CN107628937B

CN107628937B - 一种蛋白质化学交联剂及其制备方法与应用

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Publication number: CN107628937B
Application number: CN201611262823.7A
Authority: CN
Inventors: 雷晓光; 亚历山大·琼斯; 董梦秋; 曹勇; 谭惠
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2016-12-30
Filing date: 2016-12-30
Publication date: 2020-11-06
Anticipated expiration: 2036-12-30
Also published as: CN107628937A

Abstract

本发明涉及一种蛋白质化学交联剂及所述蛋白质化学交联剂的制备方法。本发明提供的多功能交联剂水溶性以及稳定性均十分优异，且交联效率高，尤其是对精氨酸的交联效率高，是首次被广泛使用的精氨酸特异交联剂。本发明证明了所述交联剂对精氨酸的选择性，其与八个模式蛋白质和多亚基酵母蛋白复合物的交联反应证明了这些交联剂与精氨酸结合的有效性。化学交联与质谱分析结合技术是结构化学中一种有效且高速发展的技术，可以被有效地应用于大的活性蛋白质复合物分析，而不需要进行严格的纯化过程。由于交联剂多样的结构特点，这些交联剂展示出互补的反应性，其可交联的精氨酸残基彼此特异。

Description

一种蛋白质化学交联剂及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及蛋白质及其功能研究领域，具体涉及一种蛋白质化学交联剂及其制备方法。

背景技术

蛋白质作为生命的物质基础和生命活动的主要承担者，研究蛋白质的功能对理解生命活动有重要意义。随着人类基因组计划的完成，过去十几年鉴定到的蛋白质数量急剧增加。然而，许多新发现的蛋白质的生理功能仍然不清楚，与研究蛋白质功能密切相关的是蛋白的三维结构以及蛋白-蛋白相互作用。传统的蛋白质结构解析方法X射线晶体学和核磁共振光谱学的分辨率可以达到原子水平。但是这两种方法都需要大量的蛋白质，而且对X射线晶体学而言获取质量很高的大分子量蛋白质或蛋白质复合体的晶体是非常困难的，核磁共振光谱学则要求蛋白质有较好的水溶性，且分子量一般低于30kDa。近年来兴起的一个完全不同的途径是化学交联－质谱鉴定技术。它在大约二十年前就已开辟，但近几年才发展成熟。该技术利用化学交联剂(chemical cross linker)在相互作用的蛋白之间形成依赖于某些类型的氨基酸残基及它们之间的空间距离的共价键，再通过质谱鉴定交联位点；所述整个流程包括(如图1所示)：1)蛋白质与交联剂发生特异性的交联反应；2)将蛋白酶切成肽段；3)质谱分析鉴定交联的肽段。新兴的单分子冷冻电镜－三维重构技术常常不能确定大分子量蛋白质或蛋白质复合体的局部构象，所以也往往与化学交联－质谱鉴定技术结合。分体式交联剂与一体式交联剂结构示意图如图2所示。

质谱技术的发展极大地推动了化学交联剂的应用，这使得它广泛应用于研究蛋白与蛋白的相互作用。这归功于质谱技术与化学交联剂的结合在研究蛋白与蛋白相互作用领域具有独特的优势，具体包括：1)化学交联剂与相互作用的蛋白质之间是通过不可逆的共价键连接的，理论上可以检测到其它方法很难捕获的瞬时相互作用；2)由于质谱直接分析的是蛋白质水解后的多肽，因此蛋白质或蛋白复合物的大小是不受限制的；3)分析速度快，对样品纯度要求低，而且需要的蛋白在微克级别，具有很高的灵敏度；4)可供选择的化学交联剂种类很多，根据两个反应官能团的差别可分为：氨基—氨基，氨基—巯基，巯基—巯基，巯基—羧基；同时两个反应官能团之间的臂长也可以改变。

尽管已经有很多商业化的化学交联剂，但是由于酶切产物大部分都是普通肽段，而交联肽段所占比例很低，因此在如此复杂的体系中去鉴定交联肽段是一项非常困难的任务。目前大部分交联剂仅仅停留在简单、纯化的蛋白样品分析，对复杂的生物样品并没能显现出太大的解决能力。通过使用生物素对样品进行纯化富集可以实现交联肽段与普通肽段的分离，这将大大减低样品的复杂程度，因此可富集型交联剂是当前发展的重点。同时，在交联剂中引入可切割位点有利于交联肽段在富集中从固相系统上释放，而同位素的引入不仅能帮助交联肽段的鉴定，更使得交联肽段的定量成为可能。然而，简单机械地将这些官能团拼凑在一起有时并不能实现它们自身的价值，不当的累加反而带来负面效果，导致交联剂水溶性降低、交联效率不高、稳定性不好等问题。因此，如何将这些官能团有机地融合在一起，使它们发挥出自身的功能，成为能解决复杂生物样品分析的化学交联剂仍是一个巨大的挑战。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种蛋白质化学交联剂，其结构如通式I所示：

R1-X-R2 I；

所述通式I中，R1、R2各自独立地选自以下基团：

其中，所述Rx位于苯环的临位或间位，选自-H、-OH、-OMe、或卤素；

所述通式I中，X选自以下基团：

其中，n1为1～3的整数；n2为1～5的整数，n3为1～5的整数；n4为0或1； n5为1～3的整数；n6为0或1；n7为1～5的整数；n8为1～3的整数；n9为1～3 的整数；n10为1～3的整数；n11为1～3的整数；Ry为H或Me。

