WO2014136780A1 - カルパイン活性検出蛍光プローブ - Google Patents

カルパイン活性検出蛍光プローブ Download PDF

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哲雄 長野
健二郎 花岡
優 串田
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国立大学法人 東京大学
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
    • G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
    • G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
    • G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
    • G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
    • G01N2333/96466—Cysteine endopeptidases (3.4.22)

Definitions

  • the present invention relates to a red fluorescent probe capable of detecting the activity of calpain.
  • Calpain a kind of cysteine protease, is an important modulator molecule that is activated by Ca 2+ concentration dependently and regulates various cellular functions through limited degradation of the substrate. Its intracellular activity is strictly controlled by a protein called calpastatin. Is controlled. As calpains that are universally present in cells in vivo, calpain-1 ( ⁇ -calpain) and calpain-2 (m-calpain) having different Ca 2+ concentrations necessary for enzyme activation are known, and these are 80 kDa + 30 kDa. Exists as a heterodimer.
  • calpain is deeply involved in the regulation of cell death and cell migration, and reports recently suggesting a relationship between calpain activity dysregulation and neurodegenerative diseases and cancer malignancy. Calpain is also attracting attention as a drug discovery target because it is involved in neurological and muscular diseases with few effective therapeutic agents such as multiple sclerosis, muscular dystrophy, and Alzheimer's disease. Visualization of calpain activity is important to elucidate disease mechanisms and conduct drug discovery research.
  • the intracellular Ca 2+ concentration and calpain activity can be observed simultaneously, but the combined use of the Ca 2+ probe Fura-2 and the blue fluorescent probe is impossible, and (3) the Ca 2+ release is dependent on light irradiation. It has been reported that when NP-EGTA, which is a caged compound to be uncaged, is UV-irradiated, the blue fluorescent probe undergoes light fading.
  • An object of the present invention is to provide a novel fluorescent probe for detecting calpain activity.
  • the present inventors By adding a new red region to the detection of calpain activity, the present inventors have used calain and other biomolecules, such as the use of Fura-2 and caged compounds, and the labeling of substrates with green fluorescent protein (GFP). We thought that it would be able to greatly contribute to the progress of calpain research by expanding the range of multi-color imaging. As a result, the present inventors have found that the problems of the prior art can be solved in a red fluorescent probe using a compound in which the oxygen atom of pyronine Y (PY), which is the basic skeleton of rhodamine, is replaced with a silicon atom, as a mother nucleus.
  • PY pyronine Y
  • R 1 represents a hydrogen atom or 1 to 4 identical or different monovalent substituents present on the benzene ring
  • R 2 represents a monovalent substituent
  • R 3 and R 4 each independently represent a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms
  • R 5 and R 6 each independently represents an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or an aryl group
  • R 7 and R 8 each independently represents a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms
  • R 9 and R 10 each independently represent a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and R 9 or R 10 together with R 3 or R 7 represents R 9 or R 10.
  • heterocyclyl or heteroaryl is alkyl having 1 to 6 carbons, alkenyl having 2 to 6 carbons, or alkynyl having 2 to 6 carbons, 6 to 10 carbons Optionally substituted with an aralkyl group of 6 to 10 carbon atoms;
  • R 11 represents a monovalent substituent that is cleaved by contact with calpain;
  • X represents a silicon atom, a germanium atom, or a tin atom) Or a salt thereof.
  • a method for measuring calpain comprising the following steps: (a) contacting the compound of any one of [1] to [7] or a salt thereof with calpain, and (b) the above The method including the process of measuring the fluorescence intensity of the compound after contact with the calpain produced
  • a calpain activity can be detected in a long wavelength region, and a fluorescent probe excellent in light stability can be provided.
  • the compounds of the present invention the range of multicolor imaging of calpain and other biomolecules, such as the use of Fura-2 and caged compounds and the labeling of substrates with green fluorescent protein (GFP), will be expanded. Is possible.
  • an “alkyl group” or an alkyl part of a substituent containing an alkyl part (such as an alkoxy group), for example, unless otherwise specified, has, for example, 1 to 6 carbon atoms, preferably 1 to 4 carbon atoms, More preferably, it means an alkyl group composed of straight, branched, cyclic, or a combination thereof having about 1 to 3 carbon atoms.
  • alkyl group for example, methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, cyclopropyl group, n-butyl group, sec-butyl group, isobutyl group, tert-butyl group, cyclopropyl
  • methyl group, an n-pentyl group, an n-hexyl group and the like can be mentioned.
  • the term “halogen atom” may be any of a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom or an iodine atom, preferably a fluorine atom, a chlorine atom or a bromine atom.
  • One embodiment of the present invention is a compound represented by the following general formula (I) or a salt thereof.
  • R 1 represents a hydrogen atom or 1 to 4 identical or different monovalent substituents present on the benzene ring.
  • R 1 represents a monovalent substituent present on the benzene ring, it is preferable that about 1 to 2 substituents which are the same or different exist on the benzene ring.
  • R 1 represents one or more monovalent substituents, the substituent can be substituted at any position on the benzene ring.
  • each R 1 represents a hydrogen atom, or one substituent is present (R 1 other than the substituent is a hydrogen atom).
  • the type of monovalent substituent represented by R 1 is not particularly limited, and examples thereof include alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms, alkenyl groups having 1 to 6 carbon atoms, alkynyl groups having 1 to 6 carbon atoms, carbon It is preferably selected from the group consisting of several to six alkoxy groups, hydroxyl groups, carboxy groups, sulfonyl groups, alkoxycarbonyl groups, halogen atoms, or amino groups. These monovalent substituents may further have one or more arbitrary substituents.
  • the alkyl group represented by R 1 may have one or more halogen atoms, carboxy groups, sulfonyl groups, hydroxyl groups, amino groups, alkoxy groups, and the like.
  • the alkyl group represented by R 1 is a halogen atom.
  • An alkyl group, a hydroxyalkyl group, a carboxyalkyl group, or an aminoalkyl group may be used.
  • the amino group represented by R 1 may be present one or two alkyl groups, an amino group represented by R 1 may be a monoalkylamino group or a dialkylamino group.
  • the alkoxy group represented by R 1 has a substituent includes, for example, a carboxy-substituted alkoxy group or an alkoxycarbonyl-substituted alkoxy group, and more specifically, a 4-carboxybutoxy group or 4-acetoxymethyloxy A carbonyl butoxy group etc. can be mentioned.
  • R 2 represents a monovalent substituent.
  • the kind of the monovalent substituent represented by R 2 is not particularly limited, but for example, as in R 1 , for example, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkenyl group having 1 to 6 carbon atoms, and 1 to 6 carbon atoms. It is preferably selected from the group consisting of an alkynyl group, an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, a hydroxyl group, a carboxy group, a sulfonyl group, an alkoxycarbonyl group, a halogen atom, or an amino group.
