CN112321489B - 一种基于活性巯基和报告离子的亲电分子探针及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于活性巯基和报告离子的针对亲电分子的分子探针，其结构式如式(I)所示，包含报告离子基团，质量平衡基团和巯基反应基团；巯基反应基团能与天然产物或细胞等复杂基质中的亲电分子特异性地结合形成探针复合物；报告离子基团端使探针复合物形成特定的报告离子基团碎片，并在高分辨二级质谱中出现特征性报告离子峰，分辨率高和通量高，能够解决以往单纯利用复合物的荧光特性和肉眼观察复合物的色谱质谱图特征带来的问题；质量平衡基团可以实现对复杂基质中的潜在亲电化合物的定量分析，结合色谱‑多级质谱检测手段，通过对反应后探针复合物二级图谱的分析，实现高通量高灵敏地发现潜在的亲电分子的同时还大大降低共流出峰导致的假阳性率，具有较大的应用前景。

Description

一种基于活性巯基和报告离子的亲电分子探针及其制备方法 和应用
技术领域
本发明涉及探针化合物技术领域，更具体地，涉及一种基于活性巯基和报告离子的亲电分子探针及其制备方法和应用。
背景技术
活性亲电分子(Electrophilic Natural Products，ENPs)通过修饰蛋白半胱氨酸残基(Cysteine Residues)发挥抗炎抗肿瘤等一系列的作用，具有很好的成药性质。比如，2018年4月，luke a.O’Neill等人发现，具有α，β-不饱和酮结构的亲电代谢物，衣康酸(Itaconate)，它通过迈克尔加成反应(Michael addition-based mechanism)对keap1蛋白半胱氨酸残基进行烷基化修饰，从而激活Nrf2，发挥抗炎作用。Itaconate是一种来自葡萄糖的分子，是巨噬细胞的一种强有力开关。而巨噬细胞这种免疫系统中的重要细胞，也就是许多炎症性疾病的核心，包括关节炎，炎症性肠病和心脏病等，他们希望这一发现能有助于研发炎症疾病相关的新药。同年10月，Peter G.Schultz和Raymond e.Moellering等人发现，具有双酮结构的糖酵解代谢物，丙酮醛(Methylglyoxal,MGO)，能选择性地修饰keap1蛋白，在近端半胱氨酸和精氨酸残基之间形成甲基咪唑交联，该翻译后修饰的过程导致Keap1的二聚化、Nrf2的积累和Nrf2转录程序的激活。
然而，天然产物或者细胞提取物的组成极其复杂，活性亲电分子的含量很可能是非常低的，并且活性亲电分子很可能在提取过程中与所用试剂或溶剂(胺类，醇类等)反应并难以发现。因此，从复杂的提取物中发现新的微量活性亲电成分相当耗费时间、人力、物力却又低效。目前的发现手段还只是停留在偶然发现和基于液质联用(LC/MS)或者气质联用(GC/MS)直接分析复杂基质分析，但是基于LC/MS或者GC/MS的手段非常有限和低效，近年来也有不少科研工作者利用化合物的荧光特性或者卤素的同位素特性发明了各种探针，例如Maxson T等公开了一种含氨基氧基的探针来检测含醛和酮的天然产物(NPs)的方法，为了便于检测标记，探针被二溴化，赋予独特的同位素特征来区分标记代谢物和光谱噪声(Maxson T,Tietz J I,Hudson G A,et al.Targeting reactive carbonyls foridentifying natural products and their biosynthetic origins[J].Journal of theAmerican Chemical Society,2016,138(46):15157-15166.)，但最后的数据分析，无论是荧光特性或者卤素的同位素特征峰，依靠的还是肉眼或者全手工解读去观察色谱和质谱图的某些特征，比如同位素峰。现有的其它检测分析手段的首要问题是要求肉眼或手工处理大量质谱图，依据仅为肉眼观察与估计，因此效率极低且具有较高的主观不准确性，分析结果难以重复。其次，现有的其它检测方法不能排除复杂基质(如植物，细菌提取物，动物组织器官细胞提取物)中常见的共流出峰产生的假阳性质谱信号的问题，存在着很大的假阳性和假阴性率的风险，因此难以为进一步大量分离制备纯化目标化合物提供相应技术参数。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种基于活性巯基和报告离子的亲电分子探针。
