DE2521460C2

DE2521460C2 - Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen Brucella canis und Antigenreagens

Info

Publication number: DE2521460C2
Application number: DE2521460A
Authority: DE
Inventors: Carmichael Ithaca N.Y. Leland; George Lisle
Original assignee: Cornell Research Foundation Inc
Current assignee: Cornell Research Foundation Inc
Priority date: 1974-05-14
Filing date: 1975-05-14
Publication date: 1984-02-02
Also published as: FR2280085B1; JPS519717A; GB1505262A; AR209302A1; FR2280085A1; DE2521460A1; US3962413A; JPS5822980B2; CA1054516A

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1 und ein Antigenreagens zur Durchführung des Verfahrens. Es ist bekannt, daß Bakterien der Gattung Brucella canis für Hunde pathogen sind Besonders gefährdet sind Beagle-Zuchten.

B.canis infiziert primär Hunde, trotzdem sind zumindest einige Beweise vorhanden, daß auch der Mensch Infiziert werden kann.

Charakteristische klinische und pathologisch-anatomische Symptome dieser caninen Brucellose sind eine generalisierte Lymphadenitis und Splenltls, früher Fruchttod oder Aborte, wobei Aborte vor allem um den 50. Tag der Trächtigkeit auftreten, sowie länger persistlerender Ausfluß im Anschluß an die Aborte. Infizierte Rüden zeigen Epidldymltis, Dermatitis des Scrotums und Hodenatrophie, wobei diese Veränderungen oft einseitig auftreten. Manche Rüden werden unfruchtbar. Sehr viele infizierte Hunde sind allerdings frei von klinischen Symptomen, bei Ihnen können aber Fruchtbarkeitsstörungen und Aktivitätsverlust beobachtet werden. In der Regel entwickelt sich eine Bakteriämie sowie ein Befall von verschiedenen Organen, die über ein Jahr perslstleren können. Infizierte Hunde zeigen gewöhnlich keine erhöhten Temperaturen. Gegenwärtig werden Infektionen nur durch den positiven Ausfall des Aggluilnationstestes sowie, wenn möglich, durch die Isolierung von B.canis diagnostiziert.

B.canls, die canine Brucellose und der Agglutinationstest sind unter anderen beschrieben worden von Carmlchael, Proc. U S. Livestock San. A., Bd. 71 (1969), Seiten bis 527, Charmlchael et al,, J.A.V.M.A., Bd. 152

•>i (1968), Selten 605 bis 616 und J.A.V.M.A., Bd. 156 (1970), Seiten 1726 bis 1734, Hall, Journal of Infectious Diseases, Bd. 124 (1971), Selten 615 bis 618 und Dlaz et al., Journal of Bacteriology, Bd. 95 (1968), Seiten 618 bis 624. Die Bakterienagglutinationsreaktion nach Gruber-Wldal zur Diagnosestellung von unter anderem Brucellosen ist bekannt; vgl. N. Henning, Klinische Laboratoriumsdiagnostik, 3. Auflage, 1966, 296, 297.

Der Agglutinationstest In Röhrchen, der in der serologischen Routinediagnostik von B. canls verwendet wird, hat durchaus seine Nachtelle. Obwohl bewiesen werden konnte, daß die Ergebnisse dieses Testes mit einer vorhandenen Bakteriämie korrelieren, schränken technische Schwierigkelten seine weite Verbreitung in der klinischen Diagnostik ein. Die Herstellung eines geeigneten

^w> homotypischen Antigens erfordert besondere Sorgfalt wegen der Neigung dieser Antigene bei längerer Lagerung dickflüssig zu werden. Es liegen Berichte vor, daß die mucolde Natur der Organismenpräparatlonen der Grund dafür sein kann, daß keine komplette Agglutlna-

^h) tion mit einigen Seren infizierter Hunde nachgewiesen werden kann. Um die Effektivität des Agglutinationstestes zu erhöhen, wurde empfohlen, die Testgemische Stunden bei 52° C zu Inkubieren. Diese Empfehlung

wurde kritisiert. Eine allgemein anerkannte Technik des Agglutinationstestes ist bis jetzt noch nicht vorhanden. Von Nachteil ist außerdem, daß agglutinierende Antikörper gegen B.canis auch in normalen Hunden gefunden werden können. Agglutinine, die mit B.canis reagieren, konnten zum Beispiel in Seren von Hunden nachgewiesen werden, die mit Bordeiella bronchiseptica infiziert worden waren. Es gehört einige Erfahrung dazu, diese Reaktionen zu differenzieren.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen Brucella canis zu schaffen, das einfach durchzuführen und leicht zu interpretieren ist und eine sichere Diagnose einer bestehenden Infektion gestattet, sowie ein Reagens zur Durchführung des Verfahrens bereitzustellen.

