CN106883284B - 雷公藤内酯三醇的快速安全制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了雷公藤内酯三醇(结构如式(Ⅰ)所示)的快速安全制备方法，具体如下：在pH 3.0～5.0或pH 7.0～9.0的磷酸缓冲溶液中，以式(Ⅱ)所示化合物为原料，在密闭环境下微波加热至120～160℃下水解反应25min～6h，得到雷公藤内酯三醇；本发明的制备方法，采用磷酸缓冲溶液作为反应介质，以具有承压保护的微波加热装置为反应容器，只有一个合成步骤，且仅需要25min～6h的反应时间，具有安全、反应周期短、反应条件稳定、易于操作，收率较高等优点，有利于式(Ⅰ)化合物的推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及雷公藤内酯三醇的快速安全制备方法。
背景技术
早在1989年，马鹏程等人就对雷公藤内酯三醇的分离与结构进行了研究，并在申请号89106941.0(公开号：CN1050021A)的中国发明专利公开了该化合物的制备方法(详见实施例4)，包括以下步骤：20mg雷公藤内酯醇溶于10mL甲醇中，并加入5mL蒸馏水，5mL磷酸缓冲液(pH 7.4)及20 μL NHEt2，室温搅拌后放置1周。
该制备方法中，反应时间过长，导致该化合物在后续的10多年里一直没能得到更多的关注和深入的研究。
直到2002年，公开号为WO 02/070472的PCT申请中公开了雷公藤内酯三醇的另一种制备方法：300mL的蒸馏水中加入1.5g的NaH2PO4·H2O，用 85％的H3PO4溶液调节其pH值为3.92，将雷公藤内酯(878mg，2.44mmol) 溶于上述的250mL磷酸缓冲溶液中(pH 4.0)，混合液回流并用TLC监控反应完成情况，96小时后，得到澄清的棕色溶液，冷却至室温。再进行常规后处理、硅胶柱层析、重结晶得到产物雷公藤内酯三醇(见申请文件第22 页实施例5A)。
该制备方法中，反应时间缩短接近一半(从1周缩短至96小时)，但是，对于工业生产来说，96h的反应时间还是太长了。并且，这种制备方法中，在纯制过程中(萃取，柱层析等)反应液仍然极易迸溅到实验台和人体，十分危险(由于残余的原料雷公藤内酯醇具有极强的免疫毒性和生殖毒性，产物和副产物也有一定的毒性)。因此，使得雷公藤内酯三醇至今还未能得到推广和应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种全新的雷公藤内酯三醇的快速安全制备方
法，以缩短该化合物的反应时间，并减少操作中接触残余原料、有毒副产物的风险。
本发明中所称的雷公藤内酯三醇，是指下述式(Ⅰ)的化合物：
根据本发明的一个方面，本发明提供了雷公藤内酯三醇的快速安全制备方法，具体过程如下：
(1)在pH 3.0～5.0或pH 7.0～9.0的磷酸缓冲溶液中(优选pH＝4.0，称取磷酸二氢钠0.8g左右，加500mL超纯水溶解，在室温下，加体积分数为 1％的磷酸溶液调pH，直至pH＝4.0)，以式(Ⅱ)所示化合物为原料，在密闭环境下微波加热至120～160℃(较高温度适用于实验室的快速制备，较低温度适用于工业化生产)水解反应25min～6h，得到式(Ⅰ)所示化合物，即雷公藤内酯三醇。
反应完毕后，一般采用的后处理方法包括减压蒸除溶剂(或者冷冻干燥去除溶剂)、纯化和干燥。
(2)应用条件性制备液相色谱纯化：
(a)样品制备：将步骤(1)中反应后的黄色溶液置于旋转蒸发仪上快速抽干溶剂(也可冷冻干燥去除溶剂)，残留固体加甲醇复溶，移液枪抽取复溶产物至离心管中，高速离心后，移液枪抽取上清液至前端固定有0.22μm 滤膜的注射器管，缓慢过滤至高效液相样品瓶；(用过的移液枪头，注射器，滤膜等可直接收纳至密封袋中，防止扩散)
(b)高效液相分离条件：
色谱柱：Phenomenex Luna C18(10.0×250mm，5.0μm)；流动相：甲醇-水体系；梯度洗脱，洗脱程序见表-1；流速：4mL/min；检测波长：220nm；进样体积：100μL；(也可选用负载量更大的色谱柱，进样量也可以相应提高)。
