MXPA05003068A

MXPA05003068A - Deteccion de moleculas biologicas por separacion diferencial de sustratos y productos enzimaticos.

Info

Publication number: MXPA05003068A
Application number: MXPA05003068A
Authority: MX
Inventors: J Bowers Raymond
Original assignee: Univ Kingston
Priority date: 2002-09-20
Filing date: 2003-09-22
Publication date: 2005-06-08
Also published as: CA2497555C; DE60315043D1; CA2497555A1; US20040106164A1; JP4857434B2; DE60315043T2; US20130217041A1; WO2004027084A1; AU2003266899A1; JP2005538728A; US8632966B2; EP1539986B1; US20140295403A1; JP5799353B2; ES2290487T3; AU2003266899B2; HK1080514A1; US7402426B2; ATE367449T1; JP2011254816A

Abstract

Esta invencion se relaciona a un metodo y aparato para detectar una molecula biologica asociada con la actividad enzimatica en una muestra. La invencion es aplicable para detectar un microorganismo asociado con una enzima en una muestra tal como agua, alimento, tierra o una muestra biologica. De acuerdo con una modalidad preferida del metodo de la invencion, una muestra que contiene una enzima de interes o un microorganismo asociado con la enzima se combina con un sustrato adecuado, y un producto fluorescente de la reaccion de enzima-sustrato se detecta selectivamente. El producto fluorescente se detecta con un sensor optico/elemento de separacion de la invencion. En una modalidad, elemento de separacion se proporciona para dividir unicamente la molecula del producto fluorescente en el sensor. La invencion tambien proporciona un sistema automatizado para verificar contaminacion biologica de agua y otras muestras.

Description

DETECCIÓN DE MOLÉCULAS BIOLÓGICAS POR SEPARACIÓN DIFERENCIAL DE SUSTRATOS Y PRODUCTOS ENZIMÁTICOS DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Esta invención se relaciona a un método y aparato para detectar moléculas biológ i ca s , tales como enzimas asociadas con contaminantes biológicos, en muestras tales como agua y productos alimenticios, por separación diferencial de sustratos y productos enzimáticos. En particular, esta invención se relaciona a un método y aparato para detectar actividad enzimática. La capacidad para detectar moléculas biológicas asociadas con actividad enzimática tiene aplicación en campos tales como experimentación para contaminación biológica de agua y productos alimenticios. De particular interés es la capacidad para detectar contaminación biológica de agua (por ejemplo, bacterial) . Usualmente, métodos para detección de bacterias tales como Escherichia coli (E. coli o EC) y coliforme total (TC) se basan en la detección de actividad enzimática indicadora en un caldo diseñado para promover el crecimiento del organismo objetivo. Las enzimas indicadoras aceptadas son 3-glucuronidasa (ß-qlu) y ?-galactosidasa {ß-gal) para EC y TC, respectivamente. Los métodos que utilizan estas enzimas se basan en una reacción de la enzima con un compuesto cromogénico o fluorogénico para medir la actividad enzimática (para revisiones, véase las referencias 1 y 2) . En el caso de ß-ql o ß-gal, usualmente se agrega al calcio de muestra un conjugado de glucuronida o galactosida de un compuesto de tinte como un sustrato, y si se presentan las enzimas objetivo, el conjugado se convierte a una molécula libre de tinte. Se detecta la conversión dependiente de enzima por un cambio en color o fluorescencia de la molécula libre de tinte comparada al conjugado. Algunas pruebas utilizan productos solubles detectados en solución, con las células coliformes usualmente suspendidas también en solución. Otras células coliformes en la superficie de un filtro, membrana o gel, usualmente con un producto de tinte insoluble el cual se adsorbe en la base para formar una mancha coloreada o fluorescente alrededor de las colonias de organismos (3) objetivo. Algunos formatos de soporte utilizan múltiples sustratos de tinte los cuales producen una variedad de colores que dependen de cuales organismos se presenten. Sin embargo, los métodos anteriores son vulnerables a fuentes de error, tales como aplicabilidad del caldo y condiciones de incubación para todos los tipos coliformes objetivos, asi como la presencia de organismos no objetivo, que pueden contribuir a la actividad enzimática indicadora. No obstante, la veracidad de métodos establecidos es suficientemente elevada a tal graoo que existe amplia aceptación reguladora de estos métodos para la evaluación de muestras que varían de productos de carne a agua potable.

Además, en la rutina o usos comerciales de tales sustratos, la detección se hace usualmente de manera visual por el ojo humano, el cual presenta limitaciones significativas en rendimiento. Un gran número de células coliformes debe presentarse antes de que suficiente sustrato sea convertido al producto que será visible. Esto requiere incubación significativa y crecimiento para la detección de un número pequeño inicial de células, y una muestra de 100 mL estándar se incuba durante 24 horas para proporcionar un limite de detección de una célula coliforme en la muestra inicial. En algunos casos, se reporta detección más rápida, pero normalmente solo con una detección más elevada limitada aceptada (por ejemplo, 100 a 300 células en una muestra de 100 mi {4, 5, 6) ) · También, la detección visual no es cuantitativa, y estas pruebas se utilizan normalmente en un modo de "presencia/ausencia" en donde el número actual de células coliformes no se determina. Una excepción a la última es algunos métodos de colocación de placas, en donde el número de colonias se cuenta y por lo consiguiente el número de células en la muestra se determina cuantitativamente (3) . Esto, sin embargo, es un proceso lento, que requiere mucho trabajo el cual requiere también incubación larga, y tiene un margen dinámico limitado. De acuerdo a un aspecto de la invención, se proporciona un método para detectar una molécula biológica asociada con la actividad de al menos una enzima en una muestra, que comprende: combinar al menos una enzima con al menos un sustrato bajo condiciones que permitan a la enzima hacerse reaccionar con el sustrato; proporcionando un elemento de separación para la separación de tal molécula biológica en éste; y detectando la fluorescencia de tal molécula biológica en el elemento de separación; en donde la fluorescencia es indicativa de actividad de la enzima. En una modalidad, el elemento de separación comprende un sensor óptico. En otra modalidad, el elemento de separación comprende una película polimérica, tal como polidimetilsiloxano (PDMS) . En una modalidad preferida, las condiciones que permiten a la enzima hacerse reaccionar con el sustrato comprenden condiciones acuosas. En una modalidad, la molécula biológica es el sustrato y la detección de la fluorescencia comprende detectar un cambio en cantidad de luorescencia. En una modalidad preferida, la molécula biológica es un producto de la reacción de la enzima-sustrato. En una modalidad, la actividad er.zimática se asocia con un microorganismo. En una modalidad preferida, el microorganismo es un contaminante biológico. En otra modalidad, al menos una enzima se selecciona de ß-glucuronidasa y ?-galactosidasa . En una modalidad preferida, el microorganismo se selecciona a partir de E. coli y coliforme total. En varias modalidades al menos un sustrato se selecciona de piren-/?-D-glucuronida , ant racen-/?- D-glucuronida, pirrometen-?-D-glucuronida, piren-/?-D-galactopiranosida y antracen-/?-D-galactopiranosida, y la actividad enzimática se detecta en una muestra seleccionada a partir de agua, una muestra biológica, alimento y tierra. En una modalidad, la enzima y el sustrato se combinan en un cartucho el cual comprende el elemento de separación . De acuerdo con un segundo aspecto de la invención, se proporciona un método para detectar un contaminante biológico en una muestra, que conprende: combinar la muestra con al menos un sustrato bajo condiciones las cuales permiten a una enzima asociarse con el contaminante biológico para hacerse reaccionar con el sustrato; y detectar la fluorescencia de un producto de la reacción de enzima-sustrato; en donde la fluorescencia es indicativa del contaminante biológico en la muestra. En V3.?1. a.s modalidades, la muestra se selecciona a partir de agua, una muestra biológica, alimento y tierra. En una modalidad preferida, la fluorescencia de un producto de la 'reacción de enzima-sustrato se detecta por la separación del producto en un sensor óptico. En una modalidad, las condiciones que permiten a la enzima hacerse reaccionar con el sustrato comprenden condiciones acuosas. En otra modalidad, la enzima es al menos una de /?-glucuronidasa y /?-galactosidasa . En una modalidad adicional, el microorganismo se selecciona de E. coli y coliforme total. En modalidades adicionales, al menos un sustrato se selecciona de piren-/?-D-glucuronida, antracen-?- D-glucuronida, pirrometen-?-D-glucuronida y piren- ?-D- galactopiranosida . De acuerdo con un tercer aspecto de la invención, se proporciona un sensor óptico para detectar fluorescencia de una molécula, que comprende: un guiaondas óptico; y un elemento de separación dispuesto en un extremo del guiaondas; en donde la molécula fluorescente se separa selectivamente en el elemento de separación, de manera que la fluorescencia se acopla en el guiaondas. En una modalidad, la molécula fluorescente se selecciona de un sustrato enzimático y un producto de una reacción de enzima-sustrato. En otra modalidad, el elemento de separación es una película polimérica. En una modalidad preferida, la película polimérica comprende polidimetilsiloxano (PDMS) . En otra modalidad, el sensor óptico comprende además un espectrómetro para medir tal fluorescencia . De acuerdo con un cuarto aspecto de la invención, se proporciona un aparato para detectar fluorescencia de una molécula, que comprende: un sensor óptico como se describe anteriormente; una fuente luminosa de excitación; y un espectrómetro para medir la fluorescencia de la molécula; en donde tal fluorescencia es indicativa de tal molécula. En una modalidad preferida, la molécula fluorescente se selecciona de un sustrato enzimático y un producto de una reacción de enzima-sustrato. En una modalidad, la enzima se asocia con un microorganismo. En varias modalidades, la enzima se selecciona de ß-glucuronidasa y ?-galactosidasa . En modalidades adicionales, el microorganismo se selecciona de E. coli y coliforme total. En varias modalidades, el sustrato se selecciona de piren-/?-D-glucuronida , antracen-?-D-giucuronida , pirrometen-?-D-glucuronida y piren-/?-D-galactopiranosida . De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un sistema automatizado para detectar un contaminante biológico en una muestra, que comprende: un incubador de muestra para incubar la muestra con al menos un sustrato bajo condiciones las cuales permiten a una enzima asociarse con un microorganismo para hacerse reaccionar con el sustrato; un aparato como se describe anteriormente para detectar fluorescencia de un producto de la reacción de enzima-sustrato; y una unidad de control para controlar la operación del sistema y para almacenar y para producir datos que se relacionan a la detección de fluorescencia; e.n donde la fluorescencia detectada es indicativa del contaminante biológico en la muestra. En una modalidad, el sistema comprende además una unidad de comunicaciones para transmitir datos que se relacionan a contaminación biológica de la muestra. En varias modalidades, la muestra se selecciona de agua, una muestra biológica, alimento y tierra. En una modalidad preferida, las condiciones que permiten a la enzima hacerse reaccionar con el sustrato comprenden condiciones acuosas. En modalidades adicionales, la enzima se selecciona de ?-glucuronidasa y ß-galactosidasa , y el microorganismo se selecciona de E. coli y coliforme total. En varias modalidades, al menos un sustrato se selecciona de piren-/?-D-glucuronida, antracen-/?-D-glucuronida, pirrometen-?-D-glucuronida , y piren-?-D-galactopiranosida . De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un equipo para detectar un contaminante biológico en una muestra, que comprende: un aparato como se describe anteriormente; un sustrato para una enzima asociada con el contaminante biológico; y un incubador para incubar la muestra y el sustrato; en donde el equipo proporciona una indicación del contaminante biológico en la muestra. En varias modalidades, la muestra se selecciona de agua, alimento, una muestra biológica y tierra. En una modalidad preferida, el contaminante biológico es al menos un microorganismo seleccionado de E. coli y coliforme total.

En una modalidad, la enzima es al menos una enzima selecciona de ?-glucuronidasa y /?-galactosidasa . En una modalidad adicional, el sustrato es al menos un sustrato seleccionado de piren-/?- D-glucuronida , antracen-/?-D- glucuronida, pirrometen-/?-D-glucuronida , y piren-/?-D- galactopi anosida. De acuerdo a otro aspecto de la invención, se proporciona un sensor óptico para detectar fluorescencia de una molécula, que comprende: un guiaondas óptica; y un elemento de separación dispuesto en un extremo del guiaondas óptico; en donde la molécula se separa selectivamente en el elemento de separación, de manera que la fluorescencia de la molécula se acopla en el guiaondas. En una modalidad, la molécula fluorescente se selecciona de un sustrato enzimático y un producto de una reacción de enzima-sustrato. En otra modalidad, el elemento de separación es una película polimérica. En una modalidad preferida, la película polimérica comprende polidimetilsiloxano (PDMS). En otra modalidad, el guiaondas óptico es una fibra óptica. De acuerdo a otro aspecto de la invención, se proporciona un aparato para detectar la presencia de una molécula, que comprende: el sensor óptico descrito anteriormente; una fuente luminosa de excitación; y un detector para detectar fluorescencia de la molécula; en donde la fluorescencia detectada es indicativa de la presencia de la molécula. En una modalidad, la molécula fluorescente se selecciona de un sustrato enzimático y un producto de una reacción de enzima-sustrato. En otra modalidad, la enzima se asocia con un microorganismo. En una modalidad adicional, la enzima se selecciona de /?-glucuronidasa y /3-galactosidasa . En una modalidad, el microorganismo se selecciona de £. coii y coliforme total. En otra modalidad, el sustrato se selecciona de piren-?-D-glucuronida , antracen-?-D-glucuronida, pirrometen-/?-D-glucuronida, piren-ß-?-galactopiranosida y antracen-?-D-galactopiranosida . De acuerdo a otro aspecto de la invención, se proporciona un sistema para detectar una molécula biológica asociada con la actividad de al menos una enzima en una muestra, que comprende: un recipiente para incubar la muestra y al menos un sustrato de manera que la enzima reaccione con el sustrato para producir la molécula biológica; un elemento de separación que permita la separación de la molécula biológica en éste; una fuente luminosa de excitación que irradie la molécula biológica separada en el elemento de separación; un detector que detecte fluorescencia de la molécula biológica separada en el elemento de separación; y una unidad de control; en donde la fluorescencia detectada es indicativa de actividad de la enzima en la muestra.

