JPS6126558B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、酵素活性測定用のけい光性基質また
はその合成中間体として有用な新規７−グリシル
プロリルミノ−４−メチルクマリンに関する。 本発明者は、簡便で高感度の測定が可能な酵素
の新しい基質を得るために鋭意研究を重ねた結
果、構造式 で示される７−グリシルプロリルアミノ−４−メ
チルクマリン（分子を構成するグリシンのｄ−ア
ミノ基が保護されているものをも含む）の合成に
成功し、さらにこの新規化合物が、簡便で高感度
の測定が可能な、酵素例えばすでに本発明者が見
出しているＸ−プロリルジペプチジルアミノペプ
チダーゼ即ちＸ−Ｌ−プロリンＰ−ニトロアニリ
ド（Ｘは中性、酸性或いは塩基性アミノ酸）に作
用しＮ−末端Ｘ−Ｌ−プロリン及びＰ−ニトロア
ニリンに分解遊離せしめる酵素のけい光性基質お
よび／またその合成中間体となることを見出し本
発明を完成するに至つた。 本発明の化合物は塩酸、硫酸等の鉱酸あるいは
酢酸、Ｐ−トルエンスルホン酸等の有機酸の酸付
加塩の形であつてもよい。 このような酸付加塩から遊離形のものを得るに
は、酸付加塩をアルカリで中和すればよい。 本発明の７−グリシルプロリルアミノ−４−メ
チルクマリンは、それを構成するグリシンのアミ
ノ基が保護されているものをも含む。 アミノ基の保護基としては、カルボベンゾキシ
基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、ｔ−アミル
オキシカルボニル基、トリチル基、Ｐ−ニトロカ
ルボベンゾキシ基、ホルミル基、トリフルオルア
セチル基、フタロイル基等ペプチドの合成に慣用
されているアミノ基の保護基やベンゾイル基、ア
セチル基、トシル基の保護基をあげることができ
る。なお、上記保護基による保護方法あるいは保
護されたものの保護基の脱離方法は、例えばそれ
ぞれペプチド合成の際にアミノ基の保護方法ある
いは脱離方法として慣用されている手段を適宜選
択利用して行うことができる。 本発明の目的化合物は例えばＮ−保護−グリシ
ルプロリンと７−アミノ−４−メチルクマリン
（MCA）を反応せしめることにより製造すること
ができる。この場合Ｎ−保護の保護基としてはも
ちろん上述したものが採用できる。反応において
はトリメチルアミン、トリエチルアミン等トリア
ルキルアミン、ピリジン等の有機塩基の存在下ジ
シクロヘキシルカルボジイミド（DCCD）、Ｎ−
エチル−N′−３−ジメテルアミノプロピル−カ
ルボジイミド（WSCI）、クロル蟻酸イソブチル
等のクロル蟻酸エステル等で縮合させるとよい。
この縮合反応はジメチルホルムアミド（DMF）
クロロホルム、ジクロルメタン、エチル酢酸エス
テルやジオキサン、テトラヒドロフラン
（THF）等の不活性溶媒を用いることもできる。 このようにして得られた縮合物から、そのアミ
ノ基の保護基を脱離するには、脱離方法として上
記慣用手段を適宜選択利用すればよい。例えば、
接触的水素化方法を利用すればよい。 また分子を構成するプロリンがＬ−体又はＤ−
体のいずれか一方のものである目的化合物を製造
するには、目的化合物の製造反応に用いる出発原
料のグリシルプロリンに目的とする光学活性体を
採用してもよいし、目的化合物のDL−体を製造
してこれを常法の光学分割に付してもよい。 試料溶液と７−グリシル−Ｌ−プロリルアミノ
−４−メチルクマリンを接触せしめ、次いで７−
アミノ−４−メチルクマリンを定量することによ
り試料溶液中の酵素Ｘ−プロリルジペプチジルア
ミノペプチダーゼ活性を測定することができる。
７−グリシル−Ｌ−プロリルアミノ−４−メチル
クマリンは試料溶液中にＸ−プロリルジペプチジ
ルアミノペプチダーゼが存在すればその量に比例
してグリシル−Ｌ−プロリンと７−アミノ−４−
メチルクマリンに分解遊離する。ここでEx380n
ｍ、Em460nｍのけい光下でその７−アミノ−４
−メチルクマリンのけい光強度を測定することに
より高感度の酵素活性を測定できる。すなわち、
７−アミノ−４−メチルクマリンは分解遊離前の
７−グリシル−Ｌ−プロリルアミノ−４−メチル
クマリンの30倍という相対けい光強度を示すこと
を見出したことにより上記測定を可能とした。 本発明者は体内に特に体液例えば血清、唾液に
７−グリシル−Ｌ−プロリルアミノ−４−メチル
クマリンに作用してグリシル−Ｌ−プロリンと７
−アミノ−４−メチルクマリンに分解するジペプ
チジルアミノペプチダーゼの一種である酵素、Ｘ
−プロリルジペプチジルアミノペプチダーゼが存
在することを見出し、さらに体液中、特に血清中
の当該酵素活性を前記７−グリシル−Ｌ−プロリ
ルアミノ−４−メチルクマリンを基質として正常
人並びに各種疾患に罹つている患者につき測定し
たところ、正常人であれば男女間に、特に若年層
の男女間に若干有意な差は認められるがほぼ一定
であるにもかかわらず、肝臓並びに隣接臓器の疾
患例えば急性及び慢性肝炎、肝硬変或いは胆管ガ
ンにあつては当該酵素活性が増加していること、
さらに驚くべきことに癌例えば胃癌、膵癌にあつ
ては活性が低下していることを見出し、本酵素活
