DE60031549T2

DE60031549T2 - Interne qualitätskontrolle

Info

Publication number: DE60031549T2
Application number: DE60031549T
Authority: DE
Inventors: Graham Gladesville VESEY
Original assignee: BTF Pty Ltd
Current assignee: BTF Pty Ltd
Priority date: 1999-08-02
Filing date: 2000-07-27
Publication date: 2007-09-06
Anticipated expiration: 2020-07-28
Also published as: DE60031549D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der internen Qualitätskontrolle bei diagnostischen Analysen, insbesondere bei der Analyse von Mikroorganismen oder anderer kleiner Partikel, wie z.B. den Nachweis von Bakterien, Protozoen, Hefen, Pilzen, Viren, Prionen und dergleichen in Wasser oder anderen trinkbaren Flüssigkeiten, Nahrungsmitteln, Blut, Urin, Kot, Zerebrospinalflüssigkeit und dergleichen.
Anmerkung: Literaturangaben sind am Ende der Beschreibung zusammengefasst.
Hintergrund der Erfindung
Wasser wird routinemäßig auf das Vorhandensein von Cryptosporidium und Giardia untersucht. Der Nachweis beruht hierbei auf Immunofluoreszenzverfahren, in denen Zysten und Oozysten mit grün fluoreszierendem Farbstoff eingefärbt werden. Die gefärbte Probe wird mittels Epifluoreszenzmikroskopie untersucht und die Anzahl der grün fluoreszierenden Zysten und Oozysten wird festgehalten.
Diese Methodik erfordert zahlreiche Verfahrensschritte, in denen Zysten und Oozysten verloren gehen können. Es ist daher wichtig, eine stringente Qualitätskontrolle durchzuführen, mit der die Leistungsfähigkeit der Methodik überwacht wird. Gegenwärtig geschieht die Qualitätskontrolle durch einen externen Prozess, in welchem ein Standard, der eine bekannte Anzahl von Zysten und Oozysten enthält, analysiert wird. Ein derartiger Test zur Qualitätskontrolle wird üblicherweise nach der Analyse von 10 oder von 20 Proben durchgeführt. Diese externe Qualitätskontrolle ist weit entfernt von einer idealen Lösung. Die Verluste an Zysten und Oozysten können von einer Probe zur anderen erheblich variieren. Es kann sein, dass einige Proben nicht für die Analyse geeignet sind. Außerdem müssen bei einem schlechten Ergebnis der Qualitätskontrolle alle aus den 10 oder 20 Proben gewonnenen Resultate verworfen werfen.
Das gleiche gilt für die diagnostische Analyse in einer Vielzahl von Anwendungsbereichen, in denen eine externe Qualitätskontrolle einer entsprechenden diagnostischen Analyse unterzogen wird, die als ein Maß für die Leistungsfähigkeit/Genauigkeit dient.
Auf dem Gebiet der diagnostischen Analyse besteht daher ein Bedarf an einer genauen, leicht durchführbaren, kostengünstigen und reproduzierbaren Qualitätskontrolle, welcher derzeit durch den Stand der Technik nicht gedeckt wird.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein diagnostisches Verfahren mit interner Kontrolle, welches die Bereitstellung einer Population von Biopartikeln umfasst sowie das Modifizieren der Biopartikel, wobei jedes der Biopartikel dauerhaft und nachweisbar markiert wird, um markierte Biopartikel zu erhalten, Herstellen einer Probe für die interne Qualitätskontrolle, welche eine definierte Menge an markierten Biopartikeln in einem definierten Volumen eines Trägers enthält, Hinzufügen der Kontrollprobe zu einer Test-Probe, in der die gleichen Biopartikel nachgewiesen werden sollen, Durchführen des Tests und anschließendes Bestimmen der genauen Anzahl der im Test gefundenen markierten Biopartikel, womit durch einen Vergleich mit der Menge der hinzugefügten markierten Biopartikel eine Bestimmung der Testgenauigkeit gegeben ist.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur internen Qualitätskontrolle bei der Analyse von Biopartikeln in trinkbaren Flüssigkeiten bereitgestellt, welches die Bereitstellung einer Probe der Biopar tikel umfasst sowie die Behandlung der Probe zur nachweisbaren Markierung der Biopartikel, Herstellen einer Probe für die interne Kontrolle, welche eine definierte Menge an markierten Biopartikeln in einem definierten Volumen enthält, das Hinzufügen der Probe für die interne Kontrolle zu einer Test-Probe und das Analysieren der Probe sowie das Bestimmen des Anteils der in der Probe enthaltenen markierten Biopartikel, wobei der Vergleich der Anzahl der nachgewiesenen markierten Test-Biopartikel mit der bekannten Anzahl markierter Biopartikel, die der Probe hinzugefügt wurden, ein Maß für die Genauigkeit des Tests liefert und tatsächliche Zahlen zur Verfügung stellt, welche die bei der Durchführung des Tests auftretenden Verluste berücksichtigen.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Standard für die interne Qualitätskontrolle, welcher eine bestimmte Menge an Biopartikeln enthält, bereitgestellt, wobei diese Biopartikel von der gleichen Art sind, wie die Biopartikel, die einer routinemäßigen Analyse unterworfen werden, und wobei die vorbestimmte Menge an Biopartikeln mit einer nachweisbaren Markierung markiert und in einem definierten Volumen eines Trägers bereitgestellt ist.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Genauigkeit diagnostischer Tests ist ein entscheidender Aspekt für deren Leistungsfähigkeit als Werkzeug in der modernen Analyse. Es ist ersichtlich, dass ein Test, der keine genauen Ergebnisse liefert, keinen wirklichen Nutzen hat, da er möglicherweise zu hohe oder zu niedrige Werte für das Vorliegen einer bestimmten Entität liefert. Nicht korrekte Analysen können zu falschen Entscheidungen führen und diese können erhebliche nachteilige Auswirkungen haben.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine interne Qualitätskontrolle, bei der interne Standards markierter Bioparti kel, welche zu einer Probe hinzugefügt und routinemäßig analysiert werden, bereitgestellt werden, wonach mit der Anzahl der markierten Biopartikel in der Probe – durch Vergleich mit der bekannten Anzahl der Biopartikel, die der Probe hinzugefügt wurden – ein direktes Maß für die Genauigkeit des Tests gegeben ist.
Gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung wird ein diagnostisches verfahren mit interner Kontrolle bereitgestellt, welches die Bereitstellung einer Population von Biopartikeln umfasst sowie das Modifizieren der Biopartikel, wobei jedes der Biopartikel dauerhaft und nachweisbar markiert wird, um markierte Biopartikel zu erhalten, Herstellen einer Probe für die interne Qualitätskontrolle, welche eine definierte Menge an markierten Biopartikeln in einem definierten Volumen eines Trägers enthält, Hinzufügen der Kontrollprobe zu einer Test-Probe, in der die gleichen Biopartikel nachgewiesen werden sollen, Durchführen des Tests und anschließendes Bestimmen der absoluten Anzahl der im Test gefundenen markierten Biopartikel, womit durch einen Vergleich mit der Menge der hinzugefügten markierten Biopartikel die Bestimmung der Testgenauigkeit gegeben ist.
Bei den Biopartikeln kann es sich um einen Mikroorganismus, beispielsweise ein Bakterium, ein Pilz, eine Hefe oder ein Virus oder um ein einzelliges oder mehrzelliges Protozoon, ein Prion oder um andere Biopartikel handeln. Beispiele für solche Biopartikel sind Cryptosporidium, Giardia, Cyclospora, Toxoplasma, Eimeria, Legionella, Salmonella, Leptospirosis, Escherichia, Saccharomyces, Clostridium, Vibrio, Pseudomonas, Anthrax, Blutzellen, humanes Immundefizienzvirus, Norwalk-Virus und Herpes-simplex-Virus.
Bei der Test-Probe, die auf Biopartikel untersucht werden soll, kann es sich um Wasser oder eine andere trinkbare Flüssigkeit, wie Fruchtsaft, Wein, Bier, Milch, Obstmost/- wein oder dergleichen handeln. Die Probe kann ein Nahrungsmittel, wie Geflügel, Rindfleisch, Ei, Käse oder haltbar gemachtes Fleisch, wie etwa Salami oder Schinken, und dergleichen sein. Weiterhin kann die Probe in Form von Blut, Zerebrospinalflüssigkeit, Urin, Gewebeextrakten, Kot und dergleichen vorliegen.
Die Biopartikel, welche auch die Kontroll-Biopartikel umfassen, werden mit einer nachweisbaren Markierung markiert, durch welche die chemischen und/oder physikalischen Eigenschaften der Biopartikel in einer Weise verändert wird, die sich problemlos nachweisen lässt. Eine leichte Nachweisbarkeit ist beispielsweise durch eine mikroskopische Analyse gegeben, bei welcher Markierungen wie z.B. Fluorophoren eingesetzt werden können. Werden Fluorophoren Lichtstrahlen einer entsprechenden Wellenlänge ausgesetzt, so fluoreszieren diese und identifizieren somit die mit den Fluorophoren markierten Biopartikel. Nicht markierte Biopartikel fluoreszieren unter diesen Bedingungen nicht. Weitere leicht nachweisbare Markierungen, welche die physikalischen und/oder chemischen Eigenschaften, wie beispielsweise Dichte, Form oder Erscheinung, der markierten Biopartikel beeinflussen, sind kolloidale Verbindungen, wie beispielsweise kolloidales Gold, Markierungen mit elektronendichten Agenzien, wie z.B. Ferritin, oder anderen Eisen- oder Schwermetallverbindungen/-komplexen und dergleichen. Beispiele für andere anwendbare Markierungen sind die Radiomarkierung mit einem radioaktiven Isotop, mit welchem Zelloberflächenproteine, Lipide oder Kohlenhydrate oder dergleichen interne Spezies markiert werden, und die Modifizierung von DNA oder RNA, um die chemischen und/oder physikalischen Eigenschaften des Biopartikels zu verändern. Letztere kann den Einbau eines Gens beinhalten, welches Lumineszenz (Catrin et al., 1999), Fluoreszenz (Nobuhide Doi & Hiroshi Yanagawa, 1999) oder andere etablierte Genexpressionssysteme wie Antibiotikaresistenz, Toleranz gegenüber chemischen Stoffen, Antigenexpression, Enzymexpression oder eine Veränderung der metabolischen Aktivität hervorruft.
