CN110981715A - 一种蛋白质化学交联剂及其制备方法与应用 - Google Patents

一种蛋白质化学交联剂及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于蛋白质及其功能研究技术领域，具体涉及一种蛋白质化学交联剂及其制备方法与应用。所述蛋白质化学交联剂，其结构如通式I所示。本发明所述的蛋白质化学交联剂具有反应迅速、不水解的优点，其应用于CXMS技术中展示出高效交联活性，对精氨酸和赖氨酸可以实现特异性识别。本发明所述蛋白质化学交联剂与六个模式蛋白质、十个蛋白混合物、多亚基酵母蛋白复合物、70S核糖体以及外泌体的交联反应证明了这些交联剂与赖氨酸结合的有效性，从而解决了现有交联剂类型不丰富，现有琥珀酰亚胺酯类交联剂在CXMS技术实际过程中存在的诸多问题，如易水解、选择性低以及交联反应较慢等问题。

Description

一种蛋白质化学交联剂及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于蛋白质及其功能研究技术领域，具体涉及一种蛋白质化学交联剂及其制备方法与应用。
背景技术
蛋白质作为生命活动的主要承担者，在生物的生长发育过程中发挥着重要的功能。蛋白质构成的基本单元是氨基酸，氨基酸主链的氨基和羧基彼此相连构成多肽，多肽通过折叠修饰进而形成具有三维结构的蛋白质。蛋白质发挥生理功能依赖于特定的蛋白质三维结构以及蛋白质相互作用网络。因此对蛋白质空间结构以及蛋白质相互作用的研究可以更深入探索蛋白质功能与结构的关系、蛋白质之间相互作用的关联，进一步阐释生命的奥义。
化学交联结合质谱(chemical cross-linking coupled with massspectrometry,CXMS)技术是近些年来迅猛发展的一种检测蛋白质结构和蛋白质相互作用的方法。
CXMS技术对蛋白质样品要求低而灵敏度高，适合对复杂蛋白质样品的分析，而且能够快速地给出相关的信息。由于化学交联剂受到臂长的限制，交联剂在空间舒展的距离范围基本涵盖了蛋白质相互作用的界面，故CXMS技术可以提供蛋白质相互作用界面的信息。另外化学交联剂基于蛋白质的共价交联，客观上实现了蛋白质的结构固定，从而使得研究微弱松散的蛋白质复合物的结构以及相互作用成为可能。该技术不仅可以用于体外蛋白质实验，而且已经有报道利用CXMS技术研究活细胞内蛋白质相互作用网络。
随着质谱仪以及交联数据搜索软件的持续发展，CXMS技术已经获得了长足的进步，但在该技术中能够应用的交联剂存在的主要问题仍未解决：
(1)交联剂类型不丰富。目前商业可购买的交联剂主要是针对蛋白质N端和赖氨酸残基，还有少量针对半胱氨酸残基。但针对其他的活性氨基酸残基，如精氨酸残基、甲硫氨酸残基、酪氨酸残基、组氨酸残基等并没有成熟的交联剂被开发出来。
(2)目前应用最为广泛种类最多的交联剂是氨基类型交联剂，该类交联剂按反应基团分类大体可分为琥珀酰亚胺酯和亚氨酸酯两类。其中由于琥珀酰亚胺酯效果优于亚氨酸酯，琥珀酰亚胺酯占据氨基交联剂的主流。目前使用最为广泛的DSS、BS3、DST等交联剂都是基于琥珀酰亚胺酯设计。
但是由于其易水解、选择性低以及交联反应较慢等问题，导致琥珀酰亚胺酯类交联剂在进行交联实验时常常因为水解而失效，即使能够交联也往往得到数量众多的mono-linked肽段形式。mono-linked肽段形式对蛋白质结构的解析，蛋白质相互作用的理解提供的信息有限，所以琥珀酰亚胺酯类交联剂往往需要较多的用量才能获得足够多inter-linked肽段形式，而加入过多的交联剂本身对蛋白质结构就存在破坏的风险。
此外，由于交联反应速度较慢，难以有效固定微弱松散的蛋白质复合物，使得琥珀酰亚胺酯类交联剂难以用于研究蛋白质微弱的相互作用和结构动态变化。而常规使用的蛋白质复合物固定剂如甲醛、戊二醛等由于其反应选择性差，质谱结果难以分析也难以应用到CXMS技术中。
基于此，开发一类反应迅速、不水解的氨基选择性交联剂是具有广泛应用价值的。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种蛋白质化学交联剂，其具有反应迅速、不水解的优点，应用于CXMS技术中展示出高效交联活性，特别是对精氨酸和赖氨酸可以实现特异性识别。
本发明所述的蛋白质化学交联剂，其结构如通式I所示：
R1-X-R2 I；
其中，所述通式I中，R1、R2各自独立地选自以下基团中的一种：
Figure BDA0002259451950000031
Figure BDA0002259451950000032
其中，所述Rx位于苯环的临位或间位，选自-H、-OH、-OMe或卤素；
所述通式I中，X选自以下基团中的一种：
Figure BDA0002259451950000033
Figure BDA0002259451950000041