  • R 3 and R 4 each independently represent a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, or a halogen atom.
  • the alkyl group may contain one or more halogen atoms, carboxy groups, sulfonyl groups, hydroxyl groups, amino groups, alkoxy groups,
  • the alkyl group represented by R 3 or R 4 may be a halogenated alkyl group, a hydroxyalkyl group, a carboxyalkyl group, or the like.
  • R 3 and R 4 are preferably each independently a hydrogen atom or a halogen atom. When R 3 and R 4 are both hydrogen atoms, or R 3 and R 4 are both chlorine atoms or fluorine atoms. More preferred.
  • R 5 and R 6 each independently represents an alkyl group or aryl group having 1 to 6 carbon atoms, but R 5 and R 6 each independently represent 1 to 3 carbon atoms. It is preferable that it is an alkyl group, and it is more preferable that both R 5 and R 6 are methyl groups.
  • the alkyl group represented by R 5 and R 6 may contain one or more halogen atoms, carboxy groups, sulfonyl groups, hydroxyl groups, amino groups, alkoxy groups, and the like, for example, R 5 or R 6 represents The alkyl group may be a halogenated alkyl group, a hydroxyalkyl group, a carboxyalkyl group, or the like.
  • the aryl group may be either a monocyclic aromatic group or a condensed aromatic group, and the aryl ring has one or more ring-constituting heteroatoms.
  • a nitrogen atom, a sulfur atom, or an oxygen atom may be contained.
  • the aryl group is preferably a phenyl group.
  • One or more substituents may be present on the aryl ring. As the substituent, for example, one or two or more halogen atoms, carboxy groups, sulfonyl groups, hydroxyl groups, amino groups, alkoxy groups and the like may be present.
  • R 7 and R 8 each independently represent a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, or a halogen atom, and are the same as those described for R 3 and R 4. is there. It is preferred that R 7 and R 8 are both hydrogen atoms, both chlorine atoms, or both fluorine atoms.
  • R 9 and R 10 each independently represent a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • R 9 or R 10 may be combined with R 3 or R 7 to form a 5- to 7-membered heterocyclyl or heteroaryl containing a nitrogen atom to which R 9 or R 10 is bonded.
  • heterocyclyl or heteroaryl may be alkyl having 1 to 6 carbon atoms, Substituted by alkenyl having 2 to 6 carbon atoms, or alkynyl having 2 to 6 carbon atoms, aralkyl group having 6 to 10 carbon atoms (benzyl group, phenethyl group, etc.), alkenyl group having 6 to 10 carbon atoms It may be.
  • heterocyclyl or heteroaryl examples include, but are not limited to, pyrrolidine, piperidine, hexamethyleneimine, pyrrole, imidazole, pyrazole, oxazole, thiazole and the like.
  • R 9 and R 10 are both hydrogen atoms.
  • R 11 represents a monovalent substituent that is cleaved by contact with calpain.
  • the monovalent substituent that is cleaved by contact with calpain is preferably a monovalent substituent containing an oligopeptide residue.
  • the monovalent substituent containing an oligopeptide residue is preferably Leu-Leu-Val-Tyr, Thr-Pro-Leu-Leu, Leu-Met, Thr-Pro-Leu-Lys, Thr-Pro-Leu.
  • the N-terminus of a monovalent substituent containing an oligopeptide residue may be protected, and examples of the protecting group include a succinyl group, a tert-butoxycarbonyl group, a benzyloxycarbonyl group, and the like.
  • a group may be used.
  • the monovalent substituent containing an oligopeptide residue is represented by the following formulas (1) to (3).
  • One preferable embodiment of the present invention is a compound represented by the following formula (4), (5) or (6) or a salt thereof.
  • the compound represented by the general formula (I), formula (4), formula (5) and formula (6) in the present invention may exist as a salt.
  • the salt include base addition salts, acid addition salts, amino acid salts and the like.
  • the base addition salt include metal salts such as sodium salt, potassium salt, calcium salt, magnesium salt, ammonium salt, or organic amine salts such as triethylamine salt, piperidine salt, morpholine salt, and acid addition salt.
  • Examples thereof include mineral acid salts such as hydrochloride, sulfate, and nitrate, and organic acid salts such as methanesulfonate, paratoluenesulfonate, citrate, and oxalate.
  • Examples of amino acid salts include glycine salts. However, the salt of the compound of the present invention is not limited to these.
  • the compound represented by the general formula (I) may have one or more asymmetric carbons depending on the type of substituent, and there are stereoisomers such as optical isomers or diastereoisomers. There is a case. Pure forms of stereoisomers, any mixture of stereoisomers, racemates, and the like are all within the scope of the present invention.
  • the compound represented by the general formula (I) or a salt thereof may exist as a hydrate or a solvate, and any of these substances is included in the scope of the present invention.
  • solvents such as ethanol, acetone, isopropanol, can be illustrated.
  • a fluorescent probe comprising a compound represented by the general formula (I), formula (4), formula (5) or formula (6) or a salt thereof provided by the present invention is capable of reacting with an R 11 substituent by contact with calpain.
  • Generating a compound corresponding to a compound in which R 11 is a hydrogen atom in the above general formula (I)) in which a monovalent substituent containing an oligopeptide residue is cleaved and the absorption wavelength is shifted to a long wavelength.
  • a fluorescent probe for measurement of calpain can be suitably used as a fluorescent probe for measurement of calpain.
  • Calpain measurement using the above-described fluorescent probe can be performed according to a method well known to those skilled in the art, so that it can be used as a reagent for research in addition to use as a reagent for research. I can do it.
  • the above-described fluorescent probe it becomes possible to measure the concentration and amount of a measurement target substance in a test tube, or it is taken into a living cell or living body and imaged and measured by a bioimaging technique. be able to.
  • the following steps (a) a step of bringing a compound represented by the general formula (I) having a monovalent substituent cleaved by contact with calpain or a salt thereof with calpain, And (b) a method including a step of measuring the fluorescence intensity of the compound after contact with the calpain produced in the step (a).
  • the method of using the fluorescent probe of the present invention is not particularly limited.
  • the activity of calpain contained in the isolated and purified enzyme and cell lysate, the measurement of calpain activity in living cells, and the long wavelength optical The activity measurement of the enzyme used as the cancer biomarker in the biological tissue which utilized the characteristic is mentioned.
  • Me means a methyl group.
  • the side chain protected peptide (2, 4, 6) was synthesized by the following ordinary Fmoc solid phase synthesis method using 2-chlorotrityl chloride resin (1.3 mmol / g, 100-200 mesh, 1% DVB).
