DE2808111A1

DE2808111A1 - Neue dipeptidderivate und deren verwendung zur messung der enzymatischen aktivitaet

Info

Publication number: DE2808111A1
Application number: DE19782808111
Authority: DE
Inventors: Toshiharu Nagatsu; Shumpei Sakakibara
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1977-02-26
Filing date: 1978-02-24
Publication date: 1978-08-31
Also published as: JPS53105477A; JPS6126558B2; SE7801997L; FR2381764A1; GB1547747A

Description

BESCHREIBUNG

Die Erfindung "betrifft neue Dipeptidderivate. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf 7-Glycylprolylamino-4-methylcuinarin und dessen Säuresalze, die sich als fluoreszenzerzeugende Substrate (fluorogene Substrate) zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität eignen, sowie auf N-geschützte Derivate von T-Glycylprolylamino-^methylcumarin, die geeignete synthetische Zwischenprodukte für diese Substrate sind.

Durch eingehende Untersuchungen im Hinblick auf die Herstellung eines neuen Substrats, welches die einfache und hochempfindliche Bestimmung von enzymatischer Aktivität ermöglicht, wurdenerfindungsgemäß die neue Verbindung 7-Glycylprolylamino-A—methylcumarin der nachstehenden Formel, sowie Säuresalze dieser Verbindung, aufgefunden und synthetisiert.

NH₀-CIL-CO-N
2 2 ν

^XCH -CH CO- MH

Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß diese Verbindungen geeignet als fluoreszenzerseugende Substrate zur einfachen und hochempfindlichen Bestimmung der Aktivität von Enzymen, wie X-Prolyl-dipeptidyl-aminopeptidase sind, die von den Erfindern bereits im Serum verschiedener Tiere und im menschlichen Serum entdeckt worden ist und die X-L-Prolin-p-nitroanilid in X-L-

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Prolin und p-Nitroanilin spaltet (dabei bedeutet X einen neutralen, sauren oder basischen Aminosäurerest). Dieses Enzym ist mit hoher Wahrscheinlichkeit identisch mit Glycylprolyl-ß-naphthylamidase, die In¹¹ClIn. Chim. Acta, 62 5-11 (1975)" beschrieben worden ist.

Weitere neue erfindungsgemäße Verbindungen sind N-geschützte Derivate von 7-Glycylprolylamino-4-methylcumarin, die wertvolle Zwischenprodukte darstellen, welche sich in die vorher erläuterten neuen Substrate überführen lassen. Zu geeigneten Schutzgruppen für die Aminogruppe des Glycinrests gehören die Carbqbenzoxy-, t-Butyloxycarbonyl-, t-Amyloxycarbonyl-, Trityl-, p-Nitrocarbobenzoxy-, Formyl-, Trifluoracetyl- und Phthaloyl-Gruppe, d.h. Gruppen, die zur Synthese von Peptiden verwendet werden, außerdem oeBenzoyl-, Acetyl- und Tosylgruppe. Die Anlagerung an die Aminogruppe und die Freisetzung von der Aminogruppe kann durch geeignet ausgewählte Methoden erfolgen, wie sie beispielsweise beider Synthese von Peptiden zum Schutz von Aminosäuren und zur Freisetzung von diesen Aminosäuren angewendet werden.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können durch die Reaktion von N-geschütztem Glycylprolin mit 7-Amino-4-methylcumarin (i-ICA) hergestellt werden. Der Schutz am N-Atom kann durch geeignete ¥ahl einer der vorher aufgezählten Schutzgruppen erreicht werden. Die Synthese umfaßt die Kondensation unter Verwendung eines Reagenz, wie Dicyclohexylcaroodiimid (DCC), IJ-Äthyl-N^-dimetlrylaminopropylcarbodiimid oder eines Chloramaisensäureesters, wie Isobutylchlorformiat, in Gegenwart einer organischen Base, wie von Triniethylainin, Triethylamin oder eines höheren Alkylamins oder von Pyridin. Für die Kondensaticnsreaktion kann ein Lösungsmittel, wie Dimethylformamid (BIIF), Chloroform, Dichlornethan, Äthylacetat, oder ein inertes Lösungsmittel, wie Dioxan oder Tetrahydrofuran (THF) angewendet werden. Die Freisetzung der Schutzgruppe von den Kondensationsprodukt kann durch geeignete Wahl der Freisetzungsmethoden, die bei Peptidsynthesen üblich sind,

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erfolgen. Als eine dieser Methoden kann die katalytische Hydrierung angewendet v/erden.

