KR101125058B1

KR101125058B1 - 물질 표지용 화합물 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR101125058B1
Application number: KR1020090090954A
Authority: KR
Inventors: 박진우; 정두영; 나종주
Original assignee: 주식회사 디케이씨코포레이션
Priority date: 2009-09-25
Filing date: 2009-09-25
Publication date: 2012-03-21
Also published as: KR20110033451A

Abstract

본 발명은 다음 화학식 1c로 표시되는 물질 표지용 화합물, 그 제조 중간체 및 그 제조방법에 관한 것이다.

[화학식 1c]

상기 식에서 치환기는 명세서에 정의한 바와 같다.

Description

물질 표지용 화합물 및 그 제조방법{Compound for labeling material, intermediate therefor and process for producing the same}

본 발명은 다양한 물질의 표지용 화합물, 그 제조 중간체 및 그 제조방법에 관한 것이다.

염료의 반응기와 결합할 수 있는 단백질 구조 내의 치환기는 기본 구조가 되는 아미노산(amino acid)의 구조로부터 유추할 수 있다. 그 예로는 아미노산 잔기를 들 수 있는데, 구체적으로는 라이신(lysine)의 아미노기(-CH₂CH₂CH₂CH₂NH₂), 시스테인(cystein)의 티올기(-CH₂SH), 히스티딘(histidine)의 이미다졸 아민기(

), 트레오닌(threonine)의 2차 지방족 히드록시기(-CH₂CH(OH)CH₃), 세린(serine)의 1차 지방족 히드록시기(-CH₂OH), 티로신(tyrosine)의 페놀 히드록시기(

) 등이 있다. 아미노산의 N-말단 아미노기(-COCHRNH₂)와의 결합도 가능하다. 또한, 염료의 반응기는 당(sugar), 당단백(glycoprotein), 항체(antibody) 등의 생체 분자와 결합할 수도 있다.

현재까지 알려진 생체 분자 표지용 염료나 물질에 사용되는 반응기들은 생체 분자와 결합되는 치환기에 따라 분류할 수 있고, 각각의 관용명으로도 통용된다. 단백질 분자의 아민기와 결합을 목적으로 하는 반응기로서 가장 많이 이용되는 것은 숙신이미딜 에스터와 이소티오시아네이트이고, 단백질 분자의 티올기와 결합을 목적으로 하는 반응기로서 가장 많이 이용되는 것은 말레이미드이며, 단백질 분자의 히드록시기와 결합을 목적으로 하는 반응기로는 아래와 같은 것들이 있다.

모든 염료가 형광을 나타내는 것은 아니다. 다양한 분야의 연구자들이 형광을 나타낼 수 있는 발색단(chromophore)을 가진 염료를 개발하였다. 지금까지 알려진 형광 물질(fluorophore)의 대표적인 예로는 안트라닐레이트(anthranilate), 1-알킬틱 이소인돌(1-alkylthic isoindoles), 피롤리논(pyrrolinones), 비메인(bimanes), 벤즈옥사졸(benzoxazole), 벤즈이미다졸(benzimidazole), 벤조퓨란(benzofurazan), 나프탈렌(naphthalenes), 쿠마린(coumarins), 스틸벤(stilbenes), 카바졸(carbazoles), 페난트리딘(phenanthridine), 안트라센(anthracenes), 아크리딘(acridines), 플로세인(fluoresceins), 에오신(eosins), 로다민(rhodamines), 피렌(pyrenes), 크리센(chrysenes) 등을 들 수 있고, 이들과 유사한 구조의 유도체들도 연구되고 있다. 이러한 형광 물질들은 앞에서 기술한 다 양한 생체 분자 결합용 반응기에 도입되어 다양한 상품으로 시판되고 있다.

상기와 같은 다수의 형광 염료 중에서 바이오 분야에서 이용 가능한 형광을 나타내도록 하기 위해서는 대부분의 생체 분자들이 존재하는 매질, 즉 수용액 내에 존재할 때 강한 형광을 내는 것이 중요하다. 이러한 목적으로 가장 많이 사용되는 형광 염료로는 잔텐(xanthane) 계열의 플로세인 및 로다민과, 폴리메틴(polymethine) 계열의 시아닌을 들 수 있다.

염료를 N,N-디메틸포름아미드(DMF) 또는 N,N-디메틸설폭사이드(DMSO)에 용해시켜 사용하는데, 염료 1 mg을 용매 100 μl에 용해시킨 후 분취하여 사용하는 경우가 많다. 염료의 사용량은 일반적으로 염색 대상이 되는 생체 분자에 대하여 당량비로 5 내지 100배 정도의 과량으로 사용되는데, 이는 단백질 분자는 1 당량이라도 주로 반응의 목표가 되는 아미노기, 히드록시기 또는 티올기의 개수가 훨씬 많기 때문이다. 복잡한 단백질 구조 내에 침투하여 반응하려면 상대적으로 더 높은 수용액 안정성이 요구됨에도 불구하고, 숙신이미딜 에스터의 경우는 오랜 반응 시간 동안 안정한 상태로 유지할 수 없는 것이 단점이다.

본 발명은 상기와 같은 종래의 문제점을 극복하는 것은 물론, 높은 형광 성능, 생체 분자와 같은 표지 대상 물질과의 반응시간 및 결합성능 또는 반응 후 이탈기 분리에 따른 부산물 발생뿐만 아니라, 수용액상에서의 안정성, 특히 다양한 pH에서의 안정성, 열안정성 외에도 수용액이나 친수성 조건에서의 광표백 및 소광 현상 발생, 몰흡광계수, 형광이 발생되는 파장영역 등의 발명의 효과가 새롭게 발현되거나 이들 물성이 현저하게 향상된 효과를 보이고, 나아가 다양한 완충액에서 염색이 가능한 장점을 보이는 표지 대상 물질, 그 제조방법 및 본 발명의 물질 표지용 물질을 포함하는 생체 분자 등 물질을 제공하고자 한다.