En una modalidad, la unidad control realiza al menos una función seleccionada a partir de controlar la operación del sistema, almacenar datos que se relacionan a la detección de fluorescencia, y produciendo datos que se relacionan a la detección de fluorescencia. En otra modalidad, el recipiente comprende un cartucho removióle que contiene la muestra y el sustrato. En otra modalidad, el elemento de separación se dispone en el cartucho removióle. En una modalidad adicional, el sistema comprende una unidad de comunicaciones que transmite datos con relación a la detección de fluorescencia a una red de comunicaciones. En otra modalidad, la enzima se asocia con un contaminante biológico. En una modalidad adicional, la muestra se selecciona de agua, una muestra biológica, alimento y tierra. En otra modalidad, la enzima se selecciona de ?-glucuronidasa y ?-galactosidasa , y el contaminante biológico se selecciona de E. coli y coliforme total. En varias modalidades, al menos un sustrato se selecciona de piren-/?-D-glucuronida , antracen-/?-D-glucuronida, pirrometen- ?-D-glucuronida , piren-/?-D-galactopiranosida y antracen-/?-D-galactopiranosida . En otra modalidad, el sistema comprende además medios para calibrar el elemento de separación y componentes ópticos del sistema o para verificar la detección de fluorescencia, o ambos. En una modalidad, el medio para calibrar el elemento de separación y para verificar la detección de fluorescencia comprende: un fluoróforo que se separa en el elemento de separación y las fluorescencias en una longitud de onda diferente que la molécula biológica; en donde la fluorescencia de tal fluoróforo se detecta por el detector; y en donde la unidad de control utiliza la fluorescencia detectada par calibrar el elemento de separación y los componentes ópticos del sistema o para verificar la detección de fluorescencia del sistema. De acuerdo a otro aspecto de la invención, se proporciona un equipo para detectar un contaminante biológico en una muestra, que comprende: el aparato descrito anteriormente; y un .sustrato para una enzima asociada con el contaminante biológico; en donde el equipo proporciona una indicación de la presencia o cantidad del contaminante biológico en la muestra. En otra modalidad, el equipo comprende además un recipiente para incubar la muestra y el sustrato. En una modalidad, la muestra se selecciona de agua, alimento, una muestra biológica y tierra. En otra modalidad, el contaminante biológico es al menos un microorganismo seleccionado de E. coli y coliforme total. En otra modalidad, la enzima es al menos una enzima seleccionada de ß-glucuronidsa y /?-galactosidasa . En otra modalidad, el sustrato es al menos un sustrato seleccionado de piren-/?-D- glucuronida , antracen-/?-D-glucuronida , pirrometen- ?-D-glucuronida, piren-?-D-galactopiranosida y antracen-/J-D-galactopiranosida. De acuerdo a otro aspecto de la invención, se proporciona un método para detectar una especie objetivo, que comprende: combinar un anticuerpo que es especifico para tal especie objetivo, con una muestra bajo condiciones que permiten al anticuerpo unirse a la especie objetivo; proporcionando una enzima que permite la cuantificación del anticuerpo unido produciendo una molécula fluorescente; proporcionando un elemento de separación para dividir la molécula fluorescente en el mismo; y detectar la fluorescencia de la molécula fluorescente en el elemento de separación; en donde la fluorescencia detectada es indicativa de actividad de la enzima en la muestra. En una modalidad, el anticuerpo se conjuga a la enzima. En otra modalidad, la enzima se conjuga a un segundo anticuerpo que es especifico al anticuerpo que es especifico para la especie objetivo y el conjugado se mezcla con la combinación del anticuerpo especifico para la especie objetivo y la muestra. En otra modalidad, la fluorescencia se detecta continuamente a través de toda la reacción de enzima-sustrato. En otra modalidad, se detecta la fluorescencia después de un tiempo determinado durante la reacción de enzima-sustrato. En una modalidad adicional, la especie objetivo es un contaminante biológico o químico. En otra modalidad, la especie objetivo se selecciona del grupo que consiste de bacterias, protozoarios y virus. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La invención se describirá ahora, a modo de ejemplo, con referencia a los dibujos anexos, en donde: La Figura 1 muestra un esquema para la detección de sensor óptico de la actividad enzimática de acuerdo con la invención; la Figura 2A es una fotomicrografía de una modalidad de un sensor óptico de acuerdo con la invención; la Figura 2B es un diagrama esquemático de otra modalidad de un sensor óptico de acuerdo con la invención; la Figura 3A muestra un sensor óptico y asocia componentes ópticos de acuerdo con una modalidad de la invención; la Figura 3B es un esquemático de un sistema automatizado para verificar la actividad enzimática de acuerdo con la invención; la Figura 3C es un diagrama esquemático de un cartucho de prueba para uso en una unidad de muestra automática de la invención; la Figura 3D es un diagrama esquemático de un depósito para mantener uno o más de los cartuchos de prueba mostrados en la Figura 3C; la Figura 3E es un diagrama esquemático de un unidad de muestra automática de acuerdo con la invención, en donde las lineas punteadas representan la trayectoria óptica ; la Figura 4 es un diagrama esquemático de un sensor óptico y aparato configurado para detectar actividad enzimática; la Figura 5 es una gráfica que muestra la velocidad de separación del hidroxipireno en un sensor óptico de PDMS de acuerdo con una modalidad de la invención; la Figura 6 es una curva de calibración del sensor óptico para hidroxipireno; la Figura 7 es una gráfica que compara la fluorescencia detectada por un sensor óptico de la invención en la presencia y ausencia de una enzima; la Figura 8 es una gráfica de velocidad de la formación de molécula objetivo como se detecta por un sensor óptico de la invención, como una función de la concentración del sustrato, para la glucuronidasa enzimática; la Figura 9 es una curva de calibración de la actividad de glucuronidasa basada en la fluorescencia detectada por un sensor óptico de acuerdo con una modalidad de la invención; la Figura 10 es una gráfica que muestra detección de sensor óptico de E. coli para diversas concentraciones iniciales ce células E. coli; las Figuras 11A a 11D son gráficas que ilustran los modelos cinéticos para tiempo para detección de E. coli o coliforme total utilizando un sustrato y un sensor óptico de acuerdo con la invención, en donde La Figura 11A muestra el tiempo de detección de E. coli en varios conteos de célula inicial con un sustrato de piren-?-D-glucuronida; la Figura 11B muestra el tiempo de detección de E. coli en varios conteos de célula inicial con un sustrato de antracen-?-D-glucuronida ; la Figura 11C muestra el tiempo de detección coliforme total en varios conteos celulares utilizando un sustrato de piren-?-D-galactopiranosida ; y la Figura 11D muestra el tiempo de detección coliforme total en varios conteos celulares utilizando un sustrato de antracenil-?-D-galactopiranosida ; las Figuras 12A y B son gráficas que muestran el cambio de tiempo para la detección como una función del número celular para una cepa de ATCC y una cepa de tipo silvestre de E. coli, respectivamente, utilizando un sensor óptico de acuerdo con la invención; las Figuras 13A y B son gráficas que muestran la intensidad de señal de sensor óptico como una función de tiempo, para la detección de E. coli en muestras que contienen millones de células y miles de células, respectivamente ; la Figura 14 muestra las curvas de calibración durante el tiempo para la detección de E. coli y coliforme total, utilizando la detección de actividad de glucuronidasa y galactosidasa, respectivamente; la Figura 15 muestra un esquema para sintetizar 2-antracenil-/?-D-galactopiranosida ; la Figura 16 muestra un esquema para sintetizar lpirenil-/?-D-galactopiranosida ; la Figura 17 muestra un esquema alternativo de glicosilación de 2-hidroxiantraceno y 1-hidroxipireno; la Figura 18 muestra un esquema para preparar glucuronida de antraceno; 1 Figura 19 muestra un esquema alternativo para preparar la glucuronida de antraceno; la Figura 20 es una gráfica que muestra la velocidad de conversión del sustrato (v) contra la concentración de sustrato ([S]) de 1-pirenfosfato (PP) inicial para un inmunoensayo para la detección de 17-/?-estradiol utilizando un sensor óptico de acuerdo con la invención. Se obtuvieron valores para v a partir de la pendiente de una gráfica de señal de sensor óptico contra tiempo, para varias concentraciones de sustrato de PP inicial después de 1000 segundos. El punto de datos a 2 x 10"" M muestra la inhibición y se omitió a partir del análisis adicional. La linea curveada se trazó utilizando parámetros cinéticos Michaells-Menton más apropiados (véase Ejemplo 20); la Figura 21 es una curva de unión de inmunoensayo para la determinación de 17-?-estradiol en el modo de punto final. Los valores B y Bo se determinaron a partir de la pendiente de una gráfica de una señal de sensor óptico contra el tiempo, para varias concentraciones de sustrato de PP iniciales, después de 2400 segundos. La barra de error en el punto de datos a 100 pg/ml se estimó de las corridas duplicadas; y la Figura 22 es una curva de unión de inmunoensayc para la determinación de E17-?-estradioi en modo cinético. Los valores B y Bo se determinaron a partir de la pendiente de una gráfica de la señal de sensor óptico contra el tiempo, para varias concentraciones de sustrato de PP iniciales, después de 5000 a 6000 segundos. Descripción Detallada de la Invención De acuerdo a un aspecto amplio de la invención, se proporciona un método y aparato para detección confiable y rápida de las moléculas biológicas asociadas con la actividad enzimática. La invención es aplicable a la detección de moléculas biológicas asociadas con la actividad enzimática de contaminantes biológicos, tales como microorganismos. Una aplicación práctica de la invención por lo tanto se relaciona a la detección de contaminantes biológicos en muestras tales como agua y alimento, en donde la detección rápida es crítica para evitar la dispersión de contaminación e infección de individuos a través del consumo de agua o alimento contaminado. Otra aplicación práctica de la invención es el uso en ensayos, tales como ensayo inmunoabsorbente unido por enzima (ELISA) para la determinación de etiquetas enzimáticas . Como se utiliza en la presente, el término "molécula biológica" se pretende para referirse a cualquier molécula la cual puede funcionar como un sustrato de una reacción enzimática, o cualquier molécula que pueda producirse por una reacción enzimática, a pesar de que la molécula se encuentra en la naturaleza. Más bien, la molécula se llama "biológica" debido a que (a) es efectiva para unirse a y metabolizarse con una enzima, o (b) se produce efectivamente por catálisis enzimática. De este modo, los sustratos sintéticos y sus productos se llaman "biológicos" para los propósitos de esta descripción. En particular, la invención proporciona detección confiable y rápida de actividad enzimática. De acuerdo con la invención se detecta la actividad enzimática objetivo proporcionando a una enzima un sustrato que comprende un fluoróforo, y detectando selectivamente fluorescencia de un producto fluorescente de la reacción de enzima-sustrato en una concentración muy baja del producto. Alternativamente, la actividad enzimática objetivo se detecta proporcionando a una enzima un sustrato que comprende un fluoróforo, y detectando selectivamente fluorescencia del sustrato y su velocidad de disminución como la reacción de enzima-sustrato procede. La detección selectiva del producto -o sustrato fluorescente se logra proporcionando un sensor óptico que tiene un elemento de separación, o simplemente un elemento de separación, en donde el producto o sustrato se separa en el elemento de separación. El sensor óptico que tiene un elemento de separación, o elemento de separación, se acoplan ópticamente al hardware óptico adecuado para detectar la fluorescencia del producto o sustrato separado en el elemento de separación . La capacidad para detectar un producto de la interacción de enzima-sustrato en una concentración muy baja del producto debido al corto plazo requerido para producir únicamente una pequeña cantidad del producto, o remover una pequeña cantidad del sustrato. En las modalidades en donde la presencia de microorganismos se detecta, por lo tanto, únicamente un número pequeño de microorganismos, y por lo tanto un periodo de incubación corto, se requiere para la detección. Aunque la invención se describirá principalmente con respecto a la detección del producto de enzima-sustrato, se entenderá que la invención es igualmente aplicable a la detección del sustrato. La detección de la actividad enzimática de acuerdo con la invención puede llevarse a cabo en cualquier medio en donde las enzimas objetivo son activas, y que existe suficientemente fluido para permitir la separación de una molécula de interés, tal como un producto de la reacción de enzima-sustrato, en el elemento de separación. Los medios adecuados son acuosos, y pueden ser fluidos (por ejemplo, líquidos) o semi-sólidos (por ejemplo, tejidos biológicos, geles). Generalmente, la invención se utiliza para detectar una enzima en una muestra, tal como por ejemplo, agua, alimento, muestras biológicas tales como tejidos y fluidos corporales, y tierra. El análisis de algunas muestras, tales como ciertos alimentos, muestras biológicas y de tierras, requieren que la muestra se combine con un medio adecuado. Como se utiliza en la presente, los términos "detección" o "detectando" y "verificando" son intercambiables y se pretenden para significar la detección de la actividad enzimática y/o la presencia de microorganismos ya sea en una base excepcional (por ejemplo, una muestra discreta), o una base continua (por ejemplo, muestreo continuo en intervalos reguladores o aleatorios). Para optimizar un esquema de detección de actividad enzimática para detección rápida, tres criterios deben cumplirse : 1) El sustrato debe reaccionar con la enzima objetivo con una constante de velocidad elevada. 2) El producto debe ser altamente fluorescente de manera que una cantidad de traza se detecte fácilmente. 3) Debe haber un gran diferencia en fluorescencia entre el sustrato y el producto de manera que una señal de fluorescencia a partir de la solución cambie a la conversión enzimática . Estos criterios colocan restricciones significativas en la optimización de los esquemas de detección convencionales. Por ejemplo, debido a que se requiere el cambio de fluorescencia, es posible que un sustrato dado pueda no ser óptimo en términos de velocidad de conversión por la enzima o el limite de detección del producto. También, los candidatos fluorogénicos que pueden ser mejores sustratos para una enzima o que tienen un producto muy fluorescente pueden no ser apropiados si el sustrato mismo es fluorescente, evitando la detección de conversión. La invención supera tales restricciones. Muchos de los limites de detección después reportados para los fluoróforos implican hidrocarburos aromáticos policiclicos , derivados de fluoresceina , derivados de rodamina, o compuestos organometálicos tales como lantánidos quelados. Tales fluoróforos no han sido utilizados en los sustratos para la detección de la actividad de ß- glucuronidasa (glu) o ?-galactosidasa (gal) en los esquemas de detección convencionales, debido a que los derivados con los azúcares correspondientes (glucuronida y galactosida) tienen significativamente diferentes espectros de fluorescencia o intensidades en relación con el producto se desconocen. En su lugar, los fluoróforos utilizados actualmente son casi todos derivados de coumarina, tal como umbeliferona, que tienen intensidad de fluorescencia aceptable, pero fluorescencia mucho más baja como un conjugado con glucuronida o galactosida. En contraste, la invención permite el uso de un rango mucho más amplio de fluoróforos en sustratos. Se ha reportado una amplia variedad de sustratos, muchos de los cuales se utilizan en aplicaciones de detección comerciales. Para la detección de producto de conversión en solución, se prefieren los tintes fluorogénicos . Por ejemplo, los conjugados de umbeliferona y deri\^ados de umbeliferona (por ejemplo, 4-metilumbelí ferona, tri f luorometilumbeliferona (7) ) son favoritos debido al buen contraste en fluorescencia entre el producto y el sustrato, asi como los cinéticos rápidos para la reacción de conjugados con cualesquiera enzimas ß-qlu o ß-gal. Otros sustratos tales como dioxetano (8) , han sido también reportados. Los sustratos cromogénicos han sido utilizados en esquemas de detección solubles, pero tienden a ser favorecidos para uso en membrana o detección de célula soportada por gel. Los ejemplos incluyen conjugados de indolilo (9) e indoxilo [10) . De acuerdo a un aspecto de la invención, se proporciona un método para detectar moléculas biológicas asociadas con la actividad enzimática en una muestra. Como se utiliza en la presente, el término "molécula biológica" se pretende para significar un sustrato enzimático o cualquier producto de una reacción de enzima-sustrato. El método comprende combinar una enzima objetivo o un contaminante biológico asociado con la enzima objetivo y un sustrato, que irradia la combinación con luz de excitación (es decir, luz de una longitud de onda que produce fluorescencia en cualquiera o ambos del sustrato y producto) , y detectando selectivamente fluorescencia de cualquiera del sustrato o cualquier producto de la reacción de la enzima-sustrato. De preferencia, se detecta la fluorescencia de un producto fluorescente de la reacción de enzima-sustrato. Cuando la muestra no es sustancialmente un liquido o semi-liquido (por ejemplo, un gel), es preferible que el sustrato y la muestra se combinen en una solución. Las soluciones adecuadas incluyen cualquier solución que pueda soportar y/o promover la actividad enzimática. Cuando se emplean células, una solución adecuada puede ser, por ejemplo, un medio apropiado (es decir, "caldo") seleccionado para soportar y promover el crecimiento de células bajo investigación. Para las células y la mayoría de las enzimas, tales soluciones son acuosas. El producto de la reacción de enzima-sustrato puede ser, por ejemplo, una molécula fluorescente libre (tinte) , la fluorescencia de la cual se detecta. De acuerdo con la invención, se detecta la fluorescencia por un sensor óptico que se distingue entre el producto y el sustrato, de manera que únicamente la fluorescencia del producto o el sustrato se detecta. En particular, la fluorescencia de cualquiera del producto o el sustrato se detecta proporcionando un elemento de separación, solo o asociado con un sensor óptico, que permite la separación del producto o el sustrato en la presente. Cuando se conecta a un dispositivo adecuado para medir la fluorescencia (es decir, luz) tal como por ejemplo, un espectrómetro o un fotómetro de filtro, el elemento de separación/ sensor óptico produce una señal que tiene una magnitud que varía previsiblemente (por ejemplo, linealmente) con la intensidad de la fluorescencia, que es una función de la concentración del producto o sustrato. En una modalidad preferida, la combinación del sustrato, producto y elemento de separación se elige de manera que el sustrato no se detecta y el producto se detecta en la concentración posible más baja. De este modo, distinguiendo entre la fluorescencia del producto y el sustrato, el tercer criterio de optimización referido como lo anterior se supera.

