CN115536566B - 化学交联剂、其制备方法及应用 - Google Patents

化学交联剂、其制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种化学交联剂、其制备方法及其在蛋白构象解析中的应用,化学交联剂的通式为或，其中n选自1‑6的整数。该交联剂在光照瞬间使得蛋白发生交联反应，可用于捕捉瞬时的蛋白构象或蛋白‑蛋白相互作用。

Description

化学交联剂、其制备方法及应用
技术领域
本发明属于化合物领域，具体涉及一种化学交联剂、其制备方法及应用。
背景技术
蛋白构象解析具有重要意义，不仅能通过构象解析了解蛋白质的生物学功能，还可以为基于蛋白质变构调节的药物设计提供结构基础和理论依据。蛋白质结构测定的经典方法包括X射线晶体衍射和核磁共振波谱分析(NMR)，两者均能够提供高分辨的结构数据信息。但上述两种方法在分析过程中，对样品的纯度及样品量要求高，对待测蛋白分子量有上限，或需要对蛋白或蛋白复合物进行结晶，技术难度高，由此，限制了上述两种方法在蛋白结构解析中的应用。
化学交联质谱法因其检测速度快，样品需求量少，生物兼容性强等优势，已被广泛应用。该方法引入具有一定臂长的交联剂，同时其两端可与特定目标氨基酸发生特异性反应，由此通过共价反应可将空间距离合适的氨基酸进行交联，经质谱检测所得交联产物，即可获得蛋白质构象变化信息。目前常用的交联剂根据对氨基酸残基反应特异性可分为氨基、巯基和羧基交联剂，选择性交联赖氨酸，半胱氨酸，天冬氨酸和谷氨酸等氨基酸。然而，目前常用交联剂仅与特定氨基酸残基反应，交联位点具有局限性，所提供的位点空间距离信息有限。同时化学交联所需反应时间长，因此仅能提供蛋白静态构象信息，尚缺乏对蛋白瞬时构象或蛋白间瞬时相互作用的捕捉和检测的能力。如专利公开文件CN110981715A公开了一种蛋白质化学交联剂及其制备方法与应用，该蛋白质化学交联剂应用于CXMS技术中展示出高效交联活性，仍只对精氨酸和赖氨酸实现特异性识别，同时仅能提供蛋白静态构象信息。
发明内容
本发明的目的在于提供一种光激活的化学交联剂，还提供该化学交联剂的制备方法和应用，该交联剂可在光照瞬间使得蛋白发生交联反应，还可用于捕捉蛋白的瞬时构象。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：
一种化学交联剂,它的通式为 其中n选自1-6的整数。
作为技术方案的进一步改进，它为表格中的任一化合物：
一种所述化学交联剂的制备方法，包括式(C)或(E)的化合物与式(D)所示的化合物经取代反应制得，其中反应路线为：
一种所述化学交联剂在蛋白构象解析中的应用，将所述化学交联剂与蛋白溶于溶剂中混合后，在激光照射下，发生交联反应。
作为技术方案的进一步改进，为了平衡所得交联产物数量和成本，蛋白与化学交联剂的摩尔配比为1:0.5-1:20。
作为技术方案的进一步改进，为了提高所得交联产物数量，交联时蛋白与交联剂的摩尔配比为1:10-1:20。
作为技术方案的进一步改进，为了捕捉蛋白瞬时构象以及蛋白间瞬时相互作用，将蛋白与交联剂的混合溶液速冻后再进行激光照射。
作为技术方案的进一步改进，所述速冻方式为液氮速冻。
作为技术方案的进一步改进，为了保证交联效率及维持蛋白瞬时构象，激光照射时间为1-60s，随着照射时间延长，样品表面开始融化，无法有效维持蛋白瞬时构象。
作为技术方案的进一步改进，所述激光波长为355nm
本发明相对现有技术具有突出的实质性特点和显著的进步，具体的说，本发明所设计的新型光交联剂对氨基酸残基无反应选择性，可有效提高交联位点的多样性，提升化学交联质谱法的蛋白结构解析分辨率。进一步说，采用本发明所设计的新型光交联剂所得交联产物在质谱检测过程中，在二级质谱碎裂过程中会产生特征碎片离子，可用于复杂样品中交联产物的快速鉴别。再一步说，本发明的交联剂在具有相同母核结构和反应原理的前提下，可设计不同臂长的系列交联剂，针对不同蛋白的构象特点，选择合适臂长或采用不同臂长交联剂组合等形式对蛋白构象进行解析，应用范围广。
