CN100494398C - 测定谷胱甘肽-S-转移酶π表达水平的方法 - Google Patents

测定谷胱甘肽-S-转移酶π表达水平的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN100494398C
CN100494398C CNB028157982A CN02815798A CN100494398C CN 100494398 C CN100494398 C CN 100494398C CN B028157982 A CNB028157982 A CN B028157982A CN 02815798 A CN02815798 A CN 02815798A CN 100494398 C CN100494398 C CN 100494398C
Authority
CN
China
Prior art keywords
gst
sample
mrna
rna
expression
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CNB028157982A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1541277A (zh
Inventor
K·D·达南伯格
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Response Genetics Inc
Original Assignee
Response Genetics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Response Genetics Inc filed Critical Response Genetics Inc
Publication of CN1541277A publication Critical patent/CN1541277A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN100494398C publication Critical patent/CN100494398C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
    • C12N9/1088—Glutathione transferase (2.5.1.18)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/24—Heavy metals; Compounds thereof
    • A61K33/243—Platinum; Compounds thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y205/00—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5)
    • C12Y205/01—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5) transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5.1)
    • C12Y205/01018—Glutathione transferase (2.5.1.18)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明涉及可用于医学、特别是癌症化疗的预测方法。本发明的目的是提供一种用于评价固定或固定及石蜡包埋组织中的GST-π表达水平的方法，并且通过检查患者肿瘤细胞中GST-πmRNA含量并将其与预定阈值表达水平进行比较，预测患者肿瘤对用基于铂的疗法的可能抗性或敏感性。更准确地讲，本发明提供寡核苷酸引物对GST-π和包括其用于检测GST-πmRNA水平的方法。