Se apreciará que la invención puede aplicarse para la detección de actividad de cualquier enzima, siempre que (1) un sustrato para tal enzima objetivo pueda conjugarse con. un fluoróforo, (2) la reacción de enzima-sustrato objetivo produzca un producto fluorescente, y (3) el producto fluorescente pueda detectarse selectivamente con un elemento de separación/sensor óptico de la invención. Para las enzimas que desdoblan uniones químicas, el sustrato debe contener una porción que se una a la enzima, y pueda conjugarse al producto fluorescente a través de una unión en donde se desdoblará la enzima. Para otras reacciones enzimáticas, algunas reacciones de peroxidasa en donde existe únicamente conversión química del sustrato para dar el producto; los sustratos adecuados son aquellos que aseguran el producto que se separa en el elemento de separación. Se apreciará que la invención puede utilizarse para detectar la presencia de más de una enzima, la cual pueda corresponder a más de una especie o cepa de microorganismo, simultáneamente. Esto requiere el uso de un sustrato adecuado para cada enzima bajo consideración. Si los productos fluorescentes de cada reacción de enzima-sustrato diferente son fluorescentes en longitudes de onda diferentes; entonces puede detectarse la actividad de cada enzima bajo consideración. Alternativamente, si los productos fluorescentes de cada reacción de enzima-sustrato diferente son fluorescentes a la misma longitud de onda, entonces la actividad de al menos una de las enzimas puede detectarse. En las modalidades preferidas, las enzimas a las cuales la invención se dirige son ?-glucuronidasa (glu) y ß- galactosidasa (gal). En tales modalidades, la invención proporciona un método para detectar la presencia de E. coli incluyendo, sus diversas cepas (por ejemplo, ATCC 25922; ATCC 35150 serotipo 0157 :H7), asi como la reserva No. 413, E. coli del tipo B (Queen's University at Kingston, Kingston, Ontario, Ca adá) y reservas de aislado de aguas residuales Nos. KS1 y KS2 (Kingston) (véase Ejemplo 6) y otros microorganismos tales como por ejemplo, Enterobacter cloacae (ATCC 13047), Citrobacter freundii (ATCC 8090), Lebsiella pneumoniae (ATCC 13883) , Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) , y coliforme total en muestras tales como agua y alimento. Los sustratos adecuados para ß-qlu y ?-gal son cualesquiera sustratos con una porción de glucurcnida o galactosida, respectivamente, en donde el término "glucuronida" se pretende para incluir cualesquiera sales y ácidos libres de la misma. Ejemplos de sustratos adecuados incluyen, pero no se limitan a: piren-/?-D-glucuronida (por ejemplo, 1 ó 2-pirenil- ?-D-glucuronida ) ; antracen-?-D-glucuronida (por ejemplo, 1-, 2-, o 9-antracenil-?-D-glucuronida ) ; pirrometen-?-D-glucuronida (por ejemplo, 1- hidroximetil-3, 5, 7-trimetilpirrometendifluoroborato-?-D- glucuronida ) ; piren-?-D-galactopiranosida (por ejemplo, 1- ó 2-pirenil-?-D-galactopiranosida) ; y antracen-?-D-galactopiranosida (por ejemplo, 1-, 2- o 9-antracenil-/?-D-galactopiranosida ) . Por ejemplo, la actividad de ß-qlu se detecta con piren-?-D. glucuronida (pyr-glu) con el producto detectado que es hidroxipireno (HP) , como se muestra en el esquema de reacción siguiente: Cuando se detecta la actividad de ?-glu con la antracen-?-D-glucuronida (ant-glu) , el producto detectado es hidroxiantracenc , como se muestra en el esquema de reacción siguiente : antracen-l-D-glucuronida S-D-glucuronida 2-hidroxiantraceno Cuando se detecta la actividad de ß-ql con pirromenten-p-D. glucuronida, el producto detectado es hidroxipirrometeno, como se muestra en el esquema de reacción siguiente : pirromenten- -D-glucuronida (3-D-glucuronida hidroxipirromenteno Cuando se detecta la actividad de ß-qal con piren- ?-D-galactopiranosída (pyr-gal), el producto detectado es hidroxipireno (HP) , como se muestra en el esquema de reacción siguiente : piren- ß-D-galactopiranosida ß-D-galactosa 1-hidroxipireno ^ Ejemplos 15 a 19 proporcionan síntesis para un número de estos sustratos y sus intermediarios. De acuerdo a un segundo aspecto de la invención, se proporciona un sensor óptico para detectar selectivamente moléculas fluorescentes. En particular, el sensor óptico proporciona la separación de moléculas en el sensor, en donde la fluorescencia detectada es predominantemente aquella de las moléculas separadas en el sensor. Tal separación de moléculas se logra situando en el final del sensor óptico un elemento de separación. El elemento de separación permite únicamente una molécula de interés para dividirse en la presente . Por ejemplo, para detectar la actividad enzimática utilizando un sustrato fluorogénico y producto de enzima-sustrato fluorescente, la invención proporciona un sensor óptico que tiene un elemento de separación que permite únicamente al sustrato o moléculas del producto para la separación en la presente, de manera que la fluorescencia del sustrato o el producto se detecta. De este modo, no importa si tanto el sustrato como el producto son fluorescente, ya que el sensor óptico detecta florescencia a partir de únicamente uno de los dos. La actividad enzimática puede entonces ' determinarse midiendo la velocidad de desvanecimiento de la fluorescencia del sustrato, o la velocidad de aparición de la fluorescencia del producto. En una modalidad preferida, las moléculas del producto se separan en el elemento de separación, y la actividad enzimática se determina midiendo la velocidad de aparición de la fluorescencia del producto. Como se observa anteriormente, la detección de la actividad enzimática de acuerdo con la invención puede llevarse a cabo en cualquier medio en donde las enzimas objetivo son activas. Generalmente, tales medios son acuosos, y estos pueden ser fluidos (por ejemplo, líquidos) o semi-sólidos (por ejemplo, tejidos biológicos, geles ) . De acuerdo con una modalidad, :· mostrada esquemáticamente en la Figura 1, un sensor 2 óptico de la invención comprende un guíaondas óptico, tal como una fibra óptica, que tiene un elemento 3 de separación dispuesto en un extremo del mismo. Una fuente 4 luminosa de excitación y el espectrómetro 6 u otro dispositivo adecuado para detectar luz se acoplan a través de un acoplador 7 al extremo opuesto de la fibra óptica, de manera que la luz viaja a partir de la fuente 4 luminosa al elemento 3 de separación, y la luz recibida por el elemento 3 de separación viaja a un detector 6 óptico (por ejemplo, un espectrómetro o dispositivo CCD) . La longitud de onda de la fuente 4 luminosa se elige como sea apropiado para la excitación de las moléculas objetivo fluorescentes de interés, y está usualmente en el rango ultravioleta (UV) para moléculas biológicas. Sin embargo, la invención es aplicable a otras longitudes de onda y moléculas objetivo. Ejemplos de fuentes de luz de excitación adecuadas son diodos que emiten luz (los LED) , diodos láser, y laceres. En una modalidad alternativa, la fuente 4 luminosa de excitación es discreta a partir del sensor, de manera que el acoplador 7 no es necesario. La selección de la longitud de onda especifica a la molécula objetivo y/o la verificación de la longitud de onda de emisión especifica a la molécula objetivo mejora la especificidad y la sensibilidad de detección . En el ejemplo de la Figura 1, el sensor 2 se sumerge en una solución 8 de muestra que comprende las moléculas 10 de sustrato y la enzima 12 objetivo, o células (por ejemplo, microorganismos) que soportan la enzima 12 objetivo. Cuando se utilizan las células, una membrana 18 se proporciona opcionalmente para la adhesión celular. Las moléculas 10 de sustrato se convierten por la enzima 12 objetivo a las moléculas 14 del producto y las moléculas 16 del producto fluorescentes (es decir, moléculas objetivo) . El elemento 3 de separación se proporciona para la separación en la misma de cualquiera de las moléculas de sustrato o las moléculas del producto fluorescente; de preferencia las ultimas. De este modo, las molécula 16 del producto se separan en el elemento 3 de separación, después de lo cual se irradian con luz de excitación a partir de la fuente 4 luminosa. La fluorescencia emitida a partir de las moléculas 16 objetivo se detecta por el espectrómetro 6 u otro dispositivo adecuado. De acuerdo con una modalidad, el elemento de separación, y el sensor óptico comprende una película polimérica dispuesta en un extremo de la fibra óptica, de manera que cubre la abertura óptica de ese extremo de la fibra. La Figura 2A es una fotomicrografía de tal sensor óptico de fibra hecha con una fibra óptica de 600 pm (véase Ejemplo 1) . Las propiedades del material polimérico, tales como el peso molecular y el grado de reticulación, que determina las propiedades físicas del polímero (por ejemplo, viscosidad y dureza (orilla A) ) se eligen para proporcionar selectivamente la separación de una molécula fluorescente de interés . En una modalidad preferida, mostrada esquemática en la Figura 2B, el sensor 100 óptico comprende un elemento 104 de separación esférica unida a un extremo de una fibra óptica. La fibra óptica tiene un núcleo 102a, un recubrimiento 102b y una camisa 102c. La fibra óptica se termina en su otro extremo por un conector adecuado, tal como un conector de SMA (no mostrado), para facilidad de conexión al equipo asociado. El elemento de separación esférico puede prepararse en un rango de tamaños y con diversa rigidez utilizando diferentes formulaciones poliméricas. En general, los elementos de separación esféricos de aproximadamente 0.2 mg a aproximadamente 3.0 mg pueden utilizarse. De preferencia, el diámetro del elemento de separación esférica es equivalente sustancialmente al diámetro de la fibra óptica utilizada. Se ha encontrado que una fibra óptica de 600 mieras produce buen rendimiento, cuando se equipa con un elemento de separación esférico de diámetro sustancialmente igual. El rendimiento puede mejorarse además uniendo el elemento de separación de mitad de esfera (es decir, una semiesfera) a la fibra óptica, ya que este reduce el volumen del elemento de separación sin comprometer el diámetro de esfera . Como se muestra en la Figura 2B, un tubo 106 rígido, por ejemplo, acero inoxidable, se utiliza para proteger el núcleo 102a de fibra y la unión 108 de fibra esférica. El acero inoxidable es un material preferido para el tubo 106 rígido, debido a su resistencia y resistencia a la corrosión. La unión 108 de fibra esférica se hace con un material polimérico que tiene sustancialmente las mismas propiedades, tal como el índice refractivo, como el elemento 104 de separación, y se utiliza para fijar la esfera 104 a la fibra óptica y el tubo rígido. La unión polimérica debe llenar el extremo del tubo rígido para evitar cualquier entrada líquida entre el tubo y el recubrimiento de fibra y la camisa. Los métodos para preparar tal sensor de fibra óptica se proporcionan en el Ejemplo 19, siguiente. En una modalidad adecuada para la detección de moléculas del producto de hidroxipireno en una solución acuosa que utiliza, por ejemplo, el sustrato pyr-glu discutido anteriormente, el elemento de separación está comprendido de un elastómero de polidimetilsiloxano (PDMS) hidrofóbico, transparente. Las divisiones de hidroxipireno en PDMS a partir de la solución acuosa, mientras el sustrato pyr-glu no se separa en PDMS. De este modo, se detecta la fluorescencia de hidroxipireno por el sensor óptico. La velocidad de aparición del hidroxipireno en la película de PDMS se relaciona linealmente a la concentración de enzima en la solución de muestra, de manera que se verifica la señal a partir del sensor óptico contra el tiempo que suministra una medida de actividad enzimática. Ejemplos de tres materiales de PDMS adecuados que tienen diferentes pesos moleculares y diferentes grados de reticulación son GE RTV118 (General Electric), Sylguard 186 (Dow), y Sylguard 184 (Dow). Para polímeros suministrados con un material precursor y un agente de curado, variables tales como la proporción del material precursor al agente curado, condiciones de curado y similares, pueden variarse para manipular las propiedades físicas del polímero. Otros polímeros, tales como GE RTV118 se suministran ya mezclados, y se polimerizan cuando se exponen al aire. Ejemplos de otros materiales adecuados para el elemento de separación incluyen, pero no se limitan a, sol-geles, resinas, geles, compuestos, absorbentes, polímeros diferentes de PDMS, poliuretanos, poliacrilatos y películas molecularmente impresas. Para optimizar el límite de detección (es decir, detectar la actividad de la enzima objetivo en concentración enzimática mínima en la muestra, o detectar la fluorescencia de molécula objetivo en la concentración mínima en la muestra) , el volumen del elemento de separación en la abertura óptica de la fibra debe maximizarse, aungue para minimizar la respuesta mínima, la reticulación del material del elemento de separación debe ser estrecho. Por ejemplo, en donde el elemento de separación es una película (por ejemplo, la Figura 2A) , la muestra representativa del elemento debe ser aproximadamente 400 ym a aproximadamente 800 m, de preferencia aproximadamente 500 µ?t? a aproximadamente 700 µ?t?, y el espesor debe ser menor de aproximadamente 800 µ?t?, de preferencia menos de aproximadamente 600 µ?t?. Un elemento de separación con rendimiento satisfactorio para detectar una molécula objetivo dada (es decir, producto o sustrato) representará un entendimiento entre estas características. El rendimiento puede mejorarse además conformando el elemento de separación de la película polimérica en un cono, esfera o forma hemisférica. Esto mejora la selectividad del sensor evitando la detección de moléculas no separadas en la película polimérica, lo cual limita la señal de fondo a partir de una muestra. Las estrategias para minimizar el tiempo de detección incluyen, por ejemplo, reducir el tiempo de incubación de las células optimizando las condiciones de crecimiento (por ejemplo, temperatura, medio nutriente) , y reduciendo el número de células requeridas para la generación de una señal por el elemento de separación/sensor óptico. Lo último puede lograrse optimizando una o más de la compatibilidad de la fuente luminosa de excitación y el detector para el producto, la velocidad de conversión del sustrato al producto por las células, y el elemento de separación para el producto. Se espera que tal optimización de la invención resultará en una mejora (reducción) de 3 a 4 veces en el tiempo de detección para una sola célula en 2 a 4 horas . Aunque la descripción ha sido descrita en detalle con respecto a las moléculas objetivo fluorescentes, se apreciará que la invención puede aplicarse a la detección de la actividad enzimática y la presencia de microorganismos detectando luz diferente de la fluorescencia, tal como por ejemplo, bioluminiscencia o quimioluminiscencia, siempre que las moléculas objetivo de bioluminiscencia o quimioluminiscencia (sustratos o productos) puedan dividirse en el elemento de separación del sensor óptico. De acuerdo con otro aspecto de la invención se proporciona un sistema automatizado para detectar la actividad enzimática. Por ejemplo, un sistema automatizado de acuerdo con la invención puede utilizarse para detectar la actividad de glucuronidasa y/o galactosidasa en muestras de agua, alimentos o tierra, para detectar E. coli y coliforme total, cuando los sustratos apropiados se utilizan, como se describe en detalle anteriormente. Una modalidad de un sistema automatizado se muestra esquemáticamente en las Figuras 3A y B. El sistema comprende al menos un sensor 3 óptico hecho de una fibra 2 óptica como se describe anteriormente, con un elemento de separación, y componentes ópticos asociados tales como una fuente 4 luminosa, un espectrómetro 6 u orro dispositivo para detectar luz (por ejemplo, dispositivo acoplado de carga), un conjunto 7 de fibra óptica, conector 8, acoplador 5 y similares, un recipiente 26 (incubador de muestra) con una entrada de muestra y una salida de residuo, hardware adecuado (por ejemplo, bombas, válvulas y similares; no mostradas) y una interfase 22 de unidad de control/computadora conectada al sensor óptico y al incubador de muestra para controlar por ejemplo, la adición del o los sustratos al incubador de muestra y el flujo de muestra. El. sistema automatizado puede además equiparse con uno o más sensores 28 adicionales para verificar variables tales como temperatura, concentración de cloro, pH y turbiedad de la muestra, ya que estas variables pueden afectar la duración y umbral de señal de las pruebas de E. coli y coliforme total. La interfase 22 de computadora controla la operación del sistema y recolecta y reporta datos que se relacionan a la presencia/ausencia de enzimas, y por consiguiente, microorganismos de interés. En algunas aplicaciones del sistema automatizado, tales como cuando se utilizan para verificar la presencia de E. coli y/o coliforme total en agua, la interfase de computadora puede configurarse para detener el flujo de agua en caso que se detecten tales microorganismos . Como puede verse en la Figura 3A, el sistema comprende un empaque óptico que suministra luz de excitación a partir de una fuente luminosa al elemento de sensor óptico/separación, y suministra fluorescencia a partir del sensor óptico a un dispositivo que detecta luz tal como un espectrómetro o un dispositivo acoplado de carga (CCD) . En una modalidad, el empaque óptico es un conjunto de fibra bifurcada; que es, una primera fibra óptica acoplada a un extremo a los extremos de la segunda y tercera fibras ópticas; la segunda fibra se asocia con la fuente luminosa y la tercera fibra se asocia con el dispositivo que detecta luz. Un fluido de índice refractivo coincidente se proporciona opcionalmente a la región del acoplamiento de las tres fibras para reducir luz diseminada. De preferencia, todos los componentes mostrados en la Figura 3A, excepto el sensor óptico, se alojan dentro de un armazón o envase común. En una modalidad preferida, la primera fibra óptica es una fibra de 600 mieras (por ejemplo, AS600/660UVPI , disponible de FiberTech Optika, Kitchener, Ontario, Canadá) , una fibra de OH baja con un recubrimiento de poliamida y camisa de nylon. Esta fibra se termina en un extremo con un conector adecuado, tal como un adaptador de S A, para conexión al sensor óptico. El otro extremo de la primera fibra se acopla a la segunda y tercera fibras. La segunda y tercera fibras pueden ser del mismo diámetro como la primera fibra, aunque el uso de fibras de diámetro más pequeño (por ejemplo, 300 ó 400 mieras de núcleo) para la segunda y terceras fibras produce mejor acoplamiento. En particular, el uso de 400 mieras de núcleo (FiberTech Optika AS400/440UVPI ) , una fibra de OH baja con recubrimiento de poliamida y camisa de nylon, para la segunda y tercera fibras proporciona muy buen rendimiento cuando se acopla a la primera fibra de 600 mieras. El acoplamiento de la luz de excitación, tal como la luz UV en el extremo libre de la segunoa fibra se mejora disponiendo una lente entre el extremo de la fibra y la fuente luminosa. En una modalidad, la lente es una lente esférica, tal como una lente de bola de zafiro disponible de Melles Griot, Ottawa, Ontario, Canadá. El extremo libre de la tercera fibra se acopla al dispositivo que detecta luz. En las modalidades en donde el dispositivo que detecta luz es un CCD, el extremo libre de la tercera fibra se alinea con uno o más pixeles en el CCD a través de un filtro óptico de paso largo que evita la luz en la longitud de onda de la fuente luminosa a partir de alcanzar el CCD. Un sistema automatizado para verificar agua para la presencia de microorganismos puede instalarse en residencias unifamillares , escuelas, hospitales, edificios municipales, etc., y, en particular, en tales residencias e instituciones con pozos, y en redes de distribución de agua municipal/de la ciudad. Por último, se espera que los sistemas automatizados se instalarían en la fuente de agua (por ejemplo, planta de tratamiento de agua) , en estaciones de bombeo, y en varios nodos dentro de la red de distribución, y cada sistema automatizado conectado a una red de comunicaciones utilizando hardware/software 24 de comunicaciones adecuados (véase la Figura 3B) . Tal sistema automatizado proporcionaría, por ejemplo, información de tiempo real a operaciones cuando la contaminación aborda niveles inaceptables, tales como advertencias, con rangos de tolerancia a varios niveles de urgencia, y en donde se detecta la contaminación de la red de distribución. El sistema podría detener automáticamente también la distribución del agua contaminada en un o unos nodos afectados. Para facilidad de instalación en nuevos o existentes sistemas de distribución de agua, el sistema automatizado se proporciona de preferencia en una configuración compacta utilizando dispositivos compactos (por ejemplo, un espectrómetro de CCD de fuente de luz de diodo que emite luz (LED) . En una modalidad, el sistema es una unidad probadora automatizada que emplea un cartucho de prueba con un elemento de separación integrado que es capaz de suministrar la presencia/ausencia y estimulación de conteo bacteriológico para una amplia variedad de patógenos, incluyendo, pero sin limitarse a, E. coli y las bacterias coliformes totales. De preferencia, el cartucho de prueba es un cartucho de uso único, desechable. El sistema se basa en los principios descritos anteriormente, pero utiliza un cartucho con un elemento de separación integral en donde se contienen las muestras individuales, en lugar de un sensor óptico. El elemento de separación no pone en contacto múltiples muestras, como podría hacerse con un sensor óptico, por lo que elimina una fuente potencia de contaminación cruzada entre las muestras. El diseño también elimina cualquier necesidad para limpiar un sensor óptico entre las pruebas. En una modalidad preferida, el sistema incluye un método de calibración basado en múltiples fluorórofos, el cual proporciona integridad de trayectoria óptica continua verificando la auto-calibración. El sistema proporciona opcionalmente múltiples pruebas de desempeño para diferentes patógenos . El cartucho de prueba incorpora elementos necesarios para conducir una prueba bacteriológica para un patógeno objetivo especifico, incluyendo, pero sin limitarse a E. coli y bacteria coliforme total. Como se muestra en la Figura 3C, el cartucho 200 de prueba comprende un forro 202 sellado que encierra un interior estéril, que puede manipularse fácilmente por un mecánico simple en un sistema automatizado. El elemento 204 de separación, y un medio de prueba en cualquier forma pulverizada o liquida, están contenidas dentro del alojamiento 202. El medio de prueba comprende uno o más materiales de sustrato de glucuronida o galactosida, cada material de sustrato comprende un fluoróforo objetivo, como se describe anteriormente. El medio de prueba comprende también un segundo fluoróforo (es decir, un fluoróforo de calibración) que se disuelve en un ambiente acuoso para proporcionar una señal óptica de base lineal para calibración y verificación de la integridad de trayectoria de señal óptica, y un medio de crecimiento para soportar el crecimiento del o de los organismos objetivo. El medio de prueba puede comprender opcíonalmente : tiosulfato de sodio para remover cloro libre a partir de la muestra acuosa ; antibiótico para inhibir el crecimiento de microorganismos no objetivo; y un compuesto que reacciona en la presencia de un patógeno objetivo para producir un cambio de color como la confirmación visua1 de la presencia del patógeno objetivo en la muestra. Como se muestra en la Figura 3C, un hueco o puerto 206 en el forro 202 se cubre por una membrana o septo que permite la introducción en el cartucho de una muestra en una manera que conserva el campo estéril dentro del forro, por ejemplo, por inyección de una muestra a través del septo utilizando una aguja. También dispuesto en el forro 202 está un alineamiento o marca de índice 208, que puede percibirse automáticamente (por ejemplo, optoelectrónicamente) , para facilitar la manipulación y orientación del cartucho por el sistema automatizado (por ejemplo, facilitar el alineamiento correcto del puerto 106 para inyección de una muestra), y pa-ra la identificación del cartucho (por ejemplo, identidad del tipo del medio de prueba contenido en la presente) , permitiendo a la unidad de muestra adaptarse a varios tipos de pruebas para una variedad de patógenos objetivo. El cartucho se proporciona además opcionalmente con las aletas, canales o bujes 210 en una o más superficies internas, para facilitar la mezcla de la muestra cuando el cartucho se hace girar o se agita. En la Figura 3D se muestra un depósito 220 para mantener una pluralidad de cartuchos 200 de prueba, con un resorte 222 o similares para mantener los cartuchos predispuestos hacia un extremo del mismo. La Figura 3E muestra esquemáticamente una modalidad de un aparato probador automatizado de la invención. El aparato comprende una agarradera 230 para mantener uno o más cartuchos 200 de prueba en una cámara de prueba. El cartucho de prueba puede cargarse en la agarradera manual o automáticamente a partir de un depósito tal como aquel mostrado en le Figura 3D. Los cartuchos de prueba cargados en el depósito pueden ser únicamente un tipo de patógeno objetivo, o haber sido una mezcla de cartuchos de prueba para diversos organismos objetivo. Por ejemplo, los cartuchos de prueba pueden ser para E. coli únicamente, o una combinación de E. coli y bacteria coliforme total, y posiblemente otros patógenos objetivo también. El indicador 208 en el cartucho de prueba, junto con una prueba optoelectrónica/sensor 232 de alineamiento, permite al aparato distinguirse entre diferentes cartuchos. La agarradera 230 tiene rodillos 234, 236 de soporte para mantener, hacer girar y/o agitar un cartucho 200, a través de un motor y sistema 238 de conducción. El aparato puede también incluir un inyector 240 de muestra que inyecta agua u otra muestra en el cartucho a través del puerto 206 de entrada del cartucho. Alternativamente, los cartuchos pueden inyectarse con muestras antes de cargarse en el. aparato. El aparato puede también incluir un sistema 260 de calentamiento para la incubación de la muestra, en donde, por ejemplo, se hace fluir aire caliente a través de la agarradera 230. El aparato incluye ópticos para detectar el fluoroforo de interés (por ejemplo, un fluoroforo producido en la degradación del sustrato por la acción de la enzima objetivo). Los ópticos junto con el elemento de separación funcionan en el mismo principio como se describe anteriormente, y la trayectoria óptica se representa por las lineas punteadas en la Figura 3E. De este modo, el aparato incluye una fuente 242 luminosa, tal como una fuente de luz UV, para irradiar el elemento 204 de separación del cartucho 200, y un detector 244 óptico, tal como un CCD, para detectar fluorescencia del fluoroforo objetivo dividido en el elemento de separación. El aparato puede también incluir ópticos para irradiar y detectar el fluoroforo de calibración, mencionado anteriormente, para proporcionar una señal óptica de base lineal para la calibración y/o verificación de la integridad de trayectoria de señal óptica. En tal modalidad, la fluorescencia producida por los fluoróforos objetivo y de calibración debe diferenciarse y detectarse. De este modo, por ejemplo, la trayectoria óptica para detectar fluorescencia emitida a partir del elemento de separación un bifurcador 250 de haz y espejo 252 que divide la trayectoria óptica en los dos canales. Cada canal se filtra utilizando un filtro 254, 256 óptico en la longitud de onda del fluoróforo de interés (es decir, los fluoróforos objetivo y de calibración), y se detectan las señales ópticas filtradas. El aparato incluye opcionalmente un panel de control para permitir a los operadores controlar su operación, un dispositivo de adquisición/procesamiento/despliegue, y una inferíase de control remoto (a través, por ejemplo, de internet o telemetría) para permitir al aparato interconectarse con el control de supervisión y verificando, registrando datos y sistemas de diagnóstico, comúnmente referidos como sistemas SCADA. La unidad probadora de agua automatizada de la invención tiene varias características que aseguran la conflabilidad del resultado de detección. Por ejemplo, como se observa anteriormente, el cartucho de prueba utiliza una molécula fluorescente adicional (es decir, el fluoróforo de calibración) . Esto puede proporcionarse convenientemente para calibración del elemento de separación de cada cartucho de prueba y los componentes ópticos del sistema. Otra función conveniente del fluoróforo es para proporcionar integridad continua verificando la trayectoria óptica a través de toda la prueba, ya que la falla de la trayectoria óptica podría resultar en una falla para detectar la luminiscencia del fluoróforo de detección, resultando en un resultado falsc negativo. La integridad de la trayectoria óptica se asegura a través del uso de un detector con base en CCD, en donde la irradiación a través de múltiples píxeles en la disposición de CCD proporciona redundancia de detección. El sistema puede proporcionarse opcionalmente con uno o más de los siguientes: 1. La re-experimentación de una muestra hasta obtener un resultado positivo (adverso) . 2. La inyección de cloro en la prueba de agua completa para reducir el potencial de peligro biológico de una muestra acuosa adversa. 3. La introducción de un indicador de color en el sustrato para proporcionar confirmación visual de una muestra acuosa adversa. 4. El uso de técnicas de detección óptica de espacio libre para adquirir la señal óptica a partir del elemento de separación incrustado en el cartucho de prueba, o uso de un segmento de fibra óptica pulido para proporcionar interfase de fricción adecuada al elemento de separación.