Diese Aufgabe wird durch die in den Patentansprüchen 1 und 9 gekennzeichneten Gegenstände gel&st. Die Unteransprüche 2 bis 8 bzw. 10 bis 13 betreffen bevorzugte Ausführungsformen dieser Gegenstände. Die Erfindung beruht auf dem überraschenden Befund, daß 2i> . Brucella ovls Antigen zum Nachweis von Antikörpern gegen Brucella canis durch eine Agglutinationsreaktion Im Blutserum eines für eine Infektion mit diesem Bakterlum empfänglichen Individuums mit Bakleriämie geeignet Ist.

Eine abgetötete und vorzugsweise gefärbte Präparation von B.-ovis-Keimen kann vorzugsweise in einem Plattenlest verwendet werden, um in einem schnellen und genauen Agglutinationstest Antikörper gegenüber B.canis festzustellen. Der Plattentest besteht darin, daß jo auf einem durchsichtigen oder einem undurchsichtigen, kontrastfarbigen Objektträger eine Mischung des Antigens und der B.-ovls-Keime sowie des verdächtigen Patientenserums filmartig aufgetragen werden. Die Diagnose wird an Hand der entstehenden Agglutinationen j"> gestellt. Werden undurchsichtige Objektträger verwendet, sollten sie In der Farbe so gewählt werden, daß Agglutinationen ohne Schwierigkeiten beurteilt werden können.

Der Plattentest kann verwendet werden zur Diagnose *< > von B.-canls-Infektionen bei allen B.canis empfänglichen, bakterlärnlschen Individuen, zum Beispiel Angehörigen der Familie der Caniden, vor allem Hunden, oder beim Menschen.

Eine Plattentest-Methode zum Nachweis von Brucel- ■»> lose wurde bereits von Alton und Jones In »Laboratory Techniques in Brucellosis«, Weltgesundheitsorganisation, Genf, Schweiz, 1967, beschrieben. Diese Methode besteht darin, daß eine bestimmte Menge des Antigens auf eine durchsichtige Testplatte aufgetragen wird. Zu ">" diesem Antigentropfen gibt man eine entsprechende Menge des verdächtigen Patientenserums. Nach einer Inkubationszeit, die ausreicht zur Ausbildung einer Agglutination, wird der Grad der Agglutination beurteilt, indem man die Platte bei entsprechender Beleuchtung >' gegen einen gut kontrastierenden Hintergrund betrachtet. Das erfindungsgemäße Verfahren kann in analoger Weise durchgeführt werden.

Ein anderer Plattentest, der In Form einer Karte durchgeführt und aufbewahrt werden kann, besteht aus den ^b0 gleichen allgemeinen Techniken mit der Ausnahme, daß er gegen einen undurchsichtigen Hintergrund abgelesen wird.

Antigene, die erfindungsgemäß verwendet werden, sind abgetötete, hitzeinaktivierte Suspensionen von H.- ^h5 ovis-Keimen. zum Beispiel eine vollständige B.-ovls-Kullur, die durch genögend langes Erhitzen abgetötet wurde.

Diese Zellsuspensionen werden vorzugsweise noch konzentriert, zum Beispiel durch Sedimentation. Hierfür werden die Suspensionen zentrifugiert, der Überstand wird verworfen, und die sedlmentierten Zellen werden in der gewünschten Konzentration in physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen. Eine gebräuchliche Konzentration Ist 125 g Zellen pro Liter.

Für die Verwendung im Plattentest zur Diagnose von B.-canis-Infektionen wird das B.-ovis-Antigen vorzugsweise gefärbt. Grundsätzlich kann für die Färbung jeder Farbstoff verwendet werden, der die Sichtbarkeit der Agglutination verbessert, ohne gleichzeitig die Agglutinationsreaktion zu inhibieren oder eine unspezifische Agglutination zu verursachen. Die Verwendungsfähigkeit eines spezifischen Farbstoffs für den Platten-Agglutinationstest kann leicht dadurch getestet werden, daß ein bekanntes Antigen gegen bekannt positive bzw. negative Seren angesetzt wirü.

Eine geeignete Färbeflüssigkeit besteht z. B. aus 2 Teilen Brilliantgrün und 1 Teil Kristallviolett. Diese zwei Farbstoffe werden gründlich gemischt, zu 300 Teilen Wasser gegeben und zum Zwecke der Alterung 6 Monate im Kühlschrank gelagert. Eine andere geeignete Färbeflüssigkeit ist Bengalrot. Dieser Farbstoff ist vor allem dann sehr wertvoll, wenn mit undurchsichtigem Hintergrund gearbeitet wird, da diese Farbe besonders intensiv ist. Die für eine Färbung benötigte Menge von Farbstoff hängt von der Affinität des Farbstoffes zum Substrat ab.

