DE60315043T2

DE60315043T2 - Nachweis biologischer moleküle mittels differentieller aufteilung von enzymsubstraten und -produkten

Info

Publication number: DE60315043T2
Application number: DE60315043T
Authority: DE
Inventors: Stephen R. Kingston BROWN; Samir P. Pickering TABASH; Igor S. Kingston KOZIN; Eric J.-P. Kingston MARCOTTE; Arthur N. Kingston LEY; Kevin R. Kingston HALL; Moe Kanata HUSSAIN; Peter V. Kingston HODSON; Parveen Kingston AKHTAR; John G. Cornwall ST.MARSEILLE; Robin A. Kingston WYNNE-EDWARDS; Raymond J. Bath BOWERS
Original assignee: Queens University at Kingston
Current assignee: Queens University at Kingston
Priority date: 2002-09-20
Filing date: 2003-09-22
Publication date: 2008-04-10
Anticipated expiration: 2023-09-23
Also published as: US20130217041A1; MXPA05003068A; JP5799353B2; US8632966B2; US20040106164A1; EP1539986A1; US7402426B2; DE60315043D1; CA2497555C; JP2011254816A; WO2004027084A1; ATE367449T1; CA2497555A1; US20140295403A1; AU2003266899B2; JP2005538728A; US8377686B2; ES2290487T3; HK1080514A1; US20090117600A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren sowie eine Vorrichtung zur Detektion von biologischen Molekülen, so wie mit biologischen Kontaminanten assoziierten Enzymen, in Proben so wie Wasser- und Nahrungsmittelprodukten, durch die differentielle Aufteilung von Enzymsubstraten und -produkten. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren sowie eine Vorrichtung zur Detektion von Enzymaktivität.
Hintergrund der Erfindung
Die Fähigkeit zur Detektion von mit Enzymaktivität assoziierten biologischen Molekülen findet Anwendung auf Gebieten so wie dem Testen der biologischen Kontamination von Wasser- und Nahrungsmittelprodukten. Von besonderem Interesse ist die Fähigkeit zur Detektion von biologischer (d.h. bakterieller) Kontamination von Wasser. Üblicherweise basieren Verfahren zur Detektion von Bakterien so wie Escherichia coli (E. coli oder EC) und Gesamt Coliformen (TC) auf der Detektion von Indikatorenzymaktivität in einer Bouillon, welche dafür vorgesehen ist, das Wachstum des Zielorganismus zu fördern. Akzeptierte Indikatorenzyme sind β-Glucuronidase (β-glu) und β-Galaktosidase (β-gal) für EC bzw. TC. Verfahren, welche diese Enzyme verwenden, basieren auf einer Reaktion des Enzyms mit einer chromogenen oder fluorogenen Verbindung, um die Enzymaktivität zu messen (zur Übersicht siehe die Referenzen 1 und 2). Im Fall von β-glu oder β-gal wird üblicherweise ein Glucuronid- oder Galaktosidkonjugat einer Farbstoffverbindung als ein Substrat zu der Probenbouillon gegeben und wenn die Zielenzyme vorhanden sind, so wird das Konjugat in ein freies Farbstoffmolekül umgewandelt. Die enzymabhängige Umwandlung wird durch eine Veränderung der Farbe oder der Fluoreszenz der freien Farbstoffmoleküle im Vergleich zu dem Konjugat detektiert. Manche Testverfahren verwenden lösliche Produkte, welche in Lösung detektiert werden, wobei die Colizellen üblicherweise ebenfalls in der Lösung suspendiert sind. Andere verwenden Colizellen Zellen auf der Oberfläche eines Filters, einer Membran oder eines Gels, üblicherweise mit einem unlöslichen Farbstoffprodukt, welches sich an den Träger adsorbiert und einen gefärbten oder fluoreszierenden Spot um Kolonien von Zielorganismen herum bildet (3). Manche unterstützte Ausführungen verwenden multiple Farbstoffsubstrate, welche eine Vielzahl von Farben produzieren, je nachdem, welche Organismen vorhanden sind.
Die zuvor genannten Ansätze sind jedoch anfällig für Fehlerquellen, so wie die Eignung der Bouillon sowie Inkubationsbedingungen für alle Zielarten von Coli, ebenso wie das Vorhandensein von Nicht-Zielorganismen, welche zu der Indikatorenzymaktivität beitragen können. Nichtsdestoweniger ist die Verlässlichkeit der etablierten Verfahren groß genug für eine weit reichende regulatorische Akzeptanz dieser Verfahren zur Bewertung von Proben von Fleischprodukten bis hin zum Trinkwasser.
Des Weiteren erfolgt bei routinemäßigen oder kommerziellen Anwendungen solcher Substrate die Detektion üblicherweise visuell durch das menschliche Auge, was wesentliche Einschränkungen in der Durchführung bedeutet. Es muss eine große Anzahl von Colizellen vorhanden sein, bevor das Substrat in ausreichender Menge umgewandelt und das Produkt somit sichtbar wird. Dies erfordert eine beträchtliche Inkubation sowie ein beträchtliches Wachstum für die Detektion einer kleinen ursprünglichen Anzahl an Zellen, und eine 100 ml umfassende Standardprobe wird für 24 h inkubiert, um ein Limit für die Detektion einer Colizelle in der ursprünglichen Probe bereitzustellen. In manchen Fällen wird von einer schnelleren Detektion berichtet, jedoch üblicherweise nur indem ein höheres Detektionslimit akzeptiert wird (z. B. 100 bis 300 Zellen in einer 100 ml umfassenden Probe (4, 5, 6)). Außerdem ist die visuelle Detektion nicht quantitativ und diese Tests werden üblicherweise nach dem Prinzip von „Vorhandensein/Abwesenheit" angewandt, wobei die tatsächliche Anzahl der Colizellen nicht bestimmt wird. Eine Ausnahme hinsichtlich des Letzteren sind einige Plattenkulturverfahren, in welchen die Anzahl der Kolonien gezählt wird und folglich die Anzahl der Zellen in der Probe quantitativ bestimmt wird (3). Dabei handelt es sich jedoch um einen äußerst arbeitsintensiven und zeitaufwändigen Vorgang, der ebenfalls eine lange Inkubation erfordert und über einen eingeschränkten dynamischen Bereich verfügt.
WO 9932655 betrifft einen Enzymassay, in welchem eine Enzym-Substrat-Reaktion auf einer festen Phase (einer hydrophoben Schicht) stattfindet, wodurch ein markiertes hydrophiles Produkt freigesetzt wird, welches sich von der Schicht aus in die wässrige Phase verteilt.
Zusammenfassung der Erfindung
Indessen stellt die vorliegende Erfindung in einem ersten Aspekt ein Verfahren zur Detektion des Vorhandenseins eines Organismus mit wenigstens einem Enzym in einer Probe bereit, umfassend:
Bereitstellung mindestens eines Substrats;
Bereitstellung eines Aufteilungselements;
Kombinieren der Probe und des mindestens einen Substrats unter Bedingungen, welche es dem mindestens einen Enzym des Organismus gestatten, mit dem mindestens einen Substrat zu reagieren sowie unreagiertes Substrat zur Aufteilung in das Aufteilungselement, und
Detektieren der Fluoreszenz des besagten unreagierten Substrats in dem besagten Aufteilungselement;
wobei das Ausmaß der besagten detektierten Fluoreszenz indikativ für das Vorhandensein des besagten Organismus in der Probe ist.
In einer Ausführungsform umfasst das besagte Aufteilungselement eine optische Sonde. In einer weiteren Ausführungsform umfasst das besagte Aufteilungselement einen Polymerfilm, und vorzugsweise einen hydrophoben Polymerfilm, so wie Polydimethylsiloxan (PDMS). In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die besagten Bedingungen, welche es dem Enzym gestatten, mit dem Substrat zu reagieren, wässrige Bedingungen.
In einer Ausführungsform handelt es sich bei dem biologischen Molekül um das Substrat und die besagte Detektionsfluoreszenz umfasst die Detektion einer Veränderung hinsichtlich der Menge an Fluoreszenz. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem biologischen Molekül um ein Produkt der Enzym-Substrat-Reaktion.
In einer Ausführungsform wird die Enzymaktivität mit einen Mikroorganismus assoziiert. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Mikroorganismus um einen biologischen Kontaminanten. In einer weiteren Ausführungsform wird das mindestens eine Enzym ausgewählt aus β-Glucuronidase und β-Galaktosidase. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Mikroorganismus ausgewählt aus E. coli und Gesamt Coliformen. In verschiedenen Ausführungsformen wird das mindestens eine Substrat ausgewählt aus Pyren-β-D-Glucuronid, Anthracen-β-D-Glucuronid, Pyrromethen-β-D-Glucuronid, Pyren-β-D-Galaktopyranosid und Anthracen-β-D-Galaktopyranosid und die Enzymaktivität wird detektiert in einer Probe ausgewählt aus Wasser, einer biologischen Probe, Nahrungsmitteln und Erde.
In einer Ausführungsform werden das besagte Enzym und das Substrat in einer Kartusche komprimiert, welche das besagte Aufteilungselement um Fasst.
In Übereinstimmung mit einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt zur Detektion eines biologischen Kontaminanten in einer Probe, umfassend: Kombinieren der Probe mit mindestens einem Substrat unter Bedingungen, welche es einem Enzym, das mit dem biologischen Kontaminanten assoziiert wird, gestatten, mit dem Substrat zu reagieren sowie die Detektion der Fluoreszenz eines Produkts der Enzym-Substrat-Reaktion, wobei die besagte Fluoreszenz indikativ für den besagten biologischen Kontaminanten in der Probe ist.
In verschiedenen Ausführungsformen wird die Probe ausgewählt aus Wasser, einer biologischen Probe, Nahrungsmitteln und Erde. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die besagte Fluoreszenz eines Produkts der Enzym-Substrat-Reaktion durch Aufteilung des Produkts in eine optische Sonde detektiert.
In einer Ausführungsform umfassen die besagten Bedingungen, welche es dem Enzym gestatten, mit dem Substrat zu reagieren, wässrige Bedingungen. In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei dem besagten Enzym um mindestens eines aus β-Glucuronidase und β-Galaktosidase. In einer weiteren Ausführungsform wird der besagte Mikroorganismus ausgewählt aus E. coli und Gesamt Coliformen. In weiteren Ausführungsformen wird das besagte mindestens eine Substrat ausgewählt aus Pyren-β-D-Glucuronid, Anthracen-β-D-Glucuronid, Pyrromethen-β-D-Glucuronid und Pyren-β-D-Galaktopyranosid.
In Übereinstimmung mit einem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine optische Sonde zur Detektion der Fluoreszenz eines Moleküls bereitgestellt, umfassend: einen optischen Wellenleiter sowie ein auf einem Ende des optischen Wellenleiters vorgesehenes Aufteilungselement, wobei das besagte fluoreszierende Molekül selektiv in das Aufteilungselement aufgeteilt wird, so dass die besagte Fluoreszenz in den Wellenleiter gekoppelt wird.
In einer Ausführungsform wird das fluoreszierende Molekül ausgewählt aus einem Enzymsubstrat und einem Produkt einer Enzym-Substrat-Reaktion. In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei dem Aufteilungselement um einen Polymerfilm. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Polymerfilm Polydimethylsiloxan (PDMS). In einer weiteren Ausführungsform umfasst die optische Sonde des Weiteren ein Spektrometer zur Messung der besagten Fluoreszenz. In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei dem optischen Wellenleiter um eine optische Faser.
In Übereinstimmung mit einem vierten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Vorrichtung zur Detektion der Fluoreszenz eines Moleküls bereitgestellt, umfassend: eine optische Sonde, wie zuvor beschrieben, eine Anregungslichtquelle sowie ein Spektrometer oder einen Detektor zur Messung der Fluoreszenz des besagten Moleküls, wobei die besagte Fluoreszenz indikativ für das besagte Molekül ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das fluoreszierende Molekül ausgewählt aus einem Enzymsubstrat und einem Produkt einer Enzym-Substrat-Reaktion. In einer Ausführungsform wird das besagte Enzym mit einem Mikroorganismus assoziiert. In verschiedenen Ausführungsformen wird das besagte Enzym ausgewählt aus β-Glucuronidase und β-Galaktosidase. In weiteren Ausführungsformen wird der besagte Mikroorganismus ausgewählt aus E. coli und Gesamt Coliformen. In verschiedenen Ausführungsformen wird das besagte Substrat ausgewählt aus Pyren-β-D-Glucuronid, Anthracen-β-D-Glucuronid, Pyrromethen-β-D-Glucuronid, Pyren-β-D-Galaktopyranosid und Anthracen-β-D-Galaktopyranosid.
In Übereinstimmung mit einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein automatisches System zur Detektion eines biologischen Kontaminanten in einer Probe bereitgestellt, umfassend: einen Probeninkubator zur Inkubation der Probe mit mindestens einem Substrat unter Bedingungen, welche es einem Enzym, das mit einem Mikroorganismus assoziiert wird, gestatten, mit dem Substrat zu reagieren, eine wie zuvor beschriebenen Vorrichtung zur Detektion der Fluoreszenz eines Produkts der Enzym-Substrat-Reaktion sowie einen Steuerungseinheit zur Steuerung des Betriebs des besagten Systems und zur Speicherung und Ausgabe von Daten, welche im Bezug zu der besagten Detektion der Fluoreszenz stehen, wobei die besagte detektierte Fluoreszenz indikativ für den besagten biologischen Kontaminanten in der Probe ist.
In einer Ausführungsform umfasst das System des Weiteren eine Kommunikationseinheit zur Weitergabe von Daten, welche mit der biologischen Kontamination der Probe in Zusammenhang stehen. In verschiedenen Ausführungsformen wird die Probe ausgewählt aus Wasser, einer biologischen Probe, Nahrungsmitteln und Erde. In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die besagten Bedingungen, welches es dem Enzym gestatten, mit dem Substrat zu reagieren, wässrige Bedingungen. In weiteren Ausführungsformen wird das besagte Enzym ausgewählt aus β-Glucuronidase und β-Galaktosidase und der besagte Mikroorganismus wird ausgewählt aus E. coli und Gesamt Coliformen. In verschiedenen Ausführungsformen wird das besagte mindestens eine Substrat ausgewählt aus Pyren-β-D- Glucuronid, Anthracen-β-D-Glucuronid, Pyrromethen-β-D-Glucuronid und Pyren-β-D-Galaktopyranosid.
In Übereinstimmung mit einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Kit zur Detektion eines biologischen Kontaminanten in einer Probe bereitgestellt, umfassend: eine wie zuvor beschriebene Vorrichtung, ein Substrat für ein Enzym, welches mit dem biologischen Kontaminanten assoziiert wird sowie einen Inkubator zur Inkubation der Probe und des Substrats, wobei das Kit eine Indikation des besagten biologischen Kontaminanten in der Probe bereitstellt.
In verschiedenen Ausführungsformen wird die Probe ausgewählt aus Wasser, Nahrungsmitteln, einer biologischen Probe und Erde. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem biologischen Kontaminanten um mindestens einen Mikroorganismus ausgewählt aus E. coli und Gesamt Coliforme.
In einer Ausführungsform handelt es sich bei dem Enzym um mindestens ein Enzym ausgewählt aus β-Glucuronidase und β-Galaktosidase. In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei dem Substrat um mindestens ein Substrat ausgewählt aus Pyren-β-D-Glucuronid, Anthracen-β-D-Glucuronid, Pyrromethen-β-D-Glucuronid und Pyren-β-D-Galaktopyranosid.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein System zur Detektion des Vorhandenseins eines Organismus, welcher mindestens ein Enzym aufweist, in einer Probe bereitgestellt, umfassend: ein Gemäß zur Inkubation der Probe und des mindestens einen Substrats, so dass mindestens ein Enzym mit dem mindestens einen Substrat reagieren kann, um ein biologisches Molekül zu produzieren, ein Aufteilungselement, welches die Aufteilung des besagten biologischen Moleküls darin gestattet, eine Anregungslichtquelle, welche das besagte biologische Molekül bestrahlt, welches in das besagte Aufteilungselement aufgeteilt wurde, einen Detektor, welcher die Fluoreszenz des besagten biologischen Moleküls detektiert, welches in das besagte Aufteilungselement aufgeteilt wurde sowie eine Steuerungseinheit, wobei die besagte detektierte Fluoreszenz indikativ für das Vorhandensein des besagten Organismus in der Probe ist.
In einer Ausführungsform übt die Steuerungseinheit mindestens eine Funktion aus, ausgewählt aus der Steuerung des Betriebs des besagten Systems, der Speicherung der mit der Fluoreszenzdetektion in Zusammenhang stehenden Daten sowie der Ausgabe von mit der Fluoreszenzdetektion in Zusammenhang stehenden Daten. In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Gefäß eine herausnehmbare Kartusche zur Aufnahme der Probe und des Substrats.
In einer weiteren Ausführungsform ist das besagte Aufteilungselement in der besagten herausnehmbaren Kartusche vorgesehen. In einer weiteren Ausführungsform umfasst das besagte System eine Kommunikationseinheit, welche mit der Fluoreszenzdetektion in Zusammenhang stehende Daten an ein Kommunikationsnetzwerk weitergibt. In einer weiteren Ausführungsform wird das besagte Enzym mit einem biologischen Kontaminanten assoziiert. In einer weiteren Ausführungsform wird die Probe ausgewählt aus Wasser, einer biologischen Probe, Nahrungsmitteln und Erde. In einer weiteren Ausführungsform wird das Enzym ausgewählt aus β-Glucuronidase und β-Galaktosidase und der besagte biologische Kontaminant wird ausgewählt aus E. coli und Gesamt Coliformen. In verschiedenen Ausführungsformen wird das besagte mindestens eine Substrat ausgewählt aus Pyren-β-D-Glucuronid, Anthracen-β-D-Glucuronid, Pyrromethen-β-D-Glucuronid, Pyren-β-D-Galaktopyranosid und Anthracen-β-D-Galaktopyranosid. In einer weiteren Ausführungsform umfasst das System des Weiteren Mittel zur Kalibrierung des besagten Aufteilungselements sowie optischer Komponenten des Systems oder zur Überwachung der besagten Fluoreszenzdetektion oder zu beiden Zwecken.
In einer Ausführungsform umfasst das besagte Mittel zur Kalibrierung des besagten Aufteilungselements und zur Überwachung der besagten Fluoreszenzdetektion: ein Fluorophor, welches sich in das besagte Aufteilungselement aufteilt und auf einer anderen Wellenlänge fluoresziert als das besagte biologische Molekül, wobei die besagte Fluoreszenz des besagten Fluorophor durch den Detektor detektiert wird und wobei die besagte Steuerungseinheit sich der detektierten Fluoreszenz bedient, um das Aufteilungselement und die optischen Komponenten des Systems zu kalibrieren oder um die Fluoreszenzdetektion des Systems zu überwachen.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Kit zur Detektion eines biologischen Kontaminanten in einer Probe bereitgestellt, umfassend: die zuvor beschriebene Vorrichtung sowie ein Substrat für ein Enzym, welches mit dem besagten biologischen Kontaminanten assoziiert wird, wobei das Kit eine Indikation des Vorhandenseins oder der Menge des besagten biologischen Kontaminanten in der Probe bereitstellt.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Kit des Weiteren ein Gefäß zur Inkubation der Probe und des Substrats. In einer Ausführungsform wird die Probe ausgewählt aus Wasser, Nahrungsmitteln, einer biologischen Probe und Erde. In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei dem biologischen Kontaminanten um mindestens einen Mikroorganismus ausgewählt aus E. coli und Gesamt Coliformen. In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei dem Enzym um mindestens ein Enzym ausgewählt aus Pyren-β-D-Glucuronid, Anthracen-β-D-Glucuronid, Pyrromethen-β-D-Glucuronid, Pyren-β-D-Galaktopyranosid und Anthracen-β-D-Galaktopyranosid.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Detektion des Vorhandenseins einer Zielspezies in einer Probe bereitgestellt, umfassend: das Kombinieren eines Antikörpers, welcher spezifisch für die besagte Zielspezies ist, mit einer Probe unter Bedingungen, welche es dem Antikörper gestatten, an die Zielspezies zu binden, das Bereitstellen eines Enzyms, welches die Quantifizierung des besagten gebundenen Antikörpers mittels der Produktion eines fluoreszierenden Moleküls gestattet, das Bereitstellen eines festen Aufteilungselements zur Aufteilung des besagten fluoreszierenden Moleküls darin sowie die Detektion der Fluoreszenz des besagten fluoreszierenden Moleküls in besagtem Aufteilungselement, wobei die besagte detektierte Fluoreszenz indikativ für das Vorhandensein der besagten Zielspezies in der Probe ist.
In einer Ausführungsform wird der besagte Antikörper an das besagte Enzym konjugiert. In einer weiteren Ausführungsform wird das besagte Enzym an einen zweiten Antikörper konjugiert, welcher spezifisch für den Antikörper ist, welcher für die Zielspezies spezifisch ist, und das Konjugat wird mit der Kombination aus dem für die Zielspezies spezifischen Antikörper und der Probe vermischt. In einer weiteren Ausführungsform wird die Fluoreszenz kontinuierlich während der gesamten Enzym-Substrat-Reaktion detektiert. In einer weiteren Ausführungsform wird die Fluoreszenz nach einer bestimmten Zeit während des Verlaufs der Enzym-Substrat-Reaktion detektiert. In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei der Zielspezies um einen biologischen oder chemischen Kontaminanten. In einer weiteren Ausführungsform wird die Zielspezies ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Bakterien, Protozoen und Viren.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die vorliegende Erfindung wird nunmehr in beispielhafter Art und Weise unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben, wobei
1 ein Schema für die Detektion der Enzymaktivität mittels einer optischen Sonde gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt;
2A eine Photomikrographie einer Ausführungsform einer optischen Sonde gemäß der vorliegenden Erfindung darstellt;
2B ein schematisches Diagramm einer weiteren Ausführungsform einer optischen Sonde gemäß der vorliegenden Erfindung darstellt;
3A eine optische Sonde und damit assoziierte optische Komponenten gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigt;
3B eine schematische Darstellung eines automatischen Systems zur Überwachung der Enzymaktivität in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung ist;
3C ein schematisches Diagramm einer Testkartusche zur Verwendung in einer automatischen Samplereinheit der vorliegenden Erfindung ist;
3D ein schematisches Diagramm eines Magazins zur Aufnahme einer oder mehrerer der in 3C gezeigten Testkartuschen ist;
3E ein schematisches Diagramm einer automatischen Samplereinheit gemäß der vorliegenden Erfindung ist, wobei die gepunkteten Linien den Lichtweg repräsentieren;
4 ein schematisches Diagramm einer optischen Sonde und einer zur Detektion der Enzymaktivität konfigurierten Vorrichtung ist;
5 ein Plot ist, welches die Bemessung der Aufteilung von Hydroxypyren in eine optische PDMS-Sonde gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigt;
6 eine Kalibrierungskurve einer optischen Sonde für Hydroxypyren darstellt;
7 ein Plot ist, welches die in der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Enzyms durch eine optische Sonde gemäß der vorliegenden Erfindung detektierte Fluoreszenz vergleicht;
8 ein Plot des Ausmaßes der Bildung von Zielmolekülen, wie durch eine optische Sonde der vorliegenden Erfindung detektiert, als eine Funktion der Substratkonzentration für das Enzym Glucuronidase ist;
9 eine auf der durch eine optische Sonde gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung detektierten Fluoreszenz basierende Kalibrierungskurve der Glucuronidaseaktivität ist;
10 ein Plot ist, welches die Detektion mittels einer optischen Sonde von E. coli für verschiedene Ausgangskonzentrationen von E. coli-Zellen zeigt;
11A bis 11D Plots sind, welche die kinetischen Modelle für die Zeit bis zur Detektion von E. coli oder Gesamt Coliformen unter Verwendung eines Substrats und einer optischen Sonde gemäß der vorliegenden Erfindung illustrieren, wobei
11A die Detektionszeit von E. coli bei verschiedenen Ausgangszellzahlen mit einem Pyren-β-D-Glucuronidsubstrat zeigt;
11B die Detektionszeit von E. coli bei verschiedenen Ausgangszellzahlen mit einem Anthracen-β-D-Glucuronidsubstrat zeigt;
11C die Detektionszeit von Gesamt Coliformen bei verschiedenen Zellzahlen unter Verwendung eines Pyren-β-D-Galaktopyranosidsubstrats zeigt; und
11D die Detektionszeit von Gesamt Coliformen bei verschiedenen Zellzahlen unter Verwendung eines Anthracenyl-β-D-Galaktopyranosidsubstrats zeigt;
12A und B Plots sind, welche unter Verwendung einer optischen Sonde gemäß der vorliegenden Erfindung die Veränderung der Zeit bis zur Detektion als eine Funktion der Zellanzahl für einen ATCC-Stamm bzw. einen Wildtypstamm von E. coli zeigen;
13A und B Plots sind, welche die Signalintensität der optischen Sonde für die Detektion von E. coli in Proben, welche Millionen von Zellen bzw. Tausende von Zellen enthalten, als eine Funktion der Zeit zeigen;
14 die Kalibrierungskurven für die Zeit bis zur Detektion für E. coli und Gesamt Coliformen unter Verwendung der Detektion von Glucuronidase- bzw. Galaktosidaseaktivität zeigt;
15 ein Schema für die Synthese von 2-Anthracenyl-β-D-Galaktopyranosid zeigt;
16 ein Schema für die Synthese von 1-Pyrenyl-β-D-Galaktopyranosid zeigt;
17 ein alternatives Schema für die Glykosylierung von 2-Hydroxyanthracen und 1-Hydroxypyren zeigt;
18 ein Schema für die Herstellung von Anthracenglucuronid zeigt;
19 ein alternatives Schema für die Herstellung des Glucuronids von Anthracen zeigt;
20 ein Plot ist, welches den Grad der Substratumwandlung (ν) aufgetragen gegen die Ausgangskonzentration von 1-Pyrenphosphat(PP)-Substrat ([S]) für einen Immunoassay für die Detektion von 17-β-Estradiol unter Verwendung einer optischen Sonde gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt. Die Werte für ν wurden für verschiedene Ausgangskonzentrationen von PP-Substrat nach 1.000 Sekunden aus der Steigung eines Plots des Signals der optischen Sonde aufgetragen gegen die Zeit erhalten. Der Datenpunkt bei 2 × 10^–4 M zeigt eine Inhibition und wurde von der weiteren Analyse ausgeschlossen. Die kurvige Linie wurde unter Verwendung der kinetischen Best-Fit-Parameter nach Michaelis-Menton gezeichnet (siehe Beispiel 20);
21 eine Bindungskurve für die Bestimmung von 17-β-Estradiol im Endpunktmodus in einem Immunoassay ist. B- und Bo-Werte wurden für verschiedene Ausgangskonzentrationen von PP-Substrat nach 2.400 Sekunden aus der Steigung eines Plots des Signals einer optischen Probe aufgetragen gegen die Zeit erhalten. Der Fehlerbalken an dem Datenpunkt bei 100 pg/ml wurde aus zweifachen Durchläufen geschätzt; und
22 eine Bindungskurve für die Bestimmung von E17-β-Estradiol im kinetischen Modus in einem Immunoassay ist. B- und Bo-Werte wurden für verschiedene Ausgangskonzentrationen von PP-Substrat nach 5.000 bis 6.000 Sekunden aus der Steigung eines Plots des Signals einer optischen Probe aufgetragen gegen die Zeit erhalten.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Gemäß einem breit gefassten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren und eine Vorrichtung zur verlässlichen und schnellen Detektion von mit Enzymaktivität assoziierten biologischen Molekülen bereitgestellt. Die vorliegende Erfindung kann angewandt werden bei der Detektion von biologischen Molekülen, welche mit der Enzymaktivität von biologischen Kontaminanten assoziiert werden, so wie Mikroorganismen. Folglich betrifft eine praktische Anwendungsmöglichkeit der vorliegenden Erfindung die Detektion von biologischen Kontaminanten in Proben so wie Wasser oder Nahrungsmitteln. Eine weitere praktische Anwendungsmöglichkeit der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung in Assays, so wie dem enzymgekoppelten immunsorbenten Assay (ELISA), zur Bestimmung von Enzymmarkierungen.
Wie hierin verwendet, soll sich der Begriff „biologisches Molekül" auf jedes beliebige Molekül beziehen, welches dazu in der Lage ist, als ein Substrat einer enzymatischen Reaktion zu fungieren, oder jedes beliebige Molekül, welches durch eine enzymatische Reaktion hergestellt werden kann, ungeachtet der Tatsache, ob das Molekül in der Natur vorzufinden ist. Um genau zu sein, wird das Molekül aus dem Grund als „biologisch" bezeichnet, weil es entweder (a) effektiv bei der Bindung an ein Enzym ist und von diesem effektiv metabolisiert werden kann, oder (b) effektiv durch enzymatische Katalyse hergestellt wird. Folglich werden für die Zwecke der vorliegenden Offenbarung synthetische Substrate sowie deren Produkte als „biologisch" bezeichnet.
Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung eine verlässliche und schnelle Detektion der Enzymaktivität bereit. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Aktivität eines Zielenzyms dadurch detektiert, dass man einem Enzym ein Substrat bereitstellt, welches ein Fluorophor umfasst, und die Fluoreszenz eines fluoreszierenden Produkts der Enzym-Substrat-Reaktion bei einer sehr niedrigen Konzentration des Produkts selektiv detektiert. Alternativ dazu wird die Aktivität eines Zielenzyms dadurch detektiert, dass man einem Enzym ein Substrat bereitstellt, welches ein Fluorophor umfasst, und die Fluoreszenz eines Substrats sowie seinen Grad der Abnahme im Verlauf der Enzym-Substrat-Reaktion selektiv detektiert. Die selektive Detektion des fluoreszierenden Produkts oder des Substrats wird dadurch erreicht, dass man eine optische Sonde mit einem Aufteilungselement, oder einfach nur ein Aufteilungselement, bereitstellt, wobei das Produkt oder das Substrat in das Aufteilungselement aufgeteilt wird. Die optische Sonde mit einem Aufteilungselement oder das Aufteilungselement an sich sind zur Detektion der Fluoreszenz des Produkts oder des Substrats, welches in das Aufteilungselement aufgeteilt wurde, optisch an eine geeignete optische Hardware gekoppelt.
Die Fähigkeit, ein Produkt der Enzym-Substrat-Interaktion bei einer äußerst niedrigen Produktkonzentration oder eine geringfügige Änderung der Substratkonzentration zu detektieren, übersetzt sich aufgrund der kurzen Zeit, welche benötigt wird, um nur eine geringe Menge des Produkts zu produzieren oder eine geringe Menge an Substrat zu entfernen, in eine schnelle Detektion. In Ausführungsformen, in welchen das Vorhandensein von Mikroorganismen detektiert wird, wird daher nur eine geringe Anzahl an Mikroorganismen und somit nur eine kurze Inkubationszeit für die Detektion benötigt. Wenngleich die vorliegende Erfindung primär in Bezug auf die Detektion von Enzym-Substrat-Produkt beschrieben wird, versteht es sich, dass die vorliegende Erfindung gleichermaßen auf die Detektion eines Substrats angewandt werden kann.
Die Detektion der Enzymaktivität gemäß der vorliegenden Erfindung kann in jedem beliebigen Medium durchgeführt werden, in welchem Zielenzyme aktiv sind und welches in ausreichendem Maße fluid ist, um die Aufteilung eines relevanten Moleküls, so wie eines Produkts der Enzym-Substrat-Reaktion, in das Aufteilungselement zu gestatten. Geeignete Medien sind wässrig und es kann sich dabei um Fluids (z. B. Flüssigkeiten) oder halbfeste Substanzen (z. B. biologische Gewebe, Gels) handeln. Im Allgemeinen wird die vorliegende Erfindung dazu verwendet, ein Zielenzym in einer Probe zu detektieren, so wie z. B. in Wasser, Nahrungsmitteln, biologischen Proben, so wie Gewebe und Körperflüssigkeiten, und Erde. Die Analyse einiger Proben, so wie bestimmter Nahrungsmittelproben, biologischer Proben und Erdproben, erfordert die Kombination der Probe mit einem geeigneten Medium.
Wie hierin verwendet, sind die Begriffe „Detektion" oder „detektieren" oder „Überwachung" gegeneinander austauschbar und sollen die Detektion einer Enzymaktivität und/oder des Vorhandenseins von Mikroorganismen entweder auf einer einmaligen Basis (z. B. eine diskrete Probe) oder auf einer kontinuierlichen Basis (z. B. kontinuierliche Probennahme in regelmäßigen oder zufälligen Intervallen) bezeichnen.
Für die Optimierung eines Detektionsschemas der Enzymaktivität zur schnellen Detektion sollten drei Kriterien erfüllt sein:

