상태를 결정하는데 이용할 수 있다. 더욱이, 생체특징을 이용하여 생리학적 상태, 가령, 임신을 판단할 수 있다.
소낭 안의 그리고 소낭 자체의 특징을 평가하여 생체특징을 결정한다. 이 특징을 이용하여 질환 단계 또는 진전, 질환 또는 상태의 치료학적 영향을 진단, 탐지 또는 결정하고, 또는 생리학적 상태를 특징화할 수 있다. 이러한 특징들은 소낭의 양 또는 수준, 소낭 크기, 소낭 반감기내 변이의 일시적 평가, 순환하는 소낭 반감기, 소낭의 대사 반감기, 또는 소낭의 활성을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
생체특징에 포함될 수 있는 생물지표들은 하나 이상의 단백질들 또는 펩티드들 (가령, 단백질 특징을 제공), 핵산 (가령 설명된 RNA 특징 또는 또는 DNA 특징), 지질들 (가령 지질 특징), 또는 이의 조합들을 포함한다. 일부 구체예들에서, 이 생체특징은 또한 소낭에 존재하는 약물 또는 약물 대사물질의 유형 또는 양을 포함할 수 있고 (가령, 약물 특징을 제공), 이러한 약물은 생물학적 시료를 수득하는 피험자로부터 취할 수 있는데 그 이유는, 이 약물 또는 약물의 대사 산물을 소낭이 가지고 있기 때문이다.
생체특징은 또한 하나 이상의 생물지표들의 발현 수준, 존재, 부재, 돌연변이, 변이체 변이체 복제수, 절두, 복제, 변이 또는 분자 연합을 포함할 수 있다. 유전적 변이, 또는 뉴클레오티드 변이는 코딩 및 넌-코딩 영역 안에서 뉴클레오티드 염기 결손, 삽입, 역전, 그리고 치환을 포함하나 이에 한정되지 않는 특정 위치에서의 유전자 또는 cDNA 서열에 변화 또는 변경을 지칭한다. 결손은 단일 뉴클레오티드 염기의 결손, 유전자의 뉴클레오티드 서열의 부분 또는 영역의 결손 또는 전체 유전자 서열의 결손일 수도 있다. 삽입은 하나 이상의 뉴클레오티드 염기의 삽입일 수 있다. 유전자 변이는 전사 조절 영역, mRNA의 미해독 영역, 엑손, 인트론, 또는 엑손/인트론 접합에서 일어날 수 있다. 유전자 변이는 중단 코돈, 틀 이동(frame shifts), 아미노산의 결손, 변경된 유전자 전사체 접합 형 또는 변경된 아미노산 서열을 초래하거나 또는 초래하지 않을 수 있다.
한 구체예에서, 뉴클레오티드 변이에 대해 소낭 내부의 핵산 페이로드를 포함하는 핵산 생물지표들을 평가한다. 이 핵산 생물지표는 하나 이상의 RNA 종들, 가령, mRNA, miRNA, snoRNA, snRNA, rRNA, tRNA, siRNA, hnRNA, shRNA, 인헨서 RNA (eRNA), 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 유사하게, DNA 페이로드를 평가하여 DNA 특징을 만들 수 있다.
RNA 특징 또는 DNA 특징은 소낭 안에 존재하는 RNA 또는 DNA의 돌연변이, 후생적(epigenetic) 변형, 또는 유전적 변이체 분석을 또한 포함한다. 후생적 수정은 DNA 메틸화 패턴을 포함한다. 가령, Lesche R. and Eckhardt F., DNA methylation 지표s: a versatile 진단적 tool for routine clinical use. Curr Opin Mol Ther. 2007 Jun;9(3):222-30, 이의 전문이 여기에 참고자료로 통합된다. 따라서, 생물지표는 DNA 분절의 메틸화 상태일 수 있다.
생체특징은 mRNA 특징, DNA 특징, 단백질 특징, 펩티드 특징, 항원 특징, 또는 이의 임의의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는 하나 이상의 추가 특징과 복합된, 하나 이상의 miRNA 특징을 포함할 수 있다. 예를 들면, 이 생체특징은 하나 이상의 DNA 생물지표들, 하나 이상의 mRNA 생물지표들, 하나 이상의 snoRNA 생물지표들, 하나 이상의 단백질 생물지표들, 하나 이상의 펩티드 생물지표들, 하나 이상의 항원 생물지표들, 하나 이상의 항원 생물지표들, 하나 이상의 지질 생물지표들, 또는 이의 임의의 조합과, 하나 이상의 miRNA 생물지표들을 포함할 수 있다.
생체특징은 2011년 4월 6일자로 제출된 국제 특허 출원 번호 PCT/US2011/031479, "Circulating Biomakers for Disease"(이들은 전문이 여기에 참고자료로 편입된다)의 각 도 1, 2 또는 본 명세서에서 설명된 것과 같은, 하나 이상의 항원들 또는 결합물질의 조합 (가령, 하나 이상의 결합물질에 결합하는 능력)을 포함할 수 있다. 이 생체특징은 가령, miRNA, DNA (가령 단일 스트랜드 DNA, 상보 DNA, 또는 넌코딩 DNA), 또는 mRNA를 포함하나 이에 한정되지 않는 하나 이상의 다른 생물지표들을 더 포함할 수 있다. 소낭의 생체특징은 가령, 국제 특허 출원 번호 PCT/US2011/031479의 도 1에 나타낸 하나 이상의 항원들과, 가령, 국제 특허 출원 번호 PCT/US2011/031479의 도 2에 나타낸 하나 이상의 결합물질, 그리고 국제 특허 출원 번호 PCT/US2011/031479의 도 3-60에 열거한 상태 또는 질환에 대한 하나 이상의 생물지표들의 조합을 포함할 수 있다. 이 생체특징은 하나 이상의 생물지표들, 예를 들면 miRNA와 함께 암 세포에 특이적인 하나 이상의 항원들(예를 들면, 국제 특허 출원 번호 PCT/US2011/031479의 도 1에 나타낸 것과 같은)을 포함할 수 있다.
일부 구체예들에서, 해당 벙법에 이용되는 소낭은 기원 세포에 특이적인 생체 특징을 보유하며, 그리고 질환-특이적 또는 생물학적 상태 특이적 진단, 예후 기원 세포의 대표적인 예후 또는 치료-관련된 생체특징을 유도하는데 이용한다. 다른 구체예들에서, 소낭은 진단, 예후, 단계확인(staging), 치요법-관련된 결정 또는 생리학적 상태 특징에 이용하기 위한 기원 세포의 생체특징과는 상이한 주어진 질환 또는 생리학적 상태에 특이적인 생체특징을 보유한다. 생체특징은 또한 기원 세포 특이적 소낭과 비-특이적 소낭의 조합을 포함할 수 있다.
생체특징을 이용하여 가령, 질환의 존재, 질환 단계확인, 질환 모니터링, 질환 특화, 또는 질환의 탐지, 전이 또는 재발 또는 진전의 감시와 같은 진단 기준을 평가할 수 있다. 생체특징은 또한 치료상의 중재를 포함하는 치료 양태와 관련된 판단을 하는데 임상적으로 이용할 수 있다. 생체특징은 수술을 실행할지, 또는 어떤 치료 표준을 수술(가령, 수술 전 또는 수술 후)과 함께 이용할 지를 포함하는 치료 판단을 하는데 임상적으로 더 이용할 수 있다. 설명을 위한 예로서, 공격적인 암 형태를 나타내는 순환하는 생물지표들의 생체특징은 환자를 치료하기 위하여 좀더 공격적인 외과적인 과정 및/또는 좀더 공격적인 치료 섭생을 요구할 수 있다.
생체특징은 질환을 진단하는데 유용한 테스트를 제공하고, 정확한 치료 섭생을 선택하기 위하여, 가령, 치료 진단을 제공하기 위하여 치료 관련된 진단에 이용할 수 있다. 치료진단은 질환이 있는 상태의 치료 또는 치료법에 영향을 주는 능력을 제공하는 진단 테스트를 포함한다. 치료진단 테스트는 진단 또는 예후 테스트가 각각 진단 또는 예후를 제시하는 유사한 방식으로 치료진단을 제공한다. 여기에서 이용된 것과 같이, 치료진단은 예측 의학, 개인맞춤화된 의학, 통합 의학, 약리게놈학, 그리고 Dx/Rx 파트너화를 포함하는, 치료법 관련된 임의의 바람직한 테스트 형태를 포함한다. 요법 관련된 테스트를 이용하여 개체 피험자에서 약물 반응을 예측하고 평가하여, 가령, 개인맞춤화된 의학을 제공한다. 약물 반응의 예측은 가령, 이 피험자가 후보 치료 물질에 노출되기 전, 또는 치료법으로 치료하기 전, 후보 치료 물질에 반응자일지 또는 비-반응자일지를 판단하는 것일 수 있다. 약물 반응의 평가는 치료를 시작한 후 시간에 걸쳐 피험자의 개선 또는 개선의 부족을 모니터링함으로써 약물에 대한 반응을 모니터링하는 것일 수 있다. 요법 관련된 테스트는 치료로부터 효과를 얻을 수 있는 해당 치료에 대한 피험자를 선택하는데 유용하거나 또는 개체 피험자내에서 치료 효과를 초기에 그리고 객관적으로 나타내는데 유용하다. 따라서, 여기에서 설명된 생체특징은 좀더 전망적인 치료를 선택하여, 이로 인하여 이로운 치료를 지체하는 손실을 피하고, 그리고 무효한 약물을 투여함으로써 재정적 그리고 병적 비용을 피하도록 치료를 변경해야 한다는 것을 나타낼 수 있다.
요법 관련된 진단은 다양한 질환 및 장애의 임상적 진단 및 관리에 또한 유용한데, 다양한 질환 및 장애는 심혈관 질환, 암, 감염질환, 폐혈증, 신경 질환, 중추 신경계 관련된 질환, 내부맥관 관련된 질환, 및 자가면역 관련된 질환을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 요법 관련된 진단은 또한 약물 독성, 약물 저항성 또는 약물 반응의 예측을 돕는다. 요법 관련된 테스트는 임의의 적절한 진단 테스트 포맷으로 발달될 수 있는데, 가령, 면역조직화학적 테스트, 임상 화학, 면역분석, 세포-기반 기술, 핵산 테스트 또는 신체 영상화 방법들을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 요법 관련된 테스트는 요법의 결정을 지원하는 테스트, 치료상의 독성을 모니터하는 테스트, 또는 요법 테스트에 대한 반응을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 따라서, 생체특징을 이용하여 치료에 대한 피험자의 반응을 예측 또는 모니터할 수 있다. 생체특징은 특정 치료를 개시, 제거 또는 변경한 후, 상이한 시간대별로 피험자에서 측정할 수 있다.
일부 구체예들에서, 피험자가 치료에 반응적인지의 결정 또는 예측은 생체특징의 하나 이상의 성분들(가령, microRNA, 관심대상 소낭 및/또는 생물지표들)의 양, 특정 생체특징의 하나 이상의 성분들의 양, 또는 성분들에 대해 탐지된 생체특징에서의 변화에 근거한다. 또다른 구체예에서, 상이한 시간대별로 생체특징을 판단함으로써 피험자의 상태를 모니터한다. 상태의 진전, 퇴행 또는 재발을 판단한다. 요법에 대한 반응 또한 시간을 두고 측정할 수 있다. 따라서, 본 발명은 피험자의 질환의 상태, 또는 다른 의학적 상태를 모니터링하는 방법을 제시하는데, 이 방법은 생물학적 피험자로부터 얻은 시료로부터 생체특징을 단리 또는 탐지하고, 특정 생체특징의 성분들의 전체적인 양을 탐지하고, 또는 하나 이상의 성분들의 생체특징을 탐지(가령, 생물지표의 존재, 부재, 또는 발현 수준)하는 것을 포함한다. 이 생체특징을 이용하여 이 질환의 단계 또는 상태를 모니터한다.
소낭의 하나 또는 그 이상의 신규한 생물특징들이 또한 식별될 수 있다. 예를 들면, 약물 처치 또는 처치 섭생에 반응하는 대상으로부터 하나 또는 그 이상의 소낭들이 단리될 수 있고, 참조, 이를 테면, 약물 처치 또는 처치 섭생에 반응하지 않은 또다른 대상과 비교된다. 이 생물특징들 간에 차이를 결정하고, 이를 이용하여 특정 약물 또는 처치 섭생에 대한 반응자 또는 비-반응자로 다른 대상들을 식별한다.
일부 구체예들에서, 생체특징을 이용하여 특정 질환 또는 상태가 약물에 저항성인지를 판단한다. 피험자가 약물 저항성인 경우, 의사는 이러한 약물 치료로 귀중한 시간을 낭비할 필요가 없다. 약물 선택 또는 치료 섭생의 초기 실증을 수득하기 위하여, 피험자로부터 수득한 시료에 대해 생체특징을 측정한다. 이 생체특징을 이용하여 특정 피험자의 질환이 약물 저항성과 관련된 생물지표들을 보유하는지를 평가한다. 이러한 결정으로 의사는 유효한 치료에 귀중한 시간 뿐만 아니라 환자의 재정에 전념할 수 있도록 한다.
더욱이, 생체특징을 이용하여 질환으로 고통을 받고 있는 피험자가 질환의 발전 위험에 처해있는지 또는 이 질환의 단계 또는 진전을 평가할 수 있다. 예를 들면, 생체특징을 이용하여 피험자가 전립선암 또는 결장암 또는 본 명세서에서 기술된 다른 암을 가지고 있는지를 판단할 수 있다. 더욱이, 생체특징을 이용하여 질환 또는 상태의 단계, 가령, 결장암을 판단할 수 있다.
더욱이, 소낭의 양, 가령, 이종 소낭 집단의 양과 하나 이상의 동종 소낭 집단, 가령, 동일한 생체특징을 가진 소낭의 집단의 양을 결정하면, 표현형을 특징화하는데 이용할 수 있다. 예를 들면, 시료내에서 전체 소낭의 양 (가령 세포-유형 특이적이지 않은)을 측정하고, 그리고 하나 이상의 상이한 기원 세포 특이적 소낭의 존재를 판단함으로써 표현형을 특징화할 수 있다. 임계치값, 또는 기준 값 또는 양은 하기에서 추가도 설명되는 것과 같이, 정상 피험자와 관심 표현형을 가진 피험자를 비교하고, 그리고 측정된 임계치 또는 기준 값에 근거한 기준에의해 결정한다. 상이한 기준을 이용하여 표현형을 특징화할 수 있다.
하나의 기준은 시료내 이종 소낭 집단의 양에 근거할 수 있다. 한 구체예에서, 일반적 소낭 지표들, 가령, CD9, CD81, 및 CD63을 이용하여 시료내 소낭의 양을 측정할 수 있다. CD9, CD81, CD63, 또는 이의 조합의 발현 수준을 탐지하고, 이 수준이 임계치 수준 이상이라면, 기준에 부합되는 것이다. 또다른 구체예에서, CD9, CD81, CD63, 또는 이의 조합의 수준이 임계치값 또는 기준 값 보다 더 낮다면 기준에 부합되는 것이다. 또다른 구체예에서, 기준은 소낭의 양이 임계치 또는 기준 값보다 더 높은지에 근거할 수 있다. 또다른 기준은 특이적 생체특징을 가진 소낭의 양에 근거할 수 있다. 특이적 생체특징을 가진 소낭의 양이 임계치 또는 기준 값보다 더 낮다면, 기준에 부합되는 것이다. 또다른 구체예에서, 특이적 생체특징을 가진 소낭의 양이 임계치 또는 기준 값보다 더 높다면, 기준에 부합되는 것이다. 특정 세포 유형으로부터 유도된 소낭의 양에 기준이 근거할 수 있다. 이 양이 임계치 또는 기준 값보다 더 낮다면, 기준에 부합되는 것이다. 또다른 구체예에서, 이 양이 임계치 값보다 더 높다면, 기준에 부합되는 것이다.
비-제한적인 예에서, 전립선 세포들로부터 소낭은 생물학적지표 PCSA 또는 PSCA의 탐지로부터 측정되는 것을 고려하여, 탐지된 PCSA 또는 PSCA의 수준이 임계치 수준보다 더 높다면 기준에 부합되는 것이다. 임계치는 대조군 세포계 또는 대조군 피험자의 시료내 동일한 지표들의 수준일 수 있다. 또다른 기준은 암 세포로부터 유도된 소낭의 양 또는 하나 이상의 암 특이적 생물지표들을 포함하는지에 근거할 수 있다. 예를 들면, 생물학적지표들 B7H3, EpCam, 또는 이 둘 모두를 측정하고, 탐지된 B7H3 및/또는 EpCam의 수준이 임계치 수준 이상이거나 또는 미리 결정한 범위내에 있다면 기준에 부합하는 것이다. 그 양이 임계치 또는 기준 값 보다 더 낮거나 또는 더 높다면, 기준에 부합되는 것이다. 기준은 또한 결과의 신뢰성일 수 있는데, 가령, 특질 대조군 측정 또는 값에 부합하는 것이다. 테스트 시료 내 B7H3 및/또는 EpCam의 탐지된 양이 대조군 시료내 지표들의 양보다 많은 경우, 테스트 시료내 암이 존재함을 나타낼 수 있다.
설명한 것과 같이, 기준에 부합하는 지를 평가하기 위하여, 다중 지표들의 분석을 복합시킬 수 있다. 설명을 위한 예에서, 생체특징을 이용하여 하나 이상의 일반적 소낭 지표들 CD9, CD63 및 CD81; PCSA 또는 PSMA를 포함하는 하나 이상의 전립선 상피 지표들; 그리고 하나 이상의 암 지표들 가령, B7H3 및/또는 EpCam를 탐지함으로써 피험자가 전립선암을 가지고 있는지를 평가한다. 피험자의 시료내 지표들의 수준이 전립선암이 없는 대조군 개체의 수준보다 더 높다면, 피험자는 전립선암을 가지고 있음을 나타낸다. 일부 구체예들에서, 다중 지표들은 다중 방식으로 평가한다.
상기에서 설명된 기준에 부합되는지에 근거한 이러한 규칙을 임의의 적합한 생물지표에도 적용할 수 있음을 인지할 것이다. 예를 들면, 이 기준을 소낭 특징들 가령, 존재하는 소낭의 양, 존재하는 특정 생체특징을 가진 소낭의 양, 존재하는 소낭 페이로드 생물지표들의 양, 존재하는 microRNA 또는 다른 순환하는 생물지표들의 양, 그리고 이와 유사한 것들과 같은 소낭 특징들에 적용할 수 있다. 적합한 생물지표들의 비율을 측정할 수 있다. 설명을 위한 예로써, 기준은 또다른 소낭 표면 단백질에 대한 소낭의 표면 단백질의 비율, microRNA에 대한 소낭 표면 단백질의 비율, 또다른 소낭 집단에 대한 한 가지 소낭 집단의 비율, 또다른 순환하는 생물지표에 대한 한 가지 순환하는 생물지표의 비율, 등이 될 수 있다.
피험자의 표현형은 임의의 다수의 유용한 기준에 부합하는 것에 근거하여 특징화할 수 있다. 일부 구체예들에서, 각 생물지표에 대해 최소한 한 가지 기준을 이용한다. 일부 구체예들에서, 최소한 1가지, 2가지, 3가지, 4가지, 5가지, 6가지, 7가지, 8가지, 9가지, 10가지, 15가지, 20가지, 30가지, 40가지, 50가지, 60가지, 70가지, 80가지, 90가지 또는 최소한 100가지의 기준을 이용한다. 예를 들면, 암의 특징화를 위하여, 암을 진단할 때 다수의 상이한 기준을 이용할 수 있다: 1) 피험자의 시료 내 microRNA의 양이 기준 값 보다 더 높은지; 2) 세포 유형 특이적 소낭 (가령 특이적 조직 또는 장기로부터 유도된 소낭)안의 microRNA의 양이 기준 값보다 더 높은지; 또는 3) 하나 이상의 암 특이적 생물지표들을 가진 소낭 안에 microRNA의 양이 기준 값보다 더 높은지. microRNA의 양이 기준보다 적거나 또는 기준과 동일하다면, 유사한 규정을 적용할 수 있다. 이 방법은 품질 대조군 측정을 더 포함할 수 있고, 시료들이 품질 대조군 측정에 보합하다면, 해당 피험자에 대한 결과를 제공한다. 일부 구체예들에서, 기준에는 부합하지만, 품질 대조군이 미심쩍은 경우, 이 피험자를 재평가한다.
다른 구체예들에서, 다중 생물지표들의 평가에 단일 측정하고, 그리고 이 측정을 기준과 비교한다. 설명하자면, 전립선암에 대한 테스트는 혈액 시료안에 miR-141의 수준에 대항하여 PSA 수준을 곱하는 것을 포함할 것이다. 이 수준의 결과가 임계치 이상이라면 기준에 부합되는 것이고, 이는 암의 존재를 나타낸다. 또다른 설명으로, 일반적 소낭 지표들에 대해 다수의 결합 물질은 동일한 라벨, 가령, 동일한 형광단을 운반할 것이다. 탐지된 라벨의 수준을 임계치와 비교할 수 있다.
동일한 유형의 다중 생물지표들에 추가하여, 다중 유형의 생물지표들에도 기준을 적용할 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 순환하는 생물지표들 (가령, RNA, DNA, 펩티드들)의 수준, 소낭, 돌연변이, 등을 기준과 비교할 수 있다. 생체특징의 상이한 성분들은 상이한 기준을 가질 수 있다. 비-제한적 예로써, 암 진단에 이용된 생체특징은 기준과 비교하였을 때 한 가지 miR 종의 과다발현과, 그리고 또다른 기준과 비교하였을 때 소낭 표면 항원의 과소발현을 포함할 수 있다.
소낭의 양, 소낭의 구조, 또는 소낭의 임의의 다른 정보를 제공하는 특징들을 비교함으로써, 생체특징을 결정할 수 있다. 소낭 구조는 전송 전자 현미경, 예를 들면, Hansen et al., Journal of Biomechanics 31, Supplement 1: 134-134(1) (1998), 또는 주사 전자 현미경을 이용하여 평가할 수 있다. 하나 이상의 소낭을 분석하는 방법 및 기술들의 다양한 조합을 이용하여 피험자에 대한 표현형을 결정할 수 있다.
생체특징은 생물지표의 존부, 복사체의 수, 발현 수준, 또는 활성 수준을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 생체 특징의 다른 유용한 성분들은 돌연변이 (가령, 전사의 활성 또는 해독 산물에 영향을 주는 돌연변이, 가령, 치환, 결손, 또는 삽입 돌연변이)의 존재, 변이체, 또는 생물지표의 해독후 변형을 포함한다. 단백질 생물지표의 해독후 변형은 아실화, 아세틸화, 포스포릴화, 유비퀴틴화(ubiquitination), 탈아세틸화, 알킬화, 메틸화, 아미드화, 바이오티닐화, 감마-카르복실화, 글루타밀화, 글리코실화, 당화(glycyation), 하이드록시화, heme 모이어티의 공유적 부착, 요오드화, 이소프레닐화, 리포일화(lipoylation), 프레닐화(prenylation), GPI 앙커 형성, 미리스토일화, 파르네실화, 제가닐게라닐화(geranylgeranylation), 뉴클레오티드 또는 이의 유도체의 공유적 부착, ADP-리보실화, 플라빈 부착, 산화, 팔미토일화, 페길화, 포스파티딜이노시톨의 공유적 부착, 포스포판테이닐화(phosphopantetheinylation), 폴리시알화(polysialylation), 피로글루타메이트(pyroglutamate) 형성, 프로일 이소메라제에 의한 프롤린 라셈체화, 아미노산의 tRNA-중개 추가, 가령, 아르기닐화, 술페이트화, 티로신에 설페이트 기 추가, 또는 생물지표들의 세레노일화(selenoylation)를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
여기에서 설명된 방법들은 질환, 상태 또는 생리학적 상태와 연관된 생체 특징을 확인하는데 이용할 수 있다. 이 생체특징은 피험자가 암을 앓고 있는지, 또는 암이 발생할 위험에 처해있는지를 판단하는데 또한 이용할 수 있다. 암이 발생할 위험에 처해있는 피험자는 전조 단계 이전의 초기 단계 질환을 가진 또는 가질 경향이 있는 피험자를 포함할 수 있다.
생체특징은 자가면역 질환, 염증성 장 질환, 심혈관 질환, Alzheimer 질환, Parkinson 질환과 같은 신경계 장애, 다발성 경화증, 폐혈증 또는 췌장염 또는 2011년 4월 6일자로 제출된 국제 특허 출원 번호 PCT/US2011/031479, "Circulating Biomakers for Disease"(이들은 전문이 여기에 참고자료로 편입된다)의 도 3-58에 열거한 임의의 질환, 상태 또는 증상을 포함하나 이에 한정되지 않는 다른 질환에 대한 진단 또는 치료진단 결정을 제공하는데 유용할 것이다.
이 생체특징을 또한 이용하여 말초 혈액, 탯줄 혈액, 또는 양수 (가령 Downs 증후군에 특이적인 miRNA 특징)로부터 현재 임신 상태를 확인하거나 또는 불리한 임신 결과 가령, 임신중독증, 조산, 막의 조기 파열, 자궁내 성장 제한 또는 습관성 유산을 확인한다. 이 생체특징을 또한 이용하여 엄마의 건강, 모든 발달 단계에서의 태아, 착상전 배 또는 신생아의 건강을 알 수 있다.
생체특징을 전조 단계 이전의 진단에 이용할 수 있다. 더욱이, 이 생체특징을 이용하여 질환을 탐지하고, 질환 단계 또는 진전을 결정하고, 질환의 재발을 판단하고, 치료 프로토콜을 확인하고, 치료 프로토콜의 효과를 판단하고 또는 나이 및 환경적 노출과 관련된 개체의 생리학적 상태를 평가할 수 있다.
소낭의 생체특징의 모니터링을 또한 이용하여 공지의 독성 물질 또는 미확인 독성 물질에 초기 노출 상태를 포함한, 피험자의 독성 노출을 확인할 수 있다. 작용 기전에 대한 임의의 한 가지 특정 이론에 결부되지 않고, 소낭은 손상된 세포들로부터 발산될 수 있고, 그리고 프로세스에서 막 성분들 및 합입된 세포질 성분들 모두를 포함하는 세포의 특이적 성분들을 분류할 수 있다. 독성 물질/화학물에 노출된 세포는 독성 물질 또는 이의 대사산물들을 방출하기 위하여 소낭 발산을 증가시킬 수 있고, 따라서 소낭 수준이 증가된다. 따라서, 모니터링 소낭 수준, 소낭 생체특징, 또는 이들 모두를 모니터링하면, 잠재적 독성 물질에 대한 개체의 반응을 평가할 수 있다.
본 발명의 소낭 및/또는 다른 생물지표들을 이용하여, 하나 이상의 특이적 항원, 결합물질, 생물지표, 또는 이의 임의의 조합을 탐지함으로써 약물-유도된 독성 또는 장기 손상 상태를 확인할 수 있다. 소낭의 수준, 소낭의 생체특징의 변화, 또는 이 둘 모두를 이용하여 약물, 항생제, 산업 화학물질, 독성 항생제 대사산물들, 허브, 가정 화학물질, 자연 생성 또는 실재하는 합성된 기타 유기체에 의해 생성된 화학물질을 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 다수 독성 물질에 급성, 만성 또는 직업에 의한 노출에 대해 개체를 모니터할 수 있다. 추가로, 생체특징을 이용하여 미확인 기원의 암, 또는 미확인 원발성 (CUP) 암을 포함하는 이상 또는 질환을 확인할 수 있다.
소낭은 이종 소낭 집단을 출현시키기 위하여 이미 설명된 것과 같이, 생물학적 시료로부터 단리할 수 있다. 그 다음, 이 이종 소낭 집단은 주어진 기원 세포에 특이적인 소낭 집단의 항원 특이적 특징들을 배제하거나 또는 확인하기 위하여 기획된 특이적 결합 물질로 피복된 기질에 접촉시킬 수 있다. 더우기, 상기에서 설명한 것과 같이, 소낭의 생체특징은 세포의 암 상태와 관련있을 수 있다. 피험자에서 암을 억제하는 화합물들은 소낭의 생체특징을 변화시킬 수 있고, 이것은 시간을 두고, 그리고 치료 과정에서 연속적으로 소낭을 분리함으로써 모니터할 수 있다. 소낭의 수준 또는 특이적 생체특징을 사진 소낭의 수준 변화를 모니터할 수 있다.
한 측면에서, 대상의 표현형의 특징화는 이 대상이 치료법에 반응할지 또는 반응하지 않을 지를 결정하는 방법을 포함한다. 본 발명의 이 방법은 또한 이 대상이 치료법에 반응할지 또는 반응하지 않을 지를 예측하는데 유용한 새로운 생물특징들을 측정하는 것도 포함한다. 치료법에 반응하는 하나 또는 그 이상의 대상들(반응자)와 동일한 요법에 반응하지 않는 하나 또는 그 이상의 대상들(비-반응자)는 정보를 보낸 이들의 소낭을 보유할 수 있다. 관심 처치에 대하여 대상을 반응자 또는 비-반응자로 분류하는 소낭 생물특징들을 식별하기 위한 심문(Interrogation)이 실행될 수 있다. 일부 특면에서, 소낭의 존재, 양, 그리고 페이로드가 분석된다. 소낭의 페이로드는 예를 들면, 내부 단백질, 핵산 이를 테면 miRNA, 지질 또는 탄수화물을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 생물지표 발견 및 생체특징 발견과 관련된다. 한 구체예에서, 요법에 반응하는 한 사람이상의 피험자(반응자)와 동일한 요법에 반응하지 않는 한 사람 이상의 피험자(비-반응자)는 조사할 이들의 소낭을 보유할 수 있다. 여기에서 설명된 임의의 생물지표들을 포함하는 하나 이상의 생물지표들의 존재를 확인하도록 조사(Interrogation)를 실행한다. 한 측면에서, miR의 존재, 양 및 페이로드를 분석한다. miR의 페이로드는 예를 들면, 표면 또는 내부 단백질, 핵산, 지질 또는 탄수화물일 수 있다.
비-반응자가 아닌, 반응자에서 생체특징의 존재 또는 부재를 치료진단에 이용할 수 있다. 반응자의 시료를 다음중 하나 이상에 대해 분석할 수 있다: 소낭의 양, 소낭의 독특한 부분집합 또는 종들의 양, 이러한 소낭에서 생물지표들의 양, 이러한 소낭의 생체특징, 등. 한 경우에서, 반응자 및 비-반응자로부터 소낭 가령, 마이크로소낭 또는 엑소좀은 하나 이상의 miRNA, 가령, miRNA 122, miR-548c-5p, miR-362-3p, miR-422a, miR-597, miR-429, miR-200a, 및/또는 miR-200b의 존재 및/또는 양을 분석한다. 반응자 및 비-반응자에서 생체특징의 차이를 치료진단에 이용할 수 있다. 또다른 구체예에서, 질환 또는 상태를 가진 피험자로부터 소낭을 얻는다. 이러한 질환 또는 상태가 없는 피험자로부터 또한 소낭을 얻는다. 한 집단의 모든 피험자와 관련되지만, 다른 집단의 피험자와는 관련되지 않은 독특한 생체특징에 대해 이 두 집단의 피험자로부터 얻은 소낭을 분석한다. 이러한 생체특징 또는 생물지표들을 이용하여 상태 또는 질환의 존부에 대해 진단하거나 또는 집단들중 어느 집단에 이 피험자가 속하는지(질환, 공격적인/비-공격적인 질환의 유무, 반응자/비-반응자, 등)를 확인할 수 있다.
한 측면에서, 대상의 표현형은 질병의 단계를 결정하는 방법을 포함한다. 본 발명의 방법은 단계결정에 유용한 신규한 생물특징을 또한 포함한다. 설명을 위한 실시예에서, 단계 I의 암을 가진 환자와 동일한 암의 단계 II 또는 단계 III을 가진 환자로부터 소낭을 분석한다. 일부 구체예들에서, 전이 암을 가진 환자들에서 소낭이 분석된다. 각 집단 환자의 소낭에서 생체특징 또는 생물지표들의 차이를 확인하고(가령, 단계 III의 암으로부터 수득한 소낭은 하나 이상의 유전자 또는 miR의 발현이 증가되었을 수 있음), 이로 인하여 질환의 상이한 단계들을 구별짓는 생체특징 또는 생물지표를 확인할 수 있다. 그 다음 이러한 생체특징은 이 질환을 가진 환자의 단계를 결정하는데 이용할 수 있다.
일부 경우들에서, 생물특징은 상당한 시간에 걸쳐, 가령, 매일, 주2회, 주1회, 2주에 1회, 한달에 2회, 한달에 1회, 2달에 1회, 1.5개월에 1회, 3개월에 1회, 반년에 1회, 2년에 1회 또는 매년 피험자로부터 소낭을 분석하여 생체특징을 결정한다. 예를 들면, 요법에 대한 반응자 또는 비-반응자를 나타내는 특징들을 탐지하기 위하여 주어진 요법에 대해 환자들에 있는 생물특징들이 시간을 두고 감시될 수 있다. 유사하게, 상이한 질환 단계를 가진 환자들은 시간을 두고 심문되는 이들의 소낭을 보유한다. 각 시점에서 소낭의 페이로드 또는 물리적 속성을 비교할 수 있다. 따라서, 임시 패턴은 치료진단, 진단, 예후, 질환 특화, 치료 모니터링, 질환 모니터링 또는 반응자/비-반응자 상태의 예측하게 하는데 이용할 수 있는 생체특징을 형성할 수 있다. 오로지 설명을 위한 예로써, 시간이 경과함에 따라 소낭에서 생물지표 (가령, miR 122)의 양이 증가한다는 것은 전이성 암과 관련되며, 반대로 시간이 경과함에 따라 이 생물학적지표의 양이 정체된다는 것은 비-전이성 암과 관련된다. 시간 일정은 최소한 1 주, 2 주, 3 주, 4 주, 1 개월, 6 주, 8 주, 2 개월, 10 주, 12 주, 3 개월, 4 개월, 5 개월, 6 개월, 7 개월, 8 개월, 9 개월, 10 개월, 11 개월, 또는 12 개월, 1년, 18개월, 2년 또는 최소한 3년에 결쳐 지속될 수 있다.
소낭의 수준, 특이적 생체특징을 가진 소낭의 수준, 또는 소낭의 생체특징을 또한 이용하여 상태에 대한 요법의 효과를 평가할 수 있다. 예를 들면, 소낭의 수준, 특이적 생체특징을 가진 소낭의 수준, 또는 소낭의 생체특징을 이용하여 암 치료, 가령, 화학요법, 방사능요법, 외과술, 또는 피험자에서 암을 억제하는데 유용한 임의의 다른 치료상의 접근법의 효과를 평가할 수 있다. 추가로, 이 소낭의 생체특징에 조절 효과를 가지는 후보 또는 테스트 화합물들 또는 물질 (가령, 단백질들, 펩티드들, 펩티드모방체들, 펩토이드, 소 분자들 또는 다른 약물)를 확인하기 위하여 스크리닝 분석에서 생체특징을 이용할 수 있다. 이러한 스크리닝 분석을 이용하여 확인된 화합물들은 예를 들면, 이상 또는 질환들의 억제, 완화, 치료 또는 예방과 같은 조절에 유용할 수 있다.
예를 들면, 소낭의 생체특징은 특정 암에 대한 성공적인 치료를 받고 있는 환자로부터 얻을 수 있다. 동일 약물로 치료를 받지 않은 암 환자의 세포를 배양할 수 있고, 배양물로부터 생체특징을 결정하기 위하여 소낭을 수득할 수 있다. 세포들을 테스트 화합물들로 처리할 수 있고, 배양물로부터 얻은 소낭의 이 생체특징은 성공적인 치료를 받은 환자로부터 수득한 소낭의 생체특징과 비교할 수 있다. 성공적인 치료를 받은 환자의 것과 유사한 생체특징을 초래하는 테스트 화합물들을 앞으로의 연구에 선택할 수 있다.
이 소낭의 생체특징은 또한 임상 시도에서 생체특징에 대하여 물질 (가령, 약물 화합물들)의 영향을 모니터하는데 이용할 수 있다. 모니터링 소낭의 수준, 이 소낭의 생체특징에서 변화, 또는 이둘 모두를 가령, 암 세포들을 억제하는 테스트 화합물의 효과를 평가하는 방법에 이용할 수 있다.
질환, 상태 또는 증후군의 존재 또는 발생 위험의 진단 또는 확인에 추가로, 본 명세서에서 기술된 방법 및 조성물들은 이러한 질환, 상태 또는 증후군을 가진 대상의 처치를 최적화시키기 위한 시스템을 제공한다. 소낭의 수준, 이 소낭의 생체특징, 또는 이둘 모두는 특정 치료상의 중재의 효과 (약제학적 또는 비-약제학적)를 판단하는데 이용할 수 있고, 그리고 1) 불리한 결과를 발달시키는 위험을 감소시키기 위한 중재를 변경시키고, 2) 중재의 효과를 강화시키고 또는 3) 저항성 상태를 확인하는데 이용할 수 있다. 따라서, 추가로, 상태 또는 증후군의 존재 또는 발생 위험을 진단 또는 확인하기 위하여, 여기에서 설명된 방법들 그리고 조성물들은 또한 이러한 질환, 상태 또는 증후군을 보유한 피험자의 치료를 최적화시키는 시스템을 제공한다. 예를 들면, 소낭의 생체특징을 확인함으로써, 시험자의 실시간 치료를 개선시키기 위하여 진단 및 치료를 통합함으로써 질환, 상태 또는 증후군을 치료하는 요법-관련된 접근법을 결정할 수 있다.
소낭의 수준, 이 소낭의 생체특징, 또는 이둘 모두를 확인하는 테스트를 이용하여, 어떤 환자가 특정 요법에 가장 적합한지를 확인하고, 그리고 치료 섭생을 최적화시키기 위하여 약물이 어떻게 작용하는지에 대한 피이드백을 제공할 수 있다. 예를 들면, 임신-유도된 고혈압 및 연관된 상태에서, 요법-관련된 진단은 료를 최적화하기 위하여 시간을 두고 중요한 매개변수들(가령, 사이토킨 및/또는 성장 인자 수준)의 변화를 융통성있게 모니터할 수 있다.
FDA, MDA, EMA, USDA, 및 EMEA에서 정의한 바와 같이, 조사 물질의 임상 시험 환경내에서, 여기에서 설명된 생체특징에 의해 결정된 요법-관련된 진단은 임상시험 기획을 최적화하고, 효과를 모니터하고, 그리고 약물 안전성을 강화시키는 주요 정보를 제공할 수 있다. 예를 들면, 임상시험 기획을 위하여, 요법-관련된 진단은 환자 특화, 환자 적격성의 결정(포함/배제), 동종 치료 집단의 생성, 그리고 대등한 경우 대조군 무리에 최적화된 환자 시료의 선별에 이용할 수 있다. 이러한 요법-관련된 진단은 따라서 환자 효과 집대성에 대한 평균을 제공할 수 있고, 이로 인하여 임상시험 모집에 필요한 개체의 수를 최소화시킬 수 있다. 예를 들면, 효과의 경우, 요법-관련된 진단은 요법을 모니터링하고 그리고 효과 기준을 평가하는데 유용하다. 대안으로, 안전성의 경우, 요법-관련된 진단을 이용하여 부작용 약물 반응을 예방하거나 또는 투약 오류를 피하고, 그리고 치료 섭생에 대한 순응성(compliance)을 모니터할 수 있다.
일부 구체예들에서, 본 발명은 임상시험중인 치료에 대해 반응자 및 비-반응자를 확인하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 임상시험에 등록된 피험자에서 순환하는 생물지표들을 포함하는 생체특징을 탐지하고, 그리고 반응자 및 비-반응자를 구별짓는 생체특징을 확인하는 것을 포함한다. 추가 구체예에서, 이 생체특징은 약물 경험이 없는(naive) 피험자에서 측정하고, 그리고 이 피험자가 반응자 또는 비-반응자인지를 예측하는데 이용한다. 이러한 예측은 약물 경험이 없는 피험자의 생체특징이 반응자로 확인된 임상시험 피험자와 좀더 밀접하게 관련있는지에 근거를 둘 수 있고, 그리고 이로 인하여 약물 경험이 없는 피험자는 반응자가 될 것이다. 역으로, 약물 경험이 없는 피험자의 생체특징이 비-반응자로 확인된 임상시험 피험자와 좀더 밀접하게 관련있다면, 본 발명의 방법들은 이 약물 경험이 없는 피험자를 비-반응자로 예측할 수 있다. 따라서, 예측은 이 치료에 대해 잠재적 반응자 및 비-반응자로 계층화시키는데 이용할 수 있다. 일부 구체예들에서, 이 예측을 이용하여 치료 의사가 이 약물의 투여를 결정하는 것을 도움으로써 치료 과정을 지도한다. 일부 구체예들에서, 이 예측을 이용하여 앞으로의 추가 임상 시험의 등록을 위한 환자의 선별을 지도한다. 비-제한적인 실시예에서, 단계 II 임상시험에서 반응자/비-반응자 상태를 예측하는 생체특징을 이용하여 단계 III 임상시험을 위한 환자를 선택할 수 있고, 이로 인하여 단계 III의 환자 집단에서 반응 가능성을 증가시킨다. 당업자는 이 방법을 채택하여 반응자/비-반응자 상태 이외의 다른 기준으로 피험자를 계층 특화시킬 수 있는 생체특징을 확인할 수 있다는 것은 인지할 것이다. 한 구체예에서, 기준은 치료 안전성이다. 따라서 치료에 대해 부작용을 가질 것같은 또는 가지지 않을 것 같은 피험자를 확인하는데 상기와 같이 이 방법을 수행한다. 비-제한적인 실시예에서, 단계 II의 임상시험에서 안정성 프로파일을 예측하는 생체특징을 이용하여 단계 III의 임상시험을 위한 환자를 선택하고, 이로 인하여 단계 III 환자 집단에서 치료 안정성 프로파일을 증가시킬 수 있다.
따라서, 소낭의 수준, 이 소낭의 생체특징, 또는 이둘 모두를 이용하여, 약물 효과를 모니터하고, 주어진 약물에 대한 반응 또는 저항성을 결정하고, 또는 이둘 모두, 이로 인하여 약물 안전성을 강화시킬 수 있다. 예를 들면, 결장암에서, 소낭은 결장암 세포들로부터 전형적으로 방사되고, 그리고 말초 혈액으로부터 단리시키고, 그리고 이를 이용하여 하나 이상의 생물지표들 가령, KRAS mRNA를 단리하고, KRAS 돌연변이를 탐지하기 위하여 이를 서열화시킬 수 있다. mRNA 생물지표들의 경우, mRNA은 cDNA로 역전사시키고, 그리고 서열화시켜(가령, Sanger 서열화, 피로시퀀싱, NextGen 서열화, RT-PCR 분석) 약물 (가령, 세투시마브 또는 파니투미마브)에 저항성을 부여하는 돌연변이가 존재하는지를 판단한다. 또다른 실시예에서, 폐암 세포들로부터 특히 발산된 소낭을 생물학적 시료로부터 단리하고고, 그리고 폐암 생물지표, 가령, EGFR mRNA를 단리하는데 이용한다. EGFR mRNA는 cDNA로 프로세스되고, 그리고 서열화하여 특이적 약물에 대한 저항성 또는 반응을 보이는 또는 폐암 치료에 저항성 또는 반응을 보이는 EGFR 돌연변이의 존재를 결정한다.
하나 이상의 생체특징을 집단으로 묶어서, 특정 집단내 일련의 생체특징에 대하여 수득한 정보는 임상적으로 관련된 판단 가령, 진단, 예후, 또는 치료의 관리, 가령, 치료 선택의 관리를 포함하나 이에 한정되지 않는 결정을 위한 합리적인 근거를 제공할 수 있다.
대부분의 진단 지표들과 마찬가지로, 정확한 의학적 판단을 제공하는데 충분한 최소한 수의 피료를 이용하는 것이 흔히 바람직하다. 이것은 추가 분석까지 치료의 지체 뿐만 아니라 시간 및 재원의 부적절한 이용을 방지한다.
정성적 그리고 정량적 성질들, 가령, 소낭의 생체특징과 질환 상태, 질환 단계, 진전, 예후; 치료의 효과 또는 선별; 또는 생리학적 상태에 대한 임상적 결과의 관련짓기를 목적으로 시료(가령, 혈청 및 조직 생체은행)에서 소급(retrospective) 분석을 실행하는 방법들을 또한 설명한다. 더욱이, 여기에서 설명된 방법들과 조성물들은 정성적 그리고 정량적 소낭의 생체특징과 질환 상태, 질환 단계, 진전, 예후; 치료의 효과 또는 선별; 또는 생리학적 상태에 대한 임상 결과의 상관관계 짓기를 목적으로 시료(가령, 임상 시험에서 개체로부터 수거한 혈청 및/또는 조직 수거된)에서 가망(예상) 분석을 실행하는데 이용한다. 여기에서 이용된 것과 같이, 소낭의 생체특징을 이용하여 기원 세포 특이적 소낭을 확인할 수 있다. 더욱이, 소낭의 표면 지표 프로파일 또는 소낭의 내용물에 근거하여 생체특징을 판단할 수 있다.
본 발명에 따라 표현형을 특징화하는데 이용되는 생체특징은 다중 성분들 (가령, microRNA, 소낭 또는 다른 생물지표들) 또는 특징들 (가령, 소낭 크기 또는 형태)를 포함할 수 있다. 이 생체특징은 최소한 2가지, 3가지, 4가지, 5가지, 6가지, 7가지, 8가지, 9가지, 10가지, 11가지, 12가지, 13가지, 14가지, 15가지, 16가지, 17가지, 18가지, 19가지, 20가지, 25가지, 30가지, 40가지, 50가지, 75가지, 또는 100가지 성분들 또는 특징들을 포함할 수 있다. 하나 이상의 성분 또는 특징, 가령, 최소한 2가지, 3가지, 4가지, 5가지, 6가지, 7가지, 8가지, 9가지, 10가지, 11가지, 12가지, 13가지, 14가지, 15가지, 16가지, 17가지, 18가지, 19가지, 20가지, 25가지, 30가지, 40가지, 50가지, 75가지, 또는 100가지의 성분들을 가진 생체특징은 표현형의 특징화에 더 높은 감응성 및/또는 특이성을 제공할 수 있다. 일부 구체예들에서, 다수의 성분들 또는 특징들의 분석은 더 적은 성분들 또는 특징들의 평가와 비교하였을 때 증가된 감응성 및/또는 특이성을 제공한다. 다른 한편으로, 정확한 의학적 판단을 하는데 충분한 최소의 수의 성분들 또는 특징들을 이용하는 것이 흔히 바람직하다. 더 적은 지표들은 분류자의 통계학적 과도적용(overfitting)을 피하고, 추가 분석으로 치료의 지연을 예방하고, 뿐만 아니라 시간 및 재원의 부적절한 사용을 피할 수 있도록 한다. 따라서, 본 발명의 방법들은 최적의 수의 성분들 또는 특징들을 결정하는 것을 포함한다.
본 발명에 따른 생체특징을 이용하여 상기에서 설명한 것과 같이, 감응성, 특이성, 정확성, 또는 유사한 성과 계량을 가진 표현형을 특징화시킬 수 있다. 이 생체특징을 또한 이용하여 시료를 하나의 집단에 속하도록 가령, 질환을 가진 또는 질환을 가지지 않은 집단, 또는 공격적인 질환을 가진 또는 가지지 않는 집단, 또는 반응자 또는 비-반응자 집단으로 분류되도록 하는 분류자를 구축할 수 있다. 한 구체예에서, 분류자를 이용하여 피험자가 공격적인 또는 비-공격적인 암을 보유하는지를 판단한다. 설명을 위한 전립선암의 경우, 이 암을 지켜볼지, 가령, "주의깊게 관찰(예의주시)"을 처방할지 또는 전립선절제술을 시행할 지를 의사가 판단하는 것을 도울 수 있다. 또다른 구체예에서, 분류자를 이용하여 유방암 환자가 탐옥시펜에 반응을 하는지 또는 하지 않는지를 판단하고, 이로 인하여 의사가 탐옥시펜 또는 또다른 약물로 이환자를 치료할지 또는 치료하지 않을지를 판단하는 것을 돕는다.
생물지표들(Bio지표s)
표현형을 특징화하는데 이용되는 생체특징은 하나 이상의 생물지표들을 포함할 수 있다. 이 생물지표는 순환하는 지표, 막 연관된 지표, 또는 소낭 안에 또는 소낭의 표면에 존재하는 성분일 수 있다. 이들 생물지표들은 핵산 (가령 RNA (mRNA, miRNA, 등.) 또는 DNA), 단백질, 펩티드, 폴리펩티드, 항원, 지질, 탄수화물, 또는 프로테오글리칸을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
이 생체특징은 생체특징(2011년 4월 6일자로 제출된 국제 특허 출원 번호 PCT/US2011/031479, "Circulating Biomakers for Disease"(이들은 전문이 여기에 참고자료로 편입된다)의 도 1, 3-60에 열거된 임의의 하나 이상의 생물지표들)의 존재 또는 부재, 발현 수준, 돌연변이 상태, 유전적 변이체 상태, 또는 임의의 변형 (가령, 후생학적 변형, 해독후변형)을 포함할 수 있다. 생물지표의 발현 수준은 대조군 또는 기준과 비교하고, 시료내 생물지표들의 과다발현 또는 과소발현 (또는 상향조절 또는 하향조절)을 결정할 수 있다. 일부 구체예들에서, 대조군 또는 기준 수준은 동일한 생물지표, 가령, 상태 또는 질환을 보유하거나 나타내지 않은 피험자의 대조군 시료안의 miRNA의 양을 포함한다. 또다른 구체예에서, 대조군 또는 기준 수준은 가령, 질환이 있는 상태 대 질환이 없는 상태의 상이한 생물학적 환경에서 치료가 최저로 영향을 받는, 관리유지 지표의 수준을 포함한다. 또다른 구체예에서, 대조군 또는 기준 수준은 동일한 피험자에서 상이한 시간대에 취한 시료내 동일한 지표의 수준을 포함한다. 다른 유형의 대조군도 여기에서 설명한다.
핵산 생물지표들은 다양한 RNA 또는 DNA 종들을 포함한다. 예를 들면, 이 생물지표는 mRNA, microRNA (miRNA), 작은 조직(nucleolar) RNA (snoRNA), 작은 핵 RNA (snRNA), 리보좀성 RNA (rRNA), 이종 핵 RNA (hnRNA), 리보좀성 RNAS (rRNA), siRNA, 전이 RNA (tRNA), 또는 shRNA일 수 있다. DNA는 이중-스트랜드 DNA, 단일 스트랜드 DNA, 상보 DNA, 또는 넌코딩 DNA일 수 있다. miRNA는 길이가 평균 약 22개 뉴클레오티드인 짧은 리보핵산(RNA) 분자들이다. miRNA는 표적 메신져 RNA 전사체s (mRNA)의 3' UTRs(three prime untranslated 영역)에 있는 상보 서열에 결합하는 전사후 조절물질로 작용하고, 이는 유전자 침묵을 유도한다(유전자 침묵). 한 개의 miRNA은 1000개의 mRNA에 작용할 수 있다. miRNA는 음성(음성) 조절, 가령, 전사체 분해 및 격리, 해독 억제에서 다중 역할을 하고, 또한 양성(양성) 조절, 가령, 전사 및 해독 활성화에 역할을 할 수 있다. 유전자 조절에 영향을 줌으로써, miRNA는 많은 생물학적 프로세스에 영향을 줄 수 있다. 상이한 세포 유형 및 조직에서 상이한 발현된 miRNA 세트를 발견한다.
본 발명에 이용하기 위한 생물지표들은 펩티드들, 폴리펩티드들, 또는 단백질들을 더 포함하는데, 이들 용어들은 다른 언급이 없는 한, 서로 호환사용된다. 일부 구체예들에서, 단백질 생물지표는 이의 변형 상태, 절두, 돌연변이, 발현 수준 (가령, 기준 수준과 비교하여 과다발현 또는 과소발현), 및/또는 상기에서 설명된 것과 같은, 가령, 해독후 수정을 포함한다. 비-제한적인 실시예에서, 질환에 대한 생체특징은 특정 해독후 변형을 보유한 단백질을 포함할 수 있는데, 이 변형은 없는 것보다는 있는 경우 이 질환과 연관된 시료에서 더 우세한다.
생체특징은 다수의 동일한 유형의 생물지표들 (가령, 2가지 상이한 microRNA 또는 mRNA 종들) 또는 하나 이상의 상이한 유형의 생물지표들 (가령 mRNA, miRNA, 단백질들, 펩티드들, 리간드, 그리고 항원들)을 포함할 수 있다.
하나 이상의 생체특징은 2011년 4월 6일자로 제출된 국제 특허 출원 번호 PCT/US2011/031479, "Circulating Biomakers for Disease"(이들은 전문이 여기에 참고자료로 편입된다)의 도 1, 3-60에 열거된 것들로부터 선택된 최소한 하나의 생물지표를 포함할 수 있다. 특이적 기원 세포 생체특징은 하나 이상의 생물지표들을 포함할 수 있다. 국제 특허 출원 번호 PCT/US2011/031479의 도 3-58은 소낭으로부터 유도되고, 그리고 분석될 수 있는 다수의 질환 또는 상태 특이적 생물지표들을 열거한 표들이다. 이 생물학적지표는 CD24, 미드킨(midkine), 헵시딘, TMPRSS2-ERG, PCA-3, PSA, EGFR, EGFRvIII, BRAF 변이체, MET, cKit, PDGFR, Wnt, 베타-카테닌(catenin), K-ras, H-ras, N-ras, Raf, N-myc, c-myc, IGFR, PI3K, Akt, BRCA1, BRCA2, PTEN, VEGFR-2, VEGFR-1, Tie-2, TEM-1, CD276, HER-2, HER-3, 또는 HER-4일 수 있다. 이 생물지표는 또한 어넥신 V, CD63, Rab-5b, 또는 카베올린, 또는 miRNA, 가령, let-7a; miR-15b; miR-16; miR-19b; miR-21; miR-26a; miR-27a; miR-92; miR-93; miR-320 또는 miR-20일 수 있다. 이 생물지표는 또한 PCT 공개 WO2009/100029에 공개된 임의의 유전자 또는 이의 단편, 가령, 표 3-15에서 열거한 것들일 수도 있다.
또다른 구체예에서, 소낭은 이를 테면, PCT 공개 번호 WO2006054991에서 설명된 것과 같은 희귀 세포로부터 유도된 세포 단편 또는 세포의 찌꺼기를 포함한다. 하나 또는 그 이상 생물지표들, 이를 테면 CD 146, CD 105, CD31, CD 133, CD 106, 또는 이의 조합이 소낭에 대해 평가될 수 있다. 한 구체예에서, 하나 또는 그 이상 생물지표들에 대한 캡쳐 물질을 이용하여 소낭을 단리 또는 탐지한다. 일부 구체예들에서, 하나 또는 그 이상의 생물지표들 CD45, 사이토케라틴 (CK) 8, CK18, CK19, CK20, CEA, EGFR, GUC, EpCAM, VEGF, TS, Muc-1, 또는 이의 조합이 소낭에 대해 평가된다. 한 구체예에서, 종양-유도된 소낭은 CD45-, CK+이며, 핵산을 포함하는데, 이때 막 소낭은 CD45가 없거나, 또는 CD45의 낮은 발현 또는 탐지를 가지고, 사이토케라틴 (이를 테면 CK8, CK18, CK19, 또는 CK20)의 탐지가능한 발현, 그리고 핵산의 탐지가능한 발현을 가진다.
본 출원을 통하여 공개된 소낭 생물특징의 일부로 평가될 수 있는 임의의 수의 유용한 생물지표들은 CD9, EphA2, EGFR, B7H3, PSM, PCSA, CD63, STEAP, CD81, ICAM1, A33, DR3, CD66e, MFG-E8, TROP-2, Mammaglobin, Hepsin, NPGP/NPFF2, PSCA, 5T4, NGAL, EpCam, 뉴로키닌 수용체-1 (NK-1 또는 NK-1R), NK-2, Pai-1, CD45, CD10, HER2/ERBB2, AGTR1, NPY1R, MUC1, ESA, CD133, GPR30, BCA225, CD24, CA15.3 (분비된 MUC1), CA27.29 (분비된 MUC1), NMDAR1, NMDAR2, M나이A, CTAG1B, NY-ESO-1, SPB, SPC, NSE, PGP9.5, P2RX7, NDUFB7, NSE, GAL3, 오스테오폰틴, CHI3L1, IC3b, 메소텔린, SPA, AQP5, GPCR, hCEA-CAM, PTP IA-2, CABYR, TMEM211, ADAM28, UNC93A, MUC17, MUC2, IL10R-베타, BCMA, HVEM/TNFRSF14, Trappin-2 Elafin, ST2/IL1 R4, TNFRF14, CEACAM1, TPA1, LAMP, WF, WH1000, PECAM, BSA, TNFR, 또는 이의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
여기에서 설명된 방법들과 조성물들에서 평가에 유용한 다른 생물지표들은 미국 특허 제 6,329,179호 및 제7,625,573호; 미국 특허 공개번호 2002/106684, 2004/005596, 2005/0159378, 2005/0064470, 2006/116321, 2007/0161004, 2007/0077553, 2007/104738, 2007/0298118, 2007/0172900, 2008/0268429, 2010/0062450, 2007/0298118, 2009/0220944 그리고 2010/0196426; 미국 특허 출원 12/524,432, 12/524,398, 12/524,462; 캐나다 특허 CA 2453198; 그리고 국제 PCT 공개 번호 WO1994022018, WO2001036601, WO2003063690, WO2003044166, WO2003076603, WO2005121369, WO2005118806, WO/2005/078124, WO2007126386, WO2007088537, WO2007103572, WO2009019215, WO2009021322, WO2009036236, WO2009100029, WO2009015357, WO2009155505, WO 2010/065968 및 WO 2010/070276에서 설명된 상태 또는 생리학적 상태와 관련된 것들을 포함하며; 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 통합된다. 이들 특허 및 출원에서 공개된 소낭 생물지표들 및 microRNA을 포함하는 생물지표들은 가령, 암 또는 다른 질환의 진단, 예후 또는 치료진단을 제공하는 것과 같이, 표현형을 특징화하기 위한 특징의 일부로 평가될 것이다. 더욱이, 설명된 방법들 및 기술들을 이용하여 소낭 생물지표들 및 microRNA을 포함하는 생물지표들을 평가할 수 있다.
여기에서 설명된 방법 및 조성물들에서 평가를 위한 또다른 집단의 생물지표들은 미국 특허 제6,692,916호, 제6,960,439호, 제6,964,850호, 제7,074,586호; 미국 특허 출원 번호 11/159,376, 11/804,175, 12/594,128, 12/514,686, 12/514,775, 12/594,675, 12/594,911, 12/594,679, 12/741,787, 12/312,390; 그리고 국제 PCT 출원 번호 PCT/US2009/049935, PCT/US2009/063138, PCT/US2010/000037에서 공개된 암 진단, 예후 및 치료 진단과 연관된 것들을 포함한다; 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 통합된다. 유용한 생물지표들은 염증 질환의 경우에 있어서 미국 특허 출원 번호 10/703,143 및 US 10/701,391에서 설명된 것들; 류마티스 관절염의 경우 미국 특허 출원 번호 11/529,010에서 설명된 것들; 다발성 경화증의 경우 미국 특허 출원 번호 11/454,553 및 11/827,892; 이식 거부의 경우 미국 특허 출원 번호 11/897,160에서 설명된 것들; 낭창의 경우 미국 특허 출원 번호 12/524,677에서 설명된 것들; 골관절염의 경우 PCT/US2009/048684에서 설명된 것들; 감염 질환 및 폐혈증의 경우 미국 특허 출원 번호 10/742,458에서 설명된 것들, 그리고 폐혈증의 경우 미국 특허 출원 번호 12/520,675에서 설명된 것들을 더 포함한다; 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 통합된다. mRNA를 포함하는 이들 특허 및 출원에서 공개된 생물지표들은 표현형을 특징화하기 위한, 가령, 암 또는 다른 질환의 진단, 예후 또는 치료진단을 제공하기 위한 특징의 일부분으로 평가된다. 더욱이, 설명된 방법들 및 기술들을 이용하여 소낭 생물지표들 및 microRNA을 포함하는 생물지표들을 평가할 수 있다.
여기에서 설명된 방법 및 조성물들에서 평가에 유용한 다른 생물지표들은 Wieczorek et al., Isolation and 특징화 of an RNA-proteo지질 복합체 연합된 with the malignant state in humans, Proc Natl Acad Sci U S A. 1985 May;82(10):3455-9; Wieczorek et al., 진단적 and 예후적 value of RNA-proteo지질 in sera of patients with malignant disorders following therapy: first clinical evaluation of a 신규한 tumor 지표, Cancer Res. 1987 Dec 1;47(23):6407-12; Escola et al. Selective enrichment of tetraspan proteins on the internal vesciles of multivesicular endosomes and on 엑소좀 분비된 by human B-림프구s. J. Biol. Chem. (1998) 273:20121-27; Pileri et al. Binding of hepatitis C virus to CD81 Science, (1998) 282:938-41); Kopreski et al. Detection of Tumor Messenger RNA in the 혈청 of patients with Malignant 흑색종, Clin. Cancer Res. (1999) 5:1961-1965; Carr et al. Circulating Membrance vesciles in Leukemic 혈액, Cancer Research, (1985) 45:5944-51; Weichert et al. 세포질의 CD24 발현 in colorectal cancer in의존적ly correlates with shortenened patient survival. Clinical Cancer Research, 2005, 11:6574-81); Iorio et al. MicroRNA gene 발현 deregulation in human breast cancer. Cancer Res (2005) 65:7065-70; Taylor et al. Tumour-derived 엑소좀 and their role in Cancer-연합된 T-세포 signaling defects British J Cancer (2005) 92:305-11; Valadi et al. Exosome-중재된de간y of mRNA and microRNA is a 신규한 mechanism of genetic exchange between cells Nature Cell Biol (2007) 9:654-59; Taylor et al. Pregancy-연합된 엑소좀 and their control of T cell signaling J Immunol (2006) 176:1534-42; Koga et al. 정제, 특징화 and 생물학적 significance of tumor-derived 엑소좀 Anticancer Res (2005) 25:3703-08; Seligson et al. 상피 cell adhesion molecule (KSA) 발현: pathobiology and its role as an in의존적 predictor of survival in renal cell carcinoma Clin Cancer Res (2004) 10:2659-69; Clayton et al. (항원-presenting cell 엑소좀 are protected from complement-중재된lysis by 발현 of CD55 and CD59. Eur J Immunol (2003) 33:522-31); Simak et al. 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Tumour-derived microvesciles carry several surface determinants and mRNA of tumour cells and transfer some of these determinants to monocells Cencer ImmunolImmunother (2006) 55:808-18; Skog et al. 교아종 microvesciles De간y RNA and Proteins that promote tumour 성장 and provide 진단적 bio지표s Nature Cell Biol (2008) 10:1470-76; El-Hefnawy et al. 특징화 of amplifiable, circulating RNA in 혈청 and its potential as a tool for cancer 진단적s Clin Chem (2004) 50:564-573; Pisitkun et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 2004; 101:13368-13373; Mitchell et al., Can urinary 엑소좀 act as 치료 response 지표s in 전립선 cancer?, Journal of Translational Medicine 2009, 7:4; Clayton et al., Human Tumor-Derived 엑소좀 seletively Impair 림프구 Responses to Interlukin-2, Cancer Res 2007; 67: (15). August 1, 2007; Rabesandratana et al. Decay-accelerating 인자 (CD55) and membrance 억제제 of reactive lysis (CD59) are released within 엑소좀 during In vitro maturation of reticulocytes. 혈액 91:2573-2580 (1998); Lamparski et al. 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Clin Cancer Res 11:2492-2501 (2005); Kristiansen et al., CD24 is an in의존적 예후적 지표 of survival in nonsmall cell lung cancer patients, Brit J Cancer 88:231- 236 (2003); Lim and Oh, The Role of CD24 in 다양한 Human 상피 Neoplasias, Pathol Res Pract 201:479-86 (2005); Matutes et al., The Immuno표현형 of Splenic Lymphoma with Villous 림프구s and its Relevance to the Differential Diagnosis With Other B-세포 disorders, 혈액 83:1558-1562 (1994); Pirruccello and Lang, Differential 발현 of CD24-관련된 Epitopes in Mycosis Fungoides/Sezary Syndrome: A Potential Marker for Circulating Sezary Cells, 혈액 76:2343-2347 (1990). 이들 문헌에서 설명된 소낭 생물지표들 및 microRNA을 포함하는 생물지표들은 표현형을 특징화하기 위한, 가령, 암 또는 다른 질환의 진단, 예후 또는 치료진단을 제공하기 위한 특징의 일부분으로 평가된다. 더욱이, 설명된 방법들 및 기술들을 이용하여 소낭 생물지표들 및 microRNA을 포함하는 생물지표들을 평가할 수 있다.
여기에서 설명된 방법 및 조성물들에서 평가에 유용한 다른 생물지표들은 Rajendran et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2006;103:11172-11177, Taylor et al., Gynecol Oncol 2008;110:13-21, Zhou et al., Kidney Int 2008;74:613-621, Buning et al., Immunology 2008, Prado et al. J Immunol 2008;181:1519-1525, Vella et al. (2008) Vet Immunol Immunopathol 124(3-4): 385-93, Gould et al. (2003). Proc Natl Acad Sci U S A 100(19): 10592-7, Fang et al. (2007). PLoS Biol 5(6): e158, Chen, B. J. and R. A. Lamb (2008). Virology 372(2): 221-32, Bhatnagar, S. and J. S. Schorey (2007). J Biol Chem 282(35): 25779-89, Bhatnagar et al. (2007) 혈액 110(9): 3234-44, Yuyama, et al. (2008). J 신경chem 105(1): 217-24, Gomes et al. (2007). 신경sci Lett 428(1): 43-6, Nagahama et al. (2003). Autoimmunity 36(3): 125-31, Taylor, D. D., S. Akyol, et al. (2006). J Immunol 176(3): 1534-42, Peche, et al. (2006). Am J Transplant 6(7): 1541-50, Iero, M., M. Valenti, et al. (2008). Cell Death and Differenatiation 15: 80-88, Gesierich, S., I. Berezoversukiy, et al. (2006), 암 Res 66(14): 7083-94, Clayton, A., A. Turkes, et al. (2004). Faseb J 18(9): 977-9, Skriner., K. Adolph, et al. (2006). Arthritis Rheum 54(12): 3809-14, Brouwer, R., G. J. Pruijn, et al. (2001). Arthritis Res 3(2): 102-6, Kim, S. H., N. Bianco, et al. (2006). Mol Ther 13(2): 289-300, Evans, C. H., S. C. Ghivizzani, et al. (2000). Clin Orthop Relat Res (379 Suppl): S300-7, Zhang, H. G., C. Liu, et al. (2006). J Immunol 176(12): 7385-93, Van Niel, G., J. Mallegol, et al. (2004). Gut 52: 1690-1697, Fiasse, R. and O. Dewit (2007). Expert Opinion on Therapeutic Patents 17(12): 1423-1441(19).에서 공개된 것들을 포함한다. 이들 문헌에서 설명된 소낭 생물지표들 및 microRNA을 포함하는 생물지표들은 표현형을 특징화하기 위한, 가령, 암 또는 다른 질환의 진단, 예후 또는 치료진단을 제공하기 위한 특징의 일부분으로 평가된다. 더욱이, 설명된 방법들 및 기술들을 이용하여 소낭 생물지표들 및 microRNA을 포함하는 생물지표들을 평가할 수 있다.
또다른 측면에서, 본 발명은 대상의 시료 안에 다음으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상 순환하는 생물지표들의 수준을 탐지하는 것을 포함하는 암을 평가하는 방법을 제공한다: CD9, HSP70, Gal3, MIS, EGFR, ER, ICB3, CD63, B7H4, MUC1, DLL4, CD81, ERB3, VEGF, BCA225, BRCA, CA125, CD174, CD24, ERB2, NGAL, GPR30, CYFRA21, CD31, cMET, MUC2 또는 ERB4. CD9, HSP70, Gal3, MIS, EGFR, ER, ICB3, CD63, B7H4, MUC1, DLL4, CD81, ERB3, VEGF, BCA225, BRCA, BCA200, CA125, CD174, CD24, ERB2, NGAL, GPR30, CYFRA21, CD31, cMET, MUC2 또는 ERB4. 또다른 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 순환하는 생물지표들은 CD9, EphA2, EGFR, B7H3, PSMA, PCSA, CD63, STEAP, STEAP, CD81, B7H3, STEAP1, ICAM1 (CD54), PSMA, A33, DR3, CD66e, MFG-8e, EphA2, Hepsin, TMEM211, EphA2, TROP-2, EGFR, Mammoglobin, Hepsin, NPGP/NPFF2, PSCA, 5T4, NGAL, NK-2, EpCam, NGAL, NK-1R, PSMA, 5T4, PAI-1, 그리고 CD45로 구성된 군으로부터 선택된다. 여전히 또다른 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 순환하는 생물지표들은 CD9, MIS Rii, ER, CD63, MUC1, HER3, STAT3, VEGFA, BCA, CA125, CD24, EPCAM, 그리고 ERB B4로 구성된 군으로부터 선택된다. 임의의 수 가령, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 유용한 생물지표들이 이들 집단으로부터 평가될 수 있다. 일부 구체예들에서, 하나 또는 그 이상의 생물지표들은 하나 또는 그 이상의 Gal3, BCA200, OPN 그리고 NCAM, 가령, Gal3 그리고 BCA200, OPN 그리고 NCAM, 또는 이들 4가지 모두이다. 암의 평가는 암의 진단, 예후 또는 치료진단을 포함할 수 있다. 이 암은 유방암일 수 있다. 이들 지표는 소낭 또는 소낭 집단과 연합될 수 있다. 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 순환하는 생물지표는 소낭 표면 항원 또는 소낭 페이로드일 수 있다. 소낭 표면 항원들은 캡쳐 항원들, 탐지 항원들, 또는 이 둘 모두로 더 이용될 수 있다.
본 발명은 대상의 시료 안에 다음에서 선택된 하나 또는 그 이상 순환하는 생물지표들의 수준을 탐지하는 것을 포함하는 처치요법적 물질에 대한 예상된 반응의 방법을 더 제공한다: CD9, HSP70, Gal3, MIS, EGFR, ER, ICB3, CD63, B7H4, MUC1, DLL4, CD81, ERB3, VEGF, BCA225, BRCA, CA125, CD174, CD24, ERB2, NGAL, GPR30, CYFRA21, CD31, cMET, MUC2 또는 ERB4. 생물지표들은 CD9, EphA2, EGFR, B7H3, PSMA, PCSA, CD63, STEAP, STEAP, CD81, B7H3, STEAP1, ICAM1 (CD54), PSMA, A33, DR3, CD66e, MFG-8e, EphA2, Hepsin, TMEM211, EphA2, TROP-2, EGFR, Mammoglobin, Hepsin, NPGP/NPFF2, PSCA, 5T4, NGAL, NK-2, EpCam, NGAL, NK-1R, PSMA, 5T4, PAI-1, 그리고 CD45로 구성된 군으로부터 선택된다. 여전히 또다른 구체예에서, 하나 또는 그 이상 순환하는 생물지표들은 CD9, MIS Rii, ER, CD63, MUC1, HER3, STAT3, VEGFA, BCA, CA125, CD24, EPCAM, 그리고 ERB B4로 구성된 군으로부터 선택된다. 임의의 수 가령, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 유용한 생물지표들이 이들 집단으로부터 평가될 수 있다. 일부 구체예들에서, 하나 또는 그 이상의 생물지표들은 하나 또는 그 이상의 Gal3, BCA200, OPN 그리고 NCAM, 가령, Gal3 그리고 BCA200, OPN 그리고 NCAM, 또는 이들 4가지 모두이다. 처치요법적 물질은 암을 치료하기 위한 처치요법적 물질일 수 있다. 이 암은 유방암일 수 있다. 이들 지표는 소낭 또는 소낭 집단과 연합될 수 있다. 예를 들면, 하나 또는 그 이상 순환하는 생물지표는 소낭 표면 항원 또는 소낭 페이로드일 수 있다. 소낭 표면 항원들은 캡쳐 항원들, 탐지 항원들, 또는 이 둘 모두로 더 이용될 수 있다.