Die totale Zellkonzentration der Zellsuspension wird vorzugsweise durch die Messung des Volumens der sedimentlerten Keime nach der Methode von Alton und Jones eingestellt. Die Endkonzentration der Zellsuspension soll möglichst einem Keimgehalt von etwa 4 bis 7% entsprechen. Die bevorzugte Konzentration ist etwa 6%.

Die Zellsuspension wird auf einen pH-Wert von 6 bis 8 eingestellt. Um den pH-Wert z. B. auf etwa 7,4 einzustellen, hat sich ein 0,15 molarer Phosphatpuffer bewährt. Wenn ein Farbstoff zusätzlich verwendet wird, richtet sich die Wahl des pH-Wertes der Suspension auch nach der Art des Farbstoffes. Hierbei ist vor allem wieder wichtig, daß ein optimaler Färbeeffekt ohne Störung der spezifischen Agglutination erreicht wird. Es wurde gefunden, daß bei der Verwendung von Bengalrot die unspezifischen Agglutinationen durch den Einsatz von mindestens 0,4 molarem, vorzugsweise von 0,6 bis 1 molarem Trls-Puffer (Tris-hydroxy-methyl-aminomethan-Maleinsäure-Puffer) bei einem pH-Wert von etwa 6,9 bis 7,1, vorzugsweise von 7,0, auf ein Minimum eingeschränkt werden. Außerdem konnte nachgewiesen werden, daß das Auftreten von unspezifischen Agglutinationen vermindert werden kann, wenn höchstens 0,8 g Bengalrot auf 100 ml einer 6%lgen Brucella-ovls-Suspenslon genommen werden. Im allgemeinen werden etwa 0,03 bis 0,6 g Bengalrot auf 100 ml einer 6%lgen Keimsuspension von B.ovls verwendet.

Wie bereits beschrieben, wird ein Tropfen oder ein Film von einer Mischung aus der Antigen-Präparation, z. B. der Zellsuspension, und dem Patientenserum auf der Platte aufgetragen. In der Regel wird dabei das zu untersuchende Serum als erstes auf die Platte getropft und anschließend das Antigen zugefügt. Es hat sich herausgestellt, daß durch diese Technik das Auftreten von unspezifischen Agglutinationen weltgehend vermieden werden kann. Derartige unspezifische Reaktionen sollen durch die zusätzliche Zugabe von Serum welter eingeschränkt werden. In einem typischen Plattentesl werden gleichzeitig zwei Tests mit zwei verschiedenen Konzentrationen parallel angesetzt. Tropfen, die 0.04 ml bzw. 0.02 ml von Patientenserum enthalten, werden auf eine

Unterlage, ζ. B. eine Glasplatte, getropft und jedem Tropfen je 0,05 ml Brucella-ovis-Antigen, das 6% Keime enthält, zugefügt. Anschließend wird die entstehende Agglutination beobachtet.

Es wurde festgestellt, daß die aussagefähigrJen Ergebnisse mit Seren zu erwarten sind, die mindestens drei, möglichst vier Wochen nach Beginn der Bakteriämie gewonnen worden sind. Vorher muß zumindest bei einigen Individuen mit negativen oder fraglichen Befunden gerechnet werden.

Die Zeit, die nötig ist, um eine Agglutination im Plattentest zu beobachten, ist nicht übermäßig kritisch. In der Regel wartet man eine Inkubationszeit von 5 Minuten ab. Gewöhnlich tritt aber bereits nach 2 Minuten eine totale Agglutination ein. Innerhalb von 5 Minuten können sicher alle möglichen Agglutinationsreaktionen erwartet und beobachtet werden.

In den nachfolgenden Beispielen beziehen sich alle Teile und Prozentangaben auf das Gewicht, sofern nichts anderes angegeben ist.

Beispiel 1

Dieses Beispiel erläutert den bekannten Agglutinationstest zum Nachweis von B.canis. lö

Das Antigen für die Verwendung im Agglutinationstest in Röhrchen wird hergestellt nach der von Carmichael beschriebenen Methode »Canine Brucellosis, Isolation, Diagnosis, Transmission«, Proceedings 71st Ann. Meeting, U.S. Livestock San. A., 1967 (1968), Seiten 517 bis 527. Es wird der Stamm RM 6-66 verwendet. Die Vermehrung der Keime erfolgte auf Schrägagar (Albimi Agar) 48 Stunden bei 37° C unter aeroben Bedingungen. Die Bakterien wurden durch Abschwemmen mit 5 ml phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung (0,15 M, pH 7,2, PBS) geerntet. Jeweils 2,5 ml der geernteten Keimsuspensionen wurden anschließend auf je IO Rouxschalen, die mit 100 ml Albiml-Agar beschichtet waren, verimpfl. Das Inoculum wurde mit sterilen Glasperlen über die Oberfläche des Agars verteilt. Die Fla- ίο sehen wurden anschließend aerob 48 Stunden bei 37° C bebrütet.