일 측면에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 1c로 표시되는 물질 표지용 화합물을 개시한다.

상기 2개의 R1은 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 수소, 탄소 수 1 내지 6의 알킬기 또는 할로겐 원자이며; 상기 2개의 R2는 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 수소, 탄소 수 1 내지 6의 알킬기 또는 할로겐 원자이며; 상기 2개의 R3은 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 수소, 탄소 수 1 내지 6의 알킬기 또는 할로겐 원자이며; 상기 2개의 R1'은 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 수소 또는 탄소 수 1 내지 6의 알킬기이다.

상기 X1 또는 X2 중 어느 하나는

이고 나머지 하나는 수소 이며; 상기 B는(CH₂)_L, p-(C₆H₄) 또는 m-(C₆H₄)이고 상기 L은 1 내지 5의 정수이다.

일 구현예에 따르면, 본 발명의 물질 표지용 화합물은 하기 화학식 1의 구조를 갖는다.

상기 2개의 R1은 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 수소, 탄소 수 1 내지 6의 알킬기 또는 할로겐 원자이며; 상기 2개의 R2는 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 수소, 탄소 수 1 내지 6의 알킬기 또는 할로겐 원자이며; 상기 2개의 R3은 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 수소, 탄소 수 1 내지 6의 알킬기 또는 할로겐 원자이며; 상기 각각의 할로겐 원자는 불소, 염소, 브롬 및 요오드 중에서 선택되며; 상기 B는(CH₂)_L, p-(C₆H₄) 또는 m-(C₆H₄)이고 상기 L은 1 내지 5의 정수이다.

다른 구현예에 따르면, 본 발명의 물질 표지용 화합물은 하기 화학식 중 어느 하나의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 물질 표지용 화합물:

다른 측면에 따르면, 본 발명은 본 발명의 물질 표지용 화합물을 포함하는 물질을 개시한다.

본 발명에 있어서, 표지 대상 물질은 본 발명에 따른 물질 표지용 화합물과 결합할 수 있는 관능기를 포함하고, 이러한 관능기의 예로는 아민기, 수산화기 또 는 티올기 등의 관능기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이러한 표지 대상 물질의 예에는 생체 분자, 나노 입자 및 유기 화합물 등이 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 특히 생체 분자의 예로는 단백질, 펩타이드, 탄수화물, 당, 지방, 항체, 프로테오글라이칸, 글라이코프로틴 및 siRNA 등이 포함되나, 이에 한정되지 않는다.

또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 본 발명에 따른 물질 표지용 화합물을 이용하여 물질을 표지하는 방법을 개시한다.

일 구현예에 따르면, 상기 표지 방법은 본 발명에 따른 물질 표지용 화합물 및 표지 대상 물질을 반응시키는 단계를 포함한다.

다른 구현예에 따르면, 상기 반응은 본 발명에 따른 물질 표지용 화합물의 비닐 설폰기와 표지 대상 물질이 포함하는 아민기, 수산화기 및 티올기 중에서 선택된 적어도 하나의 관능기가 서로 반응할 수 있는 조건에서 수행하는 것이 바람직하다.

또 다른 구현예에 따르면, 상기 반응은 pH 5-12 및 20-80℃의 조건에서 30분 내지 48시간 동안 수행하는 것이 바람직하며, 포스페이트 완충액, 카보네이트 완충액, 트리스 완충액, 디메틸설폭사이드, 디메틸포름아미드, 아세토니트릴 및 물 중에서 선택된 용매 내에서 수행하는 것이 바람직하다.

또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 4의 구조를 갖는 표지 대상 물질의 제조 중간체를 개시한다.

상기 2개의 R1은 서로 같거나 상이하고 독립적으로 수소, 탄소 수 1 내지 6의 알킬기 또는 할로겐 원자이며; 상기 2개의 R2는 서로 같거나 상이하고 독립적으로 수소, 탄소 수 1 내지 6의 알킬기 또는 할로겐 원자이며; 상기 2개의 R3은 서로 같거나 상이하고 독립적으로 수소, 탄소 수 1 내지 6의 알킬기 또는 할로겐 원자이며; 상기 R₄는 카르복시기, 카르복시기 염기, 설폰산기, 설폰산 염기 또는 수소이다.

또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 5a 또는 화학식 5b의 구조를 갖는 물질 표지용 화합물의 제조 중간체를 개시한다.

또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물을 제조하는 방법을 개시하며, 상기 제조방법은 하기 화학식 5a 또는 화학식 5b의 화합물 또는 이들의 혼합물을 하기 화학식 6의 화합물과 반응시키는 단계를 포함한다.

[화학식 5a]

[화학식 5b]

일 구현예에 따르면, 상기 반응은 휘니그 염기 존재 하에서 수행하는 것이 바람직하다.

또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 상기 화학식 4의 화합물을 제조하는 방법을 개시하며, 상기 제조방법은 하기 화학식 2의 화합물을 화학식 3의 화합물과 반응시키는 단계를 포함한다.

또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 상기 화학식 5a 또는 화학식 5b의 화합물을 제조하는 방법을 개시하며, 상기 제조방법은 상기 화학식 4의 화합물을 1,1'-카르보닐디이미다졸 또는 N,N-디숙신이미딜 카보네이트와 반응시키는 단계를 포함한다.