다양한 방법 또는 플랫포옴을 이용하여 본 명세서에서 확인된 생물지표들을 평가 또는 탐지할 수 있다. 이러한 방법 또는 플랫포옴의 예는 항체 어래이, 마이크로비드, 또는 본 명세서에서 공개된 또는 당업계 공지된 기타 방법을 이용하여 탐지될 수 있다. 예를 들면, 하나 또는 그 이상 생물지표들에 대한 캡쳐 항체 또는 압타머는 어래이 또는 비드에 결합될 수 있다. 그 다음 캡쳐된 소낭은 탐지가능한 물질을 이용하여 탐지될 수 있다. 일부 구체예들에서, 캡쳐된 소낭은 소낭의 전반적인 집단을 탐지하는 일반적인 소낭 생물지표들, 이를 테면 테트라스파닌 또는 MFG-E8을 인지하는 물질, 가령, 항체 또는 압타머를 이용하여 탐지된다. 다른 구체예들에서, 캡쳐된 소낭은 소낭 기원, 가령, 조직 또는 장기의 유형에 특이적 지표들을 이용하여 탐지된다. 일부 구체예들에서, 캡쳐된 소낭은 내피 기원의 세포 또는 소낭에 대한 지표인, CD31을 이용하여 탐지된다. 원하는 바와 같이, 캡쳐에 이용되는 생물지표들이 탐지에 또한 이용될 수 있으며, 이역도 가능하다.
본 발명의 방법을 이용하여 다양한 질환들 또는 상태를 평가할 수 있는데, 이때, 생물지표들은 다양한 이러한 다양한 질환들 또는 상태에 대응한다. 예를 들면, 본 발명의 방법의 방법을 본 명세서에서 기술된 암과 같은 하나 또는 그 이상의 암을 평가하는데 적용하는데, 이때 이 방법은 대상의 시료 안에서 5T4 (영양막), ADAM10, 나이R/R나이, APC, APP (β-아밀로이드), ASPH (A-10), B7H3 (CD276), BACE1, BAI3, BRCA1, BDNF, BIRC2, C1GALT1, CA125 (MUC16), Calmodulin 1, CCL2 (MCP-1), CD9, CD10, CD127 (IL7R), CD174, CD24, CD44, CD63, CD81, CEA, CRMP-2, CXCR3, CXCR4, CXCR6, CYFRA 21, derlin 1, DLL4, DPP6, E-CAD, EpCaM, EphA2 (H-77), ER(1) ESR1 α, ER(2) ESR2 β, Erb B4, Erbb2, erb3 (Erb-B3), PA2G4, FRT (FLT1), Gal3, GPR30 (G-coupled ER1), HAP1, HER3, HSP-27, HSP70, IC3b, IL8, insig, 졍션 플라코글로빈, 케라틴 15, KRAS, Mammaglobin, MART1, MCT2, MFGE8, MMP9, MRP8, Muc1, MUC17, MUC2, NCAM, NG2 (CSPG4), Ngal, NHE-3, NT5E (CD73), ODC1, OPG, OPN, p53, PARK7, PCSA, PGP9.5 (PARK5), PR(B), PSA, PSMA, R나이, STXBP4, Survivin, TFF3 (분비된), TIMP1, TIMP2, TMEM211, TRAF4 (스캐폴딩), TRAIL-R2 (사멸 수용체 5), TrkB, Tsg 101, UNC93a, VEGF A, VEGFR2, YB-1, VEGFR1, GCDPF-15 (PIP), BigH3 (TGFb1-유도된 단백질), 5HT2B (세로토닌 수용체 2B), BRCA2, BACE 1, CDH1-캐드헤린으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 순환하는 생물지표를 탐지하는 것을 포함한다. 이들 방법은 명시된 표적 생물지표의 단백질, RNA 또는 DNA를 탐지하는 것을 포함할 수 있다. 하나 또는 그 이상의 지표는 생물학적 유체, 이를 테면, 본 명세서에서 기술된 유체로부터 직접 평가되거나, 또는 소낭과 연합된 것, 가령, 소낭 표면 항원 또는 소낭 페이로드 (가령, 가용성 단백질, mRNA 또는 DNA)에 대해 평가될 수 있다. 본 발명의 방법 및 조성물을 이용하여 결정된 특정 생물특징은 임의의 수의 유용한 생물지표들, 가령, 생물특징은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 상이한 생물지표들 (또는 일부 경우에서 이러한 단백질 그리고 핵산과 같은 동일한 생물지표의 상이한 분자들)을 포함할 수 있다. 소낭 표면 항원들은 또한 본 명세서에서 기술된 것과 같이, 또는 참조로 편입된 출원에서와 같이, 캡쳐 항원, 탐지물질 항원, 또는 이 둘 모두로 이용될 수 있다.
본 발명의 방법 및 조성물은 암의 상이한 정보 측면을 확인하는 것을 포함하는 암의 다양한 측면을 평가하는데 적용되는데, 가령, 전이, 혈관생성을 나타내는 생물특징을 확인, 또는 동일한 종양 또는 종양 계통의 상이한 단계들, 분류 또는 하위분류를 확인하는데 적용된다.
더욱이, 본 발명의 방법은 질환 또는 상태가 대상에서 면역조절에 영향을 주는지를 결정하는 것을 포함한다. 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 순환하는 생물지표의 수준, 전이에 대한 하나 또는 그 이상의 순환하는 생물지표, 그리고 신생혈관생성에 대한 하나 또는 그 이상 순환하는 생물지표를 탐지하고; 그리고 참조와 이 수준을 비교하고, 이로써 암을 평가하는 것을 포함하는 암 평가 방법을 또한 제공한다. 면역조정에 대한 하나 또는 그 이상 순환하는 생물지표는 하나 또는 그 이상의 CD45, FasL, CTLA4, CD80 그리고 CD83일 수 있다. 전이에 대한 하나 또는 그 이상 순환하는 생물지표는 하나 또는 그 이상의 Muc1, CD147, TIMP1, TIMP2, MMP7, 그리고 MMP9일 수 있다. 신생혈관생성에 대한 하나 또는 그 이상 순환하는 생물지표는 하나 또는 그 이상의 HIF2a, Tie2, Ang1, DLL4 그리고 VEGFR2일 수 있다. 임의의 수 가령, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 유용한 생물지표들이 이들 집단으로부터 평가될 수 있다. 이 암은 유방암일 수 있다. 이 지표들은 소낭 또는 소낭 집단과 연합될 수 있다. 예를 들면, 하나 또는 그 이상 순환하는 생물지표는 소낭 표면 항원 또는 소낭 페이로드일 수 있다. 소낭 표면 항원들은 캡쳐 항원들, 탐지 항원들, 또는 이 둘 모두로 더 이용될 수 있다.
생물특징은 DLL4 또는 cMET를 포함한다. 델타-유사 4 (DLL4)는 Notch-리간드이며, 신생혈관생성 동안 상향-조절된다. cMET (c-Met, MET, 또는 MNNG HOS 형질변환 유전자로도 칭함)는 막 수용체 티로신 키나제를 인코드하는 프로토-온코겐(프로토-온코겐)으로, 이의 리간드는 간세포 성장 인자 (HGF)이다. MET 단백질은 때로는 간세포 성장 인자 수용체 (HGFR)로 불린다. MET는 상피 세포들에서 정상적으로 발현되며, 그리고 부적절한 활성화는 종양 성장, 신생혈관생성 그리고 전이를 촉발시킬 수 있다. DLL4 그리고 cMET를 생물지표들로 이용하여 소낭 집단을 탐지할 수 있다.
소낭으로부터 유도되고 분석될 수 있는 생물지표들은 miRNA (miR), miRNA*넌센스 (miR*), 그리고 다른 RNA ( mRNA, preRNA, priRNA, hnRNA, snRNA, siRNA, shRNA를 포함하나 이에 한정되지 않는)이다. miRNA 생물지표는 이의 miRNA 및 microRNA*넌센스 뿐만 아니라 이의 전구물질 분자들: pri-microRNA (pri-miR) 그리고 pre-microRNA (pre-miR)을 포함할 수 있다. miRNA의 서열은 공적으로 이용가능한 데이터베이스 가령, http://www.mirbase.org/, http://www.microrna.org/, 또는 이용가능한 임의의 다른 것으로부터 얻을 수 있다. 다른 언급이 없는 한, miR, miRNA 및 microRNA는 명시적 표시가 없는 한, 호환 사용된다. 일부 구체예들에서, 본 발명의 방법은 소낭을 단리하고, 단리된 소낭 안에 miRNA 페이로드를 평가하는 것을 포함한다. 이 생물지표는 또한 핵산 분자 (가령 DNA), 단백질, 또는 펩티드일 수 있다. 이 생물지표들에 대한 존재 또는 부재, 발현 수준, 돌연변이 (예를 들면 유전적 돌연변이, 가령, 결손, 전좌, 복제, 뉴클레오티드 또는 아미노산 치환, 그리고 이와 유사한 것들)를 판단할 수 있다. 생물지표의 임의의 후생적 조절 또는 복사체 수의 변이 또한 분석할 수 있다.
분석될 하나 이상의 생물지표들은 특정 조직 또는 기원 세포, 질환, 또는 생리학적 상태의 지표일 것이다. 더욱이, 여기에서 설명된 하나 이상의 이 생물지표들의 존재, 부재 또는 발현 수준은 질환, 상태, 예후 또는 약물 효과를 포함하는 피험자의 표현형에 관련될 것이다. 하기에서 나타낸 것과 같은 특이적 생물지표 및 생체특징은 질환, 상태 비교, 상태, 및/또는 생리학적 상태에 대한 비-포괄절 예로 구성된다. 더욱이, 표현형을 위하여 평가하는 하나 이상의 생물지표는 기원 세포 특이적 소낭일 것이다.
표현형을 특징화하는데 이용하는 하나 이상의 miRNA는 PCT Publication No. WO2009/036236에 공개된 것들로부터 선택할 수 있다. 예를 들면, 표 I-VI (도 6-11)에서 열거하는 하나 이상의 miRNA를 이용하여 하기에서 추가 설명되는 것과 같이, 결장 선종, 직장결장암, 전립선암, 폐암, 유방암, b-세포 임파종, 췌장암, 미만성 거대 BCL 암, CLL, 방광암, 신장 암, 저산소증-종양, 자궁 양성 평활근 종양(leiomyomas), 난소암, C형 간염 바이러스-연관된 간세포 암종, ALL, Alzheimer 질환, 골섬유증, 골섬유증, 진성적혈구 증가, 혈소판혈증, HIV, 또는 HIV-I 잠복을 특징화할 수 있다.
하나 이상의 miRNA는 소낭에서 탐지할 수 있다. 하나 이상의 miRNA는 miR-223, miR-484, miR-191, miR-146a, miR-016, miR-026a, miR-222, miR-024, miR-126, 및 miR-32일 것이다. 하나 이상의 miRNA는 PBMC에서 또한 탐지할 수 있다. 하나 이상의 miRNA는 miR-223, miR-150, miR-146b, miR-016, miR-484, miR-146a, miR-191, miR-026a, miR-019b, 또는 miR-020a일 것이다. 하나 이상의 miRNA는 특정 질환 또는 상태을 특징화하는데 이용할 수 있다. 예를 들면, 방광암 질환의 경우, 하나 이상의 miRNA, 가령, miR-223, miR-26b, miR-221, miR-103-1, miR-185, miR-23b, miR-203, miR-17-5p, miR-23a, miR-205 또는 이의 임의의 조합을 탐지할 수 있다. 하나 이상의 miRNA는 상향조절되거나 또는 과다발현될 수 있다.
일부 구체예들에서, 하나 이상의 miRNA를 이용하여 저산소증-종양을 특징화한다. 하나 이상의 miRNA는 miR-23, miR-24, miR-26, miR-27, miR-103, miR-107, miR-181, miR-210, 또는 miR-213일 수 있고, 그리고 상향조절된다. 하나 이상의 miRNA을 또한 이용하여 자궁 양성 평활근 종양(leiomyomas)을 특징화할 수 있다. 예를 들면, 자궁 평활근 종양을 특징화하는데 이용하는 하나 이상의 miRNA는 let-7 패밀리 구성요소, miR-21, miR-23b, miR-29b, 또는 miR-197일 수 있다. miRNA는 상향조절될 수 있다.
골섬유증은 상향조절된 하나 이상의 miRNA, 가령, miR-190에 의해 특징화되거나, 하향조절되는 miR-31, miR-150 및 miR-95에 의해 특징화되거나 또는 이의 임의의 조합에 의해 특징화될 수 있다. 더욱이, 골섬유증, 진성적혈구 증가 또는 혈소판혈증은 가령, miR-34a, miR-342, miR-326, miR-105, miR-149, miR-147, 또는 이의 임의의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는 하나 이상의 miRNA를 탐지함으로써 특징화할 수 있다. 하나 이상의 miRNA는 하향조절될 수 있다.
하나 이상의 생물지표들에 대하여 소낭을 평가함으로써 특징화할 수 있는 다른 표현형의 예는 여기에서 더 설명한다.
하나 이상의 생물지표들은 프로브를 이용하여 탐지할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오티드, 가령, DNA 또는 RNA, 압타머, 단클론 항체, 다클론 항체, Fabs, Fab', 단일 쇄 항체, 합성 항체, 펩토이드, zDNA, 펩티드 핵산 (PNA), 잠김 핵산 (LNA), 렉틴, 합성 또는 자연 생성 화학적 화합물 (약물 또는 라벨링 시약을 포함하나 이에 한정되지 않는), 덴드라이머, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 프로브는 예를 들면, 직접적으로 라벨되어 직접적으로 탐지할 수 있거나, 또는 가령, 라벨링 시약을 통하여 간접적으로 탐지할 수 있다. 프로브는 선택적으로 생물지표를 인지할 수 있다. 예를 들면, 올리고뉴클레오티드인 프로브는 선택적으로 miRNA 생물지표에 혼성화될 수 있다.
여러 측면들에서, 본 발명은 피험자에서 진단, 치료진단, 예후, 질환 특화, 질환 단계확인, 치료 모니터링 또는 질환 또는 장애의 반응자/비-반응자 상태의 예측을 위한 것이다. 본 발명은 피험자로부터 소낭을 평가하는 것을 포함하는데, 이 소낭에 있는 생물지표들의 평가 및/또는 이 소낭 안에 있는 페이로드, 가령, 단백질, 핵산 또는 다른 생물학적 분자들의 평가를 포함한다. 소낭을 이용하여 평가할 수 있고, 질환 또는 장애와 관련된 임의의 적합한 생물지표를 이용하여 본 발명의 방법들을 실행할 수 있다. 더욱이, 여기에서 설명된 것과 같이, 소낭을 평가하는 임의의 적합한 기술을 이용할 수 있다. 본 발명의 방법들에 따라 평가할 수 있는 특이적 질환에 대한 예시적인 생물지표들은 2011년 4월 6일자로 제출된 국제 특허 출원 번호 PCT/US2011/031479, "Circulating Biomakers for Disease"(이들은 전문이 여기에 참고자료로 편입된다)에서 설명된 생물지표들을 포함한다.
본 명세서에서 기술된 생물지표들 또는 특이적 생물지표들은 생물특징을 확인 또는 후보 생물특징을 확인할 수 있다. 예시적인 생물지표들은 표 5에 있는 것들을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이 표 안에 지표들은 본 명세서에서 기술된 것과 같이 표현형들을 특징화하기 위한 소낭의 캡쳐 및/또는 탐지에 이용될 수 있다. 일부 경우들에서, 다발성 캡쳐 및/또는 탐지는 특징을 강화하는데 이용된다. 이 지표들은 자유롭게 순환되는 또는 다른 생물학적 분자와의 복합체 형태의 단백질 또는 mRNA로 탐지될 수 있다. 이 지표들은 소낭 표면 항원들 또는 그리고 소낭 페이로드로써 탐지될 수 있다. "실례가 되는 분류(Illustrative 분류)"은 이 지표들이 공지의 지표들임을 나타낸다. 당업자는 특정 경우들에서 대체 세팅에 이들 지표가 이용될 수 있음을 인지할 것이다. 예를 들면, 한 가지 유형의 질환을 특징화하는데 이용될 수 있는 지표는 적합한 경우 또다른 질환을 특징화하는데 이용될 수도 있다. 다양한 계통의 종양에 대해 생물지표로 이용될 수 있는 종양 지표의 비-제한적 실시예를 고려한다.
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본 개시내용은 다양한 암, 뿐만 아니라 암의 상태 (가령, 전이성 v. 비-전이성)와 연관된 폴리펩티드 및/또는 핵산 생물지표들의 평가를 포함하는, 주어진 테스트 시료에 대한 생물특징을 측정하는데 있어서 평가되는 다양한 생물지표들을 제공한다.
한 실시예에서, 테스트 시료는 CA-125, CA 19-9, 및 c-반응성 단백질을 포함하나 이에 한정되지 않는 하나 또는 그 이상의 생물지표의 존재 또는 수준을 측정함으로써 암에 대해 평가될 수 있다. 암은 생식 국방부 직할부대 및 기관의 암, 가령, 난소암일 수 있다. 하나 또는 그 이상의 생물지표는 하나 또는 그 이상의 생물지표들, 가령, 1, 2, 3,4 ,5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 이상의 생물지표들을 더 포함할 수 있는데, 하나 또는 그 이상의 of CD95, FAP-1, miR-200 microRNA, EGFR, EGFRvIII, 아포리포단백질 AI, 아포리포단백질 CIII, 미오글로빈, 테나신 C, MSH6, 클라우딘-3, 클라우딘-4, 카베올린-1, 응고 인자 III, CD9, CD36, CD37, CD53, CD63, CD81, CD136, CD147, Hsp70, Hsp90, Rab13, Desmocollin-1, EMP-2, CK7, CK20, GCDF15, CD82, Rab-5b, Annexin V, MFG-E8 그리고 HLA-DR을 포함한다. MiR-200 microRNA (가령, miR-200 microRNA 패밀리)는 miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-141 및 miR-429를 포함한다. 이러한 평가는 본 명세서에서 기술된 생물지표들의 단백질, 핵산 또는 이들 모두의 존재를 결정하는 것을 포함할 수 있다.
CD95 (Fas, Fas 항원, Fas 수용체, FasR, TNFRSF6, APT1 또는 APO-1로도 불림)는 자가사멸의 유도를 통하여 면역계에서 주로 조직 항상성을 조절하는 원형의 사멸 수용체다. 암 진행 동안, CD95는 주로 하향조절되며, 세포들은 자가사멸 저항성을 부여받고, 이로 인하여 종양 침입에 대한 기전의 일부로써 CD95의 상실에 말려든다. CD95의 종양생성 활성은 JNK 및 Jun이 관련된 경로에 의해 중재된다. FAP-1 (Fas-연합된 포스포타제 1, 단백질 티로신 포스포타제, 비-수용체 유형 13 (APO-1/CD95 (Fas)-연합된 포스포타제로도 칭함), PTPN13)는 단백질 티로신 포스포타제 (PTP) 패밀리의 구성요소다. FAP-1은 CD95와 상호작용하고 그리고 CD95를 탈인산화시키고, 이로 인하여 Fas 중재된 예정된 세포 사멸에서 역할에 연루된다. MiR-200 패밀리 구성요소들은 CD95 및 FAP-1를 조절할 수 있다. Schickel et al. miR-200c regulates induction of apoptosis through CD95 by targeting FAP-1. Mol. Cell., 38, 908-915 (2010) 참고, 이는 전문이 여기에 참고자료로 편입된다.
본 명세서에서 기술된 본 발명의 방법은 본 명세서에서 기술된 임의의 암을 포함하나 이에 한정되지 않는 암의 존재 또는 경향을 판단하기 위하여 생물학적 시료 안에 존재하는 미세소낭 집단에 대한 CD95 및/또는 FAP-1 특징화 또는 프로파일링을 이용할 수 있다. 배수 생물지표들에 대한 다중화된 분석을 포함하는 본 발명의 방법은 miR-200 microRNA (가령, miR-200c)을 포함하나 이에 한정되지 않는, 본 명세서에서 기술된 다른 생물지표들과 함께, CD95 및/또는 FAP-1 생물지표 특징화를 이용한다. 한 구체예에서, 개체의 생물학적 테스트 시료는 CD95 및/또는 FAP-1 단백질의 존재 및 수준, 또는 CD95+ 및/또는 FAP-1+ 순환하는 미세소낭 ("cMV") 집단의 존재 또는 수준을 결정하고, 그리고 존재 또는 수준은 참조 (가령, 비-질환 또는 정상 시료, 처리-전 시료, 또는 상이한 처리 시점)과 비교된다. 이러한 비교를 이용하여 테스트 시료를 특징화한다. 예를 들면, 테스트 시료 및 참조 안에 CD95 단백질, FAP-1 단백질, CD95+ cMV 및/또는 FAP-1+ cMV 의 존재 또는 수준의 비교를 이용하여 질환 표현형을 결정하거나 또는 치료에 대한 반응/비-반응을 예측한다. 관련된 구체예들에서, cMV 집단은 더 평가되어, miR-200 microRNA의 존재 또는 수준을 결정하고, 이는 질환 또는 기타 예후적, 치료진단적 또는 진단적 정보송신(readout)을 나타내는 참조 시료의 모형 세트에서 사전결정된다. 암이 아닌 참조와 비교하였을 때, 테스트 시료 안에 FAP-1의 증가된 수준은 암의 존재, 또는 좀 더 공격적인 암의 존재를 나타낼 수 있다. 암이 아닌 참조와 비교하였을 때, CD95 또는 miR200 패밀리 구성요소들 이를 테면, miR-200c의 감소된 수준은 암의 존재, 또는 좀 더 공격적인 암의 존재를 나타낼 수. 평가되는 cMV 집단은 면역침전, 유동세포분석법, 또는 본 명세서에서 기술된 또는 당업계에 공지되어 있는 기타 단리 방법을 통하여 단리될 수 있다.
관련된 측면에서, 본 발명은 A2ML1, BAX, C10orf47, C1orf162, CSDA, EIFC3, ETFB, GABARAPL2, GUK1, GZMH, HIST1H3B, HLA-A, HSP90AA1, NRGN, PRDX5, PTMA, RABAC1, RABAGAP1L, RPL22, SAP18, SEPW1, SOX1, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 생물지표, 가령, 1, 2, 3,4 ,5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 22개의 생물지표들의 수준을 탐지하는 것을 포함하는 암을 특징화하는 방법을 제공한다. 하나 또는 그 이상의 생물지표는 Thymosin 알파-1로 절단되고, 면역 조절에 역할을 하는, 프로/파라티모신 패밀리의 구성요소인 PTMA (프로티모신, 알파)를 포함할 수 있다. Thymosin 알파-1은 B 형 및 C형 간염 의 치료용으로 최소한 35개국에서 승인되었으며, 그리고 다른 질환 치료에 있어서 면역 반응을 부스트시키기 위하여 백신에 포함되도록 또한 승인된다. 한 구체예에서, 생물지표들은 mRNA를 포함한다. mRNA들은 본 명세서에서 기술된 것과 같이 단리되는 소낭으로부터 단리될 수 있다. 일부 구체예들에서, 시료 안에 전체 소낭 집단은 가령, 여과 또는 원심분리에 의해 단리된다. 소낭은 가령, 일반적인 소낭 생물지표, 질환 생물지표 또는 세포-특이적 생물지표에 대한 결합물질을 이용하여, 친화력에 의해 또한 단리될 수 있다. 생물지표들의 수준은 대조군 이를 테면, 암이 없는 시료에 비교될 수 있는데, 이때 대조군에 대해 생물지표들의 수준 사이에 변화는 암을 특징화하는데 이용된다. 암은 전립선암일 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명에 의해 평가되는 암은 전립선암을 포함하고, microRNA (miR)는 전이성 및 비-전이성 전립선암을 구별짓는데 이용된다. 전립선암 단계(staging)는 전립선을 지나 암의 확산 위험을 나타내는 공정이다. 이러한 확산은 국소 치료법, 이를 테면, 외과술 또는 방사선요법으로 치료될 수 있는 가능성과 관련된다. 이러한 예후적 분류에서 고려되는 정보는 신체 검사, 영상 연구, 혈액 테스트 및/또는 생검 검사를 포함하는 임상적 그리고 병리적 인자들에 기초된다.
전립선암의 단계를 정하는데 이용되는 가장 흔한 계획안은 American Joint Committee on Cancer에서 공급하는 것이며, TNM 시스템이라고 한다. TNM 시스템은 종양의 크기, 관련된 림프절의 정도, 전이를 평가하고, 또한 암 등급도 고려한다. 많은 다른 암과 함께, 암은 단계, 가령, 단계 I-IV로 분류된다. 일반적으로, 단계 I 질환은 전립선 조직을 다른 이유, 이를 테면, 양성 전립선 비대증으로 떼어낸 경우, 이 시료의 작은 부분에서 우연하게 발견되는 암이며, 그리고 세포들은 정상적인 세포들과 매우 닮고, 그리고 전립선은 검사자의 손에 정상으로 느껴진다. 전립선의 단계 II는 전립선의 더 많은 부분이 관련되고, 전립선 안에 덩어리가 느껴질 수 있다. 단계 III에서, 종양은 전립선 캡슐을 통하여 퍼지고, 전립선의 표면에 덩어리가 느껴질 수 있다. 단계 IV 질환에서, 종양은 근처 구조를 침범하고, 또는 림프절 또는 다른 장기로 확산되었다.
Whitmore-Jewett 단계는 현재 덜 빈번하게 이용되는 또다른 단계결정 안이다. Gleason Grading System은 생검으로부터 세포 내용물 및 조직 양식에 기초되는데, 이 질환의 파괴적 가능성 및 궁극적 예후의 평가를 제공한다.
TNM 종양 분류 시스템을 이용하여 대상의 신체 안에 암의 정도를 설명할 수 있다. T는 이 종양의 크기를 설명하고, 그리고 종양이 부근 조직을 침범했는지를 나타내며, N은 관련된 지역 림프절을 설명하고, M은 원격 전이를 설명한다. TNM은 International Union Against Cancer (UICC)에 의해 유지되며, 그리고 American Joint Committee on Cancer (AJCC) 및 International Federation of Gynecology and Obstetrics (FIGO)에 의해 이용된다. 당업자는 모든 종양이 TNM 분류를 가지는 것이 아님을 인지할 것이다, 이를 테면, 가령, 뇌종양. 일반적으로, T (a는(0), 1-4)는 1차 종양의 크기 또는 직접적인 범위로 측정된다. N (0-3)은 지역적 림프절로의 확산 정도를 나타낸다: N0는 지역적 림프절에 종양세포가 없음을 의미한다, N1은 지역적 림프절에 가장 가까이 또는 소수의 림프절로 종양세포들이 확산됨을 나타낸다, N2는 N1과 N3 사이의 수준으로 종양 세포들이 확산됨을 의미한다; N3은 종양 세포들이 대부분 멀리 또는 다수의 지역적 림프절로 확산됨을 의미한다. M (0/1)은 전이의 존재를 나타낸다: MX는 거리를 둔 전이가 평가되지 않았다; M0는 거리를 둔 전이가 존재하지 않음을 나타낸다; M1은 전이가 멀리 있는 장기(지역적 림프절을 지나)에서 일어났음을 의미한다. M1은 다음과 같이 추가도 상세될 수 있다: M1a은 지역 림프절을 지나 림프절로 확산되었음을 나타낸다; M1b는 암이 뼈로 확산되었음을 나타내고; 그리고 M1c는 다른 부위(뼈의 관련 여부와 무관하게)로 확산되었음을 나타낸다. 다른 매개변수들 또한 평가될 수 있다. G (1-4)는 암 세포들의 등급을 나타낸다 (가령, 이들이 정상적인 세포들과 유사하게 보이는 경우 낮은 등급이며, 그리고 열악하게 구별되면 높은 등급이다). R (0/1/2)은 수술의 완전성을 나타낸다(가령, 암 세포들과의 절제-경계가 없음). L (0/1)은 림프관으로의 침임을 나타낸다. V (0/1)은 정맥으로의 침입을 나타낸다. C (1-4)는 V의 확실성(질)의 개질을 나타낸다.
전립선 종양은Gleason 득점 시스템을 이용하여 흔히 평가된다. Gleason 득점 시스템은 생검 견본을 설명하는 동안 병리학자에 의해 평가되는 현미경 종양 패턴에 기초된다. 전립선암이 생검에 존재하면, Gleason 득점은 정상적인 선(glandular) 조직 구조의 상실 수준에 기초된다(가령 선의 모양, 크기 및 분화). 전통적인 Gleason 득점 시스템은 종양 "등급(grades)"으로 기술적으로 지칭되는 5가지 기본 조직 패턴을 가진다". 암으로 인하여 정상적인 선 구조의 현미경 결정은 1 내지 5 범위의 수로 된 등급으로 나타내는데, 5는 최악의 등급이다. 등급 1은 암이 있는 전립선이 정상적인 전립선 조직과 밀접하게 닮은 경우가 일반적이다. 선은 작고, 잘-형성된 그리고 조밀하게 되어있다. 등급 2에서 조직은 여전히 잘 형성된 선(gland)을 보유하지만, 이들 사이에 더 크고 더 많은 조직이 있고, 반면 등급 3에서 조직은 인지가능한 선(gland)을 여전히 보유하지만, 세포들은 더 어둡다. 높은 확대 비율에서, 등급 3 시료 안에 이들 세포 일부는 선(gland)을 벗어나고, 주변 조직으로 침투하기 시작한다. 등급 4 시료는 인지가능한 선(gland)이 거의 없는 조직을 가지며, 많은 세포들은 주변 조직을 침투한다. 등급 5 시료의 경우, 조직은 인지가능한 선(gland)을 가지고 있지 않으며, 주변 조직에 모조리 세포들이 있다.
전이성과 비-전이성 전립선암을 구별하는 miR은 비-전이성 시료와 비교하여 전이성 시료에서 과다발현될 수 있다. 대안으로, 전이성 및비-전이성 전립선암을 구별하는 miR은 전이성과 비교하여 비-전이성 시료에서 과다발현될 수 있다. 전이성 전립선암을 구별하는 유용한 miR은 miR-495, miR-10a, miR-30a, miR-570, miR-32, miR-885-3p, miR-564, 및 miR-134으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 가령, 1, 2, 3,4 ,5, 6, 7 또는 8개의 miR을 포함한다. 또다른 구체예에서, 전이성 전립선암을 구별하기 위한 miR은 hsa-miR-375, hsa-miR-452, hsa-miR-200b, hsa-miR-146b-5p, hsa-miR-1296, hsa-miR-17*, hsa-miR-100, hsa-miR-574-3p, hsa-miR-20a*, hsa-miR-572, hsa-miR-1236, hsa-miR-181a, hsa-miR-937, 및 hsa-miR-23a*으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 가령, 1, 2, 3,4 ,5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개의 miR을 포함한다. 여전히 또다른 구체예에서, 전이성 전립선암을 구별하는데 유용한 miR은 hsa-miR-200b, hsa-miR-375, hsa-miR-582-3p, hsa-miR-17*, hsa-miR-1296, hsa-miR-20a*, hsa-miR-100, hsa-miR-452, 그리고 hsa-miR-577으로 구성된 군으로부터 선택된 가령, 1, 2, 3,4 ,5, 6, 7, 8 또는 9개의 miR을 포함할 수 있다. 전이성 전립선암을 구별하는 miR-141, miR-375, miR-200b 및 miR-574-3p으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의, 가령, 1, 2, 3 또는 4개의 miR일 수 있다.
한 측면에서, microRNA (miR)을 이용하여 암과 암이 아닌 시료를 구별한다. 환자 시료로부터 유도된 소낭은 이 소낭 안에 함유된 miR 페이로드에 대해 분석될 수 있다. 이 시료는 정액, 소변, 혈액, 혈청 또는 혈장을 포함하는 체액일 수 있다. 이 시료는 또한 조직 또는 생검 시료를 포함할 수 있다. 다수의 상이한 방법들이 miR를 탐지하는데 이용가능하다. 일부 구체예들에서, miR 패널의 어래이를 이용하여 다중miR의 발현을 동시에 문의한다. Exiqon mIRCURY LNA microRNA PCR 시스템 패널 (Exiqon, Inc., Woburn, MA)이 이러한 목적에 이용될 수 있다. 암을 구별하는 miR은 대조군 시료와 비교하여 암에서 과다발현될 수 있다. 대안으로, 암을 구별하는 miR은 대조군에 비교하여 암 시료에서 과다발현될 수 있다. 암이 아닌 것으로부터 암을 구별하는데 유용한 miR은 hsa-miR-574-3p, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-326, hsa-miR-181a-2*, hsa-miR-130b, hsa-miR-301a, hsa-miR-141, hsa-miR-432, hsa-miR-107, hsa-miR-628-5p, hsa-miR-625*, hsa-miR-497, 및hsa-miR-484으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의, 가령, 1, 2, 3, 4 ,5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개의 miR을 포함한다. 또다른 구체예에서, 암이 아닌 것으로부터 암을 구별하는데 유용한 miR은 hsa-miR-574-3p, hsa-miR-141, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-432, hsa-miR-326, hsa-miR-2110, hsa-miR-107, hsa-miR-130b, hsa-miR-301a, 및 hsa-miR-625*으로 구성된 군으로부터 선택된 가령, 1, 2, 3,4 ,5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 miR을 포함한다. 여전히 또다른 구체예에서, 암이 아닌 것으로부터 암을 유용한 miR은 hsa-miR-107, hsa-miR-326, hsa-miR-432, hsa-miR-574-3p, hsa-miR-625*, hsa-miR-2110, hsa-miR-301a, hsa-miR-141 또는 hsa-miR-373*으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상, 가령, 1, 2, 3, 4 ,5, 6, 7, 8 또는 9개의 miR을 포함한다. 암은 상기에서 언급된 암들을 포함할 수 있다. 예시적인 구체예에서, 암은 전립선암이며, microRNA(miR)은 전립선암과 암이 아닌 시료를 구별하는데 이용된다.
이 방법은 순환하는 생물지표들의 조합 평가도 고려한다. 예를 들면, 항체 어래이 및 miR 분석의 다중 지표들을 이용하여 정상으로부터 전립선암을 구별하고, BPH 및 PCa, 또는 전이성 대 비-전이성 질환을 구별할 수 있다. 이러한 방식에서, 개선된 감응성, 특이성, 및/또는 정확성이 획득될 수 있다. 일부 구체예들에서, 전립선암의 존재를 평가하기 위하여 환자 시료 안에서 hsa-miR-432, hsa-miR-143, hsa-miR-424, hsa-miR-204, hsa-miR-581f 그리고 hsa-miR-451으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의, 가령, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 miR의 수준이 탐지된다. 이들 중 임의의 miR는 PCa 환자에서 상승될 수 있지만, 혈청 PSA < 4.0 ng/ml를 보유한다. 한 구체예에서, 본 발명은 대상의 시료 안에 hsa-miR-432, hsa-miR-143, hsa-miR-424, hsa-miR-204, hsa-miR-581f 그리고 hsa-miR-451으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의, 가령, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 miR 수준 측정을 포함하는, 전립선암을 평가하는 방법을 제공한다. 이 시료는 체액, 가령, 혈액, 혈장 또는 혈청일 수 있다. miR은 시료로부터 단리된 소낭에서 단리될 수 있다. 이 대상은 혈액 시료 내에 일부 임계치, 이를 테면, 2.0, 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3.0, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 4.0, 4.2, 4.4, 4.6, 4.8, 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 또는 6.0 ng/ml 미만의 PSA 수준을 보유할 수 있다. 참조 시료 보다 더 높은 수준의 miR은 이 시료 안에 PCa의 존재를 나타낼 수 있다. 일부 구체예들에서, 참조는 PCa 없는 대상의 대조군 시료 안에 하나 또는 그 이상의 miR의 수준을 포함한다. 일부 구체예들에서, 참조는 PCa를 가진 대상의 대조군 시료 안에 하나 또는 그 이상의 miR의 수준을 포함하는데, PSA 수준 ≥ 일부 임계치, 이를 테면, 2.0, 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3.0, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 4.0, 4.2, 4.4, 4.6, 4.8, 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 또는 6.0 ng/ml이다. 임계치는 4.0 ng/ml일 수 있다.
본 발명의 일부 구체예들에서, 환자 시료 안에 소낭이 평가되어 진단적, 예후적 또는 치료진단적 정보를 제공한다. 환자 시료의 소낭 분석은 소낭 표면 생물지표들의 탐지, 가령, 본 명세서에서 기술된 것과 같이 표면 항원, 및/또는 소낭 페이로드, 가령, mRNA 및 microRNA의 탐지를 포함한다. 소낭의 분석 방법은 2009년 11월 12일자로 제출된 PCT 특허 출원 PCT/US09/06095, "METHOD AND SYSTEMS OF USING 엑소좀 FOR DETERMINING PHENOTYPES"; 2010년 7월 7일자로 제출된 미국 가특허 출원 61/362,674, "METHOD AND SYSTEMS OF USING VESICLES FOR DETERMINING PHENOTYPES"; 그리고 2010년 10월 15일자로 제출된 미국 가특허 출원 61/393,823, "DETECTION OF GI CANCERS"에서 제시되며, 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 편입된다.
한 측면에서, 본 발명은 전술한 대상의 생물학적 시료 안에 하나 또는 그 이상의 소낭의 생물특징을 확인하는 방법이 포함되는데, 이때 생물특징은 소낭 표면 항원 및 소낭 페이로드의 분석을 포함한다. 표면 항원은 표면 단백질을 포함할 수 있고, 소낭 페이로드는 microRNA를 포함할 수 있다. 예를 들면, 소낭은 소낭 표면 항원을 인지하는 결합물질을 이용하여 캡쳐될 수 있고, 그리고 이들 캡쳐된 소낭 내부에 microRNA가 평가될 수 있다. 따라서, 생물특징은 캡쳐에 이용된 표면 항원 뿐만 아니라 소낭 내부의 microRNA를 포함할 수 있다. 생물특징은 진단적, 예후적 또는 치료진단적 목적에 이용될 수 있다. 예를 들면, 생물특징은 암을 확인하는 특징, 공격적 또는 전이성 암을 확인하는 특징, 또는 후부 치료물질에 반응할 것 같은 암을 확인하는 특징일 수 있다.
설명을 위한 실시예로써, B7H3에 대한 항체를 이용하여 시료 안에 소장을 캡쳐하고, 캡쳐된 소낭 안에 miR-141의 수준을 평가하는 방법이 고려된다. 이 실시예에서, 생물특징은 이들의 표면 상에 B7H3을 나타내는 엑소좀 내에 miR-141 수준을 포함한다. 이 시료 안에 B7H3+ 소낭의 수준 뿐만 아니라 이 시료 안에 miR-141의 수준에 의존하여, 생물특징은 이 시료가 암을 포함하는지, 공격적 암을 포함하는지, 특정 화학요법물질에 반응할 지를 나타낼 수 있다.
한 구체예에서, 대상에서 암을 평가하는 방법은 다음을 포함한다: 전술한 대상의 생물학적 시료 안에 하나 또는 그 이상의 소낭의 생물 특징을 확인하는 것을 포함하는데: 하나 또는 그 이상의 일반적 소낭 단백질 생물지표들의 수준을 측정하고; 하나 또는 그 이상의 세포-특이적 단백질 생물지표들의 수준을 측정하고; 하나 또는 그 이상의 질환-특이적 단백질 생물지표들의 수준을 측정하고; 그리고 소낭 안에 하나 또는 그 이상의 microRNA 생물지표들의 수준을 측정하고, 이때 전술한 특징화는 참조에 대해 전술한 시료 안에 전술한 생물지표들의 수준을 비교하여, 전술한 대상이 암을 가진 경향이 있는지, 또는 암을 가지고 있는지를 판단하는 것을 포함한다. 단백질 생물지표들은 단일 분석에서 다중 방식으로 탐지될 수 있다. microRNA는 생물지표들은 단일 분석에서 다중 방식으로 또한 탐지될 수 있다. 일부 경우에서, 세포-특이적 그리고 질환-특이적 생물지표가 중첩될 수 있는데, 가령, 하나의 생물지표는 특정 세포 기원의 암을 확인하는데 사용될 수 있다. 생물학적 시료는 체액, 이를 테면, 혈액, 혈청 또는 혈장일 수 있다.
한 실시예에서, 본 발명의 방법은 전립선암의 존재 또는 부재를 나타내는 소낭을 탐지하기 위하여, 환자의 혈액 시료로부터 소낭을 단리하는 것을 포함하는 전립선암에 대한 진단 테스트를 포함한다. 혈액은 혈청 또는 혈장일 수 있다. 소낭은 특이적 소낭 표면 항원을 인지하는 "캡쳐 항체"으 캡쳐암으로써 단리된다. 전립선암 진단적 분석에 대한 표면 항원은 일반적으로 혈액 안의 소낭에 존재하고 따라서 일반적 소낭 생물지표들로 작용하는 테트라스파닌 CD9, CD63 및 CD81, 전립선 특이적 생물지표들 PSMA 및 PCSA, 그리고 암 특이적 생물지표 B7H3를 포함한다. 일부 경우에서, EpCam는 B7H3을 대신하여 암 특이적 생물지표로 이용된다. 캡쳐 항체는 기질에 연결될 수 있다. 한 구체예에서, 기질은 형광으로 라벨된 비드를 포함하는데, 이때 비드는 각 캡쳐 항체에 대해 차등적으로 라벨된다. 바람직할 경우, 탐지된 소낭의 페이로드를 평가하여 암을 특징화할 수 있다.
상기에서 설명한 것과 같이, 본 발명의 생물지표들이 평가되어 생물특징이 확인된다. 한 측면에서, 본 발명은 다음을 포함하는 방법을 제공한다: 생물학적 시료 안에 하나 또는 그 이상의 생물지표의 존재 또는 수준을 결정하고, 이때 하나 또는 그 이상의 생물지표는 표 5로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 생물지표를 포함하고; 그리고 하나 또는 그 이상의 생물지표의 존재 또는 수준을 포함하는 생물특징을 확인한다. 일부 구체예들에서, 이 방법은 이 생물특징을 참조 생물특징에 비교하는 것을 더 포함하는데, 이때 이러한 비교는 본 명세서에서 기술된 암 또는 당업계에 공지되어 있는 암을 특징화하는데 이용된다. 참조 생물특징은 암이 없는 대상의 것일 수 있다. 참조 생물특징은 대상의 가령, 정상적인 인접 조직 또는 다른 시점에서 취한 시료의 것일 수도 있다. 암을 특징화하는 다양한 방법들이 본 명세서에서 기술된다. 예를 들면, 암의 특징화는 대상에서 암의 존재 또는 위험을 확인하고, 또는 대상에서 암이 전이성 또는 공격성을 확인하는 것을 포함할 수 있다. 비교 단계는 이 생물특징이 참조 생물특징과 비교하여 변경되었는지를 결정하고, 이로 인하여 암에 대한 예후적, 진단적 또는 치료진단적 특징을 제공하는 것을 포함한다. 생물학적 시료는 본 명세서에서 기술된 체액을 포함하나 이에 한정되지 않는 체액을 포함한다. 예를 들면, 체액은 소변, 혈액 또는 혈액 유도체를 포함할 수 있다.
하나 또는 그 이상의 생물지표는 miR-22, let7a, miR-141, miR-182, miR-663, miR-155, mirR-125a-5p, miR-548a-5p, miR-628-5p, miR-517*, miR-450a, miR-920, hsa-miR-619, miR-1913, miR-224*, miR-502-5p, miR-888, miR-376a, miR-542-5p, miR-30b*, miR-1179, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 생물지표, 가령, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 또는 그 이상일 수도 있다. 한 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 생물지표는 miR-22, let7a, miR-141, miR-920, miR-450a, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 하나 또는 그 이상의 생물지표, 가령, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 또는 그 이상은 본 명세서의 임의의 표 20-24에 있는 유전자들로 구성된 군에서 선택된 메신져 RNA (mRNA) 및 이의 조합일 수 있다. 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 생물지표는 A2ML1, BAX, C10orf47, C1orf162, CSDA, EIFC3, ETFB, GABARAPL2, GUK1, GZMH, HIST1H3B, HLA-A, HSP90AA1, NRGN, PRDX5, PTMA, RABAC1, RABAGAP1L, RPL22, SAP18, SEPW1, SOX1, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 또는 그 이상의 메신져 RNA (mRNA)를 포함할 수 있다. 하나 또는 그 이상의 생물지표는 A2ML1, GABARAPL2, PTMA, RABAC1, SOX1, EFTB, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 메신져 RNA (mRNA)를 포함할 수 있다. 하나 또는 그 이상의 생물지표는 미세소낭 집단의 페이로드로써 단리될 수 있다. 이 집단은 이 시료로부터 미세소낭의 전체집단 또는 특이적 집단, 이를 테면, PCSA+ 집단일 수 있다. 한 구체예에서, 이 방법을 이용하여 전립선암을 평가한다. 예를 들면, 이 방법을 이용하여 전립선암이 없는 시료로부터 전립선암을 포함하는 시료를 구별할 수 있다.
한 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 생물지표, 가령, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 또는 그 이상의 생물지표들은 CA-125, CA 19-9, c-반응성 단백질, CD95, FAP-1, EGFR, EGFRvIII, 아포리포단백질 AI, 아포리포단백질 CIII, 미오글로빈, 테나신 C, MSH6, 클라우딘-3, 클라우딘-4, 카베올린-1, 응고 인자 III, CD9, CD36, CD37, CD53, CD63, CD81, CD136, CD147, Hsp70, Hsp90, Rab13, Desmocollin-1, EMP-2, CK7, CK20, GCDF15, CD82, Rab-5b, Annexin V, MFG-E8, HLA-DR, a miR200 microRNA, miR-200c, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 하나 또는 그 이상의 생물지표는 CA-125, CA 19-9, c-반응성 단백질, CD95, FAP-1, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 1, 2, 3, 4 또는 5개의 생물지표를 포함할 수 있다. 하나 또는 그 이상의 생물지표는 시료로부터 직접적으로 단리되거나, 또는 미세소낭 집단의 표면 항원 또는 페이로드로써 단리될 수 있다. 한 구체예에서, 이 방법을 이용하여 난소암을 평가할 수 있다. 예를 들면, 이 방법은 난소암이 없는 시료로부터 난소암을 포함하는 시료를 구별하는데 이용될 수 있다. 대안으로, 이 방법은 상이한 단계 또는 예후를 가진 난소암을 구별하는데 이용될 수 있다.
또다른 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 생물지표, 가령, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 또는 그 이상의 생물지표들은 hsa-miR-574-3p, hsa-miR-141, hsa-miR-432, hsa-miR-326, hsa-miR-2110, hsa-miR-181a-2*, hsa-miR-107, hsa-miR-301a, hsa-miR-484, hsa-miR-625*, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 이 방법은 전립선암을 평가하는데 이용될 수 있다. 예를 들면, 이 방법은 전립선암이 없는 시료로부터 전립선암을 포함하는 시료를 구별하는데 이용될 수 있다. 여전히 또다른 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 생물지표, 가령, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 또는 그 이상의 생물지표들은 hsa-miR-582-3p, hsa-miR-20a*, hsa-miR-375, hsa-miR-200b, hsa-miR-379, hsa-miR-572, hsa-miR-513a-5p, hsa-miR-577, hsa-miR-23a*, hsa-miR-1236, hsa-miR-609, hsa-miR-17*, hsa-miR-130b, hsa-miR-619, hsa-miR-624*, hsa-miR-198, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 예를 들면, 이 방법은 비-전이성 전립선암을 가진 시료로부터 전이성 전립선암을 포함하는 시료를 구별하는데 이용될 수 있다. 하나 또는 그 이상의 생물지표는 미세소낭 집단의 페이로드로써 단리될 수 있다.
하나 또는 그 이상의 생물지표는 miR-497일 수 있다. 이 방법은 폐암을 평가하는데 이용될 수 있다. 예를 들면, 이 방법은 암이 아닌 시료로부터 폐암 시료를 구별하는데 이용될 수 있다. 하나 또는 그 이상의 생물지표는 미세소낭 집단의 페이로드로써 단리될 수 있다.
하나 또는 그 이상의 생물지표, 가령, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 또는 그 이상의 생물지표들은 AQP2, BMP5, C16orf86, CXCL13, DST, ERCC1, GNAO1, KLHL5, MAP4K1, NELL2, PENK, PGF, POU3F1, PRSS21, SCML1, SEMG1, SMARCD3, SNAI2, TAF1C, TNNT3, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 메신져 RNA (mRNA)를 포함할 수 있다. mRNA는 미세소낭으로부터 단리될 수 있다. 이 방법은 전립선암을 특징화하는데 이용될 수 있는데, 이를 테면, 암이 없는 정상 시료로부터 전립선암을 구별한다. 또다른 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 생물지표, 가령, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 또는 그 이상의 생물지표들은 ADRB2, ARG2, C22orf32, CYorf14, EIF1AY, FEV, KLK2, KLK4, LRRC26, MAOA, NLGN4Y, PNPLA7, PVRL3, SIM2, SLC30A4, SLC45A3, STX19, TRIM36, TRPM8, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 메신져 RNA (mRNA)를 포함한다. mRNA는 미세소낭으로부터 단리될 수 있다. 이 방법은 전립선암을 특징화하는데 이용될 수 있는데, 이를 테면, 또다른 암, 가령, 유방암을 가진 시료로부터 전립선암 시료를 구별하는데 이용될 수 있다. 여전히 또다른 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 생물지표, 가령, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 또는 그 이상의 생물지표들은 ADRB2, BAIAP2L2, C19orf33, CDX1, CEACAM6, EEF1A2, ERN2, FAM110B, FOXA2, KLK2, KLK4, LOC389816, LRRC26, MIPOL1, SLC45A3, SPDEF, TRIM31, TRIM36, ZNF613, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 메신져 RNA (mRNA)를 포함한다. mRNA는 미세소낭으로부터 단리될 수 있다. 이 방법은 전립선암을 특징화하는데 이용될 수 있는데, 이를 테면, 또다른 암, 가령, 결장직장암을 가진 시료로부터 전립선암 시료를 구별하는데 이용될 수 있다. 여전히 또다른 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 생물지표, 가령, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 또는 그 이상의 생물지표들은 ASTN2, CAB39L, CRIP1, FAM110B, FEV, GSTP1, KLK2, KLK4, LOC389816, LRRC26, MUC1, PNPLA7, SIM2, SLC45A3, SPDEF, TRIM36, TRPV6, ZNF613, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 메신져 RNA (mRNA)를 포함한다. mRNA는 미세소낭으로부터 단리될 수 있다. 이 방법은 전립선암을 특징화하는데 이용될, 이를 테면, 또다른 암, 가령, 폐암을 가진 시료로부터 전립선암 시료를 구별하는데 이용될 수 있다. 하나 또는 그 이상의 생물지표는 하나 또는 그 이상의 mRNA들 전립선암을 특징화하는데 이용될 수 있는 하나 또는 그 이상의 mRNA를 조절하는 microRNA일 수도 있다. 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 생물지표, 가령, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 또는 그 이상의 생물지표들은 miR-26a+b, miR-15, miR-16, miR-195, miR-497, miR-424, miR-206, miR-342-5p, miR-186, miR-1271, miR-600, miR-216b, miR-519 패밀리, miR-203, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 microRNA를 포함할 수 있다. microRNA는 미세소낭 집단의 페이로드로 평가될 수 있다.
본 발명은 생물지표 복합체들을 평가함으로써 생물특징을 확인하는 방법을 또한 제공한다. 한 측면에서, 이 방법은 생물학적 시료로부터 하나 또는 그 이상의 핵산-단백질 복합체를 단리하고; 하나 또는 그 이상의 핵산-단백질 복합체와 함께 하나 또는 그 이상의 핵산 생물지표의 존재 또는 수준을 측정하고; 그리고 하나 또는 그 이상의 핵산 생물지표의 존재 또는 수준을 포함하는 생물특징을 확인하는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 이 생물특징은 하나 또는 그 이상의 단백질 또는 복합체의 다른 성분의 존재 또는 수준을 포함할 수 있다. 핵산-단백질 복합체는 본 명세서에서 기술된 방법 또는 당업계에 공지되어 있는 방법을 이용하여 생물학적 시료로부터 단리될 수 있다. 예를 들면, 복합체는 복합체 성분에 대한 결합물질을 이용한 친화력 선택 이를 테면, 면역침전, 컬럼 크로마토그래피 또는 유동세포분석법에 의해 단리될 수 있다. 결합물질은 본 명세서에서 기술된 것과 같이, 가령, 복합체의 단백질 성분에 대한 항체 또는 압타머일 수 있다. 일부 구체예들에서, 이 방법은 이 생물특징을 참조 생물특징에 비교하는 것을 더 포함하는데, 이때 이러한 비교는 본 명세서에서 기술된 암 또는 당업계에 공지되어 있는 암을 특징화하는데 이용된다. 참조 생물특징은 암이 없는 대상의 것일 수 있다. 참조 생물특징은 대상의 가령, 정상적인 인접 조직 또는 다른 시간대에서 취한 시료로부터 취한 것일 수 있다. 암을 특징화하는 다양한 방법들이 본 명세서에서 기술된된다. 예를 들면, 암의 특징화는 대상에서 암의 존재 또는 위험을 확인하고, 또는 대상에서 암이 전이성 또는 공격성을 확인하는 것을 포함할 수 있다. 비교 단계는 이 생물특징이 참조 생물특징과 비교하여 변경되었는지를 결정하고, 이로 인하여 암에 대한 예후적, 진단적 또는 치료진단적 특징을 제공하는 것을 포함한다. 생물학적 시료는 본 명세서에서 기술된 체액을 포함하나 이에 한정되지 않는 체액을 포함한다. 예를 들면, 체액은 소변, 혈액 또는 혈액 유도체를 포함할 수 있다.
한 구체예에서, 핵산-단백질 복합체는 하나 또는 그 이상의 Argonaute 패밀리 구성요소, Ago1, Ago2, Ago3, Ago4, GW182 (TNRC6A), TNRC6B, TNRC6C, HNRNPA2B1, HNRPAB, ILF2, NCL (Nucleolin), NPM1 (Nucleophosmin), RPL10A, RPL5, RPLP1, RPS12, RPS19, SNRPG, TROVE2, 아포리포단백질, 아포리포단백질 A, apo A-I, apo A-II, apo A-IV, apo A-V, 아포리포단백질 B, apo B48, apo B100, 아포리포단백질 C, apo C-I, apo C-II, apo C-III, apo C-IV, 아포리포단백질 D (ApoD), 아포리포단백질 E (ApoE), 아포리포단백질 H (ApoH), 아포리포단백질 L, APOL1, APOL2, APOL3, APOL4, APOL5, APOL6, APOLD1, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 단백질, 가령, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 또는 그 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들면, 핵산-단백질 복합체는 하나 또는 그 이상의 Argonaute 패밀리 구성요소, Ago1, Ago2, Ago3, Ago4, GW182 (TNRC6A), 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 핵산-단백질 복합체는 Ago2, 아포리포단백질 I, GW182 (TNRC6A), 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 단백질을 포함한다.
구체예들에서, 핵산-단백질 복합체 안에 하나 또는 그 이상의 핵산은 하나 또는 그 이상의 microRNA를 포함한다. 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 microRNA, 가령, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50개 또는 그 이상의 microRNA는 표 5의 microRNA일 수 있다. 하나 또는 그 이상의 microRNA는 miR-22, miR-16, miR-148a, miR-92a, miR-451, let7a, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 microRNA, 가령, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 microRNA를 포함할 수 있다. 하나 또는 그 이상의 microRNA가 평가되어, 전립선암을 포함하나 이에 한정되지 않는 암을 특징화, 가령, 진단, 예후 또는 치료진단할 수 있다.
한 구체예에서, 핵산-단백질 복합체는 Ago2, 아포리포단백질 I, GW182 (TNRC6A), 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 단백질을 포함하고; 그리고 하나 또는 그 이상의 microRNA는 miR-16 그리고 miR-92a, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 microRNA를 포함한다. 하나 또는 그 이상의 microRNA를 평가하여 전립선암을 특징화할 수 있다.
본 발명은 관심 미세소낭 집단 안에 핵산을 탐지하는 것을 포함하는 생물특징을 결정하는 방법을 더 제공한다. 소낭 집단은 생물학적 시료 안에 전체 집단, 또는 하위집단 이를 테면, 특정 표면 항원을 가진 하위집단일 수 있다. 이 방법은 생물학적 시료로부터 미세소낭 집단내에 하나 또는 그 이상의 단백질 생물지표를 탐지하고; 탐지된 미세소낭 집단과 연합된 하나 또는 그 이상의 하나 또는 그 이상의 핵산 생물지표의 존재 또는 수준을 측정하고; 그리고 하나 또는 그 이상의 핵산의 존재 또는 수준을 포함하는 생물특징을 확인하는 것을 포함한다. 미세소낭 집단을 탐지하는 기술, 단백질을 탐지하는 기술, 그리고 핵산을 평가하는 기술은 본 명세서에서 기술될 수 있거나 또는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 미세소낭은 하나 또는 그 이상의 단백질에 대한 친화력에 의해 단리될 수 있고, 그리고 핵산은 선택된 미세소낭으로부터 단리될 수 있다. 하나 또는 그 이상의 하나 또는 그 이상의 핵산 생물지표의 수준은 하나 또는 그 이상의 단백질 생물지표 또는 미세소낭 집단의 수준에 대해 표준화될 수 있다. 일부 구체예들에서, 이 방법은 이 생물특징을 참조 생물특징에 비교하는 것을 더 포함하고, 이때 이러한 비교를 이용하여 본 명세서에서 기술된 또는 당업계에 공지되어 있는 암을 특징화한다. 참조 생물특징은 암이 없는 대상의 것일 수 있다. 참조 생물특징은 대상으로부터 가령, 정상적인 인접 조직 또는 또다른 시간대에 취한 시료의 것일 수도 있다. 암을 특징화하는 다양한 방식이 본 명세서에서 기술된다. 예를 들면, 암의 특징화는 대상에서 암의 존재 또는 위험을 확인하고, 또는 대상에서 암이 전이성 또는 공격성을 확인하는 것을 포함할 수 있다. 비교 단계는 이 생물특징이 참조 생물특징과 비교하여 변경되었는지를 결정하고, 이로 인하여 암에 대한 예후적, 진단적 또는 치료진단적 특징을 제공하는 것을 포함한다. 생물학적 시료는 본 명세서에서 기술된 체액을 포함하나 이에 한정되지 않는 체액을 포함한다. 예를 들면, 체액은 소변, 혈액 또는 혈액 유도체를 포함할 수 있다.
미세소낭 집단 안에서 하나 또는 그 이상의 단백질 생물지표를 탐지하는데 이용되는 단백질은 본 명세서 이를 테면, 표 3-5 또는 9-11에서 공개된 하나 또는 그 이상의 생물지표를 포함할 수 있다. 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 단백질은 PCSA, Ago2, CD9 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 단백질은 PCSA, Ago2, CD9, PCSA 및 Ago2, PCSA 및 CD9, Ago2 및 CD9, 또는 PCSA, Ago2 및 CD9 모두일 수 있다. 또다른 일반적 소낭 지표 이를 테면, 표 3에서, 가령, 테트라스파닌 이를 테면, CD63 또는 CD81은 CD9를 대체하거나, 이에 추가될 수 있다. 이러한 배수 생물지표들을 이용하여 특정 기원을 가진 미세소낭 집단을 확인할 수 있다. 가령, PCSA는 전립선-유도된 소낭을 확인할 수 있고, CD9는 세포 찌꺼지로부터 소낭을 확인한다. PCSA, PSMA, PSCA, KLK2 또는 PBP (전립선 결합 단백질)을 생물지표로 이용하여 전립선암을 특징화한다.
하나 또는 그 이상의 핵산 생물지표는 본 명세서에서 기술된, 이를 테면, 표 5에서 기술된 하나 또는 그 이상의 핵산을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 핵산은 하나 또는 그 이상의 microRNA를 포함한다. 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 microRNA는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 miR-22, miR-16, miR-148a, miR-92a, miR-451, 그리고 let7a로부터 선택될 수 있다. 한 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 단백질 생물지표는 PCSA 및 Ago2를 포함하고; 그리고 하나 또는 그 이상의 핵산 생물지표는 miR-22를 포함한다. 또다른 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 단백질 생물지표는 PCSA 및/또는 CD9를 포함하고; 그리고 하나 또는 그 이상의 핵산 생물지표는 miR-22를 포함한다. 이 방법은 가령, 암이 아닌 시료로부터 암 시료를 구별하기 위하여, 암, 이를 테면 전립선암을 특징화하는데 이용될 수 있다.
다른 구체예들에서, 하나 또는 그 이상의 핵산은 mRNA를 포함한다. mRNA는 미세소낭 안에 페이로드로써 평가된다. 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 핵산 생물지표는 표 5로부터 선택된 메신져 RNA (mRNA)를 포함한다. mRNA는 표 22-24로부터 선택될 수 있다. 일부 구체예들에서, 하나 또는 그 이상의 단백질 생물지표는 PCSA를 포함하고; 그리고 하나 또는 그 이상의 핵산 생물지표는 표 22-24중 임의의 것에서 선택된 메신져 RNA (mRNA)를 포함한다. 이 방법은 가령, 암이 아닌 시료로부터 암 시료를 구별하기 위하여, 암, 이를 테면 전립선암을 특징화하는데 이용될 수 있다.
하나 또는 그 이상의 하나 또는 그 이상의 핵산 생물지표의 수준은 하나 또는 그 이상의 단백질 생물지표의 수준에 대해 표준화될 수 있다. 한 구체예에서, 이 생물특징은 하나 또는 그 이상의 단백질 생물지표 및 하나 또는 그 이상의 핵산 생물지표 수준의 비율로부터 산출된 득점을 포함한다. 예를 들면, 핵산의 수준은 단백질 수준으로 나눠질 수 있다.
득점은 다중 단백질 그리고 다중 핵산으로부터 산출될 수 있다. 한 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 단백질 생물지표는 PCSA 및 PSMA를 포함하고 그리고 하나 또는 그 이상의 핵산 생물지표는 miR-22 및 let7a를 포함한다. 이 방법은 전립선암을 특징화하는데 이용될 수 있는데, 가령, 비-전립선암 시료로부터 전립선암 시료를 구별할 수 있다. 득점은 다음의 합으로부터 취할 수 있다: a) 미세소낭 하위집단과 연합된 PCSA 단백질의 수준으로 나눈 미세소낭 하위 집단내 miR-22 페이로드의 수준의 제 1 배수; b) 미세소낭 하위집단과 연합된 PCSA 단백질의 수준으로 나눈 미세소낭 하위집단 안에 let7a 페이로드의 수준의 제 2 배수; 그리고 c) PSMA 단백질 미세소낭 하위집단과 연합된 수준의 제 3 배수. 제 1, 제 2 그리고 제 3 배수 수준을 선택하여 전립선암을 구별하기 위한 이 방법의 능력을 최대화할 수 있다. 예를 들면, 배수는 약 0.0001, 0.001, 0.01, 0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 100, 1000 또는 10000일 수 있다. 한 구체예에서, 제 1 배수는 10이고, 제 2 배수는 10이며, 그리고 제 3 배수는 1이다. 득점은 다음과 같이 합의 평균일 수 있다:
득점 = 평균( 10*miR22/PCSA MFI, 10*let-7a/PCSA MFI, PSMA MFI)
당업자는 득점의 산출은 합의 단조(monotonic) 변환을 포함할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 다른 환경에서 다른 암을 특징화하기 위한 대체 생물지표들을 이용하여 다른 생물지표들에 대해 유사한 득점 식이 개발될 수 있다.
비교를 위한 적절한 참조 시료를 선택함으로써, 확인된 생물특징들은 진단적 정보(가령, 참조 시료는 정상적인 또는 비-질환), 예후적 (가령, 참조 시료는 열악한 또는 양호한 질환 결과, 공격성 또는 이와 유사한 것이며), 또는 치료진단적 (가령, 참조 시료는 선택된 치료에 대해 코호트 반응 비-반응성일 수 있다) 정보를 제공할 수 있다.
본 발명의 이들 방법에 이용될 수 있는 추가 생물지표는 2012년 2월 17일자로 제출된 국제 특허 출원 PCT/US2012/025741; 2011년 8월 18일자로 제출된 국제 특허 출원 PCT/US2011/048327; 2011년 3월 1일자로 제출된 국제 특허 출원 PCT/ US2011/026750; 그리고 2011년 4월 6일자로 제출된 국제 특허 출원 PCT/US2011/031479에서 공개된 것들을 포함하며, 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 편입된다.
유전자 융합(Gene Fusions)
소낭의 평가된 하나 이상의 생물지표들은 유전자 융합일 수 있다. 융합 유전자는 두 개의 이미 분리된 유전자의 병치(juxtaposition)에 의해 만들어진 하이브리드 유전자다. 염색체 전위(translocation) 또는 역전, 결손 또는 횡단-접합(trans-splicing)을 통하여 일어날 수 있다. 생성된 융합 유전자는 유전자의 비정상적 임시 및 공간적 발현의 원인이되는데, 가령, 세포 성장 인자들, 맥관형성 인자들, 종양 프로모터들 또는 세포의 신형성 형질전환 및 종양의 생성에 기여하는 다른 인자들의 의 비정상적인 발현을 유도한다. 이러한 융합 유전자는 1) 세포 성장 인자의 코딩 영역, 종양 프로모터 또는 상승된 유전자 발현으로 이어지는 맥관형성을 촉진시키는 다른 유전자의 옆에 있는 한 유전자의 강력한 프로모터 영역에 병치하고, 또는 2) 2개의 상이한 유전자들의 코딩 영역의 융합으로 인하여, 키메라 유전자가 발생하고, 따라서 비정상적인 활성을 가진 키메라 단백질이 생성되기 때문에, 발암성일 수 있다.
융합 유전자의 예는 BCR-ABL로써, 이는 만성골수성 백혈병 (CML)의 ~90%와 급성 백혈병의 부분집합에서 특징적인 분자 이상이다(Kurzrock et al., Annals of Internal Medicine 2003; 138(10):819-830). BCR-ABL은 염색체 9와 22의 전위로 생성된 것이다. BCR 유전자의 5'영역과 ABL1의 3' 영역을 함께 가져가는 전위는 키메라 BCR-ABL1 유전자를 만들고, 이 유전자는 구성적으로 활성인 티로신 키나제 활성을 가진 단백질을 인코드한다 (Mittleman et al., Nature Reviews Cancer 2007; 7(4):233-245). 비정상적인 티로신 키나제 활성은 하향조절된 세포 신호생성, 세포 성장 및 세포 생존, 아팝토시스 저항성 및 성장 인자 독립을 유도하고, 이들 모두 백혈병의 병리생리학의 원인이 된다(Kurzrock et al., Annals of Internal Medicine 2003; 138(10):819-830).
또다른 융합 유전자는 Burkitt 임파종의 ~80%의 한정된 특징인 IGH-MYC이다 (Ferry et al. Oncologist 2006; 11(4):375-83). 이의 원인은 염색체 8과 14 사이의 전위이며, 면역글로블린 중쇄 유전자의 강력한 프로모터에 인접하게 c-Myc 종양유전자를 가져오고, c-myc 과다발현의 원인이 된다(Mittleman et al., Nature Reviews Cancer 2007; 7(4):233-245). c-myc 재배열은 끊임없는 증식성 상태를 초래하기 때문에 임파종 생성에 중추적인 사건이다. 세포 주기, 세포성 분화, 아팝토시스, 및 세포 흡착 (Ferry et al. Oncologist 2006; 11(4):375-83)을 통하여 진전에 광범위한 효과를 가진다.
다수의 재발 융합 유전자는 Mittleman 데이터베이스 (cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman)에 열거되어 있으며, 소낭에서 평가할 수 있고, 표현형을 특징화하는데 이용할 수 있다. 유전자 융합을 이용하여 혈액 악성 또는 상피 종양을 특징화하는데 이용할 수 있다. 예를 들면, TMPRSS2-ERG, TMPRSS2-ETV 및 SLC45A3-ELK4 융합을 탐지할 수 있고, 전립선암을 특징화하는데 이용할 수 있으며; 그리고 ETV6-NTRK3 및 ODZ4-NRG1은 유방암을 특징화하는데 이용할 수 있다.
더욱이, 융합 유전자의 존재 또는 부재, 또는 발현 수준의 평가를 이용하여 표현형의 진단 가령, 암 진단 뿐만 아니라 선택된 치료에 대한 치료의 반응을 모니터링할 수 있다. 예를 들면, BCR-ABL 융합 유전자의 존재는 CML의 진단에 대해 특징적이며, 그리고 CML 치료용 수용체 티로신 키나제 억제제인 Novartis 약물 이마티니브 메실레이트 (Gleevec)의 표적이 된다. 이마티니브(Imatinib) 치료는 분자 반응 (BCR-ABL+ 혈액 세포들의 소멸)과 BCR-ABL+ CML 환자에서 병의 진전-없는 생존을 개선시켰다(Kantarjian et al., Clinical Cancer Research 2007; 13(4):1089-1097).
유전자 융합의 존재, 부재 또는 발현 수준에 대하여 소낭의 평가는 유전자 융합의 존재, 부재 또는 발현 수준에 대해 이종 소낭 집단을 평가하는 것일 수 있다. 대안으로, 평가할 소낭은 상기에서 설명한 것과 같이, 특이적 세포 유형으로부터 유도된, 가령, 기원 세포 특이적 소낭일 수 있다. 표현형을 특징화하기 위하여 평가하게 될 융합을 이용하는 설명을 위한 예는 2011년 4월 6일자로 제출된 국제 특허 출원 번호 PCT/US2011/031479, "Circulating Biomakers for Disease"(이들은 전문이 여기에 참고자료로 편입된다)에서 설명된 것들을 포함한다.
유전자-연합된 MiRNA 생물지표들
특정 전사체와 상호작용하고, 표현형을 특징화하기 위하여 평가될 수 있는 것으로 공지된 miRNA 생물지표들의 용도의 설명을 위한 실시예는 2011년 4월 6일자로 제출된 국제 특허 출원 번호 PCT/US2011/031479, "Circulating Biomakers for Disease"(이들은 전문이 여기에 참고자료로 편입된다)에서 설명된 것들을 포함한다.
핵산 - 단백질 복합체 생물지표들
인간 혈장 안에 MicroRNA는 순환하는 미세소낭, Argonaute 단백질, 그리고 HDL 그리고 LDL 복합체들과 연합되는 것으로 밝혀졌다. 가령, Arroyo et al., Argonaute2 complexes carry a population of circulating microRNA in의존적 of vesicles in human plasma. Proc Natl Acad Sci USA. 2011. 108:5003-08. Epub 2011 Mar 7; Collino et al., Microvesicles derived from 성인 human bone marrow and tissue specific mesenchymal stem cells shuttle selected pattern of miRNA. PLOS One. 2010 5(7):e11803. 단백질의 Argonaute 패밀리는 RNA 간섭 (RNAi) 유전자 침묵에 역할을 한다. Argonaute 단백질은 짧은 RNA 이를 테면 microRNA (miRNA) 또는 짧은 간섭 RNA (siRNA)에 결합하고, 그리고 이들의 상보적인 mRNA의 해독을 억제한다. 이들은 전사 유전자 침묵 (TGS)에도 관련되는데, 이때 항원 RNA 또는 agRNA으로 알려진 짧은 RNA는 상보적인 프로모터 영역들의 전사 억제를 지시한다. Argonaute 패밀리 구성원들은 Argonaute 1 ("진핵생물의 해독 개시 인자 2C, 1", EIF2C1, AGO1), Argonaute 2 ("진핵생물의 해독 개시 인자 2C, 2", EIF2C2, AGO2), Argonaute 3 ("진핵생물의 해독 개시 인자 2C, 3", EIF2C3, AGO3), 그리고 Argonaute 4 ("진핵생물의 해독 개시 인자 2C, 4", EIF2C4, AGO4)를 포함한다. 몇 가지 Argonaute 이소타입이 확인되었다. Argonaute 2는 RNA-유도된 침묵 복합체 (RISC) 안에 효과물질 단백질이며, microRNA 침묵 경로에서 표적 메신져 RNA의 침묵에 역할을 한다.