Nach dieser Inkubation wurde jede Rouxflasche mit 10 ml PBS versetzt. Die Keime wurden durch Rollen der Glasperlen über die Agaroberfläche abgeschwemmt. Die erhaltenen Suspensionen wurden durch 6fache Gazefilter (steril) filtriert. Jede Flasche wurde darauf noch einmal mit je 10 ml PBS abgewaschen. Die Ernte der Rouxflaschen wurde gepoolt und 20 Minuten bei 10 000 g zentrifugiert. Nach dem Zentrifugieren wurde der Überstand abgegossen und das Sediment zweimal mit PBS gewaschen. Das Sediment wurde danach in 50 ml PBS aufgenommen, und die Bakterien wurden durch lstündiges Erhitzen auf 5O⁰C abgetötet. Die hitzeinaktivierte Präparation wurde mit Natrium-2-(äthylmcrcurlthio)-benzoat bis zu einer Konzentralion von 0,1% versetzt und das Antigen bei 4⁰C als Vorratssuspension aufbewahrt.

Der Röhrchentest wurde nach der folgenden Technik durchgeführt:

Ein Teil der konzentrierten Vorratssuspension wurde mit PBS bis zu einer optischen Dichte von 0,125 bei einer •Wellenlänge von 420 nm eingestellt. Jeweils 2 ml der eingestellten Antlgenverdünnung wurde zu Serum in Mengen gegeben, die einer Endverdünnung von 1 : 25 bis 1 : 2000 entsprachen (0,04; 0,02; 0.01 ml usw.). Es wurde ^b5 Stunden bei 52° C Inkubiert, bevor die Endablesung vorgenommen wurde. Die Agglutlnatlonsreaklion^n wurden mit 0 bis +4 bewertet, wobei als 0 eine fehlende Agglutination, eine totale Verklump-^-ing mit +4 bezeichnet werden.
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 2

Dieses Beispiel erläutert einen Plattentest zum Nachweis von B.canis unter Verwendung von Brucella-ovis-Antigen. Die Herstellung des Antigens erfolgte nach einer modifizierten Methode, die von Alton et al. beschrieben wurde; vgl. Laboratory Techniques in Brucellosis, Weltgesundheitsorganisation, Genf, Schweiz, 1967.

Bruceila ovis (Stamm REO 1182, 6. Passage) wurde auf die gleiche Weise vermehrt wie B.canis in Beispiel 1, jedoch wurde die Züchtung in einer 1 Oxigen CO_;-Atmosphäre vorgenommen.

Nach der Ernte von B.ovis, die in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 für B.canis beschrieben worden ist, wurden die Keime in einer Konzentration von 125 g nasse Zeilen pro Liter in PBS suspendier!. Die Suspension wurde durch lstündiges Erhitzen auf 52⁰C abgetötet und durch Zugabe von 6 ml Färbeflüssigkeit pro Liter Suspension angefärbt. Die Färbeflüssigkeit (2 Monate alt) wurde hergestellt aus einer Mischung von 2 g Brilliantgrün und 1 g Kristallviolett. Das zermörserte Pulver wurde in 300 ml destilliertem Wasser gelöst und durch ein Whatman Nr. 1 Filterpapier gegeben. Die Färbeflüssigkeit wurde In der Dunkelheit bei 4' C gelagert.

Nach der Färbung wurde das Zellvolumen der B.-ovis-Präparation bestimmt. Hierfür wurden zwei Kapillarröhrchen (75x0,9- 1,1 mm) mit der Keimsuspension gefüllt. Die Röhrchen wurden mit Ton verschlossen und 5 Minuten in einer Hämatokrit-Zentrifuge zentrifugiert. Die Suspension wird nun auf einen Keimgehalt von 6% eingestellt und durch eine mit Glaswolle gefüllte Säule mit den Abmessungen 1 cm χ 1 cm filtriert. Nach dieser Reinigung wird Natrlum-2-(äthylmercurithio)-benzoat bis zu einer Konzentration von 0,01% zugesetzt.

Der Plattentest wurde auf Glasplatten angesetzt, wobei Serum In Mengen von 0,04, 0,02, 0,01 und 0,005 ml als erstes aufgetropft wurde. Mlkrotiter-Pipetten mit einer Tropfengröße von 0,05 ml wurden verwendet, um jeweils 0,05 ml des gefärbten Antigens zu den abgemessenen Serummengen zu geben. Die Tropfen werden anschließend mit hölzernen Stäbchen über eine Kreisfläche von etwa 4 cm Durchmesser verteilt. Die Platten wurden dann 5 Minuten vorsichtig geschwenkt. Die Reaktionen können am besten durch schräge Beleuchtung mit fluoreszierenden Licht abgelesen werden. Die Agglutinationen wurden wie In Beispiel 1 mit 0 bis +4 bewertet.

