WO2021177050A1 - Ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ型ラマンプローブ - Google Patents
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Abstract
【解決課題】 標的酵素との反応前はラマンシグナルがｏｆｆであるが、標的酵素との反応によってラマンシグナルがｏｎになる、activatableな特性を有するラマンプローブを提供すること。 【解決手段】 以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩。
Description
本発明は、新規なActivatable型ラマンプローブに関する。より具体的には、本発明は、標的酵素との反応前はラマンシグナルがｏｆｆであるが、標的酵素との反応によってラマンシグナルがｏｎになる、activatableな特性を有するラマンプローブに関する。
細胞などの生体試料に光を照射すると、透過・吸収・散乱といった物理現象が生じる。この散乱光は大部分が入射光と同じ波長の光（レイリー散乱）であるが、ごく僅かに入射光よりも振動数が減少した（波長が長波長側にシフトした）光が含まれており、ストークスラマン散乱（ラマン散乱）と呼ばれている。
ラマン散乱における波長のシフト量（ラマンシフト値）は、光を散乱した分子の固有振動数に相当するため、ラマンスペクトルから試料に含まれる分子の種類やその状態などの情報を得ることができる。そのため、ラマン散乱を用いたイメージング法は、生体分子を無標識で観察する手法として注目されてきた。しかしながら、ラマン散乱光は極めて微弱であるため、(1)検出感度が低い、(2)長時間の観測時間（数十分から数時間ほど）が必要で時間分解能が低い、といった課題があり、その応用先が限られていた。
このようなラマンイメージングの課題が、誘導ラマン散乱（ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ Ｒａｍａｎ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ；ＳＲＳ）（非特許文献１）や共鳴ラマン散乱（非特許文献２）を活用したイメージング法の開発によって克服されてきた。さらに、生体分子のラマン信号が生じないｓｉｌｅｎｔ ｒｅｇｉｏｎ（１８００－２８００ｃｍ－１）に伸縮振動をもつアルキンなどの微小タグとの併用によって、生体適合性が飛躍的に向上した（非特許文献３）。
このように、近年、ラマンイメージングの発展に伴い、より多様なラマンプローブ開発の需要が高まっているが、既存のラマンプローブは常に同じラマンシフト値・信号強度を示すａｌｗａｙｓ－ｏｎ型のプローブであるため、ラベル化剤としての用途に留まっていた。
Min, W., et al., Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy. Annu Rev Phys Chem, 2011. 62: p. 507-30.
Kuzmin, A.N., et al., Resonance Raman Probes for Organelle-Specific Labeling in Live Cells. Sci Rep, 2016. 6: p. 28483.
Yamakoshi, H., et al., Imaging of EdU, an alkyne-tagged cell proliferation probe, by Raman microscopy. J Am Chem Soc, 2011. 133(16): p. 6102-5.
本発明は、酵素活性を検出することのできるラマンプローブを提供することを目的とする。具体的には、標的酵素との反応前はラマンシグナルがｏｆｆであるが、標的酵素との反応によってラマンシグナルがｏｎになる、activatableな特性を有するラマンプローブを提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ピロニン系色素のアミノ基をアミド化することにより波長変化が生じることに着目し、色素の１０位元素やアミノ基部分の構造展開によって、activatable型ラマンプローブを得ることができることを見出し、本発明を完成した。
即ち、本発明は、
［１］以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩。
（式中、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を表し；
Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を表し；
Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１～６個のアルキル基を表し、
Ｒ５又はＲ６は、Ｒ２又はＲ４と一緒になって、Ｒ２又はＲ４が結合している窒素原子を含む５～７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、
Ｒ５及びＲ６は、夫々、Ｒ２及びＲ４と一緒になって、Ｒ２及びＲ４が結合している窒素原子を含む５～７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、
該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１～３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１～６個のアルキル、炭素数２～６個のアルケニル、又は炭素数２～６個のアルキニル、炭素数６～１０個のアラルキル基、炭素数６～１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよく；
Ｒ７及びＲ８は、存在する場合は、それぞれ独立に、炭素数１～６個のアルキル基又はアリール基を表し、
ここで、Ｘが酸素原子の場合は、Ｒ７及びＲ８は存在せず、
Ｘがリン原子の場合は、－Ｒ７及び－Ｒ８の一方は、＝Ｏであってもよく；
Ｘは、珪素原子、酸素原子、炭素原子、スズ原子、リン原子又はゲルマニウム原子を表し；
Ｙは、－ＮＲａ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｌ、－ＮＲａ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－Ｌ’又は－Ｏ－Ｌ’であり、
ここで、Ｌは、アミノ酸の部分構造であり、
Ｌ’は、糖類又は糖類の部分構造であり、
Ｒａは、水素原子又は炭素数１～６個のアルキル基であり；
Ｚは、－Ｃ≡Ｃ－Ｒｂ、－１３Ｃ≡Ｃ－Ｒｂ、－１３Ｃ≡１３Ｃ－Ｒｂ、－Ｃ≡Ｎ、－Ｃ≡１５Ｎ、－１３Ｃ≡Ｎ、又は－１３Ｃ≡１５Ｎから選択され、
ここで、Ｒｂは、水素原子又は炭素数１～６個のアルキル基である。）
［２］Ｌのアミノ酸の部分構造は、それが結合しているＣ＝Ｏと一緒になって、アミノ酸、アミノ酸残基、ペプチド又はアミノ酸の一部を構成している構造である、［１］に記載の化合物又はその塩。
［３］Ｌ’の糖類の部分構造は、それが結合しているＯと一緒になって、糖類又は糖類の一部を構成している構造である、［１］に記載の化合物又はその塩。
［４］Ｙが以下の（１）～（３）のいずれかから選択される、［１］に記載の化合物又はその塩。
［５］一般式（Ｉ）の化合物又はその塩を含むラマンプローブ。
［６］ｅｐｒ－ＳＲＳ法に利用可能な［５］に記載のラマンプローブ。
［７］細胞又は組織内の標的酵素を検出する方法であって、（ａ）一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を細胞又は組織内に導入する工程、及び（ｂ）当該化合物又はその塩が細胞又は組織内で標的酵素と反応することにより増強されるラマン散乱光を測定する工程を含む方法。
［８］ｅｐｒ－ＳＲＳ法を用いてラマン散乱光を測定する、［７］に記載の方法。
を提供するものである。
［１］以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩。
（式中、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を表し；
Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を表し；
Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１～６個のアルキル基を表し、
Ｒ５又はＲ６は、Ｒ２又はＲ４と一緒になって、Ｒ２又はＲ４が結合している窒素原子を含む５～７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、
Ｒ５及びＲ６は、夫々、Ｒ２及びＲ４と一緒になって、Ｒ２及びＲ４が結合している窒素原子を含む５～７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、
該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１～３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１～６個のアルキル、炭素数２～６個のアルケニル、又は炭素数２～６個のアルキニル、炭素数６～１０個のアラルキル基、炭素数６～１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよく；
Ｒ７及びＲ８は、存在する場合は、それぞれ独立に、炭素数１～６個のアルキル基又はアリール基を表し、
ここで、Ｘが酸素原子の場合は、Ｒ７及びＲ８は存在せず、
Ｘがリン原子の場合は、－Ｒ７及び－Ｒ８の一方は、＝Ｏであってもよく；
Ｘは、珪素原子、酸素原子、炭素原子、スズ原子、リン原子又はゲルマニウム原子を表し；
Ｙは、－ＮＲａ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｌ、－ＮＲａ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－Ｌ’又は－Ｏ－Ｌ’であり、
ここで、Ｌは、アミノ酸の部分構造であり、
Ｌ’は、糖類又は糖類の部分構造であり、
Ｒａは、水素原子又は炭素数１～６個のアルキル基であり；
Ｚは、－Ｃ≡Ｃ－Ｒｂ、－１３Ｃ≡Ｃ－Ｒｂ、－１３Ｃ≡１３Ｃ－Ｒｂ、－Ｃ≡Ｎ、－Ｃ≡１５Ｎ、－１３Ｃ≡Ｎ、又は－１３Ｃ≡１５Ｎから選択され、
ここで、Ｒｂは、水素原子又は炭素数１～６個のアルキル基である。）
［２］Ｌのアミノ酸の部分構造は、それが結合しているＣ＝Ｏと一緒になって、アミノ酸、アミノ酸残基、ペプチド又はアミノ酸の一部を構成している構造である、［１］に記載の化合物又はその塩。
［３］Ｌ’の糖類の部分構造は、それが結合しているＯと一緒になって、糖類又は糖類の一部を構成している構造である、［１］に記載の化合物又はその塩。
［４］Ｙが以下の（１）～（３）のいずれかから選択される、［１］に記載の化合物又はその塩。
［５］一般式（Ｉ）の化合物又はその塩を含むラマンプローブ。
［６］ｅｐｒ－ＳＲＳ法に利用可能な［５］に記載のラマンプローブ。
［７］細胞又は組織内の標的酵素を検出する方法であって、（ａ）一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を細胞又は組織内に導入する工程、及び（ｂ）当該化合物又はその塩が細胞又は組織内で標的酵素と反応することにより増強されるラマン散乱光を測定する工程を含む方法。
［８］ｅｐｒ－ＳＲＳ法を用いてラマン散乱光を測定する、［７］に記載の方法。
を提供するものである。
本発明により、標的酵素との反応前はラマンシグナルがｏｆｆであるが、標的酵素との反応によってラマンシグナルがｏｎになる、activatableな特性を有するラマンプローブを提供することができる。
本明細書中において、「アルキル」は直鎖状、分枝鎖状、環状、又はそれらの組み合わせからなる脂肪族炭化水素基のいずれであってもよい。アルキル基の炭素数は特に限定されないが、例えば、炭素数１～６個（Ｃ１～６）、炭素数１～１０個（Ｃ１～１０）、炭素数１～１５個（Ｃ１～１５）、炭素数１～２０個（Ｃ１～２０）である。炭素数を指定した場合は、その数の範囲の炭素数を有する「アルキル」を意味する。例えば、Ｃ１～８アルキルには、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ｎｅｏ－ペンチル、ｎ－ヘキシル、イソヘキシル、ｎ－ヘプチル、ｎ－オクチル等が含まれる。本明細書において、アルキル基は任意の置換基を1個以上有していてもよい。そのような置換基としては、例えば、アルコキシ基、ハロゲン原子、アミノ基、モノ若しくはジ置換アミノ基、置換シリル基、又はアシルなどを挙げることができるが、これらに限定されることはない。アルキル基が２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。アルキル部分を含む他の置換基（例えばアルコシ基、アリールアルキル基など）のアルキル部分についても同様である。
本明細書において「ハロゲン原子」という場合には、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれでもよく、好ましくはフッ素原子、塩素原子、又は臭素原子である。
本明細書において、ある官能基について「置換されていてもよい」と定義されている場合には、置換基の種類、置換位置、及び置換基の個数は特に限定されず、２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。置換基としては、例えば、アルキル基、アルコキシ基、水酸基、カルボキシル基、ハロゲン原子、スルホ基、アミノ基、アルコキシカルボニル基、オキソ基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。これらの置換基にはさらに置換基が存在していてもよい。このような例として、例えば、ハロゲン化アルキル基、ジアルキルアミノ基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。
本明細書中において、「アリール」は単環式又は縮合多環式の芳香族炭化水素基のいずれであってもよく、環構成原子としてヘテロ原子（例えば、酸素原子、窒素原子、又は硫黄原子など）を１個以上含む芳香族複素環であってもよい。この場合、これを「ヘテロアリール」または「ヘテロ芳香族」と呼ぶ場合もある。アリールが単環および縮合環のいずれである場合も、すべての可能な位置で結合しうる。単環式のアリールの非限定的な例としては、フェニル基（Ｐｈ）、チエニル基（２－又は３－チエニル基）、ピリジル基、フリル基、チアゾリル基、オキサゾリル基、ピラゾリル基、２－ピラジニル基、ピリミジニル基、ピロリル基、イミダゾリル基、ピリダジニル基、３－イソチアゾリル基、３－イソオキサゾリル基、１，２，４－オキサジアゾール－５－イル基又は１，２，４－オキサジアゾール－３－イル基等が挙げられる。縮合多環式のアリールの非限定的な例としては、１－ナフチル基、２－ナフチル基、１－インデニル基、２－インデニル基、２，３－ジヒドロインデン－１－イル基、２，３－ジヒドロインデン－２－イル基、２－アンスリル基、インダゾリル基、キノリル基、イソキノリル基、１，２－ジヒドロイソキノリル基、１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリル基、インドリル基、イソインドリル基、フタラジニル基、キノキサリニル基、ベンゾフラニル基、２，３－ジヒドロベンゾフラン－１－イル基、２，３－ジヒドロベンゾフラン－２－イル基、２，３－ジヒドロベンゾチオフェン－１－イル基、２，３－ジヒドロベンゾチオフェン－２－イル基、ベンゾチアゾリル基、ベンズイミダゾリル基、フルオレニル基又はチオキサンテニル基等が挙げられる。本明細書において、アリール基はその環上に任意の置換基を１個以上有していてもよい。該置換基としては、例えば、アルコキシ基、ハロゲン原子、アミノ基、モノ若しくはジ置換アミノ基、置換シリル基、又はアシルなどを挙げることができるが、これらに限定されることはない。アリール基が２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。アリール部分を含む他の置換基（例えばアリールオキシ基やアリールアルキル基など）のアリール部分についても同様である。
本明細書中において、「アリールアルキル」は、上記アリールで置換されたアルキルを表す。アリールアルキルは、任意の置換基を１個以上有していてもよい。該置換基としては、例えば、アルコキシ基、ハロゲン原子、アミノ基、モノ若しくはジ置換アミノ基、置換シリル基、又はアシル基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。アシル基が２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。アリールアルキルの非限定的な例としては、ベンジル基、２－チエニルメチル基、３－チエニルメチル基、２－ピリジルメチル基、３－ピリジルメチル基、４－ピリジルメチル基、２－フリルメチル基、３－フリルメチル基、２－チアゾリルメチル基、４－チアゾリルメチル基、５－チアゾリルメチル基、２－オキサゾリルメチル基、４－オキサゾリルメチル基、５－オキサゾリルメチル基、１－ピラゾリルメチル基、３－ピラゾリルメチル基、４－ピラゾリルメチル基、２－ピラジニルメチル基、２－ピリミジニルメチル基、４－ピリミジニルメチル基、５－ピリミジニルメチル基、１－ピロリルメチル基、２－ピロリルメチル基、３－ピロリルメチル基、１－イミダゾリルメチル基、２－イミダゾリルメチル基、４－イミダゾリルメチル基、３－ピリダジニルメチル基、４－ピリダジニルメチル基、３－イソチアゾリルメチル基、３－イソオキサゾリルメチル基、１，２，４－オキサジアゾール－５－イルメチル基又は１，２，４－オキサジアゾール－３－イルメチル基等が挙げられる。
