CN103228795B - 检测生物活性的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供包含水、可以由第一生物活性转化成第一生物衍生物的第一指示试剂和多个粒子的组合物。所述第一指示试剂可以包含具有荧光团的生荧光酶底物，所述荧光团选自伞形酮、7-氨基香豆素、β-萘胺、β-萘酚、荧光素、试卤灵、9H-(1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮)、罗丹明110、任何前述荧光团的衍生物和任何前述荧光团的组合。所述粒子能够接受并保持来自含水液体的第一生物衍生物。第一生物衍生物可以指示微生物。所述组合物还可以包含胶凝剂。本发明还提供使用所述组合物来检测微生物在样品中的存在或不存在的方法。

Description

检测生物活性的方法和组合物
相关申请的交叉引用
本专利申请要求2010年11月24日提交的美国临时专利申请No.61/416,858的权益，该申请以引用的方式全文并入本文中。
背景技术
用于检测样品中靶微生物的方法经常包括使用受靶微生物作用而形成可检测产物的指示试剂。例如，可以通过与细胞(如致病微生物，生物学指示生物或癌细胞)相关的催化活性来检测生物活性。
检测到样品中的特定生物活性可以指示样品中的特定微生物。例如，细菌孢子包含可以在检测样品内活孢子的存在的方法(例如，包括快速方法)中使用的生物活性(例如，酶活性如α-吡喃葡萄糖苷酶或β-吡喃葡萄糖苷酶)对这些生物活性或其他生物活性之一的破坏可以用来验证和/或证实消毒过程的的成效。
发明内容
本发明主要涉及检测生物活性在样品中的存在或不存在的组合物、制品和方法。在一些实施例中，生物活性的存在或不存在可以指示微生物的存在或不存在。本发明方法包括在样品、可以由第一生物活性转化成第一生物衍生物的第一指示试剂和多个能够接收并保持来自含水液体的第一生物衍生物的粒子之间提供流体连通。有利地，第一生物衍生物可以从含水液体分配到粒子上和/或分配到粒子中，从而将第一生物衍生物浓缩至相对小的区域或体积中。将第一生物衍生物分配到粒子上和/或分配到粒子中，可以使得第一生物衍生物与它原本在含水液体中的检测相比更容易地检测。另外，粒子可以极大地限制第一生物衍生物在水凝胶中的扩散，从而使得可以检测水凝胶中存在的多种单独的生物活性、微生物或微菌落。
在一个方面，本发明提供一种检测生物活性的方法。该方法可以包括提供可能包含第一生物活性的样品、可由第一生物活性转化成第一生物衍生物的第一指示试剂和多个粒子，每个粒子包含接受并保持所述第一生物衍生物的有机聚合物。第一指示试剂可以包含具有荧光团的生荧光(fluorogenic)酶底物，所述荧光团选自伞形酮、7-氨基香豆素、β-萘胺、β-萘酚、荧光素、试卤灵、9H-(1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮)、罗丹明110、任何前述荧光团的衍生物和任何前述荧光团的组合。该方法还可以包括形成含水分散体，所述含水分散体包含所述第一指示试剂和所述多个粒子；使所述样品与所述含水分散体处于流体连通；并且检测所述第一生物衍生物的存在或不存在，其中所述第一生物衍生物被粒子保持。
在该方法的以上实施例的任一项中，检测生物衍生物的存在或不存在可以包括检测发荧光(fluorescent)第一生物衍生物或有色生物衍生物。在以上实施例的任一项中，该方法还可以包括提供胶凝剂，其中形成含水分散体包括形成水凝胶，其中所述多个粒子中的至少一部分分散在所述水凝胶中。在该方法的以上实施例的任一项中，提供胶凝剂可以包括提供冷水可溶性胶凝剂。在一些实施例中，冷水可溶性胶凝剂可以选自羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、聚丙烯酰胺、刺槐豆胶、瓜耳胶、黄原胶和褐藻胶、二醇改性的多糖和淀粉接枝的聚(丙烯酸钠-共-丙烯酰胺)。
在一些实施例中，该方法还可以包括提供可以由第二生物活性转化成第二生物衍生物的第二指示试剂，使第二指示试剂与水凝胶处于流体连通并检测第二生物衍生物的存在或不存在。当第二指示试剂包含生荧光酶底物时，第二指示试剂可以具有荧光团，所述荧光团选自伞形酮、7-氨基香豆素、β-萘胺、β-萘酚、荧光素、试卤灵、9H-(1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮)、罗丹明110、任何前述荧光团的衍生物和任何前述荧光团的组合。
在以上实施例的任一项中，该方法还可以包括提供可以由第二生物活性转化成第二生物衍生物的第二指示试剂并检测第二生物衍生物的存在或不存在。当第二指示试剂包含生荧光酶底物时，第二指示试剂可以具有荧光团，所述荧光团选自伞形酮、7-氨基香豆素、β-萘胺、β-萘酚、荧光素、试卤灵、9H-(1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮)、罗丹明110、任何前述荧光团的衍生物和任何前述荧光团的组合。形成含水分散体可以包括形成包含第二指示试剂的含水分散体。
在该方法的以上实施例的任一项中，使样品与含水分散体处于流体接触可以包括形成包含所述样品、第一指示试剂和所述多个粒子的含水分散体。
在该方法的以上实施例的任一项中，使样品与含水分散体处于流体连通后，该方法还可以包括分离来自含水分散体或在其内部的所述多个粒子的一部分。在一些实施例中，分离所述部分包括通过沉降、离心、絮凝或过滤分离所述部分。
在另一个方面，本发明提供一种检测生物活性的方法。该方法可以包括提供可能包含第一生物活性的样品；可以由第一生物活性转化成第一生物衍生物的第一指示试剂；多个粒子，每个粒子包含接受并保持所述第一生物衍生物的有机聚合物；和胶凝剂。第一指示试剂可以包含具有荧光团的生荧光酶底物，所述荧光团选自伞形酮、7-氨基香豆素、β-萘胺、β-萘酚、荧光素、试卤灵、9H-(1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮)、罗丹明110、任何前述荧光团的衍生物和任何前述荧光团的组合。该方法还可以包括形成水凝胶，所述水凝胶包含第一指示试剂和胶凝剂；使粒子分布在水凝胶的主表面的至少一部分上；使样品与水凝胶的一部分处于流体连通；并且检测第一生物衍生物的存在或不存在，其中所述第一生物衍生物由粒子保持。在一些实施例中，检测第一生物衍生物的存在或不存在可以包括检测发荧光第一生物衍生物或有色第一生物衍生物。在一些实施例中，提供胶凝剂可以包括提供冷水可溶性胶凝剂。在一些实施例中，冷水可溶性胶凝剂可以选自羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、聚丙烯酰胺、刺槐豆胶、瓜耳胶、黄原胶和褐藻胶、二醇改性的多糖和淀粉接枝的聚(丙烯酸钠-共-丙烯酰胺)。在一些实施例中，该方法还可以包括提供可以由第二生物活性转化成第二生物衍生物的第二指示试剂、使第二指示剂与水凝胶处于流体连通；并且检测第二生物衍生物的存在或不存在。当第二指示试剂包含生荧光酶底物时，第二指示试剂可以具有荧光团，所述荧光团选自伞形酮、7-氨基香豆素、β-萘胺、β-萘酚、荧光素、试卤灵、9H-(1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮)、罗丹明110、任何前述荧光团的衍生物和任何前述荧光团的组合。在一些实施例中，使粒子在水凝胶的主表面的至少一部分上分布还可以包括使第二指示试剂与水凝胶处于流体连通。在一些实施例中，使样品与水凝胶的主表面的至少一部分处于流体连通还可以包括使第二指示试剂与水凝胶处于流体连通。在一些实施例中，形成水凝胶还可以包括形成包含第二指示试剂的水凝胶。在一些实施例中，检测第一生物衍生物的存在或不存在可以包括检测分立的发荧光区域。在一些实施例中，检测分立的发荧光区域还包括计数分立的发荧光区域的数量。在一些实施例中，检测第一生物衍生物的存在或不存在可以包括检测分立的有色区域。在一些实施例中，检测分立的发荧光区域还包括计数分立的有色区域的数量。
在又一个方面，本发明提供一种组合物。该组合物可以包含水；可以由第一生物活性转化成第一生物衍生物的第一指示试剂；和多个粒子，其中所述粒子能够接收并保持来自含水液体的第一生物衍生物。第一指示试剂可以包含具有荧光团的生荧光酶底物，所述荧光团选自伞形酮、7-氨基香豆素、β-萘胺、β-萘酚、荧光素、试卤灵、9H-(1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮)、罗丹明110、任何前述荧光团的衍生物和任何前述荧光团的组合。在一些实施例中，该组合物还可以包含促进微生物生长的营养物质。在以上实施例的任一项中，该组合物还可以包含胶凝剂。在一些实施例中，该胶凝剂可以与水反应以形成水凝胶。在一些实施例中，该胶凝剂可以包含冷水可溶性胶凝剂。在一些实施例中，冷水可溶性胶凝剂可以选自羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、聚丙烯酰胺、刺槐豆胶、瓜耳胶、黄原胶和褐藻胶、二醇改性的多糖和淀粉接枝的聚(丙烯酸钠-共-丙烯酰胺)。在一些实施例中，该多个粒子中的至少一部分可以分散在水凝胶中。在一些实施例中，该多个粒子中的至少一部分可以布置在水凝胶的主表面上。在以上实施例的任一项中，该组合物还可以包含表面活性剂。在该组合物的任何实施例中，所述粒子可以包含有机聚合物，所述有机聚合物选自丙烯酸酯聚合物、聚苯乙烯聚合物、纤维素聚合物、葡聚糖聚合物、任何前述聚合物的组合和任何前述聚合物的衍生物。