Beispiel 3

Beagle-Hunde wurden Im Veterinary Virus Research Institute der Cornell University in speziellen Isolierställen spezifisch pathogenfrei aufzgezogen. Den Hunden wurde zum Zeitpunkt ihrer Infektion mit B.canis Blut entnommen. Jedem Tier wurden 10 ml Blut entnommen. 5 ml wurden In Röhrchen abgefüllt, die 5 ml Albiml-Brucella-Nährlösung mit 1% Natrlmcltrat enthielten. Nach 4täglger Bebrütung bei 37° C wurde je eine Albimi-Agarplatte mit einer Öse aus dem Ausgangsröhrchen beimpft. Die Platten wurden weitere 3 Tage bebrütet, bevor eine endgültige Diagnose stattfand, ob Keimwachstum vorhanden war oder nicht. Das Serum von den restlichen 5 ml Blut wurde bei - 20⁰C aufbewahrt, bis die Agglutinationstests durchgeführt werden konnten.

Die Hunde wurden anschließend durch orale Inokulation mit ungefähr 10" kolonie-blldenden Einheilen von B.canls (O.D. 0,125 bei 420 nni) infiziert. Blutkulturen und Serumproben wurden in wöchentlichen Abständen gesammelt. Die Agglutlnatlonstlter in Röhrchen wurden , innerhalb einer Woche nach der Blutentnahme bestimmt. Die Platlentests wurden dagegen erst dann durchgeführt, als alle Serumproben zur Verfügung standen. Zu der Zelt, wenn die Seren gemüß Beispiel 2 getestet wurden, wurden die Proben in zufälliger Anord m nung angesetzt und mit Codenummern versehen. Insgesamt wurden 140 Proben untersucht, einschließlich der 15 Proben vor dem Beginn der Bakterlämie, 29 Proben 1 bis 3 Wochen nach Beginn der Bakterlämie und 96 Proben, die 3 bis 25 Wochen nach Beginn der Bakteriämie ι-, gesammelt worden waren.

Röhrchen- und Plattentests wurden außerdem mit Hilfe von 74 Serumproben, die von Hunden einer gewerbsmäßigen Hundezucht stammte, und 73 Proben, die von Tierärzten zum Zwecke der serologischen B.-canis-Diagnose eingeschickt worden waren, verglichen.

Beispiel 4

Dieses Beispiel veranschaulicht die Spezifität und die Wirksamkeit des Plattenlesles. ?■-,

Wenn eine inaktivierte B.-ovis-Suspension mit einem Zellgehall von etwa 4% zu 0,04 ml Serum von Hunden, die mit B.canis infiziert waren, gegeben wurde, konnte eine granuläre Agglutination Innerhalb von 1 Minute beobachtet werden. Agglutinationen traten nicht auf, in wenn die Antlgenpräparation mit dem Serum von spezifisch pathogenfrei aufgezogenen Hunden vermischt wurde. Wenn das Antigen aber zu Seren gegeben wurde, die in geringen Mengen unspezifische Agglutinine gegenüber B.canis besaßen, konnten gewisse Agglutinationen S3 in den niedrigen Verdünnungen beobachtet werden. Dm festzustellen, ob durch die Erhöhung der Antigenkonzentration diese unspezifischen Reaktionen vermindert werden können, sind Antigentitrationen, die 4, 6, 8, 10% Zellen enthielten, gegen Seren titriert worden, die von a004 Hunden mit einer B.canis-Bakteriämie stammten und von 4 Hunden, die nicht mit B.canis infiziert waren, aber mit Antikörpertitern im Röhrchentest von unter I : 100. Durch die Verwendung von Antigenkonzentraionen von über 4% reduzierte sich die unspezifische Agglutination In manchen Seren von normalen Hunden oder sie verschwand völlig. Dafür konnten mit Antigenkonzentratlonen von über 6% bei infizierten Tieren geringe spezifische Titer festgestellt werden. Für die rouinemäßige Verwendung wurde deshalb eine 6prozentige so Keimsuspension bevorzugt.

Jm diagnostisch signifikante Titer festzustellen, wurien Platten-Agglutlnationsleste mit den serienmäßig entnommenen Serumproben der 11 infizierten Hunde durchgeführt. Alle Seren, die entnommen worden waren, nachlern die Tiere bereits 7 Wochen eine Bakteriämie hatten, igglutinierten im Plattentest das Antigen bei Verweniung von 0,02 und 0,04 ml Serumvolumen völlig. Zusätzlich aggiutlnierten 34 der 44 Proben, die 3 bis

Wochen nach Beginn der Bakteriämie entnommen vorden waren, im Ausgangs-Serumvolumen das Test-.ntigen vollständig. Alle restlichen Proben agglutinierten 00» und 7596 des Antigens in Serumvolumina von 0,04 izw. 0,02 ml.