. La inclusión de múltiples cámaras de prueba dentro del mismo aparato, que consiste de los mismos inyectores de muestra, sistemas de calentamiento, y los detectores ópticos para el elemento de separación, que permite múltiples pruebas para conducirse en paralelo - ya sea para proporcionar tiempo gradual de muestras (por ejemplo, cada 2 ó 4 horas) o para proporcionar múltiples pruebas de patógenos objetivo (por ejemplo, E. coli y coliforme total que circula simultáneamente en el mismo aparato) . Lo siguiente es un ejemplo de mayores etapas realizadas por una unidad probadora de agua automatizada (AWSU) de la invención durante un ciclo de prueba: 1. Un ciclo de prueba se activa utilizando el panel de control o por un comando de activación remoto a través de la interfase SCADA. 2. La cámara de prueba se pre-calienta a la temperatura requerida (por ejemplo, 35 a 42°C) . 3. Un cartucho de prueba se selecciona a partir del depósito de cartucho y se carga en la cámara de prueba. 4. El cartucho de prueba se acopla por un mecanismo de rodillo que hace girar al cartucho para alinear el cartucho y proporcionar agitación a través de todo el ciclo de prueba. 5. El cartucho de prueba se alinea utilizando el indicador de ID de alineación/prueba para alinear el septo con el inyector de aguja. 6. Una muestra acuosa del volumen liquido (por ejemplo, 100 mi) se inyecta (después de una descarga del agua residual en la linea de muestra) en el cartucho de prueba. Un medidor de flujo en linea se utiliza para medir el volumen de muestra requerido. 7. El inyector de agua se limpia y se esteriliza utilizando una solución de cloro o alcohol. 8. Un cronómetro interno se activa y una señal de SCADA se envía con el tiempo de inicio del ID del tipo de prueba y la muestra. 9. El cartucho de prueba se hace girar continuamente para asegurar que el sustrato se disuelva y mezcle con la muestra acuosa de prueba. 10. La muestra acuosa disuelve la mezcla de sustrato, incluyendo el fluoróforo de calibración soluble en agua . 11. La trayectoria óptica se activa y se verifica por indicaciones de base lineal del fluoróforo de calibración. 12. La rotación y agitación de la muestra se mantiene durante un periodo de prueba de hasta 20 horas. 13. A través de todo el periodo de prueba, la trayectoria óptica se verifica para la indicación del fluoróforo de calibración (para proporcionar el monitoreo de la trayectoria de integridad óptica continua) y el fluoróforo de calibración (indicando la presencia del patógeno objetivo en la muestra acuosa) . 14. Los datos de estado de trayectoria óptica, estado de detección de patógeno, y estado de diagnóstico se envían periódicamente a través del canal de datos SCADA para registrar y reportar los datos. 15. Las alarmas para la presencia de, y conteo estimado del patógeno objetivo se proporcionan auricular y visualmente en el panel frontal de la unidad y se envían a través del canal de datos SCADA para registro, reporte y acción del operador. 16. En el final del periodo de prueba, el cartucho de prueba de la muestra se expulsa en un recipiente de desecho y el sistema se vuelve a situar para conducir otra prueba . De acuerdo con aún otro aspecto de la invención, se proporciona un equipo para detectar actividad enzimática. El equipo comprende un sensor óptico, componentes ópticos asociados y opcionalmente otros componentes tales como un incubador, como se describe anteriormente, y de preferencia es compacto y de bajo costo, de manera que es utilizable y costeable por individuos tales como propietarios quienes desean probar y verificar el agua u otras muestras para la presencia de microorganismos contaminantes tales como E. coli y coliforme total. En todavía un aspecto adicional de la invención, la medición de la actividad enzimática se acopla con inmunoensayo unido con enzima (EIA) , permitiendo la detección de una amplia variedad de especies objetivo incluyendo, sin limitación, contaminantes químicos y microbiológicos en las muestras, por ejemplo, en agua. El enzimoinmunoanálisis absorbente (ELISA) es una modalidad preferida. La especificidad y selectividad en el reconocimiento de las especies objetivo se otorga al anticuerpo empleado en el inmunoensayo. La cuantificación de las especies objetivo se proporciona por la detección de una especie fluorescente (etiqueta) producida por la enzima. La etiqueta se detecta como se describe anteriormente empleando un elemento de separación . El ensayo de la invención, puede utilizar una enzima utilizada en cualquier inmunoensayo estándar, tal como por ejemplo, fosfatasa alcalina (AP) . Para verificar AP u otra actividad enzimática, un sustrato con una porción de fosfato unida a un compuesto fluorescente se utiliza, en donde el producto del compuesto fluorescente es uno el cual se dividirá en el elemento de separación del sensor óptico. Las clases de contaminantes que pueden detectarse por inmunoensayo incluyen, pero no se limitan a, hormonas, compuestos estrogénicos , pesticidas, toxinas biológicas, compuestos aromáticos polinucleares, y bifenilos poiicloraclos . En algunas modalidades de este aspecto de la invención, EIA incluye un ensayo de "unión competitiva". En una primera modalidad, una enzima se conjuga a un compuesto de manera que el conjugado puede competir con el compuesto objetivo para unirse a un anticuerpo. Esto resulta en una cantidad de conjugados compuesta con anticuerpo que es inversamente proporcional a la cantidad del compuesto objetivo presente. Una gráfica de calibración o "unión competitiva" se desarrolla cargando primero al anticuerpo complejo a partir del conjugado no unido, y luego midiendo la actividad enzimática para una serie de concentraciones de contaminante objetivo estándares. Véase el Ejemplo 20 establecido posteriormente. En una segunda modalidad, emplear la unión competitiva, una segunda etiqueta (con frecuencia una proteina, tal como por ejemplo, albúmina de suero de bovino, o especies químicas), se conjuga a un compuesto de manera que el conjugado de etiqueta/compuesto secundario puede competir con el compuesto objetivo para unirse a un anticuerpo. Después de la etapa de unión competitiva, un anticuerpo secundario que une la etiqueta secundaria se agrega, el anticuerpo que se une a una enzima. Como lo anterior, el complejo de anticuerpo se separa a partir del conjugado no unido, y la cantidad de la etiqueta compuesta es inversamente proporcional a la cantidad del compuesto objetivo de la muestra original. En otras modalidades de la invención, EIA implica un ensayo de "intercalado" (por ejemplo, ELISA) para la detección de un compuesto objetivo. Tales modalidades se prefieren generalmente para la detección de contaminantes biológicos. En un ejemplo de un ensayo de intercalado, un anticuerpo el cual es especifico para que un objeto de interés se inmovilice en un soporte sólido. Una muestra se introduce en la superficie base. Los contaminantes que tienen el objeto (que pueden ser células) se une al anticuerpo y llega a inmovilizarse. Para determinar el número de contaminantes inmovilizados, un segundo anticuerpo se agrega el cual también reconoce a los contaminantes y se une a ellos. Este segundo anticuerpo puede estar sin etiqueta o puede unirse previamente a una enzima. Si el segundo anticuerpo está sin etiqueta, entonces un tercer anticuerpo el cual se une a una enzima se agrega, el tercer anticuerpo reconoce y se une al segundo anticuerpo. En cualquier caso, el resultado de este procedimiento es una cantidad de enzima inmovilizada que es directamente proporcional al número de contaminantes objetivo presentes en la muestra original. La enzima elegida produce un producto, convenientemente un producto fluorescente, el cual se detecta como se describe en la presente. Una gráfica de calibración se desarrolla midiendo la actividad enzimática de una serie de soluciones estándares que contienen niveles de contaminante conocido (por ejemplo, célula) . De acuerdo a un aspecto, de la invención, EIA puede utilizarse para la detección de contaminantes biológicos (incluyendo, pero sin limitarse a E. coli, coliforme total, Giardia lambíia , Chryptosporidium arvuum, y Pseudmonas aeriginosa) en muestras tales como agua, alimentos, muestras biológicas y tierra. Ventajosamente, puede utilizarse para la detección de contaminantes biológicos que no pueden de otra manera detectarse por la medición de actividad biológica del contaminante mismo. Las clases de contaminantes biológicos para cuyos inmunoensayos pueden convenientemente utilizarse incluyen, pero no se limitan a, bacterias, protozoarios y virus. Los ejemplos específicos en cada clase incluyen, pero no se limitan a, para bacterias, Escherichia coli 0157 :H7, Pseudomonas aeruginosa; para protozoarios, Cryptospiridum parvuum y giardia lamblia; y para virus, Norwalk y virus SARS . En particular, el ensayo es útil para detectar Giardia lamblia, Chryptosporidium arvuum y Pseudmonas aeriginosa en muestras, ya que estos organismos no tienen glucuronidasa o galactosidasa, y por lo tanto serían adecuados para los esquemas de detección basados en estas enzimas descritas anteriormente . La invención tiene distintas ventajas sobre métodos actuales para medir actividad enzimática. Por ejemplo, los métodos más comúnmente utilizados emplean combinaciones de sustrato/producto en donde las propiedades ópticas (absorbancia de luz o emisión de fluorescencia) cambian en conversión del sustrato al producto. Varios sustratos están disponibles en donde los cambios ópticos significativos ocurren en la conversión enzimática, pero el requerimiento para este cambio coloca restricciones significativas en los sustratos que pueden utilizarse. Las enzimas tales como ß-qlu catalizan el desdoblamiento de uniones químicas, usualmente por hidrólisis, que significa remover un sustituyente unido al oxígeno a partir del sustrato y lo reemplaza con un grupo hidroxi (es decir, la conversión de un éter a una forma hidroxilada) . Los sustratos convencionales se limitan por lo tanto a compuestos que experimentan un cambio óptico significativo en la conversión de una forma etérea a una forma hidroxilo. Algunos compuestos, tales como compuestos de hidroxicoumarina, experimentan tales cambios. Muchos otros compuestos que pueden detectarse con mayor sensibilidad, incluyendo hidrocarburos aromáticos policíclicos (los PAH) , no cambian las propiedades ópticas significativamente con tal conversión . En contraste, en la invención, el producto se distingue a partir del sustrato basado en la separación diferencial en el elemento de separación del sensor óptico. Esto significa que un cambio en las propiedades químicas del compuesto se requiere, es decir, de una forma que no se separa en el elemento de separación a una forma que lo hace, mientras que un cambio en las propiedades ópticas no se requiere. Como un resultado, un amplio rango de compuestos que no está disponible para métodos convencionales puede utilizarse como sustratos de acuerdo con la invención. Por ejemplo, los PAH, que emiten fluorescencia ambos antes y después de la conversión para el producto, son sustratos adecuados. En la modalidad anterior con relación a la detección de actividad ß-qlu, pyr-glu es una forma de glucuronida de un PAH que es sustancialmente soluble en agua y no se dividirá en una película hidrofóbica como PDMS . El producto HP es mucho menos polar y se separa fácilmente en PDMS . La invención ofrece además ventajas. La trayectoria óptica completa para la excitación de fluorescencia y emisión está contenida en el interior del sensor óptico, y en particular, en el elemento de separación, de manera que la luz no tiene que penetrar la solución en la medición. Esto significa que la actividad enzimática puede detectarse en medios opacos o altamente dispersos directamente. El elemento de sensor/separación proporciona una señal de verificación continuamente, que simplifica el análisis de los cinéticos como se requiere en las mediciones de la actividad enzimática. Finalmente, la sensibilidad del elemento de sensor/separación está en parte determinado por la constante de división (Kfs) para el producto, definida como la relación de la concentración del producto en el elemento de separación a la concentración en solución. En casos en donde fS es mayor de uno, el producto se "pre-concentra" en el elemento de separación. Entre mayor sea el valor de Kfs, más elevada es la sensibilidad para la detección. Los valores de 10,000 o mayores son normalmente para los PAH. Los contenidos de todas las publicaciones citadas se incorporan en la presente para referencia en su totalidad. La invención se describe además a manera de los siguientes ejemplos no limitantes. Ejemplos en Operación Ejemplo 1. Sensor Óptico Se fabricó un sensor óptico a partir de una longitud de 1 mi de una fibra de sílice revestida con Nylon© de 600 pm de diámetro (Fiberguide Industries, Stirling, New Jersey, U.S. A. o FiberTech Optika, Kitchener, Ontario, Canadá) . Un primer extremo de la fibra se preparó para interfase óptica con otros instrumentes, y un elemento de separación se fijó al segundo extremo de la fibra. El primer extremo de la fibra se preparó removiendo 4 cm del revestimiento, clasificando la fibra con una cuchilla cerámica, y torciendo y jalando de manera que se rompa la fibra dejando una superficie plana. Para el elemento de separación, se aplicó una película de elastómero de polidimetilsiloxano hidrofóbico transparente (PDMS) al segundo extremo de la fibra. Los sensores se hicieron a partir de tres materiales de PDMS que tienen diferentes materiales de partida de peso molecular y diferentes grados de reticulación. Las películas GE RTV118 (General Electric) se hicieron mezclando 50 mg del material precursor PDMS con 300 µ? de diclorometano (DCM) y luego permitiendo al DCM evaporarse hasta que la mezcla llegó a ser pegajosa (3 horas estáticas o menos tiempo soplando con nitrógeno) . Una punta de jeringa de 18 calibres se utilizó para aplicar una perla del PDMS pegajoso en la punta expuesta de la fibra y la perla se permitió curar durante 24 horas a temperatura ambiente. Las películas Sylguard 186 (Dow) se hicieron mezclando el material base y agente de curación en una relación de 10:1 en volumen. Esta mezcla se disolvió en 3X volumen de dicloromeano (DCM) . Esta mezcla se permitió curar durante 5 horas a temperatura ambiente con evaporación de DCM. Se utilizó una punta de jeringa de 18 calibres para aplicar una perla de Sylguard 186 mezclada (viscosidad = 65,000 cp; orilla A = 24) en la punta expuesta de la fibra y la perla se permitió curar durante 48 horas a temperatura ambiente. Un ejemplo de este tipo de perla se muestra en la Figura 2. La perla se recortó entonces utilizando un escalpelo para remover el elastómero que no estuvo directamente en la trayectoria de la luz de excitación. Un extremo cónico se fabricó también utilizando un escalpelo para reducir el volumen del sensor y dispersión de fondo. Se hicieron películas Sylguard 184 (Dow) repitiendo el procedimiento de Sylguard 186 anterior, pero produjo películas mucho más delgadas (viscosidad = 3900 cp; orilla A = 50). Para obtener una película más delgada, se colocó la fibra preparada verticalmente en un horno a 90°C durante 30 minutos. La Sylguard 184 se preparó mezclando el material base y el agente de curación en una relación de 10:1 en volumen. Aunque la fibra se calentó todavía, la punta entró en contacto con la sylguard 184 mezclada. Esto provocó al elastómero curarse rápidamente en la punta de fibra y se repitió varias veces hasta que la película se pareció a una perla de dimensiones apropiadas (por ejemplo, la Figura 2). La perla se recortó entonces utilizando un escalpelo para remover el elastómero no directamente en la trayectoria de la luz de excitación (véase posteriormente) . Ejemplo 2. Configuración Experimental y Caracterización del sensor óptico La configuración experimental se muestra en la Figura 4. Esta configuración permite explorar los espectros de excitación y emisión, y también verificar la emisión en una longitud de onda fija como una función de tiempo, y producir las curvas de respuesta de tiempo del sensor. El sensor 3 óptico, hecho de una longitud de fibra 2 óptica, se conectó a través de un acoplador 5 óptico, y la fibra 7 óptica a una fuente 4 de luz de excitación y un espectrómetro 6. La fuente 4 de luz incluyó un monocromador de exploración controlado por computadora acoplado a una lámpara de xenón (ambos de Sciencetech Inc., London, ON) para seleccionar la longitud de onda de excitación, y el espectrómetro 7 incluye un monocromador similar con un detector fotomultiplicador para verificar la emisión de una longitud de onda más larga. Varios sensores ópticos se prepararon utilizando el procedimiento descrito anteriormente. La caracterización inicial de los sensores ópticos se hizo por adición directa del compuesto del producto, 1-hidroxipireno , a una solución que contiene un sensor. El tiempo de respuesta de un sensor hecho con GE RTV118 se muestra en la Figura 5. El equilibrio ocurrió en 30 a 40 minutos para este sensor, con los otros sensores que dan tiempos de respuesta similares (datos no mostrados) . Después del equilibrio, la fluorescencia detectada por el sensor se relacionó linealmente a la concentración de HP, como se muestra en la Figura 6. Una gráfica similar para el sustrato piren-?-D-glucuronida dio una inclinación de cero, sin indicar la detección del sustrato . Ejemplo 3. Detección de actividad enzimática La operación del sensor para detectar la actividad enzimática se demostró insertando el sensor en una solución de sustrato, permitiendo la estabilización, y agregando luego la enzima {ß-qlu y ß-qal derivadas de E. coli se obtuvieron de Sigma) . Después de un retraso inicial, se observó un incremento en fluorescencia durante 30 minutos (Figura 7). La inclinación de la curva de 20 minutos a 30 minutos se utilizó como una medida de actividad enzimática relativa. Se determinó la concentración de sustrato óptima par ser 10 µp? graficando la actividad enzimática medida en varios niveles de sustrato (Figura 8), y esta concentración se utilizó en experimentos subsecuentes. Una gráfica de actividad enzimática medida contra la cantidad de enzima agregada fue lineal (Figura 9), indicando la capacidad para cuantificar la actividad enzimática con el sensor, y para detectar tan poco como 10 ng/ml de niveles enzimáticos. Ejemplo 4. Detección de sensor óptico de E. coli Se determinaron números celulares de E. coli B (provisión No. 413) por una combinación de densidad óptica y mediciones de conteo de placa. Las muestras que contienen varios números iniciales de células se colocaron en frascos de vidrio con caldo Luria estándar y 10 µ? de sustrato agregado (el volumen total de cada muestra fue 4 mi) y la temperatura de incubación se mantuvo a 37.0 ± 0.1°C. Las muestras se probaron una a la vez insertando el sensor óptico en la muestra, y verificando la señal de fluorescencia como una función de tiempo. Después de 1 a 10 horas, la señal se incrementó rápidamente si una o más células de E. coli se presentaron inicialmente en la muestra (véase por ejemplo, Figura 10) . Los experimentos control (células eliminadas por ciclo de congelamiento-descongelamiento) no dieron respuesta después de 24 horas. El tiempo entre la inserción del sensor en la muestra y el inicio de la señal (definido como un incremento de 1 V del nivel de fondo anterior) se relacionó inversamente al número de células originalmente agregadas, de acuerdo con un modelo para el análisis cinético del crecimiento celular (véase la Figura 11 y el ejemplo siguiente) . Ejemplo 5. Cinéticas del crecimiento de E. coli y cuantificación de E. coli Se asumió que la señal contra los datos de tiempo obtenidos (véase la Figura 10) pueden describirse utilizando un modelo cinético simple para crecimiento celular, en donde el sensor óptico reporta la concentración del producto, que es una función del número de células presente. Con esta suposición, el sensor óptico da una señal positiva cuando un número critico de células ha sido generado en el recipiente de detección. Se definió que el número inicial de células en una muestra como C0, el número requerido para la detección como Cd (nota: la densidad celular como número/ml puede utilizarse en lugar del número celular) , el tiempo para el número de células para dobles como t2, y el tiempo requerido para la detección como td. El número de células para cualquier hora (Ct) puede escribirse: t_ y a tiempo de detección: Éste puede transformarse a: que se reconfigura a: Utilizando el sustrato de piren-/?-D-glucuronida, una serie de experimentos con CQ conocidos (determinados separadamente a través de conteos de placa) se condujo, y el tiempo para la detección de td determinado. Una gráfica en (C0) contra td fue lineal (Figura 11A) , con la inclinación dando -In(2)t2 y la intercepción dando In(Cd). A partir de la región lineal de la gráfica resultante, el tiempo de duplicación t? se calculó para ser 20.3 minutos, y el número critico de células para detección Q se determinó para ser 3xl08. La linealidad de la gráfica (Figura 11A, R2>0.99) soporta este modelo para el comportamiento total, y deja calcular el número de células en puntos de tiempo antes de la detección. Al utilizar esto, se puede tomar ahora una curva particular, por ejemplo, C0 = 1 célula, y para cualquier tiempo específico, se puede estimar el número de células presentes. Cuando ocurre la detección en un tiempo específico para una muestra desconocida, la misma gráfica puede utilizarse para determinar el número de células presentes inicialmente, de esta manera la cuantificación de E. coli en la muestra es posible. Esto asume el mismo tiempo de duplicación para la muestra y los experimentos de referencia, que pueden determinarse para una variedad más amplia de muestras . Este experimento se repitió para producir las gráficas de calibración de Log(número inicial de células) contra el tiempo de detección utilizando tres diferentes sustratos para E. coli y detección de coliforme total. La Figura 11B muestra el tiempo de detección de E. coli en varios conteos celulares iniciales con el sustrato de antracen- í-D-glucuronida . Estos experimentos se condujeron con 100 mi de muestras, se agitaron a 35°C, utilizando 0.75 mg del sustrato, y la cepa 25922 de E. coli. La Figura 11c muestra el tiempo de detección de coliforme total en varios conteos celulares utilizando el sustrato de piren-ß-?-galactopiranosida . La detección se demuestra utilizando tipo B de E. coli como el organismo de. prueba ya que E. coli está en la clase coliforme. Estos experimentos se condujeron con 10 mi de muestras agitadas a 37°C. La Figura 11D muestra el tiempo de detección de coliforme total en varios conteos celulares utilizando el sustrato de antracenil-?-D-galacopiranosida . La detección se demuestra utilizando E. coli 25922 como el organismo de prueba, ya que E. coli es la clase coliforme. Estos experimentos se condujeron con 20 mi de muestras agitadas a 37°C. Ejemplo 6. Detección de cuatro cepas de E. col! Se obtuvieron B de E. coli (provisión No. 413) a partir de un grupo de investigación en Queen' s University at Kingston, Kingston, Ontario, Canadá. La cepa ATCC 25922 se adquirió de American Type Culture Collection. Las cepas KS1 y KS2 se aislaron del efluente de planta de tratamiento de aguas residuales de la Ciudad de Kingston, y representa cepas naturales o de "tipo silvestre". Estas cepas se sometieron al análisis descrito anteriormente, es decir, utilizando el sustrato de pyr-glu y rastreando la señal de sensor contra el tiempo ya que cada cepa creció para obtener un "tiempo de inicio de señal" que se relaciona al número de células originalmente presentes. Los resultados para la cepa ATCC y una de las cepas de aguas residuales de Kingston se graficaron en las Figura 12A y B. Como puede verse a partir de las Figuras 12A y B, las inclinaciones de todas las .curvas son equivalentes (representando el cambio en tiempo de detección como una función de cambio en el logaritmo del número de células inicialmente presentes) . La intercepción-y para estas gráficas predice el tiempo que tomaría para detectar una sola célula en la muestra inicial. El hecho de que las inclinaciones sean idénticas, pero las intercepciones-y sean ligeramente diferentes puede indicar una diferencia en un tiempo de "retraso" o "resurrección" para cada cepa antes de que inicie el crecimiento. Esto coloca un rango de aproximadamente un orden de magnitud en las estimaciones de contec celular que se pueden derivar de los tiempos de inicio de señal para las muestras reales. Ejemplo 7. Sustrato de Antracen-gluc ron da Se probó el sustrato de antracen-p-D-glucuronida (ant-glu) en la misma manera como el sustrato pyr-glu (anterior) . El sustrato ant-glu se realizó sustancialmente de manera idéntica al sustrato de pirene Las longitudes de onda de excitación y emisión para la detección de este sustrato son ligeramente más largas, lo que proporciona algunas mejoras cuando se utilizan componentes de espectrómetro miniatura. Por ejemplo, el diodo que emite luz ultravioleta utilizado para la excitación en algunas configuraciones tiene una salida máxima de 375 nm, que es más largo que la longitud de onda máxima para hidroxipireno excitante (340 nm) , pero más cercana a la longitud de onda máxima para el hidroxiantraceno excitante (370 nm) . Ejemplo 8: Sustrato de piren-galactopiranosida para enzima de galactosidasa Un sustrato para la detección de la actividad de galactosidasa, piren-galactopiranosida (pyr-gal), se sintetizó y probó con E. coli B (provisión No. 413) . La prueba de enzima de galactosidasa se utiliza como un indicador de bacteria "coliforme total", análoga a la prueba de glucuronidasa para E. coli. Ya que el producto a partir de este sustrato es idéntico al producto de glucuronidasa, es decir, hidroxipireno, se esperó que el método y el sensor óptico de la invención trabajarían tan bien como con el sustrato pyr-glu, siempre que se expresó la enzima de galactosidasa. Resultados iniciales para las muestras estimaron contener millones de células (Figura 13A) y unos pocos miles de células (Figura 13B) son sustancialmente idénticas a la prueba de glucuronidasa. Ejemplo 9. Comparación de pruebas de E. coli Las muestras acuosas (n = 37) a partir de las fuentes de agua potable locales (lagos y ríos) en, y cerca de Kingston, Ontario, Canadá se suministraron a un laboratorio acreditado local (referido como Laboratorio de Referencia) para el análisis de E. coli utilizando un método de filtro de membrana estándar. El Laboratorio de Referencia removió un volumen de 10 mi de cada muestra de -200 mi para análisis, y luego regresó la muestra restante a los inventores. Un volumen de 10 mi de cada muestra se mezcló con 10 mi de caldo nutriente concentrado para proporcionar 20 mi de medio estándar (mismo medio como el utilizado en el trabajo de E. coli anterior) al cual se agregó el sustrato de pyr-glu. Las muestras se colocaron en un baño de 37 °C y una barra de agitación y el sensor óptico se agregaron. Se verificó la fluorescencia, y el "tiempo para detectar" (td) se determinó para cada muestra. Las muestras negativas no dieron señal de fluorescencia significativa después de al menos 20 horas. Se utilizaron resultados para el conjunto inicial de estas muestras para calibrar ¦ las respuestas de td, produciendo la curva de E. coli mostrada en la Figura 14. Esta calibración se utilizó para convertir subsecuentemente los resultados de td en "número de células por volumen de unidad" (que son equivalentes a las "unidades que forman la colonia" o las CFU que se detectan por el método de filtro de membrana estándar) para cada muestra. Los resultados de la comparación indicaron buen acuerdo, especialmente en el rango de 0 a 25 CFU, entre la invención y la técnica de laboratorio estándar. En la Tabla 1 una comparación cuantitativa de los dos métodos se da. La Tabla 1 funde los datos en el formato de "presencia/ausencia", con asignación para las variaciones estadísticas de muestreo en el nivel monocelular. La comparación indica el acuerdo perfecto entre la clasificación "positiva" y "negativa" de las muestras. Esta comparación demuestra que la invención proporciona numerosas ventajas sobre la técnica de Laboratorio de Referencia sin sacrificio en rendimiento. Por ejemplo, la invención proporciona una prueba que: es más rápida (por ejemplo menos de 15 horas, con detección más rápida para más muestras contaminadas contra 18 a 24 horas para la prueba de Laboratorio de Referencia) ; requiere menos manipulación de la muestra; proporciona detección óptica sin conteo visual, observación, o intervención humana (y por lo tanto no se somete a error humano) , puede utilizarse en el sobrecrecimiento y/o muestras opacas; y tiene un margen dinámico amplio (por ejemplo, 1 a lxlO6 células contra 1 a 100 células para el Laboratorio de Referencia) de manera que no son necesarias ningunas diluciones. Tabla 1: Comparación de la invención y técnica de Laboratorio de Referencia para la detección de E. coli en un modo de "presencia-ausencia" .