其中，n1为1～3的整数；n2为1～5的整数，n3为1～5的整数；n4为0或1；n5为1～3的整数；n6为0或1；n7为1～5的整数；n8为1～3的整数；n9为1～3的整数；n10为1～3的整数；n11为1～3的整数；Ry为H或Me。
本发明所述的蛋白质化学交联剂具有反应迅速、不水解的优点，应用于CXMS技术中展示出高效交联活性，对精氨酸和赖氨酸可以实现特异性识别。
为了获得更好的效果，本发明研究人员还对取代基团组合作更进一步研究，筛选出效果更好的蛋白质化学交联剂。
根据本发明的一些实施例，所述R1和R2代表相同的基团。当R1和R2的取代基团相同时，所述蛋白质化学交联剂为同种双功能交联剂，其合成相对较为容易，更有利于工业化生产；即所述R1和R2选自相同的以下基团中的一种：
Figure BDA0002259451950000042
Figure BDA0002259451950000043
其中，所述Rx位于苯环的临位或间位，选自-H、-OH、-OMe或卤素。
而当R1、R2代表不同的基团时，所述蛋白质化学交联剂为异种双功能交联剂，此类交联剂虽合成难度相对较大，但在实际使用时会获得更丰富的信息，交联效果更好。
根据本发明的一些实施例，所述X选自以下基团中的一种：
Figure BDA0002259451950000051
根据本发明的一些实施例，所述X选自以下基团中的一种：
Figure BDA0002259451950000052
根据本发明的一些实施例，所述蛋白质化学交联剂，其结构如通式I-1、I-2或I-3所示：
Figure BDA0002259451950000053
其中，n5为1～3的整数；n6为0或1；n7为1～5的整数；
R1、R2分别代表不同的基团；优选地，所述R1为
Figure BDA0002259451950000054
Figure BDA0002259451950000061
其中，所述Rx位于苯环的临位或间位，选自-H或-OMe；所述R2为
Figure BDA0002259451950000062
其中，所述Rx位于苯环的临位或间位，选自-H、-OH、-OMe或卤素。
根据本发明的一些实施例，所述蛋白质化学交联剂的结构如通式I-4、I-5、I-6所示：
Figure BDA0002259451950000063
其中，n12代表1、2或3。
根据本发明的一些实施例，所述蛋白质化学交联剂选自如下化合物之一：
Figure BDA0002259451950000064
Figure BDA0002259451950000071
Figure BDA0002259451950000081
本发明还提供上述蛋白质化学交联剂的制备方法，包括：以四甲酯中间体为原料，以二异丁基氢化铝为还原剂进行还原反应，得到四醇化合物；所得四醇化合物再与戴斯马丁氧化剂或IBX氧化剂进行氧化反应，即得。
所述制备方法具体包括：
(1)室温条件下，向四甲酯中间体的无水四氢呋喃混合溶液中加入二异丁基氢化铝，氩气气氛下45-55℃搅拌11-13小时；之后，将反应混合物淬灭，使用i-PrOH:CHCl3＝1:3萃取；有机相合并，洗涤，干燥，旋蒸去除溶剂；
(2)室温条件下，向四醇化合物中加入戴斯马丁氧化剂或IBX氧化剂，氩气气氛下搅拌11-13小时；之后，将反应混合物用饱和碳酸氢钠溶液与饱和硫代硫酸钠溶液室温搅拌，淬灭反应；使用二氯甲烷萃取；有机相合并，洗涤，干燥，旋蒸去除溶剂，使用硅胶色谱石油醚/乙酸乙酯或二氯甲烷/甲醇进行纯化。
对于KARGO交联剂，除了上述的反应步骤之外还需要额外进行SeO2氧化；具体步骤如下：将SeO2加入步骤(1)所得乙酰苯类化合物(0.1mmol)溶液中，溶剂为450L:50L 1,4-dioxane:H2O。澄清混合物使用微波照射加热至设定温度100℃，加热0.5-1h,最大功率150W。反应完成(HPLC-MS判定)后，将暗绿色混合物冷却至室温，过滤除去Se和过量的SeO2,使用1,4-dioxane(0.5-1mL)洗涤。低压旋蒸至溶剂仅剩0.3-0.5mL(完全蒸干将导致产物聚合)。加入水(2mL)，将混合物加热至100℃回流1h,热过滤除去不溶沉淀，热水洗涤，过滤后固体冷却至0℃。如产物结晶从溶液中沉淀出来，通过过滤收集产物，使用水洗涤后在真空下干燥。如没有沉淀，产物使用反相色谱法分离纯化。
上述四甲酯中间体原料可采用下述方法之一制得：
(1)以4-羟基邻苯二甲酸二甲酯类化合物为原料，与二卤代化合物发生取代反应；
或，(2)以4-氨基邻苯二甲酸二甲酯类化合物为原料，与二羧酸化合物发生缩合反应；
或，(3)以溴甲基邻苯二甲酸二甲酯为原料进行偶联反应。
本发明进一步保护所述蛋白质化学交联剂在蛋白质分析中的应用。由于本发明所述蛋白质化学交联剂对精氨酸和赖氨酸可以实现特异性识别，因此优选所述蛋白质化学交联剂应用于含有精氨酸和/或赖氨酸的蛋白质的分析中。