Neben diesen starken Reaktionen mit Volumina von i,04 und 0,02 ml bei Hundeseren, die mindestens Wochen nach Beginn der Bakterlämie entnommen worden waren, wurde das Antigen auch mit 0,01 und 0,005 ml in einem Betrag zwischen 25% und 100%, agglulinicrt.

Tabelle 1

Typische Reaktionen im Plattentest beobachtet an Seren von Hunden mit einer B.canis-Bakteriämie und an Seren von normalen Hunden, die aber trotzdem B.canis Antigen agglutinieren

Röhrchen-	Blut	0,04	Agglutination in	0.02	Platten
Titer	kultur	+ 4	0,03	+ 3	0,01
200	+	+ 4	+ 4	+ 4	+ 1
500	+	+ 4	+ 4	+ 4	+ 4
250	+	+ 2	+ 4	-	+ 3
25*)	-	+ 2	+ 2	_	-
50*)		+ 1	_

*) partielle Agglutination hei dieser Scrumverdünnung

In der gleichen Weise wurde das Platten-Testantigen ■ gewöhnlich bei Serummengen von 0,01 und 0,005 ml starker von solchen Seren agglutiniert, die einen hohen Röhrchentiter besaßen (größer als 1 : 200) als von solchen mit einem niedrigen Serumtiter (unter 1 : 200). Eine zuverlässige Korrelation zwischen der Agglutination der Röhrchenverdünnungen und dem Plattentest-Serumvolumen konnte trotzdem nicht nachgewiesen werden. Das heißt, von 140 getesteten Proben besaßen 14 einen Röhrchentiter von 1 : 200. agglutinierten aber nicht mehr als 50% des Plattentest-Antigens. 10 Proben halten Röhichentiter von 1 : 125 bis 1 : 100 und agglutinierten mehr als 50% des Plattentest-Antigens bei einer oder beiden Endverdünnungen. Auf Grund dieser Unregelmäßigkeiten war es nicht möglich, die individuellen Röhrchen und Plattentest-Serumverdünnungen in der Art gleichzusetzen, wie es bei anderen Testen geschehen ist. Ein Serum galt deshalb als posotiv, wenn es eine komplette Agglutination (+4 Reaktion) des Plattentest-Antigens in der ersten Serummenge von 0,04 ml und 75% oder mehr Agglutination mit 0.02 ml Serum verursachte.

16 von 29 Serumproben (55%) von Hunden mit einer Bakteriämie von 3 Wochen oder weniger konnten mit beiden Methoden als positiv diagnostiziert werden. 95 von 96 Proben (99%), die von Hunden mit einer Bakeriämie stammten, die zwischen 4 und 25 Wochen bestand, wurden korrekt mit dem Plattentest, 94 der gleichen Proben (98%) mit dem Röhrchentest erfaßt. Die einzige riüuc, die ίιΤι PläiiciiicM inkorrekt klassifiziert wurde, agglutinierte 75% Antigen mit 0,04, 0,02 und 0,01 ml, während das Serum der Hunde, die im Röhrchentest inkorrekt reagiert hatten, einen Titer gegenüber dem Antigen von 1 : 50 besaßen.

In vier der positiven Seren sind im Plattendienst Prozonen beobachtet worden; sie traten bei dem Serumvolumen von 0,04 ml auf. In allen 4 Proben agglutinierte das Serum in diesem Volumen das Testantigen zu 75%, aber zu 100% bei den niedrigeren Serummengen. Alle Serumproben, die vor Beginn der Bakterlämie entnommen worden waren, waren stets in beiden Testen negativ.

Beim Vergleich des Plattentestes und des Röhrchentestes an Hand der 74 Proben aus zwei Zwingern und der Proben aus der serologischen Diagnostik wurde eine asugezeichnete Korrelation zwischen den beiden Testen festgestellt.

