JP2003246788A - リン酸イオンおよびリン酸化ペプチド用蛍光センサー - Google Patents

リン酸イオンおよびリン酸化ペプチド用蛍光センサー

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 リン酸アニオンを高感度に検出することので
きる蛍光プローブから成るセンサーを提供する。 【解決手段】 下記の一般式（１）で表わされるリン酸
アニオン選択的発蛍光性化合物から成る、リン酸イオン
およびリン酸化ペプチド用蛍光センサー。式（１）中、
ＦＬは、芳香環または複素環を有する発蛍光性官能基ま
たは原子団（例えばジメチルアントリル基）を表わし、
Ｘは、水溶液中で脱離してアニオンと成る官能基または
原子団（例えばＮＯ3）を表わす。 【化１】

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、アニオンを検出す
るための技術分野に属し、特に、生体内に相応する水溶
液中でリン酸アニオンの存在下に蛍光変化するリン酸ア
ニオン選択的発蛍光性化合物から成りリン酸イオンやリ
ン酸化ペプチドの分析に用いられる蛍光センサーに関す
る。
【０００２】
【従来の技術】リン酸アニオンは生体内において重要な
役割を果たしている。例えばシグナル伝達系では、リン
酸化タンパク質やリン脂質のリン酸基を介し、種々の情
報伝達の制御が行なわれている。したがって、生体内に
相応する水溶液中でリン酸アニオンを検出するセンシン
グシステムが確立されれば、細胞生物学等の分野におけ
る基本的ツールとして生体内の諸プロセスの解析に利用
でき、また、その成果に基づき新しい薬剤や試薬の開発
に資することができるものと期待される。例えば、情報
伝達異常によって引き起こされるガン化の鍵反応である
細胞内リン酸化シグナルを認識し、その阻害剤等の設計
のために有効であると考えられる。
【０００３】リン酸アニオンのようなアニオンを検出す
るには、アニオンに特異的に結合して蛍光変化する化合
物から成る蛍光プローブが有用であると考えられる。し
かしながら、金属イオンに代表されるカチオンを検出す
るための蛍光プローブは多く開発されているのに対し、
アニオンを検出し得る蛍光プローブに関しては、有機溶
媒中で機能するものは幾つか提示されているが、生体内
のような中性水溶液中で使用できるものは殆ど存在しな
い。これは、一般にアニオンは金属イオンよりもサイズ
が大きいため、水溶液中では水和の影響を受けやすくキ
レートさせることが困難なことに一因がある。また、金
属イオン検出用プローブの場合、蛍光化合物の構造式中
に存在する芳香族アミノ基などが金属に配位することに
よって蛍光特性を変化させることが可能であるが、アニ
オン検出において同様の手法を用いることは困難なこと
にも因る。これらのことから、リン酸アニオンのような
アニオンを検出するための蛍光プローブの例はきわめて
少ない。
【０００４】水溶液中でリン酸アニオンを認識する蛍光
プローブの数少ない例としてBeerらによって報告されて
いるルテニウム−ビピリジルポリアザ化合物がある（P.
