CN110408694A - 评估替莫唑胺在治疗脑胶质瘤患者的敏感性的新方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及评估替莫唑胺在治疗脑胶质瘤患者的敏感性的新方法，采用多种基因标记物对化疗药物进行敏感性评估，包括以下步骤：测定样本的基因标记物状态；根据基因标记物状态参数实现样本对替莫唑胺的敏感性进行评估。本发明提供了引物组和试剂在基因标记物的甲基化情况，相对表达量的联合判别方法中的应用。通过上述方法计算的结果，可以更好的对脑胶质瘤治疗中替莫唑胺的敏感性进行评估。
Description
技术领域
本发明属于脑胶质瘤治疗与诊断技术领域，特别涉及一种用于对脑胶质瘤替莫唑胺治疗效果和敏感性评估的联合基因标志物，以及检测该联合标记物的检测试剂盒和敏感性评估标准。
背景技术
脑胶质瘤是最常见的神经系统恶性肿瘤，简单的分为四个级别。WHO I的良性肿瘤，WHO II为低度恶性，WHO III和IV级为高度恶性。胶质瘤呈浸润性生长，恶性程度高、患者预后差。其中WHO IV胶质母细胞瘤是胶质瘤中最恶的一种，它的中位生存时间仅14.6个月。目前脑胶质瘤的标准治疗是手术(在保护功能的情况下，尽量全切)和同步放化疗和辅助化疗。替莫唑胺(TMZ)是目前最常用的烷化剂的化疗药物。
TMZ是一种新型的口服二代烷化剂咪唑四嗪类衍生物(分子量为194.15)。TMZ作为前体药物，不需要经过肝脏代谢，在生理pH值条件下，经非酶催化快速转变为活性化合物5-(3-甲基三嗪-1-基)咪唑-4-酰胺(MTIC)，然后进一步分解为5-氨基-咪唑-4-酰胺(AIC)与重氮甲烷。TMZ是通过损伤肿瘤细胞的DNA，来杀死肿瘤。TMZ引起的DNA损伤主要发生在鸟嘌呤的O6和N7，以及腺嘌呤的N3位置上。因为在DNA复制过程中，错配修复系统虽能识别错误配对的碱基对，但不能为第6位氧原子甲基鸟嘌呤找到配对碱基，因此子链DNA有缺口形成，缺口随细胞分裂而逐渐积累，最终阻碍细胞复制启动，从而使细胞周期停滞在G2-M期发生细胞死亡；还可使细胞DNA的单链或双链断裂，阻断DNA的复制而抑制肿瘤生长。
TMZ在恶性脑胶质瘤的治疗中已经得到了广泛的认可和应用，但肿瘤对药物的敏感性是影响化疗效果的重要因素之一。其中，DNA修复酶——O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT)在胶质瘤组织中的表达与肿瘤对TMZ的敏感性相关，其机制为，MGMT是唯一能将O6鸟嘌呤复合物从DNA上移除的蛋白，可在突变前中和这种损伤作用。MGMT主要通过不可逆地将烷化基团从O6-mG转移到MGMT蛋白145位的半胱氨酸残基上，而保护细胞免受TMZ的损伤。在这一过程中，MGMT不需要辅助因子和其它蛋白质的参与，同一蛋白即作为甲基转移酶，又作为甲基受体蛋白。同时，MGMT蛋白反应位点被烷化基团不可逆结合而失活，故该反应又称自杀反应。细胞对于DNA鸟嘌呤O6上烷化基团的修复能力取决于MGMT在细胞内的含量，而MGMT基因启动区的甲基化状态是决定MGMT表达的主要因素。因此，检测MGMT基因启动区甲基化情况，已经作为临床上评价脑胶质瘤患者对TMZ药物敏感性主要手段。
然而，随着研究的不断深入，临床上发现，即使对于MGMT基因启动区甲基化程度类似的脑胶质瘤患者，其对TMZ的敏感性仍然存在一定程度的个体化差异。而其本质原因，是由于除了MGMT参与的DNA修复机制外，还存在其它DNA修复机制，能够影响TMZ的治疗效果。其中DNA碱基切除修复(base excision repair，BER)途径就是重要的通路之一。BER途径有一系列酶催化，其中N3-甲基化嘌呤糖基化酶(MPG)是该途径的启动酶，正常情况下仅在细胞核中起作用，其底物包括3-甲基腺嘌呤，7-甲基腺嘌呤，N6-乙烯基腺嘌呤，7-甲基鸟嘌呤，3-甲基鸟嘌呤，次黄嘌呤，O8-鸟嘌呤等。它负责识别并将受损的碱基从DNA链上切除，留下的脱嘌呤(AP)位点在下游其它酶的催化下，连接上正确的碱基，从而完成对DNA损伤的修复。MPG的过表达会提高BER途经的活性，使肿瘤细胞对TMZ的敏感性降低。另外，DNA修复蛋白人类AlkB同系物2(ALKBH2)也被认为可以参与TMZ细胞毒性的修复作用当中。ALKBH2是一种氧化脱甲基酶，它能够直接地去除双链或单链DNA中的N1-甲基腺嘌呤和N3-甲基胞嘧啶的损伤。ALKBH2仅存在于细胞核中，其通过与增值细胞核抗原形成复合物，主要在细胞周期的S期发挥作用，被认为在靠近复制叉的DNA修复过程中起重要作用。当ALKBH2高表达时，能够增强N1-甲基腺嘌呤和N3-甲基胞嘧啶的损伤修复，进而降低TMZ的对肿瘤细胞的毒性作用。