在又一个方面，本发明提供一种制品。该制品可以包括含有自支承防水基材的本体件，所述基材具有第一主表面和第二主表面；和粘附于第一主表面的至少一部分的涂层，其中所述涂层包含胶凝剂和多个粒子。所述粒子可以接受并保持来自水凝胶的第一指示试剂的第一生物衍生物。在一些实施例中，胶凝剂可以包含干的冷水可溶性胶凝剂。在一些实施例中，冷水可溶性胶凝剂可以选自羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、聚丙烯酰胺、刺槐豆胶、瓜耳胶、黄原胶和褐藻胶、二醇改性的多糖和淀粉接枝的聚(丙烯酸钠-共-丙烯酰胺)。在该制品的以上实施例的任一项中，第一生物衍生物可以是源自生荧光酶底物的发荧光化合物。在以上实施例的任一项中，该制品还可以包含第一指示试剂。在以上实施例的任一项中，第一指示试剂可以包含具有荧光团的生荧光酶底物，所述荧光团选自伞形酮、7-氨基香豆素、β-萘胺、β-萘酚、荧光素、试卤灵、9H-(1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮)、罗丹明110、任何前述荧光团的衍生物和任何前述荧光团的组合。在以上实施例的任一项中，该制品还可以包含布置在涂层和第一主表面之间的粘合剂层，其中所述粘合剂层布置在第一主表面和涂层之间并且粘结性地与第一主表面和涂层结合。在该制品的以上实施例的任一项中，涂层还可以包含营养物质。在该制品的以上实施例的任一项中，涂层或粘合剂层可以包含第二指示试剂。在该制品的以上实施例的任一项中，涂层或粘合剂层还包含选择剂。在该制品的以上实施例的任一项中，粒子可以包含有机聚合物，所述有机聚合物选自丙烯酸酯聚合物、聚苯乙烯聚合物、纤维素聚合物、葡聚糖聚合物、任何前述聚合物的组合和任何前述聚合物的衍生物。在该制品的以上实施例的任一项中，涂层还包含表面活性剂。
在以上实施例的任一项中，粒子直径可以为约0.01μm至约1000μm。
词语“优选的”和“优选地”是指在某些情况下可以提供某些有益效果的本发明的实例。然而，在相同的情况或其他情况下，其他实例也可以是优选的。此外，对一个或多个优选实例的表述并不暗示其他实例是不可用的，且并非意图将其他实例排除在本发明范围之外。
当术语“包括”和其变型出现在说明书和权利要求书中时，这些术语不具有限制性含义。
本文所用的“一种(个)”、“所述(该)”、“至少一种(个)”以及“一种或多种(一个或多个)”可互换使用。因此，例如，一种微生物可以解释为意指“一种或多种”微生物。
术语“和/或”意指所列要素的一个或全部，或所列要素的任何两个或两个以上的组合。
如本文所用，“生物活性”指与生物细胞相关的任何具体催化过程或过程组。生物活性的非限制性例子包括分解代谢酶活性、合成代谢酶活性、偶联反应(例如，代谢途径)、生物分子介导的氧化还原反应和生物发光反应。
如本文所用，“生物衍生物”指生物活性的任何产物。这包括例如酶反应和生物电子传递系统的产物。
如本文所用，“生物细胞”指单细胞生物(例如细菌、酵母、丝状真菌、原虫、藻类)或其衍生物和来自多细胞生物的细胞(例如，各种类型的源自植物、动物或多细胞真菌的细胞)或其衍生物两者。生物细胞的衍生物包括休眠状态(例如，孢子)、遗传工程改造的变体、多倍体细胞和杂交细胞(例如杂交瘤)。生物细胞包括天然环境中存在的细胞以及体外培养的细胞。
另外，本文通过端点表述的数值范围包括所述范围内包含的所有数值(例如，1到5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等)。
本发明的上述发明内容并不意图描述本发明的每个公开的实例或每种实施方式。以下描述更具体地举例说明了示例性实例。在整个申请的若干地方，通过例子的清单提供了指导，所述例子可以按多种组合方式来使用。在每种情形下，所列举的清单仅仅作为代表性群组，而不应被理解为排他性清单。
由具体实施方式和附图，本发明的其它特征和方面将变得显而易见。
附图说明
图1是根据本发明的检测生物活性的方法的一个实施例的框图。
图2是根据本发明的包含多个粒子的含水液体的一个实施例的横截面侧视图。
图3是根据本发明的包含水凝胶的制品的一个实施例的横截面侧视图，所述水凝胶具有布置于其上的多个粒子。
具体实施方式
本发明涉及检测样品中的微生物的组合物、制品和快速方法。本发明的组合物和制品包含多个粒子，所述粒子被设置成接受并保持生物活性的发荧光产物。因而，发荧光分子可以从含水介质分配(例如，浓缩)到粒子上和/或粒子中。有利地，使发荧光分子分配到粒子上或粒子中，可使得粒子中的发荧光分子局部浓度比周围含水介质中更高。这种浓缩作用可以提供显著集中的荧光信号，所述荧光信号可以在背景荧光上更易于检测到。
在一个方面，本发明提供一种检测样品中的微生物的方法。图1显示本发明方法的一个实施例的框图。该方法包括步骤180：提供样品、第一指示试剂和多个粒子。该样品可以是本文所述的任何合适样品。该第一指示试剂可以由生物活性转化成第一生物衍生物。所述粒子可以包含接受并保持该第一生物衍生物的有机聚合物。该方法还可以包括形成含水分散体的步骤185，该水分散体包含该第一指示试剂和该多个粒子；使该样品与该含水分散体处于流体连通的步骤190；和检测由粒子保持的该第一生物衍生物的存在或不存在的步骤195。
本发明的方法涉及检测样品中的生物活性。该样品可以是任何包含如本文定义的生物活性的样品。合适样品的非限制性例子包括细胞(例如，哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞、丝状真菌、细菌细胞)的悬液或培养物、环境样品(例如，表面拭子)、食品(例如，原料、在线样品和成品样品)、饮料、临床样品(例如，血液、尿、痰、组织、黏液、粪便、伤口渗出液、脓)和水(例如，表面水、饮用水、工艺水)。
微生物(例如，细菌、真菌、病毒)是生物活性的来源并且可以在测试样品中进行分析，所述测试样品可以源自任何来源，如生理流体，例如血液、唾液、眼晶状体液、滑液、脑脊液、脓、汗、渗出物、尿、黏液、泌乳等。此外，测试样品可源自身体部位，例如伤口、皮肤、鼻孔、头皮、指甲等。
特别值得关注的样品包括含黏液的样品，如鼻样品(来自例如前鼻孔、鼻咽腔、鼻腔、鼻前庭等)以及来自外耳、中耳、口、直肠、阴道或其他类似组织的样品。特定黏膜组织的例子包括颊黏膜、齿龈黏膜、鼻黏膜、眼睛黏膜、气管黏膜、支气管黏膜、胃肠道黏膜、直肠黏膜、尿道黏膜、输尿管黏膜、阴道黏膜、子宫颈黏膜和子宫黏膜。
除了生理流体外，其他试验样品可以包括其他液体以及溶于液体介质中的固体。所关注的样品可以包括工艺流、水、土壤、植物或其他植被、空气、表面(例如被污染的表面)等。样品还可包以括经培养的细胞。样品也可以包括在包含细胞、孢子或酶(例如，生物指示剂装置)装置上或该装置中的样品。
固体样品可以进行分裂(例如，通过混合、超声波处理、均化)并且可以悬浮在液体(例如，水、缓冲液、培养液)中。在一些实施例中，可以在该方法中使用含有样品材料的样品采集装置(例如，拭子、海绵)。或者，可以从样品采集装置洗脱(elute)(例如，淋洗、刮取、表达)样品材料，然后再将样品材料用于该方法中。在一些实施例中，液体或固体样品可以稀释于液体(例如，水、缓冲液、培养液)中。
合适的样品还有已经暴露于灭菌剂的液体和/或固体样品。这些样品的非限制性例子包括孢子悬液、孢子试条和已经向其施加孢子或营养性微生物细胞的悬液的多种材料的试样(coupon)。
合适的样品也包括含有细胞或先前含有细胞的悬浮细胞培养基(例如，培养液、半固体细胞培养基和组织培养基、滤液)。合适的样品也包括细胞裂解物。细胞裂解物可以通过化学手段(例如，去垢剂、酶)、机械手段(超声振动、均化、弗氏压碎器)或通过本领域已知的其他裂解细胞的手段产生。
样品可以包含第一微生物。第一微生物可以是靶微生物，所述靶微生物指示污染(例如，粪便污染)、感染(例如，致病微生物感染)或灭菌过程(例如，生物灭菌指示剂)失败。
特别值得关注的微生物包括原核和真核生物，尤其革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、真菌、原虫、支原体、酵母、病毒和甚至脂质包覆的病毒。特别相关的生物包括肠杆菌科(Enterobacteriaceae)或微球菌科(Micrococcaceae)或葡萄球菌属(Staphylococcusspp.)、链球菌属(Streptococcusspp.)、假单胞菌属(Pseudomonasspp.)、肠球菌属(Enterococcusspp.)、沙门氏菌属(Salmonellaspp.)、军团菌属(Legionellaspp.)、志贺氏菌属(Shigellaspp.))、耶尔森菌属(Yersiniaspp.)、肠杆菌属(Enterobacterspp.)、埃希氏菌属(Escherichiaspp.)、芽孢杆菌属(Bacillusspp.)、李斯特氏菌属(Listeriaspp.)、弧菌属(Vibriospp.)、棒状杆菌属(Corynebacteriaspp.)以及疱疹病毒、曲霉属(Aspergillusspp.)、镰刀菌属(Fusariumspp.)和假丝酵母属(Candidaspp.)的成员。毒力特别强的生物包括金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，包括耐药性菌株如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA))、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、无乳链球菌(S.agalactiae)、化脓性链球菌(S.pyogenes)、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、耐万古霉素肠球菌(VancomycinResistantEnterococcus(VRE))、耐万古霉素金黄色葡萄球菌(VancomycinResistantStaphylococcusaureus(VRSA))、中等耐受万古霉素的金黄色葡萄球菌(VancomycinIntermediate-resistantStaphylococcusaureus(VISA))、炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、黑曲霉(Aspergillusniger)、烟曲霉(A.fumigatus)、棒曲霉(A.clavatus)、茄病镰刀菌(Fusariumsolani)、尖孢镰刀菌(F.oxysporum)、厚垣镰刀菌(F.chlamydosporum)、单核增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、伊氏李斯特氏菌(Listeriaivanovii)、霍乱弧菌(Vibriocholera)、副溶血性弧菌(V.parahemolyticus)、猪霍乱沙氏杆菌(Salmonellacholerasuis)、伤寒沙氏杆菌(S.typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)、白假丝酵母(Candidaalbicans)、光滑假丝酵母(C.glabrata)、克柔假丝酵母(C.krusei)、阪崎肠杆菌(Enterobactersakazakii)、大肠杆菌O157和多药耐药性革兰氏阴性杆菌(MDR)。