Comparación de los resultados de Número de prueba de E. coli Casos Invención: +ve, Laboratorio de 19 Referencia: +ve (Positivos confirmados) Invención: 1 célula, 1 Lab. de Referencia: -ve (Positivos falsos potenciales) Invención: >1 célula 0 Lab. de Referencia: -ve (Positivos Falsos) Invención: -ve, 12 Lab. de Referencia: -ve (Negativos Confirmados) Invención: -ve, 5 Lab. de Referencia: -1 célula (Negativos falsos potenciales) Invención: -ve, 0 Lab. de Referencia: >1 célula (Negativos Falsos) Muestras totales 37 Ejemplo 10. Detección de coliforme total Un subcon unto de muestras del Ejemplo 9 se seleccionaron para análisis de coliforme total (TC) utilizando el sustrato de pyr-gal. Ya que el Laboratorio de Referencia no hizo las determinaciones para coliforme total para estos, una prueba de TC separada que utiliza el sistema Quantitray comercial (Colilert-18®, Indexx Laboratories Inc., estbrook, ME) , que proporciona un efecto de TC utilizando el método cuantitativo de Número Más Probable (MPN) , se realizó también en las muestras. Los resultados iniciales se proporcionan en la Figura 13; sin embargo, se debe observar que más datos son necesarios para confirmar los valores matemáticos para ajuste de logaritmo lineal de estos datos. Por lo tanto, no puede concluirse si esta curva es diferente de la curva de E. cali de la Figura 14, como los dos rangos diferentes de contaminación de cubierta. Se debe enfatizar que ambas curvas utilizan muestras reales con una variación aleatoria en las cepas actuales de los organismos coliformes presentes, de manera que se espera que sea similar el rendimiento total a la prueba de E. coli. Ejemplo 11. Preparación de 2-antracenil-fi-D-galactopiranosida Se preparó la 2-antracenil-p-D-galacopiranosida 4 de acuerdo al esquema mostrado en la Figura 15. La glicosilación de 2-hidroxiantraceno 2 bajo las condiciones de transferencia de fase (21) con acetobromogalactosa I dieron buenos rendimientos de conjugado 3 que se desprotegió a 4 bajo condiciones Zemplen. Ejemplo 12. Preparación de l-pirenil-fi-D-galactopiranosida Se preparó 7 l-pirenil-p-D-galactopiranosida en forma similar a aquella del Ejemplo 11 de 1-hidroxipireno y acetobromogalactosa (esquema mostrado en la Figura 16) . Como se muestra en la Figura 17, la glicosilación de 2-hidroxiantraceno y 1-hidroxipireno puede también afectarse fundiendo la aglicona con penta-acetil galactosa 5(12), pero los rendimientos del conjugado 6 no son elevados. Ejemplo 13. Preparación de antracen-fi-D-glucuronida Se preparó antracen-p-D-glucuronida de acuerdo con el esquema mostrado en la Figura 18. Se convirtió 2- hidroxiantraceno al trimetilsilil éter 10 para incrementar su solubilidad. El trimetilsilil éter 10 se acopló al tricloroacetamidato 9 (13) en la presencia de eterato de trifluoruro de boro. La desprotección del conjugado 11 resultante con metóxido de sodio en metanol seco seguido por la adición de agua permitió a la sal 12 de sodio cristalizarse a partir de la solución. Esta sal puede cambiarse a la sal 13 de ciclohexilamonio por intercambio de sal con acetato de ciclohexilamonio. El triclorolacetamidato de isobutirilo 14 (15) puede utilizarse para preparar la glucuronida de antraceno a través del conjugado 15, como se muestra en el esquema de la Figura 19, pero los rendimientos no se mejoran. Ejemplo 14. Preparación de 2-antracenil-fi-D-galactopiranosida 4 Preparación de tetra-0-acetil-2-antracenil-fi-D-galactopiranosida 3 Una mezcla de tetra-O-acetil-l-bromo-1-desoxigalactosa 1 (205 mg, 0.5 mmoles), 2-hidroxiantraceno 2 (74 mg, 0.381 mmoles), sulfato ácido de tetrabutilamonio (100 mg, 0.294 mmoles), diclorometano (2.5 mi) y 1.5 M de hidróxido de sodio (0.5 mi, 0.75 mmoles) se agitó vigorosamente a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo (20 mi), se lavó con agua (3 x 10 mi), salmuera (10 mi) y se secó con sulfato de sodio (x 2) . La evaporación del solvente dio una goma café (249 mg) la cual se llevó a cromatografía en gel de sílice utilizando diclorometano seguido por 39/1 diclorometano/acetato de etilo como eluyente para dar el compuesto 3 como una espuma dorada (129 mg, 65% de rendimiento) . xHmr (CDCI3, d) : 2.06 (3H,s,0Ac), 2.12 (6H, s, OAc) , 2.22 (3H, s, OAc) , 4.23 (3H, m, H5< , yH6< ) , 5.20 (1H, q, j=30,10.4 Hz, H3. )/ 5.24 (1H, d, j=8.0Hz, H ) , 5.52 (1H, d, j=3.0Hz, H4.), 5.60 (1H, q, j=8.0, 10.4Hz, H2' ) , 7.22(1H, q, j=2.4, 9.1Hz, H3), 7.48 (3H, m, Hi, H) , 7.99 (3H, m, ) , 8.33 (1H, s, H9) , 8.41 (1H, s, H10) . Una solución de tetra-O-acetil-2-antracenil-p-D-galactopiranosida 3 (30 mg, 0.057 mmoles) en metanol seco (0.6 mi) se agitó a temperatura ambiente y se trató con 0.052 M de metóxido de sodio en metanol (100 µ?, 0.0052 mmoles) . Después de 20 minutos, comenzó a formarse un precipitado blanco. Después de la agitación durante la noche, el producto se filtró y se lavó con un poco de metanol y luego se absorbió en seco para dejar un sólido cremoso blanco, 14.8 mg (72.5%) . xHmr (DMSOd6,5) : 3.4-3.8 (6H,m), 4.53 (1H, d, j=4.2Hz, OH) , 4.71 (1H, t, j=5.5Hz, OH primaria) , 4.88 (1H, d, j=5.7Hz, OH), 5.06 (1H, d, j=7.7Hz, Hr ) , 5.22 (1H, d, j=5.1Hz, OH) , 7.30 (1H, q, j =1.8 , 9.4Hz, H3), 7.48 (2H, m, H6 H8), 7.57 (1H, br.d, Hi), 8.04 (3H, m, H4 H5, H-), 8.40 (1H, s,H9), 8.53 (1H, s, H10) - Ejemplo 15. Preparación de l-plrenil-fi-D-galactoplranoslda Se preparó l-Pirenil-p-D-galactopiranosida en forma similar a aquella descrita en el Ejemplo 14. ^mr (DMSOd6, d) : 3.4-3.95 (6H, m) , 4.62 (1H, d, j=4.6 Hz, OH), 4.72 (1H, t, j=5.5Hz, primaria OH), 4.97 (1H, d, j=5.6Hz, OH), 5.17 (1H, d, j=7.6Hz, H '), 5.47 (1H, d, j =5.4 Hz, OH), 7.91 (1H, d, j =6.5Hz), 8.00-8.18 (4H,m), 8.18-8.30 (3H,m), 8.57 (1H, d, j=9.2Hz). Tic (10/1 acetato de etilo/metanoi , UV) mostró una sola mancha Rf 0.14. Ejemplo 16. Preparación de tri-0-acetll-2-antracenil-fi-D-gl curonida de metilo 11 Preparación de 2-hidroxiantracen trimetilsilil éter 10 ? una solución de 2-hidroxiantraceno {14) (lOOmg, 0.515 mmoles) en piridina seca (1.0 mi) se agregó clorotrimetilsilano (120 µ?, 0.845 mmoles). Se formó un precipitado inmediatamente. Después de agitar durante la noche a temperatura ambiente, se agregó (3 mi) de tolueno y la mezcla se filtró. Los sólidos se lavaron con más tolueno y los filtrados combinados se despiezan para dejar un sólido cristalino naranja. El residuo se disolvió en tolueno (5 mi) y nuevamente se filtró para remover una traza de clorhidrato de piridina. La evaporación del solvente produjo un sólido naranja el cual se secó bajo vacio elevado para dar un rendimiento cuantitativo (140 mg) del trimetilsilil éter, el cual se utilizó después sin purificación. Se cargó un matraz en forma de pera de 25 mi con 2- hidroxiantracen trimetilsilil éter 10 (191 mg, 0.717 mmoles) e imidato 9 (479 mg, 1.0 mmol) y se enjuagó con nitrógeno. Se agregaron rápidamente tamices moleculares 3Á activados, pulverizados al matraz de reacción el cual se enjuagó nuevamente con nitrógeno y se enfrio en hielo. Se agregó diclorometano seco (8.5 mi) y la mezcla se agitó durante 30 minutos, con enfriamiento con hielo. Se agregó finalmente eterato de trifluoruro de boro (85 µ?, 0.67 mmoles) y la reacción se volvió inmediatamente un color verde-gris. La mezcla de reacción se agitó durante la noche bajo nitrógeno y se permitió calentar lentamente a temperatura ambiente. La reacción se extinguió agregando metanol (2 mi) y se agitó durante 10 minutos. Los sólidos se extrajeron por filtración y se lavaron bien con diclorometano. Los filtrados combinados se evaporaron para dejar una espuma café la cual se disolvió en diclorometano y se trataron con gel de sílice (1 g) y volvieron a evaporar. El residuo se agregó a la parte superior de la columna de gel de sílice (20 g) preparada en diclorometano la cual se eluyó con este solvente. Las fracciones que contienen el producto se combinaron y se evaporaron para dejar un sólido amarillo sucio (152 mg) . La cristalización a partir de acetato de etilo (2.0 mi) dio un sólido blanquecino (69 mg, 19%). xHmr (CDCI3, d):2.10 (9H, m, 3xOAc) , 3.76 (3H, s, OCH3) , 4.33 (1H, m, H5, ) , 5.41 (4H,m), 7.21 (1H, q, j=2.5, 9.0Hz, H3) , 7.49 (3H, m, H6, H8, Hi, ) , 7.98 (3H, m, H4, H5, H7) , 8.35 (1 H, s, H9) , 8.40 (1 H, s, H10) . Ejemplo 17. Preparación de la sal de sodio del ácido 2-anfc acenil-ß-D-gl curónico 12 Se suspendió en metanol seco (4.0 mi) tri-O-acetil-2-antracenil-p-D-glucuronida 11 de metilo (145 mg, 0.284 mmoles) y se enfrió en un baño con hielo bajo nitrógeno. A éste se agregó 0.678 M de solución de metóxido de sodio (710 µ?, 0.48 mmoles) . La mezcla se agitó durante la noche, permitiendo calentar lentamente a temperatura ambiente. El sólido se consumó lentamente cuando el producto se precipitó de la solución. Al día siguiente se agregó agua (1.0 mi) y la agitación a temperatura ambiente continuó. El precipitado fino se filtró, se lavó con un poco de metanol y se aspiró en seco para dar el producto como un sólido blanquecino (97 mg, 87%) . 'te (D20, d) : 3.61 (3H,m), 3.76 (1 H, d, j=8.4Hz, H5, ) , 5.25 (1H, br.d, j=4.6Hz, H ) , 7.62 (1H, br.d, j=9.0Hz, H3) , 7.45 (2H, m, H6, H8) , 7.54 (1H, br.d, ??),7.98 (3H, m, H4, H5, H7), 8.36 (1H, s, H9) , 8.43 (1H, s, Hi0) . ^mr (DMSOd6,5) : 5.07 (1H, d, j=7.5 Hz, H ) . Ej mplo 18. Preparación de la sal de ciclohexilamonio del ácido 2-antracenil-fi-D-glucurónico 13 Se suspendió la sal de sodio 12 (54 mg, 0.137 mmol) en metanol (~5 mi) y agua (3 mi) y se calentó hasta ebullición. La solución se filtró a través de un tapón tejido contenido en una pipeta Pasteur y se lavó completamente con agua caliente (0.5 mL) . Al filtrado caliente se agregó acetato de ciclohexilamonio (22 mg, 0.138 mmol) y la solución resultante se agitó como se enfrió. Cuando se enfrió en hielo la sal de ciclohexilamonio cristalizada la cual se cosechó por filtración con un sólido amarillo crema (39.7 mg, 62%) . 'Hmr (DMSOd6, d) : 1.19 ( 5H, m) , 1.5-1.9 (5H,m), 2.87 (1H, m, Hi») , 3.62 (1H, d, j=9.8Hz, H5),5.11 (1H, d, j = 6.9Hz, Hr ) , 7.29 (1H, q, j=1.9,9.1Hz, H3) , 7.47 (2H, m, H6, H8), 7.55 (1H, br.d, ??),8.04 (3H, m, H4, H5, H7) , 8.41 (1H, s, H9) , 8.52 (1H, s, Hio) ¦ Ejemplo 19. Preparación y evaluación de un sensor óptico del elemento de separación de esfera polimérica Este ejemplo describe la preparación y evaluación de un sensor óptico del elemento de separación de esfera de silicona o polidimetilsiloxano (PDMS) . El PDMS tiene una polaridad neutra, la cual lo hace hidrofóbico. Esta propiedad provoca al material formar una forma compacta, es decir, una esfera, cuando se sumerge en agua. El PDMS utilizado para el elemento de separación descrito en este ejemplo es ligeramente más denso que el agua, a tal grado que una esfera del material se hundirá al fondo de una solución acuosa y se adherirá a la superficie del fondo del frasco. Ya que el material cura en un polímero rígido, su densidad se incrementa ligeramente. Se ha desarrollado un esquema el cual utiliza una solución de baño polar con un gradiente de densidad de manera que una esfera permanece flotante suficientemente tiempo para curar mientras se suspende. Se preparó la solución de lote como sigue. Una solución de 1.4 g de acetato-trihidrato de sodio y 4 mi de agua se preparó mezclando completamente en un frasco de vidrio de 20 mL. Se agregó entonces lentamente 4 mL de etanol al 95% al mismo frasco sin ninguna agitación. La capa de acetato de sodio es ligeramente polar y más densa que el material de PDMS y la silicona curada, mientras que la capa de alcohol es relativamente polar pero menos densa que el material precursor. Una vez sumergida en la solución, la esfera del material polimérico se mueve rápidamente hacia la capa mezclada en~re las dos capas discretas y permanece suspendida ahí. La esfera no se mueve lateralmente en la capa mezclada, de tal manera que es posible producir numerosas esferas en un solo frasco inyectando el material de PDMS en la solución. La solución de lote asegura una forma idéntica para cada esfera, pero el tamaño de la esfera depende de la cantidad de material de PDMS inyectado. Las pipetas de laboratorio estándares y jeringas no pueden utilizarse para inyecciones de volumen exacto debido a la viscosidad elevada de la silicona precursora. Por lo tanto, se agrega un solvente al material precursor para reducir su viscosidad. Durante la fase de curado del polímero, el solvente simplemente se difunde afuera. Numerosos solventes tales como diclorometano, hexano y otros orgánicos pueden utilizarse para disolver el material precursor; sin embargo, estos solventes no son completamente miscibles en etanol o agua y provocará a la silicona elevarse lentamente a la superficie de la solución de lote hasta el curado. El tetrahidrofurano (THF) es un solvente que puede disolver el material precursor y disiparse lentamente en el etanol, dejando a la esfera de silicona en la capa mezclada de la solución de lote para un rendimiento de producción de 90 a 100%. La cantidad de THF requerida para inyecciones reproducibles varia con el tipo y marca de silicona utilizada. Para una masa de esfera de aproximadamente 1.2 mg (diámetro de aproximadamente 1.5 mm) , 0.45 mi de HF por gramo del precursor de silicona se requiere cuando se utiliza la silicona de Dow Corning Sylguard 184 y 0.6 mi de THF por gramo de silicona se requiere cuando se utiliza silicona de United Chemical Technologies. Las pipetas calibradas y jeringas pueden utilizarse para inyectar la silicona/solvente en la solución de lote. Se obtuvo mejor capacidad de reproducción utilizando jeringas cuando se prepara 1 mg de esferas.de 3 mg. Cuando se utiliza una jeringa, el calibre en el barril de la jeringa puede utilizarse convenientemente para establecer el volumen de solución de silicona/solvente inyectado en la solución de lote. Una vez que se carga el polímero/solvente en la jeringa, la aguja se limpia e inserta en la capa de etanol de la solución de lote. El émbolo de la aguja se presiona lentamente hasta que una gota de la solución polimérica se libera a partir de la aguja y deja caer rápidamente a la capa limite de la solución de lote en donde permanece. La aguja se mueve a otra ubicación en la capa de etanol y otra gota se exprime fuera de la aguja. De esta manera, aproximadamente una docena de esferas pueden producirse en un frasco de 20 mi. La jeringa se remueve cuidadosamente a partir de la solución de lote y el frasco se tapa entonces y se deja todavía a temperatura ambiente hasta que el periodo de curado ha transcurrido. Para remover las esferas pcliméricas sólidas a partir de la solución de lote, un embudo de filtro plástico con tamaño de poro más pequeño que las esferas se utiliza para filtrar la solución de lote. Las esferas retenidas se lavan entonces con 95% de etanol para remover cualquier acetato de sodio residual y dejarlo secar. Cuando se seca, las esferas poliméricas se pesan y clasifican por masa. Rendimiento del sensor óptico del elemento de separación de esfera polimérica El proceso de lote utilizado para producir- concentrar elementos de separación de esfera polimérica como se describe anteriormente asegura que las esferas de silicona tienen tamaño consistente, morfología y claridad óptica, que mejora el límite de detección del sensor óptico. Como un resultado, el tiempo de equilibrio, producción de señal en una solución de producto dada, tal como hidroxipireno o hidroxiantraceno , y calibración de sensores ópticos, hechos con las esferas se estandariza. Como se observa anteriormente, varias formulaciones de PDMS pueden utilizarse en la preparación de esferas de silicona. Las diversas formulaciones cambian las propiedades físicas del polímero. Por ejemplo, Dow Corning Sylgard 184 produce un polímero muy rígido debido a un grado elevado de reticulación y la adición de los materiales de filtro tales como sílice ahumada. Este polímero tiene una vida extremadamente larga en la solución debido a su capacidad para soportar la degradación y minimizar la hinchazón en soluciones alcohólicas. La desventaja de esta formulación es que 1 mg de esferas requiere 3 horas para equilibrarse en una solución del producto. Una esfera de 1 mg producida a partir de silicona de United Chemical Technologies se equilibra en 1 hora. Esta esfera es menos rígida que una esfera producida con Sylguard 184 debido a la carencia de sílice ahumada y un grado inferior de reticulación; sin embargo, es más susceptible para hinchazón y degracación. El grado de reticulación puede controlarse en ambas formulaciones para lograr un polímero el cual tiene un tiempo de equilibrio de entre 1 y 3 horas, como se muestra en la Tabla 2.