性を測定することは疾患診断時に癌診断に大変役
立つことを認めた。殊に、従来よい診断方法のな
い、胃癌の肝転移の診断に極めて有力な方法であ
る。 さらに、７−グリシル−Ｌ−プロリルアミノ−
４−メチルクマリンは本酵素活性測定用基質とし
て発癌性等の問題を惹起することのない安全な物
質であり、また基質として不可欠な各種条件即ち
酵素作用を受けた基質量の測定の容易さ、安定
性、酵素量及び接触反応時間に対する直線性等を
全て満足するものであることを確認し、医学上重
要な意義を有する本酵素活性測定法を確立した。 基質としての７−グリシル−Ｌ−プロリルアミ
ノ−４−メチルクマリンは遊離体として使用され
るのみならず、酵素反応を阻害しない酸との付加
塩、例えばＰ−トルエンスルホン酸、塩酸、臭化
水素酸との塩の形で測定系に導入することもでき
る。 酵素活性の測定方法は格別に困難なく行うこと
ができる。例えば、まず初めに基質溶液を調製す
るのであるが、先述の如く７−グリシル−Ｌ−プ
ロリルアミノ−４−メチルクマリンの適当な濃度
の溶液を調製する。基質の水溶解性が低い場合に
は界面活性剤等の溶解促進物質を用いるのが有利
である。基質溶液のPHは使用する基質の種類によ
り異るが、本酵素による加水分解速度並びに基質
の酵素以外の要因による分解（即ち基質安定性）
等を考慮し、実験的に容易に最適値を求めること
ができる。通常PHは中性付近より詳しくは６〜９
付近が選択される。 測定は前記基質溶液と試料溶液を混合せしめ、
30〜45℃にて基質量及び試料溶液中のグリシルプ
ロピルジペプチジルアミノペプチダーゼの量に応
じ適当時間反応させた後、酵素活性を常法により
失活せしめ遊離７−アミノ−４−メチルクマリン
を上述の如く定量することにより本酵素活性を高
感度に知ることができる。 以下、実施例により本発明を詳細に説明する。 実施例 Ｎ−カルボベンゾキシグリシル−Ｌ−プロリン
1.53ｇ（５ミリモル）およびトリエチルアミン
0.7ml（５ミリモル）のTHF溶液30mlに−５〜−
10℃冷却下クロル蟻酸イソブチル585mg（５ミリ
モル）を加え10分間かきまぜた後これに７−アミ
ノ−４−メチルクマリン875mg（５ミリモル）の
DMF溶液20mlを加え同温度で30分次いで室温で
４時間かきまぜた。 反応混合物より溶媒を減圧下留去し残渣に酢酸
エチル75mlを加え１規定塩酸、水、５％重炭酸ナ
トリウム水溶液、水の順で洗浄した後、酢酸エチ
ル層を無水芒硝で乾燥した。酢酸エチルを減圧留
去後得られた粗生成物をシリカゲル（50ｇのカラ
ムクロマトグラフイー（溶出溶媒、ベンゼン：酢
酸エチル＝１：２、酢酸エチルのみ）で精製し、
次に酢酸エチル（10ml）−ｎ−ヘキサン（30ml）
で再沈し、７−（Ｎ−カルボベンゾキシグリシル
−Ｌ−プロリル）アミノ−４−メチルクマリン
1.4ｇ（収率60％）を得た。 融点：107.5〜113.5℃〔α〕^１８ _Ｄ−116.1゜（Ｃ＝
１、DMF） この結晶は薄層クロマトグラフイー（クロロホ
ルム：メタノール：酢酸＝95：５：３）で単一ス
ポツト（Rf＝0.65）を与えた。 元素分析 測定値 Ｃ 62.49％、Ｈ 5.81％、Ｎ 8.96％ C₂₅H₂₅N₃O₆・H₂Oとしての計算値 Ｃ 62.36％、Ｈ 5.65％、Ｎ 8.73％ ７−（Ｎ−カルボベンゾキシグリシル−Ｌ−プ
ロリル）アミノ−４−メチルクマリン464mg（１
ミリモル）を80％酢酸10mlとメタノール50mlに溶
解し、これに10％Pd−C50mgを加え４時間水素ガ
スを通じて接触還元を行い７−グリシル−Ｌ−プ
ロリルアミノ−４−メチルクマリンを生成せしめ
た。 反応混合物より触媒を別後液にＰ−トルエ
ンスルホン酸の１水和物190mg（１ミリモル）加
えてそのまま凍結乾燥した。残渣に水50mlを加え
さらに凍結乾燥して得た白色粉末465mgをエタノ
ール（10ml）−エーテル（50ml）で再沈を行い、
７−グリシル−Ｌ−プロリルアミノ−４−メチル
クマリンのＰ−トルエンスルホン酸塩400mg（７
−（Ｎ−カルボベンゾキシグリシル−Ｌ−プロリ
ル）アミノ−４−メチルクマリンよりの収率：
77.4％）を得た。融点：182.0〜188.5℃。 〔α〕^２０ _Ｄ＝−111.0゜（Ｃ＝１、酢酸） この結晶は次に示す如く薄層クロマトグラフイ
ーで単一スポツトを与えた。 ｎ−ブタノール：酢酸：水：＝４：１：５
Rf＝0.4 ｎ−ブタノール：ピリジン：酢酸：水＝15：
10：３：12 Rf＝0.7 元素分析 測定値 Ｃ 54.08％、Ｈ 5.44％、Ｎ 7.58％ C₂₄H₂₇O₇N₃S・３／２H₂Oとしての計算値 Ｃ 54.53％、Ｈ 5.72％、Ｎ 7.95％ ７−グリシル−Ｌ−プロリルアミノ−４−メチ
ルクマリンＰ−トルエンスルホン酸塩（GIy−
Pro−MCA Tosylate）を水に２ミリモル濃度と
なるように溶解し基質溶液とした。ヒト顎下腺よ
り均一に精製したＸ−プロリルジペプチジルアミ
ノペプチダーゼを酵素液として用いて次の表に示
す操作を順次行い、次いで同様の操作をインキユ
ベート時間を変化させて行つた。けい光分析によ
り反応時間と生成した７−アミノ−４−メチルク
マリン量と関係を求めた。