综上，如图14所示，TMZ通过对鸟嘌呤的O6和N7以及腺嘌呤的N3位置上的甲基化修饰造成DNA损伤，目前仅仅通过检测能够修复O6位置的MGMT的甲基化程度，来评估对TMZ的敏感性是不够准确的。本发明从TMZ细胞毒性的三个方面，选择三个主要基因标记物，通过实验方法联合检测，能够更全面、更准确的评估TMZ的用药敏感性和治疗的有效性。
发明内容
针对上述技术不足，本发明提供了可以用于脑胶质瘤化疗过程中对替莫唑胺敏感性进行预评估的基因标记物组合，该基因标记物是由MGMT(O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶)基因，MPG(N3-甲基腺嘌呤转葡糖激酶)基因，ALKBH2(大肠杆菌AlkB人同系物2)基因组成，可以应用于替莫唑胺敏感性的评估；同时，本发明还提供了应用与评估的引物组和试剂；本发明还提供了上述引物组和试剂在基因标记在甲基化情况，相对表达量的联合判别方法中的应用。通过上述方法计算的结果，可以更好的对脑胶质瘤治疗中替莫唑胺的敏感性进行评估。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：评估替莫唑胺在治疗脑胶质瘤患者的敏感性的新方法，采用多种基因标记物对化疗药物进行敏感性评估，包括以下步骤：
测定样本的基因标记物状态；
根据基因标记物状态参数实现样本对替莫唑胺的敏感性进行评估。所述基因标记物包括MGMT基因，MPG基因和ALKBH2基因，以及内参基因GAPDH。
所述测定样本的基因标记物状态指分别测定样本的MGMT基因启动区甲基化，MPG基因表达和ALKBH2基因表达。
所述化疗药物是替莫唑胺。
采用检测联合基因标记物的试剂。
所述的试剂中包括：
用于检测MGMT基因甲基化程度的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示；
用于检测MPG基因表达的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3-4所示；
用于检测ALKBH2基因表达的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5-6所示；
用于扩增内参GAPDH基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7-8所示。
采用包括所述试剂的试剂盒，所述试剂盒在脑胶质瘤替莫唑胺敏感性评估中的应用。
所述试剂在脑胶质瘤替莫唑胺敏感性评估用试剂盒中的应用。
所述根据基因标记物状态参数实现样本对替莫唑胺的敏感性进行评估，具体如下：
将MGMT基因启动区甲基化根据设定值分为非甲基化和甲基化；
分别在非甲基化和甲基化两部分中比较MPG基因表达的参数ΔCqM是否高于阈值A，并分别得到ΔCqM高、ΔCqM低部分；
在非甲基化或甲基化中的ΔCqM高、ΔCqM低部分中比较ALKBH2基因表达的参数ΔCqA是否高于阈值B，并分别得到ΔCqA高、ΔCqA低部分；
依次以MGMT基因启动区、MPG基因表达、ALKBH2基因表达为从高至低的优先级；设定非甲基化和甲基化为从高至低的顺序，分别按照优先级对非甲基化和甲基化中的MPG基因表达的参数ΔCqM、ALKBH2基因表达的参数ΔCqA进行从高至低的排序并分级；该排序表示样本对替莫唑胺的敏感性从不敏感至敏感的过渡，每级表示某一敏感度。
ΔCqM＝CqMPG-CqGAPDH
ΔCqA＝CqALKBH2-CqGAPDH