革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌特别值得关注。甚至更值得关注的是革兰氏阳性细菌，例如金黄色葡萄球菌。而且，特别关注的是包括MRSA、VRSA、VISA、VRE和MDR在内的抗生素耐药性微生物。
本发明的方法包括使用第一指示试剂。第一指示试剂可以是本文所述的任何合适的指示试剂。第一指示试剂可以由生物活性转化成第一生物衍生物。在一些实施例中，第一指示试剂可以是由生物活性(例如，酶活性)转化成第一生物衍生物的酶底物。合适的生物活性的非限制性例子包括糖苷酶、酯酶、磷酸酶、硫酸酯酶、蛋白酶、酰胺酶等。
在一些实施例中，第一指示试剂包括生生荧光指示试剂(例如，生荧光酶底物)。可以理解，生荧光指示试剂本身是无荧光的或以与相应生物衍生物截然不同的方式发荧光，例如，在强度或发射光谱方面不同。生荧光指示试剂包含具有特征性荧光发射光谱的发荧光组分(荧光团)。在一些实施例中，生荧光指示试剂可以是生荧光酶底物。可以在本发明的第一指示试剂中使用的荧光团的非限制性例子包括伞形酮、7-氨基香豆素、β-萘胺、β-萘酚、荧光素、试卤灵、9H-(1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮)、罗丹明110、任何前述荧光团的衍生物和任何前述荧光团的组合。如本文所用，任何上述荧光团的“衍生物”指包含该荧光团的共轭环结构的发荧光分子。示例性衍生物例如包含其中原始荧光团中的一个或多个氢原子被官能团(如卤素、链烷、酸、胺、羟基、硝基、硫酸盐等)取代的荧光团；前提是这种取代实质上不消除该荧光团发荧光的能力和/或实质上防止生物活性与包含该荧光团衍生物的指示试剂反应。荧光团可以偶联于多种糖苷、酰胺、肽、磷酸酯、硫酸盐或脂肪酸，例如以产生可以作为如本文所述的第一指示试剂使用的生荧光衍生物。
现有技术包括起源多样的许多生荧光化合物(例如，生荧光酶底物)，所述荧光化合物是已知的、可商业获得的、已经用于酶学方法中并且适合用作本发明的第一指示试剂。可用的生荧光酶底物包括生荧光酶底物的水溶性盐。
生荧光酶底物包括多种生荧光4-甲基伞形酮基化合物(可水解成4-甲基伞形酮)；7-酰氨基-4-甲基-香豆素的生荧光衍生物，例如，如英国专利No.1,547,747和欧洲专利No.0,000,063中所公开，所述专利各自以引用方式完整地并入本文；生荧光二乙酰荧光素化合物；和荧光胺。
可用的生荧光4-甲基伞形酮基化合物包括例如：4-甲基伞形酮基-2-乙酰氨基-4，6-O-亚苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡糖苷；乙酸-4-甲基伞形酮酯；4-甲基伞形酮基-N-乙β-D-氨基半乳糖苷；4-甲基伞形酮基-N-乙酰-α-D-氨基葡糖苷；4-甲基伞形酮基-N-乙β-D-氨基葡糖苷；2′-(4-甲基伞形酮基)-α-D-N-乙酰神经氨酸；4-甲基伞形酮基α-L-呋喃阿拉伯糖苷；4-甲基伞形酮基α-L-阿拉伯糖苷；丁酸-4-甲基伞形酮酯；4-甲基伞形酮基β-D-纤维二糖苷；甲基伞形酮基β-D-N，N′二乙酰壳二糖苷；反油酸-4-甲基伞形酮酯；4-甲基伞形酮基β-D-岩藻糖苷；4-甲基伞形酮基α-L-岩藻糖苷；4-甲基伞形酮基β-L-岩藻糖苷；4-甲基伞形酮基α-D-半乳糖苷；4-甲基伞形酮基β-D-半乳糖苷；4-甲基伞形酮基a-D-葡糖苷；4-甲基伞形酮基β-D-葡糖苷；4-甲基伞形酮基β-D-葡糖苷酸；对胍基苯甲酸-4-甲基伞形酮酯；庚酸-4-甲基伞形酮酯；4-甲基伞形酮基α-D-吡喃甘露糖苷；4-甲基伞形酮基β-D-吡喃甘露糖苷；油酸-4-甲基伞形酮酯；棕榈酸-4-甲基伞形酮酯；磷酸-4-甲基伞形酮酯；丙酸-4-甲基伞形酮酯；硬脂酸-4-甲基伞形酮酯；硫酸-4-甲基伞形酮酯；4-甲基伞形酮基β-D-N，N′，N″-三乙酰壳三糖；4-甲基伞形酮基2，3，5-三-邻-苯甲酰基-α-L-呋喃阿拉伯糖苷；4-甲基伞形酮基-对-三甲基氯化铵肉桂酸酯；和4-甲基伞形酮基β-D-木糖苷。
可用的生荧光7-酰氨基-4-甲基香豆素化合物包括例如：L-丙氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素；L-脯氨酸7-酰氨基-4-甲基香豆素；L-酪氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素；L-亮氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素；L-苯丙氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素；和7-戊二酰苯丙氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素。
可用的生荧光β-萘酰胺化合物包括例如Ala-Ala-2-萘酰胺、Ala-Arg-2-萘酰胺、Glu-His-2-萘酰胺、Gly-Arg-2-萘酰胺、Gly-Arg-4-甲氧基-2-萘酰胺、Gly-Phe-2-萘酰胺、His-Ser-2-萘酰胺、Phe-Arg-2-萘酰胺、Pro-Arg-2-萘酰胺、α-Asp-Arg-2-萘酰胺和Gly-Trp-2-萘酰胺。
可用的生荧光β-萘酚化合物包括例如乙酸-2-萘酯、2-萘基-α-D-吡喃葡糖苷、磷酸-2-萘酯、2-萘基-β-D-吡喃葡糖苷和2-萘基-α-L-吡喃岩藻糖苷。
包含7-酰氨基-4-甲基香豆素的可用的生荧光肽化合物包括例如：N-t-BOC-Ile-Glu-Gly-Arg7-酰氨基-4-甲基香豆素；N-t-BOC-Leu-Ser-Thr-Arg7-酰氨基-4-甲基香豆素；N-CBZ-Phe-Arg7-酰氨基-4-甲基-香豆素；Pro-Phe-Arg7-酰氨基-4-甲基香豆素；N-t-BOC-Val-Pro-Arg7-酰氨基-4-甲基香豆素；和N-戊二酰-Gly-Arg7-酰氨基-4-甲基香豆素。
可用的生荧光荧光素化合物包括例如二乙酸荧光素、荧光素单-(β-D-吡喃半乳糖苷)、荧光素二-(β-D-吡喃半乳糖苷)、荧光素二-(β-D-吡喃葡糖苷)、荧光素二-(β-D-葡糖苷酸)、二月桂酸荧光素、二磷酸荧光素和任何前述荧光素化合物的衍生物。
可用的生荧光试卤灵化合物包括例如试卤灵-β-D-吡喃半乳糖苷、试卤灵-β-D-葡糖醛酸、试卤灵-α-D-吡喃甘露糖苷、试卤灵乙醚、试卤灵甲醚、试卤灵苄醚、磷酸试卤灵和乙酸试卤灵。
可用的生荧光罗丹明化合物包括例如双-(天冬氨酸酰氨基)罗丹明110、双-(CBZ-精氨酸酰氨基)罗丹明110、双-(对-甲苯磺酰基-L-甘氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸酰氨基)罗丹明110、二盐酸双-(CBZ-L-异亮氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酸酰氨基)罗丹明110、二盐酸双-(CBZ-L-丙氨酰-L-精氨酸酰氨基)罗丹明110、双-(CBZ-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-丙氨酸酰氨基)罗丹明110、双-(N-CBZ-L-天冬氨酰-L-谷氨酰-L-缬氨酰-L-天冬氨酸酰氨基)罗丹明110、双-(N-CBZ-L-异亮氨酰L-谷氨酰-L-苏氨酰-L-天冬氨酸酰氨基)罗丹明110。
在待检测的生物活性是α-D-葡糖苷酶、胰凝乳蛋白酶或脂肪酸酯酶(例如，来自嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus))的情况下，合适的生荧光酶底物是4-甲基伞形酮基-α-D-葡糖苷、7-戊二酰苯丙氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素或庚酸-4-甲基伞形酮酯。在待检测的生物活性是α-L-呋喃阿拉伯糖苷酶(例如，衍生自枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis))的情况下，合适的生荧光酶底物是4-甲基伞形酮基-α-L-呋喃阿拉伯糖苷。在待检测的生物活性是β-D-葡糖苷酶(例如，衍生自枯草芽孢杆菌)的情况下，合适的生荧光酶底物是4-甲基伞形酮基-β-葡糖苷。
其他适合作为第一指示试剂的化合物包括可以被作用(例如，水解、氧化或还原)以产生水溶性衍生物发色团的生色化合物。应理解，生色化合物本身是无色的或以与相应的第一生物衍生物截然不同的方式显色，例如，在颜色或强度方面不同。以比色仪器使用者熟知的方式使用适宜的检测波长，将由第一生物衍生物产生有色信号与可能存在的任何其他颜色区分开来。
已经在酶学方法中使用许多生色底物。可用的生色底物包括硝基苯基衍生物和酚酞化合物。
可用的硝基苯基化合物包括对硝基苯酚和邻硝基苯酚衍生物。特别有用的对硝基苯酚包括磷酸二乙基对硝基苯酯；磷酸二对硝基苯酯；对硝基苯基-2-乙酰氨基-2-脱氧-3-O-β-吡喃半乳糖基-β-吡喃葡糖苷；对硝基苯基-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-吡喃葡糖苷；乙酸对硝基苯酯；对硝基苯基-N-乙酰-β-D-氨基葡糖苷；对硝基苯基-β-D-N-N’-二乙酰基壳二糖苷；对硝基苯基-α-吡喃葡糖苷；对硝基苯基-α-麦芽糖苷；对硝基苯基-β-麦芽糖苷；对硝基苯基-α-吡喃甘露糖苷；对硝基苯基-β-吡喃甘露糖苷；肉豆蔻酸对硝基苯酯；棕榈酸对硝基苯酯；磷酸对硝基苯酯；双(对硝基苯基)磷酸酯；对硝基苯基-β-吡喃葡糖苷；对硝基苯基-β-葡糖苷酸；α-对硝基苯基甘油；对硝基苯基-α-吡喃鼠李糖苷；胸苷一磷酸硝基苯酯；硬脂酸对硝基苯酯；硫酸对硝基苯酯；硫酸对硝基苯酯；对硝基苯基-2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-氨基葡糖苷；胸苷一磷酸对硝基苯酯；对硝基苯基-2，3，4-三-O-乙酰基-β-葡糖醛酸甲酯；和戊酸对硝基苯酯。