附图说明
图1为DOPA 1与BSA交联的考察结果。
图2为DOPA 2与BSA交联的考察结果。
图3为DOPA1、DOPA2、DSS对六个标准蛋白的交联效果对比。
图4为DOPA1、DOPA2、DOPA3、N_DOPA及DSS对10个蛋白质混合物的交联效果对比。
图5为DOPA2、DOPA3以及N_DOPA交联剂的交联位点。
图6为DSS和DOPA2在微弱相互作用蛋白样品的交联对比。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
本发明各实施例及实验例中：
关于试剂：本发明涉及的化学试剂均购于百灵威公司、阿尔法爱莎公司或TCI试剂公司。
关于溶剂：全部反应如无特殊说明，均使用无水溶剂进行。其中，1,4-二氧六环使用CaH2进行蒸馏，丙酮使用无水CaSO4进行蒸馏，二氯甲烷、乙醚、四氢呋喃、甲苯、二甲基甲酰胺通过氧化铝柱干燥。
关于实验技术：在氩气气氛的封管或回流装置中进行成醚反应；在密封的10mL微波反应管中进行SeO2氧化反应；其余反应均在氩气保护下的干燥玻璃容器中进行。
使用注射器或套管进行对空气或水蒸气敏感的试剂进行转移。
除室温外反应温度均以油浴温度进行记录，使用Biotage进行微波反应。
使用Kieselgel 60F254预先铺制的薄层色谱板进行分析，使用254nm紫外光进行观察，或是使用高锰酸钾或香草醛溶液进行染色。
使用200-400孔的硅胶进行色谱分离。
使用4.5g Santai科技公司生产的SepaFlash球形C18修饰硅胶(粒径30-50m)在Teledyne Isco公司生产的CombiFlash Rf+色谱分离仪中进行反向色谱分离，使用水和乙腈作为溶剂。
非额外说明，产率均指色谱和光谱纯物质的产率。
关于分析用HPLC-MS：样品使用Waters公司的自动纯化液相色谱-质谱联用系统(3100Mass Detector,2545Binary Gradient Module,2767Sample Manager,and2998Photodiode Array(PDA)Detector)进行分析。该系统配有Waters公司生产的C18 5μmSunFire分离柱(150*4.6mm)，使用流速为0.3mL/min的液相色谱级水(溶剂A)和液相色谱级乙腈(溶剂B)进行平衡。
关于化合物的表征：熔点未校正，1H、13C、NMR图谱均使用Bruker DRX-400、BrukerAV-400、AV-500或AV-600MHz核磁仪进行测定。
化学位移(d)使用相对于溶剂峰的兆比率(ppm)表示。
简写中s代表单峰，d代表双峰，t代表三重峰，q代表四重峰，m代表多重峰。
高分辨质谱通过北京大学质谱实验室中的Bruker APEX Flash chromatography质谱仪测得。
具体而言，以下实施例1～7提供的化合物在仅对原料相应基团进行替换的基础上，均采用如下方法合成得到：
步骤(1)：以4-羟基邻苯二甲酸二甲酯为原料进行取代反应；具体为：将4-羟基邻苯二甲酸二甲酯与二卤代化合物置于无水乙腈中，加入适量的碳酸铯固体，80℃下搅拌12小时。过滤去掉其中固体，滤液旋干，使用硅胶色谱石油醚/乙酸乙酯或二氯甲烷/甲醇进行纯化。
或步骤(1)：以4-氨基邻苯二甲酸二甲酯为原料进行缩合反应；具体为：室温条件下，向化合物4-氨基邻苯二甲酸二甲酯(702.5mg,3.36mmol)和硫代二丙酸(239.4mg,1.34mmol)的无水DMF(10.0mL)混合溶液加入HBTU(1.3g,3.36mmol)和DIPEA(406.8mg,4.02mmol)，完成后搅拌24h。之后，将反应体系尽可能旋干，加入H2O(5.0mL)溶解固体，再用EtOAc(40.0mL×3)萃取，有机相合并，用盐水(20.0mL)洗涤。洗涤后的有机相用Na2SO4干燥之后，旋蒸去除溶剂，使用硅胶柱色谱(DCM/MeOH,200:1-100:1)纯化。
或步骤(1)：以溴甲基邻苯二甲酸二甲酯为原料进行偶联反应；具体为：室温条件下，向RhCl(PPh3)3(18.5mg,0.02mmol)和溴甲基邻苯二甲酸二甲酯(287mg,1.00mmol)的无水THF(5.0mL)混合溶液中加入Me2Zn(1.0mL,1.00mmol,1.0M in hexane)，氩气气氛下搅拌24h。之后，将反应混合物用2M HCl(5.0mL)淬灭，使用EtOAc(20.0mL×3)萃取。有机相合并，用盐水(10.0mL)洗涤。洗涤后的有机相用Na2SO4干燥之后，旋蒸去除溶剂，使用硅胶柱色谱(PE/EtOAc,4:1-7:3)纯化。
步骤(2)：室温条件下，向四甲酯中间体的无水四氢呋喃混合溶液中加入二异丁基氢化铝，氩气气氛下50℃搅拌12小时。之后，将反应混合物用饱和酒石酸钠钾淬灭，使用i-PrOH:CHCl3＝1:3萃取。有机相合并，用盐水洗涤。洗涤后的有机相用无水硫酸钠干燥之后，旋蒸去除溶剂，不进行纯化直接进行下一步反应。