단백질 GW182은 미세소낭과 연합되고, 그리고 모든 인간 Argonaute 단백질 (가령, Ago1, Ago2, Ago3, Ago4) 및 이들의 연합된 miRNA에 결합하는 능력을 보유한다. 가령, Gibbings et al., Multivesicular 바디 associate with 성분들 of miRNA effector complexes and modulate miRNA activity, Nat Cell Biol 2009 11:1143-1149. Epub 2009 Aug 16; Lazzaretti et al., The C-terminal 도메인들 of human TNRC6A, TNRC6B, and TNRC6C silence binding transcripts in의존적ly of Argonaute protein. RNA. 2009 15:1059-66. Epub 2009 Apr 21. GW182, which is encoded by the TNRC6A gene (tri뉴클레오티드 반복 함유 6A), functions in post-transcritptional gene sliencing through the RNA interference (RNAi) and microRNA pathways 참고. TNRC6B 및 TNRC6C는 삼뉴클레오티드 반복을 포함하는 6개 패밀리의 구성원들이며, 유전자 침묵에서 유사한 역할을 한다. GW182는 GW-바디(bodies) 또는 P-바디로 알려진 세포질 바디에서 mRNA 및 Argonaute 단백질과 연합된다. GW182는 miRNA-의존적 해복 억제 및 argonaute 패밀리 단백질에 의한 상보적인 mRNA의 siRNA-의존적 말단 뉴클레오티드 절단에 관계된다.
한 측면에서, 본 발명은 핵산 - 단백질 복합체 생물지표들을 분석하는 것을 포함하는 표현형을 특징화하는 방법을 제공한다. 본 명세서에서 이용된 것과 같이, 핵산 - 단백질 복합체는 최소한 하나의 핵산 그리고 최소한 하나의 단백질을 포함하고, 기타 성분들 이를 테면 지질을 또한 포함할 수 있다. 핵산 - 단백질 복합체는 소낭과 연합될 수 있다. 한 구체예에서, RNA - 단백질 복합체들은 단리되고, 연합된 RNA의 수준이 평가되며, 이때 이 수준은 본 명세서에서 기술된 것과 같이 표현형, 가령, 진단, 예후, 치료진단, 또는 기타 표현형을 제공하는 것과 같이, 표현형을 특징화하는데 이용된다. RNA는 microRNA일 수 있다. MicroRNA는 소낭 및 단백질과 연합된 것으로 발견된다. 일부 경우들에서, 이러한 연합은 RNAes 또는 기타 인자들을 통한 분해로부터 miRNA를 보호하는 기능을 할 수 있다. 소낭 연합된 miRs, Ago-연합된 miRs, 세포-기원 소낭 연합된 miRs, 순환하는 Ago-결합된 miRs, 순환하는 HDL-결합된 miRs, 그리고 전체 miR 함량을 포함하나 이에 한정되지 않는 microRNA의 다양한 집단의 내용물이 시료 내에서 평가될 수 있다.
복합체들을 단리하는데 이용되는 단백질 생물지표는 하나 또는 그 이상의 Argonaute 단백질, 또는 Argonaute 패밀리 구성원들과 연합된 기타 단백질일 수 있다. 이들은 Argonaute 단백질 Ago1, Ago2, Ago3, Ago4, 그리고 이의 다양한 이소폼을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 단백질 생물지표는 GW182 (TNRC6A), TNRC6B 및/또는 TNRC6C일 수 있다. 단백질 생물지표는 P-바디 또는 GW-바디, 이를 테면 SW182, argonaute, 디캡핑(decapping) 효소 또는 RNA 헬리카제와 연합된 단백질일 수 있다. 가령, Kulkarni et al. On track with P-body. Biochem Soc Trans 2010, 38:242-251 참고. 단백질 생물지표는 can also be 하나 또는 그 이상의 HNRNPA2B1 (이질성 핵 리보핵단백질 a2/b1), HNRPAB (이질성 핵 리보핵단백질 A/B), ILF2 (인터루킨 인헨서 결합 인자 2, 45 kda), NCL (Nucleolin), NPM1 (Nucleophosmin (조직(nucleolar) 인단백질 b23, numatrin)), RPL10A (리보좀 단백질 l10a), RPL5 (리보좀 단백질 l5), RPLP1 (리보좀 단백질, 거대, p1), RPS12 (리보좀 단백질 s12), RPS19 (리보좀 단백질 s19), SNRPG (작은 핵 리보핵단백질 폴리펩티드 g), TROVE2 (Trove 도메인 패밀리, 구성원 2). Wang et al., Export of microRNA and microRNA-protective protein by mammalian cells. Nucleic Acids Res. 38:7248-59. Epub 2010 Jul 7 참고. 단백질 생물지표는 아포리포단백질일 수도 있는데, 이는 지단백질을 형성하기 위하여 지질(오일-가용성 물질 이를 테면, 지방 및 콜레스테롤)에 결합하는 단백질이며, 림프 및 순환계를 통하여 지질이 운반된다. Vickers et al., MicroRNA are de간ed in plasma and de간ed to recipient cells by high-밀도 lipoprotein, Nat Cell Biol 2011 13:423-33, Epub 2011 Mar 20 참고. 아포리포단백질은 아포리포단백질 A (apo A-I, apo A-II, apo A-IV, 그리고 apo A-V를 포함), 아포리포단백질 B (apo B48 그리고 apo B100를 포함), 아포리포단백질 C (apo C-I, apo C-II, apo C-III, 그리고 apo C-IV를 포함), 아포리포단백질 D (ApoD), 아포리포단백질 E (ApoE), 아포리포단백질 H (ApoH), 또는 이의 조합일 수 있다. 아포리포단백질은 APOL1, APOL2, APOL3, APOL4, APOL5, APOL6, APOLD1, 또는 이의 조합을 포함하는 아포리포단백질 L이다. 아포리포단백질 L (Apo L)은 콜레스테롤 운반에 중심 역할을 하는 고밀도 지단백질 패밀리에 속한다. 단백질 생물지표는 지단백질, 이를 테면 킬로미크론(chylomicron)의 성분, 초저밀도 지단백질 (VLDL), 중간 밀도 지단백질 (IDL), 저밀도 지단백질 (LDL) 및/또는 고밀도 지단백질 (HDL)의 성분일 수 있다. 한 구체예에서, 단백질 생물지표는 LDL 또는 HDL의 성분이다. 성분은 ApoE일 수 있다. 성분은 ApoA1일 수 있다. 단백질 생물지표은 일반적인 소낭 지표, 이를 테면 CD9, CD63 및/또는 CD81을 포함하나 이에 한정되지 않는 표 3에서 열거된 테트라스파닌 또는 기타 단백질일 수 있다. 단백질 생물지표는 암 지표 이를 테면 EpCam, B7H3 및/또는 CD24일 수 있다. 단백질 생물지표는 조직 특이적 생물지표, 이를 테면 전립선 생물지표들 PSCA, PCSA 및/또는 PSMA일 수 있다. 이들 또는 기타 유용한 단백질 생물지표들의 조합을 이용하여 관심 복합체의 특적 집단을 단리할 수 있다.
핵산 - 단백질 복합체들은 복합체의 하나 또는 그 이상의 성분에 대한 결합제를 이용하여 단리될 수 있다. 단백질을 단리하는 다양한 기술이 당업계에 공지되어 있거나 본 명세서에서 기술되는데, 친화력 격리, 면역캡쳐, 면역침전 그리고 유동 세포분석을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이 결합제는 본 명세서에서 기술된임의의 적절한 결합제일 수 있는데, 이를 테면 하나 또는 그 이상 결합제는 핵산, DNA 분자, RNA 분자, 항체, 항체 단편, 압타머, 펩토이드, zDNA, 펩티드 핵산 (PNA), 잠긴 핵산 (LNA), 렉틴, 펩티드, 덴드라이머, 막 단백질 라벨링 물질, 화학적 화합물, 또는 이의 조합를 포함한다. 한 구체예에서, 이 결합제는 항체, 항체 접합물(conjugate), 항체 단편, 및/또는 압타머를 포함한다. 본 발명에 이용될 수 있는 단백질-핵산 복합체를 평가하는 추가 방법은 Wang et al., Export of microRNA and microRNA-protective protein by mammalian cells. Nucleic Acids Res. 38:7248-59. Epub 2010 Jul 7; Keene et al., RIP-Chip: the isolation and identification of mRNA, microRNA and protein 성분들 of ribonucleoprotein complexes from cell extracts. Nat Protoc 2006 1:302-07; Hafner, Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP. Cell 2010 141:129-41 참고.
본 발명은 단백질과 복합체로 발견되는 miRNA를 확인하는 방법을 더 제공한다. 한 구체예에서, 단백질 - 핵산 복합체의 집단은 상기에서 설명된 바와 같이 단리된다. 이 집단의 miRNA 함량이 평가된다. 이 방법은 다양한 관심 시료(가령, 질병이 있는, 질병이 없는, 반응자, 비-반응자)에서 시용될 수 있고, 시료 안에 miRNA 함량이 비교되어 시료간에 차등되는 miRNA를 식별할 수 있다. miRNA를 탐지하는 방법들이 제공된다(어래이, PCR, 등). 확인된 miRNA는 본 명세서에서 기술된 방법에 따라 표현형을 특징화하는데 이용될 수 있다. 예를 들면, 발견에 이용되는시료는 암 및 암이 아닌 혈장 시료일 수 있다. 암과 암이 아닌 시료를 구별하는 단백질-복합된 miRNA가 식별될 수 있고, 차등 miRNA들이 평가되어 혈장 시료안에 암이 탐지될 수 있다.
본 발명은 소낭-함유 시료로부터 비-페이로드 miR을 제거하고, 이 소낭 안에 miR를 평가함으로써 소낭 안에 microRNA 페이로드를 구별하는 방법을 또한 제공한다. RNAes 또는 기타 miRNA를 분해하는 기타 엔터티를 이용하여 시료로부터 miR을 제거할 수 있다. 일부 구체예들에서, 이 시료는 RNAe 처치에 앞서 단백질 복합체로부터 microRNA를 제거하기 위하여 물질로 처리된다. 단백질을 분해하는 효소, 가령, 프로테아제 이를 테면 프로테아제 K 또는 트립신, 또는 임의의 기타 적절한 효소일 수 있다. 이 방법을 이용하여 순환하는 단백질 복합체 안에 자유 miRNA 또는 miRNA와는 별로도 소낭안에 포함된 microRNA 분획을 평가함으로써 본 명세서에서 기술된 방법에 따라 표현형을 특징화할 수 있다.
생물지표 탐지
여기에서 설명된 것과 같이, microRNA, 단백질, 소낭 또는 다른 생물지표들과 같은 순환하는 생물지표들의 존재, 수준 또는 농도를 탐지함으로써 생체특징을 정성적으로 또는 정량적으로 탐지할 수 있다. 이들 생체특징 성분들은 당업계에 공지되어 다양한 기술을 이용하여 탐지할 수 있다. 예를 들면, 생물지표는 마이크로어래이 분석, 폴리머라제 쇄 반응 (PCR) (PCR-기반 방법들 가령, 실시간 폴리머라제 쇄 반응 (RT-PCR), 정량적 실시간 폴리머라제 쇄 반응 (Q-PCR/qPCR) 그리고 이와 유사한 것들), 대립형질-특이적 프로브와의 혼성화, 효소 돌연변이 탐지, 결찰(ligation) 쇄 반응 (LCR), 올리고뉴클레오티드 결찰(ligation) 분석 (OLA), 유동-세포분석 헤테로듀플렉스 분석, 미스메취의 화학적 절단, 질량 분석, 핵산 서열화, 단일 스트랜드 구조 다형성 (SSCP), 변성 그라디언트 겔 전기영동 (DGGE), 온도 그라디언트 겔 전기영동 (TGGE), 제한(restriction) 단편 다형성, 유전자 발현 (S나이)의 일련의 분석, 또는 이의 조합들을 이용하여 탐지할 수 있다. 생물지표, 가령, 핵산을 탐지하기 전에 증폭시킬 수 있다. 생물지표는 또한 면역분석, 면역 블랏, 면역침전, 효소-연결된 면역흡착 분석 (ELISA; EIA), 방사능면역분석 (RIA), 유동 세포분석법, 또는 전자 현미경 (EM)으로 탐지할 수 있다.
생체특징은 여기에서 설명된 것과 같이, 캡쳐 물질과 탐지 물질을 이용하여 탐지할 수 있다. 캡쳐 물질은 항체, 압타머 또는 생물지표를 인지하는 다른 엔터티를 포함할 수 있으며, 그리고 이 생물지표를 캡쳐하는데 이용할 수 있다. 캡쳐될 수 있는 생물지표들은 순환하는 생물지표들, 가령, 체액 용액내 단백질, 핵산, 지질 또는 생물학적 복합체를 포함한다. 유사하게, 캡쳐 물질을 이용하여 소낭을 캡쳐할 수 있다. 탐지 물질은 생물지표를 인지하는 항체 또는 다른 엔터티를 포함할 수 있고, 그리고 소낭의 생물지표 소낭을 탐지하거나, 또는 소낭을 인지하여, 소낭을 탐지하는데 유용한 생물지표를 탐지하는데 이용할 수 있다. 일부 구체예들에서, 탐지 물질은 라벨되고, 그리고 라벨을 탐지하여, 이로 인하여 이 생물학적지표 또는 소낭을 탐지한다. 탐지 물질은 결합물질, 가령, 항체 또는 압타머일 수 있다. 다른 구체예들에서, 탐지 물질은 작은 분자 가령, 막 단백질 라벨링 물질을 포함한다. 가령, Alroy et al.,의 미국 특허 공개 2005/0158708에 공개된 막 단백질 라벨링 물질을 포함한다. 한 구체예에서, 소낭은 여기에서 설명된 것과 같이, 단리 또는 캡쳐하고, 하나 이상의 막 단백질 라벨링 물질을 이용하여 이 소낭을 탐지한다. 많은 경우에서, 캡쳐 및 탐지 물질에 의해 인지되는 항원 또는 다른 소낭-모이어티는 호환가능하다. 비-제한적 예로써, 소낭의 표면에 기원-세포 특이적 항원과 암-특이적 항원을 보유하는 소낭을 고려한다. 한 경우에서, 가령, 이 캡쳐 항체를 기질에 묶고, 그리고 이 암-특이적 항원에 대한 항체를 이용하여 이 소낭을 탐지하는데, 가령, 형광 염료로 탐지 항체를 라벨링하고, 그리고 염료에 의해 방출되는 형광 방사능을 탐지함으로써, 기원 세포 특이적 항원에 대한 항체를 이용하여 소낭을 캡쳐할 수 있다. 또다른 경우에, 암 특이적 항원, 가령, 이 캡쳐 항체를 기질에 묶고, 그리고 기원 세포에 대한 항체를 이용하여 이 소낭을 탐지하는데 가령, 형광 염료로 탐지 항체를 라벨링하고, 그리고 염료에 의해 방출되는 형광 방사능을 탐지함으로써, 암 세포 특이적 항원에 대한 항체를 이용하여 소낭을 캡쳐할 수 있다.
일부 구체예들에서, 동일한 생물지표는 캡쳐 물질과 탐지 물질 모두에 의해 인지된다. 이 계획은 환경에 따라 이용할 수 있다. 한 구체예에서, 이 생물지표는 관심 대상의 소낭, 가령, 기원 세포 특이적 소낭을 탐지하는데 충분하다. 다른 구체예들에서, 이 생물지표는 다기능성(multifunctional), 가령, 기원 세포 특이적 그리고 암 특이적 성질들을 모두 보유한다. 이 생물지표는 캡쳐 및 탐지를 위한 다른 생물지표들과 함께 이용할 수 있다.
생물지표를 탐지하는 한 가지 방법은 상기에서 설명한 것과 같이, 생물학적 시료로부터 이종 소낭 집단을 정제 또는 단리하고, 그리고 샌드위치 분석을 실행하는 것을 포함한다. 집단내 소낭은 캡쳐 물질로 캡쳐할 수 있다. 캡쳐 물질은 캡쳐 항체, 가령, 원발성 항체일 수 있다. 이 캡쳐 항체는 기질, 예를 들면, 어래이, 웰, 또는 미립자에 결합할 수 있다. 캡쳐된 또는 결합된 소낭은 탐지 물질, 가령, 탐지 항체로 탐지할 수 있다. 예를 들면, 이 탐지 항체는 소낭의 항원을 위한 것일 수 있다. 이 탐지 항체는 직접적으로 라벨하거나 또는 탐지할 수 있다. 대안으로, 탐지 물질은 이 탐지 물질과 반응할 수 있는 효소 연결된 2차 항체를 통하여 간접적으로 라벨하고 탐지할 수 있다. 가령, PCT 공개 번호 WO2009092386에서 설명된 것과 같이, 탐지 시약 또는 탐지 기질을 추가할 수 있고, 반응을 탐지할 수 있다. 설명을 위한 예에서 여기에서 캡쳐 물질은 Rab-5b에 결합하고, 그리고 탐지 물질은 CD63 또는 카베올린-1에 결합하고 또는 탐지하며, 캡쳐 물질은 항-Rab 5b 항체이고, 그리고 탐지 물질은 항-CD63 또는 항-카베올린-1 항체일 수 있다. 일부 구체예들에서, 캡쳐 물질은 CD9, PSCA, TNFR, CD63, B7H3, MFG-E8, EpCam, Rab, CD81, STEAP, PCSA, PSMA, 또는 5T4일 수 있다. 예를 들면, 캡쳐 물질은 CD9, PSCA, TNFR, CD63, B7H3, MFG-E8, EpCam, Rab, CD81, STEAP, PCSA, PSMA, 또는 5T4에 대한 항체일 수 있다. 캡쳐 물질은 또한 MFG-E8, 어넥신 V, 조직 인자, DR3, STEAP, epha2, TMEM211, unc93A, A33, CD24, NGAL, EpCam, MUC17, TROP2, 또는 TETS에 대한 항체일 수 있다. 탐지 물질은 CD63, CD9, CD81, B7H3, 또는 EpCam에 결합하거나 또는 탐지하는 물질, 가령, CD63, CD9, CD81, B7H3, 또는 EpCam에 대한 탐지 항체 또는 압타머일 수 있다. 캡쳐 및/또는 탐지 물질의 다양한 조합을 동시에 이용할 수 있다. 한 구체예에서, 캡쳐 물질은 PCSA, PSMA, B7H3 과선택적으로 EpCam을 포함하고, 그리고 탐지 물질은 하나 이상의 일반 소낭 생물지표, 가령, 테트라스파닌 가령, CD9, CD63 및 CD81을 포함한다. 또다른 구체예에서, 캡쳐 물질은 TMEM211 및 CD24을 포함하고, 그리고 탐지 물질은 하나 이상의 테트라스파닌 가령, CD9, CD63 및 CD81을 포함한다. 또다른 구체예에서, 캡쳐 물질은 CD66 및 EpCam을 포함하고, 탐지 물질은 하나 이상의 테트라스파닌 가령, CD9, CD63 및 CD81을 포함한다. 캡쳐 물질 및/또는 탐지 물질은 하나 또는 그 이상의 CD9, Erb2, Erb4, CD81, Erb3, MUC16, CD63, DLL4, HLA-Drpe, B7H3, IFNAR, 5T4, PCSA, MICB, PSMA, MFG-E8, Muc1, PSA, Muc2, Unc93a, VEGFR2, EpCAM, VEGF A, TMPRSS2, R나이*, PSCA, CD40, Muc17, IL-17-RA, 그리고 CD80을 포함하는 항원일 수 있다. 예를 들면, 캡쳐 물질 및/또는 탐지 물질은 하나 또는 그 이상의 CD9, CD63, CD81, B7H3, PCSA, MFG-E8, MUC2, EpCam, R나이 그리고 Muc17에 대한 것일 수 있다. 이러한 테트라스파닌 및/또는 다른 일반적 소낭 지표들의 수를 증가시키면, 일부 경우에서 탐지 신호를 개선시킬 수 있다. 단백질들 또는 다른 순환하는 생물지표들은 샌드위치 접근법을 이용하여 또한 탐지할 수 있다. 캡쳐된 소낭을 수거하고, 여기에 포함된 페이로드 가령, mRNA, microRNA, DNA 및 가용성 단백질을 분석할 수 있다.
일부 구체예들에서, 캡쳐 물질은 EpCam, B7H3, R나이 또는 CD24에 결합하거나 표적으로 하고, 그리고 이 소낭에서 탐지된 하나 이상의 생물지표들은 CD9 및/또는 CD63이다. 한 구체예에서, 캡쳐 물질은 EpCam에 결합하거나 표적으로 하고, 그리고 이 소낭에서 탐지된 하나 이상의 생물지표들은 CD9, EpCam 및/또는 CD81이다. 단일 캡쳐 물질은 CD9, PSCA, TNFR, CD63, B7H3, MFG-E8, EpCam, Rab, CD81, STEAP, PCSA, PSMA, 또는 5T4로부터 선택할 수 있다. 단일 캡쳐 물질은 또한 DR3, STEAP, epha2, TMEM211, unc93A, A33, CD24, NGAL, EpCam, MUC17, TROP2, MFG-E8, TF, 어넥신 V 또는 TETS에 대한 항체일 수 있다. 일부 구체예들에서, 단일 캡쳐 물질은 PCSA, PSMA, B7H3, CD81, CD9 및 CD63으로부터 선택한다
다른 구체예들에서, 캡쳐 물질은 PCSA를 표적으로 하고, 그리고 캡쳐된 소낭에서 탐지된 하나 이상의 생물지표들은 B7H3 및/또는 PSMA이다. 다른 구체예들에서, 캡쳐 물질은 PSMA를 표적으로 하고, 그리고 캡쳐된 소낭에서 탐지된 하나 이상의 생물지표들은 B7H3 및/또는 PCSA이다. 다른 구체예들에서, 캡쳐 물질은 B7H3을 표적으로 하고, 그리고 캡쳐된 소낭에서 탐지된 하나 이상의 생물지표들은 PSMA 및/또는 PCSA이다. 추가 다른 구체예들에서, 캡쳐 물질은 CD63을 표적으로 하고, 그리고 이 소낭에서 탐지된 하나 이상의 생물지표들은 CD81, CD83, CD9 및/또는 CD63이다. 여기에서 설명된 상이한 캡쳐 물질과 생물지표 조합을 이용하여 표현형을 특징화할 수 있는데, 가령, 질환, 가령, 암의 탐지, 진단 또는 예후할 수 있다. 일부 구체예들에서, EpCam를 표적으로 하는 캡쳐 물질과 CD9 및 CD63의 탐지를 이용하여; PCSA를 표적으로 하는 캡쳐 물질과 B7H3 및 PSMA의 탐지를 이용하여; 또는 CD63의 캡쳐 물질과 CD81의 탐지를 이용하여, 전립선 암을 특정화하기 위하여 소낭을 분석한다. 다른 구체예들에서, CD63을 표적으로 하는 캡쳐 물질과 CD63의 탐지, 또는 CD63의 탐지와 연관된 CD9를 표적으로 하는 캡쳐 물질을 이용하여, 결장암을 특징화하는데 소낭을 이용한다. 당업자는 캡쳐 물질 및 탐지 물질의 표적들을 서로 호환할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 설명을 위한 예에서, PCSA를 표적으로 하는 캡쳐 물질과 B7H3 및 PSMA를 표적으로 하는 탐지 물질을 고려한다. 이들 지표들 모두 PCa 유도된 소낭을 탐지하는데 유용하기 때문에, 캡쳐 물질에 의해 B7H3 또는 PSMA를 표적으로 할 수 있고, 그리고 탐지 물질에 의해 PCSA를 인지할 수 있다. 예를 들면, 일부 구체예들에서, 탐지 물질은 PCSA를 표적으로 하고, 그리고 이 소낭을 캡쳐하는데 이용하는 하나 이상의 생물지표들은 B7H3 및/또는 PSMA를 이용한다. 다른 구체예들에서, 탐지 물질은 PSMA를 표적으로 하고, 그리고 이 소낭을 캡쳐하는데 이용하는 하나 이상의 생물지표들은 B7H3 및/또는 PCSA를 포함한다. 다른 구체예들에서, 탐지 물질은 B7H3을 표적으로 하고, 그리고 이 소낭을 캡쳐하는데 이용하는 하나 이상의 생물지표들은 PSMA 및/또는 PCSA를 포함한다. 일부 구체예들에서, 본 발명은 PSMA, B7H3 및/또는 PCSA에 대한 캡쳐 물질 및/또는 탐지 물질을 이용하여 체액에서 전립선암 세포들을 탐지하는 방법을 제공한다. 이 체액은 혈청 또는 혈장을 포함하는 혈액을 포함할 수 있다. 이 체액은 사정액 또는 정자를 포함할 수 있다. 추가 구체예들에서, 전립선암을 탐지하는 방법들은 CD81, CD83, CD9 및/또는 CD63에 대한 캡쳐 물질 및/또는 탐지 물질을 더 이용한다. 이 방법은 GI 장애를 특징화하는 방법을 더 제공하는데, 하나 이상의 DR3, STEAP, epha2, TMEM211, unc93A, A33, CD24, NGAL, EpCam, MUC17, TROP2, 및 TETS으로 소낭을 캡쳐하고, 그리고 하나 이상의 일반적 소낭 항원, 가령, CD81, CD63 및/또는 CD9으로 캡쳐된 소낭을 탐지하는 것을 포함한다. 추가 물질은 테스트 성과를 개선시킬 수 있는데, 가령, 추가 생물학적 분별력을 제공함으로써 및/또는 실험 노이즈를 감소시킴으로써 테스트 정확성 또는 AUC를 개선시킬 수 있다.
본 발명에 이용하기 위한 생물지표들을 탐지하는 기술은 특정 생체특징의 탐지를 용이하게 하는 캡쳐 물질로 기질에 고정된 분자들을 가진 평면 기질 가령, 어래이 (가령, 바이오칩 또는 마이크로어래이)의 사용을 포함한다. 어래이는 하나 이상의 생물지표들 또는 소낭을 분석하기 위한 키트의 일부로 제공할 수 있다. 상기에서 설명된 것과 같은 그리고 2011년 4월 6일자로 제출된 국제 특허 출원 번호 PCT/US2011/031479, "Circulating Biomakers for Disease"(이들은 전문이 여기에 참고자료로 편입된다)의 도 1 또는 도 3-60에서 설명한 생물지표들과 뿐만 아니라 항원들을 확인하는 분자를 전조이전(presymptomatic) 질환을 포함하는 질환의 탐지 및 진단을 위하여 어래이에 포함시킬 수 있다. 일부 구체예들에서, 어래이는 특히 관심 대상의 생물지표들을 확인하기 위하여 선택한 생물분자를 포함하는 맞춤형(custom) 어래이를 포함한다. 주문형 어래이를 변형시켜 통계학적 성과를 증가시키는 생물지표들을 탐지할 수 있는데, 가령, 다변령 예측 모델(가령, 로직 회귀, 분별 분석, 또는 회귀 트리 모델)에서 개선된 교차-유효화된 오류 비율을 유도하는, 생체특징을 확인하는 생물분자들을 추가한다. 일부 구체예들에서, 주문형 어래이(들)을 작제하여 질환, 상태 또는 증후군의 생리학을 연구하고 그리고 특정화된 생리학적 상태에서 생체특징을 프로파일한다. 주문형 어래이에 포함시킬 지표들은 통계학적 기준에 근거하여 선택하는데, 가령, 표현형 또는 생리학적 상태를 구별하는데 있어서 통계학적으로 유의적인 바람직한 수준을 가진 것을 근거하여 선택한다. 일부 구체예들에서, p-값 = 0.05인 표준 유의성은 마이크로어래이에 생물분자들의 배체 또는 포함하기 위하여 선택한다. 다중 비교를 위하여 p-값를 수정할 수 있다. 설명을 위한 예로서, 질환이 있거나 또는 없는 피험자의 시료로부터 추출한 핵산을 수천개의 유전자 서열들에 결합하는 고밀도 마이크로어래이에 혼성화할 수 있다. 핵산의 수준은 이 질환이 있는 시료와 없는 시료 간에 상당히 상이한 핵산을 이 질환을 가진 또는 가지지 않은 시료들을 구별하는 생물지표로 이용하기 위하여 선택할 수 있다. 주문형 어래이를 작제하여 선택된 생물지표들을 탐지할 수 있다. 일부 구체예들에서, 주문형 어래이는 저밀도 마이크로어래이를 포함하는데, 이는 더 적은 수의 접근가능한 결합물질, 가령, 수천개 대신 수십 또는 수백개의 물질을 가진 어래이를 지칭한다. 저밀도 어래이는 기질 상에 형성될 수 있다. 일부 구체예들에서, 맞춤가능한 저밀도 어래이는 플레이트 웰, 가령, TaqMan® Gene 발현 Assay (Applied Biosystems by Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA)에서 PCR 증폭을 이용한다.
평면 어래이는 어래이 포맷에서 생물분자들의 접근가능한 위치(가령, 패드, 어드래스 또는 마이크로-위치)를 포함한다. 어래이의 크기는 조성물과 어래이의 최종 용도에 따라 달라질 것이다. 어래이는 2가지 상이한 분자들 내지 수천가지 분자들을 포함하도록 만들 수 있다. 일반적인으로, 어래이는 어래이의 최종 용도 및 제조 방법에 따라, 2개 내지 100,000개 또는 그 이상 분자들을 포함한다. 본 발명에 이용하는 마이크로어래이는 관심 대상의 생체특징, 가령, microRNA 또는 이 생체 특징을 구성하는 다른 생물분자 또는 소낭에 존재하는 생물지표들을 확인 또는 캡쳐하는 최소한 하나의 생물분자를 포함한다. 일부 어래이에서, 상이한 또는 동일한 조성물들의 다중 기질을 이용한다. 따라서, 평면 어래이는 다수의 더 작은 기질을 포함할 수 있다.
본 발명은 생물지표, 가령, 관심 대상의 생체특징과 관련된 생물지표을 탐지하기 위한 많은 유형의 어래이를 이용할 수 있다. 유용한 어래이 또는 마이크로어래이는 DNA 마이크로어래이, 가령, cDNA 마이크로어래이, 올리고뉴클레오티드 마이크로어래이 및 SNP 마이크로어래이, microRNA 어래이, 단백질 마이크로어래이, 항체 마이크로어래이, 조직 마이크로어래이, 세포성 마이크로어래이 (형질감염(transfection) 마이크로어래이라고도 부름), 화학적 화합물 마이크로어래이, 그리고 탄수화물 어래이 (당(glyco)어래이)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이들 어래이는 상기에서 상세하게 설명한다. 일부 구체예들에서, 마이크로어래이는 인지 분자들(가령, 항체들)의 고밀도 고정된 어래이를 제공하는 바이오칩을 포함하는데, 여기에서 생물지표 결합은 간접적으로 (가령, 형광을 통하여) 모니터된다. 도 2A는 관심 대상의 소낭 항원에 대한 캡쳐 항체들이 표면에 연결된 설명용 배치를 보여준다. 그 다음 캡쳐된 소낭은 관심 대상의 동일한 또는 상이한 소낭 항원들에 대항한 검출자 항체들을 이용하여 탐지한다. 캡쳐 항체들은 이용가능한 그리고 바람직한 연결된 압타머들로 치환될 수 있다. 형광 검출자가 보인다. 다른 검출자들 가령, 효소 반응, 탐지가능한 나노미립자, 방사능라벨들, 및 이와 유사한 것들도 유사하게 이용할 수 있다. 다른 구체예들에서, 어래이는 생화학적 또는 분자간 상호작용에 의해 단백질들을 캡쳐하는 포맷을 포함하고, 그리고 질량 분석 (MS)으로 탐지하도록 연결되어 있다. 이 소낭은 표면으로부터 용리시킬 수 있고, 내부의 페이로드, 가령, microRNA를 분석할 수 있다.
생체특징의 하나 이상의 생물지표들을 탐지하는데 이용할 수 있는 어래이 또는 마이크로어래이는 미국 특허 제6,329,209호; 제6,365,418호; 제6,406,921호; 제6,475,808호; 그리고 제6,475,809호, 그리고 미국 특허 출원 번호 10/884,269에서 설명하는 방법들에 따라 만들 수 있고, 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 통합된다. 여기에서 설명된 생물지표들의 세트의 특이적 선별을 탐지하기 위한 맞춤 어래이는 이들 특허에서 설명하는 방법들을 이용하여 만들 수 있다. 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는 시판되는 이용가능한 마이크로어래이는 본 발명의 방법들을 실행하는데 또한 이용할 수 있다: Affymetrix (Santa Clara, CA), Illumina (San Diego, CA), Agilent (Santa Clara, CA), Exiqon (Denmark), or Invitrogen (Carlsbad, CA). 맞춤 및/또는 시판되는 어래이는 여기에서 설명된 단백질들, 핵산, 그리고 다른 생물학적 분자들 및 엔터티 (가령, 세포들, 소낭, virii)을 탐지하기 위한 어래이를 포함한다.
일부 구체예들에서, 어래이에 고정시키는 분자들은 단백질들 또는 펩티드들을 포함한다. 하나 이상의 유형의 단백질들을 표면에 고정시킬 수 있다. 특정 구체예들에서, 단백질들의 변성을 최소화시키고, 단백질들의 활성의 변경을 최소화시키는, 또는 단백질과 이 단백질이 고정된 표면 사이에 상호작용을 최소화시키는 방법들 및 재료들을 이용하여 단백질을 고정시킨다.
유용한 어래이 표면은 임의의 바람직한 모양, 형태, 또는 크기를 가질 수 있다. 표면의 비-제한적인 예는 칩, 연속 표면, 곡선화된 표면, 유연성 표면, 필름, 플레이트, 쉬트 또는 튜브를 포함한다. 표면은 대략 미크론 제곱 내지 대략 500 ㎠ 범위의 면적을 가질 수 있다. 표면의 면적, 길이 및 폭은 실행할 분석의 요구조건에 따라 변할 수 있다. 고려사항은 예를 들면, 취급의 용이성, 표면을 형성하는 물질의 제한, 탐지 시스템의 요구사항들, 침착 시스템 (가령, 어래이어)의 요구사항, 또는 이와 유사한 것들을 포함할 수 있다.
특정 구체예들에서, 결합 섬 또는 고정된 생물분자들의 집단 또는 어래이를 분리하기 위한 물리적 수단을 이용하는 것이 바람직한데: 이러한 물리적 분리는 관심 대상의 상이한 용액에 상이한 집단 또는 어래이의 노출을 용이하게 한다. 따라서, 특정 구체예들에서, 어래이는 임의의 수의 웰을 보유하는 마이크로웰 플레이트 안에 위치한다. 이러한 구체예들에서, 웰의 바닥은 어래이의 형성을 위한 표면으로 작용할 수 있거나, 또는 어래이를 다른 표면에서 만들고, 그 다음 웰안에 위치시킬 수 있다. 특정 구체예들에서, 가령, 웰이 없는 표면을 이용할 경우, 결합 섬을 형성하거나 또는 분자들을 표면에 고정시키고, 그리고 섬 또는 생물분자에 대응하도록 공간적으로 구멍이 배열되어 있는 가스켓(gasket)을 이 표면에 위치시킬 수 있다. 이러한 가스켓은 바람직하게는 액체가 스미들지 않는다. 가스켓은 어래이를 만드는 과정 동안 임의의 시점에 표면에 위치시키고, 그리고 집단 또는 어래이의 분리가 더 이상 필요하지 않을 때 제거할 수 있다.
일부 구체예들에서, 고정된 분자들은 고정된 분자들과 접촉하는 생물학적 시료 안에 존재하는 하나 이상의 생물지표들 또는 소낭에 결합할 수 있다. 일부 구체예들에서, 고정된 분자들은 고정된 분자들과 접촉하는 하나 이상의 소낭 안에 존재하는 분자들을 변형시키거나 이 분자들에 의해 변형된다. 시료와의 접촉은 전형적으로 어래이 상에 시료를 씌우는 것을 포함한다.
어래이 상의 용액내 또는 고정된 분자들의 변형 또는 결합은 당업계에 공지되어 있는 탐지 기술을 이용하여 탐지할 수 있다. 이러한 기술들의 예는 면역학적 기술 가령, 경쟁적 결합분석과 샌드위치 분석; 가령, 공촛점 스캐너, 공촛점 현미경, 또는 CCD-기반 시스템을 이용하는 형광 탐지 그리고 기술 가령, 형광, 형광 편광 (FP), 형광 공명 에너지 전달 (FRET), 전체 내부 반사 형광 (TIRF), 형광 대비 분광기 (FCS); 발색/분광 기술; 표면에서 흡수된 재료의 양의 변화를 측정하는 표면 플라스몬 공명; 통상적인 방사성 동위원소 결합 및 섬광 근접 분석 (SPA)을 포함하는 방사성 동위원소를 이용하는 기술; 질량 분광기, 가령, 매트릭스-지원된 레이져 탈리/전리 질량 분광기 (MALDI)와 MALDI-time of flight (TOF) 질량 분광기; 단백질 필름의 두께를 측정하는 광학적 방법인, 편광해석법; 표면에 흡수되는 재료들의 양을 측정하는 고감도 방법인 석영 결정 미량천정(QCM); 주사 프로브 현미경, 가령, 원자력 현미경(AFM), 주사력 현미경(SFM) 또는 주사 전자 현미경 (SEM); 그리고 기술 가령, 전기화학적, 임피던스, 음향, 마이크로파, 그리고 IR/Raman 탐지를 포함한다. Mere L, et al.,"Miniaturized FRET analysis and microfluidics: key 성분들 for ultra-high-throughput screening," 약물 발견 Today 4(8):363-369 (1999), and references cited therein; Lakowicz J R, Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2nd Edition, Plenum Press (1999), or Jain KK: Integrative Omics, Pharmacoproteomics, and Human Body Fluids. In: Thongboonkerd V, ed., ed. Protemicss of Human Body Fluids: Principles, Methods and Applications. Volume 1: Totowa, N.J.: Humana Press, 2007 참고, 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 통합된다.
마이크로어래이 기술을 질량 분광기 (MS) 분석 및 다른 도구들과 복합할 수 있다. 질량분석계에 전자분무 인터페이스를 마이크로유체 장치 안의 모세관에 통합시킬 수 있다. 예를 들면, 시판되는 한 가지 이용가능한 시스템은 독특하고, 잘 한정된 전기영동적 이동성을 가진 형광 라벨인 eTag 리포터를 포함한다; 각 라벨은 절단가능한 링키지를 통하여 생물학적 또는 화학적 프로브들에게 연결된다. 각 eTag 리포터의 명백한 이동성 어드레스로 이들 테그 혼합물을 모세 전기영동에 의해 신속하게 해체하고, 그리고 정량화할 수 있다. 이 시스템은 동일한 시료로부터 유전자 발현, 단백질 발현 및 단백질 기능 분석을 동시에 한다. Jain KK: Integrative Omics, Pharmacoproteomics, and Human Body Fluids. In: Thongboonkerd V, ed., ed. Proteomics of Human Body Fluids: Principles, Methods and Applications. Volume 1: Totowa, N.J.: Humana Press, 2007, 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 통합된다.
바이오칩은 마이크로유체 또는 나노유체 분석을 위한 성분들을 포함할 수 있다. 마이크로유체 장치를 이용하여 생물지표들의 단리 또는 분석, 가령, 생체특징을 결정할 수 있다. 마이크로유체 시스템은 소낭의 단리, 캡쳐 또는 탐지, microRNA의 탐지, 순환하는 생물지표의 탐지, 생체특징의 탐지의 하나 이상의 프로세스, 그리고 다른 프로세스의 최소화 및 구분을 허용한다. 마이크로유체 장치들은 시스템의 최소한 한 측면에서 하나 이상의 탐지 시약을 이용하고, 그리고 이러한 탐지 시약을 이용하여 하나 이상의 생물지표들을 탐지할 수 있다. 한 구체예에서, 이 장치는 단리된 또는 결합된 소낭에서 생물지표를 탐지한다. 다양한 프로브들, 항체들, 단백질들, 또는 다른 결합물질을 이용하여 마이크로유체 시스템 안에 있는 생물지표를 탐지할 수 있다. 탐지 물질은 마이크로유체 장치의 상이한 격실내에 고정될 수 있거나 또는 장치의 다양한 채널을 통하여 혼성화 또는 탐지 반응으로 진입할 수 있다.
마이크로유체 장치 안의 소낭은 용해될 수 있고, 이의 내용물, 가령, 단백질들 또는 핵산, 가령, DNA 또는 RNA 가령, miRNA 또는 mRNA는 마이크로유체 장치 내에서 탐지된다. 이 핵산은 탐지 이전에 증폭되거나, 또는 마이크로유체 장치 안에서 직접적으로 탐지할 수 있다. 따라서, 마이크로유체 시스템은 또한 다양한 생물지표들의 다중 탐지에 이용할 수 있다. 한 구체예에서, 마이크로유체 장치 안에서 소낭을 캡쳐하고, 캡쳐된 소낭은 해리되며, 이 소낭 페이로드로부터 microRNA의 생체특징을 결정한다. 이 생체특징은 이 소낭을 캡쳐하는데 이용하는 캡쳐 물질을 더 포함할 수 있다.
신규한 나노직조(nanofabrication) 기술은 이종(heterogeneous) 나노어래이로 알려진 뉴클레오티드-기반 칩 및 단백질 어래이와 같은 고밀도, 정밀 어래이의 직조에 의존하는 바이오센싱 이용에 대한 가능성을 열어둔다. 나노유체는 마이크로칩에서 유체 분석물의 양을 나노리터 수준으로 더 감소시킬 수 있고, 여기에서 이용된 칩을 나노칩(nanochips)이라고 한다(가령, Unger M et al., Biotechniques 1999; 27(5):1008-14, Kartalov EP et al., Biotechniques 2006; 40(1):85-90, 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 통합된다) 시판되는 현재 이용가능한 나노칩은 간단한 일단계 분석 가령, 전체 콜레스테롤, 전체 단백질 또는 포도당 분석을 제공하는데, 이는 시료와 시약을 복합하고, 혼합하고, 반응을 모니터링하여서 진행할 수 있다. 액체 크로마토그래피 (LC)에 근거한 겔-없는 분석법 및 nanoLC 분리 (Cutillas et al. Protemics, 2005;5:101-112 and Cutillas et al., Mol Cell Protemics 2005;4:1038-1051, 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 통합된다)을 나노칩과 복합하여 이용할 수 있다.
질환, 상태, 증후군 또는 생리학적 상태를 확인하는데 적합한 어래이는 키트에 포함될 수 있다. 키트는 비-제한적 예로써, 어래이의 결합 섬 또는 영역 상에 고정되는 분자들을 준비하는데 유용한 하나 또는 그 이상의 시약, 고정된 분자들에게 소낭의 결합을 탐지하는데 유용한 시약, 그리고 이용 지침을 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
생물학적 시료 안에서 특정 생체특징의 탐지를 용이하게 하는 신속한 탐지 장치를 여기에서 더 제공한다. 이 장치는 칩 상에서 생물학적 시료 준비물에 폴리머라제 쇄 반응 (PCR)을 통합시킬 수 있다. 이 장치는 생물학적 시료 안에서 특정 소낭의 생체특징의 탐지를 용이하게 할 수 있으며, 그리고 Pipper et al., Angewandte Chemie, 47(21), p. 3900-3904 (2008)에서 설명한 것과 같은 예가 제공되며, 전문이 여기에 참고자료로 통합된다. 마이크로-/나노-전기화학적 시스템 (MEMS/NEMS) 센스와 Li et al., Adv Dent Res 18(1): 3-5 (2005)(전문이 여기에 참고자료로 통합된다)에서 설명하는 것과 같은 진단용 구강 유체를 이용하여 생체특징을 병합시킬 수 있다.
여기에서 설명된 것과 같이, 평면 어래이에 대한 대안으로, 미립자를 이용한 분석, 가령, 비드 기반 분석은 유동 세포분석법과 복합하여 이용할 수 있다. 높은 감응성 자동제어와 일관되는 특이적 활성을 가진 동족 리간드 및 리포트 분자들을 가진 비드 코팅을 이용하여 다중 매개변수적 분석 또는 다른 고처리량 탐지 분석을 이용할 수 있다. 비드 기반 분석 시스템에서, 생물지표 또는 소낭에 대한 결합 물질, 가령, 캡쳐 물질 (가령, 캡쳐 항체)은 접근가능한 미소구체 상에 고정시킬 수 있다. 각 개체 결합분석을 위한 각 결합 물질은 별개 유형의 미소구체(가령, 마이크로비드)에 연결될 수 있고, 그리고 분석 반응은 가령, 도 2B에서 설명된 것과 같이, 미소구체의 표면에서 일어난다. 소낭의 결합물질은 비드에 연결된 캡쳐 항체일 수 있다. 별개의 형광 강도를 가진 착색된 미소구체는 이들의 적합한 결합물질 또는 캡쳐 프로브들과 함께 별도로 로딩한다. 상이한 결합물질을 운반하는 상이한 비드 세트를 맞춤형 비드 어래이를 만드는데 필요에 따라 출자할 수 있다. 비드 어래이는 그 다음 분석을 실행하기 위하여 단일 반응 용기 안에 있는 시료와 항온처리한다. 본 발명에 이용되는, 또는 본 발명에 사용하도록 채택된 마이크로유체 장치의 예는 여기에서 설명된 것들을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
고정된 캡쳐 분자 또는 결합물질을 가진 생물지표의 생성물 형성은 형광 기반 리포터 시스템으로 탐지할 수 있다(예를 들면, 도 2A-B). 이 생물지표는 형광단을 이용하여 직접적으로 라벨하거나 또는 제 2 형광으로 라벨된 캡쳐 생물분자에 의해 탐지될 수 있다. 캡쳐된 생물지표들로부터 유도된 신호 강도는 유동 세포분석기에서 측정할 수 있다. 유동 세포분석기는 이의 개별 색 코드에 의해 각 미소구체를 우선 확인할 수 있다. 예를 들면, 별개의 비드는 별개의 형광 강도로 착색하여, 상이한 강도를 가진 각 비드는 상이한 결합물질을 보유한다. 이 비드는 최소한 2가지 상이한 라벨 또는 염료로 라벨되거나 또는 착색될 수 있다. 일부 구체예들에서, 이 비드는 최소한 3가지, 4가지, 5가지, 6가지, 7가지, 8가지, 9가지, 또는 10가지 상이한 라벨들로 라벨된다. 하나 이상의 라벨 또는 염료를 가진 비드는 라벨 또는 염료의 다양한 비율 및 조합을 또한 가질 수 있다. 이 비드는 외부적으로 라벨거나 또는 착색되거나, 또는 본질적인 형광 또는 신호생성 라벨들을 보유할 수 있다.
각 개체 비드 상에 캡쳐된 생물지표들의 양은 결합된 표적에 대해 특이적인 제 2 색의 형광으로 측정할 수 있다. 이로써 동일한 실험내에서 단일 시료로부터 다중 표적들의 다중화된 정량화를 허용한다. 감응성, 신뢰성 그리고 정확성을 비교하거나 또는 표준 미량적정 ELISA 과정으로 개선될 수 있다. 비드-기반 시스템의 장점은 캡쳐 생물분자의 개별 커플링이며 또는 별개의 미소구체에 대한 소낭의 결합물질은 다중화 능력을 제공한다. 예를 들면, 도 2C에서 나타낸 것과 같이, 탐지되는 5가지 상이한 생물지표들(항원들 가령, CD63, CD9, CD81, B7H3, 및EpCam에 대한 항체들에 의해 탐지되는)과 캡쳐 소낭을 캡쳐하기 위한 20가지 생물지표들(가령, CD9, PSCA, TNFR, CD63, B7H3, MFG-E8, EpCam, Rab, CD81, STEAP, PCSA, PSMA, 5T4, 및/또는 CD24에 대한 캡쳐 항체들을 이용하여)의 조합은 대략 100가지 탐지되는 조합을 발생시킬 수 있다. 도 2C에서 "EpCam 2x"으 나타낸 것과 같이, "CD63 2X," 단일 표적에 대한 다중 항체들을 이용하여 다양한 에피토프에 대항하는 프로브 탐지에 이용될 수 있다. 또다른 실시예에서, 다중 분석은 CD24에 대한 결합 물질을 이용하여 소낭을 캡쳐하고, 그리고 CD9, CD63, 및/또는 CD81에 대한 결합 물질을 이용하여 캡쳐된 소낭을 탐지하는 것을 포함한다. 캡쳐된 소낭은 탐지 물질 가령, 항체를 이용하여 탐지할 수 있다. 탐지 물질은 여기에서 설명된 것과 같이, 직접적 또는 간접적으로 라벨할 수 있다.
최소한 2가지, 3가지, 4가지, 5가지, 6가지, 7가지, 8가지, 9가지, 10가지, 11가지, 12가지, 13가지, 14가지, 15가지, 16가지, 17가지, 18가지, 19가지, 20가지, 25가지, 50가지, 75가지 또는 100가지 상이한 생물지표들의 다중화를 실행할 수 있다. 예를 들면, 이종 소낭 집단의 분석으로 차등적으로 라벨된 다수의 미립자로 실행할 수 있다. 최소한 2가지, 3가지, 4가지, 5가지, 6가지, 7가지, 8가지, 9가지, 10가지, 11가지, 12가지, 13가지, 14가지, 15가지, 16가지, 17가지, 18가지, 19가지, 20가지, 25가지, 50가지, 75가지 또는 100가지의 차등적으로 라벨된 미립자가 있을 수 있다. 미립자는 가령, 태그로 외부적으로 라벨되거나 또는 이들 자체가 본질적으로 라벨된 것을 수 있다. 차등적으로 라벨된 각 미립자는 캡쳐 물질, 가령, 소낭에 대한 결합물질에 연결되어, 소낭의 캡쳐를 초래한다. 일반적 소낭 생물지표들, 기원 세포 특이적 생물지표들, 그리고 질환 생물지표들에 대한 캡쳐 물질을 포함하는, 다중 캡쳐 물질을 선택하여 관심 대상의 표현형을 특징화할 수 있다. 캡쳐된 소낭의 하나 이상의 생물지표들은 그 다음 다수의 결합물질에 의해 탐지할 수 있다. 결합물질은 탐지를 용이하게 하도록 직접적으로 라벨할 수 있다. 대안으로, 결합물질은 2차 물질에 의해 라벨할 수 있다. 예를 들면, 결합물질은 소낭 상의 생물지표에 대한 항체일 수 있다. 결합물질은 바이오틴에 연결된다. 2차 물질은 리포터에 연결된 스트렙타아비딘을 포함하고, 이 생물지표를 탐지하기 위하여 추가할 수 있다. 일부 구체예들에서, 최소한 2가지, 3가지, 4가지, 5가지, 6가지, 7가지, 8가지, 9가지, 10가지, 11가지, 12가지, 13가지, 14가지, 15가지, 16가지, 17가지, 18가지, 19가지, 20가지, 25가지, 50가지, 75가지 또는 100가지의 상이한 생물지표들에 대해 캡쳐된 소낭을 분석할 수 있다. 예를 들면, 다중 검출자, 가령, 캡쳐된 소낭 또는 소낭 집단의 다중 생물지표들의 탐지는 수득된 신호를 증가시킬 수 있고, 감응성, 특이성, 또는 이둘 모두의 증가를 허용하고, 더 적은 량의 시료를 이용하는 것을 허용한다. 예를 들면, 하나 이상의 일반적 소낭 지표의 탐지는 더 적은 수의 탐지 지표들, 가령, 단일 지표를 이용한 것과 비교하였을 때 신호를 개선시킬 수 있다. 설명하자면, CD9, CD63 및 CD81중 2개 또는 3가지에 대한 라벨된 결합 물질을 가진 소낭의 탐지는 테트라스파닌중 임의의 하나를 탐지한 것과 비교하여 신호를 개선시킬 수 있다.
면역분석 기반 방법 또는 샌드위치 분석을 이용하여 소낭의 생물지표를 탐지할 수 있다. 예로는 ELISA를 포함한다. 결합물질 또는 캡쳐 물질은 웰에 결합될 수 있다. 예를 들면, 소낭의 항원에 대한 항체를 웰에 부착시킬 수 있다. 캡쳐된 소낭에 있는 생물지표는 여기에서 설명된 방법들에 근거하여 탐지할 수 있다. 도2A는 면역 분석의 샌드위치-유형에 대한 설명을 위한 개요를 나타낸다. 이 캡쳐 항체는 관심 대상의 소낭 항원, 가령, 일반적 소낭 생물지표, 기원 세포 지표, 또는 질환 지표에 대한 것일 수 있다. 도면에서, 캡쳐된 소낭은 관심 소낭 항원들에 대항하는 형광으로 라벨된 항체들을 이용하여 탐지한다. 다중 캡쳐 항체들은 가령, 어래이 또는 면역분석 플레이트의 상이한 웰 상의 구별되는 어드레스에서 이용할 수 있다. 이 탐지 항체들은 이 캡쳐 항체와 동일한 항원에 대항하는 것일 수 있고, 또는 다른 지표들을 지향하는 것일 수도 있다. 이 캡쳐 항체들은 대체 결합물질, 가령, 연결된 압타머들 또는 렉틴으로 대체될 수 있고, 및/또는 검출자 항체들은 가령, 탐지가능한 (가령, 라벨된) 압타머들, 렉틴 또는 다른 결합단백질들 또는 엔터티로 유사하게 치환시킬 수도 있다. 한 구체예에서, 일반적 소낭 생물지표, 기원 세포 지표, 및/또는 질환 지표에 대한 하나 이상의 캡쳐 물질은 하나 이상의 CD9, CD63 및 CD81을 포함하나 이에 한정되지 않는 테트라스파닌 분자들에 대항하는 탐지 물질과 함께 이용한다.
도 2D는 본 발명의 방법들에 따라 소낭을 분석하는 설명을 위한 도식을 나타낸다. 캡쳐 물질을 이용하여 소낭을 캡쳐하고, 검출자를 이용하여 캡쳐된 소낭을 탐지하고, 그리고 캡쳐된 그리고 탐지된 항체들의 수준 또는 존재를 이용하여 표현형을 특징화한다. 캡쳐 물질, 검출자 및 표현형의 특징화는 여기에서 설명된 임의의 것일 수 있다. 예를 들면, 캡쳐 물질은 관심 대상의 소낭 항원을 인지하는 기질에 연결된 항체들 또는 압타머들을 포함하고, 검출자는 관심 대상의 소낭 항원에 대한 라벨된 항체들 또는 압타머들을 포함하고, 그리고 표현형의 특징화는 질환의 진단, 예후, 또는 치료진단을 포함한다. 도 2D i)에 나타낸 계획에서, 소낭의 집단은 일반적 소낭 생물지표들에 대항한 하나 이상의 캡쳐 물질로 캡쳐된다 (6300). 그 다음 캡쳐된 소낭은 기원 세포 생물지표들 (6301) 및/또는 질환 특이적 생물지표들 (6302)에 대항하는 검출자로 라벨된다. 기원 세포 검출자만을 이용한다면(6301), 표현형을 특징화하는데 이용되는 생체특징 (6303)은 일반적 소낭 지표들 (6300)과 기원 세포 생물지표들 (6301)을 포함할 수 있다. 질환 검출자만을 이용한다면(6302), 표현형을 특징화하는데 이용되는 생체특징(6303)은 일반적 소낭 지표들 (6300)과 질환 생물지표들 (6302)을 포함할 수 있다. 대안으로, 검출자를 이용하여 기원 세포 생물지표들 (6301)과 질환 특이적 생물지표들 (6302)을 모두 탐지한다. 이 경우에서, 표현형을 특징화하는데 이용되는 생체특징(6303)은 일반적 소낭 지표들 (6300), 기원 세포 생물지표들 (6301) 그리고 질환 생물지표들 (6302)을 포함할 수 있다. 이 생물지표들 조합을 선택하여 관심 대상의 표현형을 특징화하고, 그리고 여기에서 설명된 이 생물지표들과 표현형으로부터 선택할 수 있다.
도 2D ii)에서 나타낸 계획에서, 소낭의 집단은 기원 세포 생물지표들 (6310) 및/또는 질환 생물지표들 (6311)에 대한 하나 이상의 캡쳐 물질로 캡쳐한다. 그 다음 캡쳐된 소낭은 일반적 소낭 생물지표들 (6312)에 대한 검출자를 이용하여 탐지한다. 기원 세포 캡쳐 물질만 이용한 경우(6310), 표현형을 특징화하는데 이용된 생체특징 (6313)은 기원 세포 생물지표들 (6310)과 일반적 소낭 지표들 (6312)을 포함한다. 질환 생물지표 캡쳐 물질만을 이용한 경우(6311), 표현형을 특징화하는데 이용된 생체특징 (6313)은 질환 생물지표들 (6311)과 일반적 소낭 생물지표들 (6312)을 포함한다. 대안으로, 하나 이상의 기원 세포 생물지표들 (6310) 및 하나 이상의 질환 특이적 생물지표들 (6311)에 대한 캡쳐 물질을 이용하여 소낭을 캡쳐한다. 이 경우에서, 표현형을 특징화하는데 이용된 생체특징 (6313)은 기원 세포 생물지표들 (6310), 질환 생물지표들 (6311), 그리고 일반적 소낭 지표들 (6313)을 포함할 수 있다. 이 생물지표들 조합을 선택하여 관심 대상의 표현형을 특징화하고, 그리고 여기에서 설명된 이 생물지표들과 표현형으로부터 선택할 수 있다.
소낭 페이로드를 포함하는 생물지표들을 분석하여 표현형을 특징화할 수 있다. 페이로드는 소낭 막 안에 포함된 생물학적 엔터티를 포함한다. 이들 엔터티는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다: 핵산, 가령, mRNA, microRNA, 또는DNA 단편들; 단백질, 가령, 가용성 그리고 막 연관된 단백질들; 탄수화물; 지질들; 대사산물들; 그리고 다양한 작은 분자들, 가령, 호르몬. 페이로드는 소낭이 세포 환경내에서 형성되기 때문에 에워싸인 세포성 환경의 일부일 수 있다. 본 발명의 일부 구체예들에서, 페이로드를 추가로 분석하여 탐지 소낭 표면 항원들을 탐지한다. 소낭의 특이적 집단은 상기에서 설명된 것과 같이 캡쳐될 수 있고, 캡쳐된 소낭 안의 페이로드를 이용하여 표현형을 특징화할 수 있다. 예를 들면, 기질에 캡쳐된 소낭은 여기에서 페이로드를 평가하기 위하여 추가 단리시킬 수 있다. 대안으로, 시료 안의 소낭을 탐지하고, 캡쳐없이 분류한다. 탐지된 소낭을 추가 단리하여 여기에서 페이로드를 평가할 수 있다. 한 구체예에서, 소낭 집단은 유동 세포분석법에 의해 분류하고, 분류된 소낭 안에 있는 페이로드를 분석한다. 도 2E iii)에 나타낸 계획에서, 소낭의 집단은 하나 이상의 기원 세포 생물지표들 (6320), 질환 생물지표들 (6321), 그리고 일반적 소낭 지표들 (6322)을 이용하여 캡쳐 및/또는 탐지된다(6320). 소낭은 하나 또는 그 이상의 맥관생성 또는 면역조절 생물지표를 이용하여 또한 탐지될 수 있다. 단리된 소낭의 페이로드를 평가한다(6323). 페이로드안에서 탐지된 생체특징을 이용하여 표현형을 특징화한다(6324). 비-제한적인 실시예에서, 하나 이상의 관심 대상 소낭 항원들에 대항하는 항체를 이용하여 환자의 혈장 시료에서 소낭 집단을 분석할 수 있다. 항체들은 바람직한 소낭 집단을 단리하기 위하여 기질에 연결된 캡쳐 항체들일 수 있다. 대안으로, 이 항체들을 직접적으로 라벨시키고, 그리고 유동 세포분석법에 의한 분류에 의해 라벨된 소낭을 단리한다. 단리된 소낭 집단으로부터 추출된 microRNA 또는 mRNA의 존재 또는 수준을 이용하여 생체특징을 탐지할 수 있다. 이 생체특징은 그 다음 환자의 진단, 예후 또는 치료진단에 이용한다.
다른 구체예들에서, 소낭 페이로드는 소낭의 부분집합의 탐지 또는 캡쳐 없이 소낭 집단 안에서 분석한다. 예를 들면, 소낭은 원심분리, 여과, 크로마토그래피, 또는 여기에서 설명된 다른 기술을 이용하여 시료로부터 일반적으로 단리시킬 수 있다. 단리된 소낭의 페이로드는 그 다음 분석하여 생체특징을 탐지하고, 그리고 표현형을 특징화시킨다. 도 2E iv)에 나타낸 계획에서, 소낭의 집단은 단리되고(6330) 그리고 단리된 소낭의 페이로드를 평가한다(6331). 페이로드 안에서 탐지된 생체특징을 이용하여 표현형을 특징화할 수 있다(6332). 비-제한적인 실시예에서, 소낭 집단은 크기 압출 및 막 여과를 이용하여 환자의 혈장 시료로부터 단리한다. 단리된 소낭 집단으로부터 추출된 microRNA 또는 mRNA의 존재 또는 수준을 이용하여 생체특징을 탐지할 수 있다. 이 생체특징은 그 다음 환자의 진단, 예후 또는 치료진단에 이용한다.
표현형을 특징화하는 이 방법은 관심 시료 안에 소낭 집단을 평가하는 복합 기술을 이용할 수 있다. 한 구체예에서, 시료는 다양한 분획으로 나누고, 각각이 별도로 분석된다. 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 분획의 단백질 함량이 결정되고, 하나 또는 그 이상의 기타 분획의 microRNA 함량이 결정된다. 단백질 함량과 microRNA 함량이 복합되어 표현형이 특징화될 수 있다. 또다른 구체예에서, 관심 소낭이 단리되고, 그 안의 페이로드가 평가된다. 예를 들면, 주어진 표면 지표를 가진 소낭 집단은 관심 표면 지표에 대한 결합제를 이용한 친화력 격리 이를 테면 유동 세포분석 면역침전 또는 기타 면역캡쳐 기술로 단리될 수 있다. 단리된 소낭은 생물지표들 이를 테면 표면 함량 또는 페이로드에 대해 평가될 수 있다. 주어진 표면 지표를 보유하는 소낭의 생물지표 프로파일을 이용하여 표현형이 특징화될 수 있다. 비-제한적 실시예로써, PCSA+ 캡쳐 물질이 이용되어 전립선 특이적 소낭 집단이 단리될 수 있다. 표면 항원들 이를 테면 PCSA 자체, PSMA, B7H3, 또는 EpCam의 수준이 PCSA+ 소낭으로부터 평가될 수 있다. PCSA+ 안에 페이로드, 가령, microRNA 또는 mRNA 함량의 수준이 또한 평가될 수 있다. PCSA+ 소낭 집단 안에 이 지표들의 조합으로부터 생물특징이 구축될 수 있다.
펩티드 또는 단백질 생물지표는 질량 분석 또는 유동 세포분석법을 이용하여 분석할 수 있다. 소낭의 단백질체학 분석은 면역세포화학적 착색, Western 블랏팅, 전기영동, SDS-P나이, 크로마토그래피, x-ray 결정학 또는 당업계에 공지되어 있는 과정에 따른 다른 단백질 분석 기술을 이용하여 실시할 수 있다. 다른 구체예들에서, 단백질 소낭의 생체특징은 Chromy et al. J Proteome Res, 2004;3:1120-1127에서 설명된 2 D 차등 겔 전기영동을 이용하여 분석할 수 있어나(전문이 여기에 참고자료로 통합된다) 또는 Zhang et al. Mol Cell Protemics, 2005;4:144-155(전문이 여기에 참고자료로 통합된다)에서 설명된 것과 같이, 액체 크로마토그래피 질량 분석을 이용하여 분석할 수 있다. 소낭은 예를 들면, Berger et al., Am J Pharmaco게놈s, 2004;4:371-381에서 설명된 것과 같이, 활성-기반 단백질 프로파일링을 받을 수 있다(전문이 여기에 참고자료로 통합된다). 다른 구체예들에서, 소낭은 Pisitkun et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 2004; 101:13368-13373(전문이 여기에 참고자료로 통합된다)에서 설명된 것과 같이, 나노스프레이 액체 크로마토그래피-텐덤 질량 분석을 이용하여 프로파일할 수 있다, 또다른 구체예에서, 이 소낭은 예를 들면 LTQ 및 LTQ-FT 이온 프랩 질량 분석을 이용하여, 텐덤 질량 분석 (MS) 가령, 액체 크로마토그래피/MS/MS (LC-MS/MS)으로 프로파일할 수 있다. 단백질 확인을 한 후, 상대적인 정량화는 Smalley et al., J Proteome Res, 2008;7:2088-2096(전문이 여기에 참고자료로 통합된다)에서 설명된 것과 같은 스펙트럼 카운트를 비교하여 평가할 수 있다.
소낭 안의 순환하는 단백질 생물지표들 또는 단백질 페이로드의 발현 또한 확인할 수 있다. 후자 분석은 관심 대상의 집단을 캡쳐하기 위하여 캡쳐 물질을 이용한 특이적 소낭의 분리후에 선택적으로 이어질 수 있다. 한 구체예에서, 면역세포화학적 착색를 이용하여 단백질 발현을 분석한다. 시료는 완충액에서 재현탁시키고, 면역세포화학적 착색을 위하여 준비된 접착 슬라이드 상에서 세포원심분리기를 이용하여 100 x g 예를 들면, 3 분간 원심분리한다. 사이토스핀(cytospins)은 하룻밤 동안 대기-건조시킬 수 있고, 착색때가지 -80℃에서 보관한다. 그 다음 슬라이드를 고정시키고, 혈청 없는 차단 시약으로 차단시킬 수 있다. 슬라이드는 관심 대상 단백질의 발현을 탐지하기 위하여 특이적 항체로 항온처리할 수 있다. 일부 구체예들에서, 이 소낭은 단백질 발현 분석 이전에 정제되거나, 단리되거나 또는 농축되지 않는다.
소낭 페이로드를 포함하는 생체특징은 소낭 안에 대사물질 지표 또는 대사물질의 분석으로 특징화할 수 있다. 다양한 대사물질-지향적 접근법은 가령, 대사물질 표적 분석, 대사물질 프로파일링, 또는 대사 핑거프린팅으로 설명된다. 예를 들면, Denkert et al., 분자 Cancer 2008; 7: 4598-4617, Ellis et al., Analyst 2006; 8: 875-885, Kuhn et al., Clinical Cancer Research 2007; 24: 7401-7406, Fiehn O., Comp Funct 게놈s 2001;2:155-168, Fancy et al., Rapid Commun Mass Spectrom 20(15): 2271-80 (2006), Lindon et al., Pharm Res, 23(6): 1075-88 (2006), Holmes et al., Anal Chem. 2007 Apr 1;79(7):2629-40. Epub 2007 Feb 27. Erratum in: Anal Chem. 2008 Aug 1;80(15):6142-3, Stanley et al., Anal Biochem. 2005 Aug 15;343(2):195-202., Lehtimki et al., J Biol Chem. 2003 Nov 14;278(46):45915-23, 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 통합된다.
펩티드들은 Jain KK: Integrative Omics, Pharmacoproteomics, and Human Body Fluids. In: Thongboonkerd V, ed., ed. Proteimics of Human Body Fluids: Principles, Methods and Applications. Volume 1: Totowa, N.J.: Humana Press, 2007에서 설명된 시스템을 이용하여 분석할 수 있다(이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 통합된다). 이 시스템은 신체 유체 뿐만 아니라 소낭 안에 존재하는 단백질의 감응성 분자 핑거프린트(fingerprints)를 만들 수 있다. 크로마토그래피/질량 분광기와 인간 신체의 모든 적합한 대사산물의 기준 라이브러리, 예를 들면 Paradigm Genetic's Human Metabolome Project를 이용하는 시판되는 어플리케이션을 이용하여, 대사물질 생체특징을 결정할 수 있다. 대사 프로파일을 분석하는 다른 방법들은 미국 특허 제6,683,455호 (Metabometrix), 미국 특허 출원 공개 번호 20070003965 및 20070004044 (Biocrates Life Science)에서 설명된 방법들과 장치를 포함할 수 있다(이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 통합된다). 다른 단백체공학 프로파일링 기술은 Kennedy, Toxiol Lett 120:379-384 (2001), Berven et al., Curr Pharm Biotechnol 7(3): 147-58 (2006), Conrads et al., Expert Rev Proteimics 2(5): 693-703, Decramer et al., World J Urol 25(5): 457-65 (2007), Decramer et al., Mol Cell Proteiomics 7(10): 1850-62 (2008), Decramer et al., Contrib Nephrol, 160: 127-41 (2008), Diamandis, J Proteome Res 5(9): 2079-82 (2006), Immler et al., Proteiomics 6(10): 2947-58 (2006), Khan et al., J Proteome Res 5(10): 2824-38 (2006), Kumar et al., Biomarkers 11(5): 385-405 (2006), Noble et al., Breast Cancer Res Treat 104(2): 191-6 (2007), Omenn, Dis markers 20(3): 131-4 (2004), Powell et al., Expert Rev Proteiomics 3(1): 63-74 (2006), Rai et al., Arch Pathol Lab Med, 126(12): 1518-26 (2002), Ramstrom et al., Proteiomics, 3(2): 184-90 (2003), Tammen et al., Breast Cancer Res Treat, 79(1): 83-93 (2003), Theodorescu et al., Lancet Oncol, 7(3): 230-40 (2006), or Zurbig et al., Eletrophoreiss, 27(11): 2111-25 (2006)에서 설명한다.
mRNA, miRNA 또는 다른 작은 RNA의 분석을 위하여, 전체 RNA는 가령, 미국 특허 출원 공개 2008132694(전문이 여기에 참고자료로 통합된다)에서 설명된 방법들과 같은 핵산을 단리하는 임의의 공지의 방법들을 이용하여 단리할 수 있다, 이들 방법은 시판되는 이용가능한 막 기반 RNA 정제를 실행하는 키트를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일반적인으로, 키트는 세포들 및 조직들로부터 작은 규모의 RNA 준비물(30㎎ 이하), 세포들 및 조직들로부터 중간 규모의 준비물(250㎎ 이하), 그리고 세포들 및 조직들로부터 큰 규모의 준비물(1g 최대)에 이용한다. 작은 RNA를 포함하는 전체 RNA의 효과적인 분리에 이용하는 시판되는 이용가능한 다른 키트를 이용한다. 이러한 방법들을 이용하여 소낭으로부터 핵산을 단리할 수 있다.
대안으로, 미국 특허 제7,267,950호(전문이 여기에 참고자료로 통합된다)에서 설명한 방법을 이용하여 RNA를 단리할 수 있다. 미국 특허 제7,267,950호는 생물학적 시스템(세포들, 세포 단편들, 세포기관, 조직, 장기, 또는 유기체)로부터 RNA를 추출하는 방법을 설명하는데, 이때 RNA를 포함하는 용액은 RNA가 결합하는 기질과 접촉되고, RNA는 음성 압력을 제공함으로써 기질로부터 빼낸다. 대안으로, RNA는 미국 특허 출원 번호 20050059024(작은 RNA 분자의 분리를 설명하며, 전문이 여기에 참고자료로 통합된다)에서 설명하는 방법을 이용하여 단리할 수 있다, 다른 방법들은 미국 특허 출원 번호 20050208510, 20050277121, 20070238118에서 설명하고 있으며, 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 통합된다.
한 구체예에서, mRNA 발현 분석은 시료로부터 단리된 소낭으로부터 mRNA에서 실행할 수 있다. 일부 구체예들에서, 이 소낭은 기원 세포 특이적 소낭이다. 소낭으로부터 생성된 발현 패턴은 주어진 질환 상태, 질환 단계, 요법 관련된 특징, 또는 생리학적 상태의 지표일 수 있다.