特别可用的生色邻硝基苯酚指示剂包括乙酸邻硝基苯酯、邻硝基苯基-b-葡糖苷和邻硝基苯基β-D-吡喃葡糖苷。其他特别可用的生色硝基苯基化合物包括硝基苯基-β-吡喃岩藻糖苷、硝基苯基-α-吡喃半乳糖苷、硝基苯基-β-吡喃半乳糖苷、丁酸硝基苯酯、癸酸硝基苯酯、己酸硝基酯、辛酸硝基苯酯、月桂酸硝基苯酯和丙酸硝基苯酯。
可用的含酚酞的生色指示剂包括：二丁酸酚酞；二磷酸酚酞；二硫酸酚酞；酚酞葡糖醛酸；酚酞单-β-葡糖苷酸；酚酞单-β-葡糖醛酸；和酚酞单磷酸。
上述生色指示试剂全部都会与适宜的生物活性(例如，酶)直接反应以产生发色团。
如果酶反应的产物进一步与生色试剂(如重氮化染料，例如，1-重氮基-4-苯甲酰氨基-2，5-二乙氧基苯(可从SigmaChemical作为“固蓝BB盐(FastBlueBBSalt)”商业获得)、1-重氮基-4-苯甲酰氨基-2，5-二乙氧基苯、对-重氮基-2，5-二乙氧基N-苯甲酰丙氨酸、4-氯-2-甲基苯氯化重氮和邻氨基偶氮甲苯重氮盐反应)以产生发色团，则有用地使用含有1-萘基、2-萘基和萘酚-ASBI化合物的另外的生色酶底物。
特别可用的生色1-萘基化合物包括1-萘基-N-乙酰-β-D-氨基葡糖苷。
特别可用的生色2-萘基化合物包括磷酸-2-萘酯；丁酸-2-萘酯；辛酸-2-萘酯；肉豆蔻酸-2-萘酯；L-亮氨酰-2-萘酰胺；L-缬氨酰-2-萘酰胺；L-半胱氨酰-2-萘酰胺；N-苯甲酰基-DL-精氨酸-2-萘酰胺；N-戊二酰-苯丙氨酸-2-萘胺；磷酸-2-萘酯；6-溴-2-萘基-α-D-吡喃半乳糖苷；2-萘基-β-D-吡喃半乳糖苷；2-萘基-2-D-吡喃葡糖苷；6-溴-2-萘酚-β-D-吡喃葡糖苷；6-溴-2-萘基-2-D-吡喃甘露糖苷；和2-萘基-α-L-吡喃岩藻糖苷。
特别可用的生色萘酚-ABI化合物包括萘酚-ASBI-磷酸酯和萘酚-ASBI-β-D-葡糖苷酸。
在其中待检测的生物活性是α-D-葡糖苷酶(例如，来自嗜热脂肪地芽孢杆菌)一些实施例中，生色酶底物优选为对硝基苯基-a-吡喃葡糖苷。在其中待检测的生物活性是α-L-呋喃阿拉伯糖苷酶(例如，衍生自枯草芽孢杆菌)的一些实施例中，优选的生色酶底物是对硝基苯-α-L-呋喃阿拉伯糖苷。在其中待检测的生物活性是β-D-葡糖苷酶(例如，衍生自枯草芽孢杆菌)的一些实施例中，优选的生色酶底物是对硝基苯基-β-D-吡喃葡糖苷。
为了在检测包含酶的生物活性时实施本发明的方法，操作员应当熟知待检测的酶活性和将与该酶反应从而产生产物的酶底物，所述产物可以通过其荧光、颜色等来检测(见M.Roth，MethodsofBiochemicalAnalysis(生物化学分析方法)，第7卷，D.Glock编著，IntersciencePublishers，NewYork，NY，1969，所述文献以引用方式完整地并入本文)。待采用的适宜酶底物将取决于待检测的生物活性。
本发明的方法包括使用多个包含有机聚合物材料的粒子。在一些实施例中，所述粒子是水可分散性粒子，有机聚合物材料具有相对亲水的官能团。在一些实施例中，可以将表面活性剂添加至粒子或添加至包含粒子的组合物(例如，含水组合物)。在这些实施例中，表面活性剂可以促进较不亲水的粒子的水分散性。
将粒子构造成接受并保持如本文所述的第一生物衍生物。如本文所述，“构造成接受并保持”生物衍生物意指这种生物衍生物优先地从含水液体或水凝胶分配到聚合物粒子上(例如，到其上和/或入其内)。该分配因而降低第一生物衍生物在含水液体或水凝胶本体中的浓度并且相应地增加由粒子保持的第一生物衍生物的量。在其中粒子包含表面活性剂和/或将表面活性剂添加至包含粒子的组合物的实施例中，表面活性剂可以促进第一生物衍生物由粒子接受和/或保持。不受理论约束，生物衍生物积累到基材材料上和/或积累入基材材料中可以借助多种化学吸引力(包括例如但不限于离子相互作用、疏水相互作用、范德瓦尔斯力和氢键)中的一者或多者而发生。
合适粒子的非限制性例子包括包含丙烯酸酯聚合物、聚苯乙烯聚合物、纤维素聚合物、葡聚糖聚合物和任何前述聚合物的组合或衍生物的粒子。市售的粒子适用于本发明的方法中。这些粒子包括例如SokenMX、MR和MP系列、SokenSGP系列和SokenSX-500系列(均可从日本大阪綜研化学株式会社(SokenChemicalandEngineering)获得)；EudragitTMRLPO和S-100系列(可从特拉华州纽瓦克赢创工业(EvonikIndustries)获得)；AmberliteTM非离子吸收剂和AmberliteTM离子交换树脂(可从密苏里州圣路易斯西格玛化学有限公司(SigmaChemicalCo.)获得)；AmberlystTM离子交换树脂(可从马萨诸塞州WardHill阿法埃莎公司(AlfaAesar)获得)；WhatmanQA52和WhatmanDE53(可从新泽西州皮斯卡塔韦通用电气医疗集团(GEHealthcare)获得)；和Sephadex TM粒子(可从西格玛化学有限公司(SigmaChemicalCo.)获得)。
有多种粒度适合本发明的用途。在一些实施例中，粒子可以具有约0.4微米、约1.0微米、约1.8微米、约2.0微米、约5.0微米、约10.0微米、或约20.0微米的平均粒径。在一些实施例中，粒子可以优选地在约0.01微米和约1毫米之间、更优选地在约0.05微米和约20微米之间、甚至更优选地在约0.1微米和约5微米之间、甚至更优选地在约0.2微米和约2微米之间。
本发明的方法包括形成含水分散体，所述含水分散体包含该第一指示试剂和该多个接受并保持第一生物衍生物的粒子。在一些实施例中，粒子和/或第一指示试剂可以以实质上干的形式提供并且可以分别或同时与含水液体(例如，水、含水缓冲液、营养培养液、含水样品)或水凝胶混合，其中所述粒子实质上分散于含水液体中。在某些优选的实施例中，粒子实质上均匀地分散于含水液体或水凝胶中。在一些实施例中，可以将表面活性剂添加至含水混合物以促进粒子的水分散性。通常，形成含水分散体包括混合含水液体和粒子(例如，通过搅动、搅拌等进行混合)。
在该方法的一些实施例中，含水液体还可以包含胶凝剂。在一些实施例中，胶凝剂可以包含琼脂。在一些实施例中，胶凝剂可以包含冷水可溶性胶凝剂。
合适的冷水可溶性胶凝剂包括在室温下于水中形成溶液或水凝胶的天然胶凝剂和合成胶凝剂。合适胶凝剂的非限制性例子包括羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、聚丙烯酰胺、刺槐豆胶、瓜耳胶、黄原胶和褐藻胶，以及高吸收性材料，包括二醇改性的多糖和淀粉接枝的聚(丙烯酸钠-共-丙烯酰胺)如WATERLOCK高吸收剂(伊利诺伊州Geneseo的SNISolutions公司)在内。在一个优选实施例中，瓜耳胶和黄原胶按1∶2重量比组合。在这些实施例中，形成包含该第一指示试剂和该多个粒子的含水混合物可以包括形成第一指示试剂溶解和/或悬浮于其中以及粒子分散(例如，悬浮)于其中的水凝胶。在一些实施例中，水凝胶组合物还可以包含表面活性剂。
本发明的方法包括使可能包含第一微生物的样品与本文所述的包含该第一指示试剂和该多个粒子的含水分散体处于流体连通。在一些实施例中，使样品与含水分散体处于流体连通包括将样品与含水分散体混合。例如，如果样品包括液体，则可将样品与含水分散体在器皿(例如，烧瓶、烧杯、管、微孔)中组合。例如，如果样品是固体，则可将样品在液体中悬浮和任选地均化，并且随后将悬液或匀浆与含水分散体组合。或者，可将固体样品在包含该第一指示试剂和该多个粒子的含水分散体中直接悬浮并且任选地均化。在一些实施例中，可将样品捕获并保持在多孔膜(例如，滤膜)上，并且可将该膜与含水分散体接触，其中所述样品留在膜的一侧上而含水分散体留在膜的对侧面上，其中所述含水液体可以穿过该膜，从而样品和含水分散体处于流体连通。
使样品与含水分散体处于流体连通，可以使与第一微生物(如果存在的话)相关的生物活性与第一生物指示剂相互作用以形成第一生物衍生物。同时和/或依次地，第一生物衍生物与多个粒子中的至少一个结合。
在该方法的任何实施例中，使样品与含水分散体处于流体连通还可以包括在样品和含水分散体处于流体连通的同时，将它们孵育一段时间。如本文所用，“温育”意指提供有利于与第一微生物相关的一种或多种生物活性的条件。本领域普通技术人员会确认出有利于与微生物(例如，靶微生物)相关的生物活性的条件。这类条件的非限制性例子包括温度；气体(如氧和/或二氧化碳)的存在或量；营养物质、维生素和/或辅因子的存在或量；pH；氧化-还原电位；和温育时间。通常，较长的温育时间能使生物活性产生出更大数量的第一生物衍生物。
本发明的方法包括检测第一生物衍生物的存在或不存在，其中所述第一生物衍生物由所述多个粒子中的一个或多个保持。在一些实施例中，第一生物衍生物可以包含发色团，并且因此可以通过检测由一个或多个所述粒子保持的颜色(例如，发色团的特征性颜色)来检测到。可以通过本领域已知的检测有色粒子的任何手段(例如，通过吸光度、反射比)来检测颜色。在一些实施例中，第一生物衍生物可以包含荧光团，并且因此可以通过检测由一个或多个所述粒子保持的荧光来检测到。可以通过本领域已知的检测荧光粒子的任何手段来检测荧光。
在一些实施例中，检测由一个或多个粒子保持的生物衍生物的存在或不存在可以包括使用仪器或仪器组合(例如，显微镜、照相机)来检测由一个或多个粒子保持的生物衍生物。在一些实施例中，检测由一个或多个粒子保持的生物衍生物的存在或不存在可以包括以目视方式检测由多个粒子保持的生物衍生物。
图示将有助于说明本发明的某些方面。图2显示含水液体210的截面视图，所述含水液体210包含分散于其中的多个粒子220。粒子210可以是如本文所述的任何接受并保持第一生物衍生物的适合粒子。含水液体210可以是在用于容纳液体的合适器皿(例如，管、烧瓶、烧杯、培养皿、微孔等)(未显示)中的液体。含水液体210包含溶解和/或悬浮在液体中的第一指示试剂(未显示)。在一些实施例中，含水液体210可以包含支持微生物生长的营养物质。图2中还显示生物物质230。生物物质230是生物活性(例如，酶活性)的来源(例如，细胞、组织、菌落、菌丝体等)。