作为本发明的一种优选方案，所述R1和R2代表相同的基团，均选自：

其中，所述Rx位于苯环的临位或间位，选自-H、 -OH、-OMe或卤素。

优选地，所述X选自以下基团：

其中，n1为1～3的整数；n2为1～5的整数，n3为1～5的整数；n4为0或1； Ry为H或Me。

优选地，所述X选自以下基团：

其中，n8为1～3的整数；n9为1～3的整数；n10为1～3的整数；n11为1～3 的整数；

进一步优选所述R1和R2均选自：

其中，所述Rx位于苯环的临位或间位，选自-H、-OH、-OMe 或卤素。

作为本发明的一种优选方案，所述的交联剂结构如通式I-1、I-2或I-3所示：

其中，n5为1～3的整数；n6为0或1；n7为1～5的整数；R1、R2分别代表不同的基团；

进一步优选地，所述R1为

其中，所述Rx位于苯环的临位或间位，选自-H或-OMe；和/或，所述R2为

作为本发明的一种优选方案，所述交联剂的结构如通式I-4所示：

所述通式I-4中，n₁₂代表1、2或3。

作为本发明的最优选方案，所述交联剂选自如下化合物：

本发明进一步保护所述交联剂的制备方法，所述方法包括如下步骤：以双乙酰苯类化合物为原料，以SeO₂为氧化剂进行氧化反应，所得产物在水中加热回流，即得。所述在水中加热回流步骤可以实现产物中的醛基到结晶水合物的转化。

所述反应包括以下具体步骤：将SeO₂加入双乙酰苯类化合物的溶液中，在 95～105℃下加热反应，充分反应后(约0.5～1h)冷却至室温，过滤除去Se和过量的SeO₂，低压旋蒸至残留少量溶剂(若溶剂完全蒸干将导致产物聚合)；加入水后在95～105℃回流0.5～1.5h,热过滤除去沉淀，将溶液冷却至0℃。

如产物从溶液中结晶出来，则通过过滤收集结晶，使用水洗涤后在真空下干燥，即得产物。如产物没有从溶液中结晶出来，则采用反相色谱法分离纯化。

所述反相色谱法纯化包括以下具体步骤：热过滤后溶液在减压下浓缩至总体积约1mL，加入DMSO(～0.5mL)保证产物溶解，使用反相C18柱进行纯化，溶剂使用梯度：100:0H₂O:MeCN(0→3mins)；100:0→85:15H₂O:MeCN(3 →15mins)；85:15→80:20H₂O:MeCN(15→20mins)，通过冻干除去水得到纯产物。

本发明所述双乙酰苯类化合物可以以羟基苯乙酮和双卤代直链烃为原料，经取代反应得到；或，以对乙酰苯甲酸和二元胺或二元醇为原料，经氧化反应得到。

具体而言，所述以羟基苯乙酮和双卤代直链烃为原料的反应包括以下具体步骤：将羟基苯乙酮、双卤代直链烃和碳酸铯溶解在丙酮中，置于封管中，加热至65～75℃反应过夜，反应结束后冷却至室温，去除溶剂后重新溶解在乙酸乙酯中，使用1M NaOH和盐水萃取，有机相使用硫酸钠进行干燥，过滤后旋干，粗产品使用色谱法分离(洗脱溶剂梯度为80:20到50:50石油醚:乙酸乙酯) 即得。

具体而言，所述以对乙酰苯甲酸和二元胺或二元醇为原料的反应优选用于制备化合物Amide-ArGO-1和Amide-ArGO-2。该方法包括以下具体步骤：将 EDCI.HCl、NEt₃加入溶有对乙酰苯甲酸、二元胺/二元醇和HOBt的干燥DMF 溶液中，将该均相溶液在氩气保护下室温搅拌24小时，将反应混合物过滤除去 NEt₃.HCl，滤液减压蒸发浓缩后重新溶解在二氯甲烷中。

其中，化合物Pre-amide-ArGO-2不溶于二氯甲烷，可以直接过滤得到，使用二氯甲烷洗涤。化合物pre-amide-ArGO-1可使用20％NaHCO₃水溶液和盐水萃取除去未反应的酸和脲类副产物，使用硫酸钠干燥有机相，过滤，蒸发溶剂；粗产品使用色谱法分离(洗脱溶剂梯度为50:50到0:100石油醚:乙酸乙酯)。

本发明保护的化合物均可对原料中相应基团进行替换的情况下，采用与上述方法相同或相似的手段合成得到。

本发明进一步保护所述的交联剂在蛋白质分析中的应用。由于本发明个的交联剂对精氨酸可以实现特异性识别，因此，优选所述交联剂应用于含有精氨酸的蛋白质分析。

现有技术提供的化学交联剂多特异性识别赖氨酸或半胱氨酸，本发明提供的蛋白质化学交联剂是首次被广泛使用的精氨酸特异交联剂。本发明证明了所述交联剂对精氨酸的选择性，其与八个模式蛋白质和多亚基酵母蛋白复合物(H/ACA) 的交联反应证明了这些交联剂与精氨酸结合的有效性。化学交联与质谱分析结合技术(CXMS)是结构化学中一种有效且高速发展的技术，可以被有效地应用于大的活性蛋白质复合物分析，而不需要进行严格的纯化过程。由于交联剂多样的结构特点，这些交联剂展示出互补的反应性，其可交联的精氨酸残基彼此特异。因此，组合使用这些交联剂分子可以增加从化学交联与质谱分析结合技术实验中获得的结构信息。

附图说明

图1为利用化学交联剂研究蛋白质相互作用示意图；

图2为分体式交联剂与一体式交联剂结构示意图；

图3为使用ArGO类似物与BSA反应识别的非重复的交联肽段数目示意图；

图4为ArGO2的构象模拟结果；

图5为与8种蛋白质反应对最佳ArGOs进行评估结果示意图；其中，图5a为 ArGO与各模式蛋白的可识别交联多肽段；图5b为图5a中数据的盒形图，左侧为 ArGO 1-3分别测试结果，右侧为混合测试结果，黑线为交联的多肽段数目的中位数，盒状图为四分位数差(即中间50％)，虚线为最低和最高；图5c为ArGO-2、 HP-ArGO和OMe-ArGO-2与8种模式蛋白交联后可识别的交联肽段数目结果示意图；

图6为由评估模式蛋白结构得到的Cα-Cα距离分布；蓝色表示ArGO1的数据，橘色表示ArGO2，灰色表示ArGO3，原始数据来源于BS3，BS3是一种赖氨酸交联剂；表格显示了交联结果中符合晶体结构的结果数目所占比例和各个交联剂的最大范围限制；