其中，ΔCqM、ΔCqA分别表示CqMPG、CqALKBH2与CqGAPDH的差值；CqMPG、CqALKBH2、CqGAPDH分别表示基因MPG、ALKBH2、GAPDH在QPCR反应中扩增曲线呈指数增长时对应的循环数，是反应样本中目的基因拷贝数原始量的指标。
本发明具有以下有益效果及优点：
本发明提供了可以用于脑胶质瘤化疗过程中对替莫唑胺敏感性进行预评估的基因标记物组合，该基因标记物是由MGMT(O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶)基因，MPG(N3-甲基腺嘌呤转葡糖激酶)基因，ALKBH2(大肠杆菌AlkB人同系物2)基因组成，可以应用于替莫唑胺敏感性的评估；同时，本发明还提供了应用与评估的引物组和试剂；本发明还提供了上述引物组和试剂在基因标记在甲基化情况，相对表达量的联合判别方法中的应用。相对于传统只检测MGMT甲基化来评估TMZ敏感性的方法，本发明从TMZ细胞毒性的三个方面，选择三个主要基因标记物，通过上述方法计算的结果，能够更全面、更准确的评估TMZ的用药敏感性和治疗的有效性。
附图说明
图1是样本1，2，3，8号MGMT启动区甲基化情况结果，其中箭头所指百分数是甲基化比例标准品所在位置；
图2是样本4号MGMT启动区甲基化情况结果；
图3是样本5号MGMT启动区甲基化情况结果；
图4是样本6号MGMT启动区甲基化情况结果；
图5是样本7号MGMT启动区甲基化情况结果；
图6是1-8号样本MPG相对表达情况；
图7是1-8号样本ALKBH2相对表达情况；
图8是30例样本实测TMZ敏感程度与生存期(月)生存曲线；
图9a是当取生存期大于等于12个月为TMZ敏感阳性时，本发明方法的ROC曲线坐标；
图9b是当取生存期大于等于12个月为TMZ敏感阳性时，本发明方法的ROC曲线；
图10a是当取生存期大于等于13个月为TMZ敏感阳性时，本发明方法的ROC曲线坐标；
图10b是当取生存期大于等于13个月为TMZ敏感阳性时，本发明方法的ROC曲线；
图11a是当取生存期大于等于14个月为TMZ敏感阳性时，本发明方法的ROC曲线坐标；
图11b是当取生存期大于等于14个月为TMZ敏感阳性时，本发明方法的ROC曲线；
图12a是当取生存期大于等于16个月为TMZ敏感阳性时，本发明方法的ROC曲线坐标；
图12b是当取生存期大于等于16个月为TMZ敏感阳性时，本发明方法的ROC曲线；
图13a是当取生存期大于等于17个月为TMZ敏感阳性时，本发明方法的ROC曲线坐标；
图13b是当取生存期大于等于17个月为TMZ敏感阳性时，本发明方法的ROC曲线；
图14是替莫唑胺细胞毒性的分子机制。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明。
本发明提供了可以用于脑胶质瘤化疗过程中对替莫唑胺敏感性进行预评估的基因标记物组合，该基因标记物是由MGMT(O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶)基因，MPG(N3-甲基腺嘌呤转葡糖激酶)基因，ALKBH2(大肠杆菌AlkB同系物2)基因组成，可以应用于替莫唑胺敏感性的评估；同时，本发明还提供了应用与评估的引物组和试剂；本发明还提供了上述引物组和试剂在基因标记物的甲基化情况，相对表达量的联合判别方法中的应用。通过上述方法计算的结果，可以更好的对脑胶质瘤治疗中替莫唑胺的敏感性进行评估。
本发明的第一个方面：
一种用于脑胶质瘤治疗中对化疗药物敏感性评估的联合基因标记物，包括MGMT基因，MPG基因和ALKBH2基因，以及内参基因GAPDH。
所述的用于脑胶质瘤治疗中化疗药物是指替莫唑胺治疗。
本发明的第二个方面：
用于对上述的联合基因标记物进行检测的试剂。
所述的试剂中包括：
用于检测MGMT基因甲基化程度的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示；
SEQ ID NO.1：5’-GGATATGTTGGGATAGTT-3’
