JP2015179081A - 酵素活性検出用蛍光プローブ - Google Patents

Abstract

【課題】ＰＩＭＴの活性を簡便、安全、かつ高感度に検出するための蛍光プローブ及びその検出方法を提供する。【解決手段】以下の式（１）で表されるＰＩＭＴ活性検出用蛍光プローブ：〔式中、Ａは、Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ｉｓｏＡｓｐ又はＡｓｐ−Ｍｅｔ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−ｉｓｏＡｓｐを含むアミノ酸配列であり；Ｘ及びＹは、一方が蛍光団であり、他方が消光団である。〕【選択図】なし

Description

本発明は、特定の酵素活性を検出する蛍光プローブ、より詳細にはＰＩＭＴ活性を検出する蛍光プローブ及びその検出方法に関する。

プロテインＬ−イソアスパラギン酸メチルトランスフェラーゼ（ＰＩＭＴ：Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ−ｉｓｏａｓｐａｒｔｙｌ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）は、タンパク質中のＬ−イソアスパラギン酸（ｉｓｏＡｓｐ）残基の側鎖のカルボキシル基を特異的に認識し、メチル化する酵素である。近年、この酵素は、がん、アルツハイマー、癲癇など様々な疾患との関連性が報告されており（例えば、非特許文献１、２）、重要なバイオマーカーや創薬標的となり得るため、その活性を検出することが研究課題の一つとされている。

しかしながら、従来におけるＰＩＭＴの活性検出方法としては、ＰＩＭＴの反応の際に生じるＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン（ＳＡＨ）の量を測定する方法、及び上記ｉｓｏＡｓｐ残基のメチル化に関与するＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＳＡＭ）のトリチウムラベル化物を補酵素として用いて放射活性を測定する方法に限られているのが現状である。これらの手法は、いずれもスループットが低いという欠点に加えて、前者では、夾雑物の影響により細胞や組織の抽出液を用いることが困難であること、後者の手法では、操作の煩雑さ、環境及び人体への悪影響などの問題を有していた。

Ｋｉｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４、６１３２、１９９７ Ｌｅｅら、Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．、３、９２７、２０１２

そこで、本発明は、ＰＩＭＴの活性を簡便、安全、かつ高感度に検出する方法を提供し、それにより、従来の手法では困難であったバイオマーカーとしての臨床診断、酵素阻害剤スクリーニング用試薬、細胞内の酵素機能の解明等への応用を可能とすることを課題とするものである。

本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った結果、特定のペプチド配列が、ＰＩＭＴ非存在下ではシステインプロテアーゼであるＣａｓｐａｓｅ−３に基質として認識されないが、ＰＩＭＴ存在下ではアミノ酸残基がメチル化されることによって基質として認識され、当該ペプチド配列結合が特異的に切断されることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、ＰＩＭＴ存在下でＣａｓｐａｓｅ−３によって切断され得る特定のペプチド配列の両端に蛍光団と消光団を連結させることによって、ＰＩＭＴの存在を蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）により検出することが可能な蛍光プローブ、及び当該蛍光プローブを用いたＰＩＭＴの検出方法を提供するものである。

より具体的には、本発明は、一態様において、
（１）以下の式（１）で表されるＰＩＭＴ（プロテインＬ−イソアスパラギン酸メチルトランスフェラーゼ）活性検出用蛍光プローブ：

〔式中、Ａは、Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ｉｓｏＡｓｐ又はＡｓｐ−Ｍｅｔ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−ｉｓｏＡｓｐを含むアミノ酸配列であり；Ｘ及びＹは、一方が蛍光団であり、他方が消光団である。〕；
（２）前記蛍光団が、フルオレセインを含む基であり、前記消光団がアゾベンゼンを含む基である、上記（１）に記載の蛍光プローブ；
（３）前記蛍光団が、５−アミノフルオレセインを含む基であり、前記消光団が４−エチル（２−ヒドロキシエチル）アミノ−４’−ニトロアゾベンゼンを含む基である、上記（１）に記載の蛍光プローブ；
（４）ＸとＡ、及びＹとＡが、それぞれリンカーを介して結合しており、当該リンカーが置換基を有していてもよい炭素数８〜１２のアルキルまたは３〜５のアミノ酸よりなる配列である、上記（１）〜（３）のいずれか１に記載の蛍光プローブ；
（５）前記蛍光団とＡとのリンカーが、少なくとも１のチロシンまたはフェニルアラニンを含む、上記（４）に記載の蛍光プローブ；及び
（６）以下の群から選択される、上記（１）に記載の蛍光プローブ