또한, 본 발명에서는 상기 화학식 1의 화합물의 제조 방법 및 이를 이용한 다양한 용매, 예를 들면 완충액(buffer solution) 내에서 생체 분자, 나노 입자 또는 유기 화합물을 상기 화학식 1의 화합물로 표지하는 방법(binding protocol)이 제공된다.

본 발명에 따른 물질 표지용 화합물은 특히 프로테오믹스(proteomics), 광학 분자 영상 등의 분야에서 단백질, 지방, 탄수화물 등의 생체 분자 등 표지 대상 물질의 동정을 관찰하기 위하여 광범위하게 사용될 수 있다.

한편, 아래에 예시로 든 것처럼 본 발명에 따른 물질 표지용 화합물은 pH 조건 등에 따라서 호변이성질화(tautomerizm)이 발생할 수도 있고, 따라서 본 발명의 범위는 이들 두 종류의 이성질체를 모두 포함하며 결코 이 중 어느 한 종류의 이성질체로 제한되어 해석될 수 없다.

본 발명품은 생체분자 연구자들이 표지 실험 수행 시 보다 안정적으로 염료를 다룰 수 있도록 하며 특히 생체분자와 염료의 결합 후 부산물이 발생하지 않아 부수적인 정제 작업을 피할 수 있게 된다. 또한 높은 안정성으로 장시간 보관이 용이할 뿐만 아니라 고분자 생체 분자의 장시간 염색이나 보다 복잡한 생체 분자를 다루는 사용자들에게도 보다 효과적으로 활용될 수 있다.

또한, 본 발명의 물질 표지 대상 물질은 높은 형광 성능, 생체 분자와 같은 표지 대상 물질과의 반응시간 및 결합성능 또는 반응 후 이탈기 분리에 따른 부산물 발생뿐만 아니라, 수용액상에서의 안정성, 특히 다양한 pH에서의 안정성, 열안정성 외에도 수용액이나 친수성 조건에서의 광표백 및 소광현상 발생, 몰흡광계수, 형광이 발생되는 파장영역 등의 발명의 효과가 새롭게 발현되거나 이들 물성이 현저하게 향상되는 효과를 보이고, 나아가 다양한 완충액에서 염색이 가능한 장점을 보인다.

본 발명에 따른 물질 표지용 화합물에는 비닐 설폰기가 도입되어 있으며, 상기 비닐 설폰기의 비닐기는 생체 분자의 친핵체와 아래와 같은 반응으로 결합한다.

본 발명에 따른 물질 표지용 화합물은 생체 분자와의 반응 후에 부산물을 생성시키지 않는 등의 이질적 효과를 보인다.

이하에서는 본 발명에 따른 상기 화학식 1의 화합물의 제조 방법을 예시적으로 설명한다. 본 발명에 따른 상기 화학식 1의 화합물의 제조 방법에서는 다음 화학식 2의 화합물 2당량과 화학식 3의 화합물 1당량을 반응식 1에 예시된 바와 같이 반응시켜 화학식 4의 화합물을 얻을 수 있다.

[화학식 2]

[화학식 3]

상기 화학식 2 내지 4 및 반응식 1에 있어서, R₁, R₂ 및 R₃은 각각 상기 화학식 1에 대하여 정의한 바와 같다. 화학식 3 내지 4 및 반응식 1에 있어서, R₄는 카르복시기, 카르복시기 염기, 설폰산기, 설폰산 염기 또는 수소이다.

화학식 4의 경우 하기 화학식 4a 및 4b의 화합물이 합성 단계에서 일정 비율 로 동시에 생성되며 합성 조건과 출발 물질에 따라서 비율은 달라질 수 있다. 두 가지 화합물은 칼럼 크로마토그래피 방법으로 분리하거나 메탄올, 에탄올 등을 사용한 재결정 방법으로도 따로 얻을 수 있다.

다음으로, 상기 화학식 4의 화합물에서 R₄가 카르복시기인 경우 반응식 2에 예시된 바와 같이 1,1'-카르보닐디이미다졸(CDI) 또는 N,N-디숙신이미딜 카보네이트(DSC)와 반응시켜 화학식 5a 또는 5b의 화합물을 얻는다.

[화학식 5a]

[화학식 5b]

상기 화학식 5a 및 5b에 있어서, R₁, R₂및 R₃ 은 각각 상기 화학식 1에 대하여 정의한 바와 같다.

상기 반응식 2에 있어서, R₁, R₂ 및 R₃은 각각 상기 화학식 1에 대하여 정한 바와 같고, R₅는 화학식 5a에서는 이미다졸기이고, 화학식 5b에서는 숙신이미딜옥시기이다.

다음으로, 상기 화학식 5a 또는 5b의 화합물을 반응식 3에 예시된 바와 같이 휘니그 염기(Hunig's base) 존재 하에서 하기 화학식 6으로 표시되는 화합물과 반응시켜 화학식 1의 화합물을 얻는다.

[화학식 6]

상기 화학식 6 및 반응식 3에 있어서, R₁, R₂ 및 R₃은 각각 상기 화학식 1에 대하여 정의한 바와 같고, R₅는 화학식 5a에서는 이미다졸기이고, 화학식 5b에서는 숙신이미딜옥시기이며, R₆은 불소, 염소, 브롬 및 요오드로 구성된 군에서 선택되는 할로겐 원자, 또는 설파토기(-OSO₃H)이고, B는(CH₂)_l, p-(C₆H₄) 또는 m-(C₆H₄) 이며 여기서 l은 1 내지 5의 정수이다.