한 구체예에서, 전체 RNA가 일단 단리되었다면, cDNA를 합성하고, 그리고 특이적 mRNA 표적에 대한 qRT-PCR 분석 (가령 Applied Biosystem's Taqman® 분석)을 제조업자의 프로토콜에 따라 실행하거나, 또는 발현 마이크로어래이를 실행하여 한 실험에서 매우 다양화된 발현 지표들의 세트를 볼 수 있다. 유전자 발현 프로파일을 확립하기 위한 방법들은 단백질 또는 펩티드을 코드하는 유전자에 의해 생산된 RNA 양을 결정하는 것을 포함한다. 정량적 역 전사효소 PCR (qRT-PCR), 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, 차등 디스플레이 RT-PCR, Northern 블랏 분석 또는 다른 관련된 테스트를 이용하여 실행할 수 있다. 개별 PCR 반응을 이용하여 이들 기술을 실행하는 것도 가능하지만, mRNA로부터 생성된 상보 DNA (cDNA) 또는 상보 RNA (cRNA) 를 증폭시키고, 그리고 마이크로어래이를 통하여 이를 분석하는 것 또한 가능하다.
시료 안에 miRNA 산물의 수준은 생물학적 시료에서 mRNA 발현 수준을 탐지하는데 적합한 임의의 적합한 기술을 이용하여 측정할 수 있는데, 예를 들면, Northern 블랏 분석, RT-PCR, qRT-PCR, in situ 혼성화 또는 마이크로어래이 분석을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 예를 들면, 유전자 특이적 프라이머와 표적 cDNA를 이용하여, qRT-PCR은 적은 수의 표적 miRNA (단일 및 다중 분석을 통하여) 또는 플랫포옴의 감응적 그리고 정량적 miRNA 측정을 가능하게 하고, 96-웰 또는 384-웰 플레이트 포맷을 이용하여 고처리량 측정을 실행하도록 채택할 수도 있다. 예를 들면, Ross JS et al, Oncologist. 2008 May;13(5):477-93(전문이 여기에 참고자료로 통합된다)을 참고한다. 다수의 상이한 어래이 배치와 마이크로어래이 생산을 위한 방법들은 당업계에 공지되어 있고, 그리고 하기 미국 특허에서 설명하고 있다: 미국 특허 제5,445,934호; 제5,532,128호; 제5,556,752호; 제5,242,974호; 제5,384,261호; 제5,405,783호; 제5,412,087호; 제5,424,186호; 제5,429,807호; 제5,436,327호; 제5,472,672호; 제5,527,681호; 제5,529,756호; 제5,545,531호; 제5,554,501호; 제5,561,071호; 제5,571,639호; 제5,593,839호; 제5,599,695호; 제5,624,711호; 제5,658,734호; 또는 제5,700,637호; 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 통합된다. miRNA를 프로파일링하는 다른 방법들은 Taylor et al., Gynecol Oncol. 2008 Jul;110(1):13-21, Gilad et al, PLoS ONE. 2008 Sep 5;3(9):e3148, Lee et al., Annu Rev Pathol. 2008 Sep 25 and Mitchell et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Jul 29;105(30):10513-8, Shen R et al, BMC 게놈s. 2004 Dec 14;5(1):94, Mina L et al, Breast Cancer Res Treat. 2007 Jun;103(2):197-208, Zhang L et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 May 13;105(19):7004-9, Ross JS et al, Oncologist. 2008 May;13(5):477-93, Schetter AJ et al, JAMA. 2008 Jan 30;299(4):425-36, Staudt LM, N Engl J Med 2003;348:1777-85, Mulligan G et al, 혈액. 2007 Apr 15;109(8):3177-88. Epub 2006 Dec 21, McLendon R et al, Nature. 2008 Oct 23;455(7216):1061-8, 그리고 미국 특허 제5,538,848호, 제5,723,591호, 제5,876,930호, 제6,030,787호, 제6,258,569호, 그리고 제5,804,375호에서 설명하고 있으며, 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 통합된다. 일부 구체예들에서, microRNA 패널의 어래이를 이용하여 다중 miRs의 발현을 동시에 캐낸다. Exiqon mIRCURY LNA microRNA PCR 시스템 패널 (Exiqon, Inc., Woburn, MA) 또는 the TaqMan® MicroRNA Assay 및 Array systems(Applied Biosystems (Foster City, CA))는 이러한 목적에 이용할 수 있다.
마이크로어래이 기술은 다수의 전사체 또는 miRNA의 일정한 상태의 mRNA 또는 miRNA 수준을 측정할 수 있고, 이로 인하여 조절안된 세포 증식의 개시, 정지 도는 조절을 확인하는 효과적인 도구를 제시한다. 두 가지 마이크로어래이 기술, 가령, cDNA 어래이 및 올리고뉴클레오티드 어래이를 이용할 수 있다. 이들 분석의 산물은 전형적으로 마이크로어래이 상에 공지의 위치에 있는 핵산 서열에 혼성화되는 시료의 cDNA를 탐지하는데 이용되는 라벨된 프로브로부터 수용된 신호의 강도 측정이다. 전형적으로, 이 신호의 강도는 cDNA의 양에 비례하고, 따라서 시료 세포들에서 발현된 mRNA 또는 miRNA에 비례한다. 다양한 수의 이러한 기술이 이용가능하고 그리고 유용하다. 유전자 발현을 결정하기 위한 방법들은 미국 특허 제6,271,002호(Linsley, et al.,); 미국 특허 제6,218,122호(Friend, et al.,); 미국 특허 제6,218,114호(Peck et al.,); 또는 미국 특허 제6,004,755호(Wang, et al.,)에서 설명하고 있으며, 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 통합된다.
발현 수준의 분석은 이러한 강도를 비교함으로써 실행할 수 있다. 테스트 시료와 대조군 시료에서 유전자 발현 강도의 비율 매트릭스를 생성하여 실행할 수 있다. 대조군 시료는 기준으로 이용할 수 있고, 그리고 나이, 인종 및 성별을 설명하는 상이한 기준을 이용할 수 있다. 상이한 이상 또는 질환들, 뿐만 아니라 질환 또는 상태의 상이한 단계, 뿐만 아니라 치료상의 효과를 판단하는데 상이한 기준들을 이용할 수 있다.
예를 들면, 소낭으로부터 단리된 조직을 포함한, 질환이 있는 조직으로부터 유도된 mRNA 또는 miRNA의 유전자 발현 강도를 동일한 유형의 정상 조직(가령, 질환이 있는 유방 조직 시료 대 정상 유방 조직 시료)에 있는 동일한 엔터티의 발현 강도와 비교할 수 있다. 이들 발현 강도의 비율은 테스트와 대조군 시료들 사이에 유전자 발현에서 배수-변화를 나타낸다. 대안으로, 소낭이 정상 조직(가령, 유방)에 정상적으로 존재하지 않는다면, 그러면, 당업계에 공지되어 있는 절대적인 정량화 방법들을 이용하여 정상 조직으로부터 유도한 소낭으로부터 단리된 miRNA 또는 mRNA의 요구 없이 존재하는 miRNA 분자들의 수를 특정할 수 있을 것이다.
유전자 발현 프로파일은 다양한 방법으로 또한 나타낼 수 있다. 공통적인 방법은 가공안된 형광 강도 또는 비율 매트릭스를 그래픽 덴도그람(dendogram)에 배열하는 것으로, 이때 세로는 테스트 시료들을 나타내고 그리고 가로는 유전자를 나타낸다. 유사한 발현 프로파일을 보유하는 유전자들이 서로에 대해 가까이 있도록 데이터를 배열한다. 각 유전자에 대한 발현 비율은 색으로 나타낸다. 예를 들면, 1 미만의 비율(하향-조절을 나타내는)은 스펙트럼의 청색 부분에 나타낼 수 있고, 1이상의 비율(상향-조절을 나타내는)은 스펙트럼의 적색 부분에 색으로 나타낼 수 있다. 시판되는 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어 프로그램은 이러한 데이터를 나열하는데 이용가능하다.
차등적으로 발현되는 것으로 간주되는 mRNA 또는 miRNA는 질환이 없는 개체와 비교하여 질환을 가진 환자에서 과다 또는 과소발현될 수 있다. 과다발현 및 과소발현은 일부 기준에 대해 (이를 측정하는데 이용하는 시스템에서 노이즈 원인을 넘어선) mRNA 또는 miRNA의 발현 양에서 탐지가능한 차이를 발견한다는 것을 뜻하는 상대적인 용어다. 이 경우에서, 기저선은 질환이 없는 개체에서 측정된 mRNA/miRNA 발현이다. 질환이 있는 세포들에서 관심 대상의 mRNA/miRNA는 동일한 측정 방법을 이용하여 기저 수준에 비교하여 과다 또는 과소발현될 수 있다. 본 내용에서, "질환이 있는"이란 세포들의 조절안된 증식이 일어날 때, 신체 기능의 적절한 수행을 중단 또는 혼란시키는 또는 혼란을 줄 잠재력을 가진 신체 상태의 변경을 의미한다. 개인의 유전자형 또는 표현형의 일부 측면이 질환이 있는 경우와 일치할 때, 질환을 가진 것으로 진단받는다. 그러나, 진단 또는 예후를 실행하는 작업은 질환/상태 문제의 결정의 판단 가령, 재발 또는 전이의 가능성을 결정하고 요법을 모니터링하는 것을 포함한다. 요법 모니터링에서, mRNA/miRNA 발현 프로파일이 변화되었는지 또는 정상조직과 좀더 일치하는 패턴으로 변화되었는 지를 결정하기 위하여 시간이 경과함에 따라 유전자의 발현을 비교함으로써, 주어진 요법 과정의 효과에 대한 임상적 판단을 한다.
과다 발현 및 과소 발현의 수준은 혼성화된 마이크로어래이 프로브들의 강도 측정의 배수 변화에 근거하여 구별된다. 이러한 차별을 만드는데 2X 차이가 바람직하거나 또는 0.05 미만의 p-값이 바람직하다. 즉, 질환이 있는/재발한 세포 대 정상/비-재발 세포들에서 mRNA/miRNA가 차등적으로 발현되기 전, 질환이 있는 세포는 정상 세포들보다 최소한 2배 이상 또는 2배 미만의 강도를 만든다는 것을 알았다. 배수 차이가 클수록 이 유전자를 진단 또는 예후 도구로 이용하데 더 바람직하다. 본 발명의 발현 프로파일을 위하여 선택한 mRNA/miRNA는 임상 실험 기구를 이용하여 배경을 초과하는 양으로 정상 또는 비-조절된 유전자로부터 구별되는 신호를 야기하는 발현 수준을 보유한다.
통계학적 값을 이용하여 비-조절된 mRNA/miRNA 및 노이즈로부터 조절된 mRNA/miRNA를 확실하게 구별할 수 있다. 통계학적 테스트는 다양한 시료 집단들 사이에 대부분 상당히 상이한 mRNA/miRNA를 발현한다. Student's t-테스트는 두 집단간의 상당한 차이를 발견하는데 이용하는 강력한 통계학적 테스트의 예가 된다. p-값이 더 낮을 수록, 이 유전자는 상이한 집단 간의 차이를 보여준다는 증거가 더 설들력있다. 그럼에도 불구하고, 마이크로어래이는 한 번에 하나 이상의 mRNA/miRNA를 측정하기 때문에, 수많은 통계학적 테스트를 한 번에 실행할 수 있다. 이 때문에, 확률적으로 작은 p-값을 보기는 힘들고, Sidak 보정 뿐만 아니라 무작위화/순열 실험을 이용하여 이를 조절을 할 수 있다. t-테스트에 의해 0.05 미만의 p-값은 이 유전자가 상당히 상이하다는 증가다. Sidak 보정을 포함한 후, 0.05 미만의 p-값은 좀더 강력한 증가다. 각 집단에서 상당 수의 시료에 대해, 무작위화/순연 테스트 후에 0.05 미만의 p-값은 유의적 차이의 가장 강력한 증거다.
한 구체예에서, 진단, 예후, 요법-관련된, 또는 생리학적 상태 특이적 생체특징 수치를 가능하게 하도록 하기 위한 사후확률(posterior probaility) 수치를 생성하는 방법은 통계학적으로 유의적인 숫자의 환자로부터 순환하는 생물지표 발현 데이터를 수득하고; 선택된 생물지표들을 수득하기 위하여 이들 데이터에 선형 차별 분석을 적용하고; 그리고 사후 확률 수치로 적용할 수 있는 예측 모델을 얻기 위하여 식별 기능 인자를 가진 선택된 생물지표들에게 측정된 발현 수준을 적용함으로써, 얻을 수 있다. 다른 분석학적 도구, 가령, 로직 회귀 및 뉴랄 네트워크 접근법을 또한 이용하여 동일한 질문에 답할 수 있다.
예를 들면, 다음을 선형 분별 분석에 이용할 수 있다:
여기에서
I(psid) = 밑이 2인 로그 함수에서 ( ) 안에 포함된 프로브 세트의 강도. d(cp) = 질환 양성 부류에 대한 분별 함수. d(CN) = 질환 음성 부류에 대한 분별 함수
P(CP) = 질환 양성 부류에 대한 사후 p-값
P(CN) = 질환 음성 부류에 대한 사후 p-값
패턴 인지의 다수의 다른 공지된 방법들을 이용할 수 있다. 다음 문헌들은 일부 예를 제시한다: Weighted Voting: Golub et al. (1999); Support VectorMachines: Su et al. (2001); and Ramaswamy et al. (2001); K-nearest Neighbors: Ramaswamy (2001); and Correlation Coefficients: van 't Veer et al. (2002), 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 통합된다.
하기에서 더 상세하게 설명하는 생체특징 포트폴리오는 포트폴리오 내에서 생물지표들의 조합이 개별 생물지표들 또는 무작위로 선택된 생물지표들의 조합과 비교하여 개선된 감응성 및 특이성을 나타내도록 확립할 수 있다. 한 구체예에서, 생체특징 포트폴리오의 감응성은 배수 차이로 반영될 수 있는데, 예를 들면, 정상 상태와 비교하여 질환이 있는 상태에서의 전사체의 발현으로 나타낸 배수 차이다. 특이성은 관심 대상 상태의 전사체 발현의 신호 생성의 상관관계의 통계학적 측정으로 반영시킬 수 있다. 예를 들면, 이러한 측정으로 표준 편차를 이용할 수 있다. 생체특징 포트폴리오에 포함시킬 수 있는 생물지표 집단을 고려함에 있어서, 발현 측정에서 작은 표준 편차는 더 큰 특이성과 관련있다. 다른 변이 가령, 상관 계수의 측정 또한 이 기능에 이용할 수 있다.
비-조절된 mRNA/miRNA 또는 노이즈보다 더 큰 신호를 생성하는 mRNA/miRNA를 선별하는데 이용할 수 있는 또다른 매개변수는 절대적인 신호 차이 측정을 이용하는 것이다. 조절된 mRNA/miRNA 발현에 의해 생성된 신호는 정상 또는 비-조절된 유전자의 것보다 최소한 20% 상이하다(절대적인 기준에 근거하여). 이러한 mRNA/miRNA는 정상 또는 비-조절된 mRNA/miRNA 보다 최소한 30% 상이한 발현 패턴을 만드는 것이 훨씬 더 바람직하다.
생물학적 시료로부터 증폭시키고, 그리고 미국 특허 제7,250,496호, 미국 출원 공개 번호 20070292878, 20070042380 또는 20050222399 (이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 통합된다) 그리고 여기에서 언급된 문헌들에서 설명하는 방법들을 이용하여 측정함으로써, miRNA를 탐지하고 측정할 수 있다. microRNA는 미국 특허 제7,888,035호 "METHODS FOR ASSESSING RNA PATTERN" (February 15, 2011, 전문이 여기에 참고자료로 통합된다)에서 설명된 것과 같이 평가할 수 있다.
당업계에 공지되어 있는 다양한 기술을 이용하여 microRNA 수준이 표준화될 수 있다. 예를 들면, miRNA 발현의 상대적인 정량화는 2-ΔΔCT 방법 (Applied Biosystems User Bulletin N°2)을 이용하여 실행될 수 있다. microRNA의 수준은 하우스킵핑(housekeeping) 핵산, 이를 테면 하우스킵핑 mRNA, microRNA 또는 snoRNA에 대하여 표준화될 수 있다. 본 발명에 이용될 수 있는 miRNA 수준을 표준화시키는 추가 방법은 Vasilescu, MicroRNA fingerprints identify miR-150 as a plasma prognostic marker in patients with sepsis. PLoS One. 2009 Oct 12;4(10):e7405; 그리고 Peltier and Latham, normalization of microRNA 발현 levels in quantitative RT-PCR assays: identification of suitable reference RNA targets in normal 그리고 cancerous human solid tissues. RNA. 2008 May;14(5):844-52. Epub 2008 Mar 28에서 더 설명되며; 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 편입된다.
인산염-슈가 폴리뉴클레오티드 기본골격을 유연성 슈도-펩티드 폴리머로 대체한 새로운 부류의 합성 핵산 유사체인 펩티드 핵산(PNS)를 생체특징을 분석하는데 이용할 수 있다. PNAs는 상보 RNA 및 DNA 서열들에 대해 높은 친화력과 특이성으로 혼성화할 수 있고, 그리고 뉴클레아제 및 프로테나제에 의한 분해에 상당한 저항성을 가진다. 펩티드 핵산 (PNAs)은 인간 염색체의 신속한 in situ 확인 및 복사체 수의 변이의 탐지(CNV)를 위한 세포 유전학에 이용하는 흥미로운 새로운 부류의 프로브들이다. 다색 펩티드 핵산-형광 in situ 혼성화 (PNA-FISH) 프로토콜은 몇 가지 인간 CNV-관련된 장애와 감염질환을 확인하는데 설명되었었다. PNAs를 종양 표적화된 방사능핵종-PNA-펩티드 키메라로 종양 유전자 mRNA를 비-침습적으로 측정하기 위한 분자 진단 도구로 이용할 수 있다. PNAs를 이용하는 방법들은 Pellestor F et al, Curr Pharm Des. 2008;14(24):2439-44, Tian X et al, Ann N Y Acad Sci. 2005 Nov;1059:106-44, Paulasova P and Pellestor F, Annales de Gntique, 47 (2004) 349-358, Stender H. Expert Rev Mol Diagn. 2003 Sep;3(5):649-55. Review, Vigneault et al., Nature Methods, 5(9), 777 - 779 (2008)에 더 설명되어 있고, 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 통합된다. 이들 방법을 이용하여 소낭으로부터 단리된 유전적 재료들을 스크리닝할 수 있다. 기원 세포 특이적 소낭에 이들 기술을 적용할 때, 이를 이용하여 기원 세포에 직접적으로 속하는 주어진 분자 신호를 확인할 수 있다.
소낭으로부터 확인된 것들을 포함하는 mRNA 및 DNA에 대해 돌연변이 분석을 실시할 수 있다. RNA 기원의 표적 또는 생물지표의 돌연변이 분석을 위하여, RNA (mRNA, miRNA 또는 기타)를 cDNA로 역전사시킬 수 있고, 후속적으로 서열화하거나 또는 가령, 공지의 SNPs (Taqman SNP 분석, 예를 들면) 또는 단일 뉴클레오티드 돌연변이에 대해 분석하고, 뿐만 아니라 기원 세포 안에 존재하는 돌연변이를 결정하기 위하여 삽입 또는 결손을 찾는 서열화를 이용하여 분석할 수 있다. 다양화된 결찰(ligation) 의존성 프로브 증폭 (MLPA)은 작고 관심대상의 특정 지역에서 CNV를 확인하는 목적으로 대안으로 이용할 수 있다. 예를 들면, 단리된 결장암-특이적 소낭으로부터 전체 RNA를 수득한 후, cDNA를 합성하거나 KRAS의 엑손 2와 3에 특이적인 프라이머를 이용하여 KRAS 유전자의 코돈 12, 13 및 61을 포함하는 이들 2개 엑손을 증폭시킬 수 있다. ABI 3730에서 Big Dye Terminator 서열 분석용으로 PCR 증폭에 이용되는 동일한 프라이머를 이용하여 KRAS의 엑손 2와 3에서 돌연변이를 확인한다. 이들 코돈에 있는 돌연변이는 약물 가령, 세투시마브 및 파니투미마브에 대해 저항성을 부여하는 것으로 알려져 있다. 돌연변이 분석을 실행하는 방법들은 Maheswaran S et al, July 2, 2008 (10.1056/NEJMoa0800668) and Orita, M et al, PNAS 1989, (86): 2766-70에서 설명하고 있으며, 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 통합된다.
돌연변이 분석을 실행하는 다른 방법들은 miRNA 서열화를 포함한다. miRNA를 확인하고 프로파일링하는 응용은 클로닝 기술과 모세관 DNA 서열화 또는 "차세대" 서열화 기술을 이용하여 실행할 수 있다. 현재 이용가능한 새로운 서열화 기술은 낮은 풍부성을 가진 miRNA 또는 혼성화-기반 방법들에 의해 탐지할 수 없는 서열들의 중간 수준의 발현 차이를 나타내는 것들을 확인할 수 있다. 이러한 새로운 서열화 기술은 대규모 병렬 특징 서열화 (MPSS) 방법(Nakano et al. 2006, 핵산s Res. 2006;34:D731-D735. doi: 10.1093/nar/gkj077), Roche/454 플랫포옴(Margulies et al. 2005, Nature. 2005;437:376-380) 또는 Illumina 서열화 플랫포옴(Berezikov et al. Nat. Genet. 2006b;38:1375-1377)을 포함하고, 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 통합된다.
생체특징을 결정하는 추가 방법들은 대립형질-특이적 PCR에 의한 생물지표의 분석을 포함하는데, 여기에는 유전자의 두 대립형질 사이에 단일-스트랜드 구조 다형성 (SSCP)과 DNA 및 RNA 압타머들을 동시에 증폭시키고 식별하는 특이적 프라이머를 포함하고, 이는 서열에서 미묘한 차이에 근거하여 단일-스트랜드 핵산의 전기영동적 분리와 관계한다. DNA 및 RNA 압타머들은 높은 친화력으로 특정 분자에 결합하는 능력에 근거하여 랜덤 풀로부터 선택할 수 있는 짧은 올리고뉴클레오티드 서열들이다. 압타머들을 이용하는 방법은 Ulrich H et al, Comb Chem High Throughput Screen. 2006 Sep;9(8):619-32, Ferreira CS et al, Anal Bioanal Chem. 2008 Feb;390(4):1039-50, Ferreira CS et al, Tumour Biol. 2006;27(6):289-301에서 설명하고 있으며, 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 통합된다.
생물지표들은 형광 in situ 혼성화 (FISH)를 이용하여 또한 탐지할 수 있다. 특이적 DNA 서열들을 탐지하고 국소화시키고, 조직 시료들 안에 특이적 mRNA를 국소화시키고, 또는 염생체 이상을 확인하기 위하여 FISH를 이용하는 방법들은 Shaffer DR et al, Clin Cancer Res. 2007 Apr 1;13(7):2023-9, Cappuzo F et al, Journal of Thoracic Oncology, Volume 2, Number 5, May 2007, Moroni M et al, Lancet Oncol. 2005 May;6(5):279-86에서 설명하고 있으며, 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 통합된다.
페이로드에 대해 소낭의 집단을 분석하는 설명을 위한 계획이 도 2E에 제시된다. 한 구체예에서, 본 발명의 방법들은 소낭을 캡쳐하고(6330) 그리고 여기에 포함된 microRNA 종의 수준을 측정하고(6331), 이로 인하여 표현형을 특징화함으로써(6332), 표현형을 특징화하는 것을 포함한다.
순환하는 생물지표 또는 소낭을 포함하는 생체특징은 이에 대한 결합 물질을 포함할 수 있다. 결합물질은 DNA, RNA, 압타머, 단클론 항체, 다클론 항체, Fabs, Fab', 단일 쇄 항체, 합성 항체, 압타머 (DNA/RNA), 펩토이드, zDNA, 펩티드 핵산 (PNA), 잠김 핵산 (LNA), 렉틴, 합성 또는 자연 생성 화학적 화합물들 (약물 및 라벨링 시약들을 포함하나 이에 한정되지 않는)일 수 있다.
결합물질은 상기에서 설명된 것과 같이, 소낭의 성분들에 결합하여 소낭을 단리시키거나 또는 탐지하는데 이용할 수 있다. 결합물질을 이용하여 소낭, 가령, 기원 세포 특이적 소낭을 탐지할 수 있다. 결합물질 또는 다중 결합물질은 자체적으로 소낭의 생체특징을 제공하는 결합 물질 프로파일을 형성할 수 있다. 예를 들면, 이종 소낭 집단으로부터 소낭의 차등 탐지 또는 분리에서 2가지, 3가지 또는 4가지 또는 그 이상의 결합 물질을 이용하여 소낭 집단이 탐지된다면, 이 소낭 집단에 대한 특정 결합물질 프로파일은 특정 소낭 집단에 대한 생체특징을 제공한다.
설명을 위한 예로써, 암을 특징화하기 위한 소낭은 PSA, PSMA, PCSA, PSCA, B7H3, EpCam, TMPRSS2, mAB 5D4, XPSM-A9, XPSM-A10, Galectin-3, E-세렉틴, Galectin-1, 또는 E4 (IgG2a 카파), 또는 이의 임의의 조합에 대한 하나 이상의 결합 물질을 포함하나 이에 한정되지 않는 결합 물질로 탐지할 수 있다.
결합물질은 일반적 소낭 생물지표, 가령, "유지관리(housekeeping) 단백질" 또는 항원에 대한 것일 수 있다. 이 생물지표는 CD9, CD63, 또는 CD81일 수 있다. 예를 들면, 결합물질은 CD9, CD63, 또는 CD81에 대한 항체일 수 있다. 결합물질은 또한 다른 단백질들, 가령, 조직 특이적 또는 암 특이적 소낭에 대한 것일 수도 있다. 결합물질은 PCSA, PSMA, EpCam, B7H3 또는 STEAP에 대한 것일 수 있다. 결합물질은 DR3, STEAP, epha2, TMEM211, MFG-E8, 어넥신 V, TF, unc93A, A33, CD24, NGAL, EpCam, MUC17, TROP2, 또는 TETS에 대한 것일 수 있다.. 예를 들면, 결합물질은 PCSA, PSMA, EpCam, B7H3, DR3, STEAP, epha2, TMEM211, MFG-E8, 어넥신 V, TF, unc93A, A33, CD24, NGAL, EpCam, MUC17, TROP2, 또는 TETS에 대한 항체 또는 압타머일 수 있다.
다양한 단백질들은 전형적으로 소낭 껍질에 균일하게 또는 고르게 분포되지 않는다. 소낭-특이적 단백질들은 전형적으로 좀더 공통적이며, 반면 암-특이적 단백질들은 덜 공통적이다. 일부 구체예들에서, 소낭의 캡쳐는 좀더 공통적인, 암-특이성이 덜한 단백질, 가령, 하나 이상의 유지관리 단백질들 또는 항원 또는 일반적 소낭 항원 (가령, 테트라스파닌)을 이용하고, 그리고 하나 이상의 암-특이적 생물지표들 및/또는 하나 이상의 기원 세포 특이적 생물지표들은 탐지 단계에서 이용한다. 또다른 구체예에서, 하나 이상의 암-특이적 생물지표들 및/또는 하나 이상의 기원 세포 특이적 생물지표들은 캡쳐용으로 이용하고, 그리고 하나 이상의 유지관리 단백질들 또는 항원 또는 일반적 소낭 항원 (가령, 테트라스파닌)은 탐지용으로 이용한다. 구체예들에서, 동일한 생물지표를 캡쳐 및 탐지 모두에 이용한다. 동일한 생물지표에 대한 상이한 결합물질, 가령, 항원의 상이한 에피토프에 결합하는 항체들 도는 압타머를 이용할 수 있다.
추가 세포성 결합 짝 또는 결합물질은 당업계에 공지되어 있는 임의의 통상적인 방법들에 의해 확인하거나, 또는 여기에서 설명된 것과 같은 방법을 이용하여 확인하고, 그리고 추가적으로 진단, 예후 또는 요법-관련된 지표로 이용할 수 있다. 예를 들면, 소낭은 본 명세서에서 표 3, 4 또는 5에 열거된 하나 또는 그 이상의 결합제를 이용하여 탐지될 수 있다. 예를 들면, 이 결합제는 일반적인 소낭 생물지표, 이를 테면 "하우스킵핑 단백질" 또는 항원에 대한 것일 수도 있다. 일반적인 소낭 생물지표는 표 3에서 CD9, CD63, 또는 CD81, 또는 기타 생물지표일 수 있다. 이 결합제는 기타 단백질, 이를 테면 세포 기원 특이적 또는 암 특이적 소낭에 대한 것일 수도 있다. 비-제한적 실시예로써, 전립선 암의 경우, 이 결합제는 PCSA, PSMA, EpCam, B7H3, R나이 또는 STEAP에 대한 것일 수 있다. 결합제는 표 4-5의 생물지표에 대한 것일 수 있다. 예를 들면, 이 결합제는 PCSA, PSMA, EpCam, B7H3, R나이 또는 STEAP 또는 표 4-5에 있는 다른 생물지표에 대한 항체 또는 압타머일 수 있다.
다양한 단백질은 소낭 표면 상에 고르게 또는 균일하게 분포되지 않을 수 있다. 예를 들면, 소낭-특이적 단백질은 일반적으로 더 흔하며, 반면 암-특이적 단백질은 덜 흔하다. 일부 구체예들에서, 소낭의 캡쳐는 더 흔한, 암-특이성이 덜한 단백질, 이를 테면 하우스킵핑 단백질 또는 항원을 이용하여 이루어지고, 그리고 암-특이적 단백질은 탐지 단계에서 이용된다. 탐지 시스템의 감응성에 따라, 반대 방법이 또한 이용될 수 있는데, 이때 거대 소낭 집단은 일반적인 소낭 지표에 대한 결합제를 이용하여 캡쳐되고, 그 다음 세포-특이적 소낭은 관심대상의 하위-집단에 특이적인 탐지 물질들로 탐지된다.
추가 세포성 결합 짝 또는 결합물질은 당업계에 공지되어 있는 임의의 통상적인 방법들에 의해 확인하거나, 또는 여기에서 설명된 것과 같은 방법을 이용하여 확인하고, 그리고 추가적으로 진단, 예후 또는 요법-관련된 지표로 이용할 수 있다.
microRNA 기능 분석
상기에서 설명된 것과 같이, microRNA는 이를 테면, 미세소낭, HDL 그리고 LDL 입자들 뿐만 아니라 성리보핵단백질 복합체들 (RNP)의 성분들 안에 포획된 혈액과 같은 체액 안에서 순환하는 것으로 발견될 수 있다. microRNA는 이를 테면, 본 명세서에서 기술된 또는 당업계에 공지되어 RT-qPCR 또는 차세대(next generation) 서열화를 포함하나 이에 한정되지 않는 이용가능한 기술을 이용하여 탐지될 수 있다. 그러나, 생물학적으로 활성 부위에서 microRNA는 하나 또는 그 이상의 Argonaute ("Ago") 단백질 (가령, Ago1, Ago2, Ago3, 또는 Ago4)에 의해 결합되거나 활성화된다. 본 발명의 한 측면은 단일 반응에서 생물학적 시료 안에 표적 microRNA의 기능 활성을 탐지할 수 있는 조성물 및 방법을 안내한다. Ago 패밀리 단백질에 대한 검토는 Hock and Meister, Genome Biology, 2008, 9:210 참고.
좀더 구체적으로, 기질, 합성 RNA 분자, 라벨 그리고 RISC (RNA-유도된 침묵 복합체) 반응 완충액 성분들, 그리고 임의선택적으로 하나 또는 그 이상의 단리된 Ago 단백질을 이용하여 하나 또는 그 이상의 핵산 생물지표들 (가령, microRNA)를 평가한다. 본 발명에 이용될 수 있는 기질의 예는 평면 기질, 마이크로비드, 컬럼 또는 합성 RNA 분자의 제 1 부분, 가령, 3' 또는 5'단부는 직접 또는 간접 링키지를 통하여 연결되는 이와 유사한 것을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이러한 기질은 본 명세서에서 기술되거나 또는 당업계에 공지되어 있다. 링키지는 당업계에 공지되어 있는 방법, 이를 테면, Wittebolle et al., Optimisation of the amino-carboxy coupling of oligo뉴클레오티드s to beads used in 액체 arrays, J Chem Tech Biotech 81:476480 (2006)에서 설명된 것과 같은 아미노-카르복시 결합을 이용하여 실시된다; 이러한 기술은 당업계 숙련자들에게는 공지되어 있다.
합성 RNA 분자의 또다른 부분, 가령, 반대쪽 3' 또는 5'단부는 라벨 또는 탐지가능한 분자에 직접적으로 또는 간접적으로 부착된다. 라벨은 탐지될 수 있는 임의의 분자이며, 그리고 이러한 라벨 또는 탐지가능한 분자들은 당업계에 공지되어 있고, 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다: 형광 라벨, 방사능라벨 또는 효소 라벨. 이러한 라벨의 추가 실시예는 상기에서 공개된다. 기질-연결된 부분과 라벨된 부분 사이에서, 합성 RNA 분자는 관심 대상의 표적 microRNA에 상보적인 구역 또는 부분을 포함한다. 바람직할 경우, 상보적인 구역은 표적 microRNA에 완벽하게 상보적, 가령, 100% 상보적일 수 있다. 상보적인 구역과 표적 microRNA 사이에 연합 정도는 가령, 한 가지 특이적 표적 microRNA의 인지 또는 복잡한 인지, 가령, 표적 microRNA의 패밀리의 인지가 허용되도록 조정될 수 있다. 이러한 조정을 위한 수단은 본 명세서에서 기술되거나 또는 당업계에 공지되어 있는, 가령, 염기쌍 부정합(base pair 부정합es), 또는 분석 조건 이를 테면, 온도 또는 염 농도이다. 예를 들면, 상보적인 구역은 표적 microRNA와의 부정합을 가지고 있을 수 있으며, 가령, 이러한 상보적인 구역은 표적 microRNA에 대해 최소한 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 최소한 99% 상보적이다. 이 방법은 라벨된 그리고 연결된 합성 RNA 분자를 관심 대상의 표적 microRNA를 포함하는 또는 포함하는 것으로 의심되는 시료와 접촉시키는 것을 포함한다. 표적 microRNA가 이 시료 안에 존재하고, 또한 Ago 단백질에 결합되어 있다면, Ago-microRNA는 표적 microRNA와 상보적인 영역 사이에 염기쌍 형성을 통하여 합성 RNA 분자와 연합될 수 있다. 이러한 연합으로 Ago 단백질의 엔도뉴클레아제 절단 활성을 통하여 합성 RNA 분자의 절단이 촉진된다. 이 절단으로 기질로부터 합성 RNA 분자의 라벨이 해당된다. 기질과 연합된 라벨의 양은 표적 microRNA를 포함하는 시료와 접촉 전과 후에 탐지될 수 있다. 라벨 양의 이러한 임의적인 차이는 투입물 시료 안에 Ago-결합된 표적 microRNA의 양을 나타낸다.
분석을 위한 유용한 반응 조건 및 완충액은 당업계에 공지되어 있다. 반응은 분석 감응도 및 표적 풍부성에 따라 임의의 장소에서 5분 내지 하룻밤 동안 실온, 25℃, 30℃, 37℃ 또는 최대 42℃-45℃에서 실행될 수 있다. 예를 들면, 반응은 37℃에서 1-2h 동안 실행될 수 있다. 가령, Brown et al., Target accessibility dictates the potency of human RISC. Nature Structural & 분자 Biology 12, 469 - 470 (2005); Robb et al., Specific and potent RNAi in the nucleus of human cells. Nature Structural & 분자 Biology 12, 133 - 137 (2005); Lima et al., Binding and Cleav나이 Specificities of Human Argonaute2. J. Biol. Chem. 2009 284: 26017-26028 참고.
분석의 예시적인 구체예는 도 26에 나타낸다. 도 26A에 나타낸 것과 같이, 합성 RNA 분자는 3'링커/연장부 영역 262, 중앙 miRNA 표적화 영역 263 그리고 제 2의 5'링커/연장 영역 264를 포함한다. RNA는 3'단부 262 상에 기질, 여기에서 마이크로비드 261에 부착되며, 그리고 5'단부 264는 바이오틴 266에 접합된다. 중앙 miRNA 표적화 영역 263은 관심 miRNA 서열에 상보적이 되도록 기획된다. 영역 263은 임의의 관심 microRNA에 상보적일 수 있다. 도 26에 나타낸 실시예에서, 스트렙타아비딘-PE (피코에리트린) 265를 이용하여 합성 RNA의 바이오틴 단부를 라벨시킨다. 설명된 것과 같이, 다른 라벨링 계획이 이용될 수 있다. 예를 들면, 5'단부 264는 Cy3, Cy5 또는 본 명세서에서 기술된 또는 당업계에 공지되어 있는 기타 탐지가능한 모이어티로 직접적으로 라벨될 수 있다. 또다른 실시예로써, 5'단부 264는 라벨된 또다른 상보적인 올리고뉴클레오티드와 염기쌍 형성을 통하여 간접적으로 라벨될 수 있다. 표적 microRNA가 이 시료 안에 존재하고, 그리고 Ago 단백질 267, 가령, 이 시료 안에 임의의 Ago1-4와 결합/연합되거나 또는 이를 테면, 재조합 Ago2 (rAgo2)에 추가되면, 표적 microRNA는 상보적인 microRNA 표적화 영역 263에 결합하고, 후속적으로 Argonaute의 엔도뉴클레아제 절단 활성을 통하여 영역 263에서 합성 RNA를 절단할 것이다. 도 26에서 단계 268 참고. 일단 절단되면, 합성 RNA 분자의 라벨된 단부(여기에서 5')은 방출되고, 이로 인하여 마이크로비드 261로부터 바이오틴/스트렙타아비딘-PE 복합체 265-266는 분리된다. 도 26B 참고. 그 다음, 기질 마이크로비드는 RNA의 절단된 그리고 연결안된 단부를 제거하기 위하여 단리되고 세척되며, 이로 인하여 절단안된 그리고 여전히 라벨된 물질만 남을 뿐만 아니라 임의의 절단되었지만, 현재 라벨안된 RNA로 남겨진다. 이러한 세척 단계이후, PE 신호에서 차이는 고유 분석에서 존재하는 Ago-결합된 표적 microRNA 267의 농도 및 활성과 관련된다. 투입물 시료 안에 Ago-결합된 표적 microRNA의 양은 절단된 RNA 수준을 결정한다. 예를 들면, 표적 microRNA가 존재하지 않는다면, 또는 존재하지만, Ago와 기능형태로 결합되어 있지 않다면, 합성 RNA 표적 영역 263은 절단되지 않은 채 남아있을 것이며, 신호 강도를 변함없을 것이다.
Argonaute 상에 사전-적하된 임의의 적절한 원천의 RNA 및/또는 RNA가 분석을 이용하여 테스트될 수 있다. 예를 들면, 투입물 시료는 세포 용해물, 체액, 혈액 분획물 (순환하는 Argonaute 이를 테면, miRNA에 결합된 Ago 2를 함유할 수 있다), 혈장, 혈청, 또는 단리된 미세소낭일 수 있다. 일부 구체예들에서, 시료로부터 면역침전된 Argonaute는 분석을 위한 RNP 복합체들의 투입물 원천으로 이용된다. 표적 microRNA가 존재하고, 임의의 전술한 원천에서 Argonaute 상에 적하된다면, 합성 표적 263은 절단되고, 라벨(가령, 도 26의 실시예에서 바이오틴-스트렙타아비딘-PE 265-266)은 방출된다.
도 26C-E는 분석을 위한 투입물로 이용될 수 있는 다양한 원천의 RNA를 도식적으로 설명한다. 도 26C는 리보핵산 복합체 267를 형성하기 위하여 Ago 단백질에 결합된 microRNA 268을 설명한다. Ago 단백질은 Ago1, Ago 2, Ago3 또는 Ago 4일 수 있다. 도 26D는 Ago 2610에 대한 결합물질을 이용하여, Argonaute - microRNA 복합체 267의 면역침전을 설명한다. 결합물질은 특정 Argonaute, 가령, Ago2에 대한 항체 또는 압타머에 특이적이다. 다른 구체예들에서, 결합물질은 하나 이상의 Ago 패밀리 구성요소, 가령, Ago1-4를 인지한다. 여전히 다른 구체예들에서, 결합물질은 하나 또는 그 이상의 Ago 단백질에 간접적으로 결합할 수 있다. 예를 들면, 면역침전에 대한 결합물질은 Ago 단백질과 복합체를 형성하는 GW182 단백질에 대한 항체 또는 압타머일 수 있다. 도 26E는 가령, 세포 용해물, 체액, 또는 용해된 미세소낭으로부터 Argonaute - microRNA 복합체 267의 직접적 분석을 설명한다.
대안으로, 분석 투입물은 이를 테면, 재조합 Ago (rAgo)를 포함하는 정제된 Ago와 같은 Ago 단백질과 접촉된 시료의 RNA를 포함할 수 있다, 이 방식에서, RNA는 세포 용해물, 체액, 혈장, 농축된 혈장, 미세소낭, 또는 HDL 그리고 LDL 입자를 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 적합한 원천으로부터 단리될 수 있다. 일단 단리되면, Ago 단백질, 가령, 재조합 Argonaute 2를 이용하여 이 시료 안에 존재하는 작은 RNA에 결합된다. Ago 결합된 RNA를 분석의 투입물로 이용할 수 있다.
상기에서 설명된 것과 같이, 합성 RNA 분자의 제 3 부분이 라벨되고, 따라서 상보적인 구역의 절단으로 기질로부터 라벨의 제거가 허용된다. 따라서, 기질로부터 제거된 라베르이 양은 절단 사건의 수에 상응한다. 절단 사건을 탐지하는 대안 방법은 본 발명의 범위 내에 있음을 인지할 것이다. 한 구체예에서, 라벨은 절단 반응이 일어나는 것이 허용된 이후에 반응 혼합물에 첨가된다. 상기 실시예에 따라, 스트렙타아비딘-PE 265는 절단 반응이 일어난 이후에 추가된다. 또다른 실시예에서, 합성 RNA 분자의 제 3 부분은 라벨되지 않는다. 오히려, 절단 반응이 일어난 후, 컬럼에 남아있는 절단된 합성 RNA 분자의 양을 탐지함으로써, 절단 사건이 관찰된다.
기질로부터 해방된 라벨의 수준이 탐지되고, 절단 반응이 일어나기 전과 후와 비교될 수 있다. 대안으로, 절단 반응의 역학은 해당 방법을 이용하여 관찰될 수 있다. 한 구체예에서, 기질로부터 해방된 라벨의 수준은 실시간으로 탐지되고, 이로 인하여 절단 반응의 역학이 드러난다.
microRNA 기능 분석을 이용하여, 실질적으로 임의의 microRNA는 정합된 miRNA 표적 영역을 함유하는 합성 RNA로 선별될 수 있다. 분석은 구별가능한 마이크로비드에 부착된 다중 합성 표적과 함께 단성 또는 다중 방식으로 실행될 수 있다.
한 구체예에서, miR 분석 시스템은 치료요법적 RNAi 분자 운반 및 작용 방식 확인에 이용된다. 여기에서, RNAi 분자들은 전신으로 또는 적절한 세포 유형, 조직 또는 기타 해부학적 영역으로 표적화된 방식으로 전달된다. 표적 조직은 RNAi 치료 작용 방식의 운반 및 확인을 위하여 분석될 수 있다. 예를 들면, 관심 조직에서 치료요법적 RNAi 분자의 존재는 RNAi 치료 작용으로 인하여 mRNA의 녹다운으로부터 바로 유도된 표현형적 결과에 의해 또는 대안으로 무관한 자가사멸 또는 세포의 염증 반응을 통하여 탐지될 수 있다. 끝으로, 표적 조직에서 활성화된 치료 RNAi 물질의 IC50은 이 방법을 이용하여 확립될 수 있다.
암에 대한 생체특징
여기에서 설명된 것과 같이, 순환하는 생물지표들을 포함하는 생체특징을 이용하여 암을 특징화할 수 있다. 이 단락은 가령, 전립선, GI, 또는 난소 암의 생체특징의 일부로 이용할 수 있는 비-배타적인 생물지표들의 목록을 제공한다. 일부 구체예들에서, 순환하는 생물지표들은 소낭 또는 소낭의 집단과 연합한다. 예를 들면, 소낭과 연합된 순환하는 생물지표들을 이용하여 소낭 또는 소낭 집단을 캡쳐 및/또는 탐지할 수 있다. 여기에서 제시되는 생물지표들은 기타 지환들, 가령, 기타 세포 또는 조직 장기의 기타 증식성 장애들 그리고 암에 대한 생체특징에 유용할 수 있다. 예를 들면, 다양한 세포 유형들에서 형질변환은 통상적인 사건, 가령, p53에서 돌연변이 또는 기타 종양 억제물질에서의 돌연변이로 인한 것일 수 있다. 기원 세포(cell-of-origin) 생물지표들과 암 생물지표들을 포함하는 생체특징을 이용하여 암의 성질을 더 평가할 수 있다. 전이성 암에 대한 생물지표들은 전이성 암을 평가하기 위하여, 기원 세포 생물지표들과 함께 이용할 수 있다. 본 발명에 이용하는 이러한 생물지표들은 Dawood, 신규한 Bio표식들 of metastatic cancer, Exp Rev Mol Diag July 2010, Vol. 10, No. 5, P나이s 581-590에 설명된 것들을 포함하며, 이 공개는 전문이 여기에 참고자료로 통합된다.
본 발명의 생체특징들은 기준에 따라 상향조절된, 하향조절된 또는 변화가 없는 표식을 포함할 수 있다. 단순히 설명을 하기 위하여, 기준이 정상 시료라면, 이 생체특징은 피험자의 생체특징이 기준과 비교하여 변화되지 않았다면 피험자는 정상이라고 할 것이다. 대안으로, 이 생체특징이 돌연변이된 핵산 또는 아미노산 서열을 포함할 경우, 생체특징내 구성요소들의 수준은 정상 기준과 질환이 있는 시료 사이에 동일하다. 또다른 경우, 이 기준은 암 시료일 수 있는데, 이 피험자의 생체특징이 기준과 실질적으로 유사한 경우, 피험자의 생체특징은 암을 나타낸다. 피험자의 생체특징은 기준과 비교하여 상향조절되고, 그리고 하향조절된 구성효소들을 모두 포함할 수 있다. 오직 설명을 위하여, 기준이 정상시료라면, 암 생체특징은 상향조절된 암유전자와 하향조절된 종양 억제물질들을 모두 포함할 수 있다. 소낭 표식들은 다양한 환경(setting)에서 상이하게 또한 발현될 수 있다. 예를 들면, 테트라스패닌은 암이 아닌 소낭들과 비교하여 암 소낭들에서 과다발현될 수 있고, 반면에 MFG-E8은 암 소낭들과 비교하여 암이 아닌 소낭들에서 과다발현될 수 있다.
치료진단(Theranosis)
여기에서 설명된 것과 같이, 소낭 생물지표들 및/또는 순환하는 생물지표들을 포함하는 하나 이상의 생물지표들을 평가함으로써 피험자에 대한 표현형을 특징화하는 방법들을 설명한다. 이 생물지표들은 여기에서 설명된 소낭 생물지표들의 다양화된 분석을 위한 방법들을 이용하여 평가할 수 있다. 표현형의 특징화는 피험자에 대한 치료진단을 제공하는 것을 포함할 수 있는데, 가령, 피험자가 치료에 대하여 반응성으로 예측되는지 또는 치료에 대해 비-반응성으로 예측되는 지를 결정한다. 치료에 대해 반응하는 피험자는 반응자로 불릴 수 있고, 반면에 치료에 대해 반응하지 않는 피험자는 비-반응자로 불릴 수 있다. 이상으로 고통을 받는 피험자는 치료에 대하여 이상에 대한 하나 이상의 증상의 개선; 기존 치료의 하나 이상의 부작용의 감소; 기존 치료 또는 다른 치료와 비교하여 하나 이상의 증상의 개선 증가 또는 개선율 증가; 또는 기존 치료 또는 다른 치료와 비교하여 또는 치료를 안한 것과 비교하여 생존율 증가를 포함하나 이에 한정되지 않는 것들에 근거하여 반응자로 간주할 수 있다. 예를 들면, 이상으로 고통을 받는 피험자는 치료에 대하여 하나 이상의 증상의 경감 또는 완화, 질환 정도의 감소, 질환의 안정화된 상태(가령, 악화되지 않는), 질환의 확산 방지, 질환 진전의 지연 또는 늦춤, 이 질환 상태의 개선 또는 경감, 그리고 탐지가능한 또는 탐지불가능한 완화(부분적 또는 전체적)를 포함하나 이에 한정되지 않는 유익한 또는 바람직한 임상적 결과에 근거하여 반응자로 간주할 수 있다. 치료는 또한 치료를 받지 않은 또는 상이한 치료를 받은 경우 예상되는 생존과 비교하여 연장된 생존을 포함한다.
여기에서 설명된 시스템과 방법들을 이용하여 치료를 요하는 피험자에 대한 후보 치료를 선택할 수 있다. 요법의 선별은 소낭의 하나 이상의 특징들, 가령, 이 소낭의 생체특징, 소낭의 양, 또는 이둘 모두에 근거할 수 있다. 소낭 유형또는 프로파일링, 가령, 소낭의 생체특징의 확인, 소낭의 양, 또는 이둘 모두를 이용하여 이상을 앓고 있는 개체에 대한 하나 이상의 후보 치료 물질을 확인할 수 있다. 예를 들면, 소낭 프로파일링을 이용하여 특정 치료, 가령, 피험자가 암을 앓고 있다면 암 치료에 반응자인지 또는 비-반응자인지를 결정할 수 있다.
소낭 프로파일링을 이용하여 피험자에 대한 진단 또는 예후를 제공할 수 있고, 그리고 요법은 진단 또는 예후에 근거하여 선택할 수 있다. 대안으로, 요법 선별은 피험자의 소낭 프로파일에 직접적으로 근거할 수 있다. 더욱이, 피험자의 소낭 프로파일을 이용하여 질환의 진전을 추적하고, 투약 효과를 평가하고, 질환 또는 상태를 앓고 있는 피험자에 대한 기존 치료를 수정하고, 또는 질환 또는 상태를 앓고 있는 피험자를 위한 새로운 치료를 선택할 수 있다.
치료에 대한 피험자의 반응은 소낭, microRNA, 및 다른 순환하는 생물지표들을 포함하는 생물지표들을 이용하여 평가할 수 있다. 한 구체예에서, 임의의 치료이전에 평가된 피험자의 소낭 프로파일에 근거하여 피험자가 비-반응자 또는 반응자인지를 결정하고, 분류하거나 또는 확인한다. 전치료 동안, 피험자는 비-반응자 또는 반응자로 분류될 수 있고, 이로 인하여 불필요한 치료 선택을 감소시키고, 비효과적인 치료로부터 있을 수 있는 부작용을 감소시킨다. 더욱이, 이 피험자가 특정 치료에 대해 반응자로 확인되면, 개인맞춤화된 치료를 제공함으로써, 따라서 소낭 프로파일링을 이용하여 피험자의 생존을 연장시키고, 피험자의 증상 또는 상태를 개선시키거나 이둘 모두를 제공할 수 있다. 따라서, 이상을 앓고 있는 피험자는 여기에서 설명된 하나 이상의 시스템 및 방법을 이용하여 소낭 및 다른 순환하는 생물지표들로부터 생성된 생체특징을 보유할 수 있고, 그리고 이 프로파일을 이용하여 피험자가 이 이상에 대한 특정 치료에 비-반응자인지 또는 반응자인지를 판단할 수 있다. 피험자가 처음 고려된 치료에 대하여 비-반응자인지 또는 반응자인지를 예측하기 위한 생체특징의 용도에 근거하여, 이 피험자의 상태를 치료하기 위하여 고려된 특정 치료는 이 피험자를 위하여 선택할 수 있거나, 또는 또다른 잠재적인 더 최적의 치료를 선택할 수 있다.
한 구체예에서, 건강상태로 고통을 받는 피험자는 일반적 치료로 치료받는다. 치료하기 전 그리고 치료 과정 동안 하나 이상의 시점에서 피험자로부터 시료를 구할 수 있다. 시료로부터 소낭 또는 다른 생물지표들을 포함하는 생체특징을 평가할 수 있고, 시간에 따른 생체특징의 변화에 근거하여 이를 이용하여 약물에 대한 피험자의 반응을 결정할 수 있다. 이 피험자가 이 치료에 반응이 없다면, 가령, 이 생체특징은 환자가 반응하지 않음을 나타내고, 이 피험자는 치료에 비-반응적 또는 비-반응자로 분류할 수 있다. 유사하게, 악화된 상태와 관련된 하나 이상의 생물지표들이 탐지된다면, 이 생체특징은 치료에 대해 우호적으로 반응하는데 환자가 실패함을 나타낸다. 또다른 실시예에서, 이상과 관련된 하나 이상의 생물지표들이 치료에도 불구하고 동일하게 유지된다면, 이 건강 상태는 개선되지 않음을 나타낸다. 따라서, 생체특징에 근거하여, 피험자를 위한 치료 섭생은 상이한 치료의 선택을 포함하여, 변화되거나 또는 개작될 수 있다.
대안으로, 이 피험자가 치료에 대해 반응성인 것으로 판단될 수 있고, 이 피험자는 치료에 반응성 또는 반응자로 분류할 수 있다. 예를 들면, 상태 또는 장애의 개선과 관련된 하나 이상의 생물지표들을 탐지할 수 있다. 또다른 실시예에서, 건상 상태와 연관된 하나 이상의 생물지표들이 변화되면, 따라서, 개선을 나타낸다. 따라서, 기존 치료는 지속되어야 한다. 또다른 구체예에서, 개선이 나타남에도 불구하고, 이 생체특징이 또다른 치료가 더 효과적임을 나타내는 경우, 기존 치료는 개작하거나 또는 변형할 수 있다. 기존 치료는 또다른 치료와 복합될 수 있고, 현재 치료의 투약량을 증가시키거나 또는 상이한 후보 치료 또는 치료법을 선택할 수 있다. 상이한 후보 치료의 선택을 위한 기준은 환경설정에 따라 달라질 수 있다. 한 구체예에서, 후보 치료는 기존 치료에 성공한 피험자에게 유효한 것으로 공지되어 있을 수도 있다. 또다른 구체예에서, 후보 치료는 유사한 생체특징을 가진 다른 피험자에게 유효한 것으로 공지되어 있을 수도 있다.
일부 구체예들에서, 이 피험자는 치료, 가령, 암 치료의 제 2, 제 3 또는 그 이상의 치료를 받고 있다. 본 발명에 따른 생체특징은 피험자가 제 2, 제 3 또는 그 이상의 치료선에 대해 반응자 또는 비-반응자인지를 판단하기 위하여 제 2, 제 3 또는 그 이상의 치료를 받기 전에 이 피험자에 대해 결정될 수 있다. 또다른 구체예에서, 생체특징은 피험자가 제 2, 제 3 또는 그 이상의 치료선에 대해 반응자 또는 비-반응자인지를 판단하기 위하여 제 2, 제 3 또는 그 이상의 치료를 받는 동안 이 피험자에 대해 결정될 수 있다.
하나 이상의 소낭을 평가하기 위하여 여기에서 설명된 방법들과 시스템을 이용하여 건강 이상을 앓고 있는 피험자가 치료에 대하여 반응성인지를 판단할 수 있고, 그리고 따라서 건강 이상의 하나 이상의 증상을 개선시키고; 기존 치료의 하나 이상의 부작용을 감소시키고; 그리고 기존 또는 다른 치료와 비교하여 하나 이상의 증상을 개선 또는 개선율을 증가시키거나 또는 치료를 받지 않은 또는 기존 또는 다른 치료와 비교하여 생존을 연장시키는 치료를 선택하는데 이용할 수 있다. 따라서, 여기에서 설명된 방법들을 이용하여 개인맞춤화된 치료 선택을 제공함으로써 피험자의 생존을 연장시킬 수 있고, 및/또는 피험자에 불필요한 치료 선택 및 불필요한 부작용을 감소시킬 수 있다.
연장된 생존은 진전이 없는 생존의 증가(PFS)일 수 있는데, 이는 치료 과정을 개시한 후, 질환, 가령 암을 앓고 있는 개체 또는 개체군에서 질환의 진전이 없이 유지하는 기회를 말한다. 이는 명시된 기간 후 개체의 질환이 적절하게 유지되는(가령, 질환의 진전 징후가 없는) 집단에서 개체의 비율을 지칭할 수 있다. 진전-없는 생존율은 특정 치료의 효과의 지표가 된다. 다른 구체예들에서, 연장된 생존은 질환-없는 생존 (DFS)으로 암을 앓는 개체 또는 개체군에서 특정 치료 후 질환이 없이 유지되는 기회를 말한다. 이는 명기된 기간 후 질환이 없을 것 같은 개체의 집단내 비율을 지칭할 수 있다. 질환-없는 생존율은 특정 치료의 효과에 대한 지표다. 유사한 환자군에서 얻은 질환 없는 생존에 근거하여 2가지 치료 전략을 비교할 수 있다. 질환 없는 생존은 암 생존을 설명할 때 전반적인 생존과 함께 흔히 사용된다.
여기에서 설명된 것과 같이, 소낭 프로파일에 의해 선택된 후보 치료는 이 피험자가 진행했던 가장 최근 요법에 대하여(A 기간) PFS를 가진 소낭 프로파일링(B 기간)에 의해 선택한 요법을 이용하여 진전 없는 생존(PFS)를 비교함으로서, 비-소낭 프로파일링 선택된 치료와 비교할 수 있다. 한 가지 환경에서, PFSB/PFSA 비율이 ≥ 1.3이라는 것은 이 소낭 프로파일링 선택된 요법이 피험자에게 유익함을 제공한다는 것을 말한다(예를 들면, Robert Temple, Clinical measurement in 약물 evaluation. Edited by Wu Ningano and G.T. Thicker John Wiley and Sons Ltd. 1995; Von Hoff, D.D. Clin Can Res. 4: 1079, 1999: Dhani et al. Clin Cancer Res. 15: 118-123, 2009).
소낭 프로파일링에 의해 선택된 치료를 비교하는 다른 방법들은 4 개월 시점에서 진전 또는 사멸 없는 피험자의 반응율(RECIST) 및 피험자의 비율을 결정함으로써 비-소낭 프로파일링 선택된 치료와 비교할 수 있다. PFS에 대한 수치 값의 내용에서 이용된 용어 "약"은 수치값에 대하여 ± 10% 변이를 의미한다. 소낭 프로파일링에 의해 선택된 치료에서 PFS는 비-소낭 프로파일링 선택된 치료와 비교하여 최소한 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 최소한 90% 연장될 수 있다. 일부 구체예들에서, 소낭 프로파일링에 의해 선택된 치료로부터 PFS는 비-소낭 프로파일링 선택된 치료와 비교하여 최소한 100%, 150%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 또는 최소한 약 1000% 연장될 수 있다. 추가 다른 구체예들에서, PFS 비율 (소낭 프로파일링 선택된 요법 또는 새로운 치료에서 PFS/기존 요법 또는 치료에서 PFS)는 최소한 약 1.3이다. 추가 다른 구체예들에서, PFS 비율은 최소한 약 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 또는 2.0이다. 추가 다른 구체예들에서, PFS 비율은 최소한 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이다.
유사하게, DFS는 본 발명에 따른 생체특징을 결정하고 또는 생체특징의 결정 없이 선택된 피험자의 치료와 비교할 수 있다. 소낭 프로파일링에 의해 선택된 치료의 DFS는 비-소낭 프로파일링 선택된 치료와 비교하여 최소한 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 최소한 90% 연장될 수 있다. 일부 구체예들에서, 소낭 프로파일링에 의해 선택된 치료의 DFS는 비-소낭 프로파일링 선택된 치료와 비교하였을 때, 최소한 100%, 150%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 또는 최소한 약 1000% 연장될 수 있다. 추가 다른 구체예들에서, DFS 비율 (소낭 프로파일링 선택된 요법 또는 새로운 치료에서 DFS/기존 요법 또는 치료에서 PFS)는 최소한 약 1.3이다. 추가 다른 구체예들에서, DFS 비율은 최소한 약 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 또는 2.0이다. 추가 다른 구체예들에서, DFS 비율은 최소한 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이다.
일부 구체예들에서, 현미소낭(microvescile) 프로파일링에 의해 선택된 후부 치료는 피험자에서 PFS 비율 또는 DFS 비율을 증가시키지 않는다; 그럼에도 불구하고 소낭 프로파일링은 피험자에게 이익을 제공한다. 예를 들면, 일부 구체예들에서 이 피험자를 위한 이용가능한 공지의 치료는 없다. 이러한 경우들에서, 소낭 프로파일링은 현재 확인된 치료가 없을 때 후부 치료를 확인하는 방법을 제공한다. 이 소낭 프로파일링은 PFS, DFS 또는 수명을 최소한 1 주, 2 주, 3 주, 4 주, 1 개월, 5 주, 6 주, 7 주, 8 주, 2 개월, 9 주, 10 주, 11 주, 12 주, 3 개월, 4 개월, 5 개월, 6 개월, 7 개월, 8 개월, 9 개월, 10 개월, 11 개월, 12 개월, 13 개월, 14 개월, 15 개월, 16 개월, 17 개월, 18 개월, 19 개월, 20 개월, 21 개월, 22 개월, 23 개월, 24 개월 또는 2 년 연장시킬 수 있다. 이 소낭 프로파일링은 PFS, DFS 또는 수명을 최소한 2 년, 3 년, 4 년, 5 년, 또는 그 이상 연장시킬 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 발명의 방법들은 결과를 개선시켜, 피험자가 회복시기에 있게 한다.
치료의 효과는 다른 측정으로 모니터할 수 있다. 완전한 반응 (CR)은 질환이 완전하게 사라지는 것을 포함한다: 질환이 없음은 검사, 스캔 또는 다른 테스트로 명백하게 안다. 부분적 반응 (PR)은 신체에 어느 정도의 질환이 남아있지만, 병소의 크기 또는 수가 30% 또는 그 이상으로 감소되었음을 나타낸다. 안정적인 질환 (SD)은 병소의 크기 및 수는 상대적으로 변화없이 유지되는 질환을 말한다. 일반적인으로, 크기가 50% 미만으로 감소 또는 약간 감소한 것은 안정적인 질환으로 설명할 수 있다. 진행성 질환 (PD)은 치료에서 크기 또는 수가 증가된 질환을 말한다. 일부 구체예들에서, 본 발명에 따른 소낭 프로파일링으로 완전한 반응 또는 부분적 반응을 초래한다. 일부 구체예들에서, 본 발명의 방법들은 안정적인 질환을 야기한다. 일부 구체예들에서, 본 발명은 안정적인 질환을 얻을 수 있으며, 비-소낭 프로파일링은 진행성 질환을 초래한다.
본 발명의 생체특징에 근거한 치료 진단은 여기에서 열거한 것들을 포함하나 이에 한정되지 않는 표현형에 대한 것일 수 있다. 표현형의 특징화는 하기 위한 피험자를 위한 치료 진단을 결정하는 것을 포함하는데, 가령, 피험자가 치료에 반응성인지 ("반응자") 또는 치료에 비-반응성인지("비-반응자")을 예측한다. 여기에서 이용된 것과 같이, 치료에 대해 피험자가 "반응자"인지 또는 치료에 대해 "비-반응자"인지를 확인하는 것은 이 피험자가 치료에 반응할 것 같은지 또는 치료에 반응하지 않을 것 같은지를 확인하는 것을 포함하고, 그리고 피험자 반응의 확정적인 예측을 결정하지 않는다. 피험자로부터 수득한 하나 이상의 소낭, 또는 소낭 집단을 이용하여 여기에서 설명된 생물지표들, 가령 표 5에 열거한 것들을 평가함으로써, 피험자가 특정 치료에 비-반응자 또는 반응자인지를 판단한다. 생물지표의 높은 또는 낮은 발현 수준의 탐지 또는 생물지표의 돌연변이의 탐지를 이용하여 질환이 있는 피험자에 대한 후보 치료, 가령, 약제학적 중재를 선택할 수 있다. 표 5는 이러한 상태 및 이런 상태에 대한 약제학적 중재를 포함한다. 이 표는 중재의 효과에 영향을 주는 생물지표들을 열거한다. 이 생물지표들, 가령, 순환하는 생물지표들 또는 소낭과 연합된 지표들을 본 발명의 방법들을 이용하여 평가할 수 있다.
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
암(Cancer)
소낭 생체특징을 암의 치료진단에 이용할 수 있는데, 가령, 암을 앓고 있는 피험자가 특정 암 치료에 반응자인지 또는 비-반응자인지를 확인한다. 해당 방법들을 이용하여 여기에서 설명된, 가령 상기 "표현형" 부분의 암을 치료진단할 수 있다. 여기에는 폐암, 비-소 세포 폐암, 소 세포 폐암 (소 세포 암종 (귀리 세포 암), 혼합형 소 세포/거대 세포 암종, 그리고 복합형 소 세포 암종), 결장암, 유방암, 전립선암, 간암, 췌장암, 뇌암, 신장 암, 난소암, 위암, 흑색종, 골 암, 위암, 유방암, 신경교종, 교모세포종, 간세포 암종, 유두 신장 암종, 두경부 편평 세포 암종, 백혈병, 임파종, 골수종, 또는 다른 충실성 종양을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
암을 앓고 있는 피험자의 시료내 소낭과 연합된 표식을 포함하는 순환하는 생물지표의 생체 특징을 이용하여 피험자의 후보 치료를 선택할 수 있다. 생체특징은 여기에서 제시한 본 발명의 방법들에 따라 측정할 수 있다. 일부 구체예들에서, 후보 치료는 암의 표준 치료를 포함한다. 이 생체특징을 이용하여 피험자가 특정 치료 또는 표준 치료에 비-반응자인지 또는 반응자인지를 판단할 수 있다. 표준 치료 또는 치료는 암 치료 가령, 방사능요법, 외과술, 화학요법 또는 이의 조합일 수 있다. 이 치료는 치료 가령, 항-암 물질 및 화학요법 섭생일 수 있다.
본 발명에 이용하기 위한 암 치료는 표 8에 열거된 것들을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
Figure pct00039
Figure pct00040
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
Figure pct00044
Figure pct00045
Figure pct00046

표 8에 나타낸 것과 같이, 암 처리는 다양한 외과적 그리고 치료요법적 처리를 포함한다. 항-암 물질들운 적운 분자들과 생물학제와 같은 약물을 포함한다. 본 발명의 방법들을 이용하여 처리 효과를 모니터링, 피험자를반응자 또는 비-반응자로 분류, 또는 후보 치료 물질을 선택하는 등과 같은 진단치료 목적으로 이용할 수 있는 순환하는 생물지표들을 포함하는 생체특징을 확인할 수 있다. 본 발명을 이용하여 표 8-10에 암 처리와 관련된 치료진단을 포함하나 이에 한정되지 않는 암 처리용 치료 진단을 제공할 수 있다. 본 발명의 방법들에 따른 후보 처리로 확인될 수 있는 암 요법은 표 8-10에 열거된 화학치료 물질들 및 이의 임의의 적절한 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 한 구체예에서, 이 처리들은 특이적 유형의 암에 특이적인데, 예를 들면, 표 8에서 전립선 암, 결장직장 암, 유방 암 및 폐암에 대해 열거된 처리와 같이 특이적이다. 다른 구체예들에서, 이 처리들은 이의 기원과 무관하게, 그러나, 표 9-10에 열거한 표식을 포함하는 생체특징을 나타내는 종양에 대해 특이적이다.
본 발명은 암 처리를 모니터하는 방법들을 제공하는데, 이 방법들은 시간이 경과함에 따라, 가령, 처리 전, 그리고 처리 후, 또는 처리후 시간이 경과한 후, 피험자에서 일련의 생체특징들을 확인하는 것을 포함한다. 이 생체특징들을 기준과 비교하여 처리의 효과를 결정한다. 한 구체예에서, 이 처리는 가령, 방사능, 외과술, 화학요법, 생물학적 요법, 네오-어쥬번트 요법, 어쥬번트 요법, 또는 주의깊게 관찰하는 것과 같이, 표 8-10에서 선택한다. 기준은 또다른 개별 또는 개별 집단의 것을 수도 있고, 동일한 피험자의 것일 수도 있다. 예를 들면, 암 전-처리를 나타내는 생체특징을 가진 피험자는 성공적인 처리 후 건강상태를 나타내는 생체특징을 가질 수 있다. 역으로, 이 피험자는 성공적이지 못한 처리 후 암을 나타내는 생체특징을 가질 수 있다. 이 생체특징들을 시간의 경과에 따라 비교하여, 피험자의 생체 특징이 상태의 개선, 악화 또는 변화없음을 나타내는 지를 판단할 수 있다. 이 암이 시간이 경과함에 따라 악화되었는지 또는 변화가 없는 지에 대해 추가 처리를 요청할 수 있다. 예를 들면, 외과술 또는 방사능 요법에 추가하여 호르몬 요법을 이용하여, 좀더 공격적인 전립선 암을 치료할 수 있다. 전립선 암 처리의 효과를 모니터하기 위하여 생체 특징에서 다음의 miR중 하나 이상을 이용할 수 있다: hsa-miR-1974, hsa-miR-27b, hsa-miR-103, hsa-miR-146a, hsa-miR-22, hsa-miR-382, hsa-miR-23a, hsa-miR-376c, hsa-miR-335, hsa-miR-142-5p, hsa-miR-221, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-151-3p, hsa-miR-21, hsa-miR-16. 다음의 공개문헌에 열거된 하나 이상의 miRs를 이용하여 GI 관의 암 처리를 모니터할 수 있다: Albulescu et al., Tissular and soluble miRNA for diagnostic and therapy improvement in digestive tract cancers, Exp Rev Mol Diag, 11:1, 101-120.
일부 구체예들에서, 본 발명은 후보 치료를 선택하기 위하여 피험자의 시료 안에 생체특징을 확인하는 방법을 제공한다. 예를 들면, 이 생체특징은 약물-연합된 표적이 돌연변이된 것인지 또는 차등적으로 발현된 것인지를 나타내고, 이에 의해, 피험자가 특정 처리에 반응할 것인지 또는 반응하지 않는지를 나타낸다. 후보 처리는 항-암 물질들 또는 표 8-10에서 확인된 치료 물질들의 부류로부터 선택할 수 있다. 일부 구체예들에서, 해당 방법들에 따라 확인된 후보 치료는 다음으로 구성된 군으로부터 선택한다: 5-플로오로우라실, 아라레릭스, 아렘투주마브, 아미노글루테티미드, 아나스트로졸, 아스파라기나제, 아스피린, ATRA, 아자씨티딘, 베바시주마브, 벡사로텐, 비칼루티미드, 칼시트리올, 카페시타빈, 카르보플라틴, 세리콕시브, 세투시마브, 화학요법, 콜레칼시페롤, 시스플라틴, 시타라빈, 다사티니브, 다우노루비신, 데시타빈, 독소루비신, 에피루비신, 에르로티니브, 이토포시드, 엑세미스탄, 플루타미드, 풀베스트란트, 게피티니브, 겜시타빈, 고나도레린, 고세레린, 하이드록시우레아, 이마티니브, 이리노테칸, 라파티니브, 레트로졸, 루프로리드, 리포좀성-독소루비신, 메드록시프로게스테론, 메게스트롤, 메게스트롤 아세테이트, 메토트렉세이트, 미토마이신, nab-파클리탈셀, 오트레오티드, 옥사리플라틴, 파클리탁셀, 파니투무마브, 페가스파라가스, 페메트렉시드, 펜토스타틴, 소라페니브, 수리니티브, 탐옥시펜, 탁센, 테모졸로미드, 토레미펜, 트라스투주마브, VBMCP, 및 빈크리스틴.