图7为ArGO2、HP-ArGO和OMe-ArGO2与8种蛋白交联反应识别所得特异多肽段文氏图。

具体实施方式

本发明各实施例及实验例中：

关于试剂:本发明涉及的化学试剂均购于百灵威公司、阿尔法爱莎公司或 TCI试剂公司。硼酸盐缓冲溶液由硼酸水溶液加入1M NaOH溶液调节pH制备。 N-乙酰精氨酸甲基酯,2,2’-二碘代乙醚,1,2-二(2-碘代乙烷)乙烷and 1,5-二(4-乙酰苯基氧基)戊烷。

关于溶剂:全部反应如无特殊说明，均使用无水溶剂进行。1,4-二氧六环使用CaH₂进行蒸馏，丙酮使用无水CaSO₄进行蒸馏，二氯甲烷、乙醚、四氢呋喃、甲苯、二甲基甲酰胺通过氧化铝柱干燥。

关于实验技术:在氩气气氛的封管中进行成醚反应；在密封的10mL微波反应管中进行SeO₂氧化反应；其余反应均在氩气保护下的干燥玻璃容器中进行。使用注射器或套管进行对空气或水蒸气敏感的试剂进行转移。除室温外反应温度均以油浴温度进行记录，使用Biotage进行微波反应。文中Brine指NaCl 的饱和溶液.使用Kieselgel 60 F254预先铺制的薄层色谱板进行分析，使用254 nm紫外光进行观察，或是使用高锰酸钾或香草醛溶液进行染色。使用200-400 孔的硅胶进行色谱分离。使用4.5g Santai科技公司生产的SepaFlash球形C18 修饰硅胶(粒径30-50μm)在Teledyne Isco公司生产的CombiFlash R_f+色谱分离仪中进行反向色谱分离，使用水和乙腈作为溶剂。非额外说明，产率均指色谱和光谱纯物质的产率。

关于分析用HPLC-MS:样品使用Waters公司的自动纯化液相色谱-质谱联用系统(3100 Mass Detector,2545 Binary Gradient Module,2767 Sample Manager,and 2998Photodiode Array(PDA)Detector)进行分析。该系统配有 Waters公司生产的C18 5μmSunFire分离柱(150*4.6mm),使用流速为0.3 mL/min的液相色谱级水(溶剂A)和液相色谱级乙腈(溶剂B)进行平衡。

关于化合物的表征:熔点未校正，使用ATR-IR红外检测仪进行傅里叶变化红外光谱测定并记录。¹H、¹³C、¹⁹F NMR图谱均使用Bruker DRX-400、Bruker AV-400、AV-500或AV-600MHz核磁仪进行测定。化学位移(d)使用相对于溶剂峰的兆比率(ppm)表示。简写中s代表单峰，d代表双峰，t代表三重峰， q代表四重峰，m代表多重峰。高分辨质谱通过北京大学质谱实验室中的Bruker APEX Flash chromatography质谱仪测得。

本发明合成的ArGO化合物以水合物形式和醛形式的平衡存在。两种形式对应峰在¹H NMR数据中分别给出，个别¹³C NMR谱图可以识别醛形式的峰亦给出。180-200ppm间的三峰是水合物-醛形式平衡的¹³C特征分裂图样，对应水合物和醛的酮基峰，醛峰和水合醛基峰。

具体而言，以下实施例1～11提供的化合物在仅对原料相应基团进行替换的基础上，均采用如下方法合成得到：

步骤(1)：将对羟基苯乙酮(3mmol)、双卤代直链烃(1mmol)和碳酸铯 (1.63g,5mmol)溶解在(6mL)丙酮中，置于封管中，加热至70℃反应过夜。反应结束，冷却至室温，旋蒸去除溶剂后重新溶解在乙酸乙酯中，使用1M NaOH 和盐水萃取。有机相使用硫酸钠进行干燥，过滤后旋干。粗产品使用色谱法分离(洗脱溶剂梯度为80:20到50:50石油醚:乙酸乙酯)。

步骤(1)或为：将EDCI.HCl(461mg,2.4mmol)和NEt₃(0.826mL,5mmol) 加入溶有对乙酰苯甲酸(492mg,3mmol)、二元胺/二元醇(1mmol)和HOBt (324mg,2.4mmol)的干燥DMF溶液中。将该均相溶液在氩气保护下室温搅拌 24小时。将反应混合物过滤除去NEt₃.HCl，滤液减压蒸发浓缩后重新溶解在二氯甲烷中。以下实施例10中，由于Pre-amide-ArGO-2不溶于二氯甲烷中，可以直接过滤得到，使用二氯甲烷洗涤。以下实施例9中，pre-amide-ArGO-1的制备还包括：使用20％NaHCO₃水溶液和盐水萃取除去未反应的酸和脲类副产物。使用硫酸钠干燥有机相，过滤，蒸发溶剂。粗产品使用色谱法分离(洗脱溶剂梯度为50:50到0:100石油醚:乙酸乙酯)。

步骤(2)：将SeO₂(60mg,0.54mmol,5.4eq.)加入步骤(1)所得双乙酰苯类化合物(0.1mmol)溶液中，溶剂为450L:50L 1,4-dioxane:H₂O。澄清混合物使用微波照射加热至设定温度100℃，加热0.5-1h,最大功率150W。反应完成(HPLC-MS判定)后，将暗绿色混合物冷却至室温，过滤除去Se和过量的SeO₂, 使用1,4-dioxane(0.5-1mL)洗涤。低压旋蒸至溶剂仅剩0.3-0.5mL[完全蒸干将导致产物聚合]。加入水(2mL)，将混合物加热至100℃回流1h,热过滤除去不溶沉淀，热水洗涤，过滤后固体冷却至0℃。如产物结晶从溶液中沉淀出来，通过过滤收集产物，使用水洗涤后在真空下干燥。如没有沉淀，产物使用反相色谱法分离纯化。

所述反相色谱法分离纯化具体为：热过滤后溶液在减压下浓缩至总体积约 1mL，加入DMSO(～0.5mL)保证产物溶解，使用反相C18柱在CombiFlash自动色谱分离系统上纯化，溶剂使用梯度：100:0H₂O:MeCN(0→3mins)；100:0 →85:15H₂O:MeCN(3→15mins)；85:15→80:20H₂O:MeCN(15→20mins)。通过冻干除去水得到纯产物。

实施例1

本实施例采用上述方法的步骤(1)，以二溴乙烷和对羟基苯乙酮为原料进行取代反应，得如下产物：

表征信息如下：

白色固体；226mg,收率76％(以1mmol二溴乙烷和3mmol对羟基苯乙酮为原料计算)；

m.p.167-169℃；

IR(neat)1666,1602,1253cm^-1；

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.95(d,J＝8.8Hz,4H),6.99(d,J＝8.8Hz,4H), 4.41(s,4H),2.56(s,6H)；

¹³C NMR(100MHz CDCl₃)δ26.5,66.6,114.4,130.8,130.9,162.5,196.9；

MS(ESI)m/z 299(M+H)⁺；

HRMS(ESI)m/z C₁₈H₁₉O₄(M+H)⁺理论值为：299.12779,实测值为 299.12764.