D. Beer他、Angew. Chem. Int. Ed., 40, 486 (2001);
P.D. Beer他、J. Am. Chem.Soc., 119, 11864 (1997)）
が、その蛍光変化はかなり小さい。その他には、有機ボ
ロン酸ジエステル化合物をリン酸イオン等のアニオン検
出用蛍光プローブとして使用する例（特開２００１−１
３３４０７）が見出される程度である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、リン
酸アニオンを高感度に検出することのできる蛍光プロー
ブから成る新規なセンサーを提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者は、研究を重ね
た結果、アントラセン等の蛍光性官能基を骨格として有
する亜鉛ジピコリルアミン二核錯体型分子が、生理的条
件に相応する水溶液中でリン酸アニオンを選択的に捕捉
し、これを蛍光変化としてセンシングできることを発見
した。かくして、本発明に従えば、上記の目的を達成し
得るものとして、下記の一般式（１）で表わされるリン
酸アニオン選択的発蛍光性化合物から成る、リン酸イオ
ンおよびリン酸化ペプチド用蛍光センサーが提供され
る。
【０００７】
【化３】
【０００８】式（１）中、ＦＬは、芳香環または複素環
を有する発蛍光性官能基または原子団を表わし、Ｘは、
水溶液中で脱離してアニオンと成る官能基または原子団
を表わす。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明の蛍光センサーに用いられ
るリン酸アニオン選択的発蛍光性化合物は、式（１）で
表わされるように、２，２’−ジピコリルアミン（以
下、Ｄｐａと略称する）と亜鉛とから構成される亜鉛二
核錯体型化合物から成る新しいタイプのアニオン検出用
蛍光プローブである。式（１）において、ＦＬで表わさ
れる芳香環または複素環を有する発蛍光性官能基または
原子団として好ましい例は、下記の（２）で表わされる
ものである。
【００１０】
【化４】
【００１１】また、式（１）において、Ｘで表わされ、
水溶液中で脱離してアニオンと成る官能基または原子団
として好ましい例としては、ＮＯ3、ハロゲン原子（特
に、塩素または臭素）、ＣｌＯ4（過塩素酸イオン）な
どを挙げることができる。かくして、本発明のリン酸イ
オンおよびリン酸化ペプチド用蛍光センサーを構成する
リン酸アニオン選択的発蛍光性化合物の特に好ましい１
例は、下記の式（３）で表わされるものである（以下、
式（３）の化合物をＺｎ(Dpa)−9，10−Anth錯体と略称
する）。
【００１２】
【化５】
【００１３】式（３）の化合物に代表される式（１）の
金属錯体は、生体内の条件（生理的条件）に相応する中
性ｐHの水溶液中で、リン酸アニオンの存在下に顕著な
蛍光変化を示すリン酸アニオン選択的発蛍光性化合物で
ある。これは、式（１）で表わされる化合物は、水中に
おいてＸが脱離してリン酸アニオンと入れ替わることに
よりリン酸アニオンを選択的に捕捉し、これが蛍光変化
として出現することに因るものと考えられる。かくし
て、本発明で用いられる式（１）で表わされる発蛍光性
化合物は、μＭオーダーの濃度を含むきわめて低濃度の
リン酸イオンの存在下に明瞭な蛍光変化を示すリン酸イ
オンの定性および定量分析用高感度センサーとして機能
する（後述の実施例２参照）。
【００１４】さらに、式（１）で表わされる発蛍光性化
合物は、単離したリン酸イオンのみならず、特定のリン
酸化ペプチドに対しても蛍光応答を示す。すなわち、本
発明の化合物は、リン酸化アミノ酸（アミノ酸残基）の
他に疎水性アミノ酸残基およびアニオン性アミノ酸残基
を含むアミノ酸配列から成るペプチドに対して高い親和
性を有し、該ペプチドの濃度変化に応じた蛍光変化を示
す。これは、芳香環や複素環を持つ本発明の化合物が、
一般にトータルで４価の正電荷を有することに因るもの
と考えられる。このように、式（１）で表わされる亜鉛
ジピコリルアミン二核錯体から成る本発明の化合物は、
リン酸化ペプチドに対する配列選択的なセンサーとして
も機能する（後述の実施例３参照）。
【００１５】式（１）で表わされる発蛍光性化合物は、