Description

测定谷胱甘肽-S-转移酶π表达水平的方法
发明领域
本发明涉及可用于医学、特别是癌症化疗的预测方法。更准确地讲，本发明涉及对患者肿瘤细胞基因表达的评价。通过检查人类参与DNA修复的基因所表达的mRNA，分析肿瘤细胞对靶向DNA的化疗药、尤其是以铂类药物的方式损伤DNA的药物的抗性。
发明背景
当正常细胞经历致瘤性转化并变成恶性细胞时，引起癌症。转化(恶性)细胞逃避特化细胞表型和抑制细胞增殖的正常生理控制。个体中的转化细胞如此增殖，形成肿瘤。当肿瘤被发现时，临床目标是在经过治疗的个体中选择性地消灭恶性细胞，同时减轻对正常细胞所造成的任何损害。
化学疗法基于应用对癌细胞有选择性毒性(细胞毒性)的药物。已开发出几个大类的化疗药，包括干扰核酸合成、蛋白质合成和其它生命代谢过程的药物。这些药物统称为抗代谢药。其它类的化疗药对细胞DNA造成损伤。这些种类的药物统称为基因毒物。然而，常常只有在治疗的试验期后，才可以对个体肿瘤对所需化疗药或联合药物的敏感性进行准确评价。不成功试验期中所用去的时间对在攻击性恶性肿瘤的临床处理造成相当大的危险。
对细胞DNA损伤的修复是一个由细胞酶促DNA修复机制进行的一个重要的生物学过程。细胞基因组中未修复的损伤妨碍DNA复制、削弱新合成DNA的复制保真度和/或阻碍细胞存活所需的基因表达。因此，基因毒性药物一般认为对进入DNA合成的活跃的分裂细胞比对休眠的非分裂细胞的毒性更大。许多机体组织的正常细胞是休眠细胞且通常不再进入细胞周期和分裂。一般而言，细胞分裂期之间的较长时间，给受化疗基因毒素影响的正常细胞的DNA损伤修复提供了时间。结果，达到对杀伤癌细胞的一定选择性。通过共同给予属于这些大类的两种或两种以上的化疗药，许多治疗方案反映出试图改进对癌细胞的选择性。
因为实体瘤中有效的化学疗法通常需要联合药物，对各单一药物的抗性或敏感性的决定因子的鉴定或定量已变成用以设计各种联合化疗的重要工具。
已经表明两种广泛使用的损伤细胞DNA的基因毒性抗癌药是顺铂(DDP)和卡铂。顺铂和/或卡铂目前选择性用于治疗上皮和间充质来源的不同肿瘤，包括呼吸道、胃肠道和生殖道的癌症或肉瘤，此外这两种药还用于中枢神经系统以及头颈部鳞状细胞来源的不同肿瘤。对于睾丸癌的治疗，目前优选顺铂与其它药物联合使用，并且在许多情况下，产生持续缓解。(Loehrer等，1984，100 Ann.Int.Med.704)。顺铂(DDP)通过形成链内加合物而破坏DNA结构。对铂类药物例如DDP的抗性归因于对铂加合物的耐受性增强、药物累积减少或DNA修复增加。虽然对DDP的抗性是多种多样的，但是DNA修复机制的改变可能起重要的作用。
谷胱甘肽-S-转移酶(GST)蛋白家族参与细胞毒性药物的解毒作用。通过催化毒性和致癌亲电分子与谷胱甘肽的缀合，所述GST酶保护细胞大分子免遭损伤(Boyer等，Preparation，characterization andproperties of glutathione S-transferases(谷胱甘肽S-转移酶的制备、表征和特性).载于：Zakim D，Vessey D(编著)Biochemical Pharmacologyand Toxicology.New York，NY：John Wiley and Sons，1985.)。这些蛋白的一种确定的异构类型谷胱甘肽S-转移酶Pi(GST-Pi，在本文也称为GSTP1或GST-π，并可互换使用)在人上皮组织中广泛表达，并且已经证明在数种肿瘤中过量表达(Terrier等，Am J Pathol 1990；137：845-853；Moscow等，Cancer Res 1989；49：1422-1428)。已经发现，GST-π水平在抗药性肿瘤中增加，虽然确切机制仍不清楚(Tsuchida等，CritRev Biochem Mol Biol 1992；27：337-384)。以前的研究已经表明，GST蛋白(不是mRNA)的低表达与对基于铂的化疗的反应相关(Nishimura等，Cancer.Clin Cancer Res 1996；2：1859-1865；Tominaga等，Am.J.Gastro.94：1664-1668，1999；Kase等，Acta Cytologia.42：1397-1402，1998)。然而，这些研究并没有定量测量基因表达，而是使用半定量免疫组织化学染色法测量蛋白质水平。然而，需要GST-π基因表达的定量测量，以实现非常有效的预测。
对大多数病理样品进行常规固定及石蜡包埋(FPE)，以进行组织学分析和后续建档贮藏。因此，因为这样的研究需要RNA的高度完整性，以便可以对基因表达进行准确测量，所以大多数活检组织样品不可用于基因表达的分析。目前，通过使用监测蛋白表达水平的免疫组织化学染色，仅可以定量监测这种固定和包埋样品中的基因表达水平。
迄今为止，包括GST-π表达在内的定量基因表达研究一直局限于通过逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增来自新鲜或冷冻组织的RNA。
医学专业人员使用冷冻组织相当不方便。当计划进行任何基于RNA的定量遗传标记测定时，首要关注的是活检组织的快速传递，以避免组织和后续mRNA降解。进行活组织检查的医学专业人员必须在一收到组织样品就马上将其送到准备好的设备上立即实施RNA提取方案。如果没有这样的设备可利用，则临床医师必须迅速地将样品冷冻，以防止mRNA降解。为了诊断设备在组织和RNA降解前实施有效的RNA提取方案，组织样品必须保持冷冻状态，直至其达到诊断设备，然而所述设备可能在很远的地方。在运输过程中用装有液氮和干冰的专用设备来保持冷冻组织的完整性造成花费巨大。
常规活组织检查一般包括基质组织和瘤性组织的不均一混合物。与新鲜或冷冻组织不同，FPE活检组织样品容易地进行显微解剖并且分成基质组织和肿瘤组织，因此具有优于利用新鲜或冷冻组织的优点。然而，从固定组织、尤其是固石蜡包埋组织中分离RNA导致RNA高度降解，因而一般不适合进行基因表达研究。
有许多技术用于从生物样品中纯化RNA，但没有一种技术可靠地从FPE样品中分离RNA。例如，Chomczynski(美国专利第5,346,994号)描述了一种基于使用苯酚和异硫氰酸胍的液相分离法从组织中纯化RNA的方法。将生物样品在苯酚和异硫氰酸胍水溶液中匀浆，然后将浆液与氯仿混合。离心后，浆液分成有机相、界面和水相。蛋白质汇集在有机相中，DNA汇集在界面中，而RNA汇集在水相中。RNA可以从水相中沉淀出来。遗憾的是，该方法不适合固定及石蜡包埋(FPE)组织样品。
其它已知的用于分离RNA的技术通常或者使用胍盐，或者使用苯酚抽提，如在Sambrook，J.等，(1989)，第7.3-7.24页和在Ausubel，F.M.等，(1994)，第4.0.3-4.4.7页中描述的方法。同样，没有已知的方法提供从石蜡包埋组织样品中分离RNA获得可再现的定量结果。
因此，特别需要用于从石蜡包埋组织样品中分离RNA的技术，以研究肿瘤组织中的基因表达，因为可以用某些受体或酶的表达水平来确定特殊治疗成功的可能性。
需要一种从石蜡化组织中定量GST-π mRNA的方法，以对提出的基因毒性癌症疗法提供早期预测。结果，本领域共同的努力一直尚未成功地获得在固定和石蜡化(FPE)组织中对GST-π表达进行定量。因此，本发明的目的是提供一种用于评价固定及石蜡包埋(FPE)组织中的GST-π水平方法，并且通过检查患者肿瘤细胞中GST-πmRNA含量并且将其与预定阈值表达水平进行比较，预测患者肿瘤对用DNA损伤剂治疗的可能抗性，产生由DNA铂类药物所产生的DNA损伤的类型。
发明概述
在本发明的一方面，提供一种用于评价从固定及石蜡包埋(FPE)肿瘤细胞中获得的GST-π mRNA表达水平的方法。
本发明的另一方面，提供一种对固定及石蜡包埋(FPE)组织样品中相对于内部对照的GST-π mRNA表达量进行定量的方法。该方法包括从所述样品中分离总mRNA并且测定相对于内部对照基因mRNA量的GST-π mRNA量。
在本发明该方面的一个实施方案中，提供具有GST-F(SEQ IDNO：1)或GST-R(SEQ ID NO：2)的序列和与其基本相同的序列的寡核苷酸引物。本发明也提供具有与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的序列或其互补序列在严格条件下杂交的序列的寡核苷酸引物。
在本发明的再一方面，提供一种用于确定患者的化疗方案的方法，所述方法包括从固定及石蜡包埋(FPE)肿瘤样品中分离RNA；测定所述样品中GST-π的基因表达水平；将所述样品中的GST-π基因表达水平与所述GST-π基因的预定阈值水平进行比较；并根据GST-π基因表达水平与所述预定阈值水平的比较结果，确定一种化疗方案。本发明还涉及一种将采用
Figure C02815798D00071
技术分析的组织样品中GST-π相对于内部对照基因的未校正基因表达(UGE)归一化至通过pre-
Figure C02815798D00072
技术分析的样品中相对于内部对照的已知GST-π表达水平的方法。
附图简述
图1显示用5-FU和顺铂治疗的食管贲门腺癌患者中存活率和GST-π校正的相对mRNA表达之间的联系。GST-π值高于中位值/阈值的患者的存活率与GST-π值低于中位值/阈值的患者的存活率相比更高。检查过的值用小记号表示。
图2是一幅图，显示限于TNMII期食管贲门腺癌患者生存时间分析。
图3是一幅图，显示限于TNM IV期食管贲门腺癌患者生存时间分析。
图4是一张图表，说明如何计算相对于内部对照基因的GST-π表达。该表包含用两个试验样品(未知样品1和2)所获得的数据，并且说明如何确定未校正基因表达数据(UGE)。该表也说明如何用pre-
Figure C02815798D00081
技术测定的已知相对GST-π值对通过
Figure C02815798D00082
仪器产生的UGE进行归一化。通过将UGE乘以校正系数KGST-π，来完成这一步。图中的内部对照基因是β-肌动蛋白基因，而所述校准RNA是人肝脏总RNA(Stratagene，Cat.#735017)。
图5显示本发明中所用的寡核苷酸引物。
发明详述
本发明部分归属于发现GST-π mRNA量与对DNA铂类药物敏感性增加相关。表达高水平的GST-π mRNA的肿瘤被认为可能对基于铂的化疗敏感。相反，表达低水平的GST-π mRNA的肿瘤可能对基于铂的化疗不敏感。患者肿瘤GST-π mRNA的相对表达通过将其与预定阈值表达水平进行比较而加以判断。通过患者的生存时间，确定对DNA铂类药物的这种敏感或不敏感。
本发明涉及一种对固定及石蜡包埋(FPE)组织中相对于内部对照的基因表达的GST-π mRNA表达量进行定量的方法。本发明人开发出允许准确评价固定及石蜡包埋(FPE)组织中GST-π表达的寡核苷酸引物。本发明寡核苷酸引物GST-F(SEQ ID NO：1)、GST-R(SEQ IDNO：2)或与其基本相同的寡核苷酸引物优选与从固定及石蜡包埋(FPE)肿瘤样品中提取的RNA一起使用。这种GST-π基因表达测定方法于是可用于预测基于铂的化疗。