  • A Peptide coupling cycle: Fmoc amino acid (5 equivalents of resin) and O- (7-azabenzotriazol-1-yl) -N, N, N ′, N ′,-tetramethyluronium hexafluorophosphate The salt (HATU: 5 equivalents of resin) was dissolved in DMF, diisopropylethylamine (DIPEA: 10 equivalents of resin) was added and stirred.
  • DIPEA diisopropylethylamine
  • Suc-LLVY-SiR600 and Boc-LM-SiR600 do not absorb light near the maximum absorption (593 nm) of 2MeSiR600 produced by contact with calpain, and calpain activity measurement using excitation light near 593 nm is Suc-LLVY- It was confirmed that the process can be performed without being affected by SiR600 and Boc-LM-SiR600.
  • FIG. 1 shows a reaction scheme of calpain-1 and Suc-LLVY-SiR600.
  • FIG. 1 (b) shows the fluorescence spectrum before adding calpain-1 to the Suc-LLVY-SiR600 solution (2 ⁇ M) and 180 minutes after adding 5 ⁇ g of calpain-1.
  • C) to (e) of FIG. 1 show fluorescence spectra 10 to 60 minutes after 5 ⁇ g of calpain-1 was added to the Suc-LLVY-SiR600 solution (2 ⁇ M).
  • the maximum absorption wavelength of Suc-LLVY-SiR600 is around 500 nm, but since 2Me SiR600 produced by reaction of Suc-LLVY-SiR600 with calpain has a maximum absorption at 593 nm, it reacts with calpain. Before and after the measurement, excitation light of 593 nm was used. As a result, as shown in FIG. 1B, almost no fluorescence was observed before the reaction, and very strong fluorescence was observed after the reaction. Therefore, it was shown that Suc-LLVY-SiR600 can be suitably used as a fluorescent probe for calpain. Further, as shown in FIG.
  • FIG. 2 (a) shows a reaction scheme between calpain-1 and Boc-LM-SiR600.
  • FIG. 2 (b) shows fluorescence spectra before adding calpain-1 to the Boc-LM-SiR600 solution (2 ⁇ M) and 180 minutes after adding 5 ⁇ g of calpain-1.
  • FIG. 2 (c) shows the fluorescence spectrum 10 to 60 minutes after 5 ⁇ g of calpain-1 was added to the Boc-LM-SiR600 solution (2 ⁇ M).
  • Boc-LM-SiR600 showed an increase in fluorescence with the addition of calpain-1.
  • calpeptin which is a calpain selective inhibitor, was added, no increase in fluorescence occurred ((c) in FIG. 2).
  • Example 7 Live cell imaging using Suc-LLVY-SiR600
  • A Hela cells were cultured at 37 ° C. for 10 minutes using HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution) containing DMSO as a control and
  • B HBSS containing 20 ⁇ M calpeptin, respectively, and further 2 ⁇ M Suc- Incubated with LLVY-SiR600 for 20 minutes. Then, the differential interference image and the fluorescence image were image
  • the scale bar in the figure is 20 ⁇ m.
  • calpain activity in HeLa cells can be monitored by adding Suc-LLVY-SiR600 to the extracellular fluid.
  • the intracellular fluorescence intensity was reduced by the addition of calpeptin, which is a calpain selective inhibitor.
  • Suc-LLVY-SiR600 shows intracellular localization similar to that of the lysosomal localized dye Lyso Tracker, and 2Me SiR600, which is the enzyme reaction product of the probe, can accumulate in lysosomes in the cell. found. Therefore, Suc-LLVY-SiR600 can be effectively used for visualization of calpain activity in living cells.

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Abstract

【解決課題】　カルパイン活性を検出する新規蛍光プローブを提供すること。 【解決手段】 下記の一般式（Ｉ）：で表される化合物又はその塩。

Description

カルパイン活性検出蛍光プローブ
　本発明は、カルパインの活性を検出することができる赤色蛍光プローブに関する。
　システインプロテアーゼの一種であるカルパインは、Ｃａ２＋濃度依存的に酵素活性化され、基質の限定分解を通して様々な細胞機能を調整する重要なモジュレーター分子であり、その細胞内活性はカルパスタチンというタンパク質によって厳密に制御されている。生体内の細胞に普遍的に存在するカルパインとして、酵素活性化に必要なＣａ２＋濃度の異なるカルパイン－１（μ－カルパイン）、カルパイン－２（ｍ－カルパイン）が知られており、これらは８０ｋＤａ＋３０ｋＤａのヘテロダイマーとして存在している。カルパインは特に細胞死、細胞遊走の調整に深く関与しており、カルパイン活性の制御不全と神経変性疾患やがんの悪性化の関連を示唆する報告が近年増えている。また、カルパインは多発性硬化症、筋ジストロフィー、アルツハイマー病など有効な治療薬が少ない神経・筋疾患に関与していることから、創薬ターゲットとして関心が高まっている。疾患メカニズムの解明、創薬研究を行うためにはカルパイン活性の可視化が重要である。
　カルパインの疾患への関与を明らかにするためには、様々な刺激の付与や遺伝子ノックダウンに応じた生細胞内のカルパイン活性の変化を検出することが重要である。現在、生細胞内のカルパイン活性を検出するために、青色蛍光プローブが主に用いられている。しかしながら、これら青色蛍光プローブは、その使用にあたり様々な問題が生じている。具体的には、（１）生体組織や動物個体等、測定試料に含まれる生体分子による自家蛍光が高いため、高い組織透過性が必要とされる系において使用することが困難であり、（２）細胞内Ｃａ２＋濃度とカルパイン活性を同時に観測できることが好ましいが、Ｃａ２＋プローブであるＦｕｒａ－２と青色蛍光プローブとの併用は不可能であり、（３）光照射依存的にＣａ２＋を放出するケージド化合物であるＮＰ－ＥＧＴＡを脱ケージする際に、ＵＶ照射すると青色蛍光プローブの光褪色が起こることが報告されている。
　このように、従来のカルパイン活性を検出する蛍光プローブには様々な問題があり、これらの問題点を解決したカルパイン活性検出蛍光プローブは未だ報告されていない。
　本発明は、カルパイン活性を検出する新規蛍光プローブを提供することを目的とする。
　本発明者らは、カルパイン活性の検出に新たな赤色領域を加えることにより、Ｆｕｒａ－２やケージド化合物の利用、更には緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）による基質の標識など、カルパインと他の生体分子とのマルチカラーイメージングの幅を広げ、カルパイン研究の進展に大きく寄与できるのではないかと考え、鋭意検討した。その結果、ローダミンの基本骨格であるパイロニンＹ（ＰＹ）の酸素原子を珪素原子に置換した化合物を母核とした赤色蛍光プローブにおいて、従来技術の問題を解決できることを見出し、本発明を完成した。
　即ち、本発明は、
［１］下記の一般式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 （式中、
Ｒ１は、水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する１ないし４個の同一又は異なる一価の置換基を示し；
Ｒ２は一価の置換基を示し；
Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に水素原子、又は炭素数１～６個のアルキル基を示し；
Ｒ５及びＲ６はそれぞれ独立に炭素数１～６個のアルキル基又はアリール基を示し；
Ｒ７及びＲ８はそれぞれ独立に水素原子、炭素数１～６個のアルキル基を示し；
Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立に、水素原子、又は炭素数１～６個のアルキル基を示し、Ｒ９又はＲ１０は、Ｒ３又はＲ７と一緒になって、Ｒ９又はＲ１０が結合している窒素原子を含む５～７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員としてＯ、Ｎ及びＳからなる群から選択される１～３個のさらなるヘテロ原子を含有していてもよく、さらに該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１～６個のアルキル、炭素数２～６個のアルケニル、又は炭素数２～６個のアルキニル、炭素数６～１０個のアラルキル基、炭素数６～１０個のアルアルケニル基で置換されていてもよく； 
Ｒ１１は、カルパインとの接触により切断される一価の置換基を示し；
Ｘは珪素原子、ゲルマニウム原子、又はスズ原子を示す）
で表される化合物又はその塩。
［２］Ｒ１１が、オリゴペプチド残基を含む一価の置換基である、［１］に記載の化合物又はその塩。
［３］オリゴペプチド残基を含む一価の置換基が、以下の式（１）、（２）又は（３）で表される、［２］に記載の化合物又はその塩。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 ［４］Ｘが珪素原子又はゲルマニウム原子である［１］～［３］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
［５］以下の式（４）で表される化合物又はその塩。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 ［６］以下の式（５）で表される化合物又はその塩。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 ［７］以下の式（６）で表される化合物又はその塩。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 ［８］［１］～［７］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を含む蛍光プローブ。
［９］カルパインの測定方法であって、下記の工程：（ａ）［１］～［７］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩とカルパインとを接触させる工程、及び（ｂ）上記工程（ａ）で生成したカルパインと接触後の化合物の蛍光強度を測定する工程を含む方法。
を、提供するものである。
　本発明の化合物を用いることにより、長波長領域でカルパイン活性を検出でき、光安定性に優れた蛍光プローブを提供することができる。また、本発明の化合物を用いることにより、Ｆｕｒａ－２やケージド化合物の利用、更には緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）による基質の標識など、カルパインと他の生体分子とのマルチカラーイメージングの幅を広げることが可能である。
Ｓｕｃ－ＬＬＶＹ－ＳｉＲ６００の蛍光プローブとしての評価結果 Ｂｏｃ－ＬＭ－ＳｉＲ６００の蛍光プローブとしての評価結果 Ｓｕｃ－ＬＬＶＹ－ＳｉＲ６００を用いたＨｅＬａ細胞内におけるカルパイン活性イメージング Ｓｕｃ－ＬＬＶＹ－ＳｉＲ６００を用いたＡ５４９細胞内におけるカルパイン活性イメージング Ｓｕｃ－ＬＬＶＹ－ＳｉＲ６００とＬｙｓｏ　Ｔｒａｃｋｅｒによる共染色 ２Ｍｅ　ＳｉＲ６００とＬｙｓｏ　Ｔｒａｃｋｅｒによる共染色
　本明細書において、「アルキル基」又はアルキル部分を含む置換基（例えばアルコキシ基など）のアルキル部分は、特に言及しない場合には例えば炭素数１～６個、好ましくは炭素数１～４個、さらに好ましくは炭素数１～３個程度の直鎖、分枝鎖、環状、又はそれらの組み合わせからなるアルキル基を意味している。より具体的には、アルキル基として、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、シクロプロピルメチル基、ｎ－ペンチル基、ｎ－ヘキシル基などを挙げることができる。本明細書において「ハロゲン原子」という場合には、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれでもよく、好ましくはフッ素原子、塩素原子、又は臭素原子である。
　本発明の１つの実施態様は、下記の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　一般式（Ｉ）において、Ｒ１は、水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する１ないし４個の同一又は異なる一価の置換基を示す。Ｒ１がベンゼン環上に存在する一価の置換基を示す場合には、ベンゼン環上に同一又は異なる置換基が１ないし２個程度存在していることが好ましい。Ｒ１が１個又は２個以上の一価の置換基を示す場合には、該置換基はベンゼン環上の任意の位置に置換することができる。好ましくはＲ１はいずれも水素原子を示すか、或いは１個の置換基が存在する（当該置換基以外のＲ１は水素原子である）場合である。
　Ｒ１が示す一価の置換基の種類は特に限定されないが、例えば、炭素数１～６個のアルキル基、炭素数１～６個のアルケニル基、炭素数１～６個のアルキニル基、炭素数１～６個のアルコキシ基、水酸基、カルボキシ基、スルホニル基、アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子、又はアミノ基からなる群から選ばれることが好ましい。これらの一価の置換基はさらに任意の置換基を１個又は２個以上有していてもよい。例えば、Ｒ１が示すアルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ１が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基、又はアミノアルキル基などであってもよい。また、例えばＲ１が示すアミノ基には１個又は２個のアルキル基が存在していてもよく、Ｒ１が示すアミノ基はモノアルキルアミノ基又はジアルキルアミノ基であってもよい。さらに、Ｒ１が示すアルコキシ基が置換基を有する場合としては、例えば、カルボキシ置換アルコキシ基又はアルコキシカルボニル置換アルコキシ基などが挙げられ、より具体的には４－カルボキシブトキシ基又は４－アセトキシメチルオキシカルボニルブトキシ基などを挙げることができる。
　一般式（Ｉ）において、Ｒ２は一価の置換基を示す。Ｒ２が示す一価の置換基の種類は特に限定されないが、Ｒ１と同様に、例えば、炭素数１～６個のアルキル基、炭素数１～６個のアルケニル基、炭素数１～６個のアルキニル基、炭素数１～６個のアルコキシ基、水酸基、カルボキシ基、スルホニル基、アルコキシカルボニル基、ハロゲン原子、又はアミノ基からなる群から選ばれることが好ましい。
　一般式（Ｉ）において、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基又はハロゲン原子を示す。Ｒ３又はＲ４がアルキル基を示す場合には、該アルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ３又はＲ４が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子であることが好ましく、Ｒ３及びＲ４がともに水素原子である場合、又はＲ３及びＲ４がともに塩素原子又はフッ素原子である場合がより好ましい。
　一般式（Ｉ）において、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、炭素数１～６個のアルキル基又はアリール基を示すが、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、炭素数１～３個のアルキル基であることが好ましく、Ｒ５及びＲ６がともにメチル基であることがより好ましい。Ｒ５及びＲ６が示すアルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ５又はＲ６が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。Ｒ５又はＲ６がアリール基を示す場合には、アリール基は単環の芳香族基又は縮合芳香族基のいずれであってもよく、アリール環は１個又は２個以上の環構成ヘテロ原子（例えば窒素原子、イオウ原子、又は酸素原子など）を含んでいてもよい。アリール基としてはフェニル基が好ましい。アリール環上には１個又は２個以上の置換基が存在していてもよい。置換基としては、例えばハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよい。
　一般式（Ｉ）において、Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１～６個のアルキル基、又はハロゲン原子を示すが、Ｒ３及びＲ４について説明したものと同様である。Ｒ７及びＲ８が共に水素原子であるか、共に塩素原子であるか、又は共にフッ素原子であることが好ましい。
　一般式（Ｉ）において、Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立に、水素原子、又は炭素数１～６個のアルキル基を示す。また、Ｒ９又はＲ１０は、Ｒ３又はＲ７と一緒になって、Ｒ９又はＲ１０が結合している窒素原子を含む５～７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員としてＯ、Ｎ及びＳからなる群から選択される１～３個のさらなるヘテロ原子を含有していてもよく、さらに該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１～６個のアルキル、炭素数２～６個のアルケニル、又は炭素数２～６個のアルキニル、炭素数６～１０個のアラルキル基（ベンジル基、フェネチル基等）、炭素数６～１０個のアルアルケニル基で置換されていてもよい。このようにして形成されるヘテロシクリル又はヘテロアリールとしては、例えば、ピロリジン、ピペリジン、ヘキサメチレンイミン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、チアゾールなどが挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明の好ましい態様においては、Ｒ９及びＲ１０が共に水素原子である。
　一般式（Ｉ）において、Ｒ１１は、カルパインとの接触により切断される一価の置換基を示す。カルパインとの接触により切断される一価の置換基としては、好ましくは、オリゴペプチド残基を含む一価の置換基である。
　オリゴペプチド残基を含む一価の置換基としては、好ましくは、Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｔｙｒ、Ｔｈｒ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ、Ｌｅｕ－Ｍｅｔ、Ｔｈｒ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ、Ｔｈｒ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ、Ｌｅｕ－Ｔｙｒの配列を有するオリゴペプチド残基（配列の右端のアミノ酸がパイロニンＹ（ＰＹ）に結合したＮＨ基と直接結合している）を含む一価の置換基である。
　オリゴペプチド残基を含む一価の置換基のＮ末端は保護されていてもよく、保護基としては、スクシニル基、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基などが挙げられるが、これら以外の置換基を用いてもよい。
　本発明の一つの実施態様において、オリゴペプチド残基を含む一価の置換基は、以下の式（１）～（３）で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　本発明の一つの好ましい実施態様は、以下の式（４）、（５）又は（６）で表される化合物又はその塩である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
　本発明における上記一般式（Ｉ）、式（４）、式（５）及び式（６）で表される化合物は塩として存在する場合がある。塩としては、塩基付加塩、酸付加塩、アミノ酸塩などを挙げることができる。塩基付加塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩、ピペリジン塩、モルホリン塩などの有機アミン塩を挙げることができ、酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩などの有機酸塩を挙げることができる。アミノ酸塩としてはグリシン塩などを例示することができる。もっとも、本発明の化合物の塩はこれらに限定されることはない。
　一般式（Ｉ）で表される化合物は、置換基の種類に応じて１個または２個以上の不斉炭素を有する場合があり、光学異性体又はジアステレオ異性体などの立体異性体が存在する場合がある。純粋な形態の立体異性体、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などはいずれも本発明の範囲に包含される。また、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩は、水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、これらの物質はいずれも本発明の範囲に包含される。溶媒和物を形成する溶媒の種類は特に限定されないが、例えば、エタノール、アセトン、イソプロパノールなどの溶媒を例示することができる。
　本発明により提供される一般式（Ｉ）、式（４）、式（５）又は式（６）で表される化合物又はその塩を含む蛍光プローブは、カルパインとの接触によりＲ１１置換基又はオリゴペプチド残基を含む一価の置換基が切断されて吸収波長が長波長にシフトした化合物（上記一般式（Ｉ）においてＲ１１が水素原子になった化合物に相当する）を生成することができ、カルパインの測定のための蛍光プローブとして好適に用いることができる。
　上記した蛍光プローブを用いるカルパインの測定は、当業者に周知の方法に準じて行うことができるので、研究のための試薬としての使用のほか動物や人の診断のための試薬として使用することも出来る。例えば、上記した蛍光プローブを用いることにより、試験管中で測定対象物質の濃度や量を測定することが可能になり、あるいは生細胞や生体に取り込ませてバイオイメージングの手技により画像化して測定することができる。代表的な例として、下記の工程：（ａ）カルパインと接触することで切断される一価の置換基を有する一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩とカルパインとを接触させる工程、及び（ｂ）上記工程（ａ）で生成したカルパインと接触後の前記化合物の蛍光強度を測定する工程を含む方法をあげることができる。
　本発明の蛍光プローブの使用方法は特に限定されないが、例えば、単離精製した酵素、および細胞溶解液中に含まれるカルパインの活性測定や、生細胞内でのカルパイン活性の測定、長波長という光学特性を活かした生体組織中でのがんバイオマーカーとなる酵素の活性測定等が挙げられる。
　以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。実施例中、Ｍｅはメチル基を意味する。
［実施例１～３］
　以下の合成スキーム１により３種類の本発明の化合物を合成した。
　９－ｏ－トルイル－９Ｈ－Ｓｉ－キサンテン－３，６－ジアミン（１）（合成法は特許ＰＣＴ／ＪＰ２０１２／５３８５５に記載）を原料化合物として用い、以下のスキームに示す工程によりオリゴペプチド残基（Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｔｙｒ、Ｔｈｒ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ、Ｌｅｕ－Ｍｅｔ）を導入した化合物（Ｓｕｃ－ＬＬＶＹ－ＳｉＲ６００：Ｓｕｃはスクシニル基を意味する、Ｓｕｃ－ＴＰＬＬ－ＳｉＲ６００、及びＢｏｃ－ＬＭ－ＳｉＲ６００：Ｂｏｃはｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基を意味する）を合成した
。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
側鎖保護ペプチド（２、４、６）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
　側鎖保護ペプチド（２、４、６）を２－クロロトリチルクロライドレジン（１．３ｍｍｏｌ／ｇ、１００－２００ｍｅｓｈ、１％ＤＶＢ）を用いて以下に示す通常のＦｍｏｃ固相合成法で合成した。
（ａ）ペプチドカップリングサイクル：Ｆｍｏｃアミノ酸（レジンの５当量）とＯ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロりん酸塩（ＨＡＴＵ：レジンの５当量）をＤＭＦに溶解させ、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ：レジンの１０当量）を加えて攪拌した。この溶液をＮ末脱保護ペプチドをカップリングさせたレジンに加えて４０分攪拌した。
（ｂ）Ｆｍｏｃ脱保護サイクル：Ｆｍｏｃ保護基の脱保護は、２０％（ｖ／ｖ）ピペリジン／ＤＭＦ溶液をレジンに加え、１２分攪拌することで行った。
（ｃ）レジンからの切り出し：　トリフルオロ酢酸：ジクロロメタン＝２：９８の溶液をレジンに加え、１分攪拌を１０回行なうことで、ペプチドをレジンから切り出した。レジンを濾過で除き、ろ液を減圧留去し、残渣に過剰量の冷水を加えて生じた沈殿をろ取し、粗ペプチドを得た。
（ｄ）粗ペプチドの精製：粗ペプチドを水／アセトニトリルに溶解させ、分取用逆相ＨＰＬＣを用いて精製し、側鎖保護ペプチド（２、４、６）を得た。
（１）Ｓｕｃ－ＬＬＶＹ－ＳｉＲ６００の合成（実施例１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
　９－ｏ－トルイル－９Ｈ－Ｓｉ－キサンテン－３，６－ジアミン（３．６ｍｇ、１０．５μｍｏｌ）をＤＭＦ（０．５ｍｌ）に溶解し、側鎖保護ペプチド２（８．３ｍｇ、１１．５μｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（８．７ｍｇ、２３．０μｍｏｌ）、及びＤＩＰＥＡ（８μｌ、４６．１μｍｏｌ）を加え、２１時間室温で攪拌した。反応混合物に水を加え、ジクロロメタンで抽出して食塩水で洗い、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させた後に溶媒を減圧留去した。残渣をジクロロメタン（６ｍｌ）に溶解してｐ－クロラニル（４ｍｇ、０．０１６３ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間攪拌した後、溶媒を減圧留去した。残渣にトリフルオロ酢酸（４ｍｌ）を加え、室温で１時間攪拌した後に溶媒を減圧留去した。残渣をＨＰＬＣ（溶離液，３２％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸／水（０分）から６４％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ／水（３０分）；流速＝５．０ｍＬ／ｍｉｎ）で精製し、Ｓｕｃ－ＬＬＶＹ－ＳｉＲ６００（２．８ｍｇ、２．６８μｍｏｌ，収率２６％）を得た。
ＨＲＭＳ　（ＥＳＩ＋）：ｍ／ｚ　Ｆｏｕｎｄ　９３１．４８３２，　ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ　９３１．４７９０　ｆｏｒ　［Ｍ］＋（－４．２ｍｍｕ）
精製後のＨＰＬＣクロマトグラム（４０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸／水から８０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸／水（流速＝１．０ｍＬ／ｍｉｎ）のリニアグラディエント，Ａｂｓ．５００ｎｍ）では１２．８分に単一ピークを認めた。
（２）Ｓｕｃ－ＴＰＬＬ－ＳｉＲ６００の合成（実施例２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