【表】 380nｍ／460nｍにおけるけい光強度をそれぞ
れ測定（Ex／Em）し、酵素により生成した
MCAの量は、次式により求めた。 Ｅ−Ｃ／Ｓ−Ｂ×3nmol 結果を次表に示した。

【表】 以上の結果から、本基質は反応時間に対し比例
して（直線関係に）MCAを生成せしめることが
わかる。 次に、上記の実験を酵素液量を各種変化せしめ
て行い37℃、30分間インキユベーシヨンした後の
けい光強度を同様に測定して、酵素により生成し
たMCAの量を求めた。結果を次に示した。

【表】

【表】 上記の結果から明らかな通り、本基質は使用酵
素量に比例して（直線関係に）MCAを与えるこ
とが確認された。 試料溶液に本基質を上記の方法に準じて作用せ
しめて生成するMCA量を測定し標準関係と比較
すれば、試料溶液中の目的とする酵素の量を正確
に測定でき、故に前述のような病気の診断に役立
つことがわかる。 正常ヒトの脳脊髄液、血清及び唾液について上
記同様にしてMCA量を求め、酵素活性（I.U.／
１ml酵素液）を求めた。結果を次に示した。

【表】 血清中のＸ−プロリルジペプチジルアミノペプ
チダーゼ活性は前記のように肝疾患や胃癌の診断
上有意義であるが、本物質を基質として用いれ
ば、１μｌ以下の血清で超微量測定が可能であ
る。また、脳脊髄液中の本酵素活性は本物質と用
いる測定法によつて始めて測定が可能となり、酵
素の存在が発見された。唾液中の本酵素活性も本
物質を基質として用いれば測定容易であり、血清
の代りに唾液を用いる酵素検査法にも応用可能で
ある。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 構造式 で示される７−グリシルプロリルアミノ−４−メ
   チルクマリン。