步骤(3)：室温条件下，向直接旋干的四醇化合物的无水二氯甲烷混合溶液中加入戴斯马丁氧化剂或IBX氧化剂，氩气气氛下搅拌12小时。之后，将反应混合物用饱和碳酸氢钠溶液与饱和硫代硫酸钠溶液室温搅拌1小时，淬灭反应。使用二氯甲烷萃取。有机相合并，用盐水洗涤。洗涤后的有机相用无数硫酸钠干燥之后，旋蒸去除溶剂，使用硅胶色谱石油醚/乙酸乙酯或二氯甲烷/甲醇进行纯化。
对于KARGO交联剂，除了上述的反应步骤之外还需要额外的氧化：
将SeO2(60mg,0.54mmol,5.4eq.)加入步骤(1)所得乙酰苯类化合物(0.1mmol)溶液中，溶剂为450L:50L 1,4-dioxane:H2O。澄清混合物使用微波照射加热至设定温度100℃，加热0.5-1h,最大功率150W。反应完成(HPLC-MS判定)后，将暗绿色混合物冷却至室温，过滤除去Se和过量的SeO2,使用1,4-dioxane(0.5-1mL)洗涤。低压旋蒸至溶剂仅剩0.3-0.5mL(完全蒸干将导致产物聚合)。加入水(2mL)，将混合物加热至100℃回流1h,热过滤除去不溶沉淀，热水洗涤，过滤后固体冷却至0℃。如产物结晶从溶液中沉淀出来，通过过滤收集产物，使用水洗涤后在真空下干燥。如没有沉淀，产物使用反相色谱法分离纯化。
所述反相色谱法分离纯化具体为：热过滤后溶液在减压下浓缩至总体积约1mL，加入DMSO(～0.5mL)保证产物溶解，使用反相C18柱在CombiFlash自动色谱分离系统上纯化，溶剂使用梯度：100:0H2O:MeCN(0→3mins)；100:0→85:15H2O:MeCN(3→15mins)；85:15→80:20H2O:MeCN(15→20mins)。通过冻干除去水得到纯产物。
实施例1
一种蛋白质化学交联剂(DOPA 1)的制备，包括：
(1)以溴甲基邻苯二甲酸二甲酯为原料进行偶联反应，得如下产物：
Figure BDA0002259451950000131
表征信息如下：
白色固体；315mg,收率76％；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.67(d,J＝8.0Hz,2H),7.50(d,J＝1.9Hz,2H),7.27(dd,J＝9.0,1.9Hz,2H),3.90(d,J＝8.0Hz,12H),2.99(s,4H)；
13C NMR(100MHz CDCl3)δ168.4,167.8,144.78,132.8,131.1,129.6,129.5,128.9,52.8,52.7,37.1；
HRMS(ESI)m/z C22H23O8(M+H)+的理论值为414.1387,实测值为415.1387。
(2)在步骤(1)所得化合物的基础上，经上述步骤(2)反应，得如下产物：
Figure BDA0002259451950000132
(3)在步骤(2)所得化合物的基础上，经上述步骤(3)反应，得如下产物：
Figure BDA0002259451950000141
表征信息如下：
白色固体；84mg,收率95％；
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ10.58(s,1H),10.45(s,1H),7.89(d,J＝8.0Hz,2H),7.79(d,J＝1.5Hz,2H),7.52(dd,J＝9.0,1.9Hz,2H),3.15(s,4H)；
13C NMR(125MHz CDCl3)δ192.3,192.0,147.3,136.9,134.9,133.8,132.3,130.6,37.0；
HRMS(ESI)m/z C18H15O4(M+H)+的理论值为295.0970,实测值为295.0965。
实施例2
一种蛋白质化学交联剂(DOPA 2)的制备，包括：
(1)以二碘代乙醚和4-羟基邻苯二甲酸二甲酯为原料进行取代反应，得如下产物：
Figure BDA0002259451950000142
表征信息如下：
白色固体；554mg,收率77％；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.79(d,J＝8.0Hz,2H),7.09(d,J＝1.9Hz,2H),7.00(dd,J＝9.0,1.9Hz,2H),4.20(m,4H),3.93(m,4H),3.90(s,6H),3.86(s,6H)；
13C NMR(100MHz CDCl3)δ168.9,166.9,161.3,135.8,131.7,122.6,116.5,114.3,69.8,68.0,52.9,52.5；
HRMS(ESI)m/z C24H27O11(M+H)+的理论值为491.1553实测值为491.1548。