Mit nachweisbaren Markierungen können Zelloberflächenproteine, Lipide, Glycolipide und/oder Kohlenhydrate oder dergleichen interne Spezies im Inneren des Biopartikels markiert werden. Dort wo die Markierungen dauerhaft an die Zelloberflächen- oder intrazellulären Proteine, Lipide und/oder Kohlenhydrate binden, führt dies zu verschiedenen Vorteilen. Beispielsweise ist es nicht erforderlich, solche Zellen zu permeabilisieren oder in irgendeiner Weise physikalisch zu verändern, damit die Markierung erfolgen kann; die Markierung ist permanent und eine Beschädigung oder Störung der Zellen führt nicht zu einem Verlust des von der nachweisbaren Markierung herstammenden Signals.
DNA oder RNA im Inneren eines Biopartikels können dauerhaft oder nicht dauerhaft markiert werden, z.B. unter Anwendung von Nukleinsäure-reaktiven Fluorochromen, die eine dauerhafte Bindung mit der DNA oder RNA eingehen, oder von DNA/RNA-interkalierenden Fluorochromen, die keine dauerhafte Bindung mit der DNA oder RNA eingehen. Die DNA/RNA-Markierung ist möglicherweise nicht so vorteilhaft wie andere, oben erwähnte Formen der Markierung, und zwar aufgrund des DNA/RNA-Umsatzes/-Abbaus, durch welchen die Markierung verloren gehen oder ihr detektierbares Signal abgeschwächt werden kann.
Verfahren zur nachweisbaren Markierung von Biopartikeln wie beispielsweise Mikroorganismen, Hefezellen, Viren und dergleichen sind weit verbreitet, siehe beispielsweise Gröndahl et al., 1997 und Chaka et al., 1995. Fluoreszierend gefärbte Hefen und Bakterien sind Handelsprodukte, welche von einer Reihe von Firmen, u. a. Molecular Probes Inc, Eugene, USA, vertrieben werden. Beispielsweise können Zellen, die mit einem fluoreszierenden Markar markiert werden sol len, einfach in eine Lösung des Fluorophors gegeben werden, so dass Proteine oder andere Spezies auf der Zelloberfläche, oder an der Innenseite der Zelle, fluoreszierend markiert werden können. Fluorochrome sind im Allgemeinen mit einer oder mehreren funktionellen Gruppen ausgestattet, welche das Ankoppeln beispielsweise an funktionelle Gruppen eines Proteins, wie z.B. die ε-Aminogruppe von Lysin, erlauben.
Analog hierzu enthalten kolloidale Agenzien, elektronendichte Agenzien und dergleichen im Allgemeinen eine oder mehrere reaktive Gruppen oder sind derivatisiert, so dass sie eine oder mehrere reaktive Gruppen enthalten, um eine Markierung zu ermöglichen, zum Beispiel mit proteinösen funktionellen Gruppen wie der ε-Aminogruppe von Lysin oder der Carbonsäure-Gruppe von Glutaminsäure.
Die DNA oder RNA eines Mikroorganismus kann so verändert werden, dass sie eine DNA-Sequenz enthält, die eine physikalische oder chemische Veränderung des Mikroorganismus hervorruft, welche beispielsweise anhand einer Veränderung der Form, der Dichte, der morphologischen Erscheinung und dergleichen nachgewiesen werden kann, und zwar mittels üblicher molekularbiologischer Techniken, welche im Stand der Technik bekannt sind (siehe zum Beispiel Catrin et al., 1999; Nobuhide Doi & Hiroshi Yanagawa, 1999).
Werden in einem Routinetest unterschiedliche Arten von Biopartikeln analysiert, so kann die Kontrollprobe eine vorbestimmte Anzahl jeder dieser Arten von Biopartikeln enthalten, wobei jede Biopartikelart auf eine Weise markiert wird, die eine leichte Identifizierung jeder der markierten Arten von Biopartikeln ermöglicht. Ein Beispiel hierfür wäre die Markierung jeder Biopartikelart mit einer anderen Art von fluoreszierend wirkender Substanz. So ist z.B. eine große Vielfalt an Farbstoffen kommerziell erhältlich, die grün, rot, gelb, orange oder blau fluoreszieren, wie beispielsweise Fluorescein oder Rhodamine (Haugland 1998).
