JP5299932B2 - タンパク質を蛍光標識する方法 - Google Patents

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Description

本発明は、タンパク質を蛍光標識する方法に関する。
近年、生物が生きた状態において、生物内のタンパク質などの生体分子の機能を観察するバイオイメージングが注目されている。この生体分子機能の観察は、生体分子を蛍光で標識し、生物内におけるその生体分子の局在や動きを可視化することにより汎用的に行われている。生体分子を蛍光で標識する方法としては、遺伝子工学的手法を用いて、蛍光タンパク質を目的とする生体分子（タンパク質）の融合タンパク質として発現させる方法が一般的である。この蛍光タンパク質は、分子サイズが大きく、また、組織透過性の高い近赤外光蛍光の観測が困難であるなどの不都合がある。そのため、蛍光タンパク質より分子サイズが小さく、かつ、蛍光特性に優れた有機小分子に注目が集まっている。有機小分子を目的タンパク質にラベルする技術として、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）（プロメガ株式会社）（例えば非特許文献１参照）およびＳＮＡＰ−ｔａｇ（登録商標）（例えば非特許文献２参照）を用いたラベル化キットが商品化されている。これらのラベル化法は、酵素反応を利用して目的とする生体分子を蛍光で標識する。そのため、有機小分子を目的とする生体分子にラベル化する際の特異性は非常に高いが、生体分子に結合していない有機小分子由来の蛍光が、バックグラウンドシグナルとして観測されてしまう。このバックグラウンドシグナルを小さくするため、目的とする生体分子を有機小分子で蛍光標識した後、洗浄して、未反応の有機小分子を除去する必要がある。しかしながら、細胞内や生体内に存在する生体分子を洗浄するのは、一般的に困難であり、洗浄できない場合も多い。従って、細胞内や生体内での生体分子の機能を観察するには、上述のラベル化法は汎用的とはいえない。
Qureshi,M.H., ら、J. Biol. Chem., 2001, 276, p.46422-8 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004, 101, p.9955-9959
そこで、本発明は、細胞内や生体内における生体分子（タンパク質）を蛍光で標識するために使用できる、タンパク質を蛍光標識する方法の提供を目的とする。
本発明は、タンパク質を蛍光標識する方法であって、標識対象タンパク質とＰＹＰ（Photoactive Yellow Protein）またはＰＹＰ由来タンパク質との融合タンパク質を得ること、および前記融合タンパク質と下記式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩とを反応させることにより、前記対象タンパク質を蛍光標識することを含み、
前記式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩は、式（Ａ）中のクマリン骨格または式（Ｂ）中のベンゼン骨格とＸ基とが分子内で会合し、その結果、Ｘ基由来の蛍光は抑制されており、
前記式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩の式（Ａ）中のクマリン骨格または式（Ｂ）中のベンゼン骨格が前記融合タンパク質に含まれるＰＹＰまたはＰＹＰ由来タンパク質と結合した場合、式（Ａ）中のクマリン骨格または式（Ｂ）中のベンゼン骨格とＸ基との分子内会合が解消し、Ｘ基由来の蛍光が発せられうる。
前記式（Ｉ）中、
Ｙは、酸素原子または硫黄原子であり、
Ｒ１は、低級アルキル基、ハロゲンで置換された低級アルキル基、アリール基、ヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換されたアリール基、低級アラルキル基またはヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換された低級アラルキル基であり、
Ｒ２は、クマリン骨格を有する式（Ａ）で表わされる基またはベンゼン骨格を有する式（Ｂ）で表わされる基であり、
ここで、式（Ａ）および式（Ｂ）において、
Ｘは、蛍光性基であり、
Ｌは、Ｘのためのリンカーであり、
Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、ヒドロキシ基、低級アルコキシ基またはハロゲンで置換された低級アルキル基であり、
Ｒ５は、ヒドロキシ基、アミノ基、低級アルキルでモノまたはジ置換されたアミノ基、低級アルコキシ基であり、
は、二重結合または三重結合を意味する。
本発明のタンパク質を蛍光標識する方法は、目的とするタンパク質を標識した場合にのみ、強い蛍光を示す。そのため、タンパク質を標識していない有機小分子を除去しなくとも、蛍光のバックグラウンドを最小限に抑えることができる。従って、精度の高い蛍光観察を行うことが可能である。また、未反応の有機小分子を除去する必要がないので、生体内での生体分子を観察する際に適する。
図１（ａ）は、ＰＹＰと化合物ＦＣＴＰの反応後のＣＢＢ染色画像を、図１（ｂ）はＰＹＰと化合物ＦＣＴＰの反応後の蛍光画像を示す。 図２（ａ）は、細胞溶解液中でのＰＹＰと化合物ＦＣＴＰの反応後のＣＢＢ染色画像を、図２（ｂ）は細胞溶解液中でのＰＹＰと化合物ＦＣＴＰの反応後の蛍光画像を示す。 図３（ａ）は、５μＭのＰＹＰ存在下における８μＭの化合物ＦＣＴＰの経時蛍光スペクトルを示す。 図３（ｂ）は、５μＭのＰＹＰ存在下における８μＭの化合物ＦＣＴＰの経時励起スペクトルを示す。 図３（ｃ）は、８μＭの化合物ＦＣＴＰの蛍光スペクトル（励起５００ｎｍ）を示す。 図４は、培養細胞におけるＦＣＴＰによるラベル化反応を示す蛍光顕微鏡写真である。 図５は、培養細胞におけるＣＡＴＰによるラベル化反応の手順を示す。 図６は、培養細胞におけるＣＡＴＰによるラベル化反応を示す蛍光顕微鏡写真である。
ＰＹＰ（Photoactive Yellow Protein）は、紅色光合成細菌Ectothiorhodospira halophila（Halorhodospira halophila）から単離された光受容タンパク質である。この紅色光合成細菌は真正細菌であるため、ＰＹＰを細胞内で用いた際、ＰＹＰ由来の内在性タンパク質が蛍光標識に悪影響を与える可能性は低い。また、このＰＹＰは、１２５のアミノ酸残基（配列表の配列番号１）により構成されており、比較的小さな（１４ｋＤａ）タンパク質である。このＰＹＰの６９番目のシステイン残基に発色団であるｐ−クマル酸がチオエステル結合を介して結合する。ＰＹＰにはｐ−クマル酸以外、様々な類似体が結合することが知られている（例えば、以下のスキーム１に示す化合物。例えばCordgunkeら、Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 1998, 95, pp7396-7401、Koonら、The Journal of Biological Chemistry, 1996, 271, pp. 31949-31956を参照）。
本発明の標識方法においては、前記式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩は、リンカーＬによりつながれた式（Ａ）中のクマリン骨格または式（Ｂ）中のベンゼン骨格とＸ基とが分子内で会合し、その結果、Ｘ基由来の蛍光は抑制されている（スキーム２参照）。本発明の標識方法においては、ＰＹＰまたはＰＹＰ由来タンパク質と標識対象タンパク質とを融合させた融合タンパク質を、その式（Ｉ）の化合物またはその塩と反応させる。融合タンパク質のＰＹＰまたはＰＹＰ由来タンパク質が、式（Ｉ）の化合物の式（Ａ）中のクマリン骨格または式（Ｂ）中のベンゼン骨格が前記融合タンパク質に含まれるＰＹＰまたはＰＹＰ由来タンパク質と結合した場合、ＰＹＰ等の結合部位には、式（Ａ）中のクマリン骨格または式（Ｂ）中のベンゼン骨格が入る余地しかなく、Ｘ基はＰＹＰ等の結合部位に入ることができない。その結果、式（Ａ）中のクマリン骨格または式（Ｂ）中のベンゼン骨格とＸ基との分子内会合が解消し、Ｘ基由来の蛍光が発せられうる（スキーム２参照）。すなわち、融合タンパク質と結合していない式（Ｉ）の化合物またはその塩は、蛍光強度が極めて低い。すなわち蛍光を発しないので本発明の標識方法においては、バックグラウンドシグナルが低い。その結果、式（Ｉ）の化合物で標識対象タンパク質（生体分子）を標識した後、洗浄しなくとも、バックグラウンドシグナルに邪魔されることなく、正確に標識対象タンパク質を検出することが可能なのである。さらに、本発明の標識方法で用いるＰＹＰまたはＰＹＰ由来タンパク質は、約１４ｋＤａと比較的分子量が小さく、標識対象タンパク質に与える影響は低いという利点がある。さらにＰＹＰまたはＰＹＰ由来タンパク質や、クマリン誘導体またはクマル酸誘導体は動物細胞内に存在しない物質であるため、標識に与える影響は低いという利点がある。