本明細書中において、「アルコキシ基」とは、前記アルキル基が酸素原子に結合した構造であり、例えば直鎖状、分枝状、環状又はそれらの組み合わせである飽和アルコキシ基が挙げられる。例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ－プロポキシ基、イソプロポキシ基、シクロプロポキシ基、ｎ－ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓ－ブトキシ基、ｔ－ブトキシ基、シクロブトキシ基、シクロプロピルメトキシ基、ｎ－ペンチルオキシ基、シクロペンチルオキシ基、シクロプロピルエチルオキシ基、シクロブチルメチルオキシ基、ｎ－ヘキシルオキシ基、シクロヘキシルオキシ基、シクロプロピルプロピルオキシ基、シクロブチルエチルオキシ基又はシクロペンチルメチルオキシ基等が好適な例として挙げられる。
本明細書中において、「アルキレン」とは、直鎖状または分枝状の飽和炭化水素からなる二価の基であり、例えば、メチレン、１－メチルメチレン、１，１－ジメチルメチレン、エチレン、１－メチルエチレン、１－エチルエチレン、１，１－ジメチルエチレン、１，２－ジメチルエチレン、１，１－ジエチルエチレン、１，２－ジエチルエチレン、１－エチル－２－メチルエチレン、トリメチレン、１－メチルトリメチレン、２－メチルトリメチレン、１，１－ジメチルトリメチレン、１，２－ジメチルトリメチレン、２，２－ジメチルトリメチレン、１－エチルトリメチレン、２－エチルトリメチレン、１，１－ジエチルトリメチレン、１，２－ジエチルトリメチレン、２，２－ジエチルトリメチレン、２－エチル－２－メチルトリメチレン、テトラメチレン、１－メチルテトラメチレン、２－メチルテトラメチレン、１，１－ジメチルテトラメチレン、１，２－ジメチルテトラメチレン、２，２－ジメチルテトラメチレン、２，２－ジ－ｎ－プロピルトリメチレン等が挙げられる。
１．一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩
本発明の１つの実施態様は、以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩である。
本発明の１つの実施態様は、以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩である。
本発明においては、ピロニン系色素のアミノ基の構造修飾による波長変化に着目した。理論に拘束されることを意図するものではないが、本発明で用いる主要な検出系の一つであるｅｐｒ－ＳＲＳ検出法では、分子の吸収波長よりやや長波長の励起光で検出感度が著しく上昇することから、標的分子との反応前は吸収波長が短いため検出感度が低くラマンシグナルがｏｆｆであるが、反応後は吸収波長が長波長化するためラマンシグナルがｏｎとなるプローブを設計することが重要である。
本発明のラマンプローブによるラマン散乱の発現の模式図を図１に示す。
本発明のラマンプローブによるラマン散乱の発現の模式図を図１に示す。
一般式（Ｉ）において、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を表す。Ｒ１又はＲ２がアルキル基を示す場合には、該アルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ３又はＲ４が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。
Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子であることが好ましく、Ｒ１及びＲ２がともに水素原子である場合、又はＲ１及びＲ２がともにフッ素原子又は塩素原子である場合がより好ましい。
Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子であることが好ましく、Ｒ１及びＲ２がともに水素原子である場合、又はＲ１及びＲ２がともにフッ素原子又は塩素原子である場合がより好ましい。
一般式（Ｉ）において、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基、又はハロゲン原子を示すが、Ｒ１及びＲ２について説明したものと同様である。Ｒ３及びＲ４が共に水素原子であるか、共に塩素原子であるか、又は共にフッ素原子であることが好ましい。
一般式（Ｉ）において、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１～６個のアルキル基を示す。Ｒ５又はＲ６がアルキル基を示す場合には、該アルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ５又はＲ６が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。
Ｒ５又はＲ６は、Ｒ２又はＲ４と一緒になって、Ｒ５又はＲ６が結合している窒素原子を含む５～７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよい。
また、Ｒ５及びＲ６は、夫々、Ｒ２及びＲ４と一緒になって、Ｒ２及びＲ４が結合している窒素原子を含む５～７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよい。
ヘテロシクリル又はヘテロアリールは環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１～３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよい。
ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１～６個のアルキル基、炭素数２～６個のアルケニル基、又は炭素数２～６個のアルキニル基、炭素数６～１０個のアラルキル基（ベンジル基、フェネチル基等）、炭素数６～１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよい。
このようにして形成されるヘテロシクリル又はヘテロアリールとしては、例えば、ピロリジン、ピペリジン、ヘキサメチレンイミン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、チアゾールなどが挙げられるが、これらに限定されない。
また、Ｒ５及びＲ６は、夫々、Ｒ２及びＲ４と一緒になって、Ｒ２及びＲ４が結合している窒素原子を含む５～７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよい。
ヘテロシクリル又はヘテロアリールは環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１～３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよい。
ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１～６個のアルキル基、炭素数２～６個のアルケニル基、又は炭素数２～６個のアルキニル基、炭素数６～１０個のアラルキル基（ベンジル基、フェネチル基等）、炭素数６～１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよい。
このようにして形成されるヘテロシクリル又はヘテロアリールとしては、例えば、ピロリジン、ピペリジン、ヘキサメチレンイミン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、チアゾールなどが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の１つの側面においては、Ｒ５又はＲ６は、Ｒ２又はＲ４と一緒になって、Ｒ５又はＲ６が結合している窒素原子を含む５～７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成している。
また、本発明の別の側面においては、Ｒ５及びＲ６は、夫々、Ｒ２及びＲ４と一緒になって、Ｒ２及びＲ４が結合している窒素原子を含む５～７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していている。
Ｒ５、Ｒ６の一方又は両方が、Ｒ２又はＲ４の一方又は両方と環構造を形成すると、標的酵素に対する安定性が向上する点で好ましい。
また、本発明の別の側面においては、Ｒ５及びＲ６は、夫々、Ｒ２及びＲ４と一緒になって、Ｒ２及びＲ４が結合している窒素原子を含む５～７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していている。
Ｒ５、Ｒ６の一方又は両方が、Ｒ２又はＲ４の一方又は両方と環構造を形成すると、標的酵素に対する安定性が向上する点で好ましい。
一般式（Ｉ）において、Ｒ７及びＲ８は、存在する場合は、それぞれ独立に、炭素数１～６個のアルキル基又はアリール基を示すが、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立に、炭素数１～３個のアルキル基であることが好ましく、Ｒ７及びＲ８がともにメチル基であることがより好ましい。
Ｒ７及びＲ８が示すアルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ７又はＲ８が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。
Ｒ７又はＲ８がアリール基を示す場合には、アリール基は単環の芳香族基又は縮合芳香族基のいずれであってもよく、アリール環は１個又は２個以上の環構成ヘテロ原子（例えば窒素原子、酸素原子、又は硫黄原子など）を含んでいてもよい。アリール基としてはフェニル基が好ましい。アリール環上には１個又は２個以上の置換基が存在していてもよい。置換基としては、例えばハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよい。
Ｒ７及びＲ８が示すアルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ７又はＲ８が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。
Ｒ７又はＲ８がアリール基を示す場合には、アリール基は単環の芳香族基又は縮合芳香族基のいずれであってもよく、アリール環は１個又は２個以上の環構成ヘテロ原子（例えば窒素原子、酸素原子、又は硫黄原子など）を含んでいてもよい。アリール基としてはフェニル基が好ましい。アリール環上には１個又は２個以上の置換基が存在していてもよい。置換基としては、例えばハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよい。
また、後述するＸが酸素原子の場合は、Ｒ７及びＲ８は存在しない。
また、Ｘがリン原子の場合は、－Ｒ７及び－Ｒ８の一方は、＝Ｏであってもよい。Ｘがリン原子の場合の好ましい側面においては、－Ｒ７及び－Ｒ８の一方は、＝Ｏであり、他方は、炭素数１～６個のアルキル基又はアリール基を示す。
一般式（Ｉ）において、Ｘは、珪素原子、酸素原子、炭素原子、スズ原子、リン原子又はゲルマニウム原子を示すが、炭素原子、珪素原子又はゲルマニウム原子であることが好ましく、炭素原子であることが特に好ましい。
一般式（Ｉ）において、Ｙは、標的分子と反応する部位である。Ｙは標的分子の種類に応じて選択することができる。標的酵素がグリコシダーゼである場合は、Ｙは糖類に由来する基から選択され、標的酵素がペプチダーゼである場合は、Ｙはアミノ酸類に由来する基、アミノ酸類を含む基から選択される。
一般式（Ｉ）において、Ｙは、（１）－ＮＲａ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｌ、（２）－ＮＲａ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－Ｌ’又は（３）－Ｏ－Ｌ’である。
ここで、Ｌは、アミノ酸の部分構造であり、Ｌ’は、糖類又は糖類の部分構造であり、Ｒａは、水素原子又は炭素数１～６個のアルキル基である。
ここで、Ｌは、アミノ酸の部分構造であり、Ｌ’は、糖類又は糖類の部分構造であり、Ｒａは、水素原子又は炭素数１～６個のアルキル基である。
理論に拘束されることを意図するものではないが、本発明においては、ピロニン系色素のアミノ基に対してアミド結合を介してアミノ酸やペプチドを導入する（Ｙが（１）の基の場合）ことにより、標的酵素であるアミノペプチダーゼとの反応前は吸収波長が短いためシグナルがｏｆｆであるが、反応後はアミド結合が切断され吸収波長が長波長化するためシグナルがｏｎになる。かかるラマンプローブを用いると、生細胞内においてもこれらの標的酵素の活性を検出することが可能となる。
また、同様に、ピロニン系色素のアミノ基に対してアミド結合を介して糖類又は糖類の部分構造を導入する（Ｙが（２）の基の場合）ことにより、標的酵素であるグリコシダーゼとの反応前は吸収波長が短いためシグナルがｏｆｆであるが、反応後はアミド結合が切断され吸収波長が長波長化するためシグナルがｏｎになる。
更に、ピロニン系色素の骨格にグリコシド結合を介して糖類又は糖類の部分構造を導入する（Ｙが（３）の基の場合）ことにより、標的酵素であるグリコシダーゼとの反応前は吸収波長が短いためシグナルがｏｆｆであるが、反応後はアミド結合が切断され吸収波長が長波長化するためシグナルがｏｎになる。
また、同様に、ピロニン系色素のアミノ基に対してアミド結合を介して糖類又は糖類の部分構造を導入する（Ｙが（２）の基の場合）ことにより、標的酵素であるグリコシダーゼとの反応前は吸収波長が短いためシグナルがｏｆｆであるが、反応後はアミド結合が切断され吸収波長が長波長化するためシグナルがｏｎになる。
更に、ピロニン系色素の骨格にグリコシド結合を介して糖類又は糖類の部分構造を導入する（Ｙが（３）の基の場合）ことにより、標的酵素であるグリコシダーゼとの反応前は吸収波長が短いためシグナルがｏｆｆであるが、反応後はアミド結合が切断され吸収波長が長波長化するためシグナルがｏｎになる。
Ｌは、アミノ酸の部分構造である。Ｌのアミノ酸の部分構造とは、Ｌが結合しているＣ＝Ｏと一緒になって、アミノ酸、アミノ酸残基、ペプチド、アミノ酸又はペプチドの一部を構成していることを意味する
ここで、「アミノ酸の一部」には、アミノ酸の側鎖が－ＮＲａと結合した場合の－ＮＲａを除いた部分の構造（例えば、グルタミン酸の側鎖側のカルボキシル基と－ＮＲａとの間にアミド結合を形成する場合のγ-グルタミル基等）も含まれる。
ペプチドの一部には、ペプチドを構成する一つのアミノ酸残基の側鎖が－ＮＲａと結合した場合の－ＮＲａを除いた部分の構造も含まれる。
ここで、「アミノ酸の一部」には、アミノ酸の側鎖が－ＮＲａと結合した場合の－ＮＲａを除いた部分の構造（例えば、グルタミン酸の側鎖側のカルボキシル基と－ＮＲａとの間にアミド結合を形成する場合のγ-グルタミル基等）も含まれる。
ペプチドの一部には、ペプチドを構成する一つのアミノ酸残基の側鎖が－ＮＲａと結合した場合の－ＮＲａを除いた部分の構造も含まれる。
本明細書において、「アミノ酸」は、アミノ基とカルボキシル基の両方を有する化合物であれば任意の化合物を用いることができ、天然及び非天然のものを含む。中性アミノ酸、塩基性アミノ酸、又は酸性アミノ酸のいずれであってもよく、それ自体が神経伝達物質などの伝達物質として機能するアミノ酸のほか、生理活性ペプチド（ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチドのほか、オリゴペプチドを含む）やタンパク質などのポリペプチド化合物の構成成分であるアミノ酸を用いることができ、例えばαアミノ酸、βアミノ酸、γアミノ酸などであってもよい。アミノ酸としては、光学活性アミノ酸を用いることが好ましい。例えば、αアミノ酸についてはＤ－又はＬ－アミノ酸のいずれを用いてもよいが、生体において機能する光学活性アミノ酸を選択することが好ましい場合がある。
また、アミノ酸のＮ末端は、Ｎアセチル化されていてもよい。
また、アミノ酸のＣ末端はアミド化（例えば、エチルアミド等のアルキルアミド）あるいはエステル化されていてもよい。
また、アミノ酸のＮ末端は、Ｎアセチル化されていてもよい。
また、アミノ酸のＣ末端はアミド化（例えば、エチルアミド等のアルキルアミド）あるいはエステル化されていてもよい。
本明細書において、「アミノ酸残基」とは、アミノ酸のカルボキシル基からヒドロキシル基を除去した残りの部分構造に対応する構造をいう。
アミノ酸残基には、αアミノ酸の残基、βアミノ酸の残基、γアミノ酸の残基が含まれる。
本明細書において、「ペプチド」には、ペプチドのＣ末端のアミノ酸のカルボキシル基からヒドロキシル基を除去した残りの部分構造に対応する構造も含まれる。
アミノ酸残基には、αアミノ酸の残基、βアミノ酸の残基、γアミノ酸の残基が含まれる。
本明細書において、「ペプチド」には、ペプチドのＣ末端のアミノ酸のカルボキシル基からヒドロキシル基を除去した残りの部分構造に対応する構造も含まれる。