を提供するものである。

本発明は、別の好ましい態様において、
（７）上記（１）〜（６）のいずれか１に記載の蛍光プローブを用いてＰＩＭＴ活性を検出する方法であって、
ｉ）前記蛍光プローブとＰＩＭＴの接触によって、前記アミノ酸配列ＡにおけるｉｓｏＡｓｐ残基のカルボキシル基がメチル化される工程、
ｉｉ）当該メチル化された蛍光プローブにＣａｓｐａｓｅ−３を添加し、前記アミノ酸配列Ａを切断する工程、及び
ｉｉｉ）前記切断された蛍光プローブの蛍光団から生じる蛍光応答を観測することによってＰＩＭＴの存在を検出する工程、
を含むことを特徴とする、該方法；及び
（８）前記工程ｉｉｉ）において、ＰＩＭＴ活性に基づく蛍光応答を用いてＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＳＡＭ）の存在を検出する、上記（７）に記載の方法
を提供するものである。

本発明は、さらに別の好ましい態様において、
（９）上記（１）〜（６）のいずれか１に記載の蛍光プローブを含む、ＰＩＭＴ活性又はＳＡＭの検出用キット；及び
（１０）Ｃａｓｐａｓｅ−３をさらに含む、上記（９）に記載のキット
を提供するものである。

本発明によれば、既存のＰＩＭＴ検出手法、特にＳＡＭの放射活性を用いる検出法と比べて、簡便、安全かつ高感度にＰＩＭＴを検出することができる。これにより、ＰＩＭＴが関連するがん、アルツハイマー、癲癇などの疾患に対するバイオマーカー及び治療標的となり得るため、臨床診断や酵素阻害剤スクリーニング用試薬、細胞内の酵素機能解明などへの応用が期待できる。さらに、ＳＡＭの存在の有無をＰＩＭＴによる蛍光応答として認識することで、生体内で重要な機能を担っているＳＡＭ濃度の検出等にも本発明の蛍光プローブを応用することが可能である。

図１は、本発明の蛍光プローブによるＰＩＭＴの検出機構の模式図である。 図２は、本発明の蛍光プローブ１についてＰＩＭＴ存在下及び非存在下における蛍光強度変化を示すグラフである。 図３は、本発明の蛍光プローブ１〜５についてＰＩＭＴ存在下及び非存在下における蛍光強度変化の時間依存を示すグラフである。 図４は、ＬＣ−ＭＳの結果を示すグラフである。 図５は、本発明の蛍光プローブにおける反応ダイアグラムを示す図である。 図６は、ＰＩＭＴ存在下及び非存在下におけるＳＡＨによる蛍光強度変化を示すグラフである。 図７は、本発明の蛍光プローブ３について種々のＳＡＭ濃度におけるＰＩＭＴ存在下での蛍光強度変化を示すグラフである。

以下、本発明の実施形態について説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。

１．定義
本明細書中において、「アルキル」は直鎖状、分枝鎖状、環状、又はそれらの組み合わせからなる脂肪族炭化水素基のいずれであってもよい。アルキル基の炭素数は特に限定されないが、例えば炭素数１〜２０個（Ｃ_１〜２０）である。炭素数を指定した場合は、その数の範囲の炭素数を有する「アルキル」を意味する。例えば、Ｃ_１〜８アルキルには、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ｎｅｏ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル等が含まれる。本明細書において、アルキル基は任意の置換基を1個以上有していてもよい。該置換基としては、例えば、アルコキシ基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれであってもよい）、アミノ基、モノ若しくはジ置換アミノ基、置換シリル基、又はアシルなどを挙げることができるが、これらに限定されることはない。アルキル基が２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。アルキル部分を含む他の置換基（例えばアルコシ基、アリールアルキル基など）のアルキル部分についても同様である。

また、本明細書において、ある官能基について「置換基を有していてもよい」と定義されている場合には、置換基の種類、置換位置、及び置換基の個数は特に限定されず、２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。置換基としては、例えば、アルキル基、アルコキシ基、水酸基、カルボキシル基、ハロゲン原子、スルホ基、アミノ基、アルコキシカルボニル基、オキソ基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。これらの置換基にはさらに置換基が存在していてもよい。このような例として、例えば、ハロゲン化アルキル基、ジアルキルアミノ基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。

本明細書において、「アミノ酸」は、アミノ基とカルボキシ基の両方を有する化合物であれば任意の化合物を用いることができ、天然及非天然のものを含む。中性アミノ酸、塩基性アミノ酸、又は酸性アミノ酸のいずれであってもよく、それ自体が神経伝達物質などの伝達物質として機能するアミノ酸のほか、生理活性ペプチド（ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチドのほか、オリゴペプチドを含む）やタンパク質などのポリペプチド化合物の構成成分であるアミノ酸を用いることができ、例えばαアミノ酸、βアミノ酸、γアミノ酸などであってもよい。アミノ酸としては、光学活性アミノ酸を用いることが好ましい。例えば、αアミノ酸についてはD-又はL-アミノ酸のいずれを用いてもよいが、生体において機能する光学活性アミノ酸を選択することが好ましい場合がある。