　９－ｏ－トルイル－９Ｈ－Ｓｉ－キサンテン－３，６－ジアミン（３．７１ｍｇ、１０．８μｍｏｌ）をＤＭＦ（０．５ｍｌ）に溶解し、側鎖保護ペプチド４（７．９ｍｇ、１２．１μｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（９．０４ｍｇ、２３．８μｍｏｌ）、及びＤＩＰＥＡ（８．３μｌ、４７．５μｍｏｌ）を加え、２３時間室温で攪拌した。反応混合物に水を加え、ジクロロメタンで抽出して食塩水で洗い、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させた後に溶媒を減圧留去した。残渣をジクロロメタン（６ｍｌ）に溶解してｐ－クロラニル（５ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）を加え、室温で１２時間攪拌した後、溶媒を減圧留去した。残渣にトリフルオロ酢酸（３ｍｌ）を加え、室温で２時間攪拌した後に溶媒を減圧留去した。残渣をＨＰＬＣ（溶離液、４０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸／水（０分）から８０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ／水（２０分）；流速＝５．０ｍＬ／ｍｉｎ）で精製し、Ｓｕｃ－ＴＰＬＬ－ＳｉＲ６００（２．８ｍｇ、２．８６μｍｏｌ、収率２６％）を得た。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：ｍ／ｚ　Ｆｏｕｎｄ　８６７．４４８０，　ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ　８６７．４４７７　ｆｏｒ　［Ｍ］＋（＋０．３ｍｍｕ）
精製後のＨＰＬＣクロマトグラム（４０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸／水から８０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸／水（流速＝１．０ｍＬ／ｍｉｎ）のリニアグラディエント，Ａｂｓ．５００ｎｍ）では１０．６分に単一ピークを認めた。
（３）Ｂｏｃ－ＬＭ－ＳｉＲ６００の合成（実施例３）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
　９－ｏ－トルイル－９Ｈ－Ｓｉ－キサンテン－３，６－ジアミン（３．９ｍｇ、１１．３μｍｏｌ）をＤＭＦ（１．５ｍｌ）に溶解し、側鎖保護ペプチド６（４．５ｍｇ、１２．５μｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（９．５ｍｇ、２４．９μｍｏｌ）、及びＤＩＰＥＡ（８．７μｌ、４９．７μｍｏｌ）を加え、２４時間室温で攪拌した。反応混合物に水を加え、ジクロロメタンで抽出して食塩水で洗い、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させた後に溶媒を減圧留去した。残渣をジクロロメタン（１０ｍｌ）に溶解してｐ－クロラニル（４ｍｇ、０．０１６３ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間攪拌した後、溶媒を減圧留去した。残渣をＨＰＬＣ（溶離液、４０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸／水（０分）から８０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ／水（２０分）；流速＝５．０ｍＬ／ｍｉｎ）で精製し、Ｂｏｃ－ＬＭ－ＳｉＲ６００（０．６ｍｇ、０．７５μｍｏｌ、収率７％）を得た。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：ｍ／ｚ　Ｆｏｕｎｄ　６８７．３４４０，　ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ　６８７．３４００　ｆｏｒ　［Ｍ］＋（－４．０ｍｍｕ）
精製後のＨＰＬＣクロマトグラム（４０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸／水から８０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸／水（流速＝１．０ｍＬ／ｍｉｎ）のリニアグラディエント，Ａｂｓ．５００ｎｍ）では１７．０分に単一ピークを認めた。
［実施例４］
Ｓｕｃ－ＬＬＶＹ－ＳｉＲ６００及びＢｏｃ－ＬＭ－ＳｉＲ６００の光学特性の測定
　１％ＤＭＳＯを含むｐＨ３の０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー中でＳｕｃ－ＬＬＶＹ－ＳｉＲ６００及びＢｏｃ－ＬＭ－ＳｉＲ６００の光化学特性を測定した。上記の表１に酵素反応生成物である２ＭｅＳｉＲ６００の光学特性と共に示す。
　Ｓｕｃ－ＬＬＶＹ－ＳｉＲ６００、Ｂｏｃ－ＬＭ－ＳｉＲ６００はカルパインと接触して生成する２ＭｅＳｉＲ６００の極大吸収（５９３ｎｍ）付近の光は吸収せず、５９３ｎｍ付近の励起光を使用するカルパイン活性測定がＳｕｃ－ＬＬＶＹ－ＳｉＲ６００、Ｂｏｃ－ＬＭ－ＳｉＲ６００の影響を受けずに行えることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
［実施例５］
Ｓｕｃ－ＬＬＶＹ－ＳｉＲ６００の蛍光プローブとしての評価
　実施例１で得られたＳｕｃ－ＬＬＶＹ－ＳｉＲ６００についてカルパイン蛍光プローブとしての評価を行った。
　図１の（ａ）は、カルパイン－１とＳｕｃ－ＬＬＶＹ－ＳｉＲ６００との反応スキームを示す。
　図１の（ｂ）は、Ｓｕｃ－ＬＬＶＹ－ＳｉＲ６００溶液（２μＭ）にカルパイン－１を添加する前及びカルパイン－１を５μｇ添加してから１８０分後の蛍光スペクトルを示す。
　図１の（ｃ）～（ｅ）は、Ｓｕｃ－ＬＬＶＹ－ＳｉＲ６００溶液（２μＭ）にカルパイン－１を５μｇ添加してから１０～６０分後の蛍光スペクトルを示す。
　図１の（ｂ）～（ｅ）では、１００μＭのＤＴＴ、１０％のグリセロール、０．１％のＣＨＡＰＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１．５ｍＭのＣａＣｌ２を含有し、１％のＤＭＳＯを共溶媒として含有する２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）０．７５ｍｌ中で反応を行った。（ｄ）では、１．５ｍM　ＣａＣｌ２が存在しない条件で、（ｅ）では、１μＭのカルペプチンが存在する条件で反応を行った。
　反応温度は、図１の（ｂ）、（ｄ）及び（ｅ）においては２５℃、図１の（ｃ）では３７℃である。
　表１に示すようにＳｕｃ－ＬＬＶＹ－ＳｉＲ６００の極大吸収波長は５００ｎｍ付近であるが、Ｓｕｃ－ＬＬＶＹ－ＳｉＲ６００がカルパインと反応して生成する２Ｍｅ　ＳｉＲ６００は５９３ｎｍに極大吸収を持つため、カルパインとの反応前後において５９３ｎｍの励起光を用いて測定を行った。
　その結果、図１の（ｂ）に示すように、反応前にはほとんど蛍光が観察されず、反応後に非常に強い蛍光が観察できた。従って、Ｓｕｃ－ＬＬＶＹ－ＳｉＲ６００がカルパインに対する蛍光プローブとして好適に使用できることが示された。また、図１の（ｃ）で示すように、反応溶液が３７℃の場合カルパイン－１の自己分解が２５℃の場合と比べて速いため、蛍光強度上昇はより速く停止した。
　また、カルパインはＣａ２＋と結合すると酵素活性を示すため、Ｃａ２＋を含まない溶液中では蛍光上昇は起こらないことが確認された（図１の（ｄ））。更に、カルパイン選択的阻害剤であるカルペプチンを添加すると蛍光上昇は起こらないことが図１の（ｅ）で示された。
［実施例６］
Ｂｏｃ－ＬＭ－ＳｉＲ６００の蛍光プローブとしての評価
　実施例３で得られたＢｏｃ－ＬＭ－ＳｉＲ６００についてカルパイン蛍光プローブとしての評価を行った。
　図２の（ａ）は、カルパイン－１とＢｏｃ－ＬＭ－ＳｉＲ６００との反応スキームを示す。
　図２の（ｂ）は、Ｂｏｃ－ＬＭ－ＳｉＲ６００溶液（２μＭ）にカルパイン－１を添加する前及びカルパイン－１を５μｇ添加してから１８０分後の蛍光スペクトルを示す。図２の（ｃ）は、Ｂｏｃ－ＬＭ－ＳｉＲ６００溶液（２μＭ）にカルパイン－１を５μｇ添加してから１０～６０分後の蛍光スペクトルを示す。