標的ペプチダーゼが、γ-グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）、ジペプチジルペプチダーゼ４（ＤＰＰ－４）、又はカルパインであることができる。それゆえ、標的ペプチダーゼがγ-グルタミルトランスペプチダーゼである場合、アミノ酸の部分構造としては、γ-グルタミル基であることが好ましい。また、標的ペプチダーゼがジペプチジルペプチダーゼ４である場合、アミノ酸の部分構造としては、プロリン残基を含むアシル基、プロリン残基を含むペプチドであることが好ましい。標的ペプチダーゼがカルパインである場合、アミノ酸の部分構造としては、例えば、システイン残基を含むアシル基であることができ、或いは、カルパイン基質として当該技術分野において公知のＳｕｃ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｔｙｒ（Ｓｕｃ－ＬＬＶＹ）やＡｃＬＭを用いることもできる。
好ましいアミノ酸の部分構造としては、ＧＧＴ基質の「γ―グルタミル基」やＤＰＰ－４基質のジペプチド「グルタミン酸などのアミノ酸―プロリンからなるジペプチド」、ＬＡＰ基質のロイシン残基などが挙げられる。
好ましいアミノ酸の部分構造としては、ＧＧＴ基質の「γ―グルタミル基」やＤＰＰ－４基質のジペプチド「グルタミン酸などのアミノ酸―プロリンからなるジペプチド」、ＬＡＰ基質のロイシン残基などが挙げられる。
Ｌ’は、糖類又は糖類の部分構造である。
Ｌ’の糖類の部分構造は、Ｌ’が結合しているＯと一緒になって、糖類、糖類の一部を構成している。
Ｌ’の糖類の部分構造は、Ｌ’が結合しているＯと一緒になって、糖類、糖類の一部を構成している。
糖類としては、β－Ｄ－グルコース、β－Ｄ－ガラクトース、β－Ｌ－ガラクトース、β－Ｄ－キシロース、α－Ｄ－マンノース、β－Ｄ－フコース、α－Ｌ－フコース、β－Ｌ－フコース、β－Ｄ－アラビノース、β－Ｌ－アラビノース、β－Ｄ－Ｎ－アセチルグルコサミン、β－Ｄ－Ｎ－アセチルガラクトサミン等が挙げられ、好ましくは、β－Ｄ－ガラクトースである。
Ｙの非限定的な例を以下に示す。
一般式（Ｉ）において、Ｚは、－Ｃ≡Ｃ－Ｒｂ、－１３Ｃ≡Ｃ－Ｒｂ、－１３Ｃ≡１３Ｃ－Ｒｂ、－Ｃ≡Ｎ、－Ｃ≡１５Ｎ、－１３Ｃ≡Ｎ、又は－１３Ｃ≡１５Ｎから選択される。
ここで、Ｒｂは、水素原子又は炭素数１～６個のアルキル基である。
ここで、Ｒｂは、水素原子又は炭素数１～６個のアルキル基である。
ラマン信号の検出のためには、ニトリルやアルキンのような三重結合をもつ構造を導入すると、三重結合のラマン信号は生体分子のラマン信号が出ないｓｉｌｅｎｔ ｒｅｇｉｏｎに出るため、好ましい。
また、三重結合を構成する炭素や窒素の原子の同位体標識によってもラマン信号がシフトするため、同位体標識されたニトリルやアルキンもＺとして用いることができる。
また、三重結合を構成する炭素や窒素の原子の同位体標識によってもラマン信号がシフトするため、同位体標識されたニトリルやアルキンもＺとして用いることができる。
一般式（Ｉ）で表される化合物は、酸付加塩又は塩基付加塩として存在することができる。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、又はメタンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩などの有機酸塩などを挙げることができ、塩基付加塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩などの有機アミン塩などを挙げることができる。これらのほか、グリシンなどのアミノ酸との塩を形成する場合もある。一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩は、水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、本発明においては、これらの物質も用いることができる。
一般式（Ｉ）で表される化合物は、置換基の種類により、１個又は２個以上の不斉炭素を有する場合があるが、本発明においては、１個又は２個以上の不斉炭素に基づく光学活性体や２個以上の不斉炭素に基づくジアステレオ異性体などの立体異性体のほか、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体なども用いることができる。
一般式（Ｉ）で表される化合物の代表的化合物の製造方法を本明細書の実施例に具体的に示した。従って、当業者は、これらの説明をもとにして、反応原料、反応条件、及び反応試薬などを適宜選択して、必要に応じてこれらの方法に修飾や改変を加えることにより、一般式（Ｉ）で表される化合物を製造することができる。
２．本発明のラマンプローブ
本発明のもう１つの態様は、一般式（Ｉ）の化合物又はその塩を含むラマンプローブである（以下「本発明のラマンプローブ」ともいう）。
本発明のもう１つの態様は、一般式（Ｉ）の化合物又はその塩を含むラマンプローブである（以下「本発明のラマンプローブ」ともいう）。
また、本発明のもう１つの態様は、細胞又は組織内の標的酵素を検出する方法であって、（ａ）一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を細胞内に導入する工程、及び（ｂ）当該化合物又はその塩が細胞又は組織内で標的酵素と反応することにより発せられるラマン光を測定する工程を含む方法、である。
ここで、細胞としては、正常細胞、癌細胞、神経細胞等が挙げられる。
ここで、細胞としては、正常細胞、癌細胞、神経細胞等が挙げられる。
本発明のラマンプローブは、ｅｐｒ－ＳＲＳ法に利用可能なａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ型ラマンプローブである。ｅｐｒ－ＳＲＳ法とは、前期共鳴 (electronic pre-resonance; epr)効果と誘導ラマン散乱 (stimulated Raman scattering; SRS) を組み合わせたラマンイメージング法である。
この方法では、分子の電子吸収帯よりやや長波長側の光によって励起する（前期共鳴条件）ため、光褪色や蛍光によるバックグラウンド上昇を抑えることができ、ストークス光による誘導放出によってさらに高感度なイメージングが実現できる。従来のＳＲＳ顕微鏡ではストークス光の波長変化に秒オーダーの時間がかかるため、スペクトル解析やスペクトルイメージングを行う際には測定時間が長くなってしまうのが課題の１つであったが、東京大学大学院工学系研究科電気系工学専攻の小関研究室で開発された高速ＳＲＳ分光顕微鏡では１秒当たり３０波数分変化させる高速イメージングが可能である（Ozeki, Y., Biological Imaging Based on Stimulated Raman Scattering. Seibutsu Butsuri, 2014. 54(6): p. 311-314）。当該高速ＳＲＳ分光顕微鏡の模式図を図２に示す。
高速ＳＲＳ分光顕微鏡を用いるラマンイメージング法は、上記のOzekiの論文を参照して行うことができる。また、高速ＳＲＳ分光顕微鏡でイメージングを行うに際しては、信号対雑音比を高めるため、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの測定ではデータを５～１０回程度、ｉｎ ｃｅｌｌｕｌｏでの測定ではデータを １００～１０００回程度取得して、平均化を行うことが好ましい。
この方法では、分子の電子吸収帯よりやや長波長側の光によって励起する（前期共鳴条件）ため、光褪色や蛍光によるバックグラウンド上昇を抑えることができ、ストークス光による誘導放出によってさらに高感度なイメージングが実現できる。従来のＳＲＳ顕微鏡ではストークス光の波長変化に秒オーダーの時間がかかるため、スペクトル解析やスペクトルイメージングを行う際には測定時間が長くなってしまうのが課題の１つであったが、東京大学大学院工学系研究科電気系工学専攻の小関研究室で開発された高速ＳＲＳ分光顕微鏡では１秒当たり３０波数分変化させる高速イメージングが可能である（Ozeki, Y., Biological Imaging Based on Stimulated Raman Scattering. Seibutsu Butsuri, 2014. 54(6): p. 311-314）。当該高速ＳＲＳ分光顕微鏡の模式図を図２に示す。
高速ＳＲＳ分光顕微鏡を用いるラマンイメージング法は、上記のOzekiの論文を参照して行うことができる。また、高速ＳＲＳ分光顕微鏡でイメージングを行うに際しては、信号対雑音比を高めるため、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの測定ではデータを５～１０回程度、ｉｎ ｃｅｌｌｕｌｏでの測定ではデータを １００～１０００回程度取得して、平均化を行うことが好ましい。
この小関研の高速ＳＲＳ分光顕微鏡の励起光は８４３ｎｍであるため、当該ｅｐｒ－ＳＲＳ法の装置を用いる場合は、前期共鳴がかかる波長域がおよそ６５０～７５０ｎｍであるラマンプローブを用いるのが好ましい。
本発明のラマンプローブを用いる標的酵素の検出方法には、上記の高速ＳＲＳ分光顕微鏡を好適に用いることができるが、当該高速ＳＲＳ分光顕微鏡を用いた方法に限定されるものではない。
本発明のラマンプローブを用いる標的酵素の検出方法には、上記の高速ＳＲＳ分光顕微鏡を好適に用いることができるが、当該高速ＳＲＳ分光顕微鏡を用いた方法に限定されるものではない。
即ち、本発明の１つの好ましい側面は、一般式（Ｉ）の化合物又はその塩を含むｅｐｒ－ＳＲＳ法に利用可能なａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ型ラマンプローブである。
本発明のラマンプローブの使用方法は特に限定されず、従来公知のラマンプローブと同様に用いることが可能である。通常は、生理食塩水や緩衝液などの水性媒体、又はエタノール、アセトン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどの水混合性の有機溶媒と水性媒体との混合物などに上記式（Ｉ）で表される化合物又はそれらの塩を溶解し、細胞や組織を含む適切な緩衝液中にこの溶液を添加して、ラマンスペクトルを測定すればよい。本発明のラマンプローブを適切な添加物と組み合わせて組成物の形態で用いてもよい。例えば、緩衝剤、溶解補助剤、ｐＨ調節剤などの添加物と組み合わせることができる。
本発明のもう１つの実施態様は、本発明のラマンプローブを含む、標的分子の検出用キットである。
当該キットにおいて、通常、本発明のラマンプローブは溶液として調製されているが、例えば、粉末形態の混合物、凍結乾燥物、顆粒剤、錠剤、液剤など適宜の形態の組成物として提供され、使用時に注射用蒸留水や適宜の緩衝液に溶解して適用することもできる。
また、当該キットには、必要に応じてそれ以外の試薬等を適宜含んでいてもよい。例えば、添加剤として、溶解補助剤、ｐＨ調節剤、緩衝剤、等張化剤などの添加剤を用いることができ、これらの配合量は当業者に適宜選択可能である。
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
［原料］
合成に使用した全ての化学物質は、東京化成工業（株）、和光純薬工業（株）、シグマアルドリッチ（株）、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ, Ｉｎｃ. から購入した。 さらに精製することなく使用した。
合成に使用した全ての化学物質は、東京化成工業（株）、和光純薬工業（株）、シグマアルドリッチ（株）、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ, Ｉｎｃ. から購入した。 さらに精製することなく使用した。
［測定機器］
ＮＭＲスペクトルは、重水素化溶媒中を用い、Ｂｒｕｋｅｒ ＮＭＲ ＡＶＡＮＣＥ ＩＩＩ ４００分光計［１Ｈ ４００ ＭＨｚ、１３Ｃ １００ ＭＨｚ］で得た。
高分解能ＥＳＩ質量スペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ ｍｉｃｒｏＴＯＦ ＩＩ－ＴＭ (ＥＳＩ)で得た。
ＨＰＬＣ精製は、Ｉｎｅｒｔｓｔｉｌ－ＯＤＳ－３カラム（Φ１０×２５０ｍｍ（セミ分取）およびΦ２０×２５０ｍｍ（分取））を備えたＪＡＳＣＯ ＰＵ－２０８０ Ｐｌｕｓポンプ（ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏ．、Ｌｔｄ．）およびＭＤ－２０１５検出器（ＪＡＳＣＯ）で行った。
ＨＰＬＣに使用した溶媒は、和光（株）より入手した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーは、中圧分取液体クロマトグラフＹＦＬＣ－Ａｌ５６０（山善株式会社）を用いて行った。
ＴＬＣは、シリカゲルプレートＦ２５４（０．２５ｍｍ（分析）；Ｍｅｒｃｋ、ＡＫＧ）で行った。
ＵＶ－ｖｉｓスペクトルは、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＵＶ－２４５０分光光度計で得た。
蛍光スペクトルは、Ｆ－７０００ (日立)で取得した。
ＳＲＳスペクトルおよびＳＲＳ像は、東京大学大学院工学系研究科電気系工学専攻小関研究室で開発された高速ＳＲＳ分光顕微鏡で取得した。ポンプ光パルスおよびストークス光パルスの波長は８４３ｎｍおよび１０１４－１０４６ｎｍ、パルス時間幅は約５ピコ秒、スペクトル分解能は５／ｃｍである。水浸対物レンズを用い、その開口数は１．２である。フレームごとにストークス光パルスの波長を変化させ、５００×５００ピクセルの画像を毎秒３０フレーム取得した。信号対雑音比を高めるためにデータをｉｎ ｖｉｔｒｏでは５回、ｉｎ ｃｅｌｌｕｌｏでは１０００回取得し、平均化を行った。
ＮＭＲスペクトルは、重水素化溶媒中を用い、Ｂｒｕｋｅｒ ＮＭＲ ＡＶＡＮＣＥ ＩＩＩ ４００分光計［１Ｈ ４００ ＭＨｚ、１３Ｃ １００ ＭＨｚ］で得た。
高分解能ＥＳＩ質量スペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ ｍｉｃｒｏＴＯＦ ＩＩ－ＴＭ (ＥＳＩ)で得た。
ＨＰＬＣ精製は、Ｉｎｅｒｔｓｔｉｌ－ＯＤＳ－３カラム（Φ１０×２５０ｍｍ（セミ分取）およびΦ２０×２５０ｍｍ（分取））を備えたＪＡＳＣＯ ＰＵ－２０８０ Ｐｌｕｓポンプ（ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏ．、Ｌｔｄ．）およびＭＤ－２０１５検出器（ＪＡＳＣＯ）で行った。
ＨＰＬＣに使用した溶媒は、和光（株）より入手した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーは、中圧分取液体クロマトグラフＹＦＬＣ－Ａｌ５６０（山善株式会社）を用いて行った。
ＴＬＣは、シリカゲルプレートＦ２５４（０．２５ｍｍ（分析）；Ｍｅｒｃｋ、ＡＫＧ）で行った。
ＵＶ－ｖｉｓスペクトルは、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＵＶ－２４５０分光光度計で得た。
蛍光スペクトルは、Ｆ－７０００ (日立)で取得した。
ＳＲＳスペクトルおよびＳＲＳ像は、東京大学大学院工学系研究科電気系工学専攻小関研究室で開発された高速ＳＲＳ分光顕微鏡で取得した。ポンプ光パルスおよびストークス光パルスの波長は８４３ｎｍおよび１０１４－１０４６ｎｍ、パルス時間幅は約５ピコ秒、スペクトル分解能は５／ｃｍである。水浸対物レンズを用い、その開口数は１．２である。フレームごとにストークス光パルスの波長を変化させ、５００×５００ピクセルの画像を毎秒３０フレーム取得した。信号対雑音比を高めるためにデータをｉｎ ｖｉｔｒｏでは５回、ｉｎ ｃｅｌｌｕｌｏでは１０００回取得し、平均化を行った。
［合成実施例１］
ｅｐｒ－ＳＲＳに利用可能なａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ型ラマンプローブ母核として９ＣＮ－ＪＣＰの合成を以下のスキーム１により行った。
ｅｐｒ－ＳＲＳに利用可能なａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ型ラマンプローブ母核として９ＣＮ－ＪＣＰの合成を以下のスキーム１により行った。
スキーム１
(a) Allyl Bromide, K2CO3, MeCN, y. 95%. (b) 1) (Chloromethylene)dimethylammonium Chloride, CH2ClCH2Cl, NaOH aq, 2) NaBH4, DCM, MeOH, y. 53% in 2 steps. (c) BF3・OEt2, dry DCM, y. 88%. (d) sec-BuLi, dry Acetone, dry THF, y. 76%. (e) 1) H2SO4, 2) Pd(PPh3)4, 1,3-dimethyl barbituric acid , degassed DCM, y. 77% in 2 steps. (f) Chroranil, DCM, y. 92% (g) 1) KCN, MeCN, H2O, 2) FeCl3, HCl aq, y. 4.1% in 2 steps.
(a) Allyl Bromide, K2CO3, MeCN, y. 95%. (b) 1) (Chloromethylene)dimethylammonium Chloride, CH2ClCH2Cl, NaOH aq, 2) NaBH4, DCM, MeOH, y. 53% in 2 steps. (c) BF3・OEt2, dry DCM, y. 88%. (d) sec-BuLi, dry Acetone, dry THF, y. 76%. (e) 1) H2SO4, 2) Pd(PPh3)4, 1,3-dimethyl barbituric acid , degassed DCM, y. 77% in 2 steps. (f) Chroranil, DCM, y. 92% (g) 1) KCN, MeCN, H2O, 2) FeCl3, HCl aq, y. 4.1% in 2 steps.
化合物２の合成
３－ブロモアリニン（化合物１）（１２．７ｇ、７４ｍｍｏｌ、１ｅｑ）、臭化アリール（１５．６ｍＬ、１８５ｍｍｏｌ、２．５ｅｑ）、炭酸カリウム（２０．５ｇ、１４８ｍｍｏｌ、１ｅｑ）をアセトニトリル１００ｍＬに溶解し、１００℃で２９時間加熱還流した。室温に戻し、水を加え酢酸エチルで３回抽出し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝１００／０→９５／５）により精製し、化合物２（１７．８ｇ、９５％）を得た。
1H NMR (400 MHz,CDCl3): δ7.00 (t, 1H, J = 7.6 Hz), 6.75-6.79 (m, 2H), 6.58 (dd, 1H J = 7.6, 1.3 Hz), 5.75-5.85 (m, 2H), 5.10-5.19 (m, 4H), 3.85-3.87 (m, 4H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ149.9, 133.2, 130.3, 123.4, 119.0, 116.3, 115.0, 110.9, 52.7; HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 252.03824, Found, 252.03863 (-0.4 mDa)
1H NMR (400 MHz,CDCl3): δ7.00 (t, 1H, J = 7.6 Hz), 6.75-6.79 (m, 2H), 6.58 (dd, 1H J = 7.6, 1.3 Hz), 5.75-5.85 (m, 2H), 5.10-5.19 (m, 4H), 3.85-3.87 (m, 4H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ149.9, 133.2, 130.3, 123.4, 119.0, 116.3, 115.0, 110.9, 52.7; HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 252.03824, Found, 252.03863 (-0.4 mDa)
化合物３の合成
化合物２（１３．７ｇ、５５ｍｍｏｌ、１ｅｑ）、（クロロメチレン）ジメチルアンモニウムクロライド（１４ｇ、１０９ｍｍｏｌ、２ｅｑ）をジクロロメタン３０ｍＬに溶解し、アルゴン雰囲気化、７０℃で２時間加熱還流した。室温に戻し、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加えジクロロメタンで３回抽出し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去した。残渣をジクロロメタン１５ｍＬとメタノール１５ｍＬに溶解し、０℃で撹拌した。水酸化ホウ素ナトリウム（３．１ｇ、８２ｍｍｏｌ、１.５ｅｑ）を加え、室温に戻し、３０分間撹拌した。水を加えジクロロメタンで３回抽出し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝８２／１８→６１／３９）により精製し、化合物３（８．２５ｇ、５３％）を得た。
1H NMR (400 MHz,CDCl3): δ7.19 (d, 1H, J = 8.5 Hz), 6.84 (d, 1H, J = 2.6 Hz), 6.58 (dd, 1H J = 8.5, 2.6 Hz), 5.76-5.85 (m, 2H), 5.12-5.18 (m, 4H), 4.58 (s, 2H), 3.88-3.89 (m, 4H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ149.3, 133.1, 130.4, 127.0, 124.4, 116.3, 115.8, 111.3, 64.9, 52.7; HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 282.04880, Found, 282.04809 (0.7 mDa)
1H NMR (400 MHz,CDCl3): δ7.19 (d, 1H, J = 8.5 Hz), 6.84 (d, 1H, J = 2.6 Hz), 6.58 (dd, 1H J = 8.5, 2.6 Hz), 5.76-5.85 (m, 2H), 5.12-5.18 (m, 4H), 4.58 (s, 2H), 3.88-3.89 (m, 4H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ149.3, 133.1, 130.4, 127.0, 124.4, 116.3, 115.8, 111.3, 64.9, 52.7; HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 282.04880, Found, 282.04809 (0.7 mDa)
化合物５の合成
化合物３（２．４３ｇ、８．６ｍｍｏｌ、１ｅｑ）、２、３、６、７－テトラヒドロ－１Ｈ、５Ｈ－ベンゾ[ｉｊ]キノリジン（化合物４）（１．５ｇ、８．６ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を脱水ジクロロメタン２０ｍＬに溶解し、アルゴン雰囲気化、０℃で撹拌した。三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体（３．２４ｍＬ、２５．８ｍｍｏｌ、３ｅｑ）をゆっくり滴下し、０℃で１０分間撹拌した。室温に戻し、さらに１８時間撹拌した。１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加えジクロロメタンで３回抽出し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン／ジクロロメタン＝６０／４０→０／１００）により精製し、化合物５（３．３２ｇ、８８％）を得た。
1H NMR (400 MHz,CDCl3): δ6.94 (d, 1H, J = 8.6 Hz), 6.86 (d, 1H, J = 2.6 Hz), 6.62 (s, 2H), 6.55 (dd, 1H, J = 8.6, 2.6 Hz), 5.77-5.86 (m, 2H), 5.13-5.18 (m, 4H), 3.86-3.87 (m, 4H), 3.79 (s, 2H), 3.07 (t, 4H, J = 5.6 Hz), 2.71 (t, 4H, J = 6.5 Hz), 1.92-1.98 (m, 4H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ148.1, 141.5, 133.8, 131.3, 128.9, 128.1, 127.7, 125.6, 121.8, 116.4, 116.1, 112.0, 53.0, 50.4, 40.0, 27.9, 22.6; HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 437.15869, Found, 437.15855 (0.1 mDa)
1H NMR (400 MHz,CDCl3): δ6.94 (d, 1H, J = 8.6 Hz), 6.86 (d, 1H, J = 2.6 Hz), 6.62 (s, 2H), 6.55 (dd, 1H, J = 8.6, 2.6 Hz), 5.77-5.86 (m, 2H), 5.13-5.18 (m, 4H), 3.86-3.87 (m, 4H), 3.79 (s, 2H), 3.07 (t, 4H, J = 5.6 Hz), 2.71 (t, 4H, J = 6.5 Hz), 1.92-1.98 (m, 4H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ148.1, 141.5, 133.8, 131.3, 128.9, 128.1, 127.7, 125.6, 121.8, 116.4, 116.1, 112.0, 53.0, 50.4, 40.0, 27.9, 22.6; HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 437.15869, Found, 437.15855 (0.1 mDa)
化合物６の合成
化合物５（２．４５ｇ、５．６ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を脱水テトラヒドロフラン２０ｍＬに溶解し、アルゴン雰囲気化、－７８℃で１５分撹拌した。１．３Ｍ sec－ブチルリチウムシクロヘキサン、ｎ－ヘキサン溶液（１３ｍＬ、１６．８ｍｍｏｌ、３ｅｑ）を１０分間かけて加え、１０分間撹拌した。脱水アセトン（１２ｍＬ、１６８ｍｍｏｌ、３０ｅｑ）を加え、室温に戻した。４０℃に加熱し、さらに３時間撹拌した。室温に戻し、飽和塩化アンモニウム水溶液を加えジクロロメタンで３回抽出し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝９０／１０→６９／３１）により精製し、化合物５（３．３２ｇ、８８％）を得た。
1H NMR (400 MHz,CDCl3): δ6.96 (d, 1H, J = 8.5 Hz), 6.82 (d, 1H, J = 2.8 Hz), 6.56 (dd, 1H, J = 8.5, 2.8 Hz), 6.54 (s, 2H), 5.82-5.92 (m, 2H), 5.14-5.22 (m, 4H), 4.07 (s, 2H), 3.90-3.91 (m, 4H), 3.06 (t, 4H, J = 5.6 Hz), 2.68 (t, 4H, J = 6.6 Hz), 1.91-1.97 (m, 4H), 1.60 (s, 6H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ146.8, 146.6, 141.4, 134.6, 133.9, 130.4, 127.4, 126.6, 121.8, 116.2, 111.3, 110.2, 74.2, 53.2, 50.3, 38.1, 31.9, 27.7, 22.4; HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 417.29004, Found, 417.29083 (-0.8 mDa)
1H NMR (400 MHz,CDCl3): δ6.96 (d, 1H, J = 8.5 Hz), 6.82 (d, 1H, J = 2.8 Hz), 6.56 (dd, 1H, J = 8.5, 2.8 Hz), 6.54 (s, 2H), 5.82-5.92 (m, 2H), 5.14-5.22 (m, 4H), 4.07 (s, 2H), 3.90-3.91 (m, 4H), 3.06 (t, 4H, J = 5.6 Hz), 2.68 (t, 4H, J = 6.6 Hz), 1.91-1.97 (m, 4H), 1.60 (s, 6H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ146.8, 146.6, 141.4, 134.6, 133.9, 130.4, 127.4, 126.6, 121.8, 116.2, 111.3, 110.2, 74.2, 53.2, 50.3, 38.1, 31.9, 27.7, 22.4; HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 417.29004, Found, 417.29083 (-0.8 mDa)
化合物７の合成
化合物６（１．７７ｇ、４．２ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を８０％（ｖ／ｖ）硫酸５ｍＬに溶解し、０℃で１５分間撹拌した。室温に戻し、さらに１．５時間撹拌した。０℃に冷却し、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加えジクロロメタンで３回抽出し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去した。残渣とテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（６８９ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ、０．１４ｅｑ）、１、３－ジメチルバルビツール酸（１２．４ｇ、７９．５ｍｍｏｌ、１９ｅｑ）を脱酸素ジクロロメタン２５ｍＬに溶解し、アルゴン雰囲気化、３５℃で１２時間撹拌した。飽和１Ｎ炭酸ナトリウム水溶液を加えジクロロメタンで３回抽出し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝７６／２４→５５／４５）により精製し、化合物７（１．０４ｇ、７７％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ6.94 (d, 1H. J = 8.0 Hz), 6.80 (d, 1H, J = 2.2 Hz), 6.70 (s, 1H), 6.53 (dd, 1H, J = 8.0, 2.2Hz), 3.93 (s, 2H), 3.54 (brs, 2H), 3.11-3.17 (m, 4H), 2.95 (t, 2H, J = 6.1 Hz), 2.72 (t, 2H, J = 6.3 Hz), 1.91-1.97 (m, 4H), 1.76 (s. 6H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3gfyb): δ148.6, 144.3, 143.0, 138.5, 128.3, 127.0, 122.8, 122.5, 121.5, 121.2, 113.8, 113.7, 51.1, 50.1, 38.8, 33.4, 32.1, 28.1, 27.8, 22.9, 22.1; HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 319.21688, Found, 319.21709 (-0.2 mDa)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ6.94 (d, 1H. J = 8.0 Hz), 6.80 (d, 1H, J = 2.2 Hz), 6.70 (s, 1H), 6.53 (dd, 1H, J = 8.0, 2.2Hz), 3.93 (s, 2H), 3.54 (brs, 2H), 3.11-3.17 (m, 4H), 2.95 (t, 2H, J = 6.1 Hz), 2.72 (t, 2H, J = 6.3 Hz), 1.91-1.97 (m, 4H), 1.76 (s. 6H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3gfyb): δ148.6, 144.3, 143.0, 138.5, 128.3, 127.0, 122.8, 122.5, 121.5, 121.2, 113.8, 113.7, 51.1, 50.1, 38.8, 33.4, 32.1, 28.1, 27.8, 22.9, 22.1; HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 319.21688, Found, 319.21709 (-0.2 mDa)
化合物８の合成
化合物７（２０８ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ、１ｅｑ）をジクロロメタン５ｍＬに溶解し、 Ｃｈｌｏｒａｎｉｌ（１６０ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を加え室温で３０分間撹拌した。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えジクロロメタンで３回抽出し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去した。残渣をＨＰＬＣ（ｅｌｕｅｎｔ Ａ（Ｈ２Ｏ、１％ ＣＨ３ＣＮ、０．１％ ＴＦＡ）ａｎｄ ｅｌｕｅｎｔ Ｂ（ＣＨ３ＣＮ、１％ Ｈ２Ｏ）（Ａ／Ｂ＝９０／１０ ｔｏ ０／１００ ｉｎ ４０ｍｉｎ））で精製し、化合物８（１９１ｍｇ、９２％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ7.85 (s, 1H), 7.48 (d, 1H, J = 8.6 Hz), 7.31 (s, 1H), 6.97 (d, 1H, J = 2.0 Hz), 6.72 (dd, 1H, J = 8.6, 2.0 Hz), 3.60-3.64 (m, 4H), 3.18 (t, 2H, J = 6.0 Hz), 2.82 (t, 2H, J = 6.2 Hz), 1.99-2.08 (m, 4H), 1.78 (s, 6H); 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ161.1, 159.9, 155.8, 155.2, 151.5, 138.7, 138.6, 125.1, 124.9, 122.8, 120.5, 115.5, 114.1, 53.5, 52.7, 42.5, 30.3, 28.3, 28.1, 21.6, 21.5; HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 317.20123, Found, 317.20145 (-0.2 mDa)
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ7.85 (s, 1H), 7.48 (d, 1H, J = 8.6 Hz), 7.31 (s, 1H), 6.97 (d, 1H, J = 2.0 Hz), 6.72 (dd, 1H, J = 8.6, 2.0 Hz), 3.60-3.64 (m, 4H), 3.18 (t, 2H, J = 6.0 Hz), 2.82 (t, 2H, J = 6.2 Hz), 1.99-2.08 (m, 4H), 1.78 (s, 6H); 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ161.1, 159.9, 155.8, 155.2, 151.5, 138.7, 138.6, 125.1, 124.9, 122.8, 120.5, 115.5, 114.1, 53.5, 52.7, 42.5, 30.3, 28.3, 28.1, 21.6, 21.5; HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 317.20123, Found, 317.20145 (-0.2 mDa)
９ＣＮ－ＪＣＰの合成
化合物８（６３．５ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ、１ｅｑ）をアセトニトリル１０ｍＬと水５ｍＬに溶解し、０．３Ｍシアン化カリウム水溶液１０ｍＬ（３．１ｍｍｏｌ、１６ｅｑ）を加え室温で１５分間撹拌した。さらに１Ｎ塩酸４ｍＬに溶解した塩化鉄（ＩＩＩ）六水和物（５００ｍｇ，１．８５ｍｍｏｌ、９．３ｅｑ）を加え室温で１５分間撹拌した。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えジクロロメタンで３回抽出し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去した。残渣をＨＰＬＣ（ｅｌｕｅｎｔ Ａ（Ｈ２Ｏ、１％ ＣＨ３ＣＮ、０．１％ ＴＦＡ）ａｎｄ ｅｌｕｅｎｔ Ｂ（ＣＨ３ＣＮ、１％ Ｈ２Ｏ）（Ａ／Ｂ＝９０／１０ ｔｏ ０／１００ ｉｎ ４０ｍｉｎ））で精製し、９ＣＮ－ＪＣＰ（２．８ｍｇ、４．１％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ7.65 (d, 1H, J = 8.9 Hz), 7.57 (s, 1H), 6.89 (d, 1H, J = 2.1 Hz), 6.70 (dd, 1H, J = 8.9, 2.1 Hz), 3.63-3.65 (m, 4H), 3.10 (t, 2H, J = 6.0 Hz), 2.79 (t, 2H, J = 5.9 Hz), 1.92-2.01 (m, 4H), 1.71 (s, 6H); HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 342.19647, Found, 342.19700 (-0.5 mDa)
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ7.65 (d, 1H, J = 8.9 Hz), 7.57 (s, 1H), 6.89 (d, 1H, J = 2.1 Hz), 6.70 (dd, 1H, J = 8.9, 2.1 Hz), 3.63-3.65 (m, 4H), 3.10 (t, 2H, J = 6.0 Hz), 2.79 (t, 2H, J = 5.9 Hz), 1.92-2.01 (m, 4H), 1.71 (s, 6H); HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 342.19647, Found, 342.19700 (-0.5 mDa)
［合成実施例２］
９ＣＮ－ＪＣＰに酵素基質を導入したプローブモデル化合物Ａｃ－9ＣＮ－ＪＣＰの合成を以下のスキーム２により行った。
９ＣＮ－ＪＣＰに酵素基質を導入したプローブモデル化合物Ａｃ－9ＣＮ－ＪＣＰの合成を以下のスキーム２により行った。
スキーム２
(a) Acetyl Chloride, dry pyridine, y. 50%. (b) Chroranil, DCM, y. 13%. (c) 1) KCN, MeCN, H2O, 2) FeCl3, HCl aq, y. 9.3% in 2 steps.