本明細書において、「アミノ酸残基」とは、アミノ酸のカルボキシ基から水酸基を除去した残りの部分構造と等しく、いわゆるＮ−末端残基と同様の構造を有するものを意味する。ただし、これは、Ａが複数のアミノ酸残基が連結して構成される場合を除外するものではなく、かかる場合はＣ−末端のアミノ酸残基が、上記のようにアミノ酸のカルボキシ基から水酸基を除去し、且つアミノ基から水素原子を除去した部分構造となれば良く、中間及びＮ−末端のアミノ酸残基は通常のペプチド鎖と同様に連結することができる。

２．ＰＩＭＴ活性検出用蛍光プローブ
本発明のＰＩＭＴ活性検出用蛍光プローブは、一態様において、以下の一般式（１）で表される構造を有する化合物である。

式中、Ａは、Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ｉｓｏＡｓｐを含むアミノ酸配列又はＡｓｐ−Ｍｅｔ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−ｉｓｏＡｓｐなどであり；Ｘ及びＹは、一方が蛍光団であり、他方が消光団である。

かかる構造を有することにより、本発明の蛍光プローブは、酵素の基質認識の違いを用いてタンパク質の翻訳後修飾を検出する仕組み（いわゆるＣｏｕｐｌｅｄ Ａｓｓａｙ）と蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）による蛍光制御原理を利用して、試料中のプロテインＬ−イソアスパラギン酸メチルトランスフェラーゼ（ＰＩＭＴ：Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ−ｉｓｏａｓｐａｒｔｙｌ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）の活性を高感度で検出することができる。その機構を図１に示す。

具体的には、当初、蛍光プローブ単体では、分子内に消光団が存在するため蛍光団は発光しないが、図１の左側のスキームに示すように、ここに、ＰＩＭＴが存在すると、蛍光プローブ中のＡｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ｉｓｏＡｓｐ又はＡｓｐ−Ｍｅｔ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−ｉｓｏＡｓｐというアミノ酸配列ＡにおけるｉｓｏＡｓｐ残基のカルボキシル基がＰＩＭＴによってメチル化されることによって、システインプロテアーゼであるＣａｓｐａｓｅ−３に基質として認識され代謝される。これにより、当該アミノ酸配列が切断されると、消光団が分子内から除去されるため著しい蛍光上昇が生じる。そして、当該蛍光応答を観測することによってＰＩＭＴの存在を検出することができるのである。ここで、アミノ酸配列Ａは、ＰＩＭＴによるメチル化によってＣａｓｐａｓｅ−３に基質として認識されるものであれば、上記以外の配列を用いることもできる。

一方、図１の右側のスキームに示すように、ＰＩＭＴが存在しない場合には、上記のようにｉｓｏＡｓｐ残基がメチル化されないため、Ｃａｓｐａｓｅ−３の基質として認識されず、結果として、アミノ酸配列の切断が起こらないので、蛍光の上昇は見られない。従って、上述のように、Ｃａｓｐａｓｅ−３による基質認識を利用することによって、ＰＩＭＴ活性の存在を蛍光応答として高感度に検出できるのである。ここで、ＰＩＭＴによるｉｓｏＡｓｐ残基のメチル化は、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＳＡＭ）を補酵素として量論的に進行するものであるため、本発明の蛍光プローブとの上記反応による蛍光応答を媒介として、本発明の蛍光プローブを用いてＳＡＭを検出することもできる。

式（１）において、Ｘ及びＹは、いずれか一方が蛍光団であり、他方が消光団であればよく、すなわち、Ｘが蛍光団である場合も、Ｙが蛍光団である場合も適宜選択することができる。また、当該蛍光団と消光団の組合せは、蛍光プローブ分子内に両方が存在する場合には発光せず、アミノ酸配列の切断によって蛍光が上昇するＦＲＥＴの作用を発揮するものであれば、当該技術分野において公知の組合せを用いることができる。例えば、蛍光団としては、フルオレセイン、クマリン、アントラセン、アミノベンジルを含む基であるものが挙げられ、消光団としては、例えば、アゾベンゼン、ジニトロフェノールを含む基を挙げることができる。好ましくは、前記蛍光団が、フルオレセインを含む基であり、前記消光団がアゾベンゼンを含む基である。より好ましくは、前記蛍光団が、５−アミノフルオレセインを含む基であり、前記消光団が４−エチル（２−ヒドロキシエチル）アミノ−４’−ニトロアゾベンゼンを含む基である。ただし、これらに限定されるものではない。

上記蛍光団と消光団は、それぞれリンカーを介してアミノ酸配列Ａに結合することができる。好ましくは、当該リンカーが置換基を有していてもよい炭素数８〜１２のアルキルまたは３〜５のアミノ酸よりなる配列である。これに限定されるものではないが、消光団とＡとの間のリンカーは、置換基を有していてもよい炭素数８〜１０のアルキル、または３つのアミノ酸残基よりなる配列であることが好ましい。同様に、蛍光団とＡとの間のリンカーは、置換基を有していてもよい炭素数１０〜１２のアルキル、または４つのアミノ酸残基よりなる配列であることが好ましい。蛍光団とＡとの間のリンカーがアミノ酸配列である場合、当該リンカーはかさ高いアミノ酸残基を含むことが好ましく、例えば、少なくとも１のチロシンまたはフェニルアラニンを含むこと好ましい。代表的な例としては、蛍光団とＡとの間のリンカーは、−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−であり、消光団とＡとの間のリンカーは、−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−である。