本发明的第二个目的在于提供所述基于活性巯基和报告离子的亲电分子探针的制备方法。
本发明的第三个目的在于提供所述基于活性巯基和报告离子的亲电分子探针的应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
一种基于活性巯基和报告离子的亲电分子探针，其结构式如式(I)所示：
Figure BDA0002726622770000021
命名为3-[2-(2,6-二甲基-1-哌啶基)乙酰氨基]-N-(4-巯基苯基)丙酰胺(3-[2-(2,6-Dimethyl-1-piperidyl)acetamido]-N-(4-mercaptophenyl)propanamide)。
本发明提供的式(I)所示的亲电分子探针包含报告离子基团，质量平衡基团和巯基反应基团；如下所示：
Figure BDA0002726622770000022
其中，巯基反应基团能与天然产物或细胞等复杂基质中的亲电分子特异性地结合形成探针复合物；报告离子基团端使探针复合物形成特定的报告离子基团碎片，探针复合物经色谱或其它分离方式与未反应的探针和复杂基质中的其它物质分离后，经高分辨质谱或其它分析方法检测并分离后，该探针复合物再经高能碰撞(HCD或其它碰撞方法以产生二级或更高级质谱碎片离子)形成特定的报告离子基团碎片，并在高分辨二级质谱中出现特征性报告离子峰(荷质比为126.1277，偏差小于5-10ppm)，从而能高效地从天然产物或细胞等复杂基质中发现潜在的亲电分子，分辨率高，能够解决以往单纯利用复合物的荧光特性和肉眼观察复合物的色谱图特征带来的假阳性率高和检出效率低的问题；同时，探针化合物利用多级高分辨质谱仪的高分辨率(大于4万)和高扫描速率(大于7次/秒)来实现自动化的数据搜集，有效保证了对目标化合物的检出率，降低了假阴性率；同时，探针化合物和本检测方法有效利用了高分辨质谱的高精度质量过滤特性，准确地将目标化合物的一级质谱与二级/多级质谱产生关联，从而获得目标化合物的精确分子量，同位素特征和可能的准确分子式等关键信息；而质量平衡基团，可以采用2种、6种或10种等多种同位素的标签，可以实现对复杂基质中的潜在亲电化合物的定量分析。
本发明还提供所述的基于活性巯基和报告离子的亲电分子探针的制备方法，包括如下步骤：
S1.在反应容器中加入化合物A、化合物B和多肽缩合试剂在溶剂中进行缩合反应，反应结束后，分离纯化得到白色固体中间体C，其化学反应方程式如下所示：
Figure BDA0002726622770000031
S2.在反应容器中加入溶剂和中间体C，再加入强碱溶液发生水解反应，反应完成后，加入盐酸水溶液，之后将体系旋干，油泵干燥，重新加入溶剂搅拌，有白色固体析出，抽滤，滤液经两次旋干，合并得白色固体中间体D，其化学反应方程式如下所示：
Figure BDA0002726622770000041
S3.在反应容器中加入中间体D、二硫代-4,4””-二氨基代二苯和多肽缩合试剂在溶剂中进行缩合反应，反应完成后，抽滤，滤饼用溶剂淋洗，滤液旋干，层析得红色油状中间体F，其化学反应方程式如下所示：
Figure BDA0002726622770000042
S4.在反应容器中加入溶剂、中间体F、二硫键还原剂和水，无氧条件下反应，反应完成后抽滤，滤液中分离纯化得到白色固体probe，即为式(I)所示基于活性巯基和报告离子的亲电分子探针，其化学反应方程式如下所示：
Figure BDA0002726622770000043
优选地，步骤S1和/或S3所述多肽缩合试剂为HATU。
优选地，步骤S1和/或S3所述缩合反应为在DIPEA催化下进行。