(a) Acetyl Chloride, dry pyridine, y. 50%. (b) Chroranil, DCM, y. 13%. (c) 1) KCN, MeCN, H2O, 2) FeCl3, HCl aq, y. 9.3% in 2 steps.
化合物9の合成
化合物７（４０７ｍｇ、１．２７ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を脱水ピリジン５ｍＬに溶解し、アルゴン雰囲気化、０℃で撹拌した。塩化アセチル（９１μＬ、１．２７ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を加え，室温に戻し１６時間撹拌した。溶媒を減圧除去し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝５０／５０→２９／７１）により精製し、化合物９（２３０ｍｇｇ、５０％）を得た。
1H NMR (400 MHz,CDCl3): δ7.61 (d, 1H, J = 2.1 Hz), 7.33 (brs, 1H), 7.28 (dd, 1H, J = 8.2, 2.1 Hz), 7.09 (d, 1H, J = 8.2 Hz), 6.71 (s, 1H), 3.99 (s, 2H), 3.12-3.19 (m, 4H), 2.95 (t, 2H, J = 6.1 Hz), 2.73 (t, 2H, J = 6.3 Hz), 2.17 (s, 3H), 1.91-1.98 (m, 4H), 1.77 (s, 6H); HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 361.22744, Found, 361.22754 (-0.1 mDa)
1H NMR (400 MHz,CDCl3): δ7.61 (d, 1H, J = 2.1 Hz), 7.33 (brs, 1H), 7.28 (dd, 1H, J = 8.2, 2.1 Hz), 7.09 (d, 1H, J = 8.2 Hz), 6.71 (s, 1H), 3.99 (s, 2H), 3.12-3.19 (m, 4H), 2.95 (t, 2H, J = 6.1 Hz), 2.73 (t, 2H, J = 6.3 Hz), 2.17 (s, 3H), 1.91-1.98 (m, 4H), 1.77 (s, 6H); HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 361.22744, Found, 361.22754 (-0.1 mDa)
化合物１０の合成
化合物９（２３０ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ、１ｅｑ）をジクロロメタン５ｍＬに溶解し、 Ｃｈｌｏｒａｎｉｌ（１５７ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を加え室温で３０分間撹拌した。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えジクロロメタンで３回抽出し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去した。残渣をＨＰＬＣ（ｅｌｕｅｎｔ Ａ（Ｈ２Ｏ、１％ ＣＨ３ＣＮ、０．１％ ＴＦＡ）ａｎｄ ｅｌｕｅｎｔ Ｂ（ＣＨ３ＣＮ、１％ Ｈ２Ｏ）（Ａ／Ｂ＝９０／１０ ｔｏ ０／１００ ｉｎ ４０ｍｉｎ））で精製し、化合物１０（２９．３ｍｇ、１３％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ8.02 (s, 1H), 7.80 (s, 1H), 7.51 (s, 2H), 7.34 (s, 1H), 3.67-3.70 (m, 4H), 3.16 (t, 2H, J = 6.1 Hz), 2.76 (t, 2H, J = 6.2 Hz), 2.10 (s, 3H), 1.93-2.05 (m, 4H), 1.73 (s, 6H); HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 359.21179, Found, 359.21379 (-2.0 mDa)
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ8.02 (s, 1H), 7.80 (s, 1H), 7.51 (s, 2H), 7.34 (s, 1H), 3.67-3.70 (m, 4H), 3.16 (t, 2H, J = 6.1 Hz), 2.76 (t, 2H, J = 6.2 Hz), 2.10 (s, 3H), 1.93-2.05 (m, 4H), 1.73 (s, 6H); HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 359.21179, Found, 359.21379 (-2.0 mDa)
Ａｃ－９ＣＮ－ＪＣＰの合成
化合物１０（２９．３ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ、１ｅｑ）をアセトニトリル５ｍＬと水２ｍＬに溶解し、０．３Ｍシアン化カリウム水溶液２．７ｍＬ（０．８ｍｍｏｌ、１０ｅｑ）を加え室温で１５分間撹拌した。さらに１Ｎ塩酸２ｍＬに溶解した塩化鉄（ＩＩＩ）六水和物（２２０ｍｇ，０．８ｍｍｏｌ、１０ｅｑ）を加え室温で１５分間撹拌した。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えジクロロメタンで３回抽出し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去した。残渣をＨＰＬＣ（ｅｌｕｅｎｔ Ａ（Ｈ２Ｏ、１％ ＣＨ３ＣＮ、０．１％ ＴＦＡ）ａｎｄ ｅｌｕｅｎｔ Ｂ（ＣＨ３ＣＮ、１％ Ｈ２Ｏ）（Ａ／Ｂ＝９０／１０ ｔｏ ０／１００ ｉｎ ４０ｍｉｎ））で精製し、Ａｃ－９ＣＮ－ＪＣＰ（２．９ｍｇ、９．３％）を得た。
1H NMR (400 MHz,CD3OD): δ8.01 (d, 1H, J = 2.0 Hz), 7.77 (d, 1H, J = 8.7 Hz), 7.69 (s, 1H), 7.54 (dd, 1H, J = 8.7, 2.0 Hz), 3.81-3.83 (m, 4H), 3.21 (m, 2H, partially overlapped with the CD3OD peak), 2.85 (t, 2H, J = 5.8 Hz), 2.10 (s, 3H), 2.00-2.07 (m, 4H), 1,77 (s, 6H); HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 384.20704, Found, 384.20774 (-0.7 mDa)
1H NMR (400 MHz,CD3OD): δ8.01 (d, 1H, J = 2.0 Hz), 7.77 (d, 1H, J = 8.7 Hz), 7.69 (s, 1H), 7.54 (dd, 1H, J = 8.7, 2.0 Hz), 3.81-3.83 (m, 4H), 3.21 (m, 2H, partially overlapped with the CD3OD peak), 2.85 (t, 2H, J = 5.8 Hz), 2.10 (s, 3H), 2.00-2.07 (m, 4H), 1,77 (s, 6H); HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 384.20704, Found, 384.20774 (-0.7 mDa)
［合成実施例３］
９ＣＮ－ＪＣＰのＣＮ基を安定同位体で標識したプローブ母核9Ｃ１５Ｎ－ＪＣＰおよび9１３ＣＮ－ＪＣＰの合成を以下のスキーム３により行った。
９ＣＮ－ＪＣＰのＣＮ基を安定同位体で標識したプローブ母核9Ｃ１５Ｎ－ＪＣＰおよび9１３ＣＮ－ＪＣＰの合成を以下のスキーム３により行った。
スキーム３
(a) 1) KC15N, MeCN, H2O, 2) UV irradiation, MeOH, y. 6.2% in 2 steps. (b) 1) K13CN, MeCN, H2O, 2) UV irradiation, MeOH, y. 8.6% in 2 steps.
(c) 1) K13C15N, MeCN, H2O, 2) UV irradiation, MeOH, y. 8.4% in 2 steps.
(a) 1) KC15N, MeCN, H2O, 2) UV irradiation, MeOH, y. 6.2% in 2 steps. (b) 1) K13CN, MeCN, H2O, 2) UV irradiation, MeOH, y. 8.6% in 2 steps.
(c) 1) K13C15N, MeCN, H2O, 2) UV irradiation, MeOH, y. 8.4% in 2 steps.
９Ｃ １５ Ｎ－ＪＣＰの合成
化合物８（５５．１ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ、１ｅｑ）をアセトニトリル５ｍＬと水２ｍＬに溶解し、０．３Ｍ ＫＣ１５Ｎ水溶液２．７ｍＬ（０．８ｍｍｏｌ、４．６ｅｑ）を加え室温で１５分間撹拌した。反応溶液をメタノールで洗いこんでビーカーに移し、２５４ｎｍのＵＶを照射しながら１時間撹拌した。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えジクロロメタンで３回抽出し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去した。残渣をＨＰＬＣ（ｅｌｕｅｎｔ Ａ（Ｈ２Ｏ、１％ ＣＨ３ＣＮ、０．１％ ＴＦＡ）ａｎｄ ｅｌｕｅｎｔ Ｂ（ＣＨ３ＣＮ、１％ Ｈ２Ｏ）（Ａ／Ｂ＝９０／１０ ｔｏ ０／１００ ｉｎ ４０ｍｉｎ））で精製し、９Ｃ１５Ｎ－ＪＣＰ（３．７ｍｇ、６．２％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ7.66 (d, 1H, J = 8.9 Hz), 7.54 (s, 1H), 7.00 (d, 1H, J = 1.9 Hz), 6.83 (dd, 1H, J = 1.9, 8.9 Hz), 3.70-3.71 (m, 4H), 3.11 (t, 2H, J = 5.7 Hz), 2.84 (t, 2H, J = 5.7 Hz), 1.93-2.00 (m, 2H), 1.73 (s, 6H); HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 343.19359, Found, 343.19377 (-0.2 mDa)
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ7.66 (d, 1H, J = 8.9 Hz), 7.54 (s, 1H), 7.00 (d, 1H, J = 1.9 Hz), 6.83 (dd, 1H, J = 1.9, 8.9 Hz), 3.70-3.71 (m, 4H), 3.11 (t, 2H, J = 5.7 Hz), 2.84 (t, 2H, J = 5.7 Hz), 1.93-2.00 (m, 2H), 1.73 (s, 6H); HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 343.19359, Found, 343.19377 (-0.2 mDa)
９ １３ ＣＮ－ＪＣＰの合成
化合物８（１７．７ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ、１ｅｑ）をアセトニトリル３ｍＬと水１ｍＬに溶解し、０．３Ｍ Ｋ１３ＣＮ水溶液１ｍＬ（０．２６ｍｍｏｌ、４．６ｅｑ）を加え室温で１５分間撹拌した。反応溶液をメタノールで洗いこんでビーカーに移し、２５４ｎｍのＵＶを照射しながら１時間撹拌した。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えジクロロメタンで３回抽出し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去した。残渣をＨＰＬＣ（ｅｌｕｅｎｔ Ａ（Ｈ２Ｏ、１％ ＣＨ３ＣＮ、０．１％ ＴＦＡ）ａｎｄ ｅｌｕｅｎｔ Ｂ（ＣＨ３ＣＮ、１％ Ｈ２Ｏ）（Ａ／Ｂ＝９０／１０ ｔｏ ０／１００ ｉｎ ４０ｍｉｎ））で精製し、９１３ＣＮ－ＪＣＰ（１．７ｍｇ、８．６％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ7.77 (d, 1H, J = 8.9 Hz), 7.69 (s, 1H), 7.01 (d, 1H, J = 2.1 Hz), 6.82 (dd, 1H, J = 2.1, 8.9 Hz), 3.75-3.76 (m, 4H), 3.22 (t, 2H, J = 6.0 Hz), 2.91 (t, 2H, J = 6.0 Hz), 2.06-2.11 (m, 2H), 1.83 (s, 6H); HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 343.19983, Found, 343.19941 (0.4 mDa)
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ7.77 (d, 1H, J = 8.9 Hz), 7.69 (s, 1H), 7.01 (d, 1H, J = 2.1 Hz), 6.82 (dd, 1H, J = 2.1, 8.9 Hz), 3.75-3.76 (m, 4H), 3.22 (t, 2H, J = 6.0 Hz), 2.91 (t, 2H, J = 6.0 Hz), 2.06-2.11 (m, 2H), 1.83 (s, 6H); HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 343.19983, Found, 343.19941 (0.4 mDa)
９ １３ Ｃ １５ Ｎ－ＪＣＰの合成
化合物８（３１．１ｍｇ、０．０９８ｍｍｏｌ、１ｅｑ）をアセトニトリル３ｍＬと水１ｍＬに溶解し、０．３Ｍ Ｋ１３Ｃ１５Ｎ水溶液１ｍＬ（０．４５ｍｍｏｌ、４．６ｅｑ）を加え室温で１５分間撹拌した。反応溶液をメタノールで洗いこんでビーカーに移し、２５４ｎｍのＵＶを照射しながら１時間撹拌した。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えジクロロメタンで３回抽出し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去した。残渣をＨＰＬＣ（ｅｌｕｅｎｔ Ａ（Ｈ２Ｏ、１％ ＣＨ３ＣＮ、０．１％ ＴＦＡ）ａｎｄ ｅｌｕｅｎｔ Ｂ（ＣＨ３ＣＮ、１％ Ｈ２Ｏ）（Ａ／Ｂ＝９０／１０ ｔｏ ０／１００ ｉｎ ４０ｍｉｎ））で精製し、９１３Ｃ１５Ｎ－ＪＣＰ（２．８ｍｇ、８．４％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 7.65 (d, 1H, J = 8.9 Hz), 7.57 (s, 1H), 6.89 (d, 1H, J = 2.1 Hz), 6.70 (dd, 1H, J = 8.9, 2.1 Hz), 3.63-3.64 (m, 4H), 3.10 (t, 2H, J = 5.9 Hz), 2.79 (t, 2H, J = 5.9 Hz), 1.92-2.01 (m, 2H), 1.71 (s, 6H); HRMS (ESI+ ): Calcd for [M]+ , 344.19694, Found, 344.19813 (-1.2 mDa)
化合物８（３１．１ｍｇ、０．０９８ｍｍｏｌ、１ｅｑ）をアセトニトリル３ｍＬと水１ｍＬに溶解し、０．３Ｍ Ｋ１３Ｃ１５Ｎ水溶液１ｍＬ（０．４５ｍｍｏｌ、４．６ｅｑ）を加え室温で１５分間撹拌した。反応溶液をメタノールで洗いこんでビーカーに移し、２５４ｎｍのＵＶを照射しながら１時間撹拌した。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えジクロロメタンで３回抽出し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去した。残渣をＨＰＬＣ（ｅｌｕｅｎｔ Ａ（Ｈ２Ｏ、１％ ＣＨ３ＣＮ、０．１％ ＴＦＡ）ａｎｄ ｅｌｕｅｎｔ Ｂ（ＣＨ３ＣＮ、１％ Ｈ２Ｏ）（Ａ／Ｂ＝９０／１０ ｔｏ ０／１００ ｉｎ ４０ｍｉｎ））で精製し、９１３Ｃ１５Ｎ－ＪＣＰ（２．８ｍｇ、８．４％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 7.65 (d, 1H, J = 8.9 Hz), 7.57 (s, 1H), 6.89 (d, 1H, J = 2.1 Hz), 6.70 (dd, 1H, J = 8.9, 2.1 Hz), 3.63-3.64 (m, 4H), 3.10 (t, 2H, J = 5.9 Hz), 2.79 (t, 2H, J = 5.9 Hz), 1.92-2.01 (m, 2H), 1.71 (s, 6H); HRMS (ESI+ ): Calcd for [M]+ , 344.19694, Found, 344.19813 (-1.2 mDa)
［合成実施例４］
標的酵素ＤＰＰ－４の認識配列であるＥＰのジペプチド基質をプローブに導入するために、Ｂｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｐｒｏ－ＯＨの合成を以下のスキーム４により行った。
標的酵素ＤＰＰ－４の認識配列であるＥＰのジペプチド基質をプローブに導入するために、Ｂｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｐｒｏ－ＯＨの合成を以下のスキーム４により行った。
スキーム４
(a) 1) COMU, DIEA, dry DMF, 2) Pd/C, H2, MeOH, y. 87% in 2 steps.
(a) 1) COMU, DIEA, dry DMF, 2) Pd/C, H2, MeOH, y. 87% in 2 steps.
Ｂｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｐｒｏ－ＯＨの合成
Ｂｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ（２００ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ、１ｅｑ）とＨ－Ｐｒｏ－ＯＢｚｌ（１６０ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ、１ｅｑ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（３４０μＬ、１．９８ｍｍｏｌ、３ｅｑ）を脱水Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド５ｍＬに溶解し、アルゴン雰囲気化、０℃で１０分間撹拌した。脱水Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド２ｍＬに溶解したＣＯＭＵ（３１１ｍｇ、０．７８ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ）を加え，室温に戻し１８時間撹拌した。飽和塩化アンモニウム水溶液を加え酢酸エチルで３回抽出し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝７８／２２→５７／４３）により一部精製した。目的化合物を含む画分を集めた後に減圧除去によって溶媒を除き、残渣をメタノール１００ｍＬに溶解し、パラジウム／炭素（Ｐｄ １０％）を一さじ加え、水素雰囲気化，室温で１時間撹拌した。パラジウム／炭素（Ｐｄ １０％）をろ過して溶媒を減圧除去し、Ｂｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｐｒｏ－ＯＨ（２３０ｍｇ、８７％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ4.33-4.38 (m, 2H), 3.63-3.71 (m, 2H), 2.27-2.30 (m, 2H), 2.16-2.19 (m, 1H), 1.90-1.95 (m, 4H), 1.62-1.71 (m, 1H), 1.36 (s, 9H), 1.33 (s, 9H)
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ4.33-4.38 (m, 2H), 3.63-3.71 (m, 2H), 2.27-2.30 (m, 2H), 2.16-2.19 (m, 1H), 1.90-1.95 (m, 4H), 1.62-1.71 (m, 1H), 1.36 (s, 9H), 1.33 (s, 9H)
［合成実施例５］
標的酵素β－Ｇalの糖基質をカルバメートリンカーを介してプローブに導入するために、化合物１２の合成を以下のスキーム５により行った。
標的酵素β－Ｇalの糖基質をカルバメートリンカーを介してプローブに導入するために、化合物１２の合成を以下のスキーム５により行った。
スキーム５
(a) 1) AcONH4, dry DMF, 2) 4-nitrophenyl chloroformate, TEA, DCM, y. 61% in 2 steps.
(a) 1) AcONH4, dry DMF, 2) 4-nitrophenyl chloroformate, TEA, DCM, y. 61% in 2 steps.
化合物１２の合成
ペンタ－Ｏ－アセチル－β－Ｄ－ガラクトピラノース（化合物１１）（５５２ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ、１ｅｑ）と酢酸アンモニウム（４１５ｍｇ、５．４ｍｍｏｌ、３．９ｅｑ）を脱水Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド５ｍＬに溶解し、室温で２４時間撹拌した。溶媒を減圧除去した後、残渣を酢酸エチルで３回抽出し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去した。残渣とトリエチルアミン（６９３ｍｇ、３．４ｍｍｏｌ、２．４ｅｑ）をジクロロメタン１０ｍＬに溶解し、アルゴン雰囲気下、室温で１０分間撹拌した。ジクロロメタン５ｍＬに溶解した４－ニトロフェニルクロロフォルメート（２９８μＬ、２．２ｍｍｏｌ、１.６ｅｑ）をゆっくりと滴下し、室温で１５時間撹拌した。溶媒を減圧除去し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝６７／３３→４７／５３）により精製し、化合物１２（４４０ｍｇ、６１％）を得た。
ペンタ－Ｏ－アセチル－β－Ｄ－ガラクトピラノース（化合物１１）（５５２ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ、１ｅｑ）と酢酸アンモニウム（４１５ｍｇ、５．４ｍｍｏｌ、３．９ｅｑ）を脱水Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド５ｍＬに溶解し、室温で２４時間撹拌した。溶媒を減圧除去した後、残渣を酢酸エチルで３回抽出し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去した。残渣とトリエチルアミン（６９３ｍｇ、３．４ｍｍｏｌ、２．４ｅｑ）をジクロロメタン１０ｍＬに溶解し、アルゴン雰囲気下、室温で１０分間撹拌した。ジクロロメタン５ｍＬに溶解した４－ニトロフェニルクロロフォルメート（２９８μＬ、２．２ｍｍｏｌ、１.６ｅｑ）をゆっくりと滴下し、室温で１５時間撹拌した。溶媒を減圧除去し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝６７／３３→４７／５３）により精製し、化合物１２（４４０ｍｇ、６１％）を得た。
［合成実施例６］
標的酵素ＧＧＴ、ＬＡＰ、ＤＰＰ－４及びβ－Ｇａｌの基質を導入したａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ型ラマンプローブｇＧｌｕ－９ＣＮ－ＪＣＰ、Ｌｅｕ－9Ｃ１５Ｎ－ＪＣＰ、ＥＰ－9１３ＣＮ－ＪＣＰ及びβＧａｌ－9１３Ｃ15Ｎ－ＪＣＰの合成を以下のスキーム６により行った。
標的酵素ＧＧＴ、ＬＡＰ、ＤＰＰ－４及びβ－Ｇａｌの基質を導入したａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ型ラマンプローブｇＧｌｕ－９ＣＮ－ＪＣＰ、Ｌｅｕ－9Ｃ１５Ｎ－ＪＣＰ、ＥＰ－9１３ＣＮ－ＪＣＰ及びβＧａｌ－9１３Ｃ15Ｎ－ＪＣＰの合成を以下のスキーム６により行った。
スキーム６
(a) 1) Boc-Glu-OtBu, COMU, DIEA, dry DMF, 2) Chloranil, DCM, 3) KCN, MeCN, H2O,
4) UV irradiation, MeOH, 5) TFA, DCM, y. 5.7% in 5 steps. (b) 1) Boc-Leu-OH, COMU, DIEA, dry DMF, 2) Chloranil, DCM, 3) KC15N, MeCN, H2O, 4) UV irradiation, MeOH, 5) TFA, DCM, y. 10% in 5 steps. (c) 1) Boc-Glu(Ot Bu)-Pro-OH, COMU, DIEA, dry DMF, 2) Chloranil, DCM, 3) K13CN, MeCN, H2O, 4) UV irradiation, MeOH, 5) TFA, DCM, y. 6.2% in 5 steps. (d) 1) Compound 12, DIEA, dry DMF, 2) Chloranil, DCM, 3) K13C15N, MeCN, H2O, 4) UV irradiation, MeOH, 5) 28% NaOMe in MeOH, dry MeOH, y. 3.4% in 5 steps.
(a) 1) Boc-Glu-OtBu, COMU, DIEA, dry DMF, 2) Chloranil, DCM, 3) KCN, MeCN, H2O,
4) UV irradiation, MeOH, 5) TFA, DCM, y. 5.7% in 5 steps. (b) 1) Boc-Leu-OH, COMU, DIEA, dry DMF, 2) Chloranil, DCM, 3) KC15N, MeCN, H2O, 4) UV irradiation, MeOH, 5) TFA, DCM, y. 10% in 5 steps. (c) 1) Boc-Glu(Ot Bu)-Pro-OH, COMU, DIEA, dry DMF, 2) Chloranil, DCM, 3) K13CN, MeCN, H2O, 4) UV irradiation, MeOH, 5) TFA, DCM, y. 6.2% in 5 steps. (d) 1) Compound 12, DIEA, dry DMF, 2) Chloranil, DCM, 3) K13C15N, MeCN, H2O, 4) UV irradiation, MeOH, 5) 28% NaOMe in MeOH, dry MeOH, y. 3.4% in 5 steps.
ｇＧｌｕ－９ＣＮ－ＪＣＰの合成
化合物７（１２５ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ、１ｅｑ）とＢｏｃ－Ｇｌｕ－ＯｔＢｕ（２９８ｍｇ、０．９８ｍｍｏｌ、２．５ｅｑ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（３３５μＬ、１．９７ｍｍｏｌ、５ｅｑ）を脱水Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド５ｍＬに溶解し、アルゴン雰囲気化、０℃で１０分間撹拌した。脱水Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド２ｍＬに溶解したＣＯＭＵ（４２１ｍｇ、０．９８ｍｍｏｌ、２．５ｅｑ）を加え、室温に戻し２０時間撹拌した。溶媒を減圧除去し、残渣をジクロロメタン５ｍＬに溶解し、Ｃｈｌｏｒａｎｉｌ（９７ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を加え室温で３０分間撹拌した。溶媒を減圧除去し、残渣をＨＰＬＣ（ｅｌｕｅｎｔ Ａ（Ｈ２Ｏ、１％ ＣＨ３ＣＮ、０．１％ ＴＦＡ）ａｎｄ ｅｌｕｅｎｔ Ｂ（ＣＨ３ＣＮ、１％ Ｈ２Ｏ）（Ａ／Ｂ＝９０／１０ ｔｏ ０／１００ ｉｎ ４０ｍｉｎ））で一部精製し、中間体１３（２５２ｍｇ）を得た。中間体１３（６７．７ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ、１ｅｑ）をアセトニトリル５ｍＬと水１ｍＬに溶解し、０．３Ｍ ＫＣＮ水溶液１．２ｍＬ（０．３４ｍｍｏｌ、３ｅｑ）を加え室温で３０分間撹拌した。反応溶液をメタノールで洗いこんでビーカーに移し、２５４ｎｍのＵＶを照射しながら１時間撹拌した。溶媒を減圧除去し、残渣をＨＰＬＣ（ｅｌｕｅｎｔ Ａ（Ｈ２Ｏ、１％ ＣＨ３ＣＮ、０．１％ ＴＦＡ）ａｎｄ ｅｌｕｅｎｔ Ｂ（ＣＨ３ＣＮ、１％ Ｈ２Ｏ）（Ａ／Ｂ＝９０／１０ ｔｏ ０／１００ ｉｎ ４０ｍｉｎ））で一部精製し、溶媒を減圧除去した。残渣をトリフルオロ酢酸１ｍＬとジクロロメタン１ｍＬに溶解し、室温で４時間撹拌した。溶媒を減圧除去し、残渣をＨＰＬＣ（ｅｌｕｅｎｔ Ａ（Ｈ２Ｏ、１％ ＣＨ３ＣＮ、０．１％ ＴＦＡ）ａｎｄ ｅｌｕｅｎｔ Ｂ（ＣＨ３ＣＮ、１％ Ｈ２Ｏ）（Ａ／Ｂ＝９０／１０ ｔｏ ０／１００ ｉｎ ６０ｍｉｎ））で精製し、ｇＧｌｕ－９ＣＮ－ＪＣＰ（２．９ｍｇ、５．７％）を得た。
1H NMR(400 MHz, CD3OD): δ8.16 (d, 1H, J = 2.0 Hz), 7.88 (d, 1H, J = 8.7 Hz), 7.79 (s, 1H), 7.71 (dd, 1H, J = 2.0, 8.7 Hz), 4.08 (t, 1H, J = 6.7 Hz), 3.92-3.93 (m, 4H), 3.28 (t, 2H, J = 5.9 Hz, overlapped with the CD3OD peak), 2.95 (t, 2H, J = 5.9 Hz), 2.78 (t, 2H, 7.0 Hz), 2.23-2.34 (m, 2H), 2.10-2.16 (m, 4H), 1.87 (s, 6H); HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 471.23907, Found, 471.23932 (-0.3 mDa)
1H NMR(400 MHz, CD3OD): δ8.16 (d, 1H, J = 2.0 Hz), 7.88 (d, 1H, J = 8.7 Hz), 7.79 (s, 1H), 7.71 (dd, 1H, J = 2.0, 8.7 Hz), 4.08 (t, 1H, J = 6.7 Hz), 3.92-3.93 (m, 4H), 3.28 (t, 2H, J = 5.9 Hz, overlapped with the CD3OD peak), 2.95 (t, 2H, J = 5.9 Hz), 2.78 (t, 2H, 7.0 Hz), 2.23-2.34 (m, 2H), 2.10-2.16 (m, 4H), 1.87 (s, 6H); HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 471.23907, Found, 471.23932 (-0.3 mDa)
Ｌｅｕ－９Ｃ １５ Ｎ－ＪＣＰの合成
化合物７（１１３ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ、１ｅｑ）とＢｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ・Ｈ２Ｏ（２９８ｍｇ、０．８９ｍｍｏｌ、２．５ｅｑ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（３０１μＬ、１．７７ｍｍｏｌ、５ｅｑ）を脱水Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド３ｍＬに溶解し、アルゴン雰囲気化、０℃で１０分間撹拌した。脱水Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド２ｍＬに溶解したＣＯＭＵ（３８０ｍｇ、０．８９ｍｍｏｌ、２．５ｅｑ）を加え、室温に戻し１３時間撹拌した。溶媒を減圧除去し、残渣をジクロロメタン５ｍＬに溶解し、Ｃｈｌｏｒａｎｉｌ（８７ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を加え室温で３０分間撹拌した。溶媒を減圧除去し、残渣をＨＰＬＣ（ｅｌｕｅｎｔ Ａ（Ｈ２Ｏ、１％ ＣＨ３ＣＮ、０．１％ ＴＦＡ）ａｎｄ ｅｌｕｅｎｔ Ｂ（ＣＨ３ＣＮ、１％ Ｈ２Ｏ）（Ａ／Ｂ＝９０／１０ ｔｏ ０／１００ ｉｎ ４０ｍｉｎ））で一部精製し、中間体１４（２２１ｍｇ）を得た。中間体１４（３３．９ｍｇ、０．０６４ｍｍｏｌ、１ｅｑ）をアセトニトリル３ｍＬと水１ｍＬに溶解し、０．３Ｍ ＫＣ１５Ｎ水溶液０．６４ｍＬ（０．１９ｍｍｏｌ、３ｅｑ）を加え室温で３０分間撹拌した。反応溶液をメタノールで洗いこんでビーカーに移し、２５４ｎｍのＵＶを照射しながら１時間撹拌した。溶媒を減圧除去し、残渣をＨＰＬＣ（ｅｌｕｅｎｔ Ａ（Ｈ２Ｏ、１％ ＣＨ３ＣＮ、０．１％ ＴＦＡ）ａｎｄ ｅｌｕｅｎｔ Ｂ（ＣＨ３ＣＮ、１％ Ｈ２Ｏ）（Ａ／Ｂ＝９０／１０ ｔｏ ０／１００ ｉｎ ４０ｍｉｎ））で一部精製し、溶媒を減圧除去した。残渣をトリフルオロ酢酸１ｍＬとジクロロメタン１ｍＬに溶解し、室温で３時間撹拌した。溶媒を減圧除去し、残渣をＨＰＬＣ（ｅｌｕｅｎｔ Ａ（Ｈ２Ｏ、１％ ＣＨ３ＣＮ、０．１％ ＴＦＡ）ａｎｄ ｅｌｕｅｎｔ Ｂ（ＣＨ３ＣＮ、１％ Ｈ２Ｏ）（Ａ／Ｂ＝９０／１０ ｔｏ ０／１００ ｉｎ ６０ｍｉｎ））で精製し、Ｌｅｕ－９Ｃ１５Ｎ－ＪＣＰ（２．６ｍｇ、１０％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ8.12 (d, 1H, J = 1.9 Hz), 7.92 (d, 1H, J = 8.7 Hz), 7.80 (s, 1H), 7.77 (dd, 1H, J = 1.9, 8.7 Hz), 4.09 (t, 1H, J = 7.1 Hz), 3.93-3.95 (m, 4H), 3.32 (t, 2H, J = 6.0 Hz, overlapped with the CD3OD peak), 2.96 (t, 2H, J = 6.0 Hz), 2.11-2.18 (m, 4H), 1.88 (s, 6H), 1.84 (d, 2H, 8.8 Hz), 1.75-1.82 (m, 1H), 1.07 (d, 3H, 2.8 Hz), 1.05 (d, 3H, 2.8 Hz); HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 456.27768, Found, 456.27770 (-0.0 mDa)