また、当該リンカーと蛍光団又は消光団との結合は、共有結合であることが好ましく、当該共有結合は、エステル化、アミド化、エーテル化、ジスルフィド化などにより行うことができる。この共有結合の形成は、アミノ酸配列作成の前後のいずれで行ってもよい。

式（１）で表される本発明のＰＩＭＴ活性検出用蛍光プローブの代表的な例としては、以下の構造を有する化合物が挙げられる。

当該化合物において、、Ｃａｓｐａｓｅ−３によって認識されて切断される部位（Ｃａｓｐａｓｅ−３認識配列）、消光団、及び蛍光団は、以下のように特定することができる。

また、式（１）で表される本発明のＰＩＭＴ活性検出用蛍光プローブのその他の具体例としては、以下の構造を有する化合物群を挙げることができる。

上記式（１）で表される化合物は、塩として存在する場合がある。そのような塩としては、塩基付加塩、酸付加塩、アミノ酸塩などを挙げることができる。塩基付加塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩、ピペリジン塩、モルホリン塩などの有機アミン塩を挙げることができ、酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩などの有機酸塩を挙げることができる。アミノ酸塩としてはグリシン塩などを例示することができる。もっとも、本発明の化合物の塩はこれらに限定されることはない。

式（１）で表される化合物は、置換基の種類に応じて１個または２個以上の不斉炭素を有する場合があり、光学異性体又はジアステレオ異性体などの立体異性体が存在する場合がある。純粋な形態の立体異性体、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などはいずれも本発明の範囲に包含される。

式（１）で表される化合物又はその塩は、水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、これらの物質はいずれも本発明の範囲に包含される。溶媒和物を形成する溶媒の種類は特に限定されないが、例えば、エタノール、アセトン、イソプロパノールなどの溶媒を例示することができる。

上記の蛍光プローブは、必要に応じて試薬の調製に通常用いられる添加剤を配合して組成物として用いてもよい。例えば、生理的環境で用いるための添加剤として、溶解補助剤、ｐＨ調節剤、緩衝剤、等張化剤などの添加剤を用いることができ、これらの配合量は当業者に適宜選択可能である。これらの組成物は、粉末形態の混合物、凍結乾燥物、顆粒剤、錠剤、液剤など適宜の形態の組成物として提供され得る。

本明細書の実施例には、式（１）で表される本発明の化合物に包含される代表的化合物についての製造方法が具体的に示されているので、当業者は本明細書の開示を参照することにより、及び必要に応じて出発原料や試薬などを適宜選択することにより、式（１）に包含される任意の化合物を容易に製造することができる。その他、当該製造方法における反応温度や反応時間等の反応条件は、後述の実施例において代表的な例として詳細に記載するが、必ずしもそれらに限定されるわけではなく、当該技術分野における当業者であれば、有機合成における一般的な知識に基づいてそれぞれ適宜選択可能である。なお、式（１）で表される本発明の化合物におけるＡで表されるアミノ酸配列は、慣用されているペプチド合成法、遺伝子工学的な手法などによって製造することができる。

３．ＰＩＭＴ活性検出方法
本発明のＰＩＭＴ活性の検出方法は、
ｉ）上記の式（１）表されるＰＩＭＴ活性検出用蛍光プローブとＰＩＭＴの接触によって、前記アミノ酸配列ＡにおけるｉｓｏＡｓｐ残基のカルボキシル基がメチル化される工程、
ｉｉ）当該メチル化された蛍光プローブにＣａｓｐａｓｅ−３を添加し、前記アミノ酸配列Ａを切断する工程、及び
ｉｉｉ）前記切断された蛍光プローブの蛍光団から生じる蛍光応答を観測することによってＰＩＭＴの存在を検出する工程、
を含むことを特徴とするものである。

本明細書において「検出」という用語は、定量、定性など種々の目的の測定を含めて最も広義に解釈されるべきである。蛍光応答を観測する手段は、広い測定波長を有する蛍光光度計を用いることができるが、蛍光発光部位を２次元画像として表示可能な蛍光イメージング装置を用いることもできる。

本発明の方法によるＰＩＭＴの検出は、一般的には中性条件下に行うことができ、例えば、ｐＨ５．０〜９．０の範囲、好ましくはｐＨ６．０〜８．０の範囲、より好ましくはｐＨ６．８〜７．６の範囲で行うことができる。ｐＨを調整する手段としては、例えば、リン酸バッファー等の当該技術分野において周知の任意のｐＨ調節剤や緩衝液を用いることができる。