优选地，步骤S1所述化合物A、化合物B的摩尔比为1:1。
优选地，步骤S1所述缩合反应为23～27℃反应2～3h。
优选地，步骤S2所述中间体C和强碱的摩尔比为1:1.5～2。
优选地，步骤S2、S3和/或S4所述反应为15～20℃反应过夜。
优选地，步骤S3所述中间体D和二硫代-4,4””-二氨基代二苯的摩尔比为1:0.5～1。
优选地，步骤S4所述中间体F和二硫键还原剂的摩尔比为1:2。
进一步优选地，所述二硫键还原剂为硫醇类还原剂TCEP。
本发明还提供所述基于活性巯基和报告离子的亲电分子探针在检测活性亲电分子中的应用。
本发明还提供一种检测天然产物或者细胞中潜在的活性亲电分子的方法，包括如下步骤：
S1.样品前处理在反应容器中，加入天然产物或者细胞提取物，以及本发明式(I)探针化合物、抗坏血酸后，用超干无水甲醇/超干二氯甲烷/超干DMF做溶剂(反应溶剂需事先用氮气，氩气等惰性气体除氧，惰性气体保护)，轻摇或者超声使反应混合物全溶后，通入氩气除氧，立即旋紧盖子，封上封口膜，常温下搅拌2～40小时后，停止反应，立即旋干或者抽干反应液，用质谱级的甲醇制样，配成1ppm的待测样品溶液；
S2.对步骤S1的待测样品溶液进行液相色谱-高分辨多级质谱检测，进行色谱图，质谱一级谱与质谱二级谱分析，以寻找天然产物或者细胞中潜在的活性亲电分子。
判定标准：
Rule I:
根据探针化合物的碎裂特性来看，需要排除来自探针原料本身的特征假阳性离子峰，这些特征峰(Δm≦5ppm)包括:350.1898，349.1819,697.3565(dimer)和544.2411[M+H]+。其中，350.1898是探针原料离子峰；697.3565是探针二聚体离子峰，而349.1819与544.2411这两个特征峰是由探针二聚体碎裂而来。
Rule II:高分辨质谱二级图谱
1.子离子：
1)样品与探针连接物的二级图谱一般会同时出现126.1277、225.1598和348.1818(Δm≦5ppm)这三个特征子离子峰，而且126.1277报告离子的峰强为top 1-2。
2)肯定地，报告离子126.1277会有同位素峰，126.1277与127.1313，两者的强度之比约为10:1。子离子225.1598的同位素峰为，225.1598与226.1631，两者强度之比也约是10:1。对于子离子348.1818，可能会出现其四个同位素峰中的两个、三个或四个，348.1740、349.1818、350.1868与351.1928。
2.母离子：
1)当Higher energy collision dissociation(HCD)＝30时，样品与探针连接物的母离子不应该被全部打碎，其峰强度一般为最高峰的5％及以上。
2)在二级图谱中，母离子与标注的母离子质量差(Δm)应在5ppm之内，否则不可信。
3)在二级图谱中，母离子一般至少会有三个同位素峰，强度之比一般约为10:6:1。若母离子只有一个峰，则该结果不可信。
3.针对探针连接物在二级色谱图中保留时间(Retention Time，RT)的问题，会有三种情况，判定方法如下：
1)最简单的情况，该探针连接物在二级图谱中只有一个保留时间点，且在该时间点打出的二级图符合上述判定要求，则可以认为该图是符合要求，可信的。
2)该探针连接物在二级图谱中有多个保留时间点但时间跨度不超过三分钟的情况，我们认为是合理的，在这些保留时间点得到的探针连接物二级图谱都是可信的。
3)该探针连接物在二级图谱中有多个保留时间点，且时间跨度超过三分钟的情况，则需要对每个时间点按上述要求逐一进行检查，检查结果会有两种：第一种，每个时间点都符合上述判定标准，则需要考虑同分异构体的情况；第二种，不是每个时间点都符合判定标准，则需要把不符合判定标准的保留时间点去除，否则结果是不可信的。
Rule III:高分辨质谱一级图谱
1.在一级谱中，样品与探针连接物的峰强度应在最强峰的5％及以上，且至少有三个同位素峰，否则结果不可信。
2.在一级谱中，样品与探针连接物的响应值不应低于E5。