화학식 4a 및 4b의 화합물을 사용하여 반응식 2, 3의 단계를 거쳐 혼합된 형태가 아닌 하기 화학식 1a, 1b와 같은 순수한 화합물 형태로 얻을 수도 있다.

또한 본 발명은 상기 화학식 1의 신규 플로세인 화합물을 이용하여 아민기, 수산화기 또는 티올기를 포함하는 생체 분자, 나노 입자 또는 유기 화합물을 표지하는 방법(binding protocol)에 관한 것이다.

상기 생체 분자는 바람직하게는 단백질, 펩타이드(peptide), 탄수화물, 당, 지방, 항체, 프로테오글라이칸(proteoglycan), 글라이코프로틴(glycoprotein) 및 siRNA로 구성된 군에서 선택된다.

상기 표지는 화학식 1 화합물에 존재하는 비닐 설폰기와 상기 아민기, 수산화기 또는 티올기의 반응에 의하여 상기 화학식 1 화합물과 생체 분자, 나노 입자 또는 유기 화합물, 구체적으로는 상기 생체 분자, 나노 입자 또는 유기 화합물에 존재하는 아민기, 수산화기 또는 티올기의 결합에 의하여 이루어지는 것이다.

본 발명에 따른 상기 화학식 1의 화합물은 기존의 숙신이미딜 에스터를 가진 플로세인 염료의 경우와 마찬가지로 단백질과 화학식 1의 화합물과의 반응에 의하여 단백질에 쉽게 염색될 수 있다.

따라서, 상기 표지는 용매로서 포스페이트 완충액, 카보네이트 완충액 및 트리스 완충액으로 구성된 군에서 선택되는 완충액, 디메틸설폭사이드, 디메틸포름아미드 및 아세토니트릴로 구성된 군에서 선택되는 유기 용매, 또는 물을 사용하고, pH 5 내지 12에서 상기 화학식 1의 화합물과 상기 생체 분자, 나노 입자 또는 유기 화합물을 반응시키는 것에 의하여 이루어진다. 상기 반응은 20 내지 80℃의 온도에서 30분 내지 48시간 동안이면 충분하다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물로 표지되어 있는 생체 분자, 나노 입자 및 유기 화합물로 구성된 군에서 선택되는 물질에 관한 것이다.

생체 분자의 경우 포장 단위에서부터 이미 정해진 완충액에 용해되어 있는 경우가 대부분이고, 생체 분자의 안정성을 확보하기 위하여 별도의 완충액 또는 pH를 요구하는 경우가 많아서 변수로 조절하는 것은 용이하지 않다. 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 다양한 완충액, 반응 온도, pH 조건 등에서 단백질과 용이하게 반응하여 형광을 발현하므로, 생체 분자 표지용으로 사용하기에 적합하다.

실시예

이하에서는 실시예 및 비교 실험을 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것이 아니다.

먼저, 실시예 및 비교 실험에서 사용된 실험 장치, 분석 장비 및 시약에 대하여 설명한다.

FT-NMR 분광 분석을 위한 기기로는 Bruker사의 Avance 300 및 400을 사용하였고, LC/MS에는 Varian사의 1200L Quadrupole을 사용하여, ESI(electrospray ionization) 방식으로 측정되었다. MALDI-TOF M/S는 Voyager MALDI-TOF DE 질량분석기(mass spectrometer)를 사용하였다.

합성된 염료의 흡수 파장 및 최대 파장에서의 흡수값은 Hewlett-Packard사의 HP 8452 배열 분광 광도계(diode array spectrophotometer)로 측정되었고, 발광 파장 및 최대 발광 파장에서의 발광값은 Perkin Elmer사의 LS-55를 사용하여 얻었다.

유기 화합물의 분리 및 정제를 위한 칼럼 크로마토그래피는 정상(normal phase)의 경우, 실리카겔(silica gel)로서 Merck사의 kieselgel 60(230-400 mesh)을 사용하였고, 박층 크로마토그래피(TLC)에는 실리카겔 60 GF254(0.25 mm, Merck)가 도포되어 있는 유리판을 사용하고, TLC 상의 화합물 확인은 254 nm 및 365 nm의 자외선을 이용하거나, 발색제로서 인몰리브덴산(phosphomolybdic acid)(PMA) 20 내지 30% 에탄올 용액 또는 KMnO₄를 사용하였다. 역상(reverse phase)의 경우, TLC는 실리카겔 60 RP-18 F_254S(0.25 mm, Merck)가 도포되어 있는 유리판을 사용하였고, 칼럼 크로마토그래피의 경우는 Buchi사의 MPLC(medium pressure liquid chromatography) 장비인 Fraction Collector R-660에 역상 칼럼 Lichroprep RP-18(40 내지 63 μm, Merck사 제품)를 연결하여 사용하였다. HPLC는 Agilent사의 1100 시리즈에 Waters사의 Bondapak C18 10 μm 125A를 장착하여 사용하였다.

겔 전기영동 실험을 위한 전기영동장치는 Amershame Biosciences사의 SE260, 소형 수직 겔 전기영동 장치(mini-vertical gel electrophoresis unit)에 BIO-RAD사의 PowerPac Basic Power Supply(Catalog No. 164-5050)를 연결하여 사용하였다. 겔로는 Lonza사의 PAGEr Gold Precast Gels(Polyacrylamide gels for protein electrophoresis, 10 내지 20% Tris-Glycine gels, Catalog No. 59506)을 사용하였다. SDS-PAGE 실험을 위한 러닝 완충액(running buffer) 및 로딩 완충액(loading buffer)는 아래와 같이 직접 제조하여 사용하였다.