本发明的该实施方案涉及：第一，一种用于从FPE样品中可靠地提取RNA的方法；第二，测定所述样品中GST-π mRNA含量，测定方法是使用一对寡核苷引物、最好是寡核苷酸引物对GST-F(SEQID NO：1)和GST-R(SEQ ID NO：2)或与其基本相同的寡核苷酸进行逆转录酶聚合酶链式反应。通过用于从这类样品中分离mRNA的任一方法，如在于1999年12月20日申请的美国专利申请第09/469,338号、当前的美国专利第6,248,535号中描述的方法，从所述FPE细胞中提取RNA，所述专利通过引用全部结合到本文中。
本发明方法可适合于患者的任何组织类型。为了检查肿瘤组织的敏性，最好是检查肿瘤组织。在一个优选的实施方案中，也检查取得肿瘤样品的患者的一部分正常组织。
本发明方法可适合于各种各样的肿瘤类型。这使得可以制备不同的“肿瘤表达分布型”，从而测定不同患者样品中的GST-π表达水平并且预测对各种化疗药的反应。优选本发明方法适合于实体瘤，最优选食管贲门肿瘤。为了将本发明的某些实施方案用于特定肿瘤类型，最好是通过编制能使特定GST-π表达和对基于铂的化疗的临床抗性相关的数据集，证实GST-π基因表达水平与临床抗性的关系。
本文定义的“预定阈值水平”是已经发现肿瘤可能对基于铂的化疗方案敏感的GST-π表达水平。对基于铂的化疗方案不敏感的肿瘤的表达水平可能低于该阈值水平。在对基于铂的化疗方案有反应的肿瘤中，以GST-π：β-肌动蛋白的比率表示的经校正的GST-π相对表达范围超过约1.0 x 10-3。对基于铂的化疗方案无反应的肿瘤的GST-π：β-肌动蛋白比的相对表达低于约1.0 x 10-3。图1。然而，本发明并不限于用β-肌动蛋白作为内部对照基因。
在实施本发明该实施方案的方法中，优选从所述患者中分离肿瘤细胞。实体瘤或淋巴样肿瘤或其部分通过外科手术从患者切除或者通过常规活组织检查来获取。通过本领域任一经典方法，例如，Sambrook，Fischer和Maniatis，Molecular Cloning，a laboratory manual，(第二版)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，(1989)，从所述细胞中提取从冷冻或新鲜样品中分离的RNA。在提取过程中最好是小心地避免所述RNA的降解。
然而，将从所述患者中获取的组织在活检后进行常规固定，通常用福尔马林(甲醛)或戊二醛或者通过醇浸渍进行固定。经固定的生物样品通常经脱水并且包埋在石蜡或本领域技术人员已知的其它固体支持体中。本发明方法也可使用非包埋的固定组织。设想这样的固体支持体用有机溶剂例如允许防腐组织后续再水合的有机溶剂除去。
通过1999年12月20日申请的美国专利申请第号09/469,338中描述的任何方法，从所述FPE细胞中提取RNA，所述专利申请通过引用全部结合到本文中。本文描述的固定及石蜡包埋(FPE)组织样品是指可保存或存档的组织样品。RNA从存档的病理样品或第一次脱蜡的活检样品中分离出来。示例性的脱蜡方法包括用如二甲苯等有机溶剂洗涤所述石蜡化样品。脱蜡样品可以用低级醇的水溶液再水合。合适的低级醇例如包括甲醇、乙醇、丙醇和丁醇。脱蜡样品可以用例如浓度逐渐降低的低级醇溶液连续洗涤而再水合。或者，所述样品同时进行脱蜡和再水合。然后从所述样品中提取RNA。
对于RNA提取，可以用匀浆的机械、超声处理或其它方法，将所述固定或固定和脱蜡样品匀浆。再水合样品可以在包含诸如硫氰酸胍(也作为异硫氰酸胍销售)的离液剂的溶液中匀浆。将匀浆样品在含有有效量的诸如胍盐化合物的离液剂的离液溶液中加热至温度为约50℃至100℃。一种优选的离液剂是硫氰酸胍。
选择“有效浓度的离液剂”使得从石蜡包埋样品中纯化的RNA量比在没有离液剂的情况下分离的RNA量高约10倍。离液剂包括胍盐化合物、脲、甲酰胺、碘化钾、硫氰酸钾和类似的化合物。可供本发明方法用的优选离液剂是胍盐化合物，例如异硫氰酸胍(也作为硫氰酸胍销售)和盐酸胍。许多阴离子的相反离子是有用的，本领域技术人员可以用这样的合适阴离子制备许多胍盐。本发明所用的胍盐溶液的有效浓度通常范围为约1M至约5M，其中优选值为约4M。如果RNA已在溶液中，则胍盐溶液可以为较高浓度，以便样品中达到的终浓度范围为约1M至约5M。也优选用合适的生化缓冲液例如Tris-Cl将胍盐溶液缓冲至约pH 3-6，更优选约pH 4。所述离液溶液也可以含有还原剂，例如二硫苏糖醇(DTT)和β-巯基乙醇(BME)。所述离液溶液也可以含有RNA酶抑制剂。
可以将匀浆样品在含有有效量的诸如胍盐化合物的离液剂的离液溶液中加热至温度为约50℃至100℃。一种优选的离液剂是硫氰酸胍。
然后通过例如苯酚氯仿抽提、离子交换层析或大小排阻层析，从所述溶液中回收RNA。然后可以采用抽提、电泳、层析、沉淀或其它合适的技术，进一步纯化RNA。
优选采用例如本领域公知的逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)方法，对从来自新鲜、冷冻或固定的纯化总mRNA的GST-π mRNA进行定量。GST-π mRNA的其它定量方法包括例如使用分子信标和可用于多重PCR的其它标记探针。另外，本发明设想了通过使用PCR-fiee系统对GST-π mRNA进行定量，所述PCR-free系统使用例如与
Figure C02815798D00111
 Assay(Third Wave Technologies，Inc.)相似的荧光标记探针。最优选采用基于荧光的实时检测方法(ABI PRISM 7700或7900Sequence Detection System
Figure C02815798D00112
Applied Biosystems，Foster City，CA.)或相似系统如Heid等(Genome Res 1996；6：986-994)和Gibson等(Genome Res 1996；6：995-1001)描述的系统，对GST-π cDNA和内部对照或管家基因(例如β-肌动蛋白)进行定量。所述ABI 7700(
Figure C02815798D00113
Instrument)的输出以Ct’s或“循环阈值”表示。用所述
Figure C02815798D00114
系统，样品中具有较高靶分子数的高表达基因比较少靶分子的较低相对表达基因(较高Ct)产生具有较少PCR循环的信号(较低Ct)。
本文所用的“管家”基因或“内部对照”意指包括任何组成型或全面表达的基因，其存在使得能够评价GST-π mRNA水平。这样的评价包括测定基因转录的总体组成型水平并控制RNA回收中的变化。“管家”基因或“内部对照”可以包括但不限于亲环蛋白基因、β-肌动蛋白基因、运铁蛋白受体基因、GAPDH基因等。最优选所述内部对照基因是β-肌动蛋白基因，如Eads等，Cancer Research 1999；59：2302-2306所描述的。
控制RNA回收中的变化要求使用“校准RNA”。所述“校准RNA”可以是任何可利用来源的准确预定量对照RNA。优选使用Stratagene的Adult Colon，Disease Human Total RNA，(Cat.No.#735263)。
本文所用的“未校正基因表达(UGE)”是指GST-π表达相对于由
Figure C02815798D00121
仪器产生的内部对照基因的数字输出。确定UGE所用的公式示于实施例3中并且在图4中用样品计算举例说明。
本发明的再一方面提供一种用从非
Figure C02815798D00122
技术获得的“已知相对基因表达”值将从所述
Figure C02815798D00123
仪器获得的未校正基因表达(UGE)值归一化的方法。已知非
Figure C02815798D00124
获得的相对GST-π：β-肌动蛋白表达值最好用来自组织样品的用
Figure C02815798D00125
获得的GST-π UGE值归一化。
本文所用的“校正相对GST-π表达”是指归一化的GST-π表达，其中将UGE乘以GST-π特定校正系数(KGST-π)，得出相对于内部对照基因、可以与已知范围的GST-π表达水平进行比较的值。实施例3和图4说明这些计算的细节。这些数值使得可以确定特定样品的“校正相对GST-π表达”是否在“预定阈值水平”以上或以下。β-肌动蛋白水平的校正相对GST-π表达的预定阈值水平约为1.0 x 10-3。GST-π、内部对照β-肌动蛋白和校准Adult Colon，Disease Human Total RNA，(Cat.No.#735263，Stratagene)特异性的KGST-π为7.28 x 10-3。
“已知相对基因表达”值得自以前分析的组织样品并且基于靶基因与组成型表达的内部对照基因(β-肌动蛋白，GAPDH等)的RT-PCR信号之比。优选这样的组织样品是福尔马林固定及石蜡包埋(FPE)样品，并且按照实施例1和于1999年12月20日申请的美国专利申请第09/469,338号、当前的美国专利第6,248,535号中描述的方法，从所述样品中提取RNA，所述专利申请通过引用全部结合到本文中。为了定量相对于内部对照的基因表达，采用本领域已知的标准定量RT-PCR技术。将
Figure C02815798D0013100625QIETU
技术PCR反应进行固定次数的循环(即30个循环)，然后报告每个样品的终点值。这些值则报告为GST-π表达与β-肌动蛋白表达之比。参见Reed等的美国专利第5,705,336号。
KGST-π可以根据并非β-肌动蛋白的内部对照基因和/或不同于Adult Colon，Disease Human Total RNA，(Cat.No.#735263，Stratagene)的校准RNA进行测定。为此，必须对组织样品校准内部对照基因和校准RNA进行校准，对于所述组织样品已经测定了相对于所述特定内部对照基因的GST-π表达水平(即“已知相对基因表达”)。优选这样的组织样品是福尔马林固定及石蜡包埋(FPE)样品，并且按照实施例1和于1999年12月20日申请的美国专利申请第09/469,338号中描述的方法，从所述样品中提取RNA，所述专利申请通过引用全部结合到本文中。可以采用标准
Figure C02815798D0013100625QIETU
、本领域众所周知的定量RT-PCR技术，进行这样的测定。进行这样的测定后，这样的样品具有“已知相对基因表达”水平GST-π，其可用于测量新内部对照和/或校准RNA特异性新KGST-π，如实施例3描述的。
本发明方法适合于各种各样的组织和肿瘤类型，因此可用于评价患者的临床治疗并且作为各种癌的诊断或预测工具，所述癌症包括乳癌、头颈部癌、肺癌、食管癌、结肠直肠癌等。在一个优选的实施方案中，本发明方法适合于食管贲门腺癌的预测。
化疗前治疗肿瘤活检组织通常仅可使用固定石蜡包埋(FPE)组织，一般仅含有极少量的不均一组织。这样的FPE样品易适合于显微解剖，使得可以测定没有污染基质组织的肿瘤组织中的GST-π基因表达。另外，可以在活检组织样品的基质组织和肿瘤组织之间进行比较，因为这样的样品通常含有这两种组织类型。