SEQ ID NO.2：5’-CCCAAACACTCACCAAAT-3’
用于检测MPG基因表达的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3-4所示；
SEQ ID NO.3：5’-GTCCTAGTCCGGCGACTTCC-3’
SEQ ID NO.4：5’-CTTGTCTGGGCAGGCCCTTTGC-3’
用于检测ALKBH2基因表达的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5-6所示；
SEQ ID NO.5：5’-GCTGGGCTGACCTACACATT-3’
SEQ ID NO.6：5’-TGCCGGAAGACAAAGTCTCT-3’
用于扩增内参GAPDH基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7-8所示
SEQ ID NO.7：5’-AGATCATCAGCAATGCCTCCT-3’
SEQ ID NO.8：5’-GGTCATGAGTCCTTCCACGA-3’
包括有上述的试剂的试剂盒。
上述的试剂在制备脑胶质瘤替莫唑胺敏感性评估用试剂盒中的应用。
本发明的第三个方面：
一种用于上述基因联合标记物检测结果判读标准的应用：
上述的应用，是指分别测定样本的MGMT基因启动区甲基化，MPG基因表达和ALKBH2基因表达，按照如下评判标准，样本对替莫唑胺的敏感性进行分级，见表1：
表1样本对替莫唑胺的敏感性的分级
上述的评判标准，其中的参数是指：
ΔCqM＝CqMPG-CqGAPDH；
ΔCqA＝CqALKBH2-CqGAPDH。
实施例1
我们选择了8例脑胶质瘤临床样本，样本为肿瘤组织块，应用本发明所述方法，对8例样本TMZ敏感性进行检测和评价。
●MGMT基因甲基化水平检测
1.样本DNA提取：
取3mm*3mm大小组织块样本，放入2ml EP管，使用AxyPrep基因组DNA小量制备试剂盒，按照试剂盒说明书进行DNA提取。
2.样本DNA重亚硫酸盐处理及纯化：
取适量步骤1提取的样本DNA，使用EpiTectPlus DNA Bisulfite Kit试剂盒，按照试剂盒说明书进行DNA重亚硫酸盐处理及纯化。
3.高分辨率熔解曲线法检测样本MGMT甲基化情况：
i.引物溶解：将装有引物干粉的离心管短暂离心，加入相应的蒸馏水溶解为100uM，涡旋混匀，短暂离心，保存于-20℃，避免反复冻融。
ii.引物稀释：将溶解后的引物稀释为10uM，并分装保存于-20℃，避免反复冻融。
iii.将所有模板稀释至均一浓度20ng/ul。
iv.准备好所需要的引物、处理后DNA、HRM试剂(Precision Melt Supermix，Bio-Rad)、ddH2O，计算所需要的引物总量、反应混合液总量和水的总量。
v.将引物与反应混合液、ddH2O按所需量加入同一离心管中。
vi.涡旋离心，将混合液按等量分别加至八连管或96孔板中。
加入等量的模板至反应混合液中，离心，去掉液体中的气泡并使液体集中于管底部，反应体系如下，放置于qPCR仪中。见表2：
表2反应体系
| 成分 | 体积(ul) | 终浓度 |
| HRM试剂 | 7.5 | 1x |
| 引物 | 0.6*2 | 400nM(each primer) |
| ddH2O | 5.3 | -- |
| 处理后DNA | 1 | 20ng |
| 总体积 | 15 |
vii.设置反应程序，如表3：
表3反应程序
viii.设置反应孔的引物模板等信息，然后运行程序。
ix.应用Bio-Rad Precision Melt Analysis软件进行结果分析，结果如表4(实验结果如图1-图5所示)：
表4结果分析
| 样本编号 | 检测结果 |
| 1 | 非甲基化 |
| 2 | 非甲基化 |
| 3 | 非甲基化 |
| 4 | 甲基化阳性 |
| 5 | 甲基化阳性 |
| 6 | 甲基化阳性 |
| 7 | 甲基化阳性 |
| 8 | 非甲基化 |
●MPG基因和ALKBH2基因表达检测
1.样本RNA提取：
i.取50-100mg组织置1.5ml离心管中，加入1ml TRLzol充分匀浆，室温静置5min。
ii.加入0.2ml氯仿(1：5)手动颠倒混匀15s(30次)，室温静置3min。
iii.4℃离心，13000g，15min，样品会分三层：红色有机相，中间层和上层无色水相，RNA主要在水相中，把水相(约600ul)转移到新管中。
iv.加入等体积异丙醇，将管中液体上下颠倒混匀，室温静置10min或-20℃放置20-30min。
v.4℃离心，13000g，15min，弃上清。
vi.加入500ul 75％乙醇(DEPC水处理过的水配制)，轻轻洗涤沉淀(没使用1mlTRLzol至少加500ul乙醇)。4℃，7500g，5min，弃上清。
vii.晾干，加入适量的DEPC H2O溶解(20-30ul)。
2.样本RNA逆转录：
样本提取好的RNA，使用PrimeScriptTM RT reagent Kit(TAKARA)试剂盒，按照试剂盒说明书进行逆转录。
3.QPCR方法检测MPG基因和ALKBH2基因表达：
i.iTaq Universal SYBR Green supermix及其它反应试剂室温解冻，充分混合，瞬时离心，冰上避光备用。
ii.在室温或冰上准备足够量的反应混合液(包括iTaq Universal SYBR Greensupermix，水，引物)，按引物不同分成若干管。具体量如表5：
表5反应混合液量
| 成分 | 体积(ul) | 终浓度 |
| SYBR Green Mix | 5 | - |
| Primers | 0.25*2 | 250nM |
| DNA template | 1 | gDNA:50ng-50pg |
| H<sub>2</sub>O | 3.5 | - |
| 总体积 | 10 | - |
iii.彻底混匀反应混合液，按事先设计好的位置加入到8联管或孔板中。使用校准过的移液枪及专业人员，确保分析精密准确。
iv.按事先设计好的位置加入DNA模板，盖好盖子，保证盖子上的洁净。充分混合(弹几下)，瞬时离心，将整个反应体系收集的管底部。
v.将8联管或孔板放入仪器，注意位置要与设计的一致，盖好仪器盖。运行仪器操作软件，热循环反应如表6，设置各孔信息。
表6热循环反应
i.应用CFX-Manager分析软件进行结果分析，结果如下表7，(实验结果如图6、图7所示)：
表7结果分析
图6，1-8号样本MPG相对表达情况
图7，1-8号样本ALKBH2相对表达情况
●根据本发明提供的算法，评估样本的TMZ敏感性见表8：
表8样本的TMZ敏感性
实施例2
选取近两年收集的脑胶质瘤样本30例，入组条件：病理学确认样本为WHOⅢ-Ⅳ恶性脑胶质瘤，样本来源患者均接受手术及术后同步放化疗(60Gy每次2Gy,一共30次，化疗同步75mg/㎡)，再加528化疗方案(28天给5天药150mg/㎡)6个周期。以最终生存期评价TMZ的敏感性治疗效果，分别计算生存期大于等于12，13，14个月为TMZ敏感时，本发明的准确性。
30例样本检测结果如表9：
表9样本检测结果
以敏感程度(最不敏感，不敏感，次敏感，最敏感)为分组标准，使用Kaplan-Meier法做生存函数图，计算本发明方法与生存期的符合程度(如图8所示)；分别计算生存期大于等于12，13，14，16个月(所选样本中不含生存期为15个月的样本)为TMZ敏感时，本发明的敏感度和特异性，使用SPSS软件做ROC曲线。结果如下：
生存期大于等于12个月为TMZ敏感时，本发明敏感性为85.7％，特异性为100％，传统方法敏感性为92.9％，特异性为81.2％；(如图9a、9b所示)
生存期大于等于13个月为TMZ敏感时，本发明敏感性为92.3％，特异性为100％，传统方法敏感性为92.3％，特异性为76.5％；(如图10a、10b所示)
生存期大于等于14个月为TMZ敏感时，本发明敏感性为100％，特异性为100％，传统方法敏感性为100％，特异性为77.8％；(如图11a、11b所示)
生存期大于等于16个月为TMZ敏感时，本发明敏感性为100％，特异性为94.7％，传统方法敏感性为100％，特异性为73.7％；(如图12a、12b所示)