(2)在步骤(1)所得化合物的基础上，经上述步骤(2)反应，得如下产物：
Figure BDA0002259451950000151
(3)在步骤(2)所得化合物的基础上，经上述步骤(3)反应，得如下产物：
Figure BDA0002259451950000152
表征信息如下：
白色固体；52mg,收率94％；
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ10.65(s,1H),10.32(s,1H),7.91(d,J＝8.0Hz,2H),7.46(d,J＝1.5Hz,2H),7.23(dd,J＝9.0,1.9Hz,2H),4.30(m,4H),3.98(m,4H)；
13C NMR(125MHz CDCl3)δ192.0,191.1,163.1,138.8,134.8,129.9,119.5,115.3,69.9,68.3。
实施例3
一种蛋白质化学交联剂(DOPA 3)的制备，包括：
(1)以二溴乙烷和4-羟基邻苯二甲酸二甲酯为原料进行取代反应，得如下产物：
Figure BDA0002259451950000153
(2)在步骤(1)所得化合物的基础上，经上述步骤(2)反应，得如下产物：
Figure BDA0002259451950000154
(3)在步骤(2)所得化合物的基础上，经上述步骤(3)反应，得如下产物：
Figure BDA0002259451950000161
实施例4
一种蛋白质化学交联剂(N_DOPA)的制备，包括：
(1)以N-甲基二乙胺和4-羟基邻苯二甲酸二甲酯为原料进行取代反应，得如下产物：
Figure BDA0002259451950000162
(2)在步骤(1)所得化合物的基础上，经上述步骤(2)反应，得如下产物：
Figure BDA0002259451950000163
(3)在步骤(2)所得化合物的基础上，经上述步骤(3)反应，得如下产物：
Figure BDA0002259451950000164
实施例5
一种蛋白质化学交联剂(E_DOPA 1)的制备，包括：
(1)以丙二腈和溴甲基邻苯二甲酸二甲酯为原料进行取代反应，得如下产物：
Figure BDA0002259451950000165
表征信息如下：
白色固体；628mg,收率100％；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.80-7.74(m,4H),7.60(dd,J＝8.0,1.9Hz,2H),3.92(d,J＝3.1Hz,12H),3.52(s,4H)；
13C NMR(100MHz CDCl3)δ167.7,167.1 134.8,133.10,133.05,132.6,131.0,129.8,114.0,53.06,53.02,42.8,40.3；
HRMS(ESI)m/z C25H26N3O8(M+NH4)+的理论值为496.1714,实测值为496.1715。
在所得化合物的基础上，经上述步骤三丁基氢化锡自由基取代反应，得如下产物：
Figure BDA0002259451950000171
表征信息如下：
黄色油状液体；539mg,收率100％；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.68(d,J＝7.9Hz,2H),7.54(d,J＝1.8Hz,2H),7.41(dd,J＝7.9,1.8Hz,2H),3.86(s,12H),3.13-3.04(m,1H),2.99-2.90(m,4H)；
13C NMR(100MHz CDCl3)δ167.7,167.6 139.9,132.7,131.8,131.0,129.6,129.4,120.0,52.8,52.7,37.5,34.8；
HRMS(ESI)m/z C24H27N2O8(M+NH4)+的理论值为471.1762,实测值为471.1769。
在所得化合物的基础上，经硼氢化钠还原反应，得如下产物：
Figure BDA0002259451950000172
表征信息如下：
黄色油状液体；339mg,收率90％；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.67(d,J＝7.9Hz,2H),7.45(d,J＝1.8Hz,2H),7.30(dd,J＝8.0,1.8Hz,2H),3.89(d,J＝4.5Hz 12H),2.79-2.71(m,2H),2.64-2.53(m,4H),2.10-1.99(m,1H)；
13C NMR(100MHz CDCl3)δ168.4,167.8 144.5,132.6,131.6,129.33,129.30,129.29,52.7,52.6,44.5,43.7,37.8；