- 5 x running buffer 제조

? 3 g Tris(Trizma base, Sigma)

? 14.4 g Glycine(Sigma)

? 증류수 100 mL, 제조 후 냉장 보관

- 5 x loading buffer 제조

? 0.6 mL의 1 M Tris(Trizma base, Sigma)

? 5 mL의 50% 글리세롤(glycerol)

? 2 mL의 10% SDS

? 0.5 mL의 2-메르캅토 에탄올(mercaptanethanol)

? 1.9 mL의 10% 증류수(bromophenol blue를 넣지 않고 증류수로 대체)

단백질은 GE Healthcare사와 Takara에서 시판 중인 Size Marker들을 사용하 였다. 표지된 생체 분자의 관찰 및 형광 강도(intensity)의 측정에는 Perkin Elmer사의 Geliance 600 장비를 이용하였고, 광원은 Geliance UV Epi(Catalog No. L7110026), Geliance Blue Epi(Catalog No. L7110027)이었고, 필터는 UV Filter, Geliance Short Pass Filter(500～600 nm), Geliance Long Pass Filter(580 내지 660 nm), Geliance Blue Light Filter(550～600 nm)를 형광 파장에 맞게 바꾸어 가면서 측정하였다.

시약은 주로 Aldrich사와 TCI사의 것을 사용하였다. 정제가 필요한 용매는 알려져 있는 방법에 따라 정제하여 사용하였고, 특별한 언급이 없는 한 모든 반응은 질소 기류 하에서 실시하였다. NMR 용매는 Aldrich사와 Cambridge Isotope Laboratories Inc사의 DMSO-d ₆ 또는 D₂O를 사용하였다. 시그날의 상대적인 위치는 용매 내에 들어있는 테트라메틸실란(tetramethylsilane, TMS)을 기준으로 하거나 NMR 용매를 기준으로 하였다. 화학전이(chemical shift)는 표준 물질로부터 ppm 단위로 표시하였고, 데이터는 화학전이 다중도(chemical shift multiplicity)(s=singlet, d=doublet, t=triplet, m=multiplet), intergration, coupling constant(Hz)의 순으로 기록하였다.

실시예 1 : 화합물 1-1의 제조

(1) 화합물 4-1의 합성

1,2,4-벤젠트리카르복실릭언하이드라이드(1,2,4-benzenetricarboxylic anhydride)(10g, 52 mmol, 1 eq, Aldrich)와 레소시놀(resorcinol)(11.45 g, 104 mmol, 2 eq, Aldrich)을 메탄술폰산 30 mL에 가한 후, 24 시간 동안 가열 환류하며 반응시킨다. 상온에서 냉각시킨 뒤, 얼음물을 반응액에 투입한다. 여과 후 가성소다수용액을 사용하여 반응액을 중화시키고, 진한 염산으로 넣어 입자를 석출시킨다. 여과된 반응물을 상온에서 24시간 감압 건조하여 화합물 4-1을 얻었다.(16.16 g, 82.2 %)

R_f = 0.4(RP-C18, 아세토니트릴/물 1:3 v/v)

¹H NMR(400 MHz, DMSO-d ₆ ) : δ 10.16(s, 2H), 8.39-8.08(m, 2H), 7.64-7.37(m, 1H), 6.68-6.53(m, 6H)

LC/MS, 계산치 C₂₁H₁₂O₇ 376.06, 측정치 376.13

¹H NMR(400 MHz, DMSO-d ₆ ) : δ 10.16(s, 2H), 8.39(s, 1H), 8.30-8.27(m, 1H), 7.40-7.38(d, 1H, J = 10.72), 6.69-6.52(m, 6H)

¹H NMR(400 MHz, DMSO-d ₆ ) : δ 10.16(s, 2H), 8.23(m, 1H), 8.12-8.09(d, 1H, J = 10.64), 7.64(s, 1H), 6.70-6.53(m, 6H)

(2) 화합물 1-1의 합성

화합물 1-a(800 mg, 2.125 mmol, 1 eq)와 DSC(816 mg, 3.187 mmol, 1.5 eq, Aldrich)을 DMF 30mL에 가한 후, DMAP(4'-(dimethylamino)-pyridine)(389 mg, 3.187 mmol, 1.5 eq, Aldrich)를 THF 5mL에 녹여 적가한다. 2시간 상온에서 교반한 후 물과 클로로포름을 사용하여 추출한다. 35 ℃에서 감압 증류하여 추출물의 용매를 제거한 후 감압 건조한다. DMF 30 mL를 건조된 반응물에 다시 넣고 휘니그 베이스 3.7 mL를 넣은 후 2-(2'-클로로에틸술포닐)에틸아민 염산염(440 mg, 2.125 mmol)을 DMF 5mL에 녹여 적가한다. 상온에서 24시간 교반한 후 에테르와 물을 사용하여 추출한다. 40 ℃에서 감압 증류하여 용매를 제거한 후 35 % 아세토니트릴 수용액을 전개액으로 RP-C18 역상 크로마토그래피로 정제, 순수한 화합물 1-1을 얻었다.(400 mg, 36.7 %)

R_f = 0.32(RP-C18, 아세토니트릴/물 1:1 v/v)

¹H NMR(400 MHz, DMSO-d ₆ ) : δ 10.16(s, 2H), 9.04-8.88(m, 1H), 8.43-8.10(m, 2H), 7.63-7.37(m, 1H), 7.64-7.01(m, 1H), 6.68-6.53(m, 6H), 6.33-6.28(m, 2H), 3.67-3.32(m, 4H)

LC/MS, 계산치 C₂₅H₁₉NO₈S 493.08, 측정치 493.17

λ_abs : 495 nm, λ_fl : 529 nm

상기와 같은 방법으로 화합물 4a-1 또는 4b-1을 출발물질로 사용하여 화합물 1a-1 또는 화합물 1b-1을 얻을 수 있었다.