(c)梯度洗脱程序：
表1
(d)设置样品的收集模式为使用时间按表内的参数自动进行馏分收集。表内的时间参数包括收集的时间段与信号出峰的阈值范围，收集的时间设置为12-15min，信号阈值设置为150/5000mAu。
(e)将收集的洗脱液于旋转蒸发仪上挥干溶剂，加少量甲醇溶解后，小心用移液枪转移至EP管中，以氮气吹干仪常温下吹干样品，得雷公藤内酯三醇。
本发明的制备方法，具有如下优点：
1、本发明选用的反应介质为pH3.0～5.0或pH7.0～9.0的磷酸缓冲溶液，具有较稳定的反应控制性。
2、本发明采用微波合成仪，改变能量传递过程，利用阿伦尼乌斯反应原理和增压加速正相反应原理，相对其它合成方法而言，极大缩短了反应周期，最快反应速度提高了200倍。
3、本发明在纯制过程中做到了近密封操作，相对其它合成方法的后处理操作，操作人接触到反应液的几率极低，保证了人身安全。
4、本发明反应条件稳定、易于操作，收率较高。较高温度的反应条件适用于实验室的快速制备，较低温度的反应条件适用于工业化生产，有利于雷公藤内酯三醇的推广应用。
附图说明
图1为式(Ⅰ)化合物洗脱液自动收集的图谱。
图2为式(Ⅰ)化合物经制备的后UPLC色谱图。
图3为式(Ⅰ)化合物的ESI-MS图谱。
图4为式(Ⅰ)化合物的1H-NMR图谱。
图5为式(Ⅰ)化合物的13C-NMR图谱。
图6为式(Ⅰ)化合物的13C-NMR、DEPT-135及DEPT-90图谱。
图7为式(Ⅰ)化合物的红外光谱图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步详细的说明。
下述制备例中所用常用试剂，均为市售试剂，所使用的仪器为：BiotageInitiator微波反应仪、AvanceIII 400型核磁共振仪(四甲基硅烷为内标，瑞士Bruker公司)、安捷伦制备液相、Orbitrap液质联用仪(LC-MS，美国 Thermo公司)。制备例中若未特别指出操作方法，所述干燥指用氮气吹干仪(BF2000-30A，北京八方世纪公司)，常温下吹干样品。
实施例1
称取磷酸二氢钠0.8g左右，加500mL超纯水溶解，在室温下，加体积分数为百分之一的磷酸溶液调pH至4.0，得到pH为4的磷酸缓冲溶液。
取雷公藤内酯醇0.5g置于20mL的微波反应瓶中，加入配置好的10mL 上述磷酸缓冲溶液溶解，密封。使其充分混匀，设置140℃反应1.5h。反应结束后，反应液为黄色的溶液。得到式(Ⅰ)所示化合物的母液。
将反应后的黄色溶液置于旋转蒸发仪上快速抽干溶剂，残留固体加甲醇复溶，移液枪抽取复溶产物至离心管中，高速离心后，移液枪抽取上清液至前端固定有0.22μm滤膜的注射器管，缓慢过滤至高效液相样品瓶；(用过的移液枪头，注射器，滤膜等可直接收纳至密封袋中，防止扩散)。
将样品瓶放入到Aglient制备液相色谱仪中，使用Phenomenex Luna C18 (10.0×250mm，5.0μm)色谱柱，流动相为甲醇-水，进行梯度洗脱。流速为4mL/min，进样体积为100uL，检测波长为220nm，洗脱程序如表1：
表1
设置样品的收集模式为使用时间按表内的参数自动进行馏分收集。时间表内的参数包括收集的时间段与信号出峰的阈值范围，收集的时间设置为12～15min，信号阈值设置为150/5000mAu；
将收集的洗脱液于旋转蒸发仪上挥干溶剂，加少量甲醇溶解后，小心
用移液枪转移至EP管中，以氮气吹干仪常温下吹干样品，精密称重得式
(Ⅰ)所示化合物雷公藤内酯三醇307.7mg，收率为58.6％。
将纯化后的固体加甲醇复溶，取1mL高速离心过0.22μm滤膜；
色谱柱：BEH Shield RP18(2.1×100mm，1.7μm)；流动相：乙腈-水体系；梯度洗脱，洗脱程序见表-2；流速：0.3mL/min；检测波长：220nm；柱温：35℃；进样体积：3μL；
洗脱程序如表2
表2
