WO2021153772A1 - アルデヒドデヒドロゲナーゼ１ａ１検出用青色蛍光プローブ - Google Patents
アルデヒドデヒドロゲナーゼ１ａ１検出用青色蛍光プローブ Download PDFInfo
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- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
Definitions
- the present invention relates to a novel blue fluorescent probe that can be used to detect aldehyde dehydrogenase 1A1 (ALDH1A1).
- Cancer stem cells are fundamentally important in cancer biology because of their properties against malignant transformation, treatment resistance and tumor progression. Considerable efforts have been made to develop methods for isolating stem cells to understand their unique properties that may open new windows for the treatment of various diseases.
- cytosolic functional enzymes to identify / isolate stem cells provides an alternative to conventional methods of staining with antibodies against cell surface stem cell markers.
- One such important molecule is aldehyde dehydrogenase (ALDH).
- ALDEFLUOR which is a fluorescent probe for a flow cytometer.
- BODIPY FL which is a green fluorescent dye, as the fluorescent dye, and since this fluorescent dye has a similar excitation / fluorescence wavelength to FITC and GFP, which are frequently used in biological research, these are used. There is a problem that it cannot be used at the same time as the dye.
- AldeRed a later probe for ALDH1 flow cytometer, uses BODIPY 576/589 as a dye and is sold by Merck. This probe can be used in combination with GFP, etc., but although the excitation light on the flow cytometer is 488 nm, the flow cytometer also has excitation lasers of 561 nm and 633 nm, which are also excited at these wavelengths, and further. Since the peak of the excitation wavelength is 589 nm, it is necessary to devise a combination with a fluorescent dye in the near infrared region, which has been actively developed in recent years.
- aldehyde dehydrogenase 1A2 (ALDH1A2), which is another isoform of class I aldehyde dehydrogenase (ALDH1), has an important effect on cell proliferation and drug resistance (Non-Patent Document 4). If a probe having substrate specificity for ALDH1A2 can be provided, such enzymatic activity may be used as a marker.
- An object of the present invention is to provide a novel blue fluorescent probe for ALDH1A1.
- Another object of the present invention is to provide a novel blue fluorescent probe that can also be used as a fluorescent probe for ALDH1A2.
- the present inventors use a fluorescent dye that can be excited by a 405 nm laser mounted on a flow cytometer, and include an aldehyde having substrate specificity for ALDH1A1 in the probe.
- the present invention [1] A compound represented by the following general formula (I) or a salt thereof.
- m is 1 or 2
- n is 1 or 2
- s is an integer of 1 to 4.
- Ra represents a hydrogen atom or a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 4 carbon atoms.
- a novel blue fluorescent probe capable of detecting the activity of ALDH1A1 as a cell using a living cell.
- AldeBlue-8 and AldeBlue which are preferable examples of the compounds of the present invention, have a maximum absorption / fluorescence wavelength of 397/473 nm and 418/466 nm, and are GFP excited by a laser of 488 nm, which is frequently used in biological experiments.
- FITC and other fluorescent dyes can be used in combination, and if a probe in the near infrared region is added, a multicolor assay of 3 or more probes is possible.
- the compound of the present invention can also be used as a blue fluorescent probe for detecting ALDH1A2.
- FIG. 9a shows a representative flow cytogram of SBC5 cells (relative fluorescence intensity of AldeBlue vs. EGFP), and FIG. 9B shows a representative flow cytogram of SBC5 cells (relative to AldeBlue-8 vs. EGFP). Fluorescence intensity) is shown.
- halogen atom may be any of a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, or an iodine atom, and is preferably a fluorine atom, a chlorine atom, or a bromine atom.
- One aspect of the present invention is a compound represented by the following general formula (I) or a salt thereof.
- the compound in order to develop a functional ALDH probe, the compound has a hydrophilic-hydrophobic balance suitable for passive diffusion into the cell, and intracellular.
- the ALDH metabolites produced in situ in ie, the corresponding carboxylic acid products
- the site with the aldehyde must be a good substrate for ALDH. Therefore, as a result of various studies by the present inventors, it is represented by the formula (1), which has a benzaldehyde group as a substrate-specific group for ALDH1A1 and has a structure in which the group is bonded via a specific linker. It has been found that when a group is introduced into a fluorophore of 8-amino-BODIPY, it is highly reactive with ALDH1A1 and a hydrophilic-hydrophobic balance suitable for passive diffusion into cells can be obtained.
- m is 1 or 2
- n is 1 or 2
- s is an integer of 1 to 4.
- One aspect of the present invention is a compound represented by the following general formula (Ia) or a salt thereof.
- any linker defined in the general formula (I) can be used as L, but ⁇ (CH 2 ) m ⁇ (m is 1 or 2) is particularly preferable.
- Another aspect of the present invention is a compound represented by the following general formula (Ib) or a salt thereof.
- L, Ra , and R are as defined in the formula (I).
- the group represented by the formula (1) may be introduced at any position.
- R if R exists, it can be introduced anywhere. R may be introduced into a pyrrole ring different from the pyrrole ring into which the group represented by the formula (1) has been introduced, or may be introduced into the pyrrole ring into which the group represented by the formula (1) has been introduced. Often, it may be introduced into both pyrrole rings.
- the compounds of the general formulas (I), (Ia), and (Ib) of the present invention have one or more asymmetric carbons depending on the type of substituent.
- stereoisomers such as optical isomers or diastereoisomers may be present.
- Pure forms of steric isomers, arbitrary mixtures of steric isomers, racemates and the like are all included within the scope of the present invention.
- the compound of the present invention or a salt thereof may exist as a hydrate or a solvate, and all of these substances are included in the scope of the present invention.
- the type of solvent that forms the solvate is not particularly limited, and examples thereof include solvents such as ethanol, acetone, and isopropanol.
- the compound of the present invention is useful as a fluorescent probe for detecting aldehyde rhodgenase 1A1 activity. That is, another aspect of the present invention is a fluorescent probe for detecting aldehyde dehydrogenase 1A1 containing the compound of the present invention or a salt thereof.
- Another aspect of the present invention is a method for detecting intracellular aldehyde dehydrogenase 1A1 activity, wherein (a) a step of introducing the compound of the present invention or a salt thereof into the cell, and (b) the compound.
- it is a method including a step of measuring the fluorescence emitted by the reaction of the salt with the aldehyde dehydrogenase 1A1 in the cell.
- the compound of the present invention or a salt thereof is substantially non-fluorescent in an environment without aldehyde dehydrogenase 1A1 or has only weak fluorescence, but has a characteristic of emitting strong fluorescence in an environment with aldehyde dehydrogenase 1A1.
- the method of the present invention can further include observing the fluorescence response using fluorescence imaging means.
- a fluorometer having a wide measurement wavelength can be used, but the fluorescence response can also be visualized by using a fluorescence imaging means capable of displaying the fluorescence response as a two-dimensional image.
- the fluorescence response can be visualized in two dimensions, so that the aldehyde dehydrogenase 1A1 can be visually recognized instantly.
- the fluorescence imaging apparatus an apparatus known in the art can be used. In some cases, it is also possible to detect the reaction between the sample to be measured and the fluorescent probe by a change in the ultraviolet-visible absorption spectrum (for example, a change in absorbance at a specific absorption wavelength).
- the method of using the fluorescent probe of the present invention is not particularly limited, and it can be used in the same manner as a conventionally known fluorescent probe.
- aqueous medium such as physiological saline or a buffer solution, or a mixture of an aqueous medium and a water-miscible organic solvent such as ethanol, acetone, ethylene glycol, dimethyl sulfoxide, or dimethylformamide.
- the compounds to be used or salts thereof may be dissolved, and this solution may be added to an appropriate buffer solution containing cells or tissues, and the fluorescence spectrum may be measured.
- the fluorescent probe of the present invention may be used in the form of a composition in combination with a suitable additive. For example, it can be combined with additives such as buffers, solubilizers and pH regulators.
- the compounds of the present invention can be used in flow cytometers that can be excited by a 405 nm laser.
- the 405 nm laser is one of the three standard lasers provided for flow cytometry, and the compounds of the present invention can be suitably used in such flow cytometers.
- the compound of the present invention can be used for flow cytometric analysis of multicolor staining of living cells. Therefore, the method of the present invention can further include observing the fluorescence response using a flow cytometer (preferably a flow cytometer that can be excited by a 405 nm laser).
- Another aspect of the present invention is an aldehyde dehydrogenase 1A1 detection fluorescent probe used in a 405 nm laser excitable flow cytometer containing the compound of the present invention or a salt thereof.
- Another aspect of the present invention is an aldehyde dehydrogenase 1A1 detection fluorescent probe used in a flow cytometer equipped with a 405 nm laser containing the compound of the present invention or a salt thereof.
- Another aspect of the present invention is an aldehyde dehydrogenase 1A1 detection fluorescent probe used in a flow cytometer including a laser having a laser of at least 405 nm as an on-board laser, which comprises the compound of the present invention or a salt thereof.
- the cell sample to be measured in the above step (a) can be a cell expressing aldehyde dehydrogenase 1A1, but the cell is a cancer cell or cancer tissue expressing aldehyde dehydrogenase 1A1.
- cancer cells and cancer tissues can be detected or visualized by the detection method of the present invention. That is, the fluorescent probe of the present invention, the composition containing the fluorescent probe, and the detection method of the present invention can also be used for diagnosing cancer.
- cancer tissue means any tissue including cancer cells.
- tissue should be interpreted in the broadest sense, including part or all of the organ, and should not be construed in a limited way in any sense.
- As the cancer tissue a tissue highly expressing aldehyde dehydrogenase 1A1 is preferable.
- diagnosis in the present specification needs to be interpreted in the broadest sense, including confirming the presence of cancer tissue at any biological site with the naked eye or under a microscope.
- the fluorescent probe of the present invention is usually prepared as a solution, but is provided as a composition in an appropriate form such as a mixture in powder form, a lyophilized product, a granule, a tablet, or a liquid preparation, and is provided at the time of use. It can also be applied by dissolving it in distilled water for injection or an appropriate buffer solution.
- the kit may appropriately contain other reagents and the like, if necessary.
- additives such as a solubilizing agent, a pH adjusting agent, a buffering agent, and an isotonicizing agent can be used, and the blending amount thereof can be appropriately selected by those skilled in the art.
- the method for detecting intracellular aldehyde dehydrogenase 1A2 activity of the present invention further comprises observing the fluorescence response using a flow cytometer (preferably a flow cytometer that can be excited by a 405 nm laser). Can be done.
- a flow cytometer preferably a flow cytometer that can be excited by a 405 nm laser.
- AldeBlue-8 or AldeBlue is used as the compound of the present invention.
- the PDA detector detected absorption of 400 nm for Aldeblue-8 and Aldeblue, 496 nm for probe5, and 504 nm for the BODIPY FL binding probe, followed by determining the mass of the molecule eluted by a quadrupole mass spectrometer.
- ALDH Isozyme Selectivity and Enzyme Kinetics for Probes Three isoforms of ALDH enzymes (ALDH1A1, ALDH2, ALDH3A1) were purchased from ATGen. All enzymatic reactions were performed at 37 ° C. The enzyme reaction was started at zero minutes when the enzyme solution and the probe solution were mixed. The enzyme reaction solution was 0.5-200 nM enzyme, 1% DMSO (co-solvent), 100 mM Tris buffer (pH 7.5), 100 mM KCl, 2 mM dithioslateol, and 1 mM NAD + (ALDH1A1 and ALDH2) as coenzymes. ) Or 1 mM NADP + (ALDH3).
- the enzymatic reaction was stopped at an arbitrary time by mixing the same amount of acetonitrile with the reaction solution, and then the product was analyzed by high performance liquid chromatography. Then, the amount of the carboxylic acid compound, which is a metabolite of ALDH, was quantified from the peak area of the analysis result based on the synthesized standard and the calibration curve prepared by using the liquid chromatography / quadrupole mass analyzer. The Michaelis constant and the number of turnover numbers were calculated by fitting to the Michaelis-Menten formula using graph analysis software: Kaleidagraph (HULINKS Inc.).
- Flow cytometric cells were prepared according to the procedure described in the section on fluorescence imaging. 5.0 ⁇ 10 5 cells were incubated with 500 ⁇ L of imaging buffer containing the probe. Samples stained with AldeBlue-8 were centrifuged, the supernatant was removed, and then replaced with 300 ⁇ L of ice-cooled buffer. The samples stained with Aldeblue were not subjected to the operation of substituting the buffer solution, and the samples were cooled on an ice bath and used as they were for analysis with a flow cytometer. For the cell suspension, cell aggregates were removed by a centrifuge tube equipped with a cell strainer (manufactured by Thermo Fisher Scientific).
- Knockdown of ALDH1A1 by RNA interference using Small interfering RNA ADH1A1 siRNAs are silencer select validated siRNA (Thermophinser Scientific) using s1236, s1237, s1238 as genes, s1237, and s1238 as negative controls. Introduced. The preparation of the gene transfer reagent was performed according to the procedure manual attached to the reagent. After mixing SBC5 with the introduction reagent, the cells were cultured in a 6-well dish for 3 days. As for the knockdown rate of ALDH1A1, a decrease in the expression level was confirmed by immunoblotting, and it was found that s1237 was the most efficient among the siRNAs used. Therefore, analysis by flow cytometry was performed using s1237. At the time of gene transfer, the final concentration of siRNA was adjusted to 20 nM, and the gene transfer reagent was adjusted to 0.3% v / v before use.
- the cells were lysated with a radioimmunopulation buffer (Cell Signaling). The lysate solution was electrophoresed by SDS-polyacrylamide electrophoresis and then transferred to a nitrocellulose membrane.
- As primary antibodies rabbit-derived human ALDH1A1 monoclonal antibody (1/1000 diluted, Cell Signaling) and betaactin (rabbit-derived). A human beta-actin monoclonal antibody (1/1000 diluted, Cell Signaling) was bound to the primary antibody, and then a secondary antibody (HRP-bound anti-rabbit IgG antibody, 1/2000 diluted, Cell Signaling) was added to the primary antibody.
- the complex was detected by ECL prime western blotting detection antibody (GE Healthcare). ImageQuant LAS 4000mini was used for imaging.
- the expression level of ALDH1A1 was based on the expression level of betaactin. -Expressed as a ratio with the targeting siRNA-treated group and compared.
- Cell Sorting H1048 cells were prepared and stained according to the method described in the flow cytometry section. However, AldeBlue-8 was used at a final concentration of 20 ⁇ M and with or without coexistence of 100 ⁇ M DEAB. The stained cells were analyzed by a flow cytometer with a cell sorter (FACS Maria II, BD Biosciences), and the cell group showing the top 10-15% fluorescence intensity and the cell group showing the bottom 10-15% fluorescence intensity were analyzed. Each was collected separately. The ALDH1A1 expression level of the collected cells was quantified by immunoblotting.
- Gene transfer SBC5 cells were gene-introduced with pEGFP-C1 using the Neon Transfection system. The procedure followed the instructions for use. The cells were then cultured in a medium containing G-418 (Promega) for 2 weeks, and the transgenic cells were selected and used in a co-staining experiment.
- G-418 Promega
- Compound 2 was prepared into a 10 mM DMSO solution, stored at ⁇ 20 ° C., converted to compound 3 (AldeBlue-8), and then used.
- the preparation of the solution was as follows. 25 ⁇ L of a 10 mM DMSO solution of Compound 2 and 25 ⁇ L of a hydrochloric acid aqueous solution (2N) were mixed at room temperature and allowed to stand for 15 minutes. After confirming that the raw materials had disappeared by liquid chromatography, 450 ⁇ L of physiological saline was added to prepare a 500 ⁇ M compound 3: AldeBlue-8 aqueous solution.