HRMS(ESI)m/z C24H28NO8(M+H)+理论值为：458.1809,实测值为458.1805。
在所得化合物的基础上，经与戊炔酸缩合反应，得如下产物：
Figure BDA0002259451950000181
表征信息如下：
黄色油状液体；128mg,收率90％；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.66(d,J＝7.9Hz,2H),7.42(d,J＝1.7Hz,2H),7.29(dd,J＝8.0,1.8Hz,2H),5.75(t,J＝6.1Hz,1H),3.88(d,J＝4.9Hz 12H),3.19(t,J＝6.2Hz,2H),2.73-2.65(m,2H),2.63-2.55(m,2H),2.48(td,J＝6.7,2.6Hz,2H),2.33-2.20(m,3H),2.00(t,J＝2.6Hz,1H)；
13C NMR(100MHz CDCl3)δ171.4,168.3 167.7,143.8,132.7,131.7,129.6,129.5,129.3,83.2,69.4,52.8,52.7,42.6,42.1,38.3,35.4,15.0；
HRMS(ESI)m/z C29H31NNaO9(M+Na)+理论值为：560.1891,实测值为568.1891。
(2)在步骤(1)所得化合物的基础上，经上述步骤(2)反应，得如下产物：
Figure BDA0002259451950000191
表征信息如下：
黄色油状液体；77mg,收率70％；
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.30(d,J＝7.6Hz,2H),7.22(d,J＝1.8Hz,2H),7.10(dd,J＝7.7,1.9Hz,2H),4.67(d,J＝8.4Hz,8H),3.11(d,J＝6.4Hz,2H),2.68-2.61(m,2H),2.60-2.53(m,2H),2.47–2.41(m,2H),2.37-2.31(m,2H),2.29–2.19(m,2H)；
13C NMR(100MHz,CD3OD)δ174.2,141.2,140.3,137.9,130.1,129.5,129.4,83.7,70.4,63.0,62.8,43.6,43.3,38.9,36.0,15.8；
HRMS(ESI)m/z C25H35N2O5(M+NH4)+理论值为：443.2540,实测值为443.2536。
(3)在步骤(2)所得化合物的基础上，经上述步骤(3)反应，得如下产物：
Figure BDA0002259451950000192
表征信息如下：
黄色油状液体；15.8mg,收率70％；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ10.6(s,2H),10.4(s,2H),7.89(d,J＝7.8Hz,2H),7.73(d,J＝1.8Hz,2H),7.57(dd,J＝7.8,1.8Hz,2H),5.81(t,J＝6.2Hz,1H),3.26(t,J＝6.2Hz,2H),2.89-2.81(m,2H),2.75-2.68(m,2H),2.53(td,J＝6.9,2.7Hz,2H),2.47-2.39(m,1H),2.36(t,J＝6.8Hz,2H),2.04(t,J＝2.6Hz,1H)；
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ192.3,192.0,171.6,146.6 136.7,134.9,134.4,132.4,130.9,83.2,69.9,42.5,42.0,38.6,35.6,15.1；
HRMS(ESI)m/z C25H27N2O5[M+NH4]+理论值为：435.1914,实测值为435.1914。
实施例6
一种蛋白质化学交联剂(SODOPA)的制备，包括：
(1)以硫代二丙酸和4-氨基邻苯二甲酸二甲酯为原料进行缩合反应，得如下产物：
Figure BDA0002259451950000201
(2)在步骤(1)所得化合物的基础上，经上述步骤(2)反应，得如下产物：
Figure BDA0002259451950000202
(3)在步骤(2)所得化合物的基础上，经上述步骤(3)反应，得如下产物：
Figure BDA0002259451950000203
实施例7
一种蛋白质化学交联剂(KARGO)的制备，包括：
(1)以二碘代乙醚和4-羟基苯乙酮为原料进行取代反应，得如下产物：
Figure BDA0002259451950000211
采用上述方法的步骤(1)，以上述产物和4-羟基苯乙酮为原料进行取代反应，得如下产物：
Figure BDA0002259451950000212
表征信息如下：