随着生物物质230与第一指示试剂反应，它产生游离的第一生物衍生物(“f”)。游离的第一生物衍生物“f”可以是略微水溶至极端水溶的，因此可以从生物物质230扩散遍及含水液体210。随着游离的第一生物衍生物“f”接触粒子220，游离的第一生物衍生物“f”被粒子220接受并保持，其中它变成被保持的第一生物衍生物(“F”)。如可以在图2中见到，被保持的第一生物衍生物“F”的局部浓度可以在粒子220中比在周围水介质210中更高。有利地，被保持的第一生物衍生物“F”的这个较高局部浓度可以使第一生物衍生物比游离的第一生物衍生物“f”更容易地可检测。在一些实施例中，使游离的第一生物衍生物“f”转化成被保持的第一生物衍生物“F”可以进一步增强对第一生物衍生物的检测。例如，在一些实施例中，微弱发荧光的游离第一生物衍生物“f”和粒子的相互作用可以通过例如减少含水液体的荧光猝灭作用来加强被保持的第一生物衍生物“F”的荧光。例如，在一些实施例中，首先显色的游离第一生物衍生物“f”和粒子的相互作用可以导致被保持的第一生物衍生物“F”的颜色和/或颜色强度的变化。
要认识到，该图示实施例中描述的优点也可以在包含水凝胶(未显示)的含水液体210中实现。例如，水凝胶可能是培养装置(例如，培养皿、薄膜培养装置例如PETRIFILM培养装置)中的水凝胶。另外，可以在包含水凝胶的组合物中获得额外的优点。具体地讲，水凝胶可以限制悬浮于其中或布置于其上的粒子220的运动。因此，当游离的第一生物衍生物“f”被接受并保持(从而变成被保持的第一生物衍生物“F”)时，它不再能够在水凝胶中自由地扩散。
通常，当生物物质随时间推移释放可自由扩散的产物到水凝胶时，这类产物可以从生物物质扩散开并且以包围生物物质的极巨大区域的形式积累。这种现象例如在美国专利No.5,601,998中描述；该专利以引用方式完整地并入本文。有利地，本发明的方法和组合物提供限制水溶性生物衍生物扩散的手段。当试图计数水凝胶上或水凝胶中可能相对靠近的多个生物活性来源(例如，菌落形成单位)时，这可以是特别有利的。
图3显示本发明的诊断装置300的横截面侧视图。诊断装置300包含防水基材305。防水基材305可以例如是培养皿或薄膜培养装置，如在例如美国专利No.4,565,783；5,089,413；5,232,838；5,601,998；5,681,712；7,141,387；中和在美国专利申请号No.61/360,166中描述的薄膜培养装置；这些专利的每一篇以引用方式全文并入。装置300还包含水凝胶315。水凝胶315包含第一指示试剂(未显示)。第一指示试剂可以是如本文所述的任何适合的第一指示试剂。在一些实施例中，水凝胶315可以包含支持微生物生长的营养物质。
多个粒子320在水凝胶315的主表面上布置。粒子320可以是任何如本文所述的接受并保持第一生物衍生物的适合粒子。图3中还显示生物物质330(例如，如上文所述的生物活性来源)。生物物质330可以布置在水凝胶315的主表面(例如，如在微生物学表面铺板技术中)，如图3中所示，或可以悬浮于水凝胶中(例如，如在微生物学倾倒铺板技术中)，如图2中所示和上文描述。
再参考图3，如上文所述，当生物物质330与第一指示试剂反应时，它产生游离的第一生物衍生物(“f”)。如上文所述，游离的第一生物衍生物扩散遍及包围生物物质330的含水液体(例如，水凝胶315)。如上文所述，一旦与多个粒子320中的一个接触，则游离的第一生物衍生物“f”被粒子320接受并保持从而变成被保持的第一生物衍生物(“F”)。
在图3中所示的实施例中，可以使生物物质330(其最初可以是待检验样品的一部分)、多个粒子320和第一指示试剂(未显示)单独地或以任何组合与水凝胶315处于流体接触。在一些实施例中，水凝胶315可以使用包含第一指示试剂的含水液体和/或包含生物物质330的样品来形成。在一些实施例中，生物物质330可以与包含第一指示试剂的水凝胶315处于流体接触达一段时间，之后，使多个粒子320与水凝胶315处于流体接触。
在这些实施例的任一项中，该方法还可以包括提供可以由第二生物活性转化成第二生物衍生物的第二指示试剂。在这些实施例中，形成包含第一指示试剂和多个粒子的含水分散体包括形成包含第二指示试剂的含水分散体。在这些实施例中，该方法还包括检测第二生物衍生物的存在或不存在。
在一些实施例中，第二生物衍生物的存在表示存在第一微生物。因此，在这些实施例中，可以检测第一生物衍生物的存在和与第一微生物在样品中存在相关的第二生物衍生物的存在。有利地，在这些实施例中，第二生物指示剂可以起到独立地证实使用第一指示试剂所获得的结果的作用。在一些实施例中，第二指示试剂可以包含荧光团。在一些实施例中，其发荧光第二生物衍生物可以在荧光共振能量转移(FRET)反应中与发荧光第一生物衍生物反应。FRET反应是本领域已知的，并且根据本发明，可以指示第一和第二生物活性二者的存在。
在一些实施例中，第二生物指示剂的存在表示存在第二微生物。因此，在这些实施例中，可以通过检测第一生物衍生物的存在而检测第一微生物的存在并且通过检测第二生物衍生物的存在而检测第二微生物的存在。有利地，在这些实施例中，第二生物指示剂可以起到指示多于一种微生物在样品中的存在的作用。
第二指示试剂可以是任何如本文所述的可以与生物活性反应以形成第二生物衍生物的生色或生荧光指示试剂，其中所述第二生物衍生物是可与第一生物衍生物分开检测的(即，可区分的)，并且其中第二生物指示剂和第二生物衍生物二者均实质上不干扰第一指示剂向第一生物衍生物的转化，也实质上不干扰由多个粒子中的至少一个所保持的第一生物衍生物的检测。
在这些实施例的任一项中，该方法还可以包括从含水分散体分离多个粒子中的至少一部分。通常，该分离是在已经使样品与包含第一指示试剂和多个粒子的含水分散体接触后进行。在一些实施例中，分离多个粒子中的至少一部分可以包括从含水液体的至少一部分中分离一个或多个粒子。在一些实施例中，从含水液体的至少一部分中分离多个粒子中的至少一部分是在含水液体的原始体积中形成(例如，通过沉降、絮凝或离心)分离粒子的局部浓度的过程。另外或者作为另一种选择，在一些实施例中，从含水液体的至少一部分中分离多个粒子中的至少一部分是在更小体积的含水液体中浓缩分离的粒子或从这个部分中实质上移除含水液体(例如，通过借助滗析、抽吸或借助过滤而移除含水液体的至少一部分)的过程。在一些实施例中，分离步骤可以用来使所述粒子中的一个或多个定位于检测仪器(例如，荧光细胞分选器)中的光路内。
如上文所述，本发明方法可以包括形成含水分散体，所述水分散体包含第一指示试剂、多个接受并保持第一生物衍生物的粒子和胶凝剂。在一些实施例中，包含胶凝剂的含水分散体还可以包含样品(例如，如在琼脂倾倒平板技术中或在使用可从3M公司(明尼苏达州圣路易斯)获得的PETRIFILM培养基的某些常见技术中，样品分布在所形成的凝胶中)。
在一些可选性实施例中，可以形成含水分散体，其包含多个粒子、胶凝剂和任选地包含第一指示试剂。在凝胶形成后，样品和(如果已经不存在于水分散体中)第一指示试剂可以分布到凝胶的表面的至少一部分上(例如，如在随琼脂培养基一起使用的常见表面铺板技术中)。任选地，如本文所述，可以将包含样品的组合物温育一段时间。观察粒子以检测第一生物衍生物的存在或不存在，其中所述第一生物衍生物被粒子保持。在这些实施例的任一项中，可以使如本文所述的第二指示试剂与含水分散体处于流体接触(例如，通过在形成凝胶之前添加第二指示试剂至含水分散体或通过在形成凝胶之后使第二指示试剂分布到凝胶的表面上)。
在一些可选性实施例中，可以形成含水凝胶(例如，包含琼脂或本领域已知或本文所述的其他合适胶凝剂的含水凝胶)。任选地，含水凝胶可以包含第一指示试剂。在凝胶形成后，样品、多个粒子和(如果已经不存在于含水凝胶中)第一指示试剂可以分布到凝胶的表面的至少一部分上。任选地，如本文所述，可以将包含样品的组合物温育一段时间。观察粒子以检测第一生物衍生物的存在或不存在，其中所述第一生物衍生物被粒子保持。在这些实施例的任一项中，可以使如本文所述的第二指示试剂与含水分散体处于流体接触(例如，通过在形成凝胶之前添加第二指示试剂至含水分散体或通过在形成凝胶之后使第二指示试剂分布到凝胶的表面上)。
本发明提供一种组合物。在一些实施例中，该组合物可以在如本文所述的检测第一微生物的存在的方法中使用。该组合物包含水、可以由第一生物活性转化成第一生物衍生物的第一指示试剂和多个粒子。如本文所述，粒子可以接受并保持来自含水液体的第一生物衍生物。在一些实施例中，该组合物还可以包含营养物质。营养物质可以促进微生物(例如，如本文所述的第一微生物和/或第二微生物)的生长和/或代谢。在这些实施例的任一项中，该组合物还可以包含胶凝剂。在一些实施例中，胶凝剂可以包含冷水可溶性胶凝剂。在一些实施例中，胶凝剂可以选自羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、聚丙烯酰胺、刺槐豆胶、瓜耳胶、黄原胶和褐藻胶，以及高吸收性材料，包括二醇改性的多糖和淀粉接枝的聚(丙烯酸钠-共-丙烯酰胺)。胶凝剂可以与水反应以形成水凝胶。在该组合物的这些实施例的任一项中，多个粒子中的至少一部分可以分散(例如，悬浮)于水凝胶中。在该组合物的这些实施例的任一项中，多个粒子中的至少一部分可以布置在水凝胶的主表面上。在这些实施例的任一项中，该组合物还可以包含表面活性剂。有利地，表面活性剂可以促进粒子在该组合物中的水分散性。表面活性剂可以是阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂或阳离子表面活性剂。表面活性剂可以选自硫酸盐、十二烷基硫酸钠、磺酸酯、十二烷基苯磺酸钠、长链羧酸盐、磷酸酯、季铵盐、十二烷基三甲基氯化铵、聚山梨醇酯、TweenTM表面活性剂(例如，Tween20TM)、SpanTM表面活性剂、脂肪醇乙氧基化物、TritonX-100、聚环氧乙烷衍生物和包含聚环氧丙烷的共聚物(例如：PluronicTM或TergitolTM表面活性剂)。
在这些实施例的任一项中，该组合物还可以包含可以由生物活性转化成第二生物衍生物的第二指示试剂。第二指示试剂可以是任何如本文所述的可以与生物活性反应以形成第二生物衍生物的生色或生荧光指示试剂，其中所述第二生物衍生物是可与第一生物衍生物分开检测的(即，可区分的)，并且其中第二生物指示剂和第二生物衍生物二者均实质上不干扰第一指示剂向第一生物衍生物的转化，也实质上不干扰由多个粒子中的至少一个所保持的第一生物衍生物的检测。