¹H NMR(400 MHz, DMSO-d ₆ ) : δ 10.16(s, 2H), 9.04-9.00(m, 1H), 8.43(s, 1H), 8.19-8.16(m, 1H), 7.38-7.36(m, 1H), 7.07-7.01(m, 1H), 6.64-6.50(m, 6H), 6.33-6.16(m, 2H), 3.67-3.60(m, 4H)

λ_abs : 495 nm, λ_fl : 529 nm

¹H NMR(400 MHz, DMSO-d ₆ ) : δ 8.88-8.85(m, 1H), 8.10-8.09(m, 2H), 7.64-7.62(m, S), 7.01-6.92(m, 1H), 6.66-6.51(m, 6H), 6.25-6.16(m, 2H), 3.56-3.50(m, 4H)

λ_abs : 495 nm, λ_fl : 529 nm

실시예 2: 화합물 1-2의 제조

(1) 화합물 4-2의 합성

1,2,4-벤젠트리카르복실릭언하이드라이드(1,2,4-benzenetricarboxylic anhydride)(663 mg, 3.45 mmol, 1 eq, Aldrich)와 4-클로로레소시놀(4-chlororesorcinol)(1 g, 6.9 mmol, 2 eq, Aldrich)을 메탄술폰산 2 mL에 가한 후, 24 시간 동안 가열 환류하며 반응시킨다. 상온에서 냉각시킨 뒤, 얼음물을 반응액에 투입하여 여과 후 가성소다 수용액을 사용하여 반응액을 중화시키고, 진한 염산을 가하여 입자를 석출시킨다. 여과된 반응물을 상온에서 24시간 감압 건조하여 화합물 4-2를 얻었다.(1.37 g, 89 %)

R_f = 0.85(RP-C18, 아세토니트릴/물 3:2 v/v)

¹H NMR(400 MHz, DMSO-d ₆ ) : δ 11.13(s, 2H), 8.39-8.10(m, 2H), 7.94-7.43(m, 1H), 6.93(s, 2H), 6.79-6.76(m, 2H)

LC/MS, 계산치 C₂₁H₁₀Cl₂O₇ 443.98, 측정치 443.93

(2) 화합물 1-2의 합성

화합물 4-2(446 mg, 1 mmol, 1 eq)와 DSC(384 mg, 1.5 mmol, 1.5 eq, Aldrich)을 DMF 18mL에 가한 후, DMAP(195 mg, 1.6 mmol, 1.6 eq, Aldrich)를 THF 2.5 mL에 녹여 적가한다. 2시간 상온에서 교반한 후 물과 클로로포름을 사용하여 추출한다. 35 ℃에서 감압 증류하여 추출물의 용매를 제거한 후 감압 건조한다. DMF 20mL를 건조된 반응물에 다시 넣고 휘니그 베이스 2.4 mL를 넣은 후 2-(2'-클 로로에틸술포닐)에틸아민 염산염(412 mg, 1.88 mmol)을 DMF 2 mL에 녹여 적가한다. 상온에서 24시간 교반한 후 에테르와 물을 사용하여 추출한다. 40 ℃에서 감압 증류하여 용매를 제거한 후 35 % 아세토니트릴 수용액을 전개액으로 RP-C18 역상 크로마토그래피로 정제, 순수한 화합물 4-b를 얻었다.(10 mg, 7.4 %)

R_f = 0.43(RP-C18, 아세토니트릴/물 1:1 v/v)

¹H NMR(400 MHz, DMSO-d ₆ ) : δ 9.03-8.88(m, 1H), 8.42-8.10(m, 2H), 7.64-7.43(m, 1H), 7.10-6.94(m, 1H), 6.91-6.90(m, 1H), 6.74-6.73(m, 1H), 6.33-6.16(m, 2H), 3.65-3.40(m, 2H)

LC/MS, 계산치 C₂₅H₁₇Cl₂NO₈S 561.01, 측정치 561.89

실시예 3 : 화합물 1-3의 제조

(1) 화합물 4-3의 합성

1,2,4-벤젠트리카르복실릭언하이드라이드(1,2,4-benzenetricarboxylic anhydride)(150 mg, 0.78 mmol, 1 eq, Aldrich)와 4-플루오로레소시놀(4-fluororesorcinol)(200 mg, 1.56 mmol, 2 eq, Aldrich)을 메탄술폰산 500 uL에 가 한 후, 24 시간 동안 가열 환류하며 반응시킨다. 상온에서 냉각시킨 뒤, 얼음물을 반응액에 투입한다. 여과 후 가성소다수용액을 사용하여 반응액을 중화시키고, 진한 염산을 세류하여 산석한다. 여과된 반응물을 상온에서 24시간 감압 건조하여 화합물 4-3를 얻었다.(310 mg, 95.9 %)

R_f = 0.51(RP-C18, 아세토니트릴/물 3:2 v/v)

¹H NMR(400 MHz, DMSO-d ₆ ) : δ 10.77(s, 2H), 8.38-8.08(m, 2H), 7.69-7.39(m, 1H), 6.89-6.87(d, 2H, J = 10 Hz), 6.65-6.59(m, 2H)