一般而言，侧翼为GST-π基因的一个区段的任何寡核苷酸对可以用于实施本发明的方法。可供本发明用的在严格条件下与GST-π基因的一个区段杂交的引物扩增的产物为20-1000个碱基对，优选50-100个碱基对，最优选少于100个碱基对。
本发明提供特异性寡核苷酸引物对和与其基本相同的寡核苷酸引物，使得可特别准确地评价FPE组织中的GST-π表达。最好是寡核苷酸引物GST-F(SEQ ID NO：1)和GST-R(SEQ ID NO：2)(本文也称为寡核苷酸引物对GST)及与其基本相同的寡核苷酸引物。已经证明寡核苷酸引物GST-F(SEQ ID NO：1)和GST-R(SEQ ID NO：2)对于用从所述FPE细胞中提取的RNA测量GST-π mRNA水平是特别有效的，提取RNA采用进行mRNA分离的任何方法，例如实施例1和于1999年12月20日申请的美国专利申请第09/469,338号、当前的美国专利第6,248,535号中描述的方法，该专利通过引用全部结合到本文中。
本文所用的在核酸方面的“基本相同”是指与靶在严格条件下的杂交，也指核酸区段或其互补链(当进行比较时)当与合适的核苷酸插入和缺失当进行合适比对时所述核苷酸的至少约60％、通常所述核苷酸的至少约70％、更通常至少约80％、常常至少约90％、更常常至少约95-98％是相同的。当杂交比完全缺乏特异性时具有更大选择性，则存在选择性杂交。参见Kanehisa，Nucleic Acids Res.，12：203-213(1984)。
本发明包括在严格条件下(如本文定义的)与GST-F(SEQ ID NO：1)、其互补序列、GST-R(SEQ ID NO：2)或其互补序列的全部或部分寡核苷酸引物序列杂交的基本相同的寡核苷酸。
在严格杂交条件下，仅高度互补的即基本相似的核酸杂交。优选这样的条件防止具有20个连续核苷酸中有4个或4个以上错配、更优选20个连续核苷酸中有2个或2个以上错配、最优选20个连续核苷酸中有1个或1个以上错配的核酸杂交。
所述核酸的杂交部分的长度通常为至少10个(例如15个)核苷酸。杂交核酸的杂交部分与寡核苷酸引物GST-F(SEQ ID NO：1)、其互补序列、GST-R(SEQ ID NO：2)或其互补序列的部分序列或全部序列有至少约80％、优选至少约95％、最优选约至少98％相同。
下面定义所述寡核苷酸引物与核酸样品在严格条件下的杂交。核酸双链体或杂交体稳定性以解链温度(Tm)表示，Tm是探针与靶DNA解离的温度。该解链温度用以定义所需的严格条件。如果准备鉴定的序列与探针基本相同而不是相同，则其可用于首先确定在特定浓度盐(例如SSC或SSPE)下发生同源杂交的最低温度。则假定1％错配导致Tm降低1℃，因此降低杂交反应中终洗涤温度(例如如果搜索与探针有>95％同一性的序列，则终洗涤温度降低5℃)。事实上，Tm的变化可以在每1％错配0.5℃和1.5℃之间。
严格条件包括在5x SSC/5x Denhart氏溶液/1.0％ SDS中于68℃杂交，且在0.2x SSC/0.1％ SDS中于室温下洗涤。中等严格条件包括在3x SSC中于42℃洗涤。盐浓度和温度参数可以变化，以在引物和靶核酸之间达到同一性的最佳水平。有关该条件的其它指南是本领域容易得到的，例如Sambrook，Fischer和Maniatis，Molecular Cloning，a laboratory manual，(第二版)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，(1989)和F.M.Ausubel等编著，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley and Sons(1994)。
本文公开的寡核苷酸引物能够允许准确评价固定或固定及石蜡包埋组织以及冷冻或新鲜组织中的GST-π基因表达。尽管从FPE样品中获得的RNA相对于新鲜或冷冻组织而言片段化程度更高。因此，本发明方法适合用于测定FPE组织中的GST-π表达水平，其中以前没有用固定组织测定GST-π基因表达的方法。
根据肿瘤中表达的GST-π mRNA量的测量结果，技术人员可以对肿瘤对特定基因毒素、优选基于铂的化疗或引起相似类型DNA损伤的化疗的临床抗性进行预测。基于铂的化疗引起DNA的“大量加合物”，其中所述基本效应扭曲双螺旋的三维构象。这样的化合物是指单独给予的或与其它化疗药例如吉西他滨(Gem)或5-氟尿嘧啶(5-FU)一起给予的化合物。
许多化合物常常与基于铂的化疗药一起给予。例如BEP(博来霉素、依托泊苷、顺铂)用于治疗睾丸癌，MVAC(甲氨蝶呤、长春碱、多柔比星、顺铂)用于治疗膀胱癌，MVP(丝裂霉素C、长春碱、顺铂)用于治疗非小细胞肺癌。许多研究已记载了含铂药物之间的相互作用。治疗药物例如对在基于铂的化疗中所潜在包括的许多药物的协同作用已有报道。该方面的最新参考文献精简目录包括下述文献：Okamoto等，Urology 2001；57：188-192.；Tanaka等，Anticancer Research2001；21：313-315；Slamon等，Seminars in Oncology 2001；28：13-19；Lidor等，Journal of Clinical Investigation 1993；92：2440-2447；Leopold等，NCI Monographs 1987；99-104；Ohta等，Cancer Letters 2001；162：39-48；van Moorsel等，British Journal of Cancer 1999；80：981-990。
基于铂的基因毒性化学疗法包括形成共价DNA加合物的重金属配位化合物。一般而言，这些重金属化合物与DNA共价结合，以在相应的部分形成顺式-1，2-链内二核苷酸加合物。一般而言，该类化合物以顺式-二氨二氯铂(II)(顺铂)为代表，并且包括顺式-二氨-(1，1-环丁烷二羧酸)铂(II)(卡铂)、顺式-二氨合-(1，2-环己基)二氯铂(II)和顺式-(1，2-乙二胺)二氯铂(II)。铂的优选药(first agents)包括任何前述代表性化合物的类似物或衍生物。
目前可用铂配位化合物控制的肿瘤包括睾丸癌、子宫内膜癌、宫颈癌、胃癌、鳞状细胞癌、肾上腺皮质癌和小细胞肺癌以及成神经管细胞瘤和成神经细胞瘤。人们认为反式-二氨二氯铂(ID(反式-DDP)临床给予时无效是因为其DNA加合物的快速修复。在此用反式-DDP作为化疗药将可能提供一种在非所选细胞中毒性低而在所选细胞中毒性比较高的化合物。在一个优选的实施方案中，所述铂化合物是顺铂。
通过下面提供的实验实施例举例说明如此描述的本发明和本发明的实施。技术人员将会认识到，说明性实施例中所用的材料和方法可以以各种方式进行修改。这样的修改被认为在本发明范围内。
实施例
实施例1
从FPE组织中分离RNA
通过下述通用方法，从石蜡包埋组织中提取RNA。
A.切片的脱蜡和水合：
(1)将一份大约10μM的切片置于1.5mL塑料离心管中。
(2)加入600μL二甲苯，将混合物在室温(大约20-25℃)下剧烈振荡约10分钟。
(3)将样品以台式离心机的最大速度(约10-20,000xg)在室温下离心约7分钟。
(4)重复步骤2和3，直至石蜡的绝大部分已被溶解。根据原始样品部分中所包括的石蜡量，通常要求2次或2次以上。
(5)通过与低级醇(最好是100％乙醇)(约600μL)一起剧烈振荡约3分钟，除去所述二甲苯溶液。
(6)如步骤(3)的方法，将该管离心约7分钟。倾析并弃去上清液。沉淀变成白色。
(7)连续用更稀的乙醇溶液：首先用约95％乙醇，然后用约80％乙醇，最后用约70％乙醇，重复步骤5和6。
(8)如步骤(3)的方法，将样品在室温下离心7分钟。弃去上清液，让沉淀在室温下干燥约5分钟。
B.用苯酚-氯仿分离RNA
(1)加入包含0.5％肌氨酸和8μL二硫苏糖醇的400μL异硫氰酸胍溶液。
(2)然后将样品用组织匀浆器(Ultra-Turrax，IKA-Works，Inc.，Wilmington，NC)在将速度从低速档(速度1)逐渐增加至高速档(速度5)的情况下匀浆约2-3分钟。
(3)将样品于约95℃加热约5-20分钟。最好在加热至95℃之前，用细针头戳穿含有样品的管帽。或者，将管帽用塑料夹或实验室薄膜固定。
(4)然后样品用50μL 2M乙酸钠pH 4.0和600μL苯酚/氯仿/异戊醇(10:1.93:0.036)溶液进行抽提，所述苯酚/氯仿/异戊醇溶液是通过将18mL苯酚与3.6mL 1:49异戊醇:氯仿溶液混合而最新制备的。将该溶液剧烈振荡约10秒，然后在冰上冷却约15分钟。
(5)将溶液以最大速度离心约7分钟。将上层(水层)转移至一个新的管中。
(6)用约10μL糖原和400μL异丙醇于-20℃沉淀RNA 30分钟。
(7)通过在台式离心机中以最大速度离心约7分钟而沉淀RNA；倾析并弃去上清液；沉淀用约500μl的约70-75％乙醇进行洗涤。
(8)将样品以最大速度离心7分钟。弃去上清液并将沉淀风干。然后将沉淀溶于合适的缓冲液(例如50pI.5mM Tris氯化物，pH 8.0)中，供下一步实验用。
实施例2
mRNA逆转录和PCR
逆转录：如实施例1和先前在于1999年12月20日申请的美国申请第09/469,338号、当前的美国专利第6,248,535号中描述的方法，从显微解剖或非显微解剖的福尔马林固定的石蜡包埋(FPE)组织中分离RNA，所述专利通过引用全部结合到本文中。用乙醇沉淀并离心后，将RNA沉淀溶于50μl 5mM Tris/Cl pH 8.0中。M-MLV逆转录酶将延伸在脱氧核苷酸存在下与单链RNA或DNA模板杂交的寡核苷酸引物，产生互补链。所得的RNA用无规六聚体和M-MLV逆转录酶(Life Technologies)进行逆转录。通过将25μl所述RNA溶液与25.5μl“逆转录混合物”(参见下文)混合，完成所述逆转录。将所述反应物置于热循环仪中达26℃8分钟(用于所述无规六聚体与RNA的结合)、42℃45分钟(用于M-MLV逆转录酶促反应)和95℃5分钟(用于DNA酶的热失活)。
“逆转录混合物”由以下组分组成：10μl 5X缓冲液(250mMTris-HCl，pH 8.3，375mM KCl，15mM MgCl2)，0.5μl无规六聚体(50O.D.，溶于550μl 10mM Tris-HCl pH 7.5中)，5μl 10mM dNTP(dATP，dGTP，dCTP和dTTP)，5μl 0.1M DTT，1.25μl BSA(3mg/ml的10mMTris-HCL溶液，pH 7.5中)，1.25μl RNA Guard 24,800U/ml(RNA酶抑制剂)(Porcine #27-0816，Amersham Pharmacia)和2.5μl MMLV200U/μl(Life Tech Cat #28025-02)。