Tabla 2. Formulaciones de dos marcas de materiales de PDMS que producen esferas Ejemplo 20: Inmunoensayo de enzima utilizando sensor óptico Introducción Este ejemplo describe el uso de un sensor óptico con un elemento de separación de PDMS como se describe anteriormente en un inmunoensayo para la detección de 17-ß-estradiol (E2) . Un equipo de inmunoensayo estándar se utilizó para este propósito. El equipo de 17-p-estradiol correlacionado con EIA del Diseño de Ensayo (Assay Designs Inc. Ann Arbor, MI) es un inmunoensayo competitivo para la determinación cuantitativa de E2 en muestras biológicas y ambientales. El procedimiento de ensayo estándar o convencional se describe como sigue: Una muestra o solución estándar la cual puede contener E2 se coloca en un micropozo en una placa microtituladora junto con una segunda solución que contiene E2 que se une a una etiqueta de enzima de fosfatasa alcalina (AP) (AP-E2). El anticuerpo policlonal a E2 (anti-E2) se agrega al micropozo, que ha sido recubierto previamente con otro anticuerpo el cual se une a anti-E2 irreversiblemente a la superficie de micropozo. Con relación al número de moléculas de anticuerpo inmovilizadas, se agrega AP-E2 en exceso. La unión competitiva de E2 y AP-E2 ocurre, resultando en una cantidad inmovilizada de AP-E2 que se relaciona inversamente a la cantidad de E2 en la mezcla. Después de un periodo de unión, la muestra residual y los reactivos se lavan fuera dejando únicamente los complejos de anticuerpo AP-E2 y E2 inmovilizados en el micropozo. Una solución del sustrato se agrega para determinar la cantidad de AP-E2 inmovilizada a través de una medición de actividad enzimática. Una reacción entre el sustrato y AP para producir un producto coloreado se verifica. El equipo comercial normalmente utiliza p-nitrofenilfos fato como el sustrato, con p-nitrofenol como el producto. Para cuantificar la actividad enzimázica, el color amarillo generado se mide como absorbancia a 405 nm va sea continuamente (proporcionando una absorbancia contra la curva de tiempo) o después de un tiempo de incubación fijo (por ejemplo, 20 minutos). La "señal" verificada es la inclinación de la absorbancia contra la curva de ~iempo o valor de la absorbancia medica en el modo de tiempo fijo. La señal es máxima para un espacio blanco que contiene únicamente AP-E2, y disminuye con incrementos en los niveles E2 en la muestra. La señal para cualquier muestra relativa a la señal para una solución en blanco es una medida de la unión relativa de AP-E2, y se expresa con frecuencia como una fracción de porcentaje unido. Una gráfica de fracción unida contra la concentración de E2 para las soluciones estándares proporciona una curva de calibración para el ensayo, la cual se utiliza entonces para determinar las concentraciones de muestras desconocidas. El instrumento de detección utilizado en tal inmunoensayo es normalmente un lector de placa microtituladora de "escaño superior". Esto es un instrumento sofisticado y caro (-$30,000) que requiere alquna especialización para operar y mantenimiento costoso. Alternativamente, los especrómetros convencionales con uniones de "microplaca" pueden utilizarse. Otros inmunoensayos se hacen en recipientes más grandes (por ejemplo, 5 mL de configuración de tubo de prueba) con detección en un escaño superior o aún espectrómetro portátil, aunque estos usan volúmenes de muestra más grandes, más reactivos por muestra y por consiguiente operan a un costo más elevado. Las versiones portátiles o de campo usualmente tienen precisión más pobre y limites de detección. Otros inmunoensayos portátiles utilizan "tiras de prueba" con lecturas visuales, pero estos no pueden normalmente proporcionar resultados cuantitativos y tienen limites de detección más pobres . Se describe en la presente un esquema de detección alternativo para inmunoensayos de, enzima estándar utilizando un sensor óptico para detectar la actividad enzimática. Este puede utilizarse en el esquema de unión competitivo descrito anteriormente y en todos los esquemas de inmunoensayo de enzima, incluyendo los ensayos de "intercalado", "inmunosondas" y sistemas de inmunoetiquetado . En este método, se utiliza un sensor óptico que tiene un elemento de separación polimérica (véanse los Ejemplos 1 y 19 anteriores) para la detección del producto. Para verificar la actividad de AP, un sustrato con una porción de fosfato unida a un compuesto fluorescente se utiliza, en donde el compuesto fluorescente del producto es uno el cual se detectará con el sensor óptico. Para la demostración de este método, se sintetiza 1-pirenfosfato (PP), que en la reacción con AP produce 1-hidroxipireno (HOP) , que se detecta eficientemente por el elemento de separación del sensor óptico, e ión de fosfato. En el ensayo, el sensor óptico se inserta en el micropozo que contiene AP unido (es decir, AP-E2) y sustrato de PP. Como la reacción entre PP y AP produce HOP, el HO? se detecta por el sensor. Como en el ensayo convencional, el HOP puede detectarse continuamente (sensor insertado antes o con PP) o en el modo de "punto final" (conversión de PP a HOP detenido en un tiempo de reacción fijo y luego el sensor insertado) . La señal en cualquier caso es la inclinación de una fluorescencia contra la curva de tiempo y una gráfica de calibración se genera utilizando un método similar a aquel descrito anteriormente para el inmunoensayo convencional. EXPERIMENTAL Químicos y Reactivos Se adquirió el equipo de 17~p-Estradiol correlacionado con EIA del Diseño de Ensayo (Catálogo NO. 901-008) a partir de Assay Designs Inc. (Ann Arbor, MI) . Se obtuvieron Tris [hidroximetil] aminometano (tris) y MgCl2.6H20 a partir de Sigma-Aldrich (Mississauga, Ontario, Canadá) . Se preparó el pH 9 del regulador Tris 0.1 M con 1.0 mM de MgCl2 todos los días. Se sintetizó 1-pirenfosfato en nuestro laboratorio. El repertorio de sustrato 4.97e~4 se preparó en pH 9.01 M de regulador tris-HCl con 1.0 mM de MgCl2 inmediatamente antes del uso. Se utilizó ácido sulfúrico 2M (Fisher Scientific, Ottawa, Ontario, Canadá) como solución de detención . Instrumentación Se hicieron las mediciones de fluorescencia utilizando un espectrómetro (Sciencetech Inc., London, Ontario, Canadá), con una lámpara de arco de xenón de 75 watts y un detector fotomultipiicador . Las aberturas de excitación y emisión se establecieron a 5 nm de paso de banda para todas las mediciones. La longitud de onda de excitación fue 345 nm y la longitud de onda de emisión fue 385 nm. Un sensor óptico con el elemento de separación polimérico (véanse los Ejemplos 1 y 19) se utilizó con un sistema que acopla el sensor óptico para la detección del producto (véase por ejemplo, la Figura 3A) . Procedimiento Se llevó a cabo el inmunoensayo después del procedimiento recomendado por el fabricante. Las reacciones se llevaron a cabo en micropozos recubiertos con anticuerpo. Todos los ensayos se hicieron a temperatura ambiente (24 ± 2°C). Todos los reactivos se pasaron a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos antes de la abertura. Se pipetearon 100 µ? de regulador de ensaye en el micropozo Bo y 100 µ? de estándares # 1 a # 6 se agregaron en los pozos individuales. 50 µ? del conjugado y 50 µ? del anticuerpo se agregaron entonces a cada pozo en el inmunoensayo de modo "punto final". Para el inmunoensayo de modo cinético, 20 µ? de-I conjugado y 20 µ? de anticuerpo se agregaron y el regulador de ensayo se agregó también a cada pozo para constituir el volumen de 60 µ?. La placa se cubrió con un sellador de placa e incubó durante 2 horas con agitación orbital a -500 rpm. Después de la incubación, la placa se lavó 4 veces con 300 µ?/???? de solución lavable. Después de deslavar los reactivos sin reaccionar, se agregó 250 µ? de solución de PP regulada a los pozos. En el inmunoensayo continuo, el sensor óptico se insertó antes o con la solución de PP. En el inmunoensayo de punto final, después de 30 minutos de incubación a temperatura ambiente, la reacción de conversión de PP se detuvo con 50 µ? de 2 M de ?2=04, luego, el sensor óptico se insertó en la solución. En cualquier caso, la curva de entrada de HOP se registró hasta que la inclinación confiable se obtuvo. Después de cada ensayo, HOP se limpió a partir del elemento de separación polimérica del sensor óptico con cualquier solución de etanol/agua 50/50 (v/v) o una solución de 1 de NaOH. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Determinación de parámetros KM y Vmax Los parámetros cinéticos de Michaelis-Menten para la detección de actividad AP se determinaron ya que PP no había sido reportado previamente como un sustrato para esta enzima. La velocidad de conversión del sustrato como una función de la concentración del sustrato se determinó generando un conjugo de señal de sensor óptico contra las curvas de tiempo. Las velocidades se graficaron como una función de concentración de sustrato (véase la Figura 20) y el ajuste de curva no lineal dio los parámetros cinéticos ??=:, = 9 x 1 ~J moles/s y KM = 2.45 x 10"5 . De manera ideal, una concentración de sustrato en operación del ensayo de aproximadamente 10 x KM se utilizaría en ensayos para maximizar la sensibilidad y reproducibilidad de inclinación. Ya que la inhibición de PP de la actividad enzimática es indicada en el nivel de 2 x 10"1 M, se decidió utilizar la concentración confiable máxima de 5 x KM (1.25 x 1CT4 M) para ensayos adicionales utilizando PP. Inmunoensayo con sensor óptico El inmunoensayo se llevó a cabo utilizando 1.25 x 10~4 M de solución de sustrato en regulador de pH 9 en modo de punto final. Se obtuvieron respuestas de sensor óptico después de la inmersión en la solución de tiempo de detención. Como se espera, las muestras con concentración mayor de E2 produjeron cantidades de E2-AP unidas más bajas, y por consiguiente respuestas de sensor óptico más bajas. Las respuestas relativas se utilizaron para calcular el % de E2-AP unido. La gráfica del % Unido contra la concentración de E2 que es esencialmente la curva de calibración para el ensayo, se da en la Figura 21. Los mismos parámetros de inmunoensayo se utilizaron en el modo cinético para generar una gráfica para la señal de sensor óptico contra el tiempo. Estos datos se adquirieron con un sensor óptico como se describe en el Ejemplo 19, y se utilizaron para generar el % de curva Unida mostrada en la Figura 22. CONCLUSIÓN Estos resultados indican que este nuevo método de inmunoensayo enzimático que utiliza un sensor óptico para detectar actividad enzimática produce resultados comparables a los métodos de inmunoensayo enzimáticos convencionales, sin la necesidad de equipo de detección caro. Equivalentes Aquellos expertos en la técnica reconocerán, o serán capaces de averiguar a través de la experimentación de rutina, las variantes de las modalidades descritas anteriormente. Tales variantes están dentro del alcance de la invención y están dentro del alcance de las reivindicaciones anexas .