既知の反応を工夫することにより容易に合成することが
できる。図１は、本発明で用いられる式（１）の発蛍光
性化合物の合成スキームを概示するものである。図１に
示すように、発蛍光性官能基または原子団（ＦＬ）を有
するブロモ体（Ａ）を得ることができれば、これを炭酸
カリウムの存在下に２，２’−ジピコリルアミン（Ｂ）
と反応させることにより、発蛍光性官能基または原子団
（ＦＬ）を介して２つのＤｐａが結合した化合物（Ｃ）
が生成される。発蛍光性化合物となる所望の金属錯体
（１）を得るには、この化合物（Ｃ）を亜鉛のＸ塩（Ｚ
ｎＸ）と混合するだけでよい。すなわち、亜鉛は配位子
置換活性であるため、平衡が非常に速いので、適当な緩
衝液（例えば、ホウ酸緩衝液）でｐＨを調整した水溶液
中で、合成レセプター分子と亜鉛の塩（例えば硝酸亜
鉛）を混合するだけで所望の錯体が形成される。
【００１６】
【実施例】以下に、本発明の特徴をさらに具体的に明ら
かにするため実施例を示すが、本発明は、これらの実施
例によって制限されるものではない。なお、本明細書お
よび図面中の化学構造式においては、慣用的な表現法に
従い、炭素原子や水素原子を省略して示していることも
ある。また、化学構造式において、破線で示しているの
は配位結合である。
【００１７】実施例１：発蛍光性化合物の合成 本発明に従う発蛍光性化合物として、既述の式（３）で
表されるＺｎ(Dpa)−9，10−Anth錯体を以下のように合
成した。先ず、ジメチルアントリル基を介して２つのＤ
ｐａが結合した化合物（図１のＣに相当）を次のように
合成した：50mLの二口フラスコに、ヨウ化カリウム0.12
g、炭酸カリウム1.05g、９，１０−ビス（クロロメチ
ル）アントラセン（Ａ）0.50ｇを入れ、脱気窒素置換し
た後、ジメチルホルムアミド10mLに溶解した。ジピコリ
ルアミン（Ｂ）0.68mLを加えて35度で6時間、45度で一
晩加熱攪拌した。不溶物をろ別後、ろ液を減圧留去し
た。得られた残渣をクロロホルムに溶解し、0.01N水酸
化ナトリウム水溶液で洗浄した。有機相を濃縮後、シリ
カゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、黄土色固体
を得た。同定はＮＭＲと元素分析（計算値：Ｃ：79.9
7、Ｈ：6.04、Ｎ：13.99、実測値：Ｃ：79.84、Ｈ：6.0
4、Ｎ：13.99）で行った。次に、以上のようにして得ら
れた化合物45.06ｍｇをメタノールに溶解させ、50ｍＭ
硝酸亜鉛水溶液3mLを加えて攪拌した。メタノールを減
圧留去した後、凍結乾燥を行い黄土色固体として式
（３）の化合物を得た。同定は質量分析（分子量計算
値：852.75、実測値：852.94）および元素分析（計算
値：C：47.31、Ｈ：3.97、Ｎ：13.79、実測値：Ｃ：47.
20、Ｈ：3.93、Ｎ：13.74）で行った。
【００１８】実施例２：アニオン選択性実験 本発明に従う発蛍光性化合物として実施例１のように調
製したＺｎ(Dpa)−9，10−Anth錯体を用いて、種々のア
ニオンの濃度変化に対する蛍光強度変化を測定した。測
定したアニオンは、リン酸イオン（phosphate）、酢酸
イオン（acetate）、硝酸イオン（nitrate）、硫酸イオ
ン（sulfate）、アジドイオン（azide）、フッ素イオン
（fluoride）、塩素イオン（chloride）および臭素イオ
ン（bromide）であり、いずれもナトリウム塩として水
溶液中に添加し溶解させた。測定条件は以下のとおりで
ある。 Ｚｎ(Dpa)−9，10−Anth錯体濃度＝10μＭ アニオン濃度＝0, 10, 20, 30, 100, 500, 1000, 2000
μＭ（0〜200eq.） 水溶液：ｐH(7.2), 10ｍM ＨＥＰＥＳバッファー 測定温度＝20℃ 測定セル：1ｃｍセル 励起波長λex＝380ｎｍ（ex／em＝2.5／2.5ｎｍ） 測定結果を図２に示す。図に示されるようにリン酸イオ
ン以外のアニオンについては、蛍光強度の変化は殆ど認
められない。このように、本発明に従うＺｎ(Dpa)−9，
10−Anth錯体は、リン酸アニオンに対して高い選択性を
有し、高感度のリン酸アニオン分析用センサーとして機
能することが理解される。
【００１９】実施例３：ペプチドに対する配列選択性実
験 既述の式（３）のＺｎ(Dpa)−9，10−Anth錯体を用い種
々の配列のペプチドに対する蛍光変化を調べ、その選択
性を評価した。比較のために、下記の式（４）で表わさ
れるようにＺｎ(Dpa)を１つだけ持つ単核錯体について
も同様の実験を行なった（以下、式（４）の化合物をＺ
ｎ(Dpa)−９−Anth錯体と略称する）。
【００２０】
【化６】
【００２１】ペプチド合成 図３に示すようなアミノ酸配列を有するペプチドを用い
て実験を行なった。各ペプチドは、Ｎ末端がアセチル化
により保護され且つＣ末端がアミド型となっており、ペ
プチド（peptide）１，１’、２および３のアミノ酸配
列は、それぞれ、配列番号１，２，３および４として後
述の配列表に記すものである。ペプチド１，２および３
は、図３のカッコ内に示したキナーゼによりリン酸化さ
れるコンセンサス配列を構成するものである。各配列
は、次の特性を有するものとして選択した。 ペプチド１：リン酸化されたアミノ酸（５位のＴｙｒ）
を有するとともに、疎水性残基を有し、負電荷をもつア
ミノ酸も存在する。 ペプチド１’：ペプチド１のコントロールペプチドであ
り、リン酸化されたアミノ酸を有しない。 ペプチド２：リン酸化されたアミノ酸（５位のＳｅｒ）
を有し、疎水性残基を有してはいるが、正電荷をもつア
ミノ酸が多く存在する。 ペプチド３：リン酸化されたアミノ酸（４位のＴｙｒ）
を有するとともに、疎水性残基を有し、正電荷・負電化
をもつアミノ酸が同じ数存在し、全体的に電荷が中和さ
れている。
【００２２】各ペプチドはペプチド合成機（ABI 433A p
eptide synthesizer）により自動合成した。アミド樹脂
（導入率0.64mmol／g、0.1mmolスケール）に対して４等
量のFmocアミノ酸（0.4mmol）を用い、ペプチド合成装
置により自動合成した。なお、縮合剤にはＨＢＴＵを用
い、Ｎ末端アミノ酸の脱保護まで行った。自動合成後、
得られた樹脂を使い捨てカラムに移し、塩化メチレンで
よく洗浄した。その後、塩化メチレン５ml、無水酢酸0.
8mlを加え、ボルテックスで攪拌した。反応追跡はカイ
ザーテストにより行い、フリーのアミノ基が完全になく
なるまで反応を続けた。反応終了後、塩化メチレンでよ
く洗浄し、デシケータ中で減圧乾燥した。得られた樹脂
を50mlのナスフラスコに入れ、切り出し・脱保護用試薬
（ｍ−クレゾール、チオアニソール、ＴＦＡ）をそれぞ
れ必要量（樹脂300mgに対し、ｍ−クレゾール0.06ml、
チオアニソール0.36ml、ＴＦＡ2.58ml）加え、室温で１
時間攪拌した。樹脂をろ別し、ろ液を減圧留去した。Ｔ
ＢＭＥを加え、粗ペプチドの沈殿物をろ取し、デシケー
タ中で減圧乾燥した。得られた粗ペプチドをＮＭＰに溶
解させ、ＨＰＬＣを用いて目的ペプチドのピークを分取
した。同定はＭＡＬＣＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより行った。
【００２３】ペプチド選択性評価 各ペプチドに対する水溶液中における選択性は蛍光測定
により評価した。測定条件は下記のとおりである。 錯体濃度＝0.5μＭ。但し、ペプチド３に対するＺｎ(Dp
a)−9，10−Anth錯体の濃度は10μＭ。 ペプチド濃度＝0〜10eq.。但し、ペプチド３に対するペ
プチド濃度は0〜5eq.。 測定水溶液：ｐＨ（7.2）、50ｍＭ ＨＥＰＥＳバッフ
ァー。 測定セル：1cmセル 励起波長λex＝380nm（スリット幅ex／em＝5／10nm）。 測定結果を図４に示す。図４に示されるように、Ｚｎ(D
pa)−9，10−Anth錯体のみが、リン酸化されたアミノ酸
を有するとともに疎水性アミノ酸を有し且つ負電荷をも
つアミノ酸が存在するペプチド（ペプチド１）のみに対
して高い親和性を有し、そのペプチド濃度の変化に応じ
て蛍光強度が顕著に変化している。したがって、本発明
に従うＺｎ(Dpa)−9，10−Anth錯体は、リン酸化ペプチ
ドの対する配列選択的なセンサーとしても機能すること
が理解される。
【００２４】
【発明の効果】如上の説明から明らかなように、本発明
に従う亜鉛ジピコリルアミン二核錯体は、生体内の条件