在另一方面，本发明提供一种制品。该制品可以用来检测第一微生物(例如，诊断试验中的靶微生物)。在一些实施例中，该制品可以是包含干培养基的制品，例如在美国专利No.4,565,783；5,089,413；5,232,838；5,601,998；5,681,712；7,141,387；中和在美国专利申请号No.61/360,166中描述的培养装置。
该制品可以包括含有自支承防水基材的本体件，所述基材具有第一主表面和第二主表面；和粘附于第一主表面的至少一部分的涂层。该涂层包含胶凝剂和多个粒子。所述粒子接受并保持来自水凝胶的第一指示试剂的第一生物衍生物并且可以包含任何如本文所述的合适粒子。在一些实施例中，粒子包含有机聚合物，所述有机聚合物选自丙烯酸酯聚合物、聚苯乙烯聚合物、纤维素聚合物、葡聚糖聚合物、任何前述聚合物的组合或衍生物。市售的粒子适用于本发明的方法中。这些粒子包括例如SokenMX、MR和MP系列、SokenSGP系列和SokenSX-500系列(均可从日本大阪綜研化学株式会社(SokenChemicalandEngineering)获得)；EudragitTMRLPO和S-100系列(可从特拉华州纽瓦克赢创工业(EvonikIndustries)获得)；AmberliteTM非离子吸收剂和AmberliteTM离子交换树脂(可从密苏里州圣路易斯西格玛化学有限公司(SigmaChemicalCo.)获得)；AmberlystTM离子交换树脂(可从马萨诸塞州WardHill阿法埃莎公司(AlfaAesar)获得)；WhatmanQA52和WhatmanDE53(可从新泽西州皮斯卡塔韦通用电气医疗集团(GEHealthcare)获得)；和Sephadex TM粒子(可从西格玛化学有限公司(SigmaChemicalCo.)获得)。在一些实施例中，粒子是单分散性粒子。在一些实施例中，平均粒径优选地在约0.01微米和约1毫米之间、更优选地在约0.05微米和约20微米之间、甚至更优选地在约0.1微米和约5微米之间、甚至更优选地在约0.2微米和约2微米之间。在一些实施例中，涂层可以包含冷水可重构的脱水涂层，所述脱水涂层包含其中分散有多个粒子的胶凝剂并且可以如美国专利No.4,565,783中和本文实例中所描述来制备。
在任何实施例中，该制品还可以包含布置在基层(baselayer)的第一主表面和涂层之间并且粘结性地与该第一主表面和该涂层结合的粘合剂层。在一些实施例中，涂层包含干粉末涂层，所述干粉末涂层包含胶凝剂和多个粒子并且可以如美国专利No.4,565,783中所描述来制备。
在该制品的任何实施例中，涂层和/或粘合剂层还可以包含第一指示试剂。第一指示试剂可以是任何如本文所述的适合的第一指示试剂。在该制品的任何实施例中，涂层或粘合剂层可以包含第二指示试剂。第二指示试剂可以是任何如本文所述的适合的第二指示试剂。在该制品的任何实施例中，涂层可以包含表面活性剂。表面活性剂可以包括阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂或阳离子表面活性剂。表面活性剂可以选自硫酸盐、十二烷基硫酸钠、磺酸酯、十二烷基苯磺酸钠、长链羧酸盐、磷酸酯、季铵盐、十二烷基三甲基氯化铵、聚山梨醇酯、TweenTM表面活性剂(例如，Tween20TM)、SpanTM表面活性剂、脂肪醇乙氧基化物、TritonX-100、聚环氧乙烷衍生物和包含聚环氧丙烷的共聚物(例如：PluronicTM或TergitolTM表面活性剂)。
实施例
实施例1是一种检测生物活性的方法，所述方法包括：
提供：
可能包含第一生物活性的样品；
可以由第一生物活性转化成第一生物衍生物的第一指示试剂，其中所述第一指示试剂包含具有荧光团的生荧光酶底物，所述荧光团选自伞形酮、7-氨基香豆素、β-萘胺、β-萘酚、荧光素、试卤灵、9H-(1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮)、罗丹明110、任何前述荧光团的衍生物和任何前述荧光团的组合；和
多个粒子，每个粒子包含接受并保持所述第一生物衍生物的有机聚合物；
形成含水分散体，其包含所述第一指示试剂和所述多个粒子；
使所述样品与所述含水分散体处于流体连通；和
检测所述第一生物衍生物的存在或不存在，其中所述第一生物衍生物被粒子保持。
实施例2是实施例1的方法，其中检测所述第一生物衍生物的存在或不存在包括检测发荧光第一生物衍生物。
实施例3是实施例1的方法，其中检测所述生物衍生物的存在或不存在包括检测有色生物衍生物。
实施例4是实施例1或实施例2的方法，还包括提供胶凝剂
并且其中形成含水分散体包括形成水凝胶，其中所述多个粒子中的至少一部分分散在所述水凝胶中。
实施例5是实施例4的方法，其中提供胶凝剂包括提供冷水可溶性胶凝剂。
实施例6是实施例5的方法，其中冷水可溶性胶凝剂选自羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、聚丙烯酰胺、刺槐豆胶、瓜耳胶、黄原胶和褐藻胶、二醇改性的多糖和淀粉接枝的聚(丙烯酸钠-共-丙烯酰胺)。
实施例7是前述实施例中任一项的方法，还包括：
提供可以由第二生物活性转化成第二生物衍生物的第二指示试剂；和
检测第二生物衍生物的存在或不存在；
其中形成含水分散体包括形成包含第二指示试剂的含水分散体；
其中，当第二指示试剂包含生荧光酶底物时，第二指示试剂具有荧光团，所述荧光团选自伞形酮、7-氨基香豆素、β-萘胺、β-萘酚、荧光素、试卤灵、9H-(1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮)、罗丹明110、任何前述荧光团的衍生物和任何前述荧光团的组合。实施例8是实施例4至7中任一项的方法，还包括：
提供可以由第二生物活性转化成第二生物衍生物的第二指示试剂；
使所述第二指示试剂与所述水凝胶处于流体连通；和
检测第二生物衍生物的存在或不存在。
实施例9是前述实施例中任一项的方法，其中使所述样品与所述含水分散体处于流体接触包括形成包含所述样品、所述第一指示试剂和所述多个粒子的含水分散体。
实施例10是前述实施例中任一项的方法，其中，在使所述样品与所述含水分散体处于流体连通后，所述方法还包括分离来自含水分散体或在含水分散体内部的所述多个粒子的一部分。
实施例11是实施例10的方法，其中分离所述部分包括通过沉降、离心、絮凝或过滤来分离所述部分。
实施例12是一种检测生物活性的方法，所述方法包括：
提供：
可能包含第一生物活性的样品；
可以通过所述生物活性转化成第一生物衍生物的第一指示试剂，其中所述第一指示试剂包含具有荧光团的生荧光酶底物，所述荧光团选自伞形酮、7-氨基香豆素、β-萘胺、β-萘酚、荧光素、试卤灵、9H-(1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮)、罗丹明110、任何前述荧光团的衍生物和任何前述荧光团的组合；
多个粒子，每个粒子包含接受并保持所述第一生物衍生物的有机聚合物；和
胶凝剂；
形成水凝胶，其包含所述第一指示试剂和所述胶凝剂；
使所述粒子分布在所述水凝胶的主表面的至少一部分上；
使所述样品与所述水凝胶的一部分处于流体连通；和
检测第一生物衍生物的存在或不存在，其中所述第一生物衍生物被粒子保持，其中第一生物衍生物的存在表示存在第一生物活性。
实施例13是实施例12的方法，其中检测第一生物衍生物的存在或不存在包括检测发荧光第一生物衍生物或有色第一生物衍生物。
实施例14是实施例12或实施例13的方法，其中提供所述胶凝剂包括提供冷水可溶性胶凝剂。
实施例15是实施例14的方法，其中所述冷水可溶性胶凝剂选自羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、聚丙烯酰胺、刺槐豆胶、瓜耳胶、黄原胶和褐藻胶、二醇改性的多糖和淀粉接枝的聚(丙烯酸钠-共-丙烯酰胺)。
实施例16是实施例12至15中任一项的方法，还包括：
提供可以由第二生物活性转化成第二生物衍生物的第二指示试剂；
使所述第二指示剂与所述水凝胶处于流体连通；和
检测第二生物衍生物的存在或不存在；
其中第二生物衍生物的存在表示存在第一生物活性。
实施例17是实施例16的方法，其中使粒子分布在水凝胶的主表面的至少一部分上还包括使第二指示试剂与水凝胶处于流体连通。
实施例18是实施例16的方法，其中使所述样品与所述水凝胶的主表面的至少一部分处于流体连通还包括使第二指示试剂与所述水凝胶处于流体连通。
实施例19是实施例16的方法，其中形成水凝胶还包括形成包含第二指示试剂的水凝胶。
实施例20是实施例12至15中任一项的方法，还包括：
提供可以由第二生物活性转化成第二生物衍生物的第二指示试剂；
使所述第二指示剂与所述水凝胶处于流体连通；和
检测第二生物衍生物的存在或不存在。
实施例21是实施例20的方法，其中使粒子分布在所述水凝胶的主表面的至少一部分上还包括使第二指示试剂与水凝胶处于流体连通。
实施例22是实施例20的方法，其中使所述样品与所述水凝胶的主表面的至少一部分处于流体连通还包括使第二指示试剂与所述水凝胶处于流体连通。
实施例23是实施例20的方法，其中形成所述水凝胶还包括形成包含第二指示试剂的水凝胶。
实施例24是实施例12至23中任一项的方法，其中检测所述第一生物衍生物的存在或不存在包括检测分立的发荧光区域。
实施例25是实施例24的方法，其中检测分立的发荧光区域进一步包括计数分立的发荧光区域的数量。
实施例26是实施例12至23中任一项的方法，其中检测所述第一生物衍生物的存在或不存在包括检测分立的有色区域。
实施例27是实施例26的方法，其中检测分立的发荧光区域进一步包括计数分立的有色区域的数量。
实施例28是一种组合物，其包含：
水；
可以由第一生物活性转化成第一生物衍生物的第一指示试剂；和
多个颗粒；
其中所述第一指示试剂包含具有荧光团的生荧光酶底物，所述荧光团选自伞形酮、7-氨基香豆素、β-萘胺、β-萘酚、荧光素、试卤灵、9H-(1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮)、罗丹明110、任何前述荧光团的衍生物和任何前述荧光团的组合；
其中所述粒子能够接受并保持来自含水液体的第一生物衍生物。
实施例29是实施例28的组合物，所述组合物还包含促进微生物生长的营养物质。