反应组分的终浓度为：50mM Tris-HCl，pH 8.3，75mM KCl，3mM MgCl2，1.0mM dNTP，1.0mM DTT，0.00375.mg/ml BSA，0.62U/ul RNA Guard和10U/ul MMLV。
mRNA表达的PCR定量。用基于荧光的实时检测方法(ABIPRISM 7700或7900 Sequence Detection System
Figure C02815798D00191
AppliedBiosystems，Foster City，CA.)，如Heid等人(Genome Res 1996；6：986-994)和Gibson等人(Genome Res 1996；6：995-1001)所描述的方法，对GST-π cDNA和内部对照或管家基因(例如β-肌动蛋白)cDNA进行定量。简而言之，该方法使用在正向引物和反向引物内特异性退火的双标记荧光寡核苷酸探针(GST-219T(SEQ ID NO：3)，Tm＝69℃)。含有所述反应混合物的加盖各孔内的激光刺激引起3′猝灭染料(TAMRA)的发射，直至该探针在PCR延伸期间为DNA聚合酶的5′→3′核酸酶活性所切割为止，引起5′报道染料(6FAM)的释放。因此，扩增子的产生导致发射可用 CCD(电荷-耦合装置)检测照相机所检测的荧光信号，PCR反应的纯指数期内的阈值循环产生的信号量反映出目标序列的起始拷贝数。将目标序列的起始拷贝数与内部对照基因的起始拷贝数进行比较，得到相对基因表达水平。
Figure C02815798D00194
分析所得的值以两个绝对测量值之比(目标基因/内部对照基因)表示。
PCR反应混合物组成如下：含有如上所述制备的cDNA的0.5μl所述逆转录反应物，寡核苷酸引物(GST-F(SEQ ID NO：1)，Tm＝59℃和GST-R(SEQ ID NO：2)，Tm＝59℃)各600nM，200nM 
Figure C02815798D0020101043QIETU
探针(SEQ ID NO：3)，5U AmpliTaq Gold Polymerase，dATP、dCTP、dGTP各200μM，400μM dTTP，5.5mM MgCl2和含有对照染料的1
Figure C02815798D0020101900QIETU
缓冲液A，终体积小于或等于25μl(所有试剂都得自Applied Biosystems，Foster City，CA)。循环条件为95℃10分钟，此后将95℃15秒和60℃1分钟的循环重复45次。用于定量内部对照基因β-肌动蛋白的寡核苷酸是β-肌动蛋白
Figure C02815798D0020101043QIETU
探针(SEQ ID NO：4)、β-肌动蛋白-592F(SEQ ID NO：5)和β-肌动蛋白-651R(SEQ IDNO：6)。
上述反应中所用的寡核苷酸引物GST-F(SEQ ID NO：1)和GST-R(SEQ ID NO：2)将扩增一种72bp产物。
实施例3
测定GST-π的未校正基因表达(UGE)
进行二对平行反应，即“试验”反应和“校准”反应。GST-π扩增反应和β-肌动蛋白内部对照扩增反应均为试验反应。GST-π和β-肌动蛋白扩增反应在校准RNA模板上进行并将其称为校准反应。
Figure C02815798D0020101043QIETU
器将得到四种不同的循环阈(Ct)值：得自试验反应的CtGST-π和Ctβ-肌动蛋白以及得自校准反应的CtGST-π和Ctβ-肌动蛋白。按照下列公式，确定这两个反应的Ct值之差：
ΔCt试验＝CtGST-π-Ctβ-肌动蛋白(根据“试验”反应)
ΔCT校准＝CtGST-π-Ctβ-肌动蛋白(根据“校准”反应)
接着，按照下列公式，所述步骤包括计算2的负ΔCt次方。
2-ΔCt 试验  (“试验”反应)
2-ΔCt 校准  (“校准”反应)
然后，为了从
Figure C02815798D00211
仪器获得GST-π的未校正基因表达，进行下列计算：
GST-π的未校正基因表达(UGE)＝2-ΔCt 试验/2-ΔCt 校准
用已知相对GST-π表达水平将UGE归一化
归一化计算要求将UGE乘以针对GST-π和特定校准RNA的特异性校正系数(KGST-π)。也可以确定任何内部对照基因和任何准确预定量的校准RNA的校正系数KGST-π。最好使用内部对照基因β-肌动蛋白和准确预定量的校准Adult Colon，Disease Human Total RNA(Cat.No.#735263，Stratagene)。已知这些试剂的校正系数KGST-π等于7.28 x10-3。
采用Applied Biosystems，
Figure C02815798D00212
生产商，User Bulletin #2描述的ΔCt方法的改进方法和上述方法，完成归一化。为了进行这一步骤，采用上述
Figure C02815798D00213
方法，分析6个不同试验组织GST-π表达的UGE。使用内部对照基因β-肌动蛋白和校准RNA，Adult Colon，DiseaseHuman Total RNA(Cat.No.#735263，Stratagene)。
样品14-1、14-5、14-8、13-24、13-25的各已知相对GST-π表达水平除以其相应的得自
Figure C02815798D00214
的UGE，得出非平均校正系数K。
K非平均＝已知值/UGE
接着，求所有K值的平均值，以确定针对校准RNA和β-肌动蛋白的Adult Colon，Disease Human Total RNA，(Cat.No.#735263，Stratagene)的GST-π特异性单一KGST-π校正系数。
因此，为了测定大小与
Figure C02815798D00215
 GST-π表达研究一致的未知组织样品的校正相对GST-π表达，鉴于使用相同的内部对照基因和校准RNA，只将得自
Figure C02815798D00216
仪器的未校正基因表达数据(USE)乘以KGST-π特定校正系数。
校正相对GST-π表达＝UGE x KGST-π
可以采用任何准确预定量校准RNA或内部对照基因，测定KGST-π。如上述方法所描述的，可以将准确预定量RNA的将来来源校准至具有已知相对GST-π表达水平的样品，或者可以根据前面经校准的校准RNA例如以上描述的Adult Colon，Disease Human Total RNA，(Cat.No.#735263，Stratagene)进行校准。
例如，如果测定不同的内部对照基因和/或不同的校准RNA的后续KGST-π，则必需将内部对照基因和校准RNA均校准至相对于特定内部对照基因已确定GST-π表达水平的组织样品。可以采用本领域公知的标准
Figure C02815798D00221
定量RT-PCR技术，进行这样的测定。将这些样品的已知表达水平除以其相应的UGE水平，以确定该样品的K。然后根据已知样品数，求K值的平均值，以确定专一性针对不同的内部对照基因和/或校准RNA的新的KGST-π。
实施例4
GST-π表达与生存时间的相关性
从显微解剖的FPE预处理肿瘤样品中分离出总mRNA，并用实施例2和3中描述的定量RT-PCR，测量校正相对GST-π表达。从该样品中分离mRNA的方法描述于实施例1和于1999年12月20日申请的美国专利申请第09/469,338号、当前的美国专利第6,248,535号中，专利通过引用全部结合到本文中。
运用合适的统计学方法，所述基因表达值与临床结果相关。按照Kaplan和Meier(Kaplan等，J Am Stat Assoc 1958；53：187-220)的方法估计存活率。运用log-rank检验(Mantel，Chemother Rep 1966；50：163-170)进行单变量分析。显著性水平定为P<0.05。所报道的所有P值都基于双侧检验。
分析来自31位患者的总共31个食管或食管胃连接(食管贲门)腺癌肿瘤样本，以进行GST-π mRNA表达分析。30位(97％)患者为男性，中位年龄为64岁(平均60.9岁，范围为36-78岁)。该组的种族背景包括29位白种人、1位亚洲人和1位非洲-美洲人。运用TNM临床病期分类标准，2位(6.5％)患者罹患I期疾病，22位(71％)患者罹患II期疾病，1位(3.2％)患者罹患III期疾病，而6位(19.4％)患者罹患IV期疾病。评价所有患者的总生存时间。中位总生存时间为17.17个月(平均24.8个月，范围为3.8-156.7个月)。12位(38.7％)患者死亡，而19位(61.3％)患者仍然生存。
所有患者接受的治疗为：接受2个5-FU疗程，每天给予800mg/m25-FU，共5天，或者每天给予1000mg/m25-FU，共4天，加上75mg/m2顺铂并同时进行45Gy放射疗法，然后进行手术切除。为了进行所述研究，每位患位必须完成所述化疗方案和指定放疗，经过基本完全切除，并且在手术后至少生存30天。
按照TNM病期分类，汇集所述数据，计算肿瘤期的影响。因为其它病期的患者数目太少，所以只产生II期和IV期疾病患者的存活率曲线和log-rank统计。中位校正相对GST-π mRNA表达水平为1.0 x10-3(平均为0.51 x 10-3，范围为0.0-16.1 x 10-3，所有值GST-π x 10-3/β-肌动蛋白)。根据GST-π值分析存活率显示，相对GST-π基因表达水平高于中位值的肿瘤患者，与其水平在中位值以下的那些患者相比，具有统计学显著性的存活增加(P＝0.0073，时序检验)。因此，将中位校正相对GST-π mRNA规定为阈值。该关系示于图1中。所述关系与病期无关。图2和图3显示，如果仅限于对II期或IV期疾病患者进行分析，则存在所述相关性。
GST-π mRNA表达是用含顺铂方案治疗的食管贲门腺癌患者的一个重要预测因素。
序列表
<110>RESPONSE GENETICS，INC.
<120>根据谷胱甘肽-S-转移酶π表达确定化疗方案的方法
<130>11220-159
<140>09/879,986
<141>2001-06-14
<160>6
<170>FastsEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>1
Figure C02815798D00241
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>2
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>3
Figure C02815798D00251
<210>4
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>4
Figure C02815798D00252
<210>5
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>5
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>6