由ROC曲线可知，无论取生存期大于等于12，13，14，16个月为TMZ敏感阳性时，本发明的算法(敏感度大于等于6级为阳性)始终距离左上角最近(如图9a、图9b～图12a、图12b)，可知本算法相比传统评估标准更加准确。
另外，当取生存期大于等于10，11个月为TMZ敏感阳性时，可将本发明的TMZ敏感性判读阳性标准调整为大于等于5级，此时，本发明与传统方法具有同等效力。当取生存期大于等于17个月为TMZ敏感阳性时，可将本发明的TMZ敏感性判读阳性标准调整为大于等于7级，此时，本发明的特异性将远超传统方法(如图13a、13b所示)。
综上，本发明提供的TMZ敏感性评估方法，是在传统方法基础上，增加了两个相关基因标记，从而使原来非是即否的判读，升级成动态判读，可以根据不同患者实际状态预估的TMZ有效性生存期不同，更加准确地评估患者对TMZ的敏感程度，为临床用药提供参考。
序列表
<110> 胤安国际（辽宁）基因科技股份有限公司
<120> 评估替莫唑胺在治疗脑胶质瘤患者的敏感性的新方法
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggatatgttg ggatagtt 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cccaaacact caccaaat 18
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtcctagtcc ggcgacttcc 20
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cttgtctggg caggcccttt gc 22
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gctgggctga cctacacatt 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgccggaaga caaagtctct 20
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agatcatcag caatgcctcc t 21
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggtcatgagt ccttccacga 20
Claims (10)
1.评估替莫唑胺在治疗脑胶质瘤患者的敏感性的新方法，其特征在于，采用多种基因标记物对化疗药物进行敏感性评估，包括以下步骤：
测定样本的基因标记物状态；
根据基因标记物状态参数实现样本对替莫唑胺的敏感性进行评估。
2.根据权利要求1所述的评估替莫唑胺在治疗脑胶质瘤患者的敏感性的新方法，其特征在于，所述基因标记物包括MGMT基因，MPG基因和ALKBH2基因，以及内参基因GAPDH。
3.根据权利要求1所述的评估替莫唑胺在治疗脑胶质瘤患者的敏感性的新方法，其特征在于，所述测定样本的基因标记物状态指分别测定样本的MGMT基因启动区甲基化，MPG基因表达和ALKBH2基因表达。
4.根据权利要求1所述的评估替莫唑胺在治疗脑胶质瘤患者的敏感性的新方法，其特征在于，所述化疗药物是替莫唑胺。
5.根据权利要求1所述的评估替莫唑胺在治疗脑胶质瘤患者的敏感性的新方法，其特征在于，采用检测联合基因标记物的试剂。
6.根据权利要求5所述的评估替莫唑胺在治疗脑胶质瘤患者的敏感性的新方法，其特征在于，所述的试剂中包括：
用于检测MGMT基因甲基化程度的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示；
用于检测MPG基因表达的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3-4所示；
用于检测ALKBH2基因表达的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5-6所示；