无赦油状化合物；81mg,收率81％；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.92(d,J＝8.8Hz,2H),7.79(d,J＝8.7Hz,1H),7.09(d,J＝2.5Hz,1H),7.00(dd,J＝8.7,2.6Hz,1H),6.94(d,J＝8.8Hz,2H),4.27–4.16(m,4H),3.98–3.92(m,4H),3.90(s,3H),3.87(s,3H),2.55(s,3H)；
13C NMR(100MHz(CD3)2SO)δ196.8,168.7,166.8,162.6,161.2,135.6,131.5,130.5,122.5,116.3,114.3,114.2,69.8,69.7,67.9,67.6,53.5,52.8,52.4,26.4；
HRMS(ESI)m/z calcd for C22H25O8(M+H)+417.1544,found417.1551。
HRMS(ESI)m/z C22H25O8(M+H)+的理论值为417.1544,实测值为417.1551。
(2)在步骤(1)所得化合物的基础上，经上述步骤(2)反应，得如下产物：
Figure BDA0002259451950000213
(3)在步骤(2)所得化合物的基础上，经上述步骤(3)反应，得如下产物：
Figure BDA0002259451950000221
表征信息如下：
白色固体；31mg,收率65％；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ10.64(s,1H),10.32(s,1H),7.93-7.90(m,3H),7.47(d,J＝2.5Hz,1H),7.24(dd,J＝8.5,2.5Hz,1H),6.94(d,J＝8.8Hz,2H),4.31(t,J＝4.6Hz,2H),4.23(t,J＝4.6Hz,2H),4.01-3.94(m,4H),2.55(s,3H)；
13C NMR(100MHz CDCl3)δ196.7,191.8,190.1,163.1,162.6,138.6,134.6,130.6(x2),129.7,119.3,115.3,114.3,69.9,69.7,68.2,67.6,26.3；
HRMS(ESI)m/z C20H21O7(M+H)+理论值为：357.1333，实测值为,357.1335。
在所得化合物的基础上，经SeO2氧化反应，得如下产物：
Figure BDA0002259451950000222
表征信息如下：
白色固体；12mg,收率62％；
1H NMR(400MHz,CD3CN)δ10.48(s,1H),10.28(s,1H),8.04(d,J＝9.0Hz,2H),7.97(d,J＝8.5Hz,1H),7.43(d,J＝2.6Hz,1H),7.31(dd,J＝8.5,2.6Hz,1H),7.02(d,J＝9.0Hz,2H),5.84(s,1H),4.30(t,J＝4.3Hz,2H),4.23(t,J＝4.3Hz,2H),4.03(m,4H)；
13C NMR(100MHz CD3CN)δ194.6,193.1,192.0,163.4,163.2,138.9,134.0,132.0,126.2,119.1,115.7,114.5,87.0,69.2,69.1,68.33,67.8；
HRMS(ESI)m/z C20H19O7(M–H2O+H)+理论值为：371.1125,实测值为371.1127。
实验例1：DOPA交联剂与BSA的反应
图1为DOPA1与BSA交联的考察结果。
图2为DOPA2与BSA交联的考察结果。
图1和图2的每组柱形图中第一个柱形代表spectra，第二个柱形代表peptidepairs。
本发明利用DOPA1、DOPA2分别与BSA进行交联，优化DOPA交联剂使用比例和用量，进行了交联测试，并给出最终优化结果。
最终我们确定，BSA蛋白质质量：交联剂质量比为16:1时，可以获得最佳交联效果。
实验例2：在六个标准蛋白上交联效果
图3为DOPA1、DOPA2、DSS对六个标准蛋白的交联效果对比。
图3中每组柱形图中依次代表DSS、DOPA1、DOPA2。
为了研究DOPA交联剂的交联效果，测试了六个标准蛋白上的交联情况。
在六个简单蛋白质样品上，DOPA1交联剂的交联效果均差于DOPA2交联剂，考虑是由于DOPA1交联剂受到溶解度以及交联剂臂长更短的影响。DOPA2交联剂表现较好，在蛋白质catalase上，交联效果要优于DSS。
实验例3：交联剂在十个蛋白混合物上的交联
图4为DOPA1、DOPA2、DOPA3、N_DOPA及DSS对10个蛋白质混合物的交联效果对比。
图5为DOPA2、DOPA3以及N_DOPA交联剂的交联位点。