本实施例在所得pre-ArGO-1的基础上，经步骤(2)反应，得如下产物：

表征信息如下：

白色固体；27mg,收率75％(以0.1mmol pre-ArGO-1为原料计算)；

m.p.135-137℃；

IR(neat)3400-3100(br),1653,1633cm^-1；

水合物形式与醛形式的比例＝0.93:0.07；

¹H NMR for hydrate(400MHz,(CD₃)₂SO)δ8.06(d,J＝8.9Hz,4H),7.11(d, J＝8.9Hz,4H),6.66(d,J＝7.2Hz,4H),5.65(t,J＝6.7Hz,2H),4.46(s,4H)；

¹H NMR for aldehyde(400MHz,(CD₃)₂SO)δ9.51(s,2H),7.90(d,J＝8.9Hz, 4H),7.19(d,J＝9.0Hz,4H),4.46(s,4H)；

¹³C NMR(100MHz(CD₃)₂SO)δ66.6,89.1,114.3,126.7,132.1,162.3,194.8；

MS(ESI)m/z 385(M+Na)⁺；

HRMS(ESI)m/z C₁₈H₁₈NaO₈(M+Na)⁺的理论值为385.08939,实测值为 385.08982。

实施例2：

本实施例采用上述方法的步骤(1)，以二碘代乙醚和对羟基苯乙酮为原料进行取代反应，得如下产物：

表征信息如下：

白色固体；278mg,收率81％(以1mmol二碘代乙醚和3mmol对羟基苯乙酮为原料计算)；

m.p.113-115℃；

IR(neat)1676,1601,1257,1065cm^-1；

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.91(d,J＝8.8Hz,4H),6.93(d,J＝8.8Hz, 4H),4.21(t,J＝4.6Hz,4H),3.95(t,J＝4.7Hz,4H),2.54(s,6H)；

¹³C NMR(100MHz CDCl₃)δ26.5,67.7,69.9,114.4,130.6,130.7,162.7, 196.9；

MS(ESI)m/z 343(M+H)⁺；

HRMS(ESI)m/z C₂₀H₂₃O₅(M+H)⁺的理论值为343.15400,实测值为 343.15400.

本实施例在所得pre-ArGO-2的基础上，经步骤(2)反应，得如下产物：

表征信息如下：

白色固体；24mg,收率59％(以0.1mmol pre-ArGO-2为原料计算):

m.p.147-148℃；

IR(neat)3450-3100(br),1669,1597cm^-1；

水合物形式与醛形式的比例＝0.84:0.16；

¹H NMR水合物形式(400MHz,(CD₃)₂SO)δ8.04(d,J＝8.9Hz,4H),7.06 (d,J＝8.9Hz,4H),6.66(d,J＝7.3Hz,4H),5.64(t,J＝7.0Hz,2H),4.23(t,J＝4.4 Hz,4H),3.85(t,J＝4.4 Hz,4H)；

¹H NMR醛形式(400MHz,(CD₃)₂SO)δ9.52(s,2H),8.10(d,J＝8.8Hz, 4H),7.13(d,J＝9.0Hz,4H),4.26(t,J＝4.4Hz,4H),3.85(t,J＝4.4Hz,4H)[4.26 和3.85ppm位置的峰与水合物峰重叠]；

¹³C NMR(100MHz(CD₃)₂SO)δ67.5,68.9,89.0,114.2,126.4,131.8,162.4, 194.7；

MS(ESI)m/z 407(M+H)⁺,429(M+Na)⁺；

HRMS(ESI)m/z C₂₀H₂₂NaO₉(M+Na)⁺的理论值为429.11560,实测值为 429.11642.

实施例3

本实施例采用上述方法的步骤(1)，以1,2-双(2-碘代乙氧基)乙烷和对羟基苯乙酮为原料进行取代反应，得如下产物：

表征信息如下：

白色固体；316mg,收率82％(以1mmol 1,2-双(2-碘代乙氧基)乙烷和3 mmol对羟基苯乙酮为原料计算)；

m.p.173-175℃；

IR(neat)1673,1600,1255cm^-1；

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.91(d,J＝8.8Hz,4H),6.93(d,J＝8.8Hz, 4H),4.18(t,J＝4.7Hz,4H),3.89(t,J＝4.7Hz,4H),3.77(s,4H),2.54(s,6H)；

¹³C NMR(100MHz CDCl₃)δ26.5,67.7,69.7,71.1,114.4,130.6,130.7,162.8,196.9；

MS(ESI)m/z 387(M+H)⁺,409(M+Na)⁺；

HRMS(ESI)m/z C₂₀H₂₃O₆(M+H)⁺理论值为387.18022,实测值为 387.18094.

本实施例在所得pre-ArGO-3的基础上，经步骤(2)反应，得如下产物：

表征信息如下：

白色固体；30mg,收率67％(以0.1mmol pre-ArGO-3为原料计算)；

m.p.86-88℃；

IR(neat)3500-3100(br),1678,1599cm^-1；

水合物形式与醛形式比例＝0.87:0.13；

¹H NMR水合物形式(400MHz,(CD₃)₂SO)δ8.03(d,J＝8.9Hz,4H),7.04 (d,J＝8.9Hz,4H),6.65(d,J＝7.4Hz,4H),5.63(t,J＝7.3Hz,2H),4.18(t,J＝4.5 Hz,4H),3.76(t,J＝4.5Hz,4H),3.61(t,J＝4.5Hz,4H)；

¹H NMR醛形式(400MHz,(CD₃)₂SO)δ9.51(s,2H),8.05(d,J＝9.0Hz, 4H),7.11(d,J＝9.0Hz,4H),4.18(t,J＝4.5Hz,4H),3.76(t,J＝4.5Hz,4H),3.61 (t,J＝4.5Hz,4H)[4.22和3.77ppm位置的峰与水合物峰重叠]；

¹³C NMR(100MHz(CD₃)₂SO)δ67.5,68.8,70.0,89.0,114.2,126.4,131.8, 162.5,194.7；

MS(ESI)m/z 473(M+Na)⁺；

HRMS(ESI)m/z C₂₂H₂₆NaO₁₀(M+Na)⁺理论值为473.14182,实测值为 473.14110.