- BODIPY FL NHS esters were synthesized by literature and previous studies. DIEA (26.4 ⁇ L) to 4- (aminomethyl) benzoic acid (11.7 mg, 0.077 mmol) and BODIPY FL NHS ester (10 mg, 0.026 mmol) in a mixture of THF and distilled water (5 ml / 10 ml). , 0.154 mmol) was added at ambient temperature and the mixture was stirred for 1.5 hours. The THF was then removed under reduced pressure. The obtained aqueous solution was acidified with a 2M HCl aqueous solution. The mixture was extracted with AcOEt (5 x 5 mL). The organic layer was recovered, washed with brine, dried over Na 2 SO 4 , and vacuum evaporated.
- FIG. 3 shows the measurement results of the spectral properties of the two types of probes of the present invention synthesized in Examples 1 and 2. 3a) was measured in PBS containing 0.1% DMSO with AldeBlue-8 and b) with aldehyde-type absorption (dotted line) and fluorescence (solid line excited at 380 nm) spectra of AldeBlue as a co-solvent. The result.
- These absorption spectra were ideal for excitation with a 405 nm diode laser, one of the three standard lasers provided for flow cytometry.
- the absorption of these probes at 488 nm was fairly weak (less than 1% of the absorption peak), suggesting that there was little excitation by the 488 nm laser, which is the excitation laser for green fluorescent dyes.
- FIG. 4 shows the evaluation results of the hydrophobicity of each probe measured by the reverse phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) test.
- the retention time of the carboxylate form of the two probes shifted substantially earlier than that of Probe 1 (Compound 16), i.e. the hydrophilicity of the molecule was that of the 8-amino-BODIPY core. It is considered that the zwitterion-like polarized hemicianin structure was substantially improved.
- Enzyme kinetics test Table 1 shows the enzyme kinetics parameters of various probes using recombinant human ALDH isoforms.
- the above Probe 5 is a reference example, and is the Probe 5 described in the examples of the international application PCT / JP2017 / 043881 by the applicants.
- Table 1 summarizes the enzymatic kinetics of the reactions of ALDH1A1, ALDH2 and ALDH3A1 with various probes.
- All compounds were able to serve as substrates for ALDH1A1.
- AldeBlue-8 is also metabolized by ALDH2, but not by ALDH3A1.
- ALDH3A1 metabolized AldeBlue in vitro.
- cellolo imaging / flow cytometry studies have revealed that AldeBlue has a low affinity for ALDH3A1 (high Km: 122 ⁇ M) and is therefore very likely not to stain cancer cells expressing ALDH3A1.
- FIG. 8a shows a representative flow cytogram (SSC vs. relative fluorescence intensity of each probe) of the H1048 cell.
- Flow cytometry was performed in the presence of AldeBlue-8 (20 ⁇ M) or AldeBlue (1.5 ⁇ M).
- the gates of the positive population were set as described above according to the negative control.
- FIG. 8b) is the result of immunoblot analysis of the sorted cells. Cells with an upper 10-15% fluorescence intensity level (“T” in the figure) and a lower 10-15% fluorescence intensity level (“B” in the figure) were isolated using a cell sorter and subjected to immunoblot analysis. did.
- SBC cells with AldeBlue are similar to the autofluorescence of SBC5 cells (leftmost figure in FIG. 9). However, it shows slightly higher GFP fluorescence levels, which means that there is a weak leak of AldeBlue in the GFP channel. However, it is almost negligible and can be easily corrected by the software compensation of the flow cytometer (BD FACSDiva TM). Next, the flow cytogram in the case of the combination of EGFP and AldeBlue-8 is shown in FIG.
- the fluorescent probe (dye) was dissolved in phosphate buffer (pH 7.4) so that the absorbance at 405 nm was 0.1 ( ⁇ 1%), and exposed to 4.8 mW irradiation light passed through a 405 nm filter. ..
- the degree of decomposition of the fluorescent probe was evaluated based on the absorption intensity of each and compared.
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Abstract
【解決課題】 新規なＡＬＤＨ１Ａ１用青色蛍光プローブを提供すること。 【解決手段】 以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩。
Description
本発明は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ１（ＡＬＤＨ１Ａ１）の検出に用いることができる新規の青色蛍光プローブに関する。
癌幹細胞は、悪性変型、治療抵抗性及び腫瘍進行に対する特性のため、癌生物学において基本的に重要である。様々な疾患の治療のための新たな窓を開く可能性のあるそれらの独特な特性を理解するために、幹細胞を単離する方法の開発に相当な努力が払われてきた。
幹細胞を同定／単離するためのサイトゾル機能性酵素の使用は、細胞表面幹細胞マーカーに対して抗体で染色する従来の方法に対する代替法を提供する。このような重要な分子の一つがアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）である。癌生物学において、アルデヒドを対応するカルボキシラートに変換するＡＬＤＨは、クラスＩアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ１）のアイソフォームの１つであるアルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ１（ＡＬＤＨ１Ａ１）が幹細胞マーカーであると広く認識されたことにより（非特許文献１～３）、数十年来、その重要性が増している。
幹細胞を同定／単離するためのサイトゾル機能性酵素の使用は、細胞表面幹細胞マーカーに対して抗体で染色する従来の方法に対する代替法を提供する。このような重要な分子の一つがアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）である。癌生物学において、アルデヒドを対応するカルボキシラートに変換するＡＬＤＨは、クラスＩアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ１）のアイソフォームの１つであるアルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ１（ＡＬＤＨ１Ａ１）が幹細胞マーカーであると広く認識されたことにより（非特許文献１～３）、数十年来、その重要性が増している。
ＡＬＤＨ１Ａ１の幹細胞マーカーとしての知見は、フローサイトメーター用の蛍光プローブであるＡＬＤＥＦＬＵＯＲを用いた実験によりなされてきた。しかしながら、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲは、蛍光色素として緑色蛍光色素であるＢＯＤＩＰＹ ＦＬを用いており、この蛍光色素は生物研究で頻繁に用いられているＦＩＴＣやＧＦＰなどと励起／蛍光の波長が似ているため、これら色素と同時に使用することができないという問題がある。
また、後発のＡＬＤＨ１フローサイトメーター用プローブであるＡｌｄｅＲｅｄは色素にＢＯＤＩＰＹ ５７６／５８９を用いておりＭｅｒｃｋ社より販売されている。このプローブはＧＦＰなどと併用することは可能であるが、フローサイトメーター上での励起光は４８８ｎｍとしているものの、フローサイトメーターには５６１ｎｍ、６３３ｎｍの励起レーザーもあり、これら波長でも励起され、さらに励起波長のピークが５８９ｎｍであることから、近年開発が盛んにされている近赤外領域の蛍光色素との併用は工夫が必要である。
このように、多色染色は、所与の集団内のまれな細胞集団又は特定のサブセットを単離する場合に特に有用であるものの、ＡＬＤＨプローブについての色の選択肢は限られており、ＡＬＤＨプローブの色に関してより多くの選択肢に対する需要がある。
また、クラスＩアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ１）のアイソフォームの別の１つであるアルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ２（ＡＬＤＨ１Ａ２）は、細胞増殖や耐薬性に重要な影響を及ぼすことが報告されており（非特許文献４）、ＡＬＤＨ１Ａ２に対する基質特異性のあるプローブを提供できれば、かかる酵素活性をマーカーとして使用できる可能性がある。
Jones, R. J., Barber, J. P., Vala, M. S., Collector, M. I., Kaufmann, S. H., Ludeman, S. M., Colvin, O. M., and Hilton, J. (1995) Assessment of aldehyde dehydrogenase in viable cells. Blood 85, 2742-6.
Storms, R. W., Trujillo, A. P., Springer, J. B., Shah, L., Colvin, O. M., Ludeman, S. M., and Smith, C. (1999) Isolation of primitive human hematopoietic progenitors on the basis of aldehyde dehydrogenase activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 96, 9118-23.
Tomita, H., Tanaka, K., Tanaka, T., and Hara, A. (2016) Aldehyde dehydrogenase 1A1 in stem cells and cancer. Oncotarget 7, 11018-32.
Chemico-Biologocal Interactions 195, 52-60 (2012)
本発明は、新規なＡＬＤＨ１Ａ１用青色蛍光プローブを提供することを目的とする。
また、本発明は、ＡＬＤＨ１Ａ２用の蛍光プローブとしても使用できる新規な青色蛍光プローブを提供することをも目的とする。
本発明者らは、新規プローブを設計するにあたり、フローサイトメーターに搭載されている４０５ｎｍのレーザーで励起可能である蛍光色素とすること、ＡＬＤＨ１Ａ１に対する基質特異性のあるアルデヒドをプローブ内に含むこと、及び、プローブの細胞膜透過性が反応前後で有意に変化することに着目して鋭意検討した。その結果、特定の蛍光団の骨格に、アルデヒド基を有する特定の基を導入することにより、上記課題を解決することができることを見出し、本発明を完成した。
即ち、本発明は、
［１］ 以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩。
（式中、
は、以下の式（１）；
（式（１）中、Ｌは、以下の基；
－（ＣＨ２）ｍ－、－（ＣＨ２）ｎ－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－（ＣＨ２）ｓ－、－（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－（ＣＨ２）ｓ－
から選択されるリンカーであり、
ここで、ｍは１又は２、ｎは１又は２、ｓは１～４の整数であり、
Ｒａは、水素原子、又は、炭素数１～４の置換又は無置換のアルキル基を表す。）
で表される基であり、
Ｒは、存在する場合は、炭素数１～４の置換又は無置換のアルキル基を表し、
ここで、式（Ｉ）において、
は、１つだけ存在し、
が＝Ｎ＋Ｈの部分に導入される場合は、Ｒは１位、７位には存在しない。）
［２］ 以下の一般式（Ｉａ）で表される化合物又はその塩。
（式中、Ｌ、Ｒａ、Ｒは、式（Ｉ）で定義した通りである。）
［３］ 以下の一般式（Ｉｂ）で表される化合物又はその塩。
（式中、Ｌ、Ｒａ、Ｒは、式（Ｉ）で定義した通りである。）
［４］［１］～［３］の何れか１項に記載の化合物又はその塩を含むアルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ１検出用蛍光プローブ。
［５］アルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ１の活性を検出する方法であって、
（ａ）［１］～［３］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を細胞内に導入する工程、及び
（ｂ）当該化合物又はその塩が細胞内でアルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ１と反応することにより発せられる蛍光を測定する工程、
を含む、該方法。
［６］［１］～［３］の何れか１項に記載の化合物又はその塩を含む、４０５ｎｍのレーザーで励起可能なフローサイトメーターに用いられるアルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ１検出用蛍光プローブ。
［７］［４］又は［６］に記載の蛍光プローブを含む、アルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ１検出用キット。
［８］［１］～［３］の何れか１項に記載の化合物又はその塩を含むアルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ２検出用蛍光プローブ。
［９］アルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ２の活性を検出する方法であって、
（ａ）［１］～［３］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を細胞内に導入する工程、及び
（ｂ）当該化合物又はその塩が細胞内でアルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ２と反応することにより発せられる蛍光を測定する工程、
を含む、該方法。
［１０］［１］～［３］の何れか１項に記載の化合物又はその塩を含む、４０５ｎｍのレーザーで励起可能なフローサイトメーターに用いられるアルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ１検出用蛍光プローブ。
［１１］［８］又は［１０］に記載の蛍光プローブを含む、アルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ２検出用キット。
を提供するものである。
［１］ 以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩。
－（ＣＨ２）ｍ－、－（ＣＨ２）ｎ－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－（ＣＨ２）ｓ－、－（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－（ＣＨ２）ｓ－
から選択されるリンカーであり、
ここで、ｍは１又は２、ｎは１又は２、ｓは１～４の整数であり、
Ｒａは、水素原子、又は、炭素数１～４の置換又は無置換のアルキル基を表す。）
で表される基であり、
Ｒは、存在する場合は、炭素数１～４の置換又は無置換のアルキル基を表し、
ここで、式（Ｉ）において、
［２］ 以下の一般式（Ｉａ）で表される化合物又はその塩。
［３］ 以下の一般式（Ｉｂ）で表される化合物又はその塩。
［４］［１］～［３］の何れか１項に記載の化合物又はその塩を含むアルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ１検出用蛍光プローブ。
［５］アルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ１の活性を検出する方法であって、
（ａ）［１］～［３］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を細胞内に導入する工程、及び
（ｂ）当該化合物又はその塩が細胞内でアルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ１と反応することにより発せられる蛍光を測定する工程、
を含む、該方法。
［６］［１］～［３］の何れか１項に記載の化合物又はその塩を含む、４０５ｎｍのレーザーで励起可能なフローサイトメーターに用いられるアルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ１検出用蛍光プローブ。
［７］［４］又は［６］に記載の蛍光プローブを含む、アルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ１検出用キット。
［８］［１］～［３］の何れか１項に記載の化合物又はその塩を含むアルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ２検出用蛍光プローブ。
［９］アルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ２の活性を検出する方法であって、
（ａ）［１］～［３］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を細胞内に導入する工程、及び
（ｂ）当該化合物又はその塩が細胞内でアルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ２と反応することにより発せられる蛍光を測定する工程、
を含む、該方法。
［１０］［１］～［３］の何れか１項に記載の化合物又はその塩を含む、４０５ｎｍのレーザーで励起可能なフローサイトメーターに用いられるアルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ１検出用蛍光プローブ。
［１１］［８］又は［１０］に記載の蛍光プローブを含む、アルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ２検出用キット。
を提供するものである。
本発明により、ＡＬＤＨ１Ａ１の細胞としての活性を生きた細胞を用いて検出することが可能である新規な青色蛍光プローブを提供することができる。
また、本発明の化合物の好ましい例である、ＡｌｄｅＢｌｕｅ－８、ＡｌｄｅＢｌｕｅは、最大吸収／蛍光波長が３９７／４７３ｎｍ、４１８／４６６ｎｍであり、生物実験で頻用されている４８８ｎｍのレーザーで励起されるＧＦＰ、ＦＩＴＣなどの蛍光色素と併用可能であり、更に、近赤外領域のプローブを追加すれば３プローブ以上のマルチカラーアッセイが可能である。
また、本発明の化合物の好ましい例である、ＡｌｄｅＢｌｕｅ－８、ＡｌｄｅＢｌｕｅは、最大吸収／蛍光波長が３９７／４７３ｎｍ、４１８／４６６ｎｍであり、生物実験で頻用されている４８８ｎｍのレーザーで励起されるＧＦＰ、ＦＩＴＣなどの蛍光色素と併用可能であり、更に、近赤外領域のプローブを追加すれば３プローブ以上のマルチカラーアッセイが可能である。
また、本発明の化合物は、ＡＬＤＨ１Ａ２検出用の青色蛍光プローブとしても用いることができる。
本明細書において、「アルキル基」又はアルキル部分を含む置換基（例えばアルコキシ基など）のアルキル部分は、特に言及しない場合には例えば炭素数１～６個、好ましくは炭素数１～４個、更に好ましくは炭素数１～３個程度の直鎖、分枝鎖、環状、又はそれらの組み合わせからなるアルキル基を意味している。より具体的には、アルキル基として、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、シクロプロピルメチル基、ｎ－ペンチル基、ｎ－ヘキシル基などを挙げることができる。
本明細書において「ハロゲン原子」という場合には、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれでもよく、好ましくはフッ素原子、塩素原子、又は臭素原子である。
本発明の１つの態様は、以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩である。
一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩において、蛍光団（フルオロフォア）として８－アミノ－ＢＯＤＩＰＹであることが重要である。
フルオロフォアについては，ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４０５及びＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（即ち、７－ヒドロキシクマリン誘導体）が従来最も広く使用されている親水性青色蛍光標識色素であるが、本発明者らは、新規なＡＬＤＨ検出用青色蛍光プローブの骨格として８－アミノ－ＢＯＤＩＰＹを採用した。非常に負に荷電したＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４０５とは異なり、ＢＯＤＩＰＹ基は正味の電荷を有さないため細胞膜を横切って自由に拡散する。一方、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅなどの中程度に陰性の荷電した陰イオン染料は、細胞膜を自由に通過することが知られているが、排出輸送系（有機アニオントランスポーター、多剤耐性タンパク質、ｐ－ｇｐ等）を介して細胞から容易に漏出することがあるため、新たなプローブ設計には適していないと本発明者らは考えた。
他方、ＢＯＤＩＰＹ色素は、一般に、緑色から赤色の領域で蛍光を示すが、８－アミノ－ＢＯＤＩＰＹの基底状態の構造は、ヘミシアニン類似ルイス構造によって最もよく記述され、ＢＯＤＩＰＹコアとアミンとの電子的カップリングは、可視波長の青色端への吸収の大きな浅色シフトをもたらすことが考えられる。また、化学修飾によりＢＯＤＩＰＹコアの全ての可能な位置に官能基を導入することが可能である。従って、本発明者らは、８－アミノ－ＢＯＤＩＰＹは新規なＡＬＤＨ検出用の青色蛍光プローブの設計に有用であると考えて、これを蛍光団として採用した。
フルオロフォアについては，ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４０５及びＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（即ち、７－ヒドロキシクマリン誘導体）が従来最も広く使用されている親水性青色蛍光標識色素であるが、本発明者らは、新規なＡＬＤＨ検出用青色蛍光プローブの骨格として８－アミノ－ＢＯＤＩＰＹを採用した。非常に負に荷電したＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４０５とは異なり、ＢＯＤＩＰＹ基は正味の電荷を有さないため細胞膜を横切って自由に拡散する。一方、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅなどの中程度に陰性の荷電した陰イオン染料は、細胞膜を自由に通過することが知られているが、排出輸送系（有機アニオントランスポーター、多剤耐性タンパク質、ｐ－ｇｐ等）を介して細胞から容易に漏出することがあるため、新たなプローブ設計には適していないと本発明者らは考えた。
他方、ＢＯＤＩＰＹ色素は、一般に、緑色から赤色の領域で蛍光を示すが、８－アミノ－ＢＯＤＩＰＹの基底状態の構造は、ヘミシアニン類似ルイス構造によって最もよく記述され、ＢＯＤＩＰＹコアとアミンとの電子的カップリングは、可視波長の青色端への吸収の大きな浅色シフトをもたらすことが考えられる。また、化学修飾によりＢＯＤＩＰＹコアの全ての可能な位置に官能基を導入することが可能である。従って、本発明者らは、８－アミノ－ＢＯＤＩＰＹは新規なＡＬＤＨ検出用の青色蛍光プローブの設計に有用であると考えて、これを蛍光団として採用した。
一般式（Ｉ）において、
は、以下の式（１）で表される基であり、ＡＬＤＨ１Ａ１に対する基質特異性基としての機能を有する。
理論に拘束されることを意図するものではないが、機能的なＡＬＤＨプローブを開発するためには、化合物は、細胞内へ受動拡散するのに適切な親水性－疎水性バランス、及び、細胞内でｉｎ ｓｉｔｕで生成されたＡＬＤＨ代謝産物（即ち、対応するカルボン酸生成物）がその後捕捉される能力を有する必要がある（プローブによるＡＬＤＨ活性を検出するメカニズムを示す図１を参照）。また、アルデヒドを有する部位はＡＬＤＨのよい基質でなければならない。
そこで、本発明者らは種々検討した結果、ＡＬＤＨ１Ａ１に対する基質特異性基として、ベンズアルデヒド基を有し、当該基が特定のリンカーを介して結合している構造を有する、式（１）で表される基を８－アミノ－ＢＯＤＩＰＹの蛍光団に導入すると、ＡＬＤＨ１Ａ１との反応性が高く、かつ、細胞内へ受動拡散するのに適切な親水性－疎水性バランスが得られることを見出した。
そこで、本発明者らは種々検討した結果、ＡＬＤＨ１Ａ１に対する基質特異性基として、ベンズアルデヒド基を有し、当該基が特定のリンカーを介して結合している構造を有する、式（１）で表される基を８－アミノ－ＢＯＤＩＰＹの蛍光団に導入すると、ＡＬＤＨ１Ａ１との反応性が高く、かつ、細胞内へ受動拡散するのに適切な親水性－疎水性バランスが得られることを見出した。
即ち、式（１）において、Ｌは、－（ＣＨ２）ｍ－、－（ＣＨ２）ｎ－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－（ＣＨ２）ｓ－、－（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－（ＣＨ２）ｓ－の２価の基から選択されるリンカーである。
ここで、ｍは１又は２、ｎは１又は２、ｓは１～４の整数である。ｍ、ｎ、ｓが２より大きくなるとプローブの脂溶性が高くなり過ぎて、ＡＬＤＨ代謝産物が細胞内に捕捉される能力が低下する。
ここで、ｍは１又は２、ｎは１又は２、ｓは１～４の整数である。ｍ、ｎ、ｓが２より大きくなるとプローブの脂溶性が高くなり過ぎて、ＡＬＤＨ代謝産物が細胞内に捕捉される能力が低下する。
式（Ｉ）において、アルデヒド基（－ＣＨＯ）は、ベンゼン環上のいずれの位置に導入することができるが、Ｌに対してｐ位に導入することが好ましい。
式（Ｉ）において、Ｒａは、水素原子、又は、炭素数１～４の置換又は無置換のアルキル基を表す。Ｒａは、ベンゼン環上において、４個存在し、これらは同一又は異なっていてもよい。本発明の１つの好ましい態様においては、Ｒａはいずれも水素原子である。
式（Ｉ）において、
である式（１）で表される基は、８－アミノ－ＢＯＤＩＰＹの＝Ｎ＋Ｈ２基の部分、または、蛍光団骨格のピロールの部位のいずれか一方にのみ導入される。
式（１）で表される基が蛍光団骨格のピロールの部位に導入される場合は、どの位置に導入してもよい。
一般式（Ｉ）において、Ｒは、存在する場合は、炭素数１～４の置換又は無置換のアルキル基を表す。Ｒが炭素数１～４のアルキル基であると、化合物が細胞内へ受動拡散するのに適切な親水性－疎水性バランスを得ることができ好ましい。
また、置換基としては、例えば、カルボキサミド基（（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨ２基（ｎ＝０～２)）が挙げられる。
また、置換基としては、例えば、カルボキサミド基（（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨ２基（ｎ＝０～２)）が挙げられる。
式（Ｉ）において、式（１）で表される基が８－アミノ－ＢＯＤＩＰＹの＝Ｎ＋Ｈ２の部分に導入される場合は、Ｒは１位、７位には存在しない。１位、７位にアルキル基が導入される場合は，蛍光性が著しく低下し，また蛍光波長が長波長シフトするため、１位、７位にはＲのアルキル基は導入されない。
式（Ｉ）において、式（１）で表される基が蛍光団骨格のピロールの部位に導入される場合は、Ｒは、存在する場合は、いずれの場所に導入することができる。
即ち、Ｒは、式（１）で表される基が導入されたピロール環と別のピロール環に導入してもよく、式（１）で表される基が導入されたピロール環に導入してもよく、両方のピロール環に導入してもよい。
即ち、Ｒは、式（１）で表される基が導入されたピロール環と別のピロール環に導入してもよく、式（１）で表される基が導入されたピロール環に導入してもよく、両方のピロール環に導入してもよい。
本発明の１つの側面は、以下の一般式（Ｉａ）で表される化合物又はその塩である。
一般式（Ｉａ）において、Ｌ、Ｒａ、Ｒは、一般式（Ｉ）で定義した通りである。
一般式（Ｉａ）において、Ｒが存在する場合は、Ｒは１位、７位以外の位置に導入される。ここで、Ｒは、一方のピロール環のみに導入してもよく、両方のピロール環に導入してもよい。
式（Ｉａ）において、Ｌとして、一般式（Ｉ）で定義したいずれのリンカーを用いることができるが、－（ＣＨ２）ｍ－（ｍは１又は２である）が特に好ましい。
本発明のもう１つの側面は、以下の一般式（Ｉｂ）で表される化合物又はその塩である。
一般式（Ｉｂ）において、Ｌ、Ｒａ、Ｒは、式（Ｉ）で定義した通りである。
式（Ｉｂ）において、Ｌとして、一般式（Ｉ）で定義したいずれのリンカーを用いることができるが、－（ＣＨ２）ｎ－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－（ＣＨ２）ｓ－、－（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－（ＣＨ２）ｓ－が好ましい。
式（Ｉｂ）において、式（１）で表される基は、どの位置に導入してもよい。
式（Ｉｂ）において、Ｒは、存在する場合は、いずれの場所に導入することができる。Ｒは、式（１）で表される基が導入されたピロール環と別のピロール環に導入してもよく、式（１）で表される基が導入されたピロール環に導入してもよく、両方のピロール環に導入してもよい。
本発明の一般式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）の化合物（以下「本発明の化合物」ともいう）は、置換基の種類に応じて１個または２個以上の不斉炭素を有する場合があり、光学異性体又はジアステレオ異性体などの立体異性体が存在する場合がある。純粋な形態の立体異性体、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などはいずれも本発明の範囲に包含される。また、本発明の化合物又はその塩は、水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、これらの物質はいずれも本発明の範囲に包含される。溶媒和物を形成する溶媒の種類は特に限定されないが、例えば、エタノール、アセトン、イソプロパノールなどの溶媒を例示することができる。
本発明の化合物の代表的化合物の製造方法を本明細書の実施例に具体的に示した。従って、当業者は、これらの説明をもとにして、反応原料、反応条件、及び反応試薬などを適宜選択して、必要に応じてこれらの方法に修飾や改変を加えることにより、本発明の化合物を製造することができる。
本発明の化合物は、アルデヒドロデヒドゲナーゼ１Ａ１活性を検出する蛍光プローブとして有用である。
即ち、本発明のもう１つの態様は、本発明の化合物又はその塩を含むアルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ１検出用蛍光プローブである。
即ち、本発明のもう１つの態様は、本発明の化合物又はその塩を含むアルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ１検出用蛍光プローブである。
また、本発明のもう１つの態様は、細胞内のアルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ１活性を検出する方法であって、（ａ）本発明の化合物又はその塩を細胞内に導入する工程、及び（ｂ）当該化合物又はその塩が細胞内でアルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ１と反応することにより発せられる蛍光を測定する工程を含む方法、である。
本発明の化合物又はその塩は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ１のない環境において実質的に無蛍光であるか、弱い蛍光のみを有するが、アルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ１のある環境において強い蛍光を発する特徴を有する。
本発明の化合物又はその塩は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ１のない環境において実質的に無蛍光であるか、弱い蛍光のみを有するが、アルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ１のある環境において強い蛍光を発する特徴を有する。
本発明の方法は、さらに蛍光イメージング手段を用いて蛍光応答を観測することを含むことができる。蛍光応答を観測する手段は、広い測定波長を有する蛍光光度計を用いることができるが、前記蛍光応答を２次元画像として表示可能な蛍光イメージング手段を用いて可視化することもできる。蛍光イメージングの手段を用いることによって、蛍光応答を二次元で可視化できるため、アルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ１を瞬時に視認することが可能となる。蛍光イメージング装置としては、当該技術分野において公知の装置を用いることができる。なお、場合によって、紫外可視吸光スペクトルの変化（例えば、特定の吸収波長における吸光度の変化）によって上記測定対象試料と蛍光プローブの反応を検出することも可能である。
本発明の蛍光プローブの使用方法は特に限定されず、従来公知の蛍光プローブと同様に用いることが可能である。通常は、生理食塩水や緩衝液などの水性媒体、又はエタノール、アセトン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどの水混合性の有機溶媒と水性媒体との混合物などに上記式（Ｉ）で表される化合物又はそれらの塩を溶解し、細胞や組織を含む適切な緩衝液中にこの溶液を添加して、蛍光スペクトルを測定すればよい。本発明の蛍光プローブを適切な添加物と組み合わせて組成物の形態で用いてもよい。例えば、緩衝剤、溶解補助剤、ｐＨ調節剤などの添加物と組み合わせることができる。
本発明の化合物は、４０５ｎｍのレーザーで励起可能なフローサイトメーターに用いることができる。４０５ｎｍのレーザーは、フローサイトメトリーに備えられた３つの標準レーザーの１つであり、本発明の化合物はかかるフローサイトメーターに好適に用いることができる。
また、本発明の化合物は、生細胞の多色染色のフローサイトメトリー分析に用いることができる。
従って、本発明の方法は、さらにフローサイトメーター（好適には、４０５ｎｍのレーザーで励起可能なフローサイトメーター）を用いて蛍光応答を観測することを含むことができる。
また、本発明の化合物は、生細胞の多色染色のフローサイトメトリー分析に用いることができる。
従って、本発明の方法は、さらにフローサイトメーター（好適には、４０５ｎｍのレーザーで励起可能なフローサイトメーター）を用いて蛍光応答を観測することを含むことができる。
本発明のもう１つの態様は、本発明の化合物又はその塩を含む、４０５ｎｍのレーザーで励起可能なフローサイトメーターに用いられるアルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ１検出用蛍光プローブである。
また、本発明のもう１つの態様は、本発明の化合物又はその塩を含む、４０５ｎｍのレーザーを備えるフローサイトメーターに用いられるアルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ１検出用蛍光プローブである。
また、本発明のもう１つの態様は、本発明の化合物又はその塩を含む、搭載レーザーとして少なくとも４０５ｎｍのレーザーを備えるフローサイトメーターに用いられるアルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ１検出用蛍光プローブである。
また、本発明のもう１つの態様は、本発明の化合物又はその塩を含む、４０５ｎｍのレーザーを備えるフローサイトメーターに用いられるアルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ１検出用蛍光プローブである。
また、本発明のもう１つの態様は、本発明の化合物又はその塩を含む、搭載レーザーとして少なくとも４０５ｎｍのレーザーを備えるフローサイトメーターに用いられるアルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ１検出用蛍光プローブである。
上記工程（ａ）における測定対象である細胞の試料は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ１を発現している細胞であることができるが、かかる細胞がアルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ１を発現しているがん細胞やがん組織である場合には、本発明の検出方法によって、がん細胞やがん組織を検出又は可視化することができる。すなわち、本発明の蛍光プローブ、当該蛍光プローブを含む組成物、及び本発明の検出方法は、がんの診断に用いることもできる。
本明細書において、「がん組織」の用語はがん細胞を含む任意の組織を意味している。「組織」の用語は臓器の一部又は全体を含めて最も広義に解釈しなければならず、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。がん組織としてはアルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ１を高発現している組織が好ましい。また、本明細書において「診断」の用語は任意の生体部位においてがん組織の存在を肉眼的又は顕微鏡下に確認することを含めて最も広義に解釈する必要がある。
本発明の検出方法においては、上記蛍光プローブを含むアルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ１検出用キットを用いることが好ましい。当該キットにおいて、通常、本発明の蛍光プローブは溶液として調製されているが、例えば、粉末形態の混合物、凍結乾燥物、顆粒剤、錠剤、液剤など適宜の形態の組成物として提供され、使用時に注射用蒸留水や適宜の緩衝液に溶解して適用することもできる。
また、当該キットには、必要に応じてそれ以外の試薬等を適宜含んでいてもよい。例えば、添加剤として、溶解補助剤、ｐＨ調節剤、緩衝剤、等張化剤などの添加剤を用いることができ、これらの配合量は当業者に適宜選択可能である。
また、本発明の化合物は、アルデヒドロデヒドゲナーゼ１Ａ２活性を検出する蛍光プローブとしても有用である。
即ち、本発明のもう１つの態様は、本発明の化合物又はその塩を含むアルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ２検出用蛍光プローブである。
即ち、本発明のもう１つの態様は、本発明の化合物又はその塩を含むアルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ２検出用蛍光プローブである。
また、本発明のもう１つの態様は、細胞内のアルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ２活性を検出する方法であって、（ａ）本発明の化合物又はその塩を細胞内に導入する工程、及び（ｂ）当該化合物又はその塩が細胞内でアルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ２と反応することにより発せられる蛍光を測定する工程を含む方法、である。
本発明のアルデヒドロデヒドゲナーゼ１Ａ２活性を検出する蛍光プローブ、及び、細胞内のアルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ２活性を検出する方法の詳細については、本発明のアルデヒドロデヒドゲナーゼ１Ａ１活性を検出する蛍光プローブ、及び、細胞内のアルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ１活性を検出する方法について詳述したのと同様である。
従って、本発明のもう１つの態様は、本発明の化合物又はその塩を含む、４０５ｎｍのレーザーで励起可能なフローサイトメーターに用いられるアルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ２検出用蛍光プローブである。
また、本発明のもう１つの態様は、本発明の化合物又はその塩を含む、４０５ｎｍのレーザーを備えるフローサイトメーターに用いられるアルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ２検出用蛍光プローブである。
また、本発明のもう１つの態様は、本発明の化合物又はその塩を含む、搭載レーザーとして少なくとも４０５ｎｍのレーザーを備えるフローサイトメーターに用いられるアルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ２検出用蛍光プローブである。
また、本発明の細胞内のアルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ２活性を検出する方法は、さらにフローサイトメーター（好適には、４０５ｎｍのレーザーで励起可能なフローサイトメーター）を用いて蛍光応答を観測することを含むことができる。
従って、本発明のもう１つの態様は、本発明の化合物又はその塩を含む、４０５ｎｍのレーザーで励起可能なフローサイトメーターに用いられるアルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ２検出用蛍光プローブである。
また、本発明のもう１つの態様は、本発明の化合物又はその塩を含む、４０５ｎｍのレーザーを備えるフローサイトメーターに用いられるアルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ２検出用蛍光プローブである。
また、本発明のもう１つの態様は、本発明の化合物又はその塩を含む、搭載レーザーとして少なくとも４０５ｎｍのレーザーを備えるフローサイトメーターに用いられるアルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ２検出用蛍光プローブである。
また、本発明の細胞内のアルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ２活性を検出する方法は、さらにフローサイトメーター（好適には、４０５ｎｍのレーザーで励起可能なフローサイトメーター）を用いて蛍光応答を観測することを含むことができる。
本発明の好ましい側面においては、アルデヒドロデヒドゲナーゼ１Ａ２活性検出用蛍光プローブは、本発明の化合物として、ＡｌｄｅＢｌｕｅ－８又はＡｌｄｅＢｌｕｅを含有する。
本発明の細胞内のアルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ２活性を検出する方法の好ましい側面においては、本発明の化合物として、ＡｌｄｅＢｌｕｅ－８又はＡｌｄｅＢｌｕｅが用いられる。
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
［試料及び測定方法］
有機合成のための試薬及び溶媒は東京化学工業（ＴＣＩ）、和光純化工業又はアルドリッチケミカル社から供給され、それ以上精製することなく使用した。
プロトン核磁気共鳴（１Ｈ ＮＭＲ）と炭素－ＮＭＲ（１３Ｃ ＮＭＲ）スペクトルをＪＥＯＬ ＪＭＮ－ＥＣＺ４００ＳとＪＭＮ－ＬＡ４００装置で記録した。
質量スペクトルは、ＪＥＯＬ ＪＭＳ－Ｔ１００ＬＰ ＡｃｃｕＴＯＦＴＭ ＬＣ－ｐｌｕｓ４Ｇで測定した。
有機合成のための試薬及び溶媒は東京化学工業（ＴＣＩ）、和光純化工業又はアルドリッチケミカル社から供給され、それ以上精製することなく使用した。
プロトン核磁気共鳴（１Ｈ ＮＭＲ）と炭素－ＮＭＲ（１３Ｃ ＮＭＲ）スペクトルをＪＥＯＬ ＪＭＮ－ＥＣＺ４００ＳとＪＭＮ－ＬＡ４００装置で記録した。
質量スペクトルは、ＪＥＯＬ ＪＭＳ－Ｔ１００ＬＰ ＡｃｃｕＴＯＦＴＭ ＬＣ－ｐｌｕｓ４Ｇで測定した。
分光学的性質の測定
吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルは，０．１％ ＤＭＳＯ を共溶媒として含む生理食塩水中で測定した。絶対量子収率は，浜松フォトニクスの絶対量子収率計 Ｃ１１３４７を用いて決定した。
吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルは，０．１％ ＤＭＳＯ を共溶媒として含む生理食塩水中で測定した。絶対量子収率は，浜松フォトニクスの絶対量子収率計 Ｃ１１３４７を用いて決定した。
逆相高速液体クロマトグラフィーによる化合物の疎水性評価
高速液体クロマトグラフィーは、Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ １２０カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を用い，Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０シリーズ及び６１３０ ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ ＬＣ／ＭＳシステムで分析を行った．移動相は、Ａ（１０ｍＭギ酸アンモニウム溶液）とＢ（アセトニトリル／水＝８：２のギ酸アンモニウム溶液）を用い、０～１０分間は３０％ Ｂ、その後、５分間のグラジエント勾配により１００％ Ｂ とした。検出は、ＰＤＡ検出器によりＡｌｄｅｂｌｕｅ－８及びＡｌｄｅｂｌｕｅ は４００ｎｍ、ｐｒｏｂｅ５は４９６ｎｍ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ結合プローブは５０４ｎｍの吸収を検出し、続いて四重極質量分析計によって溶出された分子の質量を決定した。
高速液体クロマトグラフィーは、Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ １２０カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を用い，Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０シリーズ及び６１３０ ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ ＬＣ／ＭＳシステムで分析を行った．移動相は、Ａ（１０ｍＭギ酸アンモニウム溶液）とＢ（アセトニトリル／水＝８：２のギ酸アンモニウム溶液）を用い、０～１０分間は３０％ Ｂ、その後、５分間のグラジエント勾配により１００％ Ｂ とした。検出は、ＰＤＡ検出器によりＡｌｄｅｂｌｕｅ－８及びＡｌｄｅｂｌｕｅ は４００ｎｍ、ｐｒｏｂｅ５は４９６ｎｍ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ結合プローブは５０４ｎｍの吸収を検出し、続いて四重極質量分析計によって溶出された分子の質量を決定した。
プローブのＡＬＤＨアイソザイム選択性と酵素反応速度論
３つのアイソフォームＡＬＤＨ酵素（ＡＬＤＨ１Ａ１、ＡＬＤＨ２、ＡＬＤＨ３Ａ１）はＡＴＧｅｎから購入した。すべての酵素反応は、３７℃で行った。酵素反応は、酵素溶液とプローブ溶液を混ぜた時点を開始ゼロ分とした。酵素反応液は、０．５－２００ｎＭの酵素、１％ＤＭＳＯ（共溶媒）、１００ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭジチオスレイトール、補酵素として１ｍＭ ＮＡＤ＋（ＡＬＤＨ１Ａ１及びＡＬＤＨ２）もしくは１ｍＭのＮＡＤＰ＋（ＡＬＤＨ３）を含む条件とした．酵素反応は，同量のアセトニトリルを反応用液に混ぜることで，任意の時間で停止し、その後、高速液体クロマトグラフィーにより生成物を分析した。その後、合成した標品と液体クロマトグラフィー／四重極質量分析計を用い作成した検量線に基づき、ＡＬＤＨの代謝産物であるカルボン酸体の量を分析結果のピーク面積から定量した。ミカエリス定数およびターンオーバー数は、グラフ解析ソフト：カレイダグラフ（ＨＵＬＩＮＫＳ Ｉｎｃ社）を用い、ミカエリスメンテン式にフィッティングして算出した。
３つのアイソフォームＡＬＤＨ酵素（ＡＬＤＨ１Ａ１、ＡＬＤＨ２、ＡＬＤＨ３Ａ１）はＡＴＧｅｎから購入した。すべての酵素反応は、３７℃で行った。酵素反応は、酵素溶液とプローブ溶液を混ぜた時点を開始ゼロ分とした。酵素反応液は、０．５－２００ｎＭの酵素、１％ＤＭＳＯ（共溶媒）、１００ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭジチオスレイトール、補酵素として１ｍＭ ＮＡＤ＋（ＡＬＤＨ１Ａ１及びＡＬＤＨ２）もしくは１ｍＭのＮＡＤＰ＋（ＡＬＤＨ３）を含む条件とした．酵素反応は，同量のアセトニトリルを反応用液に混ぜることで，任意の時間で停止し、その後、高速液体クロマトグラフィーにより生成物を分析した。その後、合成した標品と液体クロマトグラフィー／四重極質量分析計を用い作成した検量線に基づき、ＡＬＤＨの代謝産物であるカルボン酸体の量を分析結果のピーク面積から定量した。ミカエリス定数およびターンオーバー数は、グラフ解析ソフト：カレイダグラフ（ＨＵＬＩＮＫＳ Ｉｎｃ社）を用い、ミカエリスメンテン式にフィッティングして算出した。
細胞培養
ＡＬＤＨ１Ａ１を高発現している細胞として、ＳＢＣ５細胞（ヒト小細胞肺がん由来、ＪＣＲＢセルバンク）及びＨ１０４８細胞（ヒト小細胞肺がん、ＡＴＣＣ）を用いた。両細胞とも１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０中、５％の二酸化炭素を含む空気雰囲気下、３７℃で培養を行った。
ＡＬＤＨ１Ａ１を高発現している細胞として、ＳＢＣ５細胞（ヒト小細胞肺がん由来、ＪＣＲＢセルバンク）及びＨ１０４８細胞（ヒト小細胞肺がん、ＡＴＣＣ）を用いた。両細胞とも１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０中、５％の二酸化炭素を含む空気雰囲気下、３７℃で培養を行った。
蛍光イメージング
細胞は，実験を行う１日前にＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ 社製の８ウェルチャンバーカバーガラスに撒き、培養して用いた。プローブを溶解させたイメージング用緩衝液（１％ＦＢＳ、２．５ｍＭプロベネシド、１００μＭベラパミルを含むＨＢＳＳ（－）溶液）に細胞を３７℃、５－１５分静置し、染色した。染色用液を除いた後、細胞は、氷冷したプローブを含まない緩衝液ですすぎ、新しい氷冷した緩衝液を加えた。また本実験のネガティブコントロールとしては、ＡＬＤＨ活性を阻害したＤＥＡＢ（ＡＬＤＨ１／２阻害薬）で処理した細胞を用いた。共焦点蛍光像は、１０倍ないしは４０倍の対物レンズを用い、ＴＣＳ ＳＰ５／ＳＰ８で撮像を行った（励起波長４０５ｎｍ、蛍光検出波長４２０－４６０ｎｍ）。
細胞は，実験を行う１日前にＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ 社製の８ウェルチャンバーカバーガラスに撒き、培養して用いた。プローブを溶解させたイメージング用緩衝液（１％ＦＢＳ、２．５ｍＭプロベネシド、１００μＭベラパミルを含むＨＢＳＳ（－）溶液）に細胞を３７℃、５－１５分静置し、染色した。染色用液を除いた後、細胞は、氷冷したプローブを含まない緩衝液ですすぎ、新しい氷冷した緩衝液を加えた。また本実験のネガティブコントロールとしては、ＡＬＤＨ活性を阻害したＤＥＡＢ（ＡＬＤＨ１／２阻害薬）で処理した細胞を用いた。共焦点蛍光像は、１０倍ないしは４０倍の対物レンズを用い、ＴＣＳ ＳＰ５／ＳＰ８で撮像を行った（励起波長４０５ｎｍ、蛍光検出波長４２０－４６０ｎｍ）。
フローサイトメトリー
細胞は、蛍光イメージングの項で述べた手順に従い、準備した。５．０×１０５個の細胞を、プローブを含む５００μＬのイメージング緩衝液でインキュベートした。ＡｌｄｅＢｌｕｅ－８で染色したサンプルは、遠心操作後、上清を除いた後、３００μＬの氷冷した緩衝液で置換した。Ａｌｄｅｂｌｕｅで染色したサンプルは、緩衝液を置換する操作を行わず、サンプルを氷浴上で冷却し、そのままフローサイトメーターでの分析に用いた。細胞懸濁液は、セルストレイナー付きの遠心チューブ（Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）により細胞凝集塊を除いた。その後、４０５ｎｍ及び４８８ｎｍのレーザーを備えたＦＡＣＳ ＬＳＲ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてフローサイトメトリーを行い、得られたデータをＦＡＣＳ Ｄｉｖａ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析を行った。ＡｌｄｅＢｌｕｅとＡｌｄｅＢｌｕｅ－８のシグナルは、４０５ｎｍの励起により４４０／４０蛍光フィルターによって検出し、ＡＬＤＦＬＵＯＲ及びＥＧＦＰについては４８８ｎｍの励起により５３０／３０フィルターで検出した。破片、死細胞、ダブレット細胞をゲートアウトし、細胞カウント数が少なくとも１×１０４個となるよう分析を行った。Ａｌｄｅｆｌｕｏｒ（登録商標）のアッセイを参照して、陽性細胞の検出ゲートは、ネガティブコントロールがゲートに約０．５％含まれるように、陰性対照よりも高い強度レベルを示す領域で区切った。
細胞は、蛍光イメージングの項で述べた手順に従い、準備した。５．０×１０５個の細胞を、プローブを含む５００μＬのイメージング緩衝液でインキュベートした。ＡｌｄｅＢｌｕｅ－８で染色したサンプルは、遠心操作後、上清を除いた後、３００μＬの氷冷した緩衝液で置換した。Ａｌｄｅｂｌｕｅで染色したサンプルは、緩衝液を置換する操作を行わず、サンプルを氷浴上で冷却し、そのままフローサイトメーターでの分析に用いた。細胞懸濁液は、セルストレイナー付きの遠心チューブ（Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）により細胞凝集塊を除いた。その後、４０５ｎｍ及び４８８ｎｍのレーザーを備えたＦＡＣＳ ＬＳＲ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてフローサイトメトリーを行い、得られたデータをＦＡＣＳ Ｄｉｖａ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析を行った。ＡｌｄｅＢｌｕｅとＡｌｄｅＢｌｕｅ－８のシグナルは、４０５ｎｍの励起により４４０／４０蛍光フィルターによって検出し、ＡＬＤＦＬＵＯＲ及びＥＧＦＰについては４８８ｎｍの励起により５３０／３０フィルターで検出した。破片、死細胞、ダブレット細胞をゲートアウトし、細胞カウント数が少なくとも１×１０４個となるよう分析を行った。Ａｌｄｅｆｌｕｏｒ（登録商標）のアッセイを参照して、陽性細胞の検出ゲートは、ネガティブコントロールがゲートに約０．５％含まれるように、陰性対照よりも高い強度レベルを示す領域で区切った。
Ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡを用いたＲＮＡ干渉によるＡＬＤＨ１Ａ１のノックダウン
ＡＤＨ１Ａ１ ｓｉＲＮＡｓはｓｉｌｅｎｃｅｒ ｓｅｌｅｃｔ ｖａｌｉｄａｔｅｄ ｓｉＲＮＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｓｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）のｓ１２３６、ｓ１２３７、ｓ１２３８を、ネガティブコントロールとしては，ｎｏｎ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｉＲＮＡを用い、ｌｉｆｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＲＮＡｉＭＡＸで細胞に遺伝子導入した。遺伝子導入試薬の調製は、試薬付属の手順書に従った。ＳＢＣ５を導入試薬を混合させた後、６－ｗｅｌｌディッシュで３日間培養した。ＡＬＤＨ１Ａ１のノックダウン率は免疫ブロット法により発現量低下を確認したところ、使用したｓｉＲＮＡの中ではｓ１２３７が最も効率が良いことがわかったため、フローサイトメトリーでの分析はｓ１２３７を用い行った。尚、遺伝子導入の際には、ｓｉＲＮＡの終濃度は２０ｎＭ、遺伝子導入試薬は０．３％ ｖ／ｖとなるように調整し、使用した。
ＡＤＨ１Ａ１ ｓｉＲＮＡｓはｓｉｌｅｎｃｅｒ ｓｅｌｅｃｔ ｖａｌｉｄａｔｅｄ ｓｉＲＮＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｓｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）のｓ１２３６、ｓ１２３７、ｓ１２３８を、ネガティブコントロールとしては，ｎｏｎ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｉＲＮＡを用い、ｌｉｆｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＲＮＡｉＭＡＸで細胞に遺伝子導入した。遺伝子導入試薬の調製は、試薬付属の手順書に従った。ＳＢＣ５を導入試薬を混合させた後、６－ｗｅｌｌディッシュで３日間培養した。ＡＬＤＨ１Ａ１のノックダウン率は免疫ブロット法により発現量低下を確認したところ、使用したｓｉＲＮＡの中ではｓ１２３７が最も効率が良いことがわかったため、フローサイトメトリーでの分析はｓ１２３７を用い行った。尚、遺伝子導入の際には、ｓｉＲＮＡの終濃度は２０ｎＭ、遺伝子導入試薬は０．３％ ｖ／ｖとなるように調整し、使用した。
免疫ブロット法によるＡＬＤＨ１Ａ１発現量の定量
細胞は、ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ緩衝液（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）を用いライセート化した。ライセート用液はＳＤＳ－ポリアクリルアミド電気泳動法で泳動した後、ニトロセルロース膜に転写し、一次抗体として、ウサギ由来ヒトＡＬＤＨ１Ａ１モノクローナル抗体（１／１０００希釈、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）、およびベータアクチン（ウサギ由来ヒトベータアクチンモノクローナル抗体（１／１０００希釈、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）を結合させた。その後１次抗体に、二次抗体（ＨＲＰを結合させた抗ウサギＩｇＧ抗体、１／２０００希釈、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）を結合させ、ＥＣＬ ｐｒｉｍｅ ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ （ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）で複合体の検出をおこなった。撮像には、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＬＡＳ ４０００ｍｉｎｉを用いた。ＡＬＤＨ１Ａ１の発現量は、ベータアクチンの発現量で基準化し、ｎｏｎ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｉＲＮＡ処理群との比として表し、比較した。
細胞は、ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ緩衝液（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）を用いライセート化した。ライセート用液はＳＤＳ－ポリアクリルアミド電気泳動法で泳動した後、ニトロセルロース膜に転写し、一次抗体として、ウサギ由来ヒトＡＬＤＨ１Ａ１モノクローナル抗体（１／１０００希釈、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）、およびベータアクチン（ウサギ由来ヒトベータアクチンモノクローナル抗体（１／１０００希釈、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）を結合させた。その後１次抗体に、二次抗体（ＨＲＰを結合させた抗ウサギＩｇＧ抗体、１／２０００希釈、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）を結合させ、ＥＣＬ ｐｒｉｍｅ ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ （ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）で複合体の検出をおこなった。撮像には、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＬＡＳ ４０００ｍｉｎｉを用いた。ＡＬＤＨ１Ａ１の発現量は、ベータアクチンの発現量で基準化し、ｎｏｎ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｉＲＮＡ処理群との比として表し、比較した。
細胞のソーティング
Ｈ１０４８細胞は、フローサイトメトリーの項で述べた方法に従って準備し、染色した。ただし、ＡｌｄｅＢｌｕｅ－８は２０μＭの終濃度、１００μＭのＤＥＡＢの共存化／非共存化で用いた。染色した細胞は細胞のソーター付きのフローサイトメーター（ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析し、上位１０－１５％の蛍光強度を示す細胞群と下位１０－１５％の蛍光強度を示す細胞群をそれぞれ分けて採取した。採取した細胞は、免疫ブロット法によりＡＬＤＨ１Ａ１発現量を定量した。
Ｈ１０４８細胞は、フローサイトメトリーの項で述べた方法に従って準備し、染色した。ただし、ＡｌｄｅＢｌｕｅ－８は２０μＭの終濃度、１００μＭのＤＥＡＢの共存化／非共存化で用いた。染色した細胞は細胞のソーター付きのフローサイトメーター（ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析し、上位１０－１５％の蛍光強度を示す細胞群と下位１０－１５％の蛍光強度を示す細胞群をそれぞれ分けて採取した。採取した細胞は、免疫ブロット法によりＡＬＤＨ１Ａ１発現量を定量した。
遺伝子導入
ＳＢＣ５細胞にＮｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍを用い、ｐＥＧＦＰ－Ｃ１を遺伝子導入した。手順は使用書に従った。その後細胞を、Ｇ－４１８（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を含む培地で２週間培養し、遺伝子導入された細胞を選別し、共染色実験に用いた。
ＳＢＣ５細胞にＮｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍを用い、ｐＥＧＦＰ－Ｃ１を遺伝子導入した。手順は使用書に従った。その後細胞を、Ｇ－４１８（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を含む培地で２週間培養し、遺伝子導入された細胞を選別し、共染色実験に用いた。
合成実施例
本明細書に記載した本発明の概念に基づき、以下の反応スキーム１の手順に従って、ＡＬＤＨ検出用の青色蛍光プローブとしてＡｌｄｅＢｌｕｅ－８（化合物３）とＡｌｄｅＢｌｕｅ（化合物１２）を合成した。
本明細書に記載した本発明の概念に基づき、以下の反応スキーム１の手順に従って、ＡＬＤＨ検出用の青色蛍光プローブとしてＡｌｄｅＢｌｕｅ－８（化合物３）とＡｌｄｅＢｌｕｅ（化合物１２）を合成した。
スキーム１
合成条件：a) チオメチルBODIPY、b) HCl aq. c) ２－エチルピロール, CSCl2, d) CH3I, e) BF3 ・ O(C2H5)2, f) NO2BnNH2, g) NaOH aq. h) NHS, WSCD, i) 化合物１０, j) HCl aq.
化合物３：AldeBlue-8、化合物１２：AldeBlue
化合物３：AldeBlue-8、化合物１２：AldeBlue
［合成実施例１］
ＡｌｄｅＢｌｕｅ－８（化合物３：１０－（４－（ジメトキシメチル）ベンジルアミノ）－５，５－ジフルオロ－５Ｈ－ジピロロ［１，２－ｃ：１’，２’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム－５－ウイド）の合成
ＡｌｄｅＢｌｕｅ－８（化合物３：１０－（４－（ジメトキシメチル）ベンジルアミノ）－５，５－ジフルオロ－５Ｈ－ジピロロ［１，２－ｃ：１’，２’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム－５－ウイド）の合成
1H-NMR (400 MHz, CD2Cl2):δ 3.34 (s, 3H), 4.90 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 5.39 (s, 1H), 6.48 (br-m, 2H), 6.88 (br-t, J = 5.6 Hz, 1H), 7.10 (br-m, 2H), 7.40 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.52 (d, J = 8,4 Hz, 2H). 13C-NMR (100 MHz, CD2Cl2):δ51.7, 53.2, 103.2, 114.2, 115.5, 124.8, 132.9, 125.2, 136.2, 139.8, 148.6. HRMS (ESI+): m/z calcd for C19H20BF2N3NaO2, [M+Na]+, 394.15143, found 394.15270 (1.27 mmu).
化合物２は１０ｍＭのＤＭＳＯ溶液とした後、－２０℃で保存し、用事、化合物３（ＡｌｄｅＢｌｕｅ－８）へと変換した後、用いた。溶液の調整は次に従った。化合物２の１０ｍＭ ＤＭＳＯ溶液２５μＬと２５μＬの塩酸水溶液（２Ｎ）を室温下混合し、１５分静置した。液体クロマトグラフィーにより原料が消失したことを確認した後、４５０μＬの生理食塩水を加えることで、５００μＭの化合物３：ＡｌｄｅＢｌｕｅ－８水溶液とした。
［合成実施例２］
化合物１２（ＡｌｄｅＢｌｕｅ）の合成
化合物１２（ＡｌｄｅＢｌｕｅ）の合成
（１） 化合物５（メチル３－（５－（５－エチル－１Ｈ－ピロール－２－カルボノチオニル）－１Ｈ－ピロール－２－イル）プロパノエート）の合成
化合物４（メチル３－（１Ｈ－ピロール－２－イル）プロパノエート）は、文献既知の方法に従い、合成した（Synthesis of 3-BODIPY-Labeled Active Esters of Nucleotides and a Chemical Primer Extension Assay on Beads, Kerstin Giessler, et al. Eur. J. Org. Chem. 2010, 3611-3620）。
－７８℃に冷却したチオホスゲン（７５１μＬ、９．８ｍｍｏｌ）の脱水ＴＨＦ溶液（１０ｍＬ）に対し、２－エチル－１－Ｈ－ピロール（１．２４ｇ、１３．１ｍｍｏｌ）と化合物４を溶解させたＴＨＦ溶液（１０ｍＬ）を攪拌下、滴下し加えた。反応溶液を３０分間攪拌した後、反応液にアルミナ３０ｇを加えた。溶液を減圧下濃縮した後、残渣をアルミナを担体とするカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物５の橙赤色固体７６０ｍｇ、収率４０％で得た。
－７８℃に冷却したチオホスゲン（７５１μＬ、９．８ｍｍｏｌ）の脱水ＴＨＦ溶液（１０ｍＬ）に対し、２－エチル－１－Ｈ－ピロール（１．２４ｇ、１３．１ｍｍｏｌ）と化合物４を溶解させたＴＨＦ溶液（１０ｍＬ）を攪拌下、滴下し加えた。反応溶液を３０分間攪拌した後、反応液にアルミナ３０ｇを加えた。溶液を減圧下濃縮した後、残渣をアルミナを担体とするカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物５の橙赤色固体７６０ｍｇ、収率４０％で得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ1.29 (t, J = 7.8 Hz, 3H); 2.68 (q, J = 7.2 Hz, 4H); 2.97 (t, J = 7.1 Hz, 2H); 3.72 (s, 3H); 6.12 (t, J = 3.4 Hz, 1H); 6.15 (t, J = 3.4 Hz, 1H); 6.88 (t, J = 3.0 Hz, 1H); 6.93 (t, J = 3.2 Hz, 1H); 9.61 (br, 1H): 9.87 (br, 1H). 13C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ13.0, 21.4, 23.1, 33.4, 52.1, 110.3, 110.8, 115.3, 116.1, 137.4, 137.6, 141.5, 145.9, 173.3, 189.3. HRMS (ESI+): m/z calcd for C15H19N2OsS1, [M+H]+, 291.11672, found 291.11464 (-2.08 mmu).
（２） 化合物６（（Ｅ）－メチル３－（２－（（５－エチル－１Ｈ－ピロール－２－イル）（メチルチオ）メチレン）－２Ｈ－ピロール－５－イル）プロパノエート）の合成
化合物５を脱水ジクロロメタン１０ｍＬに溶解し、ヨウ化メチル（０．８２ｍＬ、１３．２ｍｍｏｌ）を室温下、攪拌しながら加えた。反応溶液を２４時間攪拌した後、溶媒を減圧下留去することで、化合物６を得た。化合物６は精製操作を行うことなく、次の反応に用いた。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 1.29 (t, J = 7.5 Hz, 3H), 2.80-2.83 (m, 5H), 3.05 (q J = 7.6 Hz, 2H), 3.26 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 3.65 (s, 3H), 6.41 (d, J = 3.7 Hz, 1H), 6.45 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 7.02 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 7.08 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 11.61 (br, 1H), 11.77 (br, 1H). 13C-NMR (100 MHz, CDCl3): δ 13.1, 22.2, 23.6, 33.3, 52.1, 116.8, 116.9, 128.7, 129.9, 130.1, 130.4, 153.6, 157.7, 159.9, 173.2. HRMS (ESI+): m/z calcd for C16H21N2OsS1, [M+H]+, 305.13237, found 305.13058 (-1.79 mmu).
（３）化合物７（７－エチル－５，５－ジフルオロ－３－（３－メトキシ－３－オキソプロピル）－１０－（メチルチオ）－５Ｈ－ジピロロ［１，２－ｃ：１’，２’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム－５－ウイド
化合物６（１．１３ｇ、２．６２ｍｍｏｌ）の脱水ジクロロメタン溶液（１０ｍＬ）をアルゴン雰気下、氷浴で冷却し、ＢＦ３ ＯＥｔ２（２．０９ ｍＬ、７．８６ｍｍｏｌ）とＤＩＥＡ（４．４８ｍＬ、２６．２ｍｍｏｌ）を順次、攪拌下、滴下して加えた。その後、反応用液を室温に戻し、終夜攪拌した。反応用液に水を加え余剰の試薬を不活化した後、２０ｍＬのジクロロメタンで希釈した。有機層を水、および飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。減圧下溶媒を濃縮した後、残渣をシリカゲルを担体としたカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物７を暗赤色固体３４５ｍｇ、収率３８％で得た。
1H-NMR (400 MHz, CD2Cl2): δ 1.31 (t, J = 7.5 Hz, 3H), 2.71-2.78 (m, 5H), 2.99 (q, J = 7.5 Hz, 2H), 3.25 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 3.68 (s, 3H), 6.33 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 6.42 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 7.33 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 7.41 (d, J = 4.1 Hz, 1H). 13C-NMR (100 MHz, CD2Cl2): δ 12.6, 21.8, 24.3, 33.3, 52.0, 117.6, 118.0, 127.8, 129.2, 134.8, 135.4, 146.6, 157.8, 163.9, 173.0. HRMS (ESI+): m/z calcd for C16H19F1N2O2S1, [M-F]+, 333.12443, found 333.12464 (0.21 mmu).
（４）化合物８（７－エチル－５，５－ジフルオロ－３－（３－メトキシ－３－オキソプロピル）－１０－（４－ニトロベンジルアミノ）－５Ｈ－ジピロロ［１，２－ｃ：１’，２’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム－５－ウイド）の合成
４－ニトロベンジルアミン塩酸塩（８９ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ）とジイソプロピルエチルアミン（１３５μＬ、０．７９ｍｍｏｌ）を脱水ＤＭＦ１ｍＬに溶解させ、化合物７（１３９ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ）を加えた。反応溶液を室温下１０分間攪拌した後、溶液を酢酸エチル１５ｍＬで希釈した。溶液を５％クエン酸溶液と飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧下留去した後、残渣をＮＨシリカゲルを担体としたカラムクロマトグラフィーによって精製し、化合物 ８を橙色固体７５ｍｇ、４１％の収率で得た。
1H-NMR (400 MHz, CD2Cl2): δ 1.20 (t, J = 7.6 Hz, 3H), 2.63 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.88 (q, J = 7.6 Hz, 2H), 3.15 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 3.58 (s, 3H), 4.87 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 6.13 (d, J = 3.6 Hz, 1H), 6.21(d, J = 3.6 Hz, 1H), 6.58(br, 1H), 6.82 (d, J = 4.4 Hz, 1H), 6.88 (d, J = 4.4 Hz, 1H), 7.45 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 8.15 (d, J = 8.8 Hz, 2H). 13C-NMR (100 MHz, CD2Cl2): δ 13.3, 21.7, 23.8, 33.8, 50.5, 51.9, 114.2, 122.9, 123.6 124.8, 128.5, 143.1, 146.6, 148.3, 150.3, 155.5, 173.5. HRMS (ESI-): m/z calcd for C22H22B1F2N4O4, [M-H]-, 455.17022, found 455.16883 (-1.38 mmu).