ＰＹＰのアミノ酸配列としては、例えば、配列表の配列番号１〜１７で表されるアミノ酸配列が挙げられ、ＰＹＰをコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、配列表の配列番号１８〜２９で表される塩基配列が挙げられる。
融合タンパク質を発現可能なプラスミド若しくはベクターを得るには、標識対象タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ＰＹＰまたはＰＹＰ由来のタンパク質をコードするポリヌクレオチド等を用い、通常の方法に従い、そのようなプラスミド若しくはベクターを調製することができる。本発明において、ベクターは、ポリヌクレオチド、好ましくは、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを細胞内に導入するためのポリヌクレオチドをいい、プラスミドを含むものをいう。なお、ベクターは、プラスミドベクターであってもよく、ウイルスベクターであってもよい。融合タンパク質を発現可能とする配列は、当業者であれば、導入する細胞の種類に応じて適宜選択しうる。プラスミド及びベクターは、融合タンパク質の発現を調節する配列（例えば、発現誘導プロモーターや制御配列）を含んでもよい。
細胞内で融合タンパク質を発現させるには、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたは、融合タンパク質を発現可能なプラスミド若しくはベクターを用いて、通常の方法に従って行うことができる。
発現した融合タンパク質を単離するには、通常の方法に従って行うことができる。
本発明の蛍光標識する方法において用いられる式（Ｉ）の化合物は、前記のように、Ｙは、酸素原子または硫黄原子であり、
Ｒ１は、低級アルキル基、ハロゲンで置換された低級アルキル基、アリール基、ヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換されたアリール基、低級アラルキル基またはヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換された低級アラルキル基であり、
Ｒ２は、クマリン骨格を有する式（Ａ）で表わされる基またはベンゼン骨格を有する式（Ｂ）で表わされる基であり、
ここで、式（Ａ）および式（Ｂ）において、
Ｘは、蛍光性基であり、
Ｌは、Ｘのためのリンカーであり、
Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、ヒドロキシ基、低級アルコキシ基またはハロゲンで置換された低級アルキル基であり、
Ｒ５は、ヒドロキシ基、アミノ基、低級アルキルでモノまたはジ置換されたアミノ基、低級アルコキシ基であり、
は、二重結合または三重結合を意味する。
本発明において、蛍光性基とは、可視光線、紫外線、Ｘ線等が照射され、そのエネルギーを吸収することにより電子が励起し、それが基底状態に戻る際に余分なエネルギーを電磁波として放出する性質を有する基を意味する。具体的には、蛍光性基とは、フルオレセイン、キサンテン色素、シアニン色素、アクリジン、イソインドール、ダンシル色素、アミノフタル酸ヒドラジド、アミノフタルイミド、アミノナフタルイミド、アミノベンゾフラン、アミノキノリン、ジシアノヒドロキノン等から誘導される基あるいは発光性希土類錯体が挙げられ、フルオレセイン、キサンテン色素から誘導される基が好ましい。
本発明において、ＸのためのリンカーＬとは、式（Ａ）の基のクマリン骨格とＸ基とを、式（Ｂ）の基のベンゼン骨格とＸ基とを結びつけるための基である。このリンカーＬは、式（Ａ）のクマリン骨格とＸ基、または式（Ｂ）のベンゼン骨格とＸ基とが分子内で会合するよう、柔軟かつある程度の長さを有するものが好ましい。柔軟であるためには、リンカーＬは、鎖状構造を有するものが好ましい。また、長さについては、リンカーＬは、例えば８Å〜２５Å、好ましくは１０Å〜２０Å、より好ましくは１２Å〜１８Åの長さを有する。具体的には、Ｌは、例えば、−（ＣＨ２）ｎ１Ｏ（ＣＨ２）ｎ２−、−（ＣＨ２）ｎ１ＣＯＮＲ１１（ＣＨ２）ｎ２−、−（ＣＨ２）ｎ１ＮＲ１１ＣＯ（ＣＨ２）ｎ２−、−（ＣＨ２）ｎ１ＮＲ１１ＣＯＮＲ１２（ＣＨ２）ｎ２−、−（ＣＨ２）ｎ１ＮＲ１１ＣＳＮＲ１２（ＣＨ２）ｎ２−、−（ＣＨ２）ｎ１ＣＯＮＲ１１（ＣＨ２）ｎ３ＣＯＮＲ１２（ＣＨ２）ｎ２−、−（ＣＨ２）ｎ１ＮＲ１１ＣＯ（ＣＨ２）ｎ３ＮＲ１２ＣＯ（ＣＨ２）ｎ２−、
−（ＣＨ２）ｎ１−、−（ＣＨ２）ｎ１Ｓ（ＣＨ２）ｎ２−、−（ＣＨ２）ｎ１ＮＲ１１（ＣＨ２）ｎ２−、−（ＣＨ２）ｎ１ＣＯ２（ＣＨ２）ｎ２−、−（ＣＨ２）ｎ１Ｏ（ＣＨ２）ｎ２Ｏ（ＣＨ２）ｎ３Ｏ（ＣＨ２）ｎ４−、
等の１つ以上を組み合わせたものが挙げられる。前記式中、ｎ１、ｎ２、ｎ３はそれぞれ独立して、０または１〜５の整数であり、Ｒ１１およびＲ１２は、それぞれ、水素原子または低級アルキル基である。このＸのためのリンカーとは、本発明のタンパク質を蛍光標識する方法における条件下で、切断されないリンカーであれば、その構造は限定されない。前記Ｌとしては、下記式（ａ）、式（ｂ）、式（ｃ）または式（ｄ）で表わされる基が好ましい。

ここで、式（ａ）および式（ｂ）において、ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５およびｎ６は、それぞれ独立して、０または１〜５の整数であり、Ｒ１１は、水素原子または低級アルキル基であり、
式（ｃ）および式（ｄ）において、ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５、ｎ６およびｎ７は、それぞれ独立して、０または１〜５の整数であり、Ｒ１１およびＲ１２は、それぞれ独立して、水素原子または低級アルキル基である。
式（Ｉ）の化合物において、Ｒ１、Ｒ２、式（Ａ）の基および式（Ｂ）の基は、１か所以上の不斉中心を有することもあり、それゆえ、式（Ｉ）の化合物はラセミ体または純粋な立体異性体として存在してもよい。さらに、式（Ｂ）が二重結合を含有する場合、シス又はトランス異性体として存在しうる。いずれの場合にも、本発明はそれらの混合物及び各異性体を共に包含するものである。
本発明において「低級」は、特に指示がなければ、炭素原子１〜６個、好ましくは炭素原子１〜４個を意味する。
本発明において、「ハロゲン原子」または「ハロゲン」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子およびヨウ素原子が挙げられる。
本発明において、「低級アルキル基」または「低級アルキル」とは、炭素数１〜６のものが挙げられる。具体的には、低級アルキル基としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｉ−ペンチル、ｓｅｃ−ペンチル、ｔ−ペンチル、２−メチルブチル、ｎ−ヘキシル、１−メチルペンチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、４−メチルペンチル、１−エチルブチル、２−エチルブチル、１，１−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、および１−エチル−１−メチルプロピルなどの直鎖状または分岐状のアルキル基を挙げることができ、好適には炭素数１〜３のものが挙げられる。