Gemäß einer besonders wirksamen Methode wird die t-Butyloxycarbonylgruppe (BOC) zum Schutz dsr Arninogruppe des Glycinrests verwendet und später wird ρ-Toluolsulfonsäure (TosOH) zur Abspaltung des BOC-Rests von dem N-geschützten Derivat von 7-Glycylprolylamino-4-methylcumarin angewendet. Im Vergleich mit anderen Methoden, wie der Behandlung mit Trifluoressigsäure oder Chlorwasserstoff in einem organischen Lösungsmittel, wie Äthylacetat, hat diese Methode nachstehende charakteristische Vorteile :

(1) Es ist nur eine kleine Menge des Reagenz (p-Toluolsulfonsäure) erforderlich,

(2) es bildet sich praktisch kein Nebenprodukt oder nur eine geringe Menge an Nebenprodukt, welches die enz3onatische Verfügbarkeit des Substrats vermindert,

(3) hohe Reinheit des Endprodukts nach der Abspaltung der Schutzgruppe,

(4) Einfachheit der Reaktion und der nachfolgenden Verfahrensschritte und

(5) höhere Ausbeute.

Diese charakteristischen Vorteile ermöglichen es, in guter Ausbeute ein hochreines Produkt (in kristalliner Form) lediglich durch Umkristallisieren des Rohprodukts aus einem geeigneten Lösungsmittel, wie einem binären Gemisch von !!ethanol und Äthanol, zu erhalten.
Die Reaktion wird durch das nachstehende Formelschema dargestellt

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Bee-GIy-Prο

2 Boc-Giy-Pro + DCC ο + Dicyclohexcylharnstoff

Boc-Gly-Pro
[I]

Boc-Gly-Pro-IJH-fi⁵'

TosOil-Gly-Pro-MCA

Um entweder die entsprechende Verbindung von L- oder D-Prolin herzustellen, kann ein optisch aktives Glycylprolin als Ausgangssubstanz verwendet v/erden oder das in der DL-Form erhaltene Endprodukt kann einer üblichen Methode der optischen Spaltung unterworfen werden.

Die enzymatische Aktivität von X-Prolyl-dipeptidyl-aminopeptidase kann gemessen v/erden, indem die I-Ienge von 7-Amino-4-methylcumarin, das durch enzymatische Hydrolyse von 7-Glycyl-L-prolylamino-4-metiryleumarin im wässrigen Medium gebildet wurde, bestimmt wird. Die Rate der enzymatischen Hydrolysereaktion ist proportional der I-Ienge des Enzyms. Somit kann die enzymatische Aktivität durch Messung der Fluoreszenzintensität des gebildeten 7-Amino-4—methylcumarin bei 460 nm bei einer Anregungswellenlänge von 3SO nm bestimmt werden. Diese Bestimmung wurde durch Feststellung der Tatsache ermöglicht, daß die Fluoreszenzintensität von 7-Amino-4-methylcumarin 30 mal so hoch wie die von 7-Glycyl-L-prolylamino-4-methylcumarin ist.

Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß exokrine und/oder endokrine Flüssigkeiten (innere oder äußere Körperflüssigkeiten), wie Serum, Cerebrospinalflüssigkeit, Speichel und Urin, X-Prolyl-dipeptidyl-aminopeptidase enthalten, welche 7-Glycyl-L-prolylamino-