本発明の蛍光プローブの適用濃度は特に限定されないが、例えば０．１〜１，００μＭ程度の濃度の溶液を適用することができる。

また、一つの実施態様において、本発明のＰＩＭＴ検出方法によって、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＳＡＭ）を検出することも可能である。ＳＡＭは、メチルトランスフェラーゼであるＰＩＭＴの補酵素として働き、ＰＩＭＴによるアミノ酸配列ＡにおけるｉｓｏＡｓｐ残基のカルボキシル基のメチルに寄与する。ＳＡＭは、非常に代謝回転が速いため，ＰＩＭＴの酵素反応の進行はＳＡＭの濃度を反映する。従って、一定量のＰＩＭＴ存在下において、Ｃａｓｐａｓｅ−３との反応による本発明の蛍光プローブの蛍光応答をモニターすることによって、対象サンプル中のＳＡＭの存在量の変化に伴う蛍光応答変化からＳＡＭの存在を検出することができる。なお、ＳＡＭは、生体内のメチル化反応を制御する働きを担っており、前立腺がんやシュワン細胞の分化にも関与していると考えれているが、従来の定量法はスループットが低く、比較的長い測定時間を要するＬＣ−ＭＳ法が用いられているため、かかるＳＡＭを検出或いは濃度を定量することは非常に有益である。

より具体的には、上記工程ｉ）において、用いるＰＩＭＴを所定量としておき、前記工程ｉｉｉ）において、ＰＩＭＴ活性に基づく蛍光応答の変化を観測することでＳＡＭの存在を検出することが好ましい。

本発明の蛍光プローブとしては、上記一般式（１）で表される化合物又はその塩をそのまま用いてもよいが、必要に応じて、試薬の調製に通常用いられる添加剤を配合して組成物として用いてもよい。例えば、生理的環境で試薬を用いるための添加剤として、溶解補助剤、ｐＨ調節剤、緩衝剤、等張化剤などの添加剤を用いることができ、これらの配合量は当業者に適宜選択可能である。これらの組成物は、一般的には、粉末形態の混合物、凍結乾燥物、顆粒剤、錠剤、液剤など適宜の形態の組成物として提供されるが、使用時に注射用蒸留水や適宜の緩衝液に溶解して適用すればよい。

４．ＰＩＭＴ活性検出用キット
本発明のＰＩＭＴ検出方法においては、上記蛍光プローブを含むＰＩＭＴ検出用キットを用いることが好ましい。当該キットは、Ｃａｓｐａｓｅ−３をさらに含むことが好ましいが、必ずしも別個の独立した容器に格納されている必要はなく、これらが混合されない環境である限り、一体化した或いは連結した複数の格納領域を有する容器を用いることができる。

当該キットにおいて、通常、本発明の蛍光プローブ或いはＣａｓｐａｓｅ−３は溶液として調製されているが、例えば、粉末形態の混合物、凍結乾燥物、顆粒剤、錠剤、液剤など適宜の形態の組成物として提供され、使用時に注射用蒸留水や適宜の緩衝液に溶解して適用することもできる。

なお、上述のとおり、本発明のＰＩＭＴ検出方法によってＳＡＭを検出することができ、その場合には、本発明の蛍光プローブ及びＣａｓｐａｓｅ−３に加えて、所定量のＰＩＭＴを予め含むことが好ましい。

また、当該キットには、必要に応じてそれ以外の試薬等を適宜含んでいてもよい。例えば、添加剤として、溶解補助剤、ｐＨ調節剤、緩衝剤、等張化剤などの添加剤を用いることができ、これらの配合量は当業者に適宜選択可能である。

以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。

［実施例１］
１．プローブの合成
以下のスキーム１に従って、本発明のＰＩＭＴ活性検出用蛍光プローブである化合物６（蛍光プローブ１）を合成した。

化合物（１）の合成

ｄｉｓｐｅｒｓｅ ｒｅｄ−１ ８００ｍｇ（２．６ｍｍｏｌ）をＣＨ_２Ｃｌ_２ ８０ｍｌに溶解させ、ピリジン２ｍｌを添加した。０℃で攪拌しながら４−ｎｉｔｒｏ ｃｈｌｏｒｏｆｏｍａｔｅ ６１２ｍｇ（３．１ｍｍｏｌ、１．２ｅｑ．）を少しずつ加えた後、室温で２時間攪拌した。ＴＬＣプレート（シリカ；ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＭｅＯＨ＝１００／２）でｄｉｓｐｅｒｓｅ ｒｅｄ−１の消失を確認した後、反応液にＣＨ_２Ｃｌ_２を加え、１０％ＡｃＯＨ水溶液、ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、減圧下溶媒を留去した。得られた固体をカラムクロマトグラフィー（シリカ；ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＭｅＯＨ＝１００／２）で精製し、目的物（１）７９４ｍｇ（１．７ｍｍｏｌ、収率６５％）を得た。