　図２の（ｂ）～（ｃ）では、１００μＭのＤＴＴ、１０％のグリセロール、０．１％のＣＨＡＰＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１．５ｍＭのＣａＣｌ２を含有し、１％のＤＭＳＯを共溶媒として含有する２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）０．７５ｍｌ中で反応を行った。図２の（ｃ）では１μＭのカルペプチンが存在する条件で反応を行い、（ｂ）ではカルペプチンが存在しない状態で反応を行った。
　図２の（ｂ）及び（ｃ）とも反応温度は２５℃であり、励起波長は５９３ｎｍである。
　図２の（ｂ）で示すように、Ｂｏｃ－ＬＭ－ＳｉＲ６００はカルパイン－１の添加により蛍光上昇を示した。また、カルパイン選択的阻害剤であるカルペプチンを添加すると蛍光上昇は起こらなかった（図２の（ｃ））。
［実施例７］
Ｓｕｃ－ＬＬＶＹ－ＳｉＲ６００を用いた生細胞イメージング
（１）ＨｅＬａ細胞内におけるカルパイン活性イメージングへの応用
　Ｓｕｃ－ＬＬＶＹ－ＳｉＲ６００を用いて、ＨｅＬａ細胞内におけるカルパイン活性の可視化を行った。
　（ａ）コントロールとしてＤＭＳＯを含有するＨＢＳＳ（Ｈａｎｋｓ’　Ｂａｌａｎｃｅｄ　Ｓａｌｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、（ｂ）２０μＭカルペプチンを含有するＨＢＳＳ、を夫々用いて、Ｈｅｌａ細胞を３７℃で１０分間培養し、更に、２μＭのＳｕｃ－ＬＬＶＹ－ＳｉＲ６００で２０分間培養した。その後、共焦点顕微鏡を用いて微分干渉像、及び蛍光像を撮影した。その結果を図３の（ａ）、（ｂ）に示す。図中のスケールバーは２０μｍである。
　図３の（ａ）で示すように、細胞外液にＳｕｃ－ＬＬＶＹ－ＳｉＲ６００を添加することにより、ＨｅＬａ細胞内のカルパイン活性をモニターすることができる。また、図３の（ｂ）で示すように、カルパイン選択的阻害剤であるカルペプチンの添加により細胞内の蛍光強度は低下した。
　また、カルペプチンが存在する場合と、存在しない場合について、３回の実験におけるＨｅｌａ細胞内の平均蛍光強度を図３の（ｃ）に示す。スチューデントのｔ検定により統計解析を行った（ｎ＝１８）。エラーバーは標準偏差を示す。
（２）Ａ５４９細胞内におけるカルパイン活性イメージングへの応用
　Ｓｕｃ－ＬＬＶＹ－ＳｉＲ６００を用いて、Ａ５４９細胞内におけるカルパイン活性の可視化を行った。
　（ａ）コントロールとしてＤＭＳＯを含有するＨＢＳＳ、（ｂ）２０μＭカルペプチンを含有するＨＢＳＳ、を夫々用いて、Ａ５４９細胞を３７℃で１０分間培養し、更に、２μＭのＳｕｃ－ＬＬＶＹ－ＳｉＲ６００で２０分間培養した。その後、共焦点顕微鏡を用いて微分干渉像、及び蛍光像を撮影した。その結果を図４の（ａ）、（ｂ）に示す。図中
のスケールバーは２０μｍである。
　また、カルペプチンが存在する場合と、存在しない場合について、３回の実験におけるＡ５４９細胞内の平均蛍光強度を図４の（ｃ）に示す。スチューデントのｔ検定により統計解析を行った（ｎ＝１８）。エラーバーは標準偏差を示す。
　図４（ａ）で示す通り、Ａ５４９細胞においても同様に、Ｓｕｃ－ＬＬＶＹ－ＳｉＲ６００を用いて細胞内カルパイン活性を可視化することができた。
（３）色素の細胞内局在
　Ｓｕｃ－ＬＬＶＹ－ＳｉＲ６００とリソソーム局在型色素Ｌｙｓｏ　Ｔｒａｃｋｅｒにより共染色を行った。
　ＨｅＬａ細胞をＳｕｃ－ＬＬＶＹ－ＳｉＲ６００（２μＭ）で３０分間培養し、その後、Ｌｙｓｏ　Ｔｒａｃｋｅｒ　Ｇｒｅｅｎ　ＤＮＤ２６（５０ｎＭ）を取り込ませた。その後、共焦点顕微鏡を用いて蛍光像を撮影した。その結果を図５に示す。
　図５（ａ）では、励起波長／検出波長は５０４ｎｍ／５１４－５３４ｎｍであり、図５（ｂ）では、励起波長／検出波長は５９３ｎｍ／６０３－６２３ｎｍである。図中のスケールバーは１０μｍである。
　次に、２Ｍｅ　ＳｉＲ６００とＬｙｓｏ　Ｔｒａｃｋｅｒにより共染色を行った。
　ＨｅＬａ細胞を２Ｍｅ　ＳｉＲ６００（５０μＭ）とＬｙｓｏ　Ｔｒａｃｋｅｒ　Ｇｒｅｅｎ　ＤＮＤ２６（５０ｎＭ）で培養した。その後、共焦点顕微鏡を用いて蛍光像を撮影した。その結果を図６に示す。図６（ａ）では、励起波長／検出波長は５０４ｎｍ／５２０－５５０ｎｍであり、図５（ｂ）では、励起波長／検出波長は５９３ｎｍ／６０８－６３８ｎｍである。（ｃ）は前者二つの画像の重ね合わせである。図中のスケールバーは１０μｍである。
　このように、Ｓｕｃ－ＬＬＶＹ－ＳｉＲ６００は、リソソーム局在型色素Ｌｙｓｏ　Ｔｒａｃｋｅｒと同様の細胞内局在を示し、また、プローブの酵素反応生成物である２Ｍｅ　ＳｉＲ６００は細胞内においてリソソームに集積することが判明した。従って、Ｓｕｃ－ＬＬＶＹ－ＳｉＲ６００は、生細胞内におけるカルパイン活性の可視化に有効に使用することができる。

Claims (9)

  1. 下記の一般式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式中、
    Ｒ１は、水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する１ないし４個の同一又は異なる一価の置換基を示し；
    Ｒ２は一価の置換基を示し；
    Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に水素原子、又は炭素数１～６個のアルキル基を示し；
    Ｒ５及びＲ６はそれぞれ独立に炭素数１～６個のアルキル基又はアリール基を示し；
    Ｒ７及びＲ８はそれぞれ独立に水素原子、炭素数１～６個のアルキル基を示し；
    Ｒ９及びＲ１０は、それぞれ独立に、水素原子、又は炭素数１～６個のアルキル基を示し、Ｒ９又はＲ１０は、Ｒ３又はＲ７と一緒になって、Ｒ９又はＲ１０が結合している窒素原子を含む５～７員のヘテロシクリル又はヘテロアリールを形成していてもよく、環構成員としてＯ、Ｎ及びＳからなる群から選択される１～３個のさらなるヘテロ原子を含有していてもよく、さらに該ヘテロシクリル又はヘテロアリールは、炭素数１～６個のアルキル、炭素数２～６個のアルケニル、又は炭素数２～６個のアルキニル、炭素数６～１０個のアラルキル基、炭素数６～１０個のアルアルケニル基で置換されていてもよく； 
    Ｒ１１は、カルパインとの接触により切断される一価の置換基を示し；
    Ｘは珪素原子、ゲルマニウム原子、又はスズ原子を示す）
    で表される化合物又はその塩。
  2. 　Ｒ１１が、オリゴペプチド残基を含む一価の置換基である、請求項１に記載の化合物又はその塩。
  3. 　オリゴペプチド残基を含む一価の置換基が、以下の式（１）、（２）又は（３）で表される、請求項２に記載の化合物又はその塩。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
  4. 　Ｘが珪素原子又はゲルマニウム原子である請求項１～３のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
  5. 　以下の式（４）で表される化合物又はその塩。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
  6. 　以下の式（５）で表される化合物又はその塩。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
  7. 　以下の式（６）で表される化合物又はその塩。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
  8. 　請求項１～７のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を含む蛍光プローブ。
  9. 　カルパインの測定方法であって、下記の工程：（ａ）請求項１～７のいずれか１項に記載の化合物又はその塩とカルパインとを接触させる工程、及び（ｂ）上記工程（ａ）で生成したカルパインと接触後の化合物の蛍光強度を測定する工程を含む方法。
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