1) Das Substrat sollte mit dem Zielenzym mit einer hohen Geschwindigkeitsrate reagieren.
2) Das Produkt sollte in hohem Maße fluoreszierend sein, so dass eine Spurenmenge leicht detektiert wird.
3) Es sollte ein großer Unterschied hinsichtlich der Fluoreszenz zwischen dem Substrat und dem Produkt bestehen, so dass ein von der Lösung ausgehendes Fluoreszenzsignal sich bei der Umwandlung von Enzym verändert.

Diese Kriterien erlegen der Optimierung von konventionellen Detektionsschemata wesentliche Einschränkungen auf. So ist es z. B., da eine Veränderung der Fluoreszenz erforderlich ist, möglich, dass ein gegebenes Substrat hinsichtlich des Grads der Umwandlung durch das Enzym oder des Detektionslimits des Produkts nicht optimal ist. Ebenso können in Frage kommende fluorogene Substanzen, welche die besseren Substrate für ein Enzym sein oder ein stark fluoreszierendes Produkt hervorbringen können, nicht geeignet sein, falls das Substrat selbst fluoresziert, was die Detektion der Umwandlung verhindert. Die vorliegende Erfindung überwindet solche Einschränkungen.
Viele der niedrigsten Detektionslimits für Fluorophore, von denen berichtet wird, involvieren polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe, Fluoresceinderivate, Rhodaminderivate oder organometallische Verbindungen so wie chelierte Lanthanide. Solche Fluorophore wurden in konventionellen Detektionsschemata bisher nicht in Substraten zur Detektion der β-Glucuronidase (glu)- oder β-Galaktosidase (gal)-Aktivität verwendet, da Derivate mit den entsprechenden Zuckern (Glucuronid und Galaktosid), welche wesentlich unterschiedliche Fluoreszenzspektren oder -intensitäten in Relation zum Produkt aufweisen, nicht bekannt sind. Stattdessen handelt es sich bei den derzeit verwendeten Fluorophoren fast ausnahmslos um Kumarinderivate, so wie Umbelliferon, welche zwar eine akzeptable Fluoreszenzintensität, jedoch eine viel niedrigere Fluoreszenz aufweisen als ein Konjugat mit Glucuronid oder Galaktosid. Im Gegensatz dazu gestattet die vorliegende Erfindung die Verwendung einer viel breiteren Palette an Fluorophoren in Substraten.
Es wurde bereits von einer Vielzahl an Substraten berichtet, von denen viele in kommerziellen Detektionsanwendungen verwendet werden. Für die Detektion von Umwandlungsprodukt in Lösung werden fluorogene Farbstoffe bevorzugt. So werden z. B. Konjugate von Umbelliferon und Umbelliferonderivate (z. B. 4-Methylumbelliferon, Trifluormethylumbelliferon (7)) bevorzugt, da sie einen guten Kontrast hinsichtlich der Fluoreszenz zwischen dem Produkt und dem Substrat ebenso wie eine schnelle Kinetik für die Reaktion von Konjugaten mit entweder den β-glu- oder den β-gal-Enzymen bieten. Es wurde ebenfalls von anderen Substraten so wie Dioxetan (8) berichtet. Chromogene Substrate wurden bisher in löslichen Detektionsschemata verwendet, sie werden jedoch tendenziell für den Gebrauch bei der membran- oder gelgestützten Zelldetektion bevorzugt. Beispiele schließen Indolyl(9)- und Indoxyl(10)-Konjugate ein.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Detektion von mit Enzymaktivität assoziierten biologischen Molekülen in einer Probe bereitgestellt. Wie hierin verwendet, soll der Begriff „biologisches Molekül" ein Enzymsubstrat oder ein beliebiges Produkt einer Enzym-Substrat-Reaktion bezeichnen. Das Verfahren umfasst die Kombination eines Zielenzyms oder eines mit dem Zielenzym assoziierten biologischen Kontaminanten mit dem Substrat, die Bestrahlung der Kombination mit anregendem Licht (d.h. Licht mit einer Wellenlänge, welche entweder in dem Substrat oder in dem Produkt oder in beiden Fluoreszenz hervorruft) sowie die selektive Detektion der Fluoreszenz von entweder dem Substrat oder jedem beliebigen Produkt der Enzym-Substrat-Reaktion. Vorzugsweise wird die Fluoreszenz eines fluoreszierenden Produkts der Enzym-Substrat-Reaktion detektiert. Handelt es sich bei der Probe nicht im Wesentlichen um eine Flüssigkeit oder eine halbflüssige Substanz (z. B. ein Gel), so ist es bevorzugt, dass das Substrat und die Probe nicht in einer Lösung miteinander kombiniert werden. Geeignete Lösungen schließen jede beliebige Lösung ein, welche dazu in der Lage ist, die Enzymaktivität zu unterstützen und/oder zu fördern. Im Fall der Verwendung von Zellen kann es sich bei einer geeigneten Lösung z. B. um ein geeignetes Medium (d.h. „Bouillon") handeln, welches so ausgewählt ist, dass es das Wachstum der zu untersuchenden Zellen unterstützt und fördert. Für Zellen und für die meisten Enzyme sind solche Lösungen wässrig. Bei dem Produkt der Enzym-Substrat-Reaktion kann es sich z. B. um ein freies fluoreszierendes (Farbstoff-)Molekül handeln, dessen Fluoreszenz detektiert wird.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Fluoreszenz durch eine optische Sonde detektiert, welche zwischen dem Produkt und dem Substrat unterscheidet, so dass nur die Fluoreszenz des Produkts oder die des Substrats detektiert wird. Insbesondere wird die Fluoreszenz entweder des Produkts oder des Substrats dadurch detektiert, dass alleine oder in Verbindung mit einer optischen Sonde ein Aufteilungselement bereitgestellt wird, welches die Aufteilung entweder des Produkts oder des Substrats darin gestattet. Ist das Aufteilungselement/die optische Sonde mit einer geeigneten Vorrichtung zur Messung der Fluoreszenz (d.h. Licht) verbunden, so wie z. B. mit einem Spektrometer oder einem Filterphotometer, so erzeugt es/sie ein Signal von einer sich in vorhersagbarer Art und Weise mit der Intensität der Fluoreszenz verändernden (z. B. linear) Stärke, welches eine Funktion der Konzentration des Produkts oder des Substrats ist. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Kombination von Substrat, Produkt und Aufteilungselement so gewählt, dass bei der niedrigstmöglichen Konzentration das Substrat nicht detektiert, das Produkt jedoch detektiert wird. Folglich wird durch die Unterscheidung zwischen der Fluoreszenz des Produkts und der des Substrats das dritte Kriterium für die Optimierung überwunden, auf welches zuvor Bezug genommen wurde.
Es wird erkannt werden, dass die vorliegende Erfindung auf die Detektion der Aktivität eines jeden beliebigen Enzyms angewandt werden kann, unter der Voraussetzung, dass (1) ein Substrat für ein solches Zielenzym mit einem Fluorophor konjugiert werden kann, (2) die Zielenzym-Substrat-Reaktion ein fluoreszierendes Produkt hervorbringt und (3) das fluoreszierende Produkt mittels eines Aufteilungselements/einer optischen Sonde gemäß der vorliegenden Erfindung selektiv detektiert werden kann. Für Enzyme, welche chemische Bindungen aufspalten, muss das Substrat einen Rest enthalten, welcher an das Enzym bindet, und es muss durch eine Bindung, welche das Enzym aufspaltet, an das fluoreszierende Produkt konjugiert sein. Für andere Enzymreaktionen so wie einige Peroxidasereaktionen, in welchen zur Bildung des Produkts lediglich eine chemische Umwandlung des Substrats stattfindet, handelt es sich bei geeigneten Substraten um solche, welche dafür Sorge tragen, dass das Produkt in das Aufteilungselement aufgeteilt wird.
Es wird erkannt werden, dass die vorliegende Erfindung dazu verwendet werden kann, das Vorhandensein von mehr als einem Enzym zu detektieren, was mehr als einer Spezies oder mehr als einem Stamm von Mikroorganismen zur gleichen Zeit entsprechen kann. Dies erfordert die Verwendung eines Substrats, welches für jedes in Frage kommende Enzym geeignet ist. Fluoreszieren die fluoreszierenden Produkte einer jeden unterschiedlichen Enzym-Substrat-Reaktion mit unterschiedlichen Wellenlängen, so kann die Aktivität eines jeden in Frage kommenden Enzyms detektiert werden. Alternativ dazu kann, in dem Fall, dass die fluoreszierenden Produkte einer jeden unterschiedlichen Enzym-Substrat-Reaktion mit der gleichen Wellenlänge fluoreszieren, die Aktivität wenigstens eines einzigen der Enzyme detektiert werden.
In bevorzugten Ausführungsformen handelt es sich bei Enzymen, auf welche die vorliegende Erfindung abzielt, um β-Glucuronidase (glu) und β-Galaktosidase (gal). In solchen Ausführungsformen stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren bereit zur Detektion des Vorhandenseins von E. coli einschließlich seiner verschiedenen Stämme (z. B. ATCC 25922; ATCC 35150 Serotyp O157:H7) ebenso wie des Bestands Nr. 413, E. coli Typ B (Queen's University at Kingston, Kingston, Ontario, Kanada) und der Abwasserisolatbestände Nrs. KS1 und KS2 (Kingston) (siehe Beispiel 6) sowie anderer Mikroorganismen, so wie z. B. Enterobacter cloacae (ATCC 13047), Citrobacter freundii (ATCC 8090), Klebsiella pneumoniae (ATCC 13883), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) und Gesamt Coliforme in Proben so wie Wasser oder Nahrungsmitteln.
Bei geeigneten Substraten für β-glu und β-gal handelt es sich um beliebige Substrate mit einem Glucuronid- bzw. einem Galaktosidrest, wobei der Begriff „Glucuronid" jegliche Salze und freie Säuren davon einschließen soll. Beispiele für geeignete Substrate schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf:
Pyren-β-D-Glucuronid (z. B. 1- oder 2-Pyrenyl-β-D-Glucuronid);
Anthracen-β-D-Glucuronid (z. B. 1-, 2- oder 9-Anthracenyl-β-D-Glucuronid);
Pyrromethen-β-D-Glucuronid (z. B. 1-Hydroxymethyl-3,5,7-
Trimethylpyrromethendifluorborat-β-D-Glucuronid);
Pyren-β-D-Galaktopyranosid (z. B. 1- oder 2-Pyrenyl-β-D-Galaktopyranosid); und
Anthracen-β-D-Galaktopyranosid (z. B. 1-, 2- oder 9-Anthracenyl-β-D-Galaktopyranosid).
So wird z. B. β-glu-Aktivität mit Pyren-β-D-Glucuronid (pyr-glu) detektiert, wobei es sich bei dem detektierten Produkt um Hydroxypyren (HP) handelt, wie in dem nachfolgenden Reaktionsschema gezeigt ist:
Wird die β-glu-Aktivität mit Anthracen-β-D-Glucuronid (ant-glu) detektiert, so handelt es sich bei dem detektierten Produkt um Hydroxyanthracen, wie in dem nachfolgenden Reaktionsschema gezeigt ist:
Wird die β-glu-Aktivität mit Pyrromethen-β-D-Glucuronid detektiert, so handelt es sich bei dem detektierten Produkt um Hydroxypyrromethen, wie in dem nachfolgenden Reaktionsschema gezeigt ist:
Wird die β-gal-Aktivität mit Pyren-β-D-Galaktopyranosid (pyr-gal) detektiert, so handelt es sich bei dem detektierten Produkt um Hydroxypyren (HP), wie in dem nachfolgenden Reaktionsschema gezeigt ist:
Die Beispiele 15 bis 19 stellen Syntheseverfahren für eine Reihe dieser Substrate und deren Zwischenprodukte bereit.
Gemäß einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine optische Sonde zur selektiven Detektion von fluoreszierenden Molekülen bereitgestellt. Insbesondere sorgt die optische Sonde für die Aufteilung der Moleküle in die Sonde, wobei es sich bei der detektierten Fluoreszenz in der Hauptsache um die der in die Sonde aufgeteilten Moleküle handelt. Eine solche Aufteilung von Molekülen wird erreicht, indem man an einem Ende der optischen Sonde ein Aufteilungselement vorsieht. Nur ein relevantes Molekül kann in das Aufteilungselement aufgeteilt werden.
So stellt die vorliegende Erfindung z. B. zur Detektion der Enzymaktivität unter Verwendung eines fluorogenen Substrats sowie eines fluoreszierenden Enzym-Substrat-Produkts eine optische Sonde bereit, welche ein Aufteilungselement aufweist, das es nur den Molekülen des Substrats oder des Produkts gestatten, sich darin aufzuteilen, so dass die Fluoreszenz von entweder dem Substrat oder dem Produkt detektiert wird. Folglich ist es nicht von Bedeutung, ob es sich sowohl bei dem Substrat als auch bei dem Produkt um fluoreszierende Substanzen handelt, da die optische Sonde lediglich die Fluoreszenz einer der beiden Substanzen detektiert. Die Enzymaktivität kann dann bestimmt werden, indem der Grad der Abnahme der Fluoreszenz des Substrats oder der Grad der Zunahme der Fluoreszenz des Produkts gemessen wird. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Produktmoleküle in das Aufteilungselement aufgeteilt und die Enzymaktivität wird bestimmt, indem der Grad der Zunahme der Fluoreszenz des Produkts gemessen wird. Wie zuvor festgestellt, kann die Detektion der Enzymaktivität gemäß der vorliegenden Erfindung in jedem beliebigen Medium durchgeführt werden, in welchem Zielenzyme aktiv sind. Im Allgemeinen sind solche Medien wässrig und es kann sich dabei um Fluids (z. B. Flüssigkeiten) oder halbfeste Substanzen (z. B. biologische Gewebe, Gels) handeln.
Gemäß einer Ausführungsform, welche in 1 schematisch dargestellt ist, umfasst eine optische Sonde 2 gemäß der vorliegenden Erfindung einen optischen Wellenleiter, so wie eine optische Faser, an dessen einem Ende ein Aufteilungselement 3 vorgesehen ist. Eine Anregungslichtquelle 4 und ein Spektrometer 6 oder eine andere geeignete Vorrichtung zur Detektion von Licht sind über einen Koppler 7 an das gegenüber liegende Ende der optischen Faser gekoppelt, so dass der Weg des Lichts von der Lichtquelle 4 zu dem Aufteilungselement 3 verläuft und das von dem Aufteilungselement 3 empfangene Licht an einen optischen Detektor 6 (z. B. ein Spektrometer oder eine CCD-Vorrichtung) weitergeleitet wird. Die Wellenlänge der Lichtquelle 4 wird so gewählt, dass sie geeignet zur Anregung der relevanten fluoreszierenden Zielmoleküle ist, und liegt für biologische Moleküle üblicherweise im ultravioletten (UV) Bereich. Die vorliegende Erfindung kann jedoch auch auf andere Wellenlängen und Zielmoleküle angewandt werden. Beispiele für geeignete Anregungslichtquellen sind Leuchtdioden (LED), Laserdioden und Laser. In einer alternativen Ausführungsform ist die Anregungslichtquelle 4 getrennt von der Sonde, so dass der Koppler 7 nicht benötigt wird. Die Auswahl der Anregungswellenlänge, welche spezifisch für das Zielmolekül ist, und/oder die Überwachung der Emissionswellenlänge, welche für das Zielmolekül spezifisch ist, verbessert die Spezifität und Sensitivität der Detektion.
In dem Beispiel aus 1 ist die Sonde 2 in einer Probenlösung 8 eingetaucht, welche die Substratmoleküle 10 und das Zielenzym 12 oder das Zielenzym 12 tragende Zellen (z. B. Mikroorganismen) enthält. Werden Zellen verwendet, so wird zur Zelladhäsion optional eine Membran 18 bereitgestellt. Die Substratmoleküle 10 werden durch das Zielenzym 12 in Produktmoleküle 14 und fluoreszierende Produktmoleküle (d.h. Zielmoleküle) 16 umgewandelt. Das Aufteilungselement 3 sorgt dafür, dass sich entweder die Substratmoleküle oder die fluoreszierenden Produktmoleküle darin aufteilen, vorzugsweise letzteres. Folglich teilen sich die Produktmoleküle 16 in dem Aufteilungselement auf, woraufhin sie mit Anregungslicht aus der Lichtquelle bestrahlt werden. Die von den Zielmolekülen 16 emittierte Fluoreszenz wird durch das Spektrometer 6 oder eine andere geeignete Vorrichtung detektiert.
Gemäß einer Ausführungsform umfasst das Aufteilungselement der optischen Sonde einen auf einem Ende der optischen Faser vorgesehenen Polymerfilm, so dass die optische Öffnung dieses Endes der Faser abgedeckt wird. Bei 2A handelt es sich um eine Photomikrographie einer solchen faseroptischen Sonde mit einer optischen Faser von 600 μm im Durchmesser (siehe Beispiel 1). Die Eigenschaften des Polymermaterials, so wie das Molekulargewicht und der Grad an Kreuzvernetzung, welche die physikalischen Eigenschaften des Polymers (z. B. Viskosität und Härte (Shore A)) bestimmen, werden so gewählt, dass sie in selektiver Art und Weise für die Aufteilung eines relevanten fluoreszierenden Moleküls sorgen.
In einer bevorzugten Ausführungsform, welche in 2B schematisch gezeigt ist, umfasst die optische Sonde 100 ein kugelförmiges Aufteilungselement 104, welches an einem Ende einer optischen Faser befestigt ist. Die optische Faser weist einen Kern 102a, eine Beschichtung 102b und eine Ummantelung 102c auf. Die optische Faser schließt zum leichten Anschluss an in Verbindung stehende Vorrichtungen an ihrem anderen Ende mit einem geeigneten Anschlussstecker ab, so wie einem SMA-Stecker (nicht gezeigt). Das kugelförmige Aufteilungselement kann in verschiedenen Größen mit unterschiedlicher Härte unter Verwendung von verschiedenen Polymerformulierungen hergestellt werden. Im Allgemeinen können Aufteilungselemente zwischen etwa 0,2 mg und etwa 3,0 mg verwendet werden. Vorzugsweise entspricht der Durchmesser des kugelförmigen Aufteilungselements im Wesentlichen dem Durchmesser der verwendeten optischen Faser. Die Erfinder haben gefunden, dass eine optische Faser von 600 Mikron eine gute Leistung erbringt, wenn sie mit einem kugelförmigen Aufteilungselement mit im Wesentlichen identischem Durchmesser ausgestattet ist. Durch die Befestigung eines halbkugelförmigen (d.h. hemisphärischen) Aufteilungselements an die optische Faser kann die Leistung weiter verbessert werden, da dies das Volumen des Aufteilungselements verringert, ohne den Kugeldurchmesser zu beeinträchtigen.
Wie in 2B gezeigt ist, wird eine starre Röhre 106, z. B. aus Edelstahl, verwendet, um den Faserkern 102a und das Anschlussstück Kugel-Faser 108 zu schützen. Aufgrund seiner Stärke und seiner nichtrostenden Eigenschaften handelt es sich bei Edelstahl um ein bevorzugtes Material für die starre Röhre 106. Das Anschlussstück Kugel-Faser 108 wird aus einem Polymermaterial hergestellt, welches im Wesentlichen die gleichen Eigenschaften, so wie Brechungsindex, aufweist wie das Aufteilungselement 104, und wird dazu verwendet, die Kugel 104 an der optischen Faser und der starren Röhre zu befestigen. Das Polymeranschlussstück sollte das Ende der starren Röhre verschließen, um zu verhindern, dass zwischen der Röhre, der Faserbeschichtung und der Ummantelung irgendeine Flüssigkeit eindringt. Verfahren zur Herstellung einer solchen faseroptischen Sonde werden im nachfolgenden Beispiel 19 bereitgestellt.
In einer Ausführungsform, welche zur Detektion von Hydroxypyrenproduktmolekülen in einer wässrigen Lösung unter Verwendung von beispielsweise dem zuvor besprochenen pyr-glu-Substrat geeignet ist, besteht das Aufteilungselement aus einem transparenten, hydrophoben Polydimethylsiloxan (PDMS)-Elastomer. Hydroxypyren verteilt sich aus wässriger Lösung in PDMS, wohingegen sich das pyr-glu-Substrat nicht in PDMS verteilt. Folglich wird die Fluoreszenz von Hydroxypyren durch die optische Sonde detektiert. Der Grad der Zunahme an Hydroxypyren in dem PDMS-Film steht in linearer Beziehung zu der Konzentration von Enzym in der Probenlösung, so dass die Überwachung des Signals von der optischen Sonde aufgetragen gegen die Zeit ein Maß für die Enzymaktivität bereitstellt.