化合物（２）の合成

５−ａｍｉｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ５００ｍｇ（１．４ｍｍｏｌ）、Ｃｓ_２ＣＯ_３ ４７０ｍｇ（１．４ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ．）をＤＭＦ１０ｍｌに溶解させ、０℃で攪拌しながら、ｐｉｖａｌｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ ６７０μｇ（３．６ｍｍｏｌ、２．５ｅｑ．）を滴下し、室温で２時間攪拌した。その後、ＡｃＯＥｔを加え、ＮＨ_４Ｃｌ水溶液、ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、減圧下で溶媒を留去した。得られた固体をカラムクロマトグラフィー（シリカ；ｎ−ｈｅｘａｎｅ／ＡｃＯＥｔ＝１／２）で精製し、目的物（２）６３３ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ、収率８５％）を得た。

化合物（３）の合成

化合物２ ６００ｍｇをＴＨＦ９ｍｌに溶解させ、１Ｎ ＮａＯＨ水溶液１．２ｍｌを添加し、０℃で攪拌しながらＦｍｏｃ−Ｃｌ ４５０ｍｇをＴＨＦ１ｍｌに溶解させたものを滴下した後、室温で１８時間攪拌した。その後、減圧下で溶媒を留去し、０．１Ｎ ＨＣｌ水溶液を加えて、溶液のｐＨを約２．０にし、ＡｃＯＥｔで抽出した後、ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、減圧下で溶媒を留去し、粗生成物（３）９２３ｍｇを得た。

化合物（４）の合成

化合物３の粗生成物９２３ｍｇをＴＦＡ１０ｍｌに溶解させ、６０℃にて１６時間攪拌した。その後、反応液にトルエンを加え、減圧下で溶媒を留去し、析出した固体をＡｃＯＥｔに溶解させ、２Ｎ ＮａＯＨ水溶液を添加することで溶液のｐＨを約１０．０にし、目的物を水相に移動させた。その後、２Ｎ ＨＣｌ水溶液を加えて、ｐＨを約２．０にした後、ＡｃＯＥｔで抽出し、ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、減圧下で溶媒を留去した。得られた固体をカラムクロマトグラフィー（シリカ；ｎ−ｈｅｘａｎｅ／ＡｃＯＥｔ＝１／２）で精製し、目的物（４）５９４ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ、収率９０％）を得た。

化合物（５）の合成

化合物４ ２２２ｍｇ（０．４ｍｍｏｌ、１．３ｅｑ．）を溶媒（ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＤＭＦ＝１／１）に溶かし、ＤＩＥＡ ２５２μｌ（１．５ｍｍｏｌ、５．０ｅｑ．）を加えたものに、２−ｃｈｌｏｒｏｔｒｉｔｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｒｅｓｉｎ １８０ｍｇ（０．３ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ．）を添加し、室温下にて１８時間振とうした。ｒｅｓｉｎをＣＨ_２Ｃｌ_２／ＭｅＯＨ／ＤＩＥＡ＝１７／２／１、ＣＨ_２Ｃｌ_２、ＤＭＦ、ＣＨ_２Ｃｌ_２の順で洗浄し、ＭＥＭ−Ｃｌ １２０μｌ（１．０ｍｍｏｌ、３．４ｅｑ．）、ＤＩＥＡ ２１６μｌ（１．２ｍｍｏｌ、４．１ｅｑ．）、ＤＭＦ２ｍｌを加え、１５分ｘ２回振とうし、ＤＭＦで洗浄した後、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ ２６７ｍｇ（０．９ｍｍｏｌ、３．０ｅｑ．）、ＨＡＴＵ ３４２ｍｇ（０．９ｍｍｏｌ、３．０ｅｑ．）、ＤＩＥＡ ３００μｌ（１．８ｍｍｏｌ、６．０ｅｑ．）を加え、２時間振とうそ、ＤＭＦ、ＣＨ_２Ｃｌ_２で洗浄した。その後は、４０％ピペリジンのＤＭＦ溶液を加え、１５分ｘ２回振とうし、ＤＭＦで洗浄した後、ｒｅｓｉｎ／各アミノ酸／ＨＡＴＵ／ＤＩＥＡ＝１／３／３／６となるように加え、４０分振とうし、ＤＭＦ、ＣＨ_２Ｃｌ_２で洗浄するという操作を繰り返し、最後に４０％ピペリジンのＤＭＦ溶液を加え、１５分ｘ２回振とうした。その後、ＴＦＡ／水／ＴＥＳ＝１００／１／１を加え、２時間振とうすることでｒｅｓｉｎからペプチドを切り出し、ＨＰＬＣ分取（Ａ／Ｂ＝７０／３０→Ａ／Ｂ＝１０／９０を３０分、Ａ：０．１Ｍ ＴＦＡ／水、Ｂ：０．１Ｍ ＴＦＡ／２０％水／８０％ＭｅＣＮ）によって精製を行い、目的物（５）８．６ｍｇ（０．００６ｍｍｏｌ、収率２％）を得た。