在十个蛋白质混合物上，我们发现DOPA2、DOPA3以及N_DOPA交联剂均能展现出较高的交联效率，可以达到或者超过DSS的交联效果。
此外，通过对其交联位点的分析，我们发现DOPA2、DOPA3以及N_DOPA交联剂的交联位点选择性具有一定的差异，交联位点具有互补性。
实验例4：交联剂在微弱相互作用蛋白样品的交联
图6为DSS和DOPA2在微弱相互作用蛋白样品的交联对比。
图6每组柱形图中第一个柱形代表DOPA2，第二个柱形代表DSS。
我们选择了HPr/EIN和EIIA/EIIB蛋白质复合物作为研究模型，这两个蛋白质复合物具有强烈的解离趋势。
在相同的蛋白浓度(10Kd)下，分别测试了DSS和DOPA2对这两个复合物交联固定情况。在DOPA2样品中鉴定到更多的分子间交联肽段对，证明DOPA交联剂交联效果更好。
结论：上述蛋白质化学交联剂与六个模式蛋白质、十个蛋白混合物、多亚基酵母蛋白复合物(H/HCA)、70S核糖体以及外泌体的交联反应证明了这些交联剂与赖氨酸结合的有效性。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种蛋白质化学交联剂，其特征在于，其结构如通式I所示：
R1-X-R2 I；
其中，所述通式I中，R1、R2各自独立地选自以下基团中的一种：
Figure FDA0002259451940000011
Figure FDA0002259451940000012
其中，所述Rx位于苯环的临位或间位，选自-H、-OH、-OMe或卤素；
所述通式I中，X选自以下基团中的一种：
Figure FDA0002259451940000013
Figure FDA0002259451940000021
其中，n1为1～3的整数；n2为1～5的整数，n3为1～5的整数；n4为0或1；n5为1～3的整数；n6为0或1；n7为1～5的整数；n8为1～3的整数；n9为1～3的整数；n10为1～3的整数；n11为1～3的整数；Ry为H或Me。
2.根据权利要求1所述的蛋白质化学交联剂，其特征在于，所述R1和R2代表相同的基团，均选自以下基团中的一种：
Figure FDA0002259451940000022
Figure FDA0002259451940000023
其中，所述Rx位于苯环的临位或间位，选自-H、-OH、-OMe或卤素。
3.根据权利要求2所述的蛋白质化学交联剂，其特征在于，所述X选自以下基团中的一种：
Figure FDA0002259451940000024
4.根据权利要求2所述的蛋白质化学交联剂，其特征在于，所述X选自以下基团中的一种：
Figure FDA0002259451940000031
5.根据权利要求1所述的蛋白质化学交联剂，其特征在于，所述蛋白质化学交联剂，其结构如通式I-1、I-2或I-3所示：
Figure FDA0002259451940000032
其中，n5为1～3的整数；n6为0或1；n7为1～5的整数；R1、R2分别代表不同的基团；
优选地，所述R1为
Figure FDA0002259451940000033
其中，所述Rx位于苯环的临位或间位，选自-H或-OMe；所述R2为
Figure FDA0002259451940000034
Figure FDA0002259451940000035
其中，所述Rx位于苯环的临位或间位，选自-H、-OH、-OMe或卤素。
6.根据权利要求1所述的蛋白质化学交联剂，其特征在于，所述蛋白质化学交联剂的结构如通式I-4、I-5、I-6所示：
Figure FDA0002259451940000041
其中，n12代表1、2或3。
7.根据权利要求1所述的蛋白质化学交联剂，其特征在于，所述蛋白质化学交联剂选自如下化合物之一：
Figure FDA0002259451940000042
Figure FDA0002259451940000051
Figure FDA0002259451940000061
8.权利要求1-7任一所述蛋白质化学交联剂的制备方法，其特征在于，包括：以四甲酯中间体为原料，以二异丁基氢化铝为还原剂进行还原反应，得到四醇化合物；所得四醇化合物再与戴斯马丁氧化剂或IBX氧化剂进行氧化反应，即得。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述四甲酯中间体原料采用下述方法之一制得：
(1)以4-羟基邻苯二甲酸二甲酯类化合物为原料，与二卤代化合物发生取代反应；
或，(2)以4-氨基邻苯二甲酸二甲酯类化合物为原料，与二羧酸化合物发生缩合反应；
或，(3)以溴甲基邻苯二甲酸二甲酯为原料进行偶联反应。
10.权利要求1-7任一所述蛋白质化学交联剂在蛋白质分析中的应用；优选在含有精氨酸和/或赖氨酸的蛋白质的分析中。
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