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4-methylcuniarin zu Glycyl-L-prolin und 7-Amino-4-methylcuinarin hydrolysiert und daß die enzymatische Aktivität in der Körperflüssigkeit, speziell im Serum von Patienten äußerst hoch ist, welche Erkrankungen der Leber, Niere oder der angrenzenden Organe haben, beispielsweise akute oder chronische Hepatitis, Leberzirrhose und Leberkrebs, während die enzymatische Aktivität im normalen menschlichen Serum fast konstant ist, wenn auch geringe, jedoch bedeutende Differenzen zwischen Männern und Frauen, speziell zwischen jungen Männern und Frauen bestehen, und daß die enzymatische Aktivität äußerst niedrig in Körperflüssigkeiten, speziell im Serum, von Patienten mit soliden Tumoren (Magen- oder Pancreaskrebs) und Blutkrebs (lymphozytisch, Neoplasmen) ist. Die erfindungsgemäße Methode zur Messung der enzymatischen Aktivität eignet sich daher zur Diagnose verschiedener Krankheiten, speziell von Leberkrankheiten und malignen Erkrankungen. Diese Methode ist speziell erfolgversprechend für die diagnostische Feststellung, ob ein Magenkrebs Metastasen an der Leber gebildet hat.

Erfindungsgemäß wird eine neue Methode zur Messung der enzymatischen Aktivität von X-Prolyl-dipeptidyl-aminopeptidase zugänglich, indem bestätigt wird, daß 7-Glycyl-L-prolylamino-4-methylcumarin oder dessen Säuresalze sich in sicherer Weise ohne wesentliche Möglichkeit der Karzinogenität als Substrate zur Enz3nn.beStimmung eignen und daß diese Verbindungen hohe Verläßlichkeit im Hinblick auf Einfachheit, Zugänglichkeit und Reproduzierbarkeit der Bestimmung des Ausmaßes der enzymatischen Hydrolyse zeigen, sowie auch im Hinblick auf die Proportionalität zur Enzymaktivität und zur Reaktionsdauer.

7-Glycyl-L-prolylamino-4-methylcumarin kann als Substrat entweder in der freien Aminoform oder in Form eines Salzes mit einer organischen Säure, wie p-Toluolsulfonsäure, oder mit einer anorganischen Säure, wie Chlorwasserstoffsäure oder Bromwasserstoffsäure, von denen keine die enzymatische Reaktion behindert,eingesetzt werden. Diese Salze können in einfacher Weise durch Behandlung der freien Verbindung mit einer Säure in einem geeigneten

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Lösungsmittel hergestellt werden.

Die enzymatische Aktivität kann ohne Schwierigkeiten gemessen werden. 7-Glycyl-L-prolylamino-4-methylcumarin oder dessen Säuresalze werden Ms zum Erreichen einer optimalen Konzentration in Wasser oder, um die Auflösung zu beschleunigen, in der wässrigen Lösung eines oberflächenaktiven Mittels, gelöst. Die Azidität der Lösung wird empirisch auf ein pH-Optimum (gewöhnlich 6 bis 9) für die experimentellen Bedingungen eingestellt, wie die Rate der enzymatischen Hydrolyse und die nichtenzymatische Zersetzung des Substrats (d.h. die.Stabilität des Substrats).

Zur Messung der enzymatischen Aktivität wird das Enzym (bzw. die Lösung der Probe) bei 30 bis 45 C während einer festgesetzten Zeit mit einem Substrat in Form einer Lösung umgesetzt und nach den üblichen Verfahrensmaßnahmen zur Desaktivierung des Enzyms wird die Kenge des in dem Reaktionsgemisch gebildeten 7-Amino-4-raethylcuniarin mit Hilfe der vorstehend beschriebenen Methode bestimmt.

Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele ausführlicher erläutert.

Beistsisl 1

535 mg (5 ml-lol) Isobutylchlorformiat wurden bei -5 bis -1O°C zu 30 ml einer Lösung von 1,53 g (5 mMol) N-Carbobenzoxyslycyl-L-prolin und 0,7 ml (5 mMol) Triäthylamin in Tetrarrydrofuran gegeben und nach 10-minütigen Rühren wurde dem Reaktionsganiisch eins Lösung von 375 mg (5 mMol) 7-Aminc-4-niethylcumarin in Dimethylformamid (20 ml) zugesetzt. Das gesamte Gemisch wurde 30 Minuten bei -5 bis -1O⁰C gerührt und wurde danach 4 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Nach den: Abdestillieren des Lösungsmittels im Vakuum wurde der Rückstand mit 75 nil Äth\-lacetat behandelt und der mit Hilfe des Esters erhaltene Extrakt wurde nacheinander

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_ G —

mit 1 η Chlorwasserstoffsäure, Wasser, 5 /oigem wässrigem Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen und mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das durch Abdestillieren des Esters im Vakuum erhaltene Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie unter Verwendung von 50 g Silicagel als Absorptionsmittel und Äthylacetat oder dessen binärem Gemisch mit Benzol (Volumenverhältnis 2 : 1) als Elutionsmittel gereinigt und mit Hilfe eines Gemisches von Äthylacetat (10 ml) und n-Hexan (30 ml) ausgefällt. Dabei wurden 1,4 g (Ausbeute 60 %) 7-(N-Carbobenzoxyglycyl-L-prolyl)-amino-4-methylcumarin erhalten.