Biopartikel werden entweder vor oder nach der Markierung inaktiviert, um die Biopartikel zu stabilisieren, dies wird mit etablierten Verfahren wie Röntgeninaktivierung, schnelles Gefrieren, chemische Inaktivierung und dergleichen erreicht. Durch die Inaktivierung werden die chemischen oder physikalischen Eigenschaften des Biopartikels nicht verändert, so dass es sich im Test genauso verhält wie Biopartikel, die unter Testbedingungen untersucht wurden.
Die markierten Biopartikel werden innerhalb des Analyseprozesses nachgewiesen, somit stellt die Kontrolle eine interne Kontrolle dar. Die Art der routinemäßigen Analyse hängt von dem Analysesystem ab, das in dem spezifischen diagnostischen Test angewandt wird. Beispielsweise kann die Wasserqualität durch mikroskopische Analyse einer Wasserprobe bei großer Vergrößerung bestimmt werden, wobei die Identifizierung unterschiedlicher Arten von Biopartikeln, wie z.B. Mikroorganismen und Protozoon, möglich ist.
Andere diagnostische Tests können eine Durchflusscytometrie umfassen, wobei die Zellen leicht entsprechend ihren physikalischen Eigenschaften sortiert werden können (Shapiro, 1995). Die Untersuchung auf Biopartikel, beispielsweise Mikroorganismen, in Wasser oder anderen trinkbaren Flüssigkeiten, in der Lebensmittelanalyse und in der Analyse biologischer Flüssigkeiten wie Blut, Sputum, Zerebrospinalflüssigkeit, fäkalem Material und dergleichen kann durch mikroskopische Analyse, Durchflusscytometrie, Cytometrie, Laser-Scanning-Cytometrie, konfokale Mikroskopie oder andere weit verbreitete Analyseverfahren erfolgen, wie sie routinemäßig für Wasser- und Futteranalysen, medizinische diagnostische Tests und Analysen der Infektiosität von Zell kulturen, Gewebekulturen und Tieren eingesetzt werden. Des Weiteren können immunologische Nachweisverfahren wie der Enzyme-linked Immunosorbant Assay (ELISA), der kolorimetrische Nachweis und die Immunofluoreszenz, oder Nukleinsäure-Nachweisverfahren wie DNA- oder RNA-Sondenhybridisierung, Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) oder die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zur Anwendung kommen.
Welche Art von Nachweistest auch immer für den Nachweis von Biopartikeln angewandt wird, es wird stets eine Kontrollprobe einer vorbestimmten Menge an Biopartikeln zu der Test-Probe hinzugefügt, der Test wird durchgeführt und der Anteil der auf diese Weise in der Test-Probe gefundenen markierten Biopartikel bestimmt und mit der vorbestimmten Anzahl der hinzugefügten markierten Biopartikel verglichen, um ein Maß für die Genauigkeit des Tests zu erhalten. Dies kann als Auszählung bezeichnet werden – ein kennzeichnendes Merkmal dieser Erfindung – wobei die genaue Anzahl der markierten Biopartikel in einer Kontrollprobe bekannt/vorbestimmt ist und bei Hinzufügen der Kontrollprobe zu einer Test-Probe die genaue oder absolute Anzahl der Biopartikel bestimmt wird, und zwar als ein Maß für die Effizienz des Tests. Das Maß für die Test-Effizienz wird dann zur Berechnung der Anzahl der Test-Organismen, die in der Probe vorliegen, verwendet. Insbesondere wird durch die Anzahl der gefundenen markierten Biopartikel bei einem Vergleich mit der Menge der Biopartikel, die der Testprobe hinzugefügt wurden, eine prozentuale Wiederfindungsrate erhalten; werden z. B. 10 markierte Biopartikel einer Test-Probe hinzugefügt, die auf die gleichen Biopartikel untersucht werden soll, und werden bei der Analyse 8 markierte Biopartikel gefunden, so beträgt die Wiederfindungsrate 80%. Dies ist ein direktes Maß für die prozentuale Wiederauffindung/den prozentualen Nachweis nicht markierter Partikel in der Test-Probe.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur internen Qualitätskontrolle bei der Analyse von Biopartikeln in trinkbaren Flüssigkeiten bereitgestellt, welches die Bereitstellung einer Probe von Biopartikeln umfasst, die Behandlung der Probe zur nachweisbaren Markierung, Herstellen einer Probe für die interne Kontrolle, welche eine definierte Menge an markierten Biopartikeln in einem definierten Volumen enthält, Hinzufügen der Probe für die interne Kontrolle zu einer Test-Probe und Analysieren der Probe sowie Bestimmen des Anteils der in der Probe enthaltenen markierten Biopartikel, wobei der Vergleich der Anzahl der nachgewiesenen markierten Test-Biopartikel mit der bekannten Anzahl markierter Biopartikel, die der Probe hinzugefügt wurden, ein Maß für die Genauigkeit des Tests liefert.