に相応する水溶液中において、リン酸イオンを検出する
高感度の蛍光センサーとして機能し、また、リン酸化ペ
プチドに対する配列選択的な高感度センサーとしても有
用である。したがって、本発明は、生体内の反応機構を
解明するための有力な研究手段を提供するとともに、こ
の手段を利用して新しい薬剤、試薬、機能素子等の開発
に資するものである。
【００２５】
【配列表】
SEQUENCE LISTING <110> Japan Science and Technology Corporation <120> Fluorescent sensors for phosphate-ions and
phosphorylated peptides <130> P0087T <160> 4 <210> 1 <211> 9 <213> Artificial Sequence <222> Position 5 <223> Tyrosine at the position 5 is phosphorylate
d <400> 1 Glu Glu Glu Ile Tyr Glu Glu Phe Asp <210> 2 <211> 9 <213> Artificial Sequence <400> 2 Glu Glu Glu Ile Tyr Glu Glu Phe Asp <210> 3 <211> 9 <213> Artificial Sequence <222> Position 5 <223> Serine at the position 5 is phosphorylated <400> 3 Arg Arg Phe Gly Ser Ile Arg Arg Phe <210> 4 <211> 8 <213> Artificial Sequence <222> Position 4 <223> Tyrosine at the position 4 is phosphorylate
d <400> 4 Lys Ser Gly Tyr Leu Ser Ser Glu
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の蛍光センサーに用いられる亜鉛ジピコ
リルアミン二核錯体の合成スキームを概示する。
【図２】本発明の蛍光センサーを用いて種々のアニオン
の濃度変化に対する蛍光強度変化を測定した１例を示
す。
【図３】本発明の蛍光センサーのペプチドに対する配列
選択性を調べるのに用いたペプチドのアミノ酸配列を示
す。
【図４】本発明の蛍光センサーを用いて種々の配列のペ
プチドの濃度変化に対する蛍光強度変化を測定した１例
を示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 31/00 Ｇ０１Ｎ 31/00 Ｖ 31/22 １２２ 31/22 １２２ 33/52 33/52 Ｃ Ｆターム(参考） 2G042 AA01 BB16 BD19 BD20 CA02 CA10 CB03 DA08 FA11 FB02 GA05 HA07 2G045 AA40 DB04 FA11 2G054 AA02 AA06 AB07 CA10 EA01 EA03 EB01 4H048 AA01 AB92 VA20 VA30 VA32 VA66 VB10

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 下記の一般式（１）で表わされるリン酸
    アニオン選択的発蛍光性化合物から成ることを特徴とす
    るリン酸イオンおよびリン酸化ペプチド用蛍光センサ
    ー。 【化１】 〔式（１）中、ＦＬは、芳香環または複素環を有する発
    蛍光性官能基または原子団を表わし、Ｘは、水溶液中で
    脱離してアニオンと成る官能基または原子団を表わ
    す。〕
  2. 【請求項２】 ＦＬが、下記の（２）に示すものの１つ
    から選ばれることを特徴とする請求項１の発蛍光性化合
    物。 【化２】
  3. 【請求項３】 Ｘが、ＮＯ3、ハロゲン原子、またはＣ
    ｌＯ4であることを特徴とする請求項１または２の発蛍
    光性化合物。
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