用于扩增内参GAPDH基因的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7-8所示。
7.根据权利要求5所述的评估替莫唑胺在治疗脑胶质瘤患者的敏感性的新方法，其特征在于，采用包括所述试剂的试剂盒，所述试剂盒在脑胶质瘤替莫唑胺敏感性评估中的应用。
8.根据权利要求5所述的评估替莫唑胺在治疗脑胶质瘤患者的敏感性的新方法，其特征在于，所述试剂在脑胶质瘤替莫唑胺敏感性评估用试剂盒中的应用。
9.根据权利要求1所述的评估替莫唑胺在治疗脑胶质瘤患者的敏感性的新方法，其特征在于，所述根据基因标记物状态参数实现样本对替莫唑胺的敏感性进行评估，具体如下：
将MGMT基因启动区甲基化根据设定值分为非甲基化和甲基化；
分别在非甲基化和甲基化两部分中比较MPG基因表达的参数ΔCqM是否高于阈值A，并分别得到ΔCqM高、ΔCqM低部分；
在非甲基化或甲基化中的ΔCqM高、ΔCqM低部分中比较ALKBH2基因表达的参数ΔCqA是否高于阈值B，并分别得到ΔCqA高、ΔCqA低部分；
依次以MGMT基因启动区、MPG基因表达、ALKBH2基因表达为从高至低的优先级；设定非甲基化和甲基化为从高至低的顺序，分别按照优先级对非甲基化和甲基化中的MPG基因表达的参数ΔCqM、ALKBH2基因表达的参数ΔCqA进行从高至低的排序并分级；该排序表示样本对替莫唑胺的敏感性从不敏感至敏感的过渡，每级表示某一敏感度。
10.根据权利要求9所述的评估替莫唑胺在治疗脑胶质瘤患者的敏感性的新方法，其特征在于，
ΔCqM＝CqMPG-CqGAPDH
ΔCqA＝CqALKBH2-CqGAPDH
其中，ΔCqM、ΔCqA分别表示CqMPG、CqALKBH2与CqGAPDH的差值；CqMPG、CqALKBH2、CqGAPDH分别表示基因MPG、ALKBH2、GAPDH在QPCR反应中扩增曲线呈指数增长时对应的循环数，是反应样本中目的基因拷贝数原始量的指标。
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Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101098696A (zh) * | 2004-11-09 | 2008-01-02 | 先灵公司 | 基于患者mgmt水平来治疗癌症的替莫唑胺的改进给药方案 |
| WO2009007677A2 (en) * | 2007-07-06 | 2009-01-15 | Stichting Het Nederlands Kanker Instituut | Anti-tumour methods |
| US20110245309A1 (en) * | 2010-04-02 | 2011-10-06 | University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education | N-methylpurine dna glycosylase and polymerase beta as biomarkers for alkylator chemotherapy potentiation |
| US20130296407A1 (en) * | 2011-01-18 | 2013-11-07 | Ark Therapeutics, Ltd. | Combination Therapy for Cancer |
| CN103797131A (zh) * | 2011-06-16 | 2014-05-14 | 卡里斯生命科学卢森堡控股有限责任公司 | 生物标志物组合物和方法 |
-
2018
- 2018-05-10 CN CN201810441729.0A patent/CN110408694A/zh active Pending
Patent Citations (5)
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