附图说明
图1为交联剂与模型蛋白在激光照射1s后的质谱检测结果图，图中以实心圆圈标识的是未发生交联反应的蛋白质谱信号,空心圆圈标识的为已发生交联反应的蛋白质谱信号。
图2为不同样品体积对交联剂的交联效率的影响结果图。
图3为交联剂和模型蛋白不同浓度比对交联效率和位点的影响结果图。
图4为无钙离子状态及钙离子结合瞬间钙调蛋白交联产物示意图。
图5是以DSD为交联剂与钙调蛋白所得交联产物的二级质谱图。
图6是以DCD为交联剂与钙调蛋白所得交联产物的二级质谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
本公开中实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。
Q-TOF质谱(Waters,SYNAPT G2-Si)用于检测模型蛋白与交联剂的反应产物。
采用Easy-nLC 1200(Thermo Scientific)液相系统对交联后的酶解产物进行分离，所用色谱柱为C18 column(Acclaim PepMapTM RSLC,75μm×25cm)；流动相A为含0.1％甲酸的水，流动相B为乙腈。洗脱程序为3-8％ B(2min)；8-28％ B(2-28min)；28-38％B(28-58min)；38 -100％B(58-61min)，最后维持在100％ B(61-65min)。
Orbitrap Eclipse Tribrid质谱用于检测交联肽段产物。
所用的激光参数和型号为：wavelength:355nm,LWUVL355-120uJ。
实施例1
N1，N5双(2-(3-甲基-3H-二嗪-3-基)乙基)戊二酰胺(A-3)的合成
将双琥珀酰亚胺戊二酸酯(C-3)(400mg,1.2mmol)和3-甲基-3H-双吖丙啶-3-乙胺(D)(267mg,2.7mmol)溶解在二氯甲烷(10mL)中，然后滴加三乙胺(622mg,6.2mmol)并在室温下搅拌18小时。用饱和氯化铵和饱和碳酸氢钠洗涤混合物，用二氯甲烷萃取，收集有机相，用无水硫酸钠干燥。在减压下去除溶剂以获得粗产物，粗产物通过使用甲基叔丁基醚打浆纯化得到白色固体的最终产物(A-3)(223mg,63％yield).1HNMR(300MHz,CDCl3)δ(ppm):6.28(s,1H),3.21-3.14(q,4H),2.29-2.24(t,4H),2.00-1.95(m,2H),1.62-1.58(m,4H),1.05(s,6H)13C NMR(75MHz,CDCl3)δ(ppm):172.75,35.26,34.67,34.06,24.68,21.79,19.70
实施例2
N1，N8双(2-(3-甲基-3H-二嗪-3-基)乙基)辛二酰胺(A-6)的合成
将双琥珀酰亚胺辛二酸酯(736mg，2.0mmol)(C-6)和3-甲基-3H-双吖丙啶-3-乙胺(D)(416mg,4.2mmol)溶解在二氯甲烷(20mL)中，然后滴加三乙胺(1011.9mg，10mmol)并在室温下搅拌18小时。用饱和氯化铵和饱和碳酸氢钠洗涤混合物，用二氯甲烷萃取，收集有机相，用无水硫酸钠干燥。在减压下去除溶剂以获得粗产物，粗产物通过使用甲基叔丁基醚打浆纯化得到白色固体的最终产物(A-6)(477mg,71％yield).1H NMR(300MHz,CDCl3)δ(ppm):5.97(s,1H),3.18-3.11(q,4H),2.19-2.14(t,4H),1.64-1.55(m,8H),1.35-1.30(m,4H),1.03(s,6H)13C NMR(75MHz,CDCl3)δ(ppm):173.22,36.46,34.59,34.13,28.73,25.41,24.54,19.78