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ8.12 (d, 1H, J = 1.9 Hz), 7.92 (d, 1H, J = 8.7 Hz), 7.80 (s, 1H), 7.77 (dd, 1H, J = 1.9, 8.7 Hz), 4.09 (t, 1H, J = 7.1 Hz), 3.93-3.95 (m, 4H), 3.32 (t, 2H, J = 6.0 Hz, overlapped with the CD3OD peak), 2.96 (t, 2H, J = 6.0 Hz), 2.11-2.18 (m, 4H), 1.88 (s, 6H), 1.84 (d, 2H, 8.8 Hz), 1.75-1.82 (m, 1H), 1.07 (d, 3H, 2.8 Hz), 1.05 (d, 3H, 2.8 Hz); HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 456.27768, Found, 456.27770 (-0.0 mDa)
ＥＰ－９ １３ ＣＮ－ＪＣＰの合成
化合物７（６２．９ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ、１ｅｑ）とＢｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｐｒｏ－ＯＨ（１７２ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ、２．５ｅｑ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１７０μＬ、０．９９ｍｍｏｌ、５ｅｑ）を脱水Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド３ｍＬに溶解し、アルゴン雰囲気化、０℃で１０分間撹拌した。脱水Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド２ｍＬに溶解したＣＯＭＵ（２１２ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ、２．５ｅｑ）を加え、室温に戻し２０時間撹拌した。溶媒を減圧除去し、残渣をジクロロメタン５ｍＬに溶解し、Ｃｈｌｏｒａｎｉｌ（４８．９ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を加え室温で３０分間撹拌した。溶媒を減圧除去し、残渣をＨＰＬＣ（ｅｌｕｅｎｔ Ａ（Ｈ２Ｏ、１％ ＣＨ３ＣＮ、０．１％ ＴＦＡ）ａｎｄ ｅｌｕｅｎｔ Ｂ（ＣＨ３ＣＮ、１％ Ｈ２Ｏ）（Ａ／Ｂ＝９０／１０ ｔｏ ０／１００ ｉｎ ４０ｍｉｎ））で一部精製し、中間体１５（８１．５ｍｇ）を得た。中間体１５（１９．７ｍｇ、０．０２８ｍｍｏｌ、１ｅｑ）をアセトニトリル３ｍＬと水１ｍＬに溶解し、０．３Ｍ Ｋ１３ＣＮ水溶液０．２８ｍＬ（０．０８４ｍｍｏｌ、３ｅｑ）を加え室温で３０分間撹拌した。反応溶液をメタノールで洗いこんでビーカーに移し、２５４ｎｍのＵＶを照射しながら１時間撹拌した。溶媒を減圧除去し、残渣をＨＰＬＣ（ｅｌｕｅｎｔ Ａ（Ｈ２Ｏ、１％ ＣＨ３ＣＮ、０．１％ ＴＦＡ）ａｎｄ ｅｌｕｅｎｔ Ｂ（ＣＨ３ＣＮ、１％ Ｈ２Ｏ）（Ａ／Ｂ＝９０／１０ ｔｏ ０／１００ ｉｎ ４０ｍｉｎ））で一部精製し、溶媒を減圧除去した。残渣をトリフルオロ酢酸１ｍＬとジクロロメタン１ｍＬに溶解し、室温で３時間撹拌した。溶媒を減圧除去し、残渣をＨＰＬＣ（ｅｌｕｅｎｔ Ａ（Ｈ２Ｏ、１％ ＣＨ３ＣＮ、０．１％ ＴＦＡ）ａｎｄ ｅｌｕｅｎｔ Ｂ（ＣＨ３ＣＮ、１％ Ｈ２Ｏ）（Ａ／Ｂ＝９０／１０ ｔｏ ０／１００ ｉｎ ６０ｍｉｎ））で精製し、ＥＰ－９１３ＣＮ－ＪＣＰ（１．７ｍｇ、６．２％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ8.08 (d, 1H, J = 1.9 Hz), 7.79 (d, 1H, J = 8.5 Hz), 7.70 (s, 1H), 7.59 (dd, 1H, J = 1.9, 8.5 Hz), 4.57 (m, 1H), 4.32 (t, 1H, J = 6.2 Hz), 3.82-3.83 (m, 4H), 3.20 (m, 2H, overlapped with the CD3OD peak), 3.19 (t, 2H, J = 5.7 Hz, overlapped with the CD3OD peak), 2.86 (t, 2H, J = 5.7 Hz), 2.56 (t, 2H, 7.2 Hz), 2.23-2.35 (m, 2H), 2.11-2.23 (m, 2H), 1.90-2.11 (m, 6H), 1.77 (s, 6H); HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 569.29519, Found, 569.29640 (-1.2 mDa)
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ8.08 (d, 1H, J = 1.9 Hz), 7.79 (d, 1H, J = 8.5 Hz), 7.70 (s, 1H), 7.59 (dd, 1H, J = 1.9, 8.5 Hz), 4.57 (m, 1H), 4.32 (t, 1H, J = 6.2 Hz), 3.82-3.83 (m, 4H), 3.20 (m, 2H, overlapped with the CD3OD peak), 3.19 (t, 2H, J = 5.7 Hz, overlapped with the CD3OD peak), 2.86 (t, 2H, J = 5.7 Hz), 2.56 (t, 2H, 7.2 Hz), 2.23-2.35 (m, 2H), 2.11-2.23 (m, 2H), 1.90-2.11 (m, 6H), 1.77 (s, 6H); HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 569.29519, Found, 569.29640 (-1.2 mDa)
βＧａｌ－９ １３ Ｃ 15 Ｎ－ＪＣＰの合成
化合物７（１４５ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ、１ｅｑ）とＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（７７５μＬ、４．６ｍｍｏｌ、１０ｅｑ）を脱水Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド５ｍＬに溶解し、アルゴン雰囲気化、０℃で１０分間撹拌した。脱水Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド３ｍＬに溶解した化合物１２（４５５ｍｇ、０．８８ｍｍｏｌ、１．９ｅｑ）、を加え、５０℃に加熱し１５時間撹拌した。溶媒を減圧除去し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝７０／３０→４９／５１）により粗精製物（２５２ｍｇ）を得た。粗生成物（８９ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ、１ｅｑ）をジクロロメタン５ｍＬに溶解し、クロラニル（３１ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を加え室温で３０分間撹拌した。溶媒を減圧除去し、残渣をＨＰＬＣ（ｅｌｕｅｎｔ Ａ（Ｈ２Ｏ、１％ ＣＨ３ＣＮ、０．１％ ＴＦＡ）ａｎｄ ｅｌｕｅｎｔ Ｂ（ＣＨ３ＣＮ、１％ Ｈ２Ｏ）（Ａ／Ｂ＝９０／１０ ｔｏ ０／１００ ｉｎ ４０ｍｉｎ））で一部精製し、中間体１６（２６９ｍｇ）を得た。中間体１６（１４５ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ、１ｅｑ）をアセトニトリル３ｍＬと水１ｍＬに溶解し、０．３Ｍ Ｋ１３Ｃ１５Ｎ水溶液１．５ｍＬ（０．４５ｍｍｏｌ、２．１ｅｑ）を加え室温で３０分間撹拌した。反応溶液をメタノールで洗いこんでビーカーに移し、２５４ｎｍのＵＶを照射しながら１時間撹拌した。溶媒を減圧除去し、残渣をＨＰＬＣ（ｅｌｕｅｎｔ Ａ（Ｈ２Ｏ、１％ ＣＨ３ＣＮ、０．１％ ＴＦＡ）ａｎｄ ｅｌｕｅｎｔ Ｂ（ＣＨ３ＣＮ、１％ Ｈ２Ｏ）（Ａ／Ｂ＝９０／１０ ｔｏ ０／１００ ｉｎ ４０ｍｉｎ））で一部精製し、溶媒を減圧除去した。残渣を脱水メタノール３ｍＬに溶解し、２８％ナトリウムメトキシド－メタノール溶液（１００μＬ）を加え、アルゴン雰囲気化、０℃で１５分間撹拌した。溶媒を減圧除去し、残渣をＨＰＬＣ（ｅｌｕｅｎｔ Ａ（Ｈ２Ｏ、１％ ＣＨ３ＣＮ、０．１％ ＴＦＡ）ａｎｄ ｅｌｕｅｎｔ Ｂ（ＣＨ３ＣＮ、１％ Ｈ２Ｏ）（Ａ／Ｂ＝９０／１０ ｔｏ ０／１００ ｉｎ ６０ｍｉｎ））で精製し、βＧａｌ－９１３Ｃ１５Ｎ－ＪＣＰ（１．７ｍｇ、３．４％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 7.94 (d, 1H, J = 1.9 Hz), 7.77 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 7.69 (s, 1H), 7.49 (dd, 1H, J = 8.8, 1.9 Hz), 5.40 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 3.81-3.82 (m, 4H), 3.54-3.66 (m, 5H), 3.49 (dd, 1H, J = 9.6, 3.4 Hz), 3.20 (m, 2H, overlapped with the CD3OD peak), 2.85 (t, 2H, J = 5.9 Hz), 1.99-2.06 (m, 4H), 1.77 (s, 6H); HRMS (ESI+ ): Calcd for [M]+, 569.29519, Found, 569.29640 (-1.2 mDa)
化合物７（１４５ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ、１ｅｑ）とＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（７７５μＬ、４．６ｍｍｏｌ、１０ｅｑ）を脱水Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド５ｍＬに溶解し、アルゴン雰囲気化、０℃で１０分間撹拌した。脱水Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド３ｍＬに溶解した化合物１２（４５５ｍｇ、０．８８ｍｍｏｌ、１．９ｅｑ）、を加え、５０℃に加熱し１５時間撹拌した。溶媒を減圧除去し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝７０／３０→４９／５１）により粗精製物（２５２ｍｇ）を得た。粗生成物（８９ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ、１ｅｑ）をジクロロメタン５ｍＬに溶解し、クロラニル（３１ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を加え室温で３０分間撹拌した。溶媒を減圧除去し、残渣をＨＰＬＣ（ｅｌｕｅｎｔ Ａ（Ｈ２Ｏ、１％ ＣＨ３ＣＮ、０．１％ ＴＦＡ）ａｎｄ ｅｌｕｅｎｔ Ｂ（ＣＨ３ＣＮ、１％ Ｈ２Ｏ）（Ａ／Ｂ＝９０／１０ ｔｏ ０／１００ ｉｎ ４０ｍｉｎ））で一部精製し、中間体１６（２６９ｍｇ）を得た。中間体１６（１４５ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ、１ｅｑ）をアセトニトリル３ｍＬと水１ｍＬに溶解し、０．３Ｍ Ｋ１３Ｃ１５Ｎ水溶液１．５ｍＬ（０．４５ｍｍｏｌ、２．１ｅｑ）を加え室温で３０分間撹拌した。反応溶液をメタノールで洗いこんでビーカーに移し、２５４ｎｍのＵＶを照射しながら１時間撹拌した。溶媒を減圧除去し、残渣をＨＰＬＣ（ｅｌｕｅｎｔ Ａ（Ｈ２Ｏ、１％ ＣＨ３ＣＮ、０．１％ ＴＦＡ）ａｎｄ ｅｌｕｅｎｔ Ｂ（ＣＨ３ＣＮ、１％ Ｈ２Ｏ）（Ａ／Ｂ＝９０／１０ ｔｏ ０／１００ ｉｎ ４０ｍｉｎ））で一部精製し、溶媒を減圧除去した。残渣を脱水メタノール３ｍＬに溶解し、２８％ナトリウムメトキシド－メタノール溶液（１００μＬ）を加え、アルゴン雰囲気化、０℃で１５分間撹拌した。溶媒を減圧除去し、残渣をＨＰＬＣ（ｅｌｕｅｎｔ Ａ（Ｈ２Ｏ、１％ ＣＨ３ＣＮ、０．１％ ＴＦＡ）ａｎｄ ｅｌｕｅｎｔ Ｂ（ＣＨ３ＣＮ、１％ Ｈ２Ｏ）（Ａ／Ｂ＝９０／１０ ｔｏ ０／１００ ｉｎ ６０ｍｉｎ））で精製し、βＧａｌ－９１３Ｃ１５Ｎ－ＪＣＰ（１．７ｍｇ、３．４％）を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 7.94 (d, 1H, J = 1.9 Hz), 7.77 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 7.69 (s, 1H), 7.49 (dd, 1H, J = 8.8, 1.9 Hz), 5.40 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 3.81-3.82 (m, 4H), 3.54-3.66 (m, 5H), 3.49 (dd, 1H, J = 9.6, 3.4 Hz), 3.20 (m, 2H, overlapped with the CD3OD peak), 2.85 (t, 2H, J = 5.9 Hz), 1.99-2.06 (m, 4H), 1.77 (s, 6H); HRMS (ESI+ ): Calcd for [M]+, 569.29519, Found, 569.29640 (-1.2 mDa)
［実施例１］
合成した化合物９ＣＮ－ＪＣＰとＡｃ－９ＣＮ－ＪＣＰの吸収スペクトルとＳＲＳスペクトルを取得した。結果として、９ＣＮ－ＪＣＰとＡｃ－９ＣＮ－ＪＣＰは最大吸収波長が１００ｎｍ以上シフトする大きな波長変化を示し、ＳＲＳスペクトルにおいて信号のｏｎ／ｏｆｆが観測された（図３参照）。
合成した化合物９ＣＮ－ＪＣＰとＡｃ－９ＣＮ－ＪＣＰの吸収スペクトルとＳＲＳスペクトルを取得した。結果として、９ＣＮ－ＪＣＰとＡｃ－９ＣＮ－ＪＣＰは最大吸収波長が１００ｎｍ以上シフトする大きな波長変化を示し、ＳＲＳスペクトルにおいて信号のｏｎ／ｏｆｆが観測された（図３参照）。
図３の（ａ）は、９ＣＮ－ＪＣＰおよびＡｃ－９ＣＮ－ＪＣＰの化学構造を示す。
図３の（ｂ）及び（ｃ）は、夫々、ＤＭＳＯ中（ｂ）、及び、共溶媒としてＤＭＳＯを０．１％含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で測定した１μＭ ９ＣＮ－ＪＣＰおよびＡｃ－９ＣＮ－ＪＣＰの吸収スペクトルである。
図３の（ｄ）は、ＤＭＳＯ中で測定した１ｍＭ ９ＣＮ－ＪＣＰおよびＡｃ－９ＣＮ－ＪＣＰのＳＲＳスペクトルである。
図３の（ｅ）は、共溶媒としてＤＭＳＯを１０％含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で測定した１ｍＭ ９ＣＮ－ＪＣＰおよびＡｃ－９ＣＮ－ＪＣＰのＳＲＳスペクトルである。データの取得回数は５回であった。