Tabelle II

Vergleich des Röhrchen- und des Plattentestes beim Nachweis von B.canis Antikörpern in Seren aus der serologischen Diagnostik

	Röhrchenlest	negativ	Plattentest	negativ
Herkunft	positiv	15	positiv	15
Zwinger A	0	59	0	59
Zwinger B	0	61	0	61
Klinikproben	12		12
(serol Diagn.)		135		135
Gesamt	12	12

Alle 74 Proben der Zwingerhunde konnten mil Hilfe von Platten- und Röhrchenlesi als negativ diagnostiziert werden. Gleich gute Beziehungen zwischen den Ergebnissen aus dem Röhrchen- und dem Platlentesl konnten bei der Untersuchung von 73 klinischen Proben, die zum

-¹H

10

Zweck der B.-canis-üiagnose von Tierärzten eingeschickt worden waren, beobachtet werden. 12 der getesietcn Seren besaiten einen Antlkörpertlter von größer .ils¹' 1 : 100. Diese Seren agglullnierten Im Plattentesl das¹', Testantigen bis zu dem angesetzten Volumen. Blutkultu- * ren konnten nur von 5 der 12 als positiv diagnostizlericn* Hunde gezüchtet werden. B.canis konnte aus allen diesen^ 5 Kulturen Isoliert werden. Verschiedene Serenl (4 Proben) zeigten eine geringe Agglutination im Röhrchentesl, die eine partielle Agglutination in den Verdünnungen von 1 : 50 und 1 : 100 zur Folge hatte. Nach 5 Minuten Inkubationszelt agglullnlerte das Serum ungefähr 75% des Antigens bei einer Serummenge von 0.04 ml. Aber sowohl bei 0,04 ml als auch bei 0,02 ml Serum konnte keine komplette Agglutination festgestellt werden. Seren, die Im Röhrchentest negativ reagierten, blieben auch im Plattentest negativ.

Um festzustellen, ob Kreuzreaktionen durch verwandte gram-negative Mikroorganismen hervorgerufen werden können, wurden verschiedene Antiseren, die gegen B.abortus und andere gram-negative Keime herge-f· stellt worden waren, mit B.-ovis-Plattenantigen und B.-;:j canis-Röhrchenantigen getestet. S

Tabelle III

Vergleich von Platten- und Röhrchenreaktionen bei Verwendung von Antiseren gegen verwandte Mikroorganismen

Immunserum

Tiler gegen- B.canis über dem Röhrchenhomologen Titer Stamm Plattenagglutination
0.04 0,02

0,01

0,005

B.abortus 800

B.bronchiseptica 1 800 1 : 100*)

B.bronchiseptica 2 50

B.ovis 500

B.canis 250

·) partielle Agglutination bei dieser Verdünnung

Obwohl einige B.bronchiseptica und B.abortus Anti- <r. seren eine partielle Agglutination im Röhrchentest verursachten, agglutlnierten sie das Plaltentesl-Antigen nicht. Im Gegensatz hierzu reagierte B.ovis Immunserum in beiden Testsystemen. Diese Reaktionen waren zudem nicht von denen mit B.-canis-Antiserum zu unterschei- so den.

Beispiel 5

Dieses Beispiel beschreibt einen Plattentest, bei dem ein undurchsichtiger weißer Hintergrund zur Ablesung und Bewertung der Agglutination verwendet wird.

In diesem Beispiel wurde ein Tris-Puffer folgender Zusammensetzung verwendet:

200 ml einer wäßrigen Lösung von Trls-(hydroxymethyD-aminomethan (242 g/Llter) und Maleinsäure (232 g/Llter),

78 ml einer 5-n-Natrlumhydroxidiösung, destilliertes Wasser ad 1000 ml.

Dieser Puffer wird nachstehend als 0,8 molarer Tris- t>5 Puffer bezeichnet.

Eine 1 prozent Ige Farblösung wurde durch Zugabe von 1 g Bengalrot zu 100 ml destilliertem Wasser hergestellt.

60 Die Antigenpräparation (abgetötete B.-ovis-Keime); wurde durch Zuabe von 5 ml der vorstehend beschriebet nen Farblösung zu 100 ml Antigenpräparation mit nach|'j folgender Inkubierung über Nacht angefärbt. Die Suspen|| sion wurde anschließend zentrifugiert und das Präzipltafa dreimal mit 0,8 molarem Trls-Puffer gewaschenfg Anschließend wurde eine 6prozentlge Zellsuspension iiy| Trls-Puffer hergestellt. Der pH-Wert dieser FarbsuspenfJ sion betrug 7,0. Die Suspension wurde durch Glaswolle! filtriert. I

Auf einem weißen, undurchsichtigen Blatt (welßi beschichtete Holzfaserplatte) werden Tropfen des Patien tenserums in unterschiedlichen Mengen aufgetraget (0,04, 0,02, 0,01, 0,005 ml). Zu jedem dieser unterschied lieh großen Tropfen wird 0,05 ml des vorstehenc beschriebenen B-ovis-Antigens gegeben. Nach 3 Minuter werden die Ergebnisse begutachtet und bewertet. Wem ein Serum bei 0,04 und 0,02 ml eine Agglutination vor 75% ausbildete, wurde das Serum als positiv bewertet.