Vorzugsweise handelt es sich bei der trinkbaren Flüssigkeit um Wasser; Beispiele für Biopartikel, die nachgewiesen werden können, sind Cryptosporidium und Giardia.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Standard für die interne Qualitätskontrolle bereitgestellt, welcher eine vorbestimmte Menge an Biopartikeln enthält, wobei diese Biopartikel von der gleichen Art sind, wie diejenigen, die einer Routineanalyse unterzogen werden, und wobei die vorbestimmte Menge an Biopartikeln mit der nachweisbaren Markierung markiert und in einem Träger mit definiertem Volumen bereitgestellt wird.
Die Bereitstellung von wie oben beschrieben markierten Biopartikeln in einer vorbestimmten Anzahl und in einem Träger, dessen Volumen vorbestimmt ist, kann beispielsweise mittels Durchflusscytometrie erfolgen, wobei die Zellen auf Basis ihrer physikalischen Eigenschaften (Shapiro, 1995; Vesey et al., 1994) getrennt werden, oder auch durch andere standardmäßig auf diesem Gebiet angewandte Verfahren.
Die in definierter Menge und in einem definierten Volumen vorliegenden markierten Biopartikel können in einem Behälter bereitgestellt werden, der eine leichte Zugabe der markierten Biopartikel zu der zu testenden Probe erlaubt.
Die vorliegende Erfindung hat breite Anwendungsmöglichkeiten bei der Untersuchung von Proben auf das Vorliegen von Biopartikeln wie beispielsweise Mikroorganismen. Eines der Gebiete, die hier von Bedeutung sind, ist die Qualitätskontrolle in Bezug auf die Untersuchung von Wasser. Trinkwasser wird im Allgemeinen auf das Vorliegen von Mikroorganismen, insbesondere von Cryptosporidium und Giardia, hin untersucht. Der Nachweis beruht hierbei auf Immunofluoreszenzverfahren, wobei Zysten und Oozysten mit einem grünen fluoreszierenden Farbstoff gefärbt werden. Die gefärbte Probe wird mittels Epifluoreszenzmikroskopie untersucht und die Anzahl der grün fluoreszierenden Zysten und Oozysten wird festgehalten. Wie oben erwähnt, ist es wichtig, dass stringente Qualitätskontrollverfahren zur Überwachung der Leistungsfähigkeit der Methodik durchgeführt werden. Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Überwachung der Analysenqualität bei jeder analysierten Probe. Wasserproben können beispielsweise mit einer bekannten Anzahl von mit einem blau fluoreszierenden Farbstoff markierten Zysten und Oozysten versetzt werden. Wird die Probe auf grün fluoreszierende Zysten und Oozysten untersucht, so erfolgt eine weitere Untersuchung, um zu bestimmen, ob die Zysten oder Oozysten einen internen Standard darstellen. Die Untersuchung der Zysten und Oozysten kann einfach darin bestehen, festzustellen, ob die Zysten oder Oozysten blau als auch grün fluoreszieren. Detektierte Zysten oder Oozysten, die grün aber nicht blau fluoreszieren, stellen keinen internen Standard dar. Bei dieser Verfahrensweise können verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe eingesetzt werden, mit denen die markierten Mikroorganismen unterschieden werden. Natürlich können auch andere Markierungstechniken, wie oben beschrieben, zur Anwendung kommen.
Auf dem Gebiet der Wasserqualitätskontrolle ist es zweckmäßig, vor der Konjugation mit einem Fluoreszenzfarbstoff oder einem anderen Markierungsstoff eine Inaktivierung der Zysten und Oozysten mit Gammastrahlen durchzuführen. Die markierten Organismen werden im Allgemeinen wie oben besprochen inaktiviert. In der Regel wird das Verfahren der Durchflusscytometrie angewandt, um eine genaue, bekannte Anzahl markierter Zysten und Oozysten in ein Proberöhrchen zu geben. Die Proberöhrchen können verschlossen und beispielsweise mit Gammastrahlen bestrahlt werden, um die Probe zu sterilisieren und die Haltbarkeit zu verbessern. Die Proben können bei niedrigen Temperaturen, beispielsweise 4°C, gelagert werden, bis sie in einem Standardtest zur Untersuchung der Wasserqualität eingesetzt werden.
Die hier beschriebene Erfindung ermöglicht ein genaues Auszählen der Biopartikel der internen Kontrolle, beispielsweise von Kontrollzellen. Dieses Auszählen, welches sich klar vom Stand der Technik unterscheidet, ist von essentieller Bedeutung, da die Bestimmung der präzisen oder absoluten Anzahl der Testorganismen einer Probe von entscheidender Wichtigkeit ist, um eine Bewertung der Testgenauigkeit zu ermöglichen.
Wie oben erwähnt, hat die vorliegende Erfindung ein breites Anwendungsgebiet in dem Bereich des Nachweises von Mikroorganismen oder anderer Biopartikel, beispielsweise des Nachweises von Bakterien, Protozoen, Hefen, Pilzen oder Viren in Wasser oder anderen trinkbaren Flüssigkeiten, Blut, Urin, Kot, Nahrungsmitteln etc.