Referencias : 1. Manafi, M. ; Kneifel, W. ; Bascomb, S. Fluorogenic and chromogenic substrates used in bacterial diagnostics. Microbiology Review 55:335-348 (1991). 2. Frampton, E. .; Restaino, L. Methods for Escherichia coli identification in food, water and clinical samples based on beta-glucuronidase detection. Journal of Applied Bacteriology 74:223-233 (1993). 3. Alonso, J.L.; Soriano, K. ; Moros, I.; Ferrus, M.A. Quantitative determination of E. coli and fecal coliforms in water using a chromogenic médium. Journal of Environmental Science and Health Part A 33:1229-1248 (1998) 4. Davies, C.M.; Apte, S.C. Rapid enzymatic detection of faecal pollution. Water Science and Technology 34:169-171 (1996). 5. Davies, C.M.; Apte, S.C. Field evaluation of a rapid portable test for monitoring fecal coliforms in coastal waters. Environmental Toxicology 14:355-359 (1999). 6. d'Auriac, M.B.A.; Roberts, H.; Shaw, T . ; Sirevag, R. ; Hermansen, L.F.; Berg, J.D. Field evaluation of a semiautomated method for rapid and simple analysis of recreational water microbiological quality. Applied and Environmental Microbiology 66:4401-4407 (2000). 7. Nelis, H.; Van Poucke, S. Enzymatic detection of coliforms and Escherichia coli within 4 hours. Water Air ar.d Soil Pollution 123:43-52 (2000) . 8. Robertson, W. ; Palmateer, G.; Aldom, J. ; Van Bakel, D. Evaluation of a rapid method for E. coli and thermotolerant coliforms in recreational waters. Water Science and Technology 38:87-90 (1998) . 9. Flowers; Daniel G.; Stemfeld, Marvin. Chromogenic compounds and methods of using same. United States Patent No. 5,364,767 (1994) . 10. Ley, A.N.; Bowers, R.J.; Wolfe, S. Indoxyl-ß-?-glucuronide, a novel chromogenic reagent for specific detection and enumeration of Escherichia coli in environmental samples. Canadian Journal of Microbiology 34:690-693 (1988) . 11. Kleine, H.P.; einberg, D.V. ; Kautman, R.J.; Sidhu, R.S. Carbobydrate Res. 142:333 (1985) . 12. Helferich, B.; Schmitz-Hillbrecht , E . Ser. Dtsch. Chem. Ges . 66:378 (1933) . 13. Fischer, B.; Nudelman, A; Ruse, M. ; Herzig, J. ; Gottlieb, H.E.; Keinan, E. J. Org. Chem. 49:4988-4993 (1984) . 14. Hall, J. ; Pericin A.G. J. Chem. Soc. p. 2029 (1923) . 15. Schienmann, F.; Lumbard, W.K.; Brown, R.T.; Mayalarp, S.P. International Patent Application No. O 93/3051 (1993) .