11 Hunden, die bekannt spezifisch pathogenfrel waren wurde Blut zu verschiedenen Zeiten entnommen. Alle 6'. untersuchten Proben waren sowohl Im Röhrchentes gemäß Beispiel 1 als auch im Plattentest (CV.) gemäf Beispiel 2 sowie in dem vorstehend beschriebenen Plat

teniest (R.B), negativ. Nach oraler Infektion mit B.canis wurde den Hunden in wöchtentlichen Abstünden Blut entnommen. Diese Proben wurden nach allen 3 Methoden (Röhrchen, CV., R.B.) in der Agglutination geiesici. lis wurden folgende Ergebnisse erhalten:

Auf die gleiche Art und Weise wurden 77 Blutproben, die aus der Praxis eingeschickt worden waren, mit Hilfe dieser 3 Methoden vergleichend getestet. Ks wurden folgende Ergebnisse erhalten:

1 - 5 Wochen

6 - 45 Wochen

B.canis positiv (R.B.)

B.canis positiv (CV.)

100%

B.canis positiv (R.B.)

95% B.canis positiv (CV.)

98%

B.canis positiv (Röhrchen) B.canis positiv (Röhrchen) Röhrchen

Plaltentesl - CV. Plauemest - R.B.

65 67 65

B.canis negativ B.canis negativ B.canis negativ

9 9 10

B.canis positiv B.canis positiv B.canis positiv

3 1 1

fraglich fraglich fraglich (= 7bü)

Beispiel 6

243 Seruniproben aus der Praxis wurden im Röhrchentest gemäß Beispiel 1 und im Platlentest gemäß Beispiel 2 vergleichend untersucht, Es wurden folgende Krgebnisse erhalten.

Röhrchenmethode Methode aus Beispiel 2

21 B.canis positiv 221 B.canis negativ

1 fraglich (Agglutation kleiner als 75%) 20 B.canis positiv
220 B.canis negativ
1 fraglich

Andere Farbstoffe. Puffer oder Adjuvantien können an Stelle der beschriebenen verwendet werden. Desgleichen ist es möglich, die beschriebene Technik den Erfordernissen der Praxis entsprechend zu variieren und trotzdem die gleichen Ergebnisse zu erhalten.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren nach Nachweis von Antikörpern gegen Bruceila canls durch eine Agglutinationsreaktion mit einem Antigenrea^ns im Blutserum eines für eine Infektion mit diesem Bakterium empfänglichen Individuums mit Bakteriämie, dadurch gekennzeichnet, daß man als Antlgenreagens eine Suspension abgetöteter Zellen von Bruceila ovis verwendet, welche auf einen pH-Wert von 6 bis 8 eingestellt 1st.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Nachwels als Plattenlest ausführt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man den Plattentest auf einem durchsichtigen Substrat, ausführt.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man den Plattentest auf einem undurchsichtigen Substrat von einer Farbe, die zu dem Agglutinat gut kontrastiert, ausführt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigenreagens einen Farbstoff enthält, der die agglutinierten Teilchen anzufärben vermag, ohne dabei die spezifische 2ϊ Agglutination zu inhibieren oder selbst unspezlftsch zu agglutinleren.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daü man als Farbstoff Kristallviolett, BrIUiantgrün oder Bengalrot verwendet.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigenreagens auf einen Keimgehalt von 4 bis 7%, vorzugsweise 6%. abgetöteter Zellen von brucella ovis eingestellt ist.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigenreagens dem Blutserum In einem Veihältnis von 0,5 Volumenteilen Reagens zu 0,5 bis 0,05 Volumenteilen Serum zugesetzt wird.

9. AntlgenTeagens zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Suspension abgetöteter Zellen von Brucella ovis, welche auf einen pH-Wert von 6 bis 8 eingestellt ist, enthält.

10. Antigenreagens nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es einen Farbstoff, der die agglutinierten Teilchen anzufärben vermag, ohne dabei die spezifische Agglutination zu inhibieren oder selbst unspezifisch zu agglutinleren, enthält.

11. Antigenreagens nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es einen Keimgehalt von 4 bis 1% aufweist.

12. Antlgenreagens nach Anspruch 9. dadurch gekennzeichnet, daß der Farbstoff Kristallviolett, BrIlllantgrün oder Bengalrot ist.

13. Antlgenreagens nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es auf einen pH-Wert von 7,3 bis 7,5 eingestellt ist und als Farbstoff eine Mischung aus Brilliantgrün und Kristallviolett enthalt.

14. Antigenreagens nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es auf einen pH-Wert von 6,9 bis 7,1 eingestellt ist und als Farbstoff Bengalrot in einer Menge von 0,3 bis 0,6 g auf 100 ml einer Antigensuspenslon mit einem Keimgehalt von b% enthält.