Die Erfindung wird im Folgenden unter Bezug auf die nachfolgend aufgeführten, nicht beschränkenden Beispiele beschrieben.
Beispiel 1
Cryptosporidium und Giardia
Cryptosporidium-parvum-Oozysten werden aus den gesammelten Faezes von auf natürlichem Wege infizierten neugeborenen Kälbern in Sydney herausgereinigt. Die Kotproben werden zentrifugiert (2000 g, 10 min) und zweimal in Wasser resuspendiert und anschließend in 5 Volumina 1%iger (Gew./Gew.) NaHCO₃-Lösung resuspendiert. Fettige Substanzen werden dann zweimal mit 1 Volumen Ether extrahiert, anschließend wird zentrifugiert (2000 g, 10 min). Die Pellets werden in Wasser resuspendiert und durch eine Schicht vorbenetzter nicht adsorbierender Baumwolle gefiltert. Das Eluat wird sodann auf 10 Volumina 55%iger (Gew./Vol.) Sucroselösung aufgegeben und zentrifugiert (2000 g, 20 min). Die Oozysten werden aus der Sucrose-Grenzfläche gesammelt und der Sucrose-Flotationsschritt so oft wiederholt, bis kein sichtbares kontaminierendes Material mehr festgestellt werden konnte. Gereinigte Oozysten werden 30 Minuten lang mit eiskaltem 70%igen (Vol./Vol.) Ethanol oberflächensterilisiert, einmal in phosphatgepufferter Salzlösung (150 mmol l^–1 NaCl, 15 mmol l^–1 KH₂PO₄, 20 mmol l^–1 Na₂HPO₄, 27 mmol l^–1 KCl, pH 7,4) (PBS) gewaschen, und bis auf eine Konzentration von ungefähr 1 × 10⁷ Oozysten ml^–1 verdünnt und bei 4°C gelagert.
Giardia-lamblia-Zysten wurden von Waterborne Inc (New Orleans, USA) erstanden.
Konjugation von Fluorochromen an Zysten und Oozysten
Einige Proben von Zysten und Oozysten werden eingefroren (–80°C), um die Zellwände der Zysten und Oozysten vor der Konjugation zu zerstören.
Aliquote (200 μl) der Zysten und Oozysten (die etwa 1 × 10⁷ Zysten und Oozysten enthalten) werden bei 12000 g 2 Minuten lang zentrifugiert und der Überstand entfernt und verworfen. Die Zysten und Oozysten werden in 0,1 M Natriumbicarbonat pH 8,3 resuspendiert. Dieser Waschvorgang wurde zweimal wiederholt.
Das blaue Fluorochrom Alexa-350-Carbonsäure-Succinimidylester (Alexa 350 – Molecular Probes, Eugene, USA) wird in Dimethylsulfoxid (DMNSO) in einer Konzentration von 1 mg pro ml gelöst.
Aliquote (10 μl) der Fluorochrom/DMSO-Mischung werden zu 200 μl der Zysten-und-Oozysten-Suspensionen hinzugegeben. Die Proben werden gründlich gemischt und bei Raumtemperatur 30 Minuten lang inkubiert. Die Proben werden dann bei 12000 g 2 Minuten lang zentrifugiert und der Überstand entfernt und verworfen. Die Zysten und Oozysten werden in 0,1 M Natriumbicarbonat resuspendiert. Dieser Waschvorgang wird zweimal wiederholt.
Aliquotierung
Die markierten Zysten und Oozysten werden mittels Durchflusscytometrie präzise in 6-ml-Kunststoffprobenröhrchen gegeben. Für die Analyse der markierten Zysten und Oozysten wird ein Becton-Dickinson-FACScalibur-Durchflusscytometer eingesetzt. Die Fluoreszenz- oder Lichtstreuungseigenschaften der Zysten oder Oozysten werden bestimmt und diese Ei genschaften dazu eingesetzt, 100 markierte Zysten und Oozysten aus einer Probe markierter Zysten und Oozysten zu sortieren. Die sortierten Zysten und Oozysten werden in ein Probenröhren gegeben.
Es ist wichtig, dass alle Zysten und Oozysten, die sortiert werden, auch markiert sind. Wenn eine unmarkierte Zyste oder Oozyste in die Probe gelangt, so führt das zu falschen positiven Ergebnissen.
Eine Qualitätskontrolle wird durchgeführt, um sicherzustellen, dass eine genaue Anzahl von Zysten und Oozysten in die Probenröhrchen gegeben wird. Zu diesem Zweck wird ein Teil der Probenröhrchen unter Anwendung von Mikroskopie oder Durchflusscytometrie analysiert, um die Zysten und Oozysten auszuzählen. Die Probenröhrchen werden gewogen und Röhrchen mit einem außerhalb liegenden Gewicht werden verworfen.