Claims (4)

1.一种用于测定固定石蜡包埋组织样品中GST-π表达水平的方法，所述方法包括：
(a)将所述组织样品脱蜡；以获得脱蜡样品；
(b)在有效量的离液剂存在下，从所述脱蜡样品中分离mRNA；
(c)采用在严格条件下与所述GST-π基因的一个区段杂交的一对寡核苷酸引物扩增所述mRNA，以获得扩增样品；
(d)测定相对于内部对照基因mRNA量的GST-πmRNA量。
2.权利要求1的方法，其中步骤(c)使用SEQ ID NO：1寡核苷酸引物或与其至少80％相同的寡核苷酸引物和SEQ ID NO：2寡核苷酸引物或与其至少80％相同的寡核苷酸引物。
3.权利要求1的方法，其中所述内部对照基因是β-肌动蛋白基因。
4.权利要求1的方法，其中如下进行mRNA分离：
(a)将所述组织样品在包含有效浓度的离液化合物的溶液中加热至温度75℃至100℃，持续时间为5分钟至120分钟；
(b)从所述离液溶液中回收所述mRNA。
CNB028157982A 2001-06-14 2002-05-15 测定谷胱甘肽-S-转移酶π表达水平的方法 Expired - Fee Related CN100494398C (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/879,986 2001-06-14
US09/879,986 US6686155B2 (en) 2001-06-14 2001-06-14 Method of determining a chemotherapeutic regimen based on glutathione-S-transferase pi expression