F. 107,5 - 113,5°C; Ca]J⁸, - 116,1° (C = 1, in DMF)

Die Kristalle ergaben im Dünnschichtchromatogramm unter Verwendung eines ternären Elutionsmittels, bestehend aus Chloroform, Methanol und Essigsäure im Volumenverhältnis 95 : 5 : 3, einen einzigen Flecken (R_£ = 0,65).

Elementaranalyse :

Gefunden C, 62,49 %, H, 5,31 %, N, 8,96 % Berechnet für C₂₅H₉₅N₃Og-H₂O,

C, 62,36 %, H, 5,65 %, N, 8,75 %

Zu einer Lösung von 7-(N-Carbobenzoxyglycyl-L-prolyl)-araino-4-methylcumarin (464 mg = 1 mMol) in einem binären Gemisch aus 80 % Essigsäure (10 ml) und Methanoi (50 ml) wurde ein 50 mg-Anteil eines aus 10 % Pd auf C bestehenden Katalysators gegeben und die katalytische Hydrierung wurde während 4 Stunden unter Bildung von 7-Glycyl-L-prolylamino-4-methylcumarin durchgeführt. Nach dem Abfiltrieren des Katalysators wurden dem Filtrat 190 mg ( ImMoI ) p-Toluolsulfonsäure-monohydrat zugesetzt und die Gefriertrocknung durchgeführt. Ein Anteil von 50 ml V/asser wurde dem Rückstand zugegeben, die erhaltene Lösung wurde ebenfalls gefriergetrocknet und das erhaltene farblose Pulver (465 mg) wurde aus einem Gemisch

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- ίο -

aus 10 ml Äthanol und 50 ml Äther umgefüllt, wobei 400 mg 7-Glyc3'-l-L-prolylamino-<'-i—methylcumarin-p-toluolsulfonat erhalten wurden (Ausbeute 77,4 % aus 7-(H-Carbobenzoxyglycyl-L— prolyl)-aniino-4-methylcumarin).

F. 182,0 - 188,5°C;
[a]_D°, -111,0° ( C = 1, in Essigsäure).

Die Kristalle ergaben in jedem der nachstehenden Dünnschichtchromatogramme einen einzigen Flecken :

1) R„ = 0,4 bei Verwendung von n-3utanol/Sssigsäure/\'.^rasser im Volumenverhältnis 4:1 : 5 ;

2) R_f = 0,7 bei Verwendung von n-Butanol/Pyridin/Essigsäure/
Wasser im Volumenverhältnis 15:10:3:12.

Elementaranalyse :

Gefunden C, 54,03 %, H, 5,44 %, N, 7,53 % Berechnet für ^C24^H27°7^N3^S'?'^H2°

C, 54,53 %, H, 5,72 %, N, 7,95 %

BeisOJel 2

10,3 g (0,05 Mol) Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) wurden tropfenweise unter Rühren bei 0⁰C zu einer Lösung von N-Boc-glycyl-L-prolin, das nach der in J. Chem. Soc. (C), 954 (1969) beschriebenen Methode hergestellt worden war (27,2 g = 0,1 ΪΊοΙ) in 100 ml getrocknetem THF gegeben und das Reaktionsgemisch wurde 45 Minuten ständig gerührt. Dann wurde der in dem Gemisch ausgefallene Dicyclohexylharnstoff abfiltriert und dem so erhaltenen Filtrat wurde bei 0 C eine Lösung von 7-Amino-4-methylcumarin (8,75 g = 0,05 Mol) in Dimethylformamid (DMF) (60 ml) zugegeben. Nach dem Stehenlassen bei Raumtemperatur über Nacht wurde das Reaktionsgemisch im Vakuum konzentriert, wobei ein Rückstand erhalten wurde, der in