図３の（ｂ）及び（ｃ）は、夫々、ＤＭＳＯ中（ｂ）、及び、共溶媒としてＤＭＳＯを０．１％含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で測定した１μＭ ９ＣＮ－ＪＣＰおよびＡｃ－９ＣＮ－ＪＣＰの吸収スペクトルである。
図３の（ｄ）は、ＤＭＳＯ中で測定した１ｍＭ ９ＣＮ－ＪＣＰおよびＡｃ－９ＣＮ－ＪＣＰのＳＲＳスペクトルである。
図３の（ｅ）は、共溶媒としてＤＭＳＯを１０％含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で測定した１ｍＭ ９ＣＮ－ＪＣＰおよびＡｃ－９ＣＮ－ＪＣＰのＳＲＳスペクトルである。データの取得回数は５回であった。
［実施例２］
合成した９ＣＮ－ＪＣＰの同位体標識化合物９Ｃ１５Ｎ－ＪＣＰ、９１３ＣＮ－ＪＣＰ、９１３Ｃ１５Ｎ－ＪＣＰの吸収スペクトルと蛍光スペクトルとＳＲＳスペクトルを取得した。結果として、９ＣＮ－ＪＣＰ骨格を有する４種類の化合物はいずれも同等な吸収・蛍光スペクトルを示したが、ＳＲＳスペクトルではこれらを明確に分離検出することができた（図４参照）。
合成した９ＣＮ－ＪＣＰの同位体標識化合物９Ｃ１５Ｎ－ＪＣＰ、９１３ＣＮ－ＪＣＰ、９１３Ｃ１５Ｎ－ＪＣＰの吸収スペクトルと蛍光スペクトルとＳＲＳスペクトルを取得した。結果として、９ＣＮ－ＪＣＰ骨格を有する４種類の化合物はいずれも同等な吸収・蛍光スペクトルを示したが、ＳＲＳスペクトルではこれらを明確に分離検出することができた（図４参照）。
図４の（ａ）は、９ＣＮ－ＪＣＰ、９Ｃ１５Ｎ－ＪＣＰ、９１３ＣＮ－ＪＣＰ及び９１３Ｃ１５Ｎ－ＪＣＰの化学構造を示す。
図４の（ｂ）及び（ｃ）は、共溶媒としてＤＭＳＯを０．１％含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で測定した１μＭ ９ＣＮ－ＪＣＰ、９Ｃ１５Ｎ－ＪＣＰ、９１３ＣＮ－ＪＣＰ及び９１３Ｃ１５Ｎ－ＪＣＰの吸収スペクトル（ｂ）及び蛍光スペクトル（ｃ）を示す。励起波長は６４０ｎｍであった。
図４の（ｄ）は、ＤＭＳＯ中で測定した１ｍＭ ９ＣＮ－ＪＣＰ、９Ｃ１５Ｎ－ＪＣＰ、９１３ＣＮ－ＪＣＰ及び９１３Ｃ１５Ｎ－ＪＣＰのＳＲＳスペクトルを示す。図４の（ｅ）は、ＤＭＳＯ中で測定した０．２５ｍＭ ９ＣＮ－ＪＣＰ、９Ｃ１５Ｎ－ＪＣＰ、９１３ＣＮ－ＪＣＰ及び９１３Ｃ１５Ｎ－ＪＣＰの混合物のＳＲＳスペクトルを示す。データの取得回数は５回であった。
図４の（ｂ）及び（ｃ）は、共溶媒としてＤＭＳＯを０．１％含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で測定した１μＭ ９ＣＮ－ＪＣＰ、９Ｃ１５Ｎ－ＪＣＰ、９１３ＣＮ－ＪＣＰ及び９１３Ｃ１５Ｎ－ＪＣＰの吸収スペクトル（ｂ）及び蛍光スペクトル（ｃ）を示す。励起波長は６４０ｎｍであった。
図４の（ｄ）は、ＤＭＳＯ中で測定した１ｍＭ ９ＣＮ－ＪＣＰ、９Ｃ１５Ｎ－ＪＣＰ、９１３ＣＮ－ＪＣＰ及び９１３Ｃ１５Ｎ－ＪＣＰのＳＲＳスペクトルを示す。図４の（ｅ）は、ＤＭＳＯ中で測定した０．２５ｍＭ ９ＣＮ－ＪＣＰ、９Ｃ１５Ｎ－ＪＣＰ、９１３ＣＮ－ＪＣＰ及び９１３Ｃ１５Ｎ－ＪＣＰの混合物のＳＲＳスペクトルを示す。データの取得回数は５回であった。
［実施例３］
合成した化合物ｇＧｌｕ－９ＣＮ－ＪＣＰ、Ｌｅｕ－９Ｃ１５Ｎ－ＪＣＰ、ＥＰ－９１３ＣＮ－ＪＣＰ、βＧａｌ－９１３Ｃ１５Ｎ－ＪＣＰをそれぞれの標的酵素であるＧＧＴ（γ－ｇｌｕｔａｍｙｌ ｔｒａｎｓｐｅｐｔｉｄａｓｅ)、ＬＡＰ（Ｌｅｕｃｉｎｅ ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）、ＤＰＰ－４（Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ－４）、β－Ｇａｌ（β－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ)と反応させて吸収スペクトルを計測すると、それぞれ吸収波長が長波長にシフトして、プローブ母核９ＣＮ－ＪＣＰ、９Ｃ１５Ｎ－ＪＣＰ、９１３ＣＮ－ＪＣＰ、９１３Ｃ１５Ｎ－ＪＣＰが生成する様子が観測された。また同様の実験に対してＳＲＳスペクトルを取得すると、酵素反応の前後で信号がｏｆｆからｏｎになる様子が観測され、これらのプローブがａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ型ラマンプローブとなることが示唆された（図５参照）。
合成した化合物ｇＧｌｕ－９ＣＮ－ＪＣＰ、Ｌｅｕ－９Ｃ１５Ｎ－ＪＣＰ、ＥＰ－９１３ＣＮ－ＪＣＰ、βＧａｌ－９１３Ｃ１５Ｎ－ＪＣＰをそれぞれの標的酵素であるＧＧＴ（γ－ｇｌｕｔａｍｙｌ ｔｒａｎｓｐｅｐｔｉｄａｓｅ)、ＬＡＰ（Ｌｅｕｃｉｎｅ ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）、ＤＰＰ－４（Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ－４）、β－Ｇａｌ（β－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ)と反応させて吸収スペクトルを計測すると、それぞれ吸収波長が長波長にシフトして、プローブ母核９ＣＮ－ＪＣＰ、９Ｃ１５Ｎ－ＪＣＰ、９１３ＣＮ－ＪＣＰ、９１３Ｃ１５Ｎ－ＪＣＰが生成する様子が観測された。また同様の実験に対してＳＲＳスペクトルを取得すると、酵素反応の前後で信号がｏｆｆからｏｎになる様子が観測され、これらのプローブがａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ型ラマンプローブとなることが示唆された（図５参照）。
図５（ａ）は、ｇＧｌｕ－９ＣＮ－ＪＣＰとＧＧＴ、Ｌｅｕ－９Ｃ１５Ｎ－ＪＣＰとＬＡＰ、ＥＰ－９１３ＣＮ－ＪＣＰとＤＰＰ－４、及びβＧａｌ－９１３Ｃ１５ＣＮ－ＪＣＰとβ－Ｇａｌの反応スキームを示す。
図５（ｂ）～図５（ｅ）は、ｇＧｌｕ－９ＣＮ－ＪＣＰ（ｂ）、Ｌｅｕ－９Ｃ１５Ｎ－ＪＣＰ（ｃ）、ＥＰ－９１３ＣＮ－ＪＣＰ（ｄ）及びβＧａｌ－９１３Ｃ１５Ｎ－ＪＣＰ（ｅ）の各ターゲット酵素の有無による、ＰＢＳ（ｐＨ ７．４）中で測定した吸収スペクトル（左）及びＳＲＳスペクトル（右）を示す。（プローブ濃度は、吸収スペクトルについては１μＭ（共溶媒として０．１％ＤＭＳＯ）、ＳＲＳスペクトルについては１ｍＭ（共溶媒として１０％ＤＭＳＯ）であった。）データの取得回数は５回であった。
図５（ｂ）～図５（ｅ）は、ｇＧｌｕ－９ＣＮ－ＪＣＰ（ｂ）、Ｌｅｕ－９Ｃ１５Ｎ－ＪＣＰ（ｃ）、ＥＰ－９１３ＣＮ－ＪＣＰ（ｄ）及びβＧａｌ－９１３Ｃ１５Ｎ－ＪＣＰ（ｅ）の各ターゲット酵素の有無による、ＰＢＳ（ｐＨ ７．４）中で測定した吸収スペクトル（左）及びＳＲＳスペクトル（右）を示す。（プローブ濃度は、吸収スペクトルについては１μＭ（共溶媒として０．１％ＤＭＳＯ）、ＳＲＳスペクトルについては１ｍＭ（共溶媒として１０％ＤＭＳＯ）であった。）データの取得回数は５回であった。
［実施例４］
合成した４種類のａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ型ラマンプローブ（ｇＧｌｕ－９ＣＮ－ＪＣＰ、Ｌｅｕ－９Ｃ１５Ｎ－ＪＣＰ、ＥＰ－９１３ＣＮ－ＪＣＰ、βＧａｌ－９１３Ｃ１５Ｎ－ＪＣＰ）をそれぞれの標的酵素発現量の違うＡ５４９細胞とＨ２２６細胞にアプライして生細胞イメージングを行った。
その結果、ＧＧＴとβ－Ｇａｌが高発現であるＡ５４９細胞ではｇＧｌｕ－９ＣＮ－ＪＣＰとβＧａｌ－９１３Ｃ１５Ｎ－ＪＣＰ由来の信号が強く検出されたのに対し、ＬＡＰとＤＰＰ－４が高発現であるＨ２２６細胞ではＬｅｕ－９Ｃ１５Ｎ－ＪＣＰとＥＰ－９１３ＣＮ－ＪＣＰ由来の信号が強く検出され、開発したプローブがライブセルでその酵素活性に応じて信号がｏｆｆからｏｎになる、ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ型ラマンプローブとして使用できることが示唆された（図６参照）。
合成した４種類のａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ型ラマンプローブ（ｇＧｌｕ－９ＣＮ－ＪＣＰ、Ｌｅｕ－９Ｃ１５Ｎ－ＪＣＰ、ＥＰ－９１３ＣＮ－ＪＣＰ、βＧａｌ－９１３Ｃ１５Ｎ－ＪＣＰ）をそれぞれの標的酵素発現量の違うＡ５４９細胞とＨ２２６細胞にアプライして生細胞イメージングを行った。
その結果、ＧＧＴとβ－Ｇａｌが高発現であるＡ５４９細胞ではｇＧｌｕ－９ＣＮ－ＪＣＰとβＧａｌ－９１３Ｃ１５Ｎ－ＪＣＰ由来の信号が強く検出されたのに対し、ＬＡＰとＤＰＰ－４が高発現であるＨ２２６細胞ではＬｅｕ－９Ｃ１５Ｎ－ＪＣＰとＥＰ－９１３ＣＮ－ＪＣＰ由来の信号が強く検出され、開発したプローブがライブセルでその酵素活性に応じて信号がｏｆｆからｏｎになる、ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ型ラマンプローブとして使用できることが示唆された（図６参照）。
図６ａ及び図６ｂは、夫々、１０μＭｇＧｌｕ－９ＣＮ－ＪＣＰ、Ｌｅｕ－９Ｃ１５Ｎ－ＪＣＰ、ＥＰ－９１３ＣＮ－ＪＣＰ、及び２０μＭβＧａｌ－９１３Ｃ１５Ｎ－ＪＣＰの混合物で処理したＡ５４９細胞（図６ａ）及びＨ２２６細胞（図６ｂ）のＳＲＳ画像を示す。データの取得回数は１０００回であった。ＳＲＳ画像は、２２５０ｃｍ－１の画像を差し引くことで得られた。細胞中のＳＲＳスペクトルは、3.3 cm-1 毎に９１波数分の画像を連続的に撮影し、データの取得回数は５０回であった。
小関研究室のＳＲＳ顕微鏡で画像を取得した。
小関研究室のＳＲＳ顕微鏡で画像を取得した。
Claims (8)
- 以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩。
（式中、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を表し；
Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を表し；
Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、水素原子又は炭素数１～６個のアルキル基を表し、
Ｒ５又はＲ６は、Ｒ２又はＲ４と一緒になって、Ｒ２又はＲ４が結合している窒素原子を含む５～７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、
Ｒ５及びＲ６は、夫々、Ｒ２及びＲ４と一緒になって、Ｒ２及びＲ４が結合している窒素原子を含む５～７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、
該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは環構成員として酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群から選択される１～３個の更なるヘテロ原子を含有していてもよく、更に該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１～６個のアルキル、炭素数２～６個のアルケニル、又は炭素数２～６個のアルキニル、炭素数６～１０個のアラルキル基、炭素数６～１０個のアルキル置換アルケニル基で置換されていてもよく；
Ｒ７及びＲ８は、存在する場合は、それぞれ独立に、炭素数１～６個のアルキル基又はアリール基を表し、
ここで、Ｘが酸素原子の場合は、Ｒ７及びＲ８は存在せず、
Ｘがリン原子の場合は、－Ｒ７及び－Ｒ８の一方は、＝Ｏであってもよく；
Ｘは、珪素原子、酸素原子、炭素原子、スズ原子、リン原子又はゲルマニウム原子を表し；
Ｙは、－ＮＲａ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｌ、－ＮＲａ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－Ｌ’又は－Ｏ－Ｌ’であり、
ここで、Ｌは、アミノ酸の部分構造であり、
Ｌ’は、糖類又は糖類の部分構造であり、
Ｒａは、水素原子又は炭素数１～６個のアルキル基であり；
Ｚは、－Ｃ≡Ｃ－Ｒｂ、－１３Ｃ≡Ｃ－Ｒｂ、－１３Ｃ≡１３Ｃ－Ｒｂ、－Ｃ≡Ｎ、－Ｃ≡１５Ｎ、－１３Ｃ≡Ｎ、又は－１３Ｃ≡１５Ｎから選択され、
ここで、Ｒｂは、水素原子又は炭素数１～６個のアルキル基である。） - Ｌのアミノ酸の部分構造は、それが結合しているＣ＝Ｏと一緒になって、アミノ酸、アミノ酸残基、ペプチド、アミノ酸又はペプチドの一部を構成している構造である、請求項１に記載の化合物又はその塩。
- Ｌ’の糖類の部分構造は、それが結合しているＯと一緒になって、糖類又は糖類の一部を構成している構造である、請求項１に記載の化合物又はその塩。
- Ｙが以下の（１）～（３）のいずれかから選択される、請求項１に記載の化合物又はその塩。
- 一般式（Ｉ）の化合物又はその塩を含むラマンプローブ。
- ｅｐｒ－ＳＲＳ法に利用可能な請求項５に記載のラマンプローブ。
- 細胞又は組織内の標的酵素を検出する方法であって、（ａ）一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を細胞又は組織内に導入する工程、及び（ｂ）当該化合物又はその塩が細胞又は組織内で標的酵素と反応することにより増強されるラマン散乱光を測定する工程を含む方法。
- ｅｐｒ－ＳＲＳ法を用いてラマン散乱光を測定する、請求項７に記載の方法。
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|---|---|---|---|
| JP2020035842A JP2023056054A (ja) | 2020-03-03 | 2020-03-03 | Ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ型ラマンプローブ |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023167282A1 (ja) * | 2022-03-02 | 2023-09-07 | 国立大学法人 東京大学 | Ｏ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ型ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅラマンプローブ |
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|---|---|---|---|---|
| WO2014136780A1 (ja) * | 2013-03-04 | 2014-09-12 | 国立大学法人 東京大学 | カルパイン活性検出蛍光プローブ |
-
2020
- 2020-03-03 JP JP2020035842A patent/JP2023056054A/ja active Pending
-
2021
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Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014136780A1 (ja) * | 2013-03-04 | 2014-09-12 | 国立大学法人 東京大学 | カルパイン活性検出蛍光プローブ |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023167282A1 (ja) * | 2022-03-02 | 2023-09-07 | 国立大学法人 東京大学 | Ｏ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ型ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅラマンプローブ |
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|---|---|
| JP2023056054A (ja) | 2023-04-19 |
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