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB2005101076846A Division CN100355770C (zh) 2001-06-14 2002-05-15 用于根据谷胱甘肽－S－转移酶π表达确定化疗方案的方法的寡核苷酸引物

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1541277A CN1541277A (zh) 2004-10-27
CN100494398C true CN100494398C (zh) 2009-06-03

Family

ID=25375288

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB028157982A Expired - Fee Related CN100494398C (zh) 2001-06-14 2002-05-15 测定谷胱甘肽-S-转移酶π表达水平的方法
CNB2005101076846A Expired - Fee Related CN100355770C (zh) 2001-06-14 2002-05-15 用于根据谷胱甘肽－S－转移酶π表达确定化疗方案的方法的寡核苷酸引物

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB2005101076846A Expired - Fee Related CN100355770C (zh) 2001-06-14 2002-05-15 用于根据谷胱甘肽－S－转移酶π表达确定化疗方案的方法的寡核苷酸引物

Country Status (15)

Country Link
US (4) US6686155B2 (zh)
EP (1) EP1407047B1 (zh)
JP (2) JP4303104B2 (zh)
KR (2) KR20090060380A (zh)
CN (2) CN100494398C (zh)
AR (1) AR034342A1 (zh)
AU (1) AU2002305573B2 (zh)
CA (1) CA2450257C (zh)
ES (1) ES2457077T3 (zh)
HK (1) HK1070921A1 (zh)
IL (2) IL159301A0 (zh)
MX (1) MXPA03011632A (zh)
NZ (1) NZ530520A (zh)
TW (1) TWI338049B (zh)
WO (1) WO2002103055A1 (zh)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040204435A1 (en) * 2003-04-09 2004-10-14 Joachim Liehr Alternating treatment with topoisomerase I and topoisomerase II inhibitors
ES2550614T3 (es) * 2004-04-09 2015-11-11 Genomic Health, Inc. Marcadores de expresión génica para predecir la respuesta a la quimioterapia
US20060115827A1 (en) * 2004-07-01 2006-06-01 University Of Southern California Genetic markers for predicting disease and treatment outcome
EP1877569A4 (en) * 2005-05-04 2009-07-15 Univ South Florida PREDICTING THE RESPONSE TO TREATMENT OF CANCER PATIENTS
US20070059753A1 (en) * 2005-09-15 2007-03-15 Tatiana Vener Detecting gene methylation
MX2009013646A (es) * 2007-06-15 2010-03-30 Univ South Florida Metodos de diagnostico y tratamiento del cancer.
AU2009339802B2 (en) * 2009-02-16 2014-07-24 Atlas Antibodies Ab RBM3 as a marker for malignant melanoma prognosis
JP5361488B2 (ja) 2009-03-24 2013-12-04 オリンパス株式会社 蛍光観察装置
JP5680442B2 (ja) * 2011-02-24 2015-03-04 シスメックス株式会社 癌細胞のタキサン系抗癌剤感受性判定方法、それを実現するためのコンピュータプログラム及び装置
GB201316027D0 (en) * 2013-09-09 2013-10-23 Almac Diagnostics Ltd Molecular diagnostic test for oesophageal cancer
WO2016104588A1 (ja) * 2014-12-26 2016-06-30 日東電工株式会社 細胞死誘導剤、細胞増殖抑制剤及び細胞の増殖異常に起因する疾患の治療用医薬組成物
CN112321489B (zh) * 2020-10-15 2022-04-19 中山大学 一种基于活性巯基和报告离子的亲电分子探针及其制备方法和应用