实施例3
3,3’-二硫二酰双(N-(2-(3-甲基-3H-二嗪-3-基)乙基)丙酰胺)(B-2)的合成
将3,3'-二硫代二丙酸二(N-羟基丁二酰亚胺酯)(E-2)(484mg,1.2mmol)和3-甲基-3H-双吖丙啶-3-乙胺(D)(267mg,2.7mmol)溶解在二氯甲烷(10mL)中，然后滴加三乙胺(622mg,6.2mmol)并在室温下搅拌18小时。用饱和氯化铵和饱和碳酸氢钠洗涤混合物，用二氯甲烷萃取，收集有机相，用无水硫酸钠干燥。在减压下去除溶剂以获得粗产物，粗产物通过使用甲基叔丁基醚打浆纯化得到白色固体的最终产物(B-2)(268mg,60％yield).1H NMR(300MHz,CDCl3)δ(ppm):5.98(s,2H),3.20-3.17(q,4H),3.10-2.98(t,4H),2.62-2.59(t,4H),1.68-1.60(m,4H),1.06(s,6H).
实施例4
将A-6化合物(DCD)与模型蛋白溶菌酶混合后，经355nm激光照射1s后，即可检测到对应蛋白交联产物的质谱信号(图1中A)，去卷积处理后(图1中B)通过质谱峰信号比可得反应效率小于10％，表明所设计的新型光交联剂可在光照瞬间完成交联反应。相似的，将B-2化合物(DSD)与模型蛋白溶菌酶混合后经355nm激光照射1s，可检测到对应蛋白交联产物质谱信号(图1中C)，经去卷积处理后可得图1中D，反应效率约为13％。在此基础上，考察不同样品总体积(30-100μL)对DCD(图2中A)和DSD(图2中B)交联效率的影响，结果如图2所示，在考察范围内体积对不同交联剂的交联效率均无显著影响,本发明的交联剂对样品体积要求低。
实施例5
称取合成所得的光交联剂，用DMSO配置合适浓度母液，向蛋白溶液(蛋白溶剂为水)中加入交联剂，吹打均匀后置于玻璃内插管中，采用浇入液氮方式，将蛋白与交联剂混合溶液速冻，随后用355nm激光照射60s,选取模型蛋白包括钙调蛋白，肌红蛋白和牛血清白蛋白。
以DCD进行交联，样品总体积为100μL，结果如图3中A和B所示，考察了蛋白：交联剂的摩尔比例范围1:0.5至1:20，随着交联剂比例升高，所得交联产物数量均有显著提升。当摩尔比为1:10和1:20时所获得交联产物数目最多，其中蛋白：交联剂的摩尔比1:20时，模型蛋白所得交联产物数目相当。
如图3中C所示，采用DCD为交联剂时，在上述三个模型蛋白所得交联产物中，除半胱氨酸和色氨酸未观察到被交联外，其余18种氨基酸均可被所设计交联剂交联，较传统交联剂，显著提升了交联位点种类，包含天冬氨酸和谷氨酸(D+E)的交联产物在总交联产物中占比较大。相似的，如图3中D所示，采用DSD为交联剂时，在钙调蛋白和肌红蛋白所得交联产物中，交联位点亦可覆盖大部分氨基酸，包含天冬氨酸和谷氨酸(D+E)的交联产物在总交联产物中占比较大。在此基础上发现，所设计的光交联剂对酸性氨基酸-天冬氨酸和谷氨酸(D+E)具有反应偏向性，与交联剂结构中含C-C或S-S键无关。
实施例6钙调蛋白构象解析
交联条件为：样品总体积100μL，其中DCD以20:1的摩尔比例与钙调蛋白混合，液氮速冻，355nm激光照射60s。