（５）化合物９（１０－アミノ－３－（２－カルボキシエチル）－７－エチル－５，５－ジフルオロ－５Ｈ－ジピロロ［１，２－ｃ：１’，２’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム－５－ウイド）の合成
化合物８（７５ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）をＴＨＦ、２Ｎ塩酸水溶液、蒸留水の混合液（５：４：１２）に溶解させた後、室温下、３時間攪拌した。ＴＨＦを減圧下留去した後、酢酸エチル１０ｍＬで３回抽出した。水槽を２Ｎ塩酸水溶液で強酸性とした後、再度、酢酸エチル１０ｍＬで３回抽出した後、まとめた有機層を飽和食塩水で洗浄した。有機層は無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下濃縮した。得られた残渣を、シリカゲルを担体としたカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物９の橙色固体４９ｍｇ、９８％収率で得た。
1H-NMR (400 MHz, CD3OD): δ 1.28 (t, J = 7.5 Hz, 3H), 2.70 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 2.93 (q, J = 7.6 Hz, 2H), 3.20 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 6.22 (t, J = 3.9 Hz, 2H), 7.22 (d, J = 3.7 Hz, 1H), 7.26 (d, J = 3.7 Hz, 1H). 13C-NMR (100 MHz, CD3OD): δ 13.8, 21.1, 24.5, 34.8, 113.1, 113.7, 118.6, 119.3, 124.6, 125.1, 149.5, 149.6, 153.9, 176.6. HRMS (ESI-): m/z calcd for C14H14B1F1N3O2, [M-F-2H]-, 286.11631, found 286.11816 (1.85 mmu).
（６）化合物１０（１０－アミノ－３－（３－（２，５－ジオキソピロリジン－１－イルオキシ）－３－オキソプロピル）－７－エチル－５，５－ジフルオロ－５Ｈ－ジピロロ［１，２－ｃ：１’，２’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム－５－ウイド
化合物９（４９ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）の脱水ＤＭＦ２ｍＬ溶液に、ＥＤＣ塩酸塩（３６ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）およびＮ－ヒドロキシコハク酸イミド（３７ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（８２μＬ、０．４８ｍｍｏｌ）を室温下、加えた。反応溶液を終夜攪拌した後、２Ｎ塩酸水溶液を加え溶液を酢酸エチル２０ｍＬで３回抽出した。集めた有機層は、水２０ｍＬで３回、飽和食塩水５ｍＬで２回洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去した。得られた残渣はシリカゲルを担体としたカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物１０を黄色固体３５ｍｇ、５４％の収率で得た。
1H-NMR (400 MHz, Acetone-d6): δ 1.28 (t, J = 7.5 Hz, 3H), 2.89 (s, 4H), 2.95 (q, J = 7.6 Hz, 2H), 3.08 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 3.36 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 6.29 (t, J = 4.1 Hz, 1H), 6.40 (t, J = 4.1 Hz, 1H), 7.36 (d, J = 3.7 Hz, 1H), 7.41 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 8.26 (br, 2H). 13C-NMR (100 MHz, Acetone-d6): δ 13.8, 21.8, 23.7, 26.4, 31.3, 113.4, 114.2, 118.6, 119.6, 124.1, 124.8, 148.0, 148.9, 154.2, 169.1, 170.5. HRMS (ESI-): m/z calcd for C18H18B1F2N4O4, [M-H]-, 403.13892, found 403.14331 (4.39 mmu).
（７）化合物１１及び化合物１２（ＡｌｄｅＢｌｕｅ：１０－アミノ－３－（３－（４－（ジメトキシメチル）ベンジルアミノ）－３－オキソプロピル）－７－エチル－５，５－ジフルオロ－５Ｈ－ジピロロ［１，２－ｃ：１’，２’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム－５－ウイド）の合成
化合物１０の脱水ＤＭＦ溶液（０．２ｍＬ）に、化合物１（５．４ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）とジイソプロピルエチルアミン（５．１μＬ、０．０３０ｍｍｏｌ）を混合した無水ＤＭＦ溶液（０．２ｍＬ）を加え、室温下、３時間攪拌した。反応用液をＨＰＬＣの溶出液（Ａ／Ｂ＝６／４、Ａ：０．１Ｍ酢酸テトラエチルアミン緩衝液、Ｂ：Ａ／アセトニトリル＝２／８）に溶解させ、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ－３カラムによって分取ＨＰＬＣ精製した。得られた溶液を減圧下濃縮した後、水溶液を酢酸エチル５ｍＬで３回抽出した。集めた有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を留去し、化合物１１を黄色固体１０ｍｇ、８５％の収率で得た。
1H-NMR (400 MHz, CD3OD): δ 1.27 (t, J = 7.6 Hz, 3H), 2.65 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.91 (q, J = 7.5 Hz, 2H), 3.22-3.28 (m, 8H), 4.36 (s 2H), 5.33 (s, 1H), 6.18 (d, J = 3.9 Hz, 1H), 6.22 (d, J = 3.9 Hz, 1H), 7.21-7.22 (m, 3H), 7.26 (d, J = 3.9 Hz, 1H), 7.34 (d, J = 8.3 Hz, 2H). 13C-NMR (100 MHz, CD3OD): δ 13.9, 22.1, 25.2, 36.9, 43.8, 53.2, 104.6, 113.2, 114.1, 118.7, 119.3, 124.7, 125.2, 127.9, 128.3, 138.3, 140.3, 149.5, 153.9, 175.1. HRMS (ESI-): m/z calcd for C24H28B1F2N4O3, [M-H]-, 469.22225, found 469.22338 (1.12 mmu).
化合物１２（ＡｌｄｅＢｌｕｅ）は、化合物３（ＡｌｄｅＢｌｕｅ－８）と同じ手順で，用事調整を行った．
［比較合成実施例１］
化合物１４（１０－（４－カルボキシベンジルアミノ）－５，５－ジフルオロ－５Ｈ－ジピロロ［１，２－ｃ：１’，２’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム－５－ウイド）の合成
化合物１４（１０－（４－カルボキシベンジルアミノ）－５，５－ジフルオロ－５Ｈ－ジピロロ［１，２－ｃ：１’，２’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム－５－ウイド）の合成
化合物１３（４－（アミノメチル）安息香酸、６０．５ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）と８－ＴＭＢ（２３．８ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）をＴＨＦと蒸留水の１：２混合液３０ｍＬに溶解させ、ジイソプロピルエチルアミン（１０５μＬ、０．６０ｍｍｏｌ）を加え室温下で１０分間攪拌した。反応用液からＴＨＦを減圧下留去し、水溶液を ２Ｎ塩酸水溶液で酸性化した後、酢酸エチル５ｍＬで３回抽出した。集めた有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ－３を用いた分取ＨＰＬＣで精製した。目的化合物を含むフラクションを凍結乾燥し、化合物１４を黄色固体２３ｍｇ、６７％収率で得た。
1H-NMR (400 MHz, Acetone-d6): δ 5.24 (d, J = 6.4 Hz, 2H), 6.42 (s, 1H), 6.45 (s, 1H), 7.19 (s 1H), 7.45 (s, 2H), 7.60 (s, 1H), 7.64 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 8.08 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 9.37 (s, 1H). 13C-NMR (100 MHz, Acetone-d6): δ 50.9, 114.1, 115.3,, 117.3, 122.9, 124.9, 126.3, 128.1, 131.1, 131.2, 132.6, 135.6, 141.8, 150.3, 167.3. HRMS (ESI-): m/z calcd for C17H13B1F2N3O2, [M-H]-, 340.10842, found 340.10689 (1.53 mmu).
［比較合成実施例２］
化合物１５（１０－アミノ－３－（３－（４－カルビキシベンジルアミノ）－３－オキソプロピル）－７－エチル－５，５－ジフルオロ－５Ｈ－ジピロロ［１，２－ｃ：１’，２’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム－５－ウイド）の合成
化合物１５（１０－アミノ－３－（３－（４－カルビキシベンジルアミノ）－３－オキソプロピル）－７－エチル－５，５－ジフルオロ－５Ｈ－ジピロロ［１，２－ｃ：１’，２’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム－５－ウイド）の合成
化合物１３（４－アミノメチル安息香酸（１１．２ｍｇ、０．０７４ｍｍｏｌ））と化合物１０（１０ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）をＴＨＦと蒸留水の１：２混合液１５ｍＬに溶解させ、ジイソプロピルエチルアミン（２５．４μＬ、０．１４８ｍｍｏｌ）を加えた。室温下、反応液を１．５時間攪拌した後、ＴＨＦを減圧下留去した。残った水溶液を２Ｎ塩酸水溶液で酸性化した後に、溶液を酢酸エチル５ｍＬで３回抽出した。集めた有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下濃縮した。残渣をＨＰＬＣの溶出液Ａ／Ｂ＝４／６（Ａ：０．１ｖ／ｖ％トリフルオロ酢酸水溶液、Ｂ：Ａ／アセトニトリル＝２／８）に溶解させた後、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ－３カラムを装備した分取ＨＰＬＣで精製した。目的化合物を含むフラクションを集め、凍結乾燥し、化合物１５を黄色固体１１ｍｇ、定量的に得た。
1H-NMR (400 MHz, Methanol-d4): δ 1.28 (t, J = 7.5 Hz, 3H), 2.69 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.92 (q, J = 7.5 Hz, 2H), 3.25 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 4.42 (s, 2H), 6.18 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 6.22 (d, J = 4.1 1H), 7.22 (d, J = 3.7 Hz, 1H), 7.27 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 7.30 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.94 (d, J = 8.2 Hz, 1H). 13C-NMR (100 MHz, Methanol-d4): δ 13.9, 22.1, 25.1, 36.9, 43.7, 113.2, 114.2, 118.6, 119.4, 124.7, 125.2, 128.4, 130.6, 130.9, 145.4, 149.4, 149.5, 153.9, 169.7, 175.3. HRMS (ESI-): m/z calcd for C22H22B1F2N4O3, [M-H]-, 439.17530, found 439.17098 (-4.33 mmu).
［比較合成実施例３］
化合物１６（３－（３－（４－カルボキシベンジルアミノ）－３－オキソプロピル）－５，５－ジフルオロ－７，９－ジメチル－５Ｈ－ジピロロ［１，２－ｃ：１’，２’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム－５－ウイド）の合成
化合物１６（３－（３－（４－カルボキシベンジルアミノ）－３－オキソプロピル）－５，５－ジフルオロ－７，９－ジメチル－５Ｈ－ジピロロ［１，２－ｃ：１’，２’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム－５－ウイド）の合成
ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ ＮＨＳエステルは、文献と以前の研究によって合成した。ＴＨＦと蒸留水（５ｍｌ／１０ｍｌ）との混合物中の４－（アミノメチル）安息香酸（１１．７ｍｇ、０．０７７ｍｍｏｌ）およびＢＯＤＩＰＹ ＦＬ ＮＨＳエステル（１０ｍｇ、０．０２６ｍｍｏｌ）へ、ＤＩＥＡ（２６．４μＬ、０．１５４ｍｍｏｌ）を周囲温度で加え、混合物を１．５時間撹拌した。次に、ＴＨＦを減圧下で除去した。得られた水溶液を２Ｍ ＨＣｌ水溶液で酸性化した。混合物をＡｃＯＥｔ（５×５ｍＬ）で抽出した。有機層を回収し、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、真空蒸発させた。 残渣をＨＰＬＣ溶離液（Ａ／Ｂ＝３／７、Ａ：０．１％ｖ／ｖ ＴＦＡバッファー、Ｂ：Ａ／アセトニトリル＝２／８）で懸濁した後、分取した。ＨＰＬＣ（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ－３、φ１０×２５０ｍｍ、溶離液Ａ／Ｂ＝３／７－＞１５分あたり０／１０線形勾配、５ｍＬフロー）。所望の生成物を含む画分を合わせ、凍結乾燥させて、化合物１６を赤色固体として得た（１０．５ｍｇ、９６％収率）。
1H-NMR (400 MHz, Methanol-d4): δ 2.27 (s, 3H), 2.50 (s, 3H), 2.69 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 3.25 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 4.42 (s, 2H), 6.20 (s, 1H), 6.29 (d, J = 3.7 Hz, 1H), 6.97 (d, J = 4.1 Hz, 1H), 7.32 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.41 (s, 1H), 7.93 (d, J = 8.2 Hz, 2H). 13C-NMR (100 MHz, Methanol-d4): δ 11.2, 14.9, 25.5, 36.0, 43.8, 117.8, 121.4, 125.8, 128.5, 129.5, 130.7, 134.9, 134.9, 136.5, 145.4, 145.9, 158.3, 161.4, 169.7, 174.6. HRMS (ESI+): m/z calcd for C22H22B1F2N3Na1O3, [M+Na]+, 448.16200, found 448.16180 (-0.20 mmu).
［実施例１］
プローブの分光学的性質の測定
合成実施例１及び２で合成した本発明の２種類のプローブの分光学的性質の測定結果を図３に示す。図３のａ）はＡｌｄｅＢｌｕｅ－８の、ｂ）はＡｌｄｅＢｌｕｅ のアルデヒド形の吸収（点線）と蛍光（３８０ｎｍで励起された実線）スペクトルを共溶媒として０．１％ＤＭＳＯを含むＰＢＳ中で測定した結果である。
プローブの分光学的性質の測定
合成実施例１及び２で合成した本発明の２種類のプローブの分光学的性質の測定結果を図３に示す。図３のａ）はＡｌｄｅＢｌｕｅ－８の、ｂ）はＡｌｄｅＢｌｕｅ のアルデヒド形の吸収（点線）と蛍光（３８０ｎｍで励起された実線）スペクトルを共溶媒として０．１％ＤＭＳＯを含むＰＢＳ中で測定した結果である。
図３に示されるように、ＡｌｄｅＢｌｕｅとＡｌｄｅＢｌｕｅ－８は共に青色波長領域で蛍光を発し、ＡｌｄｅＢｌｕｅ－８の放出物質帯域幅はＡｌｄｅＢｌｕｅのそれより広かった。更に、ＡｌｄｅＢｌｕｅ－８はＡｌｄｅＢｌｕｅ（０．９０５）より低い蛍光量子収率（０．０４８）を与えた。
これらの吸収スペクトルは、フローサイトメトリーに備えられた３つの標準レーザーの１つである４０５ｎｍダイオードレーザによる励起に理想的であった。さらに，４８８ｎｍでのこれらのプローブの吸収はかなり弱く（吸収ピークの１％未満）、緑色蛍光染料の励起レーザーである４８８ｎｍレーザーによる励起はほとんどないことを示唆した。
これらの吸収スペクトルは、フローサイトメトリーに備えられた３つの標準レーザーの１つである４０５ｎｍダイオードレーザによる励起に理想的であった。さらに，４８８ｎｍでのこれらのプローブの吸収はかなり弱く（吸収ピークの１％未満）、緑色蛍光染料の励起レーザーである４８８ｎｍレーザーによる励起はほとんどないことを示唆した。
［実施例２］
逆相高速液体クロマトグラフィーによる化合物の疎水性評価
逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）試験により測定した各プローブの疎水性の評価結果を図４に示す。測定は、ＨＰＬＣ条件：溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ、１０ｍＭギ酸アンモニウム、Ｂ：ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ＝８０／２０、１０ｍＭギ酸アンモニウムで、勾配システム：３０％ Ｂで１０分間無勾配；５分後に１００％ Ｂに；１００％ Ｂでの無勾配溶出で行った。
注目すべきことに、２つのプローブのカルボキシラート形の保持時間は、Ｐｒｏｂｅ１（化合物１６）のそれよりも実質的に早期にシフトした、すなわち、分子の親水性は、８－アミノ－ＢＯＤＩＰＹコアの双性イオン類似分極ヘミシアニン構造により実質的に改善されたと考えられる。
逆相高速液体クロマトグラフィーによる化合物の疎水性評価
逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）試験により測定した各プローブの疎水性の評価結果を図４に示す。測定は、ＨＰＬＣ条件：溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ、１０ｍＭギ酸アンモニウム、Ｂ：ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ＝８０／２０、１０ｍＭギ酸アンモニウムで、勾配システム：３０％ Ｂで１０分間無勾配；５分後に１００％ Ｂに；１００％ Ｂでの無勾配溶出で行った。
注目すべきことに、２つのプローブのカルボキシラート形の保持時間は、Ｐｒｏｂｅ１（化合物１６）のそれよりも実質的に早期にシフトした、すなわち、分子の親水性は、８－アミノ－ＢＯＤＩＰＹコアの双性イオン類似分極ヘミシアニン構造により実質的に改善されたと考えられる。
［実施例３］
酵素動力学試験
表１に、組換えヒトＡＬＤＨアイソフォームを用いた各種プローブの酵素反応速度論パラメータを示す。
上記のProbe5は、参考例であり、本出願人らによる国際出願PCT/JP2017/043881の実施例に記載のProbe5である。
酵素動力学試験
表１に、組換えヒトＡＬＤＨアイソフォームを用いた各種プローブの酵素反応速度論パラメータを示す。
パラメータは，Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ－Ｍｅｎｔｅｎ方程式を適用してＨＰＬＣ生成物の分析データから得た。データは平均±Ｓ．Ｅ．を表す。
ａは、以前の研究（Yagishita, A., Ueno, T., Esumi, H., Saya, H., Kaneko, K., Tsuchihara, K., and Urano, Y. (2017) Development of Highly Selective Fluorescent Probe Enabling Flow-Cytometric Isolation of ALDH3A1-Positive Viable Cells. Bioconjugate chemistry 28, 302-306.）のデータである。ｂは、「検出されない」、ｃは、「評価されていない」、ｄは、「使用不可」であることを示す。
ａは、以前の研究（Yagishita, A., Ueno, T., Esumi, H., Saya, H., Kaneko, K., Tsuchihara, K., and Urano, Y. (2017) Development of Highly Selective Fluorescent Probe Enabling Flow-Cytometric Isolation of ALDH3A1-Positive Viable Cells. Bioconjugate chemistry 28, 302-306.）のデータである。ｂは、「検出されない」、ｃは、「評価されていない」、ｄは、「使用不可」であることを示す。
表１では、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＡＬＤＨ２及びＡＬＤＨ３Ａ１と各種プローブの反応の酵素動力学をまとめた。新たに開発した２つの青色蛍光（ＡｌｄｅＢｌｕｅ及びＡｌｄｅＢｌｕｅ－８）を含む５種類のプローブのうち、全ての化合物はＡＬＤＨ１Ａ１の基質として働くことができた。
ＡｌｄｅＢｌｕｅ－８はＡＬＤＨ２によっても代謝されるが、ＡＬＤＨ３Ａ１では代謝されない。一方、ＡＬＤＨ３Ａ１はｉｎ ｖｉｔｒｏでＡｌｄｅＢｌｕｅを代謝した。
更に、ｃｅｌｌｏｌｏイメージング／フローサイトメトリーの研究により、ＡｌｄｅＢｌｕｅはＡＬＤＨ３Ａ１に対する親和性が低いため（高Ｋｍ：１２２μＭ）、ＡＬＤＨ３Ａ１を発現する癌細胞を染色しない可能性が非常に高いことが明らかになった。
ＡｌｄｅＢｌｕｅ－８はＡＬＤＨ２によっても代謝されるが、ＡＬＤＨ３Ａ１では代謝されない。一方、ＡＬＤＨ３Ａ１はｉｎ ｖｉｔｒｏでＡｌｄｅＢｌｕｅを代謝した。
更に、ｃｅｌｌｏｌｏイメージング／フローサイトメトリーの研究により、ＡｌｄｅＢｌｕｅはＡＬＤＨ３Ａ１に対する親和性が低いため（高Ｋｍ：１２２μＭ）、ＡＬＤＨ３Ａ１を発現する癌細胞を染色しない可能性が非常に高いことが明らかになった。
［実施例４］
生細胞イメージング及びフローサイトメトリー
次に、本発明の新規プローブを、生細胞イメージング及びフローサイトメトリーに適用し、種々の実験条件を最適化した。
図５ａは、ＡｌｄｅＢｌｕｅ－８／ＡｌｄｅＢｌｕｅ（夫々、４０μＭのＡｌｄｅＢｌｕｅ－８、１．５μＭのＡｌｄｅＢｌｕｅ）処理ヒト小細胞肺がん細胞株ＳＢＣ５の代表的な共焦点画像を示す。これは、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ（https://portals.broadinstitute.org/ccle）の中で上位ＡＬＤＨ１Ａ１発現細胞株として知られている。
図５ｂは、１０μＭのＡｌｄｅＢｌｕｅ－８／１．５μＭのＡｌｄｅＢｌｕｅ／１．５μＭのＡＬＤＥＦＬＵＯＲで染色されたＳＢＣ５細胞の代表的なフローサイトグラム（ＳＳＣ対プローブの相対蛍光強度）を示す。
ＳＢＣ５細胞を４－ジエチルアミノベンズアルデヒド（ＤＥＡＢ：ＡＬＤＨ１及びＡＬＤＨ２阻害薬）で処理した陰性対照と比較して、ＡｌｄｅＢｌｕｅ－８／ＡｌｄｅＢｌｕｅで処理した細胞は、より明るい蛍光をはっきりと示した。
フローサイトメトリー分析において、ＤＥＡＢ対照細胞と比較して、選択された放出物質フィルターセットにおいて増加したシグナルによって示されるように、３つの基質すべてが細胞を染色した。ＡｌｄｅＢｌｕｅ－８／ＡｌｄｅＢｌｕｅ陽性率はＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性率（９５％）よりわずかに低かったという点は（ＡｌｄｅＢｌｕｅ－８及びＡｌｄｅＢｌｕｅについて、夫々、８５．７％及び８２．７％）、これら３つのプローブは全てＡＬＤＨサブタイプ（ＡＬＤＨ１Ａ１及びＡＬＤＨ２）に対してｉｎ ｖｉｔｒｏ試験で低い特異性を示したという事実にもかかわらず、興味深い。それにもかかわらず、ＨＰＬＣ研究から予想されるように、新規の青色蛍光プローブは細胞膜を横切って細胞内に自由に拡散し，ｉｎ ｓｉｔｕで生成したＡＬＤＨ代謝産物はカルボキシラートの獲得負電荷の結果として細胞内に効率的にトラップされた。
ＡＭＢＡ－ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ複合体（Ｐｒｏｂｅ１）のＡＬＤＨ代謝物が細胞から容易に漏出すると仮定すると、８－アミノＢＯＤＩＰＹは期待通りＡＭＢＡ複合体の細胞保持をかなり改善した。
その上、ＡｌｄｅＢｌｕｅの優れた分光学的性質及び酵素動力学のために、フローサイトメトリー研究において、ＡＬＤＨ陽性細胞が５０ｎＭのＡｌｄｅＢｌｕｅを用いることによっても検出できたことは注目に値する。
本研究で使用したどの実験条件においても、フローサイトメトリー（図６）においてＳＹＴＯＸ（登録商標）Ｒｅｄ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎを用いた生存性試験では細胞に対する明らかな損傷は見られなかった。従って、これらのプローブにより、細胞ソーターにおける生存ＡＬＤＨ１Ａ１陽性細胞を単離することが可能であると考えられる。
生細胞イメージング及びフローサイトメトリー
次に、本発明の新規プローブを、生細胞イメージング及びフローサイトメトリーに適用し、種々の実験条件を最適化した。
図５ａは、ＡｌｄｅＢｌｕｅ－８／ＡｌｄｅＢｌｕｅ（夫々、４０μＭのＡｌｄｅＢｌｕｅ－８、１．５μＭのＡｌｄｅＢｌｕｅ）処理ヒト小細胞肺がん細胞株ＳＢＣ５の代表的な共焦点画像を示す。これは、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ（https://portals.broadinstitute.org/ccle）の中で上位ＡＬＤＨ１Ａ１発現細胞株として知られている。
図５ｂは、１０μＭのＡｌｄｅＢｌｕｅ－８／１．５μＭのＡｌｄｅＢｌｕｅ／１．５μＭのＡＬＤＥＦＬＵＯＲで染色されたＳＢＣ５細胞の代表的なフローサイトグラム（ＳＳＣ対プローブの相対蛍光強度）を示す。
ＳＢＣ５細胞を４－ジエチルアミノベンズアルデヒド（ＤＥＡＢ：ＡＬＤＨ１及びＡＬＤＨ２阻害薬）で処理した陰性対照と比較して、ＡｌｄｅＢｌｕｅ－８／ＡｌｄｅＢｌｕｅで処理した細胞は、より明るい蛍光をはっきりと示した。
フローサイトメトリー分析において、ＤＥＡＢ対照細胞と比較して、選択された放出物質フィルターセットにおいて増加したシグナルによって示されるように、３つの基質すべてが細胞を染色した。ＡｌｄｅＢｌｕｅ－８／ＡｌｄｅＢｌｕｅ陽性率はＡＬＤＥＦＬＵＯＲ陽性率（９５％）よりわずかに低かったという点は（ＡｌｄｅＢｌｕｅ－８及びＡｌｄｅＢｌｕｅについて、夫々、８５．７％及び８２．７％）、これら３つのプローブは全てＡＬＤＨサブタイプ（ＡＬＤＨ１Ａ１及びＡＬＤＨ２）に対してｉｎ ｖｉｔｒｏ試験で低い特異性を示したという事実にもかかわらず、興味深い。それにもかかわらず、ＨＰＬＣ研究から予想されるように、新規の青色蛍光プローブは細胞膜を横切って細胞内に自由に拡散し，ｉｎ ｓｉｔｕで生成したＡＬＤＨ代謝産物はカルボキシラートの獲得負電荷の結果として細胞内に効率的にトラップされた。
ＡＭＢＡ－ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ複合体（Ｐｒｏｂｅ１）のＡＬＤＨ代謝物が細胞から容易に漏出すると仮定すると、８－アミノＢＯＤＩＰＹは期待通りＡＭＢＡ複合体の細胞保持をかなり改善した。
その上、ＡｌｄｅＢｌｕｅの優れた分光学的性質及び酵素動力学のために、フローサイトメトリー研究において、ＡＬＤＨ陽性細胞が５０ｎＭのＡｌｄｅＢｌｕｅを用いることによっても検出できたことは注目に値する。
本研究で使用したどの実験条件においても、フローサイトメトリー（図６）においてＳＹＴＯＸ（登録商標）Ｒｅｄ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎを用いた生存性試験では細胞に対する明らかな損傷は見られなかった。従って、これらのプローブにより、細胞ソーターにおける生存ＡＬＤＨ１Ａ１陽性細胞を単離することが可能であると考えられる。
ここで、図６は、ＡｌｄｅＢｌｕｅ／ＡｌｄｅＢｌｕｅ－８で処理した細胞の生存性試験の結果を示す。細胞を本研究で使用した条件下（１０μＭのＡｌｄｅＢｌｕｅ－８又は１．５μＭのＡｌｄｅＢｌｕｅ）でＡｌｄｅＢｌｕｅ（８）で処理し、ＳＹＴＯＸ Ｒｅｄ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎで評価した。
（ａ）：損傷細胞（ＥｔＯＨで３０秒間処理）と無傷細胞の混合物を評価し、次いで損傷細胞のためのゲートを設定した。
（ｂ）、（ｃ）：ＡｌｄｅＢｌｕｅ－８及びビヒクルで処理したＳＢＣ５細胞の代表的なフローサイトグラム（ｂ）（ＳＹＴＯＸレッドのカウント対相対蛍光強度）、又はＡｌｄｅＢｌｕｅ及びビヒクルで処理したＳＢＣ５細胞の代表的なフローサイトグラム（ｃ）。各対は，ＡｌｄｅＢｌｕｅ（－８）とビヒクルの間の損傷細胞率に関して統計学的有意差を示さなかった（ｄ）。データは３つの異なる実験の平均（ＳＤ）である。Ｐ値はＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定で算出した（ｎ＝３）。
（ａ）：損傷細胞（ＥｔＯＨで３０秒間処理）と無傷細胞の混合物を評価し、次いで損傷細胞のためのゲートを設定した。
（ｂ）、（ｃ）：ＡｌｄｅＢｌｕｅ－８及びビヒクルで処理したＳＢＣ５細胞の代表的なフローサイトグラム（ｂ）（ＳＹＴＯＸレッドのカウント対相対蛍光強度）、又はＡｌｄｅＢｌｕｅ及びビヒクルで処理したＳＢＣ５細胞の代表的なフローサイトグラム（ｃ）。各対は，ＡｌｄｅＢｌｕｅ（－８）とビヒクルの間の損傷細胞率に関して統計学的有意差を示さなかった（ｄ）。データは３つの異なる実験の平均（ＳＤ）である。Ｐ値はＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定で算出した（ｎ＝３）。
次に、上記の点を確認するために、２つの実験を行った。最初に，ＳＢＣ５細胞のＡＬＤＨ１Ａ１を、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を用いてノックダウンした。ｓｉＲＮＡの効果はイムノブロット分析（図７）で確認され、良好なノックダウン効果を示した。
図７は、ｓｉＲＮＡ処理細胞を用いたＡＬＤＨ１Ａ１アッセイの結果を示す。
図７ａ）は、ＡＬＤＨ１Ａ１に対するｓｉＲＮＡで処理したＳＢＣ５細胞の免疫ブロット分析の結果である。３つの検証されたｓｉＲＮＡ（ｓ１２３６、ｓ１２３７、ｓ１２３８；それぞれ＃１、＃２、＃３）と負の対照ｓｉＲＮＡ（Ｎ）を用いた。
図７ｂ）は、ｓｉＲＮＡ処理ＳＢＣ５細胞の代表的なフローサイトグラム（陰性対照及びｓ１２３７）を示す。
ここで、図７ａ）のａは、陰性対照に対するＡＬＤＨ１Ａ１発現の標準化された比率を示す。
図７ａ）は、ＡＬＤＨ１Ａ１に対するｓｉＲＮＡで処理したＳＢＣ５細胞の免疫ブロット分析の結果である。３つの検証されたｓｉＲＮＡ（ｓ１２３６、ｓ１２３７、ｓ１２３８；それぞれ＃１、＃２、＃３）と負の対照ｓｉＲＮＡ（Ｎ）を用いた。
図７ｂ）は、ｓｉＲＮＡ処理ＳＢＣ５細胞の代表的なフローサイトグラム（陰性対照及びｓ１２３７）を示す。
ここで、図７ａ）のａは、陰性対照に対するＡＬＤＨ１Ａ１発現の標準化された比率を示す。
図７ｂ）では、ＡｌｄｅＢｌｕｅ－８陽性細胞がほぼ完全に消失したＡＬＤＨ１Ａ１ノックダウン細胞の代表的なフローサイトグラムが示される。対照的に、ＡｌｄｅＢｌｕｅ陽性細胞はｓｉＲＮＡによって大きく減少するが、その一部（７．７％）はまだ認識可能であった。ＡＬＤＨ１Ａ１ノックダウン細胞においてもＡＬＤＥＦＬＵＯＲの高輝度集団が見出されたことは、Ａが細胞内でＡＬＤＨ１Ａ１以外のＤＥＡＢ感受性ＡＬＤＨサブタイプによって代謝されることを示しており、特に興味深い。対照的に，ＡＬＤＨ１Ａ１ノックダウン細胞において、本発明の新規青色プローブのいずれにも高輝度集団が見出されなかったことから、プローブのＡＬＤＨサブタイプ選択性が異なることが示唆された。
次に、細胞選別とＡＬＤＨ量の評価を別の細胞系（Ｈ１０４８：高ＡＬＤＨ１Ａ１発現細胞系）で行った。その結果を図８に示す。
図８ａ）は、Ｈ１０４８セルの代表的なフロー・サイトグラム（ＳＳＣ対各プローブの相対蛍光強度）を示す。フローサイトメトリーは，ＡｌｄｅＢｌｕｅ－８（２０μＭ）又はＡｌｄｅＢｌｕｅ（１．５μＭ）の存在下で行った。陽性集団のゲートは、陰性対照に従って上記のように設定した。
図８ｂ）は、仕分けられた細胞の免疫ブロット分析の結果である。上１０～１５％蛍光強度レベル（図中の「Ｔ」）及び下１０～１５％蛍光強度レベル（図中の「Ｂ」）の細胞を、細胞ソーターを用いて単離し、イムノブロット分析に供した。
図８ａ）は、Ｈ１０４８セルの代表的なフロー・サイトグラム（ＳＳＣ対各プローブの相対蛍光強度）を示す。フローサイトメトリーは，ＡｌｄｅＢｌｕｅ－８（２０μＭ）又はＡｌｄｅＢｌｕｅ（１．５μＭ）の存在下で行った。陽性集団のゲートは、陰性対照に従って上記のように設定した。
図８ｂ）は、仕分けられた細胞の免疫ブロット分析の結果である。上１０～１５％蛍光強度レベル（図中の「Ｔ」）及び下１０～１５％蛍光強度レベル（図中の「Ｂ」）の細胞を、細胞ソーターを用いて単離し、イムノブロット分析に供した。
図８に示されるように、ＡｌｄｅＢｌｕｅ－８／ＡｌｄｅＢｌｕｅによるフローサイトグラムにおけるＨ１０４８細胞の蛍光強度は、高レベルから低レベルまで多様である。ＡｌｄｅＢｌｕｅ－８／ＡｌｄｅＢｌｕｅアッセイにおいて上位１０～１５％の蛍光強度レベル及び下位１０～１５％の蛍光強度レベルを示す細胞を別々に細胞ソーターで収集し、選別した細胞のＡＬＤＨ１Ａ１の量をイムノブロット分析（図８ｂ））により評価した。予想通り、「上位」試料はＡＬＤＨ１Ａ１の明確なバンドを示したが、一方，ＡＬＤＨ１Ａ１は「下位」試料においてほとんど検出不可能なレベルであり、これらのプローブがＡＬＤＨ１Ａ１陽性生存細胞の可視化と単離を可能にすることを明確に示唆した。
次に、フローサイトメトリーにおける緑色蛍光団と青色蛍光プローブの同時使用における蛍光放出物質の「漏れこみ」を調べた。２つのプローブを同時に使用する場合、一方の試薬からの蛍光シグナルは、他方の試薬（すなわち、漏れこみ）からの蛍光シグナルによって干渉される可能性があり、もしあれば、漏れこみを補正すべきである（このプロセスは「コンペンセーション」と呼ばれる。）。
ＥＧＦＰが一時的に過剰発現したＳＢＣ５細胞（名称ＳＢＣ５－ＥＧＦＰ）を用いて、ＡｌｄｅＢｌｕｅ－８／ＡｌｄｅＢｌｕｅについて調べた。まず，ＡｌｄｅＢｌｕｅとＥＧＦＰの組合せを調べた。ここでは，ＡｌｄｅＢｌｕｅを１５０ｎＭで使用した。ＥＧＦＰを４８８ｎｍレーザーで励起し、その放出物質を５３０／３０フィルター（これは「ＥＧＦＰチャネル」と呼び、ＡｌｄｅＢｌｕｅ（－８）用の検出器と光学フィルターセットも「ＡｌｄｅＢｌｕｅ（－８）チャンネル」と呼ぶ。）で検出した。この試験では，ＥＧＦＰの最大蛍光レベルが約１０５（ダイナミックレンジの上限）になるようにＥＧＦＰチャンネルのレーザパワーとＰＭＴ電圧を設定し、外部効果の可能性を強調した。
図９（左から２つ目）に示されるように、ＳＢＣ５－ＥＧＦＰ細胞は、ＡｌｄｅＢｌｕｅチャンネルにおいて蛍光をほとんど示さない、すなわち、ＡｌｄｅＢｌｕｅチャンネルへのＥＧＦＰの外部効果をほとんど示さない。ＡｌｄｅＢｌｕｅを有するＳＢＣ細胞（すべての細胞はＡｌｄｅＢｌｕｅａｌｌと命名され、その中の陽性集団は図ではＡｌｄｅＢｌｕｅｈｉｇｈである）は，ＳＢＣ５細胞（図９の左端の図）の自動蛍光と比較して類似しているが、わずかに高いＧＦＰ蛍光レベルを示し、これはＧＦＰチャンネルにＡｌｄｅＢｌｕｅの弱い漏れこみが存在することを意味する。しかしながら、ほとんど無視できるレベルであり、これはフローサイトメーター（ＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標））のソフトウェア上でのコンペンセーションにより容易に修正できる。
次に，ＥＧＦＰとＡｌｄｅＢｌｕｅ－８の組合せの場合のフローサイトグラムを図９に示したが、これはＡｌｄｅＢｌｕｅの場合とほぼ同様の結果、すなわち、比較的広い放出物質スペクトルではあるものの、ＡｌｄｅＢｌｕｅ－８チャンネルにはＥＧＦＰの漏れこみがなく，ＥＧＦＰチャンネルにはわずかだが無視できる程度のＡｌｄｅＢｌｕｅ－８の漏れこみがあることを示している。
以上の結果は、新規の青色ＡＬＤＨプローブの生細胞の多色染色のフローサイトメトリー分析への適用性を示すものである。
ＥＧＦＰが一時的に過剰発現したＳＢＣ５細胞（名称ＳＢＣ５－ＥＧＦＰ）を用いて、ＡｌｄｅＢｌｕｅ－８／ＡｌｄｅＢｌｕｅについて調べた。まず，ＡｌｄｅＢｌｕｅとＥＧＦＰの組合せを調べた。ここでは，ＡｌｄｅＢｌｕｅを１５０ｎＭで使用した。ＥＧＦＰを４８８ｎｍレーザーで励起し、その放出物質を５３０／３０フィルター（これは「ＥＧＦＰチャネル」と呼び、ＡｌｄｅＢｌｕｅ（－８）用の検出器と光学フィルターセットも「ＡｌｄｅＢｌｕｅ（－８）チャンネル」と呼ぶ。）で検出した。この試験では，ＥＧＦＰの最大蛍光レベルが約１０５（ダイナミックレンジの上限）になるようにＥＧＦＰチャンネルのレーザパワーとＰＭＴ電圧を設定し、外部効果の可能性を強調した。
図９（左から２つ目）に示されるように、ＳＢＣ５－ＥＧＦＰ細胞は、ＡｌｄｅＢｌｕｅチャンネルにおいて蛍光をほとんど示さない、すなわち、ＡｌｄｅＢｌｕｅチャンネルへのＥＧＦＰの外部効果をほとんど示さない。ＡｌｄｅＢｌｕｅを有するＳＢＣ細胞（すべての細胞はＡｌｄｅＢｌｕｅａｌｌと命名され、その中の陽性集団は図ではＡｌｄｅＢｌｕｅｈｉｇｈである）は，ＳＢＣ５細胞（図９の左端の図）の自動蛍光と比較して類似しているが、わずかに高いＧＦＰ蛍光レベルを示し、これはＧＦＰチャンネルにＡｌｄｅＢｌｕｅの弱い漏れこみが存在することを意味する。しかしながら、ほとんど無視できるレベルであり、これはフローサイトメーター（ＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標））のソフトウェア上でのコンペンセーションにより容易に修正できる。
次に，ＥＧＦＰとＡｌｄｅＢｌｕｅ－８の組合せの場合のフローサイトグラムを図９に示したが、これはＡｌｄｅＢｌｕｅの場合とほぼ同様の結果、すなわち、比較的広い放出物質スペクトルではあるものの、ＡｌｄｅＢｌｕｅ－８チャンネルにはＥＧＦＰの漏れこみがなく，ＥＧＦＰチャンネルにはわずかだが無視できる程度のＡｌｄｅＢｌｕｅ－８の漏れこみがあることを示している。
以上の結果は、新規の青色ＡＬＤＨプローブの生細胞の多色染色のフローサイトメトリー分析への適用性を示すものである。
［実施例５］
光安定性の評価
次に、本発明の新規プローブの光安定性について、以下の実験を行った。
光安定性の評価
次に、本発明の新規プローブの光安定性について、以下の実験を行った。
（実験方法）
蛍光プローブ（色素）を４０５ｎｍにおける吸光度が０．１（±１％）となるようにリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解させ、４０５ｎｍフィルターを通過させた４．８ｍＷの照射光に暴露した。蛍光プローブの分解度合いをそれぞれの吸光強度により評価し比較検討した。比較対象として既知の蛍光色素である７－ヒドロキシクマリン－３－カルボン酸（ＨＣＣＡ）を用いた。
蛍光プローブ（色素）を４０５ｎｍにおける吸光度が０．１（±１％）となるようにリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解させ、４０５ｎｍフィルターを通過させた４．８ｍＷの照射光に暴露した。蛍光プローブの分解度合いをそれぞれの吸光強度により評価し比較検討した。比較対象として既知の蛍光色素である７－ヒドロキシクマリン－３－カルボン酸（ＨＣＣＡ）を用いた。
評価結果を図１０に示す。同図は、それぞれの蛍光プローブについて、４０５ｎｍの光照射による吸光度の相対強度変化を時間経過で示したものである。
ＡｌｄｅＢｌｕｅ－８及びＨＣＣＡは時間経過とともに同程度で吸光度が低下しており、同程度の光安定性であった。一方でＡｌｄｅＢｌｕｅの吸光度低下は軽度であり、ＡｌｄｅＢｌｕｅ－８およびＨＣＣＡに比べ光安定性が高かった。
ＡｌｄｅＢｌｕｅ－８及びＨＣＣＡは時間経過とともに同程度で吸光度が低下しており、同程度の光安定性であった。一方でＡｌｄｅＢｌｕｅの吸光度低下は軽度であり、ＡｌｄｅＢｌｕｅ－８およびＨＣＣＡに比べ光安定性が高かった。
［実施例６］
ＡＬＤＨサブタイプ（ＡＬＤＨ１Ａ１、１Ａ２、１Ａ３、１Ｂ１）に対する反応性の評価
ＡＬＤＨ１Ａ２とＡＬＤＨ１Ａ３はＮＯＶＯＰＲＯＴＥＩＮ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ ＩＮＣ（ＮＪ、ＵＳＡ）より、ＡＬＤＨ１Ｂ１はＯｒｉｇｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＭＤ、ＵＳＡ）より購入した。
酵素反応用バッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＮＡＤ＋ ２０μＭを含む水溶液）に溶解したＡｌｄｅＢｌｕｅ－８（２０μＭ）と各酵素（１０ ｎＭ）、もしくは、ＡｌｄｅＢｌｕｅ（１．５μＭ）と各酵素（１．０ｎＭ）を３７℃で１０分間反応させた後にアセトニトリルを加えることで反応を停止させ、生成したカルボン酸型プローブをＬＣ／ＭＳにて定量した。各ＡＬＤＨサブタイプに対するカルボン酸型プローブ生成量をＡＬＤＨ１Ａ１に対するカルボン酸型プローブの生成量に対する相対値で示した（図１１）。ここで、データは平均±標準偏差（ｎ＝３）で示した。
ＡＬＤＨサブタイプ（ＡＬＤＨ１Ａ１、１Ａ２、１Ａ３、１Ｂ１）に対する反応性の評価
ＡＬＤＨ１Ａ２とＡＬＤＨ１Ａ３はＮＯＶＯＰＲＯＴＥＩＮ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ ＩＮＣ（ＮＪ、ＵＳＡ）より、ＡＬＤＨ１Ｂ１はＯｒｉｇｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＭＤ、ＵＳＡ）より購入した。
酵素反応用バッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＮＡＤ＋ ２０μＭを含む水溶液）に溶解したＡｌｄｅＢｌｕｅ－８（２０μＭ）と各酵素（１０ ｎＭ）、もしくは、ＡｌｄｅＢｌｕｅ（１．５μＭ）と各酵素（１．０ｎＭ）を３７℃で１０分間反応させた後にアセトニトリルを加えることで反応を停止させ、生成したカルボン酸型プローブをＬＣ／ＭＳにて定量した。各ＡＬＤＨサブタイプに対するカルボン酸型プローブ生成量をＡＬＤＨ１Ａ１に対するカルボン酸型プローブの生成量に対する相対値で示した（図１１）。ここで、データは平均±標準偏差（ｎ＝３）で示した。
図１１に示されるように、ＡｌｄｅＢｌｕｅ－８は、ＡＬＤＨ１Ａ２についてもＡＬＤＨ１Ａ１と同レベルの反応性を示した。また、ＡｌｄｅＢｌｕｅは、ＡＬＤＨ１Ａ２についてＡＬＤＨ１Ａ１の６０％程度の反応性を示した。
従って、ＡｌｄｅＢｌｕｅ－８及びＡｌｄｅＢｌｕｅは、ＡＬＤＨ１Ａ２検出用のプローブとしても使用が可能であることが示唆された。
従って、ＡｌｄｅＢｌｕｅ－８及びＡｌｄｅＢｌｕｅは、ＡＬＤＨ１Ａ２検出用のプローブとしても使用が可能であることが示唆された。
Claims (11)
- 以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩。
（式中、
は、以下の式（１）；
（式（１）中、Ｌは、以下の基；
－（ＣＨ２）ｍ－、－（ＣＨ２）ｎ－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－（ＣＨ２）ｓ－、－（ＣＨ２）ｎ－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－（ＣＨ２）ｓ－
から選択されるリンカーであり、
ここで、ｍは１又は２、ｎは１又は２、ｓは１～４の整数であり、
Ｒａは、水素原子、又は、炭素数１～４の置換又は無置換のアルキル基を表す。）
で表される基であり、
Ｒは、存在する場合は、炭素数１～４の置換又は無置換のアルキル基を表し、
ここで、式（Ｉ）において、
は、１つだけ存在し、
が＝Ｎ＋Ｈの部分に導入される場合は、Ｒは１位、７位には存在しない。）
- 以下の一般式（Ｉａ）で表される化合物又はその塩。
（式中、Ｌ、Ｒａ、Ｒは、式（Ｉ）で定義した通りである。）
- 以下の一般式（Ｉｂ）で表される化合物又はその塩。
（式中、Ｌ、Ｒａ、Ｒは、式（Ｉ）で定義した通りである。）
- 請求項１～３の何れか１項に記載の化合物又はその塩を含むアルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ１検出用蛍光プローブ。
- アルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ１の活性を検出する方法であって、
（ａ）請求項１～３のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を細胞内に導入する工程、及び
（ｂ）当該化合物又はその塩が細胞内でアルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ１と反応することにより発せられる蛍光を測定する工程、
を含む、該方法。 - 請求項１～３の何れか１項に記載の化合物又はその塩を含む、４０５ｎｍのレーザーで励起可能なフローサイトメーターに用いられるアルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ１検出用蛍光プローブ。
- 請求項４又は６に記載の蛍光プローブを含む、アルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ１検出用キット。
- 請求項１～３の何れか１項に記載の化合物又はその塩を含むアルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ２検出用蛍光プローブ。
- アルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ２の活性を検出する方法であって、
（ａ）請求項１～３のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を細胞内に導入する工程、及び
（ｂ）当該化合物又はその塩が細胞内でアルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ２と反応することにより発せられる蛍光を測定する工程、
を含む、該方法。 - 請求項１～３の何れか１項に記載の化合物又はその塩を含む、４０５ｎｍのレーザーで励起可能なフローサイトメーターに用いられるアルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ２検出用蛍光プローブ。
- 請求項８又は１０に記載の蛍光プローブを含む、アルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ２検出用キット。
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|---|---|
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- 2020-01-31 JP JP2020014846A patent/JP2023025307A/ja active Pending
-
2021
- 2021-01-29 WO PCT/JP2021/003368 patent/WO2021153772A1/ja active Application Filing
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| YAGISHITA, A. ET AL.: "Amino BODIPY-Based Blue Fluorescent Probes for Aldehyde Dehydrogenase 1-Expressing Cells", BIOCONJUGATE CHEMISTRY, vol. 32, no. 2, 27 January 2021 (2021-01-27), pages 234 - 238, XP055845684 * |
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