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300 ml Äthylacetat gelöst wurde. Die Lösung wurde nacheinander mit 1 η Chlorwasserstoffsäure, einer wässrigen 5 zeigen Lösung von Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen und mit wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum konzentriert. Der Rückstand xvurde aus einem binären Gemisch von 150 ml Äthylacetat und 70 ml η-Hexan umkristallisiert, wobei 20,1 g (Ausbeute 93,4 %) kristallines 7-(n-Boc-glycyl-L-prolyl)-amino-4-methylcumarin erhalten wurden.

F. 125,0 - 123_S5°C;
[α]ξ°₉ -123,0° (C = 1, in DMF)

Elementaranalyse ;

Gefunden C₅ 61„74%, H, 6,44%, N₉ 9₉76 % Berechnet für ^C22^H27°6^N3

C₉ 61,52%, E₃ 6ρ34 %, N₉ 9,79?«

Der Boc-Rest wurde nach der folgenden Methode aus der vorstehenden Verbindung entfernt :

5,7 g (0,03 Mol) p-Toluolsulfonsäure-monohydrat wurden unter Rühren zu einer Lösung von 10,8 g (0,025 Mol) 7-(N-Boc-glycyl-L-prolyl)-amino-4-methylcumarin in 20 ml Essigsäure gegeben und das Reaktionsgemisch wurde 90 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Ein Überschuß an getrocknetem Äther wurde dem Gemisch zugesetzt, um alle Reaktionsprodukte auszukristallisieren, die danach abfiltriert, mit Äther gewaschen und 2 mal aus einem binären Gemisch aus 30 ml Methanol und 300 ml Äther umkristallisiert wurden. Dabei wurden 10,5 g (Ausbeute 84 %) 7-Glycyl-L-prolylamino-4-methylcumarin-p-toluolsulfonat in kristalliner Form erhalten.

F. 183,5 - 189,5°C

[a]_D , -112,5° (C = 1, in Essigsäure)

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Elementaranalyse :

Gefunden C, 56,13 %, H, 5,69 %, N, 8,18 Berechnet für C₂^H₂₇O₇N₃S' ^- H₂O

C, 56,45 %, H, 5,53 %, N, 8,23

Beispiel 3

Unter Vervrendung von 7-Glycyl-L-prolylamino-4-methylcumarin-ptoluolsulfonat (GIy-Prο-MCA-Tosylat) als Substrat (Konzentration 2 mKol) und von gereinigter X-Prolyl-dipeptidyl-aminopeptidase aus der menschlichen Unterkieferdrüse als Enzym wurden Versuche durchgeführt, deren Bedingungen nachstehend aufgeführt sind.

HischlÖsung Versuch Kontroll- Standard Blindversuch versuch (E) (C) (S) (B)

40 40 40

25 25 25

35-0 5 55

30 Inkubation bei 37 C während 30 Minuten

1 M Natriumacetat- 1,0 1,0 1,0 1,0

puffer

(pH = 4,2) ul

Enzymlösung, ul 0-35

Die Menge an 7-Amino-4-methylcumarin (MCA), die während vsoäl er ender

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0,15 M Glycin/NaOH- Puffer (pH = 8,7) μ¹	40	35
2 mM Gly-Pro-MCA- Tosylat, ul	25	0
Snzymlösung, pl	0 -
V/asser, ul	35 -
10 pM MCA	-

Reaktions- (Inkubations-) Zeiten durch die enzymatische Reaktion gebildet wurden, wurde durch Fluoreszenzanalyse bestimmt. Die nachstehende Tabelle gibt die Zeitabhängigkeit der Menge an KCA an, die nach folgender Formel berechnet wird :

^X °'^{3 M01}

worin E, C, S und B die Fluoreszenzintensitäten sind, die bei 460 nm mit einer Anregungswellenlänge von 380 nm gemessen werden. Wie aus der nachstehenden Tabelle hervorgeht, ist die Menge von· MCA proportional der Reaktions- bzw. Inkubationszeit.