化合物（６）の合成

化合物５ ２．９ｍｇ（０．００２ｍｍｏｌ、１．０ｅｑ．）、ＤＲ１−ＮＰＣ ２．０ｍｇ（０．００４ｍｍｏｌ、２．０ｅｑ．）をＤＭＳＯ１ｍｌに溶解させ、ＤＩＥＡ ７．３μｌ（０．０４ｍｍｏｌ、２０ｅｑ．）を添加し、室温で２．５時間攪拌した。ＨＰＬＣ用Ａ、Ｂ液をそれぞれ２ｍｌずつ添加し、ＨＰＬＣ分取（Ａ／Ｂ＝７０／３０→Ａ／Ｂ＝１０／９０を３０分、Ａ：０．１Ｍ ＴＥＡＡ／水、Ｂ：０．１Ｍ ＴＥＡＡ／２０％水／８０％ＭｅＣＮ）によって精製を行い、目的物（６）０．８ｍｇ（０．０００５ｍｍｏｌ、収率２２％）を得た。

化合物６と同様の合成法を用いて、本発明のＰＩＭＴ活性検出用蛍光プローブである化合物７〜１０（蛍光プローブ２〜５）を合成した。

［実施例２］
２．ＰＩＭＴの蛍光検出アッセイ
表１に従い、ＰＩＭＴ（＋）の反応溶液とＰＩＭＴ（−）の反応溶液を作成し、３０℃で３時間インキュベーションした。その後、表２に従い、Ｐ（＋）Ｃ（＋）、Ｐ（−）Ｃ（＋）、Ｐ（＋）Ｃ（−）、Ｐ（−）Ｃ（−）の４種類の反応溶液を作成、３７℃で２時間インキュベーションした後、１０％ギ酸のメタノール溶液２０μｌを加え、反応を止め、プレートリーダーにて蛍光強度を測定した。蛍光プローブは、実施例１で合成した蛍光プローブ１（化合物６）を用いた。

その結果を図２に示す。Ｐ（＋）Ｃ（＋）とＰ（−）Ｃ（＋）の結果を比較すると、ＰＩＭＴ存在下では、非存在下に比べ蛍光強度が遥かに高くなった。また、Ｃａｓｐａｓｅ−３を添加していないＰ（＋）Ｃ（−）及びＰ（−）Ｃ（−）ではいずれも蛍光強度の上昇は観測されなかった。

同様に、実施例１で合成した蛍光プローブ２〜５（化合物７〜１０）についても、ＰＩＭＴ存在下及び非存在下における蛍光強度変化の時間依存を測定した結果を図３に示す。図３の結果から、いずれの蛍光プローブもＣａｓｐａｓｅ−３を添加することによって、ＰＩＭＴ存在下で蛍光強度の増大が観測された。なお、蛍光プローブ３において最も大きな蛍光強度変化が得られたが、これは、リンカー部位にＰＥＧを用い、剛直なアミド結合がなくなることでリンカー部位がより柔軟な構造となったために、Ｃａｓｐａｓｅ−３が蛍光プローブの認識部位にアクセスしやすくなったためであると考えられる。

これらの結果は、蛍光プローブ１〜５によって、ＰＩＭＴの存在を蛍光応答として検出できることを実証するものである。

［実施例３］
３．蛍光プローブの反応の解析
実施例２のＰＩＭＴの蛍光検出アッセイにおいて、分子レベルでどのような現象が起きているかを解析するため、蛍光プローブ１を含む４種のサンプルをＬＣ−ＭＳを用いて解析した。その結果を図４に示す。ＭＳ値と合わせて各ピークに由来する化合物を解析したところ、図５に示す化合物Ａ〜Ｊと同定できた。

ＰＩＭＴ非存在下であるとＰ（−）Ｃ（＋）及びとＰ（−）Ｃ（−）では、Ｃａｓｐａｓｅ−３による切断が起こっていなかった。Ｐ（＋）Ｃ（−）では、化合物Ｃの存在により、ＰＩＭＴによるメチル化に加え、さらにスクシンイミドの形成が起こっていることが判断できる。Ｐ（＋）Ｃ（＋）では、化合物Ｅが生成していることから、Ｃａｓｐａｓｅ−３によりアミノ酸配列Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐの右隣のアミド結合が切断されていることが分かる。また、Ｐ（＋）Ｃ（＋）において化合物Ｃが存在せず、Ｐ（＋）Ｃ（−）において化合物Ｃが存在していることから、Ｃａｓｐａｓｅ−３による切断は、化合物Ｂだけでなく、化合物Ｃにおいても生じていると判断できる。さらに、Ｐ（＋）Ｃ（＋）において化合物Ｇの吸光ピークが、化合物Ｆ、Ｈ、Ｉよりも大きいことから、スクシンイミドの形成はＣａｓｐａｓｅ−３による切断の後も起こっていると考えられる。