Beimpfen von Wasserproben mit Kontrollmaterial
Wasserproben werden entweder in Behältern gesammelt und zum Konzentrieren an ein Labor verschickt oder sie werden am Ort der Probenentnahme konzentriert. Proben, die zur Konzentration an Labore verschickt werden, haben normalerweise ein Volumen im Bereich von 10 bis 100 l. Die Probe wird mit der Kontrollprobe beimpft, und zwar unter Anwendung des folgenden Beimpfungsverfahrens:

1) In das Röhrchen mit Kontrollmaterial werden 2 ml 0,05%iges (Vol./Vol.) Tween 80 gegeben.
2) Der Deckel wird wieder aufgesetzt und es wird kräftig geschüttelt.
3) Der Deckel wird entfernt und das Kontrollmaterial in die Probe gegossen.
4) In das Kontrollmaterial-Röhrchen werden 3 ml 0,05%iges (Vol/Vol) Tween 80 gegeben.
5) Der Deckel wird wieder aufgesetzt und es wird kräftig geschüttelt.
6) Der Deckel wird entfernt und das Kontrollmaterial in die Probe gegossen.

Wiederholung der Schritte 4, 5 und 6.
Die Probe wird mittels herkömmlicher Verfahren wie Membranfiltration, Patronenfiltration, Patronenfiltration mit Faltenmembran, Flockungs- oder Wirbelflussfiltration (Anon, 1999; Vesey et al., 1994) konzentriert.
Erfolgt das Konzentrieren am Ort der Probenentnahme, so wird ein tragbares Konzentrationsverfahren, wie z.B. Patronenfiltration, angewendet. Die Filterpatrone sollte vor dem Konzentrieren der Probe mit dem Kontrollmaterial beimpft werden. Für das Beimpfen der Filterpatrone ist das oben beschriebene Beimpfungsverfahren geeignet.
Filter können von den Herstellern von Patronenfiltern während des Herstellungsverfahrens auch selbst beimpft werden.
Filter, die für die Konzentration von Wasserproben verwendet wurden, werden zum Analyselabor zurückgeschickt und das in dem Filter gesammelte partikuläre Material wird eluiert und weiter konzentriert.
Analyse
Die konzentrierten Proben werden einer Behandlung unterzogen, um kontaminierende Partikel wie Algen und mineralische Partikel zu entfernen. Verfahren wie Flotation, immunomagnetische Trennung (IMS) und Durchflusscytometrie werden routinemäßig für die Reinigung von Zysten und Oozysten aus Wasserkonzentraten eingesetzt (Vesey et al., 1994; Anon, 1999).
Die gereinigten Proben werden dann auf einen Objektträger aus Glas oder auf einen kleinen (13 mm) Membranfilter gegeben. Der Objektträger bzw. die Membran wird eingefärbt mit monoklonalen Antikörpern, die mit Fluoreszeinisothiocyanat (FITC) gefärbt wurden, dann inkubiert und gewaschen und mittels Epifluoreszenzmikroskopie untersucht (Vesey et al., 1993; Anon, 1999), beispielsweise unter Anwendung eines Nikon-Optiphot2-Epifluoreszenzmikroskops, das für die Untersuchung der Proben mit ×12-Okularen und einem ×20-Objektiv (F1uor20) ausgerüstet wurde. Ein DM510-Filterblock wird für die Untersuchung der mit dem Fluorochrom Fluoreszeinisothiocyanat FITC markierten Proben verwendet. Die Membran oder der Objektträger wird sorgfältig gescannt und die Zysten und Oozysten nachgewiesen.
Wird eine grün fluoreszierende Zyste oder Oozyste gefunden, so wird diese unter Anwendung unterschiedlicher optischer Filter untersucht, um zu bestimmen, ob sie blau fluoresziert; ist dies der Fall, so wird sie als eine Kontrollzyste oder -oozyste identifiziert. Für den Nachweis der blauen Fluoreszenz von mit Alexa 350 markierten Kontrollzysten und -oozysten wird ein DM450-Filterblock verwendet.
Sobald die gesamte Membran gescannt wurde, wird die Gesamtzahl der Zysten und Oozysten, die in der Probe entdeckt wurden, mit der Anzahl der gefundenen Zysten und Oozysten, die blau fluoreszieren, verglichen. Diese Zahlen werden dann zur Berechnung der Wiederfindungsrate verwendet und der tatsächlichen Anzahl der Zysten und Oozysten, die in der Wasserprobe vorliegen. In einem Beispiel wird die Probe mit 100 blauen Kontrollzysten und 100 blauen Kontroll-Oozysten beimpft. Die Analyse der Proben ergab 50 detektierte blaue Zysten und 30 nichtblaue Zysten sowie 50 blaue Oozysten und 10 nichtblaue Oozysten. Die Wiederfindungsrate der Analyse beträgt 50% sowohl für Zysten als auch für Oo zysten (beimpft mit 100, nur 50 gefunden). Die Probe enthielt somit 60 Zysten und 20 Oozysten.