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4830969A (en) 1981-08-31 1989-05-16 The Research Foundation Of State University Of New York Process for the rapid and simple isolation of nucleic acids
US4843155A (en) * 1987-11-19 1989-06-27 Piotr Chomczynski Product and process for isolating RNA
US5128247A (en) 1989-08-14 1992-07-07 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for isolation of nucleic acids from eukaryotic and prokaryotic sources
US5942389A (en) * 1990-10-19 1999-08-24 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Genes and genetic elements associated with sensitivity to cisplatin
US5204241A (en) * 1990-10-22 1993-04-20 Oxi-Gene Inc. Glutathione-S-transferase mu as a measure of drug resistance
US5654179A (en) * 1990-11-14 1997-08-05 Hri Research, Inc. Nucleic acid preparation methods
US5620852A (en) 1990-11-14 1997-04-15 Hri Research, Inc. Nucleic acid preparation methods
US5284940A (en) * 1990-11-14 1994-02-08 Hri Research, Inc. Preparation for nucleic acid samples
US5346994A (en) 1992-01-28 1994-09-13 Piotr Chomczynski Shelf-stable product and process for isolating RNA, DNA and proteins
US5502166A (en) 1992-02-26 1996-03-26 Mitsubishi Chemical Corporation NMDH receptor proteins and genes encoding the same
AU6230594A (en) * 1993-02-01 1994-08-29 University Of Iowa Research Foundation, The Quartenary amine surfactants and methods of using same in isolation of rna
US5637687A (en) * 1993-08-31 1997-06-10 Wiggins; James C. Methods and compositions for isolating nucleic acids
AU2289495A (en) 1994-04-13 1995-11-10 Uab Research Foundation, The Dihydropyrimidine dehydrogenase compositions and methods of use
US5643767A (en) * 1994-05-02 1997-07-01 The Rockefeller University Process for isolating cellular components
CA2153215A1 (en) * 1994-07-06 1996-01-07 Lu Wang Treatment of paraffin embedded tissue for gene analysis
US6136605A (en) * 1994-08-26 2000-10-24 Wisconsin Alumni Research Foundation Glutathione S-transferase isoforms
US5707802A (en) 1995-01-13 1998-01-13 Ciba Corning Diagnostics Corp. Nucleic acid probes for the detection and identification of fungi
US5777099A (en) * 1995-02-24 1998-07-07 Biotecx Laboratories, Inc. RNA separation
US5945515A (en) * 1995-07-31 1999-08-31 Chomczynski; Piotr Product and process for isolating DNA, RNA and proteins
DE29601618U1 (de) * 1996-01-31 1996-07-04 Invitek Gmbh Vorrichtung zur gleichzeitigen multiplen Isolierung
EP0791654A1 (en) 1996-02-21 1997-08-27 Jürgen A. Dr. Richt Polypeptides corresponding to the amino acid sequences of proteins p57 or p9.5 of Borna disease virus, nucleic acid fragments coding therefore and their use for diagnostic and immunization purposes
KR0177890B1 (ko) * 1996-03-05 1999-04-01 이병언 반응특이성이 향상된 중합효소 연쇄반응용 튜브
AU2215897A (en) 1996-03-20 1997-10-10 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Methods and compositions for detecting dihydropyrimidine dehydrogenase splicing mutations
EP0912726A4 (en) 1996-05-10 2001-07-18 Phylomed Corp METHODS FOR OXIDIZING BISULFIDE LINKS WITH OZONE
US5968737A (en) * 1996-11-12 1999-10-19 The University Of Mississippi Method of identifying inhibitors of glutathione S-transferase (GST) gene expression
WO1998041648A2 (en) 1997-03-20 1998-09-24 Variagenics, Inc. Target genes for allele-specific drugs
US6248535B1 (en) 1999-12-20 2001-06-19 University Of Southern California Method for isolation of RNA from formalin-fixed paraffin-embedded tissue specimens
AU2002220012A1 (en) * 2000-12-01 2002-06-11 Response Genetics, Inc. Method of determining a chemotherapeutic regimen by assaying gene expression in primary tumors
US7618793B2 (en) * 2004-10-20 2009-11-17 The Regents Of The University Of Washington Identifying agents for decreasing cellular toxicity associated with huntingin polypeptide
US7618777B2 (en) * 2005-03-16 2009-11-17 Agilent Technologies, Inc. Composition and method for array hybridization
US7615729B2 (en) * 2007-12-10 2009-11-10 Aptina Imaging Corporation Apparatus and method for resonant lens focusing

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EXPRESSION OF MULTIDRUGRESISTANCE-RELATEDMARKERS IN GASTRIC CANCER. FAN ET AL.ANTICANCER RESEARCH,Vol.20 . 2000
EXPRESSION OF MULTIDRUGRESISTANCE-RELATEDMARKERS IN GASTRIC CANCER. FAN ET AL.ANTICANCER RESEARCH,Vol.20 . 2000 *
EXPRESSION OF P53 AND GLUTATHIONES-TRANSFERASE-pi RELATES TO CLINICAL DRUGRESISTANCE IN NON-SMALL CELL LUNG CANCER. NAKANISHI ET AL.ONCOLOGY,Vol.57 . 1999
EXPRESSION OF P53 AND GLUTATHIONES-TRANSFERASE-pi RELATES TO CLINICAL DRUGRESISTANCE IN NON-SMALL CELL LUNG CANCER. NAKANISHI ET AL.ONCOLOGY,Vol.57 . 1999 *
QUANTIATIVE ANALYSIS FROM FIXEDANDPARAFFIN-EMBEDED TISSUES. STANTA ET AL.METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,Vol.86 . 1998
QUANTIATIVE ANALYSIS FROM FIXEDANDPARAFFIN-EMBEDED TISSUES. STANTA ET AL.METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,Vol.86 . 1998 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP1407047A1 (en) 2004-04-14
HK1070921A1 (en) 2005-06-30
TWI338049B (en) 2011-03-01
CN1763064A (zh) 2006-04-26
JP2004530434A (ja) 2004-10-07
US7138507B2 (en) 2006-11-21
AR034342A1 (es) 2004-02-18
KR20090060380A (ko) 2009-06-11
NZ530520A (en) 2006-10-27
CA2450257A1 (en) 2002-12-27
IL159301A0 (en) 2004-06-01
CA2450257C (en) 2012-11-06
US20050074775A1 (en) 2005-04-07
CN100355770C (zh) 2007-12-19
US20020197609A1 (en) 2002-12-26
CN1541277A (zh) 2004-10-27
WO2002103055A1 (en) 2002-12-27
AU2002305573B2 (en) 2009-01-08
MXPA03011632A (es) 2005-04-19
EP1407047B1 (en) 2014-01-22
JP2009000118A (ja) 2009-01-08
US6686155B2 (en) 2004-02-03
JP4303104B2 (ja) 2009-07-29
EP1407047A4 (en) 2005-03-30
KR20040018269A (ko) 2004-03-02
JP4308309B2 (ja) 2009-08-05
US20040241705A1 (en) 2004-12-02
KR100918927B1 (ko) 2009-09-28
US20050019783A1 (en) 2005-01-27
IL159301A (en) 2010-06-16
ES2457077T3 (es) 2014-04-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1596314B (zh) 基于ercc1和ts表达确定化疗方案的方法
CA2437044C (en) Method of determining a chemotherapeutic regimen based on ercc1 expression
JP4308309B2 (ja) グルタチオンＳトランスフェラーゼＰｉ発現に基づき化学療法を決定する方法
RU2737449C1 (ru) Система для предсказания прогноза и пользы от вспомогательной химиотерапии для больных раком желудка ii и iii стадии
AU2002246504A1 (en) Method of determining a chemotherapeutic regimen based on ERCC1 and TS expression
CN1840697B (zh) 确定二氢嘧啶脱氢酶基因表达的方法
US20020123051A1 (en) Method of determining a chemotherapeutic regimen based on ERCCI expression
CN101086024A (zh) 基于ercc1和ts表达确定化疗方案的方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1070921

Country of ref document: HK

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: GR

Ref document number: 1070921

Country of ref document: HK

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20090603

Termination date: 20190515

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee