JP5686385B2 - タンパク質を蛍光標識する方法 - Google Patents
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Description
標識対象タンパク質と変異型βラクタマーゼとの融合タンパク質を細胞内で得ること、
下記式(I)で表される化合物またはその塩を、細胞内のエステラーゼにより下記式(II)で表される化合物またはその塩へ変換すること、
および前記融合タンパク質と下記式(II)で表わされる化合物またはその塩とを反応させることにより、前記対象タンパク質を蛍光標識することを含み、
前記変異型βラクタマーゼは、前記式(II)で表わされる化合物またはその塩のβ−ラクタム環を開環させ、その結果、前記化合物またはその塩のβ−ラクタム環が開環した部分と共有結合可能なタンパク質である。なお、前記「細胞内のエステラーゼ」とは、細胞に本来的に存在するエステラーゼおよび、外部から細胞内へ導入したエステラーゼの少なくとも一方を意味する。
Xは、蛍光性基であり、
L1は、Xのためのリンカーであり、
R1は、低級アルキルオキシカルボニルオキシで置換された低級アルキル基または、3−オキシ−1,3−ジヒドロイソベンゾフラン−1−イルである。
Xは、蛍光性基であり、
L1は、Xのためのリンカーであり、
R1は、低級アルキルオキシカルボニルオキシで置換された低級アルキル基または、3−オキシ−1,3−ジヒドロイソベンゾフラン−1−イルである。
前記プラスミドまたはベクターは、標識対象タンパク質と変異型βラクタマーゼとの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをクローニングするため又は前記融合タンパク質を発現させるためのプラスミド又はベクターであり、
前記プラスミド又はベクターは、
配列表の配列番号5〜8のいずれかの塩基配列、
配列表の配列番号5〜8のいずれかの塩基配列の1〜数個の塩基が欠失、置換、又は付加された塩基配列であって、前記融合タンパク質において式(II)で表わされる化合物またはその塩のβ−ラクタム環を開環させ、その結果、前記化合物またはその塩のβ−ラクタム環が開環した部分と共有結合可能なアミノ酸配列をコードする塩基配列、及び、
配列表の配列番号5〜8のいずれかの塩基配列と70%以上の相同性を有する塩基配列であって、前記融合タンパク質において式(II)で表わされる化合物またはその塩のβ−ラクタム環を開環させ、その結果、前記化合物またはその塩のβ−ラクタム環が開環した部分と共有結合可能なアミノ酸配列をコードする塩基配列、からなる群から選択される塩基配列を含む。
(i)配列表の配列番号1〜4のいずれかのアミノ酸配列、
(ii)配列表の配列番号1〜4のいずれかのアミノ酸配列の1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列であって、前記融合タンパク質において上記式(II)で表わされる記化合物のβ−ラクタム環を開環させ、かつ、前記化合物のβ−ラクタム環が開環した部分と共有結合可能なアミノ酸配列、及び、
(iii)配列表の配列番号1〜4のいずれかのアミノ酸配列と70%以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、前記融合タンパク質において上記式(II)で表わされる化合物またはその塩のβ−ラクタム環を開環させ、かつ、前記化合物のβ−ラクタム環が開環した部分と共有結合可能なアミノ酸配列、からなる群から選択されるアミノ酸配列であるのが好ましい。
L1は、Xのためのリンカーであり、
R1は、低級アルキルオキシカルボニルオキシで置換された低級アルキル基または、3−オキシ−1,3−ジヒドロイソベンゾフラン−1−イルである。
前記プラスミドまたはベクターは、標識対象タンパク質と変異型βラクタマーゼとの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをクローニングするため又は前記融合タンパク質を発現させるためのプラスミド又はベクターであり、
前記プラスミド又はベクターは、
配列表の配列番号5〜8のいずれかの塩基配列、
配列表の配列番号5〜8のいずれかの塩基配列の1〜数個の塩基が欠失、置換、又は付加された塩基配列であって、前記融合タンパク質において式(II)で表わされる化合物またはその塩のβ−ラクタム環を開環させ、その結果、前記化合物またはその塩のβ−ラクタム環が開環した部分と共有結合可能なアミノ酸配列をコードする塩基配列、及び、
配列表の配列番号5〜8のいずれかの塩基配列と70%以上の相同性を有する塩基配列であって、前記融合タンパク質において式(II)で表わされる化合物またはその塩のβ−ラクタム環を開環させ、その結果、前記化合物またはその塩のβ−ラクタム環が開環した部分と共有結合可能なアミノ酸配列をコードする塩基配列、からなる群から選択される塩基配列を含む。
であり、R1は低級アルキルカルボニルオキシで置換された低級アルキル基である化合物が好ましく、下記化合物RB、化合物FB−DA、CBおよび化合物CB−MAがより好ましい。
であり、R1は低級アルキルカルボニルオキシで置換された低級アルキル基である化合物が好ましく、下記化合物RAがより好ましい。
Xは、蛍光性基であり、
L1は、Xのためのリンカーであり、
R1は、低級アルキルオキシカルボニルオキシで置換された低級アルキル基または、3−オキシ−1,3−ジヒドロイソベンゾフラン−1−イルである。
本明細書の記載において、以下の略語を使用する。
DMF:ジメチルホルムアミド
TEA:トリエチルアミン
DMSO:ジメチルスルホキシド
WSCD・HCl:1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩
DIPEA:N,N−ジイソプロピルエチルアミン
HPLC:高速液体クロマトグラフィー
HEPES:4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジンエタンスルホン酸
DMEM:ダルベッコ変法イーグル培地
FBS:ウシ胎児血清
HBSS:ハンクス平衡塩
SDS:ドデシル硫酸ナトリウム
TBST:トリス緩衝塩水トゥィーン20(Tris-Buffered Saline Tween 20)
DIC:Differential Interference Contrast Microscopic Image(微分干渉顕微鏡像)。
化合物は、入手できる最も高いグレードのものであり、東京化成工業株式会社、和光純薬工業株式会社、およびシグマ−アルドリッチジャパン株式会社から購入して、さらなる精製を行わずに用いた。抗βラクタマーゼ抗体は、ミリポア(Millipore)から購入し、抗βアクチンはシグマから購入した。ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合2次抗体は、GEヘルスケアから購入した(抗ウサギNA934、抗マウスNA931)。ECLウエスタンブロッティング検出試薬は、GEヘルスケアから購入した(RPN2109)。leibovitzの培地とpcDNA3.1(+)ベクターはインビトロジェンから購入した(21083−027)。エステラーゼはシグマから購入した(E2884)。制限エンドヌクレアーゼおよびPrimeSTAR(登録商標)HSDNAポリメラーゼはタカラバイオ株式会社から購入した。プラスミドDNAは、QIAprep Spin Miniprep kit(商品名)(株式会社キアゲン)を用いて単離した。5(6)−カルボキシテトラメチルローダミン−スクシンイミジルエステルは、インビトロジェンから購入した(C1171)。
HPLC分析を、Inertsil ODS−3 (4.6mm×250mm)カラム(GL Sciences Inc.)、ポンプ(PU−2080, JASCO)および検出器(MD−2010またはFP−2020, JASCO)からなるHPLCシステムを用いて、行った。分離HPLCは、Inertsil ODS−3(10.0mm×250mm)カラム(GL Sciences Inc.)、ポンプ(PU−2087, JASCO)および検出器(UV−2075, JASCO)からなるHPLCシステムを用いて行った。
蛍光顕微鏡画像は、IX71蛍光顕微鏡(オリンパス)、クール・スナップ・HQ冷却(Cool Snap HQ cooled)CCDカメラ(Roper Scientific)およびUSH−103OL水銀ランプ(オリンパス)を用いて記録した。用いたフィルターセットは、化合物RB用に、オリンパスBP510−550、DM575およびBA575−625であった。メタモルフ・イメージング・ソフトウェア(MetaMorph imaging software)(Universal Imaging Corporation)を、イメージングとデータ解析に用いた。共焦点顕微鏡については、共焦点レーザー蛍光顕微鏡FV10iを用いた(オリンパス)。励起光はFA,FBの場合は473 nm、RBの場合は559nmの光をそれぞれ用いた。また、用いた吸収フィルターセットは、FA、FBについてはオリンパスBA490−540、化合物RBについてはBA570−620であった。
BLのDNAフラグメントは、BL−EGFRプラスミド(特開2010−119382号公報;S. Mizukami, S. Watanabe, Y. Hori, K. Kikuchi, J. Am. Chem. Soc.2009, 131, 5016−5017)からPCRにより、増幅させ、NhelおよびHindlllを用いて消化させた。DNAフラグメントは、pcDNA3.1(+)にライゲーションさせ、それを同じ制限酵素を用いて消化させて、pcDNA3.1(+)−BL(Cytoplasmic−BL)を得た。
NLSオリゴDNAを市販のオリゴヌクレオチド(配列番号9および配列番号10: Gene design inc.)から増幅させ、HindlllおよびBamHlを用いて消化させた。その後、Cytoplasmic−BLプラスミドをHindlllおよびBamHlを用いて消化させた。消化されたNLSオリゴDNAは、消化されたCytoplasmic−BLプラスミドにライゲーションさせ、pcDNA3.1(+)−BL−NLS (BL−NLS)を得た。
エステラーゼ反応溶液(5ユニット/mL)を100mMのHEPES緩衝液(pH7.4)中で調製した。化合物RBストック溶液(DMSO中1mM)をエステラーゼ反応溶液へ添加した(最終濃度:10μM)。反応混合物を25℃で10分間インキュベートし、その後、反応性生物を逆相HPLCで分析した。
37℃5%CO2雰囲気下でDMEM(Invitrogen)の10%FBS中に保持されたHEK293T細胞を、リポフェクタミン(Lipofectamine)2000(Invitrogen)を用いて、Cytoplasmic−BLまたはBL−NLSをコードするプラスミドを用いて形質移入した。5〜6時間後、培地をDMEM(フェノール・レッド無し)と置き換え、その細胞を37℃で24時間インキュベートした。その細胞を次いで、HBSSを用いて一度洗浄し、化合物RB(5nM〜100nM)と共に37℃で15分間インキュベートした。未反応プローブを洗浄した後、細胞の蛍光イメージを適切なフィルターセットを用いて、HBSS中で撮影した。
HEK293T細胞を、リポフェクタミン2000を用いてCytoplasmic−BLもしくはBL−NLSを、またはBL−ER用いて形質移入した。5〜6時間後、培地をDMEMと置き換え、その細胞を37℃で24時間インキュベートした。その細胞を次いで、PBS(−)を用いて洗浄し、200μLの1×SDSゲル・ローディング緩衝液(50mMトリス−HCl緩衝液(pH6.8)、1.3%SDS、10%グリセロールおよび5%メルカプトエタノール)を用いて、溶解させた。かき取った後、溶解産物を95℃で3分間沸騰させた。次いで、サンプルを7.5%または10%のSDS−ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動し、ウェスタンブロット用のPVDF膜に移した。膜を5%スキムミルクを含むTBST緩衝液(0.01%Tween20、138mMのNaCl、20mMのトリス、pH7.6)を用いて室温で1時間インキュベーションすることにより、ブロックした。その後、抗βラクタマーゼ(1:5000希釈)または抗βアクチン(1:5000希釈)抗体を各膜に加えた。16時間4℃で振とうしながらインキュベーションした後、膜をTBST緩衝液で3回洗浄し、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ結合2次抗体と共にインキュベートし、TBST緩衝液で洗浄し、ECLウェスタンブロット検出試薬を用いて視覚化させた。
13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ 14.1, 19.5, 26.8, 31.0, 40.2, 57.9, 58.6, 64.8, 67.7, 70.2, 70.3, 92.2, 98.4, 106.3, 108.9, 109.0, 123.5, 124.9, 127.5, 128.6, 128.8 (2つの炭素), 129.0 (2つの炭素), 133.8, 135.2, 136.9, 152.4, 152.9, 153.1, 165.4, 165.7, 168.9, 169.4, 172.9;
HRMS (ESI+) m/z: 878.3094 ([M+H]+について計算値: 878. 3077)。
バカンピシリン塩酸塩(566mg,1.13mmol)をDMF(2.5mL)中に溶解させた。TEA(114mg,1.13mmol)と6−カルボキシフルオレセイン−スクシンイミジルエステル(107mg,225μmol)をその後0℃で加えた。その混合物を22時間攪拌し、その混合物へ酢酸エチルを加えた。有機相を10%クエン酸水溶液および水、次いで飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。有機溶媒を有機相から除去した後、残渣を、ジクロロメタンとメタノールの混合溶媒で溶出してシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、化合物FB(61mg,収率32%)を得た。
HRMS (FAB+) m/z: 824.2105 ([M+H]+について計算値:824.2047)。
FB(30mg,36.4μmol)を、アセトニトリル(2mL)中に溶解させ、その溶液中へ、炭酸セシウム(49mg,153μmol)および無水酢酸のジクロロメタン溶液(109μL,109μmol)を、室温で添加した。得られた混合物を25℃で2時間攪拌し、その混合物へ酢酸エチルを加えた。有機相を10%クエン酸水溶液および水、次いで飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。有機溶媒を有機相から除去した後、残渣を、ジクロロメタンとメタノールの混合溶媒で溶出してシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、化合物FB−DA(15mg,収率46%)を得た。
HRMS (FAB+) m/z: 908.2312 ([M+H]+について計算値: 908.2258)。
化合物FA、RAは、Multicolor Protein Labeling in Living Cells Using Mutant β-lactamase-Tag Technology; Watanabe, S.; Mizukami, S.; Hori, Y.; Kikuchi, K. Bioconjug. Chem. 2010, 21, DOI: 10.1021/bc100333k.に従い製造した。
カルボン酸1(129mg,626μmol)のDMF(2.6mL)溶液にN−ヒドロキシコハク酸イミド(109mg,947μmol)を加え、0℃に冷却した。そこにWSCD・HCl(180mg,939μmol)を加え、0℃で11時間撹拌した。酢酸エチル(10mL)で希釈した後、10%クエン酸水溶液(10mL)で洗浄した。次いで、水(10mL)で洗浄後、飽和食塩水(10mL)で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去することで、スクシンイミジルエステル2(63.8mg,210μmol,34%)を得た。なお、カルボン酸1は、Alvim, Jr. J.; Dias, R. L. A.; Castilho, M. S.; Oliva, G.; Correa, A. G. J. Braz. Chem. Soc., 2005, 16, 763-773.に従い製造した。
δ 11.46 (s, 1H), 9.02 (s, 1H), 7.88 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.90 (dd, J = 8.8, 2.0 Hz, 1H), 6.77 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 2.88 (s, 4H);
13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)
δ 170.4, 165.8, 158.8, 158.1, 155.7, 152.8, 133.3, 114.6, 110.5, 106.4, 102.0, 25.6;
HRMS (FAB+) m/z: 304.0457 ([M+H]+について計算値: 304.0451)。
バカンピシリン塩酸塩(75.4mg,150μmol)のDMF(3mL)溶液を0℃に冷却した後、DIPEA(38μL,218μmol)、スクシンイミジルエステル2(29.6mg,97.6μmol)を加え、0℃で16時間撹拌した。10%クエン酸水溶液(1mL)を加え、10分間撹拌した後、酢酸エチル(5×5mL)で抽出した。次いで10%クエン酸水溶液(25mL)で洗浄後、水(25mL)および飽和食塩水(25mL)で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を留去することで、化合物CB(61.9mg,94.7μmol,97%)を得た。なお、この反応は、 Mizukami, S.; Watanabe, S.; Hori, Y.; Kikuchi, K. J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 5016-5017.を参考にして行った。細胞試験には化合物CB(30.2mg)をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2:MeOH=99:1)でさらに精製したもの(27.6mg)を供した。
δ 11.14 (brs, 1H), 9.62 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 9.41 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 8.79 (s, 1H), 7.82 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.45-7.43 (m, 2H), 7.37-7.27 (m, 3H), 6.88 (dd, J = 8.8, 2.4 Hz, 1H), 6.82 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.72-6.66 (m, 1H), 5.91 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 5.60 (ddd, J = 8.0, 8.0, 4.0 Hz, 1H), 5.45 (dd, J = 4.0, 2.8 Hz,1H), 4.37 (d, J = 21.6 Hz, 1H), 4.19-4.13 (m, 2H), 1.54 (s, 3H), 1.48 (t, J = 5.6 Hz, 3H), 1.38 (s, 3H), 1.23-1.19 (m, 3H);
13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)
δ 173.5, 173.2, 169.7, 165.7, 165.6, 164.0, 161.3, 160.8, 156.5, 152.4, 152.3, 148.6, 138.2, 132.2, 128.5, 127.8, 126.6, 114.5, 113.0, 111.1, 101.9, 92.1, 92.0, 69.8, 69.5, 67.3, 67.1, 64.4, 64.1, 64.0, 58.5, 58.0, 55.6, 30.4, 29.4, 26.3, 19.2, 13.9;
HRMS (FAB+) m/z: 654.1731 ([M+H]+について計算値: 654.1758);
化合物CB(29.2mg,44.7μmol)のCH2Cl2(0.26mL)溶液にEt3N(8.75μL,62.8μmol)を加え、0℃に冷却した。そこにAc2O(5.1μL,54.0μmol)を加え、室温で3時間半撹拌した。CH2Cl2(3mL)で希釈し、0℃に冷却後、飽和塩化アンモニウム水溶液(1mL)を加え、反応を停止した。有機層を回収し、水層については、さらにCH2Cl2(3×3mL)で抽出した。次いで飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を留去した。この粗精製物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(CHCl3)で精製することで化合物CB−MA(24.7mg,35.5μmol,79%)を得た。なお、この反応は、Zhao, Y.; Zheng, Q.; Dakin, K.; Xu, K.; Martinez, M. L.; Li, W-H. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 4653-4663.を参考にして行った。
δ 9.63 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 9.43 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 8.88 (s, 1H), 8.04 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.47-7.43 (m, 3H), 7.37-7.25 (m, 4H), 6.71-6.61 (m, 1H), 5.92 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 5.60 (ddd, J = 7.6, 7.6, 4.0 Hz, 1H), 5.45 (dd, J = 4.2, 2.6 Hz,1H), 4.38 (d, J = 21.2 Hz, 1H), 4.19-4.13 (m, 2H), 2.33 (s, 3H), 1.54 (s, 3H), 1.48 (t, J = 5.6 Hz, 3H), 1.38 (s, 3H), 1.23-1.19 (m, 3H);
13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)
δ 173.5, 173.1, 169.6, 168.7, 165.7, 165.6, 160.6, 160.3, 154.7, 154.7, 152.4, 152.3, 147.6, 138.1. 131.4, 128.5, 127.9, 126.7, 119.6, 117.6, 116.4, 110.0, 92.1, 92.0, 79.2, 69.8, 69.5, 67.3, 67.1, 64.5, 64.4, 64.1, 64.0, 58.5, 58.1, 55.7, 30.4, 29.4, 26.3, 20.9, 19.2, 13.9;
HRMS (FAB+) m/z: 696.1851 ([M+H]+について計算値: 696.1863);
励起光および蛍光の両方について、スリット幅は2.5nmであり、光電子倍増管電圧は700Vであった。化合物RB、化合物RA、化合物FA、化合物FB、化合物CBおよび化合物CB−MAをDMSO中に溶解して、10mMストック溶液を調製し、これらの溶液を適切な水性緩衝液を用いて所望の最終濃度まで希釈した。化合物RBおよび化合物RAの相対的蛍光量子収率を、サンプルの蛍光スペクトル下面積を、0.5μMのローダミンB(545nmで励起したときに、0.97の量子効率である)のEtOH溶液の蛍光スペクトル下面積と比較することにより得た。化合物FAおよび化合物FBの相対的蛍光量子収率を、サンプルの蛍光スペクトル下面積を、フルオレセイン(492nmで励起したときに、0.85の量子効率である)の100mMのNaOH水溶液の蛍光スペクトル下面積と比較することにより得た。また、緩衝液中の化合物CBおよびEtOH中の化合物CB−MAの絶対的蛍光量子収率を得た。得られた結果を表1に示す。
化合物RBを細胞内に導入した際、化合物RBは、細胞内エステラーゼにより加水分解され、対応する化合物RAに変換された。化合物RBがエステラーゼにより化合物RAへ変換することを確認するため、化合物RBを試験管内の100mMのHEPES緩衝液(pH7.4)中のエステラーゼで処理し、反応生成物をHPLCで分析した。エステラーゼの添加により、化合物RBの保持時間は10分以内にシフトし(図2参照)、対応する生成物の質量スペクトルは化合物RAの質量スペクトル([M+H]+:762.3)と同様であった。一方、化合物RBは、100mMのHEPES(pH7.4)中で120℃で120分間インキュベートした後でさえも、エステラーゼ非存在下で非常に安定であった。図3中、下段のチャートはインキュベート前の化合物RBのチャートであり、上段のチャートはインキュベート後の化合物RBのチャートである。溶離液:(A)0.1%ギ酸/水、(B)0.1%ギ酸/アセトニトリル。(A)の割合は、0分から25分で10%まで減少させた。流速は1mL/分であり、溶出液は550nmで吸収をモニターした。図3中、「I」は、規格化吸収強度である。
化合物RBの細胞透過性と化合物RAの細胞透過性を比較した。HEK293T細胞を5μMの化合物RAまたは化合物RB溶液と共にCOインキュベータ中で30分間インキュベートした。その後、染料を2回洗浄して、細胞からの蛍光を共焦点顕微鏡により測定した。その結果、強い蛍光が、化合物RBと共にインキュベートした細胞に確認され、その蛍光は少なくとも180分間持続した。一方、化合物RAと共にインキュベートした細胞には、ほとんど蛍光は確認できなかった。細胞の蛍光分析の結果を図4に示す。蛍光分析画像は、559nmにおいて励起したものである。スケールバーは20μmを示す。図4中、「DIC」は、Differential Interference Contrast Microscopic Image(微分干渉顕微鏡像)を、「Fluorescence」は蛍光分析画像を意味する。この結果により、化合物RBはC3位のカルボキシ基のエステル化により十分な細胞透過性を有することが確認できた。細胞内に入ったあと、化合物RBは迅速に加水分解され、生じたカルボキシ基の負の荷電により、細胞内に留まる。
まず、BL−tag遺伝子を哺乳類発現ベクターにライゲートした。E.coliにおいて、βラクタマーゼの非修飾コード領域は、ペリプラスム中に分泌するためのシグナルペプチド配列を含む(R. P. Ambler, G. K. Scott, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1978, 75, 3732−3736)。BLタンパク質の細胞内形態を生成するため、そのシグナル配列を除去し、イニシエーター・メチオニンと置き換えた。さらに、発現レベルを増強するため、真核生物における最適翻訳効率用のコンセンサス配列を、イニシエーター・コドンに隣接して添加した(M. Kozak, J. Cell Biol., 1991, 115, 887-903.)。修飾したBL−tag遺伝子を哺乳類発現ベクター(pcDNA3.1(+))へ挿入し、pcDNA3.1(+)−BL(cytoplasmic BL)を生じた。HEK293T細胞に細胞質BLをコードするプラスミドをトランスフェクトし、化合物RBと共にインキュベートして、トランスフェクトされた細胞の細胞質ゾルを赤色蛍光でラベルした(図5)。図5中、「DIC」は、Differential Interference Contrast Microscopic Image(微分干渉顕微鏡像)を、「Fluorescence」は蛍光分析画像を意味する。「BL−CYTO」は、修飾したBL−tag遺伝子を哺乳類発現ベクター(pcDNA3.1(+))へ挿入したサンプルを、「Empty vector」は、哺乳類発現ベクター(pcDNA3.1(+))自体のサンプルを意味する。図5に示すように、BL−tag融合タンパク質は、哺乳類細胞中で発現し、化合物RBでラベル化されることが確認できた。
洗浄工程の時間経過を確認した。HEK293T細胞をBL−NLSプラスミドを用いてトランスフェクトし、上記のように化合物RB(200nM)と共にインキュベートした。インキュベートの後、その細胞をHBSSで2回洗浄し、空気中での微速度画像のため10%FBSを含むLeibovitz’s L-15培地中でインキュベートし、その後、蛍光顕微鏡で経時的にイメージ化した(図11参照)。図11中、「DIC」は、Differential Interference Contrast Microscopic Image(微分干渉顕微鏡像)を意味する。その結果、細胞核からの明確な蛍光が、培地でインキュベートして10分後から確認できた。細胞の核は、この測定中、安定した強い蛍光を示していた。ラベル化濃度を最適化することにより、細胞内のBL−tag融合タンパク質を、より高いシグナル対ノイズ比でラベル化することができ、かつ、余分なラベル化化合物(化合物RB)を除去する洗浄工程を短くすることが可能である。
まず、2種類のプラスミド、BL−NLSとBL−EGFRを用いた。BL−EGFRは、上皮成長因子受容体(EGFR)とのBL−tagの融合タンパク質であり、プラスミド・エンコード化BL−EGFRを用いてトランスフェクトすることにより、HEK293T細胞の細胞表面において融合タンパク質BL−EGFRを発現させた。
BL−NLSを用いてトランスフェクトされたHEK293T細胞を、化合物FB−DA(100nM)と共に15分間インキュベートし、洗浄して、共焦点顕微鏡でイメージ化した(図13参照)。図13中、「phase contrast」は、位相差顕微鏡像を、「Fluorescence」は蛍光分析画像を意味する。その結果、FB−DAを用いた場合は選択的に核の蛍光染色が見られた。これはFB−DAではそのアニオン性残基がアセチル基によって保護されているため、細胞膜を通過できるためと考えられる。なお、化合物FB−DAの場合、フルオレセインのアセチル基はラクトン環を形成しているが、アンピシリンのエトキシカルボニルオキシ(メチル)メチルと同様に、細胞内エステラーゼに切断される。その結果、フルオレセインは細胞内でその蛍光を回復する。以上の結果より、プローブ膜透過性はβ−ラクタムのカルボキシル基の状態と蛍光色素の性質の両者に依存することが分かった。
37℃5%CO2雰囲気下でDMEM(Invitrogen)の10%FBS中に保持されたHEK293T細胞を、リポフェクタミン(Lipofectamine)2000(Invitrogen)を用いて、BL−NLSをコードするプラスミドを用いて形質移入した。その細胞を37℃で24時間インキュベートした。その細胞を次いで、HBSSを用いて一度洗浄し、化合物CBまたは化合物CB−MA(100nM)と共に37℃で15分間インキュベートした。未反応プローブを洗浄した後、細胞の蛍光イメージを適切なフィルターセットを用いて、HBSS中で撮影した(図15および図16)。
37℃5%CO2雰囲気下でDMEM(Invitrogen)の10%FBS中に保持されたHEK293T細胞を、リポフェクタミン(Lipofectamine)2000(Invitrogen)を用いて、BL−NLSプラスミドおよびSNAP−COX8―2をコードするプラスミド(New England BioLabs Inc.)の両方を同時に用いて形質移入した。その細胞を37℃で24時間インキュベートした。その細胞を次いで、HBSSを用いて一度洗浄し、化合物FB−DA(100nM)とSNAP−Cell(登録商標)TMR−Star(New England BioLabs Inc., 1μM)と共に37℃で15分間インキュベートした。未反応プローブを洗浄した後、HBSS中で30分インキュベーションし、細胞の蛍光イメージを適切なフィルターセットを用いて、HBSS中で撮影した(図17)。
配列番号2 E166A TEM−1のアミノ酸配列
配列番号3 E166D TEM−1のアミノ酸配列
配列番号4 E166Q TEM−1のアミノ酸配列
配列番号5 E166N TEM−1のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号6 E166A TEM−1のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号7 E166D TEM−1のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号8 E166Q TEM−1のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号9 オリゴヌクレオチド
配列番号10 オリゴヌクレオチド
Claims (5)
- 細胞内タンパク質を蛍光標識する方法であって、
標識対象タンパク質と変異型βラクタマーゼとの融合タンパク質を細胞内で得ること、
下記式(I)で表される化合物またはその塩を、細胞内のエステラーゼにより下記式(II)で表される化合物またはその塩へ変換すること、
および前記融合タンパク質と下記式(II)で表わされる化合物またはその塩とを反応させることにより、前記対象タンパク質を蛍光標識することを含み、
前記変異型βラクタマーゼは、前記式(II)で表わされる化合物またはその塩のβ−ラクタム環を開環させ、その結果、前記化合物またはその塩のβ−ラクタム環が開環した部分と共有結合可能なタンパク質であり、
前記融合タンパク質における前記変異型βラクタマーゼのアミノ酸配列が、
配列表の配列番号1〜4のいずれかのアミノ酸配列、及び、
配列表の配列番号1〜4のいずれかのアミノ酸配列の1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列であって、前記融合タンパク質において上記式(II)で表わされる化合物のβ−ラクタム環を開環させ、かつ、前記化合物またはその塩のβ−ラクタム環が開環した部分と共有結合可能なアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列であるタンパク質の蛍光標識方法。
Xは、蛍光性基であり、
L1は、Xのためのリンカーであり、
R1は、低級アルキルオキシカルボニルオキシで置換された低級アルキル基または、3−オキシ−1,3−ジヒドロイソベンゾフラン−1−イルである。 - 前記融合タンパク質を得ることが、前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを得ること、前記融合タンパク質を発現可能なプラスミド若しくはベクターを得ること、細胞内で前記融合タンパク質を発現させること、又は、発現した前記融合タンパク質を単離することを含む、請求項1に記載の細胞内タンパク質の蛍光標識方法。
- 前記式(I)で表わされる化合物またはその塩を含む請求項1または2の方法に用いるための組成物。
L1は、Xのためのリンカーであり、
R1は、低級アルキルオキシカルボニルオキシで置換された低級アルキル基または、3−オキシ−1,3−ジヒドロイソベンゾフラン−1−イルである。 - 請求項3に記載の組成物と、
請求項1または2の方法に用いるためのプラスミドまたはベクターを含むタンパク質の蛍光標識方法用キットであって、
前記プラスミドまたはベクターは、標識対象タンパク質と変異型βラクタマーゼとの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをクローニングするため又は前記融合タンパク質を発現させるためのプラスミド又はベクターであり、
前記プラスミド又はベクターは、
配列表の配列番号5〜8のいずれかの塩基配列及び
配列表の配列番号5〜8のいずれかの塩基配列の1〜数個の塩基が欠失、置換、又は付加された塩基配列であって、前記融合タンパク質において式(I)で表わされる化合物またはその塩のβ−ラクタム環を開環させ、その結果、前記化合物またはその塩のβ−ラクタム環が開環した部分と共有結合可能なアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる群から選択される塩基配列を含むプラスミドまたはベクターであるタンパク質の蛍光標識方法用キット。
L1は、Xのためのリンカーであり、
R1は、低級アルキルオキシカルボニルオキシで置換された低級アルキル基または、3−オキシ−1,3−ジヒドロイソベンゾフラン−1−イルである。 - 一般式(I)で表わされる化合物またはその塩。
L1は、Xのためのリンカーであり、
R1は、低級アルキルオキシカルボニルオキシで置換された低級アルキル基または、3−オキシ−1,3−ジヒドロイソベンゾフラン−1−イルである。
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JPN6012020744; 菊地和也 他: 'バイオイメージングのための新規Zn2+螢光プローブ' 化学と生物 vol.39, 2001, p.549-53 * |
JPN6012020745; 菊地和也: '生細胞蛍光プローブを用いた生体可視化解析' 日本化学会生体機能関連化学部会 ニュースレター vol.16, 2001, p.4-7 * |
JPN6012020747; 菊地和也: '機能的蛍光標識導入によるbetaアミロイド蓄積過程の分析手法開発に関する研究' アミノスフェロイド仮説によるアルツハイマー病病態解明と臨床応用に関する研究 平成18年度 総括・分担研 , 2007, p.12-3 * |
JPN6012020749; 秋元悠里 他: '変異体beta-ラクタマーゼを用いた細胞内タンパク質ラベル化法の開発' 日本化学会第91春季年会(2011)講演予稿集III , 20110311, p.718, 1 B3-54 * |
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