实施例4：

本实施例采用上述方法的步骤(1)，以二溴乙烷和4-羟基-3-甲氧基苯乙酮: 为原料进行取代反应，得如下产物：

表征信息如下：

白色固体；251mg,收率70％(以1mmol二溴乙烷和3mmol 4-羟基-3- 甲氧基苯乙酮为原料计算)；

m.p.92-94℃；

IR(neat)1673,1592,1269cm^-1；

¹H NMR(400MHz,(CD₃)₂SO)δ7.64(dd,J＝8.4,1.7Hz,2H),7.46(d,J＝ 1.6Hz,2H),7.16(d,J＝8.4Hz,2H),4.44(s,4H),3.81(s,6H),2.54(s,6H)；

¹³C NMR(100MHz CDCl₃)δ26.4,56.2,67.4,110.8,112.2,123.2,131.2, 149.5,152.4,196.9；

MS(ESI)m/z 359(M+H)⁺；

HRMS(ESI)m/z C₂₀H₂₃O₆(M+H)⁺理论值为359.14892,实测值为 359.14914.

本实施例在所得pre-OMe-ArGO-1的基础上，经步骤(2)反应，得如下产物：

表征信息如下：

白色固体；18mg,收率42％(以0.1mmol pre-OMe-ArGO-1为原料计算)；

m.p.214-216℃；

IR(neat)3600-3000(br),1450,1268cm^-1；

水合物形式与醛形式比例＝0.92:0.08；

¹H NMR水合物形式(400MHz,(CD₃)₂SO)δ7.78(d,J＝8.5Hz,2H),7.56(s, 2H),7.18(d,J＝8.5Hz,2H),6.63(d,J＝7.4Hz,4H),5.68(t,J＝6.5Hz,2H),4.45 (s,4H),3.81(s,6H)；

¹H NMR醛形式(400MHz,(CD₃)₂SO)δ9.59(s,2H),7.78(d,J＝8.5Hz,2H), 7.56(s,2H),7.18(d,J＝8.5Hz,2H),4.45(s,4H),3.81(s,6H)；

¹³C NMR(100MHz(CD₃)₂SO)δ55.5,67.1,88.8,111.8,112.0,124.3,126.7, 148.2,152.2,194.8；

MS(ESI)m/z 445(M+Na)⁺；

HRMS(ESI)m/z C₂₀H₂₂NaO₁₀(M+Na)⁺理论值为445.11052,实测值为 445.11038.

实施例5

本实施例采用上述方法的步骤(1)，以二碘代乙醚和4-羟基-3-甲氧基苯乙酮:为原料进行取代反应，得如下产物：

表征信息如下：

白色固体；340mg,收率84％(以1mmol二碘代乙醚和3mmol 4-羟基-3- 甲氧基苯乙酮为原料计算)；

m.p.85-87℃；

IR(neat)1672,1592,1269cm^-1；

¹H NMR(400MHz,CD₃Cl)δ7.51(d,J＝8.1Hz,2H),7.50(s,2H),6.90(d,J ＝8.1Hz,2H),4.26(t,J＝4.9Hz,4H),3.98(t,J＝4.9Hz,4H),3.89(s,6H),2.55(s, 6H)；

¹³C NMR(100MHz CDCl₃)δ26.3,56.1,68.6,69.9,110.6,111.8,123.2,130.8,149.4,152.7,196.9；

MS(ESI)m/z 403(M+H)⁺；

HRMS(ESI)m/z C₂₂H₂₇O₇(M+H)⁺的理论值为403.17513,实测值为 403.17539.

本实施例在所得pre-OMe-ArGO-2的基础上，经步骤(2)反应，得如下产物：

表征信息如下：

白色固体；26mg,收率56％(以0.1mmol pre-OMe-ArGO-2为原料计算)；

m.p.75-77℃；

IR(neat)3600-3100(br),1658,1267cm^-1；

水合物形式与醛形式比例＝0.49:0.51；

¹H NMR水合物形式(400MHz,(CD₃)₂SO)δ7.75(d,J＝8.3Hz,2H),7.55 (s,2H),7.09(d,J＝8.5Hz,2H),6.61(d,J＝6.5Hz,4H),5.67(t,J＝7.5Hz,2H), 4.21(t,J＝4.3Hz,4H),3.91-3.85(m,4H),3.80(s,6H)；

¹H NMR醛形式(400MHz,(CD₃)₂SO)δ9.57(s,2H),7.80(d,J＝8.4Hz, 2H),7.55(s,2H),7.17(d,J＝8.5Hz,2H),4.25(t,J＝4.3Hz,4H),3.91-3.85(m, 4H),3.82(s,6H)；

¹³C NMR(100MHz(CD₃)₂SO)δ55.6,68.0,68.9,88.7,111.7,112.0,124.3, 126.5,148.5,153.7,194.7；

MS(ESI)m/z 489(M+Na)⁺；

HRMS(ESI)m/z C₂₂H₂₆NaO₁₁(M+Na)⁺的理论值为489.13673,实测值为 489.13729.