Dauer der Reaktton (Inkubation)

gebildetes MCA (n Mol)

15 30 60 90 120

1,35 2,80 5,40 8,00 10,60

In der nachstehenden Tabelle wird der Einfluß der Menge des Enzyms auf die Menge von HCA angegeben, die durch die Reaktion bei 37°C während 30 Minuten gebildet wird. Es ist ersichtlich, daß die Menge an MCA proportional der Menge des Enzyms ist.

Menge des Enzyms (pg)

gebildetes MCA ( ρ Mol )

143

1430

4290

14300

80

5/084 9

25,7
262,5
773
2722

Die geeignete Anwendung des Substrats ermöglicht es, die enzymatisch^ Aktivität zu bestimmen, indem die Menge des dabei gebildeten MCA mit der einer Kalibrierungskurve verglichen wird, und es wird somit möglich, das Verfahren zur Diagnose der vorher aufgezählten Krankheiten anzuwenden.

Beispiel 4

In der nachstehenden Tabelle wird die enzymatische Aktivität von Cerebrospinalflüssigkeit, Serum, Speichel und Urin von normalen, gesunden Menschen angegeben, die in gleicher Weise wie in Beispiel 3 gemessen wurde.

Enzymlösung

Anzahl der unter- Enzymaktivität (Durchsuchten Personen schnitt + S.F.)

η Hol/min/ml

η Hol/min/mg. Protein

Cerebrosüinalflüssigkeit

Serum

Speichel

Urin

0,0773^0,0131 38,2 ± 2,2 10,51 ± 1,79 1,46 ±0,31

0,399^0,036 Ο,51Ο±Ο,Ο36 3,91 ±3,70 1,69 ±0,31

* η Mol/min/mg. Kreatinin

Die entsprechende Anwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen als Substrat ermöglicht die Bestimmung der enzymatischen Aktivität von X-Prolyl-dipeptidyl-aminopeptidase in Serum in einem Volumen von weniger als 1 ul, die in spezifischer Relation zur Diagnose von Leberkrankheiten und Magenkrebs angewendet werden kann. Bei dem Verfahren unter Anwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen wird es möglich, die enzymatische Aktivität in Cerebrospinalflüssigkeit und Urin zu bestimmen, in denen erfindungs-

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gemäß das Vorliegen des Enzyms festgestellt v/urde» Das gleiche gilt für Speichel, auf den sich das erfindungsgemäße Verfahren ebenfalls anwenden läßt.

Claims

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KARL LUDWIG SCHIFF

DIPL. CHHM. DR. ALEXANDER V. FÜNER

DIPL. ING. PETER STREHL

DIPL. CHEM. DR. URSULA SCHÜBEL-HOPF

DIPL. INS. DIETER EBBINGHAUS

□ R. ING. DIETER FINCK

TELEFON (O89) 48 20 54.

TELEX 5-23 565 AURO D

TELEGRAMME AUROMARCPAT MÜNCHEN

AJIWOMOTO CO., INC.

DA-13 105

24. Februar 1978

Neue Dipeptidderivate und deren Verwendung zur Messung der enzyinatisehen Aktivität

PATEKTANSPRÜCHE

1 . i y-Glycyl-prolylamino-^methylcumarin, dessen Säuresalze und N-endständig geschützen Derivate.
2. Verbindungen nach Anspruch 1, in denen der Prolinrest in der ■L-Konfiguration vorliegt.

ORIGINAL IHSPECTED
3 · 7-Glycyl-L-prol3^rlamino-4-methylcumarin.
4. 7-Glycyl-L-prolylamino-4-iaethylcumarin-p-toluolsulf onat.
5- Diagnosemittel, enthaltend 7-G·lycyl-prolylamino-4-raethylcuInarin oder dessen Säuresalze.
6. Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von X-Prolyl-dipeptidylaminopeptidase, dadurch gekennzeichnet , daß man 7-Glycyl-L-prolylamino-4-methylcumarin oder dessen Säuresalze im wässrigen Medium mit X-Prolyl-dipeptidyl-aminopeptidase in Berührung bringt und das enzymatisch gebildete 7-Amino-4-methylcumarin bestimmt.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Quelle für X-Prolyl-dipeptidyl-aminopeptidase menschliche Cerebrospinalflüssigkeit, Serum, Speichel oder Urin einsetzt.

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