优选地，所述天然产物或者细胞提取物包括天然产物提取物、细胞提取物、细胞匀浆或细胞中的一种或多种。
利用本发明设计合成的式(I)所述探针化合物和色谱多级质谱检测手段，反应基团端具有极高的活性，而报告离子基团端，在质谱二级扫描中，使探针复合物具有特定的碎裂方式，能特定地给出质荷比比为126.1277(偏差小于5-10ppm)的报告离子，分辨率高，能够解决以往单纯利用复合物的荧光特性和肉眼观察复合物的色谱图特征带来的如，数据处理效率极低，共流出峰等问题，具有较大的应用前景。
本发明区别于现有的利用紫外分光光度法或者利用低分辨质谱检测一个或多个卤素的特征同位素峰去发现天然产物中的亲电分子的方法，本发明提供的探针化合物和实验分析方法不仅能高效地非靶向地发现新的未知的亲电分子、指导未知亲电分子的分离，还能大大地降低假阳性的概率，从而能够发现复杂基质中的亲电化合物化学组学或亲电化合物的化学多样性空间。同时，本发明提供的探针化合物及其实验分析方法还能够在不处理或者少处理复杂基质的前提下发现分析活性亲电化合物，从而实现其它方法尚不能实现的原位分析。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明提供了结构式如式(I)所述的基于活性巯基和报告离子的亲电分子探针化合物，反应基团端具有极高的活性，而报告离子基团端，在质谱二级扫描中，使探针复合物具有特定的碎裂方式，能特定地给出质荷比比为126.1277(偏差小于5-10ppm)的报告离子，图谱分辨率高，区别于传统的偶然发现活性亲电分子和单纯利用探针分子的荧光特性或者一个、多个卤素同位素特性去发现潜在的新的活性亲电体的手段，能够解决以往单纯利用复合物的荧光特性和肉眼观察复合物的色谱图特征带来的问题。
(2)本发明方法能够在不处理或者少处理复杂基质的前提下发现分析活性亲电化合物，从而实现其它方法尚不能实现的原位分析。
(3)本发明方法能够确定目标分子的精确分子量(质量差小于1-10ppm)，同位素特征和可能的准确分子式等关键信息；并明确目标化合物在相应液相色谱条件下的色谱性质(出峰时间等)，能够提供大规模分离制备所需的色谱条件参数。
附图说明
图1为本发明基于活性巯基和报告离子的亲电分子探针化合物的质谱图。
图2为本发明基于活性巯基和报告离子的亲电分子探针化合物的氢谱图。
图3为苍耳亭纯品化合物与探针化合物反应后的色谱图，质谱一级谱分析。
图4为苍耳亭纯品化合物与探针化合物反应后的色谱图，质谱二级谱分析。
图5-8为苍耳提取物与探针化合物反应后的二级质谱示例图。
图9为苍耳亭纯品_探针复合物与苍耳亭在提取物中与探针反应后的色谱保留时间和高分辨二级图谱的比较图。
图10为293T细胞提取物与探针化合物反应后的色谱图，质谱一级谱分析。
图11为293T细胞提取物与探针化合物反应后的色谱图，质谱二级谱分析。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1
一种基于活性巯基和报告离子的亲电分子探针化合物的合成，其合成路线如下反应式所示：
Figure BDA0002726622770000081
具体包括如下步骤：
步骤1：250ml单口瓶中加入A(5g，29.20mmol，1.0eq)，B(4.48g，29.20mmol，1.0eq)，HATU(13.22g，35.04mmol，1.2eq)，之后加入50ml DCM，50ml DMF，搅拌均匀后加入DIPEA(7.53g，58.40mmol，2.0eq)，加入时放热不明显。加完后室温25℃反应2.5h，LC-MS显示反应完。体系旋去DCM后倒入250ml水中，EA萃取(100ml*4)。EA相饱和食盐水洗(200ml*2)，无水硫酸钠干燥，旋干后为带少量固体的黏稠油状物，加入30ml MTBE，5ml MeOH，搅拌后析出类白色晶状固体，抽滤，滤饼30ml MTBE洗涤，晾干得白色固体中间体C 5.08g。LC-MS正离子纯度85％，含9％DIPEA，LC-MS[M+1]+＝271.2,Y＝64.4％.