实施例6

本实施例采用上述方法的步骤(1)，以二溴乙烷和3-羟基苯乙酮为原料进行取代反应，得如下产物：

表征信息如下：

白色固体；234mg,收率73％(以1mmol二溴乙烷和3mmol 3-羟基苯乙酮为原料计算)；

m.p.122-124℃；

IR(neat)1680,1600,1269,1066cm^-1；

¹H NMR(400MHz,CD₃Cl)δ7.58-7.55(m,4H),7.41(t,J＝7.9Hz,2H),7.18 (dd,J＝8.2,2.5Hz,2H),4.41(s,4H),2.60(s,6H)；

¹³C NMR(100MHz CDCl₃)δ26.9,66.8,113.3,120.5,121.8,129.8,138.7, 158.9,198.0；

MS(ESI)m/z 321(M+Na)⁺；

HRMS(ESI)m/z C₁₈H₁₈NaO₄(M+Na)⁺理论值为321.10973,实测值为 321.10971.

本实施例在所得pre-m-ArGO-1的基础上，经步骤(2)反应，得如下产物：

表征信息如下：

白色固体；27mg,收率76％(以0.1mmol pre-m-ArGO-1为原料计算)；

m.p.115-117℃；

IR(neat)3500-3100(br),1698,1587,1044cm^-1；

水合物形式与醛形式比例＝0.66:0.34；

¹H NMR水合物形式(400MHz,(CD₃)₂SO)δ7.68(d,J＝7.8Hz,4H),7.63 (s,2H),7.46(t,J＝8.0Hz,2H),7.28(dd,J＝8.2,2.2Hz,2H),5.73-5.64(m,2H), 4.52-4.31(m,4H)；

¹H NMR醛形式(400MHz,(CD₃)₂SO)δ9.53(s,2H),7.71(d,J＝8.0Hz,2H), 7.64(s,2H),7.53(t,J＝8.0Hz,2H),7.38(dd,J＝7.9,2,2Hz,2H),4.52-4.31(m, 4H)；

¹³C NMR水合物形式(100MHz(CD₃)₂SO)δ66.5,89.1,115.0,121.0,122.9, 130.1,135.1,158.3,189.2；

¹³C NMR醛形式(100MHz(CD₃)₂SO)δ66.7,114.9,119.6,122.0,129.7, 133.4,158.2,187.7,195.9；

MS(ESI)m/z 385(M+Na)⁺；

HRMS(ESI)m/z C₁₈H₁₈NaO₈(M+Na)⁺的理论值为385.08939,计算值为 385.09002.

实施例7

本实施例采用上述方法的步骤(1)，以二碘代乙醚和3-羟基苯乙酮为原料进行取代反应，得如下产物：

表征信息如下：

白色固体；256mg,收率75％(以1mmol二碘代乙醚和3mmol 3-羟基苯乙酮为原料计算)；

m.p.65-67℃；

IR(neat)1672,1592,1269cm^-1；

¹H NMR(400MHz,CD₃Cl)δ7.55-7.51(m,4H),7.36(t,J＝7.9Hz,2H),7.14 (dd,J＝8.2,2.2Hz,2H),4.22(t,J＝4.7Hz,4H),3.96(t,J＝4.7Hz,4H),2.59(s, 6H)；

¹³C NMR(100MHz CDCl₃)δ26.9,67.8,70.0,113.4,120.3,121.5,129.7, 138.6,159.1,198.1；

MS(ESI)m/z 343(M+H)⁺；

HRMS(ESI)m/z C₂₀H₂₃O₅(M+H)⁺的理论值为343.15400,实测值为 343.15474.

本实施例在所得pre-m-ArGO-2的基础上，经步骤(2)反应，得如下产物：

表征信息如下：

白色固体；16mg,收率39％(以0.1mmol pre-m-ArGO-2为原料计算)；

m.p.59-61℃；

IR(neat)3600-3000(br),1691,1581,1264cm^-1；

水合物形式与醛形式比例＝0.82:0.18；

¹H NMR水合物形式(400MHz,(CD₃)₂SO)δ7.66(d,J＝7.8Hz,2H),7.59(s, 2H),7.43(t,J＝7.9Hz,2H),7.23(dd,J＝8.2,2.2Hz,2H),6.74(d,J＝3.8Hz,4H), 5.72-5.64(m,2H),4.18(t,J＝4.2Hz,4H),3.85(t,J＝4.2Hz,4H)；

¹H NMR醛形式(400MHz,(CD₃)₂SO)δ9.54(s,2H),7.68(d,J＝7.8Hz,2H), 7.59(s,2H),7.50(t,J＝7.9Hz,2H),7.32(dd,J＝8.2,2.0Hz,2H),4.18(t,J＝4.2 Hz,4H),3.85(t,J＝4.2Hz,4H)；

¹³C NMR水合物形式(100MHz(CD₃)₂SO)δ67.3,68.9,89.1,114.9,119.5, 121.8,129.6,133.3,158.3,187.7；

¹³C NMR醛形式(100MHz(CD₃)₂SO)δ67.5,69.0,115.0,121.0,122.8, 130.1,135.0,158.5,189.3,195.9；

MS(ESI)m/z 429(M+Na)⁺；

HRMS(ESI)m/z C₂₀H₂₂NaO₉(M+Na)⁺的理论值为429.11560,实测值为 429.11558.

实施例8

本实施例采用上述方法的步骤(1)，以二溴乙烷和2-羟基苯乙酮为原料进行取代反应，得如下产物：

表征信息如下：

白色固体；138mg,收率46％(以1mmol dibromoethane和3mmol 2-羟基苯乙酮为原料计算)；

m.p.133-135℃；

IR(neat)1667,1294,1235cm^-1；

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.74(dd,J＝7.7,1.8Hz,2H),7.48(td,J＝7.7, 1.8Hz,2H),7.05(td,J＝7.5,0.8Hz,2H),7.00(d,J＝8.3Hz,2H),4.50(s,4H), 2.58(s,6H)；

¹³C NMR(100MHz CDCl₃)δ32.0,67.0,112.5,121.5,128.9,130.7,133.8, 157.6,199.7；

MS(ESI)m/z 299(M+H)⁺,321(M+Na)⁺；

HRMS(ESI)m/z C₁₈H₁₉O₄(M+H)⁺的理论值为299.12779,实测值为 299.12755.