후보 처리를 선택하는 것과 유사하게, 본 발명은 암을 치료할 수 있는지에 대한 판단 방법 또한 제공한다. 예를 들면, 전립선 암은 피험자에게 실질적으로 유해할 것 같지 않은 비-공격적 질환일 수도 있다. 안드로겐 제거 (호르몬 감소)와 함께 방사능 요법은 국소적으로 진행된 전립선 암을 치료하는 표준 방법이다. 호르몬 요법의 병적상태는 발기부전, 안면 홍조, 그리고 성욕의 상실을 포함한다. 추가로, 전립선절제술과 같은 처리는 발기부전 또는 실금과 같은 병적상태를 보유할 수 있다. 따라서, 본 발명은 암이 공격성인지 또는 암의 진행(가령, 단계 또는 등급)을 나타내는 생체특징을 제공한다. 비-공격적 암 또는 국소화된 암은 즉각적인 처리를 요구하지는 않고 오히려, 가령, 전립선 암의"예의주시(watchful waiting)"을 요한다. 반면에, 공격적 또는 진전된 단계 병소는 좀더 공격적 처리 섭생프로그램을 요구할 수 있다.
표 9에서는 탐지할 생물지표들의 예들, 선택할 또는 가급적 피할 치료 물질을 열거한다. 예를 들면, 전립선암을 가진 피험자를 위한 생체특징을 확인하고, 여기에서 이 생체특징은 안드로겐 수용체 (AR)의 수준을 포함한다. AR의 과다발현 또는 과다생산, 가령, 소낭 안에서 높은 수준의 mRNA 수준 또는 단백질 수준은 피험자를 위한 후보 치료를 확인시킨다. 이러한 치료는 이 피험자를 치료하는 물질 가령, 비칼루타미드, 플루타미드, 루프로라이드, 또는 고세레린을 포함한다. 따라서, 이 피험자는 비칼루타미드, 플루타미드, 루프로라이드, 또는 고세레린에 대해 반응자로 확인된다. 또다른 설명을 위한 예에서, BCRP mRNA, 단백질, 또는 이둘 모두는 NSCLC를 앓고 있는 피험자의 소낭에서 높은 수준으로 탐지된다. 그 다음 이 피험자는 물질 Cisplatin 및 Carboplatin 또는 이 피험자에서 NSCLC를 치료하기 위하여 다른 물질보다 덜 효과적으로 간주된다. 다음의 생물지표들중 임의의 것을 피험자로부터 수득한 소낭 안에서 평가할 수 있고, 그리고 이 생물지표는 하나 이상의 핵산, 폴리펩티드, 펩티드 또는 펩티드 모방체를 포함하나 이에 한정되지 않는 형태일 수 있다. 또다른 설명을 위한 실시예에서, 하나 이상의 KRAS, BRAF, PIK3CA, 및/또는 c-KIT에서 돌연변이를 이용하여 후보 치료를 선택할 수 있다. 예를 들면, 환자에서 KRAS 또는 BRAF에서 돌연변이는 세투시마브 및/또는 파니투무마브가 이 환자를 치료하는데 덜 효과적일 것이라는 것을 의미할 수 있다.
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표 10에서는 탐지할 생물지표들의 예들, 선택할 또는 가급적 피할 치료 물질을 열거한다. 예를 들면, 암을 앓고 있는 피험자의 경우, 피험자의 소낭 안에 ADA의 과다 발현의 탐지는 이 피험자는 펜토스타틴에 대해 반응자로 분류되며, 또는 펜토스타틴은 이 피험자를 치료하는데 이용하는 물질로 확인된다. 또다른 실시예에서, 암을 앓고 있는 피험자의 경우, 피험자의 소낭 안에 BCRP의 과다 발현의 탐지는 이 피험자는 시스플라틴, 카르보플라틴, 이리노테칸, 및 토포테칸에 대해 비-반응자로 분류되며, 이는 시스플라틴, 카르보플라틴, 이리노테칸, 및 토포테칸은 이 피험자를 치료하기 위한 준-적합 물질로 확인된다.
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더욱이, 본 발명의 구체예들에서 이용된 약물 연합 및 규칙은 미국 특허 출원 12/658,770, 출원인 (February 12, 2010); 국제 국제 PCT 특허 출원 PCT/US2010/000407, 출원일(February 11, 2010); 국제 PCT 특허 출원 PCT/US2010/54366, 출원일(October 27, 2010); 그리고 미국 가특허 출원 61/427,788, 출원일(December 28, 2010)에서 찾아볼 수 있다; 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 통합된다. 가령, PCT/US2010/54366의"표 4: 치료 선별을 위한 규칙 요약".
임의의 약물-연관된 표적은 치료진단을 제시하기 위한 생체특징의 일부분일 수 있다. 치료 물질 가령, 작은 분자 또는 생물학적 분자로 조절될 수 있는 표적을 포함하는 "약물화가능한 표적(약물gable target)"은 본 발명의 생체특징에 포함시킬 수 있는 후보다. 약물-연관된 표적들은 또한 가령, 표 9와 10에 나타낸 것과 같이, 치료에 저항성을 부여할 수 있는 생물지표들을 포함한다. 이 생체특징은 유전자, 가령, DNA 서열, 및/또는 유전자 산물, 가령, mRNA 또는 단백질, 또는 약물-연관된 표적에 근거할 수 있다. 이러한 핵산 및/또는 폴리펩티드는 존재 또는 부재, 수준 또는 양, 활성, 돌연변이, 서열, 단상형(haplotype), 재배열, 복사체 수, 또는 다른 측정가능한 특징에 적용가능하도록 프로파일될 수 있다. 유전자 또는 유전자 산물은 소낭 집단, 가령, 소낭 표면 지표와 연관될 수 있거나 또는 소낭 페이로드일 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명은 암의 치료진단 방법을 제공하는데, 이 방법은 하나 이상의 약물-연관된 표적의 존재 또는 수준을 포함하는 생체특징을 확인하고, 그리고 이 생체특징에 근거하여 후보 치료를 선택하는 것을 포함한다. 약물-연관된 표적은 순환하는 생물지표, 소낭, 또는 소낭연관된 생물지표일 수 있다. 약물 연합된 표적들은 조직 또는 기원 세포와 독립적일 수 있고, 약물-연합된 표적들을 포함하는 생체특징들을 이용하여 CUPS와 같은 기원 불명의 암들을 포함하는 다양한 해부학적 기원으로부터 유래된 암과 같은, 임의의 증식성 질환에 대한 치료진단을 제공할 수 있다.
본 발명의 방법들을 이용하여 평가한 약물-연관된 표적들은 ABCC1, ABCG2, ACE2, ADA, ADH1C, ADH4, AGT, AR, AREG, ASNS, BCL2, BCRP, BDCA1, 베타 III 튜블린, BIRC5, B-RAF, BRCA1, BRCA2, CA2, 카베올린, CD20, CD25, CD33, CD52, CDA, CDKN2A, CDKN1A, CDKN1B, CDK2, CDW52, CES2, CK 14, CK 17, CK 5/6, c-KIT, c-Met, c-Myc, COX-2, 사이클린 D1, DCK, DHFR, DNMT1, DNMT3A, DNMT3B, E-캐드헤린, ECGF1, EGFR, EML4-ALK 융합, EPHA2, 에피레귤린, ER, ERBR2, ERCC1, ERCC3, EREG, ESR1, FLT1, 엽산 수용체, FOLR1, FOLR2, FSHB, FSHPRH1, FSHR, FYN, GART, GNA11, GNAO, GNRH1, GNRHR1, GSTP1, HCK, HDAC1, hENT-1, Her2/Neu, HGF, HIF1A, HIG1, HSP90, HSP90AA1, HSPCA, IGF-1R, IGFRBP, IGFRBP3, IGFRBP4, IGFRBP5, IL13RA1, IL2RA, KDR, Ki67, KIT, K-RAS, LCK, LTB, 림포톡신 베타 수용체, LYN, MET, MGMT, MLH1, MMR, MRP1, MS4A1, MSH2, MSH5, Myc, NFKB1, NFKB2, NFKBIA, NRAS, ODC1, OGFR, p16, p21, p27, p53, p95, PARP-1, PDGFC, PDGFR, PDGFRA, PDGFRB, PGP, PGR, PI3K, POLA, POLA1, PPARG, PPARGC1, PR, PTEN, PTGS2, PRPN12, RAF1, RARA, ROS1, RRM1, RRM2, RRM2B, RXRB, RXRG, SIK2, SPARC, SRC, SSTR1, SSTR2, SSTR3, SSTR4, SSTR5, 설바이빈, TK1, TLE3, TNF, TOP1, TOP2A, TOP2B, TS, TUBB3, TXN, TXNRD1, TYMS, VDR, VEGF, VEGFA, VEGFC, VHL, 예1, ZAP70, 또는 이의 임의의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이들 지표들중 하나 또는 지표들의 조합을 포함하는 생체특징을 이용하여 본 발명에 따른 표현형을 특징화할 수 있는데, 가령, 치료진단을 제공할 수 있다. 이들 지표들은 증식성 질환에 대항하여 다양한 화학요법 물질의 효과에 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 지표들을 평가하여 암의 기원 또는 유형과는 독립적으로 암에 대한 후보 치료를 선택할 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명은 암에 대한 후보 치료를 선택하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 하나 이상의 약물 연관된 표적의 수준 또는 존재를 포함하는 생체특징을 확인하고, 그리고 이 생체특징을 가진 환자에 대해 예측되는 효과에 근거하여 후보 치료를 선택하는 것을 포함한다. 하나 이상의 약물-연관된 표적은 상기 언급된 표적들 또는 표 9-10에서 언급된 표적들중 하나일 수 있다. 일부 구체예들에서, 하나 이상의 약물-연관된 표적들의 최소한 2가지, 3가지, 4가지, 5가지, 6가지, 7가지, 8가지, 9가지, 10가지, 12가지, 15가지, 20가지, 25가지, 30가지, 35가지, 40가지, 45가지, 또는 최소한 50가지를 평가한다. 하나 이상의 약물-연관된 표적은 소낭과 연관될 수 있는데, 가령, 소낭 표면 지표 또는 핵산 (가령, DNA, mRNA) 또는 단백질과 같은 소낭 페이로드일 수 있다. 일부 구체예들에서, 하나 이상의 약물-연관된 표적과 상호작용하는 것으로 공지된 microRNA의 존재 또는 수준을 평가하고, 여기에서 하나 이상의 약물-연관된 표적을 억제하는 것으로 알려진 microRNA의 수준이 높다는 것은 하나 이상의 약물-연관된 표적의 발현 수준이 낮음을 나타내고, 따라서 이 약물-연관된 표적에 대항하는 치료에 대해 반응 가능성이 더 낮음을 나타낼 수 있다. 하나 이상의 약물-연관된 표적은 순환하는 생물지표들일 수 있다. 하나 이상의 약물-연관된 표적은 조직 시료 안에서 평가할 수 있다. 예측된 효과는 기준 값에 대한 하나 이상의 약물-연관된 표적의 존재 또는 수준을 비교하여 결정할 수 있는데, 여기에서 기준보다 더 높은 수준은 이 피험자가 반응자일 가능성이 있음을 나타낸다. 예측된 효과는 분류자 알고리즘을 이용하여 결정할 수 있는데, 여기에서 분류자는 후보 치료에 대해 반응자 또는 비-반응자로 공지된 피험자에서 하나 이상의 약물-연관된 표적의 생체특징을 비교하여 훈련받는다. 하나 이상의 약물-연관된 표적과 적합한 후보 표적들의 분자 연합은 표 9-10과 미국 특허 출원 12/658,770, 출원일(February 12, 2010); 국제 PCT 특허 출원 PCT/US2010/000407, 출원일(February 11, 2010); 국제 PCT 특허 출원 PCT/US2010/54366, 출원일(October 27, 2010); 2011년 4월 6일자로 제출된 국제 특허 출원 번호 PCT/US2011/031479, "Circulating Biomakers for Disease"(이들은 전문이 여기에 참고자료로 편입된다); 그리고 U.S. 가특허 출원 61/427,788, 출원일(December 28, 2010)에 나타내며; 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 통합된다.
국제 특허 출원 번호 PCT/US2011/031479, "Circulating Biomakers for Disease"(이들은 전문이 여기에 참고자료로 편입된다)의 표 11은 유전자 및 이에 대응하는 단백질 심볼 그리고 본 발명의 방법들에 따라 분석되는 많은 치료진단 표적들의 이름을 제시한다. 당업자들이 인지할 수 있는 바와 같이, 유전자 및 단백질들은 과학 논문들에서 다수의 대체 이름으로 발달되어왔다. 따라서, 국제 특허 출원 번호 PCT/US2011/031479, "Circulating Biomakers for Disease"(이들은 전문이 여기에 참고자료로 편입된다)의 표 11에 열거된 것들은 설명을 위한 것이며, 완전하게 포괄적으로 편집된 것은 아니다. 유전자의 가명 및 설명의 추가 목록들은 GeneCards® (www.genecards.org), HUGO Gene Nomenclature (www.genenames.org), Entrez Gene (www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=gene), UniProtKB/Swiss-Prot (www.uniprot.org), UniProtKB/TrEMBL (www.uniprot.org), OMIM (www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=OMIM), GeneLoc (genecards.weizmann.ac.il/geneloc/), 및 Ensembl (www.ensembl.org)을 포함하는 온라인 데이터베이스를 이용하면 찾아볼 수 있다. 일반적인으로, 유전자 심볼 및 이름은 HUGO에 의해 승인된 것들에 대응하며, 그리고 단백질 이름은 UniProtKB/Swiss-Prot에서 권장하는 것들이다. 통상의 대체 이름 또한 제시한다. 단백질 이름이 전구물질을 나타낼 경우, 성숙 단백질 또한 내포한다. 출월을 통하여 유전자 및 단백질의 심볼은 서로 호환가능하며, 의미는 필요할 때 본 내용으로부터 유추할 수 있다.
예를 들면, 비-소 세포 폐암을 앓는 피험자를 위한 치료를 선택할 수 있다. 하나 이상의 생물지표들, 가령, EGFR, 절제 복구 교차-상보성 집단 1 (ERCC1), p53, Ras, p27, 분류 III 베타 튜블린, 유방암 유전자 1 (BRCA1), 유방암 유전자 1 (BRCA2), 그리고 리보뉴클레오티드 환원효소 메신져 1 (RRM1)를 포함하나 이에 한정되지 않는 지표들을 피험자의 소낭으로부터 평가될 수 있다. 하나 이상의 생물지표들의 하나 이상의 특징에 근거하여, 이 피험자가 치료, 가령, 에르로티니브, Carboplatin, Paclitaxel, Gefitinib, 또는 이의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는 치료에 대하여 반응자인지 또는 비-반응자인지를 결정할 수 있다.
또다른 구체예에서, 직장결장암을 앓는 피험자를 위한 치료를 선택할 수 있고, 가령, K-ras을 포함하나 이에 한정되지 않는 생물지표를 피험자의 소낭으로부터 평가할 수 있다. 하나 이상의 생물지표들의 하나 이상의 특징에 근거하여, 이 피험자가 치료, 가령, 파니투무마브, 쎄투시마브 또는 이의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는 치료에 대하여 반응자인지 또는 비-반응자인지를 결정할 수 있다.
또다른 구체예에서, 유방암을 앓는 피험자를 위한 치료를 선택할 수 있고, 가령, HER2, 토포이소메라제 II α, 에스트로겐 수용체, 및 프로게스테론 수용체를 포함하나 이에 한정되지 않는 생물지표를 피험자의 소낭으로부터 평가할 수 있다. 하나 이상의 생물지표들의 하나 이상의 특징에 근거하여, 이 피험자가 치료, 가령, Trastuzumab, Anthra시클린es, Ttaxane, Methotrexate, Flurouracil 또는 이의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는 치료에 대하여 반응자인지 또는 비-반응자인지를 결정할 수 있다.
상기에서 설명한 것과 같이, 암을 치료진단하는데 이용되는 생체특징은 단백질 또는 mRNA 또는 microRNA를 포함하는 핵산일 수 있는 하나 이상의 생물지표들의 분석을 포함할 수 있다. 이 생물지표는 체액 안에서 탐지될 수 있으며 및/또는 소낭과 연관될 수 있는데, 가령, 소낭 항원 또는 소낭 페이로드일 수 있다. 설명을 위한 예에서, 이 생체특징을 이용하여 티로신 키나제 억제제에 환자가 반응자 또는 비-반응자인지를 확인한다. 이 생물지표들은 WO/2010/121238, "METHODS AND KIT TO PREDICT THERAPEUTIC OUTCOME OF TYROSIN KINASE INHIBITORS"출원일(April 19, 2010); 또는WO/2009/105223, "SYSTEMS AND METHODS OF CANCER STAGING AND 치료" 출원일(February 19, 2009); 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 통합된다)에서 설명된 것들일 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 피험자가 티로신 키나제 억제제에 반응을 할지 또는 하지 않을 지를 판단하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 피험자로부터 얻은 시료 안의 소낭 집단에서 하나 이상의 생물지표들을 확인하는 것을 포함하고, 여기에서 기준과 비교하여 시료내 하나 이상의 생물지표들의 차등 발현은 이 피험자가 티로신 키나제 억제제에 대해 반응자 또는 비-반응자인지를 나타낸다. 한 구체예에서, 하나 이상의 생물지표는 miR-497을 포함하는데, 여기에서 miR-497의 감소된 발현은 이 피험자가 반응자임을 나타낸다 (가령, 티로신 키나제 억제제에 민감성). 또다른 구체예에서, 하나 이상의 생물지표는 하나 이상의 miR-21, miR-23a, miR-23b, 및 miR-29b을 포함하는데, 여기에서 microRNA의 상향조절은 이 피험자가 비-반응자일 가능성을 나타낸다 (가령, 티로신 키나제 억제제에 저항성). 일부 구체예들에서, 하나 이상의 생물지표는 하나 이상의 hsa-miR-029a, hsa-let-7d, hsa-miR-100, hsa-miR-1260, hsa-miR-025, hsa-let-7i, hsa-miR-146a, hsa-miR-594-Pre, hsa-miR-024, FGFR1, MET, RAB25, EGFR, 키트 및VEGFR2을 포함한다. 또다른 구체예에서, 하나 이상의 생물지표는 FGF1, HOXC10 또는 LHFP를 포함하는데, 여기에서 이 생물지표의 더 높은 발현은 이 피험자가 비-반응자 (가령, 티로신 키나제 억제제에 저항성)임을 나타낸다. 이 방법을 이용하여 티로신 키나제 억제제에 대한 암, 가령, 비-소 세포 폐암 세포, 신장 암 또는 GIST의 감응성을 판단할 수 있다. 티로신 키나제 억제제는 에르로티니브(에르로티니브), 반데타니브(vandetanib), 수니티니브(sunitinib) 및/또는 소라페니브(sorafenib), 또는 유사한 작용 기전에 의해 작용하는 다른 억제제들일 수 있다. 티로신 키나제 억제제는 특이적 또는 비-특이적 방식으로 하나 이상의 티로신 키나제의 작용을 억제하는 임의의 물질을 포함한다. 티로신 키나제 억제제는 직접적으로, 간접적으로, 알로스페릴적으로(allosterically), 또는 임의의 다른 방식으로 티로신 잔기 포스포릴화를 억제하는 작은 분자들, 항체들, 펩티드들, 또는 임의의 적합한 엔터티를 포함한다. 티로신 키나제 억제제들의 특정 예로는 N-(트리플로오르메틸페닐)-5-메틸오소옥사졸-4-카르복사미드, 3-[(2,4-디메틸피롤-5-yl)메틸리데닐)인돌린-2-온, 17-(아릴아미노)-17-데메톡시겔다나마이신, 4-(3-클로로-4- 플로오로페닐아미노)-7-메톡시-6-[3-(4-몰포리닐)프로폭실]퀴나졸린, N-(3-에티닐페닐)-6,7-비스(2-메톡시에톡시)-4-퀴나졸린아민, BIBX1382, 2,3,9,10,11,12- 헥사하이드로-10-(하이드록시메틸)-10-하이드록시-9-메틸-9,12-에폭시-1H-하이드로[1,2,3-fg:3',2',1'-kl]피롤로[3,4-i][l,6]벤조디아조신-1-온, SH268, 게니스테인, STI571, CEP2563, 4-(3-클로로페닐아미노)-5,6-디메틸-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘메탄 술포네이트, 4-(3-브로모-4-하이드록시페닐)아미노-6,7-디메톡시퀴나졸린, 4-(4'-하이드록시페닐)아미노-6,7-디메톡시퀴나졸린, SU6668, STI571A, N-4-클로로페닐-4-(4-피리딜메틸)-1-프탈진아민, N-[2-(디에틸아미노)에틸]-5-[(Z)-(5-플로오로-1,2-디하이드로-2-옥소-3H-인돌-3-일리덴)메틸]-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카르복사미드 (일반적으로 수니티니브(sunitinib)로 공지됨), A-[A-[[4-클로로-3(트리플로오르메틸)페닐]카르바모일아미노]페녹시]-N-메틸-피리딘-2-카르복사미드 (일반적으로 소라페니브(sorafenib)로 공지됨), EMD121974, 그리고 N-(3-에티닐페닐)-6,7- 비스(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-4-아민(일반적으로 에르로티니브(에르로티니브)로 공지됨). 일부 구체예들에서, 티로신 키나제 억제제는 상피 성장 인자 수용체 (EGFR), VEGFR, PDGFR 베타, 및/또는 FLT3에서 억제제 활성을 보유한다.
따라서, 본 발명의 방법들에 의해 확인된 생체특징에 근거하여, 암을 앓고 있는 피험자를 위한 치료를 선택할 수 있다. 따라서, 이 생체특징은 microRNA, 소낭, 또는 임의의 유용한 소낭 연관된 생물지표를 포함하는 순환하는 생물지표의 존재 또는 수준을 포함할 수 있다.
본 발명의 이 방법을 이용하여, 심혈관 질환, 신경성 질환 및 장애들, 면역 질환및 장애들 그리고 감염성 질환을 포함하는 기타 질환의 치료진단에 이용될 수 있는 생물지표들은 2011년 4월 6일자로 제출된 국제 특허 출원 번호 PCT/US2011/031479, "Circulating Biomakers for Disease"(이들은 전문이 여기에 참고자료로 편입된다)에 설명된다.
생물특징 발견
본 명세서에서 기술된 시스템 및 방법은 소낭의 신규한 생물특징, 이를 테면, 표현형의 진단, 예후 또는 치료진단을 위한 하나 또는 그 이상의 새로운 생물지표들의 확인에 이용될 수 있다. 한 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 소낭은 결정되는 하나 또는 그 이상의 소낭의 표현형 및 생물특징을 가진 대상으로부터 단리될 수 있다. 이 생물특징은 이 표현형이 없는 대상과 비교될 수 있다. 두 가지 생물특징 사이에 차이를 측정하고, 이를 이용하여 새로운 생물특징을 만들 수 있다. 새로운 생물특징은 이 표현형을 가진 또는 이 표현형을 가지지 않는 또다른 대상을 확인하는데 이용될 수 있다.
특정 표현형을 가진 대상의 생물특징간의 차이는 이 특정 표현형을 가지지 않는 대상의 생물특징과 비교될 수 있다. 하나 또는 그 이상의 차이는 소낭의 임의의 특징의 차이일 수 있다. 예를 들면, 이 시료 안에 소낭의 수준 또는 양, 소낭의 반감기, 소낭의 순환하는 반감기, 소낭의 대사 반감기, 또는 소낭의 활성, 또는 이의 임의의 조합은 특정 표현형을 가진 대상의 생물특징과 특정 표현형을 가지지 않는 대상의 이 생물특징 사이에서 상이할 수 있다.
일부 구체예들에서, 하나 또는 그 이상의 생물지표들은 특정 표현형을 가진 대상의 생물특징과 특정 표현형을 가지지 않는 대상 간에 다르다. 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 생물지표들의 발현 수준, 존재, 부재, 돌연변이, 변리, 카피수 변이, 절두, 복제, 변형, 분자 연합, 또는 이의 임의의 조합은 특정 표현형을 가지는 대상의 생물특징과 특정 표현형을 가지지 않는 대상의 생물특징 간에 다르다. 생물지표는 본 명세서에서 기술된 임의의 생물지표이거나 또는 순환하는 생물지표, 이를 테면, 단백질 또는 microRNA, 소낭, 또는 소낭 안에 또는 소낭 상에 존재하는 성분, 이를 테면, 임의의 핵산 (가령 RNA 또는 DNA), 단백질, 펩티드, 폴리펩티드, 항원, 지질, 탄수화물, 또는 프로테오글리칸을 포함하는 생물학적 엔터티를 특징화하는데 이용되는 것일 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 시료 집단 간에 차이를 보여주는 생물지표들을 확인하기 위하여 2개 또는 그 이상의 시료 집단 사이에서 생물지표들을 비교하는 것을 포함하는 신규한 생물특징을 발견하는 방법을 제공한다. 다중 지표들은 개별 지표들의 성과를 잠재적으로 개선시키기 위하여 패널 포맷에서 평가될 수 있다. 일부 구체예들에서, 다중 지표들은 다중 방식으로 평가된다. 집단을 차등화시키기 위하여 개별 지표들 및 지표들의 능력은 본 명세서에서 기술된 것과 같이 통계학적 분별 분석 또는 분류 방법을 이용하여 평가될 수 있다. 지표들의 최적의 패널을 생물특징으로 이용하여 이 분석하에서 표현형을 특징화시키는데, 이를 테면, 질환 또는 상태의 진단, 예후 또는 치료진단을 제공한다. 최적화는 특정 특이성에서 ROC AUC를 최대화시키고, 정확성, 감응성을 최대화시키거나, 또는 특정 감응도에서 특이성을 최대화시키는 것을 포함하나 이에 한정되지 않는, 다양한 기준에 근거될 수 있다. 패널은 다중 유형의 생물지표들을 포함할 수 있다. 예를 들면, 이 생물특징은 관심대상의 소낭 집단을 캡쳐하는데 유용한 소낭 항원을 포함할 수 있고, 그리고 이 생물특징은 microRNA, mRNA들, 또는 가용성 단백질을 포함하나 이에 한정되지 않는 소낭 집단 내 페이로드 지표들을 더 포함할 수 있다. 최적의 조합은 두 가지 설장을 비교하였을 때, 최대의 ROC AUC 값을 가진 소낭 항원 및 페이로드 지표로 확인될 수 있다. 또다른 실시예로써, 이 생물특징은 엑소좀(엑소좀)의 단리에 의해 획득되지 않는 순환하는 생물지표들, 이를 테면, 순환하는 단백질 및/또는 microRNA의 평가에 추가적으로, 소낭 집단의 평가에 의해 측정될 수 있다.
표현형은 여기에서 언급된 임의의 것들, 가령, 상기"표현형" 구역에 있는 것들일 수 있다. 예를 들면, 표현형은 증식성 장애 이를 테면, 암 또는 비-악성 성장, 주산기(perinatal) 또는 임신 관련된 상태, 감염성 질환, 신경성 장애, 심혈관 질환, 염증성 질환, 면역 질환, 또는 자가면역 질환일 수 있다.
암은 비-소(small) 세포 폐암 및 소세포 폐암 (소세포 암종 (연맥 세포 암), 혼합형 소세포/거대 세포 암종, 및 복합형 소세포 암종을 포함)을 포함하는 폐암, 결장암, 유방암, 전립선 암, 간암, 췌장암, 뇌 암, 신장암, 난소암, 위암, 흑색종, 골암, 위장암, 유방암, 신경교종, 교아종, 간세포 암종, 유두상 신장 암종, 두경부 편형상피세포 암종, 백혈병, 임파종, 골수종, 또는 충실성 종양을 포함한다.
본 명세서에서 기술된 생물지표들 또는 특이적 생물지표들의 임의의 유형이 평가되어, 새로운 생물특징, 가령, 표 3-5의 생물지표들을 발견할 수 있다. 한 구체예에서, 발견을 위하여 선택된 생물지표들은 세포-특이적 생물지표들, 가령 2011년 4월 6일자로 제출된 국제 특허 출원 번호 PCT/US2011/031479, "Circulating Biomarkers for Disease"의 도 1-60 및 표 9-10 또는 표 16에 열거된 유전자 및 microRNA를 포함하나 이에 한정되지 않으며, 이는 전문이 여기에 참고자료로 편입된다. 생물지표들은 예를 들면, 표 11에 열거된 하나 또는 그 이상의 질환 연합된, 약물 연합된, 또는 예후적 표적을 포함할 수 있다. 생물지표들은 하나 또는 그 이상의 일반적 소낭 지표, 하나 또는 그 이상의 세포-특이적 소낭 지표, 및/또는 하나 또는 그 이상의 질환-특이적 소낭 지표를 포함할 수 있다.
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The 생물지표들 used for 생물특징 발견에 이용된 생물지표들은 표 11에 있는 하나 또는 그 이상의 소낭 생물지표를 포함하나 이에 한정되지 않는, 소낭과 공통적으로 연합된 지표들을 포함할 수 있다. 다른 생물지표들은 엑소좀에서 확인된 단백질 및 RNA 분자를 개시하는 exocarta.ludwig.edu.au에서 이용가능한 ExoCarta 데이터베이스에서 공개된 것으로부터 선택될 수 있다. Mathivanan and Simpson, ExoCarta: A compendium of exosomal proteins and RNA. Proteomics. 2009 Nov 9(21):4997-5000 참고.
생물특징 발견에 이용된 생물지표들은 하나 또는 그 이상의 A33, a33 n15, AFP, ALA, ALIX, ALP, AnnexinV, APC, ASCA, ASPH (246-260), ASPH (666-680), ASPH (A-10), ASPH (D01P), ASPH (D03), ASPH (G-20), ASPH (H-300), AURKA, AURKB, B7H3, B7H4, BCA-225, BCNP1, BDNF, BRCA, CA125 (MUC16), CA-19-9, C-Bir, CD1.1, CD10, CD174 (Lewis y), CD24, CD44, CD46, CD59 (MEM-43), CD63, CD66e CEA, CD73, CD81, CD9, CDA, CDAC1 1a2, CEA, C-Erb2, C-erbB2, CRMP-2, CRP, CXCL12, CYFRA21-1, DLL4, DR3, EGFR, Epcam, EphA2, EphA2 (H-77), ER, ErbB4, EZH2, FASL, FRT, FRT c.f23, GDF15, GPCR, GPR30, Gro-알파, HAP, HBD 1, HBD2, HER 3 (ErbB3), HSP, HSP70, hVEGFR2, iC3b, IL 6 Unc, IL-1B, IL6 Unc, IL6R, IL8, IL-8, INSIG-2, KLK2, L1CAM, LAMN, LDH, MACC-1, MAPK4, MART-1, MCP-1, M-CSF, MFG-E8, MIC1, MIF, MIS RII, MMG, MMP26, MMP7, MMP9, MS4A1, MUC1, MUC1 seq1, MUC1 seq11A, MUC17, MUC2, Ncam, NGAL, NPGP/NPFF2, OPG, OPN, p53, p53, PA2G4, PBP, PCSA, PDGFRB, PGP9.5, PIM1, PR (B), PRL, PSA, PSMA, PSME3, PTEN, R5-CD9 튜브 1, Reg IV, RUNX2, SCRN1, 세프라제, SERPINB3, SPARC, SPB, SPDEF, SRVN, STAT 3, STEAP1, TF (FL-295), TFF3, TGM2, TIMP-1, TIMP1, TIMP2, TMEM211, TMPRSS2, TNF-알파, Trail-R2, Trail-R4, TrKB, TROP2, Tsg 101, TWEAK, UNC93A, VEGF A, 및 YPSMA-1을 포함하나 이에 한정되지 않는 소낭과 공통적으로 연합된 지표를 포함할 수 있다. 이 생물지표들은 하나 또는 그 이상의 NSE, TRIM29, CD63, CD151, ASPH, LAMP2, TSPAN1, SNAIL, CD45, CKS1, NSE, FSHR, OPN, FTH1, PGP9, ANNEXIN 1, SPD, CD81, EPCAM, PTH1R, CEA, CYTO 7, CCL2, SPA, KRAS, TWIST1, AURKB, MMP9, P27, MMP1, HLA, HIF, CEACAM, CENPH, BTUB, INTG b4, EGFR, NACC1, CYTO 18, NAP2, CYTO 19, ANNEXIN V, TGM2, ERB2, BRCA1, B7H3, SFTPC, PNT, NCAM, MS4A1, P53, INGA3, MUC2, SPA, OPN, CD63, CD9, MUC1, UNCR3, PAN ADH, HCG, TIMP, PSMA, GPCR, RACK1, PCSA, VEGF, BMP2, CD81, CRP, PRO GRP, B7H3, MUC1, M2PK, CD9, PCSA, 및 PSMA를 포함할 수 있다. 이 생물지표들은 또한 하나 또는 그 이상의 TFF3, MS4A1, EphA2, GAL3, EGFR, N-gal, PCSA, CD63, MUC1, TGM2, CD81, DR3, MACC-1, TrKB, CD24, TIMP-1, A33, CD66 CEA, PRL, MMP9, MMP7, TMEM211, SCRN1, TROP2, TWEAK, CDACC1, UNC93A, APC, C-Erb, CD10, BDNF, FRT, GPR30, P53, SPR, OPN, MUC2, GRO-1, tsg 101 및 GDF15를 포함할 수 있다. 구체예들에서, 생물특징을 발견하기 위하여 이용된 생물지표들은 2011년 4월 6일자로 제출된 국제 특허 출원 번호PCT/US2011/031479, "Circulating Biomarkers for Disease"의 도 99, 100, 108A-C, 114A, 및/또는 115A-E에 나타낸 것들중 하나 또는 그 이상을 포함하며, 이 출원은 전문이 여기에 참고자료로 편입된다.
본 명세서에서 기술된 임의의 지표 또는 관심 대상의 2개의 시료 또는 시료 집단 간에 비교될 지표들을 이용하여 비교될 수 있는 임의의 주어진 생물학적 설정에 대한 신규한 생물특징을 발견할 수 있음을 당업자는 인지할 것이다.
그 다음 하나 또는 그 이상의 차이를 이용하여 특정 표현형에 대한 후보 생물특징을 만들 수 있는데, 이를 테면, 상태의 진단, 질환 또는 상태의 단계 진단, 상태의 예후, 또는 상태의 치료 진단을 할 수 있다. 신규한 생물특징은 다른 대상에서 표현형을 확인하는데 이용될 수 있다. 새로운 대상에 대해 소낭의 생물특징을 결정하고, 신규한 특징과 비교하여, 이 대상이 신규한 생물특징이 확인된 특정표현형을 보유하는 지를 결정할 수 있다.
예를 들면, 암을 가진 대상의 이 생물특징은 암이 없는 또다른 대상과 비교될 수 있다. 임의의 차이는 암 진단을 위한 신규한 생물특징을 만드는데 이용될 수 있다. 또다른 구체예에서, 진행된 단계의 암을 가진 대상의 생물특징은 덜 진행된 단계의 암을 가진 또다른 대상과 비교될 수 있다. 임의의 차이를 이용하여 암의 단계 분류를 위한 신규한 생물특징을 만들 수 있다. 여전히 또다른 구체예에서, 진행된 단계의 암을 가진 대상의 이 생물특징은 덜 진행된 단계의 암을 가진 또다른 대상과 비교될 수 있다. 임의의 차이를 이용하여 암의 단계 분류를 위한 신규한 생물특징을 만들 수 있다.
한 구체예에서, 표현형은 치료제에 대해 약물 저항성 또는 비-반응성이다. 하나 또는 그 이상의 소낭은 특정 치료 및 결정되는 소낭의 생물특징에 대해 비-반응자로부터 단리될 수 있다. 비-반응자로부터 획득된 소낭의 생물특징은 반응자로부터 획득된 소낭의 이 생물특징과 비교될 것이다. 비-반응자의 생물특징 사이의 차이는 반응자의 생물특징과 비교될 수 있다. 하나 또는 그 이상의 차이는 소낭의 임의의 특징에서 차이일 수 있다. 예를 들면, 이 시료 안에 소낭의 양 또는 수준, 소낭의 반감기, 소낭의 순환하는 반감기, 소낭의 대사 반감기, 소낭의 활성, 또는 이의 임의의 조합은 비-반응자의 생물특징과 반응자의 생물특징 사이에서 다를 수 있다.
일부 구체예들에서, 하나 또는 그 이상의 생물지표들은 비-반응자의 생물특징과 반응자의 생물특징간에 상이하다. 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 생물지표들의 발현 수준, 존재, 부재, 돌연변이, 변리, 카피수 변이, 절두, 복제, 변형, 분자 연합, 또는 이의 임의의 조합은 비-반응자의 생물특징과 반응자의 생물특징간에 상이하다.
일부 구체예들에서, 이 차이는 소낭에 존재하는 약물 또는 약물 대사물질의 양에 있을 수 있다. 반응자 및 비-반응자 모두 치료제로 처리될 수 있다. 반응자의 생물특징과 비-반응자의 생물특징 간의 비교를 실행하고, 반응자의 소낭에 존재하는 약물 또는 약물 대사물질의 양은 비-반응자에 존재하는 약물 또는 약물 대사물질의 양과 상이하다. 이 차이는 약물 또는 약물 대사물질의 반감기 차이일 수도 있다. 약물 또는 약물 대사물질의 양 또는 반감기의 차이는 비-반응자 및 반응자 반응자를 확인하기 위한 신규한 생물특징을 만드는데 이용될 수 있다.
본 명세서에서 기술된 방법 및 조성물에 유용한 소낭은 물리화학적 특징의 장점을 취함으로써 발견될 수 있다. 예를 들면, 소낭은 가령, 직경이 30 ~ 120 nm의 공지 범위에서 생물학적 물질을 여과시킴으로써 이의 크기로 발견될 수 있다. 크기-기반된 발견 방법, 이를 테면, 차등원심분리, 슈크로즈 구배 원심분리, 또는 여과는 소낭의 단리에 이용되어왔었다.
소낭은 이의 분자 성분들에 의해 발견될 수 있다. 분자 성질-기반된 발견 방법은 소낭과 연합된 분자를 인지하는 항체를 이용한 면역학적 단리를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 예를 들면, 소낭과 연합된 표면 분자는 MHC-II 분자, CD63, CD81, LAMP-1, Rab7 또는 Rab5를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
당업계에 공지되어 있는 다양한 기술이 소낭의 실증 및 특징화에 이용된다. 소낭의 실증 및 특징화에 유용한 기술들은 웨스턴 블랏, 전자 현미경, 면역조직화학, 면역전자 현미경, FACS (형광 활성화된 세포 소팅), 전기영동(1 차원, 2 차원), 액체 크로마토그래피, 질량분석, MALDI-TOF (매트릭스 지원된 레이져 탈리/비행 이온화-시간), ELISA, LC-MS-MS, 그리고 nESI (나노전자분무 이온화)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 예를 들면 U.S. 특허 2009/0148460은 소낭을 특징화하기 위하여 ELISA 방법의 사용을 개시한다. U.S. 특허 2009/0258379는 생물학적 유체로부터 막 소낭의 단리를 개시한다.
소낭은 하나 또는 그 이상의 핵산, 지질, 단백질 또는 폴리펩티드, 이를 테면, 소낭 안에 표면 단백질 또는 펩티드, 또는 단백질 또는 펩티드에 대해 추가 분석될 수 있다. 후보 펩티드는 정제 방법이 결합된 질량분석 이를 테면, 액체 크로마토그래피를 포함하는 다양한 기술에 의해 확인될 수 있다. 그 다음 펩티드는 단리될 수 있고, 이의 서열은 서열화에 의해 확인될 수 있다. 펩티드의 정확한 양에 근거하여 서열을 예측하는 컴퓨터 프로그램을 또한 이용하여 소낭으로부터 단리된 펩티드의 서열을 밝힐 수 있다. 예를 들면, LTQ-Orbitrap 질량분석은 또한 고감도 및 고도의 정확한 펩티드 서열화에 이용될 수 있다. LTQ-Orbitrap 방법은 (Simpson et al, Expert Rev. Proteomics 6:267-283, 2009)에서 설명되며, 이의 전문이 여기에 참고자료로 편입된다.
소낭 조성물들
특정 생체특징을 가진 단리된 소낭을 또한 여기에서 제공한다. 단리된 소낭은 특이적 세포 유형에 특이적인, 또는 상기에서 설명된 표현형을 특징화하기 위한 하나 이상의 생물지표들을 포함할 수 있다.
단리된 소낭은 또한 하나 이상의 생물지표들을 포함할 수 있는데, 여기에서 하나 이상의 생물지표들의 발현 수준은 정상 세포 (가령, 관심 대상의 표현형이 없는 피험자로부터 유도된 세포)로부터 유도된 단리된 소낭과 비교하여 더 높거나, 더 낮거나 또는 동일하다. 예를 들면, 단리된 소낭은 B7H3, PSCA, MFG-E8, Rab, STEAP, PSMA, PCSA, 5T4, miR-9, miR-629, miR-141, miR-671-3p, miR-491, miR-182, miR-125a-3p, miR-324-5p, miR-148b, 및 miR-222로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 생물지표들을 포함할 수 있고, 여기에서 하나 이상의 생물지표들의 발현 수준은 정상 세포로부터 유도된 것들과 비교하여 단리된 소낭에서 더 높다. 단리된 소낭은 집단으로부터 선택한 최소한 2가지, 3가지, 4가지, 5가지, 6가지, 7가지, 8가지, 9가지, 10가지, 11가지, 13가지, 14가지, 15가지, 16가지, 17가지, 18가지, 또는 19가지 생물지표들을 포함할 수 있다. 단리된 소낭은 EpCam, B7H3, PSMA, PSCA, PCSA, CD63, CD59, CD81, 또는 CD9으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 생물지표들을 더 포함할 수 있다.
단리된 소낭은 생물지표들 PCSA, EpCam, CD63, 그리고 CD8; 이 생물지표들 PCSA, EpCam, B7H3 그리고 PSMA을 포함할 수 있다. 단리된 소낭은 생물지표들 miR-9, miR-629, miR-141, miR-671-3p, miR-491, miR-182, miR-125a-3p, miR-324-5p, miR-148b, 및 miR-222를 포함할 수 있다.
단리된 소낭을 포함하는 조성물을 또한 여기에서 제공한다. 이 조성물은 하나 이상의 단리된 소낭을 포함할 수 있다. 예를 들면, 이 조성물은 다수의 소낭, 또는 소낭의 하나 이상의 집단을 포함할 수 있다.
이 조성물은 소낭에 대해 실질적으로 농축된(enriched) 것일 수 있다. 예를 들면, 이 조성물은 세포성 찌꺼기, 세포들, 또는 비-엑소좀 단백질들, 펩티드들, 또는 핵산 (가령, 소낭 안에 포함되지 않은 생물학적 분자들)을 실질적으로 가지고 있지 않다. 세포성 찌꺼기, 세포들, 또는 비-엑소좀 단백질들, 펩티드들, 또는 핵산은 소낭과 함께 생물학적 시료내에 존재할 수 있다. 세포성 찌꺼기, 세포들, 또는 비-엑소좀 단백질들, 펩티드들, 또는 핵산 (가령, 소낭 안에 포함되지 않은 생물학적 분자들)이 실질적으로 없는 조성물은 여기에서 설명된 임의의 방법, 가령, 하나 이상의 소낭에 대한 하나 이상의 결합 물질 또는 캡쳐 물질을 이용하여 수득할 수 있다. 이 소낭은 전체 조성물의 중량 또는 양의 최소한 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%를 포함할 수 있다. 이 조성물의 소낭은 이종 동종 소낭 집단일 수 있다. 예를 들면, 동종 소낭의 집단은 하나 이상의 성질들 또는 특징들에 대해 동종인 소낭을 포함한다.
따라서, 일부 구체예들에서, 이 조성물은 실질적으로 농축된(enriched) 소낭 집단을 포함한다. 이 조성물은 하나 이상의 성질들 또는 특징들에 대해 최소한 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동종인 소낭 집단에 대해 농축될 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 특징들은 하나 이상의 동일한 생물지표들, 동일한 세포 유형으로부터 유도된 실질적으로 유사한 또는 동일한 생체특징, 특정 크기의 소낭 그리고 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 특징들은 하나 이상의 동일한 생물지표들, 동일한 세포 유형으로부터 유도된 실질적으로 유사한 또는 동일한 생체특징, 특정 크기의 소낭 그리고 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 예를 들면, 소낭의 집단은 특정 생체특징을 가지고, 동일한 생물지표를 가지고, 동일한 생물지표 조합을 가지고, 또는 동일한 세포 유형으로부터 유도됨으로써 동종일 수 있다. 일부 구체예들에서, 이 조성물은 가령, 특이적 생체특징을 가진, 특이적 세포로부터 유도된 집단, 또는 이둘 모두인 실질적으로 동종의 소낭 집단을 포함한다.
소낭의 집단은 하나 이상의 동일한 생물지표들을 포함할 수 있다. 이 생물지표는 임의의 성분 가령, 임의의 핵산 (가령 RNA 또는 DNA), 단백질, 펩티드, 폴리펩티드, 항원, 지질, 탄수화물, 또는 프로테오글리칸과 같은 임의의 성분일 수 있다. 예를 들면, 집단에서 각 소낭은 동일한 또는 똑같은 하나 이상의 생물지표들을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 각 소낭은 동일한 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 25개, 50개, 75개 또는 100개 생물지표들을 포함한다.
동일한 또는 똑같은 생물지표를 포함하는 이 소낭 집단은 생물지표의 존재 또는 부재, 발현 수준, 돌연변이 상태, 또는 변형이 동일한 집단내 각 소낭을 포함할 수 있다. 예를 들면, 농축된(enriched) 소낭의 집단은 각 소낭이 동일한 생물지표를 가지고, 동일한 생물지표를 가지지 않고, 동일한 발현 수준의 생물지표를 가지고, 동일하게 변형된 생물지표를 가지거나, 또는 동일한 돌연변이된 생물지표를 가지는 소낭을 포함할 수 있다. 동일한 발현 수준의 생물지표는 정량적 또는 정성적 측정을 말하는데, 가령, 집단내 소낭은 기준 수준과 비교하여 생물지표들의 동일한 발현 수준 또는 과다발현 또는 과소발현 수준을 가진다.
대안으로, 생물지표들의 동일한 발현 수준은 집단내 각 소낭에 대해 유사한 생물지표들의 발현을 나타내는 수치값일 수 있다. 예를 들면, miRNA의 복사체 수, 단백질의 양 또는 mRNA의 수준이 집단내 각 소낭에서 정량적으로 유사할 수 있고, 각 소낭의 수치는 이러한 변이가 적합할 때 집단내 각 소낭의 양으로부터 ± 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 또는 20% 일 수 있다.
일부 구체예들에서, 이 조성물은 실질적으로 농축된(enriched) 소낭 집단을 포함하며, 여기에서 농축된(enriched) 집단내 소낭은 실질적으로 유사한 또는 똑같은 생체특징을 가진다. 이 생체특징은 소낭의 하나 이상의 특징, 가령, 소낭의 수준 또는 양, 소낭 반감기내에서 변이의 일시적 평가, 순환하는 소낭 반감기, 소낭의 대사 반감기, 또는 소낭의 활성을 포함한다. 생체특징은 또한 생물지표, 가령, 여기에서 설명된 생물지표들의 존재 또는 부재, 발현 수준, 돌연변이 상태 또는 변형을 포함할 수 있다.
집단내 각 소낭의 생체특징은 최소한 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는99% 똑같다. 일부 구체예들에서, 각 소낭의 생체특징은 100% 똑같다. 농축된(enriched) 집단내 각 소낭의 생체특징은 동일한 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 25개, 50개, 75개 또는 100개 특징들을 가질 수 있다. 예를 들면, 농축된(enriched) 집단내 소낭의 생체특징은 제 1 생물지표의 존재, 제 2 생물지표의 존재, 그리고 제 3 생물지표의 과소발현일 수 있다. 동일한 집단내 또다른 소낭은 존재하는 동일한 제 1 및 제 2 생물지표들을 보유하고, 제 3 생물지표들의 과소발현인, 100% 동일할 수 있다. 대안으로, 동일한 집단내 소낭은 동일한 제 1 및 제 2 생물지표를 보유하지만, 제 3 생물지표들의 과소발현은 보유하지 않을 수 있다.
일부 구체예들에서, 이 조성물은 실질적으로 농축된(enriched) 소낭 집단을 포함하는데, 여기에서 이 소낭은 동일한 세포 유형으로부터 유도된다. 예를 들면, 이 소낭은 특이적 조직의 세포들, 관심대상의 특이적 종양의 세포들 또는 관심대상의 질환 조직의 세포들, 순환하는 종양 세포들, 또는 모계 또는 태아 기원의 세포들로부터 모두 유도될 수 있다. 이 소낭은 종양 세포들로부터 모두 유도될 수 있다. 이 소낭은 폐, 췌장, 위, 소장, 방광, 신장, 난소, 고환, 피부, 결장직장, 유방, 전립선, 뇌, 식도, 간, 태반, 또는 태아 세포들을 포함하나 이에 한정되지 않는 동일한 조직 또는 세포로부터 모두 유도될 수 있다.
실질적으로 농축된(enriched) 소낭의 집단을 포함하는 이 조성물은 특정 크기의 소낭을 또한 포함할 수 있다. 예를 들면, 이 소낭은 약 10㎚, 20㎚, 또는 30㎚ 이상의 직경을 모두 가질 수 있다. 이들은 모두 약 10-1000㎚, 예를 들면, 약 30-800㎚, 약 30-200㎚, 또는 약 30-100㎚의 직경을 보유할 수 있다. 일부 구체예들에서, 이 소낭은 모두 10,000㎚, 1000㎚, 800㎚, 500㎚, 200㎚, 100㎚ 또는 50 ㎚ 미만의 직경을 보유할 수 있다.
하나 이상의 특징들에 대해 동종 집단의 소낭은 조성물의 최소한 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서,실질적으로 농축된(enriched) 소낭의 집단을 포함하는 조성물은 이 조성물이 유도된 생물학적 시료내 소낭의 농도와 비교하여 소낭의 농도가 최소한 2, 3, 4, 5, 10, 20, 25, 50, 100, 250, 500, 또는 1000배인 소낭을 포함한다. 추가 다른 구체예들에서, 이 조성물은 소낭의 제 2 농축된(enriched) 집단을 더 포함할 수 있는데, 여기에서 소낭의 집단은 여기에서 설명된 하나 이상의 특징들에 대해 최소한 30% 동종이다.
다중 분석을 이용하여 하나 이상의 소낭 집단, 가령, 최소한 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 소낭, 집단에 대해 실질적으로 농축된 조성물을 수득할 수 있다. 각 실질적으로 농축된(enriched) 소낭 집단은 질량 또는 양에 근거하여 조성물의 최소한 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 46%, 47%, 48%, 또는 49%를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 실질적으로 농축된(enriched) 소낭 집단은 질량 또는 양에 근거하여 조성물의 최소한 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%를 포함한다.
실질적으로 농축된(enriched) 소낭의 집단은 여기에서 설명된 하나 이상의 방법들, 프로세스들 또는 시스템을 이용하여 수득할 수 있다. 예를 들면, 시료로부터 소낭 집단의 분리는 소낭의 하나 이상의 생물지표들에 대한 결합 물질, 가령, 소낭의 두 개 이상의 생물지표들을 표적으로 하는 두 개 이상의 결합 물질을 이용하여 실행할 수 있다. 하나 이상의 캡쳐 물질을 이용하여 소낭의 실질적으로 농축된(enriched) 집단을 수득할 수 있다. 하나 이상의 탐지 물질을 이용하여 실질적으로 농축된(enriched) 소낭 집단을 확인할 수 있다.
한 구체예에서, 특정 생체특징을 가진 소낭 집단은 이 생체특징의 생물지표들에 대한 하나 이상의 결합 물질을 이용하여 수득한다. 이 소낭은 단리하면, 특정 생체특징을 가진 실질적으로 농축된 소낭 집단을 포함하는 조성물을 얻는다. 또다른 구체예에서, 관심 대상의 특정 생체특징을 가진 소낭의 집단은 관심 대상의 생체특징의 성분이 아닌 생물지표들에 대한 하나 이상의 결합 물질을 이용하여 수득할 수 있다. 따라서, 결합물질을 이용하여 관심대상의 생체특징을 보유하지 않은 소낭을 제거하고, 따라서 생성된 조성물은 관심대상의 특정 생체특징을 가진 실질적으로 농축된(enriched) 소낭의 집단이다. 생성된 조성물은 결합 물질에 대한 생물지표들을 포함하는 소낭이 실질적으로 없다.
2011년 4월 6일자로 제출된 국제 특허 출원 번호 PCT/US2011/031479, "Circulating Biomakers for Disease"(이들은 전문이 여기에 참고자료로 편입된다).
탐지 시스템 및 키트
하나 이상의 소낭의 생체특징을 측정하도록 설계된 탐지 시스템을 또한 제공한다. 이 탐지 시스템을 이용하여 이종 소낭 집단 또는 하나 이상의 동종 소낭 집단을 탐지할 수 있다. 이 탐지 시스템은 다수의 소낭을 탐지하도록 설계될 수 있고, 여기에서 다수의 소낭의 최소한 부분집합은 다수의 소낭의 또다른 부분집합과는 상이한 생체특징을 포함한다. 이 탐지 시스템은 소낭의 최소한 2가지, 3가지, 4가지, 5가지, 6가지, 7가지, 8가지, 9가지, 10가지, 15가지, 20가지, 25가지, 30가지, 40가지, 50가지, 60가지, 70가지, 80가지, 90가지, 또는 100가지 상이한 부분집합을 탐지하고, 여기에서 소낭의 부분집합은 상이한 생체특징을 포함한다. 예를 들면, 탐지 시스템, 가령, 여기에서 설명된 하나 이상의 방법들, 프로세스, 그리고 조성물들을 이용하여 소낭의 최소한 2가지, 3가지, 4가지, 5가지, 6가지, 7가지, 8가지, 9가지, 10가지, 15가지, 20가지, 25가지, 30가지, 40가지, 50가지, 60가지, 70가지, 80가지, 90가지, 또는 100가지 상이한 부분집합을 탐지한다.
이 탐지 시스템은 하나 이상의 소낭에 대해 소낭의 최소한 2가지, 3가지, 4가지, 5가지, 6가지, 7가지, 8가지, 9가지, 10가지, 15가지, 20가지, 25가지, 30가지, 40가지, 50가지, 60가지, 70가지, 80가지, 90가지, 100가지, 1000가지, 2500가지, 5000가지, 7500가지, 10,000가지, 100,000가지, 150,000가지, 200,000가지, 250,000가지, 300,000가지, 350,000가지, 400,000가지, 450,000가지, 500,000가지, 750,000가지, 또는 1,000,000가지의 상이한 생물지표들을 평가하도록 설계될 수 있다. 일부 구체예들에서, 하나 이상의 생물지표들은 표 3-5중 임의의 것, 또는 여기에서 설명된 것으로부터 선택한다. 이 탐지 시스템은 소낭의 특이적 집단, 가령, 특이적 기원 세포의 소낭을 평가하거나, 다수의 특이적 소낭 집단을 평가하도록 설계될 수 있고, 여기에서 각 소낭의 집단은 특이적 생체특징을 보유한다.
탐지 시스템은 저밀도 탐지 시스템 또는 고밀도 탐지 시스템일 수 있다. 예를 들면, 저밀도 탐지 시스템은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개의 상이한 소낭 집단을 탐지할 수 있고, 반면 고밀도 탐지 시스템은 최소한 약 15개, 20개, 25개, 50개, 또는 100개의 상이한 소낭 집단을 탐지할 수 있다. 또다른 구체예에서, 저밀도 탐지 시스템은 최대 약 100개, 200개, 300개, 400개, 또는 500개의 상이한 생물지표들을 탐지할 수 있고, 반면에 고밀도 탐지 시스템은 최소한 약 750개, 1000개, 2000개, 3000개, 4000개, 5000개, 6000개, 7000개, 8000개, 9,000개, 10,000개, 15,000개, 20,000개, 25,000개, 50,000개, 또는 100,000개의 상이한 생물지표들을 탐지할 수 있다. 또다른 구체예에서, 저밀도 탐지 시스템은 최대 약 100개, 200개, 300개, 400개, 또는 500개의 상이한 생체특징 또는 생물지표 조합을 탐지할 수 있고, 반면 고밀도 탐지 시스템은 최소한 약 750개, 1000개, 2000개, 3000개, 4000개, 5000개, 6000개, 7000개, 8000개, 9,000개, 10,000개, 15,000개, 20,000개, 25,000개, 50,000개, 또는 100,000개의 생체특징 또는 생물지표 조합을 탐지할 수 있다.
탐지 시스템은 소낭에 선택적으로 혼성화되는 프로브를 포함할 수 있다. 탐지 시스템은 소낭을 탐지하기 위한 다수의 프로브들을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 다수의 프로브들을 이용하여 이종 소낭 집단 안에 소낭의 양을 탐지한다. 추가 다른 구체예들에서, 다수의 프로브들을 이용하여 동종 소낭 집단을 탐지한다. 다수의 프로브들을 이용하여 소낭의 최소한 2개 상이한 부분집단을 단리 또는 탐지할 수 있고, 여기에서 소낭의 각 부분집합은 상이한 생체특징을 포함한다.
탐지 시스템, 가령, 여기에서 설명된 하나 이상의 방법들, 프로세스, 그리고 조성물들은 여기에서 설명된 하나 이상의 방법들, 프로세스, 그리고 조성물들을 이용하여 소낭의 최소한 2가지, 3가지, 4가지, 5가지, 6가지, 7가지, 8가지, 9가지, 10가지, 15가지, 20가지, 25가지, 30가지, 40가지, 50가지, 60가지, 70가지, 80가지, 90가지, 또는 100가지 상이한 부분집합을 탐지 또는 단리하도록 설계된 다수의 프로브를 포함할 수 있는데, 여기에서 소낭의 각 부분집합은 상이한 생체특징을 포함한다.
예를 들면, 탐지 시스템은 소낭의 최소한 2가지, 3가지, 4가지, 5가지, 6가지, 7가지, 8가지, 9가지, 10가지, 15가지, 20가지, 25가지, 30가지, 40가지, 50가지, 60가지, 70가지, 80가지, 90가지, 또는 100가지 상이한 부분집합을 탐지 또는 단리하도록 설계된 다수의 프로브를 포함할 수 있다. 이 탐지 시스템은 하나 이상의 소낭의 최소한 2가지, 3가지, 4가지, 5가지, 6가지, 7가지, 8가지, 9가지, 10가지, 15가지, 20가지, 25가지, 30가지, 40가지, 50가지, 60가지, 70가지, 80가지, 90가지, 100가지, 1000가지, 2500가지, 5000가지, 7500가지, 10,000가지, 100,000가지, 150,000가지, 200,000가지, 250,000가지, 300,000가지, 350,000가지, 400,000가지, 450,000가지, 500,000가지, 750,000가지, 또는 1,000,000가지 상이한 생물지표들에 선택적으로 혼성화되도록 설계된 다수의 프로브를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 하나 이상의 생물지표들은 표 3-5중 임의의 것, 또는 여기에서 설명된 것으로부터 선택한다. 다수의 프로브는 소낭의 특이적 집단, 가령, 특이적 기원 세포의 소낭을 평가하거나, 다수의 특이적 소낭 집단을 평가하도록 설계될 수 있고, 여기에서 각 소낭의 집단은 특이적 생체특징을 보유한다.
탐지 시스템은 저밀도 탐지 시스템 또는 고밀도 탐지 시스템일 수 있다. 예를 들면, 저밀도 탐지 시스템은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개 상이한 소낭 집단을 탐지할 수 있고, 반면 고밀도 탐지 시스템은 최소한 약 15개, 20개, 25개, 50개, 또는 100개 상이한 소낭 집단을 탐지할 수 있다. 또다른 구체예에서, 저밀도 탐지 시스템은 최대 약 100개, 200개, 300개, 400개, 또는 500개 상이한 생물지표들을 탐지할 수 있고, 반면에 고밀도 탐지 시스템은 최소한 약 750개, 1000개, 2000개, 3000개, 4000개, 5000개, 6000개, 7000개, 8000개, 9,000개, 10,000개, 15,000개, 20,000개, 25,000개, 50,000개, 또는 100,000개 상이한 생물지표들을 탐지할 수 있다. 또다른 구체예에서, 저밀도 탐지 시스템은 최대 약 100개, 200개, 300개, 400개, 또는 500개 상이한 생체특징 또는 생물지표 조합을 탐지할 수 있고, 반면 고밀도 탐지 시스템은 최소한 약 750개, 1000개, 2000개, 3000개, 4000개, 5000개, 6000개, 7000개, 8000개, 9,000개, 10,000개, 15,000개, 20,000개, 25,000개, 50,000개, 또는 100,000개 생체특징 또는 생물지표 조합을 탐지할 수 있다.
프로브들은 특이적 소낭 집단의 탐지에 특이적일 수 있는데, 예를 들면 특정 생체특징을 가진 소낭, 그리고 상기에서 설명한 것과 같은 소낭에 대해 특이적일 수 있다. 탐지 전립선 특이적 소낭을 탐지하기 위한 다수의 프로브가 또한 제시된다. 다수의 프로브들은 표 3-5의 생물지표들중 하나 이상을 탐지하기 위한 프로브를 포함할 수 있다. 다중 프로브는 표 3-5에 있는 하나 또는 그 이상의 생물지표들을 탐지하기 위한 하나 또는 그 이상의 프로브를 또한 포함할 수 있다.
탐지 소낭의 하나 이상의 miRNA를 탐지하기 위한 다수의 프로브는 다음의 하나 이상의 miRNA를 탐지하기 위한 프로브들을 포함할 수 있다: miR-9, miR-629, miR-141, miR-671-3p, miR-491, miR-182, miR-125a-3p, miR-324-5p, miR-148b, 및 miR-222. 또다른 구체예에서, 다수의 프로브들은 EpCam, CD9, PCSA, CD63, CD81, PSMA, B7H3, PSCA, ICAM, STEAP, 및 EGFR을 탐지하기 위한 하나 이상의 프로브를 포함한다. 일부 구체예들에서, 다수의 프로브들 EpCam, CD9, PCSA, CD63, CD81, PSMA, 및 B7H3를 탐지하기 위한 하나 이상의 프로브를 포함한다. 다른 구체예들에서, 다수의 프로브들은 EpCam, CD9, PCSA, CD63, CD81, PSMA, B7H3, PSCA, ICAM, STEAP, 및 EGFR를 탐지하기 위한 하나 이상의 프로브를 포함한다. 또다른 구체예에서, 다수의 프로브들의 부분집합은 하나 이상의 EpCam, CD9, PCSA, CD63, CD81, PSMA, B7H3, PSCA, ICAM, STEAP, 및 EGFR에 대한 캡쳐 물질이며, 그리고 또다른 부분집합은 하나 이상의 CD9, CD63, 및 CD81를 탐지하기 위한 프로브들이다. 다수의 프로브들은 또한 miR-92a-2*, miR-147, miR-574-5p, 또는 이의 조합을 탐지하기 위한 하나 이상의 프로브를 포함할 수 있다. 다수의 프로브들은 또한 miR-548c-5p, miR-362-3p, miR-422a, miR-597, miR-429, miR-200a, miR-200b 또는 이의 조합을 탐지하기 위한 하나 이상의 프로브를 포함할 수 있다. 다수의 프로브들은 또한 EpCam, CK, 및 CD45를 탐지하기 위한 하나 이상의 프로브를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 하나 이상의 프로브들은 캡쳐 물질일 수 있다. 또다른 구체예에서, 프로브들은 탐지 물질일 수 있다. 또다른 구체예에서, 다수의 프로브들은 캡쳐 물질 및 탐지 물질을 포함한다.
프로브들, 가령, 캡쳐 물질은 고형 기질, 가령, 어래이 또는 비드에 부착될 수 있다. 대안으로, 프로브들, 가령, 탐지 물질은 부착되지 않는다. 이 탐지 시스템은 가령, 상기에서 설명한 어래이 기반 시스템, 서열화 시스템, PCR-기반 시스템, 또는 비드-기반 시스템일 수 있다. 이 탐지 시스템은 또한 상기에서 설명된 것과 같이, 마이크로유체 장치일 수 있다.
이 탐지 시스템은 키트의 일부분일 수 있다. 대안으로, 이 키트는 여기에서 설명된 것과 같이 하나 이상의 프로브 세트 또는 다수의 프로브들을 포함할 수 있다. 이 키트는 이종 집단 안에서 소낭 또는 다수의 소낭을 탐지하기 위한 프로브를 포함할 수 있다. 이 키트는 동종 소낭 집단을 탐지하기 위한 프로브들을 포함할 수 있다. 예를 들면, 이 키트는 특이적 기원 세포 소낭 집단, 또는 동일한 특이적 생체특징을 가진 소낭 집단을 탐지하기 위한 프로브들을 포함할 수 있다.
컴퓨터 시스템
예를 들면, 하나 이상의 생물지표들의 양, 존재 또는 부재를 결정함으로써 분자 특징에 대해 소낭을 분석할 수 있다. 생성된 데이터를 이용하여 컴퓨터 시스템, 가령, 도 3에 나타낸 것과 같이 컴퓨터 시스템에 의해 저장되고 분석될 수 있는 생체특징을 만들 수 있다. 하나 이상의 표현형을 가진 생체특징의 분석 또는 상관성은 컴퓨터 시스템, 가령, 컴퓨터 실행가능한 로직을 이용하여 실행할 수 있다.
컴퓨터 시스템, 가령, 도 3에 나타낸 것과 같은 시스템을 이용하여, 분석이후 데이터 및 결과를 전송할 수 있다. 따라서, 도 3은 소낭으로부터 결과를 분석하고, 분석을 기록 또는 생성하는 대표적인 예시적 로직 디바이스를 나타내는 블록선도이다. 도 3은 소낭으로부터 생성된 데이터를 수용 및 보관하고, 데이터를 분석하여 하나 이상의 생체특징을 만들고, 그리고 하나 이상의 생체특징 또는 표현형 특징의 보고서를 작성하는 컴퓨터 시스템 (또는 디지털 장치) 800을 보여준다. 컴퓨터 시스템은 또한 생성된 생체특징의 비교 및 분석을 실행하고 그리고 결과를 전송할 수 있다. 대안으로, 컴퓨터 시스템은 네트워크를 통하여 데이터 전송을 통하여 소낭 분석의 가공안된 데이터를 수용하고, 분석을 실행할 수 있다.
컴퓨터 시스템 800은 매체 811 및/또는 네트워크 포트 805로부터 명령을 읽을 수 있는 로직 장치로 이해할 수 있으며, 고정된 매체 812를 보유하는 서버 809에 선택적으로 연결될 수 있다. 도 3에 나타낸 시스템은 CPU 801, 디스크 드라이브 803, 임의의 입력 장치 가령, 키보드 815 및/또는 마우스 816 그리고 임의의 모니터 807을 포함한다. 데이터 소통은 로컬 또는 먼거리에 있는 서버 809에 표시된 통신 매체를 통하여 이루어질 수 있다. 통신 매체는 임의의 데이터 전송 및/또는 수용 수단을 포함할 수 있다. 예를 들면, 통신 매체는 네트워크 연결, 무선 연결 또는 인터넷 연결일 수 있다. 이러한 연결은 World Wide Web을 통한 통신을 제공할 수 있다. 본 발명에 따른 데이터는 이러한 네트워크 또는 파티 822에 의한 리셉션 및/또는 리뷰를 위한 연결을 통하여 전송될 수 있다. 수용 파티 822는 개인, 건강 관리 제공자 도는 건강 관리 매니져를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 따라서, 테스트 결과상의 정보 및 데이터는 세계 어디에서건 만들 수 있고, 다른 곳으로 전송할 수 있다. 예를 들면, 분석은 상이한 건물, 도시, 주, 나라, 대륙 또는 해안에서 실행될 때, 테스트 결과의 정보 및 데이터가 생성될 수 있고 상기에서와 같이 전달가능한 형태로 제공될 수 있다. 전달가능한 형태의 테스트 결과는 U.S의 수용 파티 822로 수입될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 개체로부터 하나 이상의 시료들의 진단시에 전달가능한 형태의 정보를 만드는 방법을 포함한다. 이 방법은 (1) 본 발명의 방법에 따라 시료들로부터 진단, 예후, 치료진단 또는 이와 유사한 것들을 결정하는 단계; 그리고 (2) 결정 단계의 결과를 전달가능한 형태로 구체화시키는 단계를 포함한다. 전달가능한 형태는 생산 방법의 산물이다. 한 구체예에서, 컴퓨터-판독가능한 매체는 생물학적 시료의 분석 결과, 가령, 생체특징의 전송에 적합한 매체를 포함한다. 매체는 소낭에 대한 결과, 가령, 피험자의 생체특징을 포함할 수 있는데, 여기에서 이러한 결과는 여기에서 설명된 방법에 의해 유도된다.
실시예
실시예 1: 전립선암 세포계로부터 소낭의 정제
전립선암 세포계는 20% FBS (태아 소 혈청) 및 1% P/S/G를 함유하는 배양 배지에서 3-4일간 배양한다. 그 다음 이 세포들을 400x g, 4℃에서 10분간 사전-회전시킨다. 이 상층액을 보존하고, 2000 x g, 4℃에서 20분간 원심분리시킨다. 소낭을 포함하는 상층액은 Millipore Centricon Plus-70 (Cat # UFC710008 Fisher)을 이용하여 농축시킬 수 있다.
Centricon은 1000 x g, 3 분, 실온에서 30㎖ PBS로 사전-세척한다. 그 다음, 15-70㎖의 사전-회전된 세포 배양물 상층액을 Concentrate Cup에 붓고, Swing Bucket Adapter (Fisher Cat # 75-008-144)에서, 30 분, 1000 x g, 실온에서 원심분리시킨다.
채집 컵(Collection Cup)을 통하여 유동액을 따라낸다. 농축 컵(Concentrate Cup)에의 용적은 임의의 추가 상층액으로 60㎖으 채워둔다. 농축 컵은 30 분간, 1000 x g, 실온에서 원심분리하여, 세포 상층액을 농축시킨다.
농축 컵은 70㎖의 PBS를 추가하여 세척하고, 대략 2㎖이 남을 때까지 30-60 분, 1000 x g에서 원심분리한다. 이 소낭은 작은 시료 컵으로 농축물을 뒤집어 넣어 필터로부터 제거하고, 1 분간 4℃에서 원심분리한다. 이 소낭은 현재 농축되어 있으며, 30% 슈크로즈 쿠션에 추가한다.
쿠션을 만들기 위하여, 4 ㎖의 Tris/30%슈크로즈/D2O 용액 (30g 프로테아제-없는 슈크로즈, 2.4g Tris base, 50㎖ D2O, 10N NCL 드롭으로 pH는 7.4로 조정, D2O으로 100㎖으 용적을 조정, 0.22-um 필터를 통하여 통과시켜 멸균)을 30㎖ V자형 바닥, 얇은 벽으로 된 한외여과 튜브에 로딩한다. 농축된 소낭의 희석된 25㎖을 인터페이스의 혼란 없이 슈크로즈 쿠션위에 서서히 추가하고, 그리고 75 분간, 100,000 x g, 4℃에서 원심분리한다. 슈크로즈 쿠션 위 ~25㎖을 10㎖ 피펫으로 조심스럽게 빼내고, 소낭 3.5㎖은 미세 팁 운반 피펫(SAMCO 233)으로 수거하고, 그리고 30㎖ PBS가 추가되어 있는 새로운 한외원심분리 튜브로 옮긴다. 튜브는 70 분간, 100,000 x g, 4℃에서 원심분리한다. 상층액을 조심스럽게 따라낸다. 펠렛은 200㎕ PBS에 재현탁시키고, 4℃에 보관하거나 분석에 이용할 수 있다. BCA 분석 (1:2)을 이용하여 단백질 함량을 결정할 수 있고, 그리고 Western 블랏팅 또는 전자현미경관찰을 이용하여 소낭 순도를 결정할 수 있다.
실시예 2: VCaP 및 22Rv1로부터 소낭의 정제
인간 전립선 암종 이종이식편 (CWR22R)으로부터 유도된 인간 전립선 암종 세포계, 전립선 (VCaP) 및 22Rv1의 척추-암으로부터 혈장을 동량의 PBS (1 ㎖)으로 희석하여 한외원심분리에 의해 소낭을 수거하였다. 희석된 유체는 15 ㎖ 팔콘 튜브로 옮기고, 30 분간, 2000 x g, 4℃에서 원심분리하였다. 상층액 (~2 ㎖)은 한외원심분리 튜브 5.0 ㎖ PA 박벽 튜브(Sorvall # 03127)로 옮기고, 그리고 12,000 x g, 4℃, 45 분간 원심분리하였다.