步骤2：250ml单口瓶中加入50ml THF，中间体C(5.08g，18.79mmol，1.0eq)，之后加入1mol/L氢氧化锂水溶液(37.5ml，37.5mmol，2.0eq)，加完后室温15℃过夜。次日LC-MS显示反应完，加入37.5ml 1mol/L盐酸水溶液，之后将体系旋干，并用油泵拉水至拉不出来，加入100ml THF搅拌，有白色固体析出，抽滤，滤饼红外烘干；滤液加无水硫酸钠干燥后旋干，仍有少量水，加入100ml THF，30ml MTBE，干燥，旋干，为半固半液的状态，加入50ml MTBE，搅拌后抽滤，得400mg晶状固体；滤液旋干后油泵拉干，加入50ml MTBE搅拌抽滤，与之前400mg合并得900mg白色固体。与之前红外干燥的固体合并得白色固体中间体D共4.38g，可能含有无机盐。LC-MS[M+1]+＝243.2。Y＝96.3％
步骤3：100ml单口瓶中加入中间体D(4.38g，可能含盐，18.08mmol，1.0eq)，HATU(5.50g，14.46mmol，0.8eq)，二硫代-4,4””-二氨基代二苯(3.59g，14.46mmol，0.8eq)，45mlTHF，搅拌均匀后加入DIPEA(4.66g，36.15mmol，2.0eq)，加完后室温15℃过夜。次日LC-MS显示中间体D反应完，仍有少量二硫代-4,4””-二氨基代二苯。体系抽滤，滤饼20ml THF淋洗，滤液旋干，200-300目硅胶拌样柱层析(DCM-DCM:MeOH＝20:1)，得红色油状中间体F 7.6g，LC＝100％，但MS阳离子纯度为56％，有41％的DIPEA残留，LC-MS[M+1]+＝473.0(少量)，LC-MS[M/2+1]+＝237.1(主要)。直接用于下一步。
步骤4：250ml单口瓶中加入80ml THF，中间体F(4g，8.46mmol，1.0eq)，TCEP(2.91g，10.15mmol，1.2eq)，水(304mg，16.91mmol，2.0eq)，加完后氮气置换三次，剧烈搅拌下室温15℃过夜。次日LC-MS显示反应完。体系抽滤，滤饼20ml THF洗，TLC滤饼为盐，弃去；滤液15℃旋至剩30-40ml THF，加入30ml DCM，湿法上样柱层析(DCM-DCM:MeOH＝20:1，DCM开始出杂质对氨基苯硫酚，会有一个逐渐减少的过程，加大极性至20:1后会再次出大量杂质，出完后就没有了，由于产物在DCM中溶解度较差且极性较大，之后直接增加极性至5:1)，得1.3g油状物，油泵拉至鼓泡，加入5ml MTBE带一次后继续拉干得1g灰色粉末，送NMR有大量DIPEA。加入15ml丙酮，固体逐渐变粘稠，并粘在刮刀上，用刮刀不停刮瓶壁直至其重新变为固体，捣碎后搅拌5min，抽滤，滤饼5ml丙酮淋洗，油泵拉干得630mg类白色固体探针(probe)。两步Y＝19.0％，四步总收率Y＝11.8％。
所述固体探针的质谱图如图1所示，氢谱图如图2所述，其结构式如式(I)所示：
Figure BDA0002726622770000091
命名为3-[2-(2,6-二甲基-1-哌啶基)乙酰氨基]-N-(4-巯基苯基)丙酰胺(3-[2-(2,6-Dimethyl-1-piperidyl)acetamido]-N-(4-mercaptophenyl)propanamide)。应用例1苍耳亭纯品化合物与探针的加成反应
(1)预处理：在5mL反应容器中，加入苍耳亭(3.10mg，2.18μM)、探针化合物(1.2eqiv，5.67mg，16.23μM)、L-抗坏血酸(1.5eqiv，3.22mg，18.27μM)后，用1mL超干无水甲醇做溶剂(反应溶剂需事先利用通入氮气或氩气等惰性气体除氧，并充入氮气或氩气等惰性气体)，轻摇使反应混合物全溶后，通入氩气除氧，常温下搅拌22小时后，停止搅拌，立即旋干反应液。用质谱级的甲醇制样，配成0.1-100ppm的样品溶液，按下述液相与质谱的条件分析苍耳亭与探针的反应混合物。
(2)分析：仪器：超高压液相-高分辨质谱仪Thermo Fisher HPLC～Q Exactive，液相条件：Hypersil Gold Dim C18,100×2.1mm,1.9μm，流动相：A相：水溶液(含0.1％甲酸)；B相：乙腈；流速：0.3ml/min，梯度洗脱，比例如下表1所示：
表1
时间(min) A％ B％
0 70 30
1 70 30
5 40 60
16 5 95
17 5 95
17.1 70 30
20 70 30
质谱条件如下表2所示：
表2
Figure BDA0002726622770000101
Figure BDA0002726622770000111
S3.数据分析：苍耳亭色谱图，质谱一级谱与质谱二级谱分析，分别如图3、图4所示，从苍耳亭纯品与探针复合物的高分辨二级图谱中能清晰的看到特定报告离子126.1277和高分辨复合物母离子峰596.3156，说明本探针化合物能与具有α，β不饱和双键结构的苍耳亭发生迈克尔加成反应。
应用例2苍耳提取物与探针的反应
(1)预处理：在5mL反应容器中，加入苍耳提取物(10mg)、探针化合物(3mg，8.58μM)、L-抗坏血酸(3.22mg，18.27μM)后，用1mL超干无水甲醇做溶剂(反应溶剂需事先除氧，充入氩气)，超声使反应混合物全溶后，通入氩气除氧，立即旋紧盖子，封上封口膜，反应混合物略有不溶，可见少量晶状固体，反应液呈棕绿色，约几分钟后反应不溶物渐渐溶解至全溶。常温下搅拌22小时后，停止搅拌，立即旋干反应液。用质谱级的甲醇制样，配成1ppm的样品溶液，按上述应用例1中的液相与质谱的方法分析苍耳亭与探针的反应混合物。
数据分析：其色谱图，质谱一级谱与质谱二级谱分析如图5～9所示及表3详细的数据分析列表所示，表明所述方法可以从苍耳提取物中发现了苍耳亭及一些未知的亲电分子。
表3
Figure BDA0002726622770000121
Figure BDA0002726622770000131
应用例3 293T细胞提取物与探针的反应
1、实验试剂及仪器：
生物试剂及耗材(高糖DMEM培养液，胎牛血清，双抗，0.05％胰酶，PBS，培养皿，无菌枪头等)购自Thermo Fisher Scientific，Corning，Gibco以及Sigma-Aldrich公司。
2、细胞培养：
实验所用的人肾上皮细胞株293T细胞来源于中山大学人类病毒学研究所，细胞培养基采用高糖DMEM培养液，内含10％的胎牛血清及1％双抗，在5％CO2、37℃培养箱中孵育。
3、实验方法：
待10cm dish 293T细胞在5％CO2、37℃培养箱中培养至密度80-90％时，去除DMEM，用PBS洗一遍后去除，用0.05％胰酶消化离心得到细胞团，将细胞团用PBS洗两遍后，再加入1mL PBS，计算出细胞团的大约体积为60μL，加入1mL细胞裂解液后立即加入15μL探针甲醇溶液(母液浓度为3.863μM，终浓度0.68μM)和10μL的L-抗坏血酸甲醇溶液(母液浓度为6.980μM，终浓度0.82μM)。于4℃下放置30分钟，每10分钟涡旋一次，然后将上述反应混合物置于常温下搅拌过夜，约18小时。离心去掉细胞残渣，用丙酮沉淀蛋白(丙酮预先在-40℃冰箱放置半小时以上)后过柱，收集滤液，过滤膜，旋干溶剂再抽真空。用质谱级甲醇复溶后制样，配成1ppm的样品溶液，按上述应用例1中的液相与质谱的方法分析。
数据分析：其色谱图，质谱一级谱与质谱二级谱分析如图10、图11所示，所述方法从细胞提取物中发现了尚未从人细胞中明确发现的代谢物crotonbetamine。
上述结果表明，利用本发明设计的探针化合物自身的结构特点，结合其色谱多级质谱检测手段，从天然产物的粗提取物和细胞中发现了许多新的没有报道过的亲电分子和已经被证实具有活性的亲电化合物，证明本发明的探针化合物和实验方法是高效可行的；所述方法能高效准确的发现天然产物或者细胞中潜在的活性亲电分子，还能够在不处理或者少处理复杂基质的前提下发现分析活性亲电化合物，从而实现其它方法尚不能实现的原位分析，实验操作简单，图谱分辨率高，实验数据分析简单，假阳性率低。