实施例30是实施例28或实施例29的组合物，所述组合物还包含胶凝剂。
实施例31是实施例30的组合物，其中所述胶凝剂与水反应以形成水凝胶。
实施例32是实施例30或实施例31的组合物，其中所述胶凝剂包含冷水可溶性胶凝剂。
实施例33是实施例32的组合物，其中所述冷水可溶性胶凝剂选自羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、聚丙烯酰胺、刺槐豆胶、瓜耳胶、黄原胶和褐藻胶、二醇改性的多糖和淀粉接枝的聚(丙烯酸钠-共-丙烯酰胺)。
实施例34是实施例31至33中任一项的组合物，其中所述多个粒子中的至少一部分分散在所述水凝胶中。
实施例35是实施例31至34中任一项的组合物，其中所述多个粒子中的至少一部分布置在所述水凝胶的主表面上。
实施例36是实施例28至35中任一项的组合物，所述组合物还包含表面活性剂。
实施例37是实施例28至36中任一项的组合物，其中所述粒子包含有机聚合物，所述有机聚合物选自丙烯酸酯聚合物、聚苯乙烯聚合物、纤维素聚合物、葡聚糖聚合物、任何前述聚合物的组合和任何前述聚合物的衍生物。
实施例38是一种制品，其包括：
包含自支承防水基材的本体件，所述基材具有第一主表面和第二主表面；和
粘附于第一主表面的至少一部分的涂层，其中所述涂层包含胶凝剂和多个粒子；
其中所述粒子接受并保持来自水凝胶的第一指示试剂的第一生物衍生物；
其中所述第一指示试剂包含具有荧光团的生荧光酶底物，所述荧光团选自伞形酮、7-氨基香豆素、β-萘胺、β-萘酚、荧光素、试卤灵、9H-(1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮)、罗丹明110、任何前述荧光团的衍生物和任何前述荧光团的组合。
实施例39是实施例38的制品，其中所述胶凝剂包含干的、冷水可溶性胶凝剂。
实施例40是实施例39的制品，其中所述胶凝剂选自羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、聚丙烯酰胺、刺槐豆胶、瓜耳胶、黄原胶和褐藻胶、二醇改性的多糖和淀粉接枝的聚(丙烯酸钠-共-丙烯酰胺)。
实施例41是实施例38至40中任一项的制品，其中所述第一生物衍生物是发荧光化合物。
实施例42是实施例38至41中任一项的制品，其中所述制品还包含第一指示试剂。
实施例43是实施例38至42中任一项的制品，所述制品还包含布置在所述涂层和所述第一主表面之间的粘合剂层，其中所述粘合剂层布置在所述第一主表面和所述涂层之间并且粘结性地与所述第一主表面和所述涂层结合。
实施例44是实施例38至43中任一项的制品，其中所述涂层还包含营养物质。
实施例45是实施例38至44中任一项的制品，其中所述涂层或所述粘合剂层包含第二指示试剂。
实施例46是实施例38至45中任一项的制品，其中所述涂层或所述粘合剂层还包含选择剂。
实施例47是实施例38至46中任一项的制品，其中所述粒子包含有机聚合物，所述有机聚合物选自丙烯酸酯聚合物、聚苯乙烯聚合物、纤维素聚合物、葡聚糖聚合物、任何前述聚合物的组合和任何前述聚合物的衍生物。
实施例48是实施例38至47中任一项的制品，其中所述涂层还包含表面活性剂。
实施例49是实施例48的制品，其中所述表面活性剂包括阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂或阳离子表面活性剂。
实施例50是实施例49的制品，其中所述表面活性剂选自硫酸盐、十二烷基硫酸钠、磺酸酯、十二烷基苯磺酸钠、长链羧酸盐、磷酸酯、季铵盐、十二烷基三甲基氯化铵、聚山梨醇酯、TweenTM表面活性剂(例如，Tween20TM)、SpanTM表面活性剂、脂肪醇乙氧基化物、TritonX-100、聚环氧乙烷衍生物和包含聚环氧丙烷的共聚物(例如：PluronicTM或TergitolTM表面活性剂)。
实施例51是实施例1至27中任一项的方法、实施例28至37中任一项的组合物或实施例38至50中任一项的制品，其中所述粒子的直径为约0.01μm至约1000μm。
实施例52是实施例1至27或实施例51中任一项的方法、实施例28至37或实施例51中任一项的组合物或实施例38至51中任一项的制品，其中所述粒子是水可分散的。
实施例53是实施例1至27中任一项的方法，其中所述第一生物活性是存在第一微生物的指示。
实施例54是实施例7至13和实施例18至27中任一项的方法，其中第二指示试剂是存在第一微生物的指示。
实施例55是实施例7至13、实施例18至27或实施例54中任一项的方法，其中第二指示试剂是存在第二微生物的指示。
实施例56是前述实施例中任一项的方法，其中第二指示试剂，如果存在的，包含生色指示试剂。
通过以下实例说明本发明。应当理解，特定实例、材料、量和程序应根据如本文中所阐述的本发明的范围和精神进行广义地解释。
实例
实例中使用的材料
●PBS-从Sigma-Aldrich(圣路易斯，密苏里州)获得的磷酸盐缓冲盐水
●从3M公司(圣保罗，明尼苏达州)获得的Butterfields缓冲液
●从EMDBiosciences(拉荷亚，加利福尼亚州)获得的β-D-半乳糖苷酶(目录号#345788)
●从Sigma-Aldrich(圣路易斯，密苏里州)获得的猪肝脏酯酶(#E3019)
●DMSO-从EMDChemicals(Gibbstown，新泽西州)获得的二甲基亚砜
●TSB-胰蛋白胨大豆肉汤-从BectonDickinson获得的BD#211822
●黄原胶-可从CPKelco(亚特兰大，佐治亚州)获得的KELTROL黄原胶
●刺槐豆胶-从CPKelco(亚特兰大，佐治亚州)获得的Gum
表面活性剂
●TritonX-100TM-从Sigma-Aldrich(圣路易斯，密苏里州)获得的非离子表面活性剂
●Tween-20TM-从Sigma-Aldrich(圣路易斯，密苏里州)获得的聚山梨醇酯表面活性剂
●SDBS-从TCIAmerica(波特兰，俄勒冈州)获得的十二烷基苯磺酸钠
●DTAC-从K&K实验室(普莱恩维尤，纽约州)获得的十二烷基三甲基氯化铵
●SDS-从AlfaAesar(WardHill，马萨诸塞州)获得的十二烷基硫酸钠
荧光团：
●MHCgal-如Chilvers等人，J.Appl.Microbiology(应用微生物杂志)2001，91，1118-1130中所述制备的甲基-7-羟基香豆素-3-羧酸半乳糖苷
●TUacetate-如美国专利No.6,556,508中所述制备的3-噻吩基伞形酮乙酸酯
●TUgal-如美国专利No.6,556,508中所述制备的3-噻吩基伞形酮半乳糖苷
粒子：
●从綜研化学株式会社(SokenChemicalandEngineering)(大阪，日本)获得的聚丙烯酸酯粒子：
○MX-180-单分散性丙烯酸酯粒子(1.8微米平均直径)
○MX-2000-单分散性丙烯酸酯粒子(20.0微米平均直径)
○MX-500-单分散性丙烯酸酯粒子(5.0微米平均直径)
○MR-10HG-多分散性丙烯酸酯粒子(10.0微米平均直径)
○MR-7HG-多分散性丙烯酸酯粒子(6.0微米平均直径)
○MR-2HG-多分散性丙烯酸酯粒子(2.0微米平均直径)
○MR-2G-多分散性丙烯酸酯粒子(1.0微米平均直径)
○MP-1000-单分散性丙烯酸酯粒子(0.40微米平均直径)
○SGP-70C-多分散性聚苯乙烯粒子(20.0微米平均直径)
○SX-500H-单分散性聚苯乙烯粒子(5.0微米平均直径)
●QA52-WhatmanQA52(GEHealthcare(皮斯卡塔韦，新泽西州))获得的基于强碱阴离子交换纤维素的树脂
●DE53-WhatmanDE53(GEHealthcare(皮斯卡塔韦，新泽西州))获得的基于弱碱阴离子交换纤维素的树脂
●XAD-16-AmberliteTMXAD-16-从Sigma-Aldrich获得的基于聚苯乙烯的非离子吸收剂
●G-75-50-SephadexTMG-75-40从Sigma-Aldrich获得的交联葡聚糖
●S-300-SephacrylTMS-300-从GEHealthcare获得的烯丙基葡聚糖粒子
●IR-45CP-AmberliteTMIR-45CP-从Mallinckrodt(帕里斯，肯塔基州)获得的弱碱性大孔网状聚苯乙烯阴离子交换树脂
●IRA-400CP-AmberliteTMIRA-400CP-从Mallinckrodt(帕里斯，肯塔基州)获得的强碱性聚苯乙烯阴离子交换树脂
●A-21-AmberlystTMA-21-从AlfaAesar(WardHill，马萨诸塞州)获得的弱碱性大孔网状聚苯乙烯阴离子交换树脂
●MAPTAC-[3-(甲基丙烯酰氨基)丙基]三甲基氯化铵分散体，在水中按重量计约10％，根据美国专利No.7,647,835制备
培养平板的制备
将50g黄原胶粉末和50g刺槐豆胶粉末的混合物置于500mL瓶中并且手动振摇约5分钟。通过将该混合物撒布到压敏胶粘涂层片材的粘性面(从3M公司(圣路易斯，明尼苏达州)获得的9795R高级密封带)上，制备覆盖薄膜。该胶的涂覆重量是大约85mg/24平方英寸。
通过混合22.8份酪蛋白胰酶消化物、15.9份酵母膏、45.5份丙酮酸钠、4.1份右旋糖、9.0份磷酸氢二钾和2.8克磷酸二氢钾，制备营养混合物。通过在烧杯中使用气动混合器混合500mL去离子水与14.78克的以上营养混合物，制备营养培养液。随后，将5克刺槐豆胶以小增量与培养液混合，随后彻底混合几分钟。随后将烧杯用箔覆盖并且将混合物加热至80℃并混合约6分钟，然后在不加热下混合的同时让其冷却约十分钟。然后将培养液倾入经灭菌的烧杯，用塑料袋覆盖并冷藏。将冷却的培养液用刮铲小心搅拌以避免形成气泡，随后用刮刀涂布到9.5英寸宽、4密尔厚的聚对苯二甲酸乙二醇酯薄膜片材(可作为MELINEX453从杜邦帝人薄膜公司(DuPontTeijinFilms)(霍普韦尔，弗吉尼亚州)获得)上至每24平方英寸约150mg(每平方厘米约1mg)的干涂层重量。使涂布的膜在设定于210℃温度的烘炉中干燥约10分钟。