本实施例在所得pre-o-ArGO-1的基础上，经步骤(2)反应，得如下产物：

表征信息如下：

白色固体；12mg,收率30％(以0.1mmol pre-o-ArGO-1为原料计算)；

m.p.144-146℃；

IR(neat)3600-3100(br),1678cm^-1；

水合物形式与醛形式比例＝0.97:0.03；

¹H NMR水合物形式(400MHz,(CD₃)₂SO)δ7.59(d,J＝7.6Hz,2H),7.55(t, J＝8.3Hz,2H),7.22(d,J＝8.3Hz,2H),7.07(t,J＝7.3Hz,2H),6.34(d,J＝8.2 Hz,4H),5.75(t,J＝8.2Hz,2H),4.45(s,4H)；

¹H NMR醛形式(400MHz,(CD₃)₂SO)δ9.72(s,2H),7.60(d,J＝7.6Hz,2H), 7.55(t,J＝8.3Hz,2H),7.22(d,J＝8.3Hz,2H),7.07(t,J＝7.3Hz,2H),4.45(s, 4H)；

¹³C NMR水合物形式(100MHz(CD₃)₂SO)δ67.6,90.2,114.0,121.3,126.7, 130.8,134.1,157.8,199.7；

MS(ESI)m/z 385(M+Na)⁺,399(M+H+2H₂O)⁺,314(M+Na+2MeOH)⁺；

HRMS(ESI)m/z C₁₈H₁₈NaO₈(M+Na)⁺理论值为385.08939,实测值为385.08947.

实施例9

本实施例采用上述方法的步骤(1)，以N,N’-二甲基乙二胺和对乙酰苯甲酸为原料进行氧化反应，得如下产物：

表征信息如下：

白色固体；357mg,收率94％(以1mmol N,N’-二甲基乙二胺和3mmol对乙酰苯甲酸为原料计算)；

m.p.139-141℃；

IR(neat)1685,1633,1402,1267cm^-1；

¹H NMR(400MHz,CD₃Cl)δ7.94(d,J＝8.3Hz,4H),7.46(d,J＝8.3Hz, 4H),3.92(s,4H),3.08(s,6H),2.59(s,6H)；

¹³C NMR(100MHz,(CD₃)₂SO)δ26.8,37.2,44.0,126.6,128.3,137.0,141.0,169.7,197.5；

MS(ESI)m/z 381(M+H)⁺；

HRMS(ESI)m/z C₂₂H₂₅N₂O₄(M+H)⁺理论值为381.18088,实测值为 381.18210.

本实施例在所得pre-amide-ArGO-1的基础上，经步骤(2)反应，得如下产物：

表征信息如下：

白色固体；16mg,收率36％(以0.1mmol pre-amide-ArGO-1为原料计算)；

m.p.132-134℃；

IR(neat)1685,1633cm^-1；

水合物形式与醛形式比例＝0.91:0.09；

¹H NMR水合物形式(400MHz,(CD₃)₂SO)δ8.10(d,J＝7.6Hz,4H),7.46 (t,J＝8.0Hz,4H),6.82(d,J＝7.1Hz,4H),5.67(t,J＝7.1Hz,4H),3.80(s,4H), 2.95(s,6H)；

¹H NMR醛形式(400MHz,(CD₃)₂SO)δ9.51(s,2H),8.10(d,J＝7.6Hz,4H), 7.46(t,J＝8.0Hz,4H),3.80(s,4H),2.95(s,6H)；

¹³C NMR水合物形式(100MHz(CD₃)₂SO)δ37.3,44.1,89.4,126.4,129.5, 134.0,141.1,169.8,195.7；

MS(ESI)m/z 445(M+H)⁺,473(M+H+2MeOH)⁺；

HRMS(ESI)m/z C₂₂H₂₅N₂O₈(M+H)⁺的理论值为445.16054,实测值为 445.16129.

实施例10：

本实施例采用上述方法的步骤(1)，以2,2'-氧双(乙胺)和对乙酰苯甲酸为原料进行取代反应，得如下产物：

表征信息如下：

白色固体；372mg,收率94％(以1mmol 2,2'-氧双(乙胺)和3mmol对乙酰苯甲酸为原料计算)；

m.p.198-200℃；

IR(neat)1679,1634cm^-1；

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.66(t,J＝5.8Hz,2H),7.98(d,J＝8.4Hz, 4H),7.92(d,J＝8.4Hz,4H),3.59(t,J＝5.8Hz,4H),3.46(q,J＝5.8Hz,4H),2.61 (s,6H)；

¹³C NMR(100MHz DMSO-d₆)δ26.9,68.5,127.5,128.0,138.2,138.5,165.6,197.7；

MS(ESI)m/z 397(M+H)⁺,419(M+Na)⁺；

HRMS(ESI)m/z C₂₂H₂₅N₂O₅(M+H)⁺的理论值为397.17580,实测职位 397.17568.

本实施例在所得pre-amide-ArGO-2的基础上，经步骤(2)反应，得如下产物：

表征信息如下：

白色固体；25mg,收率54％(以0.1mmol pre-amide-ArGO-1为原料计算)；

m.p.117-118℃；

IR(neat)1696,1635cm^-1；

水合物形式与醛形式比例＝0.97:0.03；

¹H NMR水合物形式(400MHz,(CD₃)₂SO)δ8.68((t,J＝5.0Hz,2H),8.11(d, J＝7.9Hz,4H),7.94(d,J＝7.9Hz,4H),6.83(d,J＝7.2Hz,4H),5.68(t,J＝7.0 Hz,2H),3.59(t,J＝5.8Hz,4H),3.46(t,J＝5.8Hz,4H)；

¹³C NMR水合物形式(100MHz(CD₃)₂SO)δ68.6,89.5,92.4,127.0,129.3, 135.0,138.2,165.5,194.3；

MS(ESI)m/z 461(M+H)⁺,483(M+Na)⁺；

HRMS(ESI)m/z C₂₂H₂₅N₂O₉(M+H)⁺的理论值为461.15565,实测值为 461.15546.