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un método para detectar la presencia de un organismo que tiene al menos una enzima en una muestra, caracterizado porque comprende: proporcionar al menos un sustrato; proporcionar un elemento.de separación; combinar la muestra y al menos un sustrato bajo condiciones que permiten al menos una enzima del organismo para hacerse reaccionar con al menos un sustrato para producir una molécula biológica, y la molécula biológica para dividir el elemento de separación, y detectar fluorescencia de la molécula biológica en el elemento de separación; en donde la fluorescencia detectada es indicativa de presencia del organismo en la muestra.
2. Un método para detectar la presencia de un organismo que tiene al menos una enzima en una muestra, caracterizado porque comprende: proporcionar al menos un sustrato; proporcionar un elemento de separación; combinar la muestra y al menos un sustrato bajo condiciones que permiten al menos una enzima del organismo para hacerse reaccionar con al menos un sustrato, y el sustrato no reactivo para dividirse en el elemento de separación; y detectar la fluorescencia del sustrato no reactivo en el elemento de separación; en donde la magnitud de fluorescencia detectada es indicativa de presencia del organismo en la muestra.
3. El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el elemento de separación comprende una película polimérica.
4. El método de conformidad con la reivindicación 1, 2 ó 3, caracterizado porque las condiciones comprenden condiciones acuosas.
5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la fluorescencia de detección comprende detectar un cambio en cantidad de fluorescencia .
6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el organismo es un microorganismo.
7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el microorganismo es un contaminante biológico.
8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque al menos una enzima se selecciona de ß-glucuronidasa y ß-galactosidasa .
9. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el microorganismo se selecciona de Escherichia coli y bacteria coliforme total.
10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque al menos un sustrato se selecciona de piren-?-D-glucuronida , antracen-?- D-glucuronida, pirrometen-?-D-glucuronida, piren-?-D- galactopiranosida , y antracen-?-D-galactopiranosida .
11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones I a 10, caracterizado porque la muestra se selecciona de agua, una muestra biológica, alimento y tierra.
12. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque la enzima y el sustrato se disponen juntos en un cartucho que comprende el elemento de separación.
13. Un sensor óptico para detectar fluorescencia de una molécula, caracterizado porque comprende: un guiaondas óptico; y un elemento de separación dispuestos en un extremo del guiaondas óptico; en donde la molécula se separa selectivamente en el elemento de separación, de manera que la fluorescencia de la molécula se acopla en el guiaondas.
14. El sensor óptico de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la molécula fluorescente se selecciona de un sustrato enzimático y un producto de una reacción de enzima-sustrato.
15. El sensor óptico de conformidad con la reivindicación 13 ó 14, caracterizado porque el elemento de separación es una película polimérica.
16. El sensor óptico de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la película polimérica comprende polidimetilsiloxano (PD S).
17. El sensor óptico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, caracterizado porque el guíaondas óptico es una fibra óptica.
18. Un aparato para detectar la presencia de una molécula, caracterizado porque comprende: el sensor óptico de conformidad con la reivindicación 13; una fuente luminosa de excitación; y un detector para detectar fluorescencia a la molécula; en donde la fluorescencia detectada es indicativa de presencia de la molécula.
19. El aparato de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la molécula fluorescente se selecciona de un sustrato enzimático y un producto de una reacción de enzima-sustrato.
20. El aparato de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la enzima se asocia con un microorganismo .
21. El aparato de conformidad con la reivindicación 19 ó 20, caracterizado porque la enzima se selecciona de ß- glucuronidasa y ß-galactosidasa . 22. El aparato de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el microorganismo se selecciona de
Escherichia coli y bacteria coliforme total.
23. El aparato de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22, caracterizado porque el sustrato se selecciona de piren-/?-D-glucuronida, antracen-?-D-glucuronida, pirrometen-?-D-glucuronida, piren-/?-D-galactopiranosida, y antracen-/?-D-galactopiranosida .
24. Un sistema para detectar la presencia de un organismo que tiene al menos una enzima en una muestra, caracterizado porque comprende: un recipiente para incubar la muestra y al menos un sustrato de manera que al menos una enzima puede hacerse reaccionar con al menos un sustrato para producir una molécula biológica; un elemento de separación que permite la separación de la molécula biológica en el mismo; una fuente luminosa de excitación que irradia la molécula biológica separada en el elemento de separación; un detector que detecta fluorescencia de la molécula biológica separada en el elemento de separación; y una unidad de control; en donde la fluorescencia detectada es indicativa de presencia del organismo en la muestra.
25. El sistema de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la unidad de control realiza al menos una función seleccionada de la operación de control del sistema, datos de almacenamiento que se relacionan a detección de fluorescencia y datos de producción que se relacionan a detección de fluorescencia.
26. El sistema de conformidad con la reivindicación 24 ó 25, caracterizado porque el recipiente comprende un cartucho removible para contener la muestra y el sustrato.
27. El sistema de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26, caracterizado porque el elemento de separación se dispone en el cartucho removible.
28. El sistema de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 27, caracterizado porque comprende además una unidad de comunicaciones que retrasa datos que se relacionan a la detección de fluorescencia a una red de comunicaciones .
29. El sistema de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 28, caracterizado porque el organismo es un contaminante biológico.
30. El sistema de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 29, caracterizado porque la muestra se selecciona de agua, una muestra biológica, alimento y tierra.
31. El sistema de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 30, caracterizado porque la enzima se selecciona de ß-glucuronidasa y ß-galactosidasa .
32. El sistema de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el organismo se selecciona de Escherichia coli y bacteria colifo.rme total.
33. El sistema de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 32, caracterizado porque al menos un sustrato se selecciona de piren-?-D-glucuronida, antracen-/?- D-glucuronida, pirrometen-/?-D-glucuronida , piren-?-D-galactopiranosida , y antracen-?-D-galactopiranosida .
34. El sistema de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24 a 33, caracterizado porque comprende además medios para calibrar el elemento de separación y/o componentes ópticos del sistema o para verificar la detección de fluorescencia, o ambos.
35. El sistema de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque los medios para calibrar el elemento de separación y/o componentes ópticos y/o para verificar la detección de fluorescencia comprenden: un fluoróforo que se separa en el elemento de separación y que es fluorescente en una longitud de onda diferente en lugar de la molécula biológica; en donde la fluorescencia del fluoróforo se detecta por el detector; y en donde la unidad de control utiliza la fluorescencia detectada para calibrar el elemento de separación y/o componentes ópticos del sistema o para verificar la detección de fluorescencia del sistema.
36. Un equipo para detectar un contaminante biológico en una muestra, caracterizado porque comprende: el aparato de conformidad con la reivindicación 18; y un sustrato para una enzima asociada con el contaminante biológico; en donde el equipo proporciona una indicación de la presencia o cantidad del contaminante biológico en la muestra .
37. El equipo de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque comprende además un recipiente para incubar la muestra y el sustrato.
38. El equipo de conformidad con la reivindicación 36 ó 37, caracterizado porque la muestra se selecciona a partir de agua, alimento, una muestra biológica y tierra.
39. El equipo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 36 a 38, caracterizado porque el contaminante biológico es al menos un microorganismo seleccionado de Esc erichia coli y bacteria coliforme total.
40. El equipo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 36 a 39, caracterizado porque la enzima es al menos una enzima seleccionada de ß-glucuronidasa y ß- galactosidasa.
41. El equipo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 36 a 40, caracterizado porque el sustrato es al menos un sustrato seleccionado de piren-?-D-glucuronida , antracen-?-D-glucuronida , pirrometen-?-D-glucuronida, piren-/?-D-galactopiranosida, y antracen-?-D-galactopiranosida .
42. Un método para detectar la presencia de una especie objetivo en una muestra, caracterizado porque comprende : combinar un anticuerpo que es especifico para especies objetivo con una muestra bajo condiciones que permite al anticuerpo unirse a especies objetivo; proporcionar una enzima que permite la cuantificación del anticuerpo unido produciendo una molécula fluorescente ; proporcionar un elemento de separación para dividir la molécula fluorescente en el mismo; y detectar fluorescencia de la molécula fluorescente en el elemento de separación; en donde la fluorescencia detectada es indicativa de- presencia de la especie objetivo en la muestra.
43. El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque el anticuerpo se conjuga a la enzima .
44. El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque la enzima se conjuga a un segundo anticuerpo que es específico para el anticuerpo que es específico para las especies objetivo y el conjugado se mezcla con la combinación del anticuerpo específico para la especie objetivo y la muestra.
45. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 42 ó 44, caracterizado porque la fluorescencia se detecta continuamente a través de la reacción de enzima-sustrato.
46. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 42 a 45, caracterizado porque la fluorescencia se detecta después de una hora fija de la reacción de enzima-sustrato.
47. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 42 a 46, caracterizado, porque la especie objetivo es un contaminante biológico o químico.
48. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 42 a 47, caracterizado porque la especie objetivo se selecciona del grupo que consiste de bacterias, protozoarios y virus.