Beispiele für drei geeignete PDMS-Materialien mit unterschiedlichen Molekulargewichten und unterschiedlichen Graden der Kreuzvernetzung sind GE RTV118 (General Electric), Sylguard 186 (Dow) und Sylguard 184 (Dow). Für Polymere, welche in Form eines Vormaterials und eines Aushärtungsmittels geliefert werden, können Variable so wie das Verhältnis von Vormaterial und Aushärtungsmittel, die Aushärtungsbedingungen und dergleichen so angepasst werden, dass die physikalischen Eigenschaften des Polymers beeinflusst werden. Andere Polymere, so wie GE RTV118 werden bereits in fertig gemischtem Zustand geliefert und polymerisieren, wenn sie der Luft ausgesetzt werden.
Beispiele für andere Materialien, welche für das Aufteilungselement geeignet sind, schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf: Sol-Gels, Harze, Gels, Zusammensetzungen, Sorptionsmittel, Polymere außer PDMS, Polyurethane, Polyacrylate sowie molekular geprägte Filme.
Um das Detektionslimit zu optimieren (d.h. die Aktivität des Zielenzyms bei einer minimalen Enzymkonzentration in der Probe zu detektieren oder die Fluoreszenz des Zielmoleküls bei einer minimalen Konzentration in der Probe zu detektieren) sollte das Volumen des Aufteilungselements in der optischen Öffnung der Faser maximiert werden, während zur Minimierung der Antwortzeit der Querschnitt des Aufteilungselements begrenzt sein sollte.
Handelt es sich z. B. bei dem Aufteilungselement um einen Film (z. B. 2A), so sollte der Querschnitt des Elements etwa 400 μm bis etwa 800 μm, vorzugsweise etwa 500 μm bis etwa 700 μm, betragen und die Dicke sollte geringer als etwa 800 μm, vorzugsweise geringer als etwa 600 μm sein. Ein Aufteilungselement mit einer zufrieden stellenden Leistung zur Detektion eines gegebenen Ziel (d.h. Produkt- oder Substrat-)-Moleküls wird einen Kompromiss aus diesen Eigenschaften verkörpern. Die Leistung kann weiter verbessert werden, indem man das Aufteilungselement aus Polymerfilm in der Form eines Kegels, einer Kugel oder einer Halbkugel ausbildet. Dies erhöht dadurch die Selektivität der Sonde, dass eine Detektion von Zielmolekülen, welche nicht in den Polymerfilm aufgeteilt wurden, unterbleibt, was das Hintergrundsignal einer Probe begrenzt.
So schließen z. B. Strategien zur Minimierung der Detektionszeit eine Reduzierung der Inkubationszeit der Zellen durch Optimierung der Wachstumsbedingungen (z. B. Temperatur, Nährmedium) sowie eine Reduzierung der Anzahl von Zellen ein, welche von dem Aufteilungselement/der optischen Sonde zur Erzeugung eines Signals benötigt werden. Letzteres kann dadurch erreicht werden, dass man eines oder mehrere Kompatibilitätskriterien der Anregungslichtquelle und des Detektors für das Produkt, der Rate der Umwandlung von Substrat in Produkt durch Zellen sowie des Aufteilungselements für das Produkt optimiert. Es wird erwartet, dass eine solche Optimierung der vorliegenden Erfindung zu einer 3- bis 4-fachen Verbesserung (Reduktion) der Detektionszeit für eine einzelne Zelle führt, bis hin zu 2-4 h.
Während die Beschreibung detaillierte Ausführungen in Bezug auf fluoreszierende Zielmoleküle enthielt, wird doch erkannt werden, dass die vorliegende Erfindung zur Detektion der Enzymaktivität und des Vorhandenseins von Mikroorganismen durch anderes Licht als Fluoreszenz, so wie z. B. Biolumineszenz oder Chemilumineszenz, angewandt werden kann, vorausgesetzt dass die biolumineszenten oder chemilumineszenten Zielmoleküle (Substrate oder Produkte) in ein Aufteilungselement der optischen Sonde aufgeteilt werden können.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein automatisches System zur Detektion von Enzymaktivität bereitgestellt. So kann z. B. ein automatisches System gemäß der vorliegenden Erfindung dazu verwendet werden, Glucuronidase- und/oder Galaktosidaseaktivität in Wasser-, Nahrungsmittel- oder Erdproben zu detektieren, oder zur Detektion von E. coli und Gesamt Coliformen, wenn die geeigneten Substrate verwendet werden, wie zuvor im Detail beschrieben wurde. Eine Ausführungsform des automatischen Systems ist in den 3A und B schematisch dargestellt. Das System umfasst mindestens eine optische Sonde 3, welche wie bereits zuvor beschrieben aus einer optischen Faser 2 gefertigt ist, mit einem Aufteilungselement sowie assoziierten optischen Komponenten so wie einer geeigneten Lichtquelle 4, einem Spektrometer 6 oder anderen Vorrichtungen zur Detektion von Licht (z. B. ladungsgekoppelte Vorrichtungen), einem Bündel optischer Fasern 7, einem Anschlussstück 8, einem Koppler 5 und dergleichen, einem Gefäß 26 (Probeninkubator) mit einem Probeneinlass und einem Abfallauslass, geeigneter Hardware (z. B. Pumpen, Ventile und dergleichen; nicht gezeigt) sowie einer Steuerungseinheit/Computerschnittstelle 22, welche zur Steuerung beispielsweise der Zugabe von Substrat(en) in den Probeninkubator oder des Probenflusses mit der optischen Sonde und dem Probeninkubator verbunden ist. Das automatische System kann des Weiteren mit einer oder mehreren zusätzlichen Sonden 28 zur Überwachung von Variablen so wie Temperatur, Chlorkonzentration, pH-Wert und Trübheit der Probe ausgestattet sein, da diese Variablen die Dauer und die Signalschwelle der E. coli- und Gesamt Coliformen Tests beeinflussen kann. Die Computerschnittstelle 22 steuert den Betrieb des Systems und dient der Erfassung und Anzeige von Daten in Bezug auf das Vorhandensein/die Abwesenheit von relevanten Enzymen, und damit auch relevanten Mikroorganismen. In manchen Anwendungen des automatischen Systems, so wie wenn das System zur Beobachtung des Vorhandenseins von E. coli und/oder Gesamt Coliformen in Wasser verwendet wird, kann die Computerschnittstelle so konfiguriert sein, dass sie den Wasserfluss einstellt, falls es vorkommt, dass solche Mikroorganismen detektiert werden.
Wie in 3A zu sehen ist, umfasst das System eine Optikgruppe, welche das Anregungslicht von einer Lichtquelle zur optischen Sonde/zum Aufteilungselement leitet und die Fluoreszenz von einer optischen Sonde zu einer Licht detektierenden Vorrichtung so wie einem Spektrometer oder einer ladungsgekoppelten Vorrichtung (CCD) leitet. In einer Ausführungsform handelt es sich bei der Optikgruppe um ein gegabeltes Faserbündel, d.h. eine erste optische Faser, an einem Ende gekoppelt an Enden der zweiten und dritten optischen Faser, wobei die zweite Faser mit der Lichtquelle und die dritte Faser mit der Licht detektierenden Vorrichtung assoziiert ist. Optional wird ein entsprechendes Brechungsindexfluid in dem Bereich der Kopplung der drei Fasern vorgesehen, um Streulicht zu reduzieren. Vorzugsweise sind alle in 3A gezeigten Komponenten außer der optischen Sonde in einem gemeinsamen Gehäuse oder einer gemeinsamen Verkleidung untergebracht.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der ersten optischen Faser um eine 600 Mikron-Faser (z. B. AS600/660UVPI, erhältlich von FiberTech Optika, Kitchener, Ontario, Kanada), eine Low-OH-Faser mit einer Polyimidbeschichtung und einer Nylonummantelung. Diese Faser schließt zur Verbindung mit der optischen Sonde an einem Ende mit einem geeigneten Anschlussstück, so wie einem SMA-Adapter, ab. Das andere Ende der ersten Faser ist mit der zweiten und dritten Faser gekoppelt. Die zweite und dritte Faser können den gleichen Durchmesser aufweisen wie die erste Faser, wenngleich die Verwendung von Fasern mit geringerem Durchmesser (z. B. 300 oder 400 Mikron Core) für die zweite und die dritte Faser zu einer besseren Kopplung führt. Insbesondere stellt die Verwendung von 400 Mikron Core (FiberTech Optika, AS400/440UVPI), eine Low-OH-Faser mit einer Polyimidbeschichtung und einer Nylonummantelung, für die zweite und dritte Faser eine sehr gute Leistung bereit, wenn diese an die erste 600 Mikron-Faser gekoppelt wird. Die Kopplung von Anregungslicht, so wie UV-Licht, in das freie Ende der zweiten Faser wird dadurch verstärkt, dass eine Linse zwischen dem Ende der Faser und der Lichtquelle angeordnet wird. In einer Ausführungsform handelt es sich bei der Linse um eine kugelförmige Linse, so wie eine Saphirkugellinse, erhältlich von Melles Griot, Ottawa, Ontario, Kanada). Das freie Ende der dritten Faser wird an die Licht detektierende Vorrichtung gekoppelt. In Ausführungsformen, in welchen es sich bei der Licht detektierenden Vorrichtung um einen CCD handelt, wird das freie Ende der dritten Faser nach einem oder mehreren Pixels auf der CCD ausgerichtet, und zwar durch einen optischen Long-Pass-Filter, welcher Licht der Wellenlänge der Lichtquelle am Erreichen der CCD hindert.
Ein automatisches System zur Kontrolle von Wasser hinsichtlich des Vorhandenseins von Mikroorganismen kann in Einfamilienhäusern, Schulen, Krankenhäusern, kommunalen Gebäuden etc. und insbesondere in solchen Wohngebäuden und Institutionen mit Brunnenschächten sowie in kommunalen oder städtischen Gewässernetzen installiert werden. In den letztgenannten ist zu erwarten, dass automatische Systeme an der Wasserquelle (z. B. Wasseraufbereitungsanlage), an Pumpstationen sowie an verschiedenen Knotenpunkten innerhalb des Verteilernetzes installiert würden und dass jedes automatische System unter Verwendung von geeigneter Kommunikationshardware/-software 24 (siehe 3B) an ein Kommunikationsnetz angeschlossen würde. Solche automatischen Systeme würden z. B. in dem Fall, dass eine Kontamination gewisse Grenzwerte erreicht und dass eine Kontamination innerhalb des Netzes detektiert wird, Echtzeitinformation so wie Warnsignale mit Toleranzbereichen bei unterschiedlichen Dringlichkeitsstufen an das Bedienungspersonal senden. Das System wäre ebenfalls dazu in der Lage, die Verteilung von kontaminiertem Wasser an einem oder mehreren betroffenen Knotenpunkten abzusperren. Zur leichteren Installation in neuen oder bereits existierenden Wasserverteilungssystemen wird das automatische System vorzugsweise in einer kompakten Konfiguration unter Verwendung kompakter Vorrichtungen (z. B. ein Leuchtdioden (LED)-Lichtquellen-CCD-Spektrometer) bereitgestellt.
In einer Ausführungsform handelt es sich bei dem System um eine automatische Samplereinheit, welche eine Testkartusche mit einem integrierte Aufteilungselement anwendet, welche dazu in der Lage ist Schätzwerte in Bezug auf Vorhandensein/Abwesenheit sowie bakteriologische Zählungen für ein breites Spektrum an Pathogenen auszugeben, einschließen, jedoch nicht beschränkt auf, E. coli und Gesamt Coliforme Bakterien. Bei der Testkartusche handelt es sich vorzugsweise um eine Einwegkartusche zum einmaligen Gebrauch. Das System basiert auf den zuvor beschriebenen Prinzipien, verwendet jedoch an Stelle einer optischen Sonde eine Kartusche mit integriertem Aufteilungselement, in welchem einzelne Proben enthalten sind. Das Aufteilungselement bringt multiple Proben nicht miteinander in Kontakt, wie dies bei einer optischen Sonde geschehen könnte, wodurch eine potentielle Quelle der Kreuzkontamination unter den Proben ausgeschaltet wird. Dieses Design macht es ebenfalls unnötig, eine optische Sonde zwischen den Tests zu reinigen. In einer bevorzugten Ausführungsform schließt das System ein auf multiplen Fluorophoren basierendes Kalibrierungsverfahren ein, das eine kontinuierliche Überwachung der Integrität des Lichtweges sowie Selbstkalibrierung bereitstellt. Optional bietet das System Möglichkeiten zur Durchführung multipler Tests für unterschiedliche Pathogene.
Die Testkartusche beinhaltet Elemente, welche zur Durchführung eines bakteriologischen Tests für ein spezifisches Zielpathogen erforderlich sind, einschließend, jedoch nicht beschränkt auf, E. coli- und Gesamt Coliforme Bakterien. Wie in 3C gezeigt ist, umfasst die Testkartusche 200 ein versiegeltes Gehäuse 202, welches einen sterilen Innenraum umschließt und mittels einer einfachen Mechanik in einem automatischen System einfach zu handhaben ist. Das Aufteilungselement 204 sowie ein Testmedium in entweder pulverisierter oder flüssiger Form sind innerhalb des Gehäuses 202 enthalten.
Das Testmedium umfasst eines oder mehrere Glucuronid- oder Galaktosidsubstratmaterialien, wobei ein jedes der Substratmaterialien ein Zielfluorophor enthält, wie zuvor bereits beschrieben wurde. Des Weiteren umfasst das Testmedium ein zweites Fluorophor (d.h. ein Kalibrierungsfluorophor), welches sich in einer wässrigen Umgebung auflöst und so ein optisches Grundliniensignal zur Kalibrierung und Überwachung der Integrität des optischen Signalwegs bereitstellt, sowie ein Wachstumsmedium zur Förderung des Wachstums des/der Zielorganismus/-organismen. Das Testmedium kann optional umfassen: Natriumthiosulfat zur Entfernung von freiem Chlor aus einer Wasserprobe; ein Antibiotikum zur Inhibition des Wachstums von Nicht-Ziel-Mikroorganismen; sowie eine Komponente, welche in der Anwesenheit des Zielpathogens reagiert und so eine Farbveränderung als visuelle Bestätigung der Anwesenheit des Zielpathogens in der Probe hervorruft.
Wie in 3C gezeigt ist, wird eine Öffnung oder ein Anschluss 206 in dem Gehäuse 202 durch eine Membran oder ein Septum bedeckt, welches das Einbringen einer Probe in die Kartusche in einer Art und Weise gestattet, welche die sterile Umgebung innerhalb des Gehäuses bewahrt; z. B. durch Injektion einer Probe durch das Septum unter Verwendung einer Kanüle. Ebenso ist in dem Gehäuse 202 eine Ausrichtungs- oder Indexierungsmarkierung 208 angeordnet, welche automatisch erkannt werden kann (z. B. optoelektronisch), um die Handhabung und Orientierung der Kartusche durch das automatische System zu ermöglichen (z. B. eine korrekte Ausrichtung der Öffnung 106 zur Injektion einer Probe zu ermöglichen), zur Identifizierung der Kartusche (z. B. Identifizieren des Typs des darin enthaltenen Testmediums), was es der Samplereinheit gestattet, sich an unterschiedliche Arten von Tests für eine Vielzahl von Zielpathogenen anzupassen. Die Kartusche ist des Weiteren optional mit Rippen, Kanälen oder -Erhebungen 210 auf einer oder mehreren ihrer inneren Oberflächen ausgestattet, um die Durchmischung der Probe zu ermöglichen, wenn die Kartusche rotiert oder geschüttelt wird.
In 3D ist ein Magazin 220 zur Aufnahme einer Vielzahl von Testkartuschen 200 gezeigt, welches eine Feder 222 oder dergleichen aufweist, um die Kartuschen in die Richtung eines seiner Enden zu drücken. 3E ist eine schematische Darstellung einer Ausführungsform einer automatischen Samplervorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung. Die Vorrichtung umfasst eine Halterung 230 zur Aufnahme einer oder mehrerer Testkartuschen 200 in einer Testkammer. Die Testkartusche kann entweder manuell oder automatisch aus einem Magazin wie dem in 3D gezeigten in die Halterung geladen werden. Die in das Magazin geladenen Testkartuschen können entweder auf lediglich eine Art von Zielpathogen ausgerichtet sein, oder es kann eine Mischung von Testkartuschen für verschiedene Zielorganismen verwendet werden. So können Testkartuschen z. B. auf E. coli oder eine Kombination aus E. coli- und Gesamt Coliformen Bakterien und möglicherweise auch auf andere Pathogene ausgerichtet sein. Der Indikator 208 auf der Testkartusche, zusammen mit einem optoelektronischen Test-/Ausrichtungssensor 232, gestattet es der Vorrichtung, zwischen verschiedenen Kartuschen zu unterscheiden. Die Halterung 230 weist Stützrollen 234, 236 zum Halten, Rotieren und/oder Schütteln der Kartusche 200 über einen Antriebsmotor 238 auf. Die Vorrichtung kann ebenfalls einen Probeninjektor 240 einschließen, welcher eine Wasserprobe oder eine andere Probe durch die Aufnahmeöffnung 206 in die Kartusche injiziert. Alternativ dazu können die Kartuschen mit Proben injiziert werden, bevor sie in das Magazin geladen werden. Die Vorrichtung kann ebenfalls ein Heizsystem 260 zur Probeninkubation einschließen, in welchem z. B. erwärmte Luft durch die Halterung 230 geleitet wird.
Die Vorrichtung schließt eine Optik zur Detektion des relevanten Fluorophors ein (z. B. ein Fluorophor, welches bei der Degradation des Substrats durch die Wirkung des Zielenzyms produziert wird. Zusammen mit dem Aufteilungselement funktioniert diese Optik nach dem gleichen Prinzip wie bereits zuvor beschrieben, und der Lichtweg wird durch die gepunkteten Linien in 3E dargestellt. Folglich schließt die Vorrichtung eine Lichtquelle 242 so wie eine UV-Lichtquelle ein, welche zur Bestrahlung des Aufteilungselements 204 der Kartusche 200 dient, sowie einen optischen Detektor 244 so wie eine CCD zur Detektion der Fluoreszenz des Zielfluorophors, welches in das Aufteilungselement aufgeteilt wurde. Die Vorrichtung kann des Weiteren eine Optik zur Bestrahlung und Detektion des zuvor erwähnten Kalibrierungsfluorophors einschließen, um ein optisches Grundliniensignal zur Kalibrierung und/oder Überwachung der Integrität des Lichtwegs bereitzustellen. In einer solchen Ausführungsform muss die von dem Target produzierte Fluoreszenz differenziert und detektiert werden. Daher sind z. B. in dem Lichtweg zur Detektion der von dem Aufteilungselement emittierten Fluoreszenz ein Lichtteiler 250 und ein Spiegel 252 angeordnet, welche den Lichtweg in zwei Kanäle aufspalten. Jeder Kanal wird unter Verwendung eines optischen Filters 254, 256 auf der Wellenlänge des relevanten Fluorophors (d.h. den Ziel- und Kalibrierungsfluorophoren) gefiltert und die gefilterten optischen Signale werden detektiert.
Optional schließt die Vorrichtung eine Bedienungskonsole ein, um es dem Bediener zu ermöglichen, den Betrieb der Vorrichtung zu steuern, sowie eine Vorrichtung zur Erfassung/Verarbeitung/Anzeige von Daten und eine Fernsteuerungsschnittstelle (z. B. über das Internet oder mittels Telemetrie), um es zu ermöglichen, dass die Vorrichtung mit überwachenden Kontroll- und Steuerungs-, Datenerfassungs- und Diagnosesystemen verbunden wird, welche üblicherweise als SCADA-Systeme bezeichnet werden.
Die automatische Wasserprobeneinheit der vorliegenden Erfindung weist einige Eigenschaften auf, welche die Verlässlichkeit des Detektionsergebnisses gewährleisten. So verwendet z. B. die Testkartusche, wie zuvor erwähnt, ein zusätzliches fluoreszierendes Molekül (d.h. das Kalibrierungsfluorophor) auf. Dies ermöglicht in geeigneter Weise die Kalibrierung des Aufteilungselements einer jeden Testkartusche und optischen Komponente des Systems. Eine weitere zweckdienliche Funktion des Kalibrierungsfluorophors ist die Bereitstellung einer kontinuierlichen Überwachung der Integrität des Lichtwegs während des gesamten Testverlaufs, da eine Unterbrechung des Lichtwegs dazu führen könnte, dass die Lumineszenz des Detektionsfluorophors nicht detektiert wird, was wiederum zu einem falschen negativen Ergebnis führen würde. Die Integrität des Lichtwegs wird durch die Verwendung eines CCD-basierten Detektors gewährleistet, wobei die Bestrahlung über multiple Pixels auf dem CCD-Array für die Redundanz der Detektion sorgt.
Das System kann optional eines oder mehrere Elemente der nachfolgenden Aufzählung aufweisen:

1. Erneutes Testen einer Probe bei Erhalt eines positiven (nachteiligen) Ergebnisses.
2. Injektion von Chlor in eine getestete Wasserprobe, um das Potential für eine Biogefährdung in einer nachteiligen Wasserprobe zu reduzieren.
3. Einbringen eines Farbstoffindikators in das Substrat, um eine visuelle Bestätigung einer nachteiligen Wasserprobe bereitzustellen.
4. Verwendung von optischen Freiraum-Abtasttechniken, um das von dem in der Testkartusche eingebetteten Aufteilungselement ausgehende optische Signal zu erhalten, oder die Verwendung eines polierten faseroptischen Segments, um eine durch Reibung kraftschlüssige Schnittstelle zu dem Aufteilungselement bereitzustellen.
5. Einbeziehung von multiplen Testkammern innerhalb einer Vorrichtung, bestehend aus Probeninjektoren, Heizsystemen und optischen Detektoren für das Aufteilungselement, welche die parallele Durchführung von multiplen Tests gestatten – entweder zur Bereitstellung einer zeitlichen Kaskadierung der Proben (z. B. alle 2 oder alle 4 Stunden) oder zur Bereitstellung von multiplen Zielpathogentests (z. B. E. coli und Gesamt Coliforme im simultanen Ablauf auf der gleichen Vorrichtung).

Die nachfolgende Aufzählung ist beispielhaft für die wichtigsten Schritte, welche von einer automatischen Wasserprobeneinheit (AWSU, automated water sampler unit) gemäß der vorliegenden Erfindung während eines Testzyklus durchgeführt werden:

1. Unter Verwendung des Bedienfelds oder durch einen ferngesteuerten Aktivierungsbefehl durch die SCADA-Schnittstelle wird ein Testzyklus aktiviert.
2. Die Testkammer wird auf die erforderliche Temperatur (z. B. 35 bis 42°C) vorgeheizt.
3. Eine Testkartusche wird aus dem Kartuschenmagazin ausgewählt und in die Testkammer geladen.
4. Die Testkartusche wird mittels einer Walzenmechanik eingerastet, welche die Kartusche rotiert, um sie auszurichten und für kräftige Bewegung während des gesamten Testzyklus zu sorgen.
5. Die Kartusche wird unter Verwendung des Ausrichtungs-/Test-ID-Indikators ausgerichtet, um das Septum an den Nadelinjektor anzupassen.
6. Eine Wasserprobe mit dem erforderlichen Volumen (z. B. 100 ml) wird (nach dem Abfluss von verbleibendem Restwasser in der Probenreihe) in die Testkartusche injiziert. Zur Abmessung des erforderlichen Probenvolumens wird ein lineares Durchflussmessgerät verwendet.
7. Der Nadelinjektor wird unter Verwendung einer Chlor- oder Alkohollösung gereinigt und sterilisiert.
8. Es wird ein interner Timer aktiviert und ein SCADA-Signal mit dem ID des Testtyps und der Probeninitiierungszeit wird gegeben.
9. Die Testkartusche wird kontinuierlich rotiert, um zu gewährleisten, dass das Substrat aufgelöst und mit der Testwasserprobe vermischt wird.
10. Die Wasserprobe löst das Substratgemisch einschließlich der wasserlöslichen Kalibrierungsfluorophore auf.
11. Der Lichtweg wird aktiviert und hinsichtlich Grundlinienanzeichen der Kalibrierungsfluorophore überwacht.
12. Die Rotation und kräftige Bewegung der Probe wird für einen Testzeitraum von bis zu 20 Stunden beibehalten.
13. Während des gesamten Testzeitraums wird der Lichtweg hinsichtlich der Indikation sowohl des Kalibrierungsfluorophors (zur kontinuierlichen Überwachung der Integrität des Lichtwegs) als auch des Zielfluorophors (zur Indikation des Vorhandenseins des Zielpathogens in der Wasserprobe) überwacht.
14. Daten zum Status des Lichtwegs, der Pathogendetektion und der Diagnose werden zur Erfassung und zum Bericht in regelmäßigen Intervallen durch den SCADA-Datenkanal gesandt.
15. Warnsignale für das Vorhandensein und die geschätzte Zahl des Zielpathogens werden akustisch und visuell auf dem Frontpaneel der Einheit gegeben und werden zur Erfassung, zum Bericht und für Handlungen des Bedieners durch den SCADA-Datenkanal gesandt.
16. Am Ende des Testzeitraums wird die Probentestkartusche in einen Abfallbehälter ausgeworfen und das System wird zur Durchführung eines weiteren Tests zurückgesetzt.

In Übereinstimmung mit einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Kit zur Detektion der Enzymaktivität bereitgestellt. Das Kit umfasst eine optische Sonde, damit assoziierte optische Komponenten und optional weitere Komponenten so wie einen Inkubator, wie zuvor beschrieben, und ist vorzugsweise kompakt und kostengünstig, so dass es für Einzelpersonen wie Heimanwender, welche Wasser oder andere Proben hinsichtlich des Vorhandenseins von Mikroorganismen so wie E. coli und Gesamt Coliforme testen und überwachen möchten, anwendbar und erschwinglich ist.
In noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Messung der Enzymaktivität mit einem enzymgebundenen Immunoassay (EIA) gekoppelt, welcher die Detektion eines breiten Spektrums an Zielspezies, ohne Einschränkung einschließend chemische und mikrobiologische Kontaminanten in Proben, z. B. in Wasser, gestattet. Der enzymgebundene Immunosorbent-Assay (ELISA) ist eine bevorzugte Ausführungsform. Die Spezifität und Selektivität bei der Erkennung der Zielspezies werden durch den in dem Immunoassay verwendeten Antikörper übertragen. Die Quantifizierung der Zielspezies wird durch die Detektion einer fluoreszierenden Spezies (Markierung) bereitgestellt, welche von dem Enzym produziert wird. Die Markierung wird wie zuvor beschrieben unter Verwendung eines Aufteilungselements detektiert.
Der Assay der vorliegenden Erfindung kann jedes beliebige in jeglichem Standard-Immunoassay angewandte Enzym verwenden, so wie z. B. alkalische Phosphatase (AP). Um die Aktivität von AP oder eines anderen Enzyms zu beobachten, wird ein Substrat mit einem an eine fluoreszierende Verbindung angehängtem Phosphatrest verwendet, wenn es sich bei der fluoreszierenden Produktverbindung um eine solche handelt, die in das Aufteilungselement der optischen Sonde aufgeteilt wird.
Klassen von Kontaminanten, welche durch einen Immunoassay detektiert werden können, schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf: Hormone, Östrogenverbindungen, Pestizide, biologische Toxine, polynukleare aromatische Verbindungen und polychlorierte Biphenyle.
In manchen Ausführungsformen dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung schließt EIA einen „kompetitiven Eindungs"-Assay ein. In einer ersten Ausführungsform wird ein Enzym derart an eine Verbindung konjugiert, dass das Konjugat dazu in der Lage ist, mit der Zielverbindung um die Bindung an einen Antikörper zu kompetitieren. Dies führt zu einer Menge an mit Antikörper komplexiertem Konjugat, welche umgekehrt proportional zu der Menge an vorhandener Zielverbindung ist. Es wird ein Kalibrierungs- oder „kompetitives Bindungs"-Plot entwickelt, indem man zunächst den Antikörperkomplex aus dem ungebundenen Konjugat isoliert und dann die Enzymaktivität für eine Reihe von standardmäßigen Konzentrationen von Zielkontaminanten misst. Siehe das nachfolgende Beispiel 20.
In einer zweiten Ausführungsform, welche die kompetitive Bindung anwendet, wird eine sekundäre Markierung (oftmals ein Protein so wie z. B. bovines Serumalbumin oder eine chemische Spezies) derart an eine Verbindung konjugiert, dass die sekundäre Markierung/Verbindung dazu in der Lage ist, mit der Zielverbindung um die Bindung an Antikörper zu kompetitieren. Im Anschluss an den kompetitiven Bindungsschritt wird ein sekundärer Antikörper hinzugefügt, welcher die sekundäre Markierung bindet und an ein Enzym gekoppelt ist. Wie zuvor wird der Antikörperkomplex von ungebundenem Konjugat getrennt, wobei die Menge an komplexierter Markierung umgekehrt proportional zu der Menge an Zielverbindung in der ursprünglichen Probe ist.
In anderen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beinhaltet EIA einen „Sandwich"-Assay (z. B. ELISA) zur Detektion einer Zielverbindung. Solche Ausführungsformen sind im Allgemeinen bevorzugt zur Detektion von biologischen Kontaminanten. In einem Beispiel für einen Sandwichassay wird ein Antikörper, welcher spezifisch für ein relevantes Ziel ist, auf einem festen Träger immobilisiert. Auf der Oberfläche des Trägers wird eine Probe eingebracht. Kontaminanten, welche das Ziel aufweisen (wobei es sich um Zellen handeln kann), binden an den Antikörper und werden immobilisiert. Um die Anzahl der immobilisierten Kontaminanten zu bestimmen wird ein zweiter Antikörper hinzugefügt, welche ebenfalls die Kontaminanten erkennt und an sie bindet. Dieser zweite Antikörper kann entweder unmarkiert sein oder er kann bereits vorher an ein Enzym gekoppelt worden sein. Ist der zweite Antikörper unmarkiert, so wird ein dritter Antikörper hinzugefügt, welcher an ein Enzym gekoppelt ist, wobei der dritte Antikörper den zweiten Antikörper erkennt und an ihn bindet. In beiden Fällen ist das Ergebnis dieses Vorgangs eine Menge an immobilisiertem Enzym, welcher umgekehrt proportional zu der Anzahl von Zielkontaminanten ist, welche in der ursprünglichen Probe vorhanden sind. Das ausgewählte Enzym bringt ein Produkt, geeigneterweise ein fluoreszierendes Produkt, hervor, welches wie hierin beschrieben detektiert wird. Es wird ein Kalibrierungsplot entwickelt, und zwar durch Messen der Enzymaktivität für eine Reihe von standardmäßigen Lösungen, welche bekannte Mengen bekannter Kontaminanten (z. B. Zellen) enthalten.
Gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung kann EIA zur Detektion von biologischen Kontaminanten (einschließend, jedoch nicht beschränkt auf, E. coli, Gesamt Coliforme, Giardia lamblia, Cryptosporidium parvuum und Pseudomonas aeruginosa) in Proben so wie Wasser, Nahrungsmitteln, biologischen Proben und Erde verwendet werden. Vorteilhafterweise kann es zur Detektion von biologischen Kontaminanten verwendet werden, welche nicht anderweitig durch eine Messung der biologischen Aktivität des Kontaminanten selbst detektiert werden können. Klassen von biologischen Kontaminanten, für welche Immunoassays geeigneterweise verwendet werden können, schließen Bakterien, Protozoen und Viren ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Spezifische Beispiele in einer jeden Klasse schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, für Bakterien: Escherichia coli 0157:H7, Pseudomonas aeruginosa; für Protozoen: Cryptosporidium parvuum und Giardia lamblia; und für Viren: Norwalk- und SARS-Viren. Insbesondere ist der Assay nützlich für die Detektion von Giardia lamblia, Cryptosporidium parvuum und Pseudomonas aeruginosa in Proben, da diese Organismen keine Glucuronidase oder Galaktosidase aufweisen und daher für die zuvor beschriebenen auf diesen Enzymen basierenden Detektionsschemata geeignet waren.
Die vorliegende Erfindung weist deutliche Vorteile gegenüber den derzeitig gebräuchlichen Verfahren zur Messung der Enzymaktivität auf. So verwenden z. B. die am gebräuchlichsten verwendeten Verfahren Substrat-/Produktkombinationen, in welchen sich die optischen Eigenschaften (das Absorptionsvermögen für Licht oder die Emission von Fluoreszenz) bei der Umwandlung des Substrats in das Produkt verändern. Es sind einige Substrate erhältlich, in denen sich bei der Enzymumwandlung signifikante optische Veränderungen vollziehen, doch die Voraussetzung für diese Veränderung erlegt den Substraten, welche verwendet werden können, signifikante Beschränkungen auf. Enzyme so wie β-glu katalysieren die Spaltung chemischer Bindungen, üblicherweise durch Hydrolyse, was bedeutet, dass ein sauerstoffgebundener Substituent aus dem Substrat entfernt und durch eine Hydroxygruppe ersetzt wird (d.h. Umwandlung von einem Ether in eine hydroxylierte Form). Gebräuchliche Substrate sind daher auf Verbindungen beschränkt, welche bei der Umwandlung von einer Etherform in eine Hydroxylform eine signifikante optische Veränderung durchlaufen. Einige Verbindungen, so wie Hydroxykumarinverbindungen, durchlaufen in der Tat solche Veränderungen. Viele andere Verbindungen, welche mit einer höheren Sensitivität detektiert werden können, einschließlich polyzyklischer aromatischer Kohlenwasserstoffe (PAHs), verändern bei einer solchen Umwandlung ihre optischen Eigenschaften nicht signifikant.
Im Gegensatz dazu wird in der vorliegenden Erfindung das Produkt auf der Basis differentieller Aufteilung in das Aufteilungselement der optischen Sonde von dem Substrat unterschieden. Dies bedeutet, dass eine Veränderung hinsichtlich der chemischen Eigenschaften der Verbindung erforderlich ist, d.h. von einer Form, welche sich nicht in das Aufteilungselement aufteilt, in eine Form, welche dies tut, wohingegen eine Veränderung hinsichtlich der optischen Eigenschaften nicht erforderlich ist. In der Folge kann ein breites Spektrum an Verbindungen, welche für gebräuchliche Verfahren nicht zur Verfügung stehen, als Substrate in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden. So, sind z. B. PAHs, welche sowohl vor als auch nach der Umwandlung in Produkt Fluoreszenz emittieren, geeignete Substrate. In der zuvor genannten Ausführungsform, welche die Detektion von β-glu-Aktivität betrifft, handelt es sich bei pyr-glu um eine Glucuronidform, welche im Wesentlichen wasserlöslich ist und sich nicht in einen hydrophoben Film so wie PDMS aufteilten wird. Das Produkt HP ist viel weniger polar und teilt sich leicht in PDMS auf.
Die vorliegende Erfindung bietet weitere Vorteile. Der gesamte Lichtweg für Fluoreszenzanregung und -emission ist im Inneren der optischen Sonde und insbesondere in dem Aufteilungselement enthalten, so dass das Licht bei der Messung die Lösung nicht durchdringen muss. Dies bedeutet, dass die Enzymaktivität in opaken oder stark streuenden Medien direkt detektiert werden kann. Die Sonde/das Aufteilungselement stellt ein kontinuierlich überwachtes Signal bereit, was die Analyse der Kinetik vereinfacht, wie sie bei Messungen der Enzymaktivität erforderlich ist. Schließlich wird die Sensitivität der Sonde/des Aufteilungselements zum Teil durch die Partitionskonstante (K_fs) für das Produkt bestimmt, welche definiert ist als das Verhältnis der Konzentration der Verbindung in dem Aufteilungselement zu der Konzentration in Lösung. In Fällen, in denen K_fs größer als 1 ist, wird das Produkt in das Aufteilungselement „vorkonzentriert". Je höher der Wert für K_fs ist, desto höher ist die Sensitivität für die Detektion. Werte von 10.000 oder höher sind typisch für PAHs.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der nachfolgenden nicht einschränkenden Beispiele weiter beschrieben.
Arbeitsbeispiele
Beispiel 1. Optische Sonde
Aus 1m einer einzelnen mit Nylon^® kaschierten Silikafaser (Fiberguide Industries, Stirling, New Jersey, USA oder FiberTech Optika, Kitchener, Ontario, Kanada) mit 600 μm Durchmesser wurde eine optische Sonde hergestellt. Ein erstes Ende der Faser wurde als eine optische Schnittstelle mit anderen Instrumenten präpariert und ein Aufteilungselement wurde an dem zweiten Ende der Faser befestigt. Das erste Ende der Faser wurde präpariert, indem man 4cm der Kaschierung entfernte, die Faser mit einer keramischen Klinge einritzte und dann so lange drehte und zog, bis die Faser unter Bildung einer planaren Oberfläche zerbrach. Für das Aufteilungselement wurde ein transparenter hydrophober Polydimethylsiloxan (PDMS)-Elastomerfilm auf das zweite Ende der Faser aufgebracht. Es wurden Sonden aus drei PDMS-Materialien hergestellt, welche Ausgangsmaterialien mit unterschiedlichem Molekulargewicht und unterschiedliche Grader der Kreuzvernetzung aufwiesen.
GE RTV118 (General Electric)-Filme wurden hergestellt durch Vermischen von 50 mg des PDMS-Vorläufermaterials mit 300 μl Dichlormethan (DCM) und nachfolgendes Verdampfenlassen des DCM bis das Gemisch klebrig wurde (3 h elektrostatische Aufladung oder in kürzerer Zeit mittels Blasen von Stickstoff). Es wurde eine 18er Kanülenspitze verwendet, um ein Kügelchen des klebrigen PDMS auf die exponierte Spitze der Faser aufzubringen und der Tropfen wurde bei Raumtemperatur für 24 h aushärten gelassen.
Es wurden Sylguard 186 (Dow)-Filme hergestellt durch Vermischen des Grundmaterials mit einem Aushärtungsmittel in einem Verhältnis von 10:1 nach Volumen. Dieses Gemisch wurde in einem 3x-Volumen Dichlormethan (DCM) aufgelöst. Dieses Gemisch wurde unter Verdampfung des DCM für 5 h bei Raumtemperatur aushärten gelassen. Es wurde eine 18er Kanülenspitze verwendet, um ein Kügelchen des vermischten Sylguard 186 (Viskosität = 65.000 cp; Shore A = 24) auf die exponierte Spitze der Faser aufzubringen und der Tropfen wurde bei Raumtemperatur für 48 h aushärten gelassen. Ein Beispiel für diese Art von Kügelchen ist in 2 gezeigt. Das Kügelchen wurde dann unter Verwendung eines Skalpells zurechtgeschnitten, um das Elastomer zu entfernen, welches nicht direkt in dem Lichtweg des anregenden Lichts war. Es wurde unter Verwendung eines Skalpells ebenfalls ein konisches Ende geformt, um das Volumen der Sonde und die Hintergrundstreuung zu reduzieren.
Es wurden Filme aus Sylguard 184 (Dow) durch Wiederholen der zuvor beschriebenen Prozedur mit Sylguard 186 hergestellt, allerdings viel dünnere Filme (Viskosität = 3.900 cp; Shore A = 50). Um einen dickeren Film zu erhalten, wurde die präparierte Faser vertikal für 30 Minuten bei 90°C in einem Ofen platziert. Das Sylguard 184 wurde präpariert, indem das Grundmaterial im Verhältnis 10:1 nach Volumen mit einem Aushärtungsmittel vermischt wurde. Während die Faser noch warm war, wurde die Spitze mit dem vermischten Sylguard 184 in Kontakt gebracht. Dies führte dazu, dass das Elastomer schnell auf der Faserspitze aushärtete. Der Vorgang wurde einige Male wiederholt, bis der Film einem Kügelchen von geeigneten Ausmaßen glich (z. B. 2). Das Kügelchen wurde dann unter Verwendung eines Skalpells zurechtgeschnitten, um das Elastomer zu entfernen, das nicht direkt im Lichtweg des anregenden Lichts war (siehe unten).
Beispiel 2. Versuchsaufbau und Charakterisierung der optischen Sonde
Der Versuchsaufbau ist in 4 gezeigt. Dieser Aufbau gestattete das Scannen von Anregungs- und Emissionsspektren sowie ebenfalls die Überwachung der Emission bei einer festgelegten Wellenlänge als eine Funktion der Zeit und die Erstellung von sensorischen Zeit-Antwort-Kurven. Die optische Sonde 3, welche aus einem Stück der optischen Faser 2 hergestellt wurde, wurde über einen optischen Koppler 5 und eine optische Faser 7 mit einer Anregungslichtquelle 4 und einem Spektrometer 6 verbunden. Die Lichtquelle 4 schloss einen computergesteuerten Scanning-Monochromator ein, welcher an eine Xenonlampe gekoppelt war (beides von Sciencetech Inc., London, ON), um eine Anregungswellenlänge auszuwählen, und das Spektrometer 7 schloss einen ähnlichen Monochromator mit einem Photomultiplier-Detektor ein, um die Emission bei einer längeren Wellenlänge zu überwachen.
Es wurden einige optische Sonden unter Verwendung des zuvor beschriebenen Verfahrens präpariert. Die anfängliche Charakterisierung der optischen Sonden erfolgte mittels direkter Zugabe von Produktverbindung, 1-Hydroxypyren, zu einer eine Sonde enthaltenden Lösung. Die Antwortzeit einer mittels GE RTV118 hergestellten Sonde ist in 5 gezeigt. Für diese Sonde erfolgte die Equilibrierung in 30 bis 40 Minuten; die anderen Sonden wiesen ähnliche Antwortzeiten auf (Daten nicht gezeigt). Nach der Equilibrierung wurde die durch die Sonde detektierte Fluoreszenz linear zu der Konzentration von HP in Relation gestellt, wie in 6 gezeigt ist. Ein ähnliches Plot für das Substrat Pyren-β-D-Glucuronid ergab eine Steigung von Null, was anzeigt, dass kein Substrat detektiert wurde.
Beispiel 3. Detektion der Enzymaktivität
Die Funktion der Sonde für die Detektion der Enzymaktivität wurde dadurch gezeigt, dass man die Sonde in eine Substratlösung einführte, was Stabilisierung gestattete, und dann das Enzym (von E. coli abgeleitete β-glu und β-gal wurden von Sigma bezogen) zugab. Nach einer anfänglichen Verzögerung wurde über 30 Minuten ein Anstieg der Fluoreszenz beobachtet (7). Die Steigung der Kurve zwischen 20 und 30 Minuten wurde als ein Maß für die relative Enzymaktivität verwendet. Die optimale Substratkonzentration wurde durch Plotting der gemessenen Enzymaktivität bei verschiedenen Substratmengen als 10 μM bestimmt (8) und diese Konzentration wurde in den nachfolgenden Experimenten verwendet. Ein Plot der gemessenen Enzymaktivität aufgetragen gegen die Menge an zugegebenem Enzym war linear (9), was anzeigt, dass es möglich ist, die Enzymaktivität mit der Sonde zu quantifizieren und selbst so geringe Mengen wie 10 ng/ml an Enzym zu detektieren.
Beispiel 4. Detektion von E. coli mittels eine optischen Sonde
Die Anzahlen von E. coli B (Bestand Nr. 413)-Zellen wurden mittels einer Kombination aus Messungen der optischen Dichte und Plattenzählungen bestimmt. Es wurden Proben, welche verschiedene anfängliche Anzahlen von Zellen enthielten, mit Luria-Broth und 10 μM zugegebenem Substrat in Glasfläschchen platziert (das Gesamtvolumen einer jeden Probe betrug 4 ml) und die Inkubationstemperatur wurde bei 37,0°C ± 0,1°C gehalten. Die Proben wurden einzeln getestet, und zwar durch Einführen der Sonde in die Probe und Überwachen des Fluoreszenzsignals als eine Funktion der Zeit. Nach 1 bis 10 h stieg das Signal schnell an, wenn zu Anfang eine oder mehrere E. coli-Zellen in der Probe vorhanden waren (siehe z. B. 10). Kontrollexperimente (mit durch eine Abfolge von Einfrieren und Auftauen getöteten Zellen) lieferten nach 24 h keine Antwort. Die Zeit zwischen dem Einführen der Sonde in die Probe und dem Beginn des Signals (definiert als ein Anstieg von 1 V über dem Hintergrundlevel) war umgekehrt proportional zu der Anzahl der ursprünglich zugegebenen Zellen, in Übereinstimmung mit einem Modell für die kinetische Analyse des Zellwachstums (siehe 11 sowie das nachfolgende Beispiel).
Beispiel 5. Kinetik des Wachstums von E. coli sowie Quantifizierung von E. coli
Wir gehen davon aus, dass das die aus Signal gegen Zeit erhaltenen Daten (siehe 10) unter Verwendung eines einfachen Modells für das Zellwachstum beschrieben werden können, wobei die optische Sonde die Produktkonzentration anzeigt, welche eine Funktion der Anzahl der vorhandenen Zellen ist. Unter dieser Annahme liefert die optische Sonde ein positives Signal, wenn eine kritische Anzahl von Zellen in dem Detektionsgefäß erzeugt wurde. Wir definieren die anfänglich Anzahl von Zellen in einer Probe als C₀, die für die Detektion erforderliche Anzahl als C_d (man beachte: anstelle der Zellanzahl kann die Zelldichte als Anzahl/ml verwendet werden), die für die Verdopplung der Anzahl der Zellen benötigte Zeit als t₂ und die für die Detektion benötigte Zeit als t_d. Die Anzahl der Zellen zu einem beliebigen Zeitpunkt (C_t) kann dargestellt werden als:
und zum Zeitpunkt der Detektion als:
Dies kann transformiert werden zu:
Was umformuliert wird in:
Unter Verwendung des Substrats Pyren-β-D-Glucuronid wurde eine Reihe von Experimenten mit bekanntem Co (separat bestimmt durch Plattenzählungen) durchgeführt and es wurde die für die Detektion benötigte Zeit t_d bestimmt. Ein Plot von ln(C₀) gegen t_d war linear (11A), wobei die Steigung –ln(2)/t₂ und der Schnittpunkt ln(C_d) ergaben. Aus der linearen Regression des resultierenden Plots wurde die Verdopplungszeit t₂ als 20,3 min berechnet und die kritische Anzahl an Zellen für die Detektion C_d wurde als 3 × 10⁸ bestimmt.
Die Linearität des Plots (11A, R² > 0,99) unterstützt dieses Modell für das allgemeine Verhalten und lässt uns die Anzahl der Zellen zu Zeitpunkten vor der Detektion berechnen. Damit können wird nunmehr eine bestimmte Kurve nehmen, z. B. Co = 1 Zelle, und können für jeden beliebigen vorgegebenen Zeitpunkt die Anzahl an vorhandenen Zellen schätzen. Erfolgt die Detektion für eine unbekannte Probe zu einer bestimmten Zeit, so kann das Probenplot dazu verwendet werden, die Anzahl der Zellen zu bestimmen, welche anfänglich vorhanden sind. Somit wird die Quantifizierung von E. coli in der Probe ermöglicht. Dabei wird für die Probe wie auch für die Referenzexperimente von der gleichen Verdopplungszeit ausgegangen, welche für ein breiteres Spektrum an Proben bestimmt werden kann.
Dieses Experiment wurde wiederholt, um unter Verwendung von drei anderen Substraten für die Detektion von E. coli und Gesamt Coliforme Kalibrierungsplots von Log (anfängliche Anzahl der Zellen) aufgetragen gegen den Zeitpunkt der Detektion anzufertigen. 11B zeigt die Detektionszeit für E. coli bei verschiedenen anfänglichen Anzahlen von Zellen mit dem Substrat Anthracen-β-D-Glucuronid. Diese Experimente erfolgten mit Proben zu 100 ml, gerührt bei 35°C unter Verwendung von 0,75 mg Substrat und dem E. coli-Stamm 25922. 11C zeigt die Detektionszeit für Gesamt Coliforme bei verschiedenen Anzahlen von Zellen unter Verwendung des Substrats Pyren-β-D-Galaktopyranosid. Die Detektion wird unter Verwendung von E. coli Typ B als Testorganismus demonstriert, da E. coli ein Mitglied der Klasse der Coliformen ist. Diese Experimente wurden mit Proben zu 10 ml ausgeführt, die bei 37°C gerührt wurden. 11D zeigt die Detektionszeit von Gesamt Coliformen bei verschiedenen Anzahlen von Zellen unter Verwendung des Substrats Anthracenyl-β-D-Galaktopyranosid. Die Detektion wird unter Verwendung von E. coli 25922 als Testorganismus demonstriert, da E. coli ein Mitglied der Klasse der Coliformen ist. Diese Experimente wurde mit Proben zu 20 ml durchgeführt, welche bei 37°C gerührt wurden.
Beispiel 6. Detektion von vier E. coli-Stämmen
E. coli (Bestand Nr. 413) wurde von einer Forschungsgruppe der Queen's University at Kingston, Kingston, Ontario, Kanada, erhalten. Der Stamm ATCC 25922 wurde von der American Type Culture Collection erworben. Die Stämme KS1 und KS2 wurden aus dem Abwasser einer Kläranlage der Stadt Kingston isoliert und repräsentieren „Wildtyp-„ oder natürliche Stämme.
Diese Stämme wurden der zuvor beschriebenen Analyse unterzogen, d.h. es wurde das pyr-glu-Substrat verwendet und es wurde das Sondensignal aufgetragen gegen die Zeit verfolgt während die Stämme wuchsen, um eine „Zeit des Signalbeginns" zu erhalten, welche in Relation zu der Anzahl der anfänglich vorhandenen Zellen steht. Die Ergebnisse für den ATCC-Stamm und einen der Stämme aus der Kläranlage Kingston sind in den 12A und B geplottet. Wie aus den 12A und B ersichtlich ist, sind die Steigungen aller Kurven gleich (was die Veränderung der Detektionszeit als eine Funktion der Veränderung in dem Protokoll der Anzahl der anfänglich vorhandenen Zellen repräsentiert). Der y-Schnittpunkt für diese Plots sagt die Zeit voraus, die benötigt werden würde, um eine einzige Zelle in der ursprünglichen Probe zu detektieren.
Die Tatsache, dass die Steigungen identisch, die y-Schnittpunkte dagegen geringfügig unterschiedlich sind, könnte einen Unterschied hinsichtlich einer „Verzögerungs-„ oder „Reanimations"-Zeit für jeden Stamm vor Beginn des Wachstums anzeigen. Dies erhöht die Zellzählungsschätzungen, welche aus den Signalbeginnszeiten für echte Proben abgeleitet werden können, in etwa um den Bereich einer Zehnerpotenz.
Beispiel 7. Anthracen-Glucuronid-Substrat
Das Substrat Anthracen-β-D-Glucuronid (ant-glu) wurde in der der gleichen Art und Weise wie das pyr-glu-Substrat (zuvor) getestet. Das ant-glu-Substrat verhielt sich im Wesentlichen gleich dem Pyrensubstrat. Die Anregungs- und Emissionswellenlängen für die Detektion dieses Substrats sind geringfügig länger, was einige Verbesserungen bei der Verwendung von miniaturisierten Spektrometerkomponenten mit sich bringt. So hat z. B. die UV-Leuchtdiode, welche in manchen Konfigurationen zur Anregung verwendet wird, eine maximale Leistung bei 375 nm, was länger ist als die maximale Wellenlänge für die Anregung von Hydroxypyren (340 nm), jedoch näher an der maximalen Wellenlänge für die Anregung von Hydroxyanthracen (370 nm) liegt.
Beispiel 8. Pyren-Galaktopyranosid-Substrat für Galaktosidase-Enzym
Es wurde ein Substrat für die Detektion der Galaktosidaseaktivität, Pyren-Galaktopyranosid (pyr-gal) synthetisiert und mit E. coli (Bestand Nr. 413) getestet. Der Galaktosidase-Enzymtest wird als ein Indikator für „Gesamt-Coliforme"-Bakterien verwendet, analog zu dem Glucuronidasetest für E. coli. Da das Produkt aus diesem Substrat identisch mit dem Glucuronidaseprodukt, d.h. Hydroxypyren, ist, wurde erwartet, dass das Verfahren und die optische Sonde gemäß der vorliegenden Erfindung ebenfalls mit dem pyr-glu-Substrat funktionieren würde, unter der Voraussetzung, dass das Galaktosidaseenzym exprimiert würde. Anfängliche Ergebnisse für Proben, welche schätzungsweise Millionen von Zellen (13A) und ein paar tausend Zellen (13B) enthielten, sind im Wesentlichen identisch mit denen des Glucuronidasetests.
Beispiel 9. Vergleich von E. coli-Tests
Es wurden Wasserproben (n = 37) aus örtlichen Frischwasserquellen (Seen und Flüssen) in Kingston, Ontario, Kanada, und Umgebung zur E. coli-Analyse unter Verwendung eines standardmäßigen Membranfilterverfahrens in ein ortsansässiges akkreditiertes Labor (bezeichnet als Referenzlabor) gegeben. Das Referenzlabor entnahm zur Analyse ein Volumen von 10 ml aus jeder ~200 ml umfassenden Probe und gab dann die verbleibende Probe den Erfindern. Es wurde ein Volumen von 10 ml einer jeden Probe mit 10 ml Nährbouillonkonzentrat vermischt, um 20 ml Standardmedium bereitzustellen (das gleiche Medium, wie es zuvor bei der Arbeit mit E. coli verwendet worden war), zu welchem das pyr-glu-Substrat hinzugefügt wurde. Die Proben wurden bei 37°C in ein Bad gegeben und es wurden eine Rührstange und die optische Sonde hinzugegeben. Die Fluoreszenz wurde überwacht und die „für die Detektion benötigte Zeit" t_d wurde für jede Probe bestimmt. Negative Proben lieferten kein signifikantes Fluoreszenzsignal nach mindestens 20 h.
Die Ergebnisse für einen anfänglichen Satz dieser Proben wurden dazu verwendet, die t_d-Antwort zu kalibrieren, was die in 14 gezeigte E. coli-Kuver ergab. Diese Kalibrierung wurde dazu verwendet, die nachfolgenden td-Ergebnisse in die „Anzahl an Zellen pro Volumeneinheit" (was äquivalent zu den „koloniebildenden Einheiten" oder CFUs ist, welche mittels des standardgemäßen Membranfilterverfahrens detektiert werden) für jede Probe umzuwandeln. Die Ergebnisse des Vergleichs zeigten eine gute Übereinstimmung, vor allem in dem Bereich von 0 bis 25 CFU, zwischen der Erfindung und der standardgemäßen Labortechnik an. In Tabelle 1 ist ein qualitativer Vergleich der beiden Verfahren gegeben. Die Tabelle 1 bringt die Daten in ein „Vorhandensein/Abwesenheits"-Format, mit einer Toleranz zur Durchmusterung statistischer Abweichungen auf dem Ein-Zellen-Level. Der Vergleich zeigt eine perfekte Übereinstimmung der „positiven" und der „negativen" Klassifizierung der Proben an.

Dieser Vergleich demonstriert, dass die vorliegende Erfindung zahlreiche Vorteile gegenüber der Technik des Referenzlabors bietet, und das ohne Einbußen hinsichtlich der Durchführung. So stellt die vorliegende Erfindung z. B. einen Test bereit, welcher: schneller ist (z. B. weniger als 15 h, mit einer schnelleren Detektion für mehr kontaminierte Proben, gegenüber 18 bis 24 h für den Test des Referenzlabors); weniger Arbeitsschritte zur Handhabung der Probe erfordert; eine optische Detektion ohne visuelles Zählen, visuelle Beobachtung oder menschliche Intervention bereitstellt (und somit nicht dem menschlichen Irrtum unterliegt); in überwachsenen oder opaken Proben verwendet werden kann; und über einen breites dynamisches Spektrum verfügt (z. B. 1 bis 1 × 10⁶ Zellen gegenüber 1 bis 100 Zellen für das Referenzlabor), so dass keine Verdünnungen erforderlich sind. Tabelle 1: Vergleich der Technik der vorliegenden Erfindung und der des Referenzlabors bei der Detektion von E. coli in einem „Vorhandensein/Abwesenheits"-Modus.

Vergleich der E. coli-Testergebnisse	Häufigkeit des Vorkommens
Erfindung: +ve Referenzlabor: +ve (Bestätigte Positive)	19
Erfindung: 1 Zelle Referenzlabor: –ve (Potentiell falsche Positive)	1
Erfindung: >1 Zelle Referenzlabor: –ve	0
(Falsche Positive)
Erfindung: –ve Referenzlabor: –ve (Bestätigte Negative)	12
Erfindung: –ve Referenzlabor: 1 Zelle (Potentiell falsche Negative)	5
Erfindung: –ve Referenzlabor: >1 Zelle (Falsche Negative)	0
Gesamtanzahl der Proben	37

Beispiel 10. Detektion von Gesamt Coliformen
Ein Teilsatz der Proben aus Beispiel 9 wurden unter Verwendung des pyr-gal-Substrats für die Gesamt Coliformen (TC)-Analyse ausgewählt. Da das Referenzlabor hierfür keine Bestimmungen von Gesamt Coliformen durchführte, wurde an den Proebn außerdem ein separater TC-Test unter Verwendung des im Handel erhältlichen Quantitray-Systems (Colillert-18^®, Idexx Laboratories Inc., Westbrook, ME) durchgeführt, welcher ein TC-Ergebnis unter Verwendung des quantitativen Verfahrens der wahrscheinlichsten Anzahl (MPN, most probable number) liefert. Die anfänglichen Ergebnisse sind in 13 dargestellt; es sollte jedoch beachtet werden, dass mehr Daten erforderlich sind, um die mathematischen Werte für den Log-linear-Fit dieser Daten zu bestätigen. Man kann daher nicht zu einem Schluss kommen, ob sich diese Kurve von der E. coli-Kurve aus 14 unterscheidet, da die beiden Kurven unterschiedliche Kontaminationsbereiche abdecken. Es sollte betont werden, dass beide Kurve echte Proben mit einer zufälligen Abweichung in den tatsächlichen Stämmen von vorhandenen coliformen Organismen verwenden; demnach ist es zu erwarten, dass die Gesamtleistung der des E. coli-Tests ähnlich ist.
Beispiel 11. Herstellung von 2 Anthracenyl-β-D-Galaktopyranosid
Es wurde 2-Anthracenyl-β-D-Galaktopyranosid 4 gemäß dem in 15 gezeigten Schema hergestellt. Die Glykosylierung von 2-Hydroxyanthracen 2 unter Phasentransferbedingungen (11) mit Acetobromgalaktose 1 ergab eine gute Ausbeute an Konjugat 3, welches unter Zemplen-Bedingungen zu 4 entschützt wurde.
Beispiel 12. Herstellung von 1-Pyrenyl-β-D-Galaktopyranosid
1-Pyrenyl-β-D-Galaktopyranosid 7 wurde in einer ähnlichen Art und Weise wie in Beispiel 11 aus 1-Hydroxypyren und Acetobromgalaktose hergestellt (Schema in 16 gezeigt).
Wie in 17 gezeigt ist, kann die Glykosylierung von 2-Hydroxyanthracen und 1-Hydroxypyren ebenfalls bewirkt werden, indem man das Aglykon mit Penta-Acetylgalaktose 6 (12) fusioniert; jedoch ist die Ausbeute an Konjugat 6 nicht groß.
Beispiel 13. Herstellung von Anthracen-β-D-Glucuronid
Anthracen-β-D-Glucuronid wurde gemäß dem in 18 gezeigten Schema hergestellt. 2-Hydroxyanthracen wurde in den Trimethylsilylether 10 umgewandelt, um seine Löslichkeit zu erhöhen. Der Trimethylsilylether 10 wurde in der Gegenwart von Bortrifluoridetherat an das Trichloracetamidat 9 (13) gekoppelt. Eine Entschützung des daraus resultierenden Konjugats 11 mit Natriummethoxid in trockenem Methanol, gefolgt von der Zugabe von Wasser, gestattete es dem Natriumsalz 12 aus der Lösung auszukristallisieren. Dieses Salz kann mittels Salzaustauschs mit Cyclohexylammoniumacetat in das Cyclohexylammoniumsalz 13 umgewandelt werden.
Das Isobutyryltrichlorolacetamidat 14 (15) kann ebenfalls dazu verwendet werden, das Glucuronid von Anthracen über das Konjugat 15 herzustellen, wie in dem Schema in 19 gezeigt ist, die Ausbeute wird jedoch nicht erhöht.
Beispiel 14. Herstellung von 2-Anthracenyl-β-D-Galaktopyranosid 4
Herstellung von Tetra-O-Acetyl-2-Anthracenyl-β-D-Galaktopyranosid 3
Ein Gemisch aus Tetra-O-Acetyl-1-Brom-1-Deoxygalaktose 1 (205 mg, 0,5 mmol), 2-Hydroxyanthracen 2 (74 mg, 0,381 mmol), Tetrabutylammoniumhydrogensulfat (100 mg, 0,294 mmol), Dichlormethan (2,5 ml) und 1,5 M Natriumhydroxid (0,5 ml, 0,75 mmol) wurde über Nacht bei Raumtemperatur heftig gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Ethylacetat (20 ml) verdünnt, mit Wasser gewaschen (3 × 10 ml) und mit Natriumsulfat (× 2) getrocknet. Die Verdampfung des Lösungsmittels ergab eine braune Gummimasse (249 mg), welche unter Verwendung von Dichlormethan auf Silikagel chromatographiert, gefolgt von 39/1 Dichlormethan/Ethylacetat als Elutionsmittel, um die Verbindung 3 in Form eines goldenen Schaums zu ergeben (129 mg, 65% Ausbeute).
¹Hmr (CDCl₃, δ): 2,06 (3H, s, OAc), 2,12 (6H, s, OAc), 2,22 (3H, s, OAc), 4,23 (3H, m, H_5' und H_6'), 5,20 (1H, q, j = 3,0, 10,4 Hz, H_3'), 5,24 (1H, d, j = 8,0 Hz, H_1'), 5,52 (1H, d, j = 3,0 Hz, H_4'), 5,60 (1H, q, j = 8,0, 10,4 Hz, H_2'), 7,22 (1H, q, j = 2,4, 9,1 Hz, H₃), 7,48 (3H, m, H₁, H), 7,99 (3H, m,), 8,33 (1H, s, H₉), 8,41 (1H, s, H₁₀).
Eine Lösung aus Tetra-O-Acetyl-2-Anthracenyl-β-D-Galaktopyranosid 3 (30 mg, 0,057 mmol) in trockenem Methanol (0,6 ml) wurde bei Raumtemperatur gerührt und mit 0,052 M Natriummethoxid in Methanol (100 μl, 0,0052 mmol) behandelt. Nach 20 min begann die Bildung eines weißen Präzipitats. Nach dem Rühren über Nacht wurde das Produkt gefiltert und mit einer geringen Menge an Methanol gewaschen und im Anschluss daran trocken gesaugt, wobei ein cremiger weißer Feststoff zurückblieb, 14,8 mg (72,5%).
¹Hmr (DMSOd₆, δ): 3,4-3,8 (6H, m), 4,53 (1H, d, j = 4,2 Hz, OH), 4,71 (1H, t, j = 5,5 Hz, primäres OH), 4,88 (1H, d, j = 5,7 Hz, OH), 5,06 (1H, d, j = 7,7 Hz, H_1'), 5,22 (1H, d, j = 5,1 Hz, OH), 7,30 (1H, q, j = 1,8, 9,4 Hz, H3), 7,48 (2, m H₆, H₈), 7,57 (1H, br. d, H₁), 8,04 (3H, m H₄, H₅, H₇), 8,40 (1H, s, H₁₀).
Beispiel 15. Herstellung von 1-Pyrenyl-β-D-Galaktopyranosid
1-Pyrenyl-β-D-Galaktopyranosid wurde in einer ähnlichen Art und Weise wie in Beispiel 14 beschrieben hergestellt.
¹Hmr (DMSOd₆, δ): 3,4-3,95 (6H, m), 4,62 (1H, d, j = 4,6 Hz, OH), 4,72 (1H, t, j = 5,5 Hz, primäres OH), 4,97 (1H, d, j = 5,6 Hz, OH), 5,17 (1H, d, j = 7,6 Hz, H_1'), 5,47 (1H, d, j = 5,4 Hz, OH), 7,91 (1H, d, j = 6,5 Hz), 8,00-8,18 (4H, m), 8,18-8,30 (3H, m), 8,57 (1H, d, j = 9,2 Hz).
Tic (10/1 Ethylacetat/Methanol, UV) wies einen einzelnen Spot Rf 0,14 auf.
Beispiel 16. Herstellung von Hethyl-Tri-O-Acetyl-2-Anthracenyl-β-D-Glucuronid 11
Herstellung von 2-Hydroxyanthracen-Trimethylsilylether 10
Zu einer Lösung aus 2-Hydroxyanthracen (14) (100 mg, 0,515 mmol) in trockenem Pyridin (1,0 ml) wurde Chlortrimethylsilan (120 μl, 0,845 mmol) zugegeben. Es bildete sich unverzüglich ein Präzipitat. Nach dem Rühren über Nacht bei Raumtemperatur wurde Toluen (3 ml) zugegeben und das Gemisch wurde gefiltert. Die Feststoffe wurden mit noch mehr Toluen gewaschen und die kombinierten Filtrate wurden abgestreift, wobei ein orangefarbener kristalliner Feststoff zurückblieb. Der Rest wurde in Toluen (5 ml) aufgelöst und erneut gefiltert, um eine Spur von Pyridinhydrochlorid zu entfernen. Die Verdampfung des Lösungsmittels ergab einen orangefarbenen Feststoff, welcher im Vakuum getrocknet wurde, um eine quantitative Ausbeute (140 mg) des Trimethylsilylethers zu ergeben, welcher nachfolgend ohne Aufreinigung verwendet wurde.
Eine birnenförmige Flasche mit 25 ml Fassungsvermögen wurde mit 2-Hydroxyanthracen-Trimethylsilylether 10 (191 mg, 0,717 mmol) und Imidat 9 (479 mg, 1,0 mmol) beladen und mit Stickstoff gespült. Pulverisierte, aktivierte 3A-Molekülsiebe (1,0 g) wurden rasch in die Reaktionsflasche zugegeben, welche erneut mit Stickstoff gespült und in Eis gekühlt wurde. Es wurde trockenes Dichlormethan (8,5 ml) zugegeben und das Gemisch wurde unter Kühlung mit Eis für 30 Minuten gerührt. Schließlich wurde Bortrifluoridetherat (85 μl, 0,67 mmol) zugegeben und die Reaktion färbte sich unmittelbar graugrün. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht in Stickstoff gerührt und langsam auf Raumtemperatur gebracht.
Die Reaktion wurde durch die Zugabe von Methanol (2 ml) und Rühren für 10 min beendet. Die Feststoffe wurden abgefiltert und gründlich mit Dichlormethan gewaschen. Die kombinierten Filtrate wurden verdampft, wobei ein brauner Schaum zurückblieb, welcher in Dichlormethan aufgelöst, mit Silikagel (1 g) behandelt und erneut verdampft wurde. Der Rest wurde auf die Spitze einer Silikagelsäule (20 m) gegeben, welche in Dichlormethan präpariert wurde, welches mit diesem Lösungsmittel eluiert wurde. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen wurden kombiniert und verdampft, wobei ein schmutzig gelber Feststoff zurückblieb (152 mg). Die Kristallisation aus Ethylacetat (2,0 ml) ergab einen eierschalfarbenen Feststoff (69 mg, 19%).
¹Hmr (CDCl₃, δ): 2,10 (9H, m, 3 × OAc), 3,76 (3H, s, OCH₃), 4,33 (1H, m, H_5'), 5,41 (4H, m), 7,21 (1H, q, j = 2,5, 9,0 Hz, H3), 7,49 (3H, m H₆, H₈, H₁), 7,98 (3H, m, H₄, H₅, H₇), 8,35 (1H, s, H₉), 8,40 (1H, s, H₁₀).
Beispiel 17. Herstellung von 2-Anthracenyl-β-D-Glucuronsäure, Natriumsalz 12
Es wurde Methyltri-O-Acetyl-2-Anthracenyl-β-D-Glucuronid 11 (145 mg, 0,284 mmol) in trockenem Methanol (4,0 ml) suspendiert und in einem Eisbad unter Stickstoff gekühlt. Hierzu wurden 0,678 M Natriummethoxidlösung (710 μl, 0,48 mmol) gegeben. Das Gemisch wurde über Nacht gerührt und langsam auf Raumtemperatur gebracht. Der Feststoff wurde langsam aufgebraucht, als das Produkt aus der Lösung präzipitierte. Am Tag darauf wurde Wasser (1,0 ml) zugegeben und das Rühren bei Raumtemperatur wurde fortgesetzt. Das feine Präzipitat wurde gefiltert, mit einer geringen Menge an Methanol gewaschen und trocken gesaugt, was ein eierschalenfarbenes Produkt (97 mg, 87%) ergab.
¹Hmr (D₂O, δ): 3,61 (3H, m), 3,76 (1H, d, j = 8,4 Hz, H_5'), 5,25 (1H, br. d, j = 4,6 Hz, H_1'), 7,62 (1H, br. d, j = 9,0 Hz, H3), 7,45 (2H, m, H₆, H₈), 7,54 (1H, br. d, H₁), 7,98 (3H, m, H₄, H₅, H₇), 8,36 (1H, s, H₉), 8,43 (1H, s, H₁₀). 1Hmr (DMSOd₆, δ):, 5,07 (1H, d, j = 7,5 Hz, H_1').
Beispiel 18. Herstellung von 2-Anthracenyl-β-D-Glucuronsäure, Cyclohexylammoniumsalz 13
Das Natriumsalz 12 (54 mg, 0,137 mmol) wurde in Methanol (~5 ml) und Wasser (3 ml) suspendiert und bis zum Siedepunkt erhitzt. Die Lösung wurde durch einen in einer Pasteur-Pipette enthaltenen Gewebestopfen gefiltert und mit heißem Wasser (0,5 ml) durchgewaschen. Zu dem heißen Filtrat wurde Cyclohexylammoniumacetat (22 mg, 0,138 mmol) zugegeben und die daraus resultierende Lösung wurde während des Abkühlens gerührt. Bei Kühlung in Eis kristallisierte das Cyclohexylammoniumsalz, welches mittels Filtration als ein sandfarbener Feststoff (39,7 mg, 62%) geerntet wurde.
¹Hmr (DMSOd₆, δ): 1,19 (5H, m), 1,5-1,9 (5H, m), 2,87 (1H, m, H₁), 3,62 (1H, d, j = 9,8 Hz, H_5'), 5,11 (1H, d, j = 6,9 Hz, H_1'), 7,29 (1H, q, j = 1,9, 9,1 Hz, H₃), 7,47 (2H, m, H₆, H₈), 7,55 (1H, br. d, H₁), 8,04 (3H, m, H₄, H₅, H₇), 8,41 (1H, s, H₉), 8,52 (1H, s, H₁₀).
Beispiel 19. Herstellung und Bewertung einer optischen Sonde mit einem kugelförmigen Aufteilungselement aus Polymer
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung und Bewertung einer optischen Sonde mit einem kugelförmigen Aufteilungselement aus Silikon oder Polydimethylsiloxan (PDMS).
PDMS besitzt eine neutrale Polarität, wodurch es hydrophob ist. Diese Eigenschaft führt dazu, dass dieses Material eine kompakte Form, z. B. eine Kugelform, annimmt, wenn es in Wasser eingetaucht wird. Das für das in diesem Beispiel beschriebene Aufteilungselement verwendete PDMS weist eine geringfügig höhere Dichte auf als Wasser, so dass eine Kugel aus diesem Material auf den Grund einer wässrigen Lösung sinken und an der Grundfläche der Flasche haften bleiben wird. Beim Aushärten zu einem rigiden Polymer erhöht sich die Dichte des Materials geringfügig. Wir haben ein Schema entwickelt, welches eine polare Chargenlösung mit einem Dichtegradienten verwendet, so dass eine Kugel lange genug schwimmfähig bleibt, um auszuhärten während sie noch im Schwebezustand ist.
Die Chargenlösung wurde wie folgt hergestellt. Es wurde eine Lösung aus 1,4 g Natriumacetat-Trihydrat und 4 ml Wasser hergestellt, indem man sie in einer 20 ml fassenden Glasflasche gründlich durchmischte. Dann wurden ohne jegliches Schütteln oder Rühren in die gleiche Flasche langsam 4 ml 95% Ethanol zugegeben. Die Natriumacetatschicht ist in höchstem Maße polar und dichter als das PDMS-Material und ausgehärtetes Silikon, während die Alkoholschicht relativ polar, jedoch weniger dicht als das Vorläufermaterial ist. Ist die Kugel aus dem Polymermaterial erst einmal in die Lösung eingetaucht, so bewegt sie sich schnell auf die gemischte Schicht zwischen den beiden diskreten Schichten zu und verbleibt dort im Schwebezustand. Die Kugel bewegt sich nicht seitlich in der gemischten Schicht, so dass es möglich ist, durch Injektion des PDMS-Materials in die Lösung zahlreiche Kugeln in einer einzigen Flasche herzustellen.
Die Chargenlösung gewährleistet eine identische Form für jede Kugel, jedoch hängt die Größe der Kugel von der Menge an injiziertem PDMS-Material ab. Aufgrund der hohen Viskosität des Vorläufersilikons können standardmäßige Laborpipetten und -spritzen nicht für Injektionen von exakt bemessenen Volumina verwendet werden. Daher wird dem Vorläufermaterial ein Lösungsmittel zugesetzt, um seine Viskosität zu reduzieren. Während der Aushärtungsphase des Polymers diffundiert oder verdampft dieses Lösungsmittel einfach. Es können zahlreiche Lösungsmittel so wie Dichlormethan, Hexan und andere organische Substanzen verwendet werden, um das Vorläufermaterial aufzulösen; diese Lösungsmittel können jedoch nicht vollständig in Ethanol oder Wasser vermischt werden und werden dazu führen, dass das Silikon bei der Aushärtung langsam an die Oberfläche der Chargenlösung steigt. Bei Tetrahydrofuran (THF) handelt es sich um ein Lösungsmittel, welches dazu in der Lage ist, das Vorläufermaterial aufzulösen und sich langsam im Ethanol zu verteilen, wobei die Silikonkugel in der Mischschicht der Chargenlösung für eine Ertragsausbeute von 90 bis 100% zurückbleibt. Die Menge an THF, welche für reproduzierbare Injektionen erforderlich ist, variiert je nach der Art und der Marke des verwendeten Silikons. Für eine Kugelmasse von etwa 1,2 mg (einen Durchmesser von etwa 1,5 mm) sind 0,45 ml THF pro Gramm Silikonvorläufer erforderlich, wenn Dow Corning Sylguard 184 Silikon verwendet wird, und 0,6 ml THF pro Gramm Silikon, wenn United Chemical Technologies Silikon verwendet wird.
Zur Injektion des Silikons/Lösungsmittels in die Chargenlösung können kalibrierte Pipetten und Spritzen verwendet werden. Bei der Herstellung von Kugeln von 1 mg bis 3 mg wurde unter Verwendung von Spritzen eine bessere Reproduzierbarkeit erzielt. Bei der Verwendung einer Spritze kann das auf dem Spritzenkorpus angegebene Maß in geeigneter Weise dazu verwendet werden, das Volumen der Silikon-/Lösungsmittellösung einzustellen, welche in die Chargenlösung injiziert wird. Sobald das Polymer/Lösungsmittel in die Spritze gefüllt wurde, wird die Nadel sauber gewischt und in die Ethanolschicht der Chargenlösung eingebracht. Der Kolben der Spritze wird langsam niedergedrückt, bis sich ein Tropfen der Polymerlösung von der Nadel löst und zügig in die Grenzschicht der Chargenlösung tropft, wo er verbleibt. Die Nadel wird nun zu einer anderen Stelle in der Ethanolschicht bewegt und es wird ein weiterer Tropfen aus der Nadel herausgepresst. Auf diese Art und Weise können in einer 20 ml fassenden Flasche etwa ein Dutzend Kugeln hergestellt werden. Die Spritze wird vorsichtig aus der Chargenlösung entfernt und die Flasche wird dann verschlossen und ruhig bei Raumtemperatur stehengelassen, bis der Aushärtungszeitraum verstrichen ist.
Um die festen Polymerkugeln aus der Chargenlösung zu entfernen, wird zum Filtrieren der Chargenlösung ein Plastikfiltertrichter mit einer Porengröße verwendet, welche kleiner ist als die Kugeln. Die zurückbehaltenen Kugeln werden dann mit 95% Ethanol gewaschen, um etwaig verbliebenes Natriumacetat zu entfernen, und trocknen gelassen. Sobald sie getrocknet sind, werden die Polymerkugeln gewogen und nach Masse sortiert.
Leistungsverhalten der optischen Sonde mit einem kugelförmigen Aufteilungselement aus Polymer
Das wie zuvor beschriebene Chargenverfahren, welches zur Massenproduktion von kugelförmigen Aufteilungselementen aus Polymer verwendet wird, stellt sicher, dass die Silikonkugeln eine konstante Größe, Morphologie und optische Reinheit aufweisen, was das Detektionslimit der optischen Sonde Sonde verbessert. Als ein Resultat werden die Equilibrierungszeit, die Signalerzeugung in einer gegebenen Produktlösung so wie Hydroxypyren oder Hydroxyanthracen, sowie die Kalibrierung von mit den Kugeln hergestellten optischen Proben standardisiert.
Wie zuvor bereits erwähnt, können bei der Herstellung von Silikonkugeln verschiedene PDMS-Formulierungen verwendet werden. Die verschiedenen Formulierungen verändern die physikalischen Eigenschaften des Polymers. So ergibt z. B. Dow Corning Sylguard 184 aufgrund eines hohen Grades an Kreuzvernetzung und der Zugabe von Füllmaterialien so wie pyrogener Kieselsäure (fumed silica) ein äußerst rigides Polymer. Dieses Polymer verfügt aufgrund seiner Fähigkeit, in Alkohollösungen der Degradation zu widerstehen und ein Aufquellen zu minimieren, über eine extreme Langlebigkeit in Lösung. Der Nachteil dieser Formulierung besteht darin, dass Kugeln von 1 mg 3 Stunden benötigen, um sich in einer Produktlösung zu equilibrieren. Eine aus United Chemical Technologies Silikon hergestellte Kugel von 1 mg equilibriert sich in 1 Stunde. Diese Kugel ist aufgrund des Fehlens von pyrogener Kieselsäure und einem geringeren Grad der Kreuzvernetzung weniger rigide als die mit Sylguard 184 hergestellte Kugel; sie ist jedoch anfälliger für Aufquellen und Degradation.

Der Grad der Kreuzvernetzung kann in beiden Formulierungen kontrolliert werden, um ein Polymer zu erzielen, dessen Equilibrierungszeit zwischen 1 und 3 Stunden liegt, wie in Tabelle 2 gezeigt ist. Tabelle 2. Formulierungen aus zwei Marken von PDMS-Materialien zur Herstellung von Kugeln.

Equilibrierungszeit pro mg	PDMS	Formulierung
3 Stunden	Dow Corning Sylguard 184	Mischung 10:1 nach Gewicht von Basis-Silikonelastomer und Aushärtungsmittel
1 Stunde	United Chemical Technologies PS443/PS123	Mischung 38:1 nach Gewicht von Basis (PS443) und Kreuzvernetzungsmittel (PS123)

Beispiel 20. Enzymimmunoassay unter Verwendung einer optischen Sonde
Einführung
Das vorliegende Beispiel beschreibt die Verwendung einer wie zuvor bereits beschriebenen optischen Sonde mit einem Aufteilungselement aus PDMS in einem Immunoassay zur Detektion von 17-β-Estradiol (E2). Zu diesem Zweck wurde ein standardmäßiges Immunoassay-Kit verwendet. Bei dem Korrelat-EIA 17-β-Estradiol-Kit von Assay Designs (Assay Designs Inc., Arm Arbor, MI) handelt es sich um einen kompetitiven Immunoassay für die quantitative Bestimmung von E2 in biologischen Proben und Umweltproben. Der standardmäßige oder gebräuchliche Ablauf des Assays wird wie folgt beschrieben:
Es wird eine Proben- oder Standardlösung, welche E2 enthalten kann, zusammen mit einer zweiten Lösung enthaltend E2, welches an eine Enzymmarkierung (AP-E2) aus alkalischer Phosphatase (AP) gebunden ist, in einen Mikrowell einer Mikrotiterplatte gegeben. Es wird polyklonaler Antikörper gegen E2 (anti-E2) in den Mikrowell, welcher zuvor mit einem weiteren Antikörper beschichtet wurde, welcher den anti-E2 irreversibel an die Oberfläche des Mikrowells bindet, zugegeben. In Relation zu der Anzahl von immobilisierten Antikörpermolekülen wird überschüssige AP-E2 zugegeben. Es erfolgt eine kompetitive Bindung von sowohl E2 als auch AP-E2, was zu einer immobilisierten Menge an AP-E2 führt, welche umgekehrt proportional zu der in der Mischung vorhandenen Menge an E2 ist. Nach einer Bindungszeitspanne werden Rückstände von Proben und Reagenzien weggewaschen und es verbleiben lediglich immobilisierte AP-E2- und E2-Antikörper-Komplexe in dem Mikrowell. Es wird eine Lösung von Substrat zugegeben, um durch eine Messung der Enzymaktivität die Menge an immobilisierter AP-E2 zu bestimmen. Es wird eine Reaktion zwischen dem Substrat und AP beobachtet, welche ein farbiges Produkt hervorbringt. Üblicherweise verwendet das im Handel erhältliche Kit p-Nitrophenylphosphat als Substrat, mit p-Nitrophenol als Produkt.
Um die Enzymaktivität zu quantifizieren wird die erzeugte gelbe Farbe entweder kontinuierlich (unter Erstellung einer Kurve der Absorptivität aufgetragen gegen die Zeit) oder nach einer festgelegten Inkubationszeit (z. B. 20 min) als Absorptivität bei 405 nm gemessen. Bei dem beobachteten „Signal" handelt es sich um die Steigung der Kurve der Absorptivität aufgetragen gegen die Zeit oder um den Wert der im Festzeitmodus gemessenen Absorptivität. Das Signal ist maximal für eine Kontrolle, welche nur AP-E2 enthält, und nimmt mit steigendem E2-Spiegel in der Probe ab. Das Signal für eine beliebige Probe in Relation zu dem Signal für eine Kontrolllösung ist ein Maß für die relative Bindung von AP- E2 und wird oftmals als eine gebundene Fraktion oder als ein gebundener Prozentanteil ausgedrückt. Ein Plot von gebundener Fraktion aufgetragen gegen die E2-Konzentration für Standardlösungen ergibt eine Kalibrierungskurve für den Assay, welche im Anschluss dazu verwendet wird, die Konzentrationen in unbekannten Proben zu bestimmen.
Bei dem in solchen Immunoassays verwendeten Detektionsinstrument handelt es sich üblicherweise um einen „Benchtop" Mikrotiterplattenleser. Dieser ist ein hoch entwickeltes und kostspieliges Gerät (~30.000 $), welches eine beträchtliche fachliche Kompetenz des Bedieners erfordert und teuer im Unterhalt ist. Alternativ dazu können auch konventionelle Spektrometer mit „Mikroplatten"-Aufnahmevorrichtungen verwendet werden. Andere Immunoassays werden in größeren Gefäßen (z. B. 5 ml Reagenzgläser umfassende Konfigurationen) durchgeführt, wobei die Detektion in einem Benchtop- oder sogar einem tragbaren Spektrometer erfolgt, wenngleich diese Geräte größere Probenvolumina sowie mehr Reagenzien pro Probe verwenden und somit mit höherem Kostenaufwand verbunden sind. Die tragbaren oder Feldversionen sind im Allgemeinen von geringerer Güte hinsichtlich der Präzision und der Detektionslimits. Andere tragbare Immunoassays verwenden „Teststreifen" zur visuellen Ablesung, diese können jedoch im Normalfall keine quantitativen Ergebnisse liefern und verfügen über ungünstigere Detektionslimits.
Wir beschreiben hierin ein alternatives Detektionsschema für standardmäßige Enzymimmunoassays unter Verwendung einer optischen Sonde zur Detektion der Enzymaktivität. Dieses kann in dem zuvor beschriebenen kompetitiven Bindungsschema sowie in allen anderen Enzymimmunoassayschemata verwendet werden, einschließend „Sandwich"-Assays, „Immunosonden" und Immunmarkierungssystemen.
In unserem Ansatz verwenden wir eine optische Sonde mit einem Aufteilungselement aus Polymer (siehe Beispiele 1 und 19, supra) zur Detektion des Pordukts. Zur Überwachung der AP-Aktivität wird ein Substrat mit einem an einer fluoreszierenden Verbindung befestigtem Phosphatrest verwendet, wobei es sich bei der fluoreszierenden Produktverbindung um eine solche handelt, die mit der optischen Sonde detektiert werden wird. Zur Demonstration dieses Ansatzes synthetisierten wir 1-Pyrenphosphat (PP), welches bei der Reaktion mit AP 1-Hydroxypyren (HOP), welches durch das Aufteilungselement der optischen Sonde effektiv detektiert wird, sowie ein Phosphation produziert.
In unserem Assay wird die optische Sonde in den Mikrowell eingebracht, welcher gebundenes AP (d.h. AP-E2) und PP-Substrat enthält. Da durch eine Reaktion von PP und AP HOP gebildet wird, wird das HOP durch die Sonde detektiert. Wie in dem konventionellen Assay kann HOP kontinuierlich ((Einbringen der Sonde vor oder gleichzeitig mit PP) oder im Endpunktmodus (Umwandlung von PP in HOP wird nach einer festgelegten Reaktionszeit gestoppt und dann wird die Sonde eingebracht) detektiert werden. In jedem der beiden Fälle handelt es sich bei dem Signal um die Steigung einer Kurve der Fluoreszenz aufgetragen gegen die Zeit und es wird unter Verwendung eines Ansatzes ähnlich dem zuvor für den konventionellen Immunoassay beschriebenen Ansatzes ein Kalibrierungsplot erzeugt.
EXPERIMENTE
Chemikalien und Reagenzien
Assay Designs" Correlate-EIA 17-β-Estradiol-Kit (Katalognr. 901-008) wurde von Assay Designs Inc. (Ann Arbor, MI) bezogen. Tris [Hydroxymethyl] Aminomethan (Tris) und MgCl₂·6H₂O wurden von Sigma-Aldrich (Mississauga, Ontario, Kanada) erhalten. 0,1 M Tris-Puffer pH 9 mit 1,0 mM MgCl₂ wurde täglich frisch hergestellt. 1-Pyrenphosphat wurde in unserem Labor synthetisiert. Substratsvorrat 4,97e-4 M wurde in 0,1 M Tris-HCl-Puffer ph 9 mit 1,0 mM MgCl₂ unmittelbar vor dem Gebrauch hergestellt. 2 M Schwefelsäure (Fisher Scientific, Ottawa, Ontario, Kanada) wurde als Stopplösung verwendet.
Geräteausstattung
Die Fluoreszenzmessungen wurden unter Verwendung eines Spektrometers (Sciencetech Inc., London, Ontario, Kanada) mit einer 75 Watt Xenon-Bogenlampe und einem Photomultiplier-Detektor durchgeführt. Anregungs- und Emissionsspalte wurden für alle Messungen auf 5 nm Bandpass eingestellt. Die Anregungswellenlänge betrug 345 nm und die Emissionswellenlänge lag bei 385 nm. Es wurde eine optische Sonde mit einem Aufteilungselement aus Polymer (siehe die Beispiele 1 und 19D) mit einem Kopplungssystem für eine optische Sonde zur Produktdetektion verwendet (siehe z. B. 3A).
Ablauf
Der Immunoassay wurde gemäß der vom Hersteller empfohlenen Vorgehensweise durchgeführt. Die Reaktionen wurden in mit Antikörper beschichteten Mikrowells durchgeführt. Alle Assays wurden für mindestens 30 Minuten vor dem Öffnen auf Raumtemperatur gebracht. 100 μl Assaypuffer wurden in das Bo-Mikrowell pipettiert und 100 μl Standards #1 bis einschließlich #6 wurden in einzelne Wells zugegeben. Es wurden dann in dem im Endpunktmodus durchgeführten Immunoassay 50 μl Konjugat und 50 μl Antikörper in jedes Well zugegeben. Für den im kinetischen Modus durchgeführten Immunoassay wurden 20 μl Konjugat und 20 μl Antikörper zugegeben und es wurde ebenfalls Assaypuffer in jedes Well zugegeben, um auf ein Gesamtvolumen von 60 μl zu kommen. Die Platte wurde mit einem Plattenversiegler bedeckt und für 2 Stunden bei unter kreisendem Schütteln bei ~500 rpm inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Platte viermal mit 300 μl/Well Waschlösung gewaschen.
Nach dem Auswaschen der unreagierten Reagenzien wurden 250 μl gepufferter PP-Lösung in die Wells gegeben. In dem kontinuierlichen Immunoassay wurde die optische Sonde vor oder gleichzeitig mit der PP-Lösung zugegeben. In dem im Endpunktmodus durchgeführten Immunoassay wurde nach 30 min Inkubation bei Raumtemperatur die PP-Umwandlungsreaktion mit 50 μl 2M H₂SO₄ gestoppt und es wurde im Anschluss die optische Sonde in die Lösung eingebracht. In jedem der beiden Fälle wurde die HOP-Aufnahmekurve umkodiert, bis eine verlässliche Steigung erhalten wurde. Im Anschluss an jeden Assay wurde das Aufteilungselement aus Polymer der optischen Sonde mit entweder einer 50/50 (v/v) Ethanol/Wasserlösung oder einer 1 M NaOH-Lösung von HOP gereinigt.
ERGEBNISSE UND DISKUSSION
Bestimmung der Parameter K_M und ν_max
Die kinetischen Parameter nach Michaelis-Menten zur Detektion der AP-Aktivität wurden bestimmt, da niemals zuvor von PP als Substrat für dieses Enzym berichtet worden war. Die Rate der Substratsumwandlung als eine Funktion der Substratskonzentration wurde dadurch bestimmt, dass ein Satz von Kurven des Signals der optischen Sonde aufgetragen gegen die Zeit erzeugt wurde. Die Raten wurden als eine Funktion der Substratskonzentration geplottet (siehe 20) und eine nicht lineare Kurvenanpassung ergab die kinetischen Parameter ν_max = 9 × 10^–3 mol/s und K_M = 2,45 × 10^–5 M. Im Idealfall würde eine Arbeitskonzentration des Assays von etwa 10 × K_M in Assays verwendet werden, um die Sensitivität und die Reproduzierbarkeit der Steigung zu maximieren. Da die Inhibition der Enzymaktivität durch PP auf dem Level von 2 × 10^–4 M angezeigt wird, entschlossen wir uns, für weitere Assays unter Verwendung von PP die maximale verlässliche Konzentration von 5 × KM (1,25 × 10^–4 M) zu verwenden.
Immunoassay mit optischer Sonde
Es wurde ein Immunoassay unter Verwendung von 1,25 × 10^–4 M Substratlösung in ph 9-Puffer im Endpunktmodus durchgeführt. Nach dem Eintauchen in die Stoppzeitlösung wurden Antworten von den optischen Sonden erhalten. Wie erwartet lieferten Proben mit einer höheren E2-Konzentration geringere Mengen an gebundenem E2-AP und damit auch niedrigere Antworten der optischen Sonde. Es wurden relative Antworten dazu verwendet, die % an gebundenem E2-AP zu berechnen. Das Plot von gebundenen % aufgetragen gegen die E2-Konzentration, welche im Wesentlichen die Kalibrierungskurve für den Assay darstellt, ist in 21 gezeigt.
Die gleichen Immunoassayparameter wurden im kinetischen Modus verwendet, um ein Plot des Signals der optischen Sonde aufgetragen gegen die Zeit zu erzeugen. Diese Daten wurden mit einer wie in Beispiel 19 beschriebenen optischen Sonde erhalten und dazu verwendet, die in 22 gezeigte Kurve für gebundene % zu erzeugen.
SCHLUSSFOLGERUNG
Die vorliegenden Ergebnisse zeigen an, dass dieses neue Verfahren für Enzymimmunoassays unter Verwendung einer optischen Sonde zur Detektion der Enzymaktivität Ergebnisse hervorbringt, welche mit denen der konventionellen Verfahren für Enzymimmunoassays vergleichbar sind, ohne dass dazu kostspielige Detektionsgeräte erforderlich sind.
Äquivalente
Der Fachmann wird die Varianten der zuvor beschriebenen Ausführungsformen anerkennen oder dazu in der Lage sein, diese mittels routinemäßiger Experimentation nachzuprüfen. Solche Varianten liegen im Rahmen der vorliegenden Erfindung sowie im Rahmen der angehängten Patentansprüche.
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Claims

Verfahren zum Nachweisen des Vorhandenseins eines mindestens ein Enzym beinhaltenden Organismus in einer Probe, umfassend: Bereitstellen mindestens eines Substrats; Bereitstellen eines Aufteilungselements; Vereinigen der Probe mit dem mindestens einen Substrat unter Bedingungen, die es dem mindestens einen Enzym des Organismus erlauben, mit dem mindestens einen Substrat zu reagieren, um ein biologisches Molekül zu produzieren und es dem biologischen Molekül erlauben, sich in das Aufteilungselement abzutrennen; und Nachweisen der Fluoreszenz dieses biologischen Moleküls in diesem Aufteilungselement; wobei diese nachgewiesene Fluoreszenz indikativ ist für das Vorhandensein dieses Organismus in der Probe.
Verfahren zum Nachweisen des Vorhandenseins eines mindestens ein Enzym beinhaltenden Organismus in einer Probe, umfassend: Bereitstellen mindestens eines Substrats; Bereitstellen eines Aufteilungselements; Vereinigen der Probe mit dem mindestens einen Substrat unter Bedingungen, die es dem mindestens einen Enzym des Organismus erlauben, mit dem mindestens einen Substrat zu reagieren, und es dem nicht-reagierenden Substrat erlauben, sich in das Aufteilungselement abzutrennen; und Nachweisen der Fluoreszenz dieses nicht-reagierenden Substrats in dem Aufteilungselement; wobei die Menge dieser nachgewiesenen Fluoreszenz indikativ ist für das Vorhandensein dieses Organismus in der Probe.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei dieses Aufteilungselement einen Polymerfilm umfasst.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei dieser Polymerfilm ein hydrophobes Polymer umfasst.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei dieses hydrophobe Polymer ein Polydimethylsiloxan (PDMS) umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei diese Bedingungen wässrige Bedingungen umfassen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Nachweisen der Fluoreszenz das Nachweisen einer Änderung in der Menge an Fluoreszenz umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei dieser Organismus ein Mikroorganismus ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei dieser Mikroorganismus eine biologische Kontaminante ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei dieses mindestens eine Enzym ausgewählt ist aus β-Glucuronidase und β-Galactosidase.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei dieser Mikroorganismus ausgewählt ist aus Escherichia coli und Gesamt Coliformen Bakterien.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei dieses mindestens eine Substrat ausgewählt ist aus Pyren-β-D-Glucuronid, Anthracen-β-D-Glucuronid, Pyrromethen-β-D-Glucuronid, Pyren-β-D-Galactopyranosid und Anthracen-β-D-Galactopyranosid.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei diese Probe ausgewählt ist aus Wasser, einer biologischen Probe, Nahrung und Erdreich.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei dieses Enzym und dieses Substrat gemeinsam in einer dieses Aufteilungselement umfassenden Kartusche angeordnet sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Substrat sich nicht in das Aufteilungselement abtrennt.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Produkt des Substrats, welches mit dem mindestens einem Enzym reagiert hat, sich nicht in das Aufteilungselement abtrennt.
Eine optische Sonde zum Nachweisen von Fluoreszenz eines Moleküls, umfassend: einen Lichtwellenleiter; und ein Aufteilungselement, angeordnet an einem Ende des Lichtwellenleiters; wobei sich dieses Molekül selektiv in das Aufteilungselement abtrennt, derart, dass die Fluoreszenz des Moleküls an den Wellenleiter gekoppelt ist.
Optische Sonde nach Anspruch 17, wobei das Fluoreszenzmolekül ausgewählt ist aus einem Enyzmsubstrat und einem Produkt einer Enzymsubstratreaktion.
Optische Sonde nach Anspruch 17 oder 18, wobei das Aufteilungselement einen Polymerfilm umfasst.
Optische Sonde nach Anspruch 19, wobei der Polymerfilm ein hydrophobes Polymer umfasst.
Optische Sonde nach Anspruch 20, wobei das hydrophobe Polymer Polydimethylsiloxan (PDMS) umfasst.
Optische Sonde nach einem der Ansprüche 17 bis 21, wobei der Lichtwellenleiter ein Glasfaserleiter ist.
Vorrichtung zum Nachweisen des Vorhandenseins eines Moleküls, umfassend: die optische Sonde nach Anspruch 17; eine anregende Lichtquelle; und einen Detektor zum Nachweisen der Fluoreszenz dieses Moleküls; wobei diese nachgewiesene Fluoreszenz indikativ ist für das Vorhandensein dieses Moleküls.
Vorrichtung nach Anspruch 23, wobei das Aufteilungselement einen Polymerfilm umfasst.
Vorrichtung nach Anspruch 24, wobei der Polymerfilm ein hydrophobes Polymer umfasst.
Vorrichtung nach Anspruch 25, wobei das hydrophobe Polymer Polydimethylsiloxan (PDMS) umfasst.
Vorrichtung nach Anspruch 23, wobei das Fluoreszenzmolekül ausgewählt ist aus einem Enzymsubstrat und einem Produkt aus einer Enzymsubstratreaktion.
Vorrichtung nach Anspruch 27, wobei dieses Enzym mit einem Mikroorganismus assoziiert ist.
Vorrichtung nach Anspruch 27 oder 28, wobei dieses Enzym ausgewählt ist aus β-Glucuronidase und β-Galactosidase.
Vorrichtung nach Anspruch 28, wobei dieser Mikroorganismus ausgewählt ist aus Escherichia coli und Gesamt Coliformen Bakterien.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 23 bis 30, wobei dieses Substrat ausgewählt ist aus Pyren-β-D-Glucuronid, Anthracen-β-D-Glucuronid, Pyrromethen-β-D-Glucuronid, Pyren-β-D-Galactopyranosid und Anthracen-β-D-Galactopyranosid.
System zum Nachweisen des Vorhandenseins eines mindestens ein Enzym beinhaltenden Organismus in einer Probe, umfassend: ein Gefäß zum Inkubieren der Probe mit dem mindestens einen Substrat, derart, dass das mindestens eine Enzym mit dem mindestens einen Substrat reagieren kann, um ein biologisches Molekül zu produzieren; ein Aufteilungselement, welches das Abtrennen dieses biologischen Moleküls dorthinein erlaubt; eine anregende Lichtquelle, welche das biologische Molekül, das sich in dieses Aufteilungselement abgetrennt hat, bestrahlt; ein Detektor, der die Fluoreszenz dieses biologischen Moleküls, das sich in dieses Aufteilungselement abgetrennt hat, nachweist; und eine Kontrolleinheit; wobei diese nachgewiesene Fluoreszenz indikativ ist für das Vorhandensein dieses Organismus in der Probe.
System nach Anspruch 32, wobei das Aufteilungselement einen Polymerfilm umfasst.
System nach Anspruch 33, wobei der Polymerfilm ein hydrophobes Polymer umfasst.
System nach Anspruch 34, wobei das hydrophobe Polymer Polydimethylsiloxan (PDMS) umfasst.
System nach einem der Ansprüche 32 bis 35, wobei das mindestens eine Substrat sich nicht in das Aufteilungselement abtrennt.
System nach einem der Ansprüche 32 bis 36, wobei die Kontrolleinheit mindestens eine Funktion ausführt, ausgewählt aus Kontrollieren des Betriebs dieses Systems, Speicherung von Daten betreffend den Fluoreszenznachweis und Ausgeben von Daten betreffend den Fluoreszenznachweis.
System nach einem der Ansprüche 32 bis 37, wobei das Gefäß eine austauschbare Kartusche zum Aufnehmen der Probe und des Substrats umfasst.
System nach Anspruch 38, wobei dieses Aufteilungselement in dieser austauschbaren Kartusche angeordnet ist.
System nach einem der Ansprüche 32 bis 39, weiterhin umfassend eine Kommunikationseinheit, welche Daten betreffend den Fluoreszenznachweis an ein Kommunikationsnetzwerk weiterleitet.
System nach einem der Ansprüche 32 bis 40, wobei dieser Organismus eine biologische Kontaminante ist.
System nach einem der Ansprüche 32 bis 41, wobei die Probe ausgewählt ist aus Wasser, einer biologischen Probe, Nahrung und Erdreich.
System nach einem der Ansprüche 32 bis 42, wobei dieses Enzym ausgewählt ist aus β-Glucuronidase und β-Galactosidase.
System nach Anspruch 41, wobei dieser Organismus ausgewählt ist aus Escherichia coli und Gesamt Coliformen Bakterien.
System nach einem der Ansprüche 32 bis 44, wobei dieses mindestens eine Substrat ausgewählt ist aus Pyren-β-D-Glucuronid, Anthracen-β-D-Glucuronid, Pyrromethen-β-D-Glucuronid, Pyren-β-D-Galactopyranosid und Anthracen-β-D-Galactopyranosid.
System nach einem der Ansprüche 32 bis 45, weiterhin umfassend Mittel zum Kalibrieren dieses Aufteilungselements und/oder der optischen Komponenten des Systems oder zum Überwachen dieses Fluoreszenznachweises oder beides.
System nach Anspruch 46, wobei dieses Mittel zum Kalibrieren dieses Aufteilungselements und/oder der optischen Komponenten und/oder zum Überwachen dieses Fluoreszenznachweises umfasst: ein Fluorophor, welches sich in dieses Aufteilungselement abtrennt und bei einer anderen Wellenlänge als dieses biologische Molekül fluoresziert; wobei diese Fluoreszenz dieses Fluorophors durch den Detektor nachgewiesen wird; und wobei diese Kontrolleinheit die nachgewiesene Fluoreszenz verwendet, um das Aufteilungselement und/oder die optischen Komponenten des Systems zu kalibrieren oder den Fluoreszenznachweis des Systems zu überwachen.
Kit zum Nachweisen einer biologischen Kontaminante in einer Probe, umfassend: Vorrichtung nach Anspruch 23; und mindestens ein Substrat für ein Enzym, das mit dieser biologischen Kontaminante assoziiert ist; wobei der Kit einen Hinweis auf das Vorhandensein oder die Menge dieser biologischen Kontaminante in der Probe liefert.
Kit nach Anspruch 48, wobei das Aufteilungselement einen Polymerfilm umfasst.
Kit nach Anspruch 49, wobei der Polymerfilm ein hydrophobes Polymer umfasst.
Kit nach Anspruch 50, wobei das hydrophobe Polymer Polydimethylsiloxan (PDMS) umfasst.
Kit nach einem der Ansprüche 48 bis 51, wobei das mindestens eine Substrat sich nicht in das Aufteilungselement abtrennt.
Kit nach einem der Ansprüche 48 bis 52, weiterhin umfassend ein Gefäß zum Inkubieren der Probe mit dem mindestens einen Substrat.
Kit nach einem der Ansprüche 48 bis 53, wobei diese Probe ausgewählt ist aus Wasser, Nahrung, einer biologischen Probe und Erdreich.
Kit nach einem der Ansprüche 48 bis 54, wobei diese biologische Kontaminante mindestens ein Mikroorganismus ist, ausgewählt aus Escherichia coli und Gesamt Coliformen Bakterien.
Kit nach einem der Ansprüche 48 bis 55, wobei das Enzym mindestens ein Enzym ist, ausgewählt aus β-Glucuronidase und β-Galactosidase.
Kit nach einem der Ansprüche 48 bis 56, wobei das Substrat mindestens ein Substrat ist, ausgewählt aus Pyren-β-D-Glucuronid, Anthracen-β-D-Glucuronid, Pyrromethen-β-D-Glucuronid, Pyren-β-D-Galactopyranosid und Anthracen-β-D-Galactopyranosid.
Verfahren zum Nachweisen des Vorhandenseins einer Zielspezies in einer Probe, umfassend: Vereinigen eines für diese Zielspezies spezifischen Antikörpers mit einer Probe unter Bedingungen, die es dem Antikörper erlauben, an die Zielspezies zu binden; Bereitstellen eines Enzyms, welches die Quantifizierung dieses gebundenen Antikörpers durch die Produktion eines Fluoreszenzmoleküls erlaubt; Bereitstellen eines festen Aufteilungselements zum Abtrennen dieses Fluoreszenzmoleküls dorthinein; und Nachweisen der Fluoreszenz dieses Fluoreszenzmoleküls in diesem Aufteilungselement; wobei diese nachgewiesene Fluoreszenz indikativ ist für das Vorhandensein dieser Zielspezies in der Probe.
Verfahren nach Anspruch 58, wobei das Aufteilungselement einen Polymerfilm umfasst.
Verfahren nach Anspruch 59, wobei der Polymerfilm ein hydrophobes Polymer umfasst.
Verfahren nach Anspruch 60, wobei das hydrophobe Polymer Polydimethylsiloxan (PDMS) umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 58 bis 61, wobei das Substrat des Enzyms, welches das Fluoreszenzmolekül produziert, sich nicht in das Aufteilungselement abtrennt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 58 bis 62, wobei dieser Antikörper mit diesem Enzym konjugiert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 58 bis 62, wobei dieses Enzym mit einem zweiten Antikörper konjugiert ist, welcher spezifisch ist für den Antikörper, der für die Zielspezies spezifisch ist und das Konjugat mit der Zusammensetzung aus dem für die Zielspezies spezifischen Antikörper und der Probe gemischt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 58 bis 64, wobei die Fluoreszenz fortlaufend während der gesamten Enzymsubstratreaktion gemessen wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 58 bis 65, wobei die Fluoreszenz nach einer festgesetzten Zeit der Enzymsubstratreaktion gemessen wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 58 bis 66, wobei die Zielspezies eine biologische oder chemische Kontaminante ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 58 bis 67, wobei die Zielsequenz ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Bakterien, Protozoen und Viren.