实施例11：

以1,5-二(4-乙酰苯氧基)戊烷为原料，经步骤(2)反应，得如下产物：

表征信息如下：

白色固体；33mg,收率83％(以0.1mmol1,5-二(4-乙酰苯氧基)戊烷为原料计算)；

m.p.97-99℃；

IR(neat)3600-3000(br),1682,1603,1033cm^-1；

水合物形式与醛形式比例＝0.58:0.42；

¹H NMR水合物形式(400MHz,(CD₃)₂SO)δ8.04(d,J＝8.8Hz,4H),7.04 (d,J＝8.8Hz,4H),6.62(d,J＝7.3Hz,4H),5.65(t,J＝7.0Hz,2H),4.21-4.00(m, 4H),1.89-1.75(m,4H),1.67-1.49(m,2H)；

¹H NMR醛形式(400MHz,(CD₃)₂SO)δ9.53(s,2H),8.07(d,J＝8.9Hz,4H), 7.11(d,J＝8.8Hz,4H),4.21-4.00(m,4H),1.89-1.75(m,4H),1.67-1.49(m,2H)；

¹³C NMR水合物形式(100MHz(CD₃)₂SO)δ22.0,28.2,67.7,89.0,114.1, 124.6,131.7,162.2,185.6；

¹³C NMR醛形式(100MHz(CD₃)₂SO)δ22.0,28.2,68.0,114.7,126.2,132.6, 163.7,190.2,194.6；

MS(ESI)m/z 427(M+Na)⁺；

HRMS(ESI)m/z C₂₁H₂₄NaO₈(M+Na)⁺的理论值为427.13634,实测值为 427.13620.

经检测，本发明各实施例提供交联剂均可以与精氨酸实现有效交联。

实验例1：ArGO交联剂与BSA的反应

本发明利用ArGO 2和BSA优化了蛋白质交联的步骤。为了识别最高效的ArGO交联剂，我们将每个类似物分别与BSA在优化后的条件下进行反应，结果发现没有任何邻位或者间位的交联剂展现出和初始的对位交联剂一样好的性质。ArGO1系列中，改变芳环的电性使交联剂从BSA中识别出的多肽对更多(将OMe-ArGO1和amide-ArGO1与ArGO1比较),但是ArGO2系列中识别的多肽对减少(ArGO2>OMe-ArGO2>amide-ArGO2)。正如预期，间隔臂的灵活度有利于交联：灵活度低的BDG的最大Cα-Cα距离比ArGO1低(分别是

和

)，BDG仅能获得12个交联的多肽对而ArGO1可以得到27 个。使用烷基链取代乙二醇链后略降低了可识别的多肽对，如HP-ArGO。由于间隔臂中酯基的水解，可识别的多肽对数目降低。结果如图3所示。

实验例2：ArGO 1-3交联剂最长长度的计算

本实验例对ArGO2进行分子动力学模拟。在没有水分子的情况下，ArGO2 的C_z-C_z距离可达到

Figure DEST_PATH_GDA00013894027700002310

两个主要构象下的距离极值分别对应折叠 (π-π稳定)和展开的结构。然而，在水分子中只能观察到展开形式的构象，距离范围较窄为

(图4).在蛋白质的表面，两种构象都有可能出现。因此，我们选择了

作为ArGO2距离的最大值，对应最大

类似的，ArGO1的

ArGO3的

实验例3：使用8种模式蛋白筛选最佳ArGO化合物

本实验例在BSA交联结果的基础上，选取了五个交联剂分子：ArGO 1、ArGO 2、ArGO3、OMe-ArGO 2和HP-ArGO与8种模式蛋白(二磷酸果糖酶，β-淀粉酶，BSA，过氧化氢酶，GST，乳铁蛋白，溶酶素和PUD 1/2异质二聚体)(图5)进行进一步的评估。ArGO 1-3的间隔臂长度顺序增加，因此产生的交联对似乎也应该顺序增加，但事实并非如此(图5a)。如图5b中表格所示，在 0.5mM或1.0mM ArGO浓度下它们的表现相差无几。观察到的交联对数目差别主要是取决于蛋白质而非交联剂。ArGO 2系列也得到了相似的结果； ArGO-2,HP-ArGO和OMe-ArGO 2的结果如图5c所示。

实验例4：交联剂的结构兼容性

本实验例为了确定ArGO 1-3是否可以提供准确的蛋白质结构信息，将识别得到的交联结果和每个蛋白质对应的晶体结构比对。有趣的是，尽管交联剂的臂长不同，但三种交联剂交联结果的距离分布一致(图6)，和ArGO系列得到接近可识别交联分子种类数的情形是类似的(图5a)。其中，ArGO1的结构相容性为91％，距离的最大值为

ArGO2的结构相容性为87％，距离的最大值为

ArGO3的结构相容性为90％，距离的最大值为

在赖氨酸特异的交联剂研究中出现过相似的结果，EGS作为一个比BS3更长的交联剂并没有得到更长的交联后分子，因为EGS完全延展的构象能量较高。对于ArGO 1-3，87％或更多的交联分子在计算得到的Cα-Cα距离限制内，而75％ BS³交联分子在计算得到的Cα-Cα距离

内。很多因素都可能造成余下那些不符合晶体结构的交联分子出现，包括蛋白质在溶液中的动力学。根据上述结果，我们总结得到精氨酸特异的ArGO交联剂可以如赖氨酸特异交联剂一般有效的捕捉蛋白质构象。

实验例5：ArGO 2交联剂的互补反应

最优的ArGO2交联剂具有不同间隔臂长这一特点可以满足蛋白质中不同的残基。事实上，我们观察到143对交联对中有37对(26％)是被ArGO2(图7) 特异交联的。类似的，HP-ArGO的特异交联对占总对数的14％，OMe-ArGO2 的特异交联对占29％。这些结果显示，使用多种ArGO交联剂可以增加蛋白质表面参与交联的残基数目，因为不同的交联分子有各自特异的可交联精氨酸残基类型。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种蛋白质化学交联剂，其特征在于，选自如下化合物：

2.权利要求1所述蛋白质化学交联剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：以双乙酰苯类化合物为原料，以SeO₂为氧化剂进行氧化反应，所得产物在水中加热回流，即得。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述双乙酰苯类化合物以羟基苯乙酮和双卤代直链烃为原料，经取代反应得到；

或，所述双乙酰苯类化合物以对乙酰苯甲酸和二元胺或二元醇为原料，经氧化反应得到。

4.权利要求1所述的交联剂在蛋白质分析中的应用。

5.权利要求1所述的交联剂在含有精氨酸的蛋白质分析中的应用。