Claims (10)

1.一种基于活性巯基和报告离子的亲电分子探针，其特征在于，其结构式如式(I)所示：
Figure FDA0003484551610000011
2.权利要求1所述的基于活性巯基和报告离子的亲电分子探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.在反应容器中加入化合物A、化合物B和多肽缩合试剂在溶剂中进行缩合反应，反应结束后，分离纯化得到白色固体中间体C，其化学反应方程式如下所示：
Figure FDA0003484551610000012
S2.在反应容器中加入溶剂和中间体C，再加入强碱溶液发生水解反应，反应完成后，加入盐酸水溶液，之后将体系旋干，油泵干燥，重新加入溶剂搅拌，有白色固体析出，抽滤，滤液经两次旋干，合并得白色固体中间体D，其化学反应方程式如下所示：
Figure FDA0003484551610000013
S3.在反应容器中加入中间体D、二硫代-4,4'-二氨基代二苯和多肽缩合试剂在溶剂中进行缩合反应，反应完成后，抽滤，滤饼用溶剂淋洗，滤液旋干，层析得红色油状中间体F，其化学反应方程式如下所示：
Figure FDA0003484551610000021
S4.在反应容器中加入溶剂、中间体F、二硫键还原剂和水，无氧条件下反应，反应完成后抽滤，滤液中分离纯化得到白色固体probe，即为式(I)所示基于活性巯基和报告离子的亲电分子探针，其化学反应方程式如下所示：
Figure FDA0003484551610000022
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S1所述化合物A、化合物B的摩尔比为1:1。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S1所述缩合反应为23～27℃反应2～3h。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S2所述中间体C和强碱的摩尔比为1:1.5～2。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S2、S3和/或S4所述反应为15～20℃反应过夜。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S3所述中间体D和二硫代-4,4'-二氨基代二苯的摩尔比为1:0.5～1。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S4所述中间体F和二硫键还原剂的摩尔比为1:2。
9.权利要求1所述的基于活性巯基和报告离子的亲电分子探针在检测天然产物或者动植物细菌细胞，组织或器官提取物中活性亲电分子中的非疾病诊断和治疗用途的应用。
10.一种非疾病诊断和治疗用途的检测天然产物或者细胞中潜在的活性亲电分子的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.样品前处理在反应容器中，加入天然产物或者细胞提取物，以及本发明式(I)探针化合物、抗坏血酸后，用超干无水甲醇/超干二氯甲烷/超干DMF做溶剂，反应溶剂需事先通入氩气/氮气除氧，惰性气体保护，轻摇或者超声使反应混合物全溶后，通入氩气/氮气除氧，立即旋紧盖子，封上封口膜，常温下搅拌2～40小时后，停止反应，立即旋干或者抽干反应液，用质谱级的甲醇制样，配成0.1-100ppm的待测样品溶液；
S2.对步骤S1的待测样品溶液进行液相色谱-高分辨多级质谱检测，进行色谱图，质谱一级谱与质谱二级或多级质谱分析，以检测，发现天然产物或者细胞中潜在的活性亲电分子，并确定目标分子的精确分子量，质量差小于1-10ppm，同位素特征和可能的准确分子式；并明确目标化合物在相应液相色谱条件下的色谱性质、出峰时间。
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