LC/MS, 계산치 C₂₁H₁₀F₂O₇ 412.04, 측정치 412.90

(2) 화합물 1-3의 합성

화합물 4-3(250 mg, 0.6 mmol, 1 eq)와 DSC(230 mg, 0.9 mmol, 1.5 eq, Aldrich)을 DMF 10mL에 가한 후, DMAP(122 mg, 0.99 mmol, 1.6 eq, Aldrich)를 DMF 2 mL에 녹여 적가한다. 2시간 상온에서 교반한 후 물과 클로로포름을 사용하여 추출한다. 35 ℃에서 감압 증류하여 추출물의 용매를 제거한 후 감압 건조한다. DMF 10 mL를 건조된 반응물에 다시 넣고 휘니그 베이스 440 uL를 넣은 후 2-(2'-클로로 에틸술포닐)에틸아민 염산염(103 mg, 0.5 mmol)을 DMF 1mL에 녹여 적가한다. 상온에서 24시간 교반한 후 에테르와 물을 사용하여 추출한다. 40 ℃에서 감압 증류하여 용매를 제거한 후 35 % 아세토니트릴 수용액을 전개액으로 RP-C18 역상 크로마토그래피로 정제, 순수한 화합물 5-b를 얻었다.(5 mg, 3.9 %)

R_f = 0.5(RP-C18, 아세토니트릴/물 1:1 v/v)

¹H NMR(400 MHz, DMSO-d ₆ ) : δ 8.98-8.84(m, 1H), 8.45-8.08(m, 2H), 7.64-7.38(m, 1H), 7.09-6.95(m, 1H), 6.54(s, 2H), 6.33-6.18(m, 3H), 3.75-3.40(m, 4H)

LC/MS, 계산치 C₂₅H₁₇F₂NO₈S 529.06, 측정치 529.24

λ_abs : 457 nm, λ_fl : 509 nm

실시예 4: 단백질에 대한 염색 실험

지이 헬스케어사에서 시판 중인 SDS 전기영동을 위한 Amershame^TM LMW Calibration 키트(17-0446-01)의 1개의 팩(pack) 중 1개의 바이알(vial)에는 576 μg의 마커용 단백질로서, 포스포릴라아제 b(phosphorylase b)(97 kD, 67 μg), 알부민(albumin)(66 kD, 83 μg), 오발부민(ovalbumin)(45 kD, 147 μg), 카보닉 안하이드라이즈(carbonic anhydrase)(30 kD, 83 μg), 티롭신 인히비터(trypsin inhibitor)(20.1 kD, 80 μg), α-락탈부민(α-lactalbumin)(14.4 kD, 116 μg)의 6종이 포함되어 있다.

상온(20℃)에서 상기 마커용 단백질이 들어있는 1개의 바이알에 250 μl의 pH 9.0 0.1 M 포스페이트 완충액을 가하여 용해시키고, e-튜브에 25 μl를 분취하였다(25 μg protein / 25 μl buffer, 6.9x10^-5 μmol in 25 μl buffer solution). 화합물 1a-1 1 mg을 e-tube에 넣고 100 μl의 DMF에 용해시킨 후, 1 μl를 분취하여 앞서의 단백질이 들어 있는 e-튜브에 넣은 후, 볼텍스(vortex)와 원심분리기를 사용하여 균일하게 혼합하고 상온에서 1시간 동안 반응시켰다.

상기 반응액에 5X 로딩버퍼를 6μl를 넣은 후 15 μl를 분취하여 겔에 로딩(loading)하여 겔 전기영동으로 전개한 결과를 도 1에 나타내었다. 전기영동은 125V에서 2시간 동안 진행하였다. 육안으로 보면 희미하게 염색된 단백질들을 관찰되며 형광 사진을 측정한 결과로도 확인할 수 있다.

상기 실시예에서 확인한 바와 같이(혹은 상기 실시예에서 명시적으로 기재하고 있지는 않다고 하더라도), 본 발명에 따른 화합물은 높은 형광 성능, 생체 분자와 같은 표지 대상 물질과의 반응시간 및 결합성능 또는 반응 후 이탈기 분리에 따른 부산물 발생뿐만 아니라, 수용액상에서의 안정성, 특히 다양한 pH에서의 안정성, 열안정성 외에도 수용액이나 친수성 조건에서의 광표백 및 소광현상 발생, 몰흡광계수, 형광이 발생되는 파장영역 등의 발명의 효과가 새롭게 발현되거나 또는 이들의 물성이 현저하게 향상었음을 확인하였고, 나아가 다양한 완충액에서 염색이 가능하다는 점을 확인하였다.

또한, 본 발명에 속하는 화합물에 있어서 치환기의 종류 및 구조에 따라서 화합물의 물성이 차이를 보이기는 하나, 그럼에도 불구하고 본 발명의 범위에 속하면서 본 발명의 실시예에 명시적으로 기재되어 있지 않은 치환기를 포함하는 화합물에 대해서도 본 발명의 실시예의 반응 원리 및 조건이 그에 준하여 적용될 수 있으며, 따라서 통상의 기술자라면 본 발명의 실시예의 개시내용 및 본 발명의 출원 당시의 당업계 상식에 기초하여 본 발명의 실시예에 명시적으로 개시되어 있지 않은 본 발명의 화합물 역시 용이하게 실시할 수 있다는 점은 자명하다.

도 1는 실시예 4에서 표지시킨 단백질들을 겔 전기영동으로 전개한 것의 형광사진을 나타낸 것이다.

Claims

하기 화학식 1c로 표시되는 물질 표지용 화합물 또는 이의 호변이성질체(tautomer) 또는 이들의 염:

[화학식 1c]

상기 2개의 R1은 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 수소, 탄소 수 1 내지 6의 알킬기 또는 할로겐 원자이며; 상기 2개의 R2는 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 수소, 탄소 수 1 내지 6의 알킬기 또는 할로겐 원자이며; 상기 2개의 R3은 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 수소, 탄소 수 1 내지 6의 알킬기 또는 할로겐 원자이며; 상기 2개의 R1'은 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 수소 또는 탄소 수 1 내지 6의 알킬기이며;

상기 X1 또는 X2 중 어느 하나는
이고 나머지 하나는 수소이며; 상기 B는(CH₂)_L, p-(C₆H₄) 또는 m-(C₆H₄)이고 상기 L은 1 내지 5의 정수이다.
제1항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식 1의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 물질 표지용 화합물:

[화학식 1]

상기 2개의 R1은 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 수소, 탄소 수 1 내지 6의 알킬기 또는 할로겐 원자이며; 상기 2개의 R2는 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 수소, 탄소 수 1 내지 6의 알킬기 또는 할로겐 원자이며; 상기 2개의 R3은 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 수소, 탄소 수 1 내지 6의 알킬기 또는 할로겐 원자이며; 상기 각각의 할로겐 원자는 불소, 염소, 브롬 및 요오드 중에서 선택되며;

상기 B는(CH₂)_L, p-(C₆H₄) 또는 m-(C₆H₄)이고 상기 L은 1 내지 5의 정수이다.
제1항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식 중 어느 하나의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 물질 표지용 화합물:
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 물질 표지용 화합물을 포함하는 물질로서, 상기 물질은 아민기, 수산화기 또는 티올기를 포함하며 생체 분자, 나노 입자 및 유기 화합물 중에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 물질 표지용 화합물 포함 물질.
제4항에 있어서, 상기 생체 분자는 단백질, 펩타이드, 탄수화물, 당, 지방, 항체, 프로테오글라이칸, 글라이코프로틴 및 siRNA 중에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 물질 표지용 화합물 포함 물질.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 물질 표지용 화합물을 이용하여 물질을 표지하는 방법으로서, 상기 물질은 아민기, 수산화기 또는 티올기를 포함하며, 상기 물질은 생체 분자, 나노 입자 및 유기 화합물 중에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 물질 표지 방법.
제6항에 있어서, 상기 생체 분자는 단백질, 펩타이드, 탄수화물, 당, 지방, 항체, 프로테오글라이칸, 글라이코프로틴 및 siRNA 중에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 물질 표지 방법.
제6항에 있어서, 상기 표지 방법은 상기 물질 표지용 화합물 및 표지 대상 물질을 반응시키는 단계를 포함하고,

상기 반응은 pH 5-12 및 20-80℃의 조건에서 30분 내지 48시간 동안 포스페이트 완충액, 카보네이트 완충액, 트리스 완충액, 디메틸설폭사이드, 디메틸포름아미드, 아세토니트릴 및 물 중에서 선택된 용매 내에서 수행하는 것임을 특징으로 하는 물질 표지 방법.
제6항에 있어서, 상기 표지 방법은 상기 물질 표지용 화합물의 비닐 설폰기와 표지 대상 물질이 포함하는 아민기, 수산화기 및 티올기 중에서 선택된 적어도 하나의 관능기와 반응시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 물질 표지 방법.
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하기 화학식 1의 화합물을 제조하는 방법으로서, 하기 화학식 5a 또는 화학식 5b의 화합물 또는 이들의 혼합물을 하기 화학식 6의 화합물과 반응시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 하기 화학식 1의 화합물 제조방법:

[화학식 1]

[화학식 5a]

[화학식 5b]

[화학식 6]

상기 2개의 R1은 서로 같거나 상이하고 독립적으로 수소, 탄소 수 1 내지 6의 알킬기 또는 할로겐 원자이며; 상기 2개의 R2는 서로 같거나 상이하고 독립적으로 수소, 탄소 수 1 내지 6의 알킬기 또는 할로겐 원자이며; 상기 2개의 R3은 서로 같거나 상이하고 독립적으로 수소, 탄소 수 1 내지 6의 알킬기 또는 할로겐 원자이다.
제12항에 있어서, 상기 반응은 휘니그 염기 존재 하에서 수행하는 것임을 특징으로 하는 화학식 1의 화합물 제조 방법.
하기 화학식 4의 화합물을 제조하는 방법으로서, 하기 화학식 2의 화합물을 화학식 3의 화합물과 반응시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 화학식 4의 화합물 제조방법:

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

상기 2개의 R1은 서로 같거나 상이하고 독립적으로 수소, 탄소 수 1 내지 6의 알킬기 또는 할로겐 원자이며; 상기 2개의 R2는 서로 같거나 상이하고 독립적으로 수소, 탄소 수 1 내지 6의 알킬기 또는 할로겐 원자이며; 상기 2개의 R3은 서로 같거나 상이하고 독립적으로 수소, 탄소 수 1 내지 6의 알킬기 또는 할로겐 원자이며; 상기 R₄는 카르복시기, 카르복시기 염기, 설폰산기, 설폰산 염기 또는 수소이다.
하기 화학식 5a 또는 화학식 5b의 화합물을 제조하는 방법으로서, 하기 화학식 4의 화합물을 1,1'-카르보닐디이미다졸 또는 N,N-디숙신이미딜 카보네이트와 반응시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 화학식 5a 또는 화학식 5b의 제조방법:

[화학식 5a]

[화학식 5b]

상기 2개의 R1은 서로 같거나 상이하고 독립적으로 수소, 탄소 수 1 내지 6의 알킬기 또는 할로겐 원자이며; 상기 2개의 R2는 서로 같거나 상이하고 독립적으로 수소, 탄소 수 1 내지 6의 알킬기 또는 할로겐 원자이며; 상기 2개의 R3은 서로 같거나 상이하고 독립적으로 수소, 탄소 수 1 내지 6의 알킬기 또는 할로겐 원자이다.