상층액 (~2 ㎖)은 새로운 5.0 ㎖ 한외원심분리 튜브로 옮기고, 그리고 2.5 ㎖ PBS를 추가하여 최대 용적으로 채우고, 그리고 90 분 동안, 110,000 x g, 4℃에서 원심분리하였다. 상층액은 펠렛을 흩트리지 않고 따라내고, 펠렛은 1 ㎖ PBS로 재현탁시켰다. 튜브에 4.5 ㎖의 PBS를 추가하여 최대 용적으로 채우고, 그리고 110,000 x g, 4℃, 70 분 동안 원심분리하였다.
상층액은 펠렛을 흩트리지 않고 따라내고, 추가 1㎖의 PBS를 추가하여 펠렛을 세척하였다. 용적은 4.5㎖의 PBS를 추가하여 최대 용적으로 증가시켰고, 110,000 x g, 4℃에서 70 분 동안 원심분리하였다. 튜브의 바닥에 100㎕의 PBS가 남아있을 때까지, P-1000 피펫으로 상층액을 제거하였다. ~ 90 ㎕의 나머지는 P-200 페펫으로 제거하였고, P-20 피펫을 이용하여 서서히 피펫팅함으로써 남아있는 ~10㎕ PBS로 수거된 펠렛은 마이크로원심분리 튜브에 넣는다. 남아있는 펠렛은 추가 5 ㎕의 새로운 PBS로 건조한 튜브의 바닥으로부터 씻어내고, 마이크로원심분리 튜브로 수거하고, 인산염 완충된 염수 (PBS)로 현탁시켜, 500 ㎍/㎖으로 농축시킨다.
실시예 3: 혈장 수거 및 소낭 정제
7㎖ K2-EDTA 튜브에서 표준 정맥천자를 통하여 채혈한다. 시료는 혈액 세포들로부터 혈장을 분리하기 위하여 4℃ 원심분리기에서 10분간 400g에서 회전시켰다(SORVALL Legend RT+ centrifuge). 상층액 (혈장)을 조심스럽게 피펫팅하여 15㎖ Falcon 원심분리 튜브로 옮겼다. 혈장은 2,000g, 20 분 동안 회전시키고, 상층액을 수거한다.
보관용으로, 대략 1 ㎖의 혈장 (상층액)을 드라이아이스에 둔 냉동바이알에 한방울씩 넣고, 이를 냉동하여 -80℃에 보관한다. 소낭 정제이전에, 시료들이 -80℃에 보관되어있다면, 시료를 5분간 냉수에서 해동시켰다. 불용성 물질들을 분산시키기 위하여 시료들을 손으로 끝까지 뒤집어 혼합한다.
제 1 프레스핀(prespin)에서, 혈장은 동량의 PBS (예를 들면, 대략 2 ㎖의 혈장은 2 ㎖의 PBS로 희석한다)로 희석한다. 희석된 유체는 15 ㎖ Falcon 튜브로 옮기고, 30 분 동안 2000 x g, 4℃에서 원심분리한다.
제 1 프레스핀(prespin)에서, 상층액 (대략 4 ㎖)은 50㎖ Falcon 튜브로 조심스럽게 옮기고 Sorval에서 12,000 x g, 4℃, 45분간 원심분리하였다.
분리 단계에서, 상층액 (대략 2 ㎖)은 P1000 피펫을 이용하여 5.0 ㎖ 한외원심분리 PA thinwall 튜브 (Sorvall # 03127)로 조심스럽게 옮기고, 그리고 추가 0.5 ㎖의 PBS로 최대 용적으로 채운다. 튜브는 110,000 x g, 4℃에서 90분간 원심분리시킨다.
제 1 세척 단계에서, 상층액은 펠렛이 흩트러지지 않도록 따라낸다. 펠렛은 1 ㎖ PBS로 재현탁시키거나 또는 세척하고, 튜브를 추가 4.5 ㎖의 PBS로 최대 용적으로 채운다. 튜브는 110,000 x g, 4℃에서 70 분 동안 원심분리시킨다. 제 2 세척은 동일한 단계를 반복하여 실행한다.
이 소낭은 튜브 바닥에 100㎕의 PBS가 남아있을 때까지 상층액을 P-1000 피펫으로 제거함으로써, 수거한다. 대략 90 ㎕의 PBS를 제거하고, P-200 피펫으로 버린다. 펠렛과 남아있는 PBS는 P-20 피펫을 이용하여 서서히 피펫팅하여 수거한다. 잔류 펠렛은 추가 5 ㎕의 새로운 PBS를 이용하여 건조 튜브 바닥으로부터 세척하고, 마이크로원심분리 튜브 안에 수거한다.
실시예 4: 항체-연결된 미소구체 및 직접적으로 콘쥬게이트된 항체들을 이 용한 소낭의 분석
이 실시예는 항체가 소낭을 캡쳐하는 항체에 연결된 미립자의 이용을 설명한다 (예를 들면, 도 2A). 항체, 검출자 항체는 라벨에 직접적으로 연결되고, 그리고 이를 이용하여 캡쳐된 소낭에 있는 생물지표를 탐지한다.
제 1, 항체-연결된 미소구체 세트를 선택한다(Luminex, Austin, TX). 미소구체 세트는 다양한 항체들을 포함할 수 있고, 따라서 다중화를 허용한다. 미소구체는 볼텍스에 의해 재현탁시키고, 초음파파쇄 for 대략 20 초간 초음파파쇄시킨다. 작업 미소구체 혼합물은 연결된 미소구체 원액을 Startblock (Pierce (37538))에서 각 세트당 100개/㎕ 미소구체 농도가 되도록 희석하여 준비한다 (50 ㎕의 작업 미소구체 혼합물을 각 웰에서 이용한다). PBS-1% BSA 또는 PBS-BN (PBS, 1% BSA, 0.05% Azide, pH 7.4)를 분석 완충액으로 이용할 수 있다.
1.2 ㎛ Millipore 필터 플레이트는 100 ㎕/well의 PBS-1% BSA (Sigma (P3688-10PAK + 0.05% NaAzide (S8032)))로 사전 젖게 하고, 그리고 진공 다기관에 의해 흡출시킨다. 50 ㎕의 작업 미소구체 혼합물을 필터 플레이트의 적정웰로 분배한다 (Millipore Multiscreen HTS (MSBVN1250)). 50 ㎕ 분취량의 표준 또는 시료를 적합한 웰로 분배한다. 필터 플레이트를 덮고, 플레이트 쉐이커 상에서 실온에서 60분간 항온처리한다. 플레이트를 실러로 덮고, 오비탈 쉐이커 상에 두고, 15-30 초간 900으로 설정하여 비드를 재현탁시킨다. 그 다음 속도를 항온처리 하는 동안 550으로 설정한다.
상층액은 진공 매니폴드 (모든 흡출 단계에서 5 inches Hg 미만)로 흡출한다. 각 웰은 100 ㎕의 PBS-1% BSA (Sigma (P3688-10PAK + 0.05% NaAzide (S8032)))로 2차례 세척하고, 그리고 진공 매니폴드로 흡출시킨다. 미소구체는 50 ㎕의 PBS-1% BSA (Sigma (P3688-10PAK + 0.05% NaAzide (S8032)))에서 재현탁시킨다. PE 콘쥬게이트된 탐지 항체는 PBS-1% BSA (Sigma (P3688-10PAK + 0.05% NaAzide (S8032)))에서 4 ㎍/mL (또는 적합한 농도)로 희석시킨다. (Note: 각 반응에서 50 ㎕의 희석된 탐지 항체를 필요로 한다) 50 ㎕ 분취량의 희석된 탐지 항체를 각 웰에 추가한다. 필터 플레이트를 덮고, 플레이트 쉐이커 상에서 실온에서 60분간 항온처리한다. 플레이트를 실러로 덮고, 오비탈 쉐이커 상에 두고, 15-30 초간 900으로 설정하여 비드를 재현탁시킨다. 그 다음 속도를 항온처리 하는 동안 550으로 설정한다. 상층액은 진공 매니폴드로 흡출한다. 웰은 100 ㎕의 PBS-1% BSA (Sigma (P3688-10PAK + 0.05% NaAzide (S8032)))으로 2회 세척하고, 진공 매니폴드로 흡출한다. 미소구체는 100 ㎕의 PBS-1% BSA (Sigma (P3688-10PAK + 0.05% NaAzide (S8032)))에서 재현탁시킨다. 미소구체는 시스템 매뉴얼에 따라 Luminex 분석기에서 분석한다.
실시예 5: 항체-연결된 미소구체 및 바이오티닐화된 항체를 이용한 소낭의 분석
이 실시예는 항체에 연결된 미립자의 이용을 설명하는데, 이때 항체가 소낭을 캡쳐한다. 항체, 검출자 항체는 바이오티닐화시킨다. 스트렙타아비딘에 연결된 라벨을 이용하여 생물지표를 탐지한다.
우선, 적합한 항체-연결된 미소구체 세트를 선택한다(Luminex, Austin, TX). 미소구체는 볼텍스로 재현탁시키고, 그리고 대략 20 초간 초음파파쇄시킨다. A 작업 미소구체 혼합물은 작업 미소구체 혼합물은 연결된 미소구체 원액을 Startblock (Pierce (37538))에서 각 세트당 50개/㎕ 미소구체 농도가 되도록 희석하여 준비한다 (Note: 50 ㎕의 작업 미소구체 혼합물이 각 웰에 요구된다). Start Block 안의 비드는 30분간, 그러나 1시간 이내로 차단시켜야만 한다.
1.2 ㎛ Millipore 필터 플레이트는 100 ㎕/well의 PBS-1% BSA (Sigma (P3688-10PAK + 0.05% NaAzide (S8032)))로 사전 젖게 하고, 그리고 진공 다기관에 의해 흡출시킨다. 50 ㎕의 작업 미소구체 혼합물을 필터 플레이트의 적정웰로 분배한다 (Millipore Multiscreen HTS (MSBVN1250)). 50 ㎕ 분취량의 표준 또는 시료를 적합한 웰로 분배한다. 필터 플레이트를 덮고, 플레이트 쉐이커 상에서 실온에서 60분간 항온처리한다. 플레이트를 실러로 덮고, 오비탈 쉐이커 상에 두고, 15-30 초간 900으로 설정하여 비드를 재현탁시킨다. 그 다음 속도를 항온처리 하는 동안 550으로 설정한다.
상층액은 진공 매니폴드 ((모든 흡출 단계에서 5 inches Hg 미만)로 흡출시킨다. 흡출은 Pall 진공 매니폴드로 실행할 수 있다. 플레이트가 매니폴드에 있을 때 벨브는 풀 오프 위치에 있다. 서서히 흡출하기 위하여, 벨브를 열고, 웰로부터 유체를 빼내고, 100 ㎕의 시료의 경우 대략 3초가 소요되며, 웰로부터 비드를 충분히 흡출시킨다. 일단 시료를 빼내면, 매니폴드에 있는 청소 버튼을 눌러서 플레이트로부터 남아있는 진공압을 제거한다.
각 웰은 100 ㎕의 PBS-1% BSA + Azide (PBS-BN) (Sigma (P3688-10PAK + 0.05% NaAzide (S8032)))로 2회 세척하고, 진공 매니폴드로 흡출시킨다. 미소구체는 50 ㎕의 PBS-1% BSA+ Azide (PBS-BN) ((Sigma (P3688-10PAK + 0.05% NaAzide (S8032)))에서 재현탁시킨다.
바이오티닐화된 탐지 항체는 PBS-1% BSA + Azide (PBS-BN) (Sigma (P3688-10PAK + 0.05% NaAzide (S8032)))에서 4㎍/㎖으 희석시킨다. (Note: 50 ㎕ 의 희석된 탐지 항체가 각 반응에 요구된다) 50㎕ 분취량의 희석된 탐지 항체를 각 웰에 추가한다.
필터 플레이트를 실러(sealer)로 덮고, 플레이트 쉐이커 상에서 실온에서 60분간 항온처리한다. 이 플레이트는 오비탈 쉐이커에 두고, 비드를 재현탁시키기 위하여 15-30초간 900으로 설정한다. 그 다음, 속도는 항온처리하는 동안 550으로 설정한다.
이 상청액은 진공 매니폴드로 흡출시킨다. 흡출은 Pall 진공 매니폴드로 실시할 수 있다. 벨브는 플레이트가 매니폴드에 위치할 때, 풀오프 위치에 둔다. 서서히 흡출시키기 위하여, 벨브를 열고, 웰로부터 유체를 빼내는데, 100㎕ 시료와 비드를 웰로부터 완전하게 흡출시키는데 경우 대략 3초 소요된다. 일단 모든 시료가 배출되면, 매니폴드에 있는 퍼지(purge) 버턴을 눌러 플레이트로부터 남아있는 진공 압력을 해제한다.
각 웰은 100 ㎕의 PBS-1% BSA + Azide (PBS-BN)( (Sigma (P3688-10PAK + 0.05% NaAzide (S8032)))로 2회 세척하고, 진공 매니폴드로 흡출한다. 미소구체들은 50 ㎕의 PBS-1% BSA (Sigma (P3688-10PAK + 0.05% NaAzide (S8032)))에서 재현탁시킨다.
스트렙타아비딘-R-피코에리틴 리포터 (Molecular Probes 1 ㎎/㎖)은 PBS-1% BSA+ Azide (PBS-BN)에서 4㎍/㎖으 희석시킨다. 50 ㎕의 희석된 스트렙타아비딘-R-피코에리틴을 각 반응에 이용하였다. 50 ㎕ 분획량의 희석된 스트렙타아비딘-R-피코에리틴을 각 웰에 추가한다.
필터 플레이트는 실러(sealer)로 덮고, 플레이트 쉐이커 상에서 실온에서 60분간 항온처리한다. 이 플레이트는 오비탈 쉐이커에 두고, 비드를 재현탁시키기 위하여 15-30초간 900으로 설정한다. 그 다음, 속도는 항온처리하는 동안 550으로 설정한다.
이 상청액은 진공 매니폴드로 흡출시킨다. 흡출은 Pall 진공 매니폴드로 실시할 수 있다. 벨브는 플레이트가 매니폴드에 위치할 때, 풀오프 위치에 둔다. 서서히 흡출시키기 위하여, 벨브를 열고, 웰로부터 유체를 빼내는데, 100㎕ 시료와 비드를 웰로부터 완전하게 흡출시키는데 경우 대략 3초 소요된다. 일단 모든 시료가 배출되면, 매니폴드에 있는 퍼지(purge) 버턴을 눌러 플레이트로부터 남아있는 진공 압력을 해제한다.
각 웰은 100 ㎕의 PBS-1% BSA + Azide (PBS-BN)( (Sigma (P3688-10PAK + 0.05% NaAzide (S8032)))로 2회 세척하고, 진공 매니폴드로 흡출한다. 미소구체들은 100㎕의 PBS-1% BSA (Sigma (P3688-10PAK + 0.05% NaAzide (S8032)))에서 재현탁시키고, 그리고 이 시스템 매뉴얼에 따라 Luminex 분석기에서 분석한다.
실시예 6: 혈장으로부터 소낭 농축
공급 및 장비: Pall life sciences Acrodisc, 25㎜ 주사기 필터 w/1.2 ㎛, Versapor 막 (멸균) Part number: 4190; Pierce 농축기 7 ㎖/150 K MWCO (분자량 컷오프), Part number: 89922; BD 주사기 필터, 10 ㎖, Part number: 305482; Sorvall Legend RT Plus Series Benchtop Centrifuge w 15 ㎖ swinging bucket rotor; 살균 분자 등급수에서 준비된 PBS, pH 7.4, Sigma cat#P3813-10PAK; 코-폴리머 1.7㎖ 마이크로원심분리 튜브, USA Scientific, cat#1415-2500. 시약에 사용된 물은 살균 여과된 분자 등급수이다(Sigma, cat#W4502). 취급 of 환자 혈장의 취급은 생물안전 후드에서 실시한다.
과정:
1. 혈장 시료들을 위한 여과 과정
1.1. -80℃(-65℃ 내지 -85℃) 냉동기로부터 혈장 시료를 빼냄
1.2. 실온의 물에서 시료들을 해동(10-15 분간).
1.3. 이들 케이스로부터 불필요한 수를 제거하기 위하여 주사기와 필터를 준비
1.4. 피스톤을 당겨서 4mL의 멸균 분자 등급수를 이 주사기로 넣음. Attach a 1.2㎛ 필터를 주사기 팁에 고정시키고, 필터를 통하여 내용물을 7 ㎖/150 K MWCO Pierce 컬럼에 넣는다.
1.5 Cap the 컬럼에 캡을 씌우고, Sorvall Legend RT에서, 1000xg에서 스핀하는 스윙 버켓 원심분리기에 넣고, 20C (16C-24C)에서 4분간 원심분리한다.
1.6 스핀하는 동안 주사기로부터 필터를 떼어낸다. 그 다음 주사기로부터 피스톤을 빼낸다.
1.7. 튜브를 통하여 나오는 유체를 버리고, 종이 타올 위에 컬럼을 부드럽게 두드려, 임의의 남아있는 물을 제거한다.
1.8 모든 혈장 시료들에 대해 시작 용적을 측정하고 기록한다. 900㎕ 미만의 용적을 가진 시료는 진행하지 않을 수 있다.
1.9. 개방 주사기와 필터를 개방 Pierce 컬럼 위에 둔다. 주사기의 개방 단부를 5.2mL의 1X PBS로 채우고, 혼합 혈장을 PBS에 3-4회 피펫팅한다.
1.10. 주사기의 피스톤을 복귀시키고, 주사기의 내용물이 필터를 통하여 Pierce 컬럼 안으로 통과할 때까지 피스톤을 서서히 내리누른다. 내용물은 필터를 통하여 방울씩 통과해야만 한다.
2. 미세소낭 농축 원심분리 프로토콜
2.1. 2000xg, 20℃(16℃-24℃)에서 60분간 또는 용적이 250-300㎕에 이를 때까지 7 ml/150 K MWCO Pierce 컬럼들을 스핀한다. 필요하다면, 요구되는 용적에 이를 때까지 추가 15분씩 증분하면서 스핀한다.
2.2. 스핀 종료시, 컬럼 15x상에 믹스를 피펫하고 (버블이 생기는 것을 피하고) 용적 (300㎕ 또는 이 이만)을 빼내고, 그리고 새로운 1.7mL 코-폴리머 튜브로 옮긴다.
2.3. 혈장 농축물의 최종 용적은 혈장의 최초 용적에 따라 달라진다. 원래 혈장 용적이 1㎖이라면 혈장은 300㎕으로 농축된다. 원래 혈장 용적이 1㎖ 미만이라면 농축물의 용적은 이 비율로 일관성있게 유지되어야 한다. 예를 들면, 원래 용적이 900㎕이라면, 농축물의 용적은 270㎕이다. 식은 다음과 같다: x=(y/1000)*300, 여기에서 x는 농축물의 최종 용적이며, y는 혈장의 최초 용적이다.
2.4. 이 시료 용적을 기록하고, 이 시료에 1X PBS를 추가하여, 최종 시료 용적을 만든다.
2.5. 4℃ (2℃ 내지 8℃)에 농축된 미세소낭 시료를 보관한다.
계산:
1. 농축된 혈장 시료의 최종 용적
x=(y/1000)*300, 여기에서 x는 농축물의 최종 용적이며, y는 혈장의 최초 용적이다.
실시예 7: 자석 비드를 이용한 소낭의 캡쳐
실시예 2에서 설명된 것과 같이 단리된 소낭을 이용한다. 대략 40 ㎕의 소낭은 대략 5 ㎍ (~50 ㎕)의 EpCam 항체 피복된 Dynal 비드 (Invitrogen, Carlsbad, CA)와 50 ㎕의 Starting Block과 함께 항온처리한다. 이 소낭과 비드는 쉐이킹 인큐베이트에서 45℃에서 2시간 동안 흔들면서 항온처리한다. Dynal 비드를 포함하는 튜브는 1분간 자석 분리기 상에 두고, 상층액은 제거한다. 비드는 2차례 세척하고, 매번 상층액을 제거한다. 비드를 2차례 세척하고, 매번 상층액은 버린다.
실시예 8: 소낭에서 TMPRSS2:ERG의 탐지
실시예 7의 비드-결합된 소낭으로부터 RNA는 제조업자의 지시에 따라 Qi나이n miRneasy™ 키트, (Cat. No. 217061)를 이용하여 단리하였다.
이 소낭은 QIAzol™ 용해 시약 (Cat. No. 79306)을 이용하여 균질화시킨다. 클로로포름을 추가한 후, 균질화물은 원심분리에 의해 수성 및 유기 상으로 분리한다. RNA는 상측 수성 부분에 분할되고, DNA는 중간상에 그리고 단백질은 아래, 유기 상 또는 중간상에 분할된다. 위쪽 수성 상을 추출하고, 에탄올을 추가하여 18개 뉴클레오티드 (nt) 업워드(upwards)로부터 모든 RNA 분자들에 대한 적합한 결합 상태를 제공한다. 그 다음 시료를 RNeasy™ Mini spin column에 제공하고, 여기에서 전체 RNA는 막에 결합하고, 페놀과 다른 오염물질은 효과적으로 씻어낸다. 고품질의 RNA는 RNase 없는 물로 용리시킨다.
VCAP 비드 캡쳐된 소낭으로부터 RNA는 Taqman TMPRSS:ERG 융합 전사체 분석으로 측정하였다(Kirsten D. Mertz et al. Neoplasia. 2007 March; 9(3): 200-206.). 22Rv1 비드 캡쳐된 소낭으로부터 RNA는 Taqman SPINK1 전사체 분석로 측정하였다(Scott A. Tomlins et al. Cancer Cell 2008 June 13(6):519-528). GAPDH 전사체 (대조군 전사체)는 또한 소낭 RNA 두 개 세트 모두에 대하여 측정하였다.
더 높은 CT 값은 전사체 발현의 더 낮음을 나타낸다. 주기 임계치(CT)에서 하나의 변화는 2 배 변화와 등가이며, 3 CT 차이는 4배 변화와 등가인 방식으로 다음의 식으로 계산할 수 있다: 2^CT1-CT2 . 이 실험에서 융합 전사체 TMPRSS:ERG의 발현의 CT에서의 차이와 IgG2 음성 대조군 비드로 캡쳐된 등가를 보여준다(도 5). 22RV1 소낭에서 SPINK1 전사체의 동일한 비교는 6.14의 CT 차이는 70.5의 배수차이를 나타내었다. GAPDH 결과는 유사하다.
실시예 9: 피험자들로부터 혈청 시료들을 수득하기
피험자들 (건강한 피험자들과 암에 걸린 피험자들)의 혈액을 EDTA 튜브, 구연산염 튜브 또는 10 ㎖의 Vacutainer SST + 채혈 튜브(BD367985 or BD366643, BD Biosciences)에 채혈한다. 혈액은 채혈 2시간 이내에 혈장 분리를 위하여 처리한다.
시료들은 최소 30분간, 최대 2시간 실온에서 방치한다. 혈액 덩어리는 4℃, 1,000-1,300 x g에서 15-20분간 원심분리를 통하여 분리하였다. 혈청을 제거하고, 500 내지 750㎕의 냉동튜브로 500㎕을 분취하여 분배한다. 견본은 -80℃에 보관한다.
주어진 환경에서, 빼낸 혈액의 양은 ~20 내지 ~90 ㎖ 범위가 될 수 있다. 몇 개의 EDTA 튜브로부터 혈액을 모으고, RNase/DNase-없는 50-㎖의 원뿔 튜브 (Greiner)로 옮기고, 그리고 10분간 Hettich Rotanta 460R 벤치탑 원심분리기에서 실온, 1,200 x g에서 원심분리하였다. 혈장을 새로운 튜브로 옮기면, 펠렛이 교란되지 않도록 펠렛 위의 0.5 ㎝ 고정된 높이의 혈장 상청액만 남는다. 혈장을 분취하고(분획물의ed), 각 분취물이 혼합될 수 있도록 뒤집고, -80℃에 보관한다.
실시예 10: 사람 혈장 및 혈청 시료들로부터 RNA 분리
400㎕의 인간 혈장 또는 혈청은 얼음위에서 해동시키고, 동량의 2X Denaturing 용액 (Ambion)으로 용해시킨다. RNA는 액체 시료들 (Ambion)에 대한 제조업자의 프로토콜에 따라 mirVana PARIS kit를 이용하여 단리하고, 그리고 시료들은 동량의 산-페놀 클로로포름(Ambion kit에서 공급된)으로 2회 추출하여 변형시킨다. RNA는 제조업자의 프로토콜에 따라 105㎕의 Ambion 용리액으로 용리시킨다. 각 컬럼으로부터 회수한 용리액의 평균 용적은 약 80㎕이다.
mirVana PARIS (Ambion) 프로토콜의 확장 형태를 또한 이용한다: 10㎖의 혈장을 얼음위에서 해동시키고, 5-㎖ 분획물 2개를 50㎖ 튜브로 옮기고, 동일한 용적의 mirVana PARIS 2X Denaturing 용액으로 희석하고, 30초간 볼텍스에 의해 철저하게 혼합하고, 얼음 위에서 5분간 항온처리한다. 동량(10 ㎖)의 of 산/페놀/클로로포름 (Ambion)을 각 분획물에 추가한다. 생성된 용액은 1분간 볼텍스하고, JA17 로터에서 20℃, 8,000rpm에서 5분간 회전시켰다. 산/페놀/클로로포름 추출은 3회 반복한다. 생성된 수성 용적은 1.25 용적의 100% 분자-등급 에탄올로 철저하게 혼합하고, mirVana PARIS 컬럼을 통과시켜 연속 700-㎕ 분획물로 얻는다. 이 컬럼은 제조업자의 프로토콜에 따라 세척하고, 그리고 105㎕의 용리 완충액 (95℃)으로 용리시킨다. 총 1.5㎕의 용리물이 정량화되었다(Nanodrop).
실시예 11: qRT-PCR을 이용하여 혈장 및 혈청으로부터 RNA 안에 있는 miRNA 수준의 측정
주어진 시료의 RNA 분리물 약 ~80㎕ 용리물로부터 1.67㎕의 고정된 용적의 RNA 용액을 역전사(RT) 반응의 입력물로 이용한다. 400-㎕ 혈장 또는 혈청 시료로부터 단리된 RNA 시료인 경우, 예를 들면, 1.67㎕의 RNA 용액은 (1.67/80) X 400 = 8.3㎕ 혈장 또는 혈청에 대응하는 RNA를 나타낸다. 알려진 miRNA에 대응하는 화학적으로 합성된 RNA 올리고뉴클레오티드의 표준 곡선 생성을 위하여, 각 올리고뉴클레오티드의 물에서의 희석을 다양하게 하여 RT 반응물로의 최종 입력 용적은 은 1.67㎕이 된다. 입력 RNA는 TaqMan miRNA Reverse Transcription Kit 및 miRNA-특이적 스템-루프 프라이머(Applied BioSystems)를 이용하여 소규모 RT 반응물(1.387㎕의 H2O, 0.5㎕의 10X Reverse-Transcription 완충액, 0.063㎕의 RNase-Inhibitor (20 units/㎕), 0.05㎕의 100 mM dNTPs+ dTTP, 0.33㎕의 Multiscribe Reverse-Transcriptase, 그리고 1.67㎕의 입력 RNA를 포함)에서 역전사된다; 입력 RNA를 제외한 구성요소들은 16℃에서 30분, 42℃에서 30 분 그리고 85℃에서 5분의Tetrad2 Peltier Thermal Cycler (BioRad)를 이용하여 더 큰 용적의 마스터 믹스로 준비할 수 있다. Real-time PCR은 Applied BioSystems 7900HT thermocycler 상에서 95℃에서 10분, 이어서 40 cycles of 95℃에서 15초와 60℃에서 1분의 주기를 40회 실시한다. 데이터는 기저수준을 부여하기 위한 자동 Ct 설정 및 Ct 측정을 위한 임계치와 함께 SDS Relative Quantification Software version 2.2.2 (Applied BioSystems.)로 분석한다.
이 프로토콜은 전-증폭단계, miRNA를 탐지하는 것과 같은 단계를 포함하도록 변형할 수 있다. 1.25-㎕ 분획물의 희석안된 RT 산물은 3.75㎕의 Preamplification PCR 시약 [반응물당 2.5㎕의 TaqMan PreAmp Master Mix (2X) 및 1.25㎕의 0.2X TaqMan miRNA Assay (TE에서 희석된)을 포함]과 복합시켜, 5.0-㎕ 전-증폭 PCR을 만들고, 이는 Tetrad2 Peltier Thermal Cycler (BioRad)에서 95℃으 10분간 가열시킨 후, 이어서 95℃에서 15초와 60℃에서 4분간의 14회 주기로 실행한다. 전-증폭 PCR 산물은 희석시키고 (20㎕의 H2O를 5-㎕의 전-증폭 반응 산물에 추가하여), 2.25㎕의 희석된 물질을 real-time PCR로 도입시키고, 설명한 것과 같이 진행한다.
실시예 12: 소낭들로부터 microRNA의 추출
여기에서 설명된 것과 같이, 환자 시료들로부터 단리된 소낭에서 microRNA를 추출한다. 가령, 실시예 6 참고. 소낭들의 분리 및 농축 방법들이 여기에서 제시된다. 이 실시예의 방법들을 또한 이용하여 소낭을 우선적으로 단리하지 않고, 환자 시료들로부터 microRNA를 단리할 수 있다.
Trizol을 이용하는 프로토콜
이 프로토콜은 QIAzol Lysis Re나이nt 및 RNeasy Midi Kit(Qi나이n Inc., Valencia CA)를 이용하여 농축된 소낭으로부터 microRNA를 추출한다. 이 방법의 단계들은 다음을 포함한다:
1. 2㎕의 RNase A를 50㎕의 소낭 농축물에 추가하고, 37℃에서 20분간 항온처리한다.
2. 700㎕의 QIAzol Lysis Re나이nt를 추가하고, 1 분간 볼텍스한다. minute. Spike 시료들 with 25 fmol/㎕의 C. elegans microRNA (1㎕) after the addition of QIAzol을 추가한 후, 시료에 25 fmol/㎕의 C. elegans microRNA (1㎕)을 박아넣고(spike), 각 총 시료 안에 75 fmol/㎕ spike가 되도록 한다(3개 분획물이 복합됨).
3. 55℃에서 5분간 항온처리한다.
4. 140㎕의 클로로포름을 추가하고, 15초간 활발하게 흔든다.
*12005. 얼음위에서 2-3 분간 냉각시킨다
6. 12,000 x g, 4℃에서 15분간 원심분리한다.
7. 수성 상(300㎕)은 새 튜브로 옮기고, 1.5 용적의 100% EtOH (가령, 450㎕)을 추가한다.
8. 15㎖(50㎕ 농축물 3개의 용해물 복합)의 채집 튜브 안에 RNeasy Midi 스핀 컬럼 상에 4 ㎖의 시료를 피펫한다.
9. 2700 x g, 실온에서 5분간 스핀한다.
10. 스핀으로부터 흘러나온 유체(flowthrough)는 버린다.
11. 1㎖의 완충액 RWT를 컬럼에 추가하고, 2700 x g, 실온에서 5분간 원심분리한다. Midi kit에서 공급되는 완충액 RW1을 사용하지 않는다. 완충액 RW1은 miRNA를 씻어낼 수 있다. 완충액 RWT는 Qi나이n Inc의 Mini kit에서 공급된다.
12. 흘러내린 유체는 버린다.
13. 1 ㎖의 완충액 RPE을 컬럼에 얹고, 2700 x g, 실온에서 2분간 원심분리한다.
14. 단계 12와 13을 반복한다.
16. 컬럼을 새로운 15 ㎖ 수거 튜브에 두고, 150 ㎕ 용리 완충액을 추가한다. 실온에서 3분간 항온처리한다.
17. 2700 x g, 3분간 실온에서 원심분리한다.
18. 시료를 볼텍스하고 1.7 mL 튜브로 옮긴다. -80℃에 추출한 시료를 보관한다.
변형된 Trizol 프로토콜
1. Epicentre RNase A를 최종 229 μg/ml로 첨가한다 (Epicentre®, an Illumina® company, Madison, WI). (예를 들면, 150 ul의 농출물에 450 μl PBS 및 28.8 μl Epicentre Rnase A [5μg/μl]를 첨가.) 간단하게 혼합한다. 37℃에서 20분간 항온처리한다. 역 피펫팅을 이용하여 "babies" in increments of 100 μl 씩 증분으로 "babies"분획한다.
2. 원심분리를 4℃ 온도로 설정한다.
3. 750 μl의 Trizol LS를 각 100 μl 시료에 첨가하고, 즉시 혼합한다.
5. 벤치탑(benchtop)에서 실온에서 5분간 항온처리한다.
6. 모든 시료는 1400 rpm의 MixMate에서 실온에서 30분간 교반시킨다. 혼합하는 동안 BCP 상 분리 물질을 플레이트에 첨가한다.
7. 간단하게 튜브를 원심분리한다. 시료를 수거용 마이크로뷰트 랙으로 이동시킨다.
8. 플레이트의 시료에 150 μl BCP를 첨가한다. 플레이트에 캡을 씌우고 15초간 활발하게 흔든다.
9. 실온에서 3분간 항온처리한다.
10. 6,000 x g, 4℃에서 15분간 원심분리한다. 원심분리 온도는 24℃ (RT)로 재설정한다.
11. 500 μl 100% EtOH를 새로운 S-블록의 적절한 웰에 추가한다. 200 μl 수성 상을 새로운 S-블록으로 이동시키고, 10X 피펫팅하여 수성/EtOH를 혼합한다.
12. 간단하게 원심분리한다.
13. 새로운 S-블록의 상단에 RNeasy 96 (Qi나이n, Inc., Valencia, CA) 플레이트를 위치시킨다. 수성/EtOH 시료 혼합물을 RNeasy 96 플레이트의 웰 안으로 페펫팅한다. RNeasy 96 플레이트는 AirPore 테이프로 봉한다.
14. 6000 rpm (~5600 x g)에서 실온에서 4분간 회전시킨다. 온도는 24℃이하를 피한다.
15. S-블록을 통과하는 유체를 버림으로써 블록을 비우고 AirPore 테이프를 제거한다.
14. 700 μl의 완충액 RWT를 플레이트에 추가하고, AirPore 테이프로 봉하고, 그리고 6,000 rpm, 실온에서 4분간 원심분리한다. S-블록을 비우고, AirPore 테이프를 제거한다.
15. 500 μl의 완충액 RPE를 플레이트에 추가하고, AirPore 테이프로 밀봉하고, 그리고 6,000 rpm, 실온에서 4분간 원심분리한다. S-블록을 비우고, AirPore 테이프를 제거한다.
16. 또다른 500 μl의 완충액 RPE를 플레이트에 추가하고, AirPore 테이프로 밀봉하고, 그리고 6,000 rpm, 실온에서 10분간 원심분리한다. S-블록을 비우고, AirPore 테이프를 제거한다.
17. Rneasy 96 플레이트를 맑은 용리액 마이크로튜브 랙의 상단에 위치시킨다. 30 μl의 RNase-없는 물을 Rneasy 96 플레이트의 컬럼에 피펫팅한다. AirPore 테이프로 봉한다.
18. 물은 컬럼에 5분간 방치한다.
19. RNA를 용리하기 위하여 6,000 rpm에서 4분간 컬럼을 원심분리한다. 마이크로튜브는 용리 마이크로튜브 캡으로 씌운다. babies를 함께 모은다.
20. -80℃에서 저장한다.
MagMax를 이용하는 프로토콜
프로토콜은 Applied Biosystems/Ambion, Austin, TX의 MagMAX™ RNA 분리 키트를 이용하여 농축된 소낭들로부터 microRNA를 농축시킨다. 이 방법의 단계들은 다음을 포함한다:
1. 700 ㎖의 QIAzol Lysis Re나이nt를 추가하고 1분간 볼텍스한다.
2. 벤치탑에서 실온에서 5분간 항온처리한다.
3. 140㎕의 클로로포름을 추가하고, 15초간 활발하게 흔든다.
4. 벤치탑에서 2-3분간 항온처리한다.
5. 12,000 x g, 4℃에서 5분간 원심분리한다.
6. 수성 상을 딥 웰 플레이트로 옮기고, 1.25 용적의 100% 이소프로판올을 추가한다.
7. MagMAX™ 결합 비드 웰을 흔단다. 10㎕의 RNA 결합 비드를 각 웰에 추가한다.
8. 두 개의 용리 플레이트와 두 개의 추가 딥 웰 플레이트를 합친다.
9. 한 개의 용리 플레이트 "Elution"라고 붙이고, 다른 플레이트는 "Tip Comb"이라고 붙인다.
10. 한 개의 딥 웰에는 "1st 세척 2"를, 그리고 다른 웰에는 "2nd 세척 2"을 붙인다.
11. 세척 2 딥 웰 플레이트 모두에 150㎕의 세척 2를 채우고, 미리 세척하기 위하여 에탄올을 확실히 추가한다. 시료가 있는 동일한 수의 웰에 채운다.
12. MagMax Particle Processor에서 적절한 채집 프로그램을 선택한다.
13. 시작을 누르고, 각 적절한 플레이트를 로드한다.
14. 시료들을 마이크로원심분리 튜브로 옮긴다.
15. 볼텍스하고, -80℃에 보관한다. 잔유 비드는 시료에서 볼 수 있다.
실시예 13: MicroRNA 어래이
시료에서 MicroRNA 수준은 고밀도 및 저밀도 어레이 모두를 포함한 어레이 포맷을 이용하여 분석할 수 있다. 어레이 분석을 이용하여 원하는 환경에서 차등적으로 발현된다는 것을 발견할 수 있는데, 가령, 두 시료들 안에서 다중 miR의 발현을 분석하고, 이 시료들 사이에서 어느 것이 차등적으로 발현되는지를 판단하기 위한 통계학적 분석을 실행하고, 따라서 생체특징으로 이용할 수 있다. 이 어레이를 또한 시료 안에 생체특징을 확인함으로써, 표현형을 특징짓기 위하여 단일 시료 안에 하나 이상의 microRNA의 존재 또는 수준을 확인하는데 이용할 수 있다. 이 실시예는 본 발명의 방법들을 실행하기 위하여 이용되는 시판되는 시스템을 설명한다.
TaqMan 저밀도 어레이
TaqMan 저밀도 어레이 (TLDA) miRNA 카드를 이용하여 원하는 다양한 시료군에서 miRNA의 발현을 비교한다. miRNA는 TaqMan® MicroRNA Assays 및 어레이 시스템(Applied Biosystems, Foster City, CA)을 이용하여 채집하고 분석한다. Applied Biosystems TaqMan® Human MicroRNA 어레이는 제조업자가 공급하는 Megaplex™ Pools Quick Reference Card 프로토콜에 따라 이용한다.
Exiqon mIRCURY LNA microRNA
Exiqon miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR Human Panels I 및 II (Exiqon, Inc, Woburn, MA)을 이용하여 원하는 다양한 시료 군에서 miRNA의 발현을 비교한다. Exiqon 384 웰 패널들은 750가지 miRs를 포함한다. 시료들을 표준화시켜, 합성 RNA spike-in (Universal cDNA synthesis kit (UniSp6 CP))에 대한 프라이머를 조절한다. 결과들을 인터-플레이트 측정(calibrator) 프로브에 표준화시킨다.
어느 시스템을 사용하건, 품질 관리 표준을 시행한다. 각 표시에 대한 3가지 데이터 세트에 대해 각 프로브의 표준화된 값을 평균한다. 20%이상의 평균 CV%를 가진 프로브는 분석에 이용하지 않는다. 두 시료 군 사이에 차등적으로 발현된 miR을 찾기 위하여 결과는 paired t-test를 한다. P-값은 Benjamini and Hochberg 허위-discovery rate test로 보정한다. 결과는 결과s GeneSpring 소프트웨어(Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA)를 이용하여 분석한다.
실시예 14: 소낭에서 MicroRNA 프로파일
실시예 1 및 3에서 설명된 것과 같이, 22Rv1, LNCaP, Vcap 및 정상 혈장으로부터(16명의 기증자로부터 모은) 한외원심분리에 의해 소낭을 수거하였다. RNA는 Exiqon miR 분리 키트 (Cat. No. 300110, 300111)를 이용하여 추출하였다. BCA 분석에 의해 결정된 것과 같이 동량의 소낭 (30㎍)을 이용하였다.
동일한 용적(5 ㎕)을 microRNA를 위한 역-전사 반응에 이용하였다. 역-전사효소 반응은 81 ㎕의 뉴클레아제-없는 물에 희석시키고, 그 다음 이 용액 9 ㎕을 각 개별 miR 분석에 추가하였다. MiR-629만이 PCa (전립선암) 소낭에서 발현된 것으로 밝혀졌고, 그리고 정상 혈장 소낭에서는 실질적으로 탐지되지 않았다. MiR-9는 모든 PCa 세포계에서 상당히 과다발현된 것으로 발견되었고(복사체 수로 측정하였을 때 정상에 비교하여 ~704배 증가), 그리고 정상 혈장 소낭에서는 매우 낮게 발현하였다.
실시예 15: 자성 EpCam-캡쳐된 소낭의 MicroRNA 프로파일
실시예 7의 비드-결합된 소낭을 트QIAzol™ 용해 시약 (Cat. #79306)에 둔다. c. elegans miR-39의 125fmol 분취량을 추가하였다. 제조업자의 지시에 따라 RNA는 Qi나이n miRneasy™ 키트, (Cat. # 217061)를 이용하여 단리하였고, 30 ㎕ RNAe 없는 물에서 용리시켰다.
10 ㎕의 정제된 RNA는 Veriti 96-well thermocycler를 이용하여 miR-9, miR-141 및 miR-629를 위하여 사전-증폭 반응에 두었다. 1:5 희석된 사전-증폭 용액을 이용하여 miR9 (ABI 4373285), miR-141 (ABI 4373137) 및 miR-629 (ABI 4380969) 뿐만 아니라 c. elegans miR-39 (ABI 4373455)에 대한 qRT-PCR를 셋업하였다. 결과는 각 시료에 대해 c. elegans 결과로 표준화시켰다.
실시예 16: CD9-캡쳐된 소낭의 MicroRNA 프로파일
CD9 피복된 Dynal 비드 (Invitrogen, Carlsbad, CA)는 실시예 15에서 EpCam 피복된 비드를 대신하여 사용하였다. 전립선암 환자, LNCaP, 또는 정상 정제된 엑소좀으로부터 소낭은 CD9 피복된 비드와 함께 항온처리하였고, 실시예 15에서 설명된 것과 같이 RNA는 단리하였다. miR-21 및 miR-141의 발현은 qRT-PCR로 탐지하였고, 결과는 도 6에 나타내었다.
실시예 17: 여과 모듈을 이용한 소낭의 분리
6 ㎖의 PBS를 ㎖의 혈장에 추가한다. 그 다음 시료는 1.2 micron (㎛) Pall 주사기 필터를 통하여 바로 100 kDa MWCO (Millipore, Billerica, MA), 7 ㎖ 컬럼+150 kDa MWCO (Pierce®, Rockford, IL), 15㎖ 컬럼 + 100 kDa MWCO (Millipore, Billerica, MA), 또는 20 ㎖ 컬럼 + 150 kDa MWCO (Pierce®, Rockford, IL)에 넣는다.
튜브는 용적이 약 250㎕될 때까지 60 내지 90분간 원심분리한다. 막을 통과하지 못한 물질(retentate)을 수집하고, PBC를 추가하여 시료가 최대 300㎕이 되도록 한다. 50㎕의 시료를 하기 실시예들에서 추가 설명하는 것과 같이 추가 소낭 분석에 이용한다.
실시예 18: 필터로 단리된 소낭들의 다중(multiplex) 분석
실시예 17에서 설명한 것과 같은 방법들을 이용하여 수득한 소낭 시료들은 여기에서 설명된 것과 같이 다중 분석에 이용한다. 가령, 실시예 23-24 참고. 캡쳐 항체들은 CD9, CD63, CD81, PSMA, PCSA, B7H3, 및 EpCam이다. 탐지 항체들은 생물지표들 CD9, CD81, 및 CD63 또는 B7H3 및 EpCam에 대한 것이다.
실시예 19: 소낭들의 유동 세포분석법
정제된 혈장 소낭들은 MoFlo XDP (Beckman Coulter, Fort Collins, CO, USA)를 이용하여 분석하고, 그리고 중앙 형광 강도는 Summit 4.3 Software (Beckman Coulter)를 이용하여 분석하였다. 소낭들은 항체들로 직접 라벨하고, 또는 비드 또는 미소구체 (가령, 자성, BD FACS 7-color setup, catalog no. 335775을 포함하는 폴리스티렌)를 통합시킬 수 있다. 소낭들은 다음의 소낭 항원들에 대항하는 결합제로 탐지할 수 있다: CD9 (마우스 항-인간 CD9, MAB1880, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), PSM (마우스 항-인간 PSM, sc-73651, Santa Cruz, Santa Cruz, CA, USA), PCSA (마우스 항-인간 전립선 세포 표면 항원, MAB4089, Millipore, MA, USA), CD63 (마우스 항-인간 CD63, 556019, BD Biosciences, San Jose, CA, USA), CD81 (마우스 항-인간 CD81, 555675, BD Biosciences, San Jose, CA, USA) B7-H3 (염소 항-인간 B7-H3, AF1027, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), EpCAM (마우스 항-인간 EpCAM, MAB9601, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA). 소낭들은 바람직한 소낭 항원에 대항하는 형광 라벨된 항체들로 탐지할 수 있다. 예를 들면, FITC, 피코에리틴 (PE) 및 Cy7가 항체들을 라벨하는데 흔히 이용된다.
다중 미소구체로 항체들을 캡쳐하기 위하여, 미소구체는 Luminex (Austin, TX, USA)에서 구입할 수 있고, 그리고 Sulfo-NHS 및 EDC(Pierce Thermo (Cat. No. 24510 및 22981 차례로) Rockford, Ill, USA))를 이용하여 원하는 항체들에게 콘쥬게이트한다.
정제된 소낭들 (10㎍/㎖)은 실온에서 1시간 동안 흔들면서 5,000개의 미소구체와 항온처리한다. 이 시료들은 1700 rpms에서 10분간 FACS 완충액 (0.5% FBS/PBS)에서 세척한다. 이 탐지 항체들은 실온에서 1시간 동안 흔들면서 제조업자의 추천 농도에서 항온처리한다. 1700 rpms에서 10분간 FACS 완충액으로 세척한 후, 이 시료들은 100㎕ FACS 완충액에 재현탁시키고, FACS 기계에서 넣는다.
소낭들을 탐지하기 위하여 미소구체를 이용할 때, 라벨된 소낭들은 이들의 탐지 항체 함량에 따라 상이한 튜브로 분류한다. 예를 들면, FITC 또는 PE 라벨된 미소구체를 이용하여, 제 1 튜브는 탐지자가 없는 미소구체 집단을 함유하고, the 제 2 튜브는 PE 탐지자를 가진 집단을 함유하고, 제 3 튜브는 FITC 탐지자를 가진 집단을 함유하고, 그리고 제 4 집단은 PE 및 FITC 탐지자를 가진 집단을 함유한다. 분류된 소낭 집단은 mRNA, microRNA 또는 단백질 함량과 같은 페이로드를 검사하여 추가 분석할 수 있다.
도 7은 MoFlo XDP를 이용하여 소낭들을 분리 및 확인하는 것을 보여준다. 이 실험에서, 단순 완충액으로 약 3000회 촉발(trigger) 이벤트가 있다(가령 약 큰 소낭 크기로 미립자를 만든다). 착색안된 소낭들 (레이져로 분산시키기 위하여 충분한 크기의 43,000개 소낭들)로 약 46,000회 촉발 이벤트가 있다. 착색된 소낭들로 약 500,000회 촉발 이벤트가 있다. 모두 FITC로 라벨한 테트라스패닌 CD9, CD63, 및 CD81에 대한 탐지 물질을 이용하여 소낭들을 탐지하였다. 더 작은 소낭들은 탐지 물질들로 착색하였을 때 탐지할 수 있다.
특이적 집단의 소낭들을 분류하여 실시되는 물리적 분리는 부분적으로 또는 온전하게 정제된 소낭 집단에서 microRNA 분석과 같은 추가 연구를 용이하게 한다.
실시예 20: 소낭들의 항체 탐지
환자 시료 안에 소낭들은 여기에서 설명된 것과 같은 기술들을 이용하여 시료 안 소낭들을 탐지하기 위하여 항체-피복된 비드를 이용하여 평가한다. 다음의 일반적인 프로토콜을 이용한다:
a. 관리 시점(가령, 진료소, 의사 진료실, 병원)에서 환자로부터 채혈한다.
b. 혈액의 혈장 분획물을 추가 분석에 이용한다.
c. 큰 입자를 제거하고, 소낭을 포함하는 분획물을 단리시키기 위하여, 혈장 시료는 0.8 또는 1.2 micron (㎛) 주사기 필터로 여과하고, 그 다음 컬럼, 가령, 150 kDa 분자량 컷 오프를 가진 크기 압출 컬럼을 통과시킨다. 이 과정은 도 8A에 나타낸다. 도 8B에서 설명된 것과 같이, 여과는 한외원심분리에 바람직할 수 있다. 이론에 구속되지 않고, 고속 원심분리는 막에 좀 더 단단하게 고정되는 테트라스패닌과는 반대로 막에 약하게 고정되는 단백질 표적을 제거할 수 있고, 그리고 소낭 안에 세포 특이적 표적들을 제거할 수 있고, 소낭의 생체특징의 후속 분석에서 탐지되지 않을 수 있다.
d. 소낭 분획물은 관심 대상의 표식에 대한 "캡쳐" 항체와 콘쥬게이트된 비드와 함께 항온처리한다. 그 다음 캡쳐된 소낭들은 라벨된 "탐지" 항체들, 가령, 피코에리틴 또는 FITC 콘쥬게이트된 항체들로 테그할 수 있다. 비드도 마찬가지로 라벨될 수 있다.
e. 시료 안에 캡쳐된 그리고 테그된 캡쳐된 소낭들을 탐지한다. 형광적으로 라벨된 비드와 탐지 항체들은 도 8C에 나타낸 것과 같이 탐지할 수 있다. 라벨된 비드 및 라벨된 탐지 항체들의 이용으로 캡쳐 항체에 의해 여기에 결합된 소낭들을 가진 비드의 평가가 가능하다.
f. 데이터를 분석한다. 특정 캡쳐 항체의 중앙 형광 강도(MFI)에 대한 임계치를 설정할 수 있다. 상기 임계치 이상의 캡쳐 항체에 대한 판독은 특정 표현형을 나타낼 수 있다. 실시예로 설명하는 것과 같이, 암 표식을 지향하는 캡쳐 항체에 대한 임계치 이상의 MFI는 환자 시료에 암이 존재함을 나타낼 수 있다.
도 8에서, 비드(816)는 모세관(811)을 통하여 이동한다. 상이한 파장에서 이중 레이져(812)의 이용으로 비드로부터 유도된 형광 신호로부터 캡쳐 항체(818)의 탐지기(813)에서 그리고 라벨된 탐지 항체들 (819)로부터 중앙 형광 강도(MFI)를 분리 탐지하도록 한다. 관심 대상의 상이한 캡쳐 항체들에 콘쥬게이트된 라벨된 비드를 이용하면(각 비드는 상이한 플로오르로 라벨됨) 나타낸 것과 같이, 단일 분석에서 상이한 소낭(817)의 다중 분석을 허용한다. 레이져 1(815)는 비드 유형(가령, 캡쳐 항체)의 탐지를 허용하고 그리고 레이져 2(814)는 탐지 항체들의 측정을 허용하여, 이는 CD9, CD63 및 CD81을 포함하는 테트라스패닌과 같은 일반적인 소낭 표식들을 포함할 수 있다. 상이한 비드 집단 및 레이져의 이용으로 단일 분석에서 많은 상이한 집단의 동시 다중 분석이 허용된다.
실시예 21: 전립선암의 탐지
상업적 공급업자로부터 고품질 훈련 세트 시료들을 구하였다. 시료들은 42명의 정상 전립선을 가진 자, 42명의 PCa 및 15명의 BPH 환자들의 혈장을 포함하였다. PCa 시료들은 4개가 단계 III 그리고 나머지는 상태 II를 포함한다. 모든 작업이 완료될 때까지 시료들을 밝히지 않았다.
시료들로부터 소낭은 여과에 의해 수득하여 1.5 microns이상의 미립자를 제거하고, 이어서 컬럼 농축과 속이 빈 섬유 막 튜브를 이용하여 정제하였다. 상기에서 설명한 것과 같이, 다양화된 비드-기반 분석 시스템을 이용하여 시료들을 분석하였다.
다음의 단백질들에 대한 항체를 분석하였다
a. 일반적인 소낭 (MV) 지표들: CD9, CD81, 및 CD63
b. 전립선 MV 지표들: PCSA
c. 암-연관된 MV 지표들: EpCam 및 B7H3
시료들은 다음과 같은 품질 테스트를 통과해야만 하였다: 다양화된 중앙 형광 강도 (MFI) PSCA + MFI B7H3 + MFI EpCam < 200 이라면, 시료는 배경 이상의 신호 부족으로 기능을 하지 못한다. 훈련 세트에서, 6가지 시료들 (3가지 정상과 3가지 전립선암)는 적절한 품질 수치를 얻지 못하였고, 따라서 제외하였다. MFI에서 상한은 다음과 같이 확립하였다: EpCam의 MFI가 > 6300이면, 테스트는 상한 수치 이상이며, 시료는 암이 아닌 것으로 간주한다(가령, 테스트 목적에 대해 "음성").
훈련 세트 단백질들에 대한 6개 항체들의 MFI 수치 결과에 따라 시료를 분류하였고, 여기에서 다음 조건에 부합되어야만 시료를 PCa 양성으로 분류하였다:
a. 일반적인 MV 지표들의 평균 MFI > 1500
b. PCSA MFI > 300
c. B7H3 MFI > 550
d. EpCam MFI 550 - 6300
84개의 정상 및 PCa 훈련 데이타 시료들를 이용하여, 테스트는 PCa vs 정상 시료들에 대해 98% 민감성 및 95% 특이적인 것으로 나타났다. 도 9A 참고. 정상과 비교하여 PCa 시료의 증가된 MFI는 도 9B에 나타낸다. PSA 및 PCA3 테스트와 비교하여, 실시예에서 제시한 PCa 테스트는 스크린된 모든 1000명의 정상인에서 PCa없는 220명을 불필요한 생검을 하는 것으로부터 구할 수 있다.
실시예 22: 미소구 소낭 전립선 암 분석 프로토콜
이 실시예에서, 이 소낭 PCa 테스트는 전립선암 환자의 혈장으로부터 얻은 소낭에 존재하는 단백질 생물지표들 세트를 탐지하기 위한 면역 분석 기반의 미소구체다. 테스트는 다음의 생물지표들에 대한 특이적 항체들을 이용한다 : CD9, CD59, CD63, CD81, PSMA, PCSA, B7H3 및 EpCAM. 항체 피복된 미소구체에 의한 소낭의 캡쳐 이후, 피코에리틴-라벨된 항체들은 소낭 특이적 생물지표들의 탐지에 이용한다. 환자의 혈장으로부터 얻은 소낭에 대한 이들 항체의 결합 수준에 따라 전립선암의 존재 또는 부재가 결정된다.
소낭은 상기에서 설명된 것과 같이 단리한다.
미소구체
특정 항체들은 미소구(Luminex)에 콘쥬게이트한다. 각 미소구체는 특이적 항체에 콘쥬게이트되고, 그 이후 미소구체는 다음으로 구성된 Microsphere Master Mix를 만들기 위하여 복합된다: L100-C105-01; L100-C115-01; L100-C119-01; L100-C120-01; L100-C122-01; L100-C124-01; L100-C135-01; 및 L100-C175-01. xMAP® Classification Calibration Microsphere L100-CAL1 (Luminex)는 Luminex LX200 기구용 기구 측정 시약으로 이용한다. xMAP® Reporter Calibration MicrosphereL100-CAL2 (Luminex)는 Luminex LX200 기구의 기구 리포터 측정 시약으로 이용한다. xMAP® Classification Control Microsphere L100-CON1 (Luminex)는 Luminex LX200 기구의 기구 관리 시약으로 이용한다. xMAP Reporter Control Microsphere L100-CON2 (Luminex)는 Luminex LX200 기구의 리포터 관리 시약으로 이용한다.
캡쳐 항체들
다음의 항체들을 이용하여 이 실시예에서 소낭에 있는 항체들의 각 단백질 표적들에 결합함으로써 소낭의 특정 집단을 캡쳐하는데 이용되는 Luminex 미소구체를 피복한다: a. 마우스 항-인간 CD9 단클론 항체는 *EPCLMACD9-C105를 만들기 위하여 미소구체 L100-C105를 피복하는데 이용한 IgG2b이다; b. 마우스 항-인간 PSMA 단클론 항체는 EPCLMAPSMA-C115를 만들기 위하여 미소구체 L100-C115를 피복하는데 이용한 IgG1이다; c. 마우스 항-인간 PCSA 단클론 항체는 EPCLMAPCSA-C119를 만들기 위하여 미소구체 L100-C119를 피복하는데 이용한 IgG1이다; d. 마우스 항-인간 CD63단클론 항체는 EPCLMACD63-C120를 만들기 위하여 미소구체 L100-C120을를 피복하는데 이용한 IgG1이다; e. 마우스 항-인간 CD81 단클론 항체는 EPCLMACD81-C124를 만들기 위하여 미소구체 L100-C124를 피복하는데 이용한 IgG1이다; f. Goat 항-인간 B7-H3 다클론 항체는 EPCLGAB7-H3-C125를 만들기 위하여 미소구체 L100-C125를 피복하는데 이용한 IgG 정제된 항체이다; 그리고 g. 마우스 항-인간 EpCAM 단클론 항체는 EPCLMAEpCAM-C175를 만들기 위하여 미소구체 L100-C175를 피복하는데 이용한 IgG2b이다.
탐지 항체들
이 분석에서 다음의 피코에리틴 (PE) 라벨된 항체들을 탐지 프로브들로 이용한다: a. EPCLMACD81PE: 마우스 항-인간 CD81 PE 라벨된 항체는 캡쳐된 소낭에서 CD81을 탐지하는데 이용된 IgG1 항체이다; b. EPCLMACD9PE: 마우스 항-인간 CD9 PE 라벨된 항체는 캡쳐된 소낭에서 CD9를 탐지하는데 이용되는 IgG1 항체이다; c. EPCLMACD63PE: 마우스 항-인간 CD63 PE 라벨된 항체는 detect CD63 on 캡쳐된 소낭에서 CD63을 탐지하는데 이용되는 IgG1 항체이다; d. EPCLMAEpCAMPE: 마우스 항-인간 EpCAM PE 라벨된 항체는 캡쳐된 소낭에서 EpCAM을 탐지하는데 이용된 IgG1 항체이다; e. EPCLMAPSMAPE: 마우스 항-인간 PSMA PE 라벨된 항체는 캡쳐된 소낭에서 PSMA를 탐지하기 위하여 이용된 IgG1 항체이다; f. EPCLMACD59PE: 마우스 항-인간 CD59 PE 라벨된 항체는 캡쳐된 소낭에서CD59를 탐지하는데 이용된 IgG1 항체이다; 그리고 g. EPCLMAB7-H3PE: 마우스 항-인간 B7-H3 PE 라벨된 항체는 캡쳐된 소낭에서 B7-H3를 탐지하기 위하여 이용된 IgG1 항체이다.
시약 준비물(Re나이nt Preparation)
항체 정제: 표 12에서 다음 항체들을 판매업자로부터 제공받고, 다음의 프로토콜에 따라 바람직한 작업 농도로 조정한다.
PCa 분석을 위한 항체들
항체
용도
EPCLMACD9
소낭캡쳐를 위한 미소구체의 피복
EPCLMACD63
소낭캡쳐를 위한 미소구체의 피복
EPCLMACD81
소낭캡쳐를 위한 미소구체의 피복
EPCLMAPSMA
소낭캡쳐를 위한 미소구체의 피복
EPCLGAB7-H3
소낭캡쳐를 위한 미소구체의 피복
EPCLMAEpCAM
소낭캡쳐를 위한 미소구체의 피복
EPCLMAPCSA
소낭캡쳐를 위한 미소구체의 피복
EPCLMACD81PE
소낭생물지표 탐지용 PE 피복된 항체
EPCLMACD9PE
소낭생물지표 탐지용 PE 피복된 항체
EPCLMACD63PE
소낭생물지표 탐지용 PE 피복된 항체
EPCLMAEpCAMPE
소낭생물지표 탐지용 PE 피복된 항체
EPCLMAPSMAPE
소낭생물지표 탐지용 PE 피복된 항체
EPCLMACD59PE
 소낭생물지표 탐지용 PE 피복된 항체
EPCLMAB7-H3PE
 소낭생물지표 탐지용 PE 피복된 항체
항체 정제 프로토콜: 항체들은 Pierce (단백질 G spin kit, prod # 89979)의 단백질 G 수지를 이용하여 정제한다. 여과된 P-200 tips으로부터 만들어진 마이크로-크로마토그래피 컬럼을 정제에 이용한다.
100㎕의 단백질 G 수지를 Pierce 키트로부터 100㎕ 완충액과 함께 각 마이크로 컬럼에 로딩한다. 수지가 가라앉도록 몇 분간 기다린 후, 공기압을 P-200 Pipettman에 제공하여 컬럼이 건조한 상태로 있지 않도록 하면서 필요할 때 완충액을 배수한다. 컬럼은 0.6㎖의 결합 완충액 (pH 7.4, 100mM 인산염 완충액, 150mM NaCl; (Pierce, Prod # 89979)으로 평형을 이루게 한다. 항체를 컬럼에 제공한다 (1mg 미만의 항체를 컬럼에 로딩한다). 컬럼은 1.5㎖의 결합완충액으로 세척한다. 5개의 튜브(1.5 ㎖ 마이크로 원심분리 튜브)를 준비하고, 10 ㎕의 중화 용액(Pierce, Prod # 89979)을 각 튜브에 제공한다. 항체는 키트의 용리 완충액으로 5개의 각 튜브로, 각 튜브당 100㎕씩 용리시킨다(총 500 ㎕). 각 분획물의 상대 흡수는 Nanodrop (Thermo scientific, Nanodrop 1000 spectrophotometer)를 이용하여 280㎚에서 측정한다. 최고 OD 판독값을 가진 분획물을 다음 용도로 선택한다. 시료들은 0.25 liters PBS 완충액에 대항하여 Pierce Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette (Pierce, prod 66333, 3KDa 컷오프)를 이용하여 투석시킨다. 완충액은 4℃에서 지속적으로 교반시키면서 최소 3회 교환하는 동안 매 2시간마다 교환한다. 투석된 시료들 1.5㎖ 마이크로원심분리 튜브로 옮기고, 그리고 라벨시킬 수 있고, 4C (단기) 또는 -20C (장기)에서 저장할 수 있다.
미소구체 작업 믹스 어셈블리: 미소구체 작업 믹스 MWM101는 표 13의 처음 4개 열의 항체, 미소구체 그리고 피복된 미소구체를 포함한다.
항체-미소구체 조합
항체
미소구체
피복된 미소구체
EPCLMACD9
 L100-C105
 EPCLMACD9-C105
EPCLMACD63
 L100-C120
 EPCLMACD63-C120
EPCLMACD81
 L100-C124
 EPCLMACD81-C124
EPCLMAPSMA
 L100-C115
 EPCLMAPSMA-C115
EPCLGAB7-H3
L100-C125
EPCLGAB7-H3-C125
bEPCLMAEpCAM
L100-C175
EPCLMAEpCAM-C175
EPCLMAPCSA
L100-C119
EPCLMAPCSA-C119
미소구체는 다음의 프로토콜에 따라 상기에서 열거하고 있는 이들의 해당 항체들로 피복된다.
카르복실화된 미소구체에 단백질의 2-단계 카르보디이미드 커플링을 위한 프로토콜: 미소구체는 이 과정을 통하여 광에 장시간 노출되는 것으로부터 보호되어야 한다. 스톡(stock) 비-연결된 미소구체는 미소구체 (xMAP 기술, MicroPlex TM Microsphere)에서 제공되는 Product Information Sheet에서 설명된 지시에 따라 현탁시킨다. 5 x 106 개의 스톡 미소구체를 USA Scientific 1.5㎖ 마이크로원심분리 튜브로 옮긴다. 스톡 미소구체는 실온에서 ≥ 8000 x g, 1-2 분간 마이크로원심분리에 의해 펠렛화시킨다. 상층액을 제거하고, 펠렛화된 미소구체는 볼텍스에 의해 100 ㎕의 dH2O에서 재현탁시키고, 그리고 대략 20초간 초음파파쇄한다. 미소구체는 실온에서 ≥ 8000 x g, 1-2 분간 마이크로원심분리에 의해 펠렛화시킨다. 상층액을 제거하고, 세척된 미소구체는 80 ㎕의 100 mM 일염기 인산나트륨염, pH 6.2에서 볼텍스에 의해 재현탁시키고, 그리고 대략 20초간 초음파파쇄한다(Branson 1510, Branson ULTransonics Corp.). 10 ㎕의 50 ㎎/㎖ Sulfo-NHS (Thermo Scientific, Cat#24500) (dH20에서 희석됨)를 미소구체에 첨가하고, 그리고 볼텍스로 서서히 혼합한다. 10 ㎕의 50 ㎎/㎖ EDC (Thermo Scientific, Cat# 25952-53-8) (dH20에서 희석됨)를 미소구체에 첨가하고, 그리고 볼텍스로 서서히 혼합한다. 미소구체는 10분 간격으로 볼텍스하여 서서히 혼합하면서, 실온에서 20분간 항온처리한다. 활성화된 미소구체는 실온에서 ≥ 8000 x g, 1-2 분간 마이크로원심분리에 의해 펠렛화시킨다. 상층액을 제거하고, 그리고 미소구체는 볼텍스에 의해 250 ㎕의 50 mM MES, pH 5.0 (MES, Sigma, Cat# M2933)에서 재현탁시키고, 대략 20초간 초음파파쇄한다.(오직 PBS-1% BSA+ Azide (PBS-BN)( (Sigma (P3688-10PAK + 0.05% NaAzide (S8032)))는 분석 완충액 뿐만 아니라 세척 완충액으로 이용되어야 한다). 미소구체는 그 다음 실온에서 ≥ 8000 x g, 1-2 분간 마이크로원심분리에 의해 펠렛화시킨다.
상층액을 제거하고, 볼텍스에 의해 250 ㎕의 50 mM MES, pH 5.0 (MES, Sigma, Cat# M2933)에서 재현탁시키고, 대략 20초간 초음파파쇄한다 (Only PBS-1% BSA+ Azide (PBS-BN) ((오직 PBS-1% BSA+ Azide (PBS-BN)( (Sigma (P3688-10PAK + 0.05% NaAzide (S8032)))는 분석 완충액 뿐만 아니라 세척 완충액으로 이용되어야 한다). 미소구체는 그 다음 실온에서 ≥ 8000 x g, 1-2 분간 마이크로원심분리에 의해 펠렛화시키고, 따라서 50 mM MES, pH 5.0으로 2회 세척으로 완료된다.
상층액을 제거하고, 활성화된 미소구체는 10 ㎕의 50 mM MES, pH 5.0에서 재현탁시키고, 대략 20초간 초음파파쇄한다.
125㎍, 25㎍, 5㎍ 또는 1 ㎍의 단백질을 재현탁시킨다(주석: 1 내지 125 ㎍ 범위의 적정을 실행하여 특이적 커플링 반응당 최적의 단백질 양을 결정할 수 있다). 전체 용적은 50 mM MES, pH 5.0으로 500㎕까지 만든다. 커플링 반응은 볼텍스로 혼합하고, 실온에서 혼합하면서 2시간 동안 항온처리한다(Labquake rotator, Barnstead에서 회전). 연결된 미소구체는 실온에서 ≥ 8000 x g, 1-2 분간 마이크로원심분리에 의해 펠렛화한다. 상층액을 제거하고, 그리고 펠렛화된 미소구체는 500 ㎕의 PBS-TBN에서 볼텍스에 의해 재현탁시키고, 대략 20초간 초음파파쇄시킨다(특이적 시약, 분석 상태, 사용시에 다중화의 수준, 등에 대해 농도를 최적화할 수 있다).
미소구체는 실온에서 혼합하면서 30분간 항온처리한다(Labquake rotator, Barnstead에서 회전). 연결된 미소구체는 실온에서 ≥ 8000 x g, 1-2 분간 마이크로원심분리에 의해 펠렛화한다. 상층액을 제거하고, 그리고 미소구체는 1㎖의 PBS-TBN에서 볼텍스에 의해 재현탁시키고, 대략 20초간 초음파파쇄시키고(매번 시료들, 검출자 항체 또는 SA-PE를 추가하고, 플레이트는 실러와 빛 차단물질(가령, 알루미늄 호일)로 덮고, 오비탈 쉐이커 위에 위치시키고, 비드를 재현탁시키기 위하여 15-30초간 900으로 설정한다. 그 다음 속도는 항온처리 하는 동안 550으로 설정시켜 높아야 한다).
미소구체는 ≥ 8000 x g, 1-2 분간 마이크로원심분리에 의해 펠렛화한다. 상층액을 제거하고, 그리고 미소구체는 1㎖의 PBS-TBN에서 볼텍스에 의해 재현탁시키고, 대략 20초간 초음파파쇄시킨다. 미소구체는 ≥ 8000 x g, 1-2 분간 마이크로원심분리에 의해 펠렛화한다(1 ㎖의 PBS-TBN로 총 2번의 세척을 하게 된다).
미소구체 분석을 위한 프로토콜 : 다중 피코에리틴 검출자을 위한 준비물의 경우, 실시예 4에서 설명된 것이 항체를 이용한다. 100㎕은 시스템 매뉴얼에 따라(High PMT setting) Luminex 분석기(Luminex 200, xMAP technologies)상에서 분석한다.
의사결정수상도(Decision Tress) : 피험자가 암을 가지고 있는 지를 판단하기 위하여, 의사결정수상도 (도 10)를 이용하여 미소구체 분석의 결과를 평가한다. MFI에서 임계치 한계를 확립하고 그리고 시료가 분석을 실행하기 위한 충분한 신호를 보유하는지(가령, 분석을 위한 유효 시료인지, 또는 추가 분석에 무효 시료인지, 이때 제 2 환자 시료를 얻을 수 있다) 그리고 시료가 PCa 양성인지를 판단하기 위하여, 항체들에 대한 MFI 수치의 결과에 따라 시료를 분류한다. 도 10은 PCSA, PSMA, B7-H3, CD9, CD81 및 CD63으로 수득한 MFI를 이용한 의사결정수상도를 보여준다. MFI가 예정된 임계치(TH)의 표준 편차 이내에 있다면 이 시료는 불확정으로 분류된다. 이 경우에서, 제 2 환자 시료를 구할 수 있다. 실증을 위하여, 시료는 개별 테트라스파닌으로 소낭을 캡쳐하고, 모든 테트라스파닌으로 라벨할 때 충분한 신호를 보유해야만 한다. 실증에 통과한 시료는 전립선-특이적 지표 (PSMA 또는 PCSA)가 양성으로 간주되고, 이 암 지표(B7-H3)의 신호 또한 양성으로 간주된다면 양성으로 부른다.
실시예 23: 미소구체 소낭 PCa 분석 실행
이 실시예에서, 소낭 PCa 테스트는 전립선 암 환자들의 혈장으로부터 얻은 소낭들에 존재하는 단백질 생물지표들의 탐지를 위한 미소구체 기반 면역분석이다. 이 테스트는 하기에서 나타낸 것과 같이 변형으로 실시예 22와 유사하게 진행한다.
이 테스트는 순환하는 미세소낭들을 탐지하기 위하여 기획된 다중화된 면역분석을 이용한다. 이 테스트는 혈장과 같은 환자 시료들에 존재하는 미세소낭을 캡쳐하기 위하여 PCSA, PSMA 및 B7H3을 이용하고, 그리고 이 캡쳐된 미세소낭들을 탐지하기 위하여 CD9, CD81, 및 CD63을 이용한다. 이 분석의 결과는 미세소낭에서 개별 캡쳐 단백질과 탐지 단백질을 모두 함유하는 미세소낭들의 형광적으로 라벨된 항체 탐지로 인한 중앙 형광 강도(MFI)다. PSMA 또는 PCSA, 및 B7H3 단백질-함유하는 미세소낭들의 MFI 수준이 실험적으로 결정한 임계치 이상이면 이 테스트에서 시료는 "POSITIVE"다. 2011년 4월 6일자로 제출된 국제 특허 출원 번호 PCT/US2011/031479, "Circulating Biomakers for Disease"(이들은 전문이 여기에 참고자료로 편입된다)의 실시예 33에 제시된 임계치를 측정하는 방법. 이들 두 미세소낭 캡쳐중 임의의 하나가 실험적으로 결정한 임계치 이하의 MFI 수준을 나타낸다면, 시료는 "음성"으 결정된다. 대안으로, 시료 MFI 값이 특정 임계치에 부합되지 않거나 또는 되풀이된 데이터가 통계학적으로 너무 변이가 심하여 양성 또는 음성 결과를 분명하게 만들지 못한다면, "INDETERMINATE"결과가 보고될 것이다. 이 테스트에서"NON-EVALUABLE"해석은 실험적으로 유도된 임계치를 결정하기 위한 방법으로 국제 특허 출원 번호 PCT/US2011/031479, "Circulating Biomakers for Disease"(이들은 전문이 여기에 참고자료로 편입된다)의 실시예 33 참고.
이 테스트는 다음의 생물지표들에 대한 특이적 항체들을 이용한다: 실시예 22에서와 같이 CD9, CD59, CD63, CD81, PSMA, PCSA, 및 B7H3. 판단 규정은 표 14에서 나타낸 것과 같이, 시료를 양성, 음성 또는 중간인지를 판단하도록 설정된다. 실시예 22 참고. 양성으로 불리는 시료의 경우, 반복값은 테트라스패닌 표식들 (CD9, CD63, CD81), 전립선 표식들 (PSMA 또는 PCSA), 그리고 B7H3에 대해 결정된 4가지 MFI 컷오프 값 모두를 초과해야 한다. 시료들은 PSMA 및 PCSA로부터 3가지 반복 모두 또는 B7H3 항체들로부터 3가지 반복중 임의의 것이 컷오프 MFI 값에 미치는 경우 "중간"으로 부른다. 테트라스패닌 표식들 (CD9, CD63, 및 CD81), 전립선 표식들 (PSMA 또는 PCSA), B7H3 중 최소한 하나가 MFI 컷오프 아래로 떨어진다면 시료를 음성으로 부른다.
각 캡쳐 항체에 대한 MFI 매개변수
테스타스패닌 표식 (CD9, CD63, CD81)
 전립선 표식 (PSMA, PCSA)
 B7H3
 결과
결정
3가지 테트라스패닌의 모든 반복의 평균이 MFI >500안 경우
 두 가지 전립선 표식중 어느 것의 반복 모두가 PCSA의 경우 MFI >350 그리고 PSMA의 경우 >90
B7H3의 모든 반복이 MFI >300인 경우
 3가지 모두 참이면, 시료는 양성으로 부른다
전립선 표식의 모든 반복이 PCSA의 경우 MFI =350 이상 또는 이하, 그리고 PSMA의 경우 MFI=90
B7H3의 임의의 반복이 MFI =300 이상 및 이하 값 모두를 가진다
 어느 것 하나가 침인 경우, 시료는 중간으로 부른다
3가지 테트라스패닌의 모든 반복이 MFI <500을 가진다
 두 가지 전립선 표식들중 하나의 모든 반복이 PCSA의 경우 MFI <350이고, PSMA의 경우 <90
 B7H3의 모든 반복이 MFI <300을 가진다
 3가지중 임의의 것이 참이면, 주어진 시료가 중간으로 한정되지 못하는 조건에서는 시료를 음성이라고 한다.
소낭 PCa 테스트는 생검으로 확인한 것과 같이, PCa 또는 PCa가 아닌 296명의 환자들 무리에서 상승된 PSA와 비교하였다. 결과의 ROC 곡선은 도 11에 나타낸다. 나타낸 것과 같이, 소낭 PCa 테스트에 대한 곡선 아래 면적(AUC)은 0.94이었으며, 반면에 동일 시료에서 상승된 PSA에 대한 AUC는 단지 0.68이었다. PCa 시료들은 높은 PSA 값으로 인하여 발견될 것 같았다. 따라서, 이 집단은 PSA에 유리하게 왜곡되어, 이는 실제 임상 환경에서 관찰되는 것 이상의 더 높은 AUC 때문이다.
소낭 PCa 테스트는 933명의 환자 혈장 시료들 집단에서 추가 실행하였다. 결과는 표 15에 요약한다:
933명의 환자 집단에서 소낭 PCa 테스트 실행
참 양성
 409
참 음성
 307
거것 양성
 50
거짓 음성
 72
평가 불가
 63
중간
 32
총합
 933
감응성
 85%
특이성
 86%
정확성
 85%
평가 불가율
 8%
중간 비율
 5%
표 15에 나타낸 것과 같이, 소낭 PCa 테스트는 85% 정확성에 대해 86% 특이성 수준에서 85% 감응성을 얻었다. 대조적으로, 85% 감응성에서 PSA는 약 55% 특이도 11. 933개 시료들중 약 12%는 평가-불가하였거나 또는 중간이었다. 환자들의 시료들은 재-채집하고, 그리고 재-평가할 수 있었다. 소낭 PCa 테스트는 933개 시료들에 대해 0.92의 AUC를 보유하였다.
실시예 24: 전립선 암을 탐지하기 위한 소낭 단백질 어래이
이 실시예에서, 이 소낭 PCa 테스트는 전립선암을 가진 환자의 혈장으로부터 얻은 소낭에 존재하는 단백질 생물지표들 세트의 탐지를 위하여 단백질 어래이, 좀더 구체적으로 항체 어래이를 이용하여 실행된다. 이 어래이는 다음의 단백질 생물지표들: CD9, CD59, CD63, CD81에 특이적인 캡쳐 항체들을 포함한다. 실시예 6에서 설명된 것과 같이, 소낭을 단리한다. PCa 에 대한 위험에 처한(가령, 50세 이상의) 남성의 혈장으로부터 얻은 소낭을 여과 및 분리한 후, 혈장 시료들을 다양한 캡쳐 항체들을 품고 있는 어래이와 항온처리한다. 어래이에 혼성화되는 환자의 혈장의 소낭에 결합되는 PSMA, PSCA, B7H3 및 EpCAM에 대한 형광으로 라벨된 탐지 항체들의 결합 수준에 따라, 전립선암의 존재 또는 부재를 결정한다.
제 2 어래이 포맷에서, 이 소낭은 혈장으로부터 단리시키고, 그리고 CD9, CD59, CD63, CD81, PSMA, PCSA, B7H3 및 EpCam을 포함하는 어래이에 혼성화시킨다. 캡쳐된 소낭은 Cy3 및/또는 Cy5로 라벨된 비-특이적 소낭 항체들로 테그한다. 형광이 탐지된다. 결합 패턴에 따라, 전립선암의 존재 또는 부재를 판단한다.
실시예 25: miRs를 이용한 BPH와 PCa의 구별
9명의 정상인 남성과 전립선 암 3기인 9명의 개인의 혈장 유도된 소낭에서 RNA를 Exiqon mIRCURY LNA microRNA PCR 시스템 패널에서 분석하였다. Exiqon 384 웰 패널들은 750개 miRs를 측정한다. Universal cDNA synthesis kit (UniSp6 CP)의 합성 RNA spike-in에 대한 프라이머를 조절하기 위하여 시료들을 표준화시켰다. 각 표시 (BPH 또는 PCa)에 대하여 세 가지 데이터 세트를 통한 각 프로브의 표준화 값을 평균하였다. 20% 이상의 평균 CD%를 가진 프로브는 분석에 이용하지 않았다.
결과 분석에서 전립선 암 3기의 시료들과 비교하여 BPH 시료들에서 2배 또는 그 이상으로 과다발현된 몇 가지 microRNA가 나타났다. 이들 miRs는 표 16에 나타낸 것과 같이 다음을 포함한다: hsa-miR-329, hsa-miR-30a, hsa-miR-335, hsa-miR-152, hsa-miR-151-5p, hsa-miR-200a 및 hsa-miR-145:
PCa와 비교하여 BPH에서 과다발현된 miRs
PCa와 비교하여 BPH에서 과다발현됨
 배수 변화
hsa-miR-329
 12.32
hsa-miR-30a
 6.16
hsa-miR-335
 6.00
hsa-miR-152
 4.73
hsa-miR-151-5p
 3.16
hsa-miR-200a
 3.16
hsa-miR-145
 2.35
실시예 26: 대조군과 PCa 시료들에서 miR-145
도 12는 대조군과 전립선 암 시료들에서 miR-145의 비교를 설명한다. RNA 는 실시예 12에서와 같은 채집하였다. 대조군은 PSA < 4 ng/㎖이고, 직장 수지 검사(DRE)가 양성인 75세 이상의 Caucasians과 65세 이상의 Aferican American을 포함한다. 도면에서 볼 수 있는 것과 같이, miR-145는 PCa 시료들에서 과소발현되었다. miR-145는 양성 전립선 변화(가령, BPH)와 비교하여 초기/진행이 더딘 PCa를 가진 환자를 확인하는데 유용하다.
실시예 27: 소낭 진단 분석 성과를 강화시키기 위한 miR
여기에서 설명된 것과 같이, 소낭들은 혈장 환자의 혈장 시료들에서 농축되고, 진단, 예후 또는 치료진단 판독을 제공하기 위하여 평가한다. 환자 시료들의 소낭 분석은 여기에서 설명된 것과 같이 소낭 표면 생물지표들, 가령, 표면 항원, 및/또는 소낭 페이로드, 가령, mRNA 및 microRNA의 탐지를 포함한다. 소낭 안에 페이로드를 평가하여 분석 성과를 강화시킬 수 있다. 예를 들면, 도 13A는 거짓 음성을 참 양성으로 전환시키고, 이로 인하여 감응성을 개선시키기 위하여, 소낭 안에 miR 분석을 이용하는 계획안을 설명한다. 이 계획안에서, 소낭 표면 항원 분석에 의해 음성으로 불리는 시료들은 소낭들과 페이로드를 평가함으로써 참 음성 또는 참 양성으로 추가 확인한다. 유사하게, 도 13B는 거짓 양성을 참 음성으로 전환시키고, 이로 인하여 특이성을 개선시키기 위하여, 소낭 안에 miR 분석을 이용하는 계획안을 설명한다. 이 계획안에서, 소낭 표면 항원 분석에 의해 양성으로 불리는 시료들은 소낭들과 페이로드를 평가함으로써 참 음성 또는 참 양성으로 추가 확인한다.
전립선 암의 진단 테스트는 전립선 암의 존재 또는 부재를 나타내는 소낭을 탐지하기 위하여 환자의 혈액 시료로부터 소낭들을 단리하는 것을 포함한다. 가령, 실시예 20-23 참고. 혈액은 혈청 또는 혈장일 수 있다. 이 소낭들은 특이적 소낭 표면 항원을 인지하는 "캡쳐 항체들"으 캡쳐함으로써 단리된다. 전립선 암 진단 분석에 대한 표면 항원들은 혈액내 소낭에 일반적으로 존재하는 테트라스패닌 CD9, CD63 및 CD81이며, 따라서 일반적인 소낭 생물지표들, 전립선 특이적 생물지표들 PSMA 및 PCSA, 그리고 암 특이적 생물지표 B7H3으로 작용한다. 캡쳐 항체들 형광적으로 라벨된 비드에 연결되어 있고, 여기에서 비드는 각 캡쳐 항체에 차등적으로 라벨된다. 캡쳐된 소낭들은 테트라스패닌 CD9, CD63 및 CD81에 대한 형광적으로 라벨된 "탐지 항체들"을 이용하여 추가 강조된다. 비드와 탐지 항체들의 형광을 이용하여 전립선 암 진단 분석을 위한 표면 항원들을 발현시키는 혈장 시료 안의 소낭의 양을 결정한다. 시료안에 형광 수준은 기준 수준과 비교하여, 전립선 암을 가진 시료들을 구별할 수 있다. 이 실시예에서, microRNA 분석을 이용하여 소낭-기반 전립선 암 진단 분석의 성과를 강화시킨다.
도 13C는 소낭-기반 전립선 암 진단 분석에 의해 평가된 시료 안에 miR-107의 탐지 결과를 보여준다. 도 13D는 소낭-기반 전립선 암 진단 분석에 의해 평가된 시료 안에 miR-141의 탐지 결과를 보여준다. 이 도면에서, 표시된 miR의 표준화된 수준은 소낭 진단 분석에 의해 참 양성(TP), 소낭 진단 분석에 의해 참 음성(TN), 소낭 진단 분석에 의해 거짓 양성(FP), 그리고 소낭 진단 분석에 의해 거짓 음성(FN)에 대해 Y 축에 나타낸다. 도 13C에서 나타낸 것과 같이, miR-107의 이용은 참 음성으로부터 거짓 음성을 구별함으로써, 소낭 분석의 감응성을 강화시킨다(p=0.0008). 유사하게, 도 13D는 miR-141의 이용은 참 음성으로부터 거짓 음성을 구별함으로써, 소낭 분석의 감응성을 강화시킨다(p=0.0001). miR-141의 추가 결과는 표 17에 나타낸다. miR-574-3p는 유사하게 실행한다.
PCa에 대한 소낭-기반 테스트에 miR-141의 추가
miR-141 없이
 miR-141과 함께
감응성
 85%
 98%
특이성
 86%
 86%
이 실시예에서, 전립선 암을 나타내는 표면 항원을 통하여 소낭들을 탐지하고, 그리고 특징의 성과는 소낭들 안에 있는 miR을 검사함으로써 광화되어, 가령, 특이성에 부정적으로 영향을 주지 않고 감응성은 증가된다. 이러한 일반적인 방법은 표면 항원 또는 기타 정보를 제공하는 특징들에 대해 소낭들을 프로파일하여, 하나 이상의 추가 생물지표를 이용하여 특징을 강화시키는 임의의 설정에 대해 확장시킬 수 있다. 여기에서, 하나 이상의 추가 생물지표들은 miRs이다. 이들은 mRNA, 가용성 단백질, 지질s, 탄수화물 및 관심 대상의 표현형을 특징화시키는데 유용한 임의의 다른 소낭-연합된 생물학적 엔터티를 또한 포함할 수 있다.
실시예 28: 소낭 분리 및 탐지 방법들
당업자들에게 공지된 다수의 기술을 이용하여 상기에서 설명하는 것들에 추가하여 본 발명의 방법들을 실행하기 위하여 소낭들을 분리 및 탐지할 수 있다. 이러한 방법들중 몇 가지를 다음에서 설명한다.
유리 마이크로비드(Glass Microbeads). VeraCode/BeadXpress (Illumina, Inc. San Diego, CA, USA)로 이용가능. 단계들은 다음과 같다:
1. 이용가능한 카르복실 집단에 대한 항체들의 직접적인 콘쥬게이트에 의해 비드를 준비한다.
2. 비드의 표면에 있는 비-특이적 결합 부위를 차단한다.
3. 소낭 농축물 시료에 비드를 추가한다.
4. 결합안된 소낭들을 제거하기 위하여 시료들을 세척한다.
5. 이 소낭들에 특이적으로 결합할 수 있는 탐지 항체로 형광 라벨된 항체를 제공한다.
6. 결합안된 탐지 항체들을 제거하기 위하여 플레이트를 세척한다.
7. 소낭의 존재를 결정하기 위하여 플레이트 웰의 형광을 측정한다.
효소 링크된 면역흡착 분석 (ELISA). Methods of performing ELISA를 실행하는 방법들은 당업계 숙련자들이 잘 알고 있다. 이 단계들은 일반적으로 다음과 같다 :
1. 공지의 양의 캡쳐 항체가 결합된 표면을 준비한다.
2. 이 표면에 비-특이적 결합 부위를 차단한다.
3. 이 플레이트에 소낭 시료를 제공한다.
4. 결합안된 소낭들을 제거하기 위하여 플레이트를 세척한다.
5. 이 소낭들에게 특이적으로 또한 결합하는 탐지 항체들로서의 효소 연결된 1차 항체들을 제공한다.
6. 이 플레이트를 세척하여, 결합안된 항체-효소 콘쥬게이트를 제거한다.
7. 효소에 의해 색, 형광 또는 전기화학적 신호로 전환시키는 화학물질을 제공한다.
8. 소낭들의 존재 또는 양을 결정하기 위하여 플레이트 웰의 흡수도, 형광 또는 전기화학 신호(가령, 전류)를 측정한다.
전기화학발광(Electrochemiluminescence) 탐지 어레이. (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD, USA의 것을 이용가능:
1. 5 mL의 선택 완충액 (가령 PBS, TBS, HEPES) 및 75 ㎕의 1% Triton X-100 (0.015% 최종)을 복합하여 플레이트 피복 완충액을 준비한다.
2. 피복될 캡쳐 항체를 희석한다.
3. 플레이트 피복 완충액(Triton과 함께)을 이용하여 5 ㎕/웰의 캡쳐 항체를 준비한다.
4. 절연체를 파괴하지 않도록 조심하면서 작업 전극 표면의 중앙에 직접 5 ㎕의 희석된 캡쳐 항체를 제공한다. 이 작은 방울은 시간이 경과함에 따라 절연체 장벽의 모서리로 확산되어야 하지만, 이를 넘어가서는 안된다.
5. 플레이트는 덮지 않고, 교란되지 않도록 하룻밤 동안 세워둔다.
소낭 함유하는 시료와 이 라벨된 탐지 항체를 함유하는 용액을 이 플레이트 웰에 추가하였다. 탐지 항체는 전기화학발광 화합물, MSD SULFO-TAG로 라벨된 항-표적 항체다. 시료 안에 존재하는 소낭들은 전극상에 고정된 캡쳐 항체에 결합하고, 그리고 라벨된 탐지 항체는 소낭의 표적에 결합하여 샌드위치가 완성된다. MSD 판독 완충액을 추가하여 전기화학발광 탐지를 위한 필수적인 환경을 제공한다. 이 플레이트를 판독기에 삽입하고, 여기에서 플레이트 전극에 볼트를 제공하여, 전극 표면에 결합된 라벨이 빛을 방출하도록 한다. 판독기는 방출된 빛의 강도를 탐지하여 시료안에 소낭의 양의 정량적 측정을 제공한다.
나노입자(Nanoparticles). 금 나노입자의 다중 세트는 각 입자들에 결합된 별도 항체와 함께 준비한다. 농축된 미세소낭들은 글라스 슬라이드 상에서 37℃, 4시간 동안 단일 비드 유형과 함께 항온처리한다. 충분한 표적이 존재한다면, 붉은 색에서 자색으로 발색 변이가 있다. 이 분석은 각 표적에 대해 별도로 실행한다. 금 나노입자는 Nanosphere, Inc. of Northbrook, Illinois, USA에서 이용가능하다.
나노사이트(Nanosight). 하나 이상의 소낭들의 직경은 광학 입자 탐지를 이용하여 측정할 수 있다. 미국 특허 제7,751,053호, "Optical Detection and Analysis of Particles"(July 6, 2010); 그리고 미국 특허 제7,399,600호. "Optical Detection and Analysis of Particles"(July 15, 2010) 참고. 입자들은 또한 라벨될 수 있고, 카운트되어, 시료안에 별개의 소낭들 또는 소낭 집단의 양을 평가할 수 있다.
실시예 29: CRC 세포 계통 및 환자 시료에서 KRAS 서열화
CRC 세포 계통으로부터 유도된 소낭으로부터 KRAS RNA가 단리되었고, 서열화되었다. RNA는 서열화에 앞서 cDNA로 전환되었다. 서열화는 표 18에 열거된 세포 계통에서 실행되었다:
CRC 세포 계통 및 KRAS 서열
세포 계통
 DNA 또는 소낭 cDNA
 KRAS 유전자형 엑손 2
 KRAS 유전자형 엑손 3
Colo 205
 소낭 cDNA
 야생형 (WT)
 WT
Colo 205
DNA
 WT
 WT
HCT 116
 소낭 cDNA
 c.13G>GA
 WT
HCT 116
 DNA
 c.13G>GA
 WT
HT29
 소낭 cDNA
 WT
 WT
Lovo
 소낭 cDNA
 c.13G>GA
 WT
Lovo
 DNA
 c.13G>GA
 WT
RKO
 소낭 cDNA
 WT
 WT
SW 620
 소낭 cDNA
 c.12G>T
 WT
표 18 및 도14에서는 세포 계통으로부터 게놈 DNA에서 탐지된 돌연변이는 이 세포 계통으로부터 유도된 소낭 안에 함유된 RNA에서도 탐지되었다는 것을 보여준다. 도14는 HCT 116 세포들에서 소낭 mRNA (도14A) 및 게놈 DNA (도14B)로부터 유도된 cDNA의 서열을 보여준다.
12개의 CRC 환자 시료는 KRAS에 대해 서열화되었다. 표 19에서 나타낸 것과 같이, 모두 야생형 (WT)이었다. 모든 환자 시료는 RNA 추출 동안 DNase 처리를 받았다. 단리된 소낭으로부터 RNA가 추출되었다. GAPDH에 대해 증폭된 12명의 환자들은 이들 소낭에 RNA가 존재함을 설명하였다.
CRC 환자 시료 및 KRAS 서열
시료
 시료 유형
 단계
 KRAS 유전자형 엑손 2
 KRAS 유전자형 엑손 3
61473a6
 결장 Ca
 1
 WT
 WT
62454a4
 결장 Ca
 1
 WT
 WT
110681a4
 결장 Ca
 1
 WT
 서열화 실패
28836a7
 결장 Ca
 1
 WT
 서열화 실패
62025a2
 결장 Ca
 2a
 WT
 WT
62015a4
 결장 Ca
 2a
 WT
 WT
110638a3
 결장 Ca
 2a
 WT
 WT
110775a3
 결장 Ca
 2a
 WT
 WT
35512a5
 결장 Ca
 3
 WT
 WT
73231a1
 결장 Ca
 2a
 WT
 WT
85823a3
 결장 Ca
 3b
 WT
 WT
23440a7
 결장 Ca
 3c
 WT
 WT
145151A2/3
 정상
WT
 WT
139231A3
 정상
WT
 서열화 실패
145155A4
 정상
WT
 서열화 실패
145154A4
 정상
WT
 서열화 실패
KRAS 13G>A 돌연변이에 대해 양성으로 밝혀진 환자의 시료에서, CRC 환자 시료의 종양에서 KRAS 돌연변이는 동일한 환자의 혈장-유도된 소낭에서 또한 확인될 수 있다. 도14는 이 환자에서 혈장의 소낭 mRNA로부터 유도된 cDNA의 서열 (도14C)과 새로 냉동된 파라핀에 내장된(FFPE) 종양 시료 (도14D)로부터 유도된 게놈 DNA의 서열을 나타낸다.
실시예 30: 단백질 - 핵산 복합체들의 면역침전
본 실시예는 Ago2, 아포리포단백질 AI, 그리고 GW182와 복합체들이 포함된 혈장에서 miRNA의 수준을 검사하였다. 구체적으로, miRNA 수준은 Ago2, 아포리포단백질 AI, 및 GW182에 대한 항체와 공동-면역침전된 이후 평가되었다.
면역침전을 실행하기 위하여, 인간 혈장은 Ago2, 아포리포단백질 AI, GW182, 그리고 IgG 대조군에 대항하여 단백질 G 비드에 결합된 항체와 함께 항온처리되었다. 비드를 준비하기 위하여, 10 μg의 항-AGO2 (ab57113, lot GR29117-1, Abcam, Cambridge, MA), 항-ApoAI (PA1-22558, Thermo Scientific, Waltham, MA), 항-GW182 (A302-330A, Bethyl Labs, Montgomery, TX) 또는 항-IgG (sc-2025, Santa Cruz, Santa Cruz, CA)는 Magnabind 단백질 G 비드 (Cat. # 21349, Thermo Scientific) 또는 Dynabead 단백질 G (Cat. # 100.04D, Invitrogen, Carlsbad, CA)에 접합되었다. 200㎕의 비드를 1.5 ml 에펜도르프 튜브 안에 두고, 자석 분리기 (Cat. # S1509S, New England Biolabs, Ipswich, MA)위에 1분간 두었다. 저장 완충액을 제거하고 버렸다. 비드는 200 ml의 인산염 완충된 염수 (PBS)로 1회 세척되었다. 항체는 실온 (RT)에서 30분간 200㎕의 PBS 안에서 비드에 결합되도록 두었고, 그리고 그 다음 4℃에서 추가 90분간 두었다. 항체-결합된 비드는 자석 분리기 상에 1분간 두었다. 결합안된 항체는 제거하고, 버렸다. 비드는 얼음 냉각된 PBS로 3회 세척된다.
항체 접합된 비드는 200 ㎕의 PBS에서 재현탁되며, 정상적인 대상 (가령, 암이 없는)의 인간 혈장 200 ㎕과 혼합되었다. 혼합물은 4℃에서 Thermo Scientific Labquake Shaker/Rotisserie 상에서 하룻밤동안 구르도록 두었다. 하룻밤 항온처리 후, 비드는 자석 분리기 상에 1분간 두거나 또는 이 용액이 맑아질 때까지 두었다. 비드는 200 ㎕ 차가운 PBS로 3회 세척되며, 그리고 200 ㎕의 NP-40 세척 완충액 (1% NP-40, 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl 그리고 2 mM EDTA)으로 1회 세척되었다. NP-40 완충액 세척 이후, 이 시료를 200 ㎕의 차가운 PBS로 추가 1회 더 씻어내었다. 비드는 자석 분리기 상에서 1분간 두었다. 비드는 200 ㎕의 PBS에서 출발 용적으로 되돌렸다. 이 시료의 3/4은 이미 설명된 것과 같이 RNA 단리에 이용되었다(Arroyo et al., 2011). 나머지는 Western 분석을 위하여 -20℃에 보관되었다.
단리된 RNA는 ABI Taqman 탐지 키트 각각 ABI_391 및 ABI_431(Applied Biosystems, Carlsbad, CA)을 이용하여 miR-16 및 miR-92a에 대해 선별되었다. RNA는 합성 표준에 대항하여 정량화되었다. 상층액을 수거하고, 선택된 miRNAs (miR-16 그리고 miR-92a)에 대해 분석되었다. 탐지된 miR-16 및 miR-92a의 수준은 도 15에 나타낸다. 도 15A 및 도 15B에 차례로 나타낸 것과 같이, miR-16 및 miR-92a는 IgG 대조군과 비교하여 Magnabead를 이용하여 훨씬 더 높은 수준으로 Ago2 그리고 GW182과 함께 공동-면역침전되었다("비드"으 표시된 막대 비교). Dynabeads와 함께 공동-면역침전은 추가 설명되지 않지만 기술적인 이유로 성공하지 못하였다.
인간 혈장의 miRNA의 잠재적 원천(들)은 소낭 및/또는 순환하는 Ago2-결합된 리보핵단백질 복합체들 (RNP)를 포함한다. miR은 GW182의 캡쳐를 이용하여 AGO1-4 및 소낭과 복합된 복합체들로부터 동시에 단리될 수 있다. 본 실시예에서 miR-16 및 miR-92a는 AGO2 그리고 GW182 in 인간 혈장에서 AGO2 및 GW182와 공동-면역침전됨을 보여준다.
실시예 31: microRNA 복합체들의 유동 분급(sorting)
특이적 조직으로부터 유도된 순환하는 microRNA는 미세소낭 및 microRNA 복합체들을 단리하기 위하여 조직 특이적 생물지표들을 이용하여 단리될 수 있다. 본 실시예는 인간 혈장 안에 PCSA/Ago2 이중 양성 하위-집단에서 microRNA는 암이 아닌 것으로부터 전립선암을 구별할 수 있음을 보여준다.
전립선암이 있는 3명의 대상과 전립선암이 없는 3명의 남성으로부터 얻은 혈장 시료는 실시예 17에서와 같이 소낭을 농축하기 위하여 처리되었다. 농축된 소낭은 PCSA, 전립선 특이적 생물지표, 및 Ago2 (ab57113, lot GR29117-1, Abcam, Cambridge, MA)에 대항하는 항체의 최적화된 농도를 이용하여 착색되었다. 이용된 항체는 PE로 라벨된 항-PCSA와 FITC로 라벨된 항-Ago2이었다. 양성 및 음성 영역을 한정시키기 위하여 정합되는 이소타입 대조군 항체를 이용하여 양성 게이트를 설정하였다. 분급된 집단들은 도 16에서 나타낸 것과 같은 영역에 근거하여 선택되었다. Beckman Coulter MoFlo-XDP 세포 분류기 및 유동세포분석기는 분급된 사건이 >90%으로 순수하다는 것을 확인하기 위하여, 고순도 분류 방식(가령, "Purify 1/ Drop")을 이용하여 단리된 양성 사건에 이용되었다. MoFlo-XDP는 초당 최대 50,000 사건의 비율로 두 집단을 분급할 수 있다. 미량 분류의 순도 및 효과를 확실히 하기 위하여, 속도는 평균 초당 200-300 사건이 되었다. 양성 사건은 2 ml 튜브 3개로 분급되었고, miR 분석을 위하여 보관되었다.
일반 분급된 후, 각 전립선 특이적 하위집단로부터 microRNA 내용물이 평가되었다. 전체 농축된 혈장-유도된 미세소낭의 비교가 있을 때, 전립선암 (PrC)과 암이 아닌 시료 (가령, 정상) 사이에 miR-22의 차등 발현은 거의 관찰되지 않았다(도 17A). 각 PCSA/Ago2 이중 집단으로부터 단리된 전체 RNA로부터 miR-22의 평균 카피 수 수준에서 유사한 결과가 관찰되었다(도 17B). microRNA 수준의 고려없이, 각 혈장 시료로부터 PCSA/Ago2 이중 양성 사건 수은 암이 아닌 것으로부터 암을 유의적으로 구별하지 못하였다(도 17C). 그러나, 각 분급의 관찰된 복사 수를 각 분급의 특정 사건 수로 나누었을 때 전립선과 암이 아닌 것 사이에 분명한 분리가 관찰되었다(도 17D). 후자의 경우, 정상과 비교하였을 때, 모든 PCa 혈장 시료 안에서 PCSA/Ago2 이중 양성 복합체들 마다 더 높은 수준의 miR-22이 관찰되었다.
실시예 32: 순환하는 미세소낭의 면역침전 정제에 대한 프로토콜
본 실시예는 두 가지 지표에 대한 항체를 이용하여 순환하는 미세소낭 (cMV)의 면역침전에 대한 프로토콜을 제공한다. 관심 대상의 바람직한 소낭 지표들을 캡쳐하기 위하여 임의의 적합한 항체가 이용될 수 있다. 이 프로토콜은 상이한 시료 원천에 추가로 적용될 수 있는데, 이를 테면, 다양한 체액으로부터 소낭 분석에 적용될 수 있다. 본 실시예에서, 전립선 특이적 소낭은 PCSA 및 CD9에 대한 항체를 이용하여 혈장으로부터 이중 면역침전된다.
1) 관심 대상으로부터 Thaw 1 ml 혈장을 해동시킨다. 예를 들면, 전립선암을 가진 대상 또는 대조군, 이를 테면, 전립선암이 없는 정상적인 남성.
2) 혈장으로 40μl 항-PCSA-PE 접합된 항체 및 45μl의 항-CD9-FITC을 이용하여 농축안된 혈장을 오염시킨다.
3) 혼합하고, 실온에서 암 상태로 30분간 항온처리한다.
4) 결합안된 항체를 제거하기 위하여 300kD 컬럼을 이용하여 혈장은 1ml 내지 300㎕으 농축된다.
5) 50μl의 농축된 혈장을 빼내어 옆에 두고, 출발 함량을 결정한다. 흐름 분석용으로 4℃에 보관 저장한다.
6) 오염된 농축물의 나머지 250㎕에 20μl의 항-FITC 마이크로비드를 추가한다.
7) 암 상태, 냉각된 교반기 상에서 30분간 항온처리한다.
8) 자석이 떨어진 Separation Buffer (Miltenyi)과 함께 3 x 100 μl 세척액으로 컬럼을 세척함으로써, MultiSort 컬럼 (Miltenyi Biotec Inc., Auburn, CA)을 준비한다.
9) 항-FITC 마이크로비드 (Miltenyi)와 함께 30분간 항온처리한 후, 점성을 줄이기 위하여 오염되고 라벨된 혈장은 by adding 200 μl 완충액을 추가하여 희석시킨다. 여전히 탁하다면 더 희석시킨다.
10) 자석위에 놓인, 제 1 세척된 컬럼, 컬럼 1의 상단에 ~470 μl 혈장 용액을 추가한다.
11) 혈장 용액은 통과되도록 둔다.
12) 자화되지 않은 미립자를 제거하기 위하여 상부 저장기에 2 x 100 μl 세척액을 추가한다.
13) 컬럼 1에 대해 총 흘러나간 유체는 ~670 μl이다. 표현형결정을 위하여 보관한다.
14) 자석으로부터 컬럼 1을 제거한다.
15) 300 μl의 완충액을 추가하고, 컬럼 1로부터 자화된 cMV를 제거하기 위하여 단단히 쑤셔박는다.
16) 보유된 용적(300 μl)에 10 μl Multisort Release Re나이nt (Miltenyi)를 추가한다.
17) 혼합하고, 암상태, 4℃에서 10분간 항온처리한다.
18) 필요한 경우 방출된 마이크로비드를 제거하기 위하여 선택적 세척 단계가 실행될 수 있다.
19) 20 μl MultiSort Stop Re나이nt (Miltenyi)을 cMV 용액에 추가한다.
20) 20 μl 항-PE MultiSort Beads (Miltenyi)를 추가한다.
21) 혼합하고, 암상태, 4℃에서 10분간 항온처리한다.
22) 컬럼은 자석위에 둔 채로, 제 2 컬럼, 컬럼 2의 상단으로 이 용액을 첨가한다.
23) 흘러내리게 하고, 흘러내린 것을 수집한다.
24) 컬럼 2로부터 떨어진 임의의 자화되지 않은 미립자(~450 μl)를 세척하기 위하여 추가 100㎕을 첨가한다.
25) 흘러내린 것을 수집하고 유동 평가를 위하여 보관한다.
26) 자석으로부터 컬럼 2를 제거하고, 300 μl 완충액을 추가한다.
27) 유지된 세포들을 제거하기 위하여 단단하게 쑤셔박고, 유동 평가를 위하여 보관한다.
28) 비드를 절단하기 위하여 방출 시약 10㎕을 추가한다.
29) 암상태 4℃에서 10분간 항온처리한다.
30) 20μl 중단 시약을 추가한다.
31) 유동 평가를 위하여 이동한다.
필요에 따라 단일 항체 및 컬럼 단계를 이용하여 시료 안에서 소낭이 면역침전될 수 있다. 예를 들면, 전립선 특이적 소낭은 항-PSCA 항체로 단일면역침전을 실행하여 캡쳐될 수 있다.
유동 분석. 상기에서 수집된 5개의 집단은 유동세포분석법에 의해 분석된다: 1) 초기 분리안된 혈장; 2) 컬럼 1을 통한 흐름; 3) 컬럼 1에 유지됨; 4) 컬럼 2를 통한 흐름; 그리고 5) 컬럼 2에 유지됨. 모든 집단은 상기에서 추가된 CD9-FITC 및 항-PCSA-PE를 보유한다. 비드를 제거하였지만 PE-접합된 항체는 cMV에 남아있었고, 유동세포분석에서 평가될 수 있다.
1) cMV/사건의 정량화를 위하여 TruCount 튜브로 cMV 용액을 이동
2) MoFlo-XDP 세포 분급기를 이용하여 유동세포분석법에 의해 평가. TruCount 튜브(Beckman Coulter)에 기초된 사건 수를 계산한다.
실시예 33: 혈장 cMV에서 miRNA 발현을 cMV 수준에 표준화
본 실시예는 세포-유형 특이적 cMV 표면 단백질 지표들의 형광 강도, 면역침전 및 핵산 탐지의 복합에 의해 체액에서 miRNA 발현을 표준화시키는 방법을 설명한다. 이 과정은 관심 집단 사이에 생물지표 신호의 증폭을 허용한다. 본 실시예는 전립선암에서 상향조절되는 것으로 보이는 microRNA인 miR-22를 이용하여 전립선암이 있는 대상과 정상(가령, 비-전립선암)으로부터 혈장 시료를 구별하는 방법을 설명한다. Zhang et al. microRNA-22, downregulated in hepatocellular carcinoma and correlated with prognosis, suppresses cell proliferation and tumourigenicity. Br J 암 103:121520 (2010) 참고.
실시예 32에서 개요가 설명된 방법을 이용하여 전립선암 및 정상적인 기증자의 혈장 미세소낭은 항-CD9 항체 (CD9-FITC BD Biosciences Catalog # 555371, BD Pharmingen, San Diego, CA) 및 항-PCSA 항체 (자체 준비된)로 이중 면역침전되었다. 도 18A는 양성 사건을 확인하기 위하여 Beckman Coulter MoFlo-XDP 세포 분급기 세포 분급기 및 유동세포분석기를 이용하여 예시적인 시료에 대한 투입물 혈장을 보여준다. 도 18A에서, 전체 혈장은 대부분 이중 음성 사건 (가령, CD9-/PCSA-)임을 볼 수 있다. R7로 표시된 상단 우측 사분면에 일부 이중 양성이 있다(가령, CD9+/PCSA+). 제 1 CD9 컬럼 상에 캡쳐를 포함하는 이중 면역침전과 이어서, 방출 및 제 2 PCSA 컬럼에 제 2 캡쳐 후, 관찰된 cMV 집단은 CD9+/PCSA+ 이중 양성 사건에서 유의적으로 풍부하다. 이중 면역침전 이후 집단을 보여주는 도 18B 참고.
상기에서 설명된 집단은 용해되고, miRNA/mRNA 내용물에 대해 평가되었다. 처리안된 혈장내에서 miR-22의 수준은 암 시표보다 정상에서 더 높았다. 도 19A 참고. 농축된 혈장에서 전체 cMV로부터 단리된 전체 RNA로부터 miR-22 수준에 대해 유사한 경향이 관찰되었다. 도 19B 참고. 그러나, 비-암 시료와 비교하여, 암 시료에서 단리된 CD9+/PCSA+ cMV안에 miR-22의 가공안된 카피 수는 더 높았다. 도 19C 참고. 항-PCSA를 캡쳐 물질로 이용하여 실시예 20에서와 같이 수득된 정합된 PCSA MFI에 대하여 각 이중 양성 cMV 집단으로부터 관찰된 miR-22 복사 수를 비교하였을 때 이 분리는 강화되었다. 도 19D 참고.
제 2 실험에서, 항-PCSA 항체를 이용한 단일 면역침전은 상기 방법을 이용하여 실행되었고, 결과로 생긴 cMV 집단은 유동세포분석법에 의해 평가되었다. 투입물 재료의 예시적인 시료의 유동 분석 결과를 도 18C에 나타낸다. 시작시에 PCSA+ 사건은 거의 없었다. 항-PCSA 항체와 함께 면역침전 후, 이 집단은 PCSA + cMV에 대해 상당히 풍부하였다. 도 18D 참고. 이 집단이 용해되었고, 전립선암 기증자 혈장 및 정상 기증자 혈장 모두로부터 miRNA/mRNA 내용물에 대해 평가되었다. 도 19E-19G 참고. 이중 면역침전과 같이, 각 PCSA 양성 cMV 집단으로부터 miR-22의 관찰된 복사수를 정합된 PCSA MFI에 비교하였을 때 암과 정상 사이에 분리는 강화되었다.
실시예 34: 항체 캡쳐된 miR 발현을 항체 수준으로 표준화시키기 위한 득점
본 실시예는 순환하는 미세소낭 (cMV) 안에 miRNA의 수준을 탐지함으로써 암이 아닌 환자로부터 암 환자의 혈장을 구별하기 위한 득점을 만드는 방법을 설명한다.
전립선암 환자 및 정상 개인(가령, 전립선암이 없는)의 혈장은 1.2 uM 필터를 통하여 여과되고, 그 다음 150 kDa 컬럼으로 농축되어, cMV를 농축시켰다. 실시예 17 참고. 전립선 특이적 cMV를 측정하기 위하여, PE 접합된 항-PCSA 항체는 200 ㎕의 농축물과 함께 항온처리되었다. PCSA 라벨된 농축물은 Miltenyi 자석 컬럼을 이용하여 PCSA 발현시키는 cMV에 대해 정제되었다. 실시예 32 참고. PCSA 발현시키는 cMV를 함유하는 유지된 비드로부터 RNA는 Qi나이n miRNeasy (Qi나이n Inc., Valencia, CA)를 이용하여 단리되었다. 60 ㎕의 PCSA 라벨된 농축물은 PCSA, PSMA, B7H3, CD81, CD63 그리고 CD9에 대해 HPLC 정제된 항체를 포함하는 미소구 분석에서 운용되었다. PCSA, PSMA 그리고 B7H3에 대한 항체를 캡쳐 물질로 이용하였고, CD81, CD63 그리고 CD9에 대해 형광 라벨된 항체는 탐지물질로 이용되었다. 실시예 22-23 참고. 평균 형광 수준 (MFI)이 기록되었다.
각 시료 농축물로부터 RNA가 단리되었다. ABI 7900 (Applied Biosystems, life Technologies, Carlsbad, CA)에서 pre-amp 단계와 함께 Taqman 분석을 이용하여 miR-22 및 let-7a의 카피 수를 결정하였다. 진단 득점을 계산하기 위하여, 각 시료 안에 miR-22 및 let-7a의 카피 수는 10을 곱하고, 그 다음 미소구 분석을 이용하여 측정된 것과 같이 이 시료 안에 PCSA의 MFI로 나누었다. 이들 값의 합을 미소구 분석으로부터 얻은 PSMA의 MFI 값에 추가하였다. 이들 세 가지 값 모두의 평균으로 암과 정상간을 구별짓는데 이용되는 진단 득점이 생성된다. 환언하면, 진단득점은 10*miR22 / PCSA MFI, 10*let-7a / PCSA MFI 및 PSMA MFI의 평균과 같다.
40개의 무작위로 선택된 시료를 이용하여 득점에 대한 임계치를 결정하였다. 암을 구별하기 위하여 531 또는 그 이상의 임계치 득점을 이용하여, 83% 감응성 그리고 63% 특이성의 성과를 얻었다. 도 20A 및 20B 참고, 이때 임계치는 점선으로 된 수평선으로 나타낸다. 도 20C는 데이터로 생성된 ROC 곡선을 보여준다. AUC는 0.77이었다. 이 임계치는 20개 시료의 독립적 코호트를 분류하는데 이용되었으며, 82% 감응성 및 67% 특이성 성과를 나았다.
실시예 35: PCa의 miRNA 특징
본 실시예는 전립선암을 구별하는데 이용될 수 있는 순환하는 미세소낭 (cMV)의 miRNA 특징을 설명한다.
PCSA 발현하는 cMV에 대해 정제된 실시예 34에서 설명되는 21개의 시료를 이용하여 다양한 시료 집단을 구별하는 microRNA를 확인하였다. 이 시료 코호트는8개의 전립선암, 3개의 높은 등급 PIN, 2개의 염증성 질환, 그리고 6개의 정상(가령, 전립선 질환없음)을 포함한다. PCSA 발현하는 cMV로부터 단리된 RNA의 miR 함량은 실시예 25에서 설명된 Exiqon 카드를 이용하여 분석되었다. 암 시료를 유의적으로 구별하는 miR을 확인하기 위하여 통계학적 분석이 실행되었다. 상위 17개 miR은 miR-182, miR-663, miR-155, mirR-125a-5p, miR-548a-5p, miR-628-5p, miR-517*, miR-450a, miR-920, hsa-miR-619, miR-1913, miR-224*, miR-502-5p, miR-888, miR-376a, miR-542-5p, miR-30b* 그리고 miR-1179를 포함하였다. 도 21은 miR-920 (도 21A) 및 miR-450a (도 21B)에 대한 설명을 위한 플롯을 보여준다. 도면에서 나타낸 것과 같이, miR-920은 혼동되는 질환들에서 과다발현되지만, 암에서는 miR-450a는 하향 조절된다.
실시예 36: 순환하는 미세소낭 (cMV)에서 단백질, mRNA 그리고 microRNA 생물지표들의 분석
소낭 단백질 생물지표들은 미소구-기반된 시스템을 이용하여 분석된다. 관심 표적 단백질에 대해 선택된 항체는 차등적으로 접근가능한 미소구에 접합된다. 가령, 실시예 22에 있는 방법 참고. 접합 후, 항체 피복된 미소구는 세척되고, PBS (Catalog # 37538, Thermo Scientific, a division of Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)에서 출발 블록 차단 완충액에서 항온처리되어 차단되고, PBS에서 세척되고, 그리고 하기에서 설명된 것과 같이 혈장으로부터 농축된 cMV와 함꼐 항온처리된다. cMV의 캡쳐 후, 미소구-cMV 복합체들이 세척되고, 테트라스파닌 CD9, CD63 및 CD81 (가령, PE 라벨된 항-CD9, PE 라벨된 항-CD63, 그리고 PE 라벨된 항-CD81) 에 대한 피로에리트린(PE) 라벨된 탐지물질 항체와 함께 항온처리되고, 그리고 미소구 판독기 상에서 탐지에 앞서 세척된다. 100개 미소구로부터 형광 신호가 측정되며, 각 차등적으로 접근가능한 미소구-각각은 상이한 캡쳐 항체에 대응함-에 대한 평균 형광 강도(MFI)가 산출된다. 상기에서 설명된 테트라스파닌 탐지물질에 추가하여 탐지물질 및 캡쳐 항체의 다양한 조합이 검사된다.
유동세포분석법은 환자 시료에서 전체 cMV 수를 결정하는데 이용된다. 환자 혈장 시료는 PBS에서 100배 희석되고, 그 다음 시료당 사건을 정량화하기 위하여 BD Trucount 튜브 (BD Biosciences, San Jose, CA)에서 실온에서 15분간 항온처리된다. Trucount 튜브는 유동세포분석법에 의해 각 시료에 대해 사건을 표준화시키기 위하여 이용될 수 있는 공지의 숫자의 형광 비드를 함유한다. FACS Canto II 세포분석기 (BD Biosciences)에 의한 시료 획득 및 FlowJo 소프트웨어(Tree Star, Inc., Ashland, OR)에 의한 분석을 이용하여 튜브 당 시료 사건의 수와 Trucount 비드 수를 결정한다. 시료당 절대적인 수의 계산은 제조업자의 지침(BD Biosciences)에 따라 얻고, 필요에 따라 희석 인자로 조정된다.
MiRNA는 혈장 시료로부터 cMV와 함께 페이로드로부터 검사된다. cMV는 농축되고 miRNA는 변형된 Trizol 방법을 이용하여 추출된다. 간략하게 설명하자면, cMV는 Rnase A (20 μg/ml, 20분, 37℃; Epicentre®, an Illumina® company, Madison, WI)로 처리되고, 이어서 Trizol 치료 (각 100 μl에 750 μl의 Trizol LS)되고, 실온에서 1400rpm에서 30분간 볼텍스되었다. 원심분리이후, 상청액을 수거하고, miRNeasy 96 정제 키트 (Qi나이n, Inc., Valencia, CA)를 이용하여 RNA는 추가 정제되고 그리고 80℃에 보관된다. 40ng RNA가 역전사되고, ABI 7900 (Applied Biosystems, life Technologies, Carlsbad, CA) 상에서Exiqon qRT-PCR Human 패널 I 및 II에서 운용된다. 가령, 실시예 13-14, 25 참고. CT 값은 SDS 2.4 소프트웨어(Applied Biosystems)를 이용하여 계산된다. 모든 시료는 인터 플레이트 구경측정기 및 RT-PCR 대조군에 대해 표준화된다.
메신져 RNA (mRNA)는 혈장 시료의 cMV 페이로드에서 또한 검사된다. cMV 는 상기와 같이 단리되고, RNase A로 처리된다. mRNA는 상기에서와 같이 변형된 Trizol 방법을 이용하여 추출되고, 70% 에탄올로 침전된 Qi나이n RNeasy 미니 키트로 정제된다(Qi나이n, Inc.). 수집된 RNA는 역전사되고, 제조업자(Agilent Technologies, Santa Clara, CA)의 지침에 따라 단색 유전자 발현 분석을 위한 Agilent의 "Low Input Quick Amp Labeling" 키트를 이용하여 Cy-3 라벨된다. 라벨된 시료는 Agilent의 Whole Genome 44K v2 어래이에 혼성화되고, 제조업자의 설명에 따라 세척된다(Agilent Technologies). 어래이는 Agilent B 스캐너(Agilent Technologies) 상에서 스캔되고, 데이터는 그리고 데이터는 Feature Extractor (Agilent Technologies) 소프트웨어로 추출된다. 추출된 데이터는 글로벌 표준화 방법으로 표준화되고, GeneSpring GX 소프트웨어 (Agilent Technologies)로 분석된다.
miRNA 및 메신져 RNA는 혈장으로부터 cMV의 특이적 하위집단으로부터 검사될 수 있다. 예를 들면, cMV는 농축되고, 그 다음 PCSA에 대해 양성인 집단은 면역침전을 이용하여 단리된다. 실시예 32-33 참고. PCSA+ cMV는 단리되고 miRNA 및 mRNA는 상기에서 설명된 것과 같이 단리되고, 분석된다. 동일한 방법을 이용하여 관심대상의 상이한 소낭 표면 항원에 대한 상이한 캡쳐 물질을 이용하여 단리된 소낭의 miRNA 및 mRNA 함량이 검사된다. 또한, 하나 이상의 표면 항원에 양성인 소낭이 단리될 수 있다. 실시예 32-33 참고.
표준화된 분석 값은 R (The R Project for Statistical Computing at www.r-project.org) 또는 SAS 소프트웨어로 들여보내진다(SAS Institute Inc., Cary, NC). 적합한 품질 대조군 측정을 이용하여 데이터를 여과하고, 분석에 앞서 변형시킨다. 분석은 다음과 같이 실행된다:
특징 실행 평가(사전-지정된 또는 신규한 특징에 대해)
상기 이들 방법을 이용하여 생성된 시료 세트(가령, 단리된 소낭 집단의 페이로드 분석)는 임상 결과의 공개(unblinding) 또는 시료의 임상 실험실 테스트의 공개(unblinding)에 앞서 충분히 명시된 생물특징의 성과를 평가하는데 이용될 수 있다. 이러한 경우에서, 특징은 사전명시된 것으로 간주되고, 모든 시료에 대해 예상되는 결과를 얻기 위하여 이 시료 세트에서 새로운 분석 데이터에 정용되거나 변형되어야만 한다. 사전-명시된 특징의 성과는 예상된 그리고 진정한 결과(예를 들면, 진단적 감응성, 특이성, 그리고 정확성에 대해)를 비교함으로써 평가된다. 통계는 실행 예측 및 신뢰구간을 포함한다.
사전-명시되지 않은 특징들의 경우(가령 시료의 임상 결과 및 시료의 실험실 테스트 결과 모두에 대한 통찰로 유도된), 이들 시료는 특징의 성과를 평가하는데 여전히 이용될 수 있다. 그러나, 성과의 잠재적 편향된 예측을 감소시키기 위하여, 하기에서 설명된 것과 같이, 지표 선택 그리고 분류 예측 단계를 포함하는 k-폴드 크로스 실증 루프(k-fold cross validation loop) 안에서 통계학적 분석이 실시된다.
신규한 특징에 대한 지표 선택
당업계에 공지된 공통적으로 적용되는 기술의 하위 세트를 이용하여 질환 결과와 특징들의 연합에 대해 테스트함으로써 이들이 통계학적으로 유익하다면, 신규한 특징들에 지표들이 포함된다.
이들은 다음을 포함한다: 1) Welch 테스트 - 집단 간에 확실한 매개변수적 통계학적 테스트는 가변성이 동일하지 않을 때를 의미한다; 2) Wilcoxon 신호된-등급 테스트 - ROC AUC (0.50 이상)의 개선을 나타내는 것으로 해석될 수 있는 확실한 비-매개변수적 통계학적 테스트; 3) Youden's J - 모든 가능한 진단적 임계치에 대해 지표에 대해 최대 복합된 감응성 및 특이성으로 계산됨. 통계학적 유의성은 순열변경(permutation) 테스트를 통하여 평가된다.
실행된 숫자 통계 테스트 내용에서 테스트가 유의적이라면 지표들은 통계학적으로 유익한 것으로 판단된다. 좀더 구체적으로, comparision-wise p-값은 다중 테스트에 대해 조정된다 - 가령, 허위 발견 비율 임계치 또는 by 대조군 of 패밀리-와이즈(wise) 오류 비율의 조정.
신규한 특징의 형성
유용한 지표들의 하위 세트가 상기 설명된 지표 선택 단계에서 확인된 후, 잘-확립된 모델링 기술을 이용하여 신규한 다중-지표 모델이 형성된다. 특징에 대한 매개변수들은 충분한 모의 데이터 세트에서 모델을 양성한 후 평가되고, 이 특징에 대한 성능은 "사전명시안된 특징에 대한"방법을 이용하여 "특징 성능 평가(Signature performance evaluation)"에서 설명된 것과 같이 평가된다. 이들 단계에서 간단하고, 잘-확립된 모델링 기술이 이용되는데, 다음을 포함한다: 판별 해석, 지지 벡터 기기(support vector machine), 로지스틱 회귀(logistic regression), 그리고 의사결정 분지도(decision trees). 모든 모델에 대한 결과가 보고될 것이며, 따라서 최적의 지표 패널이 확인된다.
이용가능한 경우 관심의 임상 변수에 대한 데이터 세트에서 추가 귀납적 분석이 실행된다. 이러한 변수는 나이, 민족, PSA 수준, 디지털 직장 검사(DRE) 결과, 기존 생검 횟수, 생검 및 생검 결과의 표시(가령 HGPIN, 이형성, BPH, 전립선염 또는 전립선암), 그리고 이와 유사한 것을 포함한다. 이러한 분석은 기존에 확인된 모델로 동공변수 또는 계층화 변수들을 도입하여 실행된다. P-값은 다중 테스트에 대해 수정된다.
실시예 37: 순환하는 미세소낭 (cMV)에서 생물학적 경로 발현
본 실시예에서, cMV에서 mRNA 페이로드의 발현 프로파일링이 실행된다. cMV에서 발현된 mRNA의 경로 분석을 실행하여 가장 유의적인 생물학적 경로가 확인된다.
전체 소낭 집단안에 mRNA를 프로파일하기 위하여, 실시예 6에서 설명된 것과 같이, 여과 및 농축을 이용하여 3가지 전립선암 및 3가지 비-암 대조군 시료로부터 1ml 혈장으로부터 cMV가 단리되었다. RNA는 100μl의 혈장 농축물로부터 추출되었고, 이는 RNASE A로 처치한 이후 Trizol LS (Invitrogen, by life technologies, Carlsbad, CA)과 함께 용해시키기 위하여 25 μl 분획으로 세분되었다. 4가지 각 분획의 수성 상은 70% 에탄올로 침전되었고, 단일 Qi나이n mini RNA 추출 컬럼(Qi나이n, Inc., Valencia, CA) 상에서 복합되고, 30 μl 용적으로 용리되었다. 용리된 RNA는 표준 방법에 의해 신뢰성있도록 정량화시키는 것이 어려울 수 있다. 따라서, 10 μl 용적은 후속 라벨링 반응에 이용되었다. 시료는 제조업자의 지시(Agilent Technologies, Santa Clara, CA)에 따라 단색 유전자 발현 분석을 위한 Agilent의 Low Input Quick Amp Labeling"키트로 다음의 변형과 함께 cy-3 라벨되었다: 1) Cy3 라벨링을 위하여 스파이크-인 혼합물이 변형되어, 3번쩨 희석물은 1:5이었고, 1 μl가 각 시료에 추가되었다; 2) 10 μl의 시료는 각 시료에서 이중으로 진공원심분리(vacufuge)를 이용하여 2.5 μl로 용적이 감소되었다; 3) 모든 시료는 증폭된 시료의 정제 단계까지 프로토콜에서 모사본과 함께 처리되었다. 정제 프로토콜 시작 시에, 모사본(duplicate) 시료들은 복합되고, 후속적으로 컬럼을 통하여 통과된다; 4) 시료는 정제된 후에 정량화되지 않지만, 정제된 시료의 전체 용적은 어레이에 혼성화되었다. 라벨된 시료는 제조업자(Agilent Technologies)의 지침에 따라 Agilent Whole Genome 44K 마이크로어래이에 혼성화되었다. 데이터는 Feature Extractor 소프트웨어 (Agilent Technologies)로 추출되었고, GeneSpring GX (Agilent Technologies)으로 분석되었다. 4291 mRNA들은 표 20에서 발견된 것들을 포함하여 농축물에 존재하는 것으로 발견되었다. GeneSpring 소프트웨어를 이용하여 발현 패턴과 관련된 경로를 확인하였다. 상기 분석에 따라, 안드로겐 수용체 (AR) 및 EGFR1 경로가 소낭 집단에서 가장 유의미적으로 발현되는 경로였다. AR 및 EGFR1 경로의 구성요소들은 표 21에 나타낸다:
Figure pct00064
Figure pct00065
Figure pct00066
Figure pct00067
전체 cMV에서 경로 발현
경로
구성요소들
안드로겐 수용체 (AR)
 GTF2F1, CTNNB1, PTEN, APPL1, GAPDH, CDC37, PNRC1, AES, UXT, RAN, PA2G4, JUN, BAG1, UBE2I, HDAC1, COX5B, NCOR2, STUB1, HIPK3, PXN, NCOA4
EGFR1
 RALBP1, SH3BGRL, RBBP7, REPS1, SNRPD2, CEBPB, APPL1, MAP3K3, EEF1A1, GRB2, RAC1, SNCA, MAP2K3, CEBPA, CDC42, SH3KBP1, CBL, PTPN6, YWHAB, FOXO1, JAK1, KRT8, RALGDS, SMAD2, VAV1, NDUFA13, PRKCB1, MYC, JUN, RFXANK, HDAC1, HIST3H3, PEBP1, PXN, TNIP1, PKN2
관련된 일련의 실험에서, 발현 프로파일링은 PCSA+ cMV에서 실행되었다. PCSA+ cMV는 실시예 32에서와 같이 면역침전을 이용하여 단리되었다. Agilent Whole Genome 44K 마이크로어래이를 이용하여 상기에서와 같이 발현이 실행되었다. PCSA 캡쳐된 시료 안에서 표 22에 나타낸 것을 포함하는, 2402개 mRNA가 발현되었다. TNF-알파 경로가 가장 유의미적으로 과다발현되는 경로였다. TNF-알파 경로의 구성요소들은 표 23에 나타낸다.
Figure pct00068
Figure pct00069
Figure pct00070

PCSA+ cMV에서 경로 발현
경로
구성요소들
TNF-알파
 BCL3, SMARCE1, RPS11, CDC37, RPL6, RPL8, PAPOLA, PSMC1, CASP3, AKT2, MAP3K7IP2, POLR2L, TRADD, SMARCA4, HIST3H3, GNB2L1, PSMD1, PEBP1, HSPB1, TNIP1, RPS13, ZFAND5, YWHAQ, COMMD1, COPS3, POLR1D, SMARCC2, MAP3K3, BIRC3, UBE2D2, HDAC2, CASP8, MCM7, PSMD7, YWHAG, NFKBIA, CAST, YWHAB, G3BP2, PSMD13, FBL, RELB, YWHAZ, SKP1, UBE2D3, PDCD2, HSP90AA1, HDAC1, KPNA2, RPL30, GTF2I, PFDN2
표 24에서 유전자는 전체 cMV 집단과 비교하였을 때, PCSA+ cMV에서 모두 유의미적으로 하향조절되었다. Benjamini 및 Hochberg 허위-발견 비율 교정과 함께, t-테스트를 이용하여 발현이 비교되었다. 유의미적으로 상이하게 발현된 mRNA는 표에 나타낸다 (교정된 p-값 ≤ 0.05).
Figure pct00071
실시예 38: 순환하는 미세소낭 (cMV)으로부터 mRNA의 마이크로어래이 프로파일링
cMV 안에 고밀도 어래이 또는 mRNA 수준에서 대규모 스크리닝은 시료 양 및 질에 의해 방해를 받을 수 있다. 정상으로부터 전립선암을 구별하는 cMV 페이로드 mRNA의 확실한 분석을 허용하는 프로토콜이 개발되었다.
실시예 6에서 설명된 것과 같이 여과 및 농축을 이용하여 4가지 전립선암과 4가지 비-암 대조군 시료로부터 1ml 혈장에서 cMV가 단리되었다. 100μl의 혈장 농축물로부터 RNA가 추출되었고, 그 다음 RNASE A로 처리한 후, Trizol LS (Invitrogen, by life technologies, Carlsbad, CA)으로 용해시키기 위하여, 25 μl 분획으로 추가 세분되었다. 4개 분획 각각으로부터 수성 상은 70% 에탄올로 침전되었고, 단일 Qi나이n 미니 RNA 추출 컬럼 (Qi나이n, Inc., Valencia, CA)에 복합되고, 그리고 30 μl 용적으로 용리되었다. 용리된 RNA는 표준 수단에 의해 신뢰성있게 정량화되기 어려울 수 있다. 따라서, 10 μl 용적은 후속 라벨링 반응에 이용된다. 시료는 다음의 변형과 함께 제조업자의 지침에 따라(Agilent Technologies, Santa Clara, CA) 단색 유전자 발현 분석을 위한 Agilent의"Low Input Quick Amp Labeling" 키트로 cy-3라벨되었다: 1) Cy3 라벨링을 위하여 스파이크-인 혼합물이 변형되어, 3번째 희석물은 1:5이었고, 1 μl가 각 시료에 추가되었다; 2) 10 μl의 시료는 각 시료에서 이중으로 진공원심분리(vacufuge)를 이용하여 2.5 μl로 용적이 감소되었다; 3) 모든 시료는 증폭된 시료의 정제 단계까지 프로토콜에서 모사본과 함께 처리되었다. 정제 프로토콜 시작 시에, 모사본(duplicate) 시료들은 복합되고, 후속적으로 컬럼을 통하여 통과된다; 4) 시료는 정제된 후에 정량화되지 않지만, 정제된 시료의 전체 용적은 어레이에 혼성화되었다. 라벨된 시료는 제조업자(Agilent Technologies)의 지침에 따라 Agilent Whole Genome 44K 마이크로어래이에 혼성화되었다. 데이터는 Feature Extractor 소프트웨어 (Agilent Technologies)로 추출되었고, GeneSpring GX (Agilent Technologies)으로 분석되었다. 최종 분석에는 이 시료의 최소한 50%에서 발현된 유전자들이 포함되었다. 이 기준에 부합되는 2155개 프로브가 탐지되었다. 2155개중에서, 24개는 전립선암 집단과 대조군 집단 사이에 유의적으로 상이하게 발현된다(p 값 < 0.05). 표 25 및 도 22 참고. 표 25는 4가지 전립선암 환자 시료와 4가지 건강한 대조군 시료에서 cMV로부터 mRNA 페이로드 사이에서 유의미적으로 상이하게 발현되는 24개 유전자를 보여준다. 도 22는 마이크로어래이로부터 선택된 유전자들의 가공안된 배경 추출된 형광 값의 도트 플롯을 나타낸다.
Figure pct00072
표 25에서 약어: "GeneSymbol"은 어래이에서 각 유전자 특징에 이용가능한 명명법을 말한다. 각 유전자에 대한 상세한 설명은 Agilent (www.chem.agilent.com) 또는 HUGO 데이터베이스(www.genenames.org)에서 확인한다. "FCAbsolute"은 집단 간에 탐지된 mRNA 수준에서 절대적인 배수-변화를 보여준다.
실시예 39: 난소 암에 대한 순환하는 미세소낭 검사
이 실시예에서, 이 소낭 난소암 테스트는 난소암을 가진 환자의 혈장으로부터 소낭에 존재하는 일련의 단백질 생물지표들의 탐지를 위한 미소구 기반 면역분석이다. 이 테스트는 CD95, CD9, CD59, CD63, CD81, 그리고 EpCAM의 단백질 생물지표들에 대해 결합 특이성을 가지는 항체들 또는 기타 리간드 또는 결합제 (가령, 압타머, 펩티드, 펩티드-핵산)을 이용한다. CD95 및 EpCAM에 대한 항체(또는 기타 결합제) 피복된 미소구에 의한 소낭의 캡쳐 이후, 피코에리트린-라벨된 항체들은 일반적인 소낭 생물지표들 (here CD9, CD59, CD63, 및/또는 CD81)의 탐지용으로 이용된다. 환자의 결장으로부터 소낭에 대해 이들 항체들의 결합 수준에 따라 난소암의 존재 또는 부재가 결정된다.
소낭은 가령, 실시예 22 및 23에서 설명된 것과 같이 단리된다. 이러한 단백질 생물지표들에 대한 프로파일링 자체는 참조 시료의 것에 대해 테스트 시료의 프로파일을 비교함으로써, 진단, 예후 또는 치료진단 정보를 나타낼 수 있다. 참조 시료는 암이 없는 정상 시료 안에 미세소낭의 수준일 수 있고, 이때 CD95, CD9, CD59, CD63, CD81, 및 EpCAM를 포함하는 소낭의 상승된 수준은 난소암의 존재를 나타낸다.
추가로, 생물지표들은 미세소낭 집단에 존재하는 또는 이와 연합된 추가 생물지표들을 더 조사할 수 있는 특정 테스트 시료를 프로파일, 식별 또는 단리하는데 이용된다. 예를 들면, 미세소낭의 입력 시료는 생물지표 (여기에서, 기질-결합된 항체 결합 CD95 및/또는 EpCam)에 특이적 결합제를 이용한 친화력 또는 면역침전을 받게 되고, 그리고 단리된 생물지표-양성 (BM+) 하위집단은 본 명세서에서 기술된 방법들 또는 당업계에 공지되어 방법을 이용하여 추가 처리되어, 미세소낭의 하위집단에 존재하는 추가적인 생물지표들 (가령, 단백질, 펩티드, RNA, DNA)을 특징화 및 결정한다.
이 테스트는 실시예 14-16에서 제시한 방법들을 이용하여, 캡쳐된 소낭 안에 microRNA 수준을 평가하는 것을 더 포함할 수 있다. microRNA는 miR-200c를 포함하는 microRNA 구성원들을 포함한다. 암이 아닌 참조와 비교하였을 때, mir200 microRNA의 감소된 수준은 난소암의 존재를 나타낸다. miR200의 더 낮은 수준은 추가로 더 공격적인 암을 나타낸다.
실시예 40: PCa에서 차등적으로 발현되는 miR
전립선암 (PCa) 탐지를 위한 혈액-기반된 생물지표를 발견하기 위한 시도는 도전을 받고 있었다. 혈액에서 microRNA (miR)의 정량화를 이용하여 잠재적인 유전적 생물지표를 확인하였다. 세포들로부터 miR이 풍부한 원천으로 혈장-유도된 순환하는 미세소낭 (cMV)를 이용하여, 본 실시예는 건강한 대조군으로부터 PCa 시료를 구별하고 뿐만 아니라 전이성 PCa에 대한 miR 생물특징을 설명한다.
전립선암이 있는 남성과 대조군(전립선암이 없는 것으로 확인된 남성 생검)의 혈장 시료 패널은 본 명세서에서 기술된 것과 같이 Exiqon RT-PCR 패널을 이용하여 분석되었다. TNM 축척(scale)을 이용하여, 전립선암은 MX 시료 (거리를 둔 전이가 평가되지 않았다), M0 시료 (전이의 존재를 나타낸다), 그리고 M1 시료 (거리를 둔 전이가 확인됨)를 포함한다.
환자 시료로부터 단리된 소낭 안에서 miR이 탐지되었다. 변형된 Qi나이n miRneasy 프로토콜 (Qi나이n GmbH, Germany)을 이용하여 각 시료로부터 150 μl의 냉동된 혈장 농축물로부터 RNA가 단리되었다. 변형된 프로토콜은 단리에 앞서 농축된 시료를 Rnase A로 처리하는 것을 포함하는데, 이는 소낭 안에 보호된 RNA 만을 이 시료에서 분석되도록 하기 위함이다. 이 시료는 후속 단계에서 표준화를 위하여 알고 있는 양의 C. elegans microRNA로 스파이크하였다. 시료 안에 소낭으로부터 단리된 40 ng의 RNA가 각 Exiqon 패널에 이용되었다.
Exiqon RT-PCR 패널은 750 miR 및 대조군 분석을 포괄하는 2개의 384 카드로 구성되었다. qRT-PCR 분석은 ABI 7900 (Life Technologies Corporation, Carlsbad, California)에서 Sybr 그린 분석 운용을 이용하여 실행되었다. 각 miR 분석에 대한 Ct 값은 인터-플레이트 구경측정기(IPC) 프로브 및 RT-PCR 대조군의 Ct 값에 대해 표준화되었다. 몇 가지 품질 점검이 있었다. IPC Ct 값이 >25, RT-PCR Ct 값이 >35일 때, 그리고 시료가 대조군 miR (가령, miR-16 및 miR-21)를 증폭시키지 않았을 때 분석에서 시료를 제외시켰다. 이 시료 데이터의 주요 성분 분석은 제외자(outlier)를 확인하기 위하여 GeneSpring 소프트웨어 (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA)를 이용하여 실행되었다. 이들 품질 측정을 이용하여 자격을 얻는데 실패하였기 때문에 분석에서 3개 시료가 제외되었다.
하기에서 명시된 것과 같이, 데이터는 시료 집단 간에 쌍을 이룬(paired) t-테스트를 받았고, p-값은 Benjamini 그리고 Hochberg 허위-발견 비율 테스트로 교정되었다. 가장 유의적인 p-값을 나타내는 miR은 Taqman 프로브 방식을 이용하여 실증되었다.
비-전이성 PCa (n=64) 및 정상적인 대조군 (n=28) 시료에서 비교된 750개 miR중 10개는 P 값 <0.01과 함께 >2.0-배 변화를 가진 것으로 밝혀졌다. 표 26 참고. 실증 세트(N=168)에서, hsa-miR-107 (P=0.03) 및 hsa-miR-574-3p (P=0.02)의 발현이 검사되었다. 이 둘 모두 비-전이성 PCa (n=133) 및 대조군 (n=35) 시료 사이에서 유의적으로 상이하였다.
비-전이성 전립선암 대(vs) 대조군
miR
p-값
전립선암에서 배수 변화
hsa-miR-574-3p
 0.003
 3.32
hsa-miR-141
 0.008
 3.22
hsa-miR-432
 0.002
 4.15
hsa-miR-326
 0.001
 6.36
hsa-miR-2110
 0.005
 5.98
hsa-miR-181a-2*
 0.004
 -2.75
hsa-miR-107
 0.000
 13.16
hsa-miR-301a
 0.006
 5.41
hsa-miR-484
 0.009
 2.92
hsa-miR-625*
 0.003
 4.00
전이성(n=15) 및 비-전이성(n=55) 시료의 비교에서 750개 miR중 16개가 P 값 <0.01과 함께 >2.0-배 변화를 가진 것으로 밝혀졌다. 표 27 참조. 후속 실증 세트(39개 전이성 및 73개 비-전이성)에서 이들 miR 정량화로 found that several miR 테스트ed by qRT-PCR에 의해 테스트된 몇 가지 miR(hsa-miR-200b, hsa-miR-375, hsa-miR-141, hsa-mir-331-3p, hsa-miR-181a, 그리고 hsa-miR-574-3p)은 전이성 및 비-전이성 PCa을 구별할 수 있다는 것을 발견하였다 별도의 코호트에서, hsa-miR-141 및 hsa-miR-375 수준은 비-재발성 PCa 환자 (n=72; P=0.0001)의 cMV보다 전이성 PCa 환자(n=47)의 혈청으로부터 cMV에 유의적으로 더 높았다. 도 23 참고.
전이성 대(vs) 비-전이성 전립선암
miR
p-값
전이에서 배수 변화
hsa-miR-582-3p
 0.001
 2.51
hsa-miR-20a*
 0.002
 3.62
hsa-miR-375
 0.003
 10.71
hsa-miR-200b
 0.003
 3.90
hsa-miR-379
 0.005
 2.10
hsa-miR-572
 0.005
 -7.39
hsa-miR-513a-5p
 0.005
 2.23
hsa-miR-577
 0.005
 5.90
hsa-miR-23a*
 0.005
 2.30
hsa-miR-1236
 0.005
 2.63
hsa-miR-609
 0.006
 2.31
hsa-miR-17*
 0.006
 4.80
hsa-miR-130b
 0.007
 6.12
hsa-miR-619
 0.008
 3.37
hsa-miR-624*
 0.009
 6.09
hsa-miR-198
 0.009
 2.12
혈액-유도된 cMV는 표현형을 특징화하기 위한 miR 생물지표들의 원천이다. miR 생물특징은 대조군으로부터 비-전이성 PCa 혈액 시료를 구별할 수 있었다. 전이성 혈장-유도된 cMV 시료에서, 7 miR의 발현이 더 높았고, 이들중 2개(hsa-miR-141 및 hsa-miR-375)는 전이성 혈청-유도된 cMV에서 상승되었다고 추가 실증되었다. 본 실시예은 전립선암의 탐지 및 전이성 경우 확인을 위하여 cMV의 혈액-기반된 miR 생물특징을 제공한다.
실시예 41: 엑소좀의 하위집단 단리 및 후속 miR 프로파일
본 실시예에서, 표면 단백질 조성물에 근거하여 확인된 순환하는 미세소낭 하위집단에서 microRNA (miR) 발현 패턴이 검사되었다. 전립선암 세포 계통 (VCaP)으로부터 단리된 소낭은 본 명세서에서 기술된 것과 같은 방법을 이용하여 이들의 표면 단백질 조성물에 근거하여 유동 분급되었다. miR의 차등 발현에 대해 소낭이 평가되었다. EpCam, CD63, 또는 B7-H3을 표적으로 하는 피코에리트린-라벨된 항체를 이용하여 형광-활성화된 세포 분급(sorting)에 의해 소낭의 하위집단을 분급하였다. Beckman-Coulter MoFlo XDP (Beckman Coulter, Inc., Brea, CA)에서 소낭이 분급되어 각 소낭은 개별 입자로 분석될 수 있다. 소낭의 표면 상에 항원이 풍부하기 때문이 이소타입 대조군에 비하여 FL2 채널의 강도에서 유의적인 이동(shift)이 있었다. 소낭의 분급된 하위집단은 miR 발현에 의해 후속적으로 프로파일되었다. EpCam, CD63, 및 B7-H3 양성 하위집단에 대한 miR 프로파일은 전체 VCaP 소낭 집단의 프로파일과 비교되었다. 하위집단에 대해 차등 miR 발현 패턴이 관찰되었고, 그리고 모든 발현 패턴은 전체 집단에서 관찰된 것과 구별되었다. 집단 간에 miR의 과다 발현 및 과소 발현 패턴이 모두 관찰되었다. 소낭의 하위집단은 표면 단백질 지표들 뿐만 아니라 이들의 유전적 내용물, 이 경우에서 miR에 근거하여 구별되며, 분리될 수 있다는 것을 이들 데이터에서 보여준다. 표면 단백질 조성물에 근거하여 환자 혈장으로부터 조직-특이적 소낭 집단을 단리하고, 표면 단백질 조성물 및 유전적 내용물 모두에 근거하여 이들을 분석하는 능력은 본 명세서에서 기술된 것과 같이 진단, 예후, 그리고 치료진단 응용에 이용될 수 있다.
실시예 42: 폐암 탐지용 MicroRNA miR-497
현재 폐암의 조기 진단을 위한 혈액 테스트는 없다. 혈장 시료로부터 단리된 순환하는 미세소낭 (cMV)에서 microRNA가 검사되었다. 실시예 6에서 설명된 것과 같이 소낭이 단리되었다. RNA는 Trizol 방법을 이용하여 1ml 혈장내에 포함된 소낭으로부터 추출되었다. MicroRNA 페이로드는 정량적인 Taqman® RT-PCR 방법을 이용하여 탐지되었다. miR-497의 발현은 16명의 폐암 환자 및 15명의 대조군 정상적인 성인(가령, 폐암 없음)의 혈장에서 검사되었다. 두 집단 사이에서 miR-497의 카피 수에 유의적인 차이가 관찰되었다(p = 0.0001). 도 24A 참고. 정상 시료 (도 24A에서 수직 선으로 나타냄)와 비교하여 폐암을 구별하기 위하여 miR-497의 1154개 카피의 임계치 (0.1 ml의 혈장 안에서)를 이용하여, 폐암은 88% 감응성 및 80% 특이성으로 탐지되었다.
연구의 추적에서, 주로 초기 단계 질환(단계 IA = 9, IB = 9, IIA = 1, IIB = 2, III = 1, IV = 2)의 24명의 비-소 세포 폐암 (NSCLC) 환자 및 26명의 건강한 개인의 순환하는 미세소낭 (cMV)은 1 ml의 냉동된 혈장으로부터 단리되었다. miR-497의 발현은 폐암 환자 및 26명의 대조군 정상 성인(가령, 폐암이 없음)의 혈장 시료로부터 cMV에서 검사되었다. 환자 특징은 표 28에 나타낸다.
환자 특징
단계
남성
여성
단계 IA
 5
 4
단계 IB
 4
 5
단계 IIA
 1
 0
단계 IIB
 1
 1
단계 III
 1
 0
단계 IV
 0
 2
정상적인
 14
 12
중앙값 표준화된 카피 수는 정상 개인의 경우 ml 당 9000±307개(±95% CIM) 카피수이고, NSCLC 환자의 경우 27,500±1298개 카피수(±95% CIM)이었다. 0.1 ml 시료 안에 1570개 카피의 암에 대한 임계치(가령, ml 당 15,700개 카피)를 설정하여, 이 분석은 79%의 감응성 및 81%의 특이성을 보유하고, AUC는 0.89이었다. 도 24B-24C 및 표 29의 결과 참고. 표 29는 13,560 및 15,700개의 카피/ml의 임계치 컷오프를 이용한 테스트 성능을 보여준다. 임계치는 감응성 또는 특이성에 유리하도록 조정될 수 있다.
폐암 탐지를 위한 miR-497
진정한 양성
 21
 19
진정한 음성
 18
 21
허위 양성
 8
 5
허위 음성
 3
 5
감응성
 88%
 79%
특이성
 69%
 81%
정확성
 78%
 80%
AUC
 0.89
 0.89
컷오프
(카피 / ml)
 13,560
 15,700
실시예 43: 순환하는 생물지표 진단적 분석의 예상 분석
개요: 비-흑색종 피부 암을 제외하고, 전립선암은 미국 남성에 영향을 끼치는 가장 흔한 암이다. 2010년 미국에서, 217,730회의 새로운 전립선암이 있었고, 32,050명이 사망했다(출처 National Cancer Institute). 전립선암의 임상적 거동은 미시적으로 잘-분화된 종양에서 침입 및 전이 가능성이 높은 공격적 암에 이른다.
전립선 특이적 항원 (PSA) 테스트가 전립선암의 효과적인 관리를 한 상당한 기여에도 불구하고, 전립선 조직에 특이적이지만, 전립선암에는 특이적이지 않는 항원으로 인한 상당한 단점을 가지는 것으로 널리 인식되고 있다. 정상적인 PSA 값은 4.0 ng/mL 미만으로 현재 간주되지만, 그러나, 이 컷오프에 대해서는 여전히 논란이 된다. 혈청 PSA가 4.0 내지 10 ng/mL 범위에 있다면, 반복된 생검(가령, 10-12회 코어)의 사용에도 불구하고, 전립선 생검에서 전립선암의 발견 확률은 대략 30%이다. National Comprehensive Cancer Network (NCCN) 지침에서는 전립선 생검의 경우 2.5 ng/mL의 PSA 컷오프가 권장되었다. American Cancer Society 지침은 PSA가 2.5 ng/mL 이상인 경우 생검을 고려할 것을 권장한다.
이 테스트는 PSA 항원에 매우 특이적이기 때문에, 전립선암 및 비-악성 상태 이를 테면, 양성 전립선 비대증 (BPH) 및 전립선염 모두에서 상승된다. 더욱이, 모든 전립선암이 혈청으로 과도한 수준의 PSA를 방출하지 않고, 그리고 PSA 수준은 다양한 다른 인자들 이를 테면, 부수적인 약물, 나이, 그리고 연령 (가령, 북미인들은 흔히 상대적으로 더 높은 PSA 수준을 가지며; 아시아계 남성은 흔히 상대적으로 더 낮은 PSA 수준을 가진다)에 의해 영향을 받을 수 있다. 따라서, 상승된 PSA는 가능한 전립선암의 배경에서 위험 평가 보조로 준적합 임상적 감응성, 특이성 및 양성 예측 값에 연합된다. 현재 진단적 알고리즘에 특이성이 부여된 전립선암 진단을 돕기 위한 테스트가 필요하다.
미세소낭의 생물학: 미세소낭은 세포 막의 분절이 자발적으로 함입되고(invaginates), 엑소사이토시스를 겪고, 그리고 세포밖 환경으로 방출될 때 다양한 세포 유형에 의해 세포 안에서 만들어질 수 있다. 수지상 세포들, 종양 세포들, 림프 세포들, 중피 세포들, 상피 세포들, 그리고 상이한 조직 또는 장기의 세포들을 포함하는 다양한 세포 유형들이 미세소낭을 만들 수 있다. 미세소낭은 혈장 막 또는 내부 막으로부터 유도된 임의의 막-결합된 입자를 함유할 수 있고, 세포밖 환경으로 후속적으로 방출된다. 미세소낭은 헤르니화된 팽출 (농포화), 혈장 막 부분의 분리 및 밀봉으로 발생된, 또는 세포 기원의 다양한 막-연합된 단백질을 함유하는 임의의 세포내 막-결합된 소낭 구조의 수출로 발생된 지질 이중층 막에 결합된 세포-유도된 구조다. 이들은 미세소낭 또는 엑소좀 관강 안에 포함된 종양-유도된 단백질 뿐만 아니라 분자 이를 테면, 종양-유도된 miRNAs, mRNA들, 그리고 세포내의 단백질에 선택적으로 결합하는 숙주 순환계로부터 유도된 표면-결합된 분자들을 포함할 수 있다. 미세소낭은 막 단편들을 또한 포함할 수 있다. Valadi et al. (2007)은 비만 세포들로부터 유도된 미세소낭의 조성물 및 내용물을 분석하였고, 이들이 microRNA (miRNAs, miR) 및메신져 RNAs (mRNA들)에서 실질적으로 풍부하다는 것을 발견하였다. 또한, 미세소낭 안에서 발견된 RNA의 프로파일은 시토졸에서 발견된 RNA의 프로파일과는 상이하였다. 예를 들면, 미세소낭은 리보좀 RNA를 함유하지 않지만, 19-22개의 많은 수의 뉴클레오티드 miRNA를 함유한다. 도 25A-C는 배양에서 성장된 전립선암 세포 계통으로부터 한외원심분리에 의해 단리된 미세소낭의 투과 전자 현미경 사진을 보여준다. 도 25A는 유리 슬라이드에 결합된 Vcap-유도된 미세소낭의 전자현미경 사진이고, 도 25B는 Vcap-유도된 미세소낭의 전자 현미경 사진이고, 그리고 도 25C는 폴리-L-리신이 피복된 폴리스티렌 비드에 결합된 Vcap 미세소낭의 주사 전자 현미경 사진이다.
종양 세포들에 의한 미세소낭의 분비 및 단백질 및 핵산 (가령 miRNA)의 운반에 이들의 연루는 병리적 과정에서 미세소낭의 역할을 설명한다. 미세소낭은 혈액 혈장, 기관지폐포 세척 유체, 그리고 소변을 포함하나 이에 한정되지 않는 다수의 체액에서 발견되었다. 기타 생물학적 기능들중에서, 미세소낭은 세포간 소통에 참여하고, 뿐만 아니라 단백질, RNAs, DNAs, 바이러스, 그리고 프리온의 운반 소포로 작용하다.
미세소낭 및 생물지표들: 단백질 생물지표들 또는 종양 지표들은 암과 연합된 혈액 또는 조직에서 발생되는 단백질 분자를 포함하고, 이의 측정 또는 확인은 질환 진단 또는 임상적 관리에 유용하다.
종양 지표들은 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는 다수의 임상 목적에 이용될 수 있다: (1) 암의 존재에 대해 건강한 집단 또는 고위험 집단의 선별, (2) 암 또는 특이적 유형의 암의 진단에 도움, (3) 예후 결정에 도움, 그리고 4) 치료 감시를 지원.
임상적 결과를 지원하는 생물지표들에 대한 연구는 급격하게 증가되고 있으며, 최근 수년간, 다양한 유전적 생물지표들이 발견되었고, 암 환자를 위한 치료진단에 유용한 것으로 실증되었다(가령, 결장직장암을 가진 환자에서 KRAS, 유방암 환자에서 Her2-neu 과다발현, 그리고 비-소 세포 폐암 환자에서 EGFR). 그러나, 현재 이용가능한 많은 단백질 생물지표들은 의사결정을 지원하기 위한 감응성, 특이성, 그리고 전조 가치를 설명하는데 실패하였다. 예를 들면, 태아성 암 항원 (CEA)은 결장직장암 환자에서 우선적으로 확인되는 단백질이지만, 췌장, 위, 폐 및 유방을 포함하는 다양한 악성암 뿐만 아니라 다양한 양성 상태, 이를 테면, 간경화, 염증성 장질환, 만성 폐 질환 및 췌장염에서도 상승된 것으로 발견되었다. 또다른 예는 CA-125인데, 비-점액성 난소 암종의 80%에서 존재하는 항원이지만, 다른 악성 이를 테면, 내막, 췌장, 폐, 유방 및 결장 악성 뿐만 아니라, 양성 상태 이를 테면, 월경, 임신 및 자궁내막증과 같은 다양한 양성 상태에서도 또한 상승될 수 있다.
종양 세포들에 의해 생산되는 미세소낭은 종양-세포 기원의 분자 이를 테면, miRNAs, mRNA들, 그리고 단백질을 포함한다. 따라서, 순환하는 미세소낭 (cMV)의 단리 및 농축은 종양-연합된 생물지표들의 매우 농축된 원천을 제시할 수 있다.
본 실시예는 40 내지 75세 남성에게서 전립선암의 존재 및/또는 위험의 개선된 평가를 제공하기 위하여 생물지표 특징(생물특징)으로 특징화되는 미세소낭-기반된 진단 테스트를 개발하기 위한 프로토콜을 설명한다. 이 미세소낭-기반된 방식은 치료 결정 및 결정 예후를 지원하는 신형성 질환의 단계확인/감시에도 추가적으로 이용될 수 있다.
본 명세서에서 기술된 바와 같이, 본 발명은 전립선암이 없는 남성으로부터 장기 한정된 전립선암을 가진 남성의 혈장을 구별할 수 있는 캡쳐된 순환하는 미세소낭에 근거한 다중 샌드위치 면역분석(하기 설명)을 일부 제공한다. 이 분석은 전립선암 환자의 혈장 안에 미세소낭에 존재하는 일련의 단백질 생물지표를 탐지하기 위한 미소구-기반된 면역분석을 포함한다. 분석 개발 동안 다수의 미세소낭 표면 항원이 검사되었고, 최적화된 생물특징 패널 또는 지표들이 선택되었다. 이 예비 방법은 다음의 단백질 생물지표들: CD9, CD63, CD81, PCSA, B7H3 및 PSMA에 대한 특이적 항체를 이용하였다.
PSMA 및 PCSA는 전립선 상피 세포들로부터 분비된 미세소낭을 단리하는데 이용되는 전립선 특이적 지표들이다. B7-H3은 형질변환된 세포들에서 발견되는 단백질 생물지표이며 그리고 암 세포들로부터 미세소낭을 확인하는데 이용된다. CD9, CD63 및 CD81은 대부분의 상피 세포들 및 상피 세포들로부터 분비된 미세소낭에서 발견되는 테트라스파닌 또는 막통과 단백질이다. 이들 테트라스파닌은 일반적 소낭 지표들로 작용한다(표 3 참고). 피코에리트린 (PE) 라벨된 항-테트라스파닌 항체는 분석에서 다양한 결합된 미세소낭의 탐지에 이용된다. 환자의 혈장으로부터 미세소낭에 이들 항체의 결합 수준에 따라, 전립선암의 존재 또는 위험과의 상관관계가 결정된다.
전립선암 환자와 전립선암을 가지지 않은 남성과의 비교하는 소급 연구에서 이 분석 형태는 83% 감응성 및 86% 특이성을 보여주었다. 이 생물특징은 전립선암의 위험 상승으로 인하여 전립선 생검이 예정된 모든 남성의 예상 수집된 시표에서 테스트될 것이다.
단백질 생물지표들의 용도에 추가하여, miRNA 분자는 전립선암의 탐지 및 구별의 감응성 및 특이성을 개선시키기 위하여 이 분석에 추가될 것이다. 혈장으로부터 cMV를 수집하고 농축시키고, 그리고 특이적 miRNA 종을 추출하고 측정하며, 전립선암과의 상관관계를 결정함으로써 이루어질 수 있다. 예를 들면, 전립선암 또는 전이성 전립선암의 존재와 상관관계가 큰 miRNA는 상기 실시예에서 제시된다.
목적: 본 예상 연구의 목적은 혈액 시료로부터 전립선암의 탐지에 높은 수준의 정확성을 제공하는 미세소낭-기반된 전립선암 특이적 생물특징을 식별하고 및/또는 확인하는 것이다. 좀더 구체적으로, 목적은 전립선암 가능성의 평가를 위하여 비뇨기전문가가 참고하는 남성 집단에서 전립선암 탐지에 도움이 되는 분석을 개발하는 것이다. 분석 실행 목표는 >10 코어 초음파-안내된 생검의 불완전 금본위에 근거하여 ROC 분석에서 AUC ≥ 0.80와 함께 ≥ 80% 감응성 및 ≥ 80% 특이성을 포함한다.
의도된 용도: 본 실시예에서 설명되는 순환하는 미세소낭(cMV) 분석은 인간 혈장 안에 미세소낭에서 명시된 생물지표들의 측정을 위한 것이다. 이 분석은 상승된 PSA 및/또는 비정상적인 디지털 직장 검사(DRE)로 전립선암의 위험이 상승된 것으로 간주되는 또는 전립선 생검의 후보가 될 수 있는 40-70세 남성에서 전립선 암 탐지에서 지원도구로 이용될 것이다.
연구 안: 혈액 시료는 명시된 포함 기준에 부합되는 전립선 생검을 받기로 된 모든 남성으로부터 수집될 것이다. 적절한 형태로 시료가 취득될 것이고 보관될 것이다. Case Report Forms에서 수집된 연합 데이터는 전자형태로 보관될 것이며, 사본도 보관될 것이다. 혈액은 이 시료 수집 프로토콜에서 명시된 것과 같이 혈장으로 가공되고(도 25D 참고), 냉동되고, 그리고 수집 장소(가령, 병원 또는 관리사무소)로부터 단백질 및 핵산 생물지표들에 대해 처리 및 검사되는 분석 장소로 이동된다. 순환하는 미세소낭은 차등여과 과정에 의해 혈장으로부터 단리 및 농축될 것이다. 농축된 미세소낭은 생검에서 전립선암으로 확인된 남성의 최소한 50개 전립선암 시료 뿐만 아니라 동일 장소에서 음성 생검을 가진 남성의 최소한 50개 시료의 모의 세트 상에 있는 단백질 및 miRNA 생물지표에 대해 검사될 것이다. 미국지역에서 최소한 3가지 상이한 수집 장소로부터 시료를 이용할 것이다.
단백질 및 RNA는 PCa의 존재와 관련된 잠재적 생물지표들에 대해 검사될 것이다.
방법: 단백질 생물지표 선택은 Luminex 200 기구 시스템에서 실행될 것이다. 선택된 항체은 제조업자가 권장하는 프로토콜에 따라 Luminex Corp의 차등적으로 접근가능한 미소구에 접합된다. 접합 이후, 피복된 미소구는 PBS에서 Starting Block Blocking Buffer (Thermo Scientific, cat # 37538)에서 항온처리됨으로써 세척되고, 차단되고, 세척ed in 인산염 완충된염수 (PBS)에서 세척되고 그리고 하기에서 설명된 것과 같이 혈장으로부터 농축된 cMV와 함께 항온처리된다. 비드 결합된 항-CD9, 항-B7H3, 항-PCSA 및 항-PSMA를 이용하여 cMV 캡쳐 이후, 미소구-cMV 복합체들은 세척되고, 그 다음 피코에리트린 라벨된다 탐지물질 항체 (PE-CD9, PE-CD63 및 PE-CD81)와 함께 항온처리되며, 그리고 Luminex 200에서 판독에 앞서 세척된다. 표준 프로토콜은 100개의 미소구로부터 형광 신호를 측정하고, 각 차등적으로 접근가능한 미소구에 대한 중앙값 형광 강도(MFI)를 계산하는 것을 포함하는데, 이 강도는 상이한 캡쳐 항체에 대응된다. 상기에서 설명된 테트라스파닌 탐지물질에 추가하여 탐지물질 및 캡쳐 항체의 다양한 조합이 검사될 것이다. 예를 들면, 표 5의 전립선 또는 기타 지표 생물지표들이 필요에 따라 평가될 것이다.
유동세포분석법은 평가되는 다양한 집단 안에서 전체 수의 cMV를 분석하는데 이용될 것이다. 적정량의 혈장 시료가 PBS에서 100배 희석될 것이고, 그 다음 시료당 사건 정량화를 위하여 BD Trucount 튜브 (BD Biosciences, San Jose, CA)에서 실온에서 15분간 항온처리된다. Trucount 튜브는 유동세포분석법에 의해 각 시료에 대한 사건과 비교될 수 있는 정확한 수의 형광 비드를 포함한다. FACS Canto II 세포분석기 (BD Biosciences)에 의한 시료 획득과 FlowJo 소프트웨어 (Tree Star, Inc., Ashland, OR)에 의한 후속 분석으로 튜브당 시료 사건의 수와 Trucount 비드의 수가 들어날 것이다. 끝으로, 시료당 절대적인 수 계산은 BD의 지침에 따라 얻을 것이며, 희석 인자로 조정될 것이다.
microRNA는 혈장 시료의 cMV로부터 또한 검사될 것이다. Trizol 방법을 이용하여 cMV는 농축되고, miRNA는 cMV로부터 추출된다. 간단하게 설명하자면, cMV는 Rnase A (Epicentre Biotechnolgies, Madison, WI) 처리되고(20 μg/ml, 20분, 37℃), Trizol 처리되고(각 100 μl에 750 μl의 Trizol LS), 실온에서 14000rpm에서 30분간 볼텍스된다. 원심분리 이후, 상층액에 수집되고, RNA는 miRNeasy 96 (Qiagen Inc., Valencia, CA) 정제 키트로 추가 정제되며, -80℃에서 보관된다. 40 ng의 RNA는 역전사되며, ABI 7900 (Applied Biosystems, Life Technologies, Carlsbad, CA)에서 Exiqon qRT-PCR Human 패널 I 및 II (Exiqon, Inc, Woburn, MA)에서 운용된다. CT 값은 SDS 2.4 소프트웨어 (Applied Biosystems)에 의해 산출된다. 모든 시료는 인터플레이트 구경측정기 및 RT-PCR 대조군에 대해 표준화된다.
메신져 RNA는 또한 혈장 시료의 cMV로부터 검사될 수 있을 것이다. 메신져 RNA는 혈장 시료의 cMV로부터 검사될 것이다. 우선, cMV는 단리되며, 37℃에서 20분간 RNase A, 229 μg/ml로 처리된다. 그 다음 메신져 RNA는 Trizol 방법을 이용하여 추출될 것이며, 70% 에탄올 침전과 함께 Qiagen RNeasy 미니 키트로 추가 정제된다. 시료 RNA는 역전사될 것이며, 제조업자의 지침에 따라 단색 유전자 발현 분석을 위한 Agilent의"Low Input Quick Amp Labeling" 키트로 cy-3라벨될 것이다. 라벨된 시료는 Agilent의 Whole Genome 44K v2 어래이에 혼성화될 것이며, 제조업자(Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA)의 설명에 따라 세척될 것이다. Agilent B 스캐너에서 어래이가 스캔되며, 데이터는 Feature Extractor (Agilent Technologies) 소프트웨어로 추출될 것이다. 추출된 데이터는 세계적인 표준화 방법으로 표준화되며, GeneSpring GX (Agilent Technologies) 소프트웨어로 분석될 것이다.
miRNA 및 메신져 RNA는 혈장으로부터 cMV의 특정 하위집단으로부터 검사될 것이다. 예를 들면, cMV은 농축되고, 그 다음 PCSA에 양성인 집단은 자석 면역침전을 이용하여 단리된다. 단리 이후, miRNA는 변형된 Trizol 방법을 이용하여 추출된다. 간략하게 설명하자면, cMV는 Rnase A (Epicentre Biotechnolgies, Madison, WI) 처리되고(20 μg/ml, 20분, 37℃), Trizol 처리되고(각 100 μl에 750 μl의 Trizol LS), 실온에서 14000rpm에서 30분간 볼텍스된다. 원심분리 이후, 상층액에 수집되고, RNA는 miRNeasy 96 (Qiagen Inc., Valencia, CA) 정제 키트로 추가 정제되며, -80℃에서 보관된다. 40 ng의 RNA는 역전사되며, ABI 7900 (Applied Biosystems, Life Technologies, Carlsbad, CA)에서 Exiqon qRT-PCR Human 패널 I 및 II (Exiqon, Inc, Woburn, MA)에서 운용된다. CT 값은 SDS 2.4 소프트웨어 (Applied Biosystems)에 의해 산출된다. 모든 시료는 인터플레이트 구경측정기 및 RT-PCR 대조군 및/또는 cMV의 수에 대해 표준화된다. 메신져 RNA는 또한 혈장 시료의 cMV로부터 검사될 수 있을 것이다. 메신져 RNA는 혈장 시료의 cMV로부터 검사될 것이다. 우선, cMV는 단리되며, 37℃에서 20분간 RNase A, 229 μg/ml로 처리된다. 그 다음 메신져 RNA는 Trizol 방법을 이용하여 추출될 것이며, 70% 에탄올 침전과 함께 Qiagen RNeasy 미니 키트로 추가 정제된다. 시료 RNA는 역전사될 것이며, 제조업자의 지침에 따라 단색 유전자 발현 분석을 위한 Agilent의"Low Input Quick Amp Labeling" 키트로 cy-3라벨될 것이다. 라벨된 시료는 Agilent의 Whole Genome 44K v2 어래이에 혼성화될 것이며, 제조업자(Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA)의 설명에 따라 세척될 것이다. Agilent B 스캐너에서 어래이가 스캔되며, 데이터는 Feature Extractor (Agilent Technologies) 소프트웨어로 추출될 것이다. 추출된 데이터는 세계적인 표준화 방법으로 표준화되며, GeneSpring GX (Agilent Technologies) 소프트웨어로 분석될 것이다.
표준화된 분석 값은 R (cran.org) 및 SAS 소프트웨어 (SAS Institute Inc., Cary NC)으로 손질될 것이며, 품질 대조군 분석을 받게 되며, 분석전 형질변환된다. 분석은 다음과 같이 진행될 것이다:
1) 특징 성능 평가(사전-명시된 또는 신규한 특징에 대해)
a. 이 시료를 이용하여 임상 결과의 공개(unblinding) 또는 시료의 임상 실험실 테스트의 공개(unblinding)에 앞서 충분히 명시된 생물특징의 성과를 평가하는데 이용될 수 있다. 이러한 경우에서, 특징은 사전명시된 것으로 간주되고, 모든 시료에 대해 예상되는 결과를 얻기 위하여 이 시료 세트에서 새로운 분석 데이터에 정용되거나 변형되어야만 한다. 사전-명시된 특징의 성과는 예상된 그리고 진정한 결과(예를 들면, 진단적 감응성, 특이성, 그리고 정확성에 대해)를 비교함으로써 평가된다. 통계는 실행 예측 및 신뢰구간을 포함한다.
b. 사전-명시되지 않은 특징들의 경우(가령 시료의 임상 결과 및 시료의 실험실 테스트 결과 모두에 대한 통찰로 유도된), 이들 시료는 특징의 성과를 평가하는데 여전히 이용될 수 있다. 성과의 잠재적 편향된 예측을 감소시키기 위하여, 하기에서 설명된 것과 같이, 지표 선택 그리고 분류 예측 단계를 포함하는 k-폴드 크로스 실증 루프(k-fold cross validation loop) 안에서 통계학적 분석이 실시된다.
2) 신규한 특징에 대한 지표 선택
a. 공지된 공통적으로 적용되는 기술의 하위 세트를 이용하여 질환 결과와 특징들의 연합에 대해 테스트함으로써 이들이 통계학적으로 유익하다면, 신규한 특징들에 지표들이 포함된다:
ii) Welch 테스트 - 집단 간에 확실한 매개변수적 통계학적 테스트는 가변성이 동일하지 않을 때를 의미한다;
ii) Wilcoxon 신호된-등급 테스트 - ROC AUC (0.50 이상)의 개선을 나타내는 것으로 해석될 수 있는 확실한 비-매개변수적 통계학적 테스트;
iii) Youden's J - 모든 가능한 진단적 임계치에 대해 지표에 대해 최대 복합된 감응성 및 특이성으로 계산됨. 통계학적 유의성은 순열변경(permutation) 테스트를 통하여 평가된다.
b. 실행된 숫자 통계 테스트 내용에서 테스트가 유의적이라면 지표들은 통계학적으로 유익한 것으로 판단된다. 좀더 구체적으로, comparision-wise p-값은 다중 테스트에 대해 조정된다 - 가령, 허위 발견 비율 임계치 또는 by 대조군 of 패밀리-와이즈(wise) 오류 비율의 조정.
3) 신규한 특징의 형성 : 유용한 지표들의 하위 세트가 상기 설명된 과정(지표 선택) 단계에서 확인된 것으로 추정하고, 잘-확립된 모델링 기술을 이용하여 신규한 다중-지표 모델이 형성된다. 특징에 대한 매개변수들은 충분한 모의 데이터 세트에서 모델을 양성한 후 평가되고, 이 특징에 대한 성능은 "사전명시안된 특징에 대한"방법을 이용하여 "특징 성능 평가(Signature performance evaluation)"에서 설명된 것과 같이 평가된다. 이들 단계에서 간단하고, 잘-확립된 모델링 기술이 이용되는데, 다음을 포함한다: 판별 해석, 지지 벡터 기기(support vector machine), 로지스틱 회귀(logistic regression), 그리고 의사결정 분지도(decision trees). 모든 모델에 대한 결과가 보고될 것이며, 따라서 최적의 지표 패널이 확인된다.
관심의 임상 변수에 대한 데이터 세트에서 추가 귀납적 분석이 실행될 수 있는데, 예를 들면, 기존 생검의 수는 생검 및 생검 결과를 나타낼 수 있다(가령, 고등급 전립선 상피내 신형성(HGPIN), 비전형적 소세엽증식(ASAP), 이형성, 양성 전립선 비대증 및 전립선염. 귀납적 테스트는 충분한 데이터 분석후에만 실행될 것이고, 모든 테스트 및 결과는 기록되며, P-값은 다중 테스트에 대해 수정될 것이다.
환자 적격여부(Eligibility):
포함 기준
1. 성별: 남성
2. 40 내지 79세 연령대
3. 임의의 인종 또는 민족
4. 통상적인 관리 과정의 일부로 전립선 생검이 예정된 남성과 예정된 생검을 받기에 앞서 7일 이내에 채혈에 동의한 남성
5. 모든 연구 형태 및 환자 시료와 함께 전립선 생검 병리 보고서를 Caris에 제공할 수 있는 경우
6. 연구를 이해할 수 있는 이해력 및 동의서에 서명할 수 있는 권한
배제 기준
1. 전립선절제 또는 호르몬 요법을 포함하는 전립선암에 대해 임의의 기존 또는 진행중인 치료.
2. 전립선암 또는 비-흑색종 피부 암을 제외하고 기존의 암 진단.
3. 채혈 30일 이내에 전립선 생검.
4. 채혈전 채혈 당일 실행된 DRE.
5. 사혈 거절.
6. 동의서에 서명 거절.
전립선 채혈 프로젝트에 참가할 수 있는 개인의 인종, 성별(남성으로 제한된 연구) 및 민족적 특징은 비뇨기과 의학 관리를 받은 또는 얻고자 하는 대상의 통계를 반영할 것이다. 대상들은 이들 통계에 포함된다. 연령, 출신 국가, 민족, 신체 장애 또는 HIV 상태에 근거하여 전립선 채혈 수집 프로젝트에 참가에 배제된 개인은 없을 것이다.
환자 또는 데이터 선택 요건: 데이터 선택은 환자 적격성 기준에 근거하며, 본 연구에 포함되는 대상에 해당되는 데이터 기록에 국한될 것이다(가령, 실험실 분석 데이터가 이용가능한 경우). 데이터 필드는 표 30에서와 같이, (비-PHI) 기증자 식별, QC 및 임상 해석에 이용된 것들을 포함한다:
Figure pct00073
환자 또는 데이터 수집 요건: 데이터 필드는 채혈된 시설에서 임상 데이터 형태로 캡쳐되어야 한다. 모든 데이터 요소들을 캡쳐하기 위하여 직원 사이트는 의료 기록 및 환자에서 유도된 정보를 이용할 것이다. 각 경우에 대해 수집된 데이터는 수령 48시간 이내에 데이터베이스에 입력될 것이다. 모든 데이터 필드는 완성되어야 하고; 그렇지 않는 경우, 그 사이트로 문의가 보내지고, 반응은 영업일 10일 이내에 요구된다. 사전-선택된 데이터 필드는 완성되어야 하고, 또는 이 환자는 분석에서 배제될 것이다.
기타 환경 가령, 전립선암이외의 암 및 질환들에 대한 가령, 진단적, 예후적 및/또는 치료진단에서 순환하는 생물지표를 포함하는 생물특징을 개발하고 확인하기 위하여 유사한 프로토콜이 있을 수 있다는 것을 당업자는 인지할 것이다. 예를 들면, 표 5의 생물지표들은 다른 환경에 대한 생물특징의 일부분으로 이용될 수 있다.
실시예 44: 생물지표들을 확인하기 위한 데이터 마이닝(Mining)
microRNA는 mRNA의 발현을 조절하는 것으로 알려져 있다. 발현 데이터베이스는 많은 종양 유형의 mRNA 발현에 대한 정보를 함유하도록 만들어졌다. 데이터베이스는 수많은 환자에 대한 Illumina DASL 마이크로어래이 (Illumina, Inc., San Diego, CA)를 이용하여 획득된 데이터를 포함한다. 순환하는 미세소낭 (cMV)은 주요 RNA 종으로 microRNA를 포함하고, 또한 mRNA들을 포함한다. 본 실시예에서, 발현 데이터베이스로부터 암 종양에서 차등적으로 발현된 mRNA와 cMV에서 발현된 것들 사이에 연합을 만들었다. 종양 조직에서 차등적으로 발현된 mRNA들은 cMV에서 microRNA 표적을 찾는데 또한 이용되었다.
발현 데이터베이스에서 유전자 발현 데이터는 전립선 (PCa+), 유방 (BrCa), 폐 (LCa) 그리고 결장직장암 (CRC)과 정합된 정상적인 조직 (PCa-) 사이에 그리고 암 유형(표 31) 사이에서 가장 통계학적으로 유의미적으로 차등적으로 발현된 유전자를 찾기 위하여 평가되었다. 암 시료 (전립선, 결장직장, 유방 및 폐)에 대한 발현 데이터 (버젼 HT-12 및 REF-8)가 분석되어, 암 유형간에 차등적으로 발현된 유전자들을 탐지하였다. 유사하게, 전립선암 (PCa) 시료는 전립선 정상 시료에 대해 비교되어, 전립선암 특이적 프로브를 탐지하였다. 분석을 실행하기 위하여, 발현 데이터는 20개의 임의적으로 선택된 어래이 하위집단(6개 유방암, 5개 결장직장암, 5개 폐암, 그리고 4개 전립선암)을 채택함으로써 분석전에 표준화되어, 분위 참고 분포를 만들었다. 데이터 세트의 모든 어래이는 참조 분포에 대해 표준화되어, 각 어래이가 동일한 분위 분포(quantile distribution)를 공유하도록 하였다. 그 다음, 데이터 세트에서 각 프로브에 대해 표준화된 발현 데이터가 분석되었다. 차등적으로 발현된 프로브( 및 이에 대응하는 유전자)는 F-득점(a.k.a. Fisher 득점) 통계를 이용하여 각 분류 쌍(가령 전립선암 vs. 유방암, 그리고 전립선암 vs. 전립선 정상적인)을 비교함으로써 탐지되었다. 분류 변이간 vs. 분류 변이 안을 측정하는 이 통계는 집단 표준 편차의 합의 제곱에 대해 평균 집단 차의 제곱을 산출함으로써 획득되었다. F-득점은 PCa+ 시에 대한 평균이 두 집단보다 더 낮을 때 음성으로 설정되었다. 끝으로, F-득점의 절대값을 이용하여 F-득점은 하강 순서로 분급되고, 상향/하향 조절된 상위 지표들이 목록에서 선택되었다.
Figure pct00074
전립선암의 경우, 가장 유의미적으로 과다발현 및 과소발현된 유전자의 목록이 생성되었다. 이들 유전자는 전립선암 환자s via 마이크로어래이를 통하여 전립선암 환자의 cMV에서 탐지된 mRNA 목록과 비교되었다. 조직 목록에 있는 하나의 유전자, AQP2는 cMV에서 또한 발현된 것으로 밝혀졌다. 전립선 종양 조직에서 상향- 및 하향-조정된 유전자 목록은 이들 mRNA의 발현에 영향을 줄 수 있는 microRNA에 대한 TargetScan 공공 데이터베이스를 이용하여 발굴되었다. 검사된 20개 mRNA중 11개에 대하여 정합되는 microRNA가 발견되었다(표 32). 이 microRNA 목록은 cMV에서 신뢰성있게 탐지된 microRNA 목록과 비교되었다. 이러한 비교로 전립선 종양 조직에서 관심 mRNA를 조절하는 10개의 microRNA가 cMV에서 또한 발견됨이 드러났다(표 32).
Figure pct00075
추가적으로, 차등적으로 발현된 것으로 밝혀진 mRNA는 단백질 수준에서 차이를 또한 나타낸다. 이러한 발굴 활성 결과는 유방암, 폐암 및 결장암을 포함하는 다른 암으로부터 전립선암을 구별하는데 이용되는 cMV와 연합된 확인된 단백질(가령 KLK2)를 가진다. KLK2는 전립선 조직과 연합된 것으로 알려져 있다.
실시예 45: microRNA 기능 분석
microRNA는 혈액에서 미세소낭, HDL 및 LDL 미립자 뿐만 아니라 리보핵단백질 복합체들 (RNPs)의 성분들에 포집되어 순환하는 것으로 발견될 수 있다. microRNA는 이를 테면, RT-qPCR 또는 차세대 서열화와 같은 이용가능한 기술을 이용하여 탐지될 수 있다. 그러나, 생물학적으로 활성 상태의 microRNA는 Argonaute 단백질 (Ago1-4)중 하나에 결합되고, 활성화된다. 본 실시예는 다양한 원천(세포 용해물, 체액, 혈장, 혈청, 단리된 미세소낭, 등을 포함하나 이에 한정되지 않는)으로부터 얻은 시료 안에 주어진 microRNA의 기능 활성을 단일 반응에서 탐지할 수 있는 분석을 제시한다.
이 분석은 마이크로비드, 바이오틴 접합된 합성 RNA 분자, 스트렙타아비딘-PE, 재조합 Argonaute 2 그리고 RISC (RNA-유도된 침묵 복합체) 반응 완충액 성분들을 포함한다. 분석의 성분들은 도 26에 나타낸다. 도 26A에 나타낸 것과 같이, 바이오틴 접합된 합성 RNA 분자는 3'링커/연장부 영역 262, 중앙 miRNA 표적화 영역 263 그리고 제 2의 5'링커/연장 영역 264를 포함한다. RNA는 3'단부 262 상에 기질, 여기에서 마이크로비드 261에 부착되며, 그리고 5'단부 264는 바이오틴 266에 접합된다. 중앙 miRNA 표적화 영역 263은 관심 miRNA 서열에 상보적이 되도록 기획된다. 관심대상의 임의의 microRNA가 이 분석에 이용될 수 있다; 예시를 목적으로 여기에서는 오직 let-7a가 이용되었다. 스트렙타아비딘-PE (피코에리트린) 265은 RNA의 바이오틴 단부를 라벨하는데 이용된다. 표적 let-7a가 이 시료 안에 존재하고, Ago 단백질 267, 가령, 재조합 Ago2 (rAgo2)와 결합/연합된다면, let-7a는 상보적인 microRNA 표적화 영역 263에 결합하고, 후속적으로 Argonaute 2의 엔도뉴클레아제 절단 활성을 통하여 영역 263에서 합성 RNA를 절단할 것이다. 도 26에서 단계 268 참고. 일단 절단되면, 합성 RNA 분자의 5'단부는 방출되고, 이로 인하여 마이크로비드 261로부터 바이오틴/스트렙타아비딘-PE 복합체 265-266는 분리된다. 도 26B 참고. 그 다음, 기질 마이크로비드는 RNA의 절단된 그리고 연결안된 단부를 제거하기 위하여 단리되고 세척되며, 이로 인하여 절단안된 그리고 여전히 라벨된 물질만 남을 뿐만 아니라 임의의 절단된 RNA는 남겨진다. 이러한 세척 단계이후, PE 신호에서 차이는 고유 분석에서 존재하는 Ago-결합된 표적 microRNA 267의 농도 및 활성과 관련된다. 본 실시예에서, 투입물 시료 안에 Ago-결합된 let-7a의 양은 절단된 RNA 수준을 결정한다. 예를 들면, let-7a가 존재하지 않는다면, 합성 RNA 표적 영역 263은 절단되지 않은 채 남아있을 것이며, 신호 강도를 변함없을 것이다.
도 26C-E는 분석을 위한 투입물로 이용될 수 있는 다양한 원천의 RNA를 도식적으로 설명한다. 도 26C는 리보핵산 복합체 267를 형성하기 위하여 Ago 단백질에 결합된 microRNA 268을 설명한다. 도 26D는 Ago 2610에 대한 결합물질을 이용하여, Argonaute - microRNA 복합체 267의 면역침전을 설명한다. 도 26E는 가령, 세포 용해물, 체액, 또는 용해된 미세소낭으로부터 Argonaute - microRNA 복합체 267의 직접적 분석을 설명한다.
본 발명의 바람직한 구체예들을 여기에서 제시하고 설명하였지만, 당업자들은 이러한 구체예들이 설명을 위하여 제공됨을 인지할 것이다. 본 발명을 벗어나지 않고 다양한 변이, 변화 및 치환이 일어날 수 있다. 여기에서 설명된 본 발명의 구체예들에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실행하는데 이용될 수 있음을 인지해야 한다. 다음의 청구범위는 본 발명의 범위를 한정하고, 이 청구항의 범위내에 방법들 및 구성 및 이의 등가물도 이로 인하여 포함된다.

Claims (104)

  1. 다음을 포함하는 방법:
    (a) 생물학적 시료에서 하나 또는 그 이상의 생물지표의 존재 또는 수준을 결정하고, 이때 하나 또는 그 이상의 생물지표은 표 5에서 선택된 하나 또는 그 이상의 생물지표를 포함하고; 그리고
    (b) 하나 또는 그 이상의 생물지표의 존재 또는 수준을 포함하는 생물특징을 확인한다.
  2. 청구항 1에 있어서, 이때 하나 또는 그 이상의 생물지표는 miR-22, let7a, miR-141, miR-182, miR-663, miR-155, mirR-125a-5p, miR-548a-5p, miR-628-5p, miR-517*, miR-450a, miR-920, hsa-miR-619, miR-1913, miR-224*, miR-502-5p, miR-888, miR-376a, miR-542-5p, miR-30b*, miR-1179, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된, 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 이때 하나 또는 그 이상의 생물지표는 miR-22, let7a, miR-141, miR-920, miR-450a, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된, 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 이때 하나 또는 그 이상의 생물지표는 임의의 표 20-24, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 메신져 RNA (mRNA)를 포함하는, 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 이때 하나 또는 그 이상의 생물지표는 A2ML1, BAX, C10orf47, C1orf162, CSDA, EIFC3, ETFB, GABARAPL2, GUK1, GZMH, HIST1H3B, HLA-A, HSP90AA1, NRGN, PRDX5, PTMA, RABAC1, RABAGAP1L, RPL22, SAP18, SEPW1, SOX1, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 메신져 RNA (mRNA)를 포함하는, 방법.
  6. 청구항 1에 있어서, 이때 하나 또는 그 이상의 생물지표는 A2ML1, GABARAPL2, PTMA, RABAC1, SOX1, EFTB, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 메신져 RNA (mRNA)를 포함하는, 방법.
  7. 청구항 1에 있어서, 이때 하나 또는 그 이상의 생물지표는 CA-125, CA 19-9, c-반응성 단백질, CD95, FAP-1, EGFR, EGFRvIII, 아포리포단백질 AI, 아포리포단백질 CIII, 미오글로빈, 테나신 C, MSH6, 클라우딘-3, 클라우딘-4, 카베올린-1, 응고 인자 III, CD9, CD36, CD37, CD53, CD63, CD81, CD136, CD147, Hsp70, Hsp90, Rab13, Desmocollin-1, EMP-2, CK7, CK20, GCDF15, CD82, Rab-5b, Annexin V, MFG-E8, HLA-DR, miR200 microRNA, miR-200c, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된, 방법.
  8. 청구항 1에 있어서, 이때 하나 또는 그 이상의 생물지표는 CA-125, CA 19-9, c-반응성 단백질, CD95, FAP-1, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된, 방법.
  9. 청구항 1에 있어서, 이때 하나 또는 그 이상의 생물지표는 hsa-miR-574-3p, hsa-miR-141, hsa-miR-432, hsa-miR-326, hsa-miR-2110, hsa-miR-181a-2*, hsa-miR-107, hsa-miR-301a, hsa-miR-484, hsa-miR-625*, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된, 방법.
  10. 청구항 1에 있어서, 이때 하나 또는 그 이상의 생물지표는 hsa-miR-582-3p, hsa-miR-20a*, hsa-miR-375, hsa-miR-200b, hsa-miR-379, hsa-miR-572, hsa-miR-513a-5p, hsa-miR-577, hsa-miR-23a*, hsa-miR-1236, hsa-miR-609, hsa-miR-17*, hsa-miR-130b, hsa-miR-619, hsa-miR-624*, hsa-miR-198, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 방법.
  11. 청구항 1에 있어서, 이때 하나 또는 그 이상의 생물지표는 miR-497을 포함하는, 방법.
  12. 청구항 1에 있어서, 이때 하나 또는 그 이상의 생물지표는 AQP2, BMP5, C16orf86, CXCL13, DST, ERCC1, GNAO1, KLHL5, MAP4K1, NELL2, PENK, PGF, POU3F1, PRSS21, SCML1, SEMG1, SMARCD3, SNAI2, TAF1C, TNNT3, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 메신져 RNA (mRNA)를 포함하는, 방법.
  13. 청구항 1에 있어서, 이때 하나 또는 그 이상의 생물지표는 ADRB2, ARG2, C22orf32, CYorf14, EIF1AY, FEV, KLK2, KLK4, LRRC26, MAOA, NLGN4Y, PNPLA7, PVRL3, SIM2, SLC30A4, SLC45A3, STX19, TRIM36, TRPM8, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 메신져 RNA (mRNA)를 포함하는, 방법.
  14. 청구항 1에 있어서, 이때 하나 또는 그 이상의 생물지표는 ADRB2, BAIAP2L2, C19orf33, CDX1, CEACAM6, EEF1A2, ERN2, FAM110B, FOXA2, KLK2, KLK4, LOC389816, LRRC26, MIPOL1, SLC45A3, SPDEF, TRIM31, TRIM36, ZNF613, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 메신져 RNA (mRNA)를 포함하는, 방법.
  15. 청구항 1에 있어서, 이때 하나 또는 그 이상의 생물지표는 ASTN2, CAB39L, CRIP1, FAM110B, FEV, GSTP1, KLK2, KLK4, LOC389816, LRRC26, MUC1, PNPLA7, SIM2, SLC45A3, SPDEF, TRIM36, TRPV6, ZNF613, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 메신져 RNA (mRNA)를 포함하는, 방법.
  16. 청구항 1에 있어서, 이때 하나 또는 그 이상의 생물지표는 miR-26a+b, miR-15, miR-16, miR-195, miR-497, miR-424, miR-206, miR-342-5p, miR-186, miR-1271, miR-600, miR-216b, miR-519 패밀리, miR-203, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 microRNA를 포함하는, 방법.
  17. 다음을 포함하는 방법:
    (a) 생물학적 시료로부터 하나 또는 그 이상의 핵산-단백질 복합체를 단리하고;
    (b) 하나 또는 그 이상의 핵산-단백질 복합체와 함께 하나 또는 그 이상의 핵산 생물지표의 존재 또는 수준을 측정하고; 그리고
    (c) 하나 또는 그 이상의 핵산 생물지표의 존재 또는 수준을 포함하는 생물특징을 확인한다.
  18. 청구항 17에 있어서, 이때 핵산-단백질 복합체는 하나 또는 그 이상의 Argonaute 패밀리 구성요소, Ago1, Ago2, Ago3, Ago4, GW182 (TNRC6A), TNRC6B, TNRC6C, HNRNPA2B1, HNRPAB, ILF2, NCL (Nucleolin), NPM1 (Nucleophosmin), RPL10A, RPL5, RPLP1, RPS12, RPS19, SNRPG, TROVE2, 아포리포단백질, 아포리포단백질 A, apo A-I, apo A-II, apo A-IV, apo A-V, 아포리포단백질 B, apo B48, apo B100, 아포리포단백질 C, apo C-I, apo C-II, apo C-III, apo C-IV, 아포리포단백질 D (ApoD), 아포리포단백질 E (ApoE), 아포리포단백질 H (ApoH), 아포리포단백질 L, APOL1, APOL2, APOL3, APOL4, APOL5, APOL6, APOLD1, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 단백질을 포함하는, 방법.
  19. 청구항 17에 있어서, 이때 핵산-단백질 복합체는 하나 또는 그 이상의 Argonaute 패밀리 구성요소, Ago1, Ago2, Ago3, Ago4, GW182 (TNRC6A), 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 단백질을 포함하는, 방법.
  20. 청구항 17에 있어서, 이때 핵산-단백질 복합체는 Ago2, 아포리포단백질 I, GW182 (TNRC6A), 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 단백질을 포함하는, 방법.
  21. 청구항 17에 있어서, 이때 하나 또는 그 이상의 핵산은 하나 또는 그 이상의 microRNA를 포함하는, 방법.
  22. 청구항 21에 있어서, 하나 또는 그 이상의 microRNA는 표 5의 microRNA를 포함하는, 방법.
  23. 청구항 21에 있어서, 이때 하나 또는 그 이상의 microRNA는 miR-22, miR-16, miR-148a, miR-92a, miR-451, let7a, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 microRNA를 포함하는, 방법.
  24. 청구항 21에 있어서, 이때 핵산-단백질 복합체는 Ago2, 아포리포단백질 I, GW182 (TNRC6A), 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 microRNA를 포함하고; 그리고 하나 또는 그 이상의 microRNA는 miR-16 그리고 miR-92a, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 microRNA를 포함하는, 방법.
  25. 다음을 포함하는 방법:
    (a) 생물학적 시료의 미세소낭 집단에서 하나 또는 그 이상의 단백질 생물지표를 탐지하고;
    (b) 탐지된 미세소낭 집단과 연합된 하나 또는 그 이상의 핵산 생물지표의 존재 또는 수준을 측정하고; 그리고
    (c) 하나 또는 그 이상의 핵산 생물지표의 존재 또는 수준을 포함하는 생물특징을 확인한다.
  26. 청구항 25에 있어서, 이때 하나 또는 그 이상의 하나 또는 그 이상의 핵산 생물지표의 수준은 하나 또는 그 이상의 단백질 생물지표의 수준으로 표준화되는, 방법.
  27. 청구항 25에 있어서, 이때 하나 또는 그 이상의 단백질 생물지표는 PCSA, Ago2, CD9 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 단백질을 포함하는, 방법.
  28. 청구항 25에 있어서, 이때 하나 또는 그 이상의 핵산 생물지표는 miR-22, miR-16, miR-148a, miR-92a, miR-451, let7a, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 microRNA를 포함하는, 방법.
  29. 청구항 25에 있어서, 이때 하나 또는 그 이상의 단백질 생물지표는 PCSA 및 Ago2를 포함하고; 그리고 하나 또는 그 이상의 핵산 생물지표는 miR-22를 포함하는, 방법.
  30. 청구항 25에 있어서, 이때 하나 또는 그 이상의 단백질 생물지표는 PCSA 및/또는 CD9를 포함하고; 그리고 하나 또는 그 이상의 핵산 생물지표는 miR-22를 포함하는, 방법.
  31. 청구항 25에 있어서, 이때 하나 또는 그 이상의 단백질 생물지표는 PCSA를 포함하고; 그리고 하나 또는 그 이상의 핵산 생물지표는 임의의 표 22-24에서 선택된 메신져 RNA (mRNA)를 포함하는, 방법.
  32. 청구항 25에 있어서, 이때 이 생물특징은 하나 또는 그 이상의 단백질 생물지표 그리고 하나 또는 그 이상의 핵산 생물지표의 수준의 비율로 산출된 득점을 포함하는, 방법.
  33. 청구항 32에 있어서, 이때 하나 또는 그 이상의 단백질 생물지표는 PCSA 및 PSMA를 포함하고, 그리고 하나 또는 그 이상의 핵산 생물지표는 miR-22 및 let7a를 포함하는, 방법.
  34. 청구항 32에 있어서, 득점을 산출하는 방법은 comprises taking the sum of:
    (a) 미세소낭 하위집단과 연합된 PCSA 단백질의 수준으로 나눈 미세소낭 하위집단에 있는 miR-22 페이로드의 수준의 제 1 배수;
    (b) 미세소낭 하위집단과 연합된 PCSA 단백질의 수준으로 나눈 미세소낭 하위집단에 있는 let7a 페이로드 수준의 제 2 배수; 그리고
    (c) 미세소낭 하위집단과 연합된 PSMA 단백질 수준의 제 3 배수의 총 합에서 취하는 것을 포함하는, 방법.
  35. 청구항 34에 있어서, 이때 득점의 산출은 합계의 단조 변환(monotonic transformation)을 포함하는 방법.
  36. 청구항 34에 있어서, 이때 제 1 배수는 10인, 방법.
  37. 청구항 34에 있어서, 이때 제 2 배수는 10인, 방법.
  38. 청구항 34에 있어서, 이때 제 3배수는 1인, 방법.
  39. 임의의 전술한 항에 있어서, 이 생물특징을 참조 생물특징에 비교하는 것을 더 포함하고, 이때 이러한 비교는 암의 특징화에 이용되는, 방법.
  40. 청구항 39에 있어서, 이때 참조 생물특징은 암이 없는 대상에서 얻은, 방법.
  41. 청구항 39에 있어서, 이때 특징화는 대상에서 암의 존재 또는 위험을 확인하고, 또는 대상에서 암이 전이성 또는 공격성을 확인하는 것을 포함하는, 방법.
  42. 청구항 39에 있어서, 이때 비교 단계는 이 생물특징이 참조 생물특징과 비교하여 변경되었는지를 결정하고, 이로 인하여 암에 대한 예후, 진단 또는 치료진단을 제공하는 것을 포함하는, 방법.
  43. 전술한 임의의 한 항에 있어서, 생물학적 시료는 체액을 포함하는, 방법.
  44. 청구항 43에 있어서, 체액은 말초 혈액, 혈청, 혈장, 복수, 소변, 뇌척수액 (CSF), 객담, 타액, 골수, 활액, 수양액, 양수, 귀지, 모유, 기관지폐포 세척액, 정액, 전립선액, Cowper 유체 또는 사정전 유체, 여성 사정액, 땀, 대변 찌꺼기, 모(hair), 눈물, 낭종 유체, 늑막 및 복막 유체, 심장주변 유체, 림프, 미즙, 유미, 담즙, 간질성 유체, 월경, 고름, 피지, 구토물, 질 분비물, 점막 분비물, 대변 물, 췌액, 비강의 세척액, 기관지 폐 흡출액, 배반포강 유체, 또는 제대혈을 포함하는, 방법.
  45. 전술한 임의의 한 항에 있어서, 생물학적 시료는 소변, 혈액 또는 혈액 유도체들을 포함하는, 방법.
  46. 임의의 청구항 1-43에 있어서, 이때 생물학적 시료는 세포 배양을 포함하는, 방법.
  47. 임의의 청구항 1-43에 있어서, 이때 생물학적 시료는 조직 시료를 포함하는, 방법.
  48. 전술한 임의의 한 항에 있어서, 생물학적 시료는 하나 이상의 미세소낭을 포함하는, 방법.
  49. 청구항 48에 있어서, 하나 이상의 생물지표는 하나 이상의 미세소낭과 연합된, 방법.
  50. 청구항 48에 있어서, 하나 이상의 미세소낭은 20 ㎚ 내지 2000 ㎚의 직경을 보유하는, 방법.
  51. 청구항 48에 있어서, 하나 이상의 미세소낭은 20 ㎚ 내지 200 ㎚의 직경을 보유하는 방법.
  52. 청구항 48에 있어서, 하나 이상의 미세소낭은 크기 압출 크로마토그래피, 밀도 그라디언트 원심분리, 차등 원심분리, 나노막 한외여과, 면역흡착 캡쳐, 친화력정제, 친화력캡쳐, 면역분석, 마이크로유체 분리, 또는 이의 조합들을 거치게 되는, 방법.
  53. 청구항 48에 있어서, 하나 이상의 미세소낭은 하나 이상의 결합제와 접촉하는, 방법.
  54. 청구항 53에 있어서, 하나 이상의 결합제는 핵산, DNA 분자, RNA 분자, 항체, 항체 단편, 압타머들 , 펩토이드, zDNA, 펩티드 핵산 (PNAs), 잠김 핵산 (LNAs), 렉틴, 덴드라이머, 막 단백질 라벨링 물질, 화학 화합물, 또는 이의 조합을 포함하는 방법.
  55. 청구항 53에 있어서, 하나 이상의 결합제는 하나 이상의 미세소낭을 캡쳐 및/또는 탐지하는데 이용하는, 방법.
  56. 청구항 53에 있어서, 하나 이상의 결합제는 하나 이상의 미세소낭에서 하나 이상의 표면 항원에 결합하는, 방법.
  57. 청구항 56에 있어서, 하나 이상의 표면 항원은 하나 이상의 단백질을 포함하는, 방법.
  58. 청구항 57에 있어서, 하나 이상의 단백질은 하나 이상의 CD9, CD63, CD81, PSMA, PCSA, B7H3 및 EpCam을 포함하는, 방법.
  59. 청구항 57에 있어서, 하나 이상의 단백질은 하나 이상의 테트라스패닌, CD9, CD63, CD81, CD63, CD9, CD81, CD82, CD37, CD53, Rab-5b, Annexin V, MFG-E8, 또는 표 3에 있는 단백질을 포함하는, 방법.
  60. 청구항 57에 있어서, 하나 또는 그 이상의 단백질은 표 3-5중 임의의 것에 있는 하나 또는 그 이상의 단백질을 포함하는, 방법.
  61. 청구항 53에 있어서, 하나 이상의 결합제는 하나 이상의 미세소낭을 캡쳐하는데 이용하는, 방법.
  62. 청구항 61에 있어서, 하나 이상의 생물지표는 하나 이상의 캡쳐된 미세소낭 안에 페이로드를 포함하는, 방법.
  63. 청구항 62에 있어서, 페이로드는 하나 이상의 핵산, 펩티드, 단백질, 지질, 항원, 탄수화물, 및/또는 프로테오글리칸을 포함하는, 방법.
  64. 청구항 63에 있어서, 이 핵산은 하나 이상의 DNA, mRNA, microRNA, snoRNA, snRNA, rRNA, tRNA, siRNA, hnRNA, 또는 shRNA를 포함하는, 방법.
  65. 청구항 62에 있어서, 하나 또는 그 이상 생물지표는 mRNA를 포함하는, 방법.
  66. 청구항 39에 있어서, 암은 급성 림프구성 백혈병; 급성 골수성 백혈병; 부신피질 암종; AIDS-관련된 암; AIDS-관련된 임파종; 항문암; 맹장암; 성상세포종; 비정형 유기형/간상 종양; 기저 세포 암종; 방광암; 뇌줄기 교종; 뇌종양 (뇌줄기 교종, 중추 신경계 비정형 유기형/간상 종양, 중추 신경계 배아 종양, 성상세포종, 두개인두종, 뇌실막모세포종, 상의세포종, 수아종, 수질상피종, 중간 분화의 송과체종 종양, 천막상부 원시성 외배엽 종양 및 송과체모세포종을 포함); 유방암; 기관지 종양; Burkitt 임파종; 원발부위 불명 암; 유암종 종양; 원발부위 불명 암의 암종; 중추 신경계 비정형 유기형/간상 종양; 중추 신경계 배아 종양; 경부암; 소아 암; 척색종; 만성림프구성 백혈병; 만성골수성 백혈병; 만성골증식성 장애; 결장암; 직장결장암; 두개인두종; 피부의 T-세포 임파종; 내분비 췌장 섬 세포 종양; 자궁내막암; 뇌실막모세포종; 상의세포종; 식도암; 감각신경모세포종; Ewing 육종; 두개밖 생식 세포 종양; 고환외 생식 세포 종양; 간밖의 담즙 관 암; 쓸개암; 위 암; 위장유암종 종양; 위장기질 세포 종양; 위장기질 종양 (GIST); 임신성 영양막 종양; 신경교종; 모(hair) 세포 백혈병; 두경부암; 심장 암; Hodgkin 임파종; 하인두 암; 안구내 흑색종; 섬 세포 종양; Kaposi 육종; 신장 암; Langerhans 세포 조직구증; 후두 암; 입술 암; 간암; 악성 섬유성 조직구종 골암; 수아종; 수질상피종; 흑색종; Merkel 세포 암종; Merkel 세포 피부 암종; 중피종; 잠복 원발성을 가진 전이성 편평세포 경부암; 구강암; 다중 내분비 신조직형성 증후군; 다중 골수종; 다중 골수종/혈장 세포 신생물; 균상 식육종; 골이형성 증후군; 골증식성 신생물; 비강 암; 비인두 암; 신경아종; 비-Hodgkin 임파종; 비-흑색종 피부 암; 비-소 세포 폐암; 구강 암; 구강 공동 암; 구강인후 암; 골육종; 다른 뇌 및 척수 종양; 난소암; 난소 상피 암; 난소 생식 세포 종양; 난소 악성 가능성이 낮은 종양; 췌장암; 유두종증; 부비동 암; 부갑상선암; 골반 암; 페니스 암; 인두 암; 중간 분화의 송과체종 종양; 송과체모세포종; 뇌하수체 종양; 혈장 세포 신생물/다중 골수종; 폐모세포종; 원발성 중추 신경계 (CNS) 임파종; 원발성 간세포 간암; 전립선암; 직장 암; 신장 암; 신장 세포 (신장) 암; 신장 세포 암; 기도 암; 망막아종; 횡문근육종; 타액선 암; Szary 증후군; 소 세포 폐암; 소장 암; 연조직 육종; 편평 세포 암종; 편평 목 암; 위암; 천막상부 원시성 외배엽 종양; T-세포 임파종; 고환 암; 목 암; 흉선 암종; 가슴샘종; 갑상선암; 과도기성 세포 암; 신장 신우 및 수뇨관의 과도기성 세포암; 영양막 종양; 수뇨관 암; 요도 암; 자궁 암; 자궁 육종; 질 암; 외음부 암; Waldenstrm 매크로글로블린혈증; 또는 Wilm의 종양을 포함하는, 방법.
  67. 청구항 1-6, 9-10 또는 12-38중 임의의 것에 의존적으로 청구항 39에 있어서, 이때 암은 전립선암을 포함하는, 방법.
  68. 청구항 1, 11, 15, 17-22, 25 또는 26중 임의의 것에 의존적으로 청구항 39에 있어서, 이때 암은 폐암을 포함하는, 방법.
  69. 청구항 1, 13, 17-22, 25 또는 26중 임의의 것에 의존적으로 청구항 39에 있어서, 이때 암은 유방암을 포함하는, 방법.
  70. 청구항 1, 14, 17-22, 25 또는 26중 임의의 것에 의존적으로 청구항 39에 있어서, 이때 암은 결장직장암을 포함하는, 방법.
  71. 청구항 1, 7-8, 17-22, 25 또는 26중 임의의 것에 의존적으로 청구항 39에 있어서, 이때 암은 난소암을 포함하는, 방법.
  72. 임의의 전술한 항에 있어서, 이때 이 방법은 시험관에서 실행되는, 방법.
  73. 임의의 전술한 항에 따른 방법을 실행하는 시약의 용도.
  74. 청구항 1 내지 72 중 임의의 한 항에 따른 방법을 실행하기 위한 시약을 포함하는 키트.
  75. 청구항 74에 있어서, 이때 시약은 표 3-5, 9-11, 16- 27, 29 또는 31-32중 임의의 것에 있는 최소한 하나의 생물지표에 결합할 수 있는 결합물질인, 키트.
  76. 단리된 PCSA+ 소낭.
  77. 청구항 76에 있어서, miR-22, let7a, miR-141, miR-182, miR-663, miR-155, mirR-125a-5p, miR-548a-5p, miR-628-5p, miR-517*, miR-450a, miR-920, hsa-miR-619, miR-1913, miR-224*, miR-502-5p, miR-888, miR-376a, miR-542-5p, miR-30b*, miR-1179, 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 microRNA를 포함하는, 소낭.
  78. 청구항 76에 있어서, 임의의 표 20-24으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 메신져 RNA (mRNA)를 포함하는, 소낭.
  79. 다음을 포함하는 조성물:
    (a) 기질에 연결된 제 1 부분, 관심 microRNA 서열에 최소한 75% 상보적인 제 2 부분, 그리고 라벨을 포함하는 제 3부분을 포함하는 올리고뉴클레오티드, 이때 제 2 부분은 제 1 부분과 제 3부분 사이에 위치하고; 그리고
    (b) microRNA.
  80. 청구항 79에 있어서, 이때 기질은 평면 기질, 컬럼, 또는 비드를 포함하는, 조성물.
  81. 청구항 79에 있어서, 이때 올리고뉴클레오티드의 제 2 부분은 (b) microRNA에 최소한 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 상보적인, 조성물.
  82. 청구항 79에 있어서, 이때 올리고뉴클레오티드의 제 2 부분은 관심 microRNA 서열에 최소한 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 상보적인, 조성물.
  83. 청구항 79에 있어서, 이때 올리고뉴클레오티드의 제 3 부분은 간접적으로 라벨된, 조성물.
  84. 청구항 79에 있어서, 이때 올리고뉴클레오티드의 제 3 부분은 바이오티닐화된, 조성물.
  85. 청구항 83에 있어서, 이때 라벨은 스트렙타아비딘을 포함하는, 조성물.
  86. 청구항 79에 있어서, 이때 올리고뉴클레오티드의 제 3 부분의 라벨은 형광 라벨, 방사능라벨 또는 효소 라벨을 포함하는, 조성물.
  87. 청구항 79에 있어서, 이때 라벨은 피코에리틴 (PE)을 포함하는, 조성물.
  88. 청구항 79에 있어서, 이때 올리고뉴클레오티드의 제 3 부분은 직접적으로 라벨된, 조성물.
  89. 청구항 79에 있어서, 이때 (b)의 microRNA는 단백질과 복합체로 존재하는, 조성물.
  90. 청구항 89에 있어서, 이때 단백질은 Argonaute 패밀리 구성요소, Ago1, Ago2, Ago3, Ago4, GW182 (TNRC6A), TNRC6B, TNRC6C, HNRNPA2B1, HNRPAB, ILF2, NCL (Nucleolin), NPM1 (Nucleophosmin), RPL10A, RPL5, RPLP1, RPS12, RPS19, SNRPG, TROVE2, 아포리포단백질, 아포리포단백질 A, apo A-I, apo A-II, apo A-IV, apo A-V, 아포리포단백질 B, apo B48, apo B100, 아포리포단백질 C, apo C-I, apo C-II, apo C-III, apo C-IV, 아포리포단백질 D (ApoD), 아포리포단백질 E (ApoE), 아포리포단백질 H (ApoH), 아포리포단백질 L, APOL1, APOL2, APOL3, APOL4, APOL5, APOL6, 그리고 APOLD1로 구성된 군으로부터 선택된, 방법.
  91. 청구항 89에 있어서, 이때 단백질은 Ago1, Ago2, Ago3 및 Ago4으로 구성된 군으로부터 선택된, 방법.
  92. 청구항 89에 있어서, 이때 단백질은 재조합 단백질을 포함하는, 방법.
  93. 청구항 92에 있어서, 이때 단백질은 Ago2를 포함하는, 방법.
  94. 청구항 79에 있어서, 이때 조성물은 생물학적 시료를 포함하는, 방법.
  95. 청구항 79에 있어서, 이때 microRNA는 생물학적 시료로부터 단리된, 방법.
  96. 청구항 94 또는 95에 있어서, 이때 생물학적 시료는 체액을 포함하는, 방법.
  97. 청구항 96에 있어서, 체액은 말초 혈액, 혈청, 혈장, 복수, 소변, 뇌척수액 (CSF), 객담, 타액, 골수, 활액, 수양액, 양수, 귀지, 모유, 기관지폐포 세척액, 정액, 전립선액, Cowper 유체 또는 사정전 유체, 여성 사정액, 땀, 대변 찌꺼기, 모(hair), 눈물, 낭종 유체, 늑막 및 복막 유체, 심장주변 유체, 림프, 미즙, 유미, 담즙, 간질성 유체, 월경, 고름, 피지, 구토물, 질 분비물, 점막 분비물, 대변 물, 췌액, 비강의 세척액, 기관지 폐 흡출액, 배반포강 유체, 또는 제대혈을 포함하는, 방법.
  98. 청구항 96에 있어서, 이때 체액은 소변, 혈액 또는 혈액 유도체를 포함하는 방법.
  99. 청구항 95에 있어서, 이때 microRNA는 단백질과 복합체로 단리되는, 방법.
  100. 다음을 포함하는 방법:
    (i) 임의의 청구항 79-99의 조성물을 제공하고;
    (ii) 올리고뉴클레오티드에 microRNA가 결합되는 것을 허용하는 조건하에 조성물을 항온처리하고; 그리고
    (iii) 기질로부터 절단된 라벨의 양을 탐지한다.
  101. 청구항 100에 있어서, 이때 기질로부터 절단된 라벨의 양을 탐지하는 것은 (iii) 단계 전과 후에 기질과 접촉된 라벨의 양을 탐지하는 것을 포함하는, 방법.
  102. 청구항 100에 있어서, 이때 기질로부터 절단된 라벨의 양은 microRNA와 복합된 단백질의 존재를 나타내는, 방법.
  103. 청구항 102에 있어서, 이때 단백질은 Ago1, Ago2, Ago3 및 Ago4로 구성된 군으로부터 선택된, 방법.
  104. 청구항 100에 있어서, 이때 기질로부터 절단된 라벨의 양은 실시간으로 관찰되는, 방법.
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