通过将8英寸(20.3cm)宽4密尔厚的聚苯乙烯泡沫片材层合至衬垫上的压敏转移胶带，制备层合材料。从这个层合材料冲切直径为5厘米的圆盘以在该层合材料上形成居中于3英寸(7.6厘米)正方形内的圆形切除盘，并且移除所述圆盘。将衬垫从剩余的层合材料移除并将聚苯乙烯泡沫的涂布粘合剂的表面粘附至涂布培养液的片材，以提供基础件，所述基础件具有涂布培养液的自支承基材和粘附于该支撑基材的涂布培养液的表面的疏水性间隔部件(即“泡沫挡板”)。从层合材料切下3英寸×4英寸(7.6厘米×10.16厘米)大小的矩形板，圆形切除开口自该4英寸长度的一个末端居中于3英寸(7.6厘米)正方形内。将覆盖薄膜置于板上，涂布粉末的侧面朝向泡沫挡板并且用双侧压敏胶带连接以形成培养平板。
实例1-7和1-TUacetate加粒子和酶
通过在1mLDMSO中溶解1mgTUacetate制备染料溶液。通过在小瓶中将0.5mL的该染料溶液与表1中所示的大约100mg粒子混合，制备含水的颗粒物分散体。随后将50μL猪肝脏酯酶(PBS中1mg/ml)添加至每个小瓶以释放荧光TU。在标准实验室荧光灯(365nm)下观察小瓶的荧光。荧光如下评级：---或无；+(微弱)；++(中等微弱)；+++(中等)；++++(强烈)表1中显示每种粒子或没有粒子情况下的观察结果。
表1-TUacetate加粒子时的荧光
实例 粒子 粒子中的荧光(颜色)
1 IR-45 +
2 IRA-400CP +++(绿色)
3 A-21 +++(绿色)
4 XAD-16 ++(蓝色)
5 G-75-40 +++(蓝-绿色)
6 QA 52 +++(绿色)
7 DE53 +++(蓝色)
C1 无 溶液中的亮蓝-绿色荧光
使用来自MolecularDevices的SpectraMaxM5荧光平板读数仪对溶液进行光谱测量(未显示)。结果表明在离子基质(例如，QA52、IRA-400CP)中，荧光团从离子状态发射。在非离子基质或含有活泼质子的那些基质(弱碱)(例如，DE-53)中，来自中性状态的发射可以占优势。
实例8-10和C2-存在和不存在酶溶液时的比较
通过在1mLDMSO中溶解1mgTUgal或MHCgal制备染料溶液。通过约200μL的β-半乳糖苷酶母液与0.7mL的β-巯基乙醇、0.2gMgCl2混合并且用去离子水稀释至10mL，来制备酶试剂溶液。将10μL份的染料溶液等分试样添加至小瓶，每个小瓶含有1mLPBS、50μL试剂溶液和100mg在表2中所示的粒子之一。制备无试剂(酶)溶液的对照样品。在0.5小时后视检小瓶，并将这些小瓶如实例1中所述进行评级。
表2-存在和不存在酶时的荧光
n/a-数据不可获得
在实例8-10中，所见到的荧光来自粒子，而非溶液。这表明，可以通过用适宜的粒子，使可溶性荧光团的荧光信号隔离至固相中。
实施例11-16、C3-具有粒子和MHCgal时平板中大肠杆菌的荧光
通过添加MHCgal至DMSO以构成20mM溶液，制备染料溶液。通过以下方式制备实例11-14的含水颗粒物分散体：添加250mg在表3中所示的粒子之一至5mLButterfield缓冲液，在室温下在超声波浴中超声处理50分钟。
通过用Butterfield缓冲液稀释1mL的SephacrylS-300或MAPTAC四倍，制备实例15和16的含水颗粒物分散体。
通过将单菌落接种至10mLTSB(胰蛋白胨大豆培养液)中制备大肠杆菌(ATCC#11229)的过夜培养物。将培养物在30℃和200转/分钟下在Innova4000培养摇床(NewBrunswickScientific)中振摇24小时。次日早晨，将过夜培养物用Butterfields缓冲液进行100倍稀释3次，以提供含有估计103个生物/mL溶液的溶液。
将每一种颗粒物分散体的1mL等分试样与8μL的MHCgal染料溶液和10μL的稀释大肠杆菌培养物进行混合。将每种分散体接种至如上文所述制备的单独培养平板中。将培养平板在30℃温育18小时，随后视检荧光并评级。结果在表3中显示。
表3-大肠杆菌平板加粒子和生荧光染料时的荧光
实例 粒子 荧光
11 MX-180 +++
12 MR-2G ++
13 MP-1000 ---
14 DE-53 ---
15 S-300 ---
16 MAPTAC +
C3 无 +
这些实例中的数据显示，通过使用非沉淀性荧光团和固体粒子可增强对再水化的培养基中微生物的检测。
实例17-21和C4-表面活性剂的作用
通过添加TUgal至DMSO以构成20mM溶液，制备染料溶液。这个溶液进一步用DMSO稀释以构成1mM溶液。通过将约200μL的β-半乳糖苷酶母液与0.7mL的β-巯基乙醇、0.2gMgC12混合并且用去离子水稀释至10mL，制备试剂溶液。通过添加10μL的1mM染料溶液至含有50μL试剂溶液的2mL的PBS和60mg的实例17-20表8中所示的粒子，制备含水分散体。在无粒子情况下制备实例21。实例17-21还包括0.5mg/ml的表8中列出的表面活性剂。在无粒子和在无酶溶液的情况下制备实例C4。
表8-采用TUgal时表面活性剂和粒子的作用
NT-未测试
表8中的数据显示采用表面活性剂时TUgal的荧光发射的变化。
尽管阐述本发明广泛范围的数值范围和参数为近似值，但具体实例中所述数值是尽可能精确地给出。尽管如此，在各自测试过程中产生的标准偏差不可避免地导致所有数值固有地包括一定范围。
所有的标题是为了阅读者方便，而不应该被用于限制该标题后面的正文的含义，除非是这么规定的。
本文引用的所有专利、专利申请、出版物以及核酸和蛋白质数据库条目的整个公开内容全部以引用方式并入本文，如同每个都单独引入一样。在不背离本发明的范围和精神的前提下，本发明的各种修改和更改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，并且应该理解，本发明不应不当地受限于本文所述的示例性实例。

Claims (9)

1.一种检测生物活性的方法，所述方法不包括疾病的诊断方法，所述方法包括：
提供：
可能包含第一生物活性的样品；
可以通过第一生物活性转化成第一生物衍生物的第一指示试剂，其中所述第一指示试剂包含具有荧光团的发荧光酶底物，所述荧光团选自伞形酮、7-氨基香豆素、β-萘胺、β-萘酚、荧光素、试卤灵、9H-(1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮)、罗丹明110、任何前述荧光团的衍生物和任何前述荧光团的组合；
胶凝剂；和
多个粒子，每个粒子包含接受并保持所述第一生物衍生物的有机聚合物；
形成包含所述第一指示试剂和所述多个粒子的含水分散体；
其中形成所述含水分散体包含形成水凝胶；
其中所述多个粒子中的至少一部分分散在所述水凝胶中；
使所述样品与所述含水分散体处于流体连通；和
检测所述第一生物衍生物的存在或不存在，其中所述第一生物衍生物被粒子保持；
其中检测所述第一生物衍生物的存在或不存在包括计数菌落形成单位。
2.根据权利要求1所述的方法，其中检测所述第一生物衍生物的存在或不存在包括检测发荧光第一生物衍生物或检测有色生物衍生物。
3.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括：
提供可以由第二生物活性转化成第二生物衍生物的第二指示试剂；和
检测所述第二生物衍生物的存在或不存在；
其中形成所述含水分散体包括形成包含所述第二指示试剂的含水分散体；
其中，当所述第二指示试剂包含生荧光酶底物时，所述第二指示试剂具有荧光团，所述荧光团选自伞形酮、7-氨基香豆素、β-萘胺、β-萘酚、荧光素、试卤灵、9H-(1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮)、罗丹明110、任何前述荧光团的衍生物和任何前述荧光团的组合。
4.根据权利要求3所述的方法，所述方法还包括：
提供可以由第二生物活性转化成第二生物衍生物的第二指示试剂；
使所述第二指示试剂与所述水凝胶处于流体连通；和
检测所述第二生物衍生物的存在或不存在；
其中，当所述第二指示试剂包含生荧光酶底物时，所述第二指示试剂具有荧光团，所述荧光团选自伞形酮、7-氨基香豆素、β-萘胺、β-萘酚、荧光素、试卤灵、9H-(1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮)、罗丹明110、任何前述荧光团的衍生物和任何前述荧光团的组合。
5.根据权利要求1所述的方法，其中使所述样品与所述含水分散体处于流体接触包括形成包含所述样品、所述第一指示试剂和所述多个粒子的含水分散体。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，在使所述样品与所述含水分散体处于流体连通后，所述方法还包括分离来自所述含水分散体或在所述含水分散体内部的所述多个粒子的一部分。
7.一种检测生物活性的方法，所述方法不包括疾病的诊断方法，所述方法包括：
提供：
可能包含第一生物活性的样品；
可以由所述生物活性转化成第一生物衍生物的第一指示试剂，其中所述第一指示试剂包含具有荧光团的生荧光酶底物，所述荧光团选自伞形酮、7-氨基香豆素、β-萘胺、β-萘酚、荧光素、试卤灵、9H-(1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮)、罗丹明110、任何前述荧光团的衍生物和任何前述荧光团的组合；
多个粒子，每个粒子包含接受并保持所述第一生物衍生物的有机聚合物；和
胶凝剂；
形成包含所述第一指示试剂和所述胶凝剂的水凝胶；
使所述粒子分布在所述水凝胶的主表面的至少一部分上；
使所述样品与所述水凝胶的一部分处于流体连通；和
检测所述第一生物衍生物的存在或不存在，其中所述第一生物衍生物被粒子保持，其中所述第一生物衍生物的存在表示存在第一生物活性；
其中检测所述第一生物衍生物的存在或不存在包括检测分立的发荧光区域；
其中检测分立的发荧光区域还包括计数分立的发荧光区域的数量。
8.根据权利要求7所述的方法，所述方法还包括：
提供可以由第二生物活性转化成第二生物衍生物的第二指示试剂；
使所述第二指示剂与所述水凝胶处于流体连通；和
检测所述第二生物衍生物的存在或不存在；
其中所述第二生物衍生物的存在表示存在所述第一生物活性。
9.根据权利要求7或权利要求8中任一项所述的方法，所述方法还包括：
提供可以由第二生物活性转化成第二生物衍生物的第二指示试剂；
使所述第二指示剂与所述水凝胶处于流体连通；和
检测所述第二生物衍生物的存在或不存在。
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