本発明において、「低級アルコキシ基」または「低級アルコキシ」とは、炭素数１〜６のアルキルオキシ基が挙げられる。具体的には、低級アルコキシ基としては、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロピルオキシ、ｉ−プロピルオキシ、ｎ−ブチルオキシ、ｉ−ブチルオキシ、ｓｅｃ−ブチルオキシ、ｔ−ブチルオキシ、ｎ−ペンチルオキシ、ｉ−ペンチルオキシ、ｓｅｃ−ペンチルオキシ、ｔ−ペンチルオキシ、２−メチルブトキシ、ｎ−ヘキシルオキシ、ｉ−ヘキシルオキシ、ｔ−ヘキシルオキシ、ｓｅｃ−ヘキシルオキシ、２−メチルペンチルオキシ、３−メチルペンチルオキシ、１−エチルブチルオキシ、２−エチルブチルオキシ、１，１−ジメチルブチルオキシ、２，２−ジメチルブチルオキシ、３，３−ジメチルブチルオキシ、および１−エチル−１−メチルプロピルオキシなどの直鎖状または分岐状のアルキルオキシ基を挙げることができ、好適には炭素数１〜３のアルキルオキシ基が挙げられる。
本発明において、「アリール基」とは、炭素数６〜１０のものが挙げられる。具体的には、アリール基としては、フェニル基、ナフチル基等を挙げることができ、好適にはフェニル基が挙げられる。
本発明において、「低級アラルキル基」とは、アリール置換された低級アルキル基が挙げられる。具体的には、低級アラルキル基としては、ベンジル（フェニルメチル）、フェネチル（フェニルエチル）、３−フェニルプロピル、１−ナフチルメチル、２−（１−ナフチル）エチル等を挙げることができ、好適にはベンジル基が挙げられる。
本発明において、「ハロゲンで置換された低級アルキル基」としては、例えば、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、クロロメチル、ジクロロメチル、トリクロロメチル、ブロモメチル、ジブロモメチル、トリブロモメチル、１−フルオロエチル、１−クロロエチル、１−ブロモエチル、２−フルオロエチル、２−クロロエチル、２−ブロモエチル、１，２−ジフルオロエチル、トルフルオロメチルなどが挙げられる。
本発明において、「低級アルキルでモノまたはジ置換されたアミノ基」としては、メチルアミノ、エチルアミノ、ｎ−プロピルアミノ、ｉ−プロピルアミノ、ｎ−ブチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ等が挙げられる。
本発明において、「ヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換されたアリール基」としては、４−ヒドロキシフェニル、４−クロロフェニル、４−ブロモフェニル、４−フルオロフェニル、２，６−ジクロロフェニル、４−メトキシフェニル、３，４−ジメトキシフェニル、２−ヒドロキシナフチル等が挙げられる。
本発明において、「ヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換された低級アラルキル基」としては、４−ヒドロキシベンジル、２−クロロベンジル、２−ブロモベンジル、４−メトキシベンジル等が挙げられる。
式（Ｉ）の化合物の塩は、酸または塩基との塩であってもよい。そのような塩としては、例えばナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属塩、カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩などの無機塩基との塩、及びトリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンアミンなどの有機アミン塩、及び塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸などの無機酸塩、及びギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、マレイン酸、酒石酸などの有機カルボン酸塩、及びメタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などのスルホン酸付加塩、及びアルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸などの塩基性又は酸性アミノ酸といった塩基との塩又は酸付加塩が挙げられる。
式（Ｉ）の化合物は、溶媒和物の形をとることもありうるが、これも本発明の範囲に含まれる。溶媒和物としては、好ましくは、水和物及びエタノール和物が挙げられる。
本発明の蛍光標識する方法において用いられる式（Ｉ）の化合物は、従来技術における公知文献を参考に自家製造してもよいし、市販で入手してもよい。
本発明の蛍光標識する方法において用いられる、標識対象タンパク質とＰＹＰまたはＰＹＰ由来タンパク質との融合タンパク質を得ることは、例えば、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを得ること、融合タンパク質を発現可能なプラスミド若しくはベクターを得ること、細胞内で融合タンパク質を発現させること、又は、発現した融合タンパク質を単離することを含んでもよい。融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、標識対象タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ＰＹＰまたはＰＹＰ由来タンパク質をコードするポリヌクレオチド等を用い、通常の方法に従い、融合タンパク質を発現可能なプラスミド若しくはベクターを調製することができる。
本発明のタンパク質を蛍光標識する方法において、前記融合タンパク質と、式（Ｉ）の化合物とを反応させる工程は、融合タンパク質を発現する細胞内や生体内で行ってもよく、単離した融合タンパク質を用いてin vitroで行ってもよい。標識をin vitroで行う場合、例えば、緩衝液中（ｐＨ６．８〜８．５）で２０〜３７℃の温度で行ってもよい。
本発明のタンパク質を蛍光標識する方法において、融合タンパク質におけるＰＹＰまたはＰＹＰ由来タンパク質のアミノ酸配列は、
１）配列表の配列番号１〜１７で表されるアミノ酸配列、
２）配列表の配列番号１〜１７で表されるアミノ酸配列において、第１番目から第２４、２５、２６、または２７番目までが欠失したアミノ酸配列、
３）上記１）または２）のアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列であって、前記融合タンパク質が前記式（Ａ）中のクマリン骨格または式（Ｂ）中のベンゼン骨格と結合し、前記式（Ｉ）で表わされる化合物中の式（Ａ）中のクマリン骨格または式（Ｂ）中のベンゼン骨格とＸ基との分子内会合が解消し、Ｘ基由来の蛍光が発せられうるアミノ酸配列、及び、
４）上記１）または２）のアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、前記融合タンパク質が前記式（Ａ）中のクマリン骨格または式（Ｂ）中のベンゼン骨格と結合し、前記式（Ｉ）で表わされる化合物中の式（Ａ）中のクマリン骨格または式（Ｂ）中のベンゼン骨格とＸ基との分子内会合が解消し、Ｘ基由来の蛍光が発せられうるアミノ酸配列、からなる群から選択されるアミノ酸配列であるのが好ましい。なお、配列表の配列番号１〜１７で表されるアミノ酸配列は、１５種の紅色細菌（purple bacteria）に存在するＰＹＰのアミノ酸配列である。また、これらの紅色細菌のＰＹＰは、文献［Kumauchi et al. Photochemistry and Photobiology, 2008, 84:956-969］によれば、Ｎ末端の２４〜２７番目のアミノ酸配列を欠失させてもリガンド結合能を示すことが知られている。なお、当業者であれば、同文献図２(a)のマルチプルアライメントを参照してＮ末端の欠失可能部位を容易に判断できる。
標識対象タンパク質とＰＹＰまたはＰＹＰ由来タンパク質との融合タンパク質は、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを得ること、融合タンパク質を発現可能なプラスミド若しくはベクターを得ること、細胞内で融合タンパク質を発現させること、又は、発現した融合タンパク質を単離することの１以上の工程を含む方法、または全ての工程を含む方法により得ることができる。すなわち、融合タンパク質を得ることは、該タンパク質を単離することのみならず、細胞内や生体内で発現させることを含む。
本発明は、また、前記式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩を含む本発明の方法に用いるための組成物である。
前記式（Ｉ）中、
Ｙは、酸素原子または硫黄原子であり、
Ｒ１は、低級アルキル基、ハロゲンで置換された低級アルキル基、アリール基、ヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換されたアリール基、低級アラルキル基またはヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換された低級アラルキル基であり、
Ｒ２は、クマリン骨格を有する式（Ａ）で表わされる基またはベンゼン骨格を有する式（Ｂ）で表わされる基であり、
ここで、式（Ａ）および式（Ｂ）において、
Ｘは、蛍光性基であり、
Ｌは、Ｘのためのリンカーであり、
Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、またはハロゲンで置換された低級アルキル基であり、
Ｒ５は、ヒドロキシ基、アミノ基、低級アルキルでモノまたはジ置換されたアミノ基、低級アルコキシ基であり、
は、二重結合または三重結合を意味する。
本発明は、また、本発明の方法に用いるためのプラスミドまたはベクターであって、
前記プラスミドまたはベクターは、標識対象タンパク質とＰＹＰまたはＰＹＰ由来タンパク質との融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをクローニングするため又は前記融合タンパク質を発現させるためのプラスミド又はベクターであり、
前記プラスミド又はベクターは、
１）配列表の配列番号１８〜２９で表される塩基配列、
２）配列表の配列番号１８〜２９で表される塩基配列において、前記塩基配列がコードするアミノ酸配列のＮ末端の第１番目から第２４、２５、２６、または２７番目までの欠失に相当する塩基配列が欠失した塩基配列、
３）上記１）または２）の塩基配列の１〜数個の塩基が欠失、置換、又は付加された塩基配列であって、前記融合タンパク質が式（Ａ）中のクマリン骨格または式（Ｂ）中のベンゼン骨格と結合し、式（Ｉ）で表わされる化合物中の式（Ａ）中のクマリン骨格または式（Ｂ）中のベンゼン骨格とＸ基との分子内会合が解消し、Ｘ基由来の蛍光が発せられうるアミノ酸配列をコードする塩基配列、及び、
４）上記１）または２）の塩基配列と７０％以上の相同性を有する塩基配列であって、前記融合タンパク質が下記式（Ａ）中のクマリン骨格または式（Ｂ）中のベンゼン骨格と結合し、式（Ｉ）で表わされる化合物中の式（Ａ）中のクマリン骨格または式（Ｂ）中のベンゼン骨格とＸ基との分子内会合が解消し、Ｘ基由来の蛍光が発せられうるアミノ酸配列をコードする塩基配列、からなる群から選択される塩基配列を含む。なお、配列表の配列番号１８〜２９で表される塩基配列は、それぞれ、配列表の配列番号１〜１２で表されるＰＹＰのアミノ酸配列をコードする塩基配列である。上記２）の塩基配列における５’側塩基配列の欠失については、上述のとおりである。
また、本発明は、前記式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩を含む本発明の方法に用いるための組成物と、本発明の方法に用いるためのプラスミドまたはベクターとを含むタンパク質の蛍光標識方法用キットである。
本発明のタンパク質の蛍光標識方法用キットは、さらに、前記プラスミド又はベクターを導入するための宿主細胞、キットの取り扱い説明書を含むのが好ましい。
本発明の方法、組成物、およびキットにおいて、
Ｙが、硫黄原子であり、
Ｒ１が、アリール基またはヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換されたアリール基であり、
Ｒ２が、式（Ａ）または式（Ｂ）で表わされる基であり、
ここで、式（Ａ）および式（Ｂ）において、
Ｘが、式（ｉ）で表される基であり、
Ｌが、式（ａ）、式（ｂ）、式（ｃ）または式（ｄ）で表わされる基であり、
Ｒ３およびＲ４が、水素原子であり、
Ｒ５が、ヒドロキシであり、
が、二重結合を意味し、
ここで式（ａ）および式（ｂ）において、
ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５およびｎ６は、それぞれ独立して、０または１〜５の整数であり、
Ｒ１１は、水素原子または低級アルキル基であり、
式（ｃ）および式（ｄ）において、
ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５、ｎ６およびｎ７は、それぞれ独立して、０または１〜５の整数であり、
Ｒ１１およびＲ１２は、それぞれ独立して、水素原子または低級アルキル基である式（Ｉ）の化合物またはその塩が好ましい。
また、本発明は、一般式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩である。
前記式（Ｉ）中、
Ｙは、酸素原子または硫黄原子であり、
Ｒ１は、低級アルキル基、ハロゲンで置換された低級アルキル基、アリール基、ヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換されたアリール基、低級アラルキル基またはヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換された低級アラルキル基であり、
Ｒ２は、クマリン骨格を有する式（Ａ）で表わされる基またはベンゼン骨格を有する式（Ｂ）で表わされる基であり、
ここで、式（Ａ）および式（Ｂ）において、
Ｘは、蛍光性基であり、
Ｌは、Ｘのためのリンカーであり、
Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、ヒドロキシ基、低級アルコキシ基またはハロゲンで置換された低級アルキル基であり、
Ｒ５は、ヒドロキシ基、アミノ基、低級アルキルでモノまたはジ置換されたアミノ基、低級アルコキシ基であり、
は、二重結合または三重結合を意味する。
前記式（Ｉ）の化合物としては、式（Ｉ）中、
Ｙが、硫黄原子であり、
Ｒ１が、アリール基またはヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換されたアリール基であり、
Ｒ２が、式（Ａ）または式（Ｂ）で表わされる基であり、
ここで、式（Ａ）および式（Ｂ）において、
Ｘが、式（ｉ）で表される基であり、
Ｌが、式（ａ）、式（ｂ）、式（ｃ）または式（ｄ）で表わされる基であり、
Ｒ３およびＲ４が、水素原子であり、
Ｒ５が、ヒドロキシであり、
が、二重結合を意味し、
ここで式（ａ）および式（ｂ）において、
ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５およびｎ６は、それぞれ独立して、０または１〜５の整数であり、
Ｒ１１は、水素原子または低級アルキル基であり、
式（ｃ）および式（ｄ）において、
ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５、ｎ６およびｎ７は、それぞれ独立して、０または１〜５の整数であり、
Ｒ１１およびＲ１２は、それぞれ独立して、水素原子または低級アルキル基であるのが好ましい。

また、式（Ｉ）の化合物としては、以下の式で表わされる化合物ＦＣＴＰがより好ましい。これらの好ましい式（Ｉ）の化合物は、本発明におけるタンパク質を蛍光標識する方法、組成物等においても好ましく用いられる。

式（Ｉ）の化合物は、例えば、下記スキーム３に従い、製造することができる。下記スキーム３は、式（Ｉ）においてＬが特定の基の場合の製造例を示している。なお、出発原料は従来技術における公知文献を参考に自家製造してもよいし、購入してもよい。

前記式中、
Ｙは、酸素原子または硫黄原子であり、
Ｒ１は、低級アルキル基、ハロゲンで置換された低級アルキル基、アリール基、ヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換されたアリール基、低級アラルキル基またはヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換された低級アラルキル基であり、
Ｘは、蛍光性基であり、
Ｌは、Ｘのためのリンカーであり、
Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、ヒドロキシ基、低級アルコキシ基またはハロゲンで置換された低級アルキル基であり、
Ｒ５は、ヒドロキシ基、アミノ基、低級アルキルでモノまたはジ置換されたアミノ基、低級アルコキシ基であり、
は、二重結合または三重結合を意味する。
本発明は、さらに、本発明のタンパク質を蛍光標識する方法により標的対象タンパク質を標識することを含むバイオイメージング方法を提供しうる。本発明のバイオイメージング方法は、好ましくは、前記標的対象タンパク質を発現する細胞又は組織のイメージングを含む。前記細胞又は組織としては、特に制限されないが、好ましくは、動物の細胞又は組織であって、より好ましくは哺乳類の細胞又は組織であって、さらに好ましくは霊長類の細胞又は組織であって、さらにより好ましくはヒトの細胞又は組織である。
［実施例］
本明細書の記載において、以下の略語を使用する。
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＨＯＢｔ：１−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＷＳＣＤ・ＨＣｌ：水溶性カルボジイミド：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩
ＭＯＭＣｌ：メトキシメチルクロライド
ＤＩＥＡ：Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ＮＢＳ：Ｎ−ブロモスクシンイミド
ＡＩＢＮ：アゾビスブチロニトリル
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＴＣＥＰ：トリス［２−カルボキシエチル］ホスフィン
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＣＢＢ：クマシーブリリアントブルー
ＤＴＴ：ジチオトレイトール
ＭＥＳＮａ：２−メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム塩。
［化合物および機器］
化合物は、入手できる最も高いグレードのものであり、東京化成工業株式会社、和光純薬工業株式会社、およびシグマ−アルドリッチジャパン株式会社から購入して、さらなる精製を行わずに用いた。
ＮＭＲスペクトルは、１Ｈ用には４００ＭＨｚで、１３ＮＭＲ用には１００．４ＭＨｚで、テトラメチルシランを内部標準として用い、ＪＥＯＬ ＪＮＭ−ＡＬ４００装置（日本電子株式会社）で測定した。質量スペクトル（ＥＩ）は、ＣＢＰ１−Ｍ２５−０２５カラムを備えたＳｈｉｍａｚｕ ＧＣＭＳ−ＱＰ２０００（株式会社島津製作所）で電子衝撃モード（７０ｅＶ）で操作して測定した。高分解能質量分析（ＨＲＭＳ）は、ＪＥＯＬ ＪＭＳ−ＤＸ３０３（日本電子株式会社）測定した。ＥＳＩ−ＴＯＦ ＭＳは、Ｗａｔｅｒｓ ＬＣＴ−Ｐｒｅｍｉｅｒ ＸＥ（日本ウォーターズ株式会社）で測定した。蛍光スペクトルは、日立分光蛍光光度計Ｆ−４５００（株式会社日立製作所）を用いて測定した。スリット幅は励起および放射の両方について２．５ｎｍであった。光電子増倍管電圧は７００Ｖであった。蛍光測定前にサンプルはＤＭＳＯ（生化学用グレード、和光純薬工業株式会社）に溶解させた。シリカゲルカラムクロマトグラフィーは、ＢＷ−３００（富士シリシア化学株式会社）を用いて行った。蛍光イメージングは、ＡＥ−６９３５Ｂ ＶＩＳＩＲＡＹＳ−Ｂを用いて視覚化した。
化合物ＦＣＴＰの製造
下記化合物ＦＣＴＰを下記スキーム４に従い製造した。
スキーム４において：（ａ）マロン酸ジエチル、ピペリジン／ＥｔＯＨ、（ｂ）ＭＯＭＣｌ、ＤＩＥＡ／ＤＭＦ、（ｃ）ＮＢＳ、ＡＩＢＮ／ＣＣｌ４、（ｄ）１． ２−［２−（２−アジドエトキシ）エトキシ］エタノール、ＮａＨ／ＤＭＦ；２． ２Ｎ ＮａＯＨ水溶液；３． ＴＦＡ、（ｅ） チオフェノール、ＷＳＣＤ・ＨＣｌ、ＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ／ＤＭＦ、（ｆ） ６−カルボキシフルオレセイン−プロパラギルアミド、ＣｕＳＯ４、アスコルビン酸ナトリウム／ＤＭＦ／Ｈ２Ｏ（４／１）。
７−ヒドロキシ−５−メチルクマリン−３−カルボン酸エチルエステル（１）の製造
２，４−ジヒドロキシ−６−メチルベンズアルデヒド（２．０ｇ）、マロン酸ジエチル（２．２ｍｌ，１４．４ｍｍｏｌ）およびピペリジン（０．３５ｍｌ）をエタノール（２０ｍｌ）に溶解させ、１００℃で２３時間攪拌した。混合物を冷却後、生じた結晶をろ過して単離し、冷エタノール（−２０℃）で洗浄して標題化合物を得た（２．０２ｇ，収率６２％）。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 1.41 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 2.54 (s, 3H), 4.41 (q, J =7.2 Hz, 2H), 6.71 (d, J =7.2 Hz, 1H) 6.76 (d, 1H), 8.71 (s, 1H);
13C-NMR(100 MHz, CDCl3): δ 14.1, 17.9, 60.8, 99.9, 109.3, 110.9, 115.2, 140.6, 146.0, 156.4, 157.9, 163.3, 164.2;
HRMS(EI+) : 計算値248.06、測定値248.06。
７−（メトキシメトキシ）−５−メチルクマリン−３−カルボン酸エチルエステル（２）の製造
７−ヒドロキシ−５−メチルクマリン−３−カルボン酸エチルエステル（１）（０．２０ｇ，０．７ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（０．４０ｍｌ，１．８ｍｍｏｌ）およびクロロメチルメチルエーテル（０．０１５ｍｌ，１．８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ中に溶解させ、０℃で２時間攪拌した。溶媒を混合物から除去した後、得られた残渣を１０％クエン酸水溶液（３０ｍＬ）に溶解させ、酢酸エチルで抽出した。得られた有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、溶媒を減圧留去して標題化合物を得た（０．１８６ｍｇ，収率７９％）。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3); δ 1.41 (t, J = 7.2 Hz, 3H) 2.55 (s, 1H) 3.49 (s, 3H) 4.42 (q, J =7.2 Hz, 2H) 5.23 (s, 2H) 6.82 (d, J =6.0 Hz, 1H) 6.85 (d, J =6.0 Hz,1H) 8.69 (s, 1H) ;
13C-NMR(100 MHz, CDCl3): δ 14.3, 18.5, 56.5, 61.7, 94.2, 101.2, 111.7, 113.8, 115.3, 139.8, 145.9, 157.1, 157.9, 162.1, 163.8;
HRMS(EI+) : 計算値292.09, 測定値 292.09。
５−ブロモメチル−７−（メトキシメトキシ）クマリン−３−カルボン酸エチルエステル（３）の製造
７−（メトキシメトキシ）−５−メチルクマリン−３−カルボン酸エチルエステル（２）（０．５ｇ，１．３ｍｍｏｌ）、ＮＢＳ（０．３６５ｇ，２．１ｍｍｏｌ）およびＡＩＢＮ（０．０４ｇ，０．２４ｍｍｏｌ）をＣＣｌ４（１５ｍｌ）に溶解させ、９５度で７時間攪拌した。溶媒を混合物から除去した後、得られた残渣をジクロロメタン／酢酸エチル（９７／３）で溶出してシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、標題化合物を得た（０．３２７ｇ，収率５２％）。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3); δ 1.42 (t, J = 7.2 Hz, 3H) 3. 50 (s, 3H) 4.42 (q, J =7.2 Hz, 2H) 4.65 (s, 1H) 5.27 (s, 2H) 6.98 (d, J =6.0 Hz, 1H) 7.01 (d, J =6.0 Hz,1H) 8.77 (s, 1H);
13C-NMR(100 MHz, CDCl3): δ 14.3, 27.9, 56.7, 62.0, 94.5, 103.7, 110.7, 114.8, 115.7, 138.1, 144.5, 156.4, 157.9, 161.7, 163.3;
HRMS(EI+) : 計算値 370.01, 測定値 370.00。
５−（（２−（２−（２−アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）メチル）−７−ヒドロキシクマリン−３−カルボン酸（４）の製造
２−［２−（２−アジドエトキシ）エトキシ］エタノール（０．２３３ｇ，１．３ｍｍｏｌ）および 水素化ナトリウム（０．０３８ｇ，１．６ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５ｍｌ）中に溶解させ、室温で１５分間攪拌した。５−ブロモメチル−７−（メトキシメトキシ）クマリン−３−カルボン酸エチルエステル（３）をその混合物へ加え、得られた混合物を室温で１．５時間攪拌した。その後、ＮａＯＨ水溶液（２Ｎ、３ｍｌ）をその混合物へ添加した。２０分後、その混合物を飽和クエン酸水溶液で中和し、ジクロロメタンで中和した。溶媒を除去した後、得られた残渣をＴＦＡ（１０ｍｌ）中に溶解させ、室温で１時間攪拌した。溶媒を除去した後、０．１％ギ酸を含有するＨ２Ｏ／アセトニトリルで溶出する逆相ＨＰＬＣで得られた残渣を精製し、標題化合物を得た（２１ｍｇ，収率８％）。
1H-NMR(400 MHz, CDCl3): δ 3.21 (s, 2H) 3.53-3.61 (m, 10H) 6.61 (s,1H) 6.82 (s,1H) 8.86 (s,1H);
MS(ESI+) : 計算値 394.35, 測定値 394.11。
化合物CATPの製造
５−（（２−（２−（２−アジドエトキシ）エトキシ）エトキシ）メチル）−７−ヒドロキシクマリン−３−カルボン酸（４）（１５．５ｍｇ，０．０３９ｍｍｏｌ）、ＷＳＣＤ・ＨＣｌ（９．６ｍｇ，０．０４７ｍｍｏｌ）およびＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（７．３ｍｇ，０．０４７ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解させ、室温で１時間攪拌した。その後、チオフェノール（０．００３９ｍｌ，０．０３９ｍｍｏｌ）をその混合物に添加し、１時間攪拌した。溶媒を除去した後、得られた残渣をジクロロメタン／メタノール（９８／２）で溶出してシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、標題化合物を得た（１７ｍｇ，８９％）。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.37 (t, J = 4.8 Hz, 2H) 3.60-3.75 (m, 10H) 4.73 (s, 2H) 6.71 (d, J =2.0 Hz, 1H) 7.01 (d, J =2.0 Hz, 1H) 7.46 (m, 5H) 8.68 (s, 1H);
13C-NMR(100 MHz, CDCl3): δ 50.5, 69.6, 69.8, 70.1, 70.2, 70.6, 77.0, 70.6, 102.4, 109.6, 114.5, 117.6, 128.3, 129.1, 129.5, 134.9, 140.5, 158.1, 159.2, 163.4, 187.2;
HRMS (FAB+) 計算値 486.14, 測定値 486.13。
化合物FCTPの製造
化合物ＣＡＴＰ（３２ｍｇ，０．０６８ｍｍｏｌ）、６−カルボキシフルオレセイン−プロパルギルアミド（２８ｍｇ，０．０６８ｍｍｏｌ）、ＣｕＳＯ４（８．５ｍｇ，０．０３４ｍｍｏｌ）およびアスコルビン酸ナトリウム（１３．３ｍｇ，０．０６８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ／Ｈ２Ｏ（４／１）中に溶解させ、室温で１時間攪拌した。溶媒を除去した後、０．１％ギ酸を含有するＨ２Ｏ／アセトニトリルで溶出する逆相ＨＰＬＣで得られた残渣を精製し、標題化合物を得た（１０ｍｇ，収率１６％）。
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 3.35-4.35 (m, 8H) 3.70 (t, J =4.8, 2H) 4.37-4.42 (m, 4H) 4.69 (s, 2H) 6.53-6.69 (m, 7H) 6.80 (s, 1H) 7.46 (s, 5H) 7.71 (s, 1H) 7.86 (s, 1H) 8.05 (d, 1H) 8.18 (d, 1H) 8.66 (s, 1H) ;
13C-NMR(100 MHz, DMSO-d6): δ 34.9, 49.2, 68.6, 69.2, 69.3, 69.4, 69.5, 69.6, 69.7, 83.4, 101.7, 102.2, 108.3, 108.4, 109.1, 112.7, 115.8, 115.9, 122.3, 122.4, 124.8, 128.3, 128.4, 129.1, 129.2, 129.3, 129.4, 129.5, 134.8, 140.3, 140.9, 144.2, 151.8, 152.7, 158.4, 159.6, 164.4, 168.0, 185.3;
HRMS (FAB+) 計算値 899.22, 測定値 899.23。
［ＰＹＰのクローニング］
プラスミド（ＰＹＰのＨｉｓタグ融合タンパク質のＤＮＡをコード）を鋳型として、下記に示すプライマーを用いてＰＣＲ（PrimeSTAR HS DNA Polymerase, タカラバイオ社)によってＨｉｓ−ＰＹＰのＤＮＡを増幅した。前記プラスミドは、アムステルダム大学のK. J. Hellingwerf教授から提供を受けた。前記ＰＹＰは、Ectohiodospira halophila（Halorhodospira halophila）由来である。ＰＣＲ断片（インサート）は、２．０％アガロースゲルによる分離後、キット(QIA quick Gel Extraction kit, QIAGEN)を用いて抽出した。大腸菌発現用ベクターであるｐＥＴ−２１ｂ（＋）とインサートをＨｉｎｄｌIIIとＮｄｅI（それぞれタカラバイオ社）で制限酵素処理し、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼを用いてｐＥＴ−２１ｂ（＋）にインサートを組み込み、ｐＥＴ−ＰＹＰを作成した。
［ＰＹＰの発現・精製］
ｐＥＴ−ＰＹＰを大腸菌（ＢＬ２１（ＤＥ３））に形質転換後、ＬＢ培地にて培養し、ＯＤ６００が０．６〜０．８Åになるまで３７℃で増殖させた。次に、ＩＰＴＧを終濃度１００μＭになるように加え、２０℃で一晩培養した。培養した大腸菌を集菌し、超音波破砕した後に可溶性画分を抽出した。可溶性画分のＰＹＰは、下記に示す緩衝液を用いて、ＱＩＡＧＥＮ社のプロトコールに従い、Ｎｉ−ＮＴＡカラム(Ni-NTAアガロース、QIAGEN社)により精製した。その後、トリス緩衝液(20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, pH 8.0)を移動相として、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー(SuperdexTM 75 10/300 GL, GEヘルスケア社)により最終精製した。
Ｎｉ−ＮＴＡカラムの条件：