如图4中A所示，无Ca2+时的钙调蛋白形成crosslink交联肽段E12-D79，E12-D81，E12-S82，F13-D79，D79-Y100，D79-E128。其中依据PDB结构(1CLL)，D79-E128的理论溶剂可及表面距离(SASD)为超过了DCD理论交联的最大距离/>不符合钙调蛋白在无Ca2+时的PDB结构，表明CaM在溶液中的构象与晶体结构存在差异，C端与中间区域空间距离更加靠近。通过分子动力学模拟，获得无钙时钙调蛋白的模拟构象，其中D79-E128的SDAD为/>在可交联理论距离范围内，符合交联所得结果。上述交联产物表明在无钙离子结合时，较晶体结构，钙调蛋白的构象更加“紧密”，N端和C端分别向CaM的中间区域(D79，D81，S82)靠近。
如图4中B示，在加入钙离子的瞬间激活光交联剂，钙调蛋白形成交联肽段E12-D79，E12-E84，F13-D79，表明钙调蛋白的N端与中间区域靠近，同时交联肽段D79-Y100和D79-E128没有被检测到，推测因为距离已经超过DCD的最大理论交联距离，导致无法被交联。通过分子动力学模拟，获得了加入Ca2+瞬间的钙调蛋白模拟构象，在该构象中交联肽段D79-Y100和D79-E128的SDAD分别为和/>均在DCD的理论距离范围外，符合交联结果。由此可推测加入在Ca2+瞬间可首先诱导CaM的C端远离中心区域。
实施例7
以交联剂与钙调蛋白所得交联产物为例考察交联产物特征碎片，交联条件为：样品总体积100μL，交联剂以摩尔比20:1的比例与钙调蛋白混合，液氮速冻，激光照射60s。
图5中A和B以DSD为交联剂与钙调蛋白所得交联产物，不同类型交联产物均生成m/z 158.06的碎片离子，且丰度较高。图6中C和D是以DCD为交联剂与钙调蛋白所得交联产物，不同类型交联产物的二级质谱图中均出现m/z 281.21的碎片离子，相对丰度高。碎片离子m/z158.06和m/z 281.21的产生与交联产物的肽段序列或交联产物类型无关，而是与所设计交联剂丢失两端的双吖丙啶后分子量相符，推测m/z158.06和m/z 281.21为交联产物在二级质谱碎裂过程中产生的特征碎片离子。因此，本发明的交联剂有助于复杂样品中低丰度交联肽段的鉴定，排除假阳性结果，提升交联产物检测的准确度。
最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解，依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。

Claims (10)

1.一种化学交联剂,其特征在于，它的通式为 其中n选自1-6的整数。
2.根据权利要求1所述的化学交联剂，其特征在于，它为表格中的任一化合物：
。
3.一种根据权利要求1或2所述化学交联剂的制备方法，为式(C)或(E)的化合物分别与式(D)所示的化合物经取代反应制得，反应路线分别为：
4.一种根据权利要求1或2所述化学交联剂在蛋白构象解析中的应用，其特征在于，将所述化学交联剂与蛋白溶于溶剂中，激光照射后发生交联反应。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，蛋白与化学交联剂的摩尔配比为1:0.5-1:20。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，蛋白与化学交联剂的摩尔配比为1:10-1:20。
7.根据权利要求4-6任一项所述的应用，其特征在于，将蛋白与交联剂的混合溶液速冻后再进行激光照射。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述速冻方式为液氮速冻。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，激光照射时间为1-60s。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述激光的波长为355nm。
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