［実施例４］
４．阻害剤としてＳＡＨを用いた場合の蛍光強度の測定
表３に従い、ＰＩＭＴ（＋）、ＰＩＭＴ（−）、ＰＩＭＴ（＋）ＳＡＨ（＋）の反応溶液を作成し、３０℃で３時間インキュベーションした。ここで、ＳＡＨは、Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステインである。その後、表４に従い、Ｐ（＋）Ｃ（＋）、Ｐ（−）Ｃ（＋）、Ｐ（＋）Ｃ（＋）ＳＡＨ（＋）、Ｐ（＋）Ｃ（−）、Ｐ（−）Ｃ（−）の５種類の反応溶液を作成、３７℃で２時間インキュベーションした後、１０％ギ酸のメタノール溶液２０μｌを加え、反応を止め、プレートリーダーにて蛍光強度を測定した。蛍光プローブは、実施例１で合成した蛍光プローブ１を用いた。

その結果を図６に示す。この結果、ＳＡＨの添加により、ＰＩＭＴの活性が阻害されることが分かった。これは、例えば大規模化合物ライブラリを用いたＰＩＭＴの阻害剤スクリーニング系に本系を利用することが可能であることを意味するものである。

５．ＳＡＭの蛍光検出アッセイ
蛍光プローブ３を用いて、ＰＩＭＴの一定量存在、種々のＳＡＭ濃度における蛍光強度変化を実施例２と同様に測定を行った。測定サンプルは、蛍光プローブ４が１μｍ、ＰＩＭＴが０．１５μｇ／ｍＬ、Ｃａｓｐａｓｅ−３が２５ｎｇ／ｍＬの２５ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー溶液（ｐＨ７．４、０．１％ ＣＨＡＰＳ、１０ｍＭ ＤＴＴ、０．２％ ＤＭＳＯ）を用い、ＳＡＭ濃度を０．３〜１．５μＭの範囲とした。得られた結果を図７に示す。

図７の結果から、ＳＡＭ濃度の増加に伴って定量的に蛍光強度の増大が観測された。一方、ＰＩＭＴ非存在下では、Ｃａｓｐａｓｅ−３を添加してもほとんど蛍光強度の変化は見られなかった。この結果は、ＰＩＭＴのメチル化を介した本発明の蛍光プローブの蛍光応答を用いてＳＡＭを定量的に検出できることを実証するものである。

Claims (10)

1. 以下の式（１）で表されるＰＩＭＴ（プロテインＬ−イソアスパラギン酸メチルトランスフェラーゼ）活性検出用蛍光プローブ：
   

   

   〔式中、Ａは、Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ｉｓｏＡｓｐ又はＡｓｐ−Ｍｅｔ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−ｉｓｏＡｓｐを含むアミノ酸配列であり；Ｘ及びＹは、一方が蛍光団であり、他方が消光団である。〕
2. 前記蛍光団が、フルオレセインを含む基であり、前記消光団がアゾベンゼンを含む基である、請求項１に記載の蛍光プローブ。
3. 前記蛍光団が、５−アミノフルオレセインを含む基であり、前記消光団が４−エチル（２−ヒドロキシエチル）アミノ−４’−ニトロアゾベンゼンを含む基である、請求項１に記載の蛍光プローブ。
4. ＸとＡ、及びＹとＡが、それぞれリンカーを介して結合しており、当該リンカーが置換基を有していてもよい炭素数８〜１２のアルキルまたは３〜５のアミノ酸よりなる配列である、請求項１〜３のいずれか１に記載の蛍光プローブ。
5. 前記蛍光団とＡとのリンカーが、少なくとも１のチロシンまたはフェニルアラニンを含む、請求項４に記載の蛍光プローブ。
6. 以下の群から選択される、請求項１に記載の蛍光プローブ。
   

   
7. 請求項１〜６のいずれか１に記載の蛍光プローブを用いてＰＩＭＴ活性を検出する方法であって、
   ｉ）前記蛍光プローブとＰＩＭＴの接触によって、前記アミノ酸配列ＡにおけるｉｓｏＡｓｐ残基のカルボキシル基がメチル化される工程、
   ｉｉ）当該メチル化された蛍光プローブにＣａｓｐａｓｅ−３を添加し、前記アミノ酸配列Ａを切断する工程、及び
   ｉｉｉ）前記切断された蛍光プローブの蛍光団から生じる蛍光応答を観測することによってＰＩＭＴの存在を検出する工程、
   を含むことを特徴とする、該方法。
8. 前記工程ｉｉｉ）において、ＰＩＭＴ活性に基づく蛍光応答を用いてＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＳＡＭ）の存在を検出する、請求項７に記載の方法。
9. 請求項１〜６のいずれか１に記載の蛍光プローブを含む、ＰＩＭＴ活性又はＳＡＭの検出用キット。
10. Ｃａｓｐａｓｅ−３をさらに含む、請求項９に記載のキット。

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