結合液：リン酸緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）
洗浄液：リン酸緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）
溶出液：リン酸緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）。
［ＰＹＰのエンテロキナーゼ処理］
ＨｉｓタグとＰＹＰの間には、プロテアーゼであるエンテロキナーゼにより切断される配列が組み込まれている。Ｈｉｓタグを除去するために、精製したＰＹＰにエンテロキナーゼ(Recombinant Enterokinase, Novagen社)を加え、室温で18時間静置した。静置後、Ｎｉ−ＮＴＡカラム（Ｎｉ−ＮＴＡアガロース、ＱＩＡＧＥＮ社）に試料を添加しＨｉｓタグ部位を吸着させることにより、切断後のＰＹＰを精製した。Ｈｉｓタグ部位を除去した試料をベンズアミジンカラム(HiTrap Benzamidine FF, GEヘルスケア)に添加し、プロテアーゼを除去した。精製した試料は限外濾過(VIVASPIN 500, 5000 MWCO PES, sartorius stedim社)によりトリス緩衝液(20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, pH 8.0)に置換した。
［ＰＹＰとＦＣＴＰの反応］
トリス緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ（ｐＨ８．０））中、５μＭのＰＹＰと１２．５μＭの化合物ＦＣＴＰを３７℃で２４時間反応させた。反応終了後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（２０％アクリルアミド分離ゲル）により結果を解析した。その結果得られたＣＢＢ染色画像を図１（ａ）に、蛍光画像を図１（ｂ）に示す。図１（ａ）から、ＣＢＢ染色画像では、化合物ＦＣＴＰの添加に伴い移動度の遅いバンドが確認され、図１（ｂ）から蛍光画像においても、蛍光が確認された。これらのことから、化合物ＦＣＴＰによりＰＹＰをラベル化できることが確認された。また、ＤＴＴ（１００ｍＭ）の添加により、移動度の遅いバンドが減少し、蛍光強度も弱くなっていることから、ＰＹＰと化合物ＣＡＴＰのチオエステル結合が、大過剰のＤＴＴにより加水分解されたことが確認できた。
［細胞溶解液中でのＰＹＰと化合物ＦＣＴＰの反応］
トリス緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ（ｐＨ８．０））に溶かしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞溶解液において、５μＭのＰＹＰと５０μＭの化合物ＦＣＴＰを１０ｍＭ ＭＥＳＮａ存在もしくは非存在下、３７℃で３０分間反応させた。反応終了後ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（２０％アクリルアミド分離ゲル）により解析した。その結果得られたＣＢＢ染色画像を図２（ａ）に、蛍光画像を図２（ｂ）に示す。図２（ａ）および図２（ｂ）に示すように、化合物ＦＣＴＰの添加に伴い、ＣＢＢ染色画像により確認されるＰＹＰのバンドの付近に蛍光が確認された。また、高分子量の領域にもう一つの蛍光バンドが確認された。一方、チオール化合物の一種であるＭＥＳＮａ（１０ｍＭ）を加えることによって、高分子量側の蛍光バンドが消失した。若干量の遊離のチオールを添加することによって、細胞溶解液中において、特異的に標識できることが確認された。
［ＦＣＴＰの蛍光特性］
トリス緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＴＣＥＰ（ｐＨ８．０））、ＰＹＰに結合した化合物ＦＣＴＰの蛍光特性について検討するため、蛍光、励起スペクトルを３７℃で測定した。５μＭのＰＹＰ存在下における８μＭの化合物ＦＣＴＰの経時蛍光スペクトルを図３（ａ）に、５μＭのＰＹＰ存在下における８μＭの化合物ＦＣＴＰの経時励起スペクトルを図３（ｂ）に、８μＭの化合物ＦＣＴＰの蛍光スペクトル（励起５００ｎｍ）を図３（ｃ）に示す。
図３（ｃ）に示すように、化合物ＦＣＴＰ単独では、蛍光強度は極めて弱く、時間経過とともに蛍光スペクトルの変化は確認されなかった。一方、図３（ａ）および図３（ｂ）に示すように、ＰＹＰ存在下において化合物ＦＣＴＰは、時間とともに蛍光強度が上昇し、蛍光・励起スペクトルともに変化が確認された。これらの結果から、化合物ＦＣＴＰはＰＹＰに結合するまでは、蛍光強度が弱く、結合とともに大きく蛍光強度が上昇することが確認された。
［培養細胞におけるＦＣＴＰによるラベル化反応］
ＰＹＰを細胞表面に発現させるために、血小板由来成長因子受容体（Platelet-derived growth factor receptor: PDGFR)の膜貫通ドメインとPYPを融合させた遺伝子ＰＹＰ−ＴＭを哺乳類発現ベクターであるｐｃＤＮＡ３．１のマルチクローニングサイトに導入したプラスミドを作成した。このプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にlipofectamine2000を用いて導入した。プラスミド導入後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を３７℃で３６時間静置した後に、ＰＢＳ（リン酸緩衝液）にて洗浄し、ＦＣＴＰ（２０μＭ）を含む培地を添加し、３０分静置した。その後、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を含む培地に交換し、蛍光顕微鏡を用いて細胞を観測した。蛍光顕微鏡の励起波長を４８８ｎｍとし、５１０〜５５０ｎｍの蛍光フィルターを用いて細胞を観測した。得られた顕微鏡写真を図４に示す。
［培養細胞におけるＣＡＴＰによるラベル化反応］
マルトース結合タンパク質（Maltose binding protein: MBP) とＰＹＰを融合させた遺伝子ＭＢＰ−ＰＹＰを哺乳類発現ベクターであるｐｃＤＮＡ３．１のマルチクローニングサイトに導入したプラスミドを作成した。また、ＰＹＰを細胞表面に発現させるために、血小板由来成長因子受容体（Platelet-derived growth factor receptor：ＰＤＧＦＲ）の膜貫通ドメインとＰＹＰを融合させた遺伝子ＰＹＰ−ＴＭを哺乳類発現ベクターであるｐｃＤＮＡ３．１のマルチクローニングサイトに導入したプラスミドを作成した。これらのプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を用いて導入した。プラスミド導入後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を３７℃で３６時間静置した後に、ＰＢＳ（リン酸緩衝液）にて洗浄し、ＣＡＴＰ（５μＭ）を含む培地を添加し、３０分静置した。その後、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を含む培地に交換し、蛍光顕微鏡を用いて細胞を観測した。蛍光顕微鏡の励起波長を４３６ｎｍとし、４７０〜４９５ｎｍの蛍光フィルターを用いて細胞を観測した。反応の手順を図５に、得られた蛍光顕微鏡写真を図６に示す。
図４および図６に示すように、ＰＹＰ−ＴＭが発現した細胞において、ＦＣＴＰおよびＣＡＴＰの両方による蛍光ラベルが観察された。一方、ＰＹＰ−ＴＭが発現していない細胞においては、ＦＣＴＰおよびＣＡＴＰの両方による蛍光ラベルは観察されていない。これらの結果から、ＰＹＰは細胞膜上においてＦＣＴＰおよびＣＡＴＰの両方によって特異的にラベルされることが確認できた。さらに、図６に示すように、ＭＢＰ−ＰＹＰが発現した細胞において、ＣＡＴＰによる蛍光ラベルが観察されたのに対し、ＭＢＰ−ＰＹＰが発現していない細胞においては、ＣＡＴＰによる蛍光ラベルは観察されなかった。この結果から、ＣＡＴＰが培養細胞内部においてＰＹＰを特異的にラベルすることが確認できた。
本発明のタンパク質を蛍光標識する方法は、細胞イメージング等に適用できる。