结果测得化合物(Ⅰ)的纯度在98％以上，见图3。
化合物(Ⅰ)的结构确证
1)质谱检测：
质谱检测条件：ESI负离子高分辨模式检测，Sheath Gas Flow Rate： 35arb；AuxGasFlow Rate：8arb；I Spray Voltage：-4.0kV；Capillary Temp： 350℃；Tube Lents：-90。
在负离子模式下，化合物(Ⅰ)分子离子峰的质荷比为377，经推测该化合物的分子量为378，可能的分子式为C20H26O7。化合物1的ESI-MS图谱见图3。
2)化合物(Ⅰ)的核磁共振谱检测
核磁共振波谱法(NMR)是进行结构分析最强有力的分析方法。取化合物(Ⅰ)样品适量，用旋片式真空泵抽吸，除去水分，精密称取20mg 样品，加入0.6mL氘代DMSO溶解，迅速转移至核磁管中，盖紧帽盖，密封，用傅里叶变换超导核磁共振谱仪分析。
化合物(Ⅰ)的1H-NMR、13C-NMR、DEPT-135及DEPT-90的谱图见图4-6。碳氢的化学位移见表3。
表3化合物(Ⅰ)的碳氢化学位移值
aData were recorded at 400MHz in d-DMSO.bData were recorded at 100MHzin d-DMSO.
3)化合物(Ⅰ)的红外光谱检测
另取少量固体样品，置于傅里叶衰减全反射红外分析仪上分析。结果见图7
实施例2
微波加热条件设置为155℃，反应时间为40min，磷酸缓冲液配成 pH＝3.5，其余操作同实施例1，最后得到雷公藤内酯三醇266.8mg，收率为 50.82％。纯度98.3％，其余结构测试数据与实施例1相同。
实施例3
称取NaH2PO4·H2O 27.6g，加重蒸水至1000mL溶解。配置成甲液。称取Na2HPO4·2H2O 35.6g加重蒸水至1000mL溶解，配制成乙液。取甲液5.3 mL和乙液94.7mL混合获得pH＝8.0的磷酸缓冲液。
取雷公藤内酯醇0.5g置于20mL的微波反应瓶中，加入配置好的10mL 上述pH＝8.0的磷酸缓冲溶液溶解，密封。使其充分混匀，设置160℃反应 25min。反应结束后，反应液为黄色的溶液。得到式(Ⅰ)所示化合物的母液。
将反应后的黄色溶液冷冻，用冷冻干燥机抽干溶剂，得到黄色粉末。其余操作同实施例1。获得雷公藤内酯三醇282.3g，收率为53.77％。其余结构测试数据与实施例1相同，纯度98.1％。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (3)
1.雷公藤内酯三醇的快速安全制备方法，其特征在于，包括下列步骤：
在pH 3.0～5.0或pH 7.0～9.0的磷酸缓冲溶液中，以式(Ⅱ)所示化合物为原料，在密闭环境下微波加热至120～160℃下水解反应25min～6h，得到雷公藤内酯三醇；
所述的雷公藤内酯三醇为式(Ⅰ)所示化合物。
2.根据权利要求1所述的雷公藤内酯三醇的快速安全制备方法，其特征在于，所述的磷酸缓冲溶液通过以下方法制得：
取磷酸二氢钠，加水溶解，在室温下，加体积分数为1％的磷酸溶液调pH为3.0～5.0；
或者，取NaH2PO4·H2O加水溶解，配置成甲液，取Na2HPO4·2H2O加水溶解，配制成乙液，取甲液和乙液混合获得pH值7.0～9.0的磷酸缓冲液。
3.根据权利要求1或2所述的雷公藤内酯三醇的快速安全制备方法，其特征在于，还包括以下后处理步骤：
(a)将所述水解反应后的黄色溶液置于旋转蒸发仪上抽干溶剂或者冷冻干燥去除溶剂，残留固体加甲醇复溶，移液枪抽取复溶产物至离心管中，高速离心后，移液枪抽取上清液至前端固定有0.22μm滤膜的注射器管，过滤，得到溶液A；
(b)用高效液相色谱仪对步骤(a)所得溶液A进行分离，以甲醇-水体系为流动相进行梯度洗脱，收集洗脱液；
(c)将收集的洗脱液于旋转蒸发仪上挥干溶剂，再加甲醇溶解，以氮气吹干仪常温下吹干样品，得雷公藤内酯三醇。
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