In der vorliegenden Beschreibung sowie in den nachfolgenden Ansprüchen wird das Wort "umfassen", oder Varianten wie "umfasst" oder "umfassend", es sei denn, der Kontext verlangt etwas anderes, so verstanden, dass es eine angegebene Einheit oder einen angegebenen Schritt oder eine Gruppe von Einheiten oder Schritten mit einschließt jedoch eine andere Einheit oder einen anderen Schritt oder eine andere Gruppe von Einheiten oder Schritten nicht ausschließt.
Literaturverzeichnis

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Claims

Verfahren zur Kalibrierung und Bestimmung der Genauigkeit eines mikrobiellen Tests, umfassend: (a) Hinzufügen eines Standards für die interne Qualitätskontrolle zu einer Probe, die in Verdacht steht, eine Mikroorganismenart zu enthalten, wobei der Standard eine definierte Menge einer modifizierten Form der Mikroorganismenart umfasst und wobei der modifizierte Mikroorganismus eine nachweisbare Markierung aufweist, so dass der modifizierte Mikroorganismus von dem entsprechenden nicht modifizierten Mikroorganismus in der zu untersuchenden Probe unterschieden werden kann, (b) Durchführen des Tests zum Nachweis und zur Bestimmung der Anzahl der nicht modifizierten Mikroorganismen und der Anzahl der modifizierten Mikroorganismen, die in der Probe vorliegen, und (c) Vergleichen der Anzahl der durch den Test nachgewiesenen modifizierten Mikroorganismen mit der definierten Menge modifizierter Mikroorganismen, die zu der Probe zugegeben wurden, um den Test zu kalibrieren oder dessen Genauigkeit zu bestimmen, wobei das Verhältnis der Anzahl der nachgewiesenen modifizierten Mikroorganismen zu der definierten Menge modifizierter Mikroorganismen, die der Probe hinzugefügt wurden, die Genauigkeit des Tests auf den Mikroorganismus anzeigt.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Standard für die interne Qualitätskontrolle wenigstens zwei Arten modifizierter Mikroorganismen umfasst, so dass der Test für jede der Mikroorganismenarten kalibriert werden kann.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem der Mikroorganismus aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Bakterien, Protozoen, Hefen, Pilzen und Viren besteht.
Verfahren nach Anspruch 3, bei dem der Mikroorganismus aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Cryptosporidium, Giardia, Cyclospora, Toxoplasma, Eimeria, Legionella, Salmonella, Leptospirosis, Escherichia, Saccharomyces, Clostridium, Vibrio, Pseudomonas, humanem Immundefizienzvirus, Norwalk-Virus und Herpes-simplex-Virus besteht.
Verfahren nach Anspruch 4, bei dem der Mikroorganismus Cryptosporidium ist.
Verfahren nach Anspruch 4, bei dem der Mikroorganismus Giardia ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem der modifizierte Mikroorganismus inaktiviert ist, so dass er nicht lebensfähig ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, bei dem der modifizierte Mikroorganismus eine nachweisbare Markierung umfasst, die an Oberflächenmolekülen des Mikroorganismus angefügt ist oder sich im Inneren des Mikroorganismus befindet.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der modifizierte Mikroorganismus ein durch Modifikation der DNA oder RNA nachweisbar markierter Mikroorganismus ist, wobei die chemischen und/oder physikalischen Eigenschaften des Mikroorganismus durch diese Modifikation verändert werden.
Verfahren nach Anspruch 8, bei dem der modifizierte Mikroorganismus eine nachweisbare Markierung umfasst, welche an dessen Oberfläche angefügt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, bei dem durch die nachweisbare Markierung eine chemische Eigenschaft des Mikroorganismus, eine physikalische Eigenschaft des Mikroorganismus, oder sowohl eine chemische Eigenschaft als auch eine physikalische Eigenschaft des Mikroorganismus in einer Weise verändert wird, die es ermöglicht, in der zu untersuchenden Probe den modifizierten Mikroorganismus von einem entsprechenden nicht modifizierten Mikroorganismus zu unterscheiden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, bei dem die nachweisbare Markierung eine Fluoreszenzmarkierung ist.
Verfahren nach Anspruch 12, bei dem die Fluoreszenzmarkierung rotes, blaues oder grünes Fluorochrom ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, bei dem die vorbestimmte Menge des modifizierten Mikroorganismus in einem Verdünnungsmittel vorliegt, dessen Volumen definiert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, bei welchem der Test dem Nachweis von Mikroorganismen in Proben dient, welche aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Wasser oder einer anderen trinkbaren Flüssigkeit, Nahrungsmitteln, Blut, Sputum, Mukus, Urin und Zerebrospinalflüssigkeit besteht.
Verfahren nach Anspruch 15, bei dem die trinkbare Flüssigkeit Fruchtsaft, Wein, Bier, Milch oder Obstmost/-wein und das Nahrungsmittel Geflügel, Rindfleisch, Ei, Käse oder haltbar gemachtes Fleisch ist.
Verfahren nach Anspruch 15, bei dem der Test zum Nachweis von Mikroorganismen in Wasser durch Mikroskopie erfolgt.