配列番号３０：フォワードプライマー
配列番号３１：リバースプライマー

Claims (7)

  1. タンパク質を蛍光標識する方法であって、
    標識対象タンパク質とＰＹＰ（Photoactive Yellow Protein）またはＰＹＰ由来タンパク質との融合タンパク質を得ること、および前記融合タンパク質と下記式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩とを反応させることにより、前記対象タンパク質を蛍光標識することを含み、
    前記式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩は、式（Ａ）中のクマリン骨格とＸ基とが分子内で会合し、その結果、Ｘ基由来の蛍光は抑制されており、
    前記式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩の式（Ａ）中のクマリン骨格が前記融合タンパク質に含まれるＰＹＰまたはＰＹＰ由来タンパク質と結合した場合、式（Ａ）中のクマリン骨格とＸ基との分子内会合が解消し、Ｘ基由来の蛍光が発せられうる、タンパク質の蛍光標識方法。
    前記式（Ｉ）中、
    Ｙが、硫黄原子であり、
    Ｒ1が、アリール基またはヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換されたアリール基であり、
    Ｒ2が、式（Ａ）で表わされる基であり、
    ここで、式（Ａ）において、
    Ｘが、式（ｉ）で表される基であり、
    Ｌが、式（ａ）で表わされる基であり、
    Ｒ3およびＲ4が、水素原子であり、
    Ｒ5が、ヒドロキシ基であり、
    ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５およびｎ６は、それぞれ独立して、０または１〜５の整数であり、
    Ｒ 11 は、水素原子または低級アルキル基である。
  2. 前記融合タンパク質における前記ＰＹＰまたはＰＹＰ由来タンパク質のアミノ酸配列が、
    １）配列表の配列番号１〜１７で表されるアミノ酸配列、
    ２）配列表の配列番号１〜１７で表されるアミノ酸配列において、第１番目から第２４、２５、２６、または２７番目までが欠失したアミノ酸配列、
    ３）上記１）または２）のアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列であって、前記融合タンパク質が前記式（Ａ）中のクマリン骨格と結合し、前記式（Ｉ）で表わされる化合物中の式（Ａ）中のクマリン骨格とＸ基との分子内会合が解消し、Ｘ基由来の蛍光が発せられうるアミノ酸配列、及び、
    ４）上記１）または２）のアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、前記融合タンパク質が前記式（Ａ）中のクマリン骨格と結合し、前記式（Ｉ）で表わされる化合物中の式（Ａ）中のクマリン骨格とＸ基との分子内会合が解消し、Ｘ基由来の蛍光が発せられうるアミノ酸配列、からなる群から選択されるアミノ酸配列である、請求項１記載のタンパク質の蛍光標識方法。
  3. 前記融合タンパク質を得ることが、前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを得ること、前記融合タンパク質を発現可能なプラスミド若しくはベクターを得ること、細胞内で前記融合タンパク質を発現させること、又は、発現した前記融合タンパク質を単離することを含む、請求項１又は２記載のタンパク質の蛍光標識方法。
  4. 式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩を含む請求項１〜３のいずれかの方法に用いるための組成物。
    前記式（Ｉ）中、
    Ｙが、硫黄原子であり、
    Ｒ1が、アリール基またはヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換されたアリール基であり、
    Ｒ2が、式（Ａ）で表わされる基であり、
    ここで、式（Ａ）において、
    Ｘが、式（ｉ）で表される基であり、
    Ｌが、式（ａ）で表わされる基であり、
    Ｒ3およびＲ4が、水素原子であり、
    Ｒ5が、ヒドロキシ基であり、
    ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５およびｎ６は、それぞれ独立して、０または１〜５の整数であり、
    Ｒ 11 は、水素原子または低級アルキル基である。
  5. 請求項４に記載の組成物と、プラスミドまたはベクターとを含むタンパク質の蛍光標識方法用キットであって、
    前記プラスミドまたはベクターは、標識対象タンパク質とＰＹＰまたはＰＹＰ由来タンパク質との融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをクローニングするため又は前記融合タンパク質を発現させるためのプラスミド又はベクターであり、
    前記プラスミド又はベクターは、
    １）配列表の配列番号１８〜２９で表される塩基配列、
    ２）配列表の配列番号１８〜２９で表される塩基配列において、前記塩基配列がコードするアミノ酸配列のＮ末端の第１番目から第２４、２５、２６、または２７番目までの欠失に相当する塩基配列が欠失した塩基配列、
    ３）上記１）または２）の塩基配列の１〜数個の塩基が欠失、置換、又は付加された塩基配列であって、前記融合タンパク質が式（Ａ）中のクマリン骨格と結合し、式（Ｉ）で表わされる化合物中の式（Ａ）中のクマリン骨格とＸ基との分子内会合が解消し、Ｘ基由来の蛍光が発せられうるアミノ酸配列をコードする塩基配列、及び、
    ４）上記１）または２）の塩基配列と７０％以上の相同性を有する塩基配列であって、前記融合タンパク質が下記式（Ａ）中のクマリン骨格と結合し、式（Ｉ）で表わされる化合物中の式（Ａ）中のクマリン骨格とＸ基との分子内会合が解消し、Ｘ基由来の蛍光が発せられうるアミノ酸配列をコードする塩基配列、からなる群から選択される塩基配列を含むプラスミドまたはベクターであるキット。
    前記式（Ｉ）中、
    Ｙが、硫黄原子であり、
    Ｒ 1 が、アリール基またはヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換されたアリール基であり、
    Ｒ 2 が、式（Ａ）で表わされる基であり、
    ここで、式（Ａ）において、
    Ｘが、式（ｉ）で表される基であり、
    Ｌが、式（ａ）で表わされる基であり、
    Ｒ 3 およびＲ 4 が、水素原子であり、
    Ｒ 5 が、ヒドロキシ基であり、
    ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５およびｎ６は、それぞれ独立して、０または１〜５の整数であり、
    Ｒ 11 は、水素原子または低級アルキル基である。
  6. 一般式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩。
    前記式（Ｉ）中、
    Ｙが、硫黄原子であり、
    Ｒ1が、アリール基またはヒドロキシ、ハロゲンおよび低級アルコキシからなる群から選択される１以上で置換されたアリール基であり、
    Ｒ2が、式（Ａ）で表わされる基であり、
    ここで、式（Ａ）において、
    Ｘが、式（ｉ）で表される基であり、
    Ｌが、式（ａ）で表わされる基であり、
    Ｒ3およびＲ4が、水素原子であり、
    Ｒ5が、ヒドロキシ基であり、
    ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５およびｎ６は、それぞれ独立して、０または１〜５の整数であり、
    Ｒ 11 は、水素原子または低級アルキル基である。
  7. 下記式で